OBTENCIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS COMPONENTES DEL PIGMENTO DE

PLANTAS POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

Gianfranco Narcizo Gamarra Estrada(20151332G), Richard Castillo Trujillo(2016)
Laboratorio de Química Orgánica I, PQ-311, FIP
Gianfrancobl@hotmail.com,

Realizado: Mayo 26, 2018

Presentado: Mayo 31, 2018

RESUMEN
Alguna vez nos hemos preguntado por la coloración verdosa de las hojas de las plantas, pero la
pregunta sería si los componentes que contiene dentro son todos verdes o hay otros
componentes con distinta coloración pero en menor proporción e intensidad. Mediante la
cromatografía de capa fina identificaremos mediante distintos solventes los componentes de
la pigmentación de las plantas y adicionalmente calcularemos el Rf.

Palabras claves: Clorofilas, Relaciones de frentes, solventes, cromatografía de capa fina.

1. INTRODUCCIÓN
La cromatografía de adsorción es la forma clásica de cromatografía ideada por Tswett por
primera vez en 1903, con la que logró separar diferentes pigmentos vegetales. [1]

La cromatografía líquida de adsorción se caracteriza por utilizar una fase estacionaria sólida
(Adsorbente) de carácter polar y una fase móvil líquida (Eluyente) apolar, y se utiliza tanto con
fines analíticos (identificación de sustancias) como con fines preparativos (aislamiento), siendo
su limitación más importante la dificultad de separar sustancias de polaridad parecida. [2]

En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria la constituye un sólido poroso finamente

granulado, siendo el proceso de adsorción debido a las atracciones intermoleculares dipolo-
dipolo o puentes de hidrógeno entre los componentes de la muestra y el adsorbente. El
adsorbente más utilizado es el gel de sílice, aunque también se utiliza alúmina activada: debe
tenerse en cuenta que la capacidad de retención de un adsorbente varía en función de su
grado de activación que a su vez depende del contenido en agua: La activación requiere
eliminar de su superficie el agua adsorbida, operación que se lleva a cabo por secado
prolongado a vacío y alta temperatura; aunque un exceso de activación puede producir
adsorciones irreversibles e incluso reacciones catalíticas indeseadas. [2]
 Figura 1. Estructura del gel de sílice (solido poroso), e interacciones con algunos compuestos
polares. [2]

Por otra parte, la fase estacionaria debe ser químicamente inerte con las sustancias que se
pretenden separar, por lo que hay que tener en cuenta que el gel de sílice tiene carácter ácido,
mientras que la alúmina puede adquirirse con carácter ácido, básico o neutro. [2]

La fase móvil está constituida por una mezcla de disolventes que deben ser, al menos,
parcialmente solubles. Para una fase móvil determinada, cuanto más polar sea la sustancia de
la muestra, más va a ser retenida por la fase estacionaria (o menos arrastrada por la fase
móvil), mientras que por lo que respecta a la velocidad de elución de una sustancia
determinada, depende de la naturaleza de la fase móvil: cuanto más polar sea la fase móvil
más se desactivará la fase estacionaria y, por lo tanto, menos retenida quedará la sustancia en
cuestión, recogiéndose en el cuadro adjunto una relación de los disolventes más utilizados en
esta tipo de cromatografía.(2)

Tabla 1. Eluyentes más utilizados en cromatografía. Va del menos polar (hexano), al más polar
(agua). [2]
Como orientación se puede decir que, de forma general, una ordenación de algunos
compuestos orgánicos de menor a mayor polaridad puede ser: Alcanos, Alquenos, Éteres,
Hidrocarburos halogenados, Hidrocarburos aromáticos, Aldehídos y Cetonas, Ésteres, Aminas,
Alcoholes y Tioles, Fenoles y Ácidos carboxílicos. [2]

Con lo expuesto se llegan a las siguientes conclusiones:

 Para un mismo compuesto, un aumento en la polaridad de la fase móvil hace que se

desplace con más facilidad de la fase estacionaria.
 Para compuestos poco polares, que se retienen poco en el absorbente, se utilizan
eluyentes apolares o poco polares.
 Para compuestos muy polares, que quedan muy retenidos en el adsorbente, se
emplean eluyentes muy polares.
 Para compuestos de polaridad media se emplean eluyentes de polaridad intermedia y
son muy aconsejables en estos casos las mezclas en distintas proporciones de hexano-
acetato de etilo.

