Editando Sake (seición)

== Bioquímica del procesu ==
La ellaboración del sake consiste nuna serie de pasos bien estremaos, tantu poles condiciones nes que caúna llévase a cabu, como polos microorganismos que participen en caúna d'elles. Na ellaboración del koji, por casu, práuticamente solo participa Aspergillus oryzae, ente que na del moto desenvuélvese una importante microflora, magar los trés principales actores d'esta etapa son [[Aspergillus oryzae]], [[Lactobacillus]] sakei, [[Leuconostoc mesenteroides]] var. sake y [[Saccharomyces]] sake. Finalmente, na etapa del moromi, Aspergillus oryzae y Saccharomyces sake son los principales microorganismos, tantu en númberu, como n'importancia de cara a la ellaboración de la bébora.

Nesta, a parte d'una concentración d'ente 15 y 20 % de etanol, los principales componentes responsables del so sabor carauterístico son: [[acedu succínico]] (500 a 700 mg/L), [[acedu málico]] (200 a 400 mg/L), [[ácidu cítrico]] (100 a 500 mg/L), [[acedu acético]] (50 a 200 mg/L), [[alcohol isoamílico]] (70 a 250 mg/L), [[n-propanol]] (120 mg/L), [[alcohol fenetílico]] (75 mg/L), [[isobutanol]] (65 mg/L), [[acetato de etilo]] (50 a 120 mg/L), [[caproato de etilo]] (10 mg/L) y [[acetato de isoamilo]] (10 mg/L).

Estos metabolitos tamién pueden atopase en cerveces y la mayoría de vinos yá que provienen de la fermentadura alcohólica. Tamién hai qu'añader a estos componentes el eti-lleucinato, que ye'l que contribúi en mayor midida al arume del Saké. Sicasí, la concentración de toos estos compuestos nel Saké ye significantemente mayor. Nun hai qu'escaecer la presencia d'ácidu láctico (0,3 a 0,5 mg/L) que ye casi dafechu frutu de l'actividá de les bacteries fermentadores acidolácticas presentes mientres la etapa de la moto. Tamién se detecta, anque en concentraciones menores, una variedá d'aminoácidos. La presencia d'estos tiende a ser la mínima posible, yá que-y dan al Saké un sabor desagradable.

Lleváronse a cabu gran cantidá de meyores xenétiques de les cepes de Saccharomyces sake con tal d'amontar la presencia de dalgunos d'estos metabolitos (como ye'l casu del fenil etanol, el isoamyl alcohol o'l etilcaproato), al igual qu'amenorgar la d'otros (aminoácidos, etilcarbamato, urea). Tamién se dieron el casu de cepes diseñaes p'ameyorar la productividá, yá sía menguando la formación d'espluma, la medría de tolerancia al etanol o la non proliferación de cepes productores de toxines.

De siguío vamos detallar les víes metabóliques de los microorganismos arreyaos na producción de los principales productos presentes nel Saké. Dada la gran cantidá de cepes esistentes y de variantes esistentes na producción del saké, cinxiremos a los casos más representativos.

=== Degradación del almidón ===
Anque nun se mentara más arriba, tan importante como'l procesu fermentativo ye la degradación del almidón per parte de Aspergillus oryzae, una y bones nenguna de los otros lleldos puede degradalo. Esti procesu, tamién llamáu sacarificación, ye lleváu a cabu por dos enzimes: la α-amilasa, la enzima liquefactora, y la glucoamilasa, la enzima sacarificadora. Estes tópense ente les amilosacaridasas más estudiaes daes la so alta actividá y les sos munches aplicaciones industriales. Antes d'enfusanos más en detalle, pero, va ser conveniente recordar les carauterístiques de la so sustratu: l'almidón.
L'almidón ye unu de los mayores glucopolímeros, y la so estructura básica ye la d'una cadena central compuesta de α-D-glucoses xuníes por aciu enllaces α-1,4, y cadenes ramificaes por aciu enllaces α-1,6. La cadena llinial non ramificada recibe'l nome de amilosa, ente que les cadenes ramificaes denominar amilopectinas. 

