BIOQUIMICA DE PROTEÍNAS

BIOTECNOLOGIA DE PROTEINAS

Es la producción y el aislamiento comerciales de proteínas específicas, de fuentes

animales, vegetales o microbianas, y/o su utilización ulterior para producir un
evento biológico pre-definido.

LA VIABILIDAD COMERCIAL ES ESENCIAL PARA EL

EXITO DE CUALQUIER EMPRESA BIOTECNOLOGICA

Biotecnología clásica: Procesos fermentativos (cerveza, vino, quesos) (al menos

4000 años).
Biotecnología moderna: Tecnologías de DNA recombinante y anticuerpos
monoclonales (desde mediados de la década del 1970).
Muchas proteínas tienen aplicación industrial: enzimas, anticuerpos, hormonas,
factores de coagulación sanguinea, factores de crecimiento. Se emplean como
agentes diagnósticos y terapéuticos, y en la fabricación de una gran variedad de
productos biológicos. Se las puede obtener de sus fuentes naturales, pero
actualmente es muy frecuente su obtención a partir de otros organismos, por
técnicas de DNA recombinante.
PROTEINAS DE USO FARMACEUTICO: Factores de
coagulación (hemofilias); eritropoietinas (anemias);
Factor de crecimiento de fibroblastos (ciertas
úlceras); Insulina (diabetes); Interferones,
interleukinas (cancer, SIDA); anticuerpos
monoclonales (diagnóstico); vacunas (hepatitis B).

Se producen en cantidades moderadas (gramos o

kilos) y requieren la máxima pureza. La mayoría se
produce por técnicas de DNA recombinante.
La producción de proteínas recombinantes para uso clínico es un
emprendimiento de alto riesgo y alta recompensa. La American
Pharmaceutical Manufacturers Association ha estimado el costo del
desarrollo de una nueva droga de aplicación farmacéutica en 200 – 250
millones de US$, y el tiempo requerido puede ser de unos 12 años,
desde su concepciòn en el laboratorio hasta su llegada a los anaqueles
de una farmacia.

La primera proteína recombinante empleada en clínica fué la insulina

humana, producida en Escherichia coli y aprobada por USA, UK,
Alemania Occidental y Holanda en 1982. La primera vacuna
recombinante administrada a seres humanos fué la vacuna contra
hepatitis B, producida en levadura (Saccharomyces cerevisiae). Se
producen actualmente proteínas recombinantes para uso clínico en
hongos filamentosos, plantas y animales transgénicos.
 Muchas proteínas con APLICACION INDUSTRIAL, en general enzimas de
origen microbiano, se producen en grandes cantidades, a menudo cientos
de toneladas y con mucha menor pureza. Es una industria que moviliza
cientos de millones de US$ por año.

EJEMPLOS DE ENZIMAS CON APLICACIÓN INDUSTRIAL:

PROTEINASAS (preparados detergentes, fabricación de quesos, industrias de

la cerveza y el pan, de la carne y del cuero; digestivos de uso humano y
veterinario).
AMILASAS (procesado de almidones, industrias fermentativas).
PECTINASAS (industrias de jugos frutales y procesado de frutas).
LIPASAS (industria lechera, industria de aceites vegetales).
LACTASA (hidrólisis de lactosa en leche).
GLUCOSA ISOMERASA (producción de jarabes con alta concentración de
fructosa).
PENICILIN ACILASA (producción de penicilinas semisintéticas).

La mayoría de estas enzimas se obtiene de fuentes naturales, pero algunas son

recombinantes (quimosina, para la hidrólisis parcial de la caseína en la fabricación de
quesos).
PURIFICACIÓN DE
PROTEÍNAS
MÉTODOS – PRINCIPIOS - EQUIPAMIENTO

Marzo 2017
 Planificación inicial

• Cuál es el uso que se le va a dar a la proteína?

El grado de pureza necesario dependerá del uso que se va a dar a la proteína.
Para investigación, la escala es reducida y es más importante la pureza que el rendimiento.
Para usos terapéuticos la escala es mayor y la pureza requerida es máxima.
Para usos industriales, frecuentemente se requiere gran cantidad, bajo costo y pureza menor.
Para act. biológica debe estar nativa; para determinar estr. 1° puede estar desnaturalizada.
• Cuál es la fuente más adecuada?
Fuentes naturales donde la proteína de interés es más abundante y estable.
Fuentes recombinantes. Elección del organismo productor.
• Qué sabemos de la proteína?
Características químicas, físicas, localización celular.
El saber si la proteína es extracelular, intracelular, soluble, insoluble, asociada a membrana o localizada
en una organela particular, influirá en la elección del método de extracción.
Si se trata de una enzima o un receptor se puede explotar la afinidad por sustrato o ligando.
Tamaño y pI. Estabilidad, sensibilidad a la T, extremos de pH, proteasas, aire, metales.
Esquema general de un
método de purificación
• Clarificado y extracción.
• Sucesivos pasos de fraccionamiento cromatográfico.
entre los que se pueden requerir pasos de concentración
y/o cambios de buffer.
 Estrategia de purificación

• Definir los criterios aceptables de cantidad, calidad y costos.

