Colchicina

Resumen: A-016
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E

Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2004
Induccin de autoploida
en Paspalum plicatulum.
Sartor, Mara E. - Espinoza, Francisco - Quarin, Camilo L.
Instituto de Botnica del Nordeste (IBONE-CONICET), Facultad de Ciencias Agrarias, UNNE.
Sargento Cabral 2131 (3400) Corrientes. Argentina.
TE 03783-426218; FAX 03783-427131; E-mail: maritasartor@hotmail.com
Antecedentes
La familia de las gramneas es predominante en la vegetacin natural del nordeste de Argentina y el gnero Paspalum
es uno de los ms importantes por el nmero de especies que aporta. Muchas de sus especies tienen un alto valor
forrajero, por lo que la seleccin y el cultivo sistemtico de variedades mejoradas podra incrementar notablemente el
potencial ganadero de la regin. Por otra parte, la apomixis, reproduccin asexual por medio de verdaderas semillas
(Nogler, 1984), se encuentra con frecuencia en especies de este gnero. En general, la mayora de las especies
apomcticas son tetraploides (4x) y usualmente tienen una contrapartida co-especfica diploide (2x) y de reproduccin
sexual (Quarin, 1992). En las poblaciones de especies 4x apomcticas no existen individuos de reproduccin sexual,
aunque la reproduccin de cada individuo no es siempre totalmente apomctica. Sin embargo, las poblaciones 2x de la
misma especie son totalmente sexuales.
El grupo Plicatula agrupa a todas aquellas especies relacionadas a P. plicatulum (Chase, 1929), especies que se
caracterizan fundamentalmente por presentar espiguillas cuyas lemmas tienen arrugas transversales y el antecio es de
color marrn oscuro brillante. Este grupo incluye a numerosas especies y formas nativas cuyo principal centro de
variacin se encuentra en el centro y oeste de Brasil, Paraguay y este de Bolivia. La gran diversidad observada en
poblaciones naturales hace de este grupo un complejo extremadamente variable de especies, muchas de ellas
actualmente no bien definidas taxonmicamente. Existen especies que son diploides y se reproducen por sexualidad,
mientras que los poliploides son apomcticos, pseudgamos y autofrtiles (Quarin et al., 1997; Espinoza et al., 2001).
El mejoramiento gentico, mediante cruzamientos y seleccin, es impracticable dentro de especies de este grupo a nivel
tetraploide, debido a que todos los genotipos 4x estudiados hasta el momento se reproducen por apomixis. Por otra
parte, las razas diploides de este grupo son de reproduccin sexual. La obtencin de plantas sexuales a nivel 4x es un
requisito importante para estudios bsicos de la apomixis y/o para iniciar cualquier programa de mejoramiento gentico
a nivel tetraploide. Por lo tanto, la duplicacin de cromosomas a partir de plantas 2x es la manera ms directa para la
obtencin de plantas 4x sexuales, las que podran ser luego utilizadas como progenitores femeninos en cruzamientos de
plantas sexuales por apomcticas.
Entre las especies del grupo Plicatula para las cuales se mencionaron razas 2x sexuales tenemos a: P. plicatulum
(Espinoza y Quarin, 1997), P. yaguaronense (Pritchard, 1962), P. compressifolium ( Quarin et al. 1996) y P. limbatum
(Espinoza et al. 2001). Esto significa que es posible utilizar razas 2x de algunas de estas especies para intentar obtener
plantas autotetraploides sexuales, siguiendo los protocolos descriptos para las especies de Paspalum cuyos cromosomas
fueron duplicados artificialmente. Se han generado plantas 4x a partir de individuos 2x por la induccin con colchicina
en las especies P. notatum (Forbes y Burton, 1961; Quarin et al. 2001), P. hexastachyum (Quarin y Hanna, 1980) y P.
simplex (Cceres et al. 1999). La Ctedra de Gentica y Fitotecnia tiene una importante coleccin de plantas vivas,
entre las que se encuentran razas 2x correspondientes a especies del grupo Plicatula que pueden ser tratadas con
colchicina para intentar obtener plantas poliploides mediante duplicacin de cromosomas.
Objetivo
El objetivo del presente trabajo fue duplicar los cromosomas de plantas diploides de P.plicatulum (2n=2x=20) para
obtener individuos tetraploides con reproduccin 100% sexual.
Materiales y Mtodos
Material vegetal
Las semillas que se utilizaron para el tratamiento con colchicina fueron cosechadas en plantas diploides de P.
plicatulum, coleccin H-14 originaria de Misiones, Argentina, de la cual existen actualmente varias plantas cultivadas
en macetas o en pequeas parcelas de la Ctedra de Gentica y Fitotecnia en el predio de la Facultad de Ciencias
Agrarias. El ejemplar herborizado de esta coleccin est depositado en el herbario MNES identificado como Ana I.
Honfi n 14.
Resumen: A-016

