REV CUBANA MED TROP 2010;62(3):167-79

ARTCULO DE REVISIN
FACULTAD DE BIOLOGA, CENTRO DE ESTUDIOS DE PROTENAS, UNIVERSIDAD
DE LA HABANA

Inmunoensayos enzimticos para detectar agentes infecciosos

o sus productos: algunos diseos y aplicaciones
Anselmo J. Otero Gonzlez

RESUMEN

Se hizo una valoracin del impacto de los ensayos inmunoenzimticos en la analtica de base inmunoqumica en las ltimas
4 dcadas, en la deteccin de agentes infecciosos o los productos asociado a su presencia y(o) actividad patognica. Adems se
hace una incursin en algunos diseos y formatos que han tenido estos inmunoensayos desde los mtodos electroqumicos de
deteccin, los ensayos para detectar actividad proteoltica de origen microbiano y sus inhibidores como posibles blancos
teraputicos, los inmunoensayos directos de triple anticuerpo para lograr mayor sensibilidad, reveladores alternativos de la
actividad enzimtica, ensayos para el estudio de la serologa viral con un mnimo de determinaciones, as como ensayos de
competencia para evaluar la efectividad de candidatos vacunales basados en combinaciones peptdicas seleccionadas. Se concluy
con una rpida visin del futuro inmediato de este tipo de inmunoensayos a la luz de las tecnologas analticas emergentes de
deteccin.

Palabras clave: Reaccin antgeno-anticuerpos, especificidad, inmunoensayos, agentes infecciosos, inmunodeteccin.

INTRODUCCIN istopos radiactivos como elementos de revelado

en los inmunoensayos.2 Pero es, en realidad, a par-
A casi 40 aos de la publicacin del primer tir de esta denominacin de ELISA cuando ocu-
inmunoensayo prctico revelado con una reaccin rre una avalancha diversa y entusiasta de diseos
enzimtica y designado de modo extico con un originales y aplicaciones que han hecho de esta
nombre de mujer1 (moda que continu despus con plataforma analtica una extraordinaria, prctica y
otros diseos de ensayos de similar principio), esta masiva forma de cualificar y cuantificar antgenos
variante de inmunoanlisis cuenta con niveles de y anticuerpos, sobre todo, despus de la introduc-
deteccin corrientemente inferiores al nanogramo cin de la versin microanaltica por Alister Voller
y las variantes miniaturizadas con sistemas de re- a finales de la dcada de los setenta3 con su prc-
velado amplificados estn alcanzando la casi ini- tica y verstil modularidad
maginable cota de los atogramos. Ya desde finales Esta revisin pretende incursionar y actualizar
de la dcada de los sesenta del siglo pasado se algunos formatos corrientemente utilizados para
vena intentando la sustitucin de los controvertidos este tipo de ensayos, con el aporte de los resultados

1
Doctor en Ciencias. Investigador Titular. Centro de Estudios de Protenas, Facultad de Biologa, Universidad de La Habana. Ciudad de La
Habana, Cuba.
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del autor y su discusin en el contexto de otros ciales. 7 Debido a que los anticuerpos y los
similares que a lo largo se estos aos han enrique- antgenos no son electroqumicamente activos
cido el arsenal de variantes desde aquella de 1971, con el potencial REDOX en el rango apropiado,
precursora y muy visionaria. es necesario acoplar compuestos activos REDOX
como marcadores para la deteccin de la reaccin
1. INMUNOENSAYOS DIRECTOS antgeno-anticuerpo, de manera que cualquier unin
inespecfica no contribuya a la seal de inters. En
1.1. Electroinmunoensayos. Inmunoensayo un ensayo amperomtrico el compuesto REDOX
potenciomtrico de enzima ligada (IPELI) marcador debe tener las propiedades siguientes:
para la deteccin del subtipo "ad" del ser electroactivo en un rango de potencial entre 0
antgeno de superficie de la hepatitis B y 200 mV, no debe alterar el funcionamiento del
como una alternativa a los inmunoensayos electrodo, no tener reacciones colaterales con la
enzimticos. matriz, ser estable en el tampn de reaccin y
tener disponibles grupos qumicos activos para la
conjugacin.8
Los inmunoensayos electroqumicos pueden
Los inmunoensayos electroqumicos indirec-
ser directos cuando se utilizan transductores
tos tambin pueden ser enzimticos de tipo homo-
potenciomtricos, amperomtricos o capacitivos
gneos con el formato EMIT (Enzyme Multiplied
que indican la reaccin antgeno anticuerpo sin otra
Immunotechnique, Syva, Palo Alto, Ca) o hetero-
reaccin acoplada o accesoria. Estos ensayos se
gneos con el formato ELISA convencional. En
basan en la deteccin de cambios en la densidad
este ltimo caso, un transductor electroqumico
de carga o en la conductividad de la transduccin.
sustituye al lector colorimtrico de microplacas, lo
El hecho de trabajar sin marcadores para revelar
cual reduce los costos y permite lecturas de traba-
la reaccin es muy atractivo, sobre todo en el de-
jos de campo. Los electrodos pueden ser integra-
sarrollo de inmunosensores in vivo que permiten
dos en el pocillo de reaccin o la mezcla de reaccin
una evaluacin en tiempo real con la deseada au-
ser llevada a la celda de medicin. Este es el caso
sencia de reactivos peligrosos y con la posibilidad
de un inmunoensayo tipo sandwich para la hor-
de utilizar anticuerpos de no muy alta afinidad. Ya
mona estimulante de tiroides (TSH) con la enzi-
hace ms de 30 aos Janata y otros detectaron
ma fosfatasa alcalina (AP) como agente revelador.
un cambio de potencial con valor analtico cuando
Despus del lavado final, se aadi NADP+
incubaron manano y concanavalina A inmovilizada
(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
en una membrana de PVC (polyvinyl chloride),
como sustrato. El NAD+ (nicotinamide adenine
que representa un antecedente importante para
estos electroinmunoensayos de evaluacin di- dinucleotide) producido se determin por ampli-
recta.4 En 1984, Keating y Rechnitz5 utilizaron un ficacin enzimtica con alcohol deshidrogenasa
electrodo sensible a potasio con un conjugado (ADH) y diaforasa como enzima acoplada. En
dioxon-ionosforo en una membrana de PVC para una versin comercial de ELISA amplificado
detector anticuerpos anti-dioxina. Aun cuando al- (AmpliQ de Dako, NovoClone AELIA, Novo
gunas publicaciones han informado resultados con BioLabs) se utiliz INT-violeta como sustrato de
efectos similares, no quedaba completamente cla- la diaforasa.9 El ferricianuro al convertirse en
ro si el cambio de potencial es el resultado de un ferrocianuro puede ser detectado de modo ampe-
disturbio en el transporte de iones o es el producto romtrico. En configuraciones similares se reem-
de cambios de carga en la superficie de la inter- plaza la ADH por la formiato deshidrogenasa, la
accin de las protenas.6 glucosa deshidrogenasa, la carnitina deshidroge-
En los inmunoensayos electroqumicos indirec- nasa o la glicerol deshidrogenasa.10
tos el evento de unin molecular es visualizado En lugar del p-nitrofenilfosfato (PNPP) habi-
mediante una reaccin auxiliar con un compuesto tualmente utilizado en los inmunoensayos que se
marcado. Los transductores amperomtricos aco- revelan con fosfatasa alcalina o el NADP+ ya men-
plados a la reaccin son capaces de detectar 10-10 cionado, el p-aminofenilfosfato (p-APP) es tam-
A en un rango lineal con potenciostatos comer- bin con frecuencia usado en la determinacin
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electroqumica de la AP. El producto enzimtico ductos de la protelisis15 o, por el contrario, del

