Tipos de colorantes:

Ácidos:

En disolución se cargan negativamente por eso se unen a estructuras cargadas positivamente y

no las células, que tienen carga negativa.

Sales de Na. K, Ca, ión amonio, eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina ácida.

Básicos:

En disolución se cargan positivamente uniéndose a estructuras con carga negativa como las
células.

Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fucsina fenicada o carbol-
fucsina.

TINCIÓN SIMPLE

Se utiliza un colorante, generalmente básico, como, por ejemplo, azul de metileno, cristal violeta
y fucsina.

Todos los microorganismos toman el mismo color, con este tipo de coloración no se pretende
diferenciar microorganismos o estructuras celulares. La tinción simple nos proporciona
exclusivamente información acerca de la forma, tamaño y tipo de agrupación de los
microorganismos. Sin embargo, tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y rápido.

Las técnicas de coloración simple pueden ser positivas o negativas. En las tinciones positivas el
colorante es fijado por las células apareciendo los microorganismos de color oscuro o coloreado
sobre un fondo luminoso o claro. Ejemplo: tinción de azul de metileno, tinción de Gram, etc.
Mientras que, en las tinciones negativas los microorganismos no fijan el colorante, en cuyo caso
el fondo es el que se tiñe y los microorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro.
Ejemplo: tinción con nigrosina.
TINCIÓN DIFERENCIAL

Se denominan así los procedimientos de coloración que ponen de manifiesto diferencias entre
las células microbianas o entre subestructuras de una misma célula. Básicamente comprenden
el empleo de más de un colorante, mordientes y de colorantes específicos.

Ejemplos: tinción de Gram, tinción de endosporas, etc.

Generalmente, en las tinciones diferenciales los microorganismos se tiñen con la ayuda de una
sustancia química denominada mordiente. Una de las funciones de un mordiente es aumentar
la afinidad de una muestra biológica por un colorante; otra es cubrir una estructura (como un
flagelo) para darle mayor espesor y facilitar la observación después del teñido.

Algunos ejemplos de mordientes son: soluciones de oxalato amónico, ácido tánico, sales de
aluminio, estaño, zinc, cobre, iodo, etc.

TINCIONES COMÚNMENTE USADAS EN MICROBIOLOGÍA

Coloración de azul de metileno (tinción simple, directa, positiva) Se cubre el frotis ya fijado con
la solución de colorante durante aproximadamente 5 minutos.

Lavar con agua, secar y observar al microscopio.

COLORACIÓN DE GRAM (TINCIÓN DIFERENCIAL)

La tinción de Gram fue desarrollada por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1884

y es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera prueba

a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una
información esencial, sobre la forma, tamaño y agrupación celular. La tinción de Gram divide

a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos según el tipo y
composición de la pared que presentan: bacterias con pared de tipo Gram positiva y bacterias
con pared de tipo Gram negativa.

Procedimiento

a) Preparar el frotis en la forma ya indicada.

b) Cubrir el frotis ya fijado con cristal violeta y dejar actuar durante 1 min.

c) Lavar con agua corriente, cuidando que no se arrastre la preparación.

b) Cubrir con solución de Lugol (I3K), dejar actuar durante 1 min y lavar con agua.

c) Cubrir con alcohol-acetona, durante 10 s y lavar con agua 3 veces.

d) Cubrir con solución de fucsina básica o safranina (si se usa la fucsina fenicada se diluye 1/10),
dejar actuar 30 s y lavar con agua. Secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión
(100x).

Resultados

Con esta coloración las bacterias se presentan de dos colores distintos, las llamadas GRAM

POSITIVAS, de color azul a violeta, y las llamadas GRAM NEGATIVAS, de color rosado a rojo

Fundamento

Las bacterias reaccionan de modo distinto frente a la tinción de Gram porque las diferencias
estructurales en sus paredes determinan la retención o el escape del complejo cristal
violeta/yodo (lugol). Las bacterias Gram positivas tienen un peptidoglucano en su pared celular
más grueso que las bacterias Gram negativas. Por otro lado, las bacterias Gram positivas
presentan un polímero con un gran número de uniones cruzadas dando como resultando un
plano de malla pequeña, mientras que, las bacterias Gram negativas presentan un polímero con
pocos entrecruzamientos que determina una malla planal de “criba” o tamiz grande.

