ANALISIS CROMATOGRAFICO

CROMATOGRAFIA

La cromatografía es esencialmente un método físico de separación en el que los

componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una inmóvil (lecho estacionario),
y otra móvil (fase móvil) la cual percola a través de la primera. El proceso cromatográfico
se da como resultado de repetidos procesos de sorción-desorción durante el movimiento
de los componentes de la mezcla arrastrados por la fase móvil a lo largo del lecho
estacionario (elución), produciéndose la separación debido a las diferencias en las
constantes de distribución de los componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y
la móvil. A la distribución final de los componentes en función de su posición sobre el
lecho estacionario, o del tiempo en que eluyen se le denomina cromatograma.

Prácticamente no existen restricciones sobre la naturaleza de las fases a utilizar,

siempre que la fase estacionaria sea sólida o líquida y la fase móvil líquida o gaseosa,
por lo que es posible, en principio, realizar por medio de estas técnicas la separación de
los componentes de cualquier mezcla. Por otra parte, la utilización de las técnicas
cromatográficas no esta exenta de dificultades, debido fundamentalmente a la gran
cantidad de parámetros que pueden influir en el proceso de separación, lo cual dificulta la
elección de las condiciones óptimas de separación y en muchas ocasiones implica la
irreproducibilidad de los resultados. Por ello la cromatografía no es una técnica de rutina
que pueda aplicarse sin más a cualquier mezcla, sin invertir en muchos casos gran
cantidad de esfuerzo y tiempo.

Tipos de cromatografía y su uso.

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 Las técnicas cromatográficas pueden clasificarse en función del mecanismo de
separación de los componentes entre las fases, o bien por la forma de operar del
sistema.

a) Mecanismos de separación

En función del mecanismo de separación, las técnicas de cromatografía pueden

clasificarse en:

- Cromatografía de adsorción. La separación depende de los equilibrios de

adsorción- desorción de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria
sólida y la fase móvil líquida o gaseosa. La fuerza con que es adsorbido un
componente depende de la polaridad de este, de la actividad del adsorbente y de
la polaridad de la fase móvil. En general cuanto más polar es un compuesto más
fácilmente será adsorbido

- Cromatografía de reparto. Está basada en la separación de una mezcla de

substancias mediante el reparto existente entre la fase móvil (líquido o gas) y la
fase estacionaria (líquida) soportada o ligada sobre un sólido adecuado. La
mayor o menor migración de un compuesto en este tipo de cromatografía, será
función del coeficiente de reparto de éste entre la fase estacionaria y la fase móvil:

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 La cromatografía de reparto es utilizable para la separación de mezclas de
compuestos de polaridad media y alta. Ejemplos de este tipo de cromatografía, son
las cromatografías sobre papel, sílice hidratada y la cromatografía líqida de alta
eficacia en fase reversa.

- Cromatografía por tamaño molecular, también llamada de permeación de gel o

de tamiz molecular. Consiste en la separación de las moléculas basándose en su
tamaño en lugar de en su solubilidad o polaridad. Las fases estacionarias
empleadas para este tipo de cromatografía son inorgánicas (zeolitas), o geles
orgánicos compatibles con disolventes acuosos (agarosa, poliacrilamida) u
orgánicos (copolímeros estireno/divinilbenceno). Estas fases estacionarias poseen
cavidades en las cuales las moléculas de los compuestos a separar pueden
penetrar y ser retenidas, siendo las moléculas mayores las eluidas de la columna
en primer lugar; el rango de trabajo de estas fases estacionarias, se define como
el intervalo de pesos moleculares que pueden ser separados; otro parámetro que
caracteriza a este tipo de fases, es su límite de exclusión, que se define como el
peso molecular a partir del cual los compuestos pasarán a través del lecho
estacionario sin experimentar retención.