CROMATOGRAFÍA ANALÍTICA EN CAPA FINA (CCF)

La fase estacionaria (adsorbente) se encuentra depositada, formando una capa fina de un

espesor uniforme sobre una placa de vidrio, plástico o una lámina metálica. La mezcla a
analizar se deposita con un capilar a una pequeña distancia del borde inferior de la placa
(Figura 2) y se introduce en una cubeta donde está la fase móvil (eluyente), que ascenderá a lo
largo de la capa por capilaridad eluyendo a los componentes de la mezcla a distintas
velocidades, lo que provoca su separación (Figura 3). Cuando el frente del disolvente se
encuentra a ~ 0.5 cm del borde superior, se saca la placa de la cubeta, se marca hasta donde
ha llegado el eluyente y se deja secar para, a continuación, proceder a la visualización de las
manchas correspondientes a los productos cromatografiados. [5]

Figura 2. Aplicación de la muestra con un tubo capilar. [3]

 Figura 3.Desarrollo en la placa. [3]

Determinación del Rf
Se conoce como Rf (rate factor) la relación entre las distancias recorridas por un compuesto y
por el disolvente desde el origen del cromatograma.

Cada compuesto en unas condiciones cromatográficas determinadas: adsorbente, disolvente,

temperatura, etc, tiene un valor constante y característico de Rf. Sin embargo, solo se pueden
establecer comparaciones entre los Rf de dos compuestos cuando los dos se eluyan juntos en
la misma placa. La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la mancha
(Figura 4).

Figura 4: Determinación del Rf de dos compuestos A y B. [3]

Pigmentos principales de plantas verdes

Clorofilas: responsables de la coloración verde de las hojas. Hay dos tipos, la clorofila α y la
clorofila ß

Figura 5. Los dos principales tipos de clorofila presentes en plantas verdes. [4]

Los hidrocarburos conocidos como carotenoides son los pigmentos rojos y anaranjados
también presentes en las hojas de las plantas, pero que no son evidentes en la mayoría de las
mismas debido a la presencia de los pigmentos verdes. Los carotenos son muy numerosos. Los
dos carotenos más conocidos son el licopeno y el β–caroteno.

Licopeno

β–caroteno

Figura 6. Estructuras del licopeno y β–caroteno. [4]

La hipótesis de trabajo entonces es:

 Identificar los componentes de nuestra muestra de la espinaca mediante la prueba

experimental de cromatografía de capa fina.

Objetivos:

 Objetivo general: separar los distintos pigmentos presentes en la hoja de espinaca

mediante cromatografía.
 Objetivo específico: Evaluar que solvente es mejor para separar la solución, y calcular
los Rf.
2. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
Se lavó 6 placas de vidrio con detergente, se enjuagaron con agua destilada y se secó con papel
filtro, a partir de aquí se manipuló las placas tomándolas por los bordes; se colocó las seis
placas de vidrio sobra una cerámica limpia. Se pesó silica gel en polvo y se vertió en un vaso de
precipitado, se agregó agua destilada poco a poco y se agitaba con una bagueta, se agregó
agua hasta que la papilla formada tomó consistencia espesa pero fluida. Luego se procedió a
revestir las placas con el absorbente, para esto se tomó una placa de vidrio y se vertió un poco
de la papilla sobre el extremo superior de la placa y se inclinó de modo que la papilla se
extendió por toda la superficie de esta, se procuró que la capa fuese uniforme, el exceso del
absorbente se devolvía al vaso, con esto se obtuvo una capa lisa y uniforme de gel sobre la
superficie de las placas, con un revestimiento suficientemente espeso que opacaba la
superficie del vidrio (se hizo lo mismo para todas las placas). Se dejó las placas reposar unos
minutos hasta que el gel secara, enseguida se procedió a activar las placas, lo que se consigue
eliminando el agua, para esto se colocó las 6 placas en la estufa durante varios minutos, luego
se dejó enfriar.

