UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUERRERO

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICO-BIOLÓGICAS

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOQUIMICA

MANUAL DE PRÁCTICAS
DE BIOQUÍMICA

Dr. Donaciano Flores Robles

Febrero 2015
 INDICE

Practica 1: Las bases químicas de la vida.

Practica 2: Identificación de carbohidratos.
Practica 3: Lípidos.
Practica 4: Análisis de proteínas.
Practica 5: Aislamiento de ADN plasmidico por lisis alcalina

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SESIONES DE LABORATORIO.
Deberán observar el cumplimiento del reglamento de laboratorios, en cada sesión cada equipo
deberá traer el siguiente material: franela, etiquetas y/o masking tape, así como el material que
se les solicita para cada práctica. Se integrarán en equipos de trabajo de 6 a 7 estudiantes al
azar, en cada una de las prácticas. Cada equipo, nombrará a un coordinador que será el
responsable de coordinar la práctica en su equipo y la elaboración y entrega del reporte.

REQUISITOS DEL REPORTE DE PRACTICAS.

a). Tendrá la siguiente estructura:

La carátula debe contener los nombres de los integrantes del equipo, número que le
corresponde y quien es el coordinador
Título.

Objetivo (s)

Introducción investigada

Respuestas a las preguntas de cada práctica

Resultados.

Discusión de los resultados.
Conclusiones.
Bibliografía consultada

b). Será por equipo y se entregará por el coordinador del equipo

c). El alumno tendrá derecho a acreditar el laboratorio si tiene una asistencia de 80 %.
El reporte del total de las prácticas de laboratorio realizadas y acreditadas, se evaluarán con
30 % de de la acreditación total del curso.
La práctica se acreditará solo si el alumno tiene asistencias al laboratorio. En el reporte solo
se anotarán los alumnos que tienen asistencia en la práctica de laboratorio.
 Se discutirán en
el grupo, los resultados de las prácticas de laboratorio, cuando se considere convenient

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 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUERRERO
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICO-BIOLOGICAS
LABORATORIO DE BIOQUIMICA I

Práctica No. 1
LAS BASES QUIMICAS DE LA VIDA

OBJETIVO:

Demostrar la presencia de diferentes biomoléculas en diversas muestras biológicas.

INTRODUCCION: En los seres vivos, se halla una constitución química “sui generis” es decir
es privativa de ellos, existen componentes macromoleculares, moléculas pequeñas, elementos
e iones. En esta práctica, se analizarán diferentes biomoléculas, usando reactivos que cambian
de color, es decir, se utilizarán reacciones coloridas específicas de carácter cualitativo, v. gr.:

BIOMOLECULA REACTIVO
Azúcares reductores Reactivo de Benedict
Glucosa Glucocinta
Proteínas Reactivo de Millon
Grasas simples Reactivo de Sudán III
Almidón y glucógeno reactivo de Lugol
Acidos Nucleicos Reactivo de Difenilamina
Vitamina C Reactivo de Indofenol

A manera de ejemplo, se considera la composición de una bacteria típica, Escherichia

coli, simplemente para darse una idea de la complicada trama molecular que constituye lo que
llamamos vida.

COMPONENTE % DE PESO NUM. APROX. DE

TOTAL ESPECIES
MOLECULARES
Agua 70
Proteínas 15 3,000
Acidos nucleicos
DNA 1 1
RNA 6 1,000
Hidratos de carbono 3 50
Lípidos 2 40
Moléculas sillares 2 500
estructurales e
intermediarios
Iones inorgánicos 1 12

Las pruebas a realizar son sencillas, constituyen un primer acercamiento al análisis

bioquímico; a medida que el curso avance, se efectuará trabajo de laboratorio de mayor
profundidad.
 Esta introducción a la primera de las prácticas de bioquímica, quizá no esté completa si
no se esboza una definición de vida. He aquí un verdadero problema, pues hay tantas
definiciones o conceptos, como cabezas pensantes existen en el mundo. Sin embargo,
tenemos una definición que puede ser operacional; “la vida es un sistema altamente integrado,
que se caracteriza por el manejo de materia, energía e información, teniendo como base
estructural al carbono y con la capacidad de replicación y evolución”.

POR EQUIPO:
MATERIALES: REACTIVOS:

1 mortero y pistilo 25 ml de NaCl al 0.85 %

10 tubos de ensaye de 16x150 mm 1 rollo de glucocinta
1 gradilla 10 ml de levadura al 5 %
1 probeta de 100 ml 10 ml de gelatina al 2 %
1 agitador de vidrio 10 ml de almidón al 1 %
1 vaso de precipitados de 500 ml 15 ml de glucosa al 5 %
1 plata térmico o mechero de Bunsen 10 ml de glucógeno al 1 %
2 vasos de precipitados tamaño variable 10 ml de lugol
3 pipetas de 1.0 ml 10 ml de React. de Millon
3 pipetas de 5.0 ml 20 ml de React. de Benedict
1 navaja o cuchillo 20 ml de Sudán III, al 0.1% en
etanol:cloroformo 1:1 (v/v)
frascos de vidrio 20 ml de React. de Difenilamina
frascos gotero 10 ml de aceite o grasa comestible
1 tripie y tela de asbesto 10 ml de Indofenol al 0.1 %
1 baño maría 1 muestra de semen

Material biológico: Orina,naranjas, limones, manzana, guayaba, harina de soya, huevo,

leche, cacahuates, refresco de limón, papas, pastilla de vitamina C, levadura, aceite vegetal,
de oliva etc.

PROCEDIMIENTO:

1.- AZUCARES REDUCTORES:

En un tubo de ensaye, colocar 3 ml de reactivo de Benedict y adicionarle 1.0 ml de
glucosa al 5%. Caliéntese en baño maría hirviente por algunos minutos y observe que sucede.
Explique químicamente lo que visualice.

2.- PRUEBA PARA GLUCOSA:

Sumerja una tira de unos 2 cm de glucocinta en un tubo que contenga glucosa al 5%.
Que observa?. Cuál es el fundamento de esta prueba?.

3.- PRUEBA DE ALMIDONES Y GLUCOGENO:

Prepare 3 tubos, uno que contenga 5 ml de la suspensión de almidón al 1%, otro con 5
ml de glucógeno y otro con 5 ml de agua corriente. Adicione a cada tubo 2 gotas de reactivo
de lugol. Agitar. Qué color toma el contenido de cada tubo?. Químicamente como explica el
fenómeno?.

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4.- PRUEBA PARA GRASAS SIMPLES:
Para este ensayo, prepare 2 tubos de ensaye, uno que contenga 3 ml de aceite
comestible y otro que contenga agua corriente. Adicione a cada tubo 3 ml de Sudán III. Espere
5 minutos y observe la coloración. Cuál es la fórmula de este colorante?. Cuál es el efecto
sobre la grasa?.

5.- PRUEBA PARA PROTEINAS:

Prepare 2 tubos de ensaye, al primero adicione 3 ml. de gelatina al 2%, al segundo agua
corriente. En seguida añada a cada tubo 1.0 ml de reactivo de Millon y calentar por 30
segundos en baño maría. Qué cambios se observan?. Cómo explica el fenómeno?. Cuál es la
composición del reactivo de Millon?.

6.- PRUEBA PARA VITAMINA C:

Prepare 2 tubos de ensaye, al primero agregue 1.0 ml de agua, al segundo 1.0 ml de
jugo de limón. Adicionar 1.0 ml del reactivo de Indofenol a cada tubo, observando la precaución
de resbalar por las paredes y no agitar. Qué color se observa en la interfase?. qué sucede si
se agita?. por qué?. Cuál es la fórmula del Indofenol?. Cuál es la función bioquímica de la
vitamina C?.