Estes cadenes difieren non solo tocantes a les sos propiedaes físiques, sinón tamién tocantes a proporciones yá que la amilosa representa ente'l 17 y el 25 % del almidón, ente que'l restu son principalmente amilopectinas. La estructura d'estos dos polímeros en solución sigue siendo inda oxetu d'alderique. Sicasí sí se reparó que la distancia media ente ramificaciones de amilopectina y la cadena principal ye variable.

De la mesma, volvamos a los dos amilosacaridasas que nos concernen. La α-amilasa ye una endosacaridasa (polo tanto nun puede atacar a un polímeru pelos sos estremos) que ruempe puramente enllaces de tipu α-1,4, ente que la glucoamilasa ye una exosacaridasa, que non solo puede atacar al almidón pelos estremos de les sos cadenes, sinón que puede romper enllaces α-1,4 y α-1,6. Esto dexa entender claramente que la α-amilasa actúa principalmente sobre la cadena principal, ente que la glucoamilasa tien una función desramificadora que puede collaborar na rotura de cadenes lliniales.

Al estudiar la producción de sacaridasas nel xéneru [[Aspergillus]], reparóse que la producción yera mayor en fermentadures en mediu sólidu (como ye'l casu del Saké) qu'en mediu líquidu, yá que al paecer les fermentadures n'estáu sólidu reproducen les condiciones naturales de crecedera, creando variaciones locales de la concentración de sustratu qu'aguiyen la producción d'enzimes hidrolíticas per parte del organismu. Sicasí, reparóse que'l ratio ente amilasa y glucoamilasa ye distintu pa cada cepa Asina, la cantidá de α-amilasa ye más elevada en Aspergillus oryzae ente que la producción de glucoamilasa ye más elevada en Aspergillus niger. 

Pa los dos cepes, pero, el mecanismu d'aición ye'l mesmu. Les hifas fúngicas enfusen, por aciu [[Enzima|enzimes]] lítiques, nel granu d'arroz hasta algamar los estratos de texíu onde s'atopa l'almidón. El fungu entós llibera les sacaridasas por que degraden l'almidón. De primeres, la glucoamilasa empieza atacando pelos estremos y a les cadenes ramificaes, ente que la α-amilasa ataca a les cadenes pel mediu, creando productos entemedios, que de la mesma son atacaos pola α-amilasa. A la fin, solo queden maltosas que la α-amilasa ruempe, llogrando asina α-D-glucosa. Finalmente, esta glucosa puede ser absorbida por Aspergillus, o permanecer nel arroz y participar nel so sacarificación.

Por cuenta de la so gran actividá hidrolítica, la α-amilasa de Aspergillus oryzae, tamién llamada Taka α-amilasa, ye bien utilizada en gran variedá de procesos industriales, y foi estensamente estudiada. Basáu nel so l'analís de datos de [[Cristalografía de rayos X|cristalografía]] de rayos-X, propúnxose un mecanismu d'hidrólisis acedu-base xeneral. Glu230 actuaría como acedu xeneral y Asp297 actuaría como base xeneral mientres la catálisis. His122, Asp206, Lys209, His210 y His296 fueron propuestos como responsables de la unión al sustratu.

Estos datos tamién suxeren que la Taka α-amilasa pertenez a una superfamilia de proteínes con estructura en barril (β/α)8 y con tres dominios A, B y C. L'apodero B ta rellacionáu col sitiu d'unión a sustratu y ta xuníu al dominiu A por aciu un ion calciu. El dominiu C tien una conformanza de tipu inmunoglobulina y ye aparentemente necesariu pa l'actividá de la enzima. 

