MANUAL DE LABORATORIOS

ECOLOGA DE MICROORGANISMOS

Francisco Fuentes Arturo Massol-Dey

Universidad de Puerto Rico 2002

MANUAL DE LABORATORIOS: ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS. Derechos Reservados1996 por Francisco Fuentes y Arturo Massol-Dey. Revisado 2002. Se prohibe reproducir o transmitir cualquier parte de este manual en manera alguna ni por ningn medio sin previo permiso escrito de los autores. El Dr. Francisco Fuentes posee un doctorado del Departamento de Biologa de la Universidad de Puerto Rico, Recinto de Ro Piedras. Actualmente se desempea como catedrtico en el Departamento de Biologa del Recinto Universitario de Humacao. El Dr. Arturo Massol-Dey posee un doctorado del Centro de Ecologa Microbiana de la Universidad Estatal de Michigan. Actualmente se desempea como catedrtico en el Departamento de Biologa del Recinto Universitario de Mayagez.

TABLA DE CONTENIDO
PRIMERA PARTE Principios de Ecologa Microbiana
Laboratorio Ecologa de Microorganismos El Mtodo Cientfico, Estadsticas y Ecologa Destrezas Bsicas para el Cultivo y Manejo de Microorganismos Mtodos de Muestreo

SEGUNDA PARTE Parmetros Fsico-Qumicos

Luz Temperatura Salinidad Conductividad pH Alcalinidad Slidos Disueltos Totales Potencial de Oxi-Reduccin Determinacion del Contenido de Humedad en Suelos

TERCERA PARTE Nutrientes y Gases

Nitrgeno Fosfato Azufre Slica Hierro Gases Disueltos Oxgeno Disuelto

CUARTA PARTE Biomasa & Actividad Microbiana

Biomasa Microbiana: Determinacin por Contenido de Protenas Biomasa Fototrofos: Clorofilas Biomasa: Extraccin y Derivatizacin de Acidos Deoxiribonucleicos (ADN) Totales Enumeracin Bacteriana: el Nmero Ms Probable Anlisis de Comunidad: Extraccion y Derivatizacion de Acidos Grasos Totales Anlisis de Comunidad: Perfil de Utide Fuentes de Carbono Productividad Primaria en Hbitats Acuticos Actividad Metablica Mineralizacin de Materia Orgnica Fermentacin y Metanognesis Ensayo de Laminilla de Contacto

LABORATORIO ECOLOGA DE MICROORGANISMOS

LA ECOLOGIA MICROBIANA se desarrolla como un rea de especializacin dentro del campo de la microbiologa a partir de la dcada del sesenta. Para esa poca el hombre reconoce el rol esencial que desempean los microorganismos en aquellos procesos que regulan o afectan la homeostasis en un ecosistema (ej. reciclaje de nutrientes, la biodegradacin de contaminantes y la biomagnificacin de materiales txicos).
E s t r a t e g i a sp a r a l a E c o m i c r o b i o l o g a :

... membranas y sus cidos grasos ... componentes intracelulares ... cidos deoxiribonucleicos ... estructuras y morfologa ... ribosomas ... metabolismo ... protenas ... ambiente

T O L

ADP + Pi

ATP

5 0 S 3 0 S T e m p e r a t u r a p H H u m e d a d P r e s i n N u t r i e n t e s O x g e n o M a t e r i a O r g n i c a CO2

El estudio de la ecologa de los microorganismos depender del grado de entendimiento de las condiciones ambientales particular-res del hbitat y de las poblaciones microbianas presentes en el lugar.

