Tesis Valeria Towns

FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD
U N I V E RNS I D A DAUTÓNOMA
ACIONAL
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
N A C I ODENMAÉXICO
L DEAMUÉXICO
TÓNOMA
DE MÉXICO
TÍTULO DE LA TESIS
FA C U LTA D D E C I E N C I A S
TÍTULO DE LA TESIS
T Edel RNA
Identificación S mensajero
I S de
dos genes delTÍTULO DE LA TESIS en el
reloj circadiano
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LICENCIADO(A) EN CIENCIAS DE LA COMPUTACIÓN
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LICENCIADO(A) EN CIENCIAS DE LA COMPUTACIÓN
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NOMBRE DEL ALUMNO
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ACTUARIO(A), BIÓLOGO(A), FÍSICO(A), MATEMÁTICO(A),
LICENCIADO(A) EN
TUTOR(A) CIENCIAS DE LA COMPUTACIÓN
TUTOR(A)
Empezar por grado, nombre(s) y apellidos completos, con mayúsculas
Empezar por grado, nombre(s) y apellidos completos, con mayúsculas
DIRECTOR DE TESIS:
Dra. M aria Luisa Fanjul Peña
2007
P R E S E N T A :
UNAM
2007
2010
UNAM
NOMBRE DEL ALUMNO

Empezar por nombre(s) y apellidos completos, con mayúsculas
Identificación del RNA mensajero de dos
genes del reloj circadiano en el acocil
Procambarus clarkii
Valeria Towns Alonso

Universidad Nacional Autonoma de México
Facultad de Ciencias
2010
Tutor: Maria Luisa Fanjul Peña

Lab. Neurofisiología Comparada
F. Ciencias
UNAM
2
Hoja de Datos del Jurado
1.Datos del alumno
Towns
Alonso
Valeria Stephanie
58 11 60 82
Universidad Nacional Autonoma de Mexico
Facultad de Ciencias
Biología
405100327
2. Datos del tutor

Dra.
María Luisa
Fanjul
Peña
3. Datos del sinodal 1

Dr.
Alejandro
Zentella
Dehesa

Dr.
Román
Vidal Tamayo
Ramírez

Dr.
Carlos Arturo II
Becerra
Bracho

Dra.
Luisa Alvarina
Alba
Lois
3
S I N TI TU LO (AG RADEC IMIENTOS)
Desde el momento en que comencé a redactar esta tesis y hasta el día de hoy, una noche, tan solo
unas horas antes de dar el paso final y decidirme a llevar dicho documento a una imprenta.
Obviamente tras haber revisado, reconocido, inspeccionado, reexaminado cada una de las letras
aquí mecanografiadas y con todos los riesgos nerviosos de tener una larga lista de Fe de erratas.
Me atrevo a aseverar que, la parte más difícil de esta tesis no fueron las horas en el laboratorio,
ni los intentos fallidos o las clonas chiclosas y mucho menos el hecho de haber perdido casí toda
la información hace algunos meses, sino definitivamente estos 400 minutos, divididos a lo largo
de breves lapsos durante varios días e incluso meses, que llevo sentada frente la hoja en blanco
que debo llenar y que se titula “Agradecimientos”.
Comencé con el formato tradicional y fracasé, así que lo primero que decidí fue anotar en el
centro la frase “Gracias a Dios”, la cual estuvo escrita durante otra razonable cantidad de tiempo,
hasta esta noche, cuando me percate que para poder redactar en ella definitivamente debía
cambiarle el título: -Pero... ¿que titulo ponerle?; era evidente que algo relacionado con aquello
que buscaba transmitir; y fue entonces que me pareció mas coherente dejarla sin titulo, pues no
pretende ser absolutamente nada.
¿A quien agradecer? existen tantas personas que me han impulsado, impactado, enseñado y
apoyado en cada paso del camino para finalmente estar aquí, terminando de redactar lo que
aparenta ser mi primer y no se si último libro. Nombrar a mis padres, hermanos e innumerables
familiares, amigos, asesores, maestros, jefas, profesores, compañeros, amantes y contrincantes
presentes en el juego, honestamente me parece inútil, la lista sería enorme, no podría perdonarme
olvidar algún nombre y entonces si, nunca terminaría esta brevísima tesis.
A quienes les he fallado y lo han perdonado, a quienes nunca me han negado una segunda
oportunidad, una prueba más, un diferente experimento, otra salida, otro kit de purificación, otro
consejo, unos minutos más o un comienzo nuevo. A los que están y han estado siempre a mi
lado, a los recién encontrados, a los que ya conocen mis mañas, a quienes no siguen aquí pero lo
estuvieron en su momento, a los que nunca dejarán de estarlo. A los que me aceptan, a los que
me odian, los que me toleran, a quienes me aman y a quienes me ladran. A todos ustedes
mundos, humanos y animales diferentes, gracias, por hacer cada día, cada segundo de mi vida un
nuevo aprendizaje, una enseñanza y una satisfacción o una añoranza. Gracias por ser parte de
quien soy, del final de esta etapa y el comienzo del resto de mi vida. Gracias porque sin ustedes
esto no sería posible. GRACIAS
4
CONTE NI D O
1. RESUMEN
7
2. INTRODUCCIÓN
8
2.1 Generalidades del reloj biológico
9
2.1.1 Ritmos y sincronización
9
2.1.2 Ritmos, relojes y marcapasos

14
2.2 Bases genéticas y moleculares de los ritmos circadianos en

vertebrados e invertebrados
15
2.3 El sistema circadiano del acocil Procambarus clarkii
21
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

27
4. HIPÓTESIS
30
5. OBJETIVOS
31
6. MATERIAL Y MÉTODO
32
6.1. Animales y diseño experimental
33
6.2. Diseño de cebadores (oligonucleótidos/ primers)
33
6.3. Extracción de RNA

34
6.4 . RT - PCR
35
6.5 . Purificación del cDNA
37
6.6 . Clonación
38
Contenido 5
6.7 Análisis de secuencias
40
6.8 . Análisis funcional
41
7. RESULTADOS
42
7.1 Análisis del RNA
43
7.2 Establecimiento de las condiciones para la reacción RT- PCR
43
7.4 Identificación de un posible fragmento de P. clarkii Per
50
7.5 Clonación de los productos
54
7.6 Análisis de ritmicidad
57
8. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
59
60
8.2 PCR semicuantitativa y análisis funcional
60
8.4 Conclusiones
64
8.3 Perspectivas
65
BIBLIOGRAFÍA
67
Anexo
72
1. Diseño Cebadores
73
Contenido 6
1 . RE S U MEN
Las bases moleculares del reloj circadiano se han estudiado en diferentes organismos
proponiéndose diferentes paradigmas, el más aceptado sugiere un mecanismo que consiste en una
doble asa de retroalimentación transcripción-traducción interconectada. La base del modelo es la
retroalimentación negativa de la proteína PER sobre su propia transcripción, siendo la proteína
CLOCK el elemento positivo del asa. Ambos genes han sido identificados tanto en vertebrados
como en invertebrados.
En el acocil Procambarus clarkii, no se han descrito los mecanismos moleculares del reloj.
Debido a lo cual, el objetivo del presente trabajo fue tratar de caracterizar el RNA mensajero
(mRNA) de los genes Per y Clk, mediante RT-PCR, en una de las estructuras centrales propuesta
como posible marcapaso del sistema circadiano de Procambarus clarkii, el cerebro, así como
determinar si existe un efecto del tiempo circadiano del animal sobre la abundancia en la
expresión de estos dos genes.
Para ello, se diseñaron diferentes cebadores a partir de regiones conservadas de los genes
Per y Clock caracterizados en diferentes especies animales. El mRNA extraído de muestras de
cerebro de acocil obtenido a 6 diferentes puntos temporales de un ciclo de 24 h se utilizó para
obtener el correspondiente cDNA mediante transcripción reversa y PCR (RT-PCR). Los
amplicones que se separaron por electroforésis en geles de agarosa y las bandas de interés se
cortaron purificaron, secuenciaron y clonaron.
Los resultados muestran que la secuencia de los productos obtenidos (cDNA) tiene
diversos grados de identidad con las secuencias de pares de bases y de aminoácidos de genes y
proteínas del reloj de otros invertebrados. PCclock es similar a la región conservada en el gen
clock del crustáceo Machrobranchium rosenbergii, mientras que Pcper muestra identidad con el
mismo gen en varias especies de palomillas.
Para determinar si existen variaciones entre el día y la noche subjetivos en la cantidad del
mRNA de ambos genes; se cuantificó la densidad de las bandas de todas las horas utilizando el
sistema fotodocuemtador Gel Logic 200 (Kodak) y el programa Kodak MI. Los resultados indican
que los fragmentos presentan oscilaciones diarias siendo el pico máximo de expresión de Per a las
0300 hr y de Clk a las 1900 hr.
Resumen 7
2 . I NTROD U CCIÓN
O l d T i m e , t ha t g r e a t e s t a nd l o ng e s t e s t a bl i s he d
s pi nne r o f a l l !....
hi s f a c t o r y i s a s e c r e t pl a c e ,
hi s w o r k i s no i s e l e s s ,
a nd hi s ha nds a r e m ut e s .
( C ha r l e s D i c k e ns )
W he t he r w e w a k e o r w e s l e e p,
W he t he r w e c a r o l o r w e e p,
T he S un w i t h hi s Pl a ne t s i n c hi m e ,
Ma r k e t h t he g o i ng o f T i m e .
( Edw a r d Fi t zg e r a l d)
Introducción 8
2.1 Generalidades del reloj biológico
2.1.1 RITMOS Y SINCRONIZACIÓN
Los cambios cíclicos son fenómenos siempre presentes en nuestro ambiente, puesto que, tanto la
rotación como la traslación de nuestro planeta originan ciclos diarios y estacionales, que se
manifiestan como variaciones en la cantidad de luz, la temperatura, las mareas, la humedad y
muchos otros factores del medio. De hecho, cambios cíclicos y no constancia, parecen ser la
regla de la vida, y la ritmicidad biológica se considera un mecanismo para anticipar dichos
cambios. (Willard et. al. 2006).
Un ritmo puede ser definido como un evento que se repite con un patrón similar a lo largo del
tiempo. La recurrencia de cualquier evento biológico en intervalos de tiempo más o menos
regulares, puede ser considerado un ritmo biológico (Aschoff J; 1981). Muchos de estos ritmos
no son tan solo una respuesta a cambios ambientales, sino que provienen de un marcapaso o reloj
interno. (Turek F. Takahashi J. 2001), es decir, son endógenos.
Los ritmos biológicos se expresan dentro de una amplia gama de frecuencias (Hiriart M; 2008).
El periodo, esto es el inverso de la frecuencia, se define como el tiempo en que tarda en
completarse un ciclo en una sucesión de ondas; es decir el intervalo de tiempo que transcurre
para que se repita una fase determinada de la oscilación (Dunlap et. al. 2004. Saunders; 2002). Al
periodo de un ritmo biológico mantenido en condiciones constantes se le conoce como el periodo
ritmo en oscilación espontánea (Aguilar Roblero et al; 2009). Aquellos ritmos cuyo periodo de
oscilación es cercano a las 24 h (entre 19 y 27 h) y se mantiene en condiciones constantes, se les
conoce como circadianos (del latín: circa: alrededor y diem: día) y son una adaptación a la vida
en la Tierra, que al girar alrededor de su eje, una vez, aproximadamente cada 24 h, somete a las
plantas y los animales a ritmos diarios de luz y temperatura altamente predecibles (Moore-Ede
et. al. 1982). Aquellos ritmos cuyo periodo es menor a 20 h se les llama ultradianos y los que
Introducción 9
presentan periodos mayores a 28 h, se conocen como infradianos (Arechiga H; 1996. Dunlap et.
al; 2004. Kuhulman et. al; 2007)
Cabe aclarar que no todos los ritmos son de naturaleza endógena. Algunos son únicamente
controlados por las señales externas, como el ciclo luz oscuridad. Estos se denominan ritmos
diarios, y a diferencia de los circadianos, no persisten en condiciones ambientales constantes.
(Sehgal A; 2004)
Los pioneros en el estudio experimental de los ritmos fueron el astrónomo francés DeMairan en
1792 y posteriormente el botánico suizo DeCandolle, en 1835, que independientemente
describieron como las hojas de las plantas presentan movimientos rítmicos con un periodo
cercano a 24 h, incluso en ausencia de las señales del medio. A partir de ese momento comenzó
un arduo trabajo para tratar de describir, mediante la metodología científica, los mecanismos de
las oscilaciones endógenas y gracias a los trabajos de científicos como Bunning, Aschoff y
Pittendrigh, es que conocemos los parámetros que describen con rigor y de manera formal los
ritmos biológicos (Roenneberg y Merrow; 2002. / Daan y Beersma; 2002).
Los ritmos biológicos son ubicuos y por tanto se pueden observar en organismos tan diversos
como las algas, la mosca de la fruta, los crustáceos, las aves y los mamíferos, entre otros. El
reloj circadiano le permite a los seres vivos predecir y prepararse con anticipación a los cambios
en el ambiente físico asociados con el ciclo día y noche. Así, el organismo esta adaptado tanto
fisiológica como conductualmente, para afrontar los retos impuestos por dichos cambios, de
modo que existe una sincronía entre el ambiente externo y el medio interno. De esta manera, el
reloj biológico dota al organismo con una organización temporal interna y se asegura de que los
cambios estén coordinados uno con el otro (Pittendrigh; 1981).
El reloj circadiano ha sido conceptualizado como una serie de tres componentes: 1) Una vía de
sincronización que transmite las señales ambientales al aparato medidor y dador de tiempo, 2) el
oscilador o marcapaso central, que opera aún en ausencia de señales externas y es el componente
central del reloj biológico y 3) las vías de salida, por medio de las cuales se transmite la
Introducción 10
información temporal de este oscilador a los diferentes efectores a través de los cuales se hace
manifiesto el ritmo. Tanto las vías de salida como los efectores y el ritmo están acopladas al ciclo
del oscilador circadiano (Hardin; 2000).
Bajo este supuesto, los ritmos circadianos comparten un conjunto de propiedades, entre las que
se pueden enunciar, como las más notables: 1) La persistencia del ritmo en condiciones
constantes. 2) La capacidad de sincronizarse con las señales del medio ambiente. 3) Y la cualidad
de oscilar con un valor de periodo casi invariable en un cierto intervalo de temperatura, es decir
el reloj es capaz de compensar los cambios de temperatura (Arechiga H. 1996). Esta propiedad
se ha podido comprobar mediante la observación de que en condiciones de luz u oscuridad
constantes, el periodo de oscilación espontánea se mantiene con un valor muy similar cuando es
medido a diferentes temperaturas (Dunlap et. al; 2004); es decir, el ritmo posee un Q10
(coeficiente de temperatura que representa el factor por el cual el intervalo de una reacción se
modifica al aumentar 10 °C su temperatura) se aproxima a 1 (Hastings M, Maywood E; 2000).
Esta característica resulta importante, pues un reloj dependiente de la temperatura solo generaría
errores en la medición del tiempo. (Pittendrigh C; 1954).
Puesto que el periodo endógeno del ritmo no coincide exactamente con el periodo de los ciclos
externos, los organismos deben obtener información de los ciclos ambientales para adecuar sus
funciones a los cambios rítmicos del medio. Estos "dadores de tiempo" (Zeitgebers) envían la
información sensorial cíclica al marcapaso, que sincroniza el periodo interno con el astronómico,
adecuando las funciones del organismo al reloj biológico (Fanjul-Moles; 2007). Así, nos
referimos al tiempo definido por el ciclo ambiental como tiempo del zeitgeber (ZT)
La sincronización es el ajuste del periodo del sistema circadiano (τ) de modo que este sea igual el
periodo del zeitgeber (T). Cuando hay sincronización, el sistema adopta una relación de fase
específica con el ambiente; es decir, la diferencia de fase entre el marcapaso y el zeitgeber se
vuelve cero. La sincronización cumple con dos propósitos principales: el control de la fase y el
ajuste del periodo (Turek. Takahashi; 2001), de modo que existen tres criterios importantes para
demostrar experimentalmente la sincronización:
Introducción 11
1) El ritmo debe ser observado en la presencia del zeitgeber y el periodo del ritmo debe ser
idéntico al del zeitgeber y diferente al de este en su ausencia. 2) La oscilación circadiana en
presencia de señales ambientales debe tener la misma fase que el zeitgeber. 3) Por ultimo, debe
ser posible distinguir la sincronización del enmascaramiento o masking (en ingles). Este
fenómeno se refiere al efecto inductor o inhibidor del zeitgeber sobre la expresión del ritmo, el
cual se puede confundir con la sincronización. De hecho, la luz promueve la actividad
locomotora espontánea en la mayoría de los organismos diurnos (masking positivo), mientras que
suprime dicha actividad en animales nocturnos (masking negativo) (Dunlap et. al. 2004. Daan y
Aschoff; 2001).
Las señales ambientales que sincronizan el reloj incluyen a la luz, la temperatura, los estímulos
sociales, la disponibilidad de alimento, entre otros; sin embargo, la luz ha sido identificada como
el zeitgeber más importante (Kyriacou et. al. 2000). Esto resulta obvio desde el punto de vista
funcional , pues el ciclo luz oscuridad (LO) representa la señal mas precisa para medir el tiempo
en la mayoría de los ambientes, lo cual puede ser considerado como una presión selectiva para el
sistema de sincronización (Daan y Aschoff; 2001). De hecho, los principios y propiedades
básicas de la sincronización por el ciclo LO son muy similares entre diversos organismos.
(Turek, Takahashi; 2001)
Cuando mantenemos a un organismo en ciclos de 12 h luz y 12 h de oscuridad, el tiempo del

