In this issue: Laboratory Medicine Perspectives from Latin America

Recientes avances en el diagnóstico de

tuberculosis en el laboratorio clínico
Rommy Teran1, Jacobus H. de Waard2
1
Laboratorio de Microbiología, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Central del Ecuador
2
Programa Prometeo, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Central del Ecuador

INFORMACIÓN SOBRE EL ARTÍCULO RESÚMEN

Autores correspondentes: El laboratorio tiene un papel decisivo en el diagnósti­

Dr. Rommy Teran co de tuberculosis (TB) así como en la identificación y
Dr. Jacobus H. de Waard
Facultad de Ciencias Químicas determinación de la sensibilidad de Mycobacterium
Universidad Central del Ecuador tuberculosis a diferentes drogas (DST, del inglés, drug
Correos electrónicos: sensitivity testing). El diagnóstico de laboratorio ba­
riteran@uce.edu.ec
jacobusdeward@gmail.com sado solo en microscopía y cultivo, ha sido utilizado
por largo tiempo, sin embargo, y debido al lento cre­
Palabras clave:
tuberculosis, diagnóstico molecular,
cimiento de las micobacterias (3 a 4 semanas), se ha
test de sensibilidad a drogas (DST), hecho indispensable la búsqueda de nuevos y rápi­
NAATs, LAMP, Xpert MTB/RIF dos métodos de diagnóstico. Desde inicios de los 90s,
Agradecimientos: se dispone de técnicas moleculares para una rápida
El programa Prometeo de la SENESCYT detección, identificación y DST del M. tuberculosis.
(Secretaría de Educación Superior, El presente artículo hace una revisión de la nueva
Ciencia, Tecnología e Innovación del
Ecuador) auspició este trabajo.
metodología que ha sido introducida en el laborato­
rio clínico. Nosotros discutimos sobre la microscopía
LED y las técnicas basadas en el PCR para el diagnósti­
co de TB, ensayos inmunológicos para el diagnóstico
de TB activa y latente, métodos de cultivo líquido y
“line probe assays” para un rápido DST y métodos ba­
sados en PCR y ensayos de hibridización para la iden­
tificación de micobacterias. Aunque estas nuevas
técnicas son útiles para tener un resultado rápido,
enfatizamos en que el diagnóstico y seguimiento ba­
sado en el cultivo, es todavía el método de referencia

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para la tuberculosis y que estas nuevas técnicas casos de TB son extrapulmonares y para el dia­
moleculares no pueden reemplazarlo, aunque gnóstico de esta presentación de TB, la exami­
proveen información preliminar y mejoran el nación de esputo no sería aplicable, afectando
manejo del paciente. la detección de estos casos. La implementación
del cultivo para el diagnóstico puede mejorar
INTRODUCCIÓN la tasa de detección de TB en un laboratorio
La tuberculosis (TB) una de las principales en­ en alrededor de un 30 a 40%. El cultivo detecta
fermedades infecciosas en el mundo y es res­ casos con baja carga micobacteriana y también
ponsable por más de 2 millones de muertes se solicita en casos en riesgo de ser TB resis­
y 8 millones de nuevos casos anualmente. La tentes para evaluar su sensibilidad a diferentes
enfermedad es causada por una bacteria lla­ drogas (DST), o en casos donde se sospecha
mada Mycobacterium tuberculosis. La bacteria que la enfermedad se debe a otro miembro
usualmente ataca los pulmones, pero podría del género Mycobacterium. Estos dos métodos
infectar cualquier parte del cuerpo como los de laboratorio, la baciloscopía y el cultivo, son
riñones, el intestino, la pleura, la columna ver­ todavía los “gold standars” para el diagnóstico
tebral y el cerebro. Y si no es tratada adecua­ de TB, siendo el cultivo el método más sensi­
damente, esta enfermedad infecciosa puede ble. Sin embargo, debido al lento crecimiento
ser fatal. de las micobacterias, los resultados pueden
La estrategia de control más importante para tardar de 3 a 4 semanas, es así que nuevas y
la TB, es la detección temprana y el apropiado rápidas técnicas de diagnóstico son requeridas
tratamiento de casos infecciosos. La tasa de de­ para mejorar el diagnóstico de TB y el manejo
tección de casos (TDC) global es de alrededor el del paciente.
64%, lo cual implica que alrededor del 36% de
Desde inicios de los 90s, nuevas técnicas de
casos de TB incidente no son detectados. Esto
laboratorio para el diagnóstico de TB y las prue­
deja una brecha de aproximadamente 3.3 mi­
llones de personas con TB alrededor del mundo bas de sensibilidad a drogas han sido desarro­
que se “perdieron”, tanto porque no fueron dia­ lladas, basadas en el uso de medios de cultivo
gnosticadas o porque fueron diagnosticadas, líquidos, técnicas de amplificación de ácidos
pero esto no se reportó (1). Para las Américas, nucleicos (NAATs, del inglés, nucleic acid am­
la TDC es alrededor del 79%, lo cual significa plification tests), hibridización de ADN y téc­
que anualmente 33,000 pacientes con TB no nicas para la detección de mutaciones, y de­
son detectados o reportados (1). tección de antígenos y anticuerpos. Esta mini
revisión pretende ofrecer algo de información
Los laboratorios tienen un rol central en el dia­
gnóstico de TB, es así que reforzar su desem­ general sobre nuevas técnicas de laboratorio
peño y capacidad, es prioritario para el control que están disponibles actualmente para el dia­
de esta enfermedad. Sin embargo, el diagnósti­ gnóstico de TB activa o la detección de una
co de TB en la mayoría de laboratorios se hace infección latente por TB. Esta revisión abarca
por los llamados métodos convencionales y la solamente las técnicas más importantes que
mayoría de casos de TB son diagnosticados por se han desarrollado. La comparación de mé­
baciloscopía. La baciloscopía tiene una sensi­ todos no está dentro de los objetivos de este
bilidad de cerca del 60-70% de los casos de TB. artículo y lectores interesados son referidos a
Adicionalmente, alrededor del 25% de todos los la literatura más especializada.

