"Ao de la Promocin de la Industria Responsable y del Compromiso Climtico".

INSTITUTO SUPERIOR TECNOLOGICO DE LA CLINICA RICARDO PALMA

INMUNOHEMATOLOGIA
INFORME N3 DE LABORATORIO

TEST DE COOMBS DIRECTO E INDIRECTO

CICLO: TURNO: AULA:

VI Diurno A 302

PROFESORA: MENA CORDOVA, Milagros Patricia

INTRODUCCIN

COOMBS DIRECTO

La presencia de IgG o C3d sobre la superficie eritrocitaria puede ponerse de manifiesto mediante una antiglobulina polivalente obtenida por inmunizacin de conejos frente a las protenas del suero humano, o mezclando anticuerpos monoclonales de ratn y contienen anticuerpos Anti-IgG y antiC3d. Esta antiglobulina preparada comercialmente para uso industrial se conoce como suero de Coombs y puede tener tambin antiglobulinas especificas contra determinadas inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM) o fracciones del complemento (C3d). A diferencia de los anticuerpos producidos por el organismo la antiglobulina de coombs es un anticuerpo completo y debido a ello produce una aglutinacin de los eritrocitos cuando se hayan recubiertos por anticuerpos incompletos o por el complemento. Por tanto la prueba de Coombs pone de manifiesto la presencia de anticuerpos fijados a la membrana eritrocitaria y que son la causa de la hemlisis in vivo.

COOMBS INDIRECTO Se usa para demostrar los anticuerpos irregulares circulantes en el suero de un paciente que se cree se encuentra sensibilizado.

PRUEBA DE COOMBS DIRECTA E INDIRECTA

I.

OBJETIVOS: Determinar la existencia de glbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas y/o complemento in vivo, en particular IgG y C3d (Coombs directo) Determinar la presencia de anticuerpos irregulares en el suero del receptor (Coombs indirecto) Determinar la compatibilidad entre la sangre del donante y el receptor a transfundir (Coombs cruzado).

II.

MARCO TERICO:

La prueba de Coombs (tambin conocida como prueba de antiglobulina) es un examen de sangre que se usa en inmunologa y hematologa. Este anlisis puede detectar la presencia de anticuerpos en suero que reaccionan con antgenos en la superficie de los glbulos rojos. Hay dos tipos distintos de la prueba de Coombs: el directo y el indirecto. La prueba de Coombs directa detecta anticuerpos ya unidos a la superficie de los glbulos rojos, y la prueba de Coombs indirecta detecta anticuerpos libres que pueden reaccionar in vitro con glbulos rojos que tienen antgenos especficos.

III.

FUNDAMENTO: Permite la deteccin e identificacin de globulinas ligadas inmunolgicamente a los hemates. La adicin del reactivo antiglobulina a los mismos ocasionar su aglutinacin.

IV.

ALCANCE: El Coombs directo se realiza a pacientes en los primeros momentos de una reaccin hemoltica y en el diagnstico de anemias hemolticas autoinmunes, hemlisis inducidas por drogas, y enfermedad hemoltica del recin nacido. El Coombs indirecto se realiza a pacientes politransfundidos, embarazadas, multparas. El Coombs cruzado es una variante del Coombs indirecto y se realiza a pacientes poli transfundidos, pacientes con antecedentes de reaccin post transfusional hemoltica y a multparas para escoger sangre compatible.

V.

MATERIALES Material para toma de muestra Tubos de ensayo de 13x100 Gradillas para tubos de ensayo Pipeta Pasteur Centrfuga Suero de Coombs poliespecfico

VI.

MUESTRA Coombs directo: sangre en tubo con EDTA Coombs indirecto: suero a evaluar y glbulos rojo de grupo conocido (O)

VII.

