UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y AGRICULTURA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA II

Nombre: Poaquiza Paul Fecha: 03/01/2018

NRC: 3085

Métodos de recuento bacterianos aplicados a análisis de alimentos y de

agua

1. Alimentos:

1.1. Recuento de microorganismos aerobios mesófilos

El análisis microbiológico objeto de la práctica permitirá estimar la flora total que
porta el alimento, la cual reflejará su calidad higiénico-sanitaria.

Técnica
- Enfriar los matraces que contienen el medio de cultivo recién esterilizado (PCA), en
un baño María y esperar que la temperatura descienda hasta unos 35ºC.
- Preparar un banco de diluciones del alimento problema y realizar una siembra en
masa por duplicado de cada una de las diluciones.
- Homogeneizar, dejar solidificar el agar, invertir las placas e incubar a 30ºC durante
48 -72 horas.
- Transcurrido este tiempo, elegir una dilución (asociada a un crecimiento de un
número de colonias comprendido entre 30 y 300 aproximadamente) y realizar el
recuento. Multiplicando este valor por el factor de dilución obtendremos el resultado
(León, 2007).

Figura 1. (León, 2007)

1.2. Recuento de enterobacterias totales

El análisis microbiológico de las Enterobacterias permitirá predecir el grado de
contaminación fecal que tiene un alimento. Para su análisis se utilizará la técnica de
recuento en medio sólido.

Técnica
- Enfriar los matraces que contienen el medio de cultivo recién esterilizado (VRBG)
en un baño María y esperar que la temperatura descienda hasta unos 40ºC.
- Preparar un banco de diluciones del alimento problema.
- Realizar una siembra en masa por duplicado de las diluciones preparadas, mezclando
en placas Petri, 1 ml de cada una de las diluciones decimales con, aproximadamente,
15 ml del medio VRBG fundido.
- Una vez que ha solidificado el medio, se recubre con una nueva capa de agar.
- Dejar solidificar el agar, invertir las placas e incubar a 37ºC durante 18-24 horas.
- Una vez transcurrido este tiempo se cuentan las colonias violeta rodeadas de un
precipitado rojo-violeta (León, 2007).

Figura 2. (León, 2007)

1.3. Recuento de coliformes

El grupo formado por las denominadas coliformes comprende aquellas
Enterobacterias capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas.
Niveles de coliformes altos en un alimento indican manipulación y elaboración
deficientes. Para alimentos no procesados o con tratamiento insuficiente, es preferible
el análisis del grado de contaminación fecal mediante la evaluación de los niveles de
coliformes fecales que mediante el análisis de Enterobacteriaceas totales. Su análisis
se realizará utilizando medio líquido (León, 2007).

Técnica
- Inocular las tres series de 3 tubos con 1ml de cada dilución respectivamente. Cada
tubo irá provisto de una campana Durham para la recogida de gases.
- Incubar todos los tubos a 37 ºC durante 24 - 48 horas. Observar los tubos y tomar
nota de los que tengan desprendimiento de gases.
- Con ayuda de la tabla NMP (3 SERIES DE 3 TUBOS) calcular el número de
coliformes por gramo o ml de alimento.
 Figura 3. (León, 2007)

Figura 4. (León, 2007)

1.4. Recuento de estreptococos fecales

Los estreptococos son considerados indicadores de la contaminación fecal de agua y
alimentos. Por ser muy resistentes a condiciones de congelación o desecación se
consideran buenos indicadores para valorar, las condiciones higiénicas y de
conservación de alimentos congelados o desecados. Para su determinación se
utilizarán caldos de cultivo líquidos.

Técnica

Prueba presuntiva.
- Inocular las tres series de 3 tubos con 1ml de cada dilución respectivamente.
- Incubar a 37ºC durante 24 horas.
- Con ayuda de las tablas NMP (3 SERIES DE 3 TUBOS) calcular el número de
estreptococos por gramo o ml de alimento (los tubos que presenten ennegrecimiento
se considerarán como positivos) (Periago, 2010).