7.- PRUEBA PARA ACIDOS NUCLEICOS:

Para este ensayo se requiere, primeramente preparar una suspensión al 5% de levadura
activa y contar con una muestra de semen.
preparar 3 tubos de ensaye: testigo, levadura y semen. Al tubo testigo se le coloca 1.0
ml de agua corriente. Al tubo para levadura se le coloca 1.0 ml de la suspensión y al tubo para
semen se le adiciona 1.0 ml. Agregar a todos los tubos 4.0 ml del reactivo de Difenilamina y
calentar en baño maría durante 15-30 minutos. Enfriar y hacer observaciones. Este reactivo
indica, con una coloración azul la presencia de DNA y con una verde la de RNA. Por qué se
incluye un tubo testigo?. De qué manera reacciona la difenilamina con los ácidos nucleicos?

MUESTRAS PROBLEMA:
Las reacciones anteriores, exceptuando la última, se van a efectuar ahora, con muestras
diversas de material biológico, de tal manera que al final sea posible construir una tabla de
resultados.

1. Qué grado de confiabilidad se encuentra en estas pruebas?

2. Se podrían hacer cuantitativas esta serie de experiencias? por qué?

3. Compare en la bibliografía que validez tienen sus resultados.

PREPARACION DE REACTIVOS:

REACTIVO DE DIFENILAMINA (REACTIVO DE DISCHE):

Añadir 4.0 g de difenilamina a 400 ml de ácido acético glacial y 11 ml de ácido sulfúrico
concentrado. Consérvese a 2 ºC y atemperar antes de su uso.

REACTIVO DE MILLON

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Añadir 60 g de óxido rojo de mercurio a una mezcla de 45 ml de ácido nítrico concentrado y 50
ml de agua. Cuando se ha disuelto. se añaden 50 ml de una solución de nitrito de sodio al 30%.
Otro método alternativo: Con PRECAUCION, disolver 100 g de mercurio en 140 c.c. de HNO 3
concentrado (se calienta en exceso), cuando se ha disuelto, diluir la solución con dos veces
su volumen con agua destilada. No prepare mas de estas cantidades a la vez.

REACTIVO DE LUGOL
Disolver 2 g de yoduro de potasio en 25 ml de agua, después adicionar 1.0 g de yodo y agitar
hasta disolución. Aforar a 100 ml.

REACTIVO DE BENEDICT
Disolver en agua, 17.3 g de sulfato de cobre, 173 g de citrato de sodio anhidro y 100 g de
carbonato de sodio anhidro, aforar a un litro con agua destilada.

BIBLIOGRAFIA

1.-Nelson, E.G. y A.A. Latina. Conceptos fundamentales de biología: Manual de laboratorio

Editorial Limusa, 1977
2.-Hernández-Montenegro, Luis R.Biología Molecular Integral. Editorial Limusa, 1979.

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FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICO-BIOLOGICAS
LABORATORIO DE BIOQUIMICA

Práctica No. 2.
IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS

Los carbohidratos son sintetizados por los organismos autótrofos a partir de pequeñas
moléculas: bióxido de carbono, agua y energía radiante proveniente del sol y constituyen los
precursores biológicos de otras biomoléculas como las proteínas y los lípidos. Pueden definirse
como derivados polihidroxialdehídicos o polihidroxicetónicos.
La identificación y separación de los carbohidratos, es un problema analítico frecuente en
bioquímica. Existen reactivos que originan reacciones características con una clase de azúcar
(monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, azúcares reductores, pentosas, cetosas, etc.)
o con azúcares en general, como el de Molisch, que nos permite identificar carbohidratos en
general, incluso glucoproteínas, se fundamenta en la acción hidrolizante y deshidratante del
ácido sulfúrico. El ácido cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos deshidratándolos
hasta formar furfural (en las pentosas) o hidroximetilfurfural (en las hexosas) de los
monosacáridos resultantes. El furfural se condensa con alfa-naftol, dando un producto
coloreado. Los reactivos como el de Benedict, Barfoed, Fehling y otros, dan prueba positiva
únicamente con azúcares reductores, casi todos ellos se fundamentan en la reducción del ión
cúprico (II) en medio alcalino, el ión cuproso (I) formado se precipita en forma de óxido cuproso
dando una coloración rojiza, su cuantificación puede determinarse gravimétricamente, por
titulación o por colorimetría.
La mayoría de las reacciones son muy sensibles, por lo que el uso de reactivos en cantidades
mayores de las que se sugieren puede conducir a interpretaciones erróneas.
Existen otras pruebas para identificar los azúcares reductores que se basan en la reducción
del ión plata o del ión bismuto, originando precipitados de color negro. La reacción del Orcinol
de Bial, permite la identificación de pentosas, al producir coloraciones azul brillantes.

OBJETIVOS: El alumno:
Mediante pruebas cualitativas identificará carbohidratos en general.


Aprenderá a diferenciar diversos tipos de azúcares, mediante el uso de reactivos

especiales.

MATERIAL Y REACTIVOS POR EQUIPO:

12 tubos de ensaye de 16 x 150 mm.

1 mechero de Bunsen

1 tripie y tela de asbesto
1 baño maría

1 gradilla metálica
5 pipetas de 5 ml

3 pipetas de 1.0 ml

1 pizeta con agua destilada

10 ml de etanol al 95 %

20 ml de sacarosa al 2 %

20 ml de almidón al 2 %

20 ml de glucosa al 1.0 %

5
20 ml de celobiosa al 1.0 %

20 ml de D-ribosa al 1.0 %

20 ml de ramnosa al 1%

20 ml de fructosa al 1.0 %

20 ml de arabinosa al 1.0 %

20 ml de reactivo de Barfoed
30 ml de reactivo de Tollens
40 ml de reactivo de Seliwanoff
30 ml de reactivo de Benedict
30 ml de reactivo de Nylander
30 ml de reactivo de Bial

20 ml de acetona

POR GRUPO: Poner a disposición los siguientes reactivos.

Sacarosa

Glucosa

Arabinosa
Acido sulfúrico conc.

Ac. clorhídrico conc.

Goma arábiga

Reactivo de Molisch en frasco gotero.

EL ALUMNO DEBE TRAER EL DIA DE LA PRÁCTICA:
 Una naranja, limón, papa, jícama,
manzana, pera, zanahoria y otros, los cuales se usaran como las muestras problema.

250 ml de alcohol etílico.

PROCEDIMIENTO: Pruebas comunes de laboratorio

I.- IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS.

Prueba de Molisch.

1.- Etiquetar 5 tubos de ensaye y agregarles 0.5 ml de las siguientes sustancias:
TUBO 1, sacarosa al 2 %
2, almidón al 2 %
3, glucosa al 1 %
4, celobiosa al 1 %
5, agua destilada (Blanco)
2.- Etiquetar otros tubos con sus muestras problema.

3.-- A todos los tubos, añadir 4 gotas del reactivo de Molisch, NO MEZCLAR!.

4.- Incline ligeramente los tubos y deslice por las paredes del mismo 5 a 7 gotas de ácido
sulfúrico concentrado, NO MEZCLAR!.
5.- Observe el color que se va desarrollando en la interfase de los dos líquidos. Anote sus
resultados.

INTERPRETACION: La presencia de un color violeta-rojizo se considera como prueba positiva.