Se introdujo un tubo capilar en la muestra madre (muestra que contiene los pigmentos de la
hoja de espinaca) para que esta solución ascienda por el tubo. Con mucho cuidado se colocó
una o dos gotas, aproximadamente a un centímetro del borde de una placa.

Se realizó el desarrollo de la placa en un vaso de precipitado tapado con una luna de reloj, se
colocó un papel de filtro de tal forma que recubrió las paredes interiores del vaso. Enseguida
se vertió el solvente en el vaso de precipitado y se esperó a que el solvente impregne el papel
filtro. Después se colocó la placa un poco inclinada dentro del vaso, de modo que el solvente
no alcance la zona donde aplicamos la muestra madre. Luego se tapó el vaso con la luna de
reloj y al rato se observó el desplazamiento del solvente y de los pigmentos sobre la superficie
revestida de la placa, cuando el solvente estaba cerca del borde superior de la placa, se retiró
esta y se marcó con un lápiz hasta donde llego el solvente, finalmente se esperó unos minutos
a que el solvente se evaporase para realizar las observaciones y la toma de apuntes.

3. PARTE EXPERIMENTAL
Se tomó aproximadamente 5g de sílice gel en polvo y se vertió en un vaso de precipitado de 50
ml, se agregó agua destilada poco a poco y se agitó con una bagueta. La papilla que se formó
debía tener la consistencia de una pasta espesa pero fluida. Para revestir las placas con el
adsorbente se procedió tomando las placas por los bordes, se vertió un poco de papilla en el
extremo superior de la placa, inclinando de modo que la papilla se extendió por toda la
superficie de esta.

Se procuró que el revestimiento sea lo más uniforme posible. El exceso de gel se vertió de
nuevo al vaso. Esta operación produjo una capa lisa y uniforme de gel sobre la superficie de las
placas, con revestimiento suficientemente espeso para opacar la superficie del vidrio. Se dejó
las placas en reposo durante 5 ó 10 minutos para que el gel se seque. Enseguida se activó las
placas en mención colocándolas en una estufa a 100 ºC durante 20 minutos. Luego se dejó
enfriar. Luego se introdujo el extremo de un tubo capilar pequeño en la muestra madre para
que la solución ascendiera por el tubo debido a la capilaridad. Enseguida se dejó caer una o
dos gotas en la placa aproximadamente a 1 cm del borde.

El desarrollo de las placas se llevó a cabo en vasos de precipitado tapados con lunas de reloj.
Se colocó un papel de filtro de tamaño adecuado de modo que recubrió las paredes laterales
interiores del vaso. Enseguida, se vertió un poco de solvente en el vaso (10ml), se esperó que
el solvente impregne el papel de filtro. Después se colocó la placa en el interior de la cubeta
 teniendo en cuenta que el solvente no alcance el área de aplicación de las muestras. Se tapó
con una luna de reloj y se observó el desplazamiento del solvente y de los pigmentos sobre la
superficie revestida de la placa. Cuando el solvente llegò aproximadamente a 0.5 cm del
extremo superior de la placa, se retiró la placa de la cubeta y se marcó el límite superior del
solvente con un lápiz. Finalmente se dejó evaporar el solvente a la atmósfera unos minutos.

Este experimento se realizó para los siguientes solventes:

 Acetona (10ml)
 Diclorometano (10ml)
 Éter de petróleo (10ml)
 Mezcla: Acetona (2ml), éter de petróleo (8ml)

DIAGRAMA DE FLUJO

El diagrama muestra las principales operaciones realizadas en el experimento.

PREPARACION DEL ABSORBENTE ACTIVACIÓN

ENVOLVIMIENTO CON
EL ABSORBENTE Se coloca las placas en
Silice de gel en polvo (5g aprox.),
agua destilada la estufa a 100ºC

SECADO Y ANÁLISIS
ELUCIÓN Y SEPARACIÓN
El secado es a la atmosfera
4. RESULTADOS
Según el tipo de solvente utilizado mostramos los resultados obtenidos en cada placa.

