Micro

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
manual de prcticas
laboratorio
MICROBIOLOGA
GENERAL
Mara de los Angeles Aquiahuatl Ramos
Mara de Lourdes Prez Chabela
Casa abierta al tiempo
UNIDAD IZTAPALAPA
DERECHOS RESERVADOS 2004, Universidad Autnoma Metropolitana (Mxico). Prohibida la reproduccin de esta obra as como la distribucin y venta fuera del mbito de la UAM. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Rector General
Dr. Luis Mier y Tetn Casanueva
Secretario General
Dr. Ricardo Sols Rosales
UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA - Iztapalapa
Rector
Dr. Jos Lema Labadie
Secretario
Mtro. Luis Javier Melgoza Valdivia
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
Director
Dr. J. Gerardo Saucedo Castaeda
Secretario Acadmico
M. en C. Arturo L. Preciado Lpez
Departamento de Biotecnologa
jefe del Departamento
Dr. J. Mariano Garca Garibay
ISBN 970-31-0141-0
Primera Edicin: 2004
Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa
Av. San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina.
Del. Iztapalapa, C.P. 09340 Mxico, D.F.
Impreso y hecho en Mxico
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de los Angeles Aquiahuatl Ramos
Mara de Lourdes Prez Chabela
laboratorio
MICROBIOLOGA
GENERAL
Agradecemos al Director de la Divisin de Ciencias Biolgicas y de la
Salud Dr. Gerardo Saucedo Castaeda por todo el apoyo para la publica-
cin de este manual de prcticas del laboratorio de , *: :: ^
GENERAL
Al Sr. Jorge Lodigliani por su apoyo en el procesado de las fotografas.
Al Dr. Alfonso Totosaus y al Sr. Wilfrido Rodrguez por su ayuda en el
diseo de las figuras.
A toda la gente que revis este manual, que con sus aportaciones enri-
quecieron este trabajo.
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PRESENTACIN
RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE
PRCTICA # 1
Preparacin y esterilizacin de materiales y medios de cultivo
Preparacin del material de vidrio y medios de cultivo
Esterilizacin de materiales y medios de cultivo
Preparacin de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo
Prueba de esterilidad de materiales
PRCTICA # 2
Preparacin, fijacin y coloracin simple de frotis
Preparacin de frotis
Fijacin del frotis
Tincin simple
Observacin al microscopio
PRCTICA # 3
Tincin diferencial de Gram y tinciones selectivas
Tincin diferencial de Gram
Tincin selectiva de endosporas
Tincin negativa para observacin de cpsulas
Observaciones al microscopio
PRCTICA # 4
Mtodos de cultivo y aislamiento de bacterias
Tcnica de estra cruzada
Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo
Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos
Condiciones de incubacin
PRCTICA # 5
Mtodos de cultivo y descripcin morfolgica de hongos
Siembra de hongos
Descripcin macroscpica de levaduras y mohos
Descripcin microscpica de levaduras
Descripcin microscpica de mohos en montaje con cinta adhesiva
PRCTICA # 6
Pruebas de diferenciacin bioqumica
Tcnica de Inoculacin en cajas de Petri
Tcnicas de Inoculacin en tubos
Evaluacin de actividades metablicas
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PRCTICA # 7
Mtodos de cuantificacin de microorganismos
Tcnica turbidimtrica
Tcnica de cuenta directa en cmara de Neubauer
Tcnica de dilucin y siembra en placa
PRCTICA # 8
Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano
Efecto de la Temperatura
Efecto del pH
PRCTICA # 9
Efecto de la actividad de agua en el crecimiento microbiano
Efecto de la presin osmtica y actividad de agua (aw) en hongos y bacterias
Efecto de la desecacin
PRCTICA # 10
Curva de crecimiento bacteriano
Inoculacin e incubacin del cultivo
Tratamiento de las muestras
BIBLIOGRAFA GENERAL
Anexo 1
PREPARACIN DE SOLUCIONES Y COLORANTES
105 Anexo 2
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
115 Anexo 3
ATLAS DE PRUEBAS BIOQUMICAS
La Microbiologa, es una ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas de
la Biologa. El estudio de los microorganismos se inici a partir de que Antonie van
Leeuwenhoek en 1670 invent el microscopio, y que a partir de los estudios de Luis
Pasteur en 1876, se logr el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos
como actores de una gran diversidad de procesos.
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de en-
fermedades en plantas, animales y humanos tambin es cierto que desde la
antigedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de
produccin de alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre
otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas reas de inves-
tigacin bsica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacutica.
El objetivo general del curso prctico de Microbiologa General es que el alumno se
inicie en el conocimiento de la biologa bsica de los microorganismos, en sus
caractersticas morfolgicas, nutricionales de crecimiento, control y que ad-
quiera las habilidades necesarias para su manipulacin en el laboratorio.
Este manual est dirigido a estudiantes que iniciarn su experiencia en el manejo de
los microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al
principio del mismo una serie de recomendaciones relacionadas con las reglas
generales del laboratorio y los principales procedimientos que el estudiante
deber aprender, para que manipule en forma adecuada a los microorganismos
y garantizar tanto su seguridad como la de sus compaeros.
Este manual contiene 10 prcticas, diseadas para que el estudiante se familiarice
gradualmente con los procedimientos de cultivo y observacin de bacterias y
hongos. El orden de presentacin, corresponde al programa del curso terico
trimestral de Microbiologa General, que forma parte del plan de estudio de las
carreras de Ingeniera de los Alimentos e Ingeniera Bioqumica Industrial im-
partidas en la UAM-Iztapalapa.
En cada prctica se presentan los Objetivos y una breve Introduccin para facilitar la
comprensin de los mismos, despus se indican los Materiales necesarios y
Procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se com-
plementan con figuras y esquemas.
Posteriormente, en cada prctica se proponen formas de presentacin de los resulta-
dos en cuadros, para que el alumno recopile sus observaciones. Tambin se inclu-
yen preguntas en forma de cuestionarios que el estudiante debei resolver con-
sultando los materiales bibliogrficos sugeridos al final de este manual.
Tambin se presentan tres Anexos que contienen las indicaciones para la preparacin
de soluciones y colorantes ( anexo 1) y de medios de cultivo ( anexo 2), necesa-
rios para la realizacin de cada una de las prcticas; as como uno ( anexo 3) de
fotografas ilustrativas de algunos procedimientos y pruebas bioqumicas de
diferenciacin microbiana.
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manual de prcticas del
Consideramos que este material puede ser de gran ayuda para los profesores y alumnos de la
UAM en el curso de Microbiologa General, est elaborado de acuerdo a la infraestructu-
ra de los laboratorios y a la programacin trimestral del curso, con sesiones de 4 horas/
semana.
Dra. Ma. de Los Angeles Aqulahuatl
Dra. Ma. de Lourdes Prez Chabela
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RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIA!*
Reglas de laboratorio
1. Durante las sesiones, siempre deber usar una bata de laboratorio bien abotonada, que deber quitarse
antes de abandonar el laboratorio.
2. No deber sacar del laboratorio ningn equipo, medios o cultivos microbianos.
3. Evitar la acumulacin sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la prctica de laboratorio.
Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor.
4. Se prohibe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.
5. Se prohibe fumar, aplicarse cosmticos o tocarse la cara con las manos o algn otro objeto. Se deber lavar
meticulosamente las manos con jabn y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salga por breves
periodos.
6. Por seguridad no debei pipetear oralmente ningn tipo de cultivos microbianos, esta actividad deber
realizarse con pipetas accionadas de forma mecnica o automtica, tratando de evitar la formacin de
aerosoles.
7. No se admitirn visitas personales que distraigan la atencin y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo
que se realiza.
Procedimientos de laboratorio
1. Antes y despus de cada sesin pictica los alumnos debern limpiar las mesas de trabajo con el desinfec-
tante que se le proporcionar para este fin.
2. Cuando se utilice el mechero, este deber colocarse alejado del microscopio y otros equipos as como de
sus cuadernos o prendas de vestir.
3. Al concluir cada sesin el estudiante deber asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contami-
nados sean colocados en recipientes especficos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicar
el profesor.
4. Siempre deber dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analticas,
autoclave, potencimetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.
5. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deber notificarlo de inmediato al
profesor. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deber conservar la
calma y adems de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento:
a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersin
b. Poner abundante solucin desinfectante sobre las toallas
manual de prcticas del LABORATORIO PE NIICROBlOLOGt**
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c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptculo destinado a la
eliminacin de materiales contaminados.
Materiales indispensables en cada sesin de laboratorio
1. Bata de laboratorio limpia y con botones
2. El protocolo de la prctica y bitcora de laboratorio
3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar, marcador indeleble o etiquetas pequeas.
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Preparacin y esterilizacin de materiales
y medios de cultivo
Objetivos introduccin
Que el alumno conozca los principios Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cam-
generales de las tcnicas de estril!- bios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido
zacin de materiales de vidrio y me- adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de
dios de cultivo de uso comn en Mi- hbitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo fsi-
crobiologa. Observar el efecto de co y qumico. o
trol de la contaminacin microbiana Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfeccin y este-
en el laboratorio. rilizacin para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilizacin es
un mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismo y que
asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras
que la desinfeccin es un proceso que solamente elimina formas
vegetativas de los microorganismos.
La esterilizacin con calor seco y hmedo son los procedimientos de
mayor utilizacin en Microbiologa. El calor seco desnaturaliza las
enzimas y destruye a los microorganismos por oxidacin, por ejem-
plo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno
a 150-180C durante 2 horas. Estos mtodos se aplican principal-
mente en la esterilizacin de asas de inoculacin y todo tipo de
material de vidrio y quirrgico.
Los procesos con calor hmedo se aplican para esterilizar medios de cul-
tivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el ms
recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a
presin para alcanzar temperaturas de 121 C. El material se deja a
esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destruc-
cin de endosporas, que son las estructuras bacterianas ms resis-
tentes al calor.
Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como
las soluciones de vitaminas, aminocidos, etc. se esterilizan por
filtracin en membranas estriles de 0,2 mieras de dimetro y para
el caso de materiales plsticos es recomendable el uso de gases
como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies
generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos
qumicos en forma lquida como: los fenoles, compuestos
cuaternarios de amonio ( alquildimetil bencilamonio), formaldehdo,
alcoholes, halgenos y detergentes.
Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas de uso,
los sistemas de filtracin son muy eficientes y rpidos para la este-
rilizacin pero slo se aplican en pequeos volmenes. Los fenoles
y compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos para la
desinfeccin de superficies pero son muy corrosivos. Los
detergentes y los alcoholes tienen actividad limitada contra espo-
ras bacterianas y algunos virus por lo que slo son desinfectantes.
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m a n u a l d e p r c t i c a s d e l - * . . ' . ; . , ' - . * . , : ; . . . ? . ::* ' , < ; > <* . , - r - r . r - - "* ' \
(O
a 1 potencimetro
1 horno de calor seco
Materiales
7 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con tapn de baquelita
3 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin tapn de baquelita
9 cajas de Petri de vidrio
3 pipetas de 1 o 2 mL
3 pipetas de 10 mL
1 pipeta Pasteur
3 matraces Erlenmeyer de 250 mL
1 parrilla de calentamiento con agitacin
1 autoclave
1 mechero Fisher
1 incubadora a 35C
1 hisopo estril, algodn y gasa
papel manila o estraza para envolver
Caldo nutritivo (Anexo 2.1)
Medio de agar nutritivo (Anexo 2.2)
Medio de agar papa dextrosa PDA (Anexo 2. 6)
Medio mnimo de sales (Anexo 2.3 )
Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7
Procedimiento
El profesor explicar los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiologa, enfatizando en la
desinfeccin de reas as como en la preparacin y esterilizacin de los medios de cultivo y materiales necesarios
para el trabajo cotidiano con microorganismos. Tambin har las demostraciones necesarias para que el estudian-
te aprenda a envolver los materiales, as como su manejo en condiciones aspticas.
Preparacin del material de vidrio y medios de cultivo
1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobilln y detergente. Enjuagar con abundante agua
corriente.
2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una piceta, por las paredes interio-
res. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningn
otro medio.
3. Una vez seco el material, se proceder a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los
tubos y matraces se elaborarn tapones de algodn y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los
que finalmente se les colocar un capuchn de papel.
4. Preparar 20 mL de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y ajustar el pH a 6.5-7.0 en un
potencimetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solucin de HCI 0.1 M o solucin de NaOH
0.1 M, en caso de que el pH sea ms alcalino o cido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo
con tapn de baquelita que debern cerrar sin llegar al tope.
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5. Preparar 120 mL de Agar Nutritivo ( AN), calentar la mezcla en una parrilla con agitacin constante hasta
ebullicin, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 mL de medio en tres tubos
con tapn de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto se
esteriliza en el autoclave.