• Preservar la actividad minimizando la desnaturalización, inactivación,
proteólisis, etc.
• Planificar una estrategia de purificación considerando:
- Capacidad
- Resolución
- Rendimiento
- Costos
 Planificación inicial

• Cómo vamos a ensayarla?

Utilizar un método rápido, simple y específico que nos permita evaluar la proteína de interés.
Métodos basados en la act enzimática, propiedades inmunológicas o en la act biológica.

Gran ayuda para el seguimiento de la purificación:

- Nos permite identificar y poolear las fracciones que contienen la proteína de interés.
- Combinado con la determinación de proteínas totales nos da una idea del grado de purificación
alcanzado.

EJEMPLOS: Glucosa 6P dh, proteasas

 Proteínas totales

• espectrofotometría en el UV
(280 nm, Trp; 210-215 nm, unión peptídica)

• Métodos colorimétricos
- Reacción de Biuret (Cu2+ alcalino)
BCA (Cu2+ alcalino + ácido bicinconínico)

- Bradford (Coomassie Blue)

 Espectrofotometría UV

• Abs 280 nm dada por los aminoácidos con anillos aromáticos (W,F,Y)
• Rápida y conveniente (no se requieren reactivos ni incubaciones
adicionales, no requiere estándar, no se consume la proteína).
• Relación linear entre abs y cc de proteínas.
• Sujeta a error por presencia de interferencias que abs en la misma longitud
de onda.
• La aplicación más frecuente es para monitorear fracciones de una
cromatografía o para una estimación rápida (aunque no precisa).
Concentración (mg/ml) = (1.55 x A280) - 0.76 x A260)
• Abs 205 nm enlace peptídico
Concentración (mg/ml) = (A205)/31
 Biuret

 Biuret: Under alkaline conditions substances containing two or more peptide

bonds form a purple complex with copper salts in the reagent. (Abs550 nm).
 Lowry - BCA

• Lowry: Monovalent copper ion and the radical

groups of tyrosine, tryptophan, and cysteine
react with Folin reagent to produce an unstable
product that becomes reduced to
molybdenum/tungsten blue.

• BCA: BCA react with complexes between

copper ions and peptide bonds to produce a
purple end product.
 Bradford
• Bradford: assay based on the formation of a complex between the dye
Coomassie Brilliant Blue and proteins in solution. The reagent is prepared under
acidic conditions (doubly protonated, red). When it binds to proteins, it is
converted to a stable anionic form, which is blue. The dye binds particularly to
basic (arginine) and aromatic amino acids residues. The protein-dye complex
causes a shift in the absorption maximum of the dye from 465 nm (red) to 595
nm (blue).
Parámetros importantes!!
Actividad específica = Proteína de interés / Proteínas totales

Grado de purificación = Actividad específica 2/Actividad específica 1

Rendimiento = Proteína de interés 2/ Proteína de interés 1

DESPUÉS

INICIAL
 Ejemplo: purificación de una seríncarboxipeptidasa de Trypanosoma cruzi
Parussini F, García M, Mucci J, Agüero F, Sánchez D, Hellman U, Aslund L, Cazzulo JJ.
Characterization of a lysosomal serine carboxypeptidase from Trypanosoma cruzi.
Mol Biochem Parasitol. 2003 Sep;131(1):11-23.

Purificacion step Total Total Spec ific Yield Purification

Protein activity Activity factor

mg unitsa unitsa/mg % Fold

Cell-f ree extract 227.5 56.00 0.246 100 1

ConA- Sepharose 5.6 43.75 7.81 78.1 31.75
Mono Q 0.67 25.95 38.73 46.34 157.44
Mono P 0.36 14.70 40.83 26.25 165.97

- Las proteínas hetero oligoméricas no dan

banda única. La pureza se obtiene cuando
- Se debe utilizar un método adecuado pasos subsiguientes de purificación no
para juzgar la pureza de la proteína remueven ninguna de las bandas.
obtenida; actualmente se utiliza SDS- - De manera similar podemos decir que se
PAGE, monodimensional o, ha alcanzado la pureza cuando pasos
preferentemente, bidimensional. adicionales de purificación no logran
aumentar la actividad específica de la
proteína de interés.
CLARIFICADO
• Centrifugación: aplicación de una aceleración radial a una suspensión de
partículas por un movimiento rotacional.