En consecuencia, cuando se decolora el preparado con alcohol o alcohol-acetona, las células

Gram positivas retienen el complejo colorante-mordiente y permanecen de color violeta. En
cambio, en las células Gram negativas el alcohol altera la capa externa de lipopolisacárido y el
complejo colorante/mordiente se elimina de la capa delgada de peptidoglucano. Como
consecuencia, las células Gram negativas son incoloras hasta que se agrega el colorante de
contraste rojo (fucsina o safranina), después de lo cual aparecen de color rosado.

COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (TINCIÓN DIFERENCIAL PARA BACTERIAS ÁCIDO-ALCOHOL

RESISTENTES)

Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-Neelsen,

que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir aquellos
microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol
resistentes) de otros que no resisten la decoloración (ácido alcohol sensibles)

Procedimiento

a) Sobre el preparado ya fijado se vierte la solución de fucsina de Ziehl sin diluir.

b) Se calienta hasta que empiecen a desprenderse vapores blancos, haciendo pasar por debajo
del portaobjetos la llama de un hisopo embebido en alcohol. Se repite tres veces el
procedimiento.

c) Dejar enfriar 5 min y lavar con agua.

d) Decolorar con una solución de ácido clorhídrico al 3% en etanol de 95% (mezcla alcohol-
ácido), hasta la decoloración casi total del frotis.

e) Lavar con agua.

f) Cubrir unos minutos con solución de Azul de Metileno.

g) Lavar con agua, secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

Resultado

Las bacterias ácido-alcohol resistentes (bacilos de la tuberculosis, lepra y otras Micobacterias)

se observan de color rojo sobre el contraste azul de otras células bacterianas o restos celulares
pertenecientes a los organismos sensibles a esta decoloración ácida

Fundamento

Ciertos microorganismos especialmente los del género Mycobacterium (M. tuberculosis, M.

leprae, etc.) y Nocardia tienen dificultades para colorearse con las tinciones simples y aún con
la de Gram, por lo cual se los denomina bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR).

Dichos microorganismos contienen una gran cantidad de ceras asociadas a la mureina de la

pared celular. Estas ceras (lípidos sólidos) contienen ácidos grasos de cadena muy larga (ácidos
micólicos) que serían la causa de la resistencia a los métodos habituales de tinción.

Los BAAR retienen el color rojo porque las ceras vuelven a solidificarse al enfriarse y por lo tanto,
no actúa el decolorante. Las células que no son ácido-alcohol resistentes permanecerán
incoloras hasta que se coloree el extendido con azul de metileno, que actúa como colorante de
contraste. Las bacterias que no son ácido-alcohol resistentes aparecerán de color azul después
de la aplicación del colorante de contraste.

TINCION DE WRIGHT

La tinción de Wright cuyo colorante está compuesto de azul de metileno (que tiñe de color azul
las partes acidas de las células) y eosina (que tiñe las partes alcalinas) disueltos en metanol (que
permite la fijación de las células), adicionando a la preparación buffer de fosfatos (que rehidrata
a las células después de la exposición con metanol)

Procedimiento

1.Colocar una gota de sangre o impronta de células.

2.Hacer la extensión de las sangre con un movimiento suave y firme.

3.Secar al aire

4.Cubrir el frotis completamente con el colorante de Wright durante 7 minutos.

5.Sin tirar el colorante agregar el buffer de fosfatos durante 15 minutos.

6.Decantar y enjuagar con agua destilada.

7.Observar al microscopio.