zeitgeber donde las luces se encienden, se denomina ZT0 y el momento en que las luces se
apagan es el ZT12; de modo que el tiempo transcurrido entre la ZT0 y ZT12 se refiere a las horas
del día subjetivo y el tiempo restante (entre 12 y 0) se refiere a la noche subjetiva. (Sehgal.
2004). Si un ritmo se encuentra sincronizado a un ciclo de esta naturaleza, el tiempo circadiano
del ritmo coincidirá con el tiempo del zeitgeber puesto que 1 hora circadiana = τ/ T.
Con el objetivo de encontrar las relaciones entre el medio externo y el marcapaso; se han llevado
acabo numerosos estudios para evaluar el comportamiento y adaptación de los ritmos circadianos
ante el avance o retraso en la fase del ciclo LO. De modo que una modificación en la fase del
Introducción 12
zeitgeber da como resultado un ajuste de la fase del periodo endógeno. Sin embargo, el ritmo no
se sincroniza de inmediato, sino que pasa por una serie de ciclos transitorios hasta alcanzar una
fase estable con el zeitgeber. Estos ajustes también se dan ante cambios en la fase de ciclos de
temperatura o de variables bioquímicas. ( Koukkari. Southern; 2006. Sehgal. 2004)
Cuando una fase se adelanta es decir que el evento ocurre más temprano, decimos que el cambio
de fase es positivo. Si la fase se atrasa, decimos que el cambio es negativo ( Koukkari. Southern;
2006). La razón al hacer énfasis en esto es que, cuando le son administrados pulsos de luz a un
organismo en oscuridad constante, se producen cambios de fase discretos en el ritmo de
oscilación espontánea. La cantidad y dirección del cambio de fase, ya sea positiva o negativa,
dependen de la fase del ritmo donde se suministra el pulso de luz (Pittendrigh; 1981). La gráfica
que representa la relación entre el cambio de fase del ritmo y la fase donde se aplica el pulso, se
conoce como Curva de Respuesta de Fase (CRF) y constituye una descripción de la sensibilidad
del sistema circadiano ante un zeitgeber.
Los mayores atrasos de fase, ante un estímulo, ocurren durante la noche subjetiva temprana,
cuando los organismos diurnos inician su fase de reposo y los nocturnos su actividad. Los
avances de fase más grandes ocurren en la noche subjetiva tardía. Hay relativamente pocos
cambios de fase cuando el estímulo llega durante el día subjetivo (Moore-Ede et. al. 1982).
El hecho de que un ritmo sea capaz de sincronizarse con la luz implica la presencia de un
fotorreceptor capaz de enviar información al marcapaso. En algunos animales existe evidencia de
la presencia de estructuras fotorreceptoras organizadas, como los ojos compuestos, en otros casos
se observan receptores extrarretinianos solamente y en algunos parecen coexistir múltiples
receptores (Bradley; 1974)
Introducción 13
2.1.2 RITMOS, R E L O J E S Y M A R C A PA S O S
La mayoría del conocimiento sobre los relojes circadianos, está basada en la observación de los
ritmos, sin embargo, dichos ritmos no son el reloj (Dunlap et. al. 2004). Un grupo de células que
muestran cambios cíclicos en su fisiología y expresión génica, son consideradas osciladores
biológicos. Un oscilador que es influido por el zeitgeber, muestra ritmos endógenos y regula los
ciclos fisiológicos de otros osciladores, es denominado marcapaso (Herzog; 2007). Así, el reloj
biológico es un oscilador capaz de medir el tiempo de dos formas conceptualmente distintas; al
proporcionar una relación de fase entre el programa interno y el ciclo ambiental, mide el tiempo
local y al asegurar la sucesión eventos en una secuencia temporal estable, miden el lapso de
tiempo sideral. (Pittendrigh; 1981 / Dunlap et. al; 2004)
Existen, por lo tanto, dos tipos de osciladores biológicos: 1) Aquellos autosostenibles, que
generan ritmos circadianos y oscilan endogenamente, además de contar con vías de
sincronización con el ambiente, tanto externo como interno; 2) y aquellos, denominados
osciladores esclavos, que requieren la información de los primeros para mantener la amplitud de
su oscilación. Cuando un grupo de marcapasos controlan la misma salida, deben sincronizarse,
no solo con el medio, también entre ellos, de modo que se produzca un ritmo coherente (Herzog;
2007)
El reloj en los organismos unicelulares como el hongo del pan (Neurospora crassa) y la bacteria
(Sinechococcus elongatus), parece estar compuesto por osciladores múltiples dentro de una sola
célula. En estos sistemas se ha observado como células individuales regulan diversas salidas
circadianas. (Bell-Pedersen et. al. 2005)
Entre las pruebas que demuestran la existencia anatómica de los osciladores autosostenibles, se
encuentran los experimentos realizados en el molusco Bulla gouldianna, donde se estudiaron 100
neuronas retinales básales que presentan un ritmo diario en el potencial de acción, siendo su pico
Introducción 14
máximo durante el día, y aún si se secciona el nervio óptico, son capaces de sincronizarse con la
luz y oscilar espontáneamente en condiciones constantes (Block y Mc Mahon; 1984).
En el cerebro de la mosca de la fruta (Drosophilla melanogaster) se han caracterizado

funcionalmente dos osciladores en las neuronas laterales (LN), aquellas que expresan el Factor
Dispersor del Pigmento (PDF) , dirigen la actividad de la mañana y aquellas que no lo expresan,
dirigen la actividad de la tarde (Picot et. al. 2007). Sin embargo, existe un conjunto de
evidencias que demuestran la existencia de osciladores periféricos autosustentables y capaces de
sincronizarse con la luz (Giebutowicz; 2004), sugiriendo que el sistema circadiano es
multioscilatorio.
En algunas aves, como los gorriones, existe evidencia de que la glándula pineal es el marcapaso
central; sin embargo, para otras especies como la codorniz japonesa, un segundo modelo,
propone a la retina y el Núcleo Supraquiasmático como el reloj central (Dunlap et. al; 2004).
En el caso de los mamíferos, la localización del reloj se sugirió por primera vez cuando lesiones
en el Núcleo Supraquiasmático (NSC) modificaban el comportamiento del reloj de los roedores,
volviendose arrítmico (Hastings M, Maywood E; 2000). Más contundente aún es la observación
de que el transplante de tejido del NSC en organismos donde este había sido lesionado, restituye
el comportamiento rítmico de los animales (Bell-Pedersen et. al. 2005).
2.2 Bases genéticas y moleculares de los ritmos circadianos en

vertebrados e invertebrados
Las bases moleculares del reloj circadiano han sido estudiadas en diversos organismos que van
desde la mosca de la fruta , hasta el hongo del pan y la bacteria Sinechococcus s.p. En estos
organismos parece haber evolucionado un mecanismo general donde un asa de retroalimentación
con elementos positivos y negativos cumple el rol principal. (Hardin et. al. 1990). Este modelo
genético del sistema circadiano consiste en la transcripción y traducción de un gen a proteína.
Introducción 15
Esta proteína inhibe o promueve, directa o indirectamente, su propia transcripción, y el ciclo
reinicia cuando la proteína es degradada. El resultado son oscilaciones circadianas del RNA
mensajero (mRNA) y de la proteína (Roenneberg y Merrow; 2003)
El paradigma convencional del reloj molecular en D. melanogaster, implica la interacción de las

proteínas: Period (dPer), Timeless (dTim), con los factores de transcripción: Clock (dClk), Cycle
(dCyc), Par Domain Protein (DPDP1) y Vrille (dVri); 3 cinasas: Double-Time (dDbt), Shaggy
(dSgg), la Casein Cinasa 2 (dCK2) y la Fofatasa 2a (dPP2a). Esta asa molecular (Fig. 1) está
compuesta por varios elementos, cada uno de los cuales depende directamente del componente
que lo antecede en el asa; por ejemplo, el intervalo de producción de proteína depende de las
cantidades de mRNA transcrito (Roenneberg y Merrow; 2003).
El primer ¨gen reloj¨ descubierto, period (per), fue identificado en mutantes arrítmicas de D.
melanogaster y el análisis de la cinética de expresión del gen, sugirió el modelo en el que se
basan los diversos paradigmas genéticos que tratan de describir los diferentes sistemas
circadianos. Posteriormente, se demostró que otro producto génico, conocido como Timeless
(Tim) estaba involucrado en el mecanismo central del reloj. Desde entonces se ha identificado
que alelos nulos para cualquiera de los dos genes (per01 y tim01 ) dan como resultado la
completa perdida de la ritmicidad, así como la existencia de alelos, para ambos genes (perL, perS
y timL, timS), que modifican el periodo. (Yang. Sehgal; 2001) .
En D. melanogaster, tanto la vida media de las proteínas como de los mRNAs de per y tim
muestran oscilaciones circadianas robustas, donde el pico de mRNA aparece durante la noche
temprana y el de la proteína durante la noche tardía. (Hardin et. al; 1990. Yang. Sehgal; 2001.)
Así, se presenta una sucesión de eventos regulados temporalmente, donde se producen retrasos
en los picos de los niveles de expresión de los genes y proteínas dperiod (per) y dtimless (tim),
debido a las modificaciones postraduccionales llevadas a cabo por cinasas y fosfatasas; así como
la cinética de dimerización, mediante el dominio funcional de interacción “PAS”, de las proteínas
PER y TIM para entrar al núcleo y reprimir su propia transcripción (Piccini et. al. 2000).
Introducción 16
Tras el aumento en los niveles de mensajero de dPer y dtim, se observa un incremento en la
formación del heterodímero de las proteínas PER/TIM en el citoplasma, cuyo pico muestra un
retraso de 6 h con respecto al del mRNA. Este retraso esta mediado, en parte, por las cinasas
DoubleTime (DBT) y la Casein Cinasa, que fosforilan a Per y promueven su degradación por la
vía del proteosoma. (V. Sheeba et. al; 2008)
En el paradigma convencional, las proteínas del reloj interactuan entre ellas para formar un asa
de retroalimentación, de tal modo que los productos de la traducción de los genes dClk y dCyc,
se relacionan para formar un complejo de factores de transcripción (CLK/CYC) que se une a las
secuencias "E-box" en los promotores de los genes dPer y dTim, activando su transcripción
(Rubin et. al. 2006). Por ello, Clk y Cyc constituyen los elementos positivos del asa de
retroalimentación. El heterodímero PER/TIM se trasloca al núcleo para inactivar a CLK/CYC y
así inhibir su propia transcripción (Rubin et. al; 2006, Kiriakou P. et. al; 2008, V. Sheeba et. al;
2008), siendo entonces, Per y Tim, los elementos negativos del asa.
Sin embargo, se ha demostrado que la traslocación de Per y Tim al núcleo, puede ocurrir
independientemente de la existencia del dímero, En estudios In vitro en células S2; se observa
que la formación del dímero antecede a la disociación y entrada independiente de las proteínas al
núcleo; lo que ha llevado a la sugerencia de que la formación del complejo PER/TIM podría
tener la función de un cronómetro que mide el intervalo previo al evento de entrada al núcleo ( V.
Sheeba et. al; 2008).
El reloj molecular es sincronizado a la luz por medio del criptocromo dCry, una foto-proteína
que absorbe el espectro de luz azul y UV. Se cree que dCry se asocia a dTim en presencia de la
luz, para promover su rápida degradación por la vía del proteosoma (Rosato et. al; 2001),
impidiendo así la formación del heterodímero. Las moscas con mutaciones en el gen dCry son
insensibles a pulsos de luz en condiciones de oscuridad constante (OO) proponiendo a Cry como
indispensable para la sincronización (Van Gelder y Sancar; 2003)
Introducción 17
En Drosophilla, el complejo dClk-dCyc, están relacionado con otra asa de retroalimentación que
autorregula los ciclos de producción de dClk uniéndose a los promotores de los genes vrille (Vri)
y par domain protein-1ε (pdp1ε) . La proteína PDP1 activa la transcripción de Clk, mientras
que Vri la inhibe competitivamente ( Sheeba et. al; 2008). Formando así los elementos negativos
y positivos de la segunda asa. De modo que dClk se expresa circadianamente y cicla en antifase a
dPer y dTim (Rubin et. al; 2006). Sin embargo estudios recientes sugieren que el papel de Vri,
podría no ser trascendental en el funcionamiento del reloj (Kim and Edery, 2006).
Además de su función en el reloj central, se cree que Clk, una proteína con un dominio BHLH ,
que, como se menciono anteriormente, está relacionado con la activación de la transcripción
génica y un dominio PAS de interacción proteica, regula los niveles de mRNA de varios genes
de salida. En este modelo se asume que las modificaciones postraduccionales son las que
determinan la longitud del periodo y la fase de los ritmos generados por el oscilador. La amplitud
del ritmo podría ser regulada por diversos factores cuya transcripción esta mediada por Clk, entre
los que se encuentra el reciente candidato clockwork orange (cwo) (V. Sheeba et. al; 2008.
Hardin; 2000).
Fig 1. Modelo del asa de retroalimentación circadiana en D. melanogaster
Se muestra como se cree que están conformadas las asas moleculares de retroalimentación acopladas que dan lugar
a los ritmos circadianos. En el esquema se identifican los elementos negativos ( ) y positivos ( ) del asa
Introducción 18
Una comparación entre los mecanismos para la generación de ritmos en vertebrados y las
moscas, nos muestra que existe un alto grado de conservación, no solo en el diseño y funciones
generales del reloj, sino en que genes similares están involucrados en el modelo molecular
circadiano. Sin embargo, algunos de estos genes parecen haber tomado diferentes funciones en el
reloj de la mosca de la fruta que en el de ratón (Mus musculus) (Rubin et. al; 2006).
Estudios en los genes de mamíferos, sugieren un papel similar para los homólogos del gen per
en ratón (mper). En Drosophilla el mRNA del gen clock, oscila de modo circadiano; sin
embargo en el ratón no es este gen que oscila, sino Bmal1 (Siendo mBMal1 el ortólogo de
dCyc) . Por esto, pareciera que el mecanismo general del reloj ha sufrido diversas variaciones, tal
vez con algunas de las mismas moléculas llevando a cabo tareas ligeramente diferentes incluso
entre linajes cercanos. (Piccini et. al. 2000)
En mamíferos existen tres homólogos de Per y dos homólogos de Cry. A comparación de las
moscas, en los mamíferos la expresión de Clock es constitutiva tanto en el núcleo
supraquiasmático, como en los osciladores periféricos (Alvarez 2004). En Mus musculus mCry
es un elemento central de los marcapasos moleculares, ya que interactua con mPer, cumpliendo
una función similar a la de dTim, traslocandose al núcleo para inhibir la actividad transcripcional
de mClok-mBMal1 (Rubin et. al. 2006). Además, la actividad de mCry parece no depender de la
luz, siendo los fotorreceptores de las células ganglionares con proyecciones al NSC, la vía de
entrada de la luz al reloj (Looby P. Loudon A. 2005), En algunas de estas células ganglionares
existen pigmentos como las melanopsinas y probablemente ciertos criptocromos que envían
información al NSQ a través de una vía distinta a la visual ,el tracto retino hipotalámico.
Para el caso de estos organismos, el descubrimiento de nuevos componentes como las proteínas
Rev-ErbB, Dec1 y Dec 2 que tienen una acción negativa sobre la transcripción de Bmal1, ha
añadido un circuito negativo que tiene influencia sobre el asa de retroalimentación central,
sugiriendo la existencia de un sistema mas complejo que involucra mas de un asa de
retroalimentación interactuando entre si. (Roenneberg T. Merrow M., 2003).
Introducción 19
Los genes Per2 y Per3 ambos, se han encontrado expresados en mamíferos, aves, peces, y
anfibios. De igual manera se han descrito dos formas de Bmal, Clock y dos homólogos de
criptocromos, Cry1 y Cry2. En el caso de Per, se ha observado su presencia y oscilación en
retina, corazón, pulmón y ovarios de aves y mamíferos. Para el caso de las aves, se ha descrito
que los genes Bmal tienen una correspondencia del 93% y 65% con los genes Bmal1 y Bmal2
humanos respectivamente. Poco se sabe sobre los mecanismos moleculares del reloj de reptiles
y mucho menos en crustáceos.(Williams 2004).
En el modelo biológico del anfibio Xenopus laevis, se han descrito genes Clock, Bmal, Cry y dos
genes period homólogos para los otros grupos de vertebrados e invertebrados (Drosophila),
xPer1 y xPer2. A diferencia de las aves y otros vertebrados, el nivel de expresión de Per es alto
únicamente en la retina; en donde, xPer1 oscila espontáneamente en condiciones de luz
constante. Por su parte, en el pez cebra (Danio rerio) el escenario es ligeramente diferente,
donde zPer1 es regulado por la luz, pues en condiciones de luz constante es expresado
constitutivamente. Para el caso del pez cebra específicamente, se ha descrito un homólogo de
Clock llamado zClk, el cual presenta una correspondencia del 80% con mamíferos y del 53%
con Drosophila (Wijnen, 2006).
No existe duda de que los componentes moleculares identificados en diversas especies

constituyen una parte esencial del sistema circadiano. Aún cuando, diferentes especies pueden
usar distintos tipos de proteínas o utilizar proteínas ortólogas en tareas completamente distintas,
la mayoría de los sistemas circadianos funcionan bajo la forma de asas de retroalimentación
interconectadas (Roenneberg T. Merrow M., 2003)
Los modelos moleculares del reloj se conciben actualmente como una extensa red de asas de
retroalimentación interconectadas, sin que exista una verdadera reconsideración sobre el modelo
del asa. Sin embargo, existe una serie de observaciones anómalas, que no encajan con las
predicciones del modelo molecular ortodoxo del asa de retroalimentación (Lakin-Thomas; 2006)
Introducción 20
Con la finalidad de dilucidar el verdadero mecanismo detrás de la expresión de los ritmos
biológicos y comprender la función de los genes del reloj; es necesario identificar y caracterizar
funcionalmente los homólogos de los distintos mensajeros relacionados con el sistema
circadiano. En el presente trabajo, se pretendió identificar los genes Per y Clock que forman una
parte esencial en en paradigma actual y oscilan en antifase en D. melanogaster ; con el propósito
de comparar el comportamiento de dichos genes y comenzar a generar un modelo para el acocil.
2.3 El sistema circadiano del acocil Procambarus clarkii
El acocil Procambarus clarkii es un crustáceo decápodo que pertenece al grupo monofilético de

los reptantia de agua dulce. Los acociles han sido utilizados ampliamente en estudios que van
desde la oncología, la fisiología hasta la ecofisiología, por lo que pueden ser considerados un
importante modelo biológico. (Sinclair et. al; 2004).
P. clarkii es originario del norte de México y el sur de los Estados Unidos, pero dada su
importancia económica ha sido introducido en todos los continentes y actualmente representa
una amenaza al equilibrio de los ecosistemas donde es exótico (TL web project 2009 / Castañon
Cervantes et. al. 1996)
Fig. 2 El acocil Procambarus clarkii
Introducción 21
El sistema endocrino del acocil esta constituido por diversos órganos que pueden ser de origen
neural o epitelial. El sistema neuroendócrino esta compuesto por los órganos del sistema Órgano
X - Galandula Sinusal (OX-GS), el órgano postcomisural y el órgano pericardial. El OX-GS es el
centro endocrino del acocil, esta constituido por el Órgano X (OX), que es un conglomerado de
células neurosecretoras localizadas en la periferia de la medula terminal; y la Glándula Sinusal
(GS), que son principalmente las terminales axónicas de las neuronas del OX , que descargan las
hormonas en la hemolinfa (Vogt G; 2002).
El sistema nervioso central de Procambarus clarkii, al igual que el resto de los crustáceos
decápodos, esta conformado por un cordón nervioso ventral recubierto por una capa de tejido
conectivo. A lo largo del cordón se localizan 11 ganglios pareados unidos transversalmente por
comisuras y longitudinalmente por conectivos. El más rostral es el ganglio cerebroide que en
realidad se constituye por tres grupos de ganglios fusionados que reciben el nombre de
protocerebro central, deuterocerebro y tritocerebro, siendo este último el más caudal (Prieto-
Sagredo; 2002).
En el protocerebro se localizan los ganglios ópticos compuestos por la lámina ganglionaris, la