Durante este periodo, se reconoce que los problemas ambientales no pueden ser analizados como fenmenos circunscritos a fronteras ambientales rgidas y arbitrarias (ej. ambiente acutico, ambiente terrestre) ni como problemas inherentes a

determinadas poblaciones. Estamos convencidos hoy da de que el estudio de dichos problemas requiere de un anlisis interrogador que nos permita descubrir la amplia gama de interrelaciones que se dan entre los organismos vivos y su ambiente (factores biticos y abiticos). Slo as lograremos un entendimiento cabal del funcionamiento de los ecosistemas. Es desde esa perspectiva que surge la Ecologa Microbiana como nueva disciplina cientfica. La ecologa microbiana se caracteriza por avances significativos hacia un mejor entendimiento de los principios fundamentales que rigen la estructura y funcin de ecosistemas acuticos, marinos y terrestres. Este manual tiene como objetivo presentar aspectos tericos y prcticos de metodologas disponibles para el estudio de comunidades microbianas y sus hbitats.

PRIMERA PARTE

EL MTODO CIENTFICO, ESTADSTICAS Y ECOLOGA

EL METODO CIENTIFICO es un proceso integral que depende de una planificacin cuidadosa, de observaciones, as como de la toma sistemtica de datos. La planificacin experimental debe considerar los tipos de anlisis necesarios para interpretar y validar resultados, y conclusiones. Una de las etapas principales es la formulacin de hiptesis que puedan ser evaluadas por el mtodo cientfico. Esta fase es el fundamento para la designacin de procedimientos experimentales, muchos de ellos, mtodos que han sido previamente utilizados, as como en ciertas ocasiones, el desarrollo o adaptacin de nuevas tecnologas. Los procedimientos experimentales, con sus debidos controles, generan datos que sirven para evaluar crticamente la hiptesis. Anlisis estadsticos son tiles, durante esta fase, pues permite establecer grados de confianza durante la interpretacin de datos. Todo proceso de investigacin suele dirigir hacia la postulacin de nuevas preguntas y experimentacin. Adems, en ocasiones resulta en nuevos descubrimientos que no estaban en el plan original. Finalmente, el proceso cientfico concluye parcialmente con el reporte de los datos, usualmente, en la redaccin de un artculo(s) en revistas cientficas o presentando los resultados en conferencias y/o afiches en congresos cientficos. Durante esta etapa, la comunidad cientfica tiene la oportunidad de

informarse, as como de participar en la reflexin crtica de las observaciones y mtodos presentados:

En el mtodo cientfico, se postula una hiptesis basada en la informacin disponible. Esta hiptesis debe ser probada, por lo cual, experimentos se disean para auscultar nueva informacin y contestar la hiptesis propuesta. De lo contrario, se rechaza la hiptesis y se procede a postular una nueva hiptesis revisada.

PREGUNTA

Hiptesis Experimentacin Grupo Grupo Control Experimental

Nueva Hiptesis

Revisin

Reproducibilidad

Observaciones

Datos Apoyan Hiptesis

Datos no Apoyan Hiptesis Rechazar Hiptesis

Los tipos de datos a obtener son criterios importantes para el diseo experimental. Algunos datos, conocidos como variables independientes, estn bajo el control del investigador; otro tipo de datos, conocidos como variables dependientes, no estn bajo dominio del investigador y se obtienen realizando observaciones. Durante la experimentacin es deseable manipular una variable independiente y observar su efecto en uno o varias variables dependientes.

Datos obtenidos de rplicas experimentales usualmente pueden ser representados por la tendencia central de datos. Esto puede ser determinado calculando la mediana, moda y/o promedio de los resultados: mediana punto de la distribucin de datos sobre o bajo el cual se encuentran la mitad de los datos valor de datos que ocurre en mayor frecuencia sumatoria de todos los datos (valores) dividido por el total de nmero de datos

moda promedio

En ocasiones, grupos de datos suelen contener valores que son cercanos al valor promedio mientras que otros puntos pueden estar ms dispersos, por lo tanto, es importante describir el grado de dispersin de los datos. La forma ms simple es determinar la amplitud o rango (diferencia entre el valor mayor y mnimo). Este valor provee una rpida descripcin del grado de variabilidad de los datos. Una medida cuantitativa para medir el grado de dispersin de datos es definido por la varianza: varianza sumatoria del cuadrado de las desviaciones del promedio dividido por el tamao de la muestra menos uno