PROCEDIMIENTO: Coombs directo Centrifugar las muestras de sangre en el tubo de EDTA a 3 500 rpm por 5 min. Decantar todo el sobrenadante (plasma) Lavar cuatro veces los hemates del paciente con solucin salina fisiolgica a 0.9% (la cantidad de solucin salina es tres veces el volumen de los hemates) Hacer una suspensin de hemates lavados al 3%. Colocar en un tubo debidamente rotulado 1 gota de la suspensin de hemates. Aadir dos gotas de Suero de Coombs poliespecfico. Centrifugue 1 minuto a 3000 rpm. Leer desprendiendo suavemente el botn. Coombs indirecto Centrifugue la muestra de sangre 3 500 rpm por 5 min, para obtener el suero y decntelo en un tubo debidamente rotulado. Preparar una suspensin al 3 % con la mezcla de hemates O. En un tubo debidamente rotulado aadir dos gotas del suero problema y dos gotas de la suspensin de hemates y mezclar bien. Incubar ambos tubos en un Bao de Mara a 37C por 30 minutos Lavar tres veces con solucin salina escurriendo totalmente el sobrenadante del ltimo lavado. Aadir dos gotas de suero de Coombs poliespecfico al tubo. Centrifugar 1minuto a 1000 rpm. Leer desprendiendo suavemente el botn.

 Coombs Cruzada-indirecta Centrifugue la muestra de sangre 3 500 rpm por 5 min, para obtener el suero y decntelo en un tubo debidamente rotulado. Preparar una suspensin al 3 % de la muestra de hemates a transfundir previamente lavada. En un tubo debidamente rotulado aada dos gotas del suero y dos gotas de la suspensin y mezcle bien. Prepare un tubo control rotulado C+ (control positivo) y aada en l dos gotas de la suspensin de hemates O y dos de suero hemoclasificador anti-D y mezcle bien. Incube ambos tubos en un Bao de Mara a 37C por 30 minutos. Lave tres veces con solucin salina escurriendo totalmente el sobrenadante del ltimo lavado. Aada dos gotas de suero de Coombs poliespecfico a cada tubo. Centrifugue 1minuto a 1000 rpm. Lea desprendiendo suavemente el botn.

VIII.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS La prueba de Coombs directo no se observa aglutinacin esto indica que no hay anticuerpos y /o complemento unidos a los hemates in vivo, se debe repetir nuevamente el procedimiento pero utilizando los reactivos monoespecficos anti-IgG y anti-C3d. La prueba de Coombs indirecto no se observa aglutinacin significa que no hay presencia de anticuerpos irregulares en el suero del receptor por lo que debe proceder al estudio e identificacin de l o los anticuerpos adquiridos. Si en la prueba de Coombs cruzado se observa aglutinacin indica que estamos en presencia de anticuerpos irregulares en el suero del receptor por lo que las unidades de sangre estudiadas que presenten este resultado no deben ser transfundidas al paciente en estudio.

FLUJOGRAMA DE LA PRUEBA DE COOMBS

Obtencin de muestra de sangre

Prueba de coombs

DIRECTA

INDIRECTA

Lavado de hemates

Suspensin al 3%

Suero de Coombs

Suero problema + hemates lavados al 3%

Incubar a 37C

Suero de Coombs

IX.

CUESTIONARIO: 1. Qu es el Complemento? Protenas presentes en el suero normal. A menudo participa en las reacciones de grupo sanguneo y alteraciones inmunolgicas. 2. Qu es un Hemate Sensibilizado? Es un hemate que tiene a su alrededor o en la superficie de la membrana la presencia de anticuerpos unidos a sus respectivos antgenos. 3. Qu es un autoanticuerpo? Es un anticuerpo desarrollado por el sistema inmunitario y que acta directamente en contra de uno o ms antgenos del propio individuo. Normalmente los anticuerpos reconocen e ignoran aquellos antgenos propios de las clulas del cuerpo, adems de otras sustancias inofensivas. Sin embargo, hay ocasiones en que el sistema inmunitario termina reaccionando contra uno o ms antgenos propios. Estos autoanticuerpos terminan por atacar las propias clulas, tejidos y rganos, causando inflamacin y dao. 4. Para qu se hace el lavado de los hemates? Se necesita lavar los hemates para remover el plasma, suero, los cogulos y en general cualquier interferencia que podra provocar resultados falsos positivos si se confunden con aglutinados. Tambin elimina los eritrocitos hemolizados. 5. Por qu trabajamos con hemates del grupo O positivo? Trabajamos con estos hemates ya que son los nicos del sistema ABO que no poseen en su membrana, ningn antgeno y que al enfrentarlo con el suero problema, que contiene los anticuerpos a evaluar, lo normal sera que no aglutinara, en cambio si hay alguna aglutinacin, sera por la presencia de un anticuerpo irregular. Adems es necesario si se quiere investigar anticuerpos anti Rh (D) en el suero problema, en el caso de una Eritroblastosis fetal, ya que estos hemates si poseen Antgenos D en su membrana, que van a tender aglutinar. 6. Por qu centrifugamos los tubos con EDTA? Se utiliza EDTA ya que contiene compuestos que realizan un efecto quelante sobre el calcio, que al fijarlo impide su activacin, y por ende la coagulacin sangunea. 7. Por qu se centrifuga a 3 000 rpm por 5? Se centrifuga a esa velocidad y tiempo porque se obtiene una mayor concentracin de paquete globular. 8. Por qu se lava los hemates con PBS o suero fisiolgico? Se prefiere estas soluciones porque son isotnicas, esto quiere decir que poseen la misma concentracin de sales que la muestra de sangre. Por lo que, tienen la misma presin osmtica que la sangre y no producen deformacin de los hemates.