II. IDENTIFICACION DE AZUCARES REDUCTORES.

REACCION DE BENEDICT

1.- Etiquetar 3 tubos de ensaye y agregarles 1.0 ml de las siguientes sustancias:
TUBO 1 glucosa al 1 %

6
 2 sacarosa al 2 %
3 agua destilada (Blanco)
2.- De igual manera, prepare otros tubos para sus muestras problema.
3.- Añada a todos los tubos 3 ml del reactivo de Benedict. Mezcle.

4.- Coloque los tubos en baño maría hirviente por 3 minutos.

5.- Observar y anotar los resultados.

INTERPRETACION: Un azúcar reductor originará que el ión cobre (II) se reduzca a cobre (I
produciendo un precipitado de color rojo-parduzco de óxido cuproso, la cantidad depende
de la concentración del azúcar.

REACCION DE NYLANDER
1.- Etiquetar tubos de ensaye y agregue 2.5 ml de las siguientes sustancias:
TUBO 1, Sacarosa al 2 %
2, Glucosa al 1 %
Prepare otros tubos con sus muestras problema.


2.- Adicione 1.0 ml de reactivo de Nylander. Mezclar.


3.- Coloque los tubos en baño maría hirviente por 7 minutos.

Observe si hay cambios, anote sus resultados en forma ordenada.


INTERPRETACION: La presencia de un precipitado negro indica la reducción del ión bismuto

a bismuto metálico.

II. IDENTIFICACION DE PENTOSAS.

REACCION DE BIAL

1.- Etiquetar tubos de ensaye y agrégueles 1.0 ml de las siguientes sustancias:
TUBO 1, fructosa al 1 %
2, ribosa al 1 %
3, arabinosa al 1 %

4, sacarosa al 2 %

5, agua destilada
 (Blanco)
Prepare otros tubos para sus muestras problema que usted considere
2.- Adicione a todos los tubos 2.5 ml del reactivo de Bial. Mezcle con suavidad.

3.- Lleve los tubos a baño maría hirviente de 5 a 10 minutos.
La reacción puede ser inmediata, anotar los resultados.


INTERPRETACION. La aparición de un color azul, indicará la presencia de pentosas-

REACCION DE TOLLENS

1.- Etiquetar tubos de ensaye y agrégueles 0.5 ml de las siguientes sustancias

TUBO 1, glucosa al 1%
2, almidón al 2%
3, arabinosa al 1%
4, sacarosa al 2%
5, agua destilada (Blanco).
Prepare otros tubos con las muestras problema que considere.


7
2.- Adicione a todos los tubos 2.0 ml del reactivo de Tollens. Mezclar con cuidado.

3.- Lleve los tubos a baño María hirviente 5 minutos. Sáquelos y anote los cambios que
observe.


INTERPRETACION. La presencia de un color rosado a rojo indica la presencia de pentosas.

REACCION DE ROSENTHALER.
Para identificar metilpentosas.

1.- Etiquete tubos de ensaye y adicione los azúcares siguientes (en polvo), suficiente cantidad
que cubra el fondo del tubo.
TUBO 1, arabinosa
2, ramnosa
3, glucosa
2.- Agregar 2.5 ml de HCl y 0.75 ml de acetona, resbalando ambos reactivos por las paredes
del tubo y mezclar con cuidado.

3.- Llevar los tubos a baño maría hirviente por varios minutos.
Anotar los cambios que observe.

INTERPRETACION. La formación de un color rojo intenso indica la presencia de metilpentosas.

III. IDENTIFICACION DE MONOSACARIDOS.


REACCION DE BARFOED

1.- Etiquetar tubos de ensayo y agrégueles 0.5 ml de las siguientes sustancias.

TUBO 1, glucosa al 1%
2, celobiosa al 1%
3, sacarosa al 2%
Prepare otros tubos para sus muestras problema

2.- Añada a todos los tubos, 2.0 ml del reactivo de Barfoed y mezcle con suavidad.
3.- Coloque los tubos en baño maría hirviente por 4 a 6 minutos
Observe los cambios ocurridos.

INTERPRETACION. La prueba distingue entre monosacáridos y disacáridos, la cual es

positiva por la aparición de precipitado de color rojo de óxido cuproso. Con soluciones
concentradas de disacáridos (maltosa o lactosa) y calentamiento prolongado puede dar
ligeramente positiva.

IV. IDENTIFICACION DE CETOSAS

REACCION DE SELIWANOFF


1.- Etiquetar tubos de ensayo y agrégueles 0.5 ml de las siguientes sustancias.

TUBO 1, fructosa al 1%
2, glucosa al 1%
3, ramnosa al 1%
4, sacarosa al 2%
Prepare otros tubos con las muestras problema


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2.- Adicione 5.0 ml del Reactivo de Seliwanoff a todos los tubos, mezcle con cuidado.

3.- Lleve los tubos a baño maría hirviente por 20 segundos.

4.- Observar el color formado, si aparece un precipitado de color rojo, retire el tubo y
decántelo.

5.- Al precipitado agregar 5.0 ml de alcohol, mezcle y anote el cambio ocurrido.

INTERPRETACION. La reacción es positiva cuando aparece un color rojo con formación de

precipitado del mismo color, después de calentar a ebullición. El precipitado tiende a
disolverse en alcohol y dar este un color rojo intenso.

INVESTIGAR:

1.- Fundamentos químicos de las reacciones efectuadas.
2.- Qué es un azúcar reductor?.
3.- Las estructuras químicas y su importancia bioquímica de las siguientes sustancias: D-
glucosa, D-fructosa, D-galactosa, sacarosa, D-ribosa y D-desoxirribosa.

PREPARACION DE REACTIVOS:


1.- REACTIVO DE MOLISCH. Solución de alfa-naftol al 5 % en alcohol etílico.

2.- REACTIVO DE BARFOED MODIFICADO. Disolver 24 g de acetato de cobre en 450 ml de

agua hirviendo, añadir con rapidez 25 ml de ácido láctico al 8.5 %. Agitar, con lo cual casi
todo el precipitado se disolverá.; enfriar, diluir a 500 ml y filtrar. No usar en muestras que
contengan cloruros, puede dar falsos positivos.

3 REACTIVO DE BENEDICT. Disolver en agua, 17.3 g de sulfato de cobre, 173 g de citrato de

sodio anhidro y 100 g de carbonato de sodio anhidro, aforar a un litro con agua destilada.

4.- REACTIVO DE NYLANDER.- Disolver 2 g de subnitrato de bismuto y 4 g de tartrato doble

de sodio y potasio en 100 ml de KOH al 10 %. Enfriar y filtrar.

5.- REACTIVO DE BIAL.- Disolver 6 g de orcinol en 200 ml de etanol al 95 %. Agregar 1.0 ml

de FeCl3 al 10 %. El reactivo se conserva por lo menos seis meses.

6.- REACTIVO DE TOLLENS.- Mezclar 10 ml de HCl concentrado con 2 ml de floroglucinol al

2 % en etanol y llevar a 18 ml.

7.- REACTIVO DE SELIWANOFF.- Disolver 0.25 g de resorcinol en 500 ml de HCl 6N (HCl

conc. :agua, 1:1 v/v).

BIBLIOGRAFIA
1.- Litwack, G. Bioquímica Experimental, 1967. Ediciones Omega, S.A. Barcelona España.
2.- Rendina, G. Técnicas de Bioquímica aplicada, 1974. Editorial Interamericana, S.A. México.