Nel casu de la glucoamilasa, estudios con Aspergillus niger indiquen que Trp120 estabiliza l'estáu de transición del sustratu ente que Glu179 y Asp176 actúen como catalizadores acedu-base. Viose, a lo último, que la presencia d'almidón y de maltosa son inductores de l'actividá de la α-amilasa, ente qu'altes concentraciones de glucosa tienen un efeutu inhibidor de la so actividá. 

Afortunadamente, na ellaboración del saké esto nun ye un problema, yá que a midida que Aspergillus oryzae va xenerando glucosa, les lleldos fermentador dir utilizando pa producir etanol, polo que nunca s'algamar concentraciones de glucosa abondes pa tornar l'actividá hidrolítica de la α-amilasa. La glucoamilasa nun ta suxeta a esti tipu de inhibición.
 
La Taka α-amilasa tamién foi estudiada a nivel de la so secuencia xenético y clonao n'otros microorganismos. En Aspergillus oryzae atopáronse múltiples xenes d'espresión pa la Taka α-amilasa. cDNA y DNA de dos secuencies casi idéntiques de los xenes de la Taka α-amilasa, amyI y amyII, fueron clonaos y secuenciaos. Les secuencies amuesen diferencies en solu trés nucleótidos, qu'afecten a dos pares d'[[Aminoácido|aminoácido]], 35Arg-Glu y 121Phe-Leu, siendo estes les úniques diferencies ente los dos proteínes. A nivel de secuencia xénica, tamién se reparó que la 3’ UTR de amyI escarez de inverted repeats y contienen una rexón señal de poliadenilización ‘AATAAA’. 

Los xenes amyI y amyII nun tán amestaos nel cromosoma de Aspergillus oryzae sinón que los dixebra una distancia d'ente 6 y 10 kb, y cada unu contién 8 intrones. Esperimentos de deleción de secuencia indiquen, amás, que la secuencia que va de 299 a 377 bp dende'l codón entamu ye necesaria pa poder inducir un altu nivel d'espresión del xen.

Dende un puntu de vista de cinética enzimática, lleváronse a cabo estudio alrodiu de les condiciones óptimas d'actividá tantu pa la α-amilasa como pa la glucoamilasa.

Nel casu de la α-amilasa, viose qu'algama una actividá máxima pa un pH de 4,7 y una temperatura de 55 ºc. Pa la glucoamilasa, otra manera, el [[pH]] óptimo ye de 4, teniendo a 4,7 una actividá equivalente al 70% de l'actividá máxima, y la temperatura óptima 75 ºc, anque yá que se trata d'una enzima inestable a altes temperatures, la llende p'aplicaciones práutiques tópase alredor de los 60 ºc. Estos datos resulten entá más interesantes si tener en cuenta les condiciones d'ellaboración del koji, de la moto y del moromi, yá que mientres la ellaboración del koji la temperatura nunca devasa los 36 ºc. Mientres la ellaboración de la moto'l pH suel ser bastante ácidu, por cuenta de la producción d'ácidu láctico. Asitiándose alredor de 3,6-3,8. La temperatura, pela so parte depende del métodu de producción. En dellos casos asitiar en 25 ºc, n'otros, pa evitar l'apaición de microflora selvaxe, algámense los 55-60 ºc. 

Finalmente, mientres la ellaboración del moromi, la temperatura xira alredor de los 15 ºc. Polo tanto vemos que práuticamente nengún casu les condiciones de producción afacer coles óptimas de les sacaridasas, lo cual tien sentíu, pos d'esta manera puede controlase que la proliferación de Aspergillus oryzae sía escesiva.

