UNIVERSIDAD NACIONAL DE

FRONTERA DE SULLANA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS

Microbiología de los alimentos

Guía de prácticas

V Ciclo

Docente: Blgo. Oscar Julián Berrios Tauccaya

Sullana – Perú

2019
 PRÁCTICA N° 06

CARGA MICROBIANA EN ALIMENTOS I

I. INTRODUCCIÓN

Cultivar microorganismos significa promover de forma intencional su crecimiento en medios de cultivo

y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio
se denomina cultivo. Para favorecer el desarrollo de un microorganismo en particular, es necesario
considerar el aspecto nutricional y las condiciones ambientales de su hábitat natural. En cuanto al
aspecto nutricional se debe contar con fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo, sales y agua además de
tener un pH controlado. Al periodo de crecimiento de un cultivo se le llama incubación. Durante la
incubación de un microorganismo se deben controlar variables como la temperatura, humedad,
luminosidad y aeración.

Cada especie bacteriana crece a temperaturas que están dentro de ciertos límites. Por esto podemos
clasificarlas en función de su temperatura óptima de crecimiento (temperatura de incubación que permite
el desarrollo bacteriano en un período corto de12 a 24 h), en los siguientes grupos:
a) Psicrófilas, son capaces de crecer a 0° C o menos, aunque crecen mejor a temperaturas
superiores, cercanas a 15° o 20° C.
b) Mesófilas, son bacterias que crecen a temperaturas que se encuentran entre 25° y 40° C. Son las
más abundantes.
c) Termófilas, se desarrollan mejor entre 45° y 60°. Los límites de desarrollo de algunas bacterias
termófilas pueden llegar a la región mesofílica.

Para que los microorganismos de interés se desarrollen en los medios de cultivo es necesario tomar, en
condiciones de asepsia, un inóculo o muestra a partir de otro cultivo o de un material contaminado. A
este proceso se le denomina sembrado o inoculación.

En el sembrado de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos, pipetas graduadas

o pipetas Pasteur que deberán esterilizarse previamente. El uso de estos materiales depende del inóculo
y del medio en el cual se desea sembrar.

Si el inóculo es sólido puede sembrarse en un medio líquido usando un asa bacteriológica o un hisopo.
Si el inóculo es líquido, se usa una pipeta graduada o una pipeta Pasteur.

Los medios semisólidos se preparan en tubos, se inoculan con aguja (asa recta) o con pipeta; en este
último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura
de aproximadamente 45° C se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar.

Los medios de cultivo sólidos se preparan en tubos o en matraces dependiendo de la cantidad, después
de esterilizarlos estos se inclinan o se vierten en cajas de Petri.

La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad. En estos medios
al multiplicarse los microorganismos forman agregados que se hacen visibles a simple vista. A estos
agregados se les denomina colonias que presentan características que varían con el tipo de
microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado.
 II. OBJETIVOS

2.1.Objetivo General

Determinar la carga microbiana en alimentos líquidos

2.2.Objetivos específicos

1) Dominar la técnica de la “Diluciones Decimales”.

2) Dominar la siembra en cajas Petri por la técnica de estría en agar.
3) Determinar el número de UFC en cada dilución decimal.
4) Reconocer y diferencias las principales características de la morfología colonial de bacterias
y hongos presentes en los alimentos.

III.FUNDAMENTO TEÓRICO

3.1. Microorganismos en los alimentos

Los microorganismos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo que siempre se encuentran
presentes en diversos productos, especialmente en aquellos que favorecen de algún modo su
sobrevivencia o desarrollo.

Los alimentos por su producción primaria, generalmente tienen una importante microbiota “normal”,
según la región y condiciones en que se producen; además, su composición tiende a conservar dicha
flora y, por supuesto, le proporciona nutrientes de manera que, si las condiciones lo permiten, los
microorganismos pueden multiplicarse en los alimentos. Como consecuencia de este desarrollo
microbiano, los alimentos pueden deteriorarse y perder sus atributos.

Además de la microbiota normal, los alimentos son susceptibles de contaminación durante su manejo,
ya sea por operadores, equipo, fauna nociva, o por contaminación cruzada; algunos de los
microorganismos contaminantes pueden ser patógenos y en tal caso, su desarrollo e incluso su mera
sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de normas de higiene y seguridad, hasta la
aparición de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s).

Dado el tamaño de las poblaciones microbianas que pueden estar presentes en un alimento, que van
desde algunos miles hasta varios millones de células por gramo, su determinación cuantitativa requiere
la preparación de diluciones conocidas de la muestra; y es costumbre utilizar cifras decimales para
facilitar los cálculos. En esta práctica se establece la forma general de preparar dichas diluciones. En
vista de la gran cantidad de productos alimenticios y de la diversidad de sus características, algunos
pueden requerir modificaciones o métodos específicos pero, en todos los casos donde sea posible, se
recomienda apegarse a estas guías y modificarlas únicamente cuando sea necesario.

Lo más adecuado es preparar una dilución primaria y, a partir de ella, todas las necesarias para poder
contar los microorganismos presentes; pueden ser dos diluciones decimales consecutivas, es decir, 1:10
y 1:100 o superiores, según la carga microbiana esperada en el alimento. Un analista experimentado
puede estimar el número de diluciones necesarias a partir del conocimiento que tenga del proveedor y
del proceso, e incluso a partir de los datos de muestreo y desde luego, a partir de la experiencia con
cada tipo de muestra.

El buen resultado del método requiere que las fuentes de variación sean eliminadas en lo posible, por
lo que es muy importante apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones.

3.2. Siembra

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio

adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. Una vez
sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
 Que se efectúen asépticamente.
 Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados.
 Que se realicen solo los manipuleos indispensables.
 Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien
Flujo laminar.

Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del
microorganismo a estudiar.

3.3.Medios sólidos

a) Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se
vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza para microorganismos
aerobios.

b) Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una vez
solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la capa
anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este método se utiliza para microorganismos anaerobios
facultativos y microaerofílicos.

c) Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja
solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda de una espátula de Drigalsky
se extiende el inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se
recomienda para microorganismos aerobios estrictos.

d) Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se deja
solidificar.

Existen distintas técnicas para la siembra en estrías, el objeto es obtener colonias aisladas

 Técnica A: Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta
parte de la superficie de la placa, se quema el ansa, se enfría, se gira la placa a 90° y se vuelve
a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de la
placa. Por último, sin quemar el ansa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.

 Técnica B: Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estrías; se quema el ansa, se hacen 3 o 4

estrías perpendiculares a las anteriores, se quema el ansa y se repite el procedimiento hasta
agotar la superficie de la placa.
e) Siembra en agar en tubo inclinado o bisel: en este caso se colocan 5 ml de medio de cultivo
fundido y estéril, se inclina el tubo y se deja enfriar.
 El inóculo se siembra, con ayuda de ansa, de la siguiente manera:

 En profundidad con ansa de punta: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se introduce
mediante punción en el medio contenido en la parte inferior del tubo.

 En superficie con ansa de aro: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se esparce el mismo
sobre la superficie en bisel en forma de zigzag.

3.4. Toma del inóculo

Una vez que las colonias han crecido, puede ser necesario su confirmación. Si la muestra proviene de un
medio líquido, el inóculo se toma agitando el suavemente el asa dentro del mismo, quedando la muestra
adherida por tensión superficial en el extremo del filamento del asa de siembra.

Si el medio es sólido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (placa Petri), tome una pequeña
porción de cultivo mediante un ligero roce con el asa de siembra.

Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de flauta), hunda el filamento
dentro del medio hasta tomar una pequeña porción de la misma. Flamee la boca del tubo antes de taparlo y
colóquelo en el soporte necesario.
3.5. Transferencia

La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de recipiente que los
contiene. Se pueden presentar los siguientes casos:

 Siembra de medio líquido a medio líquido: El procedimiento se puede realizar con asa en anillo,
aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces o frascos.
 Siembra de medio sólido a medio líquido: El procedimiento se puede realizar con asa en anillo o
aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos.
 Siembra de medio sólido a medio sólido: El procedimiento se puede realizar con asa o aguja y en
tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en placa Petri, en superficie.
 Siembra de medio líquido a medio sólido: El procedimiento se puede realizar con asa en anillo,
aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en placa Petri, ya sea en
superficie o por homogeinización.

3.6. Diluciones Decimales

Primero se prepara el “Macerado Inicial”. El procedimiento más frecuentemente empleado para este fin
consiste en la utilización de un homogenizador de paletas tipo "stomacher" en el cual se homogenizan
diluyente y muestra y, de esta forma se prepara una suspensión más o menos homogénea de alimento y
microorganismos que permite la preparación posterior de las oportunas diluciones que posteriormente serán
utilizadas en los diversos métodos de recuento. Para ello se pesan asépticamente 10 g del alimento.

La maseada suele realizarse en bolsa de plástico para stomacher. Se añaden a la bolsa 90 mL de diluyente
estéril y se homogeniza el alimento con el diluyente en Stomacher durante 2 minutos. Así conseguimos el
macerado inicial que es la dilución 1:10. Si es posible es mejor pesar 25 g de alimento. Añadir 225 mL de
diluyente estéril y proceder como en el caso anterior homogenizando en Stomacher durante 2 minutos.

Para preparar las “DILUCIONES DECIMALES”, añadir 1 ml de macerado inicial (también llamado
dilución madre o dilución 1:10 o 10-1) a un tubo con 9 ml de diluyente, homogenizar usando un agitador
excéntrico de tubos de ensayo durante 20 segundos o agitando manualmente.

De esta forma hemos preparado la dilución 1:100 o 102. Repetir la operación anterior transfiriendo 1 ml de
la dilución 1:100 a un tubo con 9 ml de diluyente para preparar la dilución 1:1000 o10-3. Repetir la operación
 anterior tantas veces como sea necesario hasta conseguir el número de diluciones deseado. El número de
diluciones que se necesita depende de lo contaminado que este el alimento. De un alimento del que se
sospecha un número alto de microorganismos/g hay que hacer más diluciones que de uno poco contaminado.

Para los métodos de ausencia / presencia no es necesario preparar las diluciones decimales.

3.7.Lectura e interpretación de colonias

Si se han seguido correctamente las técnicas de siembra y cultivo, sobre algunos planos del medio,
se podrá visualizar masas microbianas definidas y separadas entre sí, llamadas colonias en medio
sólido; y turbidez, sedimento, película o flóculos en medio líquido.

Cada colonia es el resultado de la multiplicación logarítmica de una bacteria depositada en un punto

del medio sólido, que en condiciones óptimas de crecimiento forman una progenie con sus
características de especie o de grupo, las cuales nos permitirán su identificación.

Las principales características morfológicas que presentan las colonias son:

1) Forma: Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.

2) Elevación: Plana, convexa, acuminada, umbilicada.
3) Borde: Entera, ondulado, dentado, filamentoso.
4) Superficie: Lisa, rugosa, granulada.
5) Tamaño: Diámetro en milímetros.
6) Consistencia: Cremosa, membranosa, mucosa.
7) Cromogénesis: Pigmentación verde, amarilla, roja, etc.
8) Grado de transparencia: Transparente, translúcido, opaco.

IV. EQUIPOS, MATERIALES, REACTIVOS Y MUESTRAS

4.1. Equipos:

1) Balanza analítica.
2) Autoclave.
3) pHmetro.
4) Baño María.
5) Mechero Bunsen.
6) Mecheros de Alcohol.
7) Incubadora.
8) Estufa.
9) Homogenizar de paletas para alimento tipo "stomacher"
 4.2. Materiales

1) Probeta de 100 ml, 250 ml y 500 ml (1 por grupo de mesa).

2) Bagueta o agitador de cristal (1 por grupo de mesa).
3) Espátula (1 por grupo de mesa)
4) Pipeta de 1 ml (5 por grupo) y 10 ml. (2 por grupo
5) Placas Petri (10 por grupo).
6) Tubos de ensayo (5 por grupo).
7) Vaso Beaker de 100 ml, 500 ml y 1000 ml (1 de cada uno por grupo).
8) Matraz de 500 ml (1por grupo).
9) Plumón de tinta indeleble de punta fina. (Estudiante)
10) Fósforos (Estudiante).
11) Toalla o tela de secado (que no desprenda pelusas) (Estudiante)
12) Detergente. (Estudiante).
13) Esponja o tela para el lavado de los materiales de vidrio.
14) Torundas para matraz y tubos.
15) Asa de siembra.
16) Agujas de siembra.
17) Estilete.
18) Capucha para vaso beaker.
19) Papel toalla.

4.3. Reactivos

1) Medio de cultivo Agar Nutritivo Estandar MERCK.

2) Medio de cultivo Agar Cuentagermenes Estandar MERCK.
3) Medio de cultivo Agar MacConkey MERCK.
4) Medio de cultivo Agar Sabouraud. (65 g/L)
5) 1 L Agua Peptonada
6) 1 L Agua Destilada Estéril.
7) Alcohol 70° (Estudiante).
8) Lejía.
9) Agua destilada (pizetas llenas)

4.4. Muestras Biológicas

 Alimentos líquidos (leche fresca, refrescos caseros), no mayor de 150 ml.

V. PROCEDIMIENTO:

Según Contreras. A, (2013) La técnica de siembra en estría es usada para aislar cepas puras en
una placa Petri a partir de un inóculo o muestra con diferentes especies. La técnica consiste en, mediante un
asa de siembra previamente esterilizada, rayar la superficie de cultivo de una placa Petri de forma que en cada
pasada sea menor el número de células depositado, las últimas pasadas deberán depositar un número tan bajo
de células que, una vez incubadas, se formen colonias puras.

Fig.01.fuente de pdf siembra por estrías.

 5.1. Esquema del procedimiento en laboratorio:

Fuente : Elaboración propia 2019

 5.2.Preparación de la zona aséptica

 Desinfectar la zona de trabajo con disolución comercial de hipoclorito de sodio.

 Encender el mechero.
 Desinfectarse las manos con alcohol.

Fig. 02 Desinfeccion del área de trabajo

5.3.Preparación de la dilución primaria para muestras líquidas (como agua, leche, refrescos,
etc. en las cuales la distribución de microorganismos es homogénea o fácilmente
homogeneizable por medios mecánicos como agitación)

 Agitar la muestra manualmente en un arco de 30 cm., con 25 movimientos de arriba abajo, efectuados
en un tiempo de 7 segundos.
 En condiciones asépticas, tomar 10.0 ml de la muestra y
 Diluir con 90.0 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el
contacto entre la pipeta y el diluyente.

Fig.03.dilucion primaria de la muestra

5.4.Preparación de las diluciones decimales adicionales

 Transferir 1.0 mL o un múltiplo de la dilución primaria, a otro recipiente que contenga

nueve volúmenes del diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto
entre la pipeta y el diluyente. Si se toma 1.0 mL de muestra en 9.0 mL de diluyente, se
obtendrá una dilución 1:10; si se utilizan 10.0 mL de muestra se utilizarán 90.0 mL de
diluyente y así se tendrá la misma dilución 1:10.
 Mezclar cuidadosamente cada nueva dilución, siempre de la misma manera que se describe
en el punto 1.
 La selección de las diluciones a preparar, así como de aquellas que se van a inocular,
depende del número esperado de microorganismos en la muestra, con base en los
resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del personal de
inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, trabajar con las
diluciones de la primera a la sexta.
 Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas
seleccionadas. El volumen transferido debe ser > 10% de la capacidad total de la pipeta.
 Si es terminal y se transfiere su capacidad total, escurrir aplicando la punta una sola vez en
un área de la caja Petri sin líquido.
 Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del
cuello del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse
lo necesario.

Fig.04 dilución decimal

5.5.Siembra en caja Petri

 Usando un plumón permanente marcar la parte trasera de la caja en cuatro cuadrantes.

 Usando la mano derecha, colocar el asa bacteriológica en la zona azul de la flama del mechero. Inclinar
el asa para permitir que la mayor parte esté en contacto con la flama hasta que el metal se ponga al
rojo vivo. Esperar unos segundos para su enfriamiento.
 Con la mano izquierda tomar el tubo de ensayo que contiene el inoculo, quitar el tapón de algodón y
flamear la boca del tubo. Se debe cuidar de no tocar la parte interna del tapón.
 Tomar un poco de inóculo de la muestra.
 Flamear la boca del tubo y colocar el tapón de algodón.
 Colocar el tubo en la gradilla.
 Tomar la caja Petri en la que se sembrará el inóculo.
 Usando la mano izquierda, abrir la caja.
 Con la mano derecha descargar el inóculo en la superficie de la caja petri haciendo estrías y abarcando
la mayor área posible. Se debe tener cuidado de pasar suavemente el asa sobre la superficie para evitar
hacer surcos en el agar.

Fig,05 fuente del informe

 Incubar la caja Petri boca abajo para evitar el agua de condensación a 37ºC por 24 a 48 horas.

Fig.06 muestras en la incubadora

 VI. RESULTADOS

6.1. Esquema de los procedimientos de la práctica de la siembra del inoculo:

Leche previamente abierta y

expuesta al ambiente

Se hace la dilución Se toma un ml de cada

primaria de este 10 ml inoculo y se le pasa al
y 90 ml del diluyente siguiente con 9 ml de
diluyente hasta obtener 10-5

Se tomó inoculo con la aza

de siembra previamente
esterilizada y se sembró
mediante la técnica de
estrías Almacenar la muestra a
la incubadora por 24 y
48 horas

Fuente: elaboración propia 2019

 6.2. observaciones de las placas inoculadas a 24 y 48 horas después de la siembra:

muestras del
inoculo de la leche 24 horas 48 horas

10-1

10-2

10-3

10-4
 10-5

6.3. discusión :

VII. CUESTIONAMIENTOS

1) Señale los procedimientos de la dilución decimal. Esquematice

2) ¿Cuál es el fin de usar una siembra por estría simple?
3) ¿Cuál es el objetivo de la siembra por estría por dispersión o agotamiento?
4) Señale las características morfológicas de las colonias bacterianas y de los hongos.