LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA

PRESENTADO A: TUTORA LADY ESPINOSA

PRESENTADO POR:

TITO MONTENEGRO C.C 1.070.959.555

NATALIA COLINA C.C 1.116.235.821
NICOLE BONILLA C.C 1.018.408,499
MARIA DEL PLAR PEREZ C.C. 1055312585
KAREN ANDREA FORERO CARDENAS C.C 1105684340

TUTOR VIRTUAL: FEDRA LORENA ORTIZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

CEAD JOS ACEVEDO Y GMEZ
ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGA E INGENIERA
QUMICA E INGENIERA DE ALIMENOS
BIOTECNOLOGA
BOGOTA, 2016

PRACTICA No. 1
 DETERMINACION DE LA CURVA DE CRECIMIENTO E ORGANISMOS

UNICELULARES

OBJETIVO GENERAL

Realizar la curva de crecimiento de organismos unicelulares (bacterias y levaduras),

determinando los parmetros principales que la caracterizan.

RESUMEN

El crecimiento de microorganismos se produce muy rpidamente y una de sus limitaciones

es el alimento con que se nutre para poder desarrollarse, haremos el cultivo de Escherichia

Coli en varios sustratos, cambiando las concentraciones, para observar el comportamiento

de su crecimiento, dependiendo de la variacin de las concentraciones de sacarosa, glucosa

y fructosa, usando la absorbancia como parmetro de medida de la poblacin microbiana

que existe en un determinado tiempo.

INTRODUCCION

En el cultivo de microorganismos en condiciones artificiales, es muy empleado el cultivo

batch, discontinuo o en lote. Generalmente se trata de un cultivo en medio lquido, aireado

o esttico y a temperatura constante, y en el cual se parte de una pequea poblacin inicial

o inoculo. En este no se adiciona medio fresco ni se extrae material exhausto, por lo cual

todos los parmetros varan con el tiempo, es decir, es un proceso en estado transigente.

Bajo estas condiciones, si determinamos el comportamiento de una poblacin de

organismos unicelulares en funcin del tiempo (log del # de clulas o de viables o de

absorbancia vs tiempo) podremos al menos observar cuatro etapas o estadios fisiolgicos

conocidos en su conjunto como curva de crecimiento.

Existen muchos mtodos para la medicin del crecimiento. Entre los ms utilizados se
encuentran: recuento total de clulas, conteo de viables, peso seco y turbidimetra. Este

ltimo es el ms empleado para organismos unicelulares por la rapidez y facilidad con que

se logran los resultados, midiendo la densidad del cultivo a medida que este crece. Para ello

se utilizan los fotocolormetros o espectrofotmetro.

El aspecto de la curva de crecimiento vara de acuerdo con las condiciones del cultivo, el

medio empleado y caractersticas del inculo (edad del cultivo y medio de donde

proceda) entre otros aspectos.

JUSTIFICACION

Esta prctica est desarrollada para que el estudiante conozca los diferentes mtodos de

cuantificacin de microorganismos los cuales permiten establecer la poblacin total de

microorganismos existentes, tienen la ventaja de ser rpidos aunque no es posible

diferenciar a las clulas vivas de las muertas. Entre estos mtodos tenemos la turbidimetra

y el conteo de clulas.

MARCO TERICO

CRECIMIENTO MICROBIANO

El crecimiento microbiano est definido como el aumento armnico e irreversible de masa

y estructura. Esto puede estar acompaado o no de la divisin celular, ya que sta no es un

obligatorio requerimiento.

En el cultivo de microorganismos en condiciones artificiales, es muy empleado el cultivo

batch, discontinuo o en lote. Generalmente se trata de un cultivo en medio lquido, aireado

o esttico y a temperatura constante, y en el cual se parte de una pequea poblacin inicial

o inoculo. En este no se adiciona medio fresco ni se extrae material exhausto, por lo cual

todos los parmetros varan con el tiempo, es decir, es un proceso en estado transigente.

Bajo estas condiciones, si determinamos el comportamiento de una poblacin de

organismos unicelulares en funcin del tiempo (log del # de clulas o de viables o de

absorbancia vs tiempo) podremos al menos observar cuatro etapas o estadios fisiolgicos

conocidos en su conjunto como curva de crecimiento.

Fases del crecimiento microbiano

El crecimiento de un cultivo microbiano se divide en tres etapas claramente diferenciables.

? Fase de latencia: es el periodo de tiempo durante el inoculo se adapta a la

condiciones de medio fresco sobre la que se ha sembrado, realizando una ajuste

metablico.

? Fase de crecimiento exponencial: en esta fase de produce un crecimiento

balanceado no restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de

10). El tiempo de generacin (g) es caracterstico para cada especie; este depende

del medio, temperatura, pH, osmolaridad etc.

? Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento

se hace nulo (=0), pero an existe crecimiento. Lo que ocurre es que el

crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares. En este periodo se agotan

nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho, adems del pH de medio

empieza a hacerse inadecuado.

? Fase de muerte exponencial: se da muerte o lisis masiva debido al agotamiento de

reservas de energa.

Observemos en la presente grfica:

Fases de crecimiento microbiano.

 FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTA EL CRECIMIENTO

MICROBIANO

? Temperatura

La elevacin de la temperatura incrementa la velocidad de una reaccin catalizada por

enzimas. Al principio la velocidad de reaccin aumenta cuando la temperatura se eleva

debido al incremento de la energa cintica de la energa de las molculas reactantes.

Sin embargo, al final, la energa cintica de la enzima excede a la barrera energtica para

romper los enlaces dbiles de hidrogeno que conservan su estructura secundaria y terciaria.

A esta temperatura predomina la desnaturalizacin con prdida precipitada de la actividad

cataltica. Por tanto las enzimas muestran una temperatura ptima de accin. Los lmites de

actividad para la mayor parte de las enzimas tiene lugar entre los 10C y 50C; la

temperatura ptima para las enzimas en el cuerpo se hall alrededor de 37C.

El factor por el cual un proceso biolgico aumenta para un incremento de temperatura de

10C es el coeficiente de temperatura o Q10. El Q10 para la mayor parte de las enzimas

vara entre 1.5 y 3.

 ? pH

La intensidad mxima de la actividad de la enzima, ocurre en el pH ptimo, con rpida

disminucin de la actividad a cada lado de este valor de pH. La actividad ptima

generalmente se observa entre los valores de 5 y 9.

El pH ptimo de una enzima puede guardar relacin con cierta carga elctrica de la

superficie, o con condiciones ptimas para la fijacin de la enzima a su sustrato. Cuando

hay un exceso de iones hidrogeno, las enzimas los unen a sus molculas y ante un dficit

los ceden.

