4.

FIBROSIS QUSTICA
4.1. INTRODUCCIN
La Fibrosis Qustica (FQ) es la enfermedad hereditaria autosmica recesiva grave ms
frecuente en la poblacin blanca. Tiene una incidencia aproximada de 1 por cada 2.500
recin nacidos y una frecuencia de portadores de 1 por cada 25. Es una enfermedad de
las clulas epiteliales exocrinas. Los pacientes producen un moco espeso y viscoso que
obstruye los conductos del rgano donde se localiza. Aunque la enfermedad afecta a la
mayora de los rganos, el pncreas y los pulmones son los ms daados, siendo la
insuficiencia pancretica y la enfermedad pulmonar las que determinan la gravedad del
proceso as como su pronstico y mortalidad. El gen de la FQ ha sido el primer gen
humano aislado sin conocer la protena para la que codificaba, ni disponer de claves
citogenticas que permitiesen un avance rpido en su identificacin 1.
La

metodologa

utilizada

para

llegar

la

identificacin

del

gen

se bas en estudios de ligamiento gentico en familias con ms de un hijo afecto y en

la aplicacin de tcnicas de clonaje y secuenciacin de ADN. La funcin de la protena
CFTR (Regulador Transmembrana de la FQ) es la de ser un canal de cloro regulador
del transporte inico a travs de la membrana apical de las clulas epiteliales 1.
4.2. DEFINICIN:
Es una enfermedad autosmica recesiva por mutaciones en el gen CFTR. En su forma
ms comn, una mutacin de un aminocido (falta una fenilalanina en la posicin 508)
conduce a un fallo del transporte celular y localizacin en la membrana celular de
la protenaCFTR. Se

han

descrito

ms

de

1.800

mutaciones,

siendo

la

mayora de ellas pequeas delecciones, aunque con diferentes efectos, como cambios
en el marco de lectura, cambios de aminocidos, terminacin prematura de la protena
o alteraciones en el splicing 2.
El gen CFTR est localizado en el brazo largo del cromosoma 7, ocupando 180.000
pares de bases. Es un gen de gran tamao, que posee 250 kb y que incluye 27 exones.

Figura 4.1: Localizacin cromosmica del gen de la FQ en el

brazo largo del cromosoma 7

Figura 4.2: Localizacin de moco en alvolos, pncreas y

estmago.

4.3. HERENCIA

La FQ tiene un modo de herencia autosmico recesivo, afecta a ambos sexos por

igual y su transmisin es horizontal, es decir, generalmente slo hay individuos
afectados en una hermandad. En el individuo con FQ las mutaciones se encuentran en
ambos alelos del gen CFTR; se les denomina homocigotos cuando stos portan
mutaciones idnticas y heterocigotos compuestos cuando la mutacin en cada uno de
los alelos es diferente 3.
Una pareja de portadores (un alelo afectado y uno normal: heterocigotos sanos) en
cada embarazo tiene un riesgo de tener hijos afectados de 25%, hijos portadores de
50% e hijos sanos de 25%. En una poblacin, los portadores de una mutacin en un
gen recesivo siempre son ms frecuentes que los afectados (principio de Hardy
Weinberg) 3.
4.4. EL GEN CFTR
En 1989, gracias a la disponibilidad de un gran nmero de familias con dos o ms
individuos afectados, se logr la clonacin del gen responsable de la FQ. Este gen se
localiz mediante clonacin posicional a partir de los marcadores D7515, MET y
D758, estrechamente ligados a CFTR. Los primeros transcritos derivados de este gen
se obtuvieron por combinacin de mapeo fsico e hibridacin interespecie; con estos
datos se dedujo la secuencia de su producto proteico. As, el gen CFTR se localiza en la
banda q31 del cromosoma 7, contiene 250 kb, consta de 27 exones y se transcribe en
un mRNA de 6.5 kb. La identidad del gen se confirm por la presencia de una delecin
de tres pares de bases en el exn 10 (mutacin AF508) de los pacientes con FQ que no
se observ en individuos normales 4.
La regin 5' de CFTR se caracteriza por un gran contenido de GC (aproximadamente
65%) y no presenta caja TATA, de tal manera que su promotor es similar al de los
genes con expresin constitutiva, sin embargo, su expresin parece estar altamente
regulada y confinada a ciertos tejidos. Al parecer, los niveles de expresin del gen
estn modulados por cAMP, PKA, PKC y esteres de forbol. Los patrones de expresin
tejido especfico de CFTR son similares en las diferentes especies de mamferos,
sugiriendo la presencia de elementos reguladores conservados evolutivamente, aunque