COLORACIÓN DE ENDOSPORAS (TINCIÓN DIFERENCIAL)

Las endosporas bacterianas pueden distinguirse en las preparaciones microscópicas sin previa
coloración debido a la gran refringencia de su protoplasma, que las diferencia de las células
vegetativas. En las preparaciones teñidas por métodos comunes, las endosporas no se colorean
debido a la resistencia que ofrece su gruesa cubierta a la impregnación por los colorantes
habituales utilizados en la coloración de Gram y azul de metileno, permaneciendo incolora
rodeada por la parte coloreada (vegetativa) de la bacteria. No obstante, es posible lograr la
tinción de las endosporas por medio de métodos especiales en los que se emplea el calor como
mordiente.

Las endosporas, debido a las características de sus envolturas no se tiñen con procedimientos
habituales. El método más empleado es el de Schaeffer-Fulton donde la suspensión de
microorganismos se tiñe en caliente con el colorante verde de malaquita, un colorante soluble
en agua por cuya razón no se utiliza habitualmente en tinciones convencionales. El calor
modifica la permeabilidad de las endosporas y permite la entrada del colorante a través de

las capas externas. A continuación, el lavado con abundante agua produce la decoloración de
las formas vegetativas así como de los extremos de las bacterias esporuladas, que se tiñen por
último con un colorante de contraste, la safranina

Procedimiento

a) Realizar un frotis colocando una capa fina del cultivo sobre el portaobjeto, dejar secar y fijar
con la mínima cantidad de calor.

b) Cubrir la preparación con solución al 5% de verde de malaquita, calentar con hisopo hasta la
emisión de vapores y dejar enfriar durante 5 min.

c) Lavar con agua.

d) Colorear durante 30 s con solución acuosa de safranina al 0,5%.

e) Lavar con agua, secar con papel y observar con el objetivo de inmersión.

Resultados:

Las endosporas se tiñen de verde y las células vegetativas de rojo a rosado.

COLORACIÓN DE CÁPSULAS BACTERIANAS (TINCIÓN NEGATIVA)

Las cápsulas bacterianas no tienen la misma afinidad por los colorantes que otros componentes
de la misma, por lo que se emplean coloraciones especiales. Algunas, colorean la célula y el
fondo, pero no la cápsula, de manera que ésta se aprecia por contraste (método de Anthony).
Otras se basan en colorantes diferenciales cuando la cápsula toma un colorante y la bacteria
otro (método de Muir). Existe otro procedimiento que utiliza el principio de la coloración
negativa, en el cual las cápsulas se observan como un halo claro contra un fondo oscuro (método
de la tinta china).

Procedimiento

a) Colocar sobre un portaobjetos una pequeña cantidad de solución fisiológica, agua o caldo,
con un ansa en anillo, dispersar en ella una pequeña cantidad del inóculo bacteriano joven.

b) Agregar con un ansa en anillo, una pequeña cantidad de tinta china, mezclar bien y cubrir
inmediatamente con un cubreobjetos, dejando que el líquido se extienda formando una delgada
película. Se debe evitar la formación de burbujas de aire en el preparado.

c) Examinar con el objetivo de inmersión.

Fundamento

La cápsula desplaza a las partículas de carbono coloidal de la tinta china, apareciendo un halo

claro alrededor del microorganismo

COLORACIÓN DE FLAGELOS (TINCIÓN DIFERENCIAL)

Los flagelos bacterianos son estructuras de locomoción demasiado finas para visualizarlos con
el microscopio óptico sin tinción. Para lograr su coloración se trata de engrosarlos aplicando
soluciones coloidales inestables de ácido tánico, que se depositan sobre estas estructuras

engrosando el diámetro aparente de los mismos, de tal manera que se hacen visibles al
microscopio óptico con una tinción con fucsina básica. En la coloración de flagelos requiere
mucho cuidado la fijación de la bacteria en la confección del preparado, dado la facilidad con
que pueden desprenderse los flagelos por daños mecánicos.