Tratamientos con colchicina
Se trataron con una solucin de colchicina (0.1%) + dimetilsulfxido (2%) 150 semillas de H-14 durante 24, 48 y 72
horas (50 cariopses por tratamiento). Los protocolos que se utilizaron estn descriptos en Quarin et al. (2001).
Determinacin del nivel de ploida

Una vez que las plantas obtenidas tenan varios macollos, se obtuvieron puntas de races invirtiendo la maceta y
separando sta de la tierra con la planta. Se seleccionaron races por sectores identificando cada punta de raz con el
sector de la planta del cual se obtena. Las races fueron fijadas en una solucin saturada de -bromonaftaleno durante 2
horas, hidrolizadas en ClH 1N durante 10 minutos a 60 C y teidas con el reactivo de Schiff. Finalmente las raicillas
fueron aplastadas sobre un portaobjetos en una gota de orceina actica al 2% y observadas con un microscopio ptico.
Si el nmero observado difera para distintos sectores de una misma planta, sta era dividida por esos sectores y cada
sector cultivado en una maceta diferente. Es decir, cada vez que se encontraba una quimera con 20-40 cromosomas,
producto de duplicacin cromosmica sectorial, la planta se divida y se esperaba que cada sector vuelva a macollar. Se
hacan nuevamente recuentos, volviendo a separar sectores de plantas quimricas, hasta conseguir plantas 4x inducidas
puras. Al mismo tiempo, se fueron manteniendo muestras de los sectores no duplicados para contar finalmente con
genotipos isognicos 2x y 4x.
Resultados y Discusin
Anlisis del nivel de ploida
Algunas semillas no germinaron y muchas de las que germinaron luego murieron. Solo sobrevivieron 12 plantas: 8
pertenecientes al tratamiento con colchicina de 24 h, 2 al de 48 h y 2 al de 72 h (Tabla 1). En las dos plantas
correspondientes al tratamiento de 48h solo se observaron raices con 2n = 20 cromosomas, indicando que en este
tratamiento no ocurrieron duplicaciones.. En el caso de las dos plantas de 72 h de tratamiento , una de ellas era diploide
(2n=20), mientras que la otra result ser una planta hexaploide (2n=60). De las ocho plantas obtenidas que
sobrevivieron en el tratamiento de 24 h; cuatro de ellas tenan algunas puntas de races con 2n=40 y otras con 2n=20
cromosomas. A partir de estas quimeras, mediante sucesivas rondas de recuentos cromosmicos y separacin de
macollos, se lograron 2 plantas 4x puras a las que se identific como 4c y 7d3, cada una con su correspondiente lnea
isognica diploide de la cual se separ: 4d y 7a3, respectivamenteLa planta quimrica n 3 muri durante el proceso de
separacin de macollos, y de la planta quimrica n 5, solo se logr rescatar macollos diploides, por lo que fue
eliminada(Tabla 1).
Tabla 1: Resultados de los tratamientos de cariopses diploides con colchicina y de la separacin de macollos en las
plantas quimricas 2n = 20+40.
Tratamientos
24 h
Nmero de
semillas
tratadas
50
Nmero de
semillas
germinadas
Planta nmero:
1
2
3
2n
(primeros
recuentos)
20
20
20 y 40
20 y 40
5
6
7
20 y 40
20
20 y 40
8
1
2
1
2
20
20
20
20
60
50
48h
50
50
72h
50
50
2n
(ltimo
recuento)
Plantas puras
obtenidas
(denominacin)
20
40
20
4d diploide
4c tetraploide
20
40
7a3
7d3
La planta 2 del tratamiento de 72h extraamente era hexaploide. Puesto que los cariopses tratados provenan de plantas
diploides, no caba esperar una planta hexaploide luego de un tratamiento de duplicacin cromosmica. La nica
explicacin posible es que en las plantas diploides se produjo un cariopse triploide (2n = 30), seguramente por fusin de
un raro gameto diploide (n = 20) y un gameto normal haploide (n = 10). Esto ocurre, aunque muy raramente en
poblaciones diploides dando lugar a individuos triploides (Quarin et al. 1989). Lamentablemente no pudo realizarse el
seguimiento de este individuo debido a que el mismo muri.
Resumen: A-016