medula externa, la medula interna y la medula terminal, también denominada protocerebro
lateral. El protocerebro parece ser el principal encargado de procesar la información visual y se
cree que controla el sistema endocrino al regular las neuronas del sistema OX-GS. En el
deuterocerebro encontramos los lóbulos olfatorios y los lóbulos accesorios. Este segmento del
cerebro es responsable de la integración y procesamiento de la información olfatoria. Por su
parte, el tritocerebro esta formado por los neurópilos antenulares, los ganglios comisurales y la
comisura post-esofágica (Vogt G; 2002).
El ganglio cerebroide se une al ganglio subesofágico a través de un par de conectivos que rodean
el esófago, los conectivos circumesofágicos. Por debajo de este se encuentran cinco ganglios
torácicos seguidos de otros seis ganglios abdominales. De cada ganglio parten nervios con fibras
sensoriales y motoras que van a constituir el sistema nervioso periférico (Prieto-Sagredo; 2002).
Introducción 22
Es bien sabido que los acociles son animales de comportamiento nocturno y se cree que el
sistema nervioso esta involucrado en dichos patrones de actividad (Castañon C; 1996). Se han
descrito diversos ritmos circadianos en la fisiología, metabolismo y comportamiento de estos
animales. Uno de los primeros ritmos estudiados y bien conocidos de los crustáceos, en
particular de los acociles, es el ritmo de actividad locomotora.
Kalmus en 1938 demostró que el ritmo de actividad se manifestaba incluso en condiciones

constantes y propuso al sistema neurosecretor del tallo ocular como el marcapaso que controla
dicho ritmo. Sin embargo Page y Larrimer (1975) realizaron experimentos donde el ritmo
locomotor persistía incluso con el tallo ablacionado y la ritmicidad desaparecía al cortar las
conexiones circumesofágicas que conectan el ganglio supraesofágico o cerebroide con el centro
locomotor torácico; proponiendo a dicho ganglio como un posible marcapasos (Fanjul-Moles y
Prieto-Sagredo; 2003)
En el acocil adulto y en presencia de un ciclo LO 12:12, el ritmo de actividad locomotora ha sido

descrito como un ritmo que en algunos animales es unimodal y en otros bimodal y es un
comportamiento guiado por un oscilador circadiano probablemente localizado en el ganglio
cerebroide y/o los lóbulos ópticos (Page y Larimer; 1975).
Otro de los fenómenos cíclicos que han sido ampliamente estudiados en P. clarkii es el ritmo de
amplitud del electrorretinograma (ERG); que es el resultado de las variaciones diarias en la
amplitud de respuesta del fotorreceptor retiniano a pulsos de luz y se ha propuesto que estas
variaciones dependen de los cambios en la sensibilidad del fotorreceptor, así como en la posición
de los gránulos de pigmento proximales y distales (Aréchiga et. al. 1993). De modo que los
pigmentos proximales (PP) se concentran en la oscuridad y se dispersan con la luz.
Se cree que este ritmo esta controlado tanto por estructuras neurales como neuroendócrinas del
cerebro y estructuras neurosecretoras del Lóbulo Óptico, en particular el complejo OX-GS
(Fanjul-Moles y Prieto-Sagredo; 2003). Además de ser regulado por la luz; se ha observado que,
Introducción 23
la melatonina es capaz de sincronizar el ritmo de ERG, proponiendo a este neurotransmisor
como un sincronizador no fótico (Solís-Chagoyan. et. al; 2008)
La variación circadiana a la sensibilidad retinal, medida como cambios en la amplitud del ERG
esta acompañada por movimiento rítmico de los pigmentos. De modo que la mayor amplitud de
ERG se presenta cuando los pigmentos están en posición de oscuridad y menor amplitud, cuando
los pigmentos se encuentran adaptados a la presencia de luz (Fanjul-Moles, Prieto-Sagredo;
2003).
Welsh describió por primera vez la existencia de ritmos circadianos en la migración de los
pigmentos retinianos accesorios (Prieto-Sagredo; 1992). En los crustáceos, la migración de los
gránulos de pigmento en los cromatóforos tegumentarios de las células retinales se da como
resultado de la acción de la serotonina (5HT), dopamina y norepinefrina; que promueven la
activación de la hormona dispersora del pigmento distal (PDH) y la hormona concentradora del
pigmento (RPCH) en el complejo ocular. Así, los pigmentos se dispersan durante el día y se
concentran por la noche, donde el pigmento distal se mueve hacia el extremo de la cornea en el
ojo compuesto, mientras que el pigmento proximal migra en la dirección opuesta, dejando el área
del rabdomo expuesta a la luz. Esto se presenta incluso en condiciones constantes. (Martínez-
Pérez et. al; 2005).
También se ha descrito la presencia de ritmos de secreción neuroendócrina, como el de la

hormona hiperglicémica de los crustáceos (CHH) que es sintetizada y secretada por el sistema
OX-GS y la retina de acociles tanto jóvenes como adultos, y cuya secreción es regulada por la
5HT, al igual que el de otras neurohormonas. Se ha sugerido una posible relación entre la
secreción de CHH y los ritmos circadianos en el complejo ocular. (Escamilla-Chimal et. al;
2002 / Prieto-Sagredo; 1992).
Se ha hecho un gran esfuerzo por localizar físicamente al oscilador o los osciladores y las vías de
sincronización que controlan los elementos que contribuyen a la ritmicidad en los acociles. Page
y Larimer en 1975 propusieron al ganglio supraesofágico como el marcapaso central; sin
Introducción 24
embargo, se ha demostrado que el ritmo de amplitud del ERG se manifiesta incluso en el tallo
ocular ablacionado, lo cual sugiere un control local de la oscilación, e incluso se ha propuesto a
la retina como un oscilador autosustentable. (Aréchiga y Rodríguez-Sosa; 1998).
En cuanto a las vías de sincronización, se ha observado que, junto con los receptores retinianos,
existen otras estructuras extrarretinianas fotosensibles capaces de transmitir señales al sistema
circadiano. Tal es el caso de las neuronas fotorreceptoras caudales localizadas en el sexto
ganglio, que controlan el movimiento fototáctico negativo efectuado por las patas traseras del
acocil. Este ganglio presenta una frecuencia de disparo de potenciales de acción espontáneo, que
incrementa al estimularlo con luz (Prieto-Sagredo y Fanjul-Moles; 2001). Además, se ha
observado que pulsos de luz en la zona caudal provocan adelantos de fase en el ritmo de ERG
cuando son suministrados en la noche subjetiva temprana, y retrasos en la noche subjetiva tardía
(Bernal-Moreno et. al. 1996).
Estos autores, realizaron experimentos donde demostraron que las frecuencias de disparo en dos
neuronas del sexto ganglio presentan cambios endógenos que oscilan alrededor de las 24 h.
Estos resultados sugieren que estas células pueden actuar no solo como fotorreceptores y
transmisores de órdenes motoras, sino también como un oscilador circadiano encargado de
regular conductas. Por otra parte, resultados de laboratorio no publicados, han mostrado que la
cadena ganglionar ventral expresa proteínas reloj como Per y TIM ( Velazquez-Amado; 2008).
Anteriormente Page y Larimer ( 1976) propusieron la existencia de un fotorreceptor circadiano

cerebral. Recientemente el grupo de Sullivan et. al. (2009) ha realizado experimentos donde se
muestra como los fotorreceptores cerebrales son suficientes para sincronizar el reloj aún en la
ausencia de fotorreceptores caudales y retinianos. Toda esta evidencia, parece indicar que en el
acocil, como en otros organismos, el sistema circadiano es multioscilatorio y cuenta con más de
una vía de sincronización fótica.
Introducción 25
Además se han estudiado algunos aspectos referentes al desarrollo ontogénico de los ritmos de
actividad locomotora y del electrorretinograma planteando la posibilidad de que los osciladores
encargados de ambos ritmos no son necesariamente el mismo (Fanjul-Moles et. al 1996)
A pesar de que existe un gran número de trabajos con respecto al sistema circadiano del acocil;
es muy escaso el conocimiento tanto de la expresión como del funcionamiento del reloj
circadiano a nivel molecular y genético en los crustáceos. En general se han reportado tanto la
expresión de la proteína PER en la retina y la lámina ganglionaris ( Aréchiga y Rodríguez-Sosa;
1998) como la expresión de ritmos circadianos significativos de la proteína CRY en el
protocerebro medial y oscilaciones no significativas en el protocerebro lateral el tallo ocular
(Fanjul Moles et. al; 2004 / Escamilla-Chimal y Fanjul-Moles , 2008 ). Además, se ha visto que
tanto Per como Tim muestran patrones de expresión temporal diaria en la lámina la médula del
tallo ocular así como en el protocerebro medial (Escamilla-Chimal et. al. 2007)
Hasta el momento no se ha reportado la secuencia de ninguno de los genes conocidos como

genes reloj en el acocil. En los crustáceos, solamente se ha secuenciado el gen Clock en el
langostino Machrobrachium rosenbergii (Gene Bank: AY842303.1 ) y un fragmento de Per en el
cangrejo Callinectes sapidus (Gene Bank: AAL77484.1). Por ello, son necesarios estudios que
amplíen nuestro conocimiento, de modo que se puedan vislumbrar las respuestas a las distintas
preguntas de como opera el mecanismo circadiano en el acocil.
Introducción 26
3 . P LANTEAMI E NTO D E L
P ROB LE MA
C l o c k s s l a y t i m e ...
t i m e i s de a d
a s l o ng a s i t i s be i ng
c l i c k e d o f f by l i t t l e w he e l s ;
o nl y w he n t he c l o c k s t o ps
do e s t i m e c o m e t o l i f e .
( W i l l i a m Fa ul k ne r )
Planteamiento del problema 27

Las bases moleculares del reloj circadiano se han estudiado en diferentes organismos
proponiéndose diferentes paradigmas aunque en general el mecanismo consiste en una doble asa
de retroalimentación transcripción-traducción interconectada. (Roenneberg y Merrow; 2003).
Sin embargo, un cúmulo de evidencias recientes han puesto en duda el papel de las oscilaciones
de RNA mensajero en la maquinaria del marcapasos (Yang y Sehgal; 2001 / Merrow et. al;
2005. / V. Sheeba et. al; 2008). Por ello, con el objetivo de descifrar los mecanismos que dan
como resultado la expresión de los ritmos biológicos, resulta importante desarrollar una
comprensión global y comparada del comportamiento y características de los genes del reloj en
diversas especies, que nos permita la estructuración de un modelo coherente que defina la
función de los genes con sus peculiaridades en cada organismo.
Existe, día con día, un aumento considerable en el conocimiento del comportamiento de los
genes reloj en diversos organismos, especialmente en insectos y mamíferos; pero particularmente
en modelos biológicos usados comúnmente como D. melanogaster, Mus musculus, Danio rerio,
Xenopus laevis .El acocil Procambarus clarkii, un organismo en el que se ha caracterizado un
sistema circadiano multioscilatorio de naturaleza jerárquica, parece ser un buen modelo para
este tipo de estudio.
Para lograr integrar un paradigma del comportamiento molecular del reloj, uno de los primeros
pasos a seguir es la caracterización de los genes que se cree están involucrados en el sistema, es
decir, la amplificación, clonación y análisis de la secuencia; así como el estudio de su patrón de
expresión diario. Seguido de la caracterización morfofisiológica tanto de los mensajeros como de
las proteínas. Por ultimo, de ser posible, el análisis dirigido mediante mutaciones o RNA de
interferencia, para observar las manifestaciones relacionadas con la expresión de determinados
genes.

El acocil P. clarkii, ha sido un modelo ampliamente utilizado en el estudio de los ritmos
circadianos controlados por la función periódica del sistema nervioso (Fanjul-Moles, Prieto-
Sagredo; 2003). Aunque no se han descrito los mecanismos moleculares del reloj en el acocil,
trabajos de nuestro laboratorio han aportado información sobre el comportamiento de algunas de
las proteínas reloj (Escamilla-Chimal et. al. 2007). En cuanto a CLK, no existen resultados sobre
el comportamiento de la proteína en P. clarki. Sin embargo, experimentos en M. rosenbergii
indican que el gen no oscila al lo largo del día (Yang et. el. 2006).

4. HI P ÓT ES I S
Los genes Clk y Per, por tener homólogos con altos grados de similitud en diversos organismos,
también deben estar presentes en el genoma del acocil Procambarus clarkii y podrían ser
expresados rítmicamente en el ganglio cerebroide, que es considerado un posible marcapaso del
sistema multioscilatorio de este animal .
Hipótesis 30
5. OBJ E TI VOS
5.1 Particular:
Caracterizar a partir del cDNA el RNA mensajero de los genes Per y Clk en una de las
estructuras centrales propuestas como un posible marcapaso del sistema circadiano de
Procambarus clarkii, el cerebro, así como determinar si existe un efecto del tiempo circadiano
del animal sobre la abundancia en la expresión de estos dos genes.
5.2 Generales:
• Diseñar un conjunto de cebadores que amplifiquen los genes Per y Clk en el acocil.
• Purificar y secuenciar los productos amplificados por las distintas combinaciones de
cebadores
• Identificar y clonar las secuencias que presenten un mayor grado de identidad con los
genes reloj reportados para otros organismos.
• Mediante una RT-PCR semicuantitativa hacer un estudio funcional de la ritmicidad
diaria de las secuencias con mayor grado de identidad.
Objetivos
31
6 . MATERIAL Y MÉT OD O
Método
Extracción RNA 700h, 1100h, 1500h,
cerebro 1900h, 2300h, 300h
RT-PCR
PCR Semicuantitativa
Purificación
Clonación Secuenciación CLOCK

Parcial
PER
Análisis
Secuencias
T he o nl y r e a s o n f o r t i m e
i s s o t ha t e v e r yt hi ng
do e s n' t ha ppe n a t o nc e .
( A . Ei ns t e i n)
Material y método
32
6.1. Animales y diseño experimental
Dos lotes de 45 acociles Procambarus clarkii cada uno, se mantuvieron: Lot. 1 en fotoperiodo
LD12:12 (700h = zt0) y Lot. 2 en fotoperiodo invertido DL12:12 (1900h = zt0), durante una
semana antes del experimento, con el objeto de poder extraer las muestras del día y de la noche
en el mismo momento. Se utilizaron adultos sin distinción de sexo y en etapa de intermuda, los
animales fueron alimentados ad libitum. El Lot. 1 se dividió en 3 grupos de 15 animales de los
cuales se disectó el grupo 1 a las 1100h (zt 4), grupo 2 a las 1500h (zt 8) y grupo 3 a las 1900h
(zt 12). Con el Lot. 2 se hizo lo mismo y se disectó a las mismas horas (tiempo real)
correspondientes a los zt 16, zt 20 y zt 0, respectivamente.
6.2. Diseño de cebadores (oligonucleótidos/ primers)
Se buscaron, en la base de datos de Gene Bank, las secuencias reportadas de los genes
circadianos Clock y Period de diferentes especies tanto de vertebrados como de invertebrados
entre ellos: Drosophilla melanogaster (Gene Bank: Clock AAC62234 y Per NM_080317),
Antherea sp (Gene Bank: Clock AAR14936 y Per APU12769), Bombix mori (Gene Bank: Per
AY526605), Mus sp. (Gene Bank: Clock AAC53200 y Per1 NM_001159367 ), Xenopus laevis
(Gene Bank: Clock AF203107 ), Machrobrachium rosenbergii (Gene Bank: Clock AY842303.1 )
y otros. Así como las respectivas secuencias de aminoácidos.
El conjunto de secuencias correspondientes a cada gen se alinearon utilizando el programa

Clustal W (EMBL-EBI) para detectar homologias tanto entre la secuencia de pares de bases
como en la de aminoácidos, localizando preferencialmente aquellas que estuviesen dentro de los
dominios funcionales de cada gen (Anexo 1).
Con base a dichas secuencias conservadas y utilizando la tabla de preferencia de codones para el
acocil P. clarkii (CITA), se diseñaron pares de cebadores sentido y antisentido (Tabla 1. Anexo 1)
para su uso en la técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction). Para ello se utilizo el programa
Material y método
33
Oligo v.4.1 (National Bioscience Inc) buscando que la temperatura de alineación (TM) fuese alta
(entre 60 y 70 °C), que el perfil del oligo presentara una buena estabilidad interna y la
probabilidad de formación de dímeros fuese baja.
6.3. Extracción de RNA
Se extrajo el RNA total del cerebro, tallo y cadena ganglionar en distintos tiempos circadianos
(300, 700, 1100, 1500, 1900, 2300 h, tiempo real). Para ello se tomaron de 10 a 15 acociles P.
clarkii en un fotoperiodo LD 12:12 (Lot. 1) para las extracciones del día y aquellos del Lot. 2, en
fotoperiodo invertido, para las extracciones de la noche.
Se procedió a la extracción de tejido nervioso del ganglio cerebroide sacrificando al animal por
decapitación, lo más rostral posible, prestando especial cuidado en evitar derramar los líquidos
estomacales sobre el resto de los tejidos. La disección se hizo sumergiendo los tejidos en una
solución estabilizadora del RNA (RNAlater, Ambion).
Una vez colectados 15 cerebros (aproximadamente 150 mg de tejido) se colocaron en un tubo de

1.5 ml con 250 μl de Tripure (Roche), un reactivo que permite aislar DNA, RNA y proteínas de
la misma muestra mediante una separación de la fase liquida.
Los tejidos se homogeneizaron utilizando un pistílo de plástico estéril. La mezcla se centrifugó a