Figura 7. Placas desarrolladas de nuestra muestra para las distintas fases móviles.

Para analizar los resultados nos ayudamos con la siguiente imagen, que indica los colores de
los pigmentos presentes:

Figura 8. Colores de los pigmentos de las plantas verdes.

Como ya se vio para un mismo compuesto, un aumento en la polaridad de la fase móvil hace
que se desplace con más facilidad de la fase estacionaria. Por lo que el orden de polaridad de
los eluyentes sería el siguiente:

Acetona > diclorometano > éter de petróleo

Otra observación es que mientras más arriba este el pigmento, menos polar es, entonces el
orden de polaridad de los pigmentos es:

Clorofila b > clorofila a > xantofilas > carotenos

Podemos observar que los carotenos no se aprecian con mucha claridad, esto se puede deber
a que estén en poca concentración o no se haya separado bien de los demás pigmentos.

Por último, vemos que la acetona desplaza mucho los pigmentos, mientras que el éter no
desplaza casi nada. Para estos casos es más adecuado utilizar una mezcla de estos dos
eluyentes, como podemos observar en la imagen, la separación de los pigmentos ha sido más
precisa que con los eluyentes por si solos.

Cálculo de los Rf

Figura 9. Dibujo realizado mostrando distancia recorrida por el compuesto y solvente.

Solo se hará los cálculos de Rf para la mezcla de acetona y éter de petróleo, dado que es el
resultado más preciso.

Y=6cm Rf
X1 =1.5cm (clorofila b) Rf1=1.5/6=0.25
X2 =2.8cm (clorofila a) Rf2=2.8/6=0.46
X3 = 2cm (carotenos) Rf3= 2.0/6=0.33
X4 =4.3cm (xantofila) Rf4=4.3/6=0.72
5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Dado los distintos solventes utilizados, estos según su polaridad muestran en la placa distinta
coloración. Un solvente más polar mostrara los componentes más polares (acetona) de la
nuestra muestra, mientras que un solvente menos polar (éter de petróleo) podría mostrarnos
los otros componentes, entonces si tenemos dos solventes quienes logran mostrarnos ambas
partes de los componentes, empleamos una mezcla de dichos componentes (acetona + éter de
petróleo), en el cual podemos visualizar toda la coloración desde la clorofila b, clorofila a,
xantofilas y carotenos mostrados en la figura 7.

El cálculo de Rf nos sirve para determinar el mejor solvente debido a la distancia que
recorrerá, pues un solvente más polar como la acetona hace eluir más rápido mientras que el
éter de petróleo por cuestiones de retención de la fase estacionaria su desplazamiento es
menor.

6. CONCLUSIONES

Se logro la identificación de los componentes de la mezcla de pigmentos de las hojas de

espinaca por la prueba de cromatografía de capa fina.

Logramos identificar quien es el mejor solvente para esta práctica experimental. Una mezcla
de éter de petróleo y acetona fue suficiente para extraer los colores de los componentes
correspondientes de los pigmentos, estos ya mencionados anteriormente.

RECOMENDACIONES:

Añadir y esparcir adecuadamente el gel de sílice en forma de papilla sobre las placas sin
dejar lugar libre y no muy diluido puesto que podría ocasionar que no se absorba la mezcla
estudiada.
Tener sumo cuidado con la aplicación de la mezcla en la placa con capa de gel de sílice, el
tubo capilar o gotero no debe chocar puesto que dañaría la capa que hemos formado y
una negligencia experimental con los resultados obtenidos.

Tapar bien los vasos de precipitados debido a la volatilidad de los solventes orgánicos
podría ocasionar perdida de ellos y el fallo en el experimento.