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MEJORAS EN LA BACILOSCOPÍA EL CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO

PARA EL DIAGNÓSTICO DE TB PARA EL DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS
La examinación microscópica de muestras El “gold standard” para el diagnóstico de TB es
de esputo, ha sido la base de la detección de todavía el aislamiento de M. tuberculosis en
casos de TB por más de 100 años y todavía es un medio de cultivo. El cultivo provee además
el método principal en sitios con presupuestos aislados para identificación (basada en pruebas
limitados, donde el diagnóstico de TB se basa bioquímicas y moleculares) y para DST. Hasta ini­
únicamente en la tinción de Ziehl-Neelsen y la cios de los noventas, el cultivo era usualmente
observación del frotis con el microscopio óp­ hecho en medio sólido basado en huevo como
tico. Este procedimiento detecta solamente el Lowenstein-Jensen y el medio Stonebrink.
alrededor del 60-70% de los casos de TB. Una Una desventaja del cultivo en estos medios sóli­
alternativa es el uso del microscopio de fluo­ dos es el lento crecimiento de la bacteria, que
rescencia, que puede ser 10% más sensible que puede tomar al menos de 2 a 4 semanas o a
el microscopio óptico, debido a que el bacilo veces más, antes de que el cultivo dé positivo.
fluorescente puede ser visto a un aumento más Los medios líquidos tienen una incrementada
bajo y el frotis puede ser examinado en sola­ sensibilidad para el crecimiento de M. tubercu-
mente el 25% del tiempo que toma examinarlo losis (hasta un 20% de incremento en la positivi­
con el microscopio óptico. Sin embargo, ha sido dad) y un reducido tiempo de detección (10-14
difícil implementar este microscopio en el diag­ días versus 2-4 semanas). El inconveniente es
nóstico de TB debido al alto costo asociado con la tasa de contaminación del medio líquido, el
la compra de un microscopio con una lámpara cual parece ser más alto en comparación con el
de vapor de mercurio, la necesidad de reempla­ sólido (4). La OMS recomienda el uso del medio
zar frecuentemente esta lámpara de UV, la cual sólido convencional junto con el medio líquido
dura solamente 200-300h, y la necesidad de un para el aislamiento primario de micobacterias.
cuarto oscuro para la lectura de las placas (2).
El medio líquido consiste en caldo Middlebrook
El desarrollo reciente de la tecnología dio lugar 7H9 suplementado con 10% de OADC (ácido
al microscopio de fluorescencia, el mismo que oleico, albúmina, dextrosa y catalasa) y, para
usa un sistema de iluminación basado en la evitar la contaminación con otros microor­
luz emitida por un diodo (LED) con un tiempo ganismos, se agrega PANTA (una mezcla de
de vida útil de hasta diez mil horas, lo cual re­ antibióticos: polimixina, anfotericina B, ácido
sulta en la microscopía de fluorescencia LED. nalidíxico, trimetoprim y azlocilina). En la ac­
Es así que microscopios fluorescentes LED tualidad, se dispone también de sistemas de
relativamente económicos están disponibles. cultivos elaborados que están disponibles com­
La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha ercialmente. Estos van desde botellas simples y
evaluado la eficacia de la microscopía LED, y los tubos tales como MGIT (BD Diagnostic Systems,
resultados mostraron que el diagnóstico con USA), Septi-Chek AFB (BD, USA) y MB Redox
este microscopio fue más sensible (alrededor (Biotest Diagnostics, USA) hasta sistemas semi­
del 10%) que con el microscopio óptico (2,3). automatizados (BACTEC 460TB) y totalmente
Basándose en estas consideraciones, la OMS automatizados (BACTEC 9000 MB), BACTEC
recomienda que la microscopía convencional MGIT 960 (BD, USA), ESP Culture System II [Trek
y la fluorescente sean reemplazadas por la mi­ Diagnostics, USA] y MB/BacT ALERT 3D System
croscopia LED. (BioMérieux, NC). Para estudios comparativos

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de estos sistemas (semi) automatizados, el lec­ los estudios (9). Este análisis concluye que exis­
tor puede referirse a literatura especializada (5, te la necesidad de mejorar la exactitud de los
6, 7). NAATs, particularmente la sensibilidad y que
NAATs comerciales no pueden ser recomenda­
HERRAMIENTAS BASADAS EN EL ADN dos para reemplazar el cultivo y la microscopía
PARA EL DIAGNÓSTICO DE TB para el diagnóstico de TB pulmonar (8, 9).
Tests clásicos para la amplificación de
La amplificación isotérmica de ácidos
ácidos nucleicos (NAATs, del inglés,
Nucleic Acid Amplification Tests) nucleicos (LAMP, del inglés, Loop-Mediated
Isothermal Amplification)
Desde inicios de los años noventa, varias
metodologías han sido publicadas para la detec­ Otro ejemplo de NAAT comercial, y que ha sido
ción de M. tuberculosis con la reacción en ca­ diseñado recientemente, es la amplificación
dena de la polimerasa (PCR), usando cebadores isotérmica de ácidos nucleicos (LAMP, del in­
oligonucleótidos para amplificar un fragmento glés, Loop-mediated Isothermal Amplification).
de ADN específico para este microorganismo. La experiencia en investigación de este test es
Estos NAATs pueden arrojar resultados en 3-6 limitada. Este método se fundamenta en la nue­
horas e incluyen a aquellos comerciales y a los va plataforma loop-mediated isothermal ampli­
“hechos en casa”, basados en un protocolo de­ fication (LAMP) de Eiken Chemical Co. en Japón.
sarrollado en un laboratorio no-comercial. Cada Esta tecnología amplifica un ADN diana bajo
NAAT usa un método diferente para amplificar condiciones isotérmicas (alrededor de 65°C) y
regiones específicas del ácido nucleico del com­ está diseñado para detectar visualmente ADN de
plejo Mycobacterium tuberculosis. muestras clínicas, en menos de dos horas y con
Varios NAATs comerciales existen y la FDA (U.S. un mínimo de instrumentación. No hay la nece­
Food and Drug Administration) ha aprobado el sidad de un paso previo de desnaturalización de
uso de algunos de ellos para muestras respirato­ la doble cadena a su forma simple. La amplifi­
rias solamente. Estos kits incluyen el GenProbe cación y detección del ADN se dan en el mismo
Amplified  M. tuberculosis Direct test (AMTD), microtubo. (Figura 1). El relativamente comple­
el Roche Amplicor MTB test, el Cobas Amplicor jo proceso de amplificación se detalla en el si­
test, el Abbott LCx test, y el BD-ProbeTec (SDA) tio web de Eiken, en el que también se incluye
test (8). Ninguno de estos tests ha sido apro­
una animación de la reacción (http://loopamp.
bado para la detección directa de M. tubercu­
eiken.co.jp/e/lamp/index.html). Un grupo ex­
losis de muestras extrapulmonares. Aunque
perto de la OMS concuerda en que la tecnología
toda esta tecnología es rápida y ha demostrado
LAMP tiene potencial para ser una herramienta
excelente especificidad, su desempeño puede
variar y todavía su sensibilidad no iguala a la diagnóstica rápida de TB, pero que la evidencia
de los métodos basados en el cultivo, especial­ disponible de este ensayo es insuficiente para
mente para muestras con baciloscopía negati­ recomendarlo como prueba que sustituya a la
va. Un meta-análisis reciente que analizaba la microscopía tradicional. Actualmente, en 14 si­
exactitud de los métodos comerciales NAATs, tios, la OMS conduce estudios independientes
mostró 125 estudios que analizaban muestras para probar el ensayo TB LAMP, evaluando su
con frotis positivos, y determinó que había un factibilidad y costo-efectividad. Los resultados
alto grado de variabilidad en la exactitud entre se esperan en el año 2015 (10).

