Procesamiento de Coprocultivos
Procesamiento de Coprocultivos
Procesamiento de Coprocultivos
II. Crecimiento dentro o cerca de células de la mucosa intestinal, causando disfunción. La mayoría
de los virus actúan de esta manera, principalmente en el intestino delgado, y los síndromes
diarreicos no siempre están asociados con la presencia de sangre o leucocitos. Ejemplos de virus
que causan cuadros diarreicos son hepatitis A, B y C, rotavirus, agentes Norwalk y adenovirus. III.
Invasión del epitelio mucoso, causando destrucción y ocasionalmente invasión y diseminación
sistémica por el torrente sanguíneo. Ciertos parásitos, como Entamoeba histolytica y Balantidium
coli invaden el epitelio del colon y causan disentería. Otros parásitos adquiridos por ingestión, como
Trichinella y Schistosoma, pueden causar diarrea sanguinolenta transitoria por su paso por la
mucosa hacia otros sitios del organismo. Las bacterias que invaden las células epiteliales también
producen síntomas disenteriformes. Los agentes más comunes son Shigella y E. coli enteroinvasiva.
Las bacterias penetran la capa superficial de la mucosa, y rara vez alcanzan el torrente circulatorio.
Otras bacterias no solo invaden la mucosa sino que penetran los vasos sanguíneos de la submucosa
y se diseminan sistémicamente. Salmonella typhi y S. cholerasuis son agentes etiológicos de fiebre
entérica, cuadros sistémicos caracterizados por fiebre, cefalea, vómitos y constipación. La
invasividad contribuye a la patogénesis de la enfermedad causada por otros serotipos de Salmonella
spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio parahemolyticus, Campylobacter jejuni, C. fetus, Plesiomonas
shigelloides, Edwardsiella tarda y, posiblemente, Clostridium difficile. IV. Adhesión a mucosa
intestinal, alterando las funciones normales de absorción y secreción. La capacidad adherente de
Vibrio cholerae así como de varias cepas de E. coli ha sido extensamente estudiada, y se han
descrito factores de colonización antigénicos (CFA), expresados en adhesinas tipo fimbrias o
fibrillas. La adhesión le permite a las bacterias colonizar y secretar sus toxinas cerca de las células
epiteliales. Por otra parte, los cuadros diarreicos producidos por Giardia, Cryptosporidium,
Isospora y Microsporidium se asocian en parte a su capacidad de adherirse al epitelio intestinal. El
ámbito completo de factores de virulencia involucrados en la producción de diarrea está
representado en los distintos tipos de E. coli, a saber enterotoxigénica (ECET), toxina lábil (ECLT),
toxina estable a (ECSTa), toxina estable b (ECSTb), enterohemorrágica (ECEH), enteroinvasiva
(ECEI), enteropatógena (ECEP), localmente adherente (AL), adhesiva y despegable,
enteroagregativa (ECEAg) y difusamente adherente (ECDA). Esta bacteria puede producir una o
varias enterotoxinas, ser invasiva, producir colitis hemorrágica o ser adherente/agregativa,
dependiendo de genes transmisibles presentes en plásmidos y bacteriófagos. 2. Principios del
procesamiento de muestras Las enfermedades diarreicas son una causa mucho mayor de
morbilidad y mortalidad que las enfermedades más comunes de la sociedad industrializada
(cardiopatías, cáncer y accidentes cerebrovasculares), siendo los lactantes y niños pequeños los más
afectados, en especial con malas medidas sanitarias y una alimentación deficiente. La diarrea
infecciosa aguda es causada por un número de agentes diferentes: bacterias, virus y protozoarios. El
laboratorio clínico rutinariamente busca las bacterias que más comúnmente causan diarreas, sin
embargo, se requiere la colaboración del médico para asegurar la búsqueda precisa de un agente
particular. Por consiguiente, se debe obtener una historia clínica completa, que incluya los síntomas
del paciente, hora de iniciación, edad, historia de viajes, consumo de alimentos y tratamiento con
antimicrobianos. Cada microorganismo posee mecanismos patogénicos únicos que causan una serie
de síntomas, los cuales pueden ser clasificados inicialmente (Cuadro 2). Sin embargo, debe tenerse
siempre presente que los microorganismos no se adhieren estrictamente a estas categorías.
• Medio de transporte Cary-Blair, apropiado para Vibrio spp. y Campylobacter spp, pero no
es tan efectivo para recuperar Shigella sp. y es inapropiado para Clostridium difficile.
Algunos autores recomiendan reducir el contenido de agar de 0.5% a 0.16% para el
mantenimiento de Campylobacter spp. Otro tipo de muestras se puede preservar y
transportar de la siguiente manera: • Muestras para estudio por C. difficile se deben
congelar a -200C hasta su procesamiento. • Hisopados rectales pueden transportarse
alternativamente en un caldo Gram negativo (GN). • Contenidos de duodeno, colostomías
o ileostomías se transportan en viales. • Biopsias rectales se transportan en contenedores
estériles con agua destilada, no sumergir en formalina. Medios de enriquecimiento. Los
medios de enriquecimiento se utilizan para aumentar la probabilidad de crecimiento de
ciertas especies bacterianas mientras se inhiben microorganismos no deseados. Son
particularmente útiles en la recuperación de Salmonella de heces de portadores y de
pacientes con infecciones leves por Shigella, donde los números pueden ser tan bajos
como 200 bacterias/g de heces. El principio de trabajo de los medios de enriquecimiento
es el mantenimiento en fase log de E. coli y otros comensales fecales debido a los
inhibidores químicos del caldo (desoxicolato, selenito, tiosulfato). Salmonella y Shigella
son menos inhibidas y entran en fase log más rápidamente, lo que aumenta su número.