Este cambio tiene una doble consecuencia sobre la molcula. Como todas las protenas, las

enzimas desempean su funcin por los residuos de aminocidos; algunos confieren a su

superficie una distribucin de cargas elctricas.

Cuando la concentracin de iones hidrogeno es muy baja en comparacin con la

concentracin optima, la molcula los cede desapareciendo cargas positivas o apareciendo

cargas negativas en su superficie. Ante una concentracin elevada de iones hidrogeno,

algunos se fijan a la molcula desapareciendo cargas (-) o poniendo cargas (+) que no

existan.

As mismo al cambiar las cargas elctricas en los residuos de aminocidos se alteran los

lazos de unin dentro de la molcula variando su acomodo tridimensional con recuperacin

de la actividad de la enzima.

? Nutrientes

Los microorganismos que son patgenos son considerador hetertrofos, esto significa que

al igual que un ser humano ellos requieren de, Carbono, Nitrgeno, Azufre y micro

elementos.

MODELOS MATEMATICOS
Para muchos propsitos en biotecnologa microbiana es necesario conocer el nmero de

generaciones, la poblacin de bacterias con el fin de estimar el estado fisiolgico de la

poblacin microbiana y establecer relaciones con los sustratos del medio de cultivo o los

productos de la biosntesis.

En organismos unicelulares la clula se divide por fisin binaria dando lugar a dos clulas

hijas, cada una de las cuales se divide nuevamente produciendo dos clulas nuevas por lo

que cada periodo e divisin la poblacin se duplica. Esta multiplicacin representa una

progresin geomtrica en la cual hay una relacin directa entre el nmero de clulas

iniciales y la cantidad de clulas en otro tiempo determinado. La expresin matemtica que

representa esta relacin es:

N= nmero final de clulas

No = numero inicial de clulas

n = nmero de generaciones.

Para explicar la anterior ecuacin en trminos de n se aplica una transformacin logartmica

cuyo resultado es:

El tiempo de generacin (G) de la poblacin es:

t
G=
n
t = horas o minutos de crecimiento exponencial
Una expresin alternativa del crecimiento se deriva de asumir que la velocidad de

incremento en la masa celular o densidad celular (dx/dt) en un tiempo (t) es proporcional a

la densidad celular en dicho tiempo. Por consiguiente:

dx
= x
dt

De donde: x = nmero de clulas o algn componente (protena) constante de velocidad de

crecimiento instantneo

Integrando se obtiene: InX 1 = InXo + t

Tomando el antilogaritmo a cada lado se obtiene X 1 = Xoe t

Considerando que despus de un tiempo la poblacin se duplica (td) entonces: X1=2Xo por

tanto, la duplicacin de la poblacin celular se puede expresar as: X1/Xo=2 reordenando

los valores en la penltima ecuacin se obtiene:

Ln2
=
td

Entonces: = 0.693/td

PROCEDIMIENTOS PARA MEDIR CRECIMIENTOS MICROBIANOS

Existen muchos mtodos para la medicin del crecimiento. Entre los ms utilizados se

encuentran: recuento total de clulas, conteo de viables, peso seco y turbidimetra. Este

ltimo es el ms empleado para organismos unicelulares por la rapidez y facilidad con que

se logran los resultados, midiendo la densidad del cultivo a medida que este crece. Para ello

se utilizan los fotocolormetros o espectrofotmetro

ESPECTROFOTOMETRA

La Espectrofotometra como mtodo de anlisis para la cuantificacin de almidn para

poder determinar cul microorganismos es el ms eficiente en la produccin de alfa amilasa

en este experimento. Este mtodo de anlisis ptico es el ms utilizado en las

investigaciones qumicas y biolgicas, cuyo espectrofotmetro es un instrumento que

permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una

cantidad desconocida de soluto y una que contiene una cantidad conocida de la misma.

Igualmente este se apoya en el la Ley de Beer Lambert, donde afirma que la cantidad de

luz absorbida por un cuerpo depende la concentracin en la solucin y la distancia

recorrida por la luz.

El principio de la espectrofotometra consiste en que un haz de luz atraviesa una sustancia,

parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser

absorbida. Entonces, las sustancias absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca

que incide sobre ellas y solo se puede ver aquellas longitudes de onda no absorbidas. La

espectrofotometra visible se usa con radiaciones del espectro electromagntico, en el rango

de la luz visible de 400 a 800 nm. La absorcin y la trasmitancia de la luz dependen de la

cantidad de concentracin de la sustancia y la distancia recorrida

Trasmitancia y Absorcin de las Radiaciones

Al hacer pasar una cantidad de fotones o de radiaciones, por las leyes anteriores, hay

prdida que se expresa:

= !!"#

It es la intensidad de la luz que sale de la cubeta y que a llegar a la celda fotoelctrica.

Io es la intensidad con la que sale al atravesar la celda

T es la Trasmitancia

La ecuacin simplificada de la Ley de Beer Lambert

= . .
Comprende a la mnima ecuacin que relaciona la concentracin (c), la absorbancia de la

muestra (A), el espesor recorrido por la radiacin (d) y el factor de calibracin ().

Tambin, absorbancia es:

1
= log

Lo que es igual a:

= 2

ESCALA DE MCFARLAND

La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrn,

generalmente se suele usar el 0,5 Mc Farland, para esto se toma una muestra de nuestra

bacteria y la inoculamos en un tubo con solucin salina, en el momento en que se produzca

un poco de turbidez ya estamos en el 0,5.

La finalidad, es establecer una relacin entre una precipitacin qumica y una suspensin

bacteriana. Creamos 10 estndares y por espectrofotometra, creamos una recta patrn, de

forma que vamos a poder detectar la concentracin de nuestras diluciones bacterianas, se

basa en la capacidad de precipitacin del cloruro de bario en presencia de cido sulfrico.

Los estndares de turbidez de McFarland se usan como referencia en suspensiones

bacteriolgicas para saber que el nmero de bacterias por mililitro, o ms bien en UFC

segn una escala que va de 0.5 a 10. Estos estndares son creados al mezclar soluciones de

cloruro de bario al 1% con cido sulfrico al 1% en volmenes especficos,

- para asegurar la densidad correcta se puede controlar usando espectofotometros.

 - Los estndares pueden ser visualmente comparados con suspensiones de bacterias

en salina estril o en caldos. Si la suspensin es demasiado turbia, puede aadirse

diluyente, y si no es lo suficiente turbia, se puede agregar ms bacterias.

- La ventaja es que no es necesario incubar ni usar equipo especial para estimar el

nmero de bacterias.

- La desventaja de este mtodo es que no discrimina a las bacterias vivas de las

muertas en la solucin, por lo que se puede sobreestimar la poblacin de bacterias.

Casos especficos en los que se usa es en el de antibiogramas o pruebas de

sensibilidad, donde es necesario para estandarizar el mtodo y se eviten falsos

positivos o negativos.