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Figura 1 Reacciones positivas para LAMP

Reacciones positivas para LAMP se muestran en los dos tubos de la derecha. Amplificación y detección de ADN se dan en
mismo tubo. Los dos tubos de la izquierda son negativos. La imagen se tomó bajo luz UV y la fluorescencia se debe a la adición
de PicoGreen a todos los tubos, un colorante que se liga al ADN, el cual se integrará al producto amplificado. Este complejo
colorante-ADN emitirá fluorescencia bajo luz UV, lo cual hace fácil distinguir entre reacciones positivas y negativas.
Adaptado de: http://www.finddiagnostics.org/programs/tb/find_activities/lamp_assay.html.

El Xpert MTB/RIF test para el diagnóstico detección de TB entre casos confirmados por
de TB resistente a drogas cultivo en un 23%. Para la detección de re­
Los métodos NAATs disponibles para la de­ sistencia a la rifampicina, el Xpert® MTB/RIF
tección de ADN de M. tuberculosis, incluyen muestra una sensibilidad acumulada de 95%
procesamiento de la muestra de esputo y ex­ y una especificidad acumulada de 98% (12).
tracción del ADN como dos pasos separados. La OMS recomendó en diciembre del 2010,
El Xpert MTB/RIF integra procesamiento del el uso del Xpert® MTB/RIF y en la actualidad,
esputo, extracción de ADN y amplificación en está promoviendo la introducción global de
un solo paso de preparación de la muestra esta tecnología. Con la finalidad de facilitar el
(Figura 2). Este método automatizado basado acceso a esta tecnología, el sector público de
ciertos países puede adquirir los cartuchos a
en cartuchos detecta directamente del esputo
precios significativamente reducidos. Hasta
y en menos de dos horas, simultáneamente el
el 31 de diciembre del 2014, cerca de 4,000
complejo M. tuberculosis y la resistencia a la
GeneXpert instrumentos y más de 10 mil­
rifampicina. La tecnología se basa en la plata­
lones de cartuchos MTB/RIF han sido adquiri­
forma GeneXpert (11). Esta plataforma posi­
dos por el sector público de 116 de los 145
bilita la detección de resistencia a la rifam­
países elegidos para acceder a ese beneficio
picina a través de la detección de mutaciones
(13).
en el gen rpoB. El sistema cerrado de esta
tecnología, disminuye el riesgo de contami­
SERODIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS
nación y no son necesarias instalaciones de
bioseguridad especiales. Una revisión sobre La detección de anticuerpos contra M. tubercu-
la precisión de este método y que incluye 27 losis en suero, serodiagnóstico, podría ofrecer
estudios, concluye que en comparación con la resultados rápidos a bajo costo, pero desafor­
microscopía, el Xpert® MTB/RIF incrementa la tunadamente, los tests de los que se dispone

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Figura 2 Procedimiento para la tecnología MTB/RIF

De: http://www.finddiagnostics.org/programs/tb/find_activities/automated_naat.html

actualmente tienen aplicación limitada, debido DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN

a la reacción cruzada y baja sensibilidad. LATENTE POR M. TUBERCULOSIS
La detección de anticuerpos es relativamente Personas con infección latente por TB están in­
simple y es un método costo - efectivo, pero re­ fectadas por M. tuberculosis pero no tienen la
cientes meta-análisis y revisiones sistemáticas enfermedad. Alrededor del 30% de la población
concluyen que las pruebas serológicas comer­ mundial está infectada con M. tuberculosis
y hasta hace poco, esto podía ser detectado
ciales disponibles, proveen resultados inconsis­
con el test de la tuberculina (TST, del inglés,
tentes (14). La OMS actualmente no aprueba su
tuberculin skin test), también llamado test de
uso para el diagnóstico de TB pulmonar ni extra-
Mantoux. Este test se hace inyectando intradér­
pulmonar (15). Más investigación es necesaria micamente una pequeña cantidad de proteína
para desarrollar tests basados en la respuesta derivativa purificada de M. tuberculosis (PPD,
inmune o en el serodiagnóstico y que tengan un del inglés, purified protein derivative) en la piel
desempeño adecuado. de la parte interna del antebrazo. Si ha habido

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exposición previa a M. tuberculosis, una indura­ exactitud de estos ensayos. IGRAs no puede dis­
ción se desarrollará en el sitio de la inyección tinguir entre infecciones de TB activas y latentes
dentro de 2 días. y no debería ser usado para el diagnóstico de TB
El test no diferencia entre infección latente y activa.
enfermedad activa y sus limitaciones, incluyen­
Identificación de especies de Mycobacterium
do la baja sensibilidad y especificidad, han sido
bien documentadas. Resultados falsos positivos El género Mycobacterium comprende más de
en el TST pueden resultar por contacto con mi­ 150 especies y varias nuevas especies de mi­
cobacterias no tuberculosas o vacunación con el cobacterias no tuberculosas (MNT) patogéni­
Bacilo de Calmette-Guerin (BCG), debido a que cas han sido descritas en los últimos 20 años.
la PPD, una preparación de proteína cruda, con­ Aunque la mayoría de casos de TB a nivel mun­
tiene antígenos que están también presentes dial son causados por M. tuberculosis, cada es­
en BCG y en ciertas micobacterias no tuberculo­ pecies del complejo M. tuberculosis puede cau­
sas (16, 17). Sin embargo, el test en piel todavía sar tuberculosis en humanos; por ejemplo M.
permanece como el más empleado para identi­ bovis transmitido por el ganado o M. caprae por
ficar la infección de TB o el estado inmunológico las cabras. Las especies de MNT más frecuent­
del paciente frente a la infección. emente asociadas con enfermedad pulmonar
son M. avium, M. kansaii y M. abscessus y en
Reconocer que el interferón gamma (IFN-γ)
algunos países infecciones por MNT han sido
tiene un papel crítico en regular la respuesta
más importantes que la misma TB (19). Desde el
inmune mediada por células, frente a la infec­
punto de vista epidemiológico y debido a que el
ción por M. tuberculosis, condujo al desarrollo
tratamiento difiere dependiendo de la especie
de pruebas alternativas para la detección de la
de micobacteria, la identificación en el labora­
infección de TB; ensayos de liberación de IFN-γ
torio clínico es definitivamente importante.
(IGRAs, del inglés, IFN-γ- release assays). IGRAs
consisten en tests in vitro en sangre que mide Tradicionalmente, las micobacterias fueron
la respuesta inmune mediada por células; de identificadas por métodos fenotípicos, basado
hecho se mide la liberación de interferón (IFN-γ) en el cultivo, tales como características mor­
por las células T luego de la estimulación de una fológicas, tasas y temperaturas de crecimiento,
muestra del sangre del paciente con antígenos , pigmentación y una serie de pruebas bioquími­
específicos de TB, ESAT-6 y CFP-10, únicos para cas como la acumulación de niacina (M. tuber-
M. tuberculosis. En otras palabras, IGRAs detec- culosis), reducción de nitratos, hidrólisis de
ta la sensibilización a M. tuberculosis midiendo Tween 80, actividad de arilsulfatasa y ureasa e
la liberación de IFN-γ en respuesta a antígenos ingesta de hierro. Sin embargo, la identificación
representativos de M. tuberculosis. Hay dos por estos métodos es laboriosa, consume tiem­
IGRAs disponibles comercialmente; Quantiferon po e implica riesgo biológico, sumado a que una
TB Gold tests, Cellestis, Victoria, Australia y incorrecta identificación puede ocurrir, ya que
T-SPOT.TB, Oxford Immunotec, Abington, UK. diferentes especies pueden tener perfiles mor­
Varios estudios publicados han demostrado un fológicos y bioquímicos no distinguibles.
mejor desempeño de estos tests sobre el TST
en el diagnóstico de infección por M. tubercu­ Identificación basada en la tecnología ADN
losis (18). A pesar de la evidencia de estos estu­ En la última década, métodos moleculares han
dios, el no tener un estándar de referencia para sido desarrollados para la rápida y fiable iden­
la infección, hace difícil acceder a la verdadera tificación de especies de micobacterias. Un