1.5. Métodos rápidos para la identificación de enterobacterias. Tiras API-20E.

El sistema API-20E para enterobacterias es una tira con 20 cápsulas que permite
buscar 22 caracteres bioquímicos para identificar enterobacterias al cabo de 18-24
horas (Periago, 2010).
Técnica
- Hacer una suspensión en 5 ml de agua estéril a partir de una sola colonia,
previamente separada en medio de aislamiento.
- Repartir aproximadamente 5 ml de agua en los alvéolos de la cámara de incubación
para dar el grado de humedad necesario.
- Sacar una tira API-20E y colocarla sobre la mencionada cámara.
- Añadir la suspensión bacteriana con pipeta Pasteur, con la punta apoyada sobre lado
de cada cúpula y evitando que se formen burbujas de aire.
- Para los caracteres CIT, VP y GEL, llenar tubo y cúpula. Para los caracteres restantes
llenar solo el tubo.
- En los caracteres ADH, LDC, ODC URE y H2S, llenar las cúpulas con aceite de
parafina estéril, con el fin de obtener condiciones de anaerobiosis.
- Cerrar la cámara con la tapa, e incubar a 35-37ºC durante18-24 h.
- Tras la incubación, realizar la lectura de las galerías, apuntando los resultados en
la hoja de resultados.
- Si la Glucosa es positiva y/o 3 o más test son positivos, efectuar el revelado de los
test que requieren reactivos (TDA, IND, VP, NITRATOS y NITRITOS).
- El código obtenido en la hoja de resultados, nos servirá para identificar el
microorganismo correspondiente a la cepa analizada (Periago, 2010).

1.6. Mohos y levaduras

Los hongos son organismos eucarióticos, cuya pared celular contiene quitina y β-
glucanos. Son unicelulares o filamentosos, de reproducción sexual o asexual,
saprófitos mutualistas o parásitos (Cano, 2006).
En función de la temperatura de crecimiento se dividen en:
• termófilos: 20 – 50º C (40 – 50º C)
• termolatentes: máximo 50º C, mínimo por debajo de 20º C
• mesófilos: 10 – 40º C (20 – 35º C)
• psicrófilos: por debajo de 10º C (por debajo de 20º C)
Los hongos engloban los mohos y las levaduras. Los mohos son multicelulares
filamentosos cuyo crecimiento en un alimento se reconoce por su aspecto
aterciopelado. Las levaduras crecen en agregados de células independientes, cuando
crecen en los alimentos forman colonias características. Los alimentos que más
fácilmente son contaminados por micotoxinas y las micotoxinas más frecuentes son:
• Semillas oleaginosas y alimentos derivados
• Aceites vegetales no refinados
• Cereales y alimentos derivados
• Frutos secos
• Zumos de frutas
• Legumbres
• Bebidas alcohólicas
• Leche y productos lácteos
• Carne y productos cárnicos
 Figura 5. (Cano, 2006)

1.7. Escherichia coli

Escherichia coli es un coliforme fecal. Los coliformes fecales son un grupo de
microorganismos seleccionados por incubación de los inóculos procedentes de un
caldo de enriquecimiento de coliformes a temperaturas superiores a las normales (44
+/-0,5º C) y son muy indicativos de una posible contaminación de origen fecal del
alimento. Se definen por la producción de ácido y de gas en caldo EC a 44 – 46º C
(44,5 – 45,5º C). Las cepas enterohemorrágicas de E. coli no crecen a 44,5º C en la
formulación convencional de EC, pero lo hacen cuando el porcentaje de sales biliares
se reduce del 0,15 al 0,112%.
Sólo unas pocas cepas son patógenos verdaderos, enteropatógenos; o patógenos
oportunistas.
Es muy resistente en suelo y agua. Muere a 60º C en 15 minutos, y con 0,5 p.p.m. de
cloro.
Vive en el tracto intestinal del hombre y animales, por eso su presencia en un alimento
indica contaminación directa o indirecta de origen fecal. Es indicador de posibles
patógenos entéricos en el agua, moluscos, productos lácteos (Cano, 2006).

Figura 6. (Cano, 2006)

 Figura 7. (Cano, 2006)

1.8. Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus es un microorganismo de distribución en el medio ambiente
muy amplia, se encuentra de forma natural en el hombre, los animales de granja, el
polvo y diversos alimentos y otros productos en los que la contaminación se debe
principalmente a los manipuladores.
El principal problema a nivel de la microbiología de los alimentos es que S. aureus
puede producir una enterotoxina termoestable, y otras toxinas.
Estas toxinas actúan sobre receptores intestinales cuyos estímulos alcanzan el centro
del vómito del cerebro, por lo que deberían considerarse como neurotoxinas.
El mayor inconveniente de estas toxinas es su elevada resistencia a los tratamientos
térmicos habituales, soportando tratamientos de pateurización a 72º C / 13 segundos,
e incluso 100º C / 30 minutos. Se inactivan a temperaturas de esterilización de 115º
C, resisten la irradiación y las enzimas proteolíticas.
Para la producción de toxinas en un alimento tienen que concurrir los siguientes
requisitos:
- contaminación del alimento por Staphylococccus aureus: en origen, por los
manipuladores o por falta de higiene en locales o utensilios
- la multiplicación de una cepa enterotoxigénica del microorganismo en el alimento
alcanzando al menos 106 células por gramo.
S. auerus se multiplica en alimentos proteicos, soporta concentraciones normales de
azúcar e incluso elevadas de sal y el tratamiento con nitritos (Cano, 2006).