6. Preparar 120 mL de medio de cultivo Papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, ajustar
el pH del medio a 5.0-5.6. Colocar un magneto de agitacin y calentar hasta ebullicin durante 1 minuto;
cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 mL de medio en tres tubos que se
taparn con tapn de algodn y gasa. El resto se esteriliza en el autoclave.
7. Preparar 120 mL de medio de cultivo Mnimo de sales ( MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL
Esterilizacin de materiales y medios de cultivo
1. Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocaran en horno a 150 C durante 2 horas. Despus de sacarlas,
dejarlas enfriar y abrir los paquetes nicamente en rea asptica.
2. Los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave de acuerdo a las siguientes instrucciones:
a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario aadir agua
destilada.
b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y materia-
les en la canasta del autoclave y colocarla dentro.
c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posicin encontrada y esperar a que salga el vapor
de agua por el orificio de purgado. Despus cerrar este orificio con la vlvula de seguridad.
d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121 C o 15 Ibs de presin revisando continuamente la
escala del manmetro. Una vez alcanzada esta temperatura deber bajarse el nivel de calentamiento mo-
viendo la perilla de control al nivel medio o bajo.
e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos
f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presin al valor de "0". Quitar la vlvula de seguridad y con la ayuda
de guantes de asbesto o una jerga hmeda abrir cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrs para
evitar quemaduras por la salida del vapor.
Preparacin de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo
1. Los tubos con medios de cultivo con agar, se debern colocar en una superficie inclinada de tal forma que el
medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.
2. Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfren a una temperatura
aproximada de 40-50 C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin
sentir un calor excesivo.
3. Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacan en las
cajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL) en zona asptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar.
4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidado-
samente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsa de plstico limpias.
5. Guardarlas en refrigeracin hasta 24 horas antes de utilizarlas.
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manual de prcticas del LABORATORIO PE ICIlCIBiOLCIGJI SEI AL
Prueba de esterilidad de materiales
1. Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubacin
ajustada a 30 C durante 24-48 horas.
2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparicin de turbidez,
nata superficial y/o depsito de material en el fondo de los tubos con medio lquido; as como la formacin
de colonias microbianas en la superficie de medios slidos.
3. Si no hay contaminacin de los medios, se abrir una de las cajas de Petri de cada medio durante 1 minuto
en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetar como"al aire".
(0
CQ
0
4. La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetar "en
rea asptica".
5. La tercer caja se conservar sin abrir y se etiqueta como "control".
Resultados
A. Hacer la descripcin morfolgica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios de cultivo
( AN, PDA y MM) y con los distintos tratamientos en relacin a la caja control.
B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, ( +) poco crecimiento, ( ++) crecimiento
regular y ( +++) crecimiento abundante.
C. Discuta los resultados y determine si la esterilizacin en el autoclave y horno fue adecuada, as como el
manejo de los materiales.
Cuadro 1
Descripcin morfolgica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo.
MEDI O
DE CULTIVO
AGAR
NUTRITIVO
MNI MO
DE SALES
PAPA DEXTROSA
AGAR
Abierta al aire
Abierta en rea
asptica
Control
a
t
A
a
1)
Cuestionario
Cules son los mtodos de esterilizacin ms utilizados en Microbiologa? En que tipo de materiales se
aplica cada uno?
2) Explique cules son las diferencias entre los procesos de esterilizacin, desinfeccin y asepsia. Cmo se
relacionan estos procedimientos con la pasteurizacin?
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Preparacin, fijacin y
coloracin simple de frotis
Objetivos
Que el alumno aprenda las tcnicas
de preparacin de frotis, de fijacin
y coloracin ms utilizadas en el es-
tudio microscpico de cultivos
bacterianos, obtenidos de medios
slidos y lquidos. Que identifique las
principales formas bacterianas y la
importancia de las tinciones simples
en la caracterizacin morfolgica de
estos microorganismos.
Introduccin
Debido al pequeo tamao de la mayora de los microorganismos, se
requiere de un microscopio ptico, ya sea de campo claro o de campo
oscuro para hacer la descripcin morfolgica de stos. El microscopio de
uso ms comn es el de campo claro, en el que la observacin de clulas
vivas es limitada debido a que las clulas son incoloras y permiten el paso
de una gran cantidad de luz.
La observacin de frotis teidos es ms recomendable. El frotis se prepara
haciendo una extensin de los microorganismos sobre una superfi-
cie transparente, en la cul se fijan y tien los microorganismos.
De acuerdo al nmero de soluciones colorantes y a los objetivos de
estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son:
simple, diferencial, negativa y selectiva.
Los frotis de cultivos lquidos se debern fijar con alcohol para evitar resi-
duos del medio, que al quemarse darn interferencias en las obser-
vaciones y los de colonias de medios slidos se fijan generalmente
con calor. Despus de la fijacin, los frotis son teidos con diferen-
tes colorantes sintticos derivados de anilina.
Los colorantes ms utilizados son sales formadas por iones coloridos car-
gados conocidos como cromforos. Por ejemplo:
Cloruro de Azul de metileno Azul de metileno* +
( Cromoforo)
ci-
Si el cromoforo es un ion positivo el colorante es de tipo bsico, pero si la
carga es negativa ser de tipo cido. La mayora de las bacterias son
teidas por colorantes bsicos, que permean la pared celular y se
adhieren por enlaces inicos dbiles a molculas con cargas nega-
tivas de la clula bacteriana. La tincin de las bacterias con azul de
metileno, es un ejemplo de tincin simple que facilita la observa-
cin de forma, tamao y arreglo de las clulas.
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Materiales
1 Probeta de 100 mL
1 Vaso de precipitados de 100 mL
1 mechero
1 asa de siembra
5 Portaobjetos
Piceta con agua destilada
Microscopio compuesto de campo claro
Azul de metileno alcalino ( Anexo 1.2)
Alcohol etlico al 70% ( Anexo 1.7)
Fenol al 2% ( Anexo 1.9)
(0
CQ Aceite de inmersin
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Procedimiento
El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de: Escherichla col, Streptococcus sp.,
Staphylococcus sp., Badllus subtilis, Klebsi'ella sp. y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparar frotis de
cada cepa obtenida de cultivo slido y otros de cultivo lquido, los cuales fijar y teir con azul de metileno.
El profesor explicar los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminacin.
Preparacin de frotis
1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos (Figura 1).
2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.
3. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Despus
acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapn y flamear rpidamente la boca del mismo. Introducir
el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.
4. Para el caso de cultivos lquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en
un rea circular de 2 cm. de dimetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis
al aire y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2-3 veces ms.
5. Si el cultivo es de medio slido, previamente se colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua
destilada en la que se mezcla una pequea muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del
paso 3. Extenderla suavemente y dejar secar al aire.
Fijacin del frotis
1. Fijar los frotis de cultivos lquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire ( hacer esto
en zonas alejadas al mechero).
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2. Los frotis de cultivos slidos, completamente secos se fijarn con calor. Para esto se pasai el frotis rpida-
mente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero.
3. Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no
hubo sobrecalentamiento.
Tincin simple
1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.
2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piceta con agua
destilada.
3. Dejar secaral aire
Marcar el rea por debajo del portaobjeto
CULTIVO SLIDO CULTIVO LIQUIDO
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Coloque 1 o 2 gotas de agua
Colocar 1 o 2 asadas de medio de
cultivo con asa estril
Con asa estril tomar una
muestra de la colonia y
mezclarla con el agua
Distribuir en la zona marcada
Dejar secar al aire
Dejar secar al aire. Repetir los
procedimientos anteriores dos veces
Pasar rpidamente sobre la
flama del mechero
Fijar con 2 gotas de alcohol, y
dejar secar al aire
Figura 1. Preparacin y fijacin de frotis bacterianos a partir de cultivos slidos y lquidos
Observacin al microscopio
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observacin, siguiendo las indicaciones del profesor.
3. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posterior-
mente pasar al de 40X. Para la observacin con el objetivo de 100X, colocar previamente una pequea gota
de aceite de inmersin sobre la preparacin.
4. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de
aceite y evitar incrustaciones que daan estos sistemas.
Resultados
A. Reportar las observaciones de forma, agrupacin y tamao relativo de cada uno de los microorganismos en
el cuadro de resultados.
B. Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura.
24
Cuadro 2
Observaciones microscpicas de frotis de cultivos bacterianos
Cultivo: Lquido
Aumento total:
Forma: (cocos, bacilos, etc.)
Agolpamiento de las clulas
(solos, pares, cadenas, etc.)
Tamao:
Cultivo: Slido
Aumento total:
Forma: (cocos, bacilos, etc.
Agrupamiento de las clulas
(solos, pares, cadenas, etc.)
Tamao:
Escherichla coll
Streptococcus sp.
0)
(0
t
(0
a
Cuestionario
1. Investigue cules son las estruauras celulares o molculas responsables de la tincin simple realizada. De
ejemplos de otros colorantes que podran utilizarse.
2. Por qu se recomienda fijar los frotis de cultivos lquidos con alcohol y no con calor? Por qu se deben
poner varias veces muestras del cultivo lquido y slo una muestra de cultivos slidos al preparar los frotis?
25
3. Cules son las principales precauciones de manejo del microscopio y por qu se debe utilizar el aceite de
inmersin al hacer el estudio microscpico de bacterias?
4. Cules son las desventajas o limitaciones de la tincin simple?
a
o
5. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la preparacin de frotis?
6. Bibliografa consultada
Referencias bibliogrficas
Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Practicas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.
johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3
a
- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. USA.
Practical Handbookof Microbiology. William MO'Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA.
CRC Press, 1989.
Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
z
' -
s
' , - ' -
\ 0
Tincin diferencial de Gram y
tinciones selectivas
Objetivos
Que el estudiante clasifique algunas
especies bacterianas en Gram positi-
vas o Gram negativas de acuerdo a la
tincin de Gram. Que observe estruc-
turas bacterianas especiales, como las
endosporas y cpsulas con tinciones
selectivas. Que comprenda la impor-
tancia que tienen estas tinciones para
la caracterizacin e identificacin de
las bacterias.
introduccin
La tincin propuesta por el mdico dans Christian Gram en 1884, es una
de las tinciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, que clasifi-
ca los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y
Gram negativas. El mtodo se fundamenta en el hecho de que el coloran-
te primario (cristal violeta) tie por igual a todas las bacterias, pero la
combinacin con el colorante es ms permanente en los gram positivos.
Para establecer la diferenciacin en estos dos grupos, se aplica un disol-
vente del colorante primario que no tiene efecto sobre el grupo de
microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina de
aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto
completamente decolorados. En estas circunstancias, sera muy di-
fcil su observacin por lo que es preciso tratarlos con otro colorante
llamado secundario, como la safranina. Este colorante no modifica
el color de los microorganismos que haban retenido el color prima-
rio, pero tie a los microorganismos decolorados.
Estas diferencias de tincin de las bacterias se explican por cambios en la
composicin qumica y estructura de las paredes celulares, que faci-
litan la retencin o eliminacin del colorante primario despus del
proceso de decoloracin.
Otras tinciones que permiten obtener mayor informacin son la negativa
y la selectiva. La tincin negativa facilita las observaciones de la
morfologa y tamao de las bacterias sin alteracin por efecto del
calor as como de estructuras especiales, como la cpsula de algu-
nas especies bacterianas. La cpsula tambin llamada glicoclix es
una estructura externa a la clula, formada de polisacridos o
polipptidos, que confiere proteccin a las bacterias contra la dese-
cacin y la fagocitosis.
La extensin sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla
de las bacterias con tinta china o nigrosina, permite observar en el
microscopio estructuras especiales como son las cpsulas, que apa-
recen como una zona clara que rodea la clula bacteriana en un
fondo obscuro.
Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como
las endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su
presencia, forma y localizacin son importantes criterios de clasifi-
cacin taxonmica.
Adems, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas
especies son microorganismos patgenos de gran toxicidad, su de-
teccin en microbiologa alimentaria y mdica adquiere gran inters.
arabiom:
Materiales
1 Probeta de 100 mL
1 Parrilla de calentamiento
1 Mechero
5 Portaobjetos
1 Piceta con agua destilada
Cristal violeta ( Anexo 1.3)
Safranina ( Anexo 1.8)
Lugol ( Anexo 1.5)
Solucin de alcohol-acetona ( Anexo 1.6)
en Verde de malaquita ( Anexo 1.4)
Tinta china
Fenol 2% ( Anexo 1.9)
Aceite de inmersin
Microscopio compuesto de campo claro
Procedimiento
El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de: Escherichia coll, Streptococcus sp.,
Staphylococcus sp., Badllus subtills y Klebsiella sp.
El estudiante preparar frotis de cultivo slido y de cultivo lquido de cada microorganismo y aplicar la tincin
de Gram.