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método relativamente fácil se basa en el PCR y específicas con un marcador quimioluminis­

análisis de enzimas de restricción (PRA, del in­ cente que se hibridiza al ARN ribosomal del
glés, PCR and restriction enzyme analysis) de organismo blanco. El test es fácil de realizar y
los genes codificados por la proteína de shock hace posible una identificación rápida. Los re­
térmico hsp65 (20). Este gen está presente en sultados son leídos con un luminómetro. Test
todas las especies de micobacterias, y los pa­ individuales para la identificación de varias
trones generados por dos enzimas (HaeIII y importantes micobacterias están disponibles,
BstEII) de un producto de PCR de 439 pares de incluyendo el complejo M. tuberculosis, M.
bases del gen hsp 65, pueden ser comparados avium, M. intracellulare, el complejo M. avi-
con patrones disponibles en la base de datos um, M. kansasii y M. gordonae.
para la identificación de especies; también lla­
Más reciente es la introducción de otros
mado sitio PRA, con perfiles para casi todas la
sistemas moleculares para la rápida identifi­
especies micobacterianas (http://app.chuv.ch/
cación del complejo M. tuberculosis y MNT: el
prasite/index.html).
INNO- LiPA MYCOBACTERIA v2 (Innogenetics
Otro método es la secuenciación del gen 16S NV, Ghent, Belgium), y el GenoType MTBC
ARN ribosomal, el estándar de referencia fren­ and GenoType Mycobacterium CM/AS (Hain
te al cual todos las nuevas técnicas de identi­ Lifesciences, Nehren, Germany). Estos tests
ficación generalmente se comparan (23). El son también llamados ensayos de sonda de
PCR para la amplificación del gen 16S ARNr línea reversa (reverse line blot assay en inglés)
puede hacerse por métodos convencionales y detectan la presencia de ciertos loci de ADN,
o con kits disponibles comercialmente como representativos de especies, en un ensayo de
el MicroSeq 500 16S ribosomal DNA (rDNA) hibridización con un producto de PCR del mi­
bacterial sequencing kit (Applied Biosystems, croorganismo aislado. (Figura 3). INNO-LiPA
Foster City, Calif.). Este kit se basa en el PCR MYCOBACTERIA v2 es un ensayo de sonda de
y la secuenciación de las primeras 500 pares línea que simultáneamente detecta e identi­
de bases del ARNr bacteriano. El secuen­ fica el complejo M. tuberculosis y 16 diferen­
ciamiento puede hacerse fácil y económi­ tes especies micobacterianas. El test se basa
camente con proveedores del servicio de en diferencias de nucléotidos en la región
secuenciación disponibles comercialmente espaciadora 16S-23S ARNr y puede ser reali­
(aproximadamente $5 USD por secuencia). La zado a partir de un cultivo en medio sólido
identificación requiere una sola reacción de o líquido. El GenoType MTBC y el GenoType
secuenciación, lo cual es costo-efectivo. Para Mycobacterium CM and AS son también en­
la identificación final de especies, la secuen­ sayos de sonda de línea. El GenoType MTBC
cia obtenida puede ser comparada con bases pretende la diferenciación de miembros del
de datos públicas disponibles; la base de da­ complejo M. tuberculosis, incluyendo M. bo-
tos EzTaxon (http://www.ezbiocloud.net/) o vis BCG. El GenoType Mycobacterium CM and
el (GenBank) del NCBI (National Center for AS pueden identificar 40 de las especies más
Biotechnology Information; http://www.ncbi. comunes de MNT, incluyendo al complejo de
nlm.nih.gov/). M. tuberculosis. El GenoType Mycobacterium
Hay varios sistemas comerciales disponibles CM permite la identificación genética molecu­
para la identificación de micobacterias. El lar simultánea del complejo M. tuberculosis y
primer método disponible fue el AccuProbe de 24 de las especies de MNT más comunes,
(Gen- Probe Inc.), basado en sondas de ADN mientras que el GenoType  Mycobacterium

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Figura 3 Diseño de una tira de ensayo de sonda de línea reversa:

El INNO-LiPA® MYCOBACTERIA v2 test

marker line

Conjugate control - 1 Conjugate control

MYC genus - 2 Mycrobacterium genus
MTB complex - 3 MTB complex
MKA-1 - 4 M. kansasii I
MKA-2 - 5 M. kansasii II
MKA-3 - 6 M. kansasii III, IV, V
MXE - 7 M. xenopi
MGO - 8 M. gordonae
MGV - 8 M. genavense
MSI - 10 M. simiae
MMU - 11 M. marinum+ M. ulcerans
MCE - 12 M. celatum
MAIS - 13 MAIS complex
MAV - 14 M. avium
MIN-1 - 15 M. intracellulare 1
MIN-2 - 16 M. intracellulare 2
MSC - 17 M. scrofulaceum
MML - 18 M. malmoense
MHP - 19 M. haemophilum
MCH-1 - 20 M. chelonae I, II, III, IV
MCH-2 - 21 M. chelonae III
MCH-3 - 22 M. chelonae I
MPO - 23 M. fortuitum complex
MSM - 24 M. smegmatis

En la tira están covalentemente unidos, en líneas paralelas, 23 sondas de oligonucléotidos, que representan
regiones específicas de ADN de diferentes especies de MNT y cepas del complejo M. tuberculosis. Algunas especies
como M. kansasii y M. chelonea tienen más de una sonda en la tira porque estas especies tienen más de un tipo
de secuencia de una región especifica. Un producto de PCR marcado de la micobacteria de prueba, es incubado
con la tira y se permite la hibridización contra secuencias homólogas, lo que se evidencia con una banda visible de
hibridización en la tira.

AS identifica 19 especies adicionales de MNT. Identificación basada

En general, los métodos moleculares ofrecen en inmunocromatografía
vari­as ventajas sobre las técnicas convencio­ Tres ensayos rápidos inmunocromatográficos ha
nales para la rápida detección e identificación sido desarrollados para diferenciar entre cepas
de cepas del complejo M. tuberculosis y de del complejo M. tuberculosis y MNT; el BD’s
otras micobacterias, como son el corto tiempo MGIT TBc ID, el Tauns’ Capilia TB (Japan) y el SD
para tener resultados (5-48 horas), confianza Bioline TB Ag MPT64 Rapid Test (Korea).
y reproducibilidad. El uso de estos métodos Los tres son ensayos inmunocromatográficos de
moleculares mejora el manejo del paciente y flujo lateral (Figura 4). El BD y el SD Bioline de­
han sido recomendados por la OMS. tectan el antígeno MPT64, mientras que el Capilia

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Figura 4 Un ejemplo de un test inmunocromatográfico de flujo lateral positivo para

la identificación de cepas del complejo M. tuberculosis en el medio sólido
Lowenstein Jensen

Adaptado de: http://www.finddiagnostics.org/programs/tb/find_activities/rapid_speciation_test.html

detecta el antígeno MPB64; ambas proteínas al menos a dos de los antibióticos de primera
secretoras específicas del complejo M. tubercu­ línea, rifampicina e isoniacida. La TB-ER se de­
losis. Tanto medios sólidos como líquidos pue­ fine como la TB que en adición a la rifampicina
den ser usados como muestras, aunque el BD e isoniacida, es resistente a cualquier fluoro­
ha sido desarrollado para usarse con cultivos quinolona y al menos a una de las tres drogas
líquidos (MGIT). Si se usan cultivos sólidos, una inyectables de segunda línea (capreomicina,
solución tampón es requerida (24). Un control kanamicina y amikacina). La detección tem­
positivo interno es incluido para validar la prue­ prana de la resistencia a drogas es importante y
ba. El tiempo de lectura es de 15 minutos y no reduce el tiempo desde el diagnóstico de TB, al
se requiere de equipamiento especial. Este test inicio de un tratamiento apropiado, mejorando
ha mostrado ser altamente sensible (> 95%) y la recuperación del paciente y también ayu­
específico (> 95%) en varios estudios clínicos dando al control de la transmisión de cepas re­
(24). sistentes en la población. Los métodos conven­
cionales para establecer la sensibilidad a drogas
TEST DE SENSIBILIDAD A DROGAS (TSD,
son lentos. El más usado, el método estándar
DEL INGLÉS, DRUG SENSITIVITY TESTING)
de proporciones, en medio Löwenstein-Jensen
El surgimiento y diseminación de la tuberculo­ o en agar Middlebrook, requiere de 4 a 8 se­
sis multirresistente (TB-MR) y de la tuberculosis manas para dar resultados. El método estándar
extensamente resistente (TB-ER) son un impor­ de proporciones es también llamado “método
tante problema médico y de salud pública. La indirecto”, ya que requiere un procedimiento
TB-MR es un tipo de tuberculosis, resistente secuencial: aislamiento de micobacterias de las

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muestras clínicas, identificación del complejo reducción de un indicador adicionado al cultivo

M. tuberculosis, y las pruebas de susceptibili­ líquido en una microplaca donde el M. tuber-
dad in vitro en presencia de drogas anti-TB. En culosis ha sido preincubado por varios días in
los últimos 15 años, otros métodos basados en vitro y frente a diferentes concentraciones de
cultivo y biología molecular han sido desarro­ drogas. La resistencia es detectada por un cam­
llados y algunos de ellos son “métodos direc­ bio de color en el indicador, lo cual es propor­
tos” en los que se usan los especímenes del cional al número de micobacterias viables en
paciente directamente, evadiendo el tiempo el medio. Entre los indicadores de crecimiento
necesario para aislar M. tuberculosis en cultivos usados como indicadores redox están el azul de
puros (25, 26). alamar y la resazurina.
El ensayo de nitrato reductasa (NRA) es una téc­
Métodos no comerciales
nica en cultivo sólido basado en la capacidad de
de DST basados en cultivo
M. tuberculosis de reducir nitratos a nitritos, lo
Métodos basados en cultivo han sido propues­ cual es detectado al adicionar un reactivo es­
tos para la detección rápida de la resistencia a pecífico (Griess reagent) al medio convencional
drogas, propuestos para ser usados en lugares Löwenstein-Jensen (LJ) que contiene 1 mg/ml
de bajo presupuesto. Entre estos métodos es­ de nitrato de potasio (KNO3). La reducción de ni­
tán la observación microscópica de la resisten­ trato es detectada por una reacción coloreada.
cia a drogas (MODS, del inglés, microscopic ob­ Este método puede ser directo o indirecto. La
servation of drug susceptibility), agar de capa prueba de resistencia se hace inoculando di­
fina (TLA, del inglés thin layer agar), métodos rectamente las muestras del paciente o el cul­
colorimétricos con indicador redox (CRI, del in­ tivo puro de M. tuberculosis en el medio que
glés, colorimetric redox indicator) y el ensayo contiene antibióticos. Una reacción coloreada
de nitrato reductasa (NRA, del inglés, nitrate re­ en el medio libre de drogas solamente, indica
ductase assay) (27-30). Estos métodos pueden un cultivo positivo y el crecimiento en ambos
reportar resultados de susceptibilidad 1 a 2 se­ medios, con y sin drogas, indicaría resistencia.
manas luego de la inoculación.
Los métodos MODS, CRI y el NRA, recibieron
En los métodos MODS y TLA, medios libres de la aprobación de la OMS, no así el TLA. Estos
drogas y medios que las contienen (líquidos métodos tienen similar exactitud que los siste­
para MODS y sólidos para TLA), son inoculados mas comerciales de cultivo líquido y podrían ser
directamente con especímenes de pacientes. implementados a costos mínimos en lugares de
De esta manera no hay primero el crecimiento bajos ingresos y con alta cantidad de muestras.
en cultivos puros. Los cultivos son microscópi­ Sin embargo, estas pruebas requieren un exten­
camente examinados para el crecimiento tem­ so entrenamiento del operador así como estan­
prano de micro-colonias. Crecimiento en el darización y aseguramiento de la calidad antes
medio libre de drogas indica un cultivo posi­ de su implementación (25, 26).
tivo, y el crecimiento en ambos medios indica
resistencia. Pruebas comerciales para la susceptibilidad
Los métodos colorimétricos con indicador re­ a drogas (DST) en cultivos líquidos
dox (CRI) son métodos indirectos, de tal mane­ El sistema comercial de DST más comúnmente
ra que necesitan un cultivo puro de los espe­ usado en cultivo líquido es el BACTEC MGIT
címenes clínicos. Estos métodos se basan en la 960 system con el kit BACTEC MGIT 960 SIRE

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(Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, cultivo líquido incluyen el sistema BacT/ALERT
USA). Este es un método indirecto para pro­ MB (bioMerieux Inc., Durham, North Carolina,
bar la susceptibilidad frente a antibióticos de USA) y el VersaTREK system (Trek Diagnostic
primera línea (isoniacida, rifampicina, etam­ Systems, West Lake, Ohio, USA). El uso de estos
butol y pirazinamida). El test se hace con cul­ sistemas comerciales, en los que se inoculan en
tivos positivos del complejo M. tuberculosis medios de cultivo con drogas las especímenes
inoculados en medios líquidos con las drogas y de pacientes que fueron positivos en el frotis,
sin ellas y los resultados de susceptibilidad pu­ potencialmente reduciría el tiempo en el que
eden reportarse en 1 a 2 semanas después de se reportan los resultados de DST en 1 - 3 se­
la inoculación. El método ha demostrado ser manas. Sin embargo, las “pruebas directas de
equivalente al método estándar de proporcio­ susceptibilidad” de los especímenes clínicos
nes y ha sido aprobado por la FDA y promovi­ es problemática, debido al potencial de tener
do por la OMS. Otros sistemas automatizados bacterias contaminantes y otras especies no-
de DST de M. tuberculosis que usan medio de tuberculosas, lo que resulta en que estos tests

Figura 5 Un ejemplo de un “reverse line blot assay”, el Genotype MTBDRplus strip

Control

Resistencia a
rifampicin

Resistencia de alto
nivel a isoniacida

Resistencia de bajo
nivel a isoniacida

Se muestran los resultados de DST de 5 cepas del complejo M. tuberculosis. (1) cepa susceptible; (2) cepa resistente
a rifampicina y con alto nivel de resistencia a la isoniacida; (3) cepa sensible a rifampicina y bajo nivel de resistencia
a isoniacida; (4) cepa resistente a rifampicina y un alto y bajo nivel de resistencia para isoniacida; (5) cepa
resistente a rifampicina y con alto nivel de resistencia a isoniacida. La tira contiene 27 bandas: 21 son para detectar
mutaciones en regiones de genes asociados con resistencia (11 bandas detectan el loci del tipo salvaje y 10 bandas
detectan el loci de resistencia a antibióticos). Seis bandas en la tira son bandas controles: control del conjugado,
control de amplificación, control del complejo M. tuberculosis y los controles de amplificación del loci de los genes
rpoβ, katG y inhA.

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pueden fallar hasta en un 15%. Por esta razón, resistencia a isoniacida (Figura 5). En ambos
la mayoría de laboratorios confían en los méto­ tests, la identificación de resistencia a la rifam­
dos indirectos, usando un aislamiento primario, picina se da por la detección de mutaciones
para las pruebas de susceptibilidad. significantes en el gen rpoB (que codifica para
la subunidad β de la ARN polimerasa). Para
Métodos moleculares rápidos para TSD evaluar la alta resistencia a la isoniacida, el gen
Mucho esfuerzo ha convocado la investiga­ katG (que codifica para la catalasa peroxidasa)
ción en describir las mutaciones presentes en es examinado y para el bajo nivel de resistencia,
aquellos genes de M. tuberculosis, asociados se analiza la región del promotor del gen inhA
con la resistencia a las drogas anti-TB. Este (que codifica para la NADH enoyl ACP reduc­
conocimiento ha posibilitado el desarrollo de tasa). Recientemente, el GenoType MTBDRsl se
ensayos rápidos basados en el ADN también lla­ ha diseñado para evaluar la resistencia a dro­
mados, “molecular line probe assays”, que per­ gas anti-TB de segunda línea (fluoroquinolonas,
miten la detección simultánea del complejo M. e­tambutol, aminoglicósidos y péptidos cíclicos).
tuberculosis y de las mutaciones asociadas con Este test puede ser usado en combinación con
la resistencia a rifampicina (sola o en combi­ el MTBDRplus para identificar TB-ER.
nación con isoniacida). Estos ensayos se basan
La OMS ha recomendado el uso del INNO-LiPA1
en el PCR, y pueden ser usados directamente
Rif.TB y del GenoType MTBDRplus® LiPA para
con especímenes clínicos, dando resultados
el diagnóstico rápido de TB-MR en sitios con
dentro de 24 a 48 horas; una mejora considera­
niveles altos de TB-MR. Varios estudios evalúan
ble en comparación al tiempo que requiere un
y demuestran que los “Line Probe Assays”, son
convencional TSD, que es generalmente de 1 a
altamente exactos en detectar TB-MR en una
2 meses. A partir de un cultivo o una muestra
variedad de lugares y que son costo-efectivos
clínica, positiva para M. tuberculosis, se ampli­
cuando se comparan con el cultivo de TB y los
fica por PCR la región del gen asociada a resis­
métodos convencionales de DST (31-33).
tencia, seguido por un segundo ensayo para de­
terminar si esta secuencia contiene mutaciones
CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN
relacionadas a esa resistencia. Esto se realiza
con ensayos de hibridización. Los productos de En las décadas pasadas, varios métodos mo­
PCR marcados son hibridizados con sondas de leculares han sido desarrollados para la detec­
oligonucleótidos inmovilizadas en tiras de nitro­ ción, identificación de especies, y la evalua­
celulosa. Las mutaciones se detectan por falta ción rápida de la susceptibilidad a drogas de
de unión a las sondas de las cepas salvajes o por las micobacterias. Estos métodos reducen el
unión a sondas específicas para mutaciones que tiempo de diagnóstico de la TB de semanas a
ocurren comúnmente (Figura 5). días. Algunas técnicas son simples, pero otras
Actualmente, dos ensayos comerciales de este son demandantes e incrementan el costo del
tipo existen, el INNO-LiPA1 Rif.TB (Innogenetics, diagnóstico considerablemente. Algunos de es­
Ghent, Belgium) y el GenoType MTBDRplus® tos nuevos métodos, han sido recomendados
(Hain LifeScience GmbH, Nehren, Germany). El por la OMS y han mostrado su potencial para
LiPA detecta simultáneamente el complejo M. mejorar significativamente la detección de ca­
tuberculosis y la resistencia a la rifampicina. sos y el manejo de pacientes, inclusive los casos
El GenoType MTBDRplus® detecta resistencia de TB resistente a drogas (34,35). Sin embargo,
a rifampicina así como altos y bajos niveles de para la mayoría de países de bajos recursos,

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con altas tasas de TB, donde esta tecnología es de rutina requiere también de sistemas apro­
más necesaria, es prácticamente imposible que piados de aseguramiento de la calidad.
puedan acceder a la compleja infraestructura
Algunos de los principales problemas en el
técnica que está nueva metodología requiere.
diagnóstico de TB no han sido resueltos con
De acuerdo a reportes de la OMS, el ochenta
nuevas técnicas de diagnóstico. Existe todavía
por ciento de todos los casos mundiales ocur­
ren en 22 países altamente poblados, la mayo­ la necesidad de incrementar la sensibilidad
ría de ellos, de bajos recursos. En gran parte de en la detección de TB entre los pacientes con
estos países, el diagnóstico de TB se hace en TB extra-pulmonar o enfermedad paucibaci­
base a la microscopía solamente, sumado a que lar, entre pacientes inmunocomprometidos
muchos laboratorios son marginalizados por los (VIH) y niños. Se requiere también de un en­
programas de control de TB, sin personal entre­ sayo simple y de bajo costo para usarse en
nado, equipo adecuado y sin mantenimiento. centros de atención primaria, donde acuden
Programas de aseguramiento de la calidad, ni la mayoría de pacientes con TB, pero en los
tampoco controles externos para algunos de es­ que no se puede muchas veces tener acceso a
tos laboratorios están presentes (36). Es priori­ un diagnóstico de la enfermedad confirmado
dad para estos países el mejoramiento del siste­ por el laboratorio (37). Para tener un impacto
ma nacional de laboratorios, para proveerlos de en el problema de la TB en estos sitios de re­
microscopios de alta calidad y que accedan al cursos limitados, el diagnóstico ideal sería un
cultivo convencional y a los tests de susceptibi­ test sensible, específico, económicamente ac­
lidad a drogas. cesible y de realización en el punto de atención
Es importante puntualizar que la nueva tec­ a pacientes. El progreso hacia un test de este
nología no puede reemplazar a los métodos tipo ha sido limitado, pero talvez en un futuro
estándares de diagnóstico: cultivo y el tradi­ cercano el descubrimiento de nuevos biomar­
cional DST. El cultivo es todavía necesario para cadores que puedan ser medidos en el sitio de
el diagnóstico de TB en pacientes con frotis atención, hará posible un diagnóstico exacto
negativo y el DST convencional se requiere de TB con un simple test en tiempo-real. Varias
para confirmar la resistencia detectada mole­ pruebas para TB en el punto de atención, in­
cularmente. La detección molecular de la re­ cluyendo ensayos serológicos mejorados,
sistencia depende de la resistencia conferida aditamentos moleculares manuales, ensayos
por alguna mutación. Sin embargo, mecanis­
basados en la respiración para la detección de
mos alternativos de resistencia podrían desar­
compuestos orgánicos volátiles en el paciente
rollarse o podrían aparecer mutaciones que no
enfermo, tecnologías con microchips y tests
serían detectadas por el test. Para proveer re­
sultados rápidos y confiables para el diagnósti­ basados en proteomica y metabolómica, es­
co de TB y cuidado del paciente, se necesita de tán bajo investigación (34, 37). A medida que
una combinación de pruebas que incluyan tin­ la tecnología avanza, nuevas pruebas para TB
ción de frotis usando microscopio de fluores­ y TB resistente estarán disponibles en el mer­
cencia, métodos con medios de cultivo sólidos cado y cuando la competencia aumente, sus
y líquidos, y ensayos moleculares para la iden­ precios deberían reducirse significativamente,
tificación de TB y la detección de resistencia haciéndolas accesibles para países donde los
a drogas. Desde luego, que la implementación recursos son limitados y el presupuesto para
de todas estas herramientas en laboratorios la salud está lejos de ser el ideal.

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Recientes avances en el diagnóstico de tuberculosis en el laboratorio clínico