Escala de lab
Centrifugación a gran escala:
Separador continuo
con boca de descarga
1.5m

2m

1: Product feed, 2: Centripetal pump, 3: Distributor, 4: Disk

stack, 5: Solids holding space, 6: Sliding piston, 7: Closing
Hydraulic capacity: 90,000 l / h chamber, 8: Spindle, drive, 9: Solids ejection port, 10: Discharge,
Solids space: 30 l clarified phase
 CLARIFICADO
• Microfiltración: aplicación de una presión a través de un filtro compuesto
por una membrana semi-permeable
(0.1 μM-10 μM)
 Microfiltración: DFF

Escala de lab Escala industrial

 Microfiltración: TFF

• In Tangential Flow Filtration (TFF) the feed stream passes parallel to

the membrane face as one portion passes through the membrane
(permeate) while the remainder (retentate) is recirculated back to
the feed reservoir.
DFF vs TFF
 EXTRACCIÓN

• Diferencias en la facilidad de la ruptura

- Las células animales son muy fáciles de romper, sólo están recubiertas por una membrana
plasmática débilmente soportada por un citoesqueleto.
- Las vegetales también, pese a tener pared celular, su gran tamaño las hace vulnerables a la
ruptura mecánica.
- Las células bacterianas son más resistentes, y esta propiedad depende de que sean Gram
positivas o Gram negativas. El predominio del peptidoglicano en la pared de las primeras, las
hace mucho más sensibles a métodos suaves, como la digestión con lisozima.
- Los hongos filamentosos y las levaduras son los más resistentes a la ruptura. Tienen paredes
celulares que contienen hasta 80 - 90 % de polisacárido (quitina y glucanos en hongos, manano
y glucano en levaduras), además de lípidos y proteínas.
• Consecuencias de la ruptura
- Calor, liberación de proteasas, liberación del ADN celular y aumento de la viscosidad del
extracto
EXTRACCIÓN: MÉTODOS MECÁNICOS
• Homogeneizadores:
- - Mezcladoras y licuadoras para órganos y tejidos (cuchillas rotatorias)
- - French Press (extrusión de líquidos) “exprimir” las células a través de un tubo que
es mucho menor que ellas. Utilizado para romper bacterias, levaduras.

• Agitación con abrasivos:

- Mortereado con alúmina, carburo de silicio, arena para pequeños vol (< 1ml)
- Bolitas de vidrio para volúmenes mayores (< 300 ml)

• Sonicado: >20kHz “cavitación gaseosa” pequeñas burbujas se forman y explotan

produciendo una onda de shock local que produce cambios de presión y disrumpe
las células.

• Congelado-Descongelado: formación de cristales que rompen la célula. Utilizado

para materiales blandos.
EXTRACCIÓN: MÉTODOS NO MECÁNICOS
Involucran la adición de químicos o enzimas que degradan
específicamente los componentes de la pared celular. Muchas
veces se utilizan en combinación con métodos mecánicos para
asegurar una ruptura completa.

La desventaja es que luego tienen que ser removidos de la

muestra.

Ejemplos:
•Enzimas líticas
•Shock osmótico
•Detergentes y solventes
 Uso de enzimas líticas
• Bacterias: lisozima.

- from chicken egg white, from human milk, from human neutrophils
 Uso de enzimas líticas
• Hongos: lyticase, zymolase, chitinase.

Lyticase o Zymoliase (Arthrobacter luteus) hydrolyzes from Serratia marcescens, Streptomyces griseus
poly-β(1→3)-glucose such as yeast cell wall glucan Or from Trichoderma viride
 MÉTODOS DE CONCENTRACIÓN
Remoción de agua y moléculas pequeñas por:
• Precipitación y resuspensión en un volumen menor.
• Remoción a través de una membrana semipermeable:
Ultrafiltración.
• Remoción a través de una membrana semipermeable: Diálisis
contra polietilenglicol.
• Agregado de un polímero seco con poros muy pequeños como
para que la proteína penetre (Sephadex G-25).
• Remoción de agua en vacío: liofilización. Buffers volátiles,
como el bicarbonato de amonio.
 PRECIPITACIÓN
La precipitación fue utilizada como método de purificación.
Actualmente se utiliza como un paso muy grosero durante las primeras etapas
de una purificación.
La precipitación se utiliza como método de concentración de proteínas.
• Efecto de las sales (salting-in, salting-out)
• Precipitación por alteración del pH (mínima solubilidad en el pI).
• Precipitación por solventes orgánicos (etanol, acetona), que disminuyen la
constante dieléctrica de la solución y por ello su poder de solvatación.
• Desnaturalización de impurezas por altas temperaturas, extremos de pH,
solventes orgánicos.
Salting in y Salting out
Precipitación por efecto salting out
Precipitación por alteración del pH
Ultrafiltración (0,001-0,1uM)
Diálisis