es p-aminofenol (p-AP) que puede ser medido con sustrato remanente.16 Estos ensayos con frecuencia
muy alta sensibilidad mediante un electrodo de miden la liberacin de marcadores coloreados en
carbn vidriado. El mtodo fue propuesto por Kulys el sustrato proteico o cuantifican aminocidos o
y otros en 1980 e introducido en una inmunoensayo pptidos precipitados en medio cido. Todos re-
por el grupo de Heineman y Halsall.11 Este mismo quieren tratamiento y relativamente grandes vo-
grupo, 10 aos ms tarde, utiliz un electrodo de lmenes a los efectos de una escala analtica. La
disco rotatorio directamente a una microgota de sensibilidad puede ser aumentada con la utiliza-
50 L en la deteccin electroqumica de IgG de cin de sustratos a los que se ha unido de manera
ratn como modelo analtico en un inmunoensayo covalente compuestos cromognicos o fluoro-
basado en microesferas.12 gnicos en las regiones C terminales de los pp-
El inmunoensayo potenciomtrico IPELI,13 que tidos17 o istopos radioactivos.18 Estos ensayos
se desarroll en el Centro Nacional de Investiga- demandan usualmente la accin de proteinasas es-
ciones Cientficas de Cuba por los aos ochenta pecficas, requieren equipo especializado y costo-
intent sustituir la lectura colorimtrica por una so e implican riesgos de operacin adems de
potenciomtrica sobre la base de la ecuacin de presentar alta variabilidad entre muestras, as como
Nernst con la reaccin REDOX del ABTS, que se premura en la deteccin debido a la inestabilidad
reduce a expensas de la oxidacin del perxido de de los productos.
hidrgeno a agua. Naturalmente, el carcter arte- Un enfoque diferente centra su atencin en
sanal del dispositivo utilizado solo permite la com- los inmunoensayos tipo ELISA y los anticuerpos
paracin con la variante colorimtrica tradicional especficos contra una regin especfica del sustrato
para la peroxidada, basada en el cromgeno orto- que resulta excluyente despus de la protelisis.19
fenilendiamina (OPD). El concepto electroqumico Un enfoque de similar estructura pero que no
de la deteccin hace a esta independiente de la involucra anticuerpos utiliza un conjugado estrep-
turbidez de la muestra, miniaturizable en trminos tavidina-fosfatasa alcalina para detectar el sustrato
de volumen, tambin automatizable si se disea y antes biotinilado.20
construye un dispositivo capaz de medir la dife- La deteccin, con fines teraputicos, de la
rencia de potencial en placas tipo suma con quiz actividad inhibidora de proteasas de forma rpida
menos de 5 L de muestra. Por otra parte la sen- y masiva, sobre todo relacionada con entidades
sibilidad puede, en trminos de detectabilidad, ser epidmicas y pandmicas, ha sido enfrentada me-
aumentada de manera notable, porque la actividad diante inmunoensayos que cumplen con estas ex-
REDOX de fondo es mnima. A ms de 20 aos pectativas de pesquisaje. En este sentido se ha
de informado y con el advenimiento de las informado un ELISA para la deteccin de activi-
nanotecnologas de miniaturizacin, este enfoque dad proteoltica y su inhibicin de la proteasa
refuerza la pertinencia de ese intento de incursionar
asprtica del VIH, con un sustrato inmovilizado
en otro concepto inmunoanaltico diferente al tra-
relacionado a la protena gag. En estas condicio-
dicional espectrofotomtrico.
nes, el pestatn fue capaz de inhibir la protelisis y
rendir una seal discriminadora con suficiente
1.2. Inmunoensayos para detectar actividad sensibilidad como para enfrentar candidatos ex-
proteoltica. Inmunoensayo de tipo ELISA tractos naturales y sintticos.21
para detectar inhibidores de la proteasa aspr- Se ha generalizado la denominacin cat-
tica expresada por el virus de la inmunode- -ELISA para referirse a los inmunoensayos que
ficiencia humana (VIH). intentan evaluar la actividad cataltica o su inhibi-
cin en fase slida. Con este enfoque se inform
Existe un amplio rango de mtodos disponibles de un ensayo para evaluar la actividad proteoltica
para la evaluacin de actividad de endoproteinasas asprtica del VIH y la evaluacin de potenciales
(y de modo potencial para sus inhibidores) que pptidos sintticos inhibidores. Este inmunoensayo
utilizan sustratos proteicos y peptdicos.14 Algunos cuantitativo en fase slida fij un sustrato biotinilado
de ellos estn basados en la deteccin de los pro- por el extremo c-terminal con un extracto crudo
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de enzima y un anticuerpo altamente especfico el La independencia estructural del sitio de corte