12, 0000 x por 10 min a 4 °C. Se retiró y transfirió el sobrenadante, que contenía proteínas,
RNA y DNA, en un tubo estéril de propileno, al que se le agregó 0.2 ml de cloroformo por cada
1 ml de TriPure inicial. Se incubó 15 min y se centrifugó 12, 0000 x por 15 min a 4 °C.
En el tubo se separaron tres fases, de las cuales se tomo la fase acuosa superior (traslúcida) y se
transfirió a un nuevo tubo, agregando 0.5 ml de isopropanol 100% por cada ml de Tripure inicial,
mezclando e incubando 10 min a temperatura ambiente y se centrifugó 10 min. La pastilla
Material y método
34
(pellet) de RNA total, producto de la precipitación por isopropanol, se lavó con etanol al 75% y
tras centrifugarlo y retirar el exceso del alcohol, se resuspendió en 30 μl agua estéril,
desionizada, libre de RNAsas (tratada con DEPC) a 60 °C.
El RNA obtenido para cada hora se cuantificó con el uso de un espectofotómetro de masa
Ultrospec 200 ( Amersham Pharmacia Biotech) diluyendo 2 μl de muestra en 500 μl de agua
desionizada (Fd=4) y se calculó la cantidad utilizando la relación de Sambrook ( F. Martínez-
Pérez; 2005) donde:
1 unidad de densidad óptica: DO260 (Abs. 260 nm) = 40 μg/ml de RNA.
De modo que: RNA ng/μl = (DO (Abs 260 nm) X 40 μg/ml / Fd) X 1,000.
Dicha cuantificación se corroboró corriendo un gel de agarosa desnaturalizante de RNA de 40

ml al 1.2%. Con 4 ml de MOPS 10X y 6.6 ml de formaldehído. Las muestras se prepararon con 2
μl de MOPS 10X, 3 μl de formaldehído y 3 μl de formamida. Los geles se corrieron a 50 V por
90 min.
6.4 . RT - PCR
Para la amplificación de per y clock se corrieron reacciones de RT (transcripción reversa)

utilizando 2 μg de RNA total de cerebro de las 300, 700, 1100, 1500, 1900, 2300 h,
respectivamente. utilizando el kit Gene Amp PCR Core Kit (Applied Biosystems) con una
concentración de MgCl 5 mM y DNTP´s 10 mM; amplificando con cebador de oligos dT a una
concentración 100 pM, los cuales sintetizan cDNA a partir de RNA total con cadenas de poli A,
como el caso del RNA mensajero (mRNA). (Haddad F; 2007) en un termociclador programado
con un ciclo de 10 min a 25 °C, 15 min 42 °C y se mantiene a 4 °C
Material y método
35
Como control, para corroborar la calidad del cDNA producto de cada grupo de reacciones de RT
con RNA de las diferentes horas, se corrieron reacciones de PCR utilizando los cebadores para
amplificar el péptido relacionado a la taquinina (TRP), perteneciente a una familia de
neuropéptidos que se relacionan con distintas funciones en el sistema nervioso central y
periférico de varios organismos y cuya secuencia y cebadores han sido reportados previamente
para el acocil (Y. Yasuda-Kamatani. y A. Yasuda; 2004). Dicha amplificación de TRP sirvió
como control de calidad del RNA y partir de esto se determinaron los lotes de cDNA a utilizar en
las reacciones de PCR.
Con el cDNA obtenido de las RT, se corrieron reacciones de PCR de 25 μl, con una
concentración de MgCl 2 mM, para las diferentes combinaciones de cebadores Sentido (Up) y
Antisentido (Dwn) diseñados, a una concentración 100 pM. Además se probó con 3 distintas
temperaturas de alineación (Tm + - 5 °C).
Posteriormente se realizó una electroforésis de las muestras amplificadas en un gel de Agarosa

1.5%, TAE 1X, teñidos con bromuro de etidio 1:10. Las muestras se prepararon con Buffer de
carga “TrackIt” (Invitrogen) y bromuro de etidio 1:10. Para aquellas combinaciones de
cebadores que mostraron bandas, se rediseñaron reacciones de PCR de 100 μl cuyos productos
fueron purificados, secuenciados y clonados posteriormente.
Las reacciones de PCR se probaron con el kit Gene Amp PCR Core Kit (Applied Biosystems), la
Taq titanium, la Taq polimerasa (Altenzyme) convencional; también se hicieron ensayos
utilizando Pfx platinum (Invitrogen), esta última es una enzima de alta especificidad que permite
amplificar fragmentos más grandes y con mayor fidelidad.
En el caso de per, se trabajó con las combinaciones de cebadores: PER up1-1dwn , y PER up1-
dwn2. Para clock, se amplificaron los productos obtenidos de la combinación de oligos CLK
up2-dwn4, CLK up1-dwn4 y CLK up1-dwn3.
Material y método
36
6.5 . Purificación del cDNA
Para la purificación de los productos obtenidos se separaron los fragmentos amplificados

utilizando un gel preparativo con agarosa de baja temperatura de fusión, que permite manipular y
recuperar los ácidos nucleicos, después de una electroforésis, sin dañarlos. Las bandas se
cortaron y se colocaron en tubos de 1.5 ml a baño maría a 70 °C para derretir el gel. Se
purificaron las bandas utilizando un kit de miniprep (Promega) con microcolumnas. Para ello se
adhirió el DNA a la resina y se paso a través del filtro en la microcolumna con ayuda de una
jeringa de 3 ml, posteriormente se lavó con 2 ml de isopropanol al 80% y se centrifugó la
columna adaptada a un tubo de 1.5 ml, el líquido depositado en el tubo fue desechado y en la
columna, el DNA purificado se eluyó en 35 a 50 μl de agua estéril a 65 °C y se centrifugó
durante 30 seg. para recuperar el material en un nuevo tubo. El producto se almacenó a -20 °C.
Tras la purificación, se realizó la cuantificación del material obtenido. Para ello, se utilizaron dos
técnicas que se complementan con la finalidad de tener una estimación más precisa:
1) Se cuantificó el DNA por espectrofotometría y se calculó el índice de pureza (Abs260/Abs280)
2) Se corrió una electroforésis en un gel de agarosa con un marcador de masa (Fagoλ- HindIII),
contra el cual se comparó estimó la cantidad de nucleótidos en la muestra. De acuerdo con los
datos arrojados por el espectofotómetro.
La cuantificación se realizo con el uso de un espectofotómetro de masa Ultrospec 200

( Amersham Pharmacia Biotech) diluyendo 2 μl de muestra en 500μl de agua desionizada (Fd=4)
y se calculó la cantidad utilizando la relación de Sambrook donde:
1 unidad de densidad óptica: DO260 (Abs. 260 nm) = 50 μg/ml de DNA.
De modo que: DNA ng/μl = (DO (Abs 260nm) X 50 μg/ml / Fd) X 1,000.
Material y método
37
Dicha cuantificación se corroboró corriendo un gel de agarosa al 1.5%.
Por este medio nos fue posible identificar si las muestras estaban significativamente
contaminadas por aminoácidos y establecer si se contaba con la cantidad suficiente de DNA para
la determinación de la secuencia.
Los productos se secuenciaron tanto en el Instituto de Biología de la UNAM, con el apoyo de la

Dra. Laura Márquez, así como en la Unidad de Biología Molecular del Instituto de Fisiología
Celular.
6.6 . Clonación
Los productos identificados como posibles homólogos de los genes clock y per, se clonaron
utilizando bacterias supercompetentes Match1-1 incluidas en el kit Topo-TA cloning
(Invitrogen). Sin embargo, dada la dificultad para obtener resultados positivos repetitivos, se
decidió preparar bacterias supercompetentes DH5-α. Para ello, se incubaron las bacterias en
medio LB y se dejaron crecer toda la noche a 37 °C.
Posteriormente se tomaron 5 ml y se mezclaron con 500 mL de medio LB en un matraz de 2 L.

Las células se cultivaron a 37 °C, midiendo constantemente la Densidad Óptica: DO600nm. Una
vez alcanzada una DO600 de entre 0.4 y 0.6 se transfirió, inmediatamente, el cultivo a hielo y
después de 10 min se transfirió a tubos Falcon de 500 mL, el cual se centrifugó a 4000 x durante
5 min a 4 °C. Se retiró el sobrenadante para resuspender cuidadosamente la pastilla in 150 mL de
buffer CGM. La suspensión se incubó en hielo durante 15 min y nuevamente se centrifugó por 5
min. Se repitió el procedimiento anterior usando 36 mL de buffer y la suspensión se transfirió a
tubos de 50 mL.
Finalmente se agregaron 1.25 mL de DMSO incubando en hielo por 5 min. El procedimiento se

repitió y se aliquotó la suspensión en tubos estériles de 1.5 mL que fueron rápidamente
transferidos a nitrógeno líquido y posteriormente almacenados a -72 °C.
Material y método
38
Para la clonación se utilizó el plásmido al pGEM T-easy vector (Promega). En el primer paso, se
insertó el producto de la PCR (2 -5 μl) en el vector, es decir, se generó un plásmido recombinante
en una reacción de 6 a 10 μl finales y posteriormente se incubó en hielo una porción de esta
reacción junto con 100 μl de las bacterias DH5-α supercompetentes. Pasados 30 min se dio un
choque térmico de 42 °C durante menos de un minuto al tubo con la combinación plásmido
bacteria, con el propósito de cambiar la fluidez de la membrana bacteriana y permitir la
incorporación de plásmido al interior de la célula.
Posteriormente se agregaron entre 250 y 900 μl de medio, LB o SOC sin antibiótico, y se dejó
agitar el tubo horizontalmente a 200 r.p.m. a 37 °C durante al menos 1 h, para promover el
crecimiento de las bacterias, que fueron concentradas, centrifugando la suspensión, eliminando el
sobrenadante y resuspendiendo la pastilla en 50 μl de LB, que después fue cultivado en un medio
sólido.
El cultivo de las bacterias se hizo bajo un ambiente estéril, en cajas de petri con medio LB
sólido, al cual se le agregó antibiótico, ya sea Ampicilina o Carbaxicilina a una concentración de
50 a 100 μg/μl. Además se agregó, sobre el medio solidificado, 40 μl de 5-bromo-4-cloro-3-
indolyl-β-D-galactopyranosida (β-galactosidasa) y 40 μl de isopropil β-D-thiogalactopiranosido
(IPTG), como parte del método ¨Blue-White screening¨ . Una vez precalentadas las placas a 37 °
C, se tomó la suspensión de bacterias y se vertió dentro de la caja de Petri, dispersándola con
perlas de vidrio. Dichos cultivos se mantuvieron toda la noche a 37 °C.
El último paso del proceso de clonación, consistió en analizar las bacterias transformantes,
producto del cultivo en las cajas de petri, con el propósito de definir cuales tenían el inserto de
interés para finalmente purificar y almacenar, secuenciar o retransformar bacterias. Para ello, se
eligieron las colonias positivas que resultaron de el uso de la técnica ¨Blue-White screening¨,
basada en la aparición de colonias blancas cuando hay un inserto en el plásmido y se recultivan
en 3 a 5 ml de LB líquido con ampicilina 100 μg/μl dejandose crecer toda la noche con agitación
Material y método
39
horizontal 200 r.p.m. a 37 °C. Estas se centrifugaron y concentraron hasta formar una pastillat de
bacterias a partir del cual se extrajo el DNA y se purificó utilizando el QUIAprep (QIAGEN).
El DNA purificado se cuantificó utilizando el sistema de espectofotometría Nanodrop el cual

nos permitió determinar el espectro de absorbancia, el grado de pureza y la cantidad de la
muestra de DNA, expresada en ng/μl . Con base en dichas estimaciones se montó una reacción
de digestión utilizando 1 μg de DNA total y la enzima ECORI, que reconoce las secuencias
aledañas al sitio de inserción del producto de PCR en el plásmido. Las muestras resultantes se
corrieron en geles de agarosa al 1.2% para corroborar la presencia del inserto en la clona.
Aquellas resultantes positivas se secuenciaron.
Los productos se secuenciaron en 2 reacciones, en una de ellas se utilizó el cebador sentido (Up)
correspondiente y para la otra el antisentido (Dwn). De este modo, los resultados de cada una se
alinearon entre sí utilizando el programa clustal W y se complementaron para conformar un
marco de lectura mas preciso.
Para el análisis de las secuencias tanto de PCR, como aquellas resultantes de la clonación, se
utilizó el programa BLASTn (Altschul et. al; 1997) , para identificar la homología entre el
amplicón y otras secuencias almacenadas en diversas bases de datos. Además se tradujo cada
secuencia a los seis posibles marcos de lectura de aminoácidos, mismas que se compararon
utilizando el programa BLASTp.
Tanto las secuencias de pares de bases, como aquellas de aminoácidos con un marco de lectura
abierto se compararon, por alineación, contra secuencias ya reportadas de cada uno de los genes
per y clock de diferentes especies; utilizando el software ClustalW (EMBL-EBI) así se determinó
el grado de identidad entre dichos genes reloj y los productos amplificados por los cebadores
diseñados.
Material y método
40
6.8 . Análisis funcional
Para determinar si existen variaciones en la cantidad de mRNA, presente en el cerebro del acocil;
se realizó una PCR semicuantitatva con cDNA de 6 h circadianas (0700 h, 1100 h, 1500 h, 1900,
2300 h y 0300 h) para per y clk. Utilizando las combinaciones de oligos CLK 2Up-4Dwn, y Per
1Up-1Dwn.
Además se hicieron pruebas control con cebadores de TRP, de modo que se pudiese establecer un
parámetro estable de comparación para medir si los fragmentos identificados oscilaban.
Para ello, fue necesario establecer un intervalo de cuantificación lineal, lo cual consistió en
montar cuatro reacciones de PCR con distinto número de ciclos (20, 25, 30 y 35) con los
parámetros ya establecidos previamente para Clk up2-dwn4 y Per up1-dwn1. Con 2μg de RNA
totales para la RT de las 11 y las 22 h, y las temperaturas y tiempos de alineación
correspondientes a cada par de cebadores. Así se determinó la cantidad de ciclos donde no se
saturaba la reacción, haciendo posible una cuantificación más precisa de la cantidad de RNAm
en cada hora circadiana.
La intensidad de las bandas se cuantificó utilizando un fotodocumentador Gel Logic 200

(Kodak) y el software Kodak MI. Estos datos fueron analizados con estadística descriptiva y
después graficados en un cronograma.
Material y método
41
7. RES U LTAD OS
N o pa r a s i e m pr e e n l a t i e r r a ,
S o l a m e nt e un po c o a qui .
A unque s e a ja de , s e r o m pe .
A unque s e a o r o , s e hi e nde .
Y e l pl um a je de l que t za l s e qui e br a .
N o pa r a s i e m pr e e n l a t i e r r a ,
S o l a m e nt e un po c o a qui .
( N e za hua l c o yo t l de T e x c o c o )
Resultados
42
7.1 Análisis del RNA
Para cada una de las horas se obtuvieron entre 50 y 100 μg de RNA total, cuantificados por
espectofotometría, en cada extracción, los cuales al ser observados en los geles desnaturalizantes
de RNA, mostraron no estar degradados y tener buenas cantidades de RNAs ribosomales (Fig.
1).
Fig 1. Extracción de RNA del cerebro del acocil a las 1100 h y 2200 h
1 2
28 s
18 s
5s
Fig 1. Gel desnaturalizante de RNA. Agarosa 1.2% . Se observan las subunidades

ribosomales 28s, 18s y 5s para cada extracción. Carril 1: RNA 1100 h. Carril 2:
RNA 2200 h
7.2 Establecimiento de las condiciones para la reacción RT- PCR
Para todas las combinaciones de cebadores se montaron reacciones de PCR con cDNA de dos
horas extremas (1100 h y 2200 h), además cada combinación de cebadores se probo con 3
diferentes temperaturas de alineación (Tm + - 5 °C). En base a esto se decidió realizar las
reacciones subsecuentes con el cDNA de las horas y temperaturas donde las bandas mostraban
Resultados 43
mejor amplificación, valorada visualmente en forma subjetiva. Los parámetros elegidos se
muestran en la Tabla 1.
Las reacciones de PCR se montaron con distintos tipos de enzimas, dos Taq polimerasa de
distinta marca (Aplied Biosystems y Altenzyme) y una Pfx polimerasa (Invitrogen). Para la
combinación de cebadores Per Up1-Dwn1, no se mostró diferencia en los productos
amplificados entre la Taq polimerasa y la Pfx polimerasa. Sin embargo, para la combinación de
oligonucleótidos Clk Up2-Dwn4 la Pfx polimerasa amplifica, además de la banda de 350 pb, un
fragmento de 800 pb, de tamaño similar al esperado para dicha combinación de cebadores. En
cuanto a la combinación Clk Up1-Dwn4, las reacciones con Pfx aumentan la intensidad de
amplificación de la banda de 500 pb.
Tabla 1. Condiciones de la reacción de PCR para las diferentes combinaciones de cebadores.
COMBINACIÓN PROGRAMA TEMP No. PRODUCTOS

OLIGOS ALIN CICLOS AMPLIFICADOS
CLK- 1Up-4Dwn Inicio: 95 ºC 5 m 55 ºC 30 - Clk1-4 S 650 pb

Desnaturalización:
CLK-2Up-4Dwn 55 ºC 25 - Clk2-4 S 800 pb
95 ºC 30 s
- Clk 2-4 I 350 pb
Extención: 72 ºC 1m
FIN: 72 ºC 10 m
CLK-1Up-3Dwn Mantener: 4 ºC 60 ºC 30 - Clk1-3 S 410 pb
- Clk 1-3 I 170 pb
PER- 1Up-1Dwn Inicio: 95 ºC 5 m 55 ºC 20 - Per1-1 S 250 pb

Desnaturalización: - Per 1-1 I 150 pb
95 ºC 30 s
Extención: 72 ºC 1m
PER-1Up-2Dwn 55 ºC 25 - Per 1-2 S 250 pb
FIN: 72 ºC 10 m
Mantener: 4 ºC
Resultados 44
7.3 Identificación de un posible fragmento de P. clarkii Clock
Las bandas amplificadas y purificadas ( Tabla. 2) de las diferentes combinaciones de cebadores

diseñados para la amplificación del gen Clock se secuenciaron y se llevo a cabo un extenso
análisis de cada una de ellas.
Para la combinación de cebadores Clk Up1-Dwn4 se amplificó una banda clara arriba de los 500
pb, y por debajo se observó una masa que podría contener mas de una banda, por ello se purificó
solamente la banda superior y se corrieron más reacciones de PCR para el mismo producto. Esta
vez, el gel preparativo se elaboró a una mayor concentración (2%) con lo que se logró separar
una banda por debajo de los 500 pb (Fig. 2c), la cual se purificó y secuenció, sin embargo, a
pesar de múltiples intentos, no se pudo obtener una secuencia identificable. Una posibilidad es
que varios productos de tamaños similares estuviesen amplificados dentro de la misma banda. El
análisis de la secuencia de 500 pb muestra identidad con diversos productos génicos, pero
ninguno de ellos relacionado con el reloj biológico (Tabla. 2).
Para la combinación de cebadores Clk Up1-Dwn3 observamos 2 bandas: la mayor de alrededor

de 450 pb y la mas pequeña de 100 pb (Fig. 2a). Mientras que para la combinación de cebadores
Clk up2-dwn4 se amplifican 3 bandas de 800, 350 y 150 pb (Fig. 2b).
El producto que mostró mayor identidad con otros genes Clock de diversos organismos, en
particular con el crustáceo M. rosenbergii (Tabla 2) fue el amplificado por Clk Up2-Dwn4 banda
M , cuya intensidad de brillo en todos las muestras de electroforésis fue notoriamente mayor a la
de las otras dos bandas.
Resultados 45
Tabla 2. Productos que amplifican las distintas combinaciones de cebadores para Clock
Tamaño
Rendimiento
Combinación Tamaño Secuencia Similitud
Bandas Total
cebadores pb PCR (Blast)
ng
pb
Clona de Danio rerio (score: 46)
Superior
510 650 404 similar a rRNA. Gene Bank:
S
CR847541.8
Clk up1-dwn4 Inferior
180 180 ‘ No se pudo secuenciar
I
DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box
Superior
410 400 242 polypeptide (score: 42) Gene
S
Bank: 471819
Proteína de union al DNA
Clk up1-dwn3 Inferior
170 570 189 Ricinus communis (score: 42)
I
Gene Bank: 8283971
Biblioteca cDNA Homarus
Superior
750 430 720 americanus (score: 159) Gene
S
Bank: FD699468.
Macrobrachium rosengebrgii
Clock cDNA (score: 46) Gene
Media PCR: 354 Bank; AY842303.1|
380 580
M CLON: 381 Homologo de Clock Rattus
Clk up2-dwn4
norvegicus (score: 37) Gene
Bank; AB019258.1
Inferior 28 s rRNA (score: 107)
150 250 148
I GENE ID: 100008589
Al probar la combinación de cebadores Clk up2-dwn4 y up1-dwn4 a diferentes temperaturas