Sephadex G-25
 CROMATOGRAFÍA
• Separación diferencial de los componentes de una muestra entre una fase
móvil y una fase estacionaria.
• La fase móvil es el solvente en que se introduce la muestra y con el que se
eluyen las proteínas (puede ser el mismo o variar durante la corrida).
• La fase estacionaria comprende las partículas, en general esféricas, con que
se llena la columna. Estas partículas están formadas por una matriz y, en la
mayoría de los casos, moléculas de menor o mayor tamaño con las que se la
derivatiza, para adaptarla a los diferentes procedimientos cromatográficos.
• La matriz es el sustrato sólido de la fase estacionaria. Las más comunes son
celulosa, dextrano, agarosa, poliacrilamida y silica.
• Deben tener buena estabilidad mecánica y química, alta capacidad, tamaño
y forma adecuada de poros, superficie inerte para minimizar las
interacciones no específicas, y tamaño de partícula adecuado al flujo de
solvente deseado y a la presión operativa.
 FRACCIONAMIENTO CROMATOGRÁFICO
Principio de Separación Tipo de cromatografía

Forma y tamaño Filtración por gel

Carga neta Cromatografía de intercambio iónico

Punto isoeléctrico Cromatoenfocado

Hidrofobicidad Cromatografía de interacción hidrofóbica

Cromatografía en fase reversa
Función biológica Cromatografía de afinidad

Antigenicidad Inmunoadsorción

Contenido en carbohidrato Cromatografía con lectinas

Grupos sulfhidrilos libres Cromatografía covalente

Capacidad de ligar metales Cromatografía de quelatos metálicos
PASOS PRINCIPALES EN UNA CROMATOGRAFÍA
• EMPAQUETADO DE LA RESINA (aunque puede venir la columna ya lista para usar). El
tamaño de la columna a utilizar dependerá del procedimiento cromatográfico a
seguir y de la cantidad de muestra a purificar.
• EQUILIBRADO DE LA RESINA
• SIEMBRA DE LA MUESTRA. La muestra se encuentra resuspendida en un buffer de
composición similar al buffer de equilibrado de columna. La aplicación de la muestra
a la columna se hace generalmente a través de un “loop”, imprescindible para FPLC o
HPLC. En LPLC puede hacerse aplicación manual.
• LAVADO
• ELUCIÓN. La elución de las proteínas introducidas en la columna puede hacerse sin
cambiar la composición de la fase móvil (elución isocrática) o cambiándola, por
etapas o continuamente (gradientes).
• REGENERACIÓN. Normalmente, luego de la corrida la columna debe ser regenerada,
dejándola en condiciones de ser reutilizada. En general si las columnas no se utilizan
continuamente deben ser guardadas conteniendo un agente conservador, como el
etanol al 20% o la azida sódica, para evitar el crecimiento de microorganismos.
 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
• Según la presión a que se opera la corrida, se pueden considerar tres tipos:

1.Corridas a presión normal (LPLC, low-pressure liquid chromatography). Presión

inferior a 5 bar. Pueden usarse matrices de escasa rigidez, como la agarosa o el
dextrano.
2.Corridas a presión intermedia (MPLC, medium-pressure liquid chromatography,
tambien llamada FPLC (Fast protein liquid chromatography). Presión entre 6 y 50 bar.
Requiere matrices mas rígidas. Permite flujos mayores.
3.Corridas a alta presión (HPLC, high-pressure - o high-performance - liquid
chromatography). Presiones mayores de 50 bar. Requiere matrices de rigidez alta,
partículas pequeñas y columnas y tuberías de material altamente resistente a la
presión, como el acero inoxidable o el titanio.

1 Atm corresponde a 1013.25 milibars

CARACTERÍSTICAS TÍPICAS DE LPLC Y HPLC
Característica LPLC HPLC

Tamaño de partículA (µm) 100 10

Flujo (ml.cm-2.h-1) 10-30 100-300

Presión de trabajo (bar) <5 > 50

Tiempo de separación (hs) Hasta 24 1–3

Volumen de muestra ml – l µl – ml
Etapa de purificación Variable En general tardía