Tambin realizar la tincin seieaiva de endosporas en un frotis fijado al calor de Badllus subtilis y la tincin
negativa en cultivos de K/ebsfef/a sp.
Tincin diferencial de Gram
a) Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto
b) Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante
c) Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos.
d) Lavar cuidadosamente el frotis con agua.
e) Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya ms
tintura.
f) Inmediatamente lavar con agua.
g) Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos.
h) Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar
secar al aire.
i
Tincin selectiva de endosporas
a) Colocar un pequeo trozo de papel filtro sobre el frotis de Bacillus subtilk (Figura 2).
b) Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparacin.
c) Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullicin.
d) Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco ms s es necesario) y eliminar
el colorante con agua destilada.
e) Cubrir con safranina durante 30 segundos.
f) Lavar nuevamente y dejar secar al aire.
t
a
"O
(a)
(b)
(e)
Figura 2. Tincin selectiva de endosporas bacterianas
Tincin negativa para observacin de cpsulas
a) Colocar una pequea gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto una gota del
cultivo lquido de Klebsiella sp. (Figura 3). Si se trata de un cultivo slido, hacer una suspensin del micro-
organismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china.
b) Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular en ngulo de
45 sobre la muestra.
I
31
10
a
o
c) Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla.
d) Dejar secar al aire.
(a)
(d)
Figura 3. Tcnica de tincin negativa
Observaciones al microscopio
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posterior-
mente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequea gota de
aceite de inmersin sobre la preparacin.
3. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso
de aceite y evitar incrustaciones que daan a estos sistemas.
Resultados
A. Reportar las observaciones de forma, agrupacin, color y tamao relativo tal como se indica en el Cuadro 3
de resultados. Hacer los dibujos de la morfologa de cada uno de los microorganismos y colorearlos.
B. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.
32
Cuadro 3
Descripcin microscpica de cultivos baaerianos
Descripcin del cultivo: (lquido
o slido, edad del cultivo, etc.)
Aumento total:
o
I
o
cu
t
ti
a
o
Forma: cocos, bacilos
Agolpamiento de las clulas
Tamao:
Reaccin de Gram
TINCIN DE ENDOSPORAS
Aumento total:
Badllus subtills
Streptococcus sp
Forma: cocos, bacilos
Agrupamiento de las clulas
Tamao:
TINCIN DE CPSULA
Aumento total:
Klebsiellasp. Streptococcus sp
Cuestionario
1. Explique en forma completa la teora que explica la tincin de Gram. Investigue otros dos ejemplos de
tincin diferencial.
33
2. Cules son las fuentes de error ms comunes en la tincin de Gram?
3. Explique que reaccin de Gram darn los cultivos de levaduras? Estos resultados tendrn la misma impor-
tancia que para las bacterias? Por qu?
4. Explique el fundamento de la tincin de endosporas. Por qu se debe calentar la preparacin? Que dificul-
tades se tendran si no se adiciona la safranina al final de la tincin?
5. Explique el fundamento de la tincin negativa realizada en la prctica.Qu tipo de informacin se obtiene?
Investigue otra tcnica de tincin selectiva que permita observar estas estructuras bacterianas.
Johnson T.R. and C L. Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3
a
Company, Inc. EEUUA.
Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiologa. Cuarta Edicin. McGraw Hill Interamericana.
Mxico.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods ( 4th Edition) Edited by Francs
Pouch Downes and Keith Ito, 2001.
Practical Hahdt^ic of Microbiology. William M O'Leary, Cornell Medical College, New York, New York,
USA. CRC Press, 1989.
j
^ - w'V
^
Mtodos de cultivo y
aislamiento de bacterias
Objetivos Introduccin
Que el alumno conozca las diferen- Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio
tes tcnicas de aislamiento en me- para caracterizar su crecimiento, hacer su identificacin y determinar sus
dios de cultivo slido para la obten- actividades metablicas. Un medio de cultivo es una solucin acuosa de
cin de cultivos puros de bacterias, diferentes compuestos que contiene todos los elementos indispensables
Que el estudiante prepare medios de que requieren los microorganismos para crecer,
cultivo de uso general, diferenciales
y selectivos para el cultivo de dife- Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios lquidos
rentes especies bacterianas. (caldos) o solidificados con agar para su propagacin y/o conserva-
cin, as como para estudiar sus caractersticas de crecimiento. Es im-
portante recordar que la inoculacin de los microorganismos en los
medios de cultivo, siempre debelan realizarse en zona asptica (cerca
del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan
la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes.
Las tcnicas de aislamiento, permiten la obtencin de microorganismos a
partir de muestras complejas ( suelo, agua, alimentos, etc.) en las
que hay una gran diversidad microbiana, as como para comprobar
la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros estn forma-
dos por un solo tipo de microorganismo; y son indispensables para
conocer las caractersticas morfolgicas, propiedades de tincin,
actividad bioqumica, patogeniddad, sensibilidad a antibiticos e
identificacin de las especies microbianas.
El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por mtodos de
dilucin, en medios slidos por estra en placa o en medios lqui-
dos. En el primer caso se considera que cada clula bacteriana que
se separa dai origen a una poblacin que formar una colonia ca-
racterstica, visible a simple vista.
La limitacin principal de estas tcnicas de dilucin, es que no es prctica
para el aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo de
inters se encuentra en pequeas cantidades, donde solamente se
obtendrn las bacterias dominantes.
Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, se aplican m-
todos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que con-
tienen nutrientes especiales, antibiticos, altas concentraciones de
sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura para favorecer el
crecimiento del microorganismo de inters y se conocen como se-
lectivos o de enriquecimiento.
En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros componen-
tes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. para distinguir espe-
cies bacterianas diferentes por la forma en que metabolizan los
sustratos que se manifiesta por cambios en la apariencia o modifi-
cacin del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como
medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterizacin e
identificacin de especies bacterianas.
o
i
i
8.
o
manual de prcticas del LABORATORIO J MICROBIOLOGA GENERAL
_t
Materiales
3 cajas de Petri con Agar nutritivo (Anexo 2.2)
2 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB
(Anexo 2.3)
2 cajas de Petri con Agar para Estafilococos 110 (Anexo
2.5)
2 cajas de Petri con Medio Mnimo de sales (Anexo 2.3)
1 tubo con agua destilada estril
2 tubos con Caldo Nutritivo (Ver Anexo 2.1)
4 tubos con Agar Nutritivo (Ver Anexo 2.2)
1 Mechero
t 1 Asa de i nocul aci n
0
1 Parrilla de agi t aci n
1 Autocl ave
Procedimiento
El profesor proporcionar cultivos puros de Bacillussubtilis, Escherichia col, Staphylococcusaureus, Pseudomonas
fluorescens, Klebslella sp. y Streptococcus sp.
Tambin les proporcionar una muestra problema por equipo (con dos microorganismos diferentes) en la que
practicarn la tcnica de aislamiento por estra cruzada.
Tcnica de estra cruzada
a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el asa
previamente flameada y fra, inocular la muestra haciendo 4-5 estras simples muy juntas de lado a lado
sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja (Figura 4).
b) Flamear el asa de inoculacin y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y
enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estras recin hechas.
c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estras y hacer un segundo grupo de estras
en el segundo cuadrante como en el caso anterior.
d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el ltimo cuadrante, no se
deber flamear el asa de siembra y se har una estra ms abierta ( simple).
Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo
1. Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los dos tubos con caldo Nutritivo y en tubos con agar
nutritivo inclinado.
2. Sembrar con el asa extendida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con agar nutritivo solidificado en
forma recta (Figura 5).
.
o
o
I
cu
a
0)
Figura 4. Aislamiento de bacterias por estra cruzada en placa
(a)
(b)
Figura 5. Siembra de medios con agar por estra simple (a) en tubos inclinados y por picadura
(b) en tubos solidificados en forma recta.
Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos
1. Dividir en tres partes, una caja de Petri con EMB Agar, otra con Agar 110 y una de MM. Sembrar en cada parte
un cultivo puro diferente por estra simple.
2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estra cruzada la muestra
problema.
39
Condiciones de incubacin
1. Incubar las cajas en forma invertida a 35C durante 24 horas. De las cajas inoculadas por estra cruzada,
seleccionar la colonia ms aislada (generalmente del cuarto cuadrante). Transferir una pequea muestra de
esta colonia a tubos inclinados con agar nutritivo.
2. Incubar los tubos a 35C durante 24-48 horas. Observar la aparicin de colonias y reportar la forma en que
se distribuyen a lo largo del tubo.
Resultados
A. Recopilar la informacin de la caracterizacin colonial de cada cepa en los cuadros 4 y 5.
ce
0
B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema.
40
Cuadro 4
Morfologa colonial de cultivos bacterianos
Aislamiento por Estra
cruzada
Forma:
Color:
Tamao (mm):
Borde-.
Superficie:
Aspecto:
Elevacin:
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
Siembra en medios
selectivos y diferenciales:
Microorganismo 1:
Forma:
Color:
Tamao (mm):
Elevacin:
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
Escherichla col i
MEDKDEMB
Streptococcus sp
MED
(j
0110
MUESTRA PROBLEMA
MEDIO fMNIMO
o
(0
a
o
Nota: La descripcin colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios
Forma: circular, irregular, filamentosa o rizoide
Borde: entero, lobulado, aserrado
Superficie: lisa o rugosa
Aspecto de la colonia: hmeda, seca, butirosa
Elevacin: convexa, plana, hundida
Luz transmitida: translcida, opaca
Luz reflejada: brillante, mate
Consistencia: dura, blanda, mucoide
41
Cuadro 5
Descripcin morfolgica de cultivos puros en tubos de cultivo
Tubos inclinados de
Agar Nutritivo
w
\y
w w
Crecimiento: arborescente,
filiforme, rizoide, disperso,
puntiforme
Color:
ultivo en tubo de
Caldo Nutritivo
Crecimiento: superficie
como pelcula, como sedi-
mento, turbidez en todo
el tubo
Color:
Tubos rectos de
Agar Nutritivo
r~\
Crecimiento: en forma de
pelcula superficial, a lo
largo de la picadura,
solo en el fondo
Color:
i-
Cuestionario
1. Que es el agar y de donde se obtiene? Cules son los nutrimentos que proporciona a los microorganismos?
2. Cul es la composicin qumica de los medios EMB, 110 y MM? Cules son los componentes o propiedades
responsables de su funcin como medios selectivos o diferencales?
O
|
o
I
I
3. Porque el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias? Proponga algunas sustan-
cias que se le agregaran para hacerlo selectivo para bacterias Gram negativas?
4. Cul es la informacin que se obtiene de las siembras de cultivos barterianos en tubos con agar inclinado
y en tubos con agar solidificado en forma recta?
manual de prcticas del LABORATORIO PE MlCRClBiCiLClGJA GEliERAL
_k
Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prcticas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods ( 4th Edition). Edited by Francs
Pouch Downes and Keith Ito, 200.
Practical Handbook of Microbilogo CRC Press, 1989. William M O'Leary, Cornell Medical College, New
York, New York, USA.
Bergey's Manual of Determinative Barteriology. 9th edition, The Williams and Wiikins Co., Baltimore, USA.
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA),
American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
Ed. ( 1991).
Mtodos de cultivo y
descripcin morfolgica de hongos
5
(0
a
o
"O
Que el alumno aprenda las tcnicas Los hongos son organismos eucariticos y de mayor tamao que las bac-
de cultivo y manipulacin de diferen- terias, se distinguen de otros eucariotes como los animales por ser inm-
tes tipos de hongos. Que el estudian- viles y de las algas y plantas por carecer de pigmentos fotosintticos.
te conozca las principales caracters-
ticas morfolgicas (macroscpica y Son de nutricin hetertrofa, es decir dependen de nutrientes orgnicos
microscpicas) de los hongos. que son solubilizados por sistemas enzimticos especficos y son
absorbidos a travs de su pared celular y membrana plasmtica.
Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multice-
lulares ( filamentosos), sin embargo, tambin existen hongos
dimrficos principalmente patgenos que se presentan en las dos
formas alternativamente, dependiendo de condiciones ambienta-
les como la temperatura.
Las levaduras son clulas de forma esfrica u oval, ampliamente distribui-
das en la naturaleza; frecuentemente se encuentran formando una
cubierta polvosa fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reprodu-
cen asexualmente por gemacin, un proceso por el cul brota una
protuberancia o yema de la clula madre que posteriormente se
separa como clula individual.
El cuerpo o estructura vegetativa caracterstica de los hongos filamentosos
( mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifas
ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongos
presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los
Zygomycetes las hifas no presentan estos septos y se les conoce
como hifas cenocticas.