se han reportado mltiples sitios de iniciacin en el gen que parecen ser especie-tejido
especfico 5.
4.5. IDENTIFICACIN DEL GEN DE LA FQ
Se identificaron las regiones de unin del poli A en 3'y las zonas ricas en CpG y las
cajas TATA y CAAT en 5'. Identificndose un total de 27 exones, el 6, 14 y 17 se vio
que estaban interrumpidos por intrones que no se haban visto previamente. En lugar de
renombrar todos de nuevo, se renombraron solamente stos dndoles los nombres 6a,
6b, 14a, 14b, 17a y 17b. En total, la regin codificante del gen son 4.440 pares de bases
y 1.480 residuos de aminocidos. El tamao de los exones es muy variable, siendo el
14b el ms pequeo (38 pb) y el 13 el mayor (724 pb). El tamao de los intrones
tambin vara mucho, el ms pequeo es el intrn 6a y el mayor el 3. Los aminocidos
se numeran del 1 al 1.480, siendo el 1 la metionina de iniciacin codificada por el
triplete "ATG" y el 1.480 la leucina anterior al triplete "TAG" de finalizacin de la
traduccin. En los intrones del gen se han descrito varios microsatlites polimrficos.
Los microsatlites son repeticiones situadas en un nmero de nucletidos (2, 3, 4 5).
El nmero de veces que se repite la secuencia vara de unos individuos a otros,
constituyendo distintos alelos. Estos marcadores suelen ser altamente informativos, ya
que suelen presentar un gran nmero de alelos. En el gen FQ se utilizan los
microsatlites IVS8CA (en el intrn 8), IVS17BTA yIVS17BCA en el intrn 17b, para
estudios evolutivos del gen, caracterizacin y rastreo de mutaciones y diagnstico
indirecto de la FQ 6.

Figura 4.3: (A) El gen de la fibrosis qustica contiene 27 exones; la mayor

cantidad del gen corresponde a regiones intrnicas. (B) La presumible estructura
de la protena contiene dos dominios transmembrana, dos dominios de unin
de ATP (NBFl y NBF2), y un dominio regulador R. (C) El modelo esquemtico
de la estructura de la molcula muestra anclada a la membrana epitelial con los
centros activos orientados hacia el citoplasma.

4.6. EXPRESIN DEL GEN FQ

Las clulas utilizan complicados mecanismos para regular cuantitativamente sus
protenas. Es la base de la diferenciacin celular y la aparicin de distintos tejidos. La
expresin del gen FQ est restringida a las clulas epiteliales exocrinas. Podemos
imaginar,

a priori, dos modos de conseguir una sntesis

diferencial.

La

primera

utilizara seales moleculares para regular los niveles de transcripcin de los distintos
ARNm(s). La segunda implicara mecanismos moleculares para regular la tasa de
traduccin de los ARNm(s) ya sintetizados. Existen ms pasos en los que se puede
llevar a cabo esta regulacin: activacin/inactivacin del gen, durante el procesa-

miento del ARNm, o durante su transporte al citoplasma. Como parece lgico que la
clula no haga ms ARNm del que necesita, parece que la regulacin de la
transcripcin del genes el mecanismo que predominantemente opera en la fisiologa
celular. El gen FQ parece estar regulado principalmente a nivel transcripcional.7
En las clulas eucariotas, los genes se clasifican por sus promotores y las diferentes
ARN-polimerasas que los transcriben en tres categoras: el ARNr es transcrito por la
ARN polimerasa I, los ARNt y otros ARN polimerasa II. Los promotores utilizados por
la ARN- polimerasa II presentan gran variacin de secuencia, en contra de la de los
promotores de las ARN-polimerasas I y III. Adems de la secuencia del promotor, un
gran