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 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUERRERO
UNIDAD ACADEMICA DE CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS
LABORATORIO DE BIOQUIMICA
PRACTICA 3
LIPIDOS
Objetivo:

Identificar los lípidos presentes en diversas muestras biológicas, mediante pruebas comunes de
laboratorio.

INTRODUCCION:

Los lípidos son biomolé́ culas orgá nicas insolublés én él agua, tiénén én comú n sér solublés én
disolvéntés no polarés como él cloroformo, béncéno, é́ tér, alcohol caliénté. Para diférénciar é
idéntificar la gran cantidad dé lípidos qué puédén éncontrarsé én aliméntos y productos bioló gicos,
és nécésario réalizar aná lisis químicos, como la détérminació n dél índicé dé réfracció n, qué
pérmité détéctar adultéracionés, por comparació n con él índicé dé réfracció n dél acéité o á cido
graso patró n puro.
El índicé dé acidéz qué sé définé como la cantidad dé miligramos dé KOH nécésarios para
néutralizar la acidéz dé un gramo dé muéstra, él índicé dé yodo sirvé para détérminar él grado dé
insaturació n dé un á cido graso o acéité, débido a qué él yodo és absorbido ú nicaménté én los doblés
énlacés. El índicé dé yodo sé définé como la cantidad dé yodo qué absorbén 100 g dé muéstra.
Los lípidos sé déscomponén por él calor y sé vuélvén rancios por oxidació n con él oxígéno dél airé,
por él rompimiénto dé los doblés énlacés, formá ndosé productos de olores desagradables.
La formació n dé compléjos dé á cidos grasos con uréa, pérmité la obténció n dé compuéstos
cristalinos fá cilménté aislablés, cuyo punto dé fusió n y forma dé cristalizació n ayudan a idéntificar
al á cido graso.
Los á cidos grasos mas abundantés én las plantas y én los animalés son él palmítico (16 C) y
éstéá rico (18 C), ambos saturados y los á cidos grasos insaturados oléico (18 C) y linoléico (18 C)
de una y dos dobles ligaduras respectivamente.
Los lípidos sé considéran como résérvas énérgé́ ticas én la nutrició n humana. Al oxidarsé én él
organismo producén énérgía éxprésada én la molé́ cula dél ATP, su podér caló rico és mayor qué él
de los carbohidratos, dan 9 cal/g.
Un alto conténido dé coléstérol o triglicé́ ridos én la sangré ocasiona qué éstos sé acumulén como
sarro én un tubo dé agua, provocando una obstrucció n, qué puédé llégar a sér total, ocasionando
los infartos al corazó n, qué puédén sér mortalés.

POR GRUPO:
Alcohol étílico al 96 %
MATERIALES Y REACTIVOS:
Etér étílico
Metanol o isopropanol
Acetona anhidra
Cloroformo
Acido acé́ tico glacial
Acido sulfú rico concéntrado

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Glicerina
Colesterol polvo
Acido oleico
Acido éstéá rico
Acido palmítico
Hidró xido dé sodio saturado (fco. gotéro) Sulfato dé cobré saturado (fco. gotero) Indicador rojo
congo (fco. gotero)
POR EQUIPO:
30 ml de KI al 15 % (frasco gotero)
20 ml dé una mézcla: Cloroformo: á cido acé́ tico 1:2 (v/v). 30 ml dé la mézcla uréa: métanol
12 tubos de ensaye de 16 x 150 mm
4 pipetas de 5 ml
6 pipetas de 1 ml
1 bañ o maría
1 mechero de Bunsen
1 pinza para tubo de ensayo
1 microscopio
3 portaobjetos y 3 cubreobjetos
1 gradilla métá lica
papel filtro

EL ALUMNO DEBERÁ TRAER EL DÍA DE LA PRÁCTICA:

10 ml de diversos aceites comestibles (etiquetados) én buén éstado y rancios 10 ml dé acéité

minéral (pétrolato o vasélina líquida)
Manteca (10 g) vegetal y animal en buen estado y rancias
Mantequilla en buen estado y rancia
un trozo dé chicharró n

DESARROLLO EXPERIMENTAL:
I.- PRUEBA DE SOLUBILIDAD
1.- Etiquete 6 tubos de ensaye de 16 x 150 mm y añadir a cada uno 0.5 ml de aceite (de un mismo
tipo o diferentes) mas 1.0 ml de las siguientes sustancias:
TUBO 1, metanol
2, alcohol étílico al 96 %
3, alcohol étílico al 96 % caliénté 4, cloroformo
5, é́ tér étílico
2.- Mézclar con cuidado. Anotar sus obsérvacionés én funció n dél grado dé solubilidad qué
presenten.

II.- IDENTIFICACION DE ACIDOS GRASOS

1.- Etiquété tantos tubos como muéstras dé á cidos grasos ténga (palmítico, éstéá rico. oléico, étc).

11
2.- Disuélva 1 g dé á cido graso én 5 ml dé la mézcla uréa/métanol. Si él á cido graso és só lido,
caliénté suavéménté én bañ o maría, añ adiéndo gota a gota métanol o alcohol isopropílico hasta su
disolució n. Mézclé con cuidado.
3.- Enfrié la muestra al chorro dél agua dé la llavé, énséguida llévar los tubos a bañ o dé hiélo o al
réfrigérador por 5 minutos. La formació n dé cristalés és casi inmédiata.
4.- Filtré la muéstra. Séqué los cristalés y obsé́ rvélos al microscopio. Esquématicé sus
observaciones

INTERPRETACION:
La formació n dé compléjos á cido graso-uréa, présénta una cristalizació n caractérística, dé acuérdo
al nú méro dé carbonos é insaturacionés qué contiéné én su éstructura.

III.-IDENTIFICACION DE ACIDOS GRASOS LIBRES

1.- Etiquete tantos tubos como muestras en buen estado o rancias tenga.
2.- Agregue 1.0 ml de cada una de las muestras en los tubos etiquetados.
3.- Adicione 0.5 ml de agua destilada a todos los tubos.
4.- Mézclé y añ ada dé 2 a 3 gotas dél indicador rojo congo. Mézclar y anotar los résultados dé los
cambios químicos déspué́ s dé trés minutos.

INTERPRETACION: La préséncia dé una coloració n azul a violéta indica la éxisténcia dé á cidos

grasos libres en la muestra.

IV.- IDENTIFICACION DE PEROXIDOS

1.- Etiquete tantos tubos como muestras rancias tenga.
2.- Agregue 0.5 ml de muestra a cada uno de los tubos.
3.- Adicioné 1.0 ml dé la mézcla Cloroformo-á cido acé́ tico. Mézclar suavéménté.
4.- Adicione 2 a 3 gotas de KI al 15 %., mezclando al agregar cada gota.
5.- Deje reposar de 5 a 10 minutos a temperatura ambiente, mezclando ocasionalmente.
6.- Anote en que tubo aparece primero coloración.

INTERPRETACION:
La préséncia dé coloració n sé considéra positiva (amarillo, café́́ rojizo, rojo, rosa méxicano, étc).

V. IDENTIFICACION DE GLICEROL
1.- Etiquete tantos tubos como muestras en buen estado tenga. Meter un patrón positivo (glicerol).
2.- Añada una gota de sulfato de cobre saturado a todos los tubos.
3.- Adicione 2.5 ml de agua destilada y una gota de hidróxido de sodio saturado. Mezclar.
4.- Adicione 2 o 3 gotas de muestra. Mezcle. Deje reposar 2 a 6 minutos. Anote sus observaciones

INTERPRETACION:
La formació n dél compléjo glicérol-cobré sé idéntifica por la coloració n azul-verdoza.

