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    Coloraciones Simples y Compuestas

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    El documento describe las diferencias entre las paredes celulares de bacterias Gram positivas y Gram negativas, así como los procedimientos para realizar tinción simple, tinción compuesta de Gram y tinción de Ziehl-Neelsen. La pared celular de las bacterias Gram negativas tiene una membrana externa, espacio periplásmico y membrana citoplasmática, mientras que las bacterias Gram positivas solo tienen una membrana citoplasmática y su pared celular contiene una gran cantidad de peptidoglicano. La tinción de Gram diferencia las bacterias

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    El documento describe las diferencias entre las paredes celulares de bacterias Gram positivas y Gram negativas, así como los procedimientos para realizar tinción simple, tinción compuesta de Gram y tinción de Ziehl-Neelsen. La pared celular de las bacterias Gram negativas tiene una membrana externa, espacio periplásmico y membrana citoplasmática, mientras que las bacterias Gram positivas solo tienen una membrana citoplasmática y su pared celular contiene una gran cantidad de peptidoglicano. La tinción de Gram diferencia las bacterias

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    DIFERENCIAS ENTRE LA PARED CELULAR DE DE UNA BACTERIA GRAM NEGATIVA Y

    UNA GRAM POSITIVA

    PARED CELULAR DE Mycobacterium (BAAR)

    TIPOS DE TINCIONES BACTERIANAS:


    A. TINCION SIMPLE
    1. TINCIN SIMPLE POSITIVA:
    Basada en la afinidad electrnica de los colorantes a los distintos componentes
    celulares, ya que las clulas bacterianas en medios con pH neutros suelen presentar
    una dbil carga negativa. As pues, la bacteria cargada negativamente se combinara
    con los iones positivos de los colorantes bsicos, como por ejemplo, el azul de
    metileno, de tal forma que la bacteria queda coloreada. Esto explica porque en las
    tinciones simples los colorantes usados suelen ser de tipo bsico. Se caracteriza por:
    Necesita una fijacin previa
    Se utiliza un solo colorante (Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina, etc.)
    Permite nicamente la visualizacin de la morfologa bacteriana.
    Las tinciones simples se pueden realizar con colorantes bsicos, cidos o neutros.
    2. TINCION SIMPLE NEGATIVA: Consiste en la aplicacin de un colorante acido
    (cargado negativamente). Por ello los microorganismos, que tambin estn cargados
    negativamente, no van a captar el colorante, quedando claros y brillantes sobre un
    fondo teido oscuro, es decir, en realidad no tie las bacterias sino que tie su
    entorno, aumenta el contraste entre este y las clulas y facilita su observacin.
    Se consigue una imagen ms real de su forma y tamao, adems de permitirnos
    observar si presentan o no capsulas. Se caracteriza por:
    Es un tipo de tincin simple (Se utiliza un solo colorante: Nigrosina o Tinta
    china).
    No necesita fijacin previa
    Nos permite visualizar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria, adems
    de, alguna otra caracterstica estructural como la presencia de capsulas.

    (1)

    (2)

    1. Colocar una gota de nigrosina sobre una lmina portaobjetos y mezclar con
    una gota del cultivo en medio lquido; colocar el extremo de otra lmina
    portaobjetos delante de la gota, permitiendo que sta discurra de manera

    uniforme por el borde de ella y luego realizar el extendido. Dejar secar y


    observar al microscopio.