nmero

de

factores

actan

en

conjuncin

con

la

ARN- polimerasa II para llevar a cabo la transcripcin. Estos factores se pueden dividir
en tresgrupos:7
Los "factores bsales",

son

necesarios para la iniciacin de la sntesis de

ARNm(s). Se unen con la ARN-polimerasa para formar un complejo proteico

necesario para que se lleve a cabo la transcripcin.
Los "factores de antes del gen" (upstream factors), son protenas que se unen al
ADN al reconocer cortas secuencias consenso localizadas antes del lugar de
iniciacin. La actividad de estos factores, al igual que la de los bsales, no est
regulada; son ubicuos y actan sobre cualquier promotor que contenga la
secuencia de ADN apropiada para unirse.
Los "factores inducibles",
son
como

los

factores de antes del gen,

pero tienen un papel regulador. Son sintetizados o activados

en

tiempos

tejidos especficos y son, por tanto, los responsables del control de los patrones
de transcripcin en el tiempo y en el espacio. Las secuencias de ADN a las que
se unen se llaman elementos de respuesta. Un gen cuyo promotor contenga
solamente elementos reconocidos por factores bsales y de antes del gen ser
transcrito en cualquier tipo de clula. Aquellos genes bajo un mismo control
comparten un elemento promotor que es reconocido por el mismo factor
regulador

de

la

transcripcin.

la bibliografa diversos elementos de respuesta

Se
que

han
regulan

descrito
el

nivel

en
de

transcripcin de determinados grupos de genes. Se sabe que en el gen FQ los

niveles de ARNm descienden con la adicin del ster deforbol PMA (Acido
Phorbol Myrstico).7
Sin embargo, hasta el momento no hay acuerdo respecto a qu secuencia por delante
del gen constituye el elemento de respuesta mnimo del gen FQ. En lneas celulares
que expresan este gen se ha observado que los niveles de ARNm decrecen cuando se
inducen mutaciones en el gen, indicando que el control transcripcional del gen podra
estar regulado por mltiples factores que actuaran de forma individual y colectiva. En
resumen, no se conocen hasta el momento todos los factores que regulan la
transcripcin del gen FO y que hacen que se exprese mayoritariamente en clulas
exocrinas.7
4.7. EL GEN FQ PUEDE SUFRIR MUTACIONES
La enfermedad aparece cuando los dos genes FQ del paciente presentan mutaciones
que hacen que la protena bien no exista, o tenga alterada su funcionalidad. Con el
clonaje y caracterizacin del gen se cerr una pgina importante en el estudio de la
gentica de la enfermedad. Pero al mismo tiempo se abri otra no menos importante,
la bsqueda de alteraciones que puedan causar enfermedad. Ya en el mismo nmero
donde se describe el gen, se habla de una delecin de un triplete de bases en la posicin
508 de la protena (mutacin AF508) encontrada en muchos genes FQ de individuos
enfermos o portadores pero no en sanos. Desde entonces se ha hecho un gran esfuerzo
para caracterizar mutaciones en el gen y hasta el momento se han descrito ms de
600.Son diversos los tipos de mutaciones que pueden dar lugar a protenas anmalas:8

Deleciones/Inserciones
En la regin codificante. Si estas alteraciones son mltiplo de tres bases (cada
tres nucletidos codifican para un aminocido) la protena resultante tendr un
nmero de residuos menor en el caso de deleciones o mayor en el de
inserciones. Si no es mltiplo de tres, la pauta de lectura cambiar a partir de la
mutacin, y los aminocidos incorporados variarn desde este punto 8.

Cambios de base

Si se produce un cambio de base en una determinada posicin,

es posible que se incorpore un aminocido distinto del original o que este
cambio codifique un triplete de finalizacin de traduccin (codn STOP). Si el
cambio no afecta a la funcionalidad de la protena o codifica para el aminocido
original, entonces se habla de polimorfismo y no de mutaciones causantes de
enfermedad 8.

