Enzimología-Cinética enzimática

María Mercedes Vásquez

IBT611-2

1.      La enzima Invertasa cataliza la hidrólisis de Sacarosa a fructosa y glucosa. Esta enzima tiene un
Km = 0.5 mM para sacarosa y una constante catalítica (Kcat) igual a 175 min-1. Se mide su actividad en
presencia de 0.25 mM de sacarosa con 25 x 10-6 µmol de enzima.

a)      ¿Qué velocidad de catálisis se observará (Vo) en estas condiciones?

Vo=Vmáx[S]/Km+[S]

Km 0.5 mM
[S] 0.25 mM
[E] 0.025 mM
Kcat 2.92 1/s

Vmax= 0.073 mM/s

Vo= 0.024 mM/s

b)      ¿Qué fracción representa esto de la Vmáx?

Vo=Vmáx[S]/Km+[S]

Vo=Vmáx[0.25]/0.5+[0.25]

Vo=Vmáx[0.25]/0.125
representa dos veces la velocidad máxima
Vo=2 Vmáx
c)      ¿Cuánto sustrato habría que añadir para que la velocidad observada alcance 95% de la Vmáx?

Vmáx= 0.012 mM/s

0.012 1
x 0.95

x= 0.0114

d)      ¿Qué importancia podría tener esto para la posible aplicación industrial de la

enzima? - Explique sus respuestas.
Pueden presentar una mayor importancia debido a que poseemos la capacidad de reducir el tiempo de reacció
conociendo la concentración al que los sustratos pueden llegar.
Esta enzima tiene un
e mide su actividad en
ima.

nce 95% de la Vmáx?

reducir el tiempo de reacción solo
n llegar.
2.     La actividad de la Acetil-CoA carboxilasa, medida con tres diferentes concentraciones de enzima
y a tres diferentes concentraciones de sustrato fue la siguiente:

[Enzima] (µg de proteína) [Enzima] (µg de prote

0.1 0.2 0.5 0.1
[AcetilCoA] (µM) ¯ Velocidad (µmol / min) 1/[S] 1/V
0.05 0.275 0.546 1.373 20.00 3.64
0.14 0.482 1.001 2.502 7.14 2.07
0.23 0.58 1.185 2.891 4.35 1.72
0.32 0.642 1.385 3.463 3.13 1.56
0.5 0.755 1.494 3.656 2.00 1.32
0.59 0.766 1.497 3.81 1.69 1.31

a)     Calcular para cada uno de los tres experimentos el valor de Km y el valor de Vmáx.

Vmáx
Km (µM) (µmol/min) Chart Ti
0.1 0.112 0.884 4.00
0.2 0.118 1.834 3.50 f(x) = 0.1263063055x + 1.1306564913
0.5 0.115 4.525 3.00 R² = 0.9973726366

2.50
2.00
1.50 f(x) = 0.0642766509x + 0.5452126833
R² = 0.9988131415
1.00
0.50 f(x) = 0.025387882x + 0.2210076047
R² = 0.9977132014
0.00
0.00 5.00 10.00
Col umn G
Col umn H
Col umn I

b) ¿Son los valores de Km y Vmáx iguales o diferentes?

en cuanto a los valores de Km no difieren tanto en los valores, pero a diferencia de
la Vmáx la cual incrementa notablemente

c)     Explique si lo que observó es lo que esperaba obtener.

Si, debido a que los valores de Km presentan un incremento cuando la concentración de la enzima incrementa
Si, ya que los valores de Vmáx incrementa cuando la concentración del sustrato incrementa

d) Sabiendo que la enzima pesa 220000 grs/mol, haga una gráfica de Vmax vs µmol de enzima total.

[E](µmol) Vmáx
[E]=0,1µg 4.55E-07 µmol 4.55E-07 0.884
[E]=0,2µg 9.09E-07 µmol 9.09E-07 1.834
[E]=0,5µg 2.27E-06 µmol 2.27E-06 4.525

e) ¿Qué representa la pendiente de esta gráfica? (V máx / [ET])

representa un incremento proporcional entre Vmáx y µmol

f) ¿En qué se parece el valor anterior a la Actividad específica = Vmax/[E T]?