- Cromatografía de cambio iónico. Las separaciones por intercambio iónico, se llevan a

cabo con materiales insolubles y de textura porosa, los cuales presentan grupos
reactivos asociados a iones lábiles capaces de intercambiarse con los del medio que
les rodea, por lo que inevitablemente este tipo de cromatografía ha de realizarse en
medio líquido. La cromatografía de intercambio iónico, es utilizable para la separación
de substancias iónicas, tanto inorgánicas como orgánicas. Las separaciones por
cambio iónico, están basadas en los diferentes equilibrios de reparto de los iones de
la mezcla entre el material cambiador y la disolución:

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 En general, se utilizan tres tipos de materiales para cromatografía de cambio iónico:
resinas, geles y celulosas. La diferencia fundamental entre ellos reside en su
microestructura ya que, generalmente, las resinas presentan un tamaño de poro mucho
menor, siendo apropiadas para la separación de substancias de pequeño volumen
molar. Otras diferencias existentes entre los diversos materiales de cambio iónico son
debidas a la naturaleza de los grupos cambiadores (fuerza del grupo cambiador) y al
número de estos por unidad de peso de material (capacidad de cambio).

Debe tenerse en cuenta que los mecanismos de separación descritos, son

aproximaciones a las situaciones reales y que, aunque en una técnica concreta
predomine alguno de ellos, la separación suele estar basada en la conjunción de
diversos mecanismos.

b) Formas de separación.

Otra posible clasificación de las técnicas cromatográficas, está basada en la forma

de operar del sistema cromatográfico. Básicamente existen cuatro formas de operación:

- Análisis por desarrollo. Es el método utilizado en los experimentos

iniciales de cromatografía. El cromatograma se desarrolla hasta que el
frente de disolvente alcanza el final del lecho estacionario, de forma que los
constituyentes de la mezcla una vez separados permanecen sobre el lecho
al finalizar la separación. La técnica de análisis por desarrollo presenta la
ventaja de que es analizable la totalidad de la muestra, incluyendo los
compuestos de muy baja o muy alta retención. Se utiliza
fundamentalmente en cromatografía de papel y capa fina.

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- Análisis por elución. Es la técnica utilizada en casi todas las
separaciones cromatográficas analíticas y en muchas preparativas. En ella,
el paso de la fase móvil se continúa indefinidamente hasta que los
componentes separados de la mezcla emergen al final del lecho
cromatográfico. Esta técnica presenta la desventaja de que los compuestos
con retenciones muy altas pueden no ser observados.

- Análisis frontal. Este método está basado en la diferencia de afinidad del

adsorbente por cada una de las sustancias a separar. Se utiliza una
pequeña columna, que es saturada sucesivamente por cada una de las
substancias a separar, emergiendo de ella el primer componente puro hasta
que la columna se satura del segundo componente, momento en el que
empezará a emerger éste mezclado con el primero. El análisis frontal tiene
su principal aplicación como técnica preparativa para la purificación de
substancias.

- Análisis por desplazamiento. En este caso, la substancia desplazante va

incorporada dentro de la fase móvil. Este metodo se utiliza tanto para
separaciones analíticas como preparativas, siendo muy utilizada en
cromatografía de cambio iónico.

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PARÁMETROS BÁSICOS DE CROMATOGRAFÍA

El tratamiento teórico del proceso cromatográfico, fue desarrollado

fundamentalmente en base a las técnicas instrumentales de cromatografía que utilizan el
método de análisis por elución y, en consecuencia, como parámetros para definir la
banda cromatográfica, se utilizan el tiempo o el volumen de eluyente a que aparece
dicha banda al final de lecho estacionario (tiempo o volumen de retención); no obstante,
es necesario precisar que los parámetros que definen una separación cromatográfica,
son extrapolables a las separaciones que utilizan técnicas de desarrollo.

Retención y factor de capacidad

Cuando se introduce un compuesto en la corriente de fase móvil de un sistema

cromatográfico, de no existir interacción de éste con la fase estacionaria, la banda que
forma se desplazaría a la misma velocidad que la fase móvil y emergería del lecho
estacionario cuando el volumen total de fase móvil utilizado fuese igual al volumen vacío
o intersticial de la columna (volumen muerto); sin embargo, como las moléculas de la
muestra interaccionan de hecho con la fase estacionaria, aquellas necesitan para su
elución el paso de un volumen mayor de fase móvil, que se denomina volumen de
retención de la muestra. Dado que en un sistema cromatográfico que opere a caudal
constante, el volumen eluído y el tiempo son proporcionales, los conceptos de volumen
muerto y volumen de retención, son directamente intercambiables por los de tiempo
muerto (tM) y tiempo de retención (tR).

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 En la figura 1, se muestran los parámetros de retención para el caso de una única
banda cromatográfica. Se observa que el tiempo de retención de la banda, puede
dividirse en dos partes: el tiempo muerto (tM) y el tiempo transcurrido a partir de este
momento hasta la aparición del máximo de la banda. A partir de la definición de tiempo
muerto, se induce que el segundo, es el tiempo real que la fase estacionaria ha retrasado
el avance del compuesto, y se conoce con el nombre de tiempo de retención corregido
(t'R).

Figura 1.- Cromatograma de un componente y sus parámetros

característicos

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INTERPRETACIÓN DEL CROMATOGRAMA

Como ya se ha mencionado, la cromatografía es básicamente un método de

separación, tal vez el más potente de que se puede

disponer en un laboratorio,
aunque debe tenerse siempre
en cuenta que la
cromatografía, a efectos
analíticos, es una técnica ciega.
Los métodos cromatográficos,
por si mismos, pueden informar,
en el mejor de los casos, del
número de compuestos
químicos que están presentes
en una mezcla (figura 7), pero
nunca de proporcionar

información sobre su
naturaleza.

Figura 7.- Cromatograma típico de una mezcla

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 Análisis cualitativo

A pesar de la limitación mencionada, ya desde los primeros trabajos publicados

sobre técnicas cromatográficas instrumentales, se indicaba que los parámetros de
retención (tiempo o volumen) de un compuesto, eran constantes para un sistema
cromatográfico dado, por lo que podían ser utilizados de forma cualitativa para identificar
compuestos.

Evidentemente, los parámetros de retención de un compuesto dependen de un

gran número de variables, por lo que la identidad entre analitos y patrones solamente
puede ser establecida para un sistema dado y en un momento dado, lo que hace muy
trabajosa la identificación de una substancia por este método. Aunque existen en la
bibliografía colecciones de datos de retención para diversos compuestos, estos datos
tienen un valor puramente orientativo, ya que resulta muy difícil reproducir los datos
de retención (de unos laboratorios a otros e incluso dentro del mismo laboratorio)
debido a la irreproducibilidad de los sistemas cromatográficos. De forma análoga, las
ecuaciones empíricas desarrolladas para correlacionar datos de retención con la
estructura química de diversos compuestos es utilizable únicamente para la identificación
de compuestos pertenecientes a series homólogas muy bien definidas.

Teniendo en cuenta estas limitaciones, el mejor método para realizar un análisis

cualitativo, es, todavía, la comparación directa de los parámetros de retención de los
picos de la muestra con los de substancias patrón, trabajando en ambos casos con el
mismo sistema cromatográfico. A la hora de realizar las comparaciones, es conveniente
utilizar determinados parámetros, que si bien no eliminan totas las posibilidades de
variabilidad de los resultados, si permiten al menos corregir la variabilidad inducida por
determinadas condiciones; como parámetros de retención utilizados frecuentemente
para análisis cualitativo, los más utilizados son:

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 1.- Tiempos o volúmenes de retención corregidos.

2.- Factores de capacidad.

3.- Tiempos de retención relativos.

De entre estos parámetros, los dos primeros permiten corregir las diferencias de
retención debidas a los volúmenes muertos de cada sistema.

Los tiempos de retención relativos se definen mediante la ecuación:

Donde t es el tiempo de retención del compuesto que se trata de identificar y tp el

tiempo de retención de un compuesto que se toma como patrón. La utilización de los
tiempos de retención relativos, permite eliminar todos los factores de variabilidad, salvo
los que pueden afectar a los valores de k' (naturaleza de la fase estacionaria,
naturaleza de la fase móvil y temperatura), por lo que este parámetro es el más
adecuado para la identificación cualitativa de compuestos en base a los datos
bibliográficos.

Una última consideración sobre la utilización de las técnicas cromatográficas para

el análisis cualitativo, es que estas técnicas permiten realizar una identificación negativa,
es decir, permiten asegurar con absoluta certeza que un compuesto determinado no se
encuentra presente en una mezcla pero, por el contrario, no permiten nunca asegurar la
presencia de un compuesto, ya que no se puede excluir la posibilidad de que dos
compuestos diferentes presenten los mismos parámetros de retención sobre un sistema
dado. Este problema puede soslayarse en parte realizando la identificación sobre diversas
columnas, con diferentes fases estacionarias. Por supuesto, es obvio que los resultados

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cualitativos son más fiables cuanto mayor número de columnas se utilicen, pero el
método es largo y tedioso; como norma general se puede decir que la identificación de
un compuesto sobre tres columnas, aunque no proporciona una certeza absoluta, ofrece
una fiabilidad suficiente a todos los efectos.

Análisis cuantitativo

Si bien, como se ha mencionado en el apartado anterior, las técnicas de análisis

cromatográfico ofrecen escasas posibilidades para la realización de análisis cualitativos,
sus posibilidades como técnica cuantitativa son enormes. La cromatografía permite
separar mezclas muy complejas de productos, aun cuando éstos sean de naturalezas
muy semejantes, lo que permite un análisis directo de muestras que de otra manera
serían muy difíciles de cuantificar. Por otra parte, los detectores que se utilizan en
cromatografía ofrecen una respuesta muy fácil de relacionar con la cantidad de analito
contenida en la disolución inyectada, y con una sensibilidad que, en ocasiones, es casi
imposible de alcanzar por medio de cualquier otra técnica.

La medida del área o de la altura del pico cromatográfico, es el factor más

importante a la hora de realizar un análisis cuantitativo. La utilización de la altura de pico
para la cuantificación es de gran comodidad, pero únicamente proporciona una exactitud
aceptable en cromatogramas que presenten picos agudos, estrechos, claramente
definidos y muy simétricos; este procedimiento de cuantificación es interesante para
análisis de rutina, en los que se puede sacrificar la exactitud en favor de la sencillez y la
rapidez de las cuantificaciones. La utilización para el análisis cuantitativo de las áreas de
los picos, es el procedimiento de uso más general cuando se requiere exactitud en las
cuantificaciones.

Existen multitud de métodos que permiten medir las áreas bajo los picos
cromatográficos, aunque la medida por medio de integración electrónica es con mucho
la más utilizada; de entre los restantes métodos, sólo se mencionará el de la "altura por
la mitad de la anchura", un método muy sencillo y que ofrece muy buenos resultados.

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Este método consiste en medir la anchura del pico cromatográfico a la mitad de su
altura (W1/2), el producto de este valor por su altura:

A = W1/2 h

Ofrece un valor A, que es proporcional al área del pico. Este método proporciona muy
buenos resultados para picos de forma aproximadamente gaussiana, pero los
resultados son menos satisfactorios para picos no simétricos o para picos pequeños y
anchos.

Al margen de cualquier otro método de medida de áreas, el sistema más utilizado

actualmente es el integrador electrónico; un dispositivo de esta naturaleza digitaliza la
señal analógica proporcionada por el detector, detecta el comienzo y el final de cada
pico cromatográfico, integra digitalmente el área bajo la curva y corrige automáticamente
la linea de base. El único problema que presentan los integradores digitales se plantea a
la hora de integrar picos parcialmente resueltos (figura 7), ya que muchos integradores
tienen limitadas sus posibilidades de medida en estos casos a muy pocos métodos,
llegando a realizar en algunos casos extremos integraciones totalmente disparatadas.
Este problema, no obstante, se resuelve bastante bien mediante la utilización de
integradores basados en ordenadores personales, que permiten al usuario tanto la
visualización de la forma en que se han integrado los picos, como la posibilidad de
modificar la forma de integración en caso de ser necesario.

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 Figura 8.- Posibles métodos de integración de picos no resueltos

Métodos de calibrado

Una vez conocida el área o la altura del pico que se pretende cuantificar, es
posible conocer su masa o su concentración en la muestra inyectada si se conoce la curva
de calibración que relaciona la respuesta del detector con la cantidad de compuesto
inyectada.

Las concentraciones de un analito que pueden ser medidas en cada caso

dependen del rango dinámico del detector, una característica de cada combinación
detector/analito, que se define como el rango de concentraciones de soluto entre las
cuales el detector produce una respuesta dependiente de la concentración de soluto que
llega a él; el valor mínimo de este rango se corresponde con la sensibilidad del detector,
y el máximo con la concentración de soluto a partir de la cual la respuesta del detector es

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constante (saturación). Dado que casi todos los detectores presentan curvas de
respuesta de tipo sigmoide, debe tenerse en cuenta que lo más conveniente es trabajar,
siempre que sea posible, dentro del rango dinámico lineal del detector, que se define
como la zona del rango dinámico en la que la respuesta del detector es lineal frente a la
concentración de soluto (figura 9); las cuantificaciones realizadas fuera del rango
dinámico lineal (figura 10) deberían ser evitadas en lo posible, realizándose únicamente
en caso de trabajar con concentraciones muy próximas al límite de sensibilidad del
detector.

Figura 9.- Calibración con respuesta lineal

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 Figura 10.- Calibración con respuesta exponencial

De los diferentes métodos que existen para realizar el calibrado, los más
utilizados con mucho son el método del estándar externo y el método del estándar
interno.

El método del estándar externo, consiste en inyectar en el equipo volúmenes constantes

de disoluciones de concentraciones conocidas y crecientes del compuesto que se
pretende cuantificar; tras este proceso, se representa la cantidad de compuesto frente al
tamaño del pico (área o altura), debiéndose obtener una linea recta. A partir de esta recta
de calibrado, es posible realizar la cuantificación en una muestra desconocida, por
interpolación gráfica o matemática del pico obtenido en la recta de calibrado. El principal
problema que plantea la calibración por medio de este método es la reproducibilidad de la
inyección, o bien el control estricto de las cantidades inyectadas, aunque tomando las
debidas precauciones, la exactitud alcanzada puede ser notablemente alta. Por otra parte, la
calibración debe repetirse periódicamente para verificar la fiabilidad de la cuantificación, lo
que en algunos casos puede hacer que este método sea un poco tedioso.

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 La calibración por el método del estándar interno, se utiliza con frecuencia en el
análisis cuantitativo para compensar posibles errores derivados de la manipulación de la
muestra. Este método consiste en esencia en añadir una cantidad conocida de un
compuesto patrón a la muestra a analizar antes de realizar con ella cualquier
manipulación; en el cromatograma, aparecerán los picos correspondientes al analito y al
patrón añadido, y de la relación entre el tamaño de ambos, podrá calcularse, previo
calibrado, la cantidad de analito existente en la muestra. Para efectuar el calibrado en
este método, se preparan disoluciones de concentración creciente del compuesto a
analizar a las que se añade una cantidad idéntica en todos los casos del compuesto
patrón; tras obtener los correspondientes cromatogramas, se representa la
concentración del compuesto a cuantificar en función de la relación de los picos
problema/patrón, con lo que se obtendrá una recta en la que es posible interpolar la
relación entre los dos picos que se obtenga al realizar el cromatograma de una muestra
desconocida. Los requisitos que debe cumplir un producto para ser utilizado como
patrón interno, serán:

a) El producto patrón debe dar un pico totalmente resuelto de los de la mezcla a

analizar.

b) El pico del compuesto patrón debe estar situado en el cromatograma en las

proximidades de los picos de interés.

c) A lo largo de todo el proceso de análisis, debe tener un comportamiento similar

al de los compuestos a cuantificar.

d) En ningún caso debe estar presente en la muestra a analizar.

e) Debe ser químicamente estable, tanto frente a los componentes de la muestra

como frente a los compuestos que se puedan utilizar durante el proceso de
análisis.

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 Debe destacarse que, para los dos métodos de calibración mencionados, muchos
sistemas de integración permiten realizar el cálculo únicamente en base a un factor de
respuesta obtenido a partir de una sola concentración de patrón; este método de cálculo
asume implícitamente que la respuesta del detector es lineal frente a la concentración
con pendiente 1, lo que muy raramente se cumple en la práctica. En estos casos la
calibración debe realizarse únicamente con patrones cuya concentración de analito sea
muy similar a la de las muestras ya que, en caso contrario, las cuantificaciones
realizadas mediante este tipo de cálculo pueden alejarse notablemente de la realidad, tanto
más cuanto mayor sea la diferencia de concentraciones entre patrón y muestra.

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