( Tm= 60 y 50 °C) no se amplificó ningún producto. Sin embargo, para la combinación Clk up1-
dwn3, se logra una mayor fidelidad de amplificación de la banda S (Tabla 1).
Por su parte, el uso de la Platinum Pfx (Invitrogen) hizo más específica la amplificación de la
Clk up2-dwn4 banda S de 720 pb, la cual, a pesar de ser del tamaño aproximado del producto
esperado, no mostró mayor identidad que la banda M con otros genes Clk, aunque guarda
homología con la secuencia de una clona del crustáceo Homarus americanus (Tabla 2).
Resultados 46
Fig. 2. Geles preparativos con las diferentes combinaciones de cebadores para el gen Clock
A) 1 2
C) 1 2
600 pb
S
500 pb S
I
I
B) 1 2
Fig. 2. Geles preparativos (agarosa bajo punto de fusión) para
purificación de los productos de PCR generados con las diferentes
combinaciones de cebadores para el gen Clock. El tamaño de las
bandas se calculó usando un fotodocumentador Kodak y el software
S KodakMI
A) Carril 1: Marcador 100 pb (Invitrogen).
500 pb
M Carril 2: Producto de PCR con Clk Up1-Dwn3 Bandas S (410 pb) e I
(170 pb)
B) Carril 1: Marcador 100 pb (Axygene).
I
Carril 2: Producto de PCR con Clk Up2-Dwn4 Bandas S (750 pb), M
(350 pb) e I (150 pb)
C) Carril 1: Marcador 100 pb (Axygene).
Carril 2: Producto de PCR con Clk Up1-Dwn4 Bandas S (500 pb) e I
(180 pb)
La banda M Clk up2-dwn4 fue amplificada tanto con la Pfx, como con la Taq polimerasa y
ambas secuencias se compararon, dando como resultado una secuencia consenso

(Clk2-4bigconsensus). El producto de dichas amplificaciones fue clonado utilizando el plásmido
pGEM T-easy (PROMEGA) y la secuencia del plásmido (Clk Up2-Dwn4 ClonG) fue comparada
contra la del producto de PCR . Como se discute posteriormente, el inserto del plásmido es
prácticamente idéntico al producto de la PCR. Sin embargo, la secuencia de la clonación presenta
una mayor similitud al gen Clock de M. rosenbergii ( ClustalW Score: 39). Por ello, se utilizó
dicho producto para hacer el análisis de la secuencia (Fig. 3).
Resultados 47
Fig 3. Comparación de las secuencia CLKup2-dwn4ClonG con genes clk reportados para otros organismos
Secuencia Problema Tamaño(pb)

Secuencia Comparada
Género Tamaño(pb) Score
=========================================================================
CLKup2-dwn4ClonG 381 Macrobrachium.clk 2115 39
CLKup2-dwn4ClonG 381 DrosophilaM.clk 3084 6
CLKup2-dwn4ClonG 381 MamestraB.clk 2337 8
CLKup2-dwn4ClonG 381 MusM.clk 2568 11
CLKup2-dwn4ClonG 381 DanioR.clk 2682 6
CLKup2-dwn4ClonG 381 Xenopus.clk 4219 13
CLKup2-dwn4ClonG ----------------------CCTGTGGTAGTGCTGTTTATAGAATTCCT---AACACT 35
Macrobrachium.clk_ AGTAGCTGTAGTAGAAGTATGTTCGGTGGTAATGCCGGGGGAGGAGTTACTGGTAGCAGT 720
* ****** *** * ** ** ** * ** *
CLKup2-dwn4ClonG GATGT--GTCCTAATCCATCTCAAACCTTAGGAATCTAGTACTTGATAACAGACTGAACA 93
Macrobrachium.clk_ AATGCTGGTTCTGGTCTCTGTCAGAGCTC-----TCTTGTACAGACTAATCCATCTCA-G 774
*** ** ** ** * *** * ** *** **** *** * *
CLKup2-dwn4ClonG AAAACCACCTAGTTATCGCAGGGGACT-TTAAT--ATTGACCTCTGCGAGCCTGAACACC 150

Macrobrachium.clk_ GAACCTACGAAGCTAGTGTTTGTGGCTATTGGTCGACTGGAACGGCCACAGCTGGTTAGG 834
** * ** ** ** * * * ** ** * * ** * *** *
CLKup2-dwn4ClonG CCACTGCTGTTAGCATACAACCAAGTATAACAGTATATACTTGAGGACACTGTTTA---- 206

Macrobrachium.clk_ GAAATGATGATA--ATAGAACCAAGTAAAACAGAATTTACTTCAAGACACAGTTTAGAAT 892
* ** ** ** *** ********* ***** ** ***** * ***** *****
CLKup2-dwn4ClonG --------CCTCAACTGTAT----GAACTCCTGCTTCCTCATACCCTTAACCACTTGACC 254

Macrobrachium.clk_ GGAAATTTCTTTTTCTAGACCACAGAGCTCCTACCATCATTGGCTACCTTCCATTTGAAG 952
* * ** * ** ***** * * * *** ****
CLKup2-dwn4ClonG TGTTAGAATCACTGATAGCACTGCCACGACTCTCGATAACATCTGCACATA-CCGCATCA 313

Macrobrachium.clk_ TGTTAGGAACTTCGG-GGTATGACTATTATCACGTAGAAGATCTGGACAAAGTCGCATCA 1011
****** * * * * * * * * * ** ***** *** * *******
CLKup2-dwn4ClonG TAACATCTCCGCTTACTGAAGGTATAATCGCCAATATCTTGTTACTACAGATTCTTGACC 373

Macrobrachium.clk_ TGCCATGAACAATTAATGAAGACTGGAAAGGGAACATCTTGTTACTACAGATTCTTGACC 1071
* *** * *** ***** * * ** *************************
CLKup2-dwn4ClonG AAAGGACA---------------------------------------------------- 381

Macrobrachium.clk_ AAAGGACAACAATGGATATGGTTGCAAACCCAGTATTACATTACTTATCATCAGTGGAAC 1131
********
Comparación de las secuencia Clk Up2-Dwn4 ClonG producto de la clonación de la banda M Clk Up2-Dwn4
con genes clk reportados para otros organismos. En la parte superior se observa una tabla donde se muestra la
secuencia problema y el score (Clustal W) de la alineación contra cada gen. Podemos ver como la similitud con
el crustáceo M rosenbergii (Macrobrachium.clk) es mayor que la de otros organismos.
Abajo se muestra la alineación (ClustalW) del producto de la clona G contra Macrobrachium.clk. En negritas se
resaltan los pares de bases que son idénticos (*).
Al traducir la secuencia a los tres posibles marcos de lectura en sentido (+) y antisentido (-), 6
marcos de lectura totales, ninguno de ellos da un marco de lectura abierto y al buscar en la base
de datos del BLASTp, no se encuentran similitudes significativas con ninguna proteína
Resultados 48
reportada. A excepción del marco +2 que, a pesar de tener varios codones de termino en el
principio de la secuencia, la parte final da un marco de lectura que presenta una similitud con
Clock del langostino M. rosenbergii.
Se alineó dicho marco de lectura contra diversas proteínas CLK tanto de vertebrados como de
invertebrados (Fig. 4), a partir de esto se pudo identificar que la secuencia cae dentro del
dominio PAS de las diferentes proteínas y es idéntica en la zona donde se diseñó el cebador. Sin
embargo, cinco de los aminoácidos (aa) codificados no forman parte de la secuencia del cebador,
lo cual nos indica que nuestro fragmento muestra similitud con una zona altamente conservada
en la secuencia de aa. Aunque continua habiendo parecido, no podemos decir lo mismo para los
primeros aa de la secuencia.
Fig 4. Comparación del marco de lectura +2 del producto de la clona con proteínas CLOCK reportados
para otros organismos
Secuencia Problema Tamaño(pb) Secuencia comparada Tamaño(pb) Score
=========================================================================
CLKup2-dwn4ClonG 68 Macrobrachium.clk 704 26
CLKup2-dwn4ClonG 68 DrosophilaM.clk 1027 30
CLKup2-dwn4ClonG 68 MusM.clk 855 14
CLKup2-dwn4ClonG 68 Xenopus.clk 778 14
MusM.clk TPQFIKEMCTVEEPNEEFTSRHSLEWKFLFLDHRAPPIIGYLPFEVLGTSGYDYYHVDDL 318

Xenopusclock TPQFIKEMCTVEESNEEFTSRHSLEWKFLFLDHRAPPIIGYLPFEVLGTSGYDYYHVDDL 309
Macrobrachium.clk RPQLVREMMIIEPSKTEFTSRHSLEWKFLFLDHRAPTIIGYLPFEVLGTSGYDYYHVEDL 332
DrosophilaM.clk NPQLIREMSIIDPTSNEFTSKHSMEWKFLFLDHRAPPIIGYMPFEVLGTSGYDYYHFDDL 309
CLKup2-dwn4ClonG -------------HTTKYN---SIYLRTLFTSTVTP-ASSYPPLDLLESL-IALPRLSIT 42
. ::. *: : ** . :* .* *:::* : :..
MusM.clk ENLAKCHEHLMQYGKGKSCYYRFLTKGQQWIWLQTHYYITYHQWNSRPEFIVCTHTVVSY 378

Xenopusclock ENLAKCHEHLMQYGKGKSCYYRFLTKGQQWIWLQTRYYITYHQWNSRPEFIVCTHTVVSY 369
Macrobrachium.clk DKVASCHEQLMKTGKGTSCYYRFLTKGQQWIWLQTQYYITYHQWNSKPEFIVCTNTVVSY 392
DrosophilaM.clk DSIVACHEELRQTGEGKSCYYRFLTKGQQWIWLQTDYYVSYHQFNSKPDYVVCTHKVVSY 369
CLKup2-dwn4ClonG SAHTASHLRLLKVSP-ISCYYRFLTKG--------------------------------- 68
. . .* .* : . **********
Comparación del marco de lectura +2 de las secuencia CLKUp2-Dwn4ClonG producto de la clonación de la banda M
Clk Up2-Dwn4 con proteínas Clock reportadas para otros organismos. En la parte superior se observa una tabla donde
se muestra la secuencia problema y el score (Clustal W) de la alineación contra cada gen. Podemos ver como la
similitud con la mosca de la fruta D. melanogaster (DrosophilaM.clk) y el crustáceo M rosenbergii
(Macrobrachium.clk) no es mayor al 30%.
Abajo se muestra la alineación (ClustalW) del marco de lectura contra la secuencia de la proteína reportada para
diferentes especies. En negritas se resaltan los aminoácidos que son idénticos (*), también se muestran aquellos que
son sustituciones conservadas (:) y sustituciones semiconservadas (.) ClustalW (EMBL-EBI).
Resultados 49
7.4 Identificación de un posible fragmento de P. clarkii Per
Al hacer las PCR prueba se observó la mayor intensidad de brillo en las bandas amplificadas por
los cebadores Per Up1-Dwn1 y Per Up1-Dwn2; razón por la cual se decidió tomar dichas
combinaciones de oligonucleótidos para reamplificar las muestras, cuyos productos fueron
secuenciados y clonados.
Ambas combinaciones de cebadores amplifican una banda de alrededor de 220 pb y Per Up1-
Dwn1 también amplifica una banda de 150 pb (Tabla 3).
Tabla 3. Productos que amplifican las distintas combinaciones de cebadores para Per.
Tamaño
Rendimiento
Combinación Tamaño Secuencia Similitud
Bandas Total
cebadores pb PCR (Blast)
ng
pb
Superior
218 300 - No se obtuvo secuencia clara
S
Per up1-dwn2
Period (Per) mRNA, partial cds
Superior Unzela japix y Pachylia ficus
210 300 205 (score: 46 y 42) Gene Bank:
S
EU479441.1 y EU479414.1
Per up1-dwn1 Inferior
150 1500 ‘ No se obtuvo secuencia clara
I
A pesar de diversos intentos, no se pudo obtener una secuencia coherente para l Per Up1-Dwn1
banda I ni Per Up1-Dwn2 banda S (Fig. 5 / Tabla 3). Una hipótesis es que se conglomeraban
diferentes bandas de tamaños similares en un mismo punto. Por ello se intentó separar con geles
de agarosa a altas concentraciones (2.5 %) y geles de acrilamida, pero no se lograron resolver
bandas bien definidas..
Resultados 50
Fig 5. Geles preparativos con las diferentes combinaciones de cebadores para el gen Per
A) 1 2 B) 1 2
Fig 5. Geles preparativos (agarosa bajo
punto de fusión) para purificación de los
productos de PCR generados con las
diferentes combinaciones de cebadores para
el gen Per. El tamaño de las bandas se
calculó usando un fotodocumentador Kodak
y el software KodakMI
A) Carril 1: Marcador 100 pb (Axygene).
Carril 2: Producto de PCR con Per Up1-
S S Dwn2; Banda S (210 pb)
I
B) Carril 1: Marcador 100 pb (Axygene).
Carril 2: Producto de PCR con Per up1-
dwn1; Bandas S (218 pb) e I (110 pb)
La secuencia obtenida, de Per Up1-Dwn1 banda S (Fig. 5) muestra similitudes con fragmentos
del gen Per reportados para diversos géneros de palomillas (Tabla 3) con un buen grado de
similitud.
Resulta interesante que el software BLAST encuentre inmediatamente una relación entre una
fracción del amplicón y las secuencias incompletas recién reportadas de estos organismos, pues
nos indica la posibilidad de tener un fragmento del gen. Sin embargo, el tamaño de la secuencia
es muy pequeño en comparación con otras ya reportadas para el mismo gen. Lo cual es una señal
de que el amplicón no necesariamente es el mRNA de Per.
Al alinear el amplicón con otras secuencias de pares de bases en el programa Clustal W,

encontramos que la mayor similitud se encuentra en la zona inicial de la secuencia (primeros
50 pb), en especial con las palomillas y la mosca de la fruta. Como se observa en el cuadro
de la Fig. 6, la identidad con per del ratón (MusmusPerI) es casi la mitad de el parecido con los
invertebrados.
Resultados 51
Fig 6. Comparación de las secuencia PerUp1-Dwn1 con genes Per reportados para otros organismos
Secuencia Problema Tamaño(pb)

Secuencia comparada
Género Tamaño(pb) Score
===========================================================================
PerUp1-Dwn1 205 DrosophilaM.Per 3657 23
PerUp1-Dwn1 205 ApisM.Per 3375 24
PerUp1-Dwn1 205 MusmusPer1 4669 14
PerUp1-Dwn1 205 UnzelajapixPer 948 25
PerUp1-Dwn1 205 PachyliaFicusPer 948 26
PachyliaFicusPer ---------------------------ATTGGCAGATCGTTCATCGATTTTGT---TCAT 30
Unzela-japixPer ---------------------------ATCGGCAGGTCCTTCATCGACTTTGT---TCAT 30
Droso.per GTCCTGGGCTACCCGCGCGACATGTGGCTGGGCAGGTCCTTCATCGATTTTGT---GCAC 837
Apis.per GCTCTAGGATATCTCAAGGATGCATGGATTGGCCGTTCTTTCATCGATTACGT---CCAT 609
PerUp1-Dwn1 ----------------------------TGGGCAGGTCCTTCATCGATTTTGCATGGCAT 32
* *** * ** ** ** ** * * **
PachyliaFicusPer CCTAGGGACCGCAACACCTTCGCATCGCAGATCACCAGCGGGCTAGCTGTRCCRAAGATA 90
Unzela-japixPer CCTAGGGACCGCAACACGTTCGCCTCGCAGATCACCAGCGGGCTTGCTGTGCCGAAAATA 90
Droso.per CTTAAGGACCGCGCCACCTTCGCCAGTCAGATCACCACGGGCATACCCATTGCGGAATCC 897
Apis.per CCCAAGGATAAGGCCACACTGGCTGATCAGATTAAAAACGGAATAGTCTCGCCTCAAGAA 669
PerUp1-Dwn1 CCAAGGGAGGGAAACAGGCTCGCAGTTCAGTTCACCAGCCCGGTACTCGGTCCTGAACTT 92
* * *** ** * ** *** * * * * * *
PachyliaFicusPer GTA---------------------------------------AATTCGACTATGGTATGT 111

Unzela-japixPer GTA---------------------------------------AATTCGACGATGGTCTGC 111
Droso.per AGGGGCAGCGTGCCCAAGG-----------------ACGCCAAGAGCACCTTCTGCGTGA 940
Apis.per GAAAGACCGAAAGGTATTA---------------ATGGGAGAAGAGCAAGTCTGTTTTGC 714
PerUp1-Dwn1 ACATGCCTATACTCGATTA---------------------GGAGAACAGAG-CGTCCTGT 130
* * **
PachyliaFicusPer CGCATTCGKCGTTAC-CGTGGGCTCA---CCACYGGGT--TTGGAGTAAAGGACCGCGTT 165

Unzela-japixPer CGCATCCGCCGGTAC-CGCGGTCTCA---CCACAGGGT--TCGGAGTAAAGGACCGTGTG 165
Droso.per TGC-TGCGTCGCTAC-CGGGGACTCAAGTCCGGCGGAT--TCGGCGTCATCGGCAGGCCC 996
Apis.per GGATTACAGAAGTACACAAGATCTTTCGCTCATCAATCGATCAACAAAGAGGCAAGATCG 774
PerUp1-Dwn1 TTGTTGCATGTTCGCCCTCTTGCTCGTGCTCACCCTTC---TTGTATAATGGGACTACCT 187
* * * * **
PachyliaFicusPer GTCACCTTCATGCCGTTCCTCCTGAAGTTCACCTTCAAGAACATCTCT-----GATGAGG 220