extremo c-terminal del producto de escisin. Una proteoltico y el sitio de reconocimiento
curva estndar sirvi de base para estimar la inmunoqumico en el pptido DU1, permite la
actividad enzimtica y los autores aseguran que el utilizacin de este diseo en la bsqueda de
mtodo es menos costoso y ms sensible que el inhibidores para otras proteasas e inclusive puede
convencional, cromatogrfico.22 contener la secuencia de ms de un sitio de corte
Ya en 1991 el grupo de Maurizio Denaro en simultneo, que otorga cierta universalidad solo
la Universidad de Miln haba informado de un condicionada por la capacidad fsica y cataltica
inmunoensayo tipo ELISA para detectar inhibidores de la construccin.25
de la proteasa asprtica del VIH, en mezclas tan
complejas como fracciones de fermentacin 1.3. Inmunoensayos de triple anticuerpo.
microbiana a partir de un pptido con la secuencia Inmunoensayo de tipo TAS-ELISA con
apropiada y un anticuerpo monoclonal (AcM). El anticuerpo monoclonal de captura para la
fragmento escindido est conjugado con beta deteccin temprana de antgenos del hongo
galactosidasa, por lo que la actividad inhibidora se Mycosphaerella fijiensis, agente causal de
evala como la aparicin de actividad beta la sigatoka negra en el banano.
galactosidsica en lugar de la disminucin de la
actividad proteoltica, lo que aporta una ventaja
Con el advenimiento de la tecnologa de hi-
analtica al sistema adems de un procesamiento
bridomas, la posibilidad de disponer de anticuerpos
rpido y masivo de muestras.23 de estructura homognea (idiotipo e isotipo) y afi-
Lo ms interesante, desde el punto de vista nidad constante con un razonable o exigente grado
inmunoqumico, en el ensayo descrito en el artculo de pureza segn la aplicacin de destino, cambi
de Gutirrez y otros24 es, entre otras cosas, la ex- por completo los conceptos de variabilidad e ines-
celente curva lineal de calibracin que se pudo lo- tabilidad de las tradicionales preparaciones de
grar con el pptido de inters proteoltico DU1 en anticuerpos policlonales tan dependientes de la
un rango entre 0,25 y 0,46 nmol/L, lo que ofrece un fuente animal. Por otra parte, este advenimiento
escenario apropiado para evaluar la protelisis (dis- abri nuevos horizontes en el mapeo epitpico su-
minucin en la intensidad de la reaccin) y la inhi- perficial (caracterizacin molecular) de microor-
bicin (recuperacin de la intensidad de la reaccin). ganismos y clulas superiores, introduciendo una
Lo puntos crticos de la puesta a punto fueron, nueva dimensin en el anlisis biolgico, que llega
primero, el pretratamiento de las muestras que pro- inclusive a convertir a estas preparaciones mono-
venan de extractos de invertebrados organismos clonales en herramientas para la demostracin de
marinos, con la consiguiente carga salina, tarea mecanismos de accin en procesos bioqumicos e
nada sencilla por la cantidad de combinaciones inmunolgicos.26
ensayadas y, en segundo lugar, el compromiso ana- La clsica disyuntiva, muy difcil de encarar
ltico entre la concentracin adecuada de pptido con anticuerpos policlonales, para distinguir eptopes
DU1 (4,6 nmol/L) y su relacin seal-fondo, la dis- exclusivos en un agente infeccioso que comparte
minucin de la seal por la protelisis hasta un rango otros eptopes presentes en flora normal no
con la sensibilidad necesaria para con un valor de patognica, pudo ser resuelta de manera racional
corte, razonablemente objetivo, detectar actividad y efectiva con el establecimiento de la tecnologa
recuperadora de la seal como evidencia de la in- de hibridomas, que permite obtener las lneas celu-
hibicin de la enzima. lares productoras de AcMs. Efectivamente, es
La capacidad del pptido DU1 de unirse a la posible sin la necesidad de purificar los eptopes
estreptavidina y de ser reconocida por el AcM 322, exclusivos, inmunizar con los patgenos completos
sin reacciones cruzadas con el recubrimiento y en el paso de evaluacin de los sobrenadantes
de biotina ni con el bloqueo garantiz un fondo de los hibridomas, pesquisar la reactividad de los
excelente para estimar la sensibilidad del siste- AcMs contra los microorganismos patgenos y los
ma en trminos de cantidad mnima detectada no patgenos de forma paralela. Solo sern selec-
(121 pmol/L). cionados los anticuerpos que reaccionen con
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eptopes relacionados, de modo exclusivo, con las sobre los cuales generar los anticuerpos se con-
especies patgenas de inters. vierte en la primera tarea de diseo del inmu-
El tema de la eleccin de los antgenos, inclu- noensayo.29
sive los eptopes, sobre los cuales generar una res- En el caso de este hongo, la fuente para la
puesta de anticuerpos con fines analticos y(o) consideracin de los antgenos provienen de:
diagnsticos est, naturalmente, muy relacionado
con la complejidad de ciclo infectivo del patgeno. a) Extracto de micelio de hongo cultivado in vitro.
De hecho los parsitos protozoarios y multi- b) Extracto de micelio proveniente de infeccin
celulares que interaccionan con los vertebrados natural o experimental.
han tenido la capacidad de retar y condicionar la c) Protenas fngicas segregadas en el cultivo
respuesta inmune del hospedero, muy a favor de in vitro.
estos invasores y en detrimento de los organismos d) Conidias.
parasitados, como ocurre con el Plasmodium (ma- e) Ascosporas.
laria), el Trypanosoma (enfermedad de Chagas)
y la Leishmania (leishmaniasis), que han conver- Si el origen de la infeccin en poca lluviosa
tido su complejo ciclo de vida en un formidable es una o varias ascosporas o conidias en poca
factor de virulencia en trminos de desestabiliza- seca que penetran en la hoja por los estomas, pa-
cin y desorientacin de la respuesta inmune. rece razonable pensar que los anticuerpos de cap-
Aunque en el reino vegetal an no se ha des- tura reconozcan protenas de estas estructuras
cubierto una franca respuesta adaptativa, con cier- como candidatos tempranos de infeccin. Obvia-
mente, estos antgenos aparecern de nuevo en la
tos indicios ya de ella, la respuesta innata frente
fase necrtica avanzada, cuando un nuevo lote de
a las infecciones microbianas est firmemente es-
esporas muy abundante est preparado para pro-
tablecida, inclusive con una cascada de induccin
seguir la propagacin a nuevas plantas. La pre-
de seal muy semejante a la encontrada para c-
gunta es: la abundancia de esporas en un rea
lulas animales.27
foliar determinada es suficiente para que el inmu-
Los hongos, sin llegar a estas ingeniosas y
noensayo logre la detectabilidad suficiente para un
efectivas transformaciones antignicas de los pa- criterio analtico?
rsitos protozoarios, pueden presentar, en sus di- Esto nos lleva a la intencin de que ese an-
ferentes fases reproductivas, alternativas a tener ticuerpo policlonal o esas mezclas de AcMs como
en cuenta con respecto a qu tipo de antgenos se anticuerpos de captura reconozcan tambin
deben considerar para generar anticuerpos, sobre antgenos de micelio y protenas segregadas que
todo monoclonales. permiten al hongo abrirse camino en las estructu-
Mycosphaerella fijiensis Morelet, agente ras titulares de las hojas. La utilizacin de extracto
etiolgico de la sigatoka negra en bananos y pl- de micelio como antgeno tiene la ventaja de in-
tanos, enfermedad devastadora para este cultivo, cluir tambin a las protenas segregadas que
