PRCTICA 3.

BIOENSAYO DE CITOTOXICIDAD AGUDA Y CRNICA

Diana Patricia Chamorro; Allison Enriquez Marquez; Natalia Flrez Muoz; Jos Alejandro
Llanos
155001; 154938; 154940; 154949
Universidad Libre - Seccional Cali, Facultad de Ciencias de la Salud,
Programa de Medicina
Cali,Valle del Cauca, Colombia
Octubre 4 de 2017

Figura 3. Pozos de soluciones con artemias salinas.

Figura 1. Morfologa de la Artemia salina.

PREGUNTAS

1.Realice una tabla donde consigne los datos

experimentales obtenidos. Diferenciando una
columna de la otra con los siguientes parmetros:
Dosis, nmero de muertes, nmero de
sobrevivientes, muertes acumuladas,
sobrevivientes acumulados, total acumulado,
Figura 2. Esquema morfolgico de la Artemia salina. porcentaje de sobrevivientes y porcentaje de
muertes.
 TABLA 1. CITOTOXICIDAD EXTRACTO GUANBANA AMARILLA

NOTA: CADA POZO MINUTO 1 MINUTO 30 MINUTO 60

CONTIENE 10
ARTEMIAS

POZO CONCENTRACI MUERTES VIVOS MUERTES VIVOS MUERTES VIVOS

N

D1 2% 1 9 9 0 0 0

D1 2% 1 9 9 0 0 0

D1 2% 3 7 7 0 0 0

TOTAL 5 25 25 0.0 0 0

TOTAL PORCENTAJE 16.6666% 83.3333% 83.3333% 0.0% 0.0% 0.0%

D2 1% 0 10 10 0 0 0

D2 1% 3 7 7 0 0 0

D2 1% 1 9 9 0 0 0

TOTAL 4 26 26 0 0 0

TOTAL PORCENTAJE 13.3333% 86.6666% 86.6666% 0.0% 0.0% 0.0%

D3 0.5% 0 10 8 2 2 0

D3 0.5% 0 10 6 4 4 0

D3 0.5% 0 10 6 4 2 2

TOTAL 0 30 20 10 8 2

TOTAL PORCENTAJE 0.0% 100% 66.6666% 33.3333% 26.6666% 6.6666%

D4 0.25% 0 10 2 8 3 5

D4 0.25% 0 10 2 8 5 3

D4 0.25% 0 10 0 10 6 4

TOTAL 0 30 4 26 14 12

TOTAL PORCENTAJE 0.0% 100% 13.3333% 86.6666% 46.6666% 39.9999%

D5 0.1% 0 10 0 10 0 10

D5 0.1% 0 10 0 10 0 10

D5 0.1% 0 10 0 10 0 10

TOTAL 0 30 0 30 0 30

TOTAL PORCENTAJE 0.0% 100% 0.0% 100% 0.0% 100%

 TABLA 2. CITOTOXICIDAD FRMACOS

F1: N-ACETIL CISTENA MINUTO 1 MINUTO 30 MINUTO 60

F2: DIFENHIDRAMINA
CLORHIDRATO JARABE

POZO CONCENTRACIN MUERTES VIVOS MUERTES VIVOS MUERTES VIVOS

F1 1 9 1 8 8 0

F1 2% 0 10 6 4 4 0

F1 1 9 5 4 3 1

TOTAL 2 28 12 16 15 1

TOTAL PORCENTAJE 6.6666% 93.3333% 40% 53.3333% 50% 3.3333%

F2 0 10 8 2 2 0
0.25g/100mL
F2 0 10 10 0 0 0

F2 0 10 9 1 1 0

TOTAL 0 30 27 3 3 0

TOTAL PORCENTAJE 0.0% 100% 90% 10% 10% 0.0%

TABLA 3. PRUEBA CONTROL

S/S: SOLUCIN SALINA MINUTO 1 MINUTO 30 MINUTO 60

POZO CONCENTRACIN MUERTES VIVOS MUERTES VIVOS MUERTES VIVOS

S/S 0 10 0 10 0 10
30%
S/S 0 10 0 10 0 10

S/S 0 10 0 10 0 10

TOTAL 0 10 0 10 0 10

TOTAL PORCENTAJE 0.0% 100% 0.0% 100% 0.0% 100%

 TABLA 4. TABLA DE REED MUENCH DE GUANBANA AMARILLA

DOSIS Nmero Nmero de Muertes Sobreviviente Total Porcentaje de Porcentaje de

de sobrevivientes Acumulada s Acumulados Acumulado Sobrevivientes Muertes
Muertes s