PROCEDIMIENTO

Tomar al pie de un mechero 3 mL

de inoculo en un frasco con tapa y
completar a 100 mL con el medio Llevar a bao mara a 37 C
escogido

Tomar un blanco sin inoculo y luego

una muestra de 2 mL, en un tubo Guardar cada muestra en la nevera
en una gradilla para realizar al nal
de ensayo cada media hora a parCr
una serie de medidas.
de la segunda hora

Tomar registro de la absorbancia

de cada tubo
RESULTADOS

Para la el anlisis se utilizaron 10ml de un cultivo puro de Escherichia coli a una

concentracin de 0,5 en la escala de MacFarland 1.5 x 10! ufc/ml.

10 ml E. Coli 90 ml= 100 ml total de muestra.

Lectura de la absorbancia se realiz a una longitud de onda de 625 nm con

espectrofotmetro los medios usados son:

sacarosa

Fructosa

Glucosa

ABSORBANCIA
MEDIO (s)
FRUCTOSA SACAROSA GLUCOSA
TIEMPO
0,5 0,704 0,519 0,3228
1 0,658 0,5073 0,3529
1,5 0,648 0,5057 0,4868
2 0,69 0,5107 0,3597
2,5 0,558 0,5103 0,4959
3 0,63 0,5112 0,4761
3,5 0,615 0,5073 0,3385
Tabla 1. Resultados Absorbancias

Fuente: Laboratorio Biotecnologa

Los datos obtenidos corresponden a la absorbancia con relacin al tiempo, por lo que

debemos realizar la conversin para obtener concentracin de biomasa seca con respecto al

tiempo.

Utilizaremos la ecuacin de biomasa:

= . + . (Ec. 1)

Donde: y= a la Abs obtenida a 625 nm y x=concentracin/biomasa seca (mg/ml), la cual

relacionaremos con el mismo tiempo que se trabajo.

 ,
=
,

Utilizando la anterior ecuacin se obtienen los siguientes resultados en la Tabla 2.

CONCENTRACION BIOMASA SECA

(mg/ml)
MEDIO (h)
SACAROSA FRUCTOSA GLUCOSA
TIEMPO
0,5 3,65968586 2,69109948 1,66387435
1 3,41884817 2,62984293 1,82146597
1,5 3,36649215 2,62146597 2,52251309
2 3,58638743 2,64764398 1,85706806
2,5 2,89528796 2,64554974 2,57015707
3 3,27225131 2,65026178 2,46649215
3,5 3,19371728 2,62984293 1,7460733
Tabla 2. Clculo de Concentracin/biomasa seca

Fuente: Clculo con la ecuacin 1

Eliminacin de puntos atpicos

Un punto atpico; es un punto que se desva de la curva del anlisis realizado por esta razn

los puntos atpicos de las absorbancias no sern tenidos en cuenta para determinar la

concentracin de biomasa

Los puntos sealados en rojo no se tuvieron en cuenta ya que no permite observar las fases

de: adaptacin, exponencial, latencia y muerte del microrganismo Escherichia Coli (E

Coli)

Grfica 1 Crecimiento en el medio Sacarosa

 SACAROSA
y = -0,0016x + 0,5134
0,6 R = 0,15934
Absorbancia

0,4

0,2 Serie1

Lineal (Serie1)
0
0 1 2 3 4
Tiempo

Grfica 2 Crecimiento en el medio Fructosa

FRUCTOSA y = -0,0234x + 0,7023

R = 0,62381
0,8
Absorbancia

0,6
0,4
Serie1
0,2
Lineal (Serie1)
0
0 1 2 3 4
Tiempo

Grfica 3 Crecimiento en el medio Glucosa

GLUCOSA y = 0,0216x + 0,3689

R = 0,09734

0,6
Absorbancia

0,4

0,2 Serie1

Lineal (Serie1)
0
0 1 2 3 4
Tiempo

Grafica 4 Comparacin entre los diferentes medios

 COMPARACION DE BIOMASA
0,8
Absorbancia

0,6

0,4 Serie2

0,2 Serie3

Serie1
0
0 1 2 3 4
Tiempo

ANLISIS DE LOS RESULTADOS

Teniendo en cuenta la forma de la lnea expresada en las grficas obtenidas se determinar

la fase de adaptacin, exponencial, estacionaria y muerte celular en cada uno de los

sustratos trabajados.

Desde el tiempo cero hasta la segunda hora se muestra que el microorganismo se encuentra

en fase de adaptacin (en esta primera fase de la grfica en la primera hora se observa un

punto atpico en relacin con el orden de la grfica), lo que tom 2 horas. Posteriormente,

desde la hora 2 hasta la hora 4 media el microorganismo se encuentra en crecimiento, en

esta grafica no se puede observar la fase exponencial segn el tiempo determinado para la

toma de muestras.

La fase de adaptacin del microorganismo tiene un tiempo de duracin de dos horas y

media que comprende desde la hora 0 hasta 2.5 (en esta parte de la grfica no se realiza

toma de muestra en la segunda hora ya que la muestra tomada en muy poca y el equipo no

alcanza a leerla), la fase de crecimiento exponencial tiene una duracin de una hora y media

que comprende desde el tiempo 2.5 hasta el 4 , el a partir de la hora 4 se identifica que el
microorganismo se encuentra en fase estacionaria y el tiempo que utiliz para este estadio

fue de 30 minutos segn el tiempo establecido para la toma de muestras.

Podemos observar que el crecimiento de microorganismos no se dio como se esperaba de

manera exponencial, por el contrario se observa que durante el periodo de incubacin los

microorganismos se mantuvieron en periodo de latencia y solo durante la hora 2,5 a 4 se

observa un leve crecimiento. El bajo crecimiento puede ser producto de distintos factores

como errores en la siembra, contaminacin del medio, errores en la preparacin de los

medios de cultivo, errores en la medicin de espectofotometria; ya que se utilizaron celdas

usadas que tenan rayones los cuales pudieron afectar las lecturas (lo ideal en estas

mediciones es hacerlo con celdas nuevas para evitar los errores en las mediciones.)

Se observa que el rendimiento es mayor en el medio de cultivo Glucosa esto puede deberse

a que la E-coli asimila mejor este azcar, para confirmarlo sera necesario realizar otras

pruebas confirmativas.

CONCLUSIONES

En general se observan curvas de crecimiento ascendentes lo que nos est indicando

que a medida que transcurre el tiempo se va aumentando la cantidad de biomasa en el

sustrato que es consecuencia del crecimiento de la poblacin microbiana.

Para obtener un mejor crecimiento se bebe incubar las muestras por un tiempo ms

largo para as observar mejor el crecimiento exponencial de la bacteria

 Se debera llegar a un punto en el cual la concentracin de biomasa se hace constante en

el que nos indicara que se ha llegado a la mxima reproduccin del microorganismo y

al total consumo de los nutrientes disponibles en el medio de cultivo.