No obstante, con el tiempo la inhibición de coliformes disminuye, por lo que se
recomienda subcultivar dentro de las 8 h de inoculado el caldo para evitar
sobrecrecimiento. • Caldo Gram-negativo (GN): contiene desoxicolato de sodio, citrato,
manitol. Medio poco selectivo, apropiado para Shigella spp. y Salmonella spp. • Caldo
selenito F: contiene selenito de sodio. Medio altamente selectivo para Salmonella spp. •
Caldo tetrationato: contiene tiosulfato de sodio, sales biliares y carbonato de calcio. Debe
agregarse 0.1 ml/tubo de solución yodo-yoduro antes de inocular la muestra. Medio
altamente selectivo para Salmonella spp. • Agua peptonada alcalina (pH 8.6): apropiado
para Vibrio cholerae. Medios de inoculación primaria. El microbiólogo debería examinar
los especímenes de heces por Salmonella, Shigella, Campylobacter, Aeromonas y
Plesiomonas spp., y por predominio evidente de Staphylococcus aureus, levaduras y
Pseudomonas spp. Debido al riesgo potencial del cólera, debe incluirse el protocolo de
aislamiento para Vibrio cholerae en casos sospechosos y en las regiones de mayor
incidencia. Cada laboratorio debe evaluar la historia del paciente, la población, la
localización geográfica y el tamaño del hospital para determinar los medios selectivos de
rutina y de aislamiento especial. El cuadro 3 resume los principales medios selectivos de
inoculación primaria para coprocultivos.
4. Procedimientos. Examen directo. Un examen al fresco de una muestra de heces sin teñir es útil
para detectar parásitos y, con experiencia, las formas curvas y con movilidad en dardo de
Campylobacter y Vibrio cholerae a partir de heces frescas. Estos últimos se pueden observar mejor
en microscopios de campo oscuro o contraste de fases. 1. Examen a fresco con azul de metileno.
Seleccionar una porción de material fecal de un área con sangre y moco y mezclar con una gota del
colorante de azul de metileno de Loeffler (azul de metileno al 0.3% en etanol al 30%) por 2-3
minutos observar en alto poder seco. El predominio de polimorfonucleares indica la presencia de un
posible patógeno invasivo, mientras que el predominio de monocitos se asocia con infecciones por
Salmonella typhi. 2. Tinción de Gram. Preparar un frotis delgado del material fecal y realizar una
tinción de Gram. Observar predominio de polimorfonucleares, levaduras, cocos Gram-positivos o
bacilos Gram- negativos, lo cual puede sugerir una infección por Candida, S. aureus o
Pseudomonas, respectivamente. El predominio de bacilos Gram-positivos largos, rectos y con
paredes paralelas puede sugerir sobrecrecimiento de Clostridium difficile, aun cuando no es una
prueba totalmente confiable de la infección. La tinción de Gram modificada con fucsina básica al
0.1% permite la observación de bacilos Gram-negativos delgados, en forma de coma, ese (S) o en
alas de gaviota, sugestivo de infección por Campylobacter spp. Además, puede usarse una tinción
de Giemsa para buscar protozoarios relacionados con cuadros diarreicos. Cultivo primario de
rutina. 1. Aislamiento de Salmonella sp. y Shigella sp. Las muestras que se reciben para la
detección de éstos patógenos deben cultivarse en un medio de enriquecimiento, un medio de
soporte, un medio levemente selectivo-diferencial, y un medio moderadamente selectivo. El uso de
un medio altamente selectivo no se justifica para uso de rutina, con excepción de la investigación de
un brote. Los medios más comúnmente recomendados, de acuerdo con las posibilidades del
laboratorio, son los siguientes: • Medio de soporte: agar sangre (agar tripticasa-soya con 5% de
sangre). • Medio diferencial: agar MacConkey o agar eosina-azul de metileno de Levine. •
Moderadamente selectivo: agar Hektoen, agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD), agar Salmonella-
Shigella (SS). • Altamente selectivo: agar verde brillante y agar bismuto sulfito. Con el fin de
aumentar la probabilidad de aislar alguno de estos agentes se pueden utilizar los siguientes caldos: •
Caldo GN: la muestra se inocula en el caldo, se incuba a 35°C estrictamente por 4 a 6 horas y se
subcultiva a medios diferenciales y selectivos. • Caldo Selenito F y caldo tetrationato: la muestra se
inocula en el caldo, se incuba a 35°C por 12 horas y se subcultiva a medios diferenciales y
selectivos. Las placas se inoculan directamente con una asada de la muestra de heces, con el hisopo
rectal o del medio de transporte, o a partir de los caldos de enriquecimiento, se rayan con asa y se
incuban a 35°C por 18-24 h. Las colonias que se deben buscan son lactosa negativa con o sin H2S,
las cuales se inoculan por picadura y/o rayado a TSI y urea (puede inocularse además otros medios
similares, como LIA y SIM). De acuerdo con la reacción bioquímica, que se muestra en el cuadro 4,
se procede a la identificación bioquímica completa y serológica.