2% 30 0 30 44 74 0.0% 100%

1% 30 0 60 44 104 0.0% 100%

0.5% 28 2 88 44 132 6.6666% 93.3333%

0.25% 18 12 106 42 148 40% 60%

0.1% 0 30 106 30 136 100% 0.0%

TABLA 5. CITOTOXICIDAD DEL FRMACO

1 MIN 30 MIN 60 MIN

Solucin Salina 0, 0% 0,0% 0.0%

(CONTROL)

N-acetilcisteina 6,6666% 40% 50%

Difenhidramina 0,0% 90% 10%

clorhidrato

Grfica 1. Citotoxicidad del frmaco

2.Anexe impreso, en formato pdf y reciente, una publicacin referente al mtodo de Reed Muench.
Ver documento anexo.
3.Realice una curva donde representa las muertes acumuladas y otra curva en donde represente los
sobrevivientes acumulados en un mismo grfico.

TABLA 6. ACUMULADOS - GUANBANA AMARILLA.

CONCENTRACIN % MUERTES ACUMULADAS % SOBREVIVIENTES

DE LA DOSIS ACUMULADAS

0.1% 0.0% 100%

0.25% 60% 40%

0.5% 93.3333% 6.6666%

1% 100% 0.0%

2% 100% 0.0%

Grfica 2. Citotoxicidad de la guanbana amarilla.

0.3315 - 1 = -0.6685
3.1 Determine el DL50
AntiLog ( -0.6685) = 10-0.6685 = 0.2145
DL50 terico
50% 0
60% 0 = 0.8333 DL50 = 0.2145 mg/kg

Log 0.25
= 0.3979 DL50 Experimental
0.1
0.22 mg/kg aproximadamente
0.8333 x 0.3979 = 0.3315
3.2 Qu puede analizar y concluir acerca de la
prueba realizada?Qu concluye acerca de la
Log 0.1 = -1 DL50?
 En cuanto a la prueba realizada podemos concluir
que en los pozos en los que se utiliz la guanbana
Porcentaje de error amarilla registrada en la tabla 1 se pudo evidenciar
0.22 0.2145
que en la exposicin a las dosis de 0.10%,0.25% y
% error = 0.2145 x 100 0.5% no se presentaron muertes en el minuto 1, pero
que al aumentar la dosis al 1% y 2% empiezan a
0.0055
% error = 0.2145 x 100 haber muertes en el primer minuto. Despus de 30
minutos para las dosis de 1% y 2% todas las artemias
% error = 0.02564103 x 100 que quedaban con vida, en esta dosis murieron,
contrario a lo sucedido en las concentraciones
% error = 2.5641% iniciales, donde algunas quedaron con vida,
exceptuando la dosis de 0.1% para la cual al final de
la prueba todas las Artemias sobrevivieron. Con lo
La DL50 es una cifra que determina la toxicidad de anteriormente dicho, se puede concluir que a mayor
un veneno o sustancia, es decir, es la dosis letal para dosis y exposicin, las muertes van a ser mayores y
provocar la muerte a un 50% de un conjunto de por ende los sobrevivientes menores, cuya razn de
individuos estudiados. citotoxicidad est explicado por su principio activo,
Acetogeninas anonceas, la cual desactiva la
A partir de la DL50 terica que fue de 0.2145 mg/kg habilidad de una clula a generar ATP mediante una
y en comparacin a la experimental 0.22 mg/kg, se ruta oxidativa, obligando finalmente a una clula a
puede apreciar que el porcentaje de error fue de un apoptosis o necrosis, explicado ms ampliamente en
2.5641%, lo que representa un nivel de confianza del el anlisis, exceptuando la dosis de 0.1, en la cual la
96%, por tanto se concluye que la dosis de extracto toxicidad no fue suficiente para causar su muerte.
de Guanbana Amarilla que se necesita para provocar
la muerte al 50% de la poblacin de Artemia Salina De acuerdo a la grfica No. 1, podemos decir que el
se encuentra entre el rango de la DL50 terica y frmaco Difenhidramina clorhidrato es ms txico
experimental. que el N-acetilcistena, puesto que el nmero de
muertes por unidad de tiempo a la misma
Esto es algo que no puede extrapolarse al 100% en el concentracin es mayor
ser humano, por la complejidad nuestro sistema
inmunitario y otro aspectos, pero al menos nos En cuanto al DL50, ste fue una prueba fundamental
ofrecen una visin fiable de la toxicidad de cada una para medir la dosis necesaria para causar la muerte al
de las sustancias que se emplean. 50% de las Artemias salinas y poder usarla como
parmetro de fidelidad de dicha prueba comparndola
La interpretacin de esta cifra es sencilla, si a una con nuestro valor experimental y de este modo poder
poblacin de artemia salina se le aplica 0.2145 mg interpretar y graficar el Mtodo de Reed-Muench
por cada kilogramo de sta, se espera que muera el para el porcentaje acumulado de nauplii
50% de la poblacin. sobrevivientes y muertos. Adems de que nos sirve
para extrapolar este tipo de prueba a la evaluacin de
toxicidad de medicamentos o extractos medicina.
ANALISIS

