Punto Isoeléctrico De Aminoácidos Y Proteínas

1.
Levi Patterson 1-745-849 2. Tifanny Navarro 4-781-2352
3.
Gabriela Rodríguez 4-799-2349
Bioquímica (Qm.235), Escuela De Tecnología Médica, Facultad De Ciencias
Naturales Y Exactas, Universidad Autónoma De Chiriquí. David, Chiriquí, Republica
De Panamá.
Email: 1. levipatterson28@gmail.com 2 .tifannydalet@gmail.com
3.
gabyroqui1998@gmail.com
Resumen:
Las proteínas y aminoácidos tienen un pH característico al cual su carga neta es cero.
A este pH se le denomina punto isoeléctrico (PI). En el punto isoeléctrico se encuentran
en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su
máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su
agregación. Como primer punto en este laboratorio se realizó una titulación de
aminoácidos con una alícuota de 25 ml y añadiendo cada 1 ml del titulante (NaOH) 0.2M,
cada vez midiendo el pH hasta que la solución que logramos alcanzar un pH de 10.
Seguidamente se procedió a determinar el punto isoeléctrico experimental a partir de la
gráfica “pH & Volumen consumido” luego pusimos aprueba la solubilidad añadiendo en
un tubo de ensayo 3 ml de agua con una pequeña cantidad del aminoácido (glicina)
observándose que fue soluble y los demás insolubles como respectivamente. Por último
se realizó la separación de la caseína de la leche a la que inicialmente añadimos HCl al
2% hasta alcanzar un pH de 4.8 luego agitamos durante 10minutos y dejamos reposar
hasta pasados 30 minutos observándose la separación por la formación de 2 capas en
la solución, realizamos una decantación y realizamos varios lavados utilizando etanol al
95% y éter, filtrando y secando en el horno obteniendo únicamente la caseína contenida
en la leche la cual era el aminoácido de interés durante estas pruebas .
Palabras claves: Aminoácido, pH, Punto Isoeléctrico, Polaridad, Titulación, Carga Neta.
Objetivos: grupos ionizables corresponden a
grupos carboxilos, aminos, fenólicos y
 Determinar los pKa de un tiolicos. (Silvera, 2019).
aminoácido polar con carga y un
aminoácido no polar, mediante El pKa en una magnitud que cuantifica
titulación con álcali. la tendencia que tienen las moléculas de
 Estimar el punto isoeléctrico de disociarse en solución acuosa. Se
los aminoácidos polares y no define tal que una forma conveniente de
polares del grafico pH vs expresar la relativa fortaleza de un acido
volumen de base. es mediante el valor de su pKa.
 Determinar el punto isoeléctrico
El ácido glutámico pertenece al grupo de
de una proteína mediante la
los llamados aminoácidos ácidos, o con
técnica de precipitación.
carga negativa a pH fisiológico, debido a
Marco Teórico: que presenta un segundo grupo
carboxilo en su cadena secundaria.
el punto isoeléctrico se define como el
(Guyton, 2016)
pH en el cual el numero de cargas
positivas se iguala al numero de cargas
negativas que aportan los grupos
ionizables de una molécula. En el punto
isoeléctrico la carga neta de la molécula
es cero (0). En los aminoácidos los
Materiales y Reactivos Ácid HCL Liquido Puede
o incoloro o producir gastr
Descripción Capacida Cantida clor levement itis, quemadur
d d hídri e as, gastritis
Buretas co amarillo. hemorrágica,
Soporte - 1 Masa edema, necro
molar: sis
Pinzas de - 1
36.458 Puede
bureta g/mol producir
Matraces 125 y 250 2 P.F: - quemaduras,
ml 26°C. p.e: úlceras,
pipetas 25 ml 1 48°C irritación.
potenciómetr - 1 Hidr NaO Solido Puede causar
o óxid H blanco, daños graves,
Reactivos o de densidad: permanentes
sodi 2100 al sistema
Nom For Prop. Toxicidad o kg/mol3. gastrointestin
bre mula físicas y masa al o fatales
químicas molar: 40 para la
g/mol. persona
solubilida (intoxicación
d en agua Irritación con
111g/100 pequeñas
Ácid C5H Densidad Toxicidad
ml exposiciones,
o 9NO : mínima
puede ser
glut 4 1460 kg/
dañino o
ámic m3;
mortal en
o 1,46 g/cm
3. altas dosis.
masa
Por
molar:
inhalación.
147,13
g/mol Etan C2H Incoloro. Peligroso en
p.f: ol 5OH Densidad altas
199°C. : concentracion
soluble 789kg/mo es.
en agua l3. PF: -
114 °C.
Glici C2H Solido Especifica en
PE 78 °C.
na 5NO blanco. determinados
Acidez:
2 Densidad órganos
15,9 pKa.
: 1607
Soluble.
kg/m3.
en agua:
Masa
miscible
molar:
75,07.
p.F: Éter (C2 Incoloro. Peligroso en
236°C H5)2 Densidad altas
Acidez: O : 713, 4 concentracion
2.4-9.8 kg/mol3. es inhaladas o
pKa pf: 157 K. ingerida.
Aminoáci pe: 308 k.
do no sol. en
esencial agua:
6.9g/100
ml. m
dipolar:
1.5 D
 Metodología: C. Determinación del punto
isoeléctrico de la leche.
A. Titulación de aminoácidos.