Figura 8. (Cano, 2006)

2. Agua

2.1. Bacterias coliformes

Fundamento
Los coliformes reagrupan ciertas especies bacterianas pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae, de morfología bacilar, Gram negativas, aerobias o anaerobias
facultativas, oxidasa negativa, no esporuladas y que fermentan la lactosa con
producción de ácido a 37ºC en 24-48 horas.

Método
El método consiste en desarrollar solo una prueba presuntiva en el
que una reacción negativa excluye la presencia del grupo coliforme.

Procedimiento
Inocular caldo de peptona con diluciones decimales de la muestra
de agua, expresados en 10-1, 10-2, 10-3. Inocular 3 tubos de lactosa
bilis verde brillante (a los que se les añade un tubo de Durham
invertido) con 1 ml de cada dilución. Incubar a 37ºC (+/-1ºC)
durante 24 ó 48h.

Lectura e interpretación.
Si se observa crecimiento bacteriano con producción de gas las 24h
o antes, la presencia de bacterias coliformes fecales se considerará
confirmada, prosiguiendo con el método del filtro de membrana
para conteo (Obón, 2014). Figura 9. (Obón, 2014)

2.2. Coliformes fecales

Fundamento
Las bacterias coliformes de origen fecal son aquellas comprendidas en el grupo
anterior (coliformes totales), que además son capaces de fermentar la lactosa, con
producción de ácido y de gas a 44ºC, en un tiempo máximo de 24h.

Método
El método consiste en la determinación del número de coliformes mediante filtración
de volúmenes determinados del agua a analizar por filtros de membrana e incubación
sobre medio de lactosa enriquecido (agar de lactosa TTC con heptadecilsulfato de
sodio) y una temperatura de 44,5ºC (+/-0,2ºC).

Procedimiento
Colocar un filtro de membrana estéril sobre el soporte de filtración. Adaptar el
embudo y conectar el matraz a una bomba eléctrica de vacío. Filtrar 100 ml de muestra
si se trata de agua potable, y 0,1 y 1 ml si se trata de aguas no potables, previamente
homogeneizadas. Lavar con unos 30 ml de agua destilada. Retirar el embudo.
Mediante las pinzas esterilizadas, transferir la membrana filtrante sobre el medio de
cultivo contenido en una placa de Petri, de modo que la superficie de filtración quede
hacia arriba. Cerrar e invertir la placa e incubar a 44ºC (+/-1ºC) durante 24h (+/-2h).

Lectura e interpretación
La lectura de los resultados requiere el examen de las colonias aparecidas sobre la
membrana y el examen de los halos en la capa de agar subyacente a la membrana. La
fermentación de la lactosa provoca la formación de un halo amarillo. Por ello se
considera coliformes aquellas
colonias que presentan halo amarillo,
halo amarillo con centro naranja
(Escherichia y Citrobacter), o halo
amarillo con centro rojo ladrillo
(Klebsiella y Enterobacter). La
densidad se estima como el total de
coliformes totales por 100ml,
utilizando aquellos filtros de
membrana que tengan 20-80 colonias
de coliformes y no más de 200 (Obón,
2014).

2.3. Enterococos fecales

Figura 10. (Obón, 2014)
Fundamento
Los enterococos pueden considerarse como indicadores de contaminación fecal. Sin
embargo, algunos enterococos presentes en las aguas pueden proceder de otros
hábitats. Se pueden detectar y cuantificar las especies: Enterococcus faecalis, E.
faecium, E. durans y E. hirae.

Método
Se utiliza para la determinación del número de enterococos intestinales mediante
filtración de un volumen determinado del agua a analizar a través de filtros de
membrana e incubación de los mismos sobre medios de cultivo a temperaturas
adecuadas.

Procedimiento
Se filtran 100 ml del agua a analizar previamente homogeneizada. Se coloca el filtro
de membrana sobre el medio de
Slanetz y Bartley y se incuban las
placas a 37ºC durante 48 h.