VI.- IDENTIFICACION DE COLESTEROL (Reacción de Lieberman-Buchard).

1.- Etiquete tantos tubos como muestras tenga
2.- Agrégué a cada uno 1 ml dé muéstra. Trabajé un patró n positivo.
3.-Adicioné 5 gotas dé á cido acé́ tico glacial y dos gotas dé á cido sulfú rico concéntrado. Mézclar.
4.- Aténció n, la réacció n puédé sér inmédiata.
5.- Tome lecturas a los 5 minutos.

12
INTERPRETACION:
Si hay coléstérol én la muéstra, sé producirá un color rojo inténso, él cual és proporcional a la
concéntració n.

INVESTIGAR:
1.- Fundamento químico de las pruebas
2.- Estructura química dé las biomolé́ culas idéntificadas
3.- ¿Qué́ importancia biomé́ dica tiéné él coléstérol?
4.- Cual es la importancia viológica de los lípidos?
5.- por que considera que es importante conocer los métodos que existen para identificar lípidos?

BIBLIOGRAFIA
1..- Léhningér, A.L. Bioquímica. 18a réimp. dé la 2a éd. Edit. Edicionés Oméga, S.A. Barcélona
Españ a 2009.

13
 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUERRERO
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICO-BIOLOGICAS
LABORATORIO DE BIOQUIMICA

Práctica No.4.
ANALISIS DE PROTEINAS

OBJETIVO:

REALIZAR TECNICAS CUALITATIVAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE PROTEINAS

Introducción.
El nombre de proteínas proviene de la palabra griega “proteios” que significa “de primera clase”,
fue propuesto por Jöns J. Berzelius en 1838 para resaltar la importancia de estas
macromoléculas complejas constituyente de los seres vivos, ya que son quizá las más
versátiles responsables en gran parte de las capacidades metabólicas y de la morfología de
los seres vivos. Son los componentes principales del protoplasma y las membranas celulares
tanto de animales como de vegetales.

Las proteínas contienen en su molécula C,H,O,N y en ocasiones P y S, el nitrógeno en ellas

se encuentra aproximadamente en un 16 %; por hidrólisis se desdoblan dando como producto
final, alfa-aminoácidos, los cuales varían en número, cantidad y posición en cada proteína.

Existen diferentes tipos de proteínas en un organismo, cada una con una función específica;
algunas son estructurales, otras actúan como catalizadores, hormonas, transportadoras de
gases, transportadoras de solutos a través de la membrana, de electrones, en mecanismos de
defensa, mecanismos genéticos, en el mantenimiento del balance hidroelectrolítico, etc..

Las diferencias entre una proteína y otra se deben: 1) el número total y estructura de los
aminoácidos que contenga y 2) del orden o secuencia en que estén unidos estos aminoácidos.
Esto quiere decir que el simple análisis químico no sirve para caracterizarlas individualmente
ya que es posible que existan proteínas que tengan el mismo peso molecular, el mismo tipo
de aminoácidos y sin embrago exhiban propiedades y funciones completamente diferentes.
Esto se comprenderá si se recuerda que la estructura de una proteína está determinada por
cuatro niveles de organización, o niveles estructurales que se designan como estructura
primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria.

La estructura primaria depende del número y secuencia de aminoácidos que se unen entre sí
por el enlace peptídico (-CO-HN) covalente.

La cadena polipeptídica puede enrollarse sobre sí misma formando estructuras helicoidales u

otro tipo de conformación, estabilizadas por puentes de hidrógeno (entre los enlaces
peptídicos). Esta ordenación espacial de la molécula se conoce como estructura secundaria.
La cadena polipeptídica ya enrollada adopta en el espacio la conformación más estable, o sea,
sufre un super enrollamiento que se designa como estructura terciaria, En la mayoría de las
ocasiones una proteína biológicamente activa puede estar constituida por más de una cadena
polipeptídica. La asociación de estas cadenas en el espacio para adoptar una estructura
tridimensional característica es lo que se llama estructura cuaternaria. Tanto la estructura

14
terciaria como la cuaternaria carecen de enlaces definidos, ya que participan ya que participan
todos los tipos de enlaces químicos, fuertes o débiles, en estos niveles estructurales.

La actividad de una proteína depende fundamentalmente de su conformación espacial, más

que de su estructura química. Existe una gran cantidad de agentes físicos y químicos capaces
de modificar la conformación de las proteínas al alterar los diferentes enlaces que estabilizan
las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria. Estos agentes se denominan agentes
desnaturalizantes, algunos de los más comunes son: ácidos, bases, detergentes, metales
pesados, solventes orgánicos, alcaloides, calor, radiación ultravioleta, rayos x, ondas
ultrasónicas, sales inorgánicas, sustancias orgánicas como urea, guanidina, agentes
reductores, agentes oxidantes, etc.

Las proteínas tal como existen en la naturaleza se denominan proteínas nativas; si se

modifican por cualquiera de los agentes anteriores en su conformación, se transforman en
proteínas desnaturalizadas, las cuales generalmente pierden su actividad, modifican su
solubilidad y precipitan.

MATERIALES Y REACTIVOS:

150 ml albúmina de huevo al 2 %

150 ml peptona al 2 %
150 ml caseina 2 %
150 ml gelatina 2 %
100 ml reactivo de Millon en frasco gotero
15 tubos de ensayo de 16 x 150 mm
Mechero
100 ml Sulfato de cobre al 1 %
150 ml NaOH al 10 % (preparar con agua recientemente hervida)
50 ml Acido nitrico concentrado
50 ml Hidróxido de amonio concentrado
150 ml de reactivo de Hopkins-Cole
100 ml ácido sulfúrico concentrado
100 ml de acetato de plomo al 2%
Ninhidrina en butanol al 0.1 %
Papel filtro
Horno eléctrico
100 ml NaCl al 5 %
100 mlCloruro férrico (FeCl3) al 3 %
50 ml nitrato de plata (AgNO3) al 2 %
50 ml cloruro mercúrico (HgCl2) al 2 %
150 ml ácido tricloroacético (CCl3COOH) al 5 %
100 ml Solución saturada de sulfato de amonio
Sulfato de amonio reactivo
150 ml alcohol etílico al 96 %

DESARROLLO EXPERIMENTAL

15
I. PROPIEDADES QUIMICAS. Como ya se explicó, las proteínas están formadas por
aminoácidos, unidos por enlaces peptídicos, presentan propiedades fisicoquímicas y
biológicas características de los aminoácidos que las constituyen. Muchas de las reacciones
coloridas que se utilizan para el análisis de las proteínas en realidad se deben a la presencia
de un aminoácido específico.

REACCION DE MILLON. Específica para el grupo fenólico y por lo tanto, la dan positiva todas
las sustancias que poseen esta función, como el fenol, ácidos salicílico, timol, tirosina y todas
aquellas proteína que contengan tirosina.

1. Prepare una serie de cuatro tubos de ensaye de 16 x 150 mm etiquetados, y adicióneles 2

ml de las soluciones siguientes

TUBO No, PROTEINA 2%

1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina
2. Enseguida añada 5 gotas del reactivo de millon. Caliente ligeramente hasta que la solución
hierva. ¡PRECAUCION!. La presencia de tirosina se pone de manifiesto por la aparición de
un precipitado blanco el cual por acción del calor se vuelve rojo. La presencia de sales así
como soluciones muy alcalinas pueden interferir en esta reacción.

a). Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final.

b). Explique el mecanismo de esta reacción.