Se evidencias errores en toma de muestras, mostrando puntos atpicos en las grficas se

podra decir que en el momento de realizada la muestra no se agito el frasco, lo cual

solo tomo la parte superior del contenido.

El crecimiento de los microorganismos no solo depende del tiempo de incubacin; sino

tambin de las condiciones en que se encuentren, las concentraciones de los medios, el

pH, la temperatura, para obtener un crecimiento exponencial de la bacteria.

ANEXOS

BIBLIOGRAFA

Universidad de Bayamn. Crecimiento bacteriano. Recuperado de

http://facultad.bayamon.inter.edu/yserrano/Crecimiento%20Microbiano.htm

Universidad de Granada. Diversidad microbiana y Taxonoma . Recuperado de:

http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&view=articl

e&id=182&Itemid=225
 Brock, Madigan, Martinko, Parker. (2004). Biologa de los microorganismos, 10

edicin, Prentice Hall.

Prescott, Harley, Klein (2004). Microbiologa, McGraw-Hill Interamericana

Rodrguez, Olga. Hanssen, Henry. (2007). Obtencin de dextrano y fructosa,

utilizando residuos agroindustriales con la cepa Leuconostoc mesenteroides NRRL

B512-F. Revista EIA .Nmero 7, p. 159-172

Kimberley A. Elmer W. Peter Doolin. Estndar de McFarland, Wikipedia,

https://es.wikipedia.org/wiki/Est%C3%A1ndar_de_McFarland
 PRACTICA No. 2

CUANTIFICACIN DE AZUCARES - METABOLISMO MICROBIANO

OBJETIVO GENERAL

Determinar la concentracin de azcares reductores y azcar total en los medios de

cultivo glucosa y sacarosa con el microorganismo E. colli.

INTRODUCCION

Para construir un medio de cultivo para un organismo o grupo dado, deben conocerse las

necesidades nutritivas de los mismos. Las clulas microbianas tienen entre un 80 % a 90 %

de su peso en agua, por lo que ste es un nutriente principal. El peso seco restante contiene

una serie de elementos en diversas proporciones, de los cuales los principales son: H, O, C,

N, P y

Los microorganismos consumen diferentes tipos de sustratos, pero poseen preferencia por

un tipo particular de sustrato y algunos resultan no consumibles para algunas cepas de una

especie en particular. Cuando dos o ms sustratos estn presentes en el medio de cultivo,

los microorganismos no los consumen por igual, sino que consumen preferencialmente uno

de ellos hasta agotarlo. Solo en este punto inician el consumo del siguiente sustrato

preferido. Este fenmeno se conoce como diauxia.

Esa preferencia por un sustrato en particular es diferente para cada una de las cepas de un

organismo, y puede ser medida como la variacin en la velocidad de crecimiento, consumo

de sustrato o generacin de producto.

JUSTIFICACION

En esta prctica podemos observar el comportamiento de la e. coli en los diferentes

sustratos y determinar la velocidad, el consumo de los microrganismos y cual presenta

mayor eficiencia segn los resultados de la misma.

MARCO TEORICO

METABOLISMOS MICROBIANO

Se denomina metabolismo a la suma de las transformaciones qumicas que ocurren en la

clula. Puede dividirse en dos categoras:

Rutas generadores de energa o degradativas (catabolismo)

Rutas consumidoras de energa o biosintticas (anabolismo)

La funcin qumica esencial del metabolismo productor de energa es la de sintetizar

molculas orgnicas que poseen un alto nivel de energa potencial en forma de enlaces ricos

de energa, la que luego es acoplada por medio de reacciones a las vas anablicas

En el esquema presentado a continuacin se visualiza la asociacin entre estos procesos y el

rol que desempea el ATP como agente acoplador entre la sntesis y el catabolismo.
Grafica 5. Papel del ATP acoplando el catabolismo y la fotosntesis a la biosntesis.

La energa de los enlaces fosfato del ATP intervienen en diferentes etapas del proceso

biosinttico. Participa en la entrada de nutrientes a la clula se utiliza para convertir estos

nutrientes en metabolitos intermedios de bajo peso molecular (aminocidos, nucletidos,

etc.) y adems se utiliza en la polimerizacin de estos intermediarios en biopolmeros que

constituyen los componentes principales del material celular.

Los mecanismos por los que se sintetiza ATP como resultado de reacciones de oxidacin

reduccin que implica compuestos orgnicos pueden contemplarse en dos grandes grupos:

fermentacin y respiracin.

FERMENTACION:

Es el mecanismo ms simple para la obtencin de energa; por tal razn, o podemos definir

como el proceso metablico de generacin de ATP, en el cual los donantes y los aceptores

de electrones son molculas orgnicas.

La fermentacin posee tres caractersticas:

? En la fermentacin, tanto donantes como aceptores de electrones son molculas

orgnicas; en ocasiones es la misma molculas la que se oxida y se reduce.

? El proceso ocurre en ausencia del oxgeno.

? Existe un riguroso balance de C, O e H entre los sustrato y los productos.

Desde el punto de vista termodinmico, la fermentacin se caracteriza por ser una suma de

reacciones pasando de un grupo carbonilo e hidroxilo a un grupo carboxilo con menor

contenido energtico.

Existen tres rutas bsicas empleadas por los microorganismos para el aprovechamiento

energtico de los sustratos

 ? La va fructosa-difosfato (FDP) tambin conocida como glicolisis o va de Embden-

Meyerhof

? La va de la pentosa-fosfato (PP) o de Warburg-Dickens Horecker.

? La va de Enther-Doudorff p KDPG.

NUTRICION

Para el catabolismo y anabolismo, los microorganismos deben tomar del ambiente las

sustancias para crecer y generar energa. A estas sustancias se las llama nutrientes. Algunos

nutrientes son empleados como bloques en la construccin de los constituyentes celulares,

mientras que otros sirven como fuente de energa. Los microorganismos toman esos

nutrientes del lugar donde se desarrollan, p. ej.: el suelo, la leche, un animal, una planta,

etc. Cuando queremos hacer crecer un microorganismo o grupo de microorganismos en

laboratorio, hacemos un cultivo de estos microorganismos en condiciones artificiales.

(Para su crecimiento se usan medios de cultivo: conjunto de sustancias nutritivas y

condiciones determinadas que permiten el crecimiento y multiplicacin de un

microorganismo o grupo de microorganismos.) Los medios de cultivo deben contener los

nutrientes necesarios para el crecimiento los microorganismos para el cual fue creado. Los

microorganismos son muy diversos en cuanto a sus requerimientos nutritivos.