El principal mecanismo de reproduccin de los hongos es asexual, por
fragmentacin de hifas vegetativas o por la produccin de abun-
dantes esporas en conidiforos y esporangiforos formados en hifas
areas llamadas hifas reproductivas. Sin embargo, la descripcin
de las estructuras de reproduccin sexual es el principal criterio de
clasificacin, por el que pueden ser ubicados en tres subdivisiones
o phylum: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota.
Se estima que puede haber 1.5 millones de especies de hongos, de las
cules se han descrito ms de 250 000 y de stas solo se conocen
150 especies patgenas para el hombre y otras tantas para plantas y
animales. Es de gran importancia conocerlos, por los beneficios
que proporcionan al hombre, ya que como se mencion la mayora
son saprobios ( utilizan materia orgnica muerta), por lo que tienen
una gran capacidad de reciclar materiales orgnicos de diferentes
tipos, de tal forma que se pueden utilizar como agentes de
biodegradacin de compuestos recalcitrantes en procesos de
biorremediacin.
47
manual de pr ct i cas del
Desde la antigedad, estos microorganismos se han utilizado en procesos de produccin de diferentes alimentos
como: vino, cerveza, pan y queso entre otros. Tambin se ha reportado que en la naturaleza hay diversas
especies que funcionan como importantes agentes de control biolgico de insectos (bioinsecticidas) y que
pueden mejorar la nutricin y permanencia de la mayora de las plantas ( micorrizas).
Materiales
4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA (Anexo 2.6 )
4 Cajas de Petri con 25 mL de medio Czapek-Dox (Anexo
2.8)
3 Tubos de cultivo inclinados con 7 mL de PDA
2 matraces Erlenmeyer de 250 mL
m 1 Probeta de 100 mL
0
1 Mechero Fisher
5 Portaobjetos y cubreobjetos
1 Aguja de diseccin
1 Asa de siembra
Cinta adhesiva transparente
Microscopio ptico de campo claro
Aceite de inmersin
Autoclave
Incubadora a 30 C
Azul de lactofenol (Anexo 1.1 )
Procedimiento
El profesor proporcionar a los alumnos tubos de cultivo con Aspergillus niger, PenicHHum chrysogenum, Rhizopus
oliQosporus, Trlchoderma viridey de la levadura Saccharomycescerevislae.
El estudiante inocular cada una de las cepas en cajas de Petri con dos medios de cultivo: a) Czapek-Dox Agar, a
base de sales minerales y sacarosa y b) Papa Dextrosa Agar, que es un medio complejo.
Har la descripcin macroscpica de cada especie en los dos medios de cultivo y la observacin microscpica la
realizar aplicando la tcnica de cinta Scotch con azul de lactofenol.
Siembra de hongos
1. Para sembrar los hongos filamentosos, se deber separar una parte de micelio de los tubos de cultivo con
aguja de diseccin, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada.
2. Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDA y de la misma manera inocular la caja con medio
de Czapek-Dox.
3. Las levaduras se inocularn por estra cruzada sobre la superficie de las cajas, en forma similar a la inocula-
cin de bacterias.
4. Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plstico en forma invertida dentro de una incubadora a
28-30 C durante 3-5 das.
48
Descripcin macroscpica de levaduras y mohos
1. Hacer la descripcin de la forma, tamao, aspecto, textura y color de las colonias de Saccharomyces cerevisiae.
2. En los cultivos de mohos describir la forma, tamao y el tipo de colonia, as como las caractersticas del
micelio ( algodonoso, aterciopelado, velloso, areo o pegado al medio) el color del micelio, el color de
esporas, cambios en el medio de cultivo, etc.
Descripcin microscpica de levaduras
t
1. De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teirlo con azul de metileno.
2. Hacer observaciones al microscopio con objetivo de 40X y 100X.
Descripcin microscpica de mohos en montaje con cinta adhesiva
1. Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomndola nicamente por los extremos.
2. Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la cinta transparente sobre la periferia de la
colonia.
3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocada en el
centro de un portaobjetos. La cinta funcionar como cubreobjetos por lo que se deber aplanar lo mejor
posible, evitando la formacin de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras.
4. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y
40X.
5. Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidiforos, conidias, esporangiforos,
esporangios y rizoides. Determine si las hifas presentan septos o no.
Resultados
A. Reportar sus observaciones en el Cuadro 6. Hacer los dibujos de las observaciones morfolgicas de cada
uno de los microorganismos y colorearlos.
B. Comparar las observaciones realizadas con los esquemas de la Figura 6.
C. Investigar en la literatura como se clasifican los hongos estudiados en la prctica.
i
o
4 9
m a n u a l d e p r c t i c a s d e l : -. ,-*: v
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i . ' > : ; -*Z M ^ ; ; * * ? ; ; < ; * : y ^ v . ; , ? - - , v . : : ' - " <
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f *
(O
m
o
conidias
conidiforo
Aspergillus niger
conidiforos
conidias O
10
Penicillium roqueforti
conidiforos
10 \im
conidias
10 ^m 10 \im
Aspergillus flavus
esporangiforo
100
porangiosporas
25 Jim
Rhizopus oligosporus
Saccharomyces cerevisiae
conidias
conidiforos
10 un
Trichoderma viride
10
conidias
OOOOooo
oooooo
OOOOOO
Penicillium chrysogenum
Figura 6. Descripcin microscpicade estructuras de reproduccin asexual de algunas especies de hongos.
Cuadro 6
Descripcin morfolgica de hongos
liliillilltllillliilllliiilliilliii
Descripcin macroscpica
en PDA
o
o
i ;olor y tamao:
Aspecto:
Textura:
Descripcin microscpica:
Aumento total:
Micelio con o sin septos
Tamao:
Estructuras de reproduccin
Tamao:
Clasificacin ( phylum):
Descripcin macroscpica
en medio Czapek-Dox:
Color y tamao:
Aspecto:
Textura:
Descripcin microscpica:
Aumento total:
Micelio con o sin septos
Tcmao:
Estructura de reproduccin
Tamao:
Tipo de esporas
Tamao:
51
Cuestionario
1. Cules son las principales estructuras caraaersticas de levaduras y mohos?
2. Elaborar un cuadro comparativo de caraaersticas morfolgicas, nutridonales y sensibilidad a antibiticos de
hongos y baaerias. Mencione las diferencias que hay entre las esporas de hongos y las endosporas baaerianas.
3. Mencione los criterios de clasificacin de hongos filamentosos y levaduras.
4. Describir brevemente tres problemticas concretas para el hombre causadas por hongos y tres ejemplos de
utilizacin benfica.
Hudson B.T. and L Sherwood. 1997. Explorations in Microbiology. Prentice-Hall, New Jersey. USA.
Herrera, T., Ulloa, M. 1990. El Reino de los Hongos. Micologa Bsica y Aplicada. Fondo de Cultura Econmi-
ca, UNAM. Mxico.
Mxico.
52
fe*
Pruebas de diferenciacin bioqumica
Objetivos
Que el alumno realice algunas prue-
bas bioqumicas en medios de cultivo
con sustratos especficos que permiti-
rn demostrar actividades metablicas
de bacterias y levaduras. Que el estu-
diante comprenda la importancia de las
pruebas bioqumicas para la caracteri-
zacin e identificacin de estos
microorganismos.
introduccin
El metabolismo, es toda la serie de reacciones que ocurren en los
seres vivos. stas reacciones incluyen procesos de obtencin de ener-
ga como son: la descomposicin de molculas orgnicas en los
quimitrofos (catabolismo) o la captacin de luz para el caso de los
fottrofos, as como de sntesis de material celular a partir de nutrientes
escenciales (anabolismo). Todas las reacciones metablicas, son
catalizados por enzimas que en su mayora funcionan dentro de la
clula por lo que se conocen como endoenzimas, hay tambin
exoenzimas principalmente hidrolticas que son liberadas por la clu-
la para catalizar reacciones fuera de sta.
En el laboratorio, es posible conocer las caractersticas metablicas de los
microorganismos, inoculndolos en diferentes medios de cultivo, con
sustratos que pueden utilizar como fuente de energa, fuente de car-
bono y de otros nutrientes escenciales para su crecimiento.
La mayora de microorganismos, utilizan la glucosa como fuente de car-
bono y energa. Al entrar a la clula, la glucosa ser oxidada en
forma incompleta (fermentacin) o completa (respiracin) depen-
diendo de la presencia de oxgeno y de las capacidades enzimticas
de los microorganismos.
En la fermentacin, los microorganismos obtienen 1-2 ATP/mol de gluco-
sa y liberan cidos orgnicos u otras pequeas molculas orgnicas
como productos metablicos; mientras que las bacterias y levadu-
ras de catabolismo respiratorio obtienen mayor cantidad (36-38 ATP/
mol de glucosa), CO
2
y agua. Algunas especies microbianas pueden
ser de tipo respiratorio o fermentativo de acuerdo a las condiciones
de oxigenacin.
Se han propuesto numerosas pruebas bioqumicas en medios de cultivo
con indicadores de pH, para detectar la produccin de cido o lca-
li; con inhibidores selectivos como bilis, cianuro, colorantes,
sulfuros, etc., que facilitan la determinacin de diferentes activida-
des metablicas como son: la capacidad para fermentar carbohidratos
(glucosa, lactosa, sacarosa), catabolizar aminocidos y urea, la pro-
duccin de enzimas especficas de tipo endo o exo como oxidasas,
reductasas, amilasas, lipasas, etc.
Como se ha observado en las prcticas anteriores, algunas bacterias y
levaduras tienen caractersticas coloniales y microscpicas muy si-
milares, lo que no permite decidir si dos cultivos bacterianos o de
levaduras morfolgicamente similares pertenecen a una misma
especie. Con algunas pruebas bioqumicas es posible su diferen-
ciacin e incluso su identificacin, cuando el nmero de pruebas
es suficientemente amplio.
t
(0
a
o
55
Materiales
1 Gradilla
1 Parrilla de agitacin
1 Probeta de 100 mL.
3 Matraces Erlenmeyer de 250 mL
3 Vasos de precipitados de 250 mL.
1 Mechero
1 Asa de siembra
2 cajas con agar almidn (AA) (Anexo 2.13 )
2 tubos con campana de Durham y 5 mL de cada uno de
fl los siguientes medios: glucosa-rojo de fenol lactosa-rojo
0
de fenol , sacarosa-rojo de fenol y manitol-rojo de fenol
(Anexo 2.9 ).
2 tubos con 7 mL de medio SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad)
(Anexo 2.11)
2 tubos con 7 mL de medio TSI ( triple azcar hierro)
solidificados en forma inclinada (Anexo 2.15)
2 tubos con 7 mL medio de citrato de Simmons solidificados
en forma inclinada (Anexo 2.10 )
2 tubos con 7 mL de caldo urea (Anexo 2.11)
2 tubos con 7 mL de leche tornasolada (Anexo 2.14)
2 tubos con 7 mL de agar gelatina solidificados en forma
recta (Anexo 2.15 )
2 tubos con 7 mL de agar nutritivo blando solidificados en
forma recta (Anexo 2.17 ).
Perxido de hidrgeno 30 %
cido tricloroactico al 5% (Anexo 1).
Procedimiento
El profesor proporcionar cultivos puros de Bacillussubtllis, Escherichia col!, Pseudomonas fluorescens, Klebslella
sp. y Saccharomyces cerevislae. A cada uno de los equipos, les corresponder tambin un cultivo problema.
Todos los tubos y cajas debern etiquetarse e inocularse de acuerdo a las siguientes instrucciones.
Tcnica de Inoculacin en cajas de Petri
1. Dividir en tres secciones por la parte de atrs las cajas con agar-almidn.
2. En una de las cajas inocular por estra simple tres cepas diferentes.
3. En la segunda caja inocular en dos secciones la muestra problema y dejar una seccin sin inocular.
4. Incubar las cajas en forma invertida a 35C durante 24-48 horas.
56
Tcnicas de inoculacin en tubos
1. Los tubos de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, caldo urea y leche tornasolada se inocularn
mezclando una asada de cada uno de los microorganismos.
2. Los tubos con agar TSI se inocularn por estra simple en la superficie y por picadura hasta el fondo del tubo
(Figura 5).
3. Los tubos con gelatina nutritiva y agar nutritivo blando se inocularn por picadura (con el asa recta)
4. Incubar los tubos a 35C durante 24-48 horas.
Evaluacin de actividades metablicas
1. Determinar la actividad de amiiasas en las cajas de agar almidn por el crecimiento y aparicin de zonas
claras alrededor de las colonias. Si no es posible observarlas a simple vista, agregar unas gotas de lugol a las
cajas y observar la aparicin de zonas claras sobre el medio que se colorear de azul como indicativo de
prueba ( +). Comparar los resultados con la zona de la caja que se dej sin inocular.
2. En un portaobjetos hacer una suspensin en una gota de agua de las colonias obtenidas en cajas de agar-
almidn y agregar unas gotas de perxido de hidrgeno al 30%. Observar la formacin de burbujas que
significan una prueba de catalasa ( +).
3. Todas las pruebas en tubo debern interpretarse en comparacin con tubos control, que contienen los
mismos medios de cultivo pero sin inocular
4. En los tubos de agar gelatina, observar la licuefaccin del medio y agregar unas gotas de solucin de TCA
(cido tricloroactico) al 5%, observar la aparicin de zonas claras o nubosidad en el medio.
5. En los tubos con medios de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, hacer observaciones a las 24
y 48 horas de incubacin. Determinar si hay crecimiento, cambios en el color del indicador y produccin de
gas en la campana de Durham
Resultados
A. Reportar los resultados en el Cuadro 7. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento ( -), crece un
poco ( +), mayor crecimiento ( ++), crecimiento abundante ( ++). Actividad sobre sustratos ( +) o negativa (-)
B. Investigar los resultados bibliogrficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la
prctica
C. Investigar las reacciones enzimticas y de color realizadas para la evaluacin de actividades metablicas
D. De acuerdo a sus observaciones proponga el nombre de la especie que corresponde a su microorganismo
problema.
57
M
MI
Cuadro 7
Resultados de pruebas de diferenciacin bioqumica
MEDIO DE CULTIVO
Agar Almidn
Escherichla cot
Saccharomyces
cerevislae
CULTIVO PROBLEMA
Crecimiento:
Color del medio con el
ugol:
Hidrlisis de almidn:
Prueba de catalasa:
Aparicin de burbujas al
agregar perxido de
hidrgeno:
Reaccin de catalasa:
Gelatina Nutritiva:
Crecimiento:
Licuefaccin del medio:
Formacin de nubosidad
al agregar TCA al 5%:
Hidrlisis de gelatina:
Agar Nutritivo Blando:
r\
Crecimiento: superficial,
en la parte media,
en el fondo:
Crecimiento en la picadura
Movilidad:
58
Caldo rojo de fenol
r\ r\ r\ r\
1011011
Gluc Lac Sac Man
r\ r\
Gluc Lac Sac Man
r\ r\ r\
9
TI
|
a
Gluc Lac Sac Man
Crecimiento:
Color del medio:
cido:
Gas:
Leche tornasolada
(Litmus Milk)
ddO:
lcali:
Sin cambio:
Reduccin:
Peptonizacin:
Coagulacin:
Gas:
Caldo Urea
Crecimiento:
Color:
Hidrlisis de urea:
59
m
o
Medio TSI
Crecimiento:
Cambio de color:
Produccin de H
2
s:
Produccin de gas:
Fermentacin del azcar:
Medio de citrato de
Simmons
r\
Crecimiento:
Cambio de color:
Utilizacin de citrato:
Cuestionario
1. Cules son las rutas bioqumicas de obtencin de energa de las bacterias respiradoras aerobias, las de
respiracin anaerobia, las fermentadoras, y las anaerobias estrictas?.Cul de stas es ms eficiente?
Porque?
2. Describa brevemente las actividades enzimticas que se identificaron en cada uno de los medios de cultivo
utilizados en la prctica. Cul es la reaccin bioqumica que cataliza cada una? Cules son exoenzimas y
cules son endoenzimas?
!
0)
t
ti
a
o>
o
3. Explique por qu los tubos de fermentacin de azcares deben evaluarse a las 24 y 48 horas? Qu resul-
tados se observaran en los tubos en el caso de que un microorganismo metabolizara oxidativamente la
glucosa?
4. Explique por qu se busca la presencia de precipitados de sulfuros en el fondo del tubo de TSI y no en la
superficie?
manual de prcticas del LABORATORIO PE fliil>BIL0CI GENERAL
McFaddin, J.F., J Mac Faddin. 2000. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 3rd ed.,
Lippicont, Williams & Wilkins.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods ( 4th Edition) Edited by Francs
Pouch Downes and Keith Ito, 2001
Practical Handbook of Microbiology. William O'Leary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press,
1989.
Bergey's Manual of Determinative Bacterilogo 9th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA),
American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
Ed. ( 1991).
Mtodos de cuantificacin
de microorganismos
a
o
introduccin
objetivos
Existen diferentes mtodos para cuantificar el nmero o peso (biomasa)
Que el alumno conozca algunas de de clulas microbianas en un cultivo; los mtodos pueden ser directos e
las tcnicas de cuantificacin direc- indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a la determinacin de
ta e indirecta de microorganismos peso seco y el recuento de clulas en cmara de Neubauer.
ms utilizadas. Que compare las ven-
tajas y desventajas de cada una en La determinacin de peso seco es un mtodo de cuantificacin muy utili-
funcin de la informacin que se ob- zado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y leva-
tiene, del tiempo invertido y de los duras. Como los cultivos se someten a varios procesos (filtracin,
recursos necesarios. lavado, secado) se pueden causar prdidas importantes de biomasa
y errores en la cuantificacin.
El mtodo de cuenta direaa en cmara tiene la ventaja de ser muy rpido y
econmico, aun que no se pueden distinguir las clulas viables y no
viables. Se puede calcular el nmero de microorganismos en una mues-
tra a partir del volumen de la cmara y de las diluciones de la muestra
que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la
observacin y cuantificacin se dificultan en clulas muy pequeas (1-
5/m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeo volumen
de muestra que se utiliza (0.1-0.2 mm
3
).
Entre los mtodo indirectos, uno de los ms utilizados es la medicin de
laturbidez de los cultivos en un espectrofotmetro, que es relativa-
mente rpida y que se basa en la capacidad de las clulas
microbianas de dispersar la luz que incide sobre stas. Como el
tamao de las clulas en una poblacin es casi constante, el grado
de dispersin es proporcional a la concentracin de clulas pre-
sentes pero no se puede diferenciar la turbidez dada por clulas
viables o no viables.
La forma de cuantificar clulas viables ms utilizada en Microbiologa, es
la de hacer diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo es-
pecficos para la poblacin de inters. Esta tcnica se basa en la
suposicin de que cada bacteria incluida en un medio de agar o en
su superficie se multiplicar y producir una colonia visible, en con-
secuencia el nmero de colonias que se observarn a simple vista
ser igual al nmero de bacterias viables o unidades formadoras de
colonias (UFO inoculadas en el agar multiplicadas por la dilucin.
Esta tcnica aplicada en muestras complejas, dar una estimacin aproxi-
mada del nmero total de microorganismos, dependiendo del me-
dio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de
incubacin que favorezcan el crecimiento de todos los
microorganismos. Tambin pueden presentarse problemas relacio-
nados con falta de homogeneidad de las diluciones y en la inocula-
cin de las muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores si
es que las clulas no se separan bien y valores elevados si la toma
de las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concen-
trado por gravedad los microorganismos.
65
Materiales
6 cajas de Petri con agar nutritivo (Anexo 2.2 )
10 Pipetas de 1-2 ml_ estriles
10 Tubos con 9 mL de ssi (solucin salina isotnica= 0.89%
NaCI)
1 matraz Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de ssi
Vasos de precipitados
1 Parrilla de agitacin
1 espectrofotmetro
w
1 cmara de Neubauer
g I pipeta Pasteur
Fenol al 2% (Anexo 1.9)
1 Varilla de vidrio doblada en L
1 Microscopio compuesto
Safranina (Anexo 1.8)
Procedimiento
El profesor proporcionar un cultivo de Saccharomyces cerevisiae y Escherichla colL
El alumno medir la turbidez de los cultivos en un espectrofotmetro (Spectronic 20); cuantificarn el nmero de
clulas totales, por cuenta direaa en cmara de Neubauer y determinar el nmero de unidades formadoras
de colonias ( UFO por dilucin y siembra en placa.
Tcnica turbidimtrica
1. Encender el aparato y dejar que el instrumento se caliente por 15 minutos.
2. Ajustar el aparato a la longitud de onda ( 520 nm)
3. Calibrar el instrumento a 0% de transmitancia con el botn izquierdo. Para leer en la escala, observar la
aguja a nivel de los ojos y tomar el dato donde la aguja coincida sobre su reflejo en el espejo.
4. Colocar una celda con medio de cultivo estril como testigo (sin inocular) y calibrar el instrumento a 100% de
transmitancia.
5. Para medir la turbidez de una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfectamente con papel suave y
medir el valor de %T.
6. Calcule la absorbancia de la frmula A= -log (%T/100)
7. En caso de disponer de un aparato digital ajustar la mediciones a absorbancia ( D.O.).
66
o
I
8.
4)
Tcnica de cuenta directa en
cmara de Neubauer
1. Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de ensaye. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentra-
das ( D.O > 1.5) ser necesario preparar diluciones de la misma con solucin salina isotnica. Agregar 0.5 mL
de solucin de fenol al 2% y dos gotas de safranina. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos.
2. Lavar cuidadosamente la cmara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar
con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales,
donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista.
3. Homogeneizar perfectamente la muestra en un vrtex, tomar inmediatamente una muestra con una pipeta
Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cmara y el cubreobjetos por el borde de la cmara. Dejar
que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultar la evaluacin precisa de la
poblacin microbiana.
4. Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cmara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo
seco dbil (10X) la zona cuadriculada que se muestra en la Figura 7.
5. Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se encuentra dividido en 5X5
cuadros pequeos (C2) limitados por triple lnea que miden 0.2mm por lado. Estos cuadros pequeos a su
vez se encuentran divididos en 16 cuadros mas pequeos (C3) de 0.05 mm de lado.
6. Hacer la cuantificacin de clulas con el objetivo seco fuerte ( 40X), contando el nmero de clulas que se
localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamao C2 sirven de gua para el cmputo. Se empieza a
contar desde la parte superior de los cuadros C2 y se contina hasta la base. Si las clulas tocan los lmites de
los cuadros C2; debern contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del
cuadro. Si las clulas tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este mtodo reduce las
posibilidades de contar la misma clula dos veces.
7. Cuente hasta cerca de 200 a 250 clulas antes de determinar el nmero de clulas por mL En el proceso de
contar se pueden presentar tres situaciones diferentes que a continuacin se explican:
a. Si hay de 200 a 250 clulas por cuadro grande ( C1), multiplicar directamente X 10
4
para reportar el
nmero de clulas por mL.
b- Con menos de 200 clulas por cuadro grande ( C1), ser necesario contar algunos de los cuadros de las
esquinas ( miden 1x1 mm de lado y divididos en 4X4). De esta manera se cuantificarn ms de 200 clulas.
Despus dividir el nmero total de clulas entre el nmero de cuadros empleados y sacar el valor promedio
por cuadro grande. Despus multiplicar este valor por X 10
4
para reportar el nmero de clulas por mL.
c. En el caso de que se observen ms de 200 clulas por cuadro grande ( C1), se debern contar las clulas de
los cuadros de menor tamao (C2) hasta contar cerca de 200 clulas. Dividir este valor entre el nmero de
cuadros usados para la cuenta para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio
por 25 para obtener el nmero de clulas aproximado en un cuadro grande (C1) y despus multiplicar X10
4
para reportar el nmero de clulas por mL.
67
m a n u a l d e p r c t i c a s d e l ' ' - -.*;.:* "<< rr ><-. ' ^ ' V . ' / ; : \ *C --'. -\ '*:. -'' :' **< \.
( O
CQ
8. El factor de 10
4
por el cul se debe multiplicar el nmero de clulas por cuadro grande (C1) es porque este
cuadrado contiene un volumen de 0.1 mm
3
(mide 1mm por lado y la cmara tiene una profundidad de 0.1
mm).
# clulas/cuadro C1 ( 25cuadros C2) = # clulas/ 0.1 mm
3
X 10
4
= # clulas/mL
9. En el caso de que el # de clulas sea muy grande, la suspensin deber diluirse y se har la correccin como
sigue:
# clulas/mL en la muestra diluida X ( factor de dilucin) = # clulas/ mL en la suspensin original.
1 mm
1 mm 1 mm
::::::::i:E2
1 mnri
0.2 mrri
Cuadro 1 (10X)
Cuadro 2 (40X)
Figura 7. Cuenta en cmara de Neubauer
Tcnica de dilucin y siembra en placa
1. Hacer diluciones decimales del cultivo de 10
5
hasta 10"
9
en condiciones estriles (Figura 8). Se colocarn en
cajas de Petri con agar nutritivo por duplicado 0.1 mL de las ltimas tres diluciones.
2. Distribuir cuidadosamente el inoculo en toda la caja con ayuda de una varilla de vidrio doblada en "L"
previamente esterilizada a la flama del mechero y enfriada.
3. Dejar absorber el lquido durante 10 minutos
4. Incubar las cajas en forma invertida a 35C durante 24-48 horas para bacterias y levaduras y de 5-7 das para
hongos filamentosos.
5. Hacer la cuenta de las colonias de las placas, seleccionando la dilucin donde el nmero de colonias sea
entre 30 y 300.
68
6. Si la inoculacin fue por duplicado o triplicado, se calcula el nmero promedio de colonias por dilucin y
este nmero se multiplicar por el inverso de la dilucin XI0 (por ajuste de volumen inoculado) para obte-
ner la nmero total de unidades formadoras de colonias (UFC)/mL en la muestra original.
1 mL
Cultivobacteriano
1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
10-
3
io-
4
io-
5
io-
6
io-
7
O. lmL X O . l mL
0)
(6
a
o
Figura 8. Tcnica de dilucin y cuenta en placa
Resultados
A. Reportar los resultados de cuantificacin de los cultivos, aplicando las tcnicas descritas. Indicar los clcu-
los hechos para cada metodologa.
B. Recopilar sus resultados en el Cuadro 8 incluyendo los de los otros equipos, indicando la muestra analizada
por cada equipo. Discutir en cada caso cules fueron las ventajas y desventajas de las metodologas de
cuantificacin.
69
Cuadro 8
Cuantificacin de microorganismos por tcnicas directas e indirectas
(0
a
o
MICROORGANISMO
Escherichia col
Saccharomyces
cerevisiae
Turbidez ( D.O.) Cuenta en cmara de Neubauer
( # clulas totales/mL)
Cuenta viable en placa
( # UFC/mL)
Cuestionario
1. Compare el mtodo de dilucin en placa con el mtodo de cuenta direaa en cmara de Neubauer para la
cuantificacin de microorganismos. En que casos conviene usar cada uno?
2. Explique cules son las ventajas y desventajas del mtodo turbidimtrico de cuantificacin de clulas.
70
3. Mencione dos aplicaciones concretas en las que se utilicen cada una de las tcnicas de cuantificacin
realizadas.
1
(0
ti
a
o
4. Algunos autores sugieren la medicin de actividad biolgica y la determinacin de constituyentes celulares
para la cuantificacin de poblaciones microbianas. Comente sus ventajas y desventajas.
71
c
Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prcticas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.
Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3
a
Company, Inc. USA.
Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biologa de los Microorganismos. Octava Edicin.
Prentice Hall. Espaa.
Prescott L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiologa. Cuarta Edicin. McGraw Hill Interamericana.
Mxico.
72
I " O
ai*
Efeao del pH y la temperatura en
el crecimiento microbiano
Objetivos
Que el estudiante conozca el efecto
del pH y la temperatura como parme-
tros de control del crecimiento micro-
biano. Que el alumno comprenda la
importancia de estos factores fsico-
qumicos en la seleccin de pobla-
ciones microbianas en los diferentes
ambientes en que se encuentran y
los mecanismos de adaptacin a ni-
vel celular y metablicos que han
desarrollado.
introduccin
Los microorganismos estn continuamente afectados por su ambiente, ya
que ste ejerce una influencia profunda en su desarrollo al igual que
sobre las dems formas de vida. Los factores del medio se pueden clasi-
ficar en tres grupos:
a).- Fsicos.- temperatura, presiones externas, humedad.
b).- Qumicos.- pH, disponibilidad de nutrimentos, presencia de produc-
tos txicos.
c).- Biolgicos.- las interacciones microbianas entre las especies
coexistentes.
Algunos microorganismos estn especialmente adaptados a los habitat
extremos, donde otros no pueden sobrevivir y que incluso tienen
propiedades fisiolgicas que restringen su crecimiento a tales si-
tios. En otros habitat menos rigurosos, las fuentes de nutrimentos y
las interacciones entre poblaciones adquieren mayor importancia
en la seleccin de las poblaciones que se encontrarn.
Los factores ambientales que se controlan en condiciones de laboratorio
con mayor frecuencia, adems de los nutrimentales son los
fisicoqumicos como: la temperatura y pH.
Todos los organismos tienen una temperatura ptima de crecimiento que
los caracteriza; en la cual muestran las tasas ms elevadas de creci-
miento. Tambin hay lmites de temperatura, la temperatura mni-
ma en las que son metablicamente inactivos y una temperatura
arriba de la cul el crecimiento ya no es posible llamada tempera-
tura mxima.
De acuerdo a su temperatura ptima de crecimiento, los microorganismos
se dividen en psicrfilos (<0C-20C), mesfilos (20-40C), termfilos
(40-80C) e hipertermfilos (80-110C). La mayora de hiper-
termfilos son arqueas como Methanococcus Qneus. Las diferen-
cias entre la temperatura ptima de crecimiento y los intervalos de
temperatura entre los cuales es posible el crecimiento de bacterias
y arqueas determinan la separacin espacial en la naturaleza de
estos dominios de microorganismos.
La concentracin de iones hidrgeno del medio afecta directamente a
los microorganismos y enzimas, e influye tambin en la disocia-
cin y solubilidad de molculas que requieren. Sin embargo, algu-
nos microorganismos se han adaptado a diferentes condiciones de
acidez o alcalinidad, como Sulfolobusy Thiobacillus que crecen a
pH tan cido como 1 - 2 oxidando minerales de sulfuro para produ-
cir cido sulfrico y son llamado acidfilos.
0)
(6
t
ti
a
0)
"O
75
Otros microorganismos se desarrollan en los habitat naturalmente alcalinos como lagos salados y desiertos don-
de los valores de pH 10 son comunes, estos alcalfilos incluyen especies de Rhizoblum, Bacillusy algunas
bacterias entricas y cianobacterias. En general los hongos son ms tolerantes a la acidez que las bacterias.
Cada microorganismo tiene un rango de temperatura y pH en el cual pueden crecer, de tal manera que al
modificarse estos factores se pueden alterar la velocidad de crecimiento y causar la muerte de lo mismos,
por lo que se pueden utilizar como factores de control del crecimiento microbiano.
Materiales
2 Caj as de Petri con me d i o de Papa Dext r osa Agar ( Anexo
2.6) aj ust ado a pH 7.0
fi 2 Caj as de Petri con me d i o de Papa Dext r osa Agar aj ust a-
0
do a pH 5.0
2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajusta-
do a pH 9.0
22 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin (Bioxon) ajus-
tado a pH 7.0 sin amortiguar (Anexo 2.19)
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin ajustado a pH
5.0 sin amortiguar
9.0 sin amortiguador
7.0 con amortiguador (Anexos 1.1, 2.19)
5.0 con amortiguador
9.0 con amortiguador
1 Asa de inoculacin
3 pipetas de 1.0 mL. estriles
1 mechero Fisher
Espectrofotmetro
Microscopio estereoscpico
Soluciones amortiguadoras de pH 4, 7 y 10
Procedimiento
El profesor proporcionar cultivos lquidos de: Eschechia coli, Pseudomonas fluorescensy Lactobacii/ussp., una
suspensin de esporas de Aspergillus nigery Penicillium roqueforti. Cada uno de los tubos y cajas debern
etiquetarse con el nombre del microorganismo que se inocular.
Efecto de la Temperatura
1. En tres cajas de Petri con PDA divididas en dos secciones, inocular 0.1 mL. de la suspensin de esporas de
hongos en cada seccin.
2. Incubar una caja de Petri a 15C, otra a 30C y la ltima a 45C en forma invertida durante 72 horas y hacer
las observaciones macroscpicas.
76
3. Incubar nuevamente las cajas y realizar observaciones en microscopio estereoscpico despus de una semana.
4. En seis tubos de caldo microinoculacin ajustado a pH 7.0, inocular dos con cada una de las cepas bacterianas.
5. Incubar dos tubos en estufa a 15C, otros dos a 30C y los dos ltimos a 45C durante 24-48 horas. Medir la D.O.
Efecto del pH
1. Preparar tres series de cuatro tubos de caldo de microinoculacin ajustados a 3 diferentes valores de pH
(5.0, 7.0 y 9.0) con solucin de HC11.0 M o NaOH 1.0 M.
2. Preparar otra serie de cuatro tubos ajustados a los mismos valores de pH del punto anterior pero utilizando
soluciones amortiguadoras tal como se indica en la Tabla del Anexo 1.10.
3. Inocular 0.1 ml_. de cada una de las cepas bacterianas en la serie de seis tubos de caldo microinoculacin
ajustados a diferentes pH con amortiguador y sin amortiguador, dejando uno sin inocular como testigo.
4. Incubar los tubos a 35 C durante 24-48 horas y medir la D.O.
5. Inocular tres cajas de Petri con medio PDA ajustado a tres pH diferentes con cada una de las cepas de
hongos.
6. Incubar las cajas de Petri a 30 C durante 72-96 horas y hacer observaciones macroscpicas.
7. Despus de una semana observar las cajas en microscopio estereoscpico.
Resultados
A. Reportar los resultados en los cuadros 8, 9 y 10 de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-),
crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++).
B. Comparar sus resultados con los reportados en la bibliografa de cada una de las cepas.
i
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77
m a n u a l d e p r c t i c a s d e l . v> - v<; \ -:
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Cuadro 9
Efecto de la temperatura de cultivo en el crecimiento microbiano
PAPA DEXTROSA AGAR
Asperg I Ius nger
Morfologa de la colonia
a las 72 horas
Morfologa microscpica
a la semana
Penidllium roquefort
a las 72 horas
a la semana
CALDO .
MICROINOCULACIN
Escherlchla col i
15C
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia (D.O.)
Pseudomonas
fluorescens
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia (D.O.)
Lactobadllus sp.
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia (D.O.)
TEMPERATURA
30C
A
45C
r\
78
Cuadro 10
Efecto del pH de cultivo en el crecimiento microbiano
PAPA DEXTROSA AGAR
Asperg/fus n/ger
a las 72 horas
a la semana
Penidlllum roquefortl
a las 72 horas
a la semana
CAtDO .
MICROINOCULACIN
Escherichia col!
lili 111
I
I
ff
Con amortiguador Sin amortiguador
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbanda( D.O.;
Pseudomonas
fuorescens
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia( D.O.)
Lactobadllus sp.
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbanda(D.O.)
PH5.0
r\
i
PH7.0
r\
PH9.0 PH5.0 PH7.0 PH9.0
79
Cuestionario
1. Cules son las temperaturas cardinales y como se clasifican los microorganismos de acuerdo a su tempera-
tura ptima de crecimiento?
(0
ffl 2. Como influy el pH en el crecimiento de hongos y baaerias? Que diferencias se observaron en los medios
de cultivo amortiguados y sin amortiguar?
3. Explique brevemente cules son los mecanismos celulares que los microorganismos termfilos extremos y
psicrfilos han desarrollado para adaptarse a condiciones extremas de temperatura y pH.
4. Explique cul es la relacin que existe entre condiciones ptimas de crecimiento en el laboratorio y las
condiciones del habitat de origen de las poblaciones microbianas.
Harrigan, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 1998. Academic Press. 3
a
. Edition.
Jay, J.M.1994. Microbiologa Moderna de los Alimentos. Tercera Edicin. Editorial Acribia, Zaragoza, Espaa.
Holt, J. C, N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacterilogo 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
80
Efecto de la actividad de agua
en el crecimiento microbiano
Que el estudiante conozca las res- El agua lquida es esencial para todos los procesos bioqumicos. Para los
puestas de crecimiento de diferen- microorganismos, un factor crtico es la disponibilidad de agua lquida
tes cultivos microbianos, frente al ms que la cantidad total de agua presente en el ambiente. El total de
estrs osmtico causado por la adi- agua realmente disponible para uso microbiano se expresa como la acti-
cin de azcares, la adicin de NaCI vidad de agua ( a
w
).
y la desecacin. Que el alumno com-
prenda el efecto de estos factores Los efectos de las altas concentraciones de solutos sobre los microorga-
sobre la actividad de agua y los me- nismos pueden deberse a los solutos mismos o a los efectos del
canismos de adaptacin que han de- soluto sobre la a
w
. Cada vez que se disuelven sustancias en el agua
sarrollado los microorganismos. pura se disminuye la cantidad de agua disponible o agua libre. La
actividad de agua en trminos termodinmicos proporciona una
medida de agua libre y es definida por la ecuacin
a -
P
o
n
t
+n
2
Donde P- la presin de vapor de la solucin y P
o
es la presin de vapor
del agua pura, n
1
y n
2
son el nmero de moles de soluto y solvente
respectivamente. As, si la concentracin de soluto aumenta la a
w
disminuye, para agua pura la a
w
es igual a 1.0.
La mayora de microorganismos solo toleran pequeos disminuciones en
la a
w
y al igual que con otros factores ambientales, hay notables
excepciones de microorganismos que toleran o incluso requieren
actividades de agua reducidas como: las bacterias haloflicas, hon-
gos xerofticos y las levaduras osmfilas. Las bacterias halfilas que
viven en ambientes salinos son las que mejor toleran la disminu-
cin de la a
w
independientemente del soluto utilizado para reducir-
la, mientras que en las otras la tolerancia vara en funcin del soluto
que se utiliza para disminuirla.