Resolución Buena Excelente

Dificultades Largo tiempo, Alto costo de equipo,
cámara fría posible desnaturalización
por presión
Generación del gradiente para la elución en LPLC
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
• El material cromatográfico es un gel en partículas esféricas, de porosidad controlada, sin
derivatizaciones.
• La elución es isocrática. Se usa en general fuerza iónica alta, para minimizar las
interacciones de las proteínas entre si, y de las proteínas con la matriz (en este último caso,
no relacionadas con el tamaño de poro).
• La separación de las proteínas se hace en base a la forma y la masa de la proteína. Las
proteínas que no penetran en absoluto en los poros del gel son las que salen primero (en el
volumen de exclusión o volumen vacío, Vo). Las demás moléculas en la muestra se separan,
saliendo últimas las que penetran por completo en las particulas de gel
• Los materiales mas comunes son geles de dextrano (Sephadex), de agarosa (Sepharosa), de
agarosa y poliacrilamida (Biogel A), de poliacrilamida (Biogel P). Puede usarse en LPLC, y
tambien en FPLC (Superosa, Superdex) y HPLC (silica porosa, como Lichrosorb).
• En la filtración por gel es crítica la relación entre el volumen de muestra y el volumen de la
columna (1 a 5 % del volumen total (Vt) del gel), por lo cual es una técnica que no se puede
aumentar en escala mas que hasta un cierto punto. Para desalado de proteínas, se admite
hasta un 25 - 30 % del Vt.

Aplicaciones: Purificación de proteínas - Desalado - Determinación de pesos moleculares de

proteínas nativas - Determinación de constantes de equilibrio de unión (“binding”).
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
USOS EXPERIMENTALES

Gel filtration can be used as a purification technique. In most cases, gel filtration is
used as a later step in the purification procedure, because it is a relatively low
resolution technique, and because it cannot tolerate large sample volumes.

However, gel filtration can be used as a desalting technique at any time during the
purification.

As mentioned above, gel filtration is used as an analytical technique to measure

the molecular weight of proteins in solution. In performing these experiments, it is
worth examining the migration of different standard molecules
 CROMATOGRAFÍA
DE INTERCAMBIO IÓNICO
• Todas las proteínas contienen residuos cargados, positiva o negativamente, y su balance a un
determinado valor de pH da la carga neta de la molécula a ese pH. El valor de pH en el que las cargas
se balancean, y en consecuencia la carga neta de la molécula es 0, es el punto isoeléctrico de la
proteína.

• Los métodos cromatográficos basados en la carga son dos:

1) La cromatografía de intercambio iónico.
2) El cromatoenfocado.
 CROMATOGRAFÍA
DE INTERCAMBIO IÓNICO
 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
BASADOS EN LA CARGA DE LA PROTEÍNA
• La mayoría de las proteínas tienen su pI entre pH 5 y 9. Por encima de su pI la carga
neta de la proteína es negativa, y por debajo es positiva.
• El material utilizado es una matriz derivatizada con grupos cargados positivamente
(que intercambian iones negativos, y se llaman por eso intercambiadores aniónicos,
como DEAE-celulosa) o negativamente (intercambiadores catiónicos, como CM-
celulosa).
• La adsorción puede hacerse en “batch” o en columna. Las proteínas migrarán en
base a su carga neta a ese determinado pH. La elución se hará aumentando la fuerza
iónica del buffer (eventualemente también cambiando el pH).
• Los intercambiadores pueden ser débiles (utilizables cuando la proteína tiene carga
elevada a ese pH) o fuertes (cuando la carga es baja). No conviene usar
intercambiadores fuertes para proteínas muy cargadas a ese pH, pues la interacción
será muy fuerte y la elución más dificil.
 GRUPOS INTERCAMBIADORES DE IONES
USADOS EN PURIFICACION DE PROTEINAS
Fórmula Nombre Abreviatura
Aniónico fuerte
- CH2N+(CH3)3 Trimetilaminometil TAM -
- C2H4N+(C2H5)3 Trietilaminoetil TEAE -
Aniónico débil
- C2H4N+H3 Aminoetil AE -
- C2H4N+(C2H5)2 Dietilaminoetil DEAE -
Catiónico fuerte
- SO3- Sulfo S-
- CH2 SO3- Sulfometil SM -
Catiónico débil
- CH2 - COO- Carboxi metil CM -
PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI POR
FPLC EN COLUMNA DE MONO Q (INTERCAMBIADOR ANIÓNICO)
Elución por pH

• Since the net charge on a protein is pH dependent, samples can also be eluted
from an IEX medium by altering the pH of the elution buffer. As there is no salt
gradient, samples are simply retained on the column at one pH and eluted by
increasing or decreasing the pH.
• The various charged groups in the sample or on the column are titrated until
they are neutral or of opposite charge to the medium and the sample elutes.
• Proteins bound to an anion exchanger will elute as pH is decreased.
• Proteins bound to a cation exchanger will elute as pH is increased.
• Since pH elution will involve working at pH values close to the isoelectric point of
a protein and since many proteins show minimum solubility close to their
isoelectric points, precautions must be taken to avoid precipitation on the
column.
 CROMATOENFOCADO