MATERIALES

8 x 2 g de levadura seca o hmeda de cerveza o de

panadera. Preferiblemente 3 grupos de laboratorio deben trabajar con el mismo tipo

de levadura.

200 cm3 de solucin de fructosa 0.2M

200 cm3 de solucin de galactosa 0.2M

200 cm3 de solucin de glucosa 0.2M

 200 cm3 de solucin de lactosa 0.2M

200 cm3 de solucin de maltosa 0.2M

200 cm3 de solucin de rafinosa 0.2M

200 cm3 de solucin de sucrosa 0.2M

8 x 0.5g de ortofosfato dihidrogeno de amonio

8 x 0.5g de sulfato de amonio

(Alternativamente puede emplearse 1g de nutriente de levadura disponible

comercialmente, para reemplazar las dos sales de amonio)

8 x 250 cm3 erlenmeyers

8 x tapones de caucho con dos orificios

Varillas de vidrios

Bureta de 50 cm3

Jeringas aforadas de 25 cm3 o equivalentes para muestreo

8 x 100 cm3 erlenmeyers para titulacin

Solucin de hidrxido de sodio 0.1M (alrededor de 400cm3)

PROCEDIMIENTO

A parCr de un caldo esteril de

150 ug/l (solucion estandar)

De la solicion estandar y prepare

diluciones

En un erlemeyer de 50 ml aada
1 ml de fenol a 5%, aada 5ml
de acido sulfurico al 95%

Lea la adsorbancia de los nm

perCnentes

Azcar 100 500 150 100 70 50 25 10 5

ug/L ug/L ug/L ug/L ug/L ug/L ug/L ug/L ug/L ug/L

absorbancia 1,178 0,614 0,230 0,210 0,203 0,208 0,205 0,205 0,205

Resultados Cuantificacin de azucares

Eliminacin de puntos atpicos

Los puntos sealados en rojo no se tuvieron en cuenta ya que no permite observar las fases

de: adaptacin, exponencial, latencia y muerte del microrganismo Escherichia Coli (E

Coli)

CURVA PATRON
AZUCAR
Ug/l ABSORBANCIA
150 0,23
100 0,21
70 0,203
50 0,208
25 0,205
10 0,205
5 0,205
PROMEDIO 0,209428571
D.
ESTANDAR 0,009360505

CURVA PATRON
y = 0,0001x + 0,2009
0,235 R = 0,68177
0,23
Absorbancia

0,225
0,22
0,215 Serie1
0,21 Lineal (Serie1)
0,205
0,2
0 50 100 150 200
Concentracin
 SACAROSA
TIEMPO ABSORBANCIA
0 1,073
0,5 0,345
1 0,514
1,5 0,585
2 0,478
2,5 0,484
3 0,814
3,5 1,026
PROMEDIO 0,664875
D.
ESTANDAR 0,254538031
y = 0,2001x + 0,2434
SACAROSA R = 0,86547
1,2
1
Absorbancia

0,8
0,6
Serie1
0,4
Lineal (Serie1)
0,2
0
0 1 2 3 4
concentracin

FRUCTOSA
TIEMPO ABSORBANCIA
0 0,344
0,5 0,926
1 0,714
1,5 1,094
2 1,103
2,5 1,186
3 1,285
3,5 1,026
PROMEDIO 0,95975
D.
ESTANDAR 0,282972945
 FRUCTOSA
y = 0,1814x + 0,658
1,4 R = 0,56734
1,2
Absorbancia

1
0,8
0,6 Serie1
0,4
Lineal (Serie1)
0,2
0
0 1 2 3 4
Concentracin

GLUCOSA
TIEMPO ABSORBANCIA
0 0,842
0,5 0,756
1 0,73
1,5 0,642
2 0,528
2,5 0,77
3 0,534
3,5 0,438
PROMEDIO 0,655
D.
ESTANDAR 0,133251642

GLUCOSA
y = -0,1097x + 0,8188
1 R = 0,93494

0,8
Absorbancia

0,6

0,4 Serie1

0,2 Lineal (Serie1)

0
0 1 2 3 4
Concentracin
ANALISIS DE RESULTADOS

A Continuacin se enva los resultados de la concentracin de azcar obtenida al trabajar

con el E.coli, que se haya al leer cada muestra la cual se deja en incubacin por ciertas

horas a cierta temperatura con variables controladas y condiciones estipuladas dndonos

una absorbancia en cada muestra y con ayuda del tiempo que dura cada una en incubacin

se puede crear una grfica de tendencia la cual nos ayuda a determinar la eficiencia de

trabajo del azcar con la E. coli.

FRUCTOSA x = abs- 0,6267/0,1903

TIEMPO ABSORBANCIA x = Ug de azucar
0 0,344 -1,485549133
0,5 0,926 1,572779821
1 0,714 0,458749343
1,5 1,094 2,455596427
2 1,103 2,502890173
2,5 1,186 2,939043615
3 1,285 3,459274829
3,5 1,026 2,098265896
PROMEDIO 0,95975
D.
0,282972945
ESTANDAR




SACAROSA x = abs- 0,0433/0,5891
TIEMPO ABSORBANCIA x = Ug de azucar
0 1,073 1,747920557
0,5 0,345 0,512137158
1 0,514 0,799015447
1,5 0,585 0,919538279
2 0,478 0,737905279
2,5 0,484 0,748090307
3 0,814 1,308266848
3,5 1,026 1,668137837
 PROMEDIO 0,664875
D.
0,254538031
ESTANDAR

= abs- 0,8188/-
x
GLUCOSA
0,0936
TIEMPO ABSORBANCIA x = Ug de azucar
0 0,842 -0,247863248
0,5 0,756 0,670940171
1 0,73 0,948717949
1,5 0,642 1,888888889
2 0,528 3,106837607
2,5 0,77 0,521367521
3 0,534 3,042735043
3,5 0,438 4,068376068
PROMEDIO 0,655
D.
0,133251642
ESTANDAR

CONCLUSIONES

se puede concluir con los datos obtenidos que la mayor concentracin de azcar se obtuvo

con la glucosa la cual nos da la concentracin ms alta comparndola con la sacarosa y la

fructuosa ya que se observa que el punto ms alto de la sacarosa es 1,747920557 y es al

tiempo 0 donde no ha pasado tiempo de incubacin es cuando consigue su mayor

eficiencia, por otro lado la fructuosa obtiene su punto ms alto con una concentracin de

3,459274829 en un tiempo de 3 horas y ya que la tendencia era positiva se crea por grafica

que el punto a las 3 horas y media sera ms alto pero nos llevamos una sorpresa al ver que

en el siguiente punto bajo y no logra dar una mayor concentracin si no que por el contrario

baja; mientras que con la glucosa se obtiene el punto de concentracin ms alta con

4,068376068 que es en el tiempo de 3 horas y media donde podemos ver que en la

concentracin ms alta entre los tres azucares, por lo tanto se concluye que la glucosa es la

ideal trabajando con E. coli para aumentar su concentracin.