Mutaciones en regiones intrnicas

Estas mutaciones afectan sobre todo al fenmeno de maduracin del ARNm.
Pueden aparecer formas maduras anmalas queden lugar a protenas alteradas y
poco o nada funcionales 8.

Mutaciones en las regiones promotoras

Afectan a los niveles de transcripcin haciendo que las cantidades de protena
sean menores de lo normal 8.

4.8. LA PROTENA CFTR

El gen CFTR codifica para una glicoprotena transmembranal de 1,480 aminocidos y
170 kDa. Esta protena funciona como un canal de cloro y por su papel fisiolgico se
denomina protena reguladora de la conductancia transmembranal de la FQ o CFTR
(del ingls "Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator"). Se expresa en
una gran variedad de tejidos especialmente pulmn, pncreas, glndulas sudorparas,
intestino, hgado, mucosa nasal, glndulas salivales y tracto reproductivo. La protena
CFTR presenta una gran homologa estructural con la familia de protenas ABC
(cassette de unin a ATP), que son protenas integrales de membrana que contienen dos
segmentos repetidos constituidos por dos dominios transmembranales (TMD1 y
TMD2) y dos dominios que interaccionan con ATP (NBD1 y NBD2). A diferencia de
las otras protenas de la familia ABC, CFTR contiene adems, un dominio regulador
(dominio R) (Figura 1).1

La protena CFTR est anclada a la membrana citoplasmtica por los dos TMDs, cada
uno organizado en seis segmentos (TM1TM12) que atraviesan la membrana
formando un poro que constituye el canal de cloro. Con base en los efectos que
producen algunas mutaciones encontradas en pacientes con FQ, se ha deducido la
presencia de varios residuos de aminocidos en los dominios TMs de CFTR, los cuales
son particularmente importantes para la conductancia de iones, como es el caso de los
residuos de arginina y asparagina.1
Los dominios NBDs presentan secuencias que se encuentran conservadas en las
protenas que unen e hidrolizan ATP. Interesantemente las estructuras primarias de los
dos dominios NBDs slo presentan 29% de homologa entre sus aminocidos y parece
ser que NBD1 y NBD2 contribuyen de manera diferente a la regulacin del canal. Se
ha propuesto que el NBD1 se fosforila despus de una fosforilacin parcial del
dominio R, lo que permite la apertura del canal, mientras que la fosforilacin completa
del dominio R, conduce a la fosforilacin de NBD2 causando el cierre del canal; de tal
manera que el grado de fosforilacin del dominio R regula la actividad del canal.1
Existen evidencias experimentales que demuestran que la CFTR, adems de ser un
canal de cloro dependiente de cAMP, puede tener otras funciones, por ejemplo el
transporte de bicarbonato y la regulacin de otros canales endgenos de cloro y calcio.1
4.9. REGULADOR DE LA CONDUCTANCIA TRANSMEMBRANA DE LA
FIBROSIS QUSTICA
La alteracin del transporte de electrolitos, particularmente del transporte de iones
cloruro, es la anomala principal en la Fibrosis Qustica (FQ). Las secreciones en
diversos rganos son, en la FQ, anormalmente espesas y deshidratadas, lo que
provoca la obstruccin de los conductos del pncreas, glndulas salivares, epiddimo,
intestino, bronquios y bronquiolos. La formacin de estas secreciones anormalmente
espesas son el resultado final de un flujo alterado de iones cloruro e iones sodio y del
agua que les acompaa. Actualmente se acepta que las secreciones espesas son las
responsables

de

la

insuficiencia

pancretica

los pacientes, de la infertilidad del 90% de los

que

presentan

el

85%

de

varones

enfermos

de

las

obstrucciones

de

los

bronquios

las

infecciones

respiratorias. No se descarta, sin embargo, la posible influencia de otros factores que