    B. TINCIN COMPUESTA (DIFERENCIAL)


    TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM
    PREPARACIN DE FROTIS PARA COLORACIN DE GRAM
    Primer paso: Extensin

    Segundo paso: Fijacin

    Al calor

    Qumica: Metanol

    TCNICA DE COLORACIN DE GRAM


    1. Colocar el frotis sobre una varilla de coloraciones.
    2. Agregar cristal violeta de Hucker por 1 minuto (colorante primario)
    3. Eliminar el colorante y lavar con agua corriente.
    4. Agregar solucin de Lugol por 1 minuto (mordiente)
    5. Decolorar con alcohol acetona por 30 segundos (decolorante)

    6. Lava con agua corriente.


    7. Agregar colorante de Safranina por 1 minuto (colorante de contraste)
    8. Lava con agua corriente.
    9. Secar al medio ambiente en plano inclinado sobre papel secante (sin frotar).
    10. Una vez que la preparacin est totalmente seca, poner una gota muy pequea de aceite
    de inmersin y observar al microscopio con el objetivo 100X (inmersin).
    PREPARACIN DE FROTIS PARA COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN
    Identificacin de muestras y lminas.
    Numerar los envases. Numerar las lminas portaobjetos empleando un lpiz graso, en forma
    correlativa. Deber trazarse una lnea en cada lmina portaobjeto empleando el lpiz graso.
    Realizacin del extendido.
    Destapar cuidadosamente el envase de la muestra que se va
    a procesar, manteniendo la boca del envase cerca del
    mechero encendido.

    Dividir un aplicador de madera (baja lengua) en dos o tres


    partes y tomarlo entre el pulgar y el ndice de la mano, para
    luego seleccionar y extraer la partcula til, que es la
    porcin muco-purulenta de color amarillo verdoso del
    esputo, enrollndola en el aplicador.

    Colocar la partcula til sobre el portaobjeto y extenderla,


    haciendo movimientos de vaivn, hasta lograr que el
    extendido sea homogneo (ni muy fino ni muy grueso), que
    no llegue a los bordes de la lmina. Por ningn motivo
    debe calentarse la lmina mientras se haga el
    extendido.

    Fijacin del extendido.


    Fijar cada lmina, una vez seca, mediante dos o tres pasajes
    rpidos sobre la llama del mechero con el extendido hacia
    arriba.

    TCNICA DE COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN


    TENER EN CUENTA:
    La tcnica ms recomendada es la tincin de Ziehl Neelsen. Antes de su uso, todos los
    colorantes y soluciones a emplearse deben ser previamente filtrados.
    Las lminas portaobjetos con los extendidos debern estar previamente fijadas al
    calor y correctamente identificadas.
    Primer Paso: Coloracin

    Colocar sobre el soporte las lminas fijadas


    conservando el orden numrico con el extendido
    hacia arriba y manteniendo una separacin de al
    menos 1 cm entre ellas.

    Cubrir totalmente la superficie del extendido con


    fucsina bsica fenicada recin filtrada. Dispensar el
    colorante con suavidad, con el gotero sobre los
    extendidos.

    Con la llama de un hisopo embebido en alcohol


    calentar suavemente por debajo de los extendidos,
    con movimientos de vaivn, hasta que observe que
    se desprenden los primeros vapores blancos (no
    hervir). En caso de prdida de volumen, agregar
    fucsina para no dejar secar el preparado.

    En el trmino de la eliminacin de los 3 vapores


    dejar colorear por 5 minutos.

    Eliminar la fucsina tomando la lmina por el


    extremo numerado, con una pinza, inclinndola
    hacia adelante y enjuagar con agua corriente a baja
    presin.

    Segundo Paso: Decoloracin

    Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con


    la solucin de alcohol cido durante 45 segundos.

    Una vez eliminado el alcohol cido lavar nuevamente la lmina con agua a baja
    presin.

    Tercer Paso: Coloracin de fondo

    Cubrir la superficie del extendido con el colorante


    azul de metileno, previamente filtrado, durante 2
    minutos.

    Eliminar el azul de metileno y lavar cada lmina con


    agua a baja presin, por ambos lados (el que tiene el extendido, como el otro lado).

    Dejar secar las lminas a temperatura ambiente, apoyndolas en posicin vertical


    en un soporte sobre un papel absorbente. Verificar la numeracin de la lmina.

    Llevar a observacin al microscopio con objetivo de 100X (Inmersin).

    Profesor. Manuel Farcio Villarreal

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