BIBLIOGRAFA

HERNANDEZ B., Claudia I. Tesis: Crecimiento y Formacin de Productos en Cultivos

Aerobios y Anaerbicos. Instituto Tecnolgico de Zacatepec. Mxico, 2003.

 PRACTICA No. 3. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES

DE AMILASA - ENZIMA

OBJETIVO GENERAL

Aislar y seleccionar microorganismos productores de enzimas amilolticas a partir

de muestras de suelo.

RESUMEN

Las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan molculas de almidn dando como

productos dextrinas y polmeros compuestos progresivamente por unidades de glucosa.

Haremos un a prueba de la accin de un microorganismo que produce amilasa para lo cual

nos dar un halo el cual demostrar como fue desdoblado el almidn hasta glucosa a causa

de la enzima.

INTRODUCCIN

Esta prctica constituye por medio de una muestra de suelo determinar si existen

microorganismos que tengan la capacidad de producir la enzima amilasa. Ya que esta

enzima presenta gran valor industrial puesto que promueven la hidrlisis de enlaces

glucosdicos presentes en almidn, glucgeno y otros polisacridos (Van der Maarel y col.,

2002) y la aplicacin de estas enzimas es muy variada, entre las cuales se tiene como

mejoramiento de las harinas para la industria panadera, liberacin de azcares a partir de la

malta en la industria cervecera, para desalmidonar telas en la industria textil y como

aditivos en detergentes (Prasanna 2005).

JUSTIFICACION

La implementacin de microorganismos en los diversos procesos biotecnolgicos ha

incrementado progresivamente, debido a que stos pueden complementar, y en algunas

ocasiones reemplazar los procesos anteriormente usados, causando un menor impacto

negativo en la naturaleza y proporcionando ms ventajas, ya que representan una

disminucin en los costos de produccin y mayor rendimiento

MARCO TERICO

ENZIMAS

Son molculas proteicas, que actan como catalizadores de una reaccin bioqumica, es

decir aumentan la velocidad cataltica de dicha reaccin sin alterar los productos que se

generen al final de dicho proceso.

Caractersticas De Las Enzimas

Son catalizadores muy activos en medios acuosos y cada enzima acta bajo condiciones

especficas de temperatura. pH, entre otros.

Son catalizadores muy especficos: pueden modificar un nico sustrato en una mezcla se

substratos muy similares.

Son catalizadores muy selectivos: pueden modificar un nico enlace o un nico grupo

funcional en unas molculas que tenga varias posiciones modificables.

FUENTES DE ENZIMAS

Las enzimas pueden ser de origen vegetal, animal y microbiano.

Entre las enzimas de tipo vegetal, se encuentran las proteasas carbohidrasas (las cuales

descomponen residuos de azucares de carbohidratos superiores, a-amilasas y b-amilasa)

Entre las enzimas de tipo animal estn la esterapa (lipasa se produce en la mucosa gstrica,

el pncreas; fosfotasas, que se obtienen de tejidos animales seo, muscular, tripsina y la

quimitripsina que se produce en el pncreas)

Las enzimas del tipo microbiano proviene de bacterias arqueas y de hongos.

MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ENZIMAS

Los microorganismos adecuados para la produccin de enzimas deben ser estables y

aceptados por las autoridades de control, tener facilidad y rapidez de crecimiento con

nutrientes sencillos y relativamente baratos, producir una enzima de alto rendimiento, que

sea fcil de aislar, purificar y concentrar sin contaminantes o txicos. Tradicionalmente, el

objetivo es maximizar la velocidad de formacin de la enzima para minimizar los costos de

produccin de la enzima. En los microorganismos, el rendimiento es igual a la masa de

clulas obtenida, multiplicada por el volumen, por ello, lo adecuado es combinar de la

mejor manera la cepa seleccionada, las condiciones de recuperacin y fermentacin y el

equipo ms apropiado; habitualmente los microbios se sumergen en fermentadores bien

agitados y aireados o en fermentadores slidos o semislidos, por ejemplo, los que

producen lactasa, a-amilasa, proteasa, entre otros. Lo ms adecuado es usar enzimas

termostables, que a mayor temperatura, producen mayor velocidad de reaccin, menor

viscosidad del sustrato, mayor solubilidad del reactivo y menor contaminacin. Adems,

para liberar ms rpido la enzima se aaden surfactantes al medio de cultivo que aceleran la

liberacin. Las reacciones enzimticas se llevan a cabo por numerosas enzimas con

distintas funciones, por ello, una pequea cantidad de enzimas son necesarios, inclusive a

escala industrial; los preparados enzimticos necesitan poco espacio de almacenamiento y

las reacciones son controladas de forma sencilla y pueden detenerse cuando se ha alcanzado

el grado deseado de conversin de sustrato.

Las enzimas microbianas se consideran seguras porque son extractos naturales, adems las

enzimas txicas son muy raras. La introduccin de nuevas enzimas requiere una
demostracin de que no son txicas. Los microorganismos ms comunes usados en el

sector comercial son los hongos y bacterias, entre ellos se destacan los aspergillus niger, a.

oryzae y bacillus subtilis.

LAS AMILASAS ENZIMAS QUE CATALIZAN EL ALMIDN

Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrlisis de glicoslicos presentes en el almidn,

glicgeno y otros poliscardiso. El almidn est compuestos por dos polmeros de glucosa

la amilosa y la amilo pectina. La industria del almidn es una de las principales usuarias de

amilasas para la hidrlisis y modificacin de esta materia prima con el fin de obtener

glucosa, maltosa y oligosacridos, que pueden ser convertidos en jarabes de fructosa y

dextrosa. La glucosa obtenida tambin puede ser fermentada para producir etanol,

aminocidos y cidos orgnicos (Kirk, O., y col. 2002). Las amilasas son producidas por

animales, plantas y microorganismos, pero los rendimientos en los dos primeros son muy

bajos, ya que para la obtencin de esta enzima implica pasos como bioseparacin, puesto

que estas enzimas son de carcter intracelular, por lo cual ser necesario grandes cantidades

de materia prima. Por lo tanto, las mejores fuentes productoras de amilasas son las

bacterias y hongos, porque sus amilasas son de carcter extracelular sino adems porque

presentan altos niveles de expresin (Pandey y col., 2000). Se tiene caracterizado que los

microorganismos productores de amilasas son Bacillus subtilis, B. stearothermophilus, B.

licheniformis, B. amyloliquefaciens y Aspergillus sp. (Vihinen y Mantsala, 1989, Pandey y

col., 2000). Segn bibliografa, estos microrganismos han sido aislados principalmente de

residuos agroindustriales (Ramachandra y col., 2004; Francis y col. 2002), semillas en

descomposicin (Boyer y Shannon, 1987), compostas y suelos (Quintero y col., 2009; Devi

y col., 2010).
MATERIALES Y EQUIPOS

50 ml de agua destilada previamente esterilizada o agua peptonada 0.1% (p/v).