S2 =
x x

(x x )

n 1

S2 = varianza = sumatoria = valor numrico de un dato = promedio n = tamao de la muestra

donde n - 1, representa el grado de libertad definido como el nmero de valores que son permisibles a variar despus que ciertas restricciones han sido definidas para la data... La desviacin estndar describe el grado de dispersin dentro de un grupo de datos (cuantitativamente describe dispersin):

SD = S
SD = desviacin estndar S2 = varianza

Si las muestras son colectadas repetidamente y el promedio es calculado para cada grupo de datos en forma individual, entonces habr una distribucin de los promedios. El error estndar del promedio se puede calcular para describir la distribucin de esos promedios calculados individualmente:

SD SE = n
SE = error estndar SD = desviacin estndar n = nmero de datos
La evaluacin de una hiptesis depende en gran medida de la habilidad a comparar resultados observados con resultados esperados. Frecuentemente es deseable determinar si un resultado observado es significativamente diferente de un resultado esperado. Estas determinaciones pueden ser estadsticamente calculadas comparando el promedio de grupos experimentales y grupos controles. La significancia del anlisis est basada en la probabilidad de que los resultados observados (grupo experimental) sean debido a la naturaleza de la variabilidad de la poblacin. Pruebas estadsticas de significancia: Ho = hiptesis nula (no existen diferencias entre grupos control y experimental) Ha = hiptesis alterna (de existir diferencias significativas entre grupos control y experimental) Establecer niveles de significancia (a) o la probabilidad de que un error se cometa rechazando la hiptesis nula cuando en realidad es cierta. Generalmente en experimentacin biolgica a = 0.05 (el investigador tiene 95% de confianza de que la Ho no ser rechazada). Tipos de error: Tipo I Ho es errneamente rechazada (de mayor preocupacin en microbiologa debido a que usualmente se desean establecer diferencias entre grupos control y experimental)

Tipo II error en no rechazar H o Entre las pruebas estadsticas comnmente utilizadas para determinar la validez de 2 hiptesis se encuentran prueba t, x (chi cuadrado), ANOVA y otras.

Otros estudios en microbiologa van dirigidos a determinar relaciones entre dos variables. El coeficiente de correlacin puede ser calculado para expresar cuantitativamente el grado de relacin entre dos variables son relacionadas (este valor flucta entre +1 a -1). Un coeficiente de correlacin (r ) que se acerca a -1 expresa una relacin negativa (mientras una variable aumenta, la segunda disminuye proporcionalmente), mientras que cuando r se acerca a +1, esta sugiere una relacin positiva (ambas variables aumentan en valor proporcionalmente).

r = 1.0

r = 0.8

.. . . .. .
r = -0.4

r = 0.6 .

. .

. ... . .. . .. . . .

. .
r = 0.0

. . . .. . .. . .. . . . . .. .

. . . . .. . . .. .. . . . . ..

r = -1.0

..

Diagramas que demuestran varios grados de correlacin entre dos variables.

En otras ocasiones es necesario determinar si existe una relacin entre dos variables. Calcular y definir matemticamente la relacin entre dos variables permite obtener mayor poder de prediccin de una variable si el valor de la segunda es conocido. Esto se logra realizando un anlisis de regresin donde la pendiente de la curva representa el coeficiente de regresin y donde este anlisis trata de minimizar la varianza a un mximo.