Es que al dividir estas dos da como resultado la pendiente de la gráfica

 [Enzima] (µg de proteína)
0.2 0.5
1/V
1.83 0.73
1.00 0.40
0.84 0.35
0.72 0.29
0.67 0.27
0.67 0.26

Chart Title

= 0.1263063055x + 1.1306564913
= 0.9973726366

= 0.0642766509x + 0.5452126833
= 0.9988131415

= 0.025387882x + 0.2210076047
= 0.9977132014
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00
Col umn G Li nea r (Col umn G)
Col umn H Li nea r (Col umn H)
Col umn I Li nea r (Col umn I)

de la enzima incrementa
e enzima total.
Chart Title
5.000
4.500
f(x) = 1995551.47199146x - 0.0043555841
4.000 R² = 0.9998642635
3.500
3.000
2.500
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
0.00E+00 5.00E-07 1.00E-06 1.50E-06 2.00E-06 2.50E-06
 Enzima: Fosfatasa alcalina de suero bovino, inhibidor: Oxalato de Bromolevamisol

[Bromolevamisol] (µM) [Bromole

0 8 16 40 0
[Sustrato] (m
Velocidades iniciales (µmol min-1 mgProt.-1) 1/s
M)
0.1 0.231 0.21 0.191 0.158 10.00 4.329
0.3 0.431 0.369 0.309 0.239 3.33 2.320
0.7 0.607 0.488 0.425 0.277 1.43 1.647
1.3 0.751 0.599 0.467 0.304 0.77 1.332
1.8 0.811 0.657 0.53 0.319 0.56 1.233
2.6 0.912 0.657 0.546 0.328 0.38 1.096
4.1 0.957 0.688 0.561 0.351 0.24 1.045
5.8 0.981 0.741 0.558 0.344 0.17 1.019

Chart Title
5.000 0
4.500 8
4.000
f(x) = 0.3349330384x + 1.0457260579 16
R² = 0.9926537413
40
3.500
3.000
2.500
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

pendiente= 0.33

a) Vmáx= 0.95 µM/min mgProt.

Km= 0.31 mM

b) Tipo de inhibición No competitivo

Enzima: Transaminasa Glutámico Pirúvica, inhibidor: Ácido 2 hidroxisuccínico

[2hidroxisuccínico] (µM) [2hidroxis

 0 1 2 5.1 0
[Sustrato] (m
Velocidades iniciales (µmol min-1 mgProt.-1) 1/s
M)
0.6 0.59 0.48 0.38 0.24 1.67 1.69
1.4 1.12 0.91 0.78 0.51 0.71 0.89
2.9 1.63 1.43 1.19 0.87 0.34 0.61
5.2 1.94 1.7 1.64 1.19 0.19 0.52
8 2.19 1.94 1.94 1.56 0.13 0.46
10.3 2.28 2.06 1.99 1.74 0.10 0.44
16 2.32 2.33 2.24 1.89 0.06 0.43
25.1 2.62 2.53 2.25 2.09 0.04 0.38

Chart Title
1.80
1.60 f(x) = 0.7945662186x + 0.3560338995
R² = 0.9984015016
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80

pendiente= 0.80

a) Vmáx= 2.81 µM/min mgProt.

Km= 2.25 mM

b) Tipo de inhibición Competitivo

 [Bromolevamisol] (µM)
8 16 40

1/v

4.762 5.236 6.329

2.710 3.236 4.184
2.049 2.353 3.610
1.669 2.141 3.289
1.522 1.887 3.135
1.522 1.832 3.049
1.453 1.783 2.849
1.350 1.792 2.907

m b alpha Ki
0.33 1.05 1.00 -
0.34 1.33 1.34 23.71
0.35 1.69 1.78 20.57
0.34 2.95 2.80 22.17

Ki 22.15 mM

Chart Title
7.000

6.000 f(x) = 0.3442835332x + 2.9422777796

R² = 0.9903507767
5.000

4.000

3.000

2.000

1.000

0.000
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00
Col umn H Col umn I Col umn J
Col umn K Li nea r (Col umn K)

[2hidroxisuccínico] (µM)
 1 2 5.1

1/v

2.08 2.63 4.17

1.10 1.28 1.96
0.70 0.84 1.15
0.59 0.61 0.84
0.52 0.52 0.64
0.49 0.50 0.57
0.43 0.45 0.53
0.40 0.44 0.48

m b alpha Ki
0 0.80 0.36 1.00 -
1 1.02 0.39 1.29 3.45
2 1.37 0.34 1.70 2.86
5.1 2.29 0.36 2.85 2.76

Ki 3.02 mM

Chart Title
4.50
4.00 f(x) = 2.2682667763x + 0.3732036921
3.50 R² = 0.9997082808
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80
Col umn H Col umn I
Col umn J Col umn K
Li near (Col umn K)