Pipeta de 10 ml.

Pipetas de vidrio 1 ml estril.

1 gr de tierra seca recogida 1 cm por debajo de la superficie, de diferentes sitios o

tambin a diferentes alturas o se pueden tomar muestras de diferentes tipos de suelo

(Se debe colocar en bolsas estriles y rotular). Mnimo utilizar tres muestras.

Una solucin de yodo.

Bastoncillos de algodn estril.

Cajas de Petri estril con 15 a 20 mm con nutriente de agar preparado con 0,2 de

almidn soluble.

Rotulador.

PROCEDIMIENTO

Diluir en 99
AISLAMIENTO DE Tomar 1 g ml y de esta
MICROORGANISMOS
INICIO
PRODUCTORES DE de muestra hacer
AMILASA de suelo diluciones
10

Sembrar de cada Hacer

tubo en una placa
de agar
Rotular la Incubar a 30 recuento de
nutriente/ caja de Petri por 48 h. todas las
almidn AL 2% colonias

VerCr en las placas solucin de Hacer recuento de Medir con

Yodo. Las zonas en que todava colonias que Tomar datos y
quede almidn se teirn de regla el
presentan halos de llenar tabla.
color entre azul y negro y s han
degradado el almidn aparecern
hidrlisis alrededor dimetro de
zonas de color marrn claro de las mismas. cada halo.

FIN
RESULTADOS

Se realizan diluciones de tierra de 0,1ml; 0,5ml; 1,0ml; 1,5ml.

Sembrar de cada tubo en una placa de agar nutriente/almidn AL 2%

Se realiza el conteo de colonias al siguiente da.

Anexos

ANALISIS DE LOS RESULTADOS

Se puedelizar que EEcuando se requiere investigar el contenido de microorganismos

viables en un alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta tcnica

no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las

condiciones de temperatura y la presencia de oxgeno, permiten seleccionar grupos de

bacterias cuya presencia es importante para los diferentes anlisis. Se considera que las

colonias puedan contarse de manera confiable, ya que se hacen las diluciones decimales

necesarias de la muestra que en este caso van desde, antes de ponerla en el medio de

cultivo Se considera que las colonias puedan contarse de manera confiable, ya que se

hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra que en este caso van desde 100

ug/l, 70 ug/l, 50 ug/l, 25 ug/l, 10 ug/l, y 5ug/l. Se pudo verificar que la seleccin de las

cajas que se toman en cuenta para los clculos es muy importante para la confiabilidad de

los resultados; aunque en nuestro caso las colonias eran incontables se pudo realizar el
ejercicio por medio de otra caja en la cual contena el microorganismo. Al utilizar el lugol

para detectar el almidn se pudo observar que no se produjo coloraciones azules, dando

prueba negativa para la presencia de este polisacarido

CUNCLUSION

El mtodo permite numerosas fuentes de variacin, algunas de ellas controlables, pero

sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy importante apegarse a la

tcnica y controlar cuidadosamente las condiciones.

El almidn en contacto con el reactivo de Lugol (disolucin de yodo y yoduro potsico)

toma un color azul-violeta caracterstico. Esa coloracin producida por el Lugol se debe a

que el yodo se introduce entre las espiras de la molcula de almidn. Por lo tanto, no es una

verdadera reaccin qumica, sino que se forma un compuesto de inclusin que modifica las

propiedades fsicas de esta molcula, apareciendo la coloracin azul violeta. En este caso

no se produjo esta reaccin debido a que haba gran presencia de microrganismos

amilolticos por lo que degradaron todo el almidn presente.

Ejercicio:

Como el resultado de la prctica aislamiento de bacterias amiloliticos es incontable se

realiza un ejercicio con una placa de S. Aureus para ver el funcionamiento del contador de

colonias y realizar los clculos para informar el nmero de UFC/ml

Recuento en placa de S. ureos

Se toma la placa y se seleccionan 3 cuadrantes,

1 Un cuadrante donde hay muchas UFC.

 1 cuadrante donde hay +0 UFC

1 cuadrante donde hay menos UFC

Se realiza el conteo con ayuda del contador de colonias de la siguiente manera:

CA = 92 UFC

CM = 71 UFC

CB = 53 UFC

Para obtener el nmero de colonias por placa se aplica la siguiente formula:

Colonias = CA + CM +CB / 3

Colonias por placa = (92+71+53)/3 = 71,6

Para obtener el nmero total de UFC/ml aplicamos la siguiente formula:

UFC/ml =

71,6 65
UFC/ml =
1

/ = ,

Aprox. 4, / de S. Aureus

CONCLUSIONES

Mediante este ejercicio se pudo determinar el nmero de unidades formadoras de colonias

presentes en la placa.

Se aprendi a utilizar l cuenta colonias de manera prctica, rpida y segura. Ofreciendo

resultados confiables a partir de los cuales se obtuvo el nmero total de UFC en la placa.

Anexos
BIBLIOGRAFA

http://www. Unas.edu.ar/matbib/micagri/micagricap3.pdf Produccin de amilasa,

Facultad de Ciencias Qumicas, Argentina.

Universidad Autnoma de Guadalajara. Enzimas. Recuperado de

genesis.uag.mx/edmedia/material/quimicaII/enzimas.cfm
 PRACTICA No. 4.

AISLAMIENTO DE ADN MICROBIANO

OBJETIVO GENERAL

Aislar los cidos nucleicos de la Bacteria Scherichia colli.

INTRODUCCIN

En la aplicacin de la biotecnologa es muy importante conoce la estructura del ADN y

basada en esta se puede manejar el material gentico en otros organismos hacindolos ms

funcionales en nuestro entorno. En esta prctica se observar su estructura con este mtodo

en el cual la presencia de un detergente (SDS), provoca la lisis celular, la desnaturalizacin

del DNA cromosmico y de las protenas, y la liberacin de los plsmidos. Los plsmidos

se ven menos afectados por su pequeo tamao y estructura sper enrollada haciendo lo ver

como un pequeo hilo.

JUSTIFICACION

La prctica est desarrollada para que los estudiantes vean y compartan la experiencia y de

este modo poder ver la importancia de conocer la estructura del ADN y emplearla en

diversos proyectos de investigacin.

MARCO TEORICO

El cido desoxiribonucleico o ADN (DNA) es la molcula que guarda el cdigo gentico de

todas las clulas. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o

procariota, todos tienen el DNA como vehculo de su cdigo gentico.