Coloque una alicuota de 25 ml de Mida 50 ml de leche y coloquelos en

la soliccion de aa en un vaso un vaso quimico de 400 ml
nquimico de 250 ml

Proceda a titular con naoh 0.2 M, Diluya con 150 ml de agua destilada.
con adiciones de 1.0 ml cada vez Titule con HCL al 2% hasta alcanzar
midiendo el ph antes de cada un ph de 4.8.
adicion hasta alcanzar un ph de 10

Observar el punto final cuando la

Grafique sus resultados y reporte proteina de la leche empieza a
los valores de pka de los precipiatar. Agite durante 10 minuto,
aminoacidos analizados y calcule dejar sedimentar media hora y anote
el pi en cada caso sus resultados
D. Separación de la caseína

Lavar el
B. Punto isoeléctrico precipitado
y solubilidad Decantar el
2 veces por
sobrenadante de
suspencion
la leche
Verifique la con100 ml
precipitada
solubilidad de de agua
varios destilada
aminoacidos en
medio acuoso.
Pasar el residuo
Prepare varios tubo humedo a un Agitar con fuerza
de ensayo con 3 ml vaso y preparar durante 5 minutos y
de agua Y añade una uuna suspension decantar. Repetir otra
pequeña cantidad del final de caseina vez con alcohol y otras
aminoacido de 50 ml del 2 veces con eter.
respectivamente etanol al 95%

Filtrar la
Anote sus suspension y
observacion llevarla al horno
es. para obtener un
polvo blanco muy
ligero
 Gráfica de la titulacion de la Glicina
Cálculos y Resultados
con NaOH
12
CUADRO #1 Titulación de la Glicina con
NaOH
10
Pka2 8.63
pH volumen (mL)
8
1.39 0 Punto
1.43 1 6.43 isoeléctrico

pH
6 Experimenta
1.5 2 l
Pka1 4.03
1.58 3
4
1.63 4
1.67 5
2
1.7 6
1.77 7
0
1.82 8 0 10 20 30 40 50
1.89 9 Volumen
1.94 10
2.04 12
Grafico#1 Punto Isoeléctrico Experimental Tomando
2.13 14
De La Titulación De La Glicina Con NaOH
2.22 16
2.42 18
2.8 20
2.98 22
3.19 24
3.39 26 31
3.51 28
Cuadro# 2 Cálculos Del Punto Isoeléctrico Teórico
3.81 30
& Punto Isoeléctrico Experimental Tomando De La
4.03 32 Grafica #1
8.63 34
9.29 36
Aminoácidos Punto Punto
9.55 38 isoeléctrico isoeléctrico
9.76 40 teórico Experimental
9.88 42
Glicina 2.35 + 9.78 4.03 + 8.63
10 44
2 2
= 6.065 = 6.33
 Cuadro #3 Titulación de Ac.
Glutámico con NaOH pH & volumen
12

pH V (mL) 10
8.49
1.39 3
8
1.43 5
6 4.76
1.48 7
4
1.54 9
2
1.61 11
0
1.69 13 0 10 20 30 40 50
1.77 15
Grafico#2 Punto Isoeléctrico Experimental Tomando De La
1.89 17 Titulación Del Ac. Glutámico Con NaOH