Unzela-japixPer GTGACCTTCATGCCCTTCCTGCTGAAGTTCACCTTCAAGAACATTTCT-----GATGAGG 220
Droso.per GTCAGCTACGAACCCTTCCGCCTGGGGCTCACCTTCAGGGAGGCTCCGGA--GGAGGCGC 1054
Apis.per AATTTGTATCTCCCGTTCCACTTGACATTGTCGTTCAGAGATTTTCGAGATCGTACGACT 834
PerUp1-Dwn1 TAAGCTTACAAACCGTTC------------------------------------------ 205
* ** ***
Comparación de las secuencia Per up1-dwn1 banda S contra genes Per reportados para otros organismos. En la
parte superior se observa una tabla donde se muestra la secuencia problema y el score (Clustal W) de la
alineación contra cada gen. Podemos ver como la similitud con las palomillas Pachylia Ficus
(PachyliaFicusPer), Unzela japix (Unzela-japixPer) y en general, de los insectos, es mayor que comparada con
el ratón Mus musculus (MusmusPer1).
Abajo se muestra la alineación (ClustalW) del producto de la clona G vs invertebrados. En negritas se resaltan
los pares de bases que son idénticos (*).
Resultados 52
Fig 7. Comparación del marco de lectura +3 del producto de Per up1-dwn1 S contra proteínas PER
reportados para invertebrados
Secuencia Problema Tamaño(pb) Secuencia comparada Tamaño(pb)
Score
===========================================================================
PerUp1-Dwn1frame+3 57 Unzela- 316 31
PerUp1-Dwn1frame+3 57 Pachylia 316 31
PerUp1-Dwn1frame+3 57 Acosmeryx 316 31
Unzela- IGRSFIDFV-HPRDRNTFASQITSGLAVPKIVNSTMVCRIRRYRGLTTGFGVKDRVVTFM 59
Pachylia IGRSFIDFV-HPRDRNTFASQITSGLAVPKIVNSTMVCRIRRYRGLTTGFGVKDRVVTFM 59
Acosmeryx VGRSFIDFV-HPRDRNTFASQITTGLAVPEVVDSTMVCRIRRYRGLSAGFAVKDRVTTFM 59
PerUp1-Dwn1frame+3 -GRSFIDFAWHPREGNRLAVQFTSPVLGPELT---CLYSIRR---------TERPVCCMF 47
*******. ***: * :* *:*: : *::. : *** .: * ::
Unzela- PFLLKFTFKNISDEEKVIYLVIQATPFFSAFRIPNEVVAKAVPFVMRHSANGNLEYIDPE 119

Pachylia PFLLKFTFKNISDEEKVIYLVIQATPFFSAFRIPNEVVAKAIPFVMRHSANGNLEYIDPE 119
Acosmeryx PFLLKFSFKNVADDAKVIYLVIQATPFFSAFRIPNEVLAKSNPFVIRHSANGNLEFIDPE 119
PerUp1-Dwn1frame+3 ALLL------------VLTLLV-------------------------------------- 57
.:** *: *::
Comparación del marco de lectura +3 de las secuencia Per Up1-Dwn1 S con proteínas PER reportados para 3
diferentes especies de palomilla. En la parte superior se observa una tabla donde se muestra la secuencia problema
y el score (Clustal W) de la alineación contra cada gen.
Abajo se muestra la alineación (ClustalW) del marco de lectura vs la secuencia de la proteína reportada para
diferentes especies. En negritas se resaltan los aminoácidos que son idénticos (*), también se muestran aquellos
que son sustituciones conservadas (:) y sustituciones semiconservadas (.) ClustalW (EMBL-EBI).
Se tradujo la secuencia a los tres posibles marcos de lectura en sentido (+) y antisentido (-), 6
marcos de lectura totales. De los cuales únicamente los marcos + 3 y +1 son marcos de lectura
abiertos. Para el marco +1, al ser alineado con el programa BLAST, no se encuentran
similitudes significativas con ninguna secuencia. Sin embargo, para el marco + 3, se
encuentra similitud (score: 36) conla proteína Per reportada para una especie de palomilla
Ascosmeryx naga (Gene Bank: ACD01778.1). Como se puede ver en la alineación con
ClustalW (Fig. 7), el marco de lectura + 3 es idéntico en la zona conservada donde fue
diseñado el oligo, y esa similitud continua 16 aa más, aunque conforme nos alejamos en la
secuencia el parecido disminuye.
Resultados 53
El mismo marco de lectura también se alinea con una proteína de dominio PAS (LPAS1) del
mamífero Murina leucogaster (Gene Bank: FJ858730.1) , en la base de datos del Protein Data
Bank (RSCB.org)
7.5 Clonación de los productos
Se clonaron en bacterias DH5-α supercompetentes utilizando el vector pGEM T-easy

(Promega), los fragmentos: M; amplificado por los cebadores Clk Up2-Dwn4 y S; amplificado
por los cebadores Per Up1-Dwn1, por ser aquellos que mostraban mayor identidad con sus
respectivos homólogos.
Fig 8. Placa con colonias DH5-α transformadas con marcador X-Gal e IPTG
Colonia positiva
Colonia negativa
Las reacciones de clonación del fragmento S Per Up1-Dwn1 como del M Clk Up2-Dwn4 se
llevaron a cabo utilizando el kit TopoTA (Invitrogen) con sus propias bacterias (MatchT1);
así como el plásmido pGEM T-easy (Promega) con bacterias supercompetentes fabricadas
en el laboratorio. los resultados con el Kit siempre fueron negativos, la mayoría de las
bacterias transformantes no contenían inserto, sino que el plásmido se había circularizado y
les había conferido resistencia al medio con antibiótico.
Resultados 54
El análisis de las transformantes se agilizó y simplificó con el uso del método de tamizaje ¨Blue-
White screening¨, pues de este modo nos fue posible diferenciar visualmente entre las colonias
que contenían el vector de clonación sin inserto, de aquellas que portaban un inserto. Dado que el
vector utilizado es del tipo pUC y contiene una secuencia que codifica para el fragmento-α del
gen de la β−galactosidasa y que las bacterias DH5-α portan en su genoma el fragmento
complementario del gen, entonces esta combinación permitó el ensamblaje de un complejo
activo que, en presencia de X-Gal (el sustrato cromogénico de la β−galactosidasa) y el inductor
IPTG dio lugar a la formación de colonias de color azul (Messing J, et. al. 1977), mientras que
la inactivación del gen de la β−galactosidasa debido a la inserción de un fragmento de DNA en el
vector de clonación dio como resultado la pérdida de la actividad funcional de la β
−galactosidasa. Por lo tanto, las bacterias que fueron transformadas con un plásmido con inserto
generaron colonias que se mantuvieron blancas (Fig. 8).
De este modo, las colonias de las cuales se extrajeron los plásmidos poseían casi con certeza el
inserto, lo cual se corroboro al hacer la digestión con la enzima EcoRI. Ninguno de los plásmidos
recombinantes (pGEM T-easy) para el fragmento S Per Up1-Dwn1 muestra similitud con la
secuencia de PCR para este amplicón, ni con algún otra secuencia en el Gene Bank. Por lo que
consideramos que el cDNA presente en la muestra contenía diferentes amplicones, de los cuales
había poca cantidad del fragmento esperado y por ello el rendimiento de la clonación para dicho
fragmento fue muy bajo.
Para el amplicón M Clk up2-dwn4, tras varios intentos, clonando diversos productos
desconocidos, finalmente una clona portaba un inserto de 381 pb (Fig. 9), la cual es del tamaño
esperado del amplicón (Tabla 2. Fig. 2) y como se puede ver en la figura 9, al ser comparado con
la secuencia de PCR, la similitud es del 92% . Pero en el plásmido, el secuenciador detecta con
claridad una secuencia de 40 pb que no se había identificado en la secuenciación del producto de
PCR.
Resultados 55
Fig 9. Comparación entre la secuencia de PCR de Clk Up2-Dwn4 banda M (Clk2-4bigconsensus) vs la
secuencia de la clona del mismo producto (Clk Up2-Dwn4 ClonG)
CLKup2-dwn4ClonG --------------------------CCTGTGGTAGTGCTGTTTATAGAATTCCTAACAC 34
CLK2-4bigconsensus TTGTTGATGACAAGTCCACTGTCCTGCCTGTGG--GTGCAGTTTATAGAATTCCTAACAC 58
******* **** ********************
CLKup2-dwn4ClonG TGATGTGTCCTAATCCATCTCAAACCTTAGGAATCTAGTACTTGATAACAGACTGAACAA 94
CLK2-4bigconsensus TGATGTGTCCGAATTCAACTCAAACCTTAGAAATCTAATACTTGATAACAGACTGAACAA 118
********** *** ** ************ ****** **********************
CLKup2-dwn4ClonG AAACCACCTAGTTATCGCAGGGGACTTTAATATTGACCTCTGCGAGCCTGAACACCCCAC 154

CLK2-4bigconsensus AAACCACCTAGTTATCGCAGGGGACTTTAATATTGACCTCTGCGAGCCTGAACACCCCAC 178
************************************************************
CLKup2-dwn4ClonG TGCTGTTAGCATACAACCAAGTATAACAGTATATACTTGAGGACACTGTTTACCTCAACT 214

CLK2-4bigconsensus TGCTGTTAGCTT----------------------------------------CCTCAACT 198
********** * ********
CLKup2-dwn4ClonG GTATGAACTCCTGCTTCCTCATACCCTTAACCACTTGACCTGTTAGAATCACTGATAGCA 274

CLK2-4bigconsensus GTATGAATTCCTGCTTCCTCATACCCTTAATCACTAGACCTACTAGAATCACTGATAGCA 258
******* ********************** **** ***** *****************
CLKup2-dwn4ClonG CTGCCACGACTCTCGATAACATCTGCACATACCGCATCATAACATCTCCGCTTACTGAAG 334

CLK2-4bigconsensus CTGCCACGACTCTCGATCACATCTGGACA------AACATAACCTCTCCGCTTACTTCAG 312
***************** ******* *** * ****** ************ **
CLKup2-dwn4ClonG GTATAATCGCCAATATCTTGTTACTACAGATTCTTGACCAAAGGACA 381

CLK2-4bigconsensus GTATAATCACCGATAGC-----ACTACAGATTCTTGACCAAAGGACA 354
******** ** *** * *************************
Alineación entre la secuencia de PCR de clk up2-dwn4 banda M (Clk2-4bigconsensus) y la secuencia de la clona del
mismo producto (Clkp2-dwn4ClonG).
Se puede observar como la clona no presenta el fragmento inicial de la secuencia correspondiente a el oligonucleótido
“clk Up2”. A pesar de que los productos son prácticamente idénticos (*), ClustalW Score: 92 (EMBL-EBI), el tamaño
de la secuencia de la clona es el esperado por la cuantificación del fotodocumentador (Tabla 2) y presenta un fragmento
de 40 pb que no se había identificado en el producto de PCR.
Resultados 56
7.6 Análisis de ritmicidad
Teóricamente, si la eficiencia de la amplificación es del 100%, el número de amplicones se

duplica en cada momento. Sin embargo, en este trabajo, la mayoría de las PCRs tuvo una
eficiencia menor al 100% y en una amplificación típica se obtuvo eficiencia constante de entre el
70% y el 80% a partir del XVº ciclo. De hecho, la amplificación solo es exponencial durante un
número limitado de ciclos, después de los cuales se alcanza un estado estable; esto se debe, entre
otras cosas al agotamiento de los cebadores con respecto a su constante de afinidad por el cDNA.
De este modo, para hacer una PCR adecuada para la cuantificación, se debe encontrar el punto
donde la amplificación deja de ser exponencial y se detiene. Lo cual dependerá de número de
ciclos, la cantidad de material con el que se inicia la reacción y el sistema de detección y
cuantificación del producto amplificado. A esta ventana de ensayos donde la cuantificación es
significativa, se le conoce como intervalo de amplificación lineal (Ferre F; 1992), el cual
definimos mediante la cuantificación de la brillantez de las bandas en reacciones de las 1100 h y
las 2200 h, sometidas a distintos números de ciclos (20, 25 y 30), todas con 2 μg de RNA totales
al inicio de la reacción de RT. De este modo se eligió, para la PCR semicuantitativa, el número
de ciclos en el que se amplificaba la menor cantidad de producto (Tabla 1) y así poder comparar
la cantidad de brillantez de la banda a las diferentes horas.
Los productos de PCR se cuantificaron por electroforésis con geles de agarosa al 1.5%, TAE 1X
y teñidas con bromuro de etidio en un fotodocumentador Kodak y con el software del mismo
(ver material y método). Dichos valores se normalizaron y se expresaron como eje de control al
ser graficados en un cronograma donde se observa que, tanto Per (Fig. 10) como Clk (Fig. 11)
muestran un ritmo diario, siendo el pico máximo de expresión del primero a las 1900 h y para el
segundo a las 0300 h.
Resultados 57
Fig 10. PCR semicuantitativa de la expresión de Per Up1-Dwn1 S a lo largo del día
200 pb
Fig 10. Cronograma de la expresión de pcPer.

Carril 1: Marcador.
Carriles 2-7: Producto de PCR con los cebadores Per Up1-Dwn1 a partir de cDNA de diferentes
horas, del cerebro del acocil (LO 12:12). n= 2 reacciones PCR.
Fig 11. PCR semicuantitativa de la expresión de Clk Up2-Dwn4 M a lo largo del día
400 pb
Fig 11. Cronograma de la expresión de pcClock.

Carril 1: Marcador.
Carriles 2-7: Producto de PCR con los cebadores Clk Up2-Dwn4 a partir de cDNA de diferentes horas, del
cerebro del acocil (LO 12:12). n= 2 reacciones PCR.
Resultados 58
8 . D I S CU S I ÓN Y CON CLU SI ONE S
¡L e v á nt a t e , m uc ha c ho ha r a g á n de l a t a be r na !"
L l e na nue v a m e nt e nue s t r o s t a r r o s v a c í o s
c o n l a m e di da de l dí a .
¡A nt e s de que s e a l l e na da
l a m e di da de nue s t r a s v i da s !
( O m a r Ka ya m )
Discusión y conclusiones 59
Los resultados muestran que la secuencia de los productos obtenidos (cDNA) tiene diversos
grados de identidad con las secuencias de pares de bases y de aminoácidos de genes y proteínas
del reloj de otros invertebrados. Clock es similar a la región conservada en el gen clock del
crustáceo Machrobranchium rosenbergii (BLAST score: 46) y per muestra identidad con el
mismo gen en las palomillas Pachylia Ficus y Unzela japix (BLAST score: 42 y 46
respectivamente).
Sin embargo, estos resultados no son concluyentes por diversas razones. El que no se haya
logrado determinar la secuencia de todas las bandas que se observaban en la electroforesis de
cada grupo de cebadores, deja en duda si alguna de esas secuencias muestra mayor similitud con
los genes buscados que aquellas que presentan los dos productos de PCR analizados. De la
misma manera, la necesidad de ampliar las secuencias ya identificadas mediante el diseño de
cebadores basados en los productos amplificados, es una limitante para aseverar la existencia de
homología con otros genes reloj.
La dificultad para clonar los fragmentos fue también un problema recurrente durante el
desarrollo de este trabajo que tiene repercusión en la determinación de las secuencias dentro de
los amplicones. Como lo podemos observar en el caso de Clk, cuya clona nos muestra la
secuencia completa del producto amplificado y la similitud con el gen del langostino es mayor.
Por ello, resulta indispensable el establecimiento de las condiciones para la clonación de los
fragmentos de Per, pues sin un plásmido recombinante con el amplicón se dificulta el desarrollo
de otros experimentos funcionales.
8.2 PCR semicuantitativa y análisis funcional
La habilidad para medir con precisión los patrones de expresión génica, es esencial en el estudio
de las funciones de los genes. La expresión de RNA puede ser determinada con diversos ensayos
como northern blots o análisis de protección de la RNasa. Sin embargo, estos métodos carecen de
sensibilidad y requieren grandes cantidades de RNA. Por ello, no son apropiados para casos en
los que se analizan cambios en los niveles de expresión de un mensajero poco abundante que se
expresa en una estructura muy pequeña (Haddad F; 2007), tal es el caso que observamos en este
trabajo, donde se buscó amplificar genes cuya expresión, de acuerdo al modelo del asa, esta
altamente regulada; lo cual significa, no solo que la cantidad de mensajero es poca, sino que
varía ampliamente a lo largo del día.
Por esta razón se eligió el uso de la técnica de transcripción reversa - reacción en cadena de la
polimerasa (RT-PCR), que se ha convertido en uno de los métodos de elección para quienes
desean medir y detectar los patrones de expresión de mRNA en células y pequeñas cantidades de
tejido.
Actualmente no existen dudas del poder cuantitativo de la PCR, que puede ser definido como el
nivel de reproducibilidad, precisión y exactitud que se logra al cuantificar una cantidad
especifica de ácidos nucleicos. Sin embargo, es muy reconocido que la precisión de
cuantificación de la PCR a partir de cDNA es menor, en parte debido a la adición de un segundo
paso enzimático, la transcripción reversa. (Ferre F; 1992).
Con el propósito de eliminar el ruido causado por la reacción de RT, se procuró estandarizar al
máximo las reacciones, calibrar frecuentemente las pipetas y mantener constante la cantidad de
RNA total, así como la prueba control con los cebadores para TRP para definir en forma visual y
subjetiva la calidad y cantidad de cada lote de reacciones de RT. En estas pruebas se observó que
no hay diferencias de la intensidad de brillo, de la banda del producto de la TRP, entre el RNA de
las 1100 h y de las 2200 h (datos no mostrados), lo cual podría sugerir que este producto no
muestra diferencias de expresión entre el día y la noche. Aún cuando no se tiene un control de
carga para la cuantificación de la intensidad relativa de brillo en las pruebas funcionales,
consideramos las pruebas de TRP como control interno de la cantidad de cDNA en cada lote de
RT´s para las diferentes horas.
Además, se estableció el intervalo lineal de saturación para las reacciones de clk y per, para
determinar el número de ciclos apropiado para realizar la cuantificación sin que se limitara la
reacción. Aún así, en los geles para la PCR semicuantitativa, se observa como la brillantez de las
bandas en horas donde se encuentra el pico máximo de expresión (0300 h en Per y 1900 h en
Clk), esta por encima de la saturación, comparado con otras horas, lo que sugiere la presencia de
altas cantidades del mensajero para esa hora. Es posible que los valores tan grandes en la
desviación estándar se deban a que la muestra es muy pequeña, por lo que es sugerible ampliar la
muestra, no solamente aumentando el número de reacciones sino los lotes de extracción de RNA
utilizados para las reacciones de reversa transcriptasa.
No existen resultados concluyentes sobre el comportamiento de la proteína PER en P. clarkii. En