REACCION DE BIURET. Todas las moléculas que contengan dos o más uniones peptídicas,
por lo tanto todas las proteínas y todos los péptidos no menores de tres unidades dan
positiva la reacción de Biuret.
El nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el cual da positiva la prueba.
Cuando una proteína o un polipéptido se hacen reaccionar con sulfato de cobre en solución
alcalina se produce un color característico púrpura o violeta.
El color se debe a un compuesto que resulta al unirse el cobre con los átomos de nitrógeno
de los enlaces peptídicos. Esta reacción nos sirve para diferenciar las proteínas y péptidos
de los aminoácidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrólisis proteica, la
reacción será negativa cuando la hidrólisis sea completa.

1. Prepare una serie de cuatro tubos de ensaye de 16 x 150 mm etiquetados, y adicióneles 1

ml de las soluciones siguientes

TUBO No, PROTEINA 2 %

1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

16
2. Añada 2 ml de solución de NaOH al 10 % ¡PRECAUCION! Y 3 a 5 gotas de sulfato de
cobre al 1 %. Agite los tubos y observe la reacción que se produce en cada caso. La
aparición de una coloración violeta o rasa en no más de 20 minutos, debe considerarse
como prueba positiva.

a). Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final.

b).¿Se puede considerar al biuret como una reacción característica para todas las
proteínas?. ¿Por qué?.
c). Escriba la reacción química.

REACCION XANTOPROTEICA. Esta reacción se debe a la formación de nitroderivados

aromáticos por reacción del ácido nítrico sobre grupos bencénicos que poseen algunos
aminoácidos como fenilalanina, tirosina y triptofano. Por lo tanto, la dan positiva todas
aquellas proteínas que tengan aminoácidos aromáticos en su molécula.

1. Prepare una serie de cuatro tubos de ensaye de 16 x 150 mm etiquetados, y adicióneles 2

ml de las soluciones siguientes

TUBO No, PROTEINA 2 %

1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

2. Añada 1 ml de ácido nítrico concentrado (HNO3), caliente ligeramente y observe una

coloración amarilla característica. Se deja enfriar esta solución y se añaden gotas de
hidróxido de amonio (NH4OH) concentrado cuidadosamente para estratificar. En la interfase
se observará un anillo naranja.

a). Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final.

b). ¡Se puede considerar esta reacción general para todas las proteínas?
c). Explique por qué se tiñe de amarillo la piel al contacto con el HNO 3 .

REACCION DE HOPKINS-COLE. La reacción de Hopkins-Cole es específica para el

aminoácido triptofano y el color violeta que se produce se debe a la condensación del anillo
indólico del triptofano con el aldehído presente en el reactivo de Hopkins-Cole. Esta reacción
la darán positiva los péptidos y proteínas que contengan triptofano en su molécula.

1. . Prepare una serie de cuatro tubos de ensaye de 16 x 150 mm etiquetados, y adicióneles 2

ml de las soluciones siguientes

TUBO No, PROTEINA 2 %

1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

17
2. Agregue 3 ml del reactivo de Hopkins-Cole y mezcle vigorosamente. Añada
cuidadosamente resbalando por las paredes 1 ml de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado
¡PRECAUCION! Procurando que se formen dos capas.
3. Introduzca los tubos en un vaso con agua caliente y si la reacción es positiva a los dos
minutos aparecerá un anillo violeta en la interfase.

a). Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final

b). Escriba la reacción que se ha producido.

REACCION DE AMINOACIDOS AZUFRADOS. El aminoácido cisteína y la cistina y las

proteínas que los contengan, cuando se tratan con álcalis concentrados desprenden ácido
sulfhídrico, el cual se puede reconocer por su olor fuertemente desagradable y característico,
o bien, por la formación de un precipitado negro de sulfuro de plomo (PbS).

1. Prepare una serie de cuatro tubos de ensaye de 16 x 150 mm etiquetados, y adicióneles 2

ml de las soluciones siguientes

TUBO No, PROTEINA 2 %

1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

1. Agregue 2 ml de solución de hidróxido de sodio (NaOH) al 10 % ¡PRECAUCION!

Caliente ligeramente.
2. Añada a todos los tubos 0.5 ml de solución al 1 %de acetato de plomo (Pb(CH 3-
COO-)2).
3. Coloque los tubos en baño maría a ebullición por 5 minutos. El obscurecimiento de la
solución o la formación de un precipitado negro indica la presencia de aminoácidos
azufrados.
a). Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final.
b). Escriba la reacción química que se ha efectuado
c). ¿Qué sustancias pueden interferir en esta reacción?

REACCION DE NINHIDRINA. Esta es una de las reacciones más sensibles que se conocen
para identificar aminoácidos en general (se puede detectar una parte de alanina en 500 000
partes de agua).
Por su sensibilidad esta reacción se emplea para valoración cuantitativa de aminoácidos por
colorimetría.
La valoración de aminoácidos en orina, por ejemplo, tiene importancia en medicina ya que en
alguna enfermedades, como hepatopatías, infecciones agudas o diabetes mellitas en las que
se presenta hiperaminoacidemia se ve acompañada por hiperaminoaciduria paralela.
Algunas enfermedades metabólicas congénitas también dan lugar a eliminación anormal de
algunos aminoácidos en la orina.
Los aminoácidos y muchas aminas primarias dan un color violeta característico. La prolina
da coloración amarilla.

18
1. Se utilizarán rectángulos de papel filtro Whatman No. 1, de 2 x 2 cm, sobre los cuales
se colocarán gotas de una de las siguientes soluciones:

CUADRO DE SUSTANCIA
PAPEL
1 Glicina
2 Peptona
3 Caseína
4 Gelatina
5 Albúmina
2. ¡PRECAUCION! Use guantes o pinzas para manipular el papel. Anote debajo de cada
muestra el nombre del compuesto y añádale una gota de solución de ninhidrina en butanol al
0.1 %. Coloque el papel en el horno a 110 °C durante 5 minutos.

a). Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final.

b). Escriba la reacción química que se ha efectuado
c) ¿Qué sustancias dan positiva la reacción de la ninhidrina , además de las proteína,
péptidos y aminoácidos?,

TABLA DE RESULTADOS DE ALGUNAS PROPIEDADES QUIMICAS DE LAS PROTEINAS

REACCION MILLON BIURET XANTOPROTE HOPKINS- A.A. AZU- NINHI-

SUSTANCIA ICA COLE FRADOS DRINA
GLICINA
GELATINA
PEPTONA
CASEINA
ALBUMINA

PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DE LAS PROTEINAS.

Estas propiedades dependen fundamentalmente del peso molecular, de su carga eléctrica

neta y de la conformación que adopte la molécula (estructuras secundaria, terciaria y
cuaternaria).
Las propiedades fisicoquímicas y biológicas de las proteínas se alteran profundamente
cuando se someten a la acción de agentes fisicoquímicos capaces de romper los diferentes
enlaces que estabilizan las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria . De tal forma que
la estructura altamente ordenada de una proteína queda reducida al polímero de
aminoácidos. Estos agentes pueden ser muy diversos y se denominan en general, agentes
desnaturalizantes.