2.01 19 Cuadro# 4 Cálculos Del Punto Isoeléctrico Teórico &

2.16 21 Punto Isoeléctrico Experimental Tomando De La
Grafica #2
2.41 23
Glutámico 2.10 + 9.47 4.46 + 8.49
31 =
2.79 25 2 2
= 5.78 6.47
3.27 27
3.73 29
4.12 31 Cuadro#5: Punto isoeléctrico y
solubilidad.
4.76 33
Aminoácidos Con H2O
8.49 35 Glicina Soluble
9.44 37 Acido Glutámico Insoluble
Tirosina Insoluble
9.92 39
Triptófano Soluble
10.50 41 Cisteína Insoluble
 CUADRO #6 Punto isoeléctrico de la
caseína

pH VOLUMEN (mL)
6.65 0
6.5 1
6.34 2
6.13 3
5.94 4
5.77 5
5.61 6
5.51 7
Ilustración 1 “Solubilidad de varios 5.38 8
aminoácidos en medio acuoso” 5.27 9
5.19 10
5.13 11
4.98 12
4.93 13
4.79 14

Ilustración 2 “Estructura molecular de los

aminoácidos triptófano y tirosina”

Ilustración 3”Estructura de algunos aminoácidos

tratados en el laboratorio: cisteína, ácido glutámico y
glicina.
Separación de Observaciones Discusión
la caseína
El punto isoeléctrico se define como el
pH en el cual el número de cargas
Se agito Se agito durante 10 minuto
durante 10 positivas se iguala al número de cargas
minutos negativas que aportan los grupos
ionizables de una molécula. En el punto
Reposo
durante 30 isoeléctrico la carga neta de la molécula
minutos es cero (0). En los aminoáci-dos los
grupos ionizables corresponden a
grupos carboxilos, amino, fenólicos y
Ilustración 4 Formación de 2 tiólicos. Según (Castillo C. 2015) El
fases punto isoeléctrico (pI) es el punto en el
Decantación cual la carga neta en una molécula es
cero. el pi se examina lo más común
posible para las proteínas. Cada uno de
los aminoácidos en una proteína lleva
una carga distinta, y la carga total de
una proteína es la adición de las cargas
Ilustración 5 Filtración y lavados
individuales en cada aminoácido. Esta
carga es también relacionada en el pH
Residuo
de la solución circundante. Durante esta
húmedo
experiencia le realizamos la prueba a
dos aminoácidos en la tabla #1
podemos observar los valores
reportados durante la titulación de la
Ilustración 6 residuo húmedo glicina con NaOH 0.2M con el que
iniciamos con un 𝑝𝐻 de 1.39 y que
Peso del logramos aumentarla agregando mililitro
residuo final a mililitro la cantidad de 44 mililitros para
15.0017g – el llegar a un pH de 10 del cual realizamos
peso del papel una gráfica donde se puede apreciar
1.8070g = claramente donde se encuentra el punto
13.1947 isoeléctrico experimental de este
aminoácido es de 6.33 mientras que el
teórico es de 6.06 por lo que con esto
podemos decir que efectivamente
dentro de estos rangos se encuentra el
punto isoeléctrico de la glicina. Los
aminoácidos por tener al menos un
grupo ácido y un grupo amino pueden
considerarse como anfolitos, es decir,
sustancias que pueden comportarse
como ácidos o como bases.
La concentración relativa de estas
especies depende del pH de la solución.
Todos los aminoácidos poseen un punto
en el que se comportan como una sal
neutra. En este punto la carga neta del
aminoácido es nula ya que los dos
grupos disociables tienen su carga de de esto fue extraída la fase superior “
signocontrario y compensada. Este liquida “ y a la parte solida le realizamos
punto recibe el nombre de punto varios lavados uno con agua destilada y
isoeléctrico. La valoración los otros con alcohol etílico al 95% luego
potenciométrica de glicina protonada, filtramos y obtuvimos el sólido que
con hidróxido sódico da lugar a una posteriormente dejamos en el horno por
25 minutos y pesamos para así obtener
curva,pH frente al volumen de valorante,
la cantidad en gramos de caseína el cual
características de un ácido diprótido. A
fue de 13.19g para esta experiencia.