cuanto a CLK, los datos en el crustáceo M. rosenbergii indican que el gen no oscila al lo largo
del día (Yang et. al. 2006). Sin embargo, nuestros experimentos muestran que hay mayor
cantidad del producto hacía la noche temprana, contrario a lo observado en la mosca de la fruta
donde el mínimo de expresión es al inicio de la noche.
Estudios realizados en los genes del reloj, sugieren que existen variaciones en los mecanismos
moleculares entre los organismos, incluso entre aquellos que están relacionados
filogenéticamente (Rubin et. al. 2007). Mas intrigante aún es lo que se observa en el molusco
Bulla gouldiana, donde los patrones de expresión temporal de PER en las neuronas retinianas
basales, no encajan con el modelo de asa de retroalimentación negativa descrito para Drosophila,
pues en este molusco el pico de expresión del mRNA del gen es durante el día subjetivo
temprano, mientras que en la mosca, el máximo se presenta durante la noche subjetiva temprana
(Constance et. al; 2002).
En el presente trabajo se mostró como los fragmentos identificados como porciones de la

secuencia para los genes del reloj Clock y Per, presentan oscilaciones diarias en la cantidad de
RNA mensajero (Figs. 10 y 11) sin embargo, la fase de la oscilación no coincide con el modelo
propuesto para D. melanogaster, pues en este organismo se ha descrito que los RNA mensajeros
de per y clock, oscilan en antifase, siendo el pico de expresión máxima de per durante la noche
temprana justo cuando clock se encuentra en su mínimo. (Piccini et. al. 1999. Yu y Hardin 2006).
En los resultados aquí mostrados y el trabajo desarrollado en nuestro laboratorio (datos sin
publicar ), la diferencia entre la acrofase del mRNA de clk y per es de 8 horas, presentando una
diferencia de 4 horas entre el pico de expresión del mRNA de clk y la proteína. Está última
muestra un adelanto de fase en relación con el zenith del mensajero de per; sugiriendo una
acción positiva de Clock sobre la transcripción de per, como se ha propuesto en el modelo
canónico del reloj molecular .
Hay que tener en cuenta que los resultados funcionales corresponden a la media aritmética de tan
sólo dos experimentos por ello no pueden ser considerados como un hallazgo definitivo, aunque
parecen sustentar los datos moleculares, las pruebas de oscilación no son contundentes ya que se
ha encontrado mRNA expresado rítmicamente que no forma parte del grupo de genes canónicos,
sino de la salida del reloj (Hardin; 2000).
Aún cuando el paradigma actual sugiere que las oscilaciones de per y clock proveen de
información al reloj, la importancia y el papel de dichas oscilaciones no es muy claro. El hecho
de que la oscilación de los productos del reloj desaparezcan en condiciones constantes y aún así
se mantenga el ritmo de actividad locomotora en D. melanogaster (Hardin et. al; 1990), es una
observación que pone a prueba la hipótesis de las asas de retroalimentación .
Se ha demostrado que la expresión constitutiva de per y tim no interviene en la expresión de los

ritmos de actividad, pero, al eliminar la oscilación de cualquiera de las proteínas, los ritmos
conductuales desaparecen. (Yang. Sehgal; 2001). Y recientemente, en uno de los experimentos
más sorprendentes del estudio molecular del reloj, se demostró de que la fosforilación de las
proteínas reloj de la bacteria Synechococcus exhiben un ritmo circadiano dentro de un tubo de
ensayo, con tan solo agregar cinasas y fosfatasas (Nakajima et. al; 2005).
Los resultados de estos autores dejan en duda si las oscilaciones del RNAm son indispensables
para el funcionamiento del reloj, pero hasta ahora no se ha llevado a cabo un estudio donde se
bloqueen simultáneamente todos los componentes del reloj, y resulta probable que aún no se
hayan identificado otros componentes redundantes del marcapasos ( Sheeba et. al; 2008). Aún
así, ello no implica que las oscilaciones de el mensajero no tengan un papel bajo circunstancias
normales (Yang. Sehgal; 2001).
La importancia del estudio del comportamiento de los genes y proteínas canónicas del reloj en
diversos grupos de organismos, en particular en el acocil P. clarkii, radica en la posibilidad de,
en un futuro, comprender el mecanismo bajo el que opera el sistema cicadiano, y más aún, su
evolución.
8.4 Conclusiones
Durante la elaboración de este proyecto se lograron establecer las condiciones para la

extracción de RNA, la reacción RT-PCR y la PCR semicuantitativa de diversos productos
génicos del cDNA del acocil P. clarkii. Esto representó gran parte del trabajo debido al
complejo proceso de estandarización de las técnicas moleculares para el genoma del acocil.
que, por experiencia personal, ha resultado ser un sencillo modelo neurobiológico pero uno
complicado a nivel molecular.
Se secuenciaron varios productos de la amplificación de diversos cebadores diseñados sobre las

secuencias conservadas de los genes reloj Per y Clock. No todos los productos muestran
similitud con los genes reloj reportados, e incluso queda pendiente la corroboración de la
identidad de los amplicones descritos como fragmentos de pcPer y pcClock, los cuales muestran
parecido (BLAST) con otras secuencias de genes reloj reportadas para diferentes organismos, en
particular entre los pares de bases de nuestro amplicón y clock del langostino M. rosenbergii. La
secuenciación de productos que no muestran homología con los genes reloj no resulta en vano,
pues surge la posibilidad de ir generando una base de datos de cDNA de clarkii, la cual es
indispensable en está época de la biología molecular.
El análisis del comportamiento diario de los fragmentos mencionados se realizó mediante la
PCR semicuantitativa de dos lotes, cada uno con muestras de 6 h del día de cDNA del
cerebro de acociles en ciclos LO 12:12. Siendo el pico máximo de expresión del amplicón
identificado como clock en la noche temprana 1900 h (ZT 12) momento en el que parece
comenzar a aumentar la abundancia de la proteína CLK (resultados no publicados). La acrofase
de expresión de per se presenta durante la noche tardía 0300 h (ZT 20) alrededor de 4 h
después del máximo de la proteína CLK.
8.3 Perspectivas
La biología molecular de los crustáceos es un campo poco explorado. Sin embargo, con el
análisis molecular podemos investigar procesos complejos en las células del sistema nervioso del
acocil, cuyas características anatómicas y funcionales lo convierten en un buen modelo para el
estudio de las neurociencias y en particular de los ritmos biológicos.
El aislamiento de cDNA que contenga un pequeño fragmento de RNA es un buen punto de inicio
para plantear experimentos funcionales. Examinar la expresión de mRNA a través de una
ribosonda en una sola o varias células, localizar la expresión proteíca dentro de un tejido, o
suprimir la expresión de una proteína especifica con inhibidores de RNA (McClintock et. al.
2002), son solo algunas de las técnicas que se pueden montar tras la identificación de un
fragmento de un gen específico.
En el presente trabajo se secuenciaron diversos amplicones, producto de la amplificación por

PCR de cDNA del genoma de P. clarkii con cebadores diseñados en zonas conservadas de los
genes del reloj circadiano (Period y Clock) conocidos en vertebrados e invertebrados. La
importancia de estos experimentos está en la identificación secuencias que muestran diversos
grados de similitud con los genes reloj mencionados, dichos amplicones han sido utilizados para
un análisis funcional, que es la detección de su comportamiento en los ciclos luz oscuridad.
Sin embargo, los resultados que se presentan no son concluyentes, pues además de la necesidad
de identificar con mejor precisión el grado de homología. Se requiere un mayor número de
pruebas funcionales para determinar si estos genes están realmente involucrados en el
mecanismo central del reloj.
Muchos experimentos han puesto a prueba la capacidad del modelo del asa de retroalimentación
para explicar todos los aspectos involucrados con el sistema circadiano. Pero existe aún un largo
trecho por recorrer y la necesidad de determinar el funcionamiento del mecanismo en diversos
organismos surge cuando, bajo nuestra perspectiva de biólogos, nos percatamos de la
importancia de una visión holística que deje atrás el reduccionismo y contemple la diversidad
para tener una perspectiva completa de como operan los relojes biológicos. Por ello la
trascendencia en el estudio de los ritmos en modelos como P. clarkii.
BI B LIO G RAF ÍA
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ANE XO
Anexo 72
1. Diseño Cebadores
Fig 1. Mapa de la posición de los cebadores para Clock
Clk 1 Clk 2 Clk 3 Clk 4

pb 65 pb 141 pb 964 pb 1,057
BHLH PAS 1
M. rosenbergii Clock
Clk 1-3 899pb
Fig. 1 Muestra la ubicación de los cebadores
Clk 1-4 992 pb diseñados para el gen clock sobre la
secuencia del crustáceo M. rosenbergii. todos
Clok 2-4 916pb
los cebadores están diseñados sobre dominios
y secuencias conservadas del gen.
Las lineas de colores representan los
productos esperados para cada combinación
de cebadores
Fig 2. Mapa de la posición de los cebadores para Per
Per up 1 Per up 2 Per dwn 1 Per dwn 2

pb 810 pb 1,495 pb 1,400 pb 1,805
PAS 1 PAS 2 D. melanogaster Per
Per 1-1 590 pb
Per 1-2 995 pb
Fig. 2 Muestra la ubicación de los cebadores diseñados Per 2-2 310 pb

para el gen per sobre la secuencia del la mosca de la
fruta D. melanogaster. Los cebadores están diseñados
sobre dominios y secuencias conservadas del gen.
Las lineas de colores representan los productos
esperados para cada combinación de cebadores y su
tamaño
Anexo 73
Fig 3. Alineación de diversas secuencias de la proteína CLOCK
CLK-1up
Ratus.N.clk MLFTVSCSKMSSIVDRDDSSIFDGLVEEDDKDKAKRVSRNKSEKKRRDQFNVLIKELGSM 60
MusM.clk MVFTVSCSKMSSIVDRDDSSIFDGLVEEDDKDKAKRVSRNKSEKKRRDQFNVLIKELGSM 60
GallusG.clk MFFTISTHKMSSIADRNDGSIFDGLVEEDDKDKAKRVSRNKSEKKRRDQFNVLIKELG-S 59
Xenopusclock ---------MSSTTDRDDGSIFDELVDEDDKDKAKRASRNKSEKRRRDQFNILIKELGSM 51
Danio ---------MTSSIDRDDSSIFDGLMEEDEKDKAKRVSRNRSEKKRRDQFNVLIKELGTM 51
AntheraeaP.clk ---------MDDDGDEKD----------DSK----RRTRNLSEKKRRDQFNLLINELSSL 37
DrosophilaM.clk ---------MDDESDDKD----------DTKSFLCRKSRNLSEKKRRDQFNSLVDDLSAL 41
Macrobrachium.clk ---------MDDDADEKD----------DVK----RKSRNLSEKKRRDQFNLLINELSSM 37
CLK-2up
Ratus.N.clk LPGNARKMDKSTVLQKSIDFLRKHKEITAQSDASEIRQDWKPTFLSNEEFTQLMLEALDG 120
MusM.clk LPGNARKMDKSTVLQKSIDFLRKHKETTAQSDASEIRQDWKPTFLSNEEFTQLMLEALDG 120
GallusG.clk LPGNARKMDKSTVLQKSIDFLRKHKEITAQSDASEIRQDWKPTFLSNEEFTQLMLEALDG 119
Xenopusclock LPGNARRMDKSTVLHKSIDYLRKHKEISAQSDASEIRQDWKPTFLSNEEFTQLMLEALDG 111
Danio LPGNTRKMDKSTILQKSIDFLRKHKEIAAQSESSEIRQDWKPPFLSNEEFTQLMLEALDG 111
AntheraeaP.clk VTSNSRKMDKSTVLKSTISFLRNHNEITVRSRAHDIQDDWKPTFLSNEEFTYLVLEALEG 97
DrosophilaM.clk ISTSSRKMDKSTVLKSTIAFLKNHNEATDRSKVFEIQQDWKPAFLSNDEYTHLMLESLDG 101
Macrobrachium.clk VASNNRKMDKSTVLKATIAFLKNQKEISVRTQSNEIREDWKPSFLSNEEFTHLMLEALDG 97
Ratus.N.clk FFLAIMTDGSIIYVSETVTSLLEHLPSDLVDQSIFNFIPEGEHSEVYKILSTHLLESDSL 180

MusM.clk FFLAIMTDGSIIYVSESVTSLLEHLPSDLVDQSIFNFIPEGEHSEVYKILSTHLLESDSL 180
GallusG.clk FFLAIMTDGNIIYVSESVTPLLEHLPSDLVDQSVFNFIPQGEHSEIYKILSSHLLESDSL 179
Xenopusclock FFLAVMTDGNIIYVSESVTSLLEHLPSDLVDQSIFNFVPEGEHSEVYKILSTRMLESGSL 171
Danio FFLAIMTDGNIIYVSESVTSLLEHLPSDLVDQNLLNFLPLGEHSEVYKALSTHMLEGETL 171
AntheraeaP.clk FVVVFSTSGRIHYVSESISSLLGYNPVDIINKSLFELVFEEDQQTLYSLLQSPGNITDP- 156
DanausP.clk FVMVFSASGCIYYVSESVTSLLGHTPGDIINKSIFDLAFVDDRPNLYNILQNGGTLDPT- 156
DrosophilaM.clk FMMVFSSMGSIFYASESITSQLGYLPQDLYNMTIYDLAYEMDHEALLNIFMNPTPVIEPR 161 Fig. 3 Alineaciones (ClustalW) de varias secuencias
Macrobrachium.clk FIMTVSCSGRVLYTSESITPLIGHLPSDLAGTPLYDLMLEEERGEMRRFLSNPALAPNPS 157
de proteínas CLOCK (Gene Bank) tanto de
Ratus.N.clk TPEDLKSKNQLEFCCHMLRG-TIDPKEPSTYEYVRFIGNFKSLNSVSTS----------- 228
MusM.clk TPEYLKSKNQLEFCCHMLRG-TIDPKEPSTYEYVRFIGNFKSLTSVSTS----------- 228 vertebrados como invertebrados.
GallusG.clk TPEYLKSKNQLEFCCHMLRG-TIDPKEQPTYEYVKFIGNFKCLNNVPNS----------- 227
Xenopusclock SSEYLKTKNELEFCCHMLRG-TADPKEPSTYEFVKFIGNFKSLNNVPNS----------- 219 En verde se marca el dominio BHLH.
Danio TPDYLKTKNQLEFCCHMLRG-TIDPKEPPVYEYVKFIGNFKSLNTVPNS----------- 219
AntheraeaP.clk --THTGKENEIQFQCHIRRGGSSEYGEDVAYELIQFNGHFR--SNVESL----------- 201 En morado se delimita el dominio PAS.
DanausP.clk --QVVMTDNPISFRCRLQRG-TLDFRDEVTYELVQFDGHFR--KNLES------------ 199
DrosophilaM.clk Q-TDISSSNQITFYTHLRRG-GMEKVDANAYELVKFVGYFRNDTNTSTG----------- 208 Sobre la secuencia donde se diseñó el cebador se
Macrobrachium.clk T-CFDNTKEKYTIAVHLRRG-TINSSDATNYERVHLMGYFERYSGPSEDGVLDFSCSEAE 215
observan unas flechas con el nombre del primer
Ratus.N.clk ----------------THNGFEGTIQRTHR-----------PSYEDRVCFVATVRLATPQ 261
MusM.clk ----------------THNGFEGTIQRTHR-----------PSYEDRVCFVATVRLATPQ 261 (azules: Downstream (Dwn)/ rojas: Upstream (Up))
GallusG.clk ----------------AHNGFEGTIQRSHR-----------PSYEDKVCFIATVRLATPQ 260
Xenopusclock ----------------THNGFDGALQRSLR-----------PPYEERVCFVATVRLATPQ 252
Danio ----------------TRNGFEGVIQRSLR-----------HAFEDRVCFIATVRLAKPQ 252
AntheraeaP.clk ----------------HADDLSHYRQGS----------------DNRLLFVCTGRLSNPQ 229
DanausP.clk ----------------NENGHHSYQDEH----------------ESRLLFVCTGRLYMPQ 227
DrosophilaM.clk ----------------SSSEVSNGSNGQPAVLPRIFQQNPNAEVDKKLVFVGTGRVQNPQ 252
Macrobrachium.clk DSVSVSSCSRSMFGGNAGGGVTGSSNAGSGLCQSSLVQTNPSQEPTKLVFVAIGRLERPQ 275
CLK-3dwn
Ratus.N.clk FIKEMCTVEEPNEEFTSRHSLEWKFLFLDHRAPPIIGYLPFEVLGTSGYDYYHVDDLESL 321
MusM.clk FIKEMCTVEEPNEEFTSRHSLEWKFLFLDHRAPPIIGYLPFEVLGTSGYDYYHVDDLENL 321
GallusG.clk FIKEMCTVEEPNEEFTSRHSLEWKFLFLDHRAPPIIGYLPFEVLGTSGYDYYHVDDLDNL 320
Xenopusclock FIKEMCTVEESNEEFTSRHSLEWKFLFLDHRAPPIIGYLPFEVLGTSGYDYYHVDDLENL 312
Danio FIKEMCTVEEPNEEFTSRHSLEWKFLFLDHRAPPIIGYLPFEVLGTSGYDYYHVDDLETL 312
AntheraeaP.clk LIRDVSLVDSSRNEFTSRHSLEWKFLFLDRRAPPIIGYLPFEVLGTSGYDYYHFDDLEKV 289
DrosophilaM.clk LIREMSIIDPTSNEFTSKHSMEWKFLFLDHRAPPIIGYMPFEVLGTSGYDYYHFDDLDSI 312
Macrobrachium.clk LVREMMIIEPSKTEFTSRHSLEWKFLFLDHRAPTIIGYLPFEVLGTSGYDYYHVEDLDKV 33
CLK-4dwn
Ratus.N.clk AKCHEHLMQYGKGKSCYYRFLTKGQQWIWLQTHYYITYHQWNSRPEFIVCTHTVVSYAEV 381
MusM.clk AKCHEHLMQYGKGKSCYYRFLTKGQQWIWLQTHYYITYHQWNSRPEFIVCTHTVVSYAEV 381
GallusG.clk AKCHEHLMQYGKGKSCYYRFLTKGQQWIWLQTHYYITYHQWNSRPEFIVCTHTVVSYAEV 380
Xenopusclock AKCHEHLMQYGKGKSCYYRFLTKGQQWIWLQTRYYITYHQWNSRPEFIVCTHTVVSYAEV 372
Danio AKCHEHLMQYGKGKSCYYRFLT-GQQWIWLQTHYYITYHQWNSRPEFIVCTHTVVSYAEV 371
AntheraeaP.clk ITCHEALMQKGELTSCYYRFLTKGQQWIWLQTRFYITYHQWNSKPEFIVCTHRVVSYTDM 349
DrosophilaM.clk VACHEELRQTGEGKSCYYRFLTKGQQWIWLQTDYYVSYHQFNSKPDYVVCTHKVVSYAEV 372
Macrobrachium.clk ASCHEQLMKTGKGTSCYYRFLTKGQQWIWLQTQYYITYHQWNSKPEFIVCTNTVVSYSDV 395
Anexo 74
Fig 4. Alineación de diversas secuencias de la proteína PER
PER-1up
manduca.per ------------GIVMYTTSSLTTTLGFPKDMWIGRSFIDFVHPRDRNTFASQITSGLAV 48
bombix.per -DGFSCVISMHDGIVMYTTSSLTATLGFPKDMWIGRSFIDFVHPRDRSTFASQITSGLAV 226
mamestra.per KDGFSCVISMHDGVIMYATSTLTTTLGFPKDMWIGRSFIDFVHPRDRNTFASQITNGLAV 254
antheraea.per --GFSCVISMHDGVVLYATASLTSTLGFPKDMWVGRSFIDFVHPRDRNTFASQITNELAI 224
Periplaneta.per EGEFCVVVSMQDGVVVFTTPSITDVVGFPKDMWLGRSFIDFVHPRDRTAFANHITSGVIT 286
Gryllus ENEFSAIVSLHDGVVMYTTTSITSVLGFPKDMWLGRSFIDFVHPKDRMAFASHITTGVAL 260
Apis.per EG-FCAVISMHDGLVLYTTPSICTALGYLKDAWIGRSFIDYVHPKDKATLADQIKNGIVS 220
droso.per EDSFCCVISMHDGIVLYTTPSITDVLGYPRDMWLGRSFIDFVHLKDRATFASQITTGIP- 295
LuciliacuprinaPer EDSFCCVISMHDGIVLYTTPSITDVLGFPRDMWLGRSFIDFVHTKDRATFASQITTGIP- 238
SarcophagabullataPER EESFCCVISMHDGIVLYTTPSITNVLGFPRDMWLGRSFIDFVHTKDRATFASQITTGIP- 239
homo.per QDTFSVAVSFLTGRIVYISEQAAVLLRCKRDVFRGTRFSELLAPQDVGVFYGSTAPSRLP 232
mus.per1 QDTFSVAVSFLTGRIVYISEQAGVLLRCKRDVFRGARFSELLAPQDVGVFYGSTTPSRLP 276
rat.per1 QDTFSVAVSFLTGRIVYISEQAGVLLRCKRDVFRGARFSELLAPQDVGVFYGSTTPSRLP 276
xenopus.per PDTFSVAVSFISGRIVYISDQASLILHCKKEVFKGATFAEFLAPQDVSVFYGSTAPYHLP 155
danio.per3 TDSFVVVFSLASGKVVYASEQASSVLHCKRKFLESAKFVEMLYHQDVNVFYSHTAQPRLP 295
manduca.per PKIVNG-----QSPGNPASTMVCRIRRYRGLTTGFGVKDRVVTFMPFLLKFTFKNVS--- 100