=== Producción del ácidu láctico ===

La producción d'[[acedu láctico]] dar mientres la fase d'ellaboración del moromi, principalmente mediada por Lactobacillus sake y Leuconostoc mesenteroides, anque Saccharomyces sake tamién puede contribuyir puntualmente. Esta producción d'acedu láctico, de gran utilidá p'acabar cola microflora selvaxe que crez mientres la ellaboración de la moto, ye frutu de la fermentadura láctica llevada a cabu polos dos microorganismos citaos enantes. La vía de fermentadura acidoláctica nun difier enforma d'unu a otru, cabo señalar, qu'ente que Lactobacillus sake ye un lleldáu homoláctico facultativu, Leuconostoc mesenteroides ye un fermentador heteroláctico, polo que, amás d'acedu láctico, va producir etanol.

La fermentadura homoláctica del ácidu láctico ta estrechamente rellacionada cola fermentadura alcohólica, una y bones dambes tienen de mancomún tol procesu glucolítico que desagua nel piruvato. Sicasí, a diferencia de la fermentadura alcohólica, la fermentadura acidoláctica nun pretende xenerar ATP sinón solo refaer el NAD+ que se gastar mientres la glucólisis. L'amenorgamientu del piruvato ta catalizada pola lactato desidrogenasa que forma'l isómero L del ácidu láctico. L'equilibriu global d'esta reaición favorez fuertemente la formación de lactato, tal que se demuestra pola gran variación negativa d'enerxía llibre estándar (ΔG’º=-25,1 kJ/mol).

La [[fermentadura heteroláctica]] estremar de la [[fermentadura homoláctica|homoláctica]] en qu'una parte del piruvato ye descarboxilado a acetil-CoA, que de la mesma puede ser amenorgáu a etanol o tresformáu en acetato por aciu el fosfatu acetiltransferasa, que lo convierte en acetil fosfatu, y la acetoquinasa, que nos dexa llograr un acetato y un ATP, polo que la fermentadura heteroláctica dexa xenerar enerxía amás de poder reductor. El acetato xeneráu va pasar depués a acedu acético, o inclusive etil acetato, productos importantes de cara al arume y el sabor del saké. Poro, la intervención de Leuconostoc mesenteroides ye importante de cara a la carauterización de la bébora. Esta bacteria, amás, destaca pol ampliu rangu de temperatures y concentraciones d'azucres (hasta del 50 %) nes que ye capaz de crecer, siendo en consecuencia d'usu habitual na industria alimentaria.

Podemos dicir, poro, que la participación d'estos dos microorganismos nel saké nun ye despreciable, yá que non solo producen cantidaes abondes d'acedu láctico pa tornar la crecedera d'otros microorganismos indeseados, sinón que tamién xeneren metabolitos secundarios que contribúin al sabor del saké. Del so grau d'actividá, amás, va depender en gran midida l'acidez final del Saké, polo que se desenvolvieron un abanicu de cepes que dexen algamar el grau d'acidez deseyáu en cada casu. Parte d'estes cepes fueron desenvueltes por aciu procesos de mutagénesis y xenética recombinante. 

Sicasí, nos últimos años, apaecieron variantes nel métodu de producción del saké (sobremanera del de menor calidá), nel que se refuga la necesidá d'estos microorganismos yá que se dar# en la acidificación de la moto por aciu adición direuta d'acedu láctico dende'l principiu, polo que s'evita l'apaición de microflora indeseada coles mesmes que s'evita la crecedera d'estos fermentadores. Esto debe a que Lactobacillus sake llega a algamar un tamañu de población del orde de 108 cfu/g, polo que al evitar la so crecedera, facilítense les xeres de peneráu del productu.

=== Producción del etanol ===

La [[fermentadura alcohólica]] ye un procesu común lleváu a cabu por munchos de los microorganismos que se topen en situación de anaerobiosis. Nel casu de los lleldos, el xéneru Saccharomyces convirtióse'l microorganismu de referencia en cuanto fermentadura alcohólica aplicada a los alimentos. Saccharomyces saké ye, amás, una variante de Saccharomyces cerevisiae capaz de tolerar mayores concentraciones de etanol, que dexen que nel saké algame porcentaxes cimeros al 20 %.