EFECTO DEL CALOR. El calor es uno de los agentes primordiales de desnaturalización, la

mayor parte de las proteínas en solución son inestables a temperaturas superiores a 60 °C.
Las alteraciones que sufre la molécula disminuyen su solubilidad y generalmente precipitan
en forma de agregados insolubles. Esta propiedad de las proteínas se denomina
coagulación.
19
1. Prepare una serie de cuatro tubos de ensaye de 16 x 150 mm etiquetados, y adicióneles 3
ml de las soluciones siguientes

TUBO No, PROTEINA 2 %

1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

2. Adicióneles 2 ml de NaCl al 5 % . Caliente los tubos en baño maría a ebullición por 5

minutos observe cuidadosamente lo que ha ocurrido en cada tubo y escriba

a). sus resultados en la tabla que aparece al final.

b). ¿Qué papel desempeña el agua en el fenómeno de la coagulación?
c). Explique la diferencia entre desnaturalización y coagulación.

PRECIPITACION DE PROTEINAS POR METALES PESADOS. Las proteínas cuando se

encuentran en solución a pH superiores a su punto isoeléctrico son capaces de reaccionar
con diferentes metales pesados formando los correspondientes proteinatos insolubles.

1. Coloque en tubos de ensaye numerados, 1 ml de de soluciones

TUBO No, PROTEINA 2 %

1 Peptona
2 Gelatina
2. Añada dos gotas de solución de cloruro férrico (FeCl 3) al 3 %. Observe lo que sucede en
cada caso y a continuación añada un exceso de cloruro férrico (FeCl 3) al 3 %. (si no ocurre
precipitación compruebe el pH). Repita este experimento usando nitrato de plata (AgNO 3),
cloruro mercúrico (HgCl2) y acetato básico de plomo (Pb(CH3-COO-)2) todos al 2 %.

a). Anote sus resultados en al tabla que aparece al final.

b). ¿Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre las proteínas?
c). ¿Tienen todos los metales pesados el mismo efecto precipitante sobre las proteínas?

PRECIPITACION DE PROTEINAS POR EFECTO DE ACIDOS FUERTES. Los ácidos

fuertes son capaces de desnaturalizar a las proteínas formando productos de
desnaturalización insolubles conocidos como metaloproteínas.

1. Prepare una serie de cuatro tubos de ensaye de 16 x 150 mm etiquetados, y adicióneles 3

ml de las soluciones siguientes

TUBO No, PROTEINA 2 %

1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

20
2. Añada un volumen igual de ácido tricloroacético (CCl3COOH) al 5 % y observe que
sucede.

a). Anote sus resultados en al tabla que aparece al final .

b). ¿Cómo puede explicar el efecto desnaturalizante del ácido tricloroacético y, en general de
cualquier ácido?

PRECIPITACION DE PROTEINAS POR EFECTO DE SALES. Por regla general, las

proteínas en solución son menos solubles cuando se aumenta la fuerza iónica y esto se
puede lograr adicionando sales solubles como el sulfato de amonio (NH4)2SO4. Sin embargo
la concentración para precipitar diferentes proteínas es variable. Esta diferencia en
sensibilidad se ha utilizado para separar y purificar proteína. Por ejemplo las albúminas y
globulinas a, b, c de la clara de huevo.

1. Coloque en tubos de ensaye numerados, 2 ml de las siguientes soluciones: peptona

2 % y clara de huevo fresca diluida 1:2
2. Añada a cada tubo 2 ml de solución saturada de sulfato de amonio, agitar y centrifugra
a 3000 rpm durante 5 minutos. ¿Qué sustancias constituyen el precipitado?
3. Disolver el precipitado en 2 ml de agua destilada y hacer la prueba del Biuret. ¿ Es
negativa o positiva?. Repita la prueba con 1 ml de sobrenadante, ¿Qué resultado
obtiene?.
4. Al resto del sobrenadante agréguele poco a poco sulfato de amonio sólido agitando
para disolverlo en cada caso hasta que la solución se sature. ¿Se forma nuevamente
precipitado y por qué?
5. Centrifugar a 3000 rpm por 5 min. Repetir la prueba del Biuret en el precipitado y la
solución disolviendo el precipitado en 1 ml de agua destilada. ¿Qué resultado obtiene
en ambos casos?. ¿Cuál es la interpretación y la conclusión final con los resultados?

PRECIPITACION POR ALCOHOL.

Los alcoholes y la acetona son agentes desnaturalizantes de proteínas ya que las
deshidratan al competir por el agua de solvatación y por lo tanto las precipitan.

1. Prepare una serie de cuatro tubos de ensaye de 16 x 150 mm etiquetados, y adicióneles 2

ml de las soluciones siguientes

TUBO No, PROTEINA 2 %

1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

2. Estratificando cuidadosamente agregue 3 ml de alcohol de 96 % y observe lo que ocurre

en la interfase.

a). ¿Observa turbidez o precipitación en todos los tubos?

b). Anote sus resultados en la tabla.
c). ¿Qué entiende por fuerza iónica de una solución?

21
d). Mencione otras sales que se puedan utilizar para precipitar las proteínas.

TABLA DE RESULTADOS DE LAS PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DE LAS

PROTEINAS

AGENTES CALOR Fe Hg Pb SULFATO DE ALCOHOL TCA 5%

SUSTANCIA AMONIO 96 %
Peptona
Albúmina
Gelatina
Caseina

PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS:

1.- Reactivo de Hopkins-Cole:

Pesar 10 g de magnesio en polvo y disolver en 20 ml de agua destilada. Añadir lentamente

250 ml de ácido oxálico saturado frío (debe mantenerse en frío al chorro de agua de la llave
mientras se adiciona el ácido, la reacción es rápida y desprende mucho calor). Filtrar para
separar el oxalato de magnesio insoluble. Acidificar con ácido acético para evitar la
precipitación parcial del magnesio. Aforar a 1000 ml con agua destilada. Este reactivo contiene
únicamente la sal magnésica de ácido glioxílico.

2.- Reactivo de Millon

Añadir 60 g de óxido rojo de mercurio a una mezcla de 45 ml de ácido nítrico concentrado y 50

ml de agua. Cuando se ha disuelto. se añaden 50 ml de una solución de nitrito de sodio al 30%.
El reactivo contiene nitrato y nitrito mercúricos.
Otro método alternativo: Con PRECAUCION, disolver 100 g de mercurio en 140 c.c. de
HNO3 concentrado (se calienta en exceso), cuando se ha disuelto, diluir la solución con dos
veces su volumen con agua destilada. No prepare mas de estas cantidades a la vez.

BIBLIOGRAFIA:

YAÑES, A. R. MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA. 1996. IPN.

22
 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUERRERO
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICO-BIOLOGICAS

LABORATORIO DE BIOQUIMICA

PRÁCTICA 5

AISLAMIENTO DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA.

MINIPREPARACIÓN (“Miniprep”)

INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas de DNA circular extracromosómico presente en bacterias,

capaces de llevar a cabo su replicación en forma autónoma y portan uno o más genes que,
por lo general, codifican para proteínas que le confieren resistencia a los antibióticos, por lo
que han sido útiles vehículos en la clonación molecular.

En esta práctica se aislará ADN plasmídico del resto de los componentes celulares bacterianos
por el método de lisis alcalina, donde se rompen las células mediante un choque alcalino
(NaOH) y un detergente (SDS) y se precipita el plásmido con etanol.