descubierta en las Islas Fidji en 1963 y que apareci provienen de l. Esta fue la estrategia utilizada en
en Amrica en 1972. Su control se basa en la apli- el artculo de Otero y otros para generar AcMs,
cacin de fungicidas muy txicos para los anima- donde se logra un hibridoma que segrega una
les y el ecosistema. La deteccin temprana de la monoclonal, la cual reconoce una protena de alto
infeccin en ausencia de sntomas permitira una peso molecular que pudiera ser una enzima.30
aplicacin mucho ms racional y segura de sus- En este caso el tema de la sensibilidad analti-
tancias antifngicas.28 ca (detectabilidad del ensayo) puede manejarse con
Los inmunoensayos con anticuerpos que re- la cantidad de tejido foliar utilizado para hacer la
conocen estructuras fngicas exclusivas de forma prueba, lo cual naturalmente incluira una etapa de
especfica y sensibles, pueden detectar antgenos extraccin, concentracin y clarificacin ms o
tempranos que ofrezcan una valoracin de la menos compleja, en dependencia del concepto que
intensidad y pronsticos de una infeccin asinto- se establezca de "estadio temprano". Esta consi-
mtica. Por lo tanto, la eleccin de los antgenos deracin ser la que decida, aun trabajando en el
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lmite de sensibilidad del ensayo, cun til ser la analito. Por lo tanto, la eleccin de este revelador
prueba para diagnosticar la infeccin antes que tendr una influencia en la sensibilidad del sistema
aparezcan las lesiones caractersticas de esta en- en trminos de cantidad mnima detectable. Las
fermedad. enzimas que, durante aos, han sido ms frecuen-
La utilizacin, en este artculo, de un sistema temente utilizadas en los inmunoensayos son la
de 3 anticuerpos (TAS-ELISA) de 3 especies peroxidasa de rbano picante y la fosfatasa alcali-
mejor notablemente la detec-tabilidad por ampli- na de intestino bovino. Con respecto a la peroxi-
ficacin, cuando se compar la variante del conju- dasa, algunos autores sostienen que la relacin
gado directo con la policlonal de conejo. Esta cromgeno-producto con el par perxido-agua
modalidad TAS-ELISA se encuentra bastante es tan estrecha, que deben considerarse a esos
extendida en aplicaciones inmunoanalticas comer- compuestos como parte de un sustrato complejo
ciales, por ejemplo, de la firma Agdia de EE. UU., para la peroxidasa. Esta enzima utiliza como
que presenta una amplia variedad de ensayos para sustrato al perxido de hidrgeno que se oxida a
el diagnstico y la deteccin de agentes infeccio- agua y la contraparte que intercambia electrones
sos en plantas. en el evento REDOX puede ser el cromgeno
3,3,5,5'- tetrametilbenzidina (TMB), el ortofenilen-
2. INMUNOENSAYOS INDIRECTOS diamina (OPD) y el 2,2'-azinobis[3-etilbenzil-
tiazolino-6-cido sulfnico] (ABTS). Este ltimo,
cuya frmula general es C18 H18 N4 O6 S4 y masa
2.1. Reveladores del conjugado enzimtico. molar 514,62 g/mol, es un cromgeno soluble en
Introduccin de un sustrato de enzima agua asociado que rinde un producto de punto fi-
peroxidasa para revelado de conjugado de nal de color verde. Presenta 2 picos en su espec-
fosfatasa alcalina en inmunoensayo tipo tro de absorcin, 410 nm y 650 nm. El ABTS es
ELISA, el cual incluye a un anticuerpo menos sensible que el OPD y el TMB en aplica-
monoclonal que reconoce al subtipo "ad" ciones de ELISA, pero esa misma propiedad pue-
del antgeno de superficie de la hepatitis B. de ser en algunas circunstancias beneficiosa, si una
mayor sensibilidad produce fondos inadmisibles. Por
En los ensayos no competitivos (sandwich o otra parte, ABTS tiene un desarrollo de color ms
ensayos de saturacin secuencial) se utiliza un lento (20 min) que los otros cromgenos, lo cual
significante exceso de anticuerpos con respecto a tambin puede ser favorable por la misma razn.33
la concentracin de antgeno. En este caso, la di- Un estudio de la firma KPL (Gaithersburg,
fusin resulta un fenmeno tan decisivo como la MD, EE. UU.) referido en su reporte de servicio
avidez o afinidad de las inmunoglobulinas invo- tcnico ML-108-03, compar los cromgenos
lucradas. Mientras que la menor concentracin de TMB, OPD y ABTS de acuerdo con su compor-
analito detectable en los ensayos de competencia tamiento en un ELISA de 2 pasos con IgG huma-
est en el orden de 107 molculas por mililitro, un na como recubrimiento, y un conjugado anti IgG
ensayo no competitivo es potencialmente capaz de peroxidasa en condiciones de detencin y no de-
detectar concentraciones menores en varios rde- tencin de la reaccin enzimtica. Ellos concluye-
nes de magnitud.31 Por otra parte, debido al exce- ron que el TMB fue el cromgeno de mayor seal,
so de uno de los componentes analticos, el ensayo seguido de OPD y ABTS cuando se aadi solucin
no competitivo es habitualmente ms rpido que detenedora. Con respecto a la relacin positivo-
su equivalente competitivo.32 negativo la diferencia no fue tan marcada, lo cual
En los ensayos tipo ELISA no competitivos de demuestra que la mayor sensibilidad no necesaria-
tipo sandwich para cuantificar antgenos o indi- mente est relacionada con la mayor seal de
recto del tipo serolgico para estimar el ttulo de absorbancia obtenida. Por otra parte TMB y OPD
anticuerpos, la reaccin final involucra a un com- requieren 2 filtros diferentes para reacciones de-
puesto cromgeno que genera un producto colo- tenidas y no detenidas, a diferencia de ABTS que
reado cuya concentracin es, en un cierto rango requiere solo un filtro para las 2 variantes de punto
manejable, proporcional a la concentracin del final; este, adems, es un compuesto no peligroso
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para los operadores del ensayo y a los efectos de sustrato colorimtrico tradicional para la fosfa-
su desecho. tasa alcalina.
En un reciente inmunoensayo enzimtico tipo
ELISAPCR,34 despus de la optimizacin de la 2.2. Serologa diagnstica viral con dilucin
reaccin, se evaluaron estos 3 mismos compuestos. nica del suero. Aplicacin de la esti-
El cromgeno que aport ms sensibilidad al macin del ttulo de anticuerpos contra
ensayo en trminos de la relacin seal-fondo fue citomegalovirus, virus herpes simple y
el ABTS, el cual genera un producto de color ver- adenovirus, con una sola dilucin del sue-
de-azul con total independencia del DNA que pro- ro y una curva estndar mediante la apli-
viene del extracto fngico crudo o purificado. El cacin del sistema ultra microanaltico
ABTS, adems, mostr el menor fondo y la ms (SUMA).
clara y legible condicin aun a la dilucin de 1:250
del conjugado de peroxidasa. El OPD fue menos
sensible con un mayor fondo debido a su mayor Las enfermedades infecciosas pueden ser
sensibilidad a la luz y la inestabilidad del crom- diagnosticadas por mtodos inmunoqumicos
geno.35 El color naranja incipiente del OPD fue mediante la deteccin de antgeno circulante (o ex-
difcil distinguir del amarillo del fondo y las reac- trado de tejidos) en ensayos de tipo directo o
ciones negativas. EL cromgeno menos sensible sndwich, en los cuales se precisa determinar
fue el TMB debido a su alto fondo. La combina- cuantitativamente la existencia de un marcador
cin de ABTS con SDS result la ms apropiada y cuya concentracin correlacione con el avance de
estos autores auguran que ser una alternativa muy la infeccin como es el caso del antgeno de su-
ventajosa en el futuro de los inmunoensayos que perficie de la hepatitis B.37 Algunos agentes infec-