• En cromatoenfocado se forma un gradiente dentro de la columna,

mezclando una matriz de intercambio aniónico pre-ajustada a un
valor de pH, con un buffer de pH más bajo.
• La proteína al descender en la columna encontrará valores
crecientes de pH; cuando llegue a su pI se volverá electronegativa,
y se unirá a la matriz positivamente cargada. Como el buffer sigue
corriendo, la proteína se separará y unirá sucesivamente, hasta
eluirse en una banda muy definida (“enfocada”) al pH
correspondiente a su pI.
PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI POR FPLC EN
COLUMNA DE MONO P (CROMATOENFOCADO)
CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA
 La mayoría de las proteínas tienen regiones hidrofóbicas en su superficie. Estos “parches”
hidrofóbicos se deben a la presencia de cadenas laterales de aminoácidos hidrofóbicos o
no polares como Phe, Trp, Ala, Met. Estas regiones hidrofóbicas están dispersas entre
regiones más hidrofílicas o polares y su número, tamaño y distribución son una
característica específica de cada proteína.
 La cromatografía de interacción hidrofóbica separa proteínas de acuerdo a sus diferencias
en la hidrofobicidad de superficie utilizando una interacción reversible entre las
proteínas y la superficie hidrofóbica presente en la matriz..
 La interacción entre las proteínas y la matriz se ve significativamente influenciada por la
presencia de ciertas sales en el buffer de corrida.
 Las sales provocan la eliminación de las moléculas de agua que se encuentran ordenadas
cubriendo las regiones hidrofóbicas de las proteínas. Así las sales promueven la
exposición de las porciones hidrofóbicas facilitando la interacción con la resina. A
medida que la fuerza iónica disminuye, la interacción se revierte y las proteínas con el
menor grado de hidrofobicidad se eluyen primero. Las proteínas más hidrofóbicas eluyen
después requiriendo una mayor reducción en la concentración de sales para revertir la
interacción.
CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA

Matrices
CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA
 CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA
La cromatografía en fase reversa se denomina de ese modo porque utiliza una fase
estacionaria no polar y una fase móvil polar. La fase estacionaria está en general
formada por cadenas alifáticas de hasta C18 unidas a una matriz de silica. La fase
móvil es un solvente polar como metanol, propanol, etanol o acetonitrilo. Estas
condiciones pueden causar la desnaturalización de muchas proteínas . Por ello se
las utiliza en general en HPLC en fase reversa (RP-HPLC), para purificar proteínas y
péptidos para su secuenciación. Se usan contraiones como el ácido trifluoroacético
para asociarse con grupos cargados en la proteína y aumentar su hidrofobicidad.
 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
• Principio: existencia de una interacción reversible entre una proteína y un ligando específico
acoplado a una matriz cromatográfica.

• Algunas interacciones biológicas típicas son:

Enzimaanálogo de sustrato, inhibidor, cofactor.
Anticuerpoantígeno, virus, célula.
Lectinapolisacárido, glicoproteina, receptor de sup celular, célula.
Acidos Nucleicossecuencias complementarias, histonas, polimerasa de ácidos
nucleicos, proteínas de unión a ácidos nucleicos.
Hormonas, vitaminasreceptores, proteínas transportadoras.
Glutationglutation-S-transferasa o proteínas de fusión a GST.
Iones metálicosproteínas de fusión a poli (His) fusion, proteínas nativas con residuos de
histidina, cisteína y/o triptofano en su superficie.

• La interacción biológica entre el ligando y el target puede ser resultado de interacciones

electrostáticas, hidrofóbicas, fuerzas de van der Waals’ y/o enlaces de hidrógeno. Para eluir
la interacción puede ser revertida específicamente utilizando un ligando competitivo, o de
manera no específica cambiando el pH, la fueza iónica o la polaridad.

• La afinidad de la proteína por el ligando debe ser moderada (KL entre 10-4 y 10-8 M) para
permitir una buena unión y una disociación ulterior del complejo en condiciones no
desnaturalizantes.
Pasos de purificación
Coupling through the primary amine of a ligand:
NHS-activated Sepharose
Dissolve the ligand in the coupling buffer (0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH
8.3) to a final concentration of 0.5–10 mg/ml (for protein ligands)
Coupling through the primary amine of a ligand:
CNBr-activated Sepharose
Coupling through hydroxy, amino or thiol group:
Epoxy-activated Sepharose 6B
Coupling through hydroxy, amino or thiol group:
Epoxy-activated Sepharose 6B
 Coupling through a thiol group
Thiopropyl Sepharose 6B
• Thiol-containing substances can be isolated selectively by covalent binding to an activated thiolated matrix
via thiol-disulphide exchange to form a mixed disulphide bond. After washing away unbound material, the
thiol-containing substance is eluted by reducing the disulphide bond.
Principio de la cromatografía covalente basada en el 2-piridil disulfuro

• If the proteins to be purified contain disulphide bonds, the disulphide bridges must be reduced, for example
with 2-mercaptoethanol (5 mM).
• The coupling reaction can be monitored and, in some cases, quantified by following the appearance of 2-
thiopyridone in the eluent at 343 nm during the purification.
• Resolve different thiol proteins by sequential elution: 5–25 mM L-cysteine < 0.05 M glutathione
< 0.02–0.05 M 2-mercaptoethanol < and 0.02–0.05 M dithiothreitol.
• Reactivation: Pass one to two column volumes of a saturated solution (approximately 1.5 mM) of
2,2’-dipyridyl disulphide, pH 8.0 through the medium.
 ConA-Sepharose
• Lectinas: proteínas que interaccionan específicamente y de manera reversible
con ciertos residuos de azúcares. Se utilizan para aislar y separar glicoproteínas,
glicolípidos, polisacáridos.
• Con A es una metalloproteina tetramérica aislada de Canavalia ensiformis (jack
bean). Con A se une a moléculas que contienen α-d-mannopyranosyl, α-d-
glucopyranosyl, y residuos relacionados estéricamente.
• Para mantener las características de unión de la Con A Sepharose, es esencial la
presencia de Mn2+ y Ca2+ (1 mM).
• La elución de las sustancias unidas se puede realizar con un gradiente creciente
(linear o en pasos) de α-D-metilmanósido or α-D-metilglucósido. Estos azúcares
actúan como eluyentes fuertes. Muchas sustancias eluyen a 0.1-0.2 M pero para
sustancias unidas fuertemente se pueden requerir concentraciones más
elevadas. Glucosa y manosa también se pueden usar pero son eluyentes más
débiles.
• Las sustancias unidas fuertemente también pueden eluirse [por disminución del
pH, pero no por debajo de pH 4. El Borato se sabe que forma complejos con los
cis-diols presentes en los residuos de azúcares y así actúa como un eluyente
competitivo (0.1 M buffer borato, pH 6.5).
ConA-Sepharose
Application:
Enrichment of glycoproteins from human plasma
Cromatografía de afinidad: proteínas
recombinantes
• The purification of recombinant proteins can often
be simplified by incorporating a tag of known size
into the protein. As well as providing a marker for
expression and facilitating detection of the
recombinant protein, an important role for the tag
is to enable a simple purification by affinity
chromatography. The two most commonly used
tags are glutathione-S-transferase (GST) and 6 x
histidine residues (His)6.
 Cromatografía de quelatos
metálicos inmovilizados (IMAC)
• La matriz tiene unido covalentemente un quelante de metales, como el ácido
iminodiacético.
• Se carga la columna con un ión adecuado, que puede ser Ni2+, Co2+, Zn2+, Cu2+. La
proteína se adsorbe a la columna si tiene residuos agrupados de His, Cys o Trp. Se
puede eluir compitiendo con imidazol, con quelantes (EDTA) o bajando el pH a 4 - 6,
o.
• Esta técnica es muy usada actualmente para purificar proteínas recombinantes,
expresandolas como fusiones con un “tag” de poly-His (en general 6 residuos), que
pueden agregarse en el N o en el C-terminal.
• Si todo funciona bien, se puede tener proteína recombinante pura en un solo paso
de purificación. Debe tenerse en cuenta los metales pueden catalizar la oxidación
de grupos en la proteína, en especial de –SH.
Cromatografía de Afinidad a Glutation
Sepharose
 REMOCIÓN DE SALES Y
CAMBIO DE BUFFER
• Diálisis
• Diafiltración (ultrafiltración y cambio de buffer)
• Filtración por gel (G-25, PD-10)
 PURIFICACIÓN DE
PROTEÍNAS DE MEMBRANA
1) Es fundamental determinar el modo de asociación de la proteína de
interés con la membrana ya que de ello dependerán los métodos adoptados
para su purificación.
• Las proteínas periféricas (o extrínsecas) están asociadas a la membrana a través de interacciones con otras
proteínas o con las regiones expuestas de los fosfolípidos. En estos casos, la proteína puede a menudo ser
disociada de la membrana alterando las condiciones iónicas del buffer o, en situaciones más resistentes,
induciendo un cierto grado de desnaturalización. Aunque los detergentes pueden ayudar a liberar este tipo
de proteínas, no suelen ser requeridos en los pasos subsiguientes.