En lleldos, la producción de etanol deriva namái de la vía glucolítica de Embden-Meyerhof-Parnas, na que la glucosa fosfatu ye tresformada en dos triosas fosfatu: gliceraldéhido -3_P y dihidroxilacetona fosfatu. El gliceraldéhido-3 –P ye de siguío tresformáu en piruvato. Esti convertir en etanol y dióxidu de carbonu nun procesu en dos pasos. Nel primer pasu, el piruvato se descarboxila na reaición irreversible catalizada pola piruvato descarboxilasa. Esta reaición precisa ion magnesiu y tien un coenzima xuníu bien fuertemente, la tiamina fosfatu. 

Nel segundu pasu, el acetaldéhido llográu amenorgar a etanol, con NADH proveniente de la deshidrogenación del gliceraldéhido 3-fosfatu, apurriendo'l poder reductor al traviés de l'aición del alcohol deshidrogenasa. Per otra parte, la dihidroxilacetona fosfatu xenerada mientres la glucólisis pasa tamién a gliceraldéhido 3-fosfatu, polo que per cada molécula de glucosa llogramos dos de etanol, dos de CO2, 2 de ATP, 2 de H2O y aferruñamos los dos NADH llograos mientres la glucólisis.

Suxirióse que parte de la producción de etanol podría ser frutu de l'actividá fermentadora de Aspergillus oryzae, magar ye ciertu, que nun se da siempres, ya inda cuando produzse, la so contribución ye bien minoritaria. Sía comoquier, los altos niveles de etanol alcanzaos, magar nun afectar por demás l'actividá del fungu, sí que sirven p'acabar colos microorganismos indeseados y tamién coles bacteries productores d'acedu láctico que topen vencíu yá por cuenta de la baxa da de pH qu'elles mesmes causaron mientres la etapa de la moto.

=== Producción de etil leucinato y de fenil etanol ===
De tolos metabolitos secundarios llograos mientres la fermentadura'l etil leucinato y el fenil etanol son de los más importantes, yá que la so contribución al sabor del saké ye especialmente destacada. Nel casu del etil leucinato, ye quiciabes el principal responsable del so sabor, ente que el etil etanol destaca pol so arume a roses carauterísticu. Por ello, y magar que les sos víes de llogru son bien distintos, merecen mención a aparte.

El etil leucinato ye productu de l'aición combinada de Aspergillus oryzae y los lleldos del saké. Nun primer tiempu, Aspergillus oryzae convierte leucina (yá sía endóxena, yá sía llograda de la proteólisis del arroz) n'acedu leucínico que se lliberar al mediu. Viose qu'esto ye daqué que solo puede llevar a cabu Aspergillus yá que puede topase acedu leucínico nel koji, pero non l'arroz fervíu namái en presencia de lleldos del Saké. Nun segundu llugar, los lleldos del saké (principalmente Saccharomyces) converten esti acedu leucínico en etil leucinato. 

Diversos estudios demostraron que Aspergillus oryzae escarez de la capacidá pa llevar a cabu esta última conversión. Ye, más, constatóse que la capacidá de producir más o menos etil leucinato depende de la combinación de cepes de Aspergillus oryzae y lleldos del Saké presentes na muestra.

El fenil etanol, pela so parte, ye un compuestu producíu puramente por Saccharomyces saké, xunto al fenil acetato. Nel Saké, la proporción d'estos dos productos suel ser d'ente 4 y 10 vegaes, siendo'l fenil etanol el que se topa a niveles más elevaos. El fenil etanol formar mientres la fermentadura alcohólica por aciu conversión de la fenil alanina presente nel mediu, o bien por síntesis de novo.