La extraccin de ADN en suspensiones bacterianas de todas las muestras biolgicas que

podemos someter a un proceso de extraccin de ADN, las suspensiones bacterianas, son

quizs las que ofrecen menos problemas por la homogeneidad y riqueza del material. En
particular, las suspensiones densas de bacterias Gram Negativas pueden liberar cantidad

suficiente de ADN en condiciones bastante suaves como pueden ser una simple

centrifugacin. (frezze & thaw).

El primer paso en cualquier protocolo de separacin es el rompimiento del material

bacteriano. El mtodo utilizado para romper la clula debe ser tan leve como sea posible

con el fin de causar el menor dao posible al ADN. La lisis celular se puede hacer por

accin mecnica, pulverizando el tejido con hielo seco o nitrgeno lquido, tambin se

puede utilizar la degradacin enzimtica de la pared celular (si est presente) y lisis con

SDS de las membranas celulares. Seguido al rompimiento celular la mayora de mtodos

involucran una desproteinizacin, lo cual se lleva a cabo con un solvente orgnico, seguido

de una precipitacin con isopropanol o etanol.

El material gentico de las bacterias se encuentra en el citoplasma, se le denomina como

nucleoide. Est compuesto de alrededor de 80% de ADN, 10% de RNA y 10% de protenas

(RNA polimerasa). El cromosoma bacteriano nico contiene dos tiras complementarias de

ADN que estn enrolladas alrededor una de la otra en patrn helicoidal, con los extremos

unidos para formar una molcula circular. La extraccin de DNA a partir de suspensiones

bacterianas ofrece menos consideracin desde el manejo de la clula, as como la

homogeneidad y riqueza que presenta el material. La extraccin de ADN consta de una

etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al

medio su contenido y otra de purificacin, que implica la retirada de la solucin final de la

mayora de elementos celulares. La degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN.

Se consigue mediante la adicin de una proteasa La precipitacin del ADN se logra por que

el DNA es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol fro y recuperar

mediante una centrifugacin. La confirmacin de la presencia de ADN se lleva a cabo

mediante la tincin con azul de metileno y observacin con luz UV o directamente al

espectrofotmetro mediante espectro de absorcin. El ADN purificado se puede cuantificar

con un espectrofluormetro mediante el uso de fluorforos especficos.

EDTA: es un inhibidor de nucleasas y un buen tampn para la conservacin del ADN. El

EDTA inhibe la PCR a concentraciones superiores a 1mM.

El SDS es un detergente inico que desnaturaliza las protenas pero tambin inhibe la PCR

a concentraciones mnimas

MATERIALES

Cultivo previamente preparado de Scherichia colli

3 ml de Isopropanol frio

3 ml de SDS detergente 10%

Tubos de ensayo

Pipetas de 1 ml Pasteur

Bao Mara a 60C

Incubadora a 37C

Centrifuga

Tubos de 5 ml

PROCEDIMIENTO
 Preparacion
del medio de
AISLAMIENTO DE ADN
INICIO MICROBIANO culCvo
Sacarosa,
0,5%

inocular 90ml
del culCvo incubar por 24 h a tomar 1 ml
con 10 ml de 37C del culCvo
E-coli

Centrifugar
Descartar el Aadir 300 microlitros de SDS
por 5 min a
sobrante llevar a bao de maria por 1o min
1000 RPM

tomar el ADN
precipitado de la
agregar lentamente
capa media y
300 microlitros de
Isopropanol frio agrgar azul de FIN
meCleno para
mayor visivilidad

Resultados

En el aislamiento y del ADN se observaron pequeas fibrillas los cuales al agregarle unas

Gotas de azul de metileno se observaron con mayor claridad determinando presencia de

ADN bacteriano.

Anlisis de resultados

Uno de los hechos que ms dificulto la extraccin exitosa del ADN por ausencia de

protocolos extandarizados segn las caractersticas fsicas (estructura de la pared celular).

Para lograr aislar, purificar y visualizar DNA, se deben seguir los pasos con extrema

precaucin ya que en cualquier momento puede perderse la muestra y no observarse el

ADN.

Se sabe que la purificacin de los cidos nucleicos es imprescindible para realizar diversas

tcnicas de biologa molecular. Uno de los puntos interesantes que se realizaron el

laboratorio fue que no se realiz por el mtodo clsico de purificacin de cidos nucleicos

se basa en el uso de disolventes orgnicos txicos, en vez de esto se utiliz un mtodos

alternativo que emplea una alta concentracin salina en vez de disolventes orgnicos. Con

ello se consigue el mismo objetivo de desproteinizar la muestra, sin sufrir la desventaja de

la toxicidad, as se indujo a la lisis celular, para acceder al ADN por medio de un detergente

aninico que solubilizo los componentes celulares.

Al extraer el ADN estando en la capa intermedia por medio de una micropipeta, se cometi

errores de extraccin pues este quedo con trazas de las otras fases y no se pudo apreciar

bien la hebra caracterstica que se produce al extraerlo de la manera correcta.

Conclusiones

Se aprendi experimentalmente como aislar, analizar y visualizar ADN bacteriano a parir

de un cultivo aislado de E. Coli. El desarrollo de la metodologa y tcnica para el

aislamiento y anlisis- visualizacin del ADN, se desarroll con la adecuada destreza, por

lo que se pudo cumplir el objetivo de la prctica, y se visualizaron fibrillas para la

confirmacin de la presencia de ADN. Para logar aislar, purificar y visualizar ADN es

imprescindible seguir adecuadamente la tcnica, la disposicin exacta de los volmenes y

la nula contaminacin de la muestra en cuestin.

Las bacterias no suelen contener substancias inhibidoras, por lo que en la mayora de casos

una extraccin primaria (lisis y liberacin del ADN) es suficiente para tener resultados

satisfactorios. (Microbial)

Se aprendi experimentalmente como aislar, analizar y/o visualizar DNA bacteriano a parir

de un cultivo suministrado. El desarrollo de la metodologa y/o tcnica para el aislamiento

y anlisis- visualizacin del DNA, no se desarroll con la adecuada habilidad, por lo que no

se pudo visualizar bien la banda para la confirmacin de la presencia de ADN. Para logar
aislar, purificar y visualizar DNA es imprescindible seguir adecuadamente la tcnica, la

disposicin exacta de los volmenes y la nula contaminacin de la muestra en cuestin.

Bibliografa

Biologa molecular de la clula. Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K,

Roberts & P, Walter. 2001, cuarta edicin

Biologa Molecular y Herencia. Robert A. Wallace, Jack L. King, Gerald P.

Sanders., 1a edicin. Editorial

Malajovich, Mara 2010/ Actividades Biotecnologa: aislamiento de ADN

Bacteriano enseanza y divulgacin

Microbial. (S.f.). La extraccin y purificacin del ADN para el anlisis por PCR.

http://www.microbial-systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf