1.

ESPECTROFOTOMETRÍA

La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para

la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión,
sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes,
biomoléculas, etc.) y estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los
fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son relativamente
sencillos. Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en
forma de energía interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos
organismos, entre ellos el de la fotosíntesis en plantas y bacterias.

La espectrofotometría uv –visible se basa en la absorción selectiva de radiación

electromagnética en la región ultravioleta y visible del espectro electromagnético
(190 – 800 nm) por algunos medios químicos. De esta manera, a través de la
medición de una propiedad llamada Absorbancia, a determinada longitud de
onda, es posible determinar la concentración de un analito dado si se compara
con las Absorbancias de soluciones patrón conocidas (Skoog y West, 2000).

La espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía radiante que

absorbe o transmite un sistema químico en función de la longitud de onda; es el
método de análisis óptico más usado en las investigaciones químicas y
bioquímicas.

El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación

absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida
de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. En
la espectrofotometría es aprovechada la absorción de radiación
electromagnética en la zona del ultravioleta y visible del espectro. La muestra
absorbe parte de la radiación incidente en este espectro y promueve la transición
del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de menor energía
radiante.

En esta técnica es medida la cantidad de luz absorbida como una función de la

longitud de onda utilizada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles
e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para
cada sustancia química. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben
cierto intervalo de longitudes de onda de la luz visible y transmite o refleja el color
complementario que no ha sido alterado. Así, en el análisis colorimétrico de un
material que añada un color rojo a un disolvente es porque la variación de la
absorbancia con la concentración será máxima en la región verde del espectro,
mientras que el cambio de absorbancia con la radiación roja será mínimo.

1.1. Espectro Electromagnético:

Desde Newton, sabemos que la luz blanca se descompone en los colores que la
integran si la hacemos pasar a través de un prisma. Es el efecto que se repite,

por ejemplo, en el arco iris, el cual se dice es el espectro de la luz visible

procedente del sol, son las gotas de lluvia y el aire atmosférico lo que hacen de
espectroscopio. La principal emisión de radiación de los cuerpos es la radiación
electromagnética en forma de luz visible, de la misma manera cada elemento
químico absorbe y emite luz decolores que componen su espectro.

La longitud de onda de la radiación puede ser desde muy pequeña, en el caso

de la llamada radiación gamma, hasta muy grande en las ondas de radio.

Se mide, pues, usando desde nanómetros y angstroms hasta cientos de metros.

Recordemos que un nanómetro es la milmillonésima parte de un metro (1 m =
109 nm) y que un Angstroms la diez mil millonésima parte de un metro, por lo
que un nanómetro equivale a 10 Angstrom (1nm = 10 A) La luz que recibimos
del Sol es radiación electromagnética que se desplaza a 300.000kms/s, en su
totalidad, pero la longitud de onda no es la misma en todos los fotones luminosos,
sino que varía entre los 4000

1.2. TRANSMITANCIA

La figura muestra un haz de radiación paralela antes y después de que ha

pasado a través de una capa de solución que tiene un espesor de b cm y una
concentración c de una especie absorbente. Como consecuencia de
interacciones entre los fotones y las partículas absorbentes, la potencia del haz
es atenuada. La transmitancia T de la solución es entonces la fracción de la
radiación incidente transmitida por la solución:

La transmitancia se expresa a menudo como porcentaje:

1.3. ABSORBANCIA

La absorbancia A de una solución se define mediante la ecuación:

La mayor parte de los trabajos analíticos se realizan con soluciones de manera
que vamos a desarrollarla relación que existe entre la concentración de la
solución y su capacidad de absorber radiación.

1.4. MEDICIÓN DE TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA

La transmitancia y la absorbancia se miden en un instrumento llamado

espectrofotómetro, la solución del analito se debe contener en algún recipiente
transparente, tubo o celda.

Como se ve en la representación, ocurre reflexión en las interfases: aire-pared,

tanto como en la pared-solución. La atenuación del haz resultante es sustancial.
Además, la atenuación de un haz puede ocurrir por dispersión de las moléculas
grandes y a veces por absorción de las paredes del recipiente. Para compensar
estos efectos.

la potencia del has transmitido por la solución del analito es comparada

comúnmente con la potencia del haz transmitido por una celda idéntica que
contiene solamente solvente. Una absorbancia experimental que se aproxima
mucho a la absorbancia verdadera se obtiene con la ecuación.
Los espectrofotómetros, están a menudo, equipados con un dispositivo que tiene
una escala lineal que se extiende de 0 a 100%. De manera de hacer tal
instrumento de lectura directa en porcentaje de transmitancia, se efectúan dos
ajustes preliminares, llamados 0%T y 100%T. El ajuste del 0%T se lleva a cabo
mediante un cierre mecánico del detector. El ajuste de 100%T se hace con el
cierre abierto y el solvente en el camino de la luz. Normalmente el solvente está
contenido en una celda que es casi idéntica a las que contienen las muestras.

Cuando la celda del solvente es reemplazada por la celda que contiene la

muestra, la escala da la transmitancia porcentual. Los instrumentos actuales
poseen un sistema electrónico que realiza la operación matemática y da la
respuesta directamente absorbancia. También hay que hacer una calibración
previa con el solvente o blanco.

1.5. LEY DE LAMBERT-BEER

Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud
de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:

A = log I/Io = ε·c·l

La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración

a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas, también
depende de la distancia que recorre la luz por la solución a igual concentración,
cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se
encontrará-; y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad -
denominada coeficiente de extinción- que es específica de cada cromóforo.
Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de c y l. La
segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se
hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de ε resultan
ser M-1·cm-1.

Este coeficiente así expresado, en términos de unidades de concentración molar

(o un submúltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extinción molar (εM).
Cuando, por desconocerse el peso molecular del soluto, la concentración de la
disolución se expresa en otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1, las
dimensiones de ε resultan ser distintas, por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente
así expresado se denomina coeficiente de extinción específico (εs).

La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c

altos, ε varía con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz,
agregación de moléculas, cambios del medio, etc.

1.6. INSTRUMENTACIÓN PARA LA MEDICIÓN DE ABSORBANCIAS

DE LA LUZ VISIBLE Y ULTRAVIOLETA: ESPECTROFOTÓMETRO
UV-VISIBLE

La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos

aparatos llamados espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en
especial con la incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los
espectrofotómetros constan, según se indica en la figura, de:

 Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.

  Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada
longitud de onda: filtros, prismas, redes de difracción.
 Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o
tubos) que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico
transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice
fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV.

 Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas

en señales eléctricas.
 Un registrador o sistema de lectura de datos.

2. CROMATOGRAFÍA

En 1910, el botánico ruso M. Tswett describió por vez primera esta técnica, que
fue aplicada a la separación de pigmentos de plantas, dándole el nombre de
cromatografía en referencia a las bandas coloreadas de pigmentos que se
separaban por su adsorción selectiva sobre columnas de yeso. Tras su
descubrimiento, la cromatografía quedo prácticamente olvidada hasta 1930 año
en que fue redescubierta por Kuhn y Lederer, quienes la aplicaron para la
separación de carotenoides; a partir de este momento, el uso de esta técnica se
fue extendiendo cada vez más, al tiempo que se desarrollaban diferentes
versiones de esta: cromatografía de reparto.
La cromatografía es esencialmente un método físico de separación en el que los
componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una inmóvil (lecho
estacionario), y otra móvil (fase móvil) la cual percola a través de la primera. El
proceso cromatográfico se da como resultado de repetidos procesos de sorción-
desorción durante el movimiento de los componentes de la mezcla arrastrados
por la fase móvil a lo largo del lecho estacionario (elución), produciéndose la
separación debido a las diferencias en las constantes de distribución de los
componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la móvil. A la distribución
final de los componentes en función de su posición sobre el lecho estacionario,
o del tiempo en que eluyen se le denomina cromatograma.

2.1. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

Las técnicas cromatográficas pueden clasificarse en función del mecanismo de

separación de los componentes entre las fases, o bien por la forma de operar del
sistema.

2.1.1. Mecanismos de separación

En función del mecanismo de separación, las técnicas de cromatografía pueden

clasificarse:

 Cromatografía de adsorción. La separación depende de los equilibrios

de adsorción desorción de los componentes de la mezcla, entre la fase
estacionaria sólida y la fase móvil líquida o gaseosa. La fuerza con que
 es adsorbido un componente depende de la polaridad de este, de la
actividad del adsorbente y de la polaridad de la fase móvil.

En general cuanto más polar es un compuesto más fácilmente será adsorbido.La

cromatografía de adsorción es una técnica que está particularmente bien
adaptada para la separación de compuestos de polaridad baja y media. La
separación de compuestos muy polares mediante cromatografía de adsorción
requiere, debido a la gran retención que ofrecen, la utilización de adsorbentes
muy poco activos, o bien, tratamientos químicos previos para la preparación de
la muestra (preparación de trimetilsilil derivados, etc.) a fin de reducir su
polaridad.

 Cromatografía de reparto. Está basada en la separación de una mezcla

de substancias mediante el reparto existente entre la fase móvil (líquido o
gas) y la fase estacionaria (líquida) soportada o ligada sobre un sólido
adecuado. La mayor o menor migración de un compuesto en este tipo de
cromatografía, será función del coeficiente de reparto de éste entre la fase
estacionaria y la fase móvil:

Cromatografía por tamaño molecular, también llamada de permeación de gel o

de tamiz molecular. Consiste en la separación de las moléculas basándose en
su tamaño en lugar de en su solubilidad o polaridad. Las fases estacionarias
empleadas para este tipo de cromatografía son inorgánicas (zeolitas), o geles
orgánicos compatibles con disolventes acuosos (agarosa, poliacrilamida) u
orgánicos (copolímeros estireno/divinilbenceno).

 Cromatografía de cambio iónico. Las separaciones por intercambio

iónico se llevan a cabo con materiales insolubles y de textura porosa, los
cuales presentan grupos reactivos asociados a iones lábiles capaces de
intercambiarse con los del medio que les rodea, por lo que
inevitablemente este tipo de cromatografía ha de realizarse en medio
líquido. La cromatografía de intercambio iónico es utilizable para la
 separación de substancias iónicas, tanto inorgánicas como orgánicas. Las
separaciones por cambio iónico están basadas en los diferentes
equilibrios de reparto de los iones de la mezcla entre el material cambiador
y la disolución:

2.2. FORMAS DE SEPARACIÓN.

Otra posible clasificación de las técnicas cromatográficas está basada en la

forma de operar del sistema cromatográfico. Básicamente existen cuatro formas
de operación:

 Análisis por desarrollo. Es el método utilizado en los experimentos

iniciales de cromatografía. El cromatograma se desarrolla hasta que el
frente de disolvente alcanza el final del lecho estacionario, de forma que
los constituyentes de la mezcla una vez separados permanecen sobre el
lecho al finalizar la separación. La técnica de análisis por desarrollo
presenta la ventaja de que es analizable la totalidad de la muestra,
incluyendo los compuestos de muy baja o muy alta retención. Se utiliza
fundamentalmente en cromatografía de papel y capa fina.

 Análisis por elución. Es la técnica utilizada en casi todas las

separaciones cromatográficas analíticas y en muchas preparativas. En
ella, el paso de la fase móvil se continúa indefinidamente hasta que los
componentes separados de la mezcla emergen al final del lecho
cromatográfico. Esta técnica presenta la desventaja de que los
compuestos con retenciones muy altas pueden no ser observados.

 Análisis frontal. Este método está basado en la diferencia de afinidad del

adsorbente por cada una de las sustancias a separar. Se utiliza una
pequeña columna, que es saturada sucesivamente por cada una de las
 substancias a separar, emergiendo de ella el primer componente puro
hasta que la columna se satura del segundo componente, momento en el
que empezará a emerger este mezclado con el primero. El análisis frontal
tiene su principal aplicación como técnica preparativa para la purificación
de substancias.

 Análisis por desplazamiento. En este caso, la substancia desplazarte

va incorporada dentro de la fase móvil. Este método se utiliza tanto para
separaciones analíticas como preparativas, siendo muy utilizada en
cromatografía de cambio iónico.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen

mutuamente:

 Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que

puedan serusados posteriormente (etapa final de muchas síntesis)

 Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica).

En estecaso, las cantidades de material empleadas son pequeñas.

2.3. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE SEPARACIÓN EN

CROMATOGRAFÍA

Las distintas técnicas cromatográficas se pueden dividir según cómo esté

dispuesta la fase estacionaria:

 Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana

o sobre un papel. Las principales técnicas son:

 Cromatografía en papel
 Cromatografía en capa fina
 Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una
columna. Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:

 Cromatografía de líquidos
 Cromatografía de gases
Crowder, A. L., Swenson, C. A. 1973. Diferencia ultravioleta Estudios
espectroscópicos de la unión de ligandos a aldolasa de músculo de conejo.
Bioquímica.

Marrón. 2000. Espectrofotómetros utravioleta, visible e infrarrojo cercano.

Aplicado Spectroscopy Reviews.

Pauly, H. E. y Pfleiderer, G. 1977. Aspectos conformacionales y funcionales de

la Disociación reversible y desnaturalización de la glucosa deshidrogenasa.
Bioquímica.
Sosa, AI; Sanchez LL. 2004. espectrofotometría de absorción. maestría en
ciencias bioquímicas. métodos de laboratorio.

UNAM (Universidad Nacional Autónoma de México). 2007. Técnicas

Cromatográficas. Facultad de Química. Química Analítica Instrumental II