La síntesis de novo dar a partir de fenil piruvato, que ye un precursor de la fenil alanina. En Saccharomyces, el primer pasu de la biosíntesis d'aminoácidos arumosos ta catalizada pola 3-deoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfatu sintasa. Esta enzima ta presente en dos isoformas, una de les cualos se inhibe por aciu mecanismu de feedback negativu en presencia de fenil alanina, ente que la otra facer en presencia de tirosina. Creáronse mutantes insensibles a estes inhibiciones pa llograr mayores cantidaes de fenil etanol.

El llogru de fenil etanol pela vía catabólica, pela so parte, dar por aciu tres pasos enzimáticos: nel primeru una aminoácidu transferasa convierte la L-fenil alanina en fenil piruvato. De siguío, la tiamina pirofosforilasa convierte esi fenil piruvato en fenil acetoaldéhido que ye convertíu en fenil etanol por aciu una l'alcohol hidrogensa. 

El balance d'esti procesu, a parte d'un fenil etanol por una L-fenil alanina, ye d'un NADH ferruñosu a NAD+ y la formación d'una molécula de CO2. La producción de fenil etanol y otros alcoholes volátiles dase cuando les bacteries utilicen aminoácidos como fonte de nitróxenu, anque la presencia de glucosa ye esencial, yá que dexa la síntesis de novo.

=== Producción d'otros metabolitos secundarios ===
Como vimos antes, el piruvato frutu de la glucólisis dexa llograr acedu láctico, acedu acético y etanol mientres la fermentadura. Sicasí, estos nun son los únicos productos llograos. Munchos otros metabolitos secundarios pueden aniciase a partir del piruvato mientres la fermentadura, de resultes de rutes anapleróticas o de sistemes de regulación, yá sía del poder reductor, yá sía de dalgún de los productos antes mentaos.

Dellos d'esos metabolitos secundarios fueron enunciaos de primeres d'esti artículu. El [[ácidu cítrico]], l'[[acedu succínico]] y el [[acedu málico]] formaben parte d'esa llista. El llogru d'estos dase al traviés del ciclu del ácidu cítrico. Nel entamu del ciclu, una molécula d'[[acetil-CoA]] (que provién del [[piruvato]]) dexa'l so grupu [[acetilu]] al [[oxalato]], formando una molécula de citrato. Esta puede convertise n'ácidu cítrico, o puede siguir el ciclu. El citrato ye entós tresformáu en [[isocitrato]], que al deshidrogenarse produz [[α-cetoglutarato]]. Esti postreru compuestu tamién sufre una descarboxilación, produciendo finalmente [[succinato]], que, como antes, puede derivar en [[acedu succínico]] o siguir el ciclu. 

De siguío el succinato ye convertíu a [[fumarato]] por aciu una deshidrogenación, y este por aciu hidratación, va dar [[malato]]. Esti malato tien d'últimes la opción de salir del ciclu como acedu málico, o cerralo, deshidrogenándose pa dar [[oxalacetato]], la molécula cola qu'empezamos. Tamién esiste la posibilidá de saltase les etapes enzimáticas que midíen ente'l isocitrato y el oxalacetato por aciu el [[ciclu del glioxilato]], sicasí, colo dicho basta pa faese una idea del mecanismu de llogru d'estos ácidos.
 
Otru metabolito secundariu importante, magar que nun figuraba na llista inicial ye'l [[glicerol]], que contribúi a la suavidá del saké y atrópase mientres les etapes iniciales de la fermentadura. El glicerol llograr a partir de la de [[dihidroxiacetona fosfatu]] que ye amenorgada a glicerol fosfatu por aciu una [[deshidrogenasa]] NADH-dependiente. Esti glicerol fosfatu ye hidrolizado pola α-glicerofosfatasa pa dar glicerol.

Finalmente, el restu d'alcoholes volátiles formar a partir de cetoácidos precursores d'aminoácidos, como ye'l casu del piruvato. Por aciu descarboxilaciones y amenorgamientu al alcohol correspondiente pueden llograse tolos alcoholes enunciaos de primeres del capítulu.