Lectura e interpretación
Tras la incubación, se consideran
como colonias típicas de
enterococos todas las que muestren
un color rojo, marrón o rosado, en
el centro o en toda la colonia,
consecuencia de la reducción del
TTC (incoloro) a trifenilformazán
(rojo) (Obón, 2014).
Figura 11. (Obón, 2014)
2.4. Clostridium perfringens

Fundamento
Las bacterias incluidas en el género Clostridium tienen morfología bacilar, son Gram
positivas, anaerobias estrictas y capaces de formar esporas. La especie C. perfringens
está normalmente presente en heces. Sus esporas son resistentes al calor, a los
procesos de desinfección y a los tratamientos de depuración habituales de las aguas
(cloración), por lo que su supervivencia en agua es mayor. La diferenciación de C.
perfringens de otras especies de Clostridium, se basa en su capacidad de fermentar la
sacarosa con producción de ácido, en su incapacidad de fermentar la celobiosa (debido
a la ausencia de β-D-glucosidasa) y en la producción de fosfatasa ácida.

Método
Se utiliza de método de filtración para la determinación del número de C. perfringens
mediante filtración de un volumen determinado del agua a analizar a través de filtros
de membrana e incubación de los mismos sobre medios de cultivo a temperaturas
adecuadas.

Procedimiento
Siguiendo el método de filtración, se filtran 100 ml del agua a analizar, previamente
homogeneizado. Se coloca el filtro de membrana sobre el medio de m-CP y se incuban
las placas a 44ºC durante 24 h en condiciones de
anaerobiosis.

Lectura e interpretación
Tras la incubación, se consideran como colonias
típicas de C. perfringens todas las que muestren
un color amarillo opaco, consecuencia de la
acidificación del medio tras la fermentación de la
sacarosa, y que cambien a color rosa o rojo al cabo
de 20 a 30 segundos de exposición a vapores de
hidróxido amónico. En general, el resto de las
especies de Clostridium aparecen de color azul-
verdoso si, además de fermentar la sacarosa, son
β-D-glucosidasa positivas (hidrolizan el indoxil-
β-D-glucósido) o de color púrpura si no
fermentan la sacarosa. NOTA: Aunque no está
incluido en la Normativa se realizará una tinción
de Gram de una de las colonias positivas para
observar al microscopio (Obón, 2014). Figura 12. (Obón, 2014)

2.5. Bacterias aerobias

Fundamento
Las bacterias aerobias son todas las bacterias heterótrofas, aerobias o anaerobias
facultativas, mesófilas y psicotróficas capaces de crecer en un medio de agar nutritivo.
Este recuento de colonias es útil para evaluar el estado de los recursos de agua en su
origen y la eficacia del proceso de tratamiento de las aguas destinadas al consumo
humano e indica la limpieza y el estado de los sistemas de distribución. De igual
modo, permite detectar cambios anómalos en el número de microorganismos en la red
de distribución. Así, todo aumento repentino del número obtenido puede advertir de
la existencia de un foco de contaminación y requeriría su inmediata investigación.

Método
Este método se basa en contar el número de colonias desarrolladas en una placa de
medio de cultivo sólido, en el que se ha sembrado un volumen conocido de agua
muestra, transcurrido un tiempo y una temperatura de incubación determinados.

Procedimiento
Preparar 3 tubos con 9 ml de agua peptonada cada uno. Inocular el caldo de peptona
con diluciones decimales de la muestra de agua problema expresados en 10-1, 10-2,
10-3. De cada dilución depositar 1 ml en cada placa de Petri. Verter 30 ml de medio
 de cultivo de agar en cada placa y dejar solidificar (5-10min), invertir las placas y
meterlas en la estufa a 37ºC (+/-1ºC), incubar durante 48h. También se emplean placas
con medio agar extracto de levadura en las que se siembra un volumen conocido de
agua, y la incubación se lleva a cabo a 22ºC durante 72 horas.

Lectura y expresión de resultados

Transcurridos 48h (+/-3h) contar todas las colonias desarrolladas en cada placa. El
resultado se expresará, como número de bacterias totales en 1 ml. Se estima utilizando
aquellos filtros de membrana que tengan 20-80 colonias de coliformes y no más de
200 (Obón, 2014).

Figura 13. (Obón, 2014)

Bibliografía
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http://www.cofourense.com/antigua/index.php?option=com_content&view=artic
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Cano, S. (2006). MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. MÉTODOS DE
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León, A. (2007). MÉTODOS CLÁSICOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS.
GUIÓN DE PRÁCTICAS . TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS , 1-15.
Obón, J. (2014). Análisis microbiológico del agua. Universidad Politécnica de
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Periago, M. (2010). MICROORGANISMOS MARCADORES: RECUENTO TOTAL (en
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