bombix.per PKTANGTQEKAQSPGNSGSTMVCRIRRYRGLSTGFGVKERVVTFMPFLLKFTFKNIS--- 283
mamestra.per PKIVNGTQEKVQSPANSVSTMVCRIRRYRGLTTGFGVIERVVGFMPFLLKLTFKNIS--- 311
antheraea.per PKIVSLTEETDQTMENPGSTMVCRIRRYRGLSCGFSVKNTTTAYLPFLLKFKFKNVN--- 281
Periplaneta.per PLSNSNPKGGSHPGKNSFYCCLRRY--RGLKSTGYGVTEKEVSYLPFQLNMTFRELLPHS 344
Gryllus PVEENRCK-VSLTAKESFYCCLRQY--RGLKSSGYGVTEKKVTYLPXHLTXTFRDVT--- 314
Apis.per PQEE-RPK-GINGRRASLFCGLQKYT-RSFAHQSINKEARSNLYLPFHLTLSFRDFR--- 274
droso.per -IAESRG-SVPKDAKSTFCVMLRRY--RGLKSGGFGVIGRPVSYEPFRLGLTFREAP--- 348
LuciliacuprinaPer -IAESRS-SMPKDARSTFCVMLRRY--RGLKSGGYGVIGRSVNYEPFRLGLTFREAP--- 291
SarcophagabullataPER -IAESRS-SLPKDARSTFCVMLRRY--RGLKSGGYGVIGRSVNYEPFRLGLTFREAP--- 292
homo.per TWGTGASAGSGLRDFTQEKSVFCRIR-------GGPDRDPGPRYQPFRLTPYVTKIR--- 282
mus.per1 TWGTGTSAGSGLKDFTQEKSVFCRIR-------GGPDRDPGPRYQPFRLTPYVTKIR--- 326
rat.per1 TWGTGTSAGSGLKDFTQEKSVFCRIR-------GGPDRDPGPRYQPFRLTPYVTKIR--- 326
xenopus.per SWSNCTSGDPALMDYTQEKSVFCRIS-------GGRERDMNIRYHPFRLTPYLMKVR--- 205 Fig. 4 Alineaciones (ClustalW) de varias
manduca.per
bombix.per
--------------DEEGKVIYLVIQATQFFSAFRIPSE-VVSKAVPFVMRHAANGNLEY
--------------DEEGNVIYLVIQATPFFSAFKTSFE-ILPKVNPFVMRHSANGNLEY
145
328
secuencias de proteínas PERIOD (Gene Bank)
mamestra.per
antheraea.per
--------------DEEGKVIYLVIQATPFFSAFKSPNE-MVIKPVPFVIRHAANGHIEY
--------------EDKGNVIYLVIQAVPFFSAFKTSNE-VLAKTVSFVIRHSADGNLEY
356
326 tanto de vertebrados como invertebrados.
Periplaneta.per NPLEVEGNTSPESVPGGCNSMFLVITAKLICSAYKHAGETCAS--PKFVTRHLATCKLNY 402
Gryllus
Apis.per
---STEKMGLAEEEPG-IQGSFLIILASRIKPAYTHPDETKIS--SKFIIRHQASCELSH
----------DRTTEQQHKAMFLVVTAQPVHSAYKAPEETIIS--SVFTTRHNATCYLSH
368
322
En verde se marca el dominio PAS 1.
droso.per
LuciliacuprinaPer
-----EEARPDNYMVSNGTNMLLVICATPIKSSYKVPDEILSQKSPKFAIRHTATGIISH
-----EEARSDNYLPS-GTNMLLVICATPIKSAYKVSDELLSHKSAKFTIRHTATGIISH
403
345 En amarillo se delimita el dominio PAS 2.
SarcophagabullataPER -----EEARSDSHLPS-GTNMLLVICATPIKSAYKVSDELLSHKNAKFAIRHTATGIISH 346
homo.per
mus.per1
------------VSDGAPAQPCCLLIAERIHSGYEAPRIPPDK--RIFTTRHTPSCLFQD
328
372
Sobre la secuencia donde se diseñó el cebador se
rat.per1
xenopus.per
------------DSDTAEGQPCCLLIAEKIHSGYEAPRIPPDK--RTFTTR
372
observan unas flechas con el nombre del primer
manduca.per IDPESVP--YLGYLPQDVTDKDALQLYHPEDLDYLQQVYETIVK----EGGVPRTKAYRM 199 (azules: Downstream (Dwn)/ rojas: Upstream
bombix.per LDPESVP--YLGYLPQDVQDKDALQLYHPEDLEYLQQVYEVIVK----DGGMPRSKTYRM 382
mamestra.per
antheraea.per
VDPASVP--YLGYLPQDLADKDALLLYHPEDLMYLRQVYDTIVK----EGGLPRSKSYRM
IDAESVP--YLGYLPQDITNRDALLLYHPGDLGYLQEIYGSLVK----EGNVTRSKTYRM
410
380
(Up))
Periplaneta.per VDPECMP--YLGYLPHEMLGNSVLDFYHPEDLPFLKEVYQIVMQ---ENGAPFRSKPYRF 457
Gryllus VDSDIVQ--YLGYMPQDMIGRSVFEFYHPEDSPYLKEVYEGVIK---AQGQPFRSKPYRF 423
Apis.per VDPDVVQ--YFGYLPQDMVGRSLFDFYHPEDLPFIKDIYETVIK---LEGASFRSKPYRF 377
droso.per VDSAAVS--ALGYLPQDLIGRSIMDFYHHEDLSVMKETYETVMKKGQTAGASFCSKPYRF 461
LuciliacuprinaPer VDSAAVS--ALGYLPQDLIGRSILDFYHHEDLIVLKEIYETVMKKGQTAGASFCSKPYRF 403
SarcophagabullataPER VDSAAIS--ALGYLPQDLIGRSILDFYHHEDLIVLKEIYETVMKKGQMAGASFCSKPYRF 404
homo.per VDERAAP--LLGYLPQDLLGAPVLLFLHPEDRPLMLAIHKKILQLA--G-QPFDHSPIRF 383
mus.per1 VDERAAP--LLGYLPQDLLGAPVLLFLHPEDRPLMLAIHKKILQLA--G-QPFDHSPIRF 427
rat.per1 VDERAAP--LLGYLPQDLLGAPVLLFLHPEDRPLMLAIHKKILQLA--G-QPFDHSPIRF 427
xenopus.per VDERAVP--LLGYLPQDLIGMPVLLFIHPEDRPLMLAIHKKVLQQA--G-QPFDHSPIRL 306
PER-1dwn
PER-2up
manduca.per MAQNGDYLKLETEWSSFINPWSKRLDFVIGKHHIIEGPSNPDVFQSPDPEKAVAMS---E 256
bombix.per MTQNGDYIKIETEWSSFINPWSKKLEFVIGKHYIIEGPENPDVFQSQDPEKHTKLC---D 439
mamestra.per ITQNGDYIRLETEWSSFINPWSKRLEFVIGKHHILEGPTNPDVFQAPDPEKPTKVT---E 467
antheraea.per MTQNGHYMKVETEWSAFINPWSKKLEFVTGKHYIIEGPANPDVFQ--NPENVLKLT---E 435
Periplaneta.per RSHNGGYILLETEWSSFVNPWSKKLEFVVGQHRVLKGPENADVFMAPVEDDTLQIS---E 514
Gryllus KAQNGGFVLLDTEWSAFINPWSRKLEFIIGQNRVLKGPPNPNVFVTQTSEDCLQIS---E 480
Apis.per GIQNGDYVVLETEWSSFINPWTKKLEFVVGQHRILKGPANPDIFRVSCATEHSQLTNISE 437
droso.per LIQNGCYVLLETEWTSFVNPWSRKLEFVVGHHRVFQGPKQCNVFEAAPT---CKLKIS-E 517
LuciliacuprinaPer LIQNGCYALLETEWTSFVNPWSRKLEFVIGHHRVFQGPKNVHVFEPPPN---TKPKLS-E 459
SarcophagabullataPER LIQNGCYVLLETEWTSFVNPWSRKLEFVIGHHRVFQGPKNVNVFEPPPN---TKPKLS-E 460
homo.per CARNGEYVTMDTSWAGFVHPWSRKVAFVLGRHKVRTAPLNEDVFTPPAPSPAPSLDTDIQ 443
mus.per1 CARNGEYVTMDTSWAGFVHPWSRKVAFVLGRHKVRTAPLNEDVFTPPAPSPAPSLDSDIQ 487
rat.per1 CARNGEYVTMDTSWAGFVHPWSRKVAFVLGRHKVRTAPLNEDVFTPPVPSPAPSLDSDIQ 487
xenopus.per CARSGEYVTIDTSWTSFVNPWSRKVSFILGRHKVRTSPLNEDVFTAPKGVELKPLDFDTQ 366
manduca.per EEKAKEQKYRRDIIRTMNEVLTKPAEVAKQQMTKRCQDLAS------------------F 298

bombix.per EQIKKSMVFRENIVKLMNEALTKPAEVAKQQMSKRCQDLAS------------------F 481
mamestra.per EEKNKAQMLRENIVRTMNEALTKPAELAKQQMSKRCQDLAS------------------F 509
antheraea.per EQKNQAKMYRDSIIRIMKDVLTKPAEIAKQQMSKRCQDLAH------------------F 477
Periplaneta.per EVLKESKIIQEEIRSLLSEMVKNNGHLEKQQMSKRCRDLAT------------------F 556
Gryllus EVLKESKVIQHEIENLLKETIQRTTGAAKQVASKRCKDLAT------------------F 522
Apis.per EVLKEAKIIQEEIRTLLDESIQRKSDITELDVSKRCKDLAS------------------F 479
droso.per EAQSRNTRIKEDIVKRLAETVSRPSDTVKQEVSRRCQALAS------------------F 559
LuciliacuprinaPer DSQARIARIKEDIVKLLAETVSRPSDTVKQEVSRRCQALAS------------------F 501
SarcophagabullataPER DSQARIGSIKEEILKLLAENVSRPSDTVKQEVSRRCQALAS------------------F 502
homo.per ELSEQIHRLLLQPVHSPSPTGLCGVGAVTSPGPLHSPGSSSDSNGGDAEGPG------PP 497
mus.per1 ELSEQIHRLLLQPVHSSSPTGLCGVGPLMSPGPLHSPGSSSDSNGGDAEGPG------PP 541
rat.per1 ELSEQIHRLLLQPVHSSSTTGLCGVGPLMSPGPLHSPGSSSDSNGGDAEGPG------PP 541
xenopus.per ELSEQIHRILLQPVHSTTSGGNGSGGSNMSQEPFHCNASSSDSNAMVTEEGA------DR 420
Anexo 75
Tabla. 1 Cebadores diseñados para la amplificación de los genes Per y Clk
CEBADOR
SENTIDO SECUENCIA pb TM
Clock
CLK-1up Upstream CGCCGCGACCAGTTCAAC 66 °C
CLK-2up Upstream GATGGACAAGTCCACTGTCCTG 62 °C
CLK-3dwn Down stream TGAAGTGTTAGGAACTTCGGGG 63 °C
CLK-4dwn Down stream CTACAGATTCTTGACCAAAGGAC 57 °C
CEBADOR
SENTIDO SECUENCIA pb TM
Per
PER-1up Upstream GGCCGCTCTTTCATCGACTT 64 °C
PER-2up Upstream CGGCGACTACCTTAAGCTGG 62 °C
PER-1dwn Down stream GACTACCTTAAGCTGGAAACCG 59 °C
PER-2dwn Down stream AACGACTCTAAGTCTTCTACCGGC 61 °C
Tabla. 1 Muestra los diferentes cebadores diseñados con el programa

Oligo v.4.1para amplificar los genes Per y Clock.
En la primera columa se enlistan los nombres de los cebadores para cada
gen y en la segunda el sentido de amplificación. La última columna señala
la TM de cada cebador según la hoja de datos de los cebadores
(Invitrogen).
Anexo 76

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FACULTAD DE CIENCIAS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

NOMBRE DEL ALUMNO

Valeria Towns Alonso

Tutor: Maria Luisa Fanjul Peña

2. Datos del tutor

3. Datos del sinodal 1

4. Datos del sinodal 2

5. Datos del sinodal 3

6. Datos del sinodal 4

2.1.2 Ritmos, relojes y marcapasos

2.2 Bases genéticas y moleculares de los ritmos circadianos en

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

6.3. Extracción de RNA

2.1.1 RITMOS Y SINCRONIZACIÓN

Cuando mantenemos a un organismo en ciclos de 12 h luz y 12 h de oscuridad, el tiempo del

En el cerebro de la mosca de la fruta (Drosophilla melanogaster) se han caracterizado

2.2 Bases genéticas y moleculares de los ritmos circadianos en

El paradigma convencional del reloj molecular en D. melanogaster, implica la interacción de las

Fig 1. Modelo del asa de retroalimentación circadiana en D. melanogaster

No existe duda de que los componentes moleculares identificados en diversas especies

2.3 El sistema circadiano del acocil Procambarus clarkii

El acocil Procambarus clarkii es un crustáceo decápodo que pertenece al grupo monofilético de

Fig. 2 El acocil Procambarus clarkii

En el protocerebro se localizan los ganglios ópticos compuestos por la lámina ganglionaris, la

Kalmus en 1938 demostró que el ritmo de actividad se manifestaba incluso en condiciones

En el acocil adulto y en presencia de un ciclo LO 12:12, el ritmo de actividad locomotora ha sido

También se ha descrito la presencia de ritmos de secreción neuroendócrina, como el de la

Anteriormente Page y Larimer ( 1976) propusieron la existencia de un fotorreceptor circadiano

Hasta el momento no se ha reportado la secuencia de ninguno de los genes conocidos como

Planteamiento del problema 27

Planteamiento del problema 28

Planteamiento del problema 29

Clonación Secuenciación CLOCK

6.2. Diseño de cebadores (oligonucleótidos/ primers)

El conjunto de secuencias correspondientes a cada gen se alinearon utilizando el programa

6.3. Extracción de RNA

Una vez colectados 15 cerebros (aproximadamente 150 mg de tejido) se colocaron en un tubo de

Los tejidos se homogeneizaron utilizando un pistílo de plástico estéril. La mezcla se centrifugó a

1 unidad de densidad óptica: DO260 (Abs. 260 nm) = 40 μg/ml de RNA.

Dicha cuantificación se corroboró corriendo un gel de agarosa desnaturalizante de RNA de 40

Para la amplificación de per y clock se corrieron reacciones de RT (transcripción reversa)

Posteriormente se realizó una electroforésis de las muestras amplificadas en un gel de Agarosa

Para la purificación de los productos obtenidos se separaron los fragmentos amplificados

1) Se cuantificó el DNA por espectrofotometría y se calculó el índice de pureza (Abs260/Abs280)

La cuantificación se realizo con el uso de un espectofotómetro de masa Ultrospec 200

1 unidad de densidad óptica: DO260 (Abs. 260 nm) = 50 μg/ml de DNA.

Los productos se secuenciaron tanto en el Instituto de Biología de la UNAM, con el apoyo de la

Posteriormente se tomaron 5 ml y se mezclaron con 500 mL de medio LB en un matraz de 2 L.

Finalmente se agregaron 1.25 mL de DMSO incubando en hielo por 5 min. El procedimiento se

El DNA purificado se cuantificó utilizando el sistema de espectofotometría Nanodrop el cual

6.7 Análisis de secuencias

La intensidad de las bandas se cuantificó utilizando un fotodocumentador Gel Logic 200

Fig 1. Gel desnaturalizante de RNA. Agarosa 1.2% . Se observan las subunidades

7.2 Establecimiento de las condiciones para la reacción RT- PCR

Tabla 1. Condiciones de la reacción de PCR para las diferentes combinaciones de cebadores.

COMBINACIÓN PROGRAMA TEMP No. PRODUCTOS

CLK- 1Up-4Dwn Inicio: 95 ºC 5 m 55 ºC 30 - Clk1-4 S 650 pb

PER- 1Up-1Dwn Inicio: 95 ºC 5 m 55 ºC 20 - Per1-1 S 250 pb

Las bandas amplificadas y purificadas ( Tabla. 2) de las diferentes combinaciones de cebadores