utilicen conjugados de peroxidasa. ciosos experimentan, como parte de su estrategia
Una posible aplicacin al uso del ABTS36 como de incubacin y(o) evasin, perodos de ausencia
sustrato alternativo al paranitrofenil fosfato en con- antignica en los fluidos corporales o se encuen-
jugados de fosfatasa alcalina se basa en que los tran en los tejidos en zonas de difcil recuperacin.
inmunoensayos en los cuales el analito se encuen- Entonces el diagnstico acude a los efectores de
tra en un extracto vegetal, no pueden ser detecta- la respuesta inmune que esos agentes han provo-
dos a partir de conjugados de peroxidada, debido cado, tras su entrada y trnsito por el organismo
al alto contenido de esta enzima en los tejidos ve- inmunolgicamente competente. En general, la pre-
getales que por supuesto contaminar, aun en tra- sencia (IgM) o la variacin del ttulo (IgG) de los
zas, la secuencia inmunoqumica, que provoca anticuerpos especficos a un determinado agente
falsos positivos generalizados en todo el ensayo. infecciosos aportan una medida de la evolucin de
Resultan muy conocidos los habituales bajos y des- la infeccin, adems, permite tener una certeza de
alentadores niveles de intensidad del color del que el desarrollo de la respuesta inmune est rela-
paranitrofenol, que es el compuesto coloreado re- cionada con la sospecha de infeccin de un deter-
sultante de la accin enzimtica de la fosfatasa minado microorganismo y ante un cuadro clnico
alcalina sobre el paranitrofenil fosfato. Esto hace especfico.38
que los revelados basados en este par enzima- De esta manera, un ensayo tipo ELISA indi-
sustrato sean difciles de evaluar visualmente de- recto compuesto, en la fase slida, por un antgeno
bido a la subjetividad, por la poca diferencia entre apropiado y representativo del reto antignico de
dbiles positivos, negativos y blancos. la infeccin natural es necesario para detectar
Los inmunoensayos visuales son en particular anticuerpos que el organismo infectado est gene-
atractivos en fitopatologa, cuando se piensa en rando contra este agente (representado por este
pruebas masivas que requieren una rpida y enr- antgeno) y que se unirn a l especficamente. El
gica decisin en el campo. En estos casos sera revelado depender de si el analista est interesa-
posible y quiz deseable introducir el ABTS como do en determinar anticuerpos de la clase IgM si el
cromgeno, el cual ofrece mayor absorbancia patrn de infeccin es apropiado para estimacin
neta y mejor relacin positivo-negativo que el de una infeccin reciente39 o en la evolucin
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mediata de los ttulos de IgG, si es que se requiere macin por defecto que se acostumbra a hacer
la evaluacin de una seroconversin o la elevacin para comparar despus con una prxima titulacin
del ttulo especfico de IgG en varios rdenes de y evaluar una seroconversin. La estimacin del
magnitud en el transcurso de 2 semanas.40 ttulo a punto final se facilita si, estadsticamente, a
Esta determinacin de ttulo de anticuerpo IgG la curva de dilucin del suero se aplica logaritmo a
especfico requiere que se realicen a la muestra cada eje (densidad ptica y recproco de la dilu-
de suero al menos 4 diluciones en un rango apro- cin) y una regresin lineal interpolando el valor
piado, de manera que la magnitud indirecta de corte en la ecuacin correspondiente. Una vez
cuantificada (densidad ptica en caso de ELISA) compilados los ttulos a punto final de este panel
disminuya significativamente por debajo de un va- de sueros representativos del espectro de
lor prefijado. Este valor es establecido mediante reactividad de la prueba es posible, para cada dilu-
un histograma de frecuencias que relaciona valo- cin ensayada, confeccionar una curva estndar,
res medidos en el mismo ensayo en una poblacin que relaciona los logaritmos de los recprocos de
de individuos sanos y enfermos y al que se deno- los ttulos a punto final en el eje de las abscisas con
mina valor de corte. La definicin de casos sa- el logaritmo de las densidades pticas en el eje de
nos y enfermos se establece mediante una prueba las ordenadas de cada determinacin. Un detalla-
de mxima confianza a la que le llama prueba de do anlisis de regresin y factibilidad puede permi-
oro y se considera la verdad absoluta mientras tir al analista seleccionar la curva estndar ms
no se pruebe o establezca lo contrario. De esta precisa y operativamente practicable. Con esta cur-
manera, la mayor dilucin del suero que ofrezca va es posible entonces evaluar en el ensayo de
una densidad ptica superior al valor de corte, ser ELISA una sola dilucin del suero problema, para
determinada como el ttulo de anticuerpos espe- una vez conocida la densidad ptica correspon-
cficos al agente cuyo antgeno fue vinculado a la diente llevarla a la curva estndar y encontrar por
fase slida del ensayo. Como puede apreciarse, interpolacin el ttulo a punto final que caracteriza
este valor es una aproximacin por defecto a un a ese suero. Como los mdicos no estn acostum-
ttulo real que sera interpolado en el sitio exacto brados a maniobrar ttulos a punto final, el analista
de interseccin de la lnea de valor de corte con la puede hacer una aproximacin por defecto de este
curva de dilucin. Si la prueba se repite en el trans- valor y entregar como diagnstico un ttulo discre-
curso de 2 semanas y el ttulo especfico se incre- to que le sirva al especialista para estimar, des-
menta en al menos 4 veces (diluciones seriadas pus de una segunda prueba, si hay seroconversin
dobles), entonces el mdico puede tener una cer- Este enfoque fue aplicado, en los aos noven-
teza de que el paciente est desarrollando una res- ta, en el laboratorio de diagnstico serolgico viral
puesta humoral frente a un agente infeccioso en el Instituto de Medicina Tropical Pedro Kour
responsable del cuadro clnico que presenta. a los ensayos montados en el sistema ultra micro-
El hecho de tener que realizar 4 diluciones a analtico (SUMA)42 para la titulacin de sueros (IgG
cada suero para estimar el ttulo por interpolacin especfica) contra citomegalovirus43, herpes sim-
de la curva con el valor de corte, indudablemente, ple44 y adenovirus.45 En el caso de citomegalovirus,
encarece la prueba porque consume 4 posibilida- a manera de ejemplo, las determinaciones de ttulo
des diagnsticas en la placa de ELISA. Para solu- a punto final fueron calculadas a partir de regre-
cionar este inconveniente se han realizado intentos siones lineales de curvas de dilucin, con coefi-
por hacer una estimacin del ttulo especfico de cientes de determinacin siempre mayores que
un suero por ELISA utilizando una nica dilucin.41 0,95. La curva estndar escogida para la dilucin
Este procedimiento consiste en escoger un panel de 1/40, a partir de un panel de sueros de amplio
de sueros de amplio espectro de reactividad en espectro de reaccin, demostr una regresin li-
trminos de ttulo especfico a un agente determi- neal con un coeficiente de determinacin r2 de 0,93.
nado y recalcular su ttulo por interpolacin directa Con esta curva fue posible estimar los ttulos a
en la curva de titulacin; se esta forma se calcula punto final de sueros problemas con una nica di-
lo que se ha llamado el ttulo a punto final, que lucin y compararlos con la determinacin del ttu-
no es ms que el verdadero ttulo y no la aproxi- lo por el mtodo clsico de 4 diluciones. Se encontr
 175