partir de esta curva se puede calcular la Las fosfoproteinas son un grupo de
concentración de glicina y de los valores proteínas que están químicamente
de las constantes de equilibrio (Ka1 y unidas a una sustancia que contiene
Ka2). La valoración potenciométrica de ácido fosfórico. En la
la glicina protonada da lugar a una curva caseína la mayoría de los grupos fosfato
del tipo propuesto Según (Fernández están unidos por los grupos hidroxilo de
M. 2007) los aminoácidos serina y treonina. La
caseína en la leche se encuentra en
Mientras que para el ácido glutámico al forma de sal cálcica
realizar la curva y extraer de dicha (caseinato cálcico). La caseína
grafica el valor experimental del punto representa cerca del 77% al 82% de las
isoeléctrico de este es de 6.47 y al proteínas presentes en
contrastarlo con el valor teórico el cual la leche y el 2,7% en composición de la
es de 5.78 esta diferencia se la leche líquida. Según (Fernández M.
podríamos atribuir a varios factores 2007) por lo que podemos decir que de
durante el proceso de la titulación desde los 50ml de leche 13.19g son de caseína
el restos lo componen otros
la lectura correcta de este instrumento
aminoácidos y proteínas de la cual está
hasta algún error a del analista al anotar
formada la leche. Una propiedad
los datos. Sin embargo debemos característica de la caseína es su baja
resaltar que ambas sustancias se solubilidad a pH 4,6. El pH de la
comportaron de la manera esperada por leche es 6,6 aproximadamente, estando
lo que se reafirman los conocimientos a ese pH la caseína cargada
teóricos adquiridos, por otro lado negativamente y
también realizamos lo que es la solubilizada como sal cálcica. Si se
extracción de la caseína de la leche añade ácido a la leche, la carga negativa
comercial. En la leche hay tres clases de de la superficie
proteínas: caseína, lacto albúminas y de la micela se neutraliza (los grupos
lacto globulinas (todas globulares). fosfato se protonan) y la proteína neutra
La caseína es una proteína conjugada precipita. Obteniendo como resultado lo
que observamos en la ilustración#4 y los
de la leche del tipo fosfoproteína que se
que se refleja en la siguiente reacción:
separa de la leche por acidificación y
forma una masa blanca. Según Ca2+ Caseinato + 2HCl = Caseína + CaCl2
(Martínez E. 2017).
continuando este laboratorio realizamos
Por lo que durante esta experiencia la prueba de solubilidad la cual se llevó
necesitamos iniciar el proceso de a cabo con los siguientes aminoácidos:
extracción acidificando la leche para ello glicina, ácido glutámico, tirosina,
necesitamos añadir mililitro a militro e ir triptófano y cisteína. Los resultados
verificando el 𝑝𝐻 hasta llegar a un 𝑝𝐻 de obtenidos fueron los siguientes: glicina y
4.80 el cual agitamos con el fin de que triptófano; solubles, acido glutámico,
se terminaran de dividir las fases y luego tirosina y cisteína; insoluble. La glicina,
dejamos reposar para que se formaran la cisteína, tirosina y el triptófano son
de manera clara ambas fases como aminoácidos hidrofóbicos o con grupos
podemos ver en la ilustración #4 luego R no polares. Sus características es que
tienen el grupo–R hidrocarbonado, los
que los hace soluble en agua, aunque contaminada o el reactivo ya no poseía
en ocasiones son pocos solubles y la misma concentración.
pueden ser insolubles en este caso
como lo fueron la cisteína y la tirosina.
También puede ser que las muestras
Cuestionario
hayan estado contaminada o hubo un
mal manejo de los aminoácidos por 1. ¿Por qué no se alcanza el pH 1
parte del estudiante. Los Aminoácidos con HCl 0.1M en las soluciones en