Grfica 1. y tracto respiratorio) con considerable accin

anticolinrgica y sedante. Se utiliza en algunos
En la grfica 1 de Citotoxicidad de frmacos, vemos somnferos y medicamentos para la alergia. (4)
que se utilizaron 2 jarabes, el N-acetilcistena y el En la grfica No. 1 observamos que al transcurrir un
Difenhidramina clorhidrato, pero adems se utiliz minuto de adicionar las Artemias salinas en el pozo
una sustancia control, la cual es la solucin salina; con el frmaco antes mencionado no se registra
sta se considera nuestra sustancia control puesto que ninguna muerte (0,0%).
el microorganismo evaluado fue la Artemia salina, la
cual como su nombre lo indica sobrevive en medio Despus de 30 minutos tenemos que han muerto el
salino, y por tanto, se encuentra ampliamente en agua 90% de las artemisas salinas y a los 60 minutos el
salada. De esta manera para verificar la veracidad de 10% restante. Esto es porque la difenhidramina
la prueba, se necesit de esta sustancia para clorhidrato tiene un efecto sobre el Sistema Nervioso
comprobar que la Artemia se encontraba en un buen Central (SNC), principalmente el Sistema Nervioso
estado y as no sesgar los resultados al exponer este autnomo (SNA) puede llegar a producir dificultad
microorganismo a un frmaco en el cual su en la movilidad, hasta tal punto que no puedan
supervivencia o muerte no dependiera directamente moverse y terminan muriendo. En este caso las
de la citotoxicidad de este. De acuerdo a la grfica no Artemias salinas tienen un Sistema Nervioso poco
se presentaron muertes de las larvas en ninguno de desarrollado y esto puede aumentar la posibilidad de
los 3 tiempos expuestos a la solucin salina, que los efectos sobre este sean mucho ms mortales,
comprobando as la no existencia de sesgos. pues cualquier dao, por pequeo que sea, tendr
repercusiones fisiolgicas ms grandes. De la misma
El frmaco N-acetilcistena acta como mucoltico, manera una sobredosis con este medicamento puede
secretoltico y fluidificante de las secreciones afectar el corazn dorsal de estos animales y llevarlos
mucopurulentas de las vas respiratorias hacindolas a tener arritmias, ataque cardaco, coma y muerte. (5)
menos viscosas y facilitando su expectoracin. El
moco segregado por las membranas mucosas est De acuerdo a los resultados evidenciados, es posible
compuesto por una mezcla de glicoprotenas y concluir que mientras ms exposicin haya al
proteoglicanos. (1) frmaco el nmero de muertes aumenta, as como
tambin que entre mayor sea la concentracin, mayor
En la grfica 1 podemos ver que al minuto 1 durante nmero de muertes hay por unidad de tiempo.
la exposicin a N-acetilcistena se presentan el
6.6666% de las muertes, esto debido a que la Grafica 2.
Artemia salina en su composicin es rica en protenas
(nauplios 50-60%; adultos 40-50%) (2) y como este Annona Muricata es el nombre cientfico que se le da
frmaco induce la lisis del moco, a su vez promueve a la planta de la que se tom el extracto, conocida
la lisis de las protenas, protenas tambin presentes tambin como Guanbana Amarilla. Este rbol es
en la Artemia salina. A los 30 min se presentaron el cultivado en muchos pases por sus frutos
40% de las muertes, el porcentaje de muertes comestibles, los cuales tienen cierto grado de
aument ya que las Arteminas estuvieron por ms toxicidad, el cual evaluamos en el bioensayo y cuyo
tiempo en contacto con el frmaco y por tanto, registro lo podemos apreciar en la tabla No. 1.
tambin la probabilidad de ser lisada. Alrededor de 1
hora, muere el 50%, es decir que al final solo queda 1 Dentro de sus compuestos se encuentran principios
Artemia viva. Adems del componente mucolitico activos como las Acetogeninas anonceas, que son
del frmaco, tambin cuenta con los siguientes sustancias cerosas que resultan de la combinacin de
excipientes: manitol, sucralosa y esencia de cidos grasos de cadena larga (C32 C34) con una