una correlacin estrecha entre ambas evaluacio- Mientras que la afinidad es una medicin ter-
nes caracterizadas por un coeficiente de determi- modinmica de la interaccin de antgeno y anti-
nacin rs de Spearman de 0,92, para la estimacin cuerpo medida en el equilibrio, la avidez es una
de la asociacin entre magnitudes continuas y dis- medida ms relativa de la fortaleza de la interaccin,
cretas. enriquecida por el efecto bonificador de la poli-
Estos resultados demuestran que es posible clonalidad; es una funcin de la valencia antignica,
utilizar una nica dilucin del suero, en un sistema la valencia de anticuerpo, la concentracin de am-
analtico tan sensible y demandante de habilidades bos y de la afinidad individual de los anticuerpos
tcnicas como el SUMA, para estimar los ttulos integrantes de la preparacin policlonal.47
especficos de IgG en agentes infecciosos cuyos La evaluacin de la avidez de una respuesta
patrones de respuesta inmunolgica permitan esti- humoral en respuesta a una infeccin es un evento
mar una conversin srica, como indicador diag- de crucial importancia en el seguimiento y control
nstico de infeccin en curso con la consiguiente de las infecciones, que puede decidir la estrategia
optimacin del espacio en la placa y disminucin de vacunacin si el agente infeccioso provoca una
de costos en el ensayo sin sacrificar valor diag- reaccin neutralizante potenciada por la avidez de
nstico. sus anticuerpos especficos. La avidez de una
preparacin o respuesta policlonal puede medirse
en un inmunoensayo mediante antgenos radio-
3. INMUNOENSAYOS DE COMPETENCIA
marcados,48 a travs de una agente caotrpico
como la urea o el tiocianato que provocan el des-
Evaluacin de la avidez en respuestas hu-
prendimiento de antgeno inmovilizado y su anti-
morales vacunales. Estudio de la avidez en
cuerpo especfico y determinando lo que queda en
respuestas humorales vacunales. Inmunoensayo
la fase slida;49 tambin mediante ensayos de com-
de tipo ELISA de competencia para estimar la
petencia en los cuales el antgeno marcado compi-
avidez de los anticuerpos que reconocen
te con el nativo por los anticuerpos o el antgeno
pptidos de virus de la inmunodeficiencia hu-
soluble compite con el antgeno unido a la fase s-
mana (HIV) en pacientes vacunados con gp160
lida por anticuerpos que tambin estn en la fase
recombinante. fluida.50
Con respecto al papel de la avidez de la res-
La avidez de una preparacin policlonal de puesta de anticuerpos contra el VIH y su relacin
anticuerpos por su antgeno correspondiente ha con la proteccin,51 la atencin ha sido centrada
tenido durante aos, adems de su inherente y adems en los ttulos neutralizantes naturales o
crucial importancia fisiolgica, un papel fundamen- provocados por vacunacin.52 Las respuestas de
tal en la calidad y sensibilidad de estos anticuerpos anticuerpos inducidas por la glucoprotena de la
en los ensayos diagnsticos a los que han sido des- envoltura (Env) de los lentiviruses SIV53 y de la
tinados. Por esta razn, desde su generacin en anemia infecciosa equina54 maduran lento. La
los animales de experimentacin, ha sido posible maduracin en funcin de la proteccin se define
provocar la maduracin de la respuesta para estos como el desarrollo de una avidez significativa, al-
propsitos mediante un apropiado protocolo de tos ttulos de anticuerpos neutralizantes y algn
inmu-nizacin. Aunque es posible, naturalmente, grado de actividad neutralizante cruzada. Mien-
evaluar de forma previa la avidez de estas prepa- tras que los ttulos de anticuerpos se incrementan
raciones en una prueba particular, su propia intro- durante varias semanas de la infeccin y los an-
duccin en el ensayo definitivo dir la ltima palabra ticuerpos neutralizantes lo hacen durante varios
en cuanto a sensibilidad y calidad analtica.3 En el meses, la avidez de los antisueros policlonales se in-
caso de los AcMs, como su afinidad puede encon- crementa ms lentamente y alcanzan sus mximos
trase en el rango de 105-1012 M-1, los inmunoen- valores entre 6 y 8 meses despus de la infeccin.
sayos competitivos utilizando anticuerpos con una Este incremento de la avidez es coincidente con la
Kd= 10-12 M alcanzan su ms alta sensibilidad en amplitud de la respuesta neutralizante protectora a
el rango picomolar.46 los virus heterlogos.53 Una maduracin lenta en
176