hidrofóbicos son aquellos que las que se prepararon los a.a?
interaccionan poco con el agua, sus
R: A pH ácido la glicina se encuentra
características es que tienen el grupo –
como un ácido diprótico, ya que tanto el
R hidrocarbonado, este grupo no tiene
carga ni positiva ni negativas, es decir, grupo amino como el carboxilo se
son apolares, (Gonzales, 2014). encuentran protonados, es decir, a
Su definición está referida a que en este pH=1 el 100% de las moléculas de
tipo de aminoácidos, su grupo –R es una aminoácidos se encuentran en forma de
cadena alifática, es decir, la naturaleza catión lo cual altera totalmente sus
alifática del –R, hace que no se generan funciones como aminoácido.
zonas electronegativas o 2. Compare los puntos isoeléctricos
electropositivas en la molécula. Tiene la de la glicina y los péptidos glicil-
propiedad de que cuando forman parte glicina. ¿Qué concluye sobre los
de proteínas, se alejan del medio resultados?
acuoso e interaccionar entre sí en zonas 3. ¿Por qué las moléculas con
internas de la molécula, (santos, 2018). grupos ionizables se hacen
De acuerdo a esto los aminoácidos se menos solubles en el punto
dividen en: isoeléctrico?
 Aminoácidos hidrofóbicos R: El punto isoeléctrico se define como
alifáticos: Estos se caracterizan el pH en el cual el número de cargas
por tener una cadena alifática positivas se iguala al número de cargas
completamente lineal, ejemplo la negativas que aportan los grupos
glicina. ionizables de ua molécula. En el punto
isoeléctrico la carga neta de la molécula
 Aminoácidos hidrofóbicos es cero. En los aminoácidos los grupos
aromáticos: En este caso su ionizables corresponden a grupos
cadena alifática se cumple con carboxilos, amino, fenólicos y tiolicos,
ciclos derivados del benceno. por lo que su aporte es igualado.
Ejemplo el triptófano.
4. En la precipitación de la caseína
El Acido glutámico es un aminoácido que pasará si se añade muy
que pertenece al grupo hidrofílico. rápido el ácido y se alcanza un pH
Poseen cargas negativas a pH 7 y con más bajo que 4.8. ¿Qué se debe
un segundo grupo carboxilo. Son hacer en este caso?
aminoácidos hidrofílicos aquellos que R: si se adicionara muy rápido el ácido
interaccionan fácilmente con el agua, la precipitación ocurriría más rápido y
poseen grupos funcionales capaces de afectaría la determinación del punto
formar enlaces de hidrógeno, (Cáceres, isoeléctrico de la caseína ya que se
2018). obtendría un pH más ácido y no se
En base a esta información el ácido podría apreciar el momento en que la
glutámico debió ser soluble en agua, caseína se vuelve insoluble, es decir, el
pero el resultado fue insoluble, puede momento en que precipita. En este caso
ser que esta muestra haya estado se deben añadir una solución de pH
básico para compensar la disminución
de pH o también se le añade más leche
para disminuir la solución ácida.
Bibliografia
5. ¿Por qué es necesario lavar la  Gonzales, M. (2014). Recuperado
cocina precipitada con alcohol de:https:www//aminoacidos./hidrofo
(Etanol 95%) y éter? bicos-quimica.com
R: Porque se encuentran en su punto
isoeléctrico, su solubilidad es diferente  Santos, I. (2018). Recuperado de
de lo normal y no es soluble en agua, aminoácidos y proteínas
además se neutraliza su carga eléctrica https://aminoacidos.top/hidrofobicos
al precipitarse. -hidrofilicos/.com

 Caceres, M. (2017). Recuperado de

Conclusiones https:www//los/es-aminoácidos-
hidrofilicos/información
 Logramos la debida separación de
la proteína de la leche (caseína) con
el proceso de acidificación.  Fernández M. 2007 Recuperado de
: https://www.news-medical.