7. CUESTIONARIO
1. En todas las formas de cromatografía hay una fase móvil y una fase estacionaria.
A) En general, en cromatografía de capa fina ¿cuál es la fase estacionaria?
FASE ESTACIONARIA: ADSORBENTE
Está constituida por un sólido poroso, finamente granulado, con centros activos polares en su
superficie donde se adsorben las moléculas de los compuestos que se van a cromatografíar.
Cuanto menor sea el tamaño de partícula de este material mayor será la capacidad de
adsorción. La adsorción se debe a interacciones intermoleculares del tipo dipolo-dipolo, dipolo
dipolo inducido o enlaces de hidrógeno entre el adsorbente y el soluto. El adsorbente debe ser
inerte con las sustancias a cromatografía.
B) En general, en la cromatografía en capa fina, ¿cuál es la fase móvil?
FASE MOVIL: ELUYENTE
Es un disolvente en el que los componentes de las mezcla son, al menos, parcialmente
solubles. Al aumentar la polaridad del disolvente aumenta la velocidad de elución de los
compuestos de la mezcla. Se puede utilizar un único disolvente o una mezcla de disolventes e
incluso llevar a cabo la elución con un gradiente de polaridad aumentando progresivamente la
proporción del disolvente más polar. Las moléculas de soluto S se adsorben en los centros
polares de la fase estacionaria X y, a medida que se produce la elución, van siendo desplazadas
por las moléculas de disolvente/s que constituyen la fase móvil M.

2. Este diagrama, similar al de la guía, muestra los resultados de un experimento simple de

cromatografía en capa fina.

A) Describe breve, pero precisamente, lo que habría hecho para llegar a esta etapa. Usted
puede suponer que se le ha dado una placa de cromatografía de capa fina adecuada.

Primeramente debo tener mi mezcla de pigmentos extraidos utilizando un embudo de

decantación, solventes como metanol y éter de petróleo y almacenarlo en la oscuridad.

Luego de obtener mi mezcla de pigmentos, para empezar la cromatografía de capa fina, se

necesita placas en las cuales se le agregara una capa de sílice de gel con poca agua para luego
llevarla a secar en el horno.

Una vez obtenido las placas con capas de sílice de gel, mediante un tubo capilar agregamos
una gota de nuestra mezcla a cada placa en una distancia de 1cm en el borde inferior, por otro
lado debemos tener listo un vaso de precipitado con nuestro solvente dentro para luego poner
la placa en dicho vaso de precipitado parado desde el medio del vaso hasta apoyarse con la
pared, tapar el vaso y dejar unos minutos. Se observara el ascenso de la coloración y seguido
obtendremos algo muy similar a la imagen mostrada.

B) ¿Por qué hay una tapa sobre el vaso de precipitados?

Los solventes utilizados deben permanecer junto con la placa cierto tiempo para observar el
acenso del componente a identificar, en todo el tiempo que nos referimos el vaso debe estar
tapado debido a que el solvente es un compuesto volátil y el ambiente ocasionaría que
desaparezca ocasionando incertidumbres en el experimento.

C) Para ayudar a identificar las cosas en un cromatograma, puede medir el valor de Rf para
cada mancha. ¿Cómo calcularía el valor de Rf para cada uno de los puntos del cromatograma
anterior?
Para calcular el valor de Rf emplearemos dicha relación entre la distancia recorrida por el
compuesto y la distancia recorrida por el solvente.

Como utilizamos distintos solventes para nuestra muestra e incluso una mezcla de ellas,
debemos medir cada distancia por la distinta coloración dado que cada tono o intensidad
indica un distinto componente como en la figura 9 en la cual mostramos nuestros resultados
en un dibujo.

(Figura 9. Dibujo realizado mostrando distancia recorrida por el compuesto y solvente.)

En la siguiente figura mostramos como se determina el Rf para distintos eluyentes y una

mezcla de ellas, el cual se puede visualizar en nuestro trabajo en la figura 7.

Figura 10. Determinación del Rf para distintos eluyentes y una mezcla de ambas.
 (Figura 7. Placas desarrolladas de nuestra muestra para las distintas fases móviles.)