ayuden a modular la fisiopatologa de la enfermedad y que condicionen el
pronstico.1
4.10. FLUJO DE ELECTROLITOS EN LOS EPITELIOS AFECTADOS EN LA FQ
La secrecin que recubre el rbol respiratorio procede del epitelio bronquial y de la
actividad de las glndulas submucosas. En esta secrecin pueden distinguirse dos
capas: una ms fluida, con un espesor similar al de los cilios de las clulas ciliadas del
epitelio, y que al ser tan fluida permite a los cilios moverse libremente; y otra capa
ms viscosa que la cubre. El movimiento de los cilios hace progresar la secrecin
hacia los bronquios grandes, ayudando a eliminar las partculas y bacterias retenidas
en la capa viscosa, y de esta forma se consigue limpiar el rbol respiratorio de
sustancias extraas.9
En la FQ el movimiento de los cilios est alterado debido a la elevada viscosidad de
las secreciones. Este hecho impide que la limpieza sea la adecuada, dando como
resultado la obstruccin de los bronquios y, finalmente, las infecciones respiratorias.
Como se ha dicho anteriormente, la desecacin de las secreciones se debe a una
alteracin en el flujo de iones y, por tanto, del agua, provocado por la
impermeabilidad de los epitelios afectados a los iones cloruro. En la membrana basal
de la clula epitelial los iones cloruro entran en contra del gradiente electroqumico,
cotransportados pasivamente a travs de un transportador activo que introduce
potasio y sodio en la clula, de esta forma, el cloro se acumula en el interior. En la
membrana apical de la clula epitelial, los iones cloruro salen a favor de gradiente
cuando se abren los canales de iones cloruro. Simultneamente sale agua, que
contribuye a mantener la fluidez de la secrecin. En la misma membrana apical
existen tambin canales para iones sodio que permiten la entrada de sodio a favor del
gradiente electroqumico y que se cierran cuando se estimula la secrecin de iones
cloruro.9

En la FQ, uno de los canales de iones cloruro de la membrana apical del epitelio
respiratorio, el canal CFTR, no responde a los estmulos hormonales fisiolgicos y el
flujo de iones cloruro queda bloqueado, y con ello tambin se reduce el flujo de agua
hacia el exterior. Paralelamente, aumenta la reabsorcin de sodio a travs de la
membrana apical, lo que hace que aumente pasivamente la reabsorcin de agua. El
resultado final es quela secrecin se deshidrata 9.
Uno de los signos bioqumicos que contribuyen al diagnstico de la FQ es la
elevacin de electrolitos en el sudor. Este fenmeno es tambin el resultado de un
bloqueo de la permeabilidad a los iones cloruro en el epitelio de los conductos
excretores de la glndula sudorpara 9.
En las personas sanas, las clulas secretoras del acino glandular producen una
secrecin isotnica que al fluir por el conducto excretor, impermeable al agua, se
hace hipotnica por la reabsorcin de cloro y de sodio.
En la FQ, la produccin de fluido en el acino est disminuida y la impermeabilidad
del conducto excretor al ion cloruro hace quela concentracin de este ion (y la del ion
sodio, que no se reabsorbe porque el potencial electroqumico est alterado) est
elevada en el sudor.9
4.11. ESTRUCTURA Y REGULACIN DEL CANAL CFTR
La CFTR es una protena de 170.000 dalton anclada a la membrana por dos dominios
transmembrana (TM-1 y TM-2) y cada dominio transmembrana atraviesa 6 veces la
doble capa lipdica. Tiene dos sitios de unin al ATP (NBF1 y NBF2) y un dominio
regulador (R) de alto contenido en aminocidos elctricamente cargados como
glutmico, asprtico, glutamina y lisina 1.
Los lugares de unin al ATP presentan una gran homologa con dominios similares
de una familia de pro-tenas llamadas protenas ABC o trqffic ATPases, entre las que
se encuentran las pro-tenas de resistencia a frmacos (MDR) del ratn y de humanos,
el transportador del factor sexual a de Saccharornyces cerevisiae (STE6) y el factor
de resistencia a cadmio (YCF1) de levadura 1.