BIBLIOGRAFÍA 13. World Health Organization. TB diagnostics and labo­

ratory strengthening. Retrieved from: http://who.int/tb/
1. WHO. Global tuberculosis report 2014. Geneva: World laboratory/mtbrifrollout/en/.
Health Organization, 2014. http://www.who.int/tb/publi­
cations/global_report/en/ (accessed Sept 12, 2015). 14. Steingart KR, Flores LL, Dendukuri N, et al. Commer­
cial serological tests for the diagnosis of active pulmonary
2. Marais BJ, Brittle W, Painczyk K, Hesseling AC, Beyers and extra-pulmonary tuberculosis: an updated systematic
N, et al. Use of light-emitting diode fluorescence micros­ review and meta-analysis. PLoS Med 2011; 8: e1001062.
copy to detect acid-fast bacilli in sputum. Clin Infect Dis
2008;47: 203–207. 15. World Health Organization. Commercial serodiagnos­
tic tests for diagnosis of tuberculosis: policy statement.
3. Hanscheid T The future looks bright: low-cost fluo­
rescent microscopes for detection of Mycobacterium WHO/HTM/TB/2011.5. Geneva, Switzerland: WHO, 2011.
tuberculosis and Coccidiae. Trans R Soc Trop Med Hyg 16. Wang L, Turner MO, Elwood RK, Schulzer M, FitzGer­
2008;102: 520–521 ald JM A meta-analysis of the effect of Bacille Calmette
4. Somoskövi A, Ködmön C, Lantos A, Bártfai Z, Tamási L, Guerin vaccination on tuberculin skin test measurements.
Füzy J, Magyar P. Comparison of recoveries of mycobac­ Thorax 2002; 57: 804-809.
terium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 17. Farhat M, Greenaway C, Pai M, Menzies D False-
960 system, the BACTEC 460 TB system, and Löwenstein- positive tuberculin skin tests: what is the absolute effect
Jensen medium. J Clin Microbiol. 2000;38(6):2395-2397.
of BCG and non-tuberculous mycobacteria? Int J Tuberc
5. Heifets L, Linder T, Sanchez T, Spencer D, Brennan J. Lung Dis 2006;10: 1192-1204
Two liquid medium systems, mycobacteria growth indica­
tor tube and MB redox tube, for Mycobacterium tubercu­ 18. Centers for Disease Control and Prevention. Updated
losis isolation from sputum specimens. J Clin Microbiol. Guidelines for Using Interferon Gamma Release Assays
2000;38(3):1227-1230. to Detect Mycobacterium tuberculosis Infection, United
States, 2010. MMWR 2010;59(1-25)
6. Williams-Bouyer N, Yorke R, Lee HI, Woods GL. Com­
parison of the BACTEC MGIT 960 and ESP culture system 19. Prevots DR, Marras TK. Epidemiology of human pul­
II for growth and detection of mycobacteria. J Clin Micro­ monary infection with nontuberculous mycobacteria: a
biol. 2000;38(11):4167-4170. review. Clin Chest Med. 2015;36(1):13-34.
7. Piersimoni C, Scarparo C, Callegaro A, Tosi CP, Nista 20. Telenti A, Marchesi F, Balz M, Bally F, Böttger EC, Bod­
D, Bornigia S, Scagnelli M, Rigon A, Ruggiero G, Goglio mer T. Rapid identification of mycobacteria to the spe­
A. Comparison of MB/Bact alert 3D system with radio­ cies level by polymerase chain reaction and restriction
metric BACTEC system and Löwenstein-Jensen medium enzyme analysis. J Clin Microbiol. 1993;31(2):175-178.
for recovery and identification of mycobacteria from
clinical specimens: a multicenter study. J Clin Microbiol. 21. Kirschner P, Springer B, Vogel U, et al. Genotypic
2001;39(2):651-657. identification of mycobacteria by nucleic acid sequence
determination: report of a 2-year experience in a clinical
8. Update: Nucleic acid amplification tests for tuberculo­ laboratory. J Clin Microbiol. 1993;31(11):2882-2889.
sis. MMWR Morb Mortal Wkly Rep.2000;49:593–594.
22. Brent AJ, Mugo D, Musyimi R, Mutiso A, Morpeth S,
9. Ling DI, Flores LL, Riley LW, Pai M. Commercial nucleic- Levin M, Scott JA. Performance of the MGIT TBc identifi­
acid amplification tests for diagnosis of pulmonary tuber­ cation test and meta-analysis of MPT64 assays for iden­
culosis in respiratory specimens: meta-analysis and meta- tification of the Mycobacterium tuberculosis complex in
regression. PLoS One. 2008;3(2):e1536.
liquid culture. J Clin Microbiol. 2011;49(12):4343-4346.
10. The use of a commercial loop-mediated isothermal
23. Palomino JC, Vandamme P, Martin A. Classical and
amplification assay (TB-LAMP) for the detection of tuber­
culosis. 2013. WHO/HTM/TB/2013.05. Geneva. Retrieved new assays for detecting drug resistance in tuberculosis.
from: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/83142/1/ Biomark Med. 2014;8(9):1105-1114.
WHO_HTM_TB_2013.05_eng.pdf. 24. Palomino JC. Molecular detection, identification and
11. Cepheid GeneExpert Systems. http://www.cepheid. drug resistance detection in Mycobacterium tuberculo­
com/us/cepheid-solutions/systems/genexpert-systems/ sis. FEMS Immunol Med Microbiol. 2009;56(2):103-111.
genexpert-i. 25. Minion J, Leung E, Menzies D, Pai M. Microscopic-
12. Steingart KR, Schiller I, Horne DJ, Pai M, Boehme CC, observation drug susceptibility and thin layer agar as­
Dendukuri N. Xpert® MTB/RIF assay for pulmonary tuber­ says for the detection of drug resistant tuberculosis: a
culosis and rifampicin resistance in adults. Cochrane Da­ systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis.
tabase Syst Rev. 2014: 21;1- 161. 2010;10(10):688-698.

Page 324
eJIFCC2015Vol26No4pp310-325
 Rommy Teran, Jacobus H. de Waard
Recientes avances en el diagnóstico de tuberculosis en el laboratorio clínico

26. Martin A, Panaiotov S, Portaels F, Hoffner S, Palo­ 30. Ling D, Zwerling A, Pai M. GenoType MTBDR assays
mino JC, Angeby K. The nitrate reductase assay for the for the diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis: a
rapid detection of isoniazid and rifampicin resistance in meta-analysis, Eur Respir J. 2008; 32: 1165–1174
Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and 31. Ling DI, Zwerling AA, Pai M. Rapid diagnosis of
meta-analysis. J Antimicrob Chemother. 2008;62(1): drug-resistant TB using line probe assays: from evi­
56-64. dence to policy, Expert Review of Respiratory Medicine
2008;2(5):583-588.
27. Martin A, Portaels F, Palomino JC. Colorimetric redox-
indicator methods for the rapid detection of multidrug 32. Boehme CC, Saacks S, O’Brien RJ. The changing
resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic landscape of diagnostic services for tuberculosis. Semin
review and meta-analysis. J Antimicrob Chemother. 2007; Respir Crit Care Med. 2013;34(1):17-31
59(2):175-183. 33. Parrish NM, Carroll KC. Role of the clinical mycobac­
teriology laboratory in diagnosis and management of
28. Montoro E, Lemus D, Echemendia M, Martin A, Por­ tuberculosis in low-prevalence settings. J Clin Microbiol.
taels F, Palomino JC. Comparative evaluation of the ni­ 2011;49(3):772-776.
trate reduction assay, the MTT test, and the resazurin
microtitre assay for drug susceptibility testing of clinical 34. Parsons LM, Somoskövi A, Gutierrez C, Lee E, Parama­
isolates of Mycobacterium tuberculosis. J Antimicrob sivan CN, Abimiku A, Spector S, Roscigno G, Nkengasong
J. Laboratory diagnosis of tuberculosis in resource-poor
Chemother. 2005;55(4):500-505
countries: challenges and opportunities. Clin Microbiol
29. Morgan M, Kalantri S, Flores L, Pai M. A commercial Rev. 2011;24(2):314-350.
line probe assay for the rapid detection of rifampicin 35. McNerney R, Maeurer M, Abubakar I, et al. Tuberculo­
resistance in Mycobacterium tuberculosis: a system­ sis diagnostics and biomarkers: needs, challenges, recent
atic review and meta-analysis. BMC Infect Dis 2005; 5: advances, and opportunities. J Infect Dis. 2012:15;205
1-9 Suppl. 2:S147-58.

Page 325
eJIFCC2015Vol26No4pp310-325