D) El valor de Rf para un componente particular en una mezcla es solamente constante si

usted controla cuidadosamente ciertas variables durante el experimento. Sugiere tres
variables que tendrían que ser controladas.

 La polaridad del compuesto

 Naturaleza del disolvente
 El absorbente
 Disolvente
 Tamaño del vaso
 Temperatura

3. Se ensayó una mezcla de aminoácidos (M) contra cinco aminoácidos conocidos (1 a 5) y se

realizó el siguiente cromatograma:

¿Qué puedes decir sobre la mezcla M?

La figura nos muestra pruebas cromatográficas en un mismo eluyente de distintos
aminoácidos y una mezcla de aminoácidos (M). Como se ha de visualizar del aminoácido 1
hasta el 5, proponen distintos colores lo cual sería correcto dado que son aminoácidos
diferentes, y respecto a la mezcla de aminoácidos (M) la cual nos propone 4 colores en el que 3
de ellos son iguales a de los otros aminoácidos ya mencionados, por lo tanto podemos decir
que la mezcla (M) no es más que una mezcla de los aminoácidos 3, 4, 5 y un aminoácido
adicional el cual tiene una coloración diferente.

4. La superficie del gel de sílice tiene una estructura que se parece a esta representación:
Supongamos que se utilizó una placa recubierta con gel de sílice, con propanona (CH3COCH3)
como solvente para la cromatografía en capa fina. Supongamos también que la mezcla que
estaba tratando de identificar contenía

• Un compuesto, P, que puede formar fuertes puentes de hidrógeno.

• Un compuesto, Q, que formó enlaces de hidrógeno, pero no tan fuertemente como P.

• Un compuesto, R, que era polar, basándose en las fuerzas de dispersión y las interacciones
dipolo-dipolo en sus atracciones intermoleculares.

Describa y explique cómo sería probablemente el cromatograma.

El cromatograma dependerá de la fase móvil y la fase estacionaria, puesto que las

interacciones entre el absorbente y el soluto debe ser muy buena, dado como nuestro
absorbente es gel de sílice este contiene enlaces puente hidrogeno, dipolo – dipolo e dipolo
inducido, entonces el compuesto P que es más polar por formar enlaces puente hidrogeno
será el más absorbido seguido por Q que también forma enlaces hidrogeno pero no tan fuertes
como P, y por último el compuesto R quien es un compuesto polar pero no indica la presencia
de enlaces puente hidrogeno más que interacciones dipolo-dipolo y dipolo-dipolo inducido.

Ahora nuestro solvente es propanona quien es un compuesto polar pero de menor polaridad
que los alcoholes por no presentar enlaces puente hidrogeno, entonces ocurrirá una retención
de la fase estacionaria en el compuesto P y en menor intensidad en Q debido a que el solvente
(eluyente) competirá con el gel de sílice (absorbente) para saber quién será absorbido en los
centros polares de los compuestos, de esta manera en la placa se mostrara la coloración de R
en mayor intensidad por ser polar pero menor que P y Q, todo esto debido al solvente
propanona quien es un aldehído, y también pequeñísima coloración de P y un poco más de Q.

ORDEN DE POLARIDAD DE LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS:

Ácidos carboxílicos > Fenoles > Alcoholes y Tioles > Aminas > Ésteres > Aldehídos y Cetonas >
Hc. Aromáticos > Hc. Halogenados > Éteres > Hidrocarburos Insaturados > Alcanos
8. BIBLIOGRAFÍA
[1] https://lidiaconlaquimica.wordpress.com/2015/08/14/cromatografia-de-adsorcion/

[2] https://rodas5.us.es/file/23a16560-123f-bec5-ec5b
44a3042a281d/2/laboratotio_quimica_organica_SCORM.zip/pagina_24.htm

[3] Guía de laboratorio, Universidad Nacional de Ingeniería - Facultad de Petróleo, gas natural
y Petroquímica, practica Nº4.

[4] http://universobotanico.blogspot.com/2013/08/las-plantas-y-sus-pigmentos.html

[5] https://www.uam.es/docencia/jppid/documentos/practicas/actuales/guion-p6.pdf