El primer dominio transmembrana (TM1) de la CFTR es el soporte fsico del poro del
canal. Se supone que determinados residuos aminocidos bsicos crean dentro del
poro las condiciones para dotarle de las caractersticas de un canal de cloro: las cargas
positivas de la arginina interaccionaran con algunas de las molculas de cloro y
crearan un poro por el que fluiran los iones cloruro embebidos entre molculas de
agua. El cambio de algunos aminocidos de la regin transmembrana de la protena
modifica

su

especificidad,

hacindose

ms

permeable a los iones I que a los iones cloruro. Este hecho aval, experimentalmente,
que la pro-tena CFTR puede funcionar como un canal de cloruros. Otra evidencia de
que la protena CFTR es un canal de iones cloruro es que las clulas que no tienen
canal CFTR (un canal de aproximadamente 8-10 pS estimulable por epinefrina y
AMP cclico y sus anlogos) lo adquieren cuando se les introduce el gen y ste se
expresa 1.

Figura 4.4: Esquema de la protena CFTR. TM1 y TM2, dominios

transmembrana 1 y 2; NBF1 y NBF2, dominios de unin del ATP; R,
dominio regulador.

La CFTR es un canal cuya apertura y cierre est controlado por estmulos

hormonales, cuyo efecto se ejerce elevando la concentracin intracelular de AMPc. El
AMPc es un segundo mensajero que activa una protena quinasa A (PKA), la cual a
su vez fosforila a otras protenas que son activadas o inactivadas por esta
fosforilacin. El isoproterenol, la epinefrina, las prostaglandinas El y E2, la adenosina
y el pptido intestinal vasoactivo son algunas de las sustancias que estimulan el flujo
de iones cloruro por este mecanismo. En todos estos casos, la fosforilacin de
laCFTR por la protena quinasa dependiente de AMPc provoca la apertura del canal y
la salida de iones cloruro a favor de gradiente. Existen 9 sitios "consenso" para
fosforilacin por PKA en el dominio R de la protena CFTR. Cuatro de estos sitios se
fosforilan invivo. Mediante mutagnesis dirigida se pueden cambiar estas serinas por
alaninas y con ello se consigue que la CFTR sea menos sensible a AMPc. La delecin
de una gran parte del dominio R (desde el aminocido 708 al 835) hace quela CFTR
se haga casi insensible a la accin del AMPc (permanece abierto en ausencia
deAMPc). En este mutante de CFTR, la sustitucin por alanina de la nica serina

fosforilable por PKA que an conserva (serina 660) provoca la apertura total y la inde
pendenciadel AMPc, pero an necesita para abrirse de la presencia de ATP Los
anlogos no hidrolizables del ATP no pueden sustituirle en provocar este efecto, lo
que hace suponer que es necesaria la hidrlisis del ATP En este sentido, se ha
comprobado que la regin NBF1aislada tiene actividad ATPasa; su constante de
Michaelis (Km) para ATP es de 0,1 mM y su actividad molecular es inferior a la de
la protena MDR, una protena de la superfamilia de protenas ABC humanas que
transporta frmacos. La actividad se inhibe por inhibidores de las ATPasas como
el AMP-PNP y el sulfito sdico. Mutantes en aminocidos muy conservados a lo
largo de la evolucin de este dominio pierden la actividad hidroltica sobre ATP Sobre
la CFTR fosforilada en su dominio R, la hidrlisis de ATP consigue as una apertura
transitoria que se puede estabilizar por la presencia de anlogos del ATP no
hidrolizables 1.

Figura 4.5: Fosforilacin in vivo del dominio R de la protena CFTR

Se ha construido un mutante de la CFTR al que le faltan los dominios TM2 y NBF2 y

que tiene caractersticas muy similares a la protena nativa, aunque est abierto en
ausencia defosforilacin y hay evidencia de que el canal se forma por la unin de dos
molculas. En base a los datos experimentales actuales, la apertura del canal CFTR se

activa porfosforilacin del dominio R por la PKA. Adems, es necesaria la hidrlisis

de ATP por el NBFl y que otra molcula de ATP (o anlogos no hidrolizables de este)
se una al NBF2 para estabilizar la apertura del canal 9.

Figura 4.6: Regulacin del canal CFTR (modificado)

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