PRIMERA PARTE

DESTREZAS BSICAS PARA EL CULTIVO Y MANEJO DE MICROORGANISMOS

PROCEDIMIENTOS ESTANDARES para el cultivo, aislacin y caracterizacin de microorganismos: Diseo y preparacin de medios de cultivo (para ms detalles refirase a Atlas y Parks 1993) i. Selectivos medio diseado para promover el crecimiento de un tipo de microorganismo en preferencia sobre otros ii. Diferenciales medio donde el crecimiento de un grupo en particular de microorganismos crece con una apariencia visible distintiva iii. Enriquecimientos medio lquido de cultivo que resulta en el aumento de un tipo de microorganismo sobre otros tipos de organismos presentes Transferencia/estriados: i. Seleccin de colonias ii. Diluciones en serie

Muestra
1 ml 1 ml

Incubar & Monitoreo

9 ml

9 ml

Micro-Macro-Nutrientes

Estrategias de manejo de microorganismos dependientes de crecimiento

Preservacin de cultivos: En ocasiones es necesario mantener, de forma prolongada, cultivos puros. Usualmente cultivos en medios lquidos o slidos pierden viabilidad en un espacio de varias semanas a pocos meses. Por lo tanto, para el almacenaje de cultivos a largo plazo es necesario recurrir a otros mtodos que permitan mantener estos cultivos viables. Esta tarea no es simple debido al hecho de que diferentes poblaciones poseen diferentes adaptaciones, y requerimientos nutricionales y ambientales. A continuacin se describen dos estrategias que trabajan muy eficientemente para una gran gama de microorganismos: Almacenaje en glicerol , Transferir una alcuota del cultivo en fase exponencial a tubo estril y concentrar por centrifugacin, lavar clulas con solucin de sales minerales (SSM), resuspender clulas en SSM con 15-20% glicerol en tubos de almacenaje, congelar cultivos rpidamente en bao de hielo seco, y almacenar a -20C. Para recobrar el cultivo, simplemente toque aspticamente con su aguja de inoculacin la parte superior de su cultivo congelado y estre sobre un medio slido apropiado. Almacenaje en suelo, Transferir una alcuota del cultivo en fase exponencial a tubo estril y concentrar por centrifugacin, lavar clulas con solucin de sales minerales (SSM), resuspender clulas en SSM e inocular suelo estril; puede almacenar a temperatura ambiente por muchos aos. El tipo de suelo debe ser bajo en materia orgnica, pH neutral y matriz heterognea. Para recobrar el cultivo

toque aspticamente con su aguja de inoculacin la parte superior de su cultivo en suelo y estre sobre un medio slido apropiado. Microscopa: El microscopio es aquel instrumento que magnifica el tamao de un objeto y que permite observar objetos muy pequeos para ser visibles al ojo humano. Con la ayuda del mismo podemos observar y estudiar microorganismos provenientes de diferentes ambientes. Debido a la gran diversidad de tipos de microscopios y aplicaciones, la seleccin del mismo va a depender del tamao del objeto, grado de detalle necesario, naturaleza de especimen y el propsito principal de las observaciones. Entre los microscopios de mayor utilidad en el estudio de microorganismos se encuentran microscopios de luz, fluorescencia, fase, electrnico y confocal. Tincin: Contraste es necesario para discernir entre un objeto y su medio, as como para poder visualizar ultraestructuras. En ocasiones, cuando utilizamos el microscopio de luz es necesario mejorar el contraste entre el especimen y su medio. Esto se puede lograr utilizando tintes como cristal violeta y safranina en procedimientos tales como tincin simple (positiva o negativa) o diferencial (ej. tincin Gram). Entre otras aplicaciones de tincin deberemos reconocer su uso para la observacin de estructuras celulares, tales como la presencia de endosporas, cpsulas y flagelos.
FORMA

Puntiforme

Circular

Filamentoso

Irregular

Rizoide

Espigar

ELEVACION

Plano

Elevado

Convexo

Pulvinado

Umbonado

Umbilicoide

MARGEN

Entero

Ondulado

Lobular

Erodado

Filamentoso

Rizado

Elementos morfolgicos utilizados para la descripcin de colonias: forma, elevacin y mrgenes.