El plásmido que con mayor frecuencia se utiliza y el que mejor se conoce es el pBR322, éste
fue el primer plásmido artificial creado por el investigador mexicano Francisco G. Bolívar
Zapata et. al. (1977) y se convirtió en una de las primeras herramientas para la introducción
de genes específicos en una bacteria, según lo requiera el investigador. El plásmido pBR322
contiene un origen de replicación, así como un gen de resistencia a la ampicilina, el cual le
confiere a la célula portadora la capacidad de crecer en un medio bacteriológico en presencia
de dicho antibiótico. El trabajo consistió́ en introducir el gen que se quería producir (en este
caso el de insulina) en el interior del gen de resistencia a ampicilina, reemplazándolo, de tal
manera que si el gen nuevo estaba presente, la bacteria perdería la capacidad de crecer en el
medio con el antibiótico y, por lo tanto, señalaría que es portadora del gen de interés. Esto es
llamado “selección negativa”, porque se busca que la colonia de bacterias o levadura pierda
una función; en este caso, la de resistir a la ampicilina. Esto permitió́ separar a las células
que poseen el gen de insulina de las que no lo incorporaron. El plásmido pBR322 contiene
sitios de restricción donde se pueden introducir fragmentos de ADN extraño sin afectar la
autorreplicación del mismo los fragmentos con una longitud de entre 5 y 10 kilopares de
bases (kbp) son clonados en este vector de manera muy eficiente, fragmentos más largos
tienden a ser inestables (Bolivar, et al., 1977).

(http://www.fermentas.com/techinfo/nucleicacids/mappbr322.htm)

El medio de cultivo Luria/Bertani (LB), cuyo nombre se debe a sus creadores, Salvador Luria
y Giuseppe Bertani, contiene los nutrientes necesarios para promover el crecimiento
principalmente de las bacterias como son: péptidos, aminoácidos, vitaminas y minerales.

23
Contiene tres ingredientes principales: tristona, extracto de levadura y cloruro de sodio. La
primera provee la fuente de carbono (en forma de péptidos), el segundo componente es rico
en vitaminas y aminoácidos (fuente de nitrógeno) y el último aporta los iones de sodio
necesarios para el balance osmótico. Para promover un crecimiento más rápido se puede
suplementar el medio con glucosa (Sambrook y Russell, 2001).

< PRECAUCION: Las bacterias Escherichia coli no son patógenas, sin embargo pueden ser
un peligro biológico si no son manejadas adecuadamente que va desde dolor abdominal y
diarrea (gastroenteritis) hasta la muerte por deshidratación. Se debe evitar el contacto
directo con las bacterias, por lo que no se debe pipetear ninguna solución con la
boca, siempre usar guantes y lavarse las manos después de manipular las bacterias y
antes de comer o beber. Los desechos tienen que ser manejados por separado para su
posterior incineración. Para evitar que el cultivo se contamine es necesario realizarlo en un
área estéril. Ver Medidas Especiales de Seguridad en el Laboratorio de Biología Molecular.

OBJETIVO GENERAL

Extraer ADN plasmídico bacterial por medio de la técnica de lisis alcalina y comparar este
método con otros reportados en la literatura.

MATERIAL Y EQUIPO Material por grupo

2 Pipetas serológicas de 10 mL Incubador

Microcentrífuga
Vortex

Hielo frapé
Hielo seco/acetona o ultracongelador

Material por equipo

1 Tubo cónico de polipropileno de 15 mL (Marca Falcon)

4 Tubos para microcentrífuga tipo Eppendorf, de 1.5 mL
Bacterias E. coli transformadas con el plásmido pBR322
5 ml de medio de cultivo LB suplementado con ampicilina (100 μg/mL). Microcentrífuga
(Marca Eppendorf, modelo 5415)

Micropipetas de volumen variable 10 a 100 μL

Micropipetas de volumen variable 100 a 1000 μL Puntas para las respectivas micropipetas

SOLUCIONES Y REACTIVOS

Por equipo

 Acetato de Sodio 5 M
 Etanol absoluto
 Etanol al 70%

24
  *GTE (50 mM Glucosa, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0)
 TE pH 8.0 (10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, pH 8.0)
 *NaOH/SDS (0.2N NaOH, 1% (p/v) SDS)

* Soluciones que deben ser preparadas al momento de ser utilizadas y se deberá

desechar el sobrante
Preparación de soluciones: Ver ANEXO 2.

MÉTODO

CRECIMIENTO DE BACTERIAS.

1. Un día antes de la práctica se colocará una alícuota de 20 μL de bacterias E coli con el

plásmido pBR322 y se depositaran en 3 ml de medio LB suplementado con ampicilina
(100 μg/mL) contenido en un tubo cónico de polipropileno con tapa y estéril de 15 mL.
2. Se prepara un control negativo en donde se coloca 3 mL de medio de cultivo sin
bacterias.
3. El medio inoculado y el control se incuban a 37° C, con agitación constante, por 12-18
h para permitir el crecimiento exponencial de las bacterias.

AISLAMIENTO DE PLASMIDOS POR LISIS ALCALINA

1. Al día siguiente, en condiciones estériles, transferir 1.5 mL del cultivo de bacterias en

un tubo estéril de 1.5 mL y guardar el resto en el tubo cónico de 15 mL a 4° C,
cuidando que no se contamine (estas servirán si se requiere repetir la extracción o
realizar un cultivo de mayor volumen.
2. Centrifugar a 14,000 g (o máxima velocidad) por 20 seg.
3. Decantar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 100 μL de la

solución GTE.

4. Agregar 200 μL de una solución recién preparada de NaOH/SDS y

resuspender .

5. Pasar a hielo frapé durante 5 minutos y agregarle 150 μL de acetato de sodio

5M y mantener en hielo durante 5 minutos.

6. Agitar en “vortex” por 2 segundos y regresar al hielo por 5 minutos.

7. Centrifugar a 14,000 g durante 3 minutos y recuperar el sobrenandante con

una micropipeta (aproximadamente 100-200 μL), vaciarlo en un tubo nuevo.

8. Agregarle 0.8 mL de etanol absoluto, agitar por inversión y mantener a -70oC

(ultracongelador o hielo seco/acetona) por al menos 10 minutos para permitir

25
 la precipitación del ADN.
NOTA: En caso necesario el plásmido puede permanecer en etanol indefinidamente.

9. Centrifugar a 14,000 rpm (o máxima velocidad) por 10 minutos.

10. Decantar con cuidado el sobrenandante y lavar el precipitado “pellet” con 1

mL de etanol al 70%.
11. Centrifugar a 14,000 rpm por 5minutos.

12. Decantar el sobrenadante y asegurarse de que no quede residuos de etanol. 13. Eliminar
la mayor cantidad de etanol por aspiración con vacío o limpiado con

un aplicador con algodón.

NOTA: no secar completamente para permitir una mejor resuspensión del pellet.

14. Resuspender el “pellet”, el cual contiene el plásmido, en 20-50 μL de TE pH8.0.

NOTA: El buffer TE aumenta la estabilidad del ADN en muestras almacenadas a largo plazo,
y/o de uso frecuente, pues inhibe ADNasas presentes en la muestra.

15. Guardar a 4° C si se usará pronto, o a -20° C si se desea preservar por más tiempo.

RESULTADOS

Una vez que se ha decantado el sobrenadante (paso 11) debe observarse el “pellet” de color
blanco en el fondo del tubo, el cual contiene el ADN plasmídico extraído de las bacterias.

CUESTIONARIO

1. Describe cuáles son los pasos fundamentales para aislar ácidos nucleicos
por medio de la técnica denominada “lisis alcalina” y en qué consisten estos.
2. ¿Cuál es la razón de agregar ampicilina al medio de cultivo?
3. Describe brevemente cuál es la función de las siguientes

soluciones: GTE, TE y SDS/NaOH.

4. Explica el fundamento do dos técnicas son utilizadas para

aislar ácidos nucleicos, además de la “lisis alcalina”.

5. Explica el fundamenta de las técnicas de transformación y

transfección.

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