Geração de linhagens celulares bovinas monoalélicas para BoLA-DRB3, caracterização imunopeptidômica e desenvolvimento da ferramenta NetBoLAIIpan para o avanço em mapeamento de epítopos de células CD4+ T e desenvolvimento de vacinas

Resumo

A bovinocultura é um componente significativo na indústria global de pecuária devido à sua contribuição tanto para a produção de carne quanto de laticínios. Rhipicephalus microplus, o carrapato-do-boi, causa substanciais perdas econômicas na indústria de gado em muitas áreas tropicais e subtropicais do mundo. Os métodos atuais para o controle de R. microplus dependem de acaricidas e de abordagens quimio profiláticas/terapêuticas, que têm sido degradadas devido ao aumento da resistência por carrapatos. Por se tratar de um parasita complexo, o controle sustentável de carrapatos por meio de vacinas é desafiador, uma vez que requer várias classes funcionais de antígenos. Nosso grupo de pesquisa demonstrou que uma formulação vacinal composta por nove antígenos salivares foi 75% eficaz na proteção de bovinos suscetíveis contra infestações por R. microplus. Atualmente, estamos finalizando a identificação de epítopos de células B presentes nesses antígenos vacinais, que serão utilizados no desenvolvimento de uma nova vacina anti-carrapato, de molécula única e quimérica, para comercialização. No entanto, é bem estabelecido que, para respostas eficazes de anticorpos contra patógenos, os epítopos devem ser apresentados por células B através de moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) classe II a células T "auxiliares" CD4+ para obtenção do suporte necessário para sua ativação e maturação. Nesse contexto, nosso grupo tem trabalhado ativamente na caracterização de epítopos apresentados pelo MHC-II usando a imunopeptidômica, o que melhorou significativamente o desenvolvimento e a precisão de algoritmos de predição de peptídeos ligantes do MHC e resultou na geração da ferramenta de predição de ligantes de BoLA-DR, específica para bovinos, NetBoLAIIpan. Ferramentas in silico como essa podem acelerar a seleção racional de antígenos e epítopos para o desenvolvimento de vacinas, especialmente para parasitos com grandes proteomas, como carrapatos. No entanto, há uma necessidade urgente de expandir tal ferramenta de previsão para uma cobertura mais ampla das populações de bovinos de interesse, como o gado comercial brasileiro; além disso, os modelos celulares anteriormente utilizados não foram otimizados e não puderam ser transferidos para nosso laboratório no Brasil devido a limitações de biossegurança, de modo que o desenvolvimento de modelos livres de patógenos representa uma alternativa para continuar nossos esforços de expansão do banco de epítopos de MHC-II e da capacidade de pesquisa anti-carrapato no Brasil. Para superar esses desafios, este projeto visa gerar linhagens celulares bovinas monoalélicas que expressem alelos BoLA-DRB3 prevalentes no gado comercial brasileiro, de modo a atingir uma cobertura de ~95%. Um alelo BoLA-DRB3 bem caracterizado será usado como modelo para otimizar a inserção do gene DRB3 mediada por plasmídeo ou lentivírus e a expressão de proteínas nas linhagens celulares BoLA-null derivadas de bovinos, recentemente desenvolvidas por nosso grupo. Posteriormente, serão realizadas análises de imunopeptidômica e de motivos de ligação BoLA-DRB3 e os conjuntos de dados gerados serão comparados com aquele atualmente incluído no banco de dados da ferramenta NetBoLAIIpan. Uma vez que o protocolo para a expressão do gene esteja padronizado e os conjuntos de dados de motivos sejam validados, as sequências completas de BoLA-DRB3 prevalentes no gado comercial brasileiro serão caracterizadas e expressas nas linhagens celulares BoLA-null derivadas de bovinos. Finalmente, o imunopeptidôma e os novos conjuntos de dados de motivos serão produzidos para atualizar a ferramenta NetBoLAIIpan. Como perspectiva desses resultados, empregaremos a ferramenta na descoberta de epítopos para facilitar a seleção de antígenos e o desenvolvimento de vacinas baseadas em epítopos contra R. microplus, complementando assim os dados de mapeamento de epítopos de células B.