• La liberación de las proteínas integrales de membrana (o intrínsecas) en una forma soluble requerirá la
disrupción de la bicapa fosfolipídica o el clivado de su anclaje a membrana. Si una parte sustancial de la
proteína se encuentra dentro de la bicapa lipoídica, durante todas los procedimientos de purificación
posteriores se requerirá “proteger” las regiones hidrofóbicas de su exposición al medio acuoso, por lo que
normalmente se usan detergentes.

2) El paso inicial más valioso consiste en tener una preparación de la

membrana de interés tan pura como sea posible.
• Inducción de shedding, fraccionamiento de membranas, centrifugación en gradiente de densidad, etc
Six ways in which membrane proteins associate with the lipid bilayer. Most trans-membrane proteins are thought to extend across the bilayer as a
single a helix (1) or as multiple a helices (2); some of these "single-pass" and "multipass" proteins have a covalently attached fatty acid chain
inserted in the cytoplasmic monolayer (1). Other membrane proteins are attached to the bilayer solely by a covalently attached lipid - either a fatty
acid chain or prenyl group - in the cytoplasmic monolayer (3) or, less often, via an oligosaccharide, to a minor phospholipid, phosphatidylinositol,
in the noncytoplasmic monolayer (4). Finally, many proteins are attached to the membrane only by noncovalent interactions with other membrane
proteins (5) and (6).
 SOLUBILIZACIÓN DE
PROTEÍNAS DE MEMBRANA
• Proteínas de membrana periféricas
- Se utilizan tratamientos suaves (buffers de baja fuerza iónica conteniendo
0.1-1 mM EDTA o bufferes de alta fuerza iónica conteniendo hasta 1M NaCl
o KCl. Para prevenir la desnaturalización irreversible de proteínas, el pH
debería estar en el rango 6-8 y las incubaciones deben hacerse en hielo.
Incluir inhibidores de proteasas.
- Condiciones más drásticas (6M clorhidrato de guanidina, 8M urea, ácidos
pH 2-3 o bases pH 9.5-11 diluidas) usualmente conducen a la
desnaturalización de las proteínas, a menudo irreversiblemente.
 SOLUBILIZACIÓN DE
PROTEÍNAS DE MEMBRANA
• Proteínas de membrana integrales
- Las que tienen una parte soluble sustancial, pueden ser solubilizadas
cortando la parte que las ancla en la membrana con fosfolipasas o
proteasas, según de qué ancla se trate. Las integrales de membrana que
poseen una parte sustancial de la proteína inmersa en la bicapa lipídica se
extraen por delipidación con solventes orgánicos, agentes caotrópicos o
detergentes.
• Detergentes: Moléculas anfifílicas, relativamente pequeñas. Por encima de
la concentración micelar crítica las moléculas coalescen a través de su parte
hidrofóbica para formar micelas, en equilibrio con el monómero.
Non ionic detergents have a
hydrophilic head group that is
uncharged and are preferred for
their ability to break lipid-lipid
and lipid-protein interactions.
They have limited ability to break
protein-protein interactions and
are often referred to as non-
denaturing detergents and are
used to isolate biologically active
membrane proteins.
Zwitterionic detergents protect
the native state of proteins
without altering the native charge
of the protein molecules.
Zwitterionic detergents are used
for isoelectric focusing and 2D
electrophoresis.
Ionic detergents are used for
complete disruption of cellular
structure and denaturing of
proteins for separation during gel
electrophoresis. Ionic detergents
bind with protein molecules
masking their native charge and
rendering the protein molecules
the overall charge of the ionic
detergent.
Actualmente se usa mucho el Triton X-114, que tiene la propiedad de ser
miscible con el agua a 0 - 4oC, pero se separa en dos fases a 20 - 25oC.
Las proteínas integrales, solubilizadas a baja temperatura, particionan
en la fase de detergente al llevarlas a 20 - 25oC.
 PURIFICACIÓN DE LAS
PROTEÍNAS SOLUBILIZADAS
• Las proteínas periféricas (o los fragmentos hidrofílicos de proteínas integrales) en
general se purifican por los mismos métodos que los usados para las solubles. Las
proteínas integrales presentan problemas especiales, debido a que requieren la
presencia continua de detergentes o solventes orgánicos.

• La filtración por gel puede aplicarse; prácticamente todos los materiales para esta
técnica pueden usarse en presencia de detergentes o desnaturalizantes, y existen
algunas resinas (poliéteres hidroxilados, dextranos hidroxipropilados) admiten
solventes orgánicos. La cromatografía de intercambio iónico y el cromatoenfocado
pueden utilizarse, en presencia de detergentes no iónicos. La cromatografía en fase
reversa en algunos casos puede aplicarse, con la muestra solubilizada en ácido
fórmico al 50 - 70 % en agua. La cromatografía de afinidad es aplicable en general,
requiriéndose a veces resinas de altas porosidad y brazos espaciadores largos.