Meiosis y sistema reproductivo
Los estudios aun preliminares de la meiosis fueron realizados en las dos plantas 4x inducidas: 4c y 7d3 y en las
respectivas lneas isognicas diploides (no inducidas): 4d y 7a3. Los resultados estn indicados en la Tabla 2. En las
plantas 2x los cromosomas se asociaron formando nicamente bivalentes. Esto es coincidente con el comportamiento de
los cromosomas en meiosis reportados por Espinoza y Quarin (1997) para la coleccin Honfi n 14, de la cual se
obtuvieron las semillas para este estudio. Por su parte, en las plantas 4x los cromosomas se asociaron formando
preferentemente bivalentes y cuadrivalentes, como se espera de plantas de origen autoploides como son estas. Si bien el
nmero de clulas analizadas en meiosis, para ambas plantas autotetraploides inducidas, es aun pequeo, se puede hacer
una comparacin con la meiosis de plantas 4x naturales de esta especie. En efecto, Burson y Bennett(1971) estudiaron
plantas de siete orgenes diferentes de P.plicatulum y observaron formaciones quadrivalentes en meiosis con promedios
por clula que varan entre 0.17 y 1.56. Basados en esos resultados propusieron para esta especie un origen
alotetraploide segmentario. Nuestros resultados previos, con valores promedios de 2.3 quadrivalentes por clula en la
planta 4c y 4.17 en la planta 7d3, estaran confirmando la hiptesis de Burson y Bennett. En efecto, los valores por
observados por estos autores indican un menor grado de homologa entre los genomios. Nuestras plantas son autnticos
autotetraploides por origen y lgicamente esto se refleja un mayor grado de homologa entre los genomios. Sin
embargo, nuestros resultados muestran una notable diferencia entre los promedios de quadrivalentes por clula de
ambas plantas inducidas. Este es un dato que nos indica que debemos aumentar el nmero de cluas estudiadas para
sacar conclusiones fundamentadas sobre estas diferencias.
Tabla 2. Asociaciones cromosmicas observadas en diacinesis y metafase I de plantas diploides y tetraploides de P.
plicatulum.
Planta
2n
N
CMP
Configuracin cromosmica por CMP (clula madre del polen)

I: univalentes; II: bivalentes; III: trivalentes; IV: cuadrivalentes
Promedio por clula
Rango por clula
I
H14 4d 20
60
H14 4c 40
23
H14
7a3
20
75
H14
7d3
40
29
II
III
IV
II
III
IV
0.04
2.3
(0-1)
(12-18)
(0-1)
(1-4)
0.24
4.17
(0-2)
(4-18)
(0-2)
(1-8)
10
0.04
15.4
10
0.31
11.14
Conclusiones
El uso de colchicina y las tcnicas utilizadas permitieron conseguir plantas autotetraploides de Paspalum plicatulum a
partir de plantas diploides de esta misma especie. Este es un hecho promisorio puesto que son muy escasos los
antecedentes de poliploidizacin en el gnero Paspalum. Las plantas tetraplodes naturales de esta especie son de
reproduccin apomctica. Puesto que las plantas diploides que utilizamos eran de reproduccin sexual, es muy posible
que las dos plantas 4x logradas experimentalmente en este trabajo sean tambin de reproduccin sexual. Sin embargo, la
determinacin del sistema reproductivo de estas plantas es el prximo objetivo de esta investigacin.
Bibliografa
Byron L, Bennett HW, Burson (1971). Meiotic and Reproductive Behavior of Some Introduced Paspalum Species.
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Chase, A. 1929. The North American species of Paspalum. Contr. U. S. Natl. Herb. 28:1-310.
Cceres ME, Pupilli F, Quarin CL, Arcioni S (1999). Feulgen-DNA densitometry of embryo sacs permits
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Forbes I jr, Burton GW (1961). Cytology of diploids, natural and induced tetraploids, and intraspecies hybrids of
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Resumen: A-016

Nogler, G. A. (1984). Genetic of apospory in apomictic Ranuculus auricomus. V. Conclution. Botanica Helvetica.
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Quarin CL, Norrmann GA, Urbani MH (1989). Polyploidization in aposporous Paspalum species. Apomixis Newsl.
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