frambuesa, los cuales son edulcorantes y no tienen unidad de 2-propanol en el carbono 2 para formar
cloruro de sodio, necesario para su supervivencia. (3) una lactonaterminal. Esta sustancia bloquea el
complejo I, que es responsable de convertir NADH a
El frmaco Difenhidramina clorhidrato es un NAD+, y crea la acumulacin de protones a travs de
antihistamnico H1 (compite con histamina en los la membrana interna mitocondrial. Esta desactiva la
receptores transmembranales H1 de las clulas habilidad de una clula a generar ATP mediante una
efectoras en tracto gastrointestinal, vasos sanguneos ruta oxidativa, obligando finalmente a una clula a
apoptosis o necrosis. Tambin, es una neurotoxina, En esta grfica podemos apreciar que a una
sustancias qumicas exgenas neurolgicamente concentracin de 0.10% el 100% de las Artemias, es
dainas que pueden causar efectos adversos en la decir las 10 Artemias de cada pozo, (3)
funcin tanto del tejido nervioso en desarrollo como sobrevivieron, lo que significa que sta concentracin
en el maduro. Este principio se aplica a la Artemia no fue suficiente para causar su muerte; sin embargo,
salina. (6) a pesar de que dicha concentracin no result letal, se
evidenci el dao por toxicidad puesto que las
La prueba de citotoxicidad evala teniendo en cuenta Artemias disminuyeron notablemente su movimiento
el tiempo, tanto aguda como crnica. Por lo general habitual, el cual es constante en condiciones
se refiere a aguda cuando hablamos de horas y normales como se vio evidenci en la prueba control,
crnica cuando hablamos de das, sin embargo, por lo que indica que el hecho de que no hayan muerto
cuestiones del curso estos tiempos fueron reducidos a no quiere decir que la dosis no haya sido txica, sino
1 minuto, 30 minutos y 1 hora. La concentracin o que no estaba en la concentracin suficiente como
dosis letal letal 50 (CL DL50) a travs del Mtodo para matarlas en el tiempo del experimento. El dao
de Reed Muench es una prueba en la que se utilizan mencionado de la movilidad puede deberse a dao
varias concentraciones, en nuestra prctica estas relacionado a los cordones nerviosos laterales que
fueron de 0.10%, 0.25%, 0.50%, 1% y 2% con el fin garantizan la movilidad de los toracpodos (ver
de determinar la dosis nociva para el 50% de la figura 2) y a la reduccin de los niveles de ATP a
poblacin. El valor del DL50 terico en nuestra causa del dao mitocondrial.
prctica fue de 0.2145%, lo que quiere decir que a
esta dosis el 50% de las Artemias se moran. Por otro Conforme la concentracin de la guanbana amarilla
lado, el DL experimental, donde se intersectan el aumenta, tambin lo hace el porcentaje de muertes,
porcentaje de sobrevida y el porcentaje de muerte en puesto que al 0.25% el 40% de las Artemias
la grfica fue de 0.22% aproximadamente, siendo murieron. Al 0.50% de la dosis aproximadamente el
este un valor muy cercano al DL terico y 95% de las Artemias murieron y al 1% la totalidad de
comprobando as la fidelidad de la prueba. las Artemias, es decir, el 100% se encontraban
muertas y por lo tanto a una dosis de 2% stas ya
estaban muertas.

BIBLIOGRAFA

1. Vademecum V. Acetilcistena [Internet].

Vademecum.es - Su fuente de conocimiento
farmacolgico. Vidal Vademecum; 2016. Available
from:
https://www.vademecum.es/principios-activos-acetilc
isteina-r05cb01
2.ARTEMIA SALINA. Available from:
http://www.andresroca.com/fotosdiscos/informacion/
artemia_salina.htm
3.GADOR S.A. Antusel, N-acetilcistena. [Internet].
2016. Avialable from:
http://www.gador.com.ar/wp-content/uploads/2017/0
4/G00175100-00-ANTUSEL.pdf
4.Pediamecum. Difenhidramina. CM comit de
medicamentos. [Internet]. 2016. Avialable from:
http://pediamecum.es/wp-content/farmacos/Difenhidr
amina.pdf
5.Antihistamnicos [Internet]. Antihistamnicos.
Available from:
https://www.antihistaminico.com/difen
6.Annona muricata [Internet]. Wikipedia. Wikimedia
Foundation; 2017. Available from:
https://es.wikipedia.org/wiki/Annon