la avidez y el desarrollo de anticuerpos de neutra- resante de la puesta a punto es la seleccin de la

lizacin cruzada despus de los 8 y 12 meses, se dilucin de anticuerpo para lograr una competen-
ha observado en individuos infectados con el cia comparable entre muestras de suero. En este
VIH.55 Por el contrario la avidez de la respuesta sentido, el protocolo original de Steward47 indica
de anticuerpos en una infeccin causada por un que debe utilizarse una dilucin del suero que rinda
virus diferente a los lentivirus como el virus de la una absorbancia de 0,5 unidades y en el artculo de
hepatitis C,56 es alcanzada rpido y se manifiesta Broliden y otros se indica un rango entre 0,5 y
alta en intensidad en perodos de algunos meses e 1,0 unidades.
inclusive en algunas semanas. La prctica demostr que cuando se fij una
El protocolo inicial del inmunoensayo de avi- dilucin de los sueros mucho ms precisa a partir
dez informado en el artculo de Broliden y otros57 de valores de 1,0 0,1 unidades de absorbancia,
mostraba bastante poca robustez en trminos de se obtuvieron valores mucho ms consistentes y
la definicin del blanco que, en este tipo de ensa- reproducibles en las concentraciones molares
yo, se defina 100 % de reaccin sin competencia, inhibitorias. La interpolacin estadstica (y no gr-
sobre el cual ser necesario calcular la afinidad fica) permiti una mayor precisin en la determi-
relativa as como la determinacin de la dilucin nacin de esta concentracin, que en definitiva fue
de los sueros para ejecutar los ensayos de com- importante en el anlisis de la significacin en el
petencia. Tambin fue necesario disear un pro- incremento de la avidez. Llama la atencin el tra-
cesamiento estadstico riguroso, para llegar a tamiento lineal de la inhibicin por competencia
resultados confiables en cuanto a la afinidad rela- cuando el tratamiento sigmoidal (ecuacin de
tiva como medida de la avidez de los anticuerpos Boltzman) pudo aplicado ampliando el rango de
de los pacientes seropositivos inmunizados con anlisis pero, en realidad, el segmento lineal de la
gp160 recombinante. El inmunoensayo de compe- curva contuvo suficientes puntos de inhibicin como
tencia para estudiar la avidez se mont sobre un para ser considerado, simplificando los clculos,
diseo anterior para pptidos sintticos del lazo V3 naturalmente.
de la gp120 del VIH,58 el cual tena la caractersti- La optimizacin de este inmunoensayo de com-
ca de no necesitar bloqueo debido a la compactacin petencia para determinar la avidez, y junto a otras
del recubrimiento peptdico que impeda a los determinaciones, la funcionalidad de una respues-
anticuerpos del suero y los del conjugado su acce- ta humoral que se intenta sea protectora, demues-
so al soporte slido de la placa. tra que los parmetros de control de calidad del
EL nmero de repeticiones del blanco de com- ensayo y la robustez del tratamiento estadstico
petencia (PBS-tween en lugar de pptidos en so- pueden ser decisivos para obtener los resultados
lucin compitiendo por el pptido) fue aumentado consistentes y reproducibles que se pretendi con
a 5 en cada placa para garantizar una cifra su eleccin en el protocolo de investigacin.
estadsticamente robusta sobre la cual calcular
50 % de seal mxima. Sucedi lo mismo con la 4. CONCLUSIN
concentracin de pptido en solucin que defini
el otro extremo de la curva de competencia o se- Los inmunoensayos enzimticos de tercera ge-
al mnima, cuando el pptido unido a la fase sli- neracin determinan (detectan y[o] cuantifican)
da no tuvo oportunidad de recibir los anticuerpos analitos sin enriquecimiento o concentracin,
del suero por estar saturados de pptido en solu- purificacin o pretratamiento, procedimientos
cin. Estos 2 niveles extremos de seal son el re- que con frecuencia dificultan y encarecen a los
sultado de valores asintticos muy difciles de mtodos analticos y que son imprescindibles
estandarizar mediante promedios, sobre todo el in- para procedimientos estandarizados y recono-
ferior, cuando la seal tiene al fondo del experi- cidos como la cromatografa lquida de alta presin,
mento qu es la reaccin donde se utiliza como la cromatografa gaseosa o la espectrometra
blanco PBS-Tween en lugar de la mezcla anticuer- de masas. De forma especial en el diagnstico
pos y pptidos en competencia. Otro aspecto inte- clnico donde es necesario analizar muestras
 177