9. Por qu realizamos la prueba cruzada indirecta? Es una variante del Coombs indirecto y se realiza a pacientes politransfundidos, pacientes con antecedentes de reaccin post transfusional hemoltica y a multparas, para evaluar sangre compatible. 10. Por qu se realiza fase de albmina? Se realiza porque al agregar la albmina, al tubo conteniendo el suero problema y los hemates suspendidos al 3%, va a facilitar la aglutinacin ya que la albmina acta disminuyendo el potencial zeta con lo cual la fuerza de repulsin entre hemates se reduce, adems la albumina permite que Ac IgG unan hemates adyacentes. 11. Por qu a temperatura ambiente? Se incuba a esa temperatura ya que es ptima para que los Anticuerpos fros como IgM reaccionen mejor con su antgeno y favorecer la aglutinacin.

12. Por qu a temperatura de 37C? Se incuba a esa temperatura porque es ptima para que Anticuerpos calientes como IgG acten mejor permitiendo que los hemates adyacentes se unan haciendo una aglutinacin ms visible.

ANEXOS:

Obtencin de muestra de sangre Materiales: Algodn. Alcohol al 70%. Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo. Tubo al vaco con anticoagulante EDTA. Agujas con dispositivo para extraccin de sangre al vaco nmero 20.

Procedimiento: Verificar que los elementos por utilizar estn listos, y que el paciente se sienta cmodo. Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexin del codo o 10 cm por encima de ste y pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatacin de las venas. Una vez escogida la vena, desinfectarla con una pieza de algodn embebido en alcohol al 70%. Se retira el estuche protector de la aguja y ste se enrosca al dispositivo para extraccin de sangre al vaco. Se coloca la aguja en direccin paralela a la vena, se perfora la piel haciendo avanzar la aguja entre 0,5 cm y 1 cm en el tejido subcutneo. Se inserta el tubo al vaco por la parte posterior y no preocuparse por la cantidad de sangre extrada ya que el mismo sonido del vaco avisar que la extraccin termin. Retirar la ligadura tirando del extremo doblado. Colocar un pedazo de algodn seco sobre la parte donde se encuentra oculta la aguja. Retirar primero el tubo al vaco. Luego sacar la aguja con un movimiento rpido y depositarla en el recipiente de metal con desinfectante o descartarla en el envase dispuesto. Pedir al paciente que presione firmemente el algodn durante 3 minutos, con el brazo extendido. No se recomienda que se flexione el brazo a causa del riesgo que se forme un hematoma. Mezclar por inmersin suave la sangre con el anticoagulante contenido en el tubo. No agitar el contenido.

FLUJOGRAMA DEL TEST DE COOMBS

DIRECTO

INDIRECTO

Hacer 4 lavados de los G.R con solucin salina

Suero problem

Suero de Coombs

Suspensin al 3%

Suspensin al 3%

Suero de Coombs

1 gta. De la suspensin al 3% + 2 gtas.Suero de Coombs

Resultado: negativo

1gta. De la suspensin al 3% + 1 gta. De suero + 2 gta. De suero de Coombs

Hemates o suero de coombs

Resultado: positivo

Suero o hemates A