PRIMERA PARTE

MTODOS DE MUESTREO
PARA EL ESTUDIO COMPRENSIVO de los roles microbianos en un ambiente en particular es usualmente necesario recolectar muestras representativas. El objetivo de muestrear es obtener porciones de suficiente material para transportarlo convenientemente al laboratorio, mientras que mantiene y representa el material del ambiente del cual proviene. Por lo tanto, procedimientos de muestreo y sus equipos son componentes importantes del programa de investigacin. Seleccin de estaciones i. Requiere de estudios preliminares y descripcin general del ambiente (ej. un ambiente acutico: profundidad, tipo de sedimentos, etc.) ii. Lugares escogidos debern ser representativos de las diferentes zonas del rea de estudio (ej. ambientes homogneos vs. gradientes) Nmero de muestras i. En trminos prcticos depende de la habilidad para manejar las muestras en un tiempo razonable; precisin estadstica vs. tiempo y esfuerzo necesario para la recoleccin y procesamiento de muestras

ii. Suficiente volumen para anlisis iii. Muestras representativas pueden ser obtenidas conbinando varias muestras durante un periodo de tiempo o conbinando varias muestras de diferentes puntos de muestreo Frecuencia de muestreo i. Depende del objetivo del trabajo

Tipos de muestra
Simples Compuestas representan un lugar y tiempo mezcla de muestras simples de un lugar recolectadas a diferentes tiempos combinacin de muestras simples de varios lugares de muestreo

Integradas

Cantidad y preservacin
Cantidad de muestra: 2-L para la mayora de anlisis qumicos; almacenar diferentes muestras en diferentes envases para anlisis qumicos, microbiolgicos y examinacin microscpica Preservacin: depende de la naturaleza de la muestra, retardar degradacin qumica o biolgica (Tabla 1): Refrigeracin (4C to -20C) Acidificacin (H2SO4, HNO3, pH<2) Filtracin Tiempo de almacenamiento vara con tipo de prueba

Consideraciones generales
Utilizar equipos que no sean hechos de algn material txico a los microorganismos y que stos puedan ser esterilizado Las muestras deben ser manejadas de forma tal que no se deterioren o contaminen antes del anlisis Tomar muestras del lugar de forma precisa y con un mnimo o ninguna contaminacin Lugar de operacin del equipo debe ser aceptable Seguridad

Tabla 1: Recipientes requeridos, tcnicas de preservacin y tiempos de almacenaje para anlisis qumico-fsico del ambiente. Tiempo mximo de 2 almacenaje 14 das 28 das

Parmetro Alcalinidad Amonia

Preservativo

Refrigerar 1 a 4C Refrigerar 1 a 4C y H2SO4 pH<2 No Requiere Refrigerar 1 a 4C Refrigerar 1 a 4C Refrigerar 1 a 4C y H2SO4 pH<2 Refrigerar 1 a 4C y H2SO4 pH<2 HNO3 pH<2 H2SO4 pH<2 HNO3 pH<2 Refrigerar 1 a 4C Refrigerar 1 a 4C Refrigerar 1 a 4C Filtrar y refrigerar 1 a 4C No Requiere No requiere No Requiere

Cloruros Conductividad Demanda Bioqumica de Oxgeno Demanda Qumica de Oxgeno

28 das 28 das 48 horas 28 das

Fosfato Total

28 das

Dureza Metales Nitrato Nitrito Sulfato Ortofosfatos Oxgeno Disuelto pH Temperatura

1 2

6 meses 6 meses 48 horas 48 horas 28 das 48 horas Analice al momento Analice al momento Analice al momento

Preservacin de muestras debe ser realizado inmediatamente. Las muestras deben ser analizadas lo antes posible. Los tiempos sugeridos representan tiempos mximos a los cuales los anlisis se consideran an vlidos. Es posible que algunas muestras no sean estables por el periodo recomendado.