muy complejas como sangre total, suero o plas- Enzymatic immunoassays for the detection of infectious
ma, orina y heces que contienen una gran can- agents or their products: presentation of some designs
and applications
tidad de sustancias, orgnicas y biomoleculares,
los inmunoensayos representan frecuentemente
una alternativa muy deseable en cuanto a tiempo ABSTRACT

y sensibilidad. This paper assessed the impact of the immunoenzymatic assays

on the field of the immunochemistry-based analytics for the last
40 years, and on the detection of infectious agents or the products
La tendencia actual a la miniaturizacin seguir related to their presence and/or pathogenic activity. It also
siendo una importante consideracin en el diseo addressed some designs and formats of these immunoassays from
electrochemical methods of detection, assays to determine
y desarrollo de ensayos y analizadores. Los sistemas proteolytic microbial activity and their inhibitors as possible
de alto flujo de pesquisaje para el descubrimiento therapeutical targets, more sensitive direct triple antibody
de nuevas drogas y los anlisis a gran escala para systems, alternative enzymatic activity detectors, assays for
viral serology of minimal determinations to competitive assays
los estudios genticos necesitarn de estos con- for evaluation of vaccinal candidate effectiveness based on
ceptos de miniaturizacin. Existen numerosos ejem- selected peptide combinations. Finally, it provided a rapid
overview of the near future of this type of immunoassays in the
plos de ensayos y procesos analticos que han sido light of the emerging detection analytical technologies.
adaptados con xito al formato microchip y el
objetivo tener un laboratorio en un chip parece estar Key words: antigen-antibody reaction, specificity, immunoassays,
infectious agents, immunodetection.
al alcance de la mano. Los microchips fabricados
en plstico posibilitan ya la sustitucin de los mate-
riales completos en los dispositivos siliconados. Hoy
da el desarrollo de las nanotecnologas en el terreno REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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