Estas propiedades de disminucin de la a
w
en soluciones es la base de
algunos sistemas de conservacin de alimentos, por ejemplo: el
salado del pescado o en la adicin de elevadas concentraciones de
azcares en mermeladas.
manual de prcticas del tjmcmKtomo PE ftCltIB0LlGA SEEff AL
.
Materiales
1 asa de inoculacin
1 Espectrofotmetro
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10% de sacarosa (p/v)
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 30% sacarosa
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 60% de sacarosa
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 1 % NaCI (p/v)
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 5 % NaCI
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10 % de NaCI
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 10% sacarosa
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 30% sacarosa
S 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 60% de
sacarosa
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 1 % NaCI
36 tubos de ensayo vacos y estriles
5 pipetas de 1mL estriles
Procedimiento
El profesor proporcionar cultivos lquidos de bacterias: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Pseuc/omonas sp. y hongos: Saccharomyces rouxii, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum. En series de tres
cajas de Petri y 6 tubos de cada medio se inocularn por equipo tres de los microorganismos.
Efecto de la presin osmtica y
actividad de agua ( a
w
) en hongos y bacterias
1. Inocular en el centro de las cajas de Petri, con una gota de cada una de las cepas de hongos.
2. Inocular con 0.1 mL de cultivo de dos de las cepas de bacterias en dos tubos de ensaye con 7mL de cada uno
de los medios.
3. Incubar las cajas en forma invertida a 30C y los tubos de caldo a 35C durante 48 horas y hacer las observa-
ciones. Incubar nuevamente y a la semana realizar observaciones de la morfologa de los cultivos en cajas y
en tubos medir la turbidez de los cultivos en caldo nutritivo a las 24-48 horas.
Efecto de la desecacin
1. En series de seis tubos de ensayo vacos y estriles, con una pipeta estril, colocar una gota de una suspen-
sin de cada uno de los siguientes cultivos bacterianos: Bacillus subtilis, Escherichia co/iy en un tercer tubo
una gota de una suspensin de esporas de Aspergillus niger
2. Cerrar los tubos y dejarlos a la temperatura ambiente durante una semana
3. En dos tubos de cada cultivo agregar 3 mL de caldo nutritivo estril.
84
4. Incubar los tubos a 35 C durante 24-48 horas.
5. Observar si hay crecimiento o no.
6. Repetir la instrucciones de los puntos 3-5, despus de dos y tres semanas en los tubos restantes.
Resultados
A. Reportar los resultados en los Cuadros 11-13. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-),
crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++).
B. Medir la absorbancia de los tubos de cultivo en un espectrofotmetro.
C. Investigar los resultados bibliogrficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la
prctica
Cuadro 11
Efecto de la presin osmtica y aaividad de agua en el crecimiento de baaerias
a
o
o
0.990) = 0.970)
CEPA
Staphylococcus sp.
Crecimiento a las
24 horas
Densidad ptica:
Escherichia coli
Crecimiento a las
24 horas
Densidad ptica:
Baclllus subtlis
Crecimiento a las
24 horas
Densidad ptica:
Sacarosa
10%
NaC11%
A
Sacarosa
30%
A A
Nac 5%
r\
Sacarosa
60%
r\ A
0.940)
NaCI 10%
A
r\
85
Cuadro 12
Efecto de la presin osmtica y actividad de agua en el crecimientos de hongos
m
o
( a
w
= 0.990) ( ^ = 0.970) ( ^ = 0.940)
CEPA
Sacharomyces
rouxll
a las 72 horas:
despus de una semana:
AspergIIus nlger
a las 72 horas:
Penlcllllum
chrysogenum
a las 72 horas:
Sacarosa
10%
Nac 1 %
Sacarosa
30%
Nac 5%
Sacarosa
60%
NaC110%
86
Cuadro 13
Efeao de la desecacin en la recuperacin de cepas microbianas de bacterias y hongos
Escherchla col!
depsito:
Absorbanda (D.O.):
Badilus subtilis
depsito:
Absorbanda (D.O.):
AspergIIus nlger
Crecimiento: superficial
depsito:
Absorbanda (D.O.):
SEMANA 1
.1
r\
<J
! / :
r\
r\
<J
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r\
r\
<J
>
KJ
i.;.
/->
r\ /^\
r\
**
1
r\
r\
U
0)
I
I
Cuestionarlo
1. Definir brevemente los trminos: osmfilo, halfilo, xerfito.
manual de prcticas del LABOItJITOlIlCI OE VfiCHOBiOLd&iA
0)
o
2. Cules son las hiptesis que tratan de explicar la osmofilia y la halofilia de poblaciones microbianas?
3. Explique cul es la importancia de controlar la artividad de agua en procesos de conservacin de alimen-
tos? Que es la plasmoptisis? Que es la plasmlisis?
4. Que relacin hay entre la a
w
y la humedad relativa ?
5. Como se explica la mayor tolerancia de los hongos a valores de a
w
reducidos que en bacterias?
Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3
a
Company, Inc. USA.
Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prcticas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.
Mxico.
88
1O
O
O ^
Curva de crecimiento bacteriano
Objetivos
Que el estudiante conozca las fases
de una curva de crecimiento en un
cultivo en lote de Escherichla colL
Que el alumno aprenda a calcular
parmetros cinticos (/*, t
d
) caracte-
rsticos de las especies bacterianas.
introduccin
El crecimiento y la viabilidad de los microorganismos est determinada
por factores nutricionales y ambientales, y en condiciones de laboratorio
ptimas, es posible predecir una curva de crecimiento caracterstica de
cada especie microbiana.
Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo lquido fresco,
experimentar un periodo de adaptacin al medio y condiciones
de cultivo y posteriormente se dividir en forma exponencial, dan-
do lugar a una curva de tipo sigmoidal que se acostumbra dividir
en 4 partes:
3
o
u
O
3
B
tiempo
A) fase de retardo, de adaptacin o fase lag, B) fase de crecimiento
exponencial o fase l og, C) fase estacionaria y D) fase de declina-
cin o muerte. La forma de cada porcin de la curva y el tiempo de
duracin de cada fase depender de: la especie de microorganis-
mo, la preparacin del inoculo, la composicin qumica del medio
de cultivo y las condiciones ambientales de incubacin.
Durante la fase de adaptacin no hay divisin celular, la clula est sinte-
tizando nuevos componentes, durante la fase exponencial los
microorganismos que se dividen por fisin binaria lo hacen a inter-
valos regulares, finalmente el crecimiento de la poblacin dismi-
nuye y la curva se vuelve horizontal debido al agotamiento de
nutrimentos o la acumulacin de productos residuales txicos has-
ta que la poblacin disminuye.
En general las bacterias crecen con mayor rapidez que los
microorganismos eucariticos y los eucariticos pequeos se desa-
rrolla ms rpidamente que los grandes.
El metabolismo energtico tambin influye sobre la velocidad de creci-
miento, debido a la ganancia energtica que se obtiene de cada va
o
ti
t
es
a
o
o
91
manual de prcticas del I O
catablica de obtencin de energa. As, los microorganismos fermentadores crecern mas lentamente que
los respiradores.
Materiales
1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio
lquido (Anexo 2.18)
2 Matraces Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de solucin
salina isotnica estril
6 Pipetas de 10 mL estriles
16 Pipetas de 1 mL estriles
1 Potencimetro
1 Mechero Fisher
1 Espectrofotmetro y celdas
1 Gradilla
16 Tubos con 9 mi de solucin salina isotnica estril
1 Varilla doblada en "L"
12 Cajas de Petri con Agar Nutritivo (Anexo 2.2)
Procedimiento
El profesor inocular Escherichia co/fen un matraz Erlenmeyer con medio lquido complejo 12 horas antes de
iniciar la prctica, que se utilizar como inoculo para los cultivos en matraces Erlenmeyer con diferente concen-
tracin de glucosa.
Los estudiantes cuantificarn el crecimiento peridicamente durante 6 horas de incubacin. Se aplicarn los mto-
dos turbidimtrico y el de diluciones y siembra en placa (prctica* 7) para cuantificar el crecimiento bacteriano.
Inoculacin e incubacin del cultivo
1. Inocular en condiciones estriles un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo complejo
con 10 mL de un cultivo de Escherichia coli
2. Homogeneizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una muestra de 5 mL con una
pipeta estril y vaciarla en una celda del espectrofotmetro. Esta muestra corresponder al tiempo cero
(t=0). De la misma manera se tomarn muestras a las 0.5, 1, 2, 3 y 4 horas. Para el tiempo de 6 horas de
incubacin se tomarn 6 mL
3. Colocar el cultivo en incubadora con agitacin (150 rpm) a 35C
Tratamiento de las muestras
1. Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotmetro a 560 nm. Leer el valor de la densidad
ptica (Figura 9).
92
2. En la muestra de 6 horas adems de evaluar la turbidez, se deber poner 1 mL del cultivo en un matraz
Erlenmeyer con 99 mL de solucin salina isotnica (ssi) estril. Del matraz con la muestra diluida, hacer una
serie de diluciones en tubos con 9 mL de ssi estril, hasta 10
8
. Cuidando de homogeneizar las muestras
cada vez que se haga una nueva dilucin.
3. Enseguida inocular 0.1 mL de las ltimas tres diluciones en dos cajas de Petri con agar nutritivo y distribuir
la muestra con una varilla de vidrio doblada en "L".
4. Dejar que se absorba el lquido en las cajas y posteriormente incubarlas en forma invertida durante 24-48
horas.
5. Cuantificar el nmero de UFC/mL de Escherichia colL
10 mL
t
(0
a
o
o
055
(5)
(6)
Figura 9. Tratamiento de muestras para medicin del crecimiento microbiano y elaboracin de una curva de crecimiento.
93
Resultados
A. Se registran los resultados de cuantificacin del crecimiento de Escherichla co/ien el Cuadro 14.
B. El alumno reportar tambin en forma grfica la relacin entre dos variables, la variable independiente
siempre ser el tiempo que se colocar en el eje X, para cada concentracin de glucosa
a. Una grfica de D.O. contra el tiempo
b. En la grfica a) identificar las fases de crecimiento y duracin
c. Determinar la tasa de crecimiento promedio (k) de la frmula k=( log N- log N
o
)/ log 2 (t), donde N
o
=# de
UFC al tiempo "0" y N = # de UFC al final del experimento
d. Calcular la tasa de crecimiento especifica ( JU ) de la frmula fi = In2 (k) con este valor determinar el tiempo
de generacin de Escherichia co/ con la relacin t
d
= In2/fi
Cuadro 14
Resultados de mediciones del crecimiento de Escherichia coll en un
cultivo por lote con diferentes concentraciones de glucosa
Tiempo de muestreo ( h)
0
0.5
1
2
3
4
6
Turbidez ( D.O.) UFC/mL
94
Cuestionario
1. Cmo se define el crecimiento en Microbiologa y cules son los eventos a nivel celular que ocurren en
cada una de las etapas de crecimiento?
!
a
2. Qu condiciones ambientales y nutrimentales causarn una disminucin o eliminacin de la fase lag en la
curva de crecimiento. Que condiciones la incrementara?
3. Cmo se define el tiempo de duplicacin? Cmo se relaciona con la tasa de crecimiento especfica
95
Larpent-Gourgaud, M., J.P. Larpent, B. Boissonnet. ( 1988). Travaux pratiques et diriges de Microbiologie.
Socit Marocaine des Editeurs Runis. Rabat, Maroc.
Mxico.
a
o
96
o
o
Brooks, G.F., ButelJ.S., Morse, S.A. 1999. Microbiologa mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Editorial
el Manual Moderno. 16
a
. Edicin.
Harrigan, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 1998. Academic Press. 3
a
. Edition.
Jay, J.M.1994. Microbiologa Moderna de los Alimentos. Tercera Edicin. Editorial Acribia, Zaragoza,
Espaa.
Larpent-Gourgaud, M., J.P. Larpent., B. Boissonnet. ( 1988). Travaux pratiques et diriges de Microbiologie.
Socit Marocaine des Editeurs Runis. Rabat, Maroc.
Manual de Medios de Cultivo. Bioxon.
Mxico.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods 2001 ( 4th Edition) Edited by
Francs Pouch Downes and Keith Ito. American Public Health Assosiation.
Practical Handbook of Microbiology. 1989 William M O'Leary (Ed), Cornell Medical College, New York,
New York, USA. CRC Press.
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated
(APHA), American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater. Ed. ( 1991).
|
ti
a
o
99
m a n u a l d e p r c t i c a s d e l / ^K/ f - uv^Y ;-: i - ; - ; : " . ' " ;", : ' ' *
100
0
0
'J$fF*F
Preparacin de soluciones
y colorantes
1. Azul de lactofenol
Disolver cuidadosamente 10 g de fenol (cristales)
en 20 ml_ de agua destilada, agregar 20 g de ci-
do lctico y 40 g de glicerol. Posteriormente di-
solver 0.05 g de azul de metilo.
2. Azul de metileno alcalino
Disolver 0.3 g de azul de metileno en 30 mL de
alcohol etlico al 95% y mezclarlo con 100 mL de
solucin de hidrxido de potasio al 0.01%
3. Cristal violeta
Este colorante se prepara en dos partes,
a. Solucin a: en un vaso de precipitados de 50
mL colocar 10 mL de alcohol etlico y disolver
1 g de cristal violeta. Solucin b: en otro vaso
se disuelven 0.4 g de oxalato de amonio en
40 mL de agua destilada.
b. Mezclar cuidadosamente las soluciones a)
y b)
c. Guardar la mezcla en un frasco mbar en
obscuridad durante 24 hrs. Filtrar en papel
Whatman No. 1 antes de utilizarlo.
4. Verde de malaquita
Disolver 5.0 g del colorante verde de malaquita
en 100 mL de agua destilada.
5. Solucin de lugol
En un matraz aforado de 50 mL, disolver 0.333 de
yoduro de potasio en 20 mL de agua destilada y
enseguida agregar lentamente 0.166 g de yodo,
mezclar completamente y aforar con agua desti-
lada.
6. Solucin decolorante alcohol-acetona
Colocar en una probeta de 50 mL, 30 mL de alco-
hol etlico y 20 mL de acetona, mezclar perfecta-
mente.
7. Alcohol al 70%
8. Safranina
En un matraz aforado de 50 mL colocar 5 mL de
alcohol etilico y disolver 0.125 g de safranina. Afo-
rar con agua destilada
9. Solucin de Fenol al 2%
En un matraz aforado de 100 mL colocar 2.0 g de
fenol cristales y disolver con un poco de agua poco
a poco, despus aforar con agua destilada.
10. Soluciones amortiguadoras para controlar el pH de medios de cultivo
PH
2.8
3.6
4.4
5.2
6.0
6.8
7.6
8.4
9.2
10
K
2
HPO
4
0.2 M ( mL)
0.3
0.6
0.9
1.1
1.3
1.5
1.9
-
-
-
cido Ctrico
0.1 M ( mL)
1.7
1.4
1.1
0.9
0.7
0.5
0.1
-
-
-
cido Brico
0.2 M ( mL)
-
-
-
-
-
-
-
1.7
1.3
1.0
NaOH
0.2 M ( mL)
-
-
-
-
-
-
0.3
0.7
1.0
Caldo Nutritivo
( mL)
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
103
104
:\.k
o
o
*
**0
Preparacin de medios de cultivo
1. Caldo nutritivo ( CN). Es un medio lquido complejo de uso general para el cultivo de bacterias
ingredientes
Peptona de casena
NaCI
Extracto de carne
PH
<g/L)
5.0
8.0
3.0
6.5-7.0
a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado
b. Ajustar el pH
c. Distribuir en tubos de ensaye con tapn de rosca
d. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos
2. Agar nutritivo ( AN). Es un medio slido complejo de uso general para el cultivo de bacterias exigentes
ingredientes
Peptona de casena
NaCI
Extracto de carne
Agar
PH
( g/t)
5.0
8.0
3.0
15.0
6.5-7.0
a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, menos el agar.
b. Ajustar el pH
c. Agregar el agar y calentar a ebullicin durante 1 minuto
e. Distribuir el medio en volmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones aspticas.
3.Medio Mnimo de Sales ( MM). Es un medio qumicamente definido de uso general para el cultivo de bacterias
poco exigentes.
ingredientes ( g/L)
Glucosa"
(NH
4
)
2
SO
4
MgSO
4
7H
2
O
K
2
HPO
4
FeSO
4
-7H
2
O
DH
Medio 1.
10.0
5.0
2.0
2.0
0.1
6.5-7.0
a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, excepto la glucosa.
b. La glucosa debei disolverse en recipiente separado de las sales.
c. Ajustar el pH en el medio de sales.
d. Agregar el agar (15 g/L) y calentar a ebullicin durante 1 minuto.
e. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos las dos soluciones.
f. Dejar enfriar a 40C y cerca del mechero mezclar las soluciones.
g. Distribuir el medio en volmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones aspticas.
manual de prcticas del \ - ".": \ ? V
a
\O :*T:
107
4. Agar de Eosina azul de metileno ( EMB-agar). Es un medio de cultivo comercial utilizado para identifica-
cin y diferenciacin de enterobacterias.
Ingredientes
Peptona de gelatina
Lactosa
Sacarosa
K
2
HPO
4
Eosina
Azul de metileno
Agar
<g/L)
10.0
5.0
5.0
2.0
0.4
0.065
13.5
(0
ca a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco.
b. Calentar a ebullicin durante 1 minuto
c. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos
d. Distribuir el medio en volmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones aspticas.
5. Agar para Estafilococos No. 110. Es un medio selectivo comercial para el aislamiento e identificacin de
estafilococos.
ingredientes ( g/L)
Extracto de levadura 2.5
Peptona de casena 10.0
Gelatina 30.0
Lactosa 2.0
D-Manitol 10.0
NaCI 75.0
K
2
HPO
4
5.0
Agar 15.0
pH final 7.0
a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco.
b. Calentar a ebullicin durante 1 minuto
6. Papa-Dextrosa Agar ( PDA). Es un medio slido complejo comercial de uso general para el cultivo de hongos.
Ingredientes
Glucosa
Extracto de papa
Agar
PH
( g/L)
20.0
4.0
15.0
5.6
b. Ajustar el pH
c. Calentar a ebullicin durante 1 minuto
7. Papa Dextrosa Agar rosa de bengala Es un medio slido complejo de uso general para el aislamiento de
hongos
Ingredientes ( g/L)
Glucosa 20.0
Extracto de papa 4.0
Rosa de bengala 0.03
Agar 15.0
pH 5.6
a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, menos el agar
b. Ajustar el pH
c. Agregar el agar y calentar a ebullicin durante 1 minuto
8. Czapek-Dox Agar (CDA) Es un medio de sales, de uso general para el cultivo de hongos poco exigentes.
(0
a
o
Ingredientes
Sacarosa
NaNO
3
KH
2
PO
4
MaSO
4
-7H
2
O
KCI
FeSO
4
-7H
2
O
Agar
PH
<g/u
30.0
2.0
1.0
0.5
0.5
0.01
15.0
5.6
a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado. Ajustar el pH
b. Agregar el agar y calentar a ebullicin durante 1 minuto
9. Caldo rojo de fenol Es un medio con diferentes azucares (glucosa, sacarosa, manitol) para pruebas de
fermentacin
Ingredientes
Azcar
KH
2
PO
4
K
2
HPO
4
Extracto de levadura
Rojo de fenol
pH final
(g/L)
20.0
9.1
9.5
0.1
0.01
6.8-7
a. Disolver cuidadosamente las sustancias
b. Ajustar el pH
c. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapn de rosca
d. Colocar un tubo de Durham invertido
e. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos
109
10. Medio citrato de Simmons Agar. Medio complejo de prueba de utilizacin de citrato en enterobacterias
Ingredientes
Citrato de Sodio
K
2
HPO
4
NH
4
H
2
PO
4
MgSCy7H
2
O
NaCI
FeSCy 7H
2
O
Agar
Azul de bromotimol
PH
( g/U
2.0
1.0
1.0
0.2
5.0
0.01
15.0
0.08
7.0
(0
CQ
0
b. Ajustar el pH
c. Calentar a ebullicin durante 1 minuto.
d. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapn de rosca.
f. Dejar solidificar el medio en forma inclinada.
11. Caldo urea. Se emplea para la identificacin de bacterias, particularmente para diferenciar los miembros del
gnero Proteus de Salmonella yShlgella
Ingredientes
Urea
KH
2
PO
4
K
2
HPO
4
Rojo de fenol
pH final
<g/U
20.0
9.1
9.5
0.1
0.01
6.8
b. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapn de rosca.
c. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
12. Medio SIM. Medio semisiido usado rutinariamente en la diferenciacin e identificacin de cultivos de
Enterobacterias y que detecta la produccin de sulfuras, indol y movilidad de las mismas.
Ingredientes ( g/L)
Peptona de carne 6.1
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Tiosulfato de sodio 0.2
Agar 3.5
pH final 7.3
110
13. Agar almidn. Para determinar actividad amiloltica
ingredientes ( g/U
Almidn 10.0
NaCI 8.0
Extracto de carne 3.0
Agar 15.0
pH 6.5-7.0
b. Ajustar el pH
c. Calentar a ebullicin durante 1 minuto.
14. Medio de leche con tornasol. Medio comercial para diferenciar microorganismos sobre la base de sus
mltiples reacciones metablicas en un medio lcteo
ingredientes ( g/L)
Leche descremada deshidratada 100
Polvo de tornasol 0.75
15. Agar de hierro y triple azcar TSI. Medio comercial para identificar y diferenciar enterobacterias. Se basa
en la formacin de sulfuros y fermentacin de glucosa, sacarosa y lactosa.
ti
t
(8
a
o
T3
ingredientes
Mezcla de peptonas
NaCI
Lactosa
Sacarosa
Dextrosa
Sulfato de amonio frrico
Tiosulfato de sodio
Rojo fenol
Agar
pH final
(g/L)
20.0
5.0
10.0
10.0
1.0
0.2
0.2
0.025
13.0
7.3
b. Calentar a ebullicin durante 1 minuto.
c. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapn de rosca.
e. Dejar solidificar el medio en forma inclinada.
111
16. Medio de gelatina. Medio comercial para determinar actividad de proteasas
Ingredientes
Peptona de gelatina
Extracto de carne de res
Gelatina
pH final
( g/U
5.0
3.0
120.0
6.8
QQ
17. Medio de agar nutritivo blando.- Es un medio semisiido complejo de uso general para determinar movi-
lidad de bacterias
Ingredientes
Peptona de casena
NaCI
Extracto de carne
Agar
PH
( 0/L)
5.0
8.0
3.0
3.5
6.5-7.0
a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado
b. Ajustar el pH
c. Calentar a ebullicin durante 1 minuto
d. Distribuir en tubos de ensaye con tapn de rosca
18. Medio de cultivo complejo. Para la curva de crecimiento microbiano probando diferentes concentraciones
de sustrato carbonado. (1-20 g/L)
Ingredientes
Glucosa
Peptona de casena
K
2
HPO
4
PH
( g/L)
10.0
2.0
0.5
0.5
6.5
a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado.
b. Agregar la cantidad de glucosa correspondiente
c. Ajustar el pH
d. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
112
19. Caldo microinoculacin. Medio comercial para cultivar y preparar inculos de Lactobacilos y otros
microorganismos utilizados en ensayos microbiolgicos.
ingredientes
Mezcla de peptonas
Dextrosa
KH
2
PO
4
Polisorbato 80
PH
<g/U
20.0
5.0
10.0
2.0
0.1
6.5
o
o
{
a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado. w
b. Ajustar el pH o
113
manual de prcticas del * > > ,
114
; ; --
Atlas de pruebas bioqumicas
116
CITRATO DE SIMMONS
a: negativo, b: y c: positiva
USINA DESCARBOXILASA
a: negativo, b:, c: y d: positiva
TRIPLE AZCAR HI ERRO
a: negativo, b: cido/cido
c: cido/alcalino con gas
PRODUCCIN DE GAS EN CAMPANA DE DURHAM
a: negativo, b: positivo con gas, c: positivo sin gas
SULFURO INDOL MOHLIDAD
a: sin inocular, b: microorganismo no mvil,
c: microorganismo mvil
LECHE TORNASOLADA
a: negativo, b:, c: y d: positiva
AISLAMIENTO DE Rhodotorula
sp.
Manual de prcticas del Laboratorio de Microbiologa General, se termin de imprimir
en el mes de junio de 2004 en la Seccin de Talleres Grficos del Departamento de Publica- }** -> 0
ciones de Rectora General de la Universidad Autnoma Metropolitana. Se tiraron 1000 ejem- *> # ^ #n
piares sobre papel grfico bond de 60 kgs., en tipos Castle de 11 y 13 pts., en interiores y de O * *
32 y 17 pts., para portada. Diagramacin, formacin y portada, diseados por D.G. Liliana
Hidalgo Snchez de Tagle, de la Seccin de Textos y Formacin del mismo Departamento. kfQ ** 0
N.E. 0534
$17.00
9 789703 101412
Manual de prac. lab de
microbiologa general,
publicaciones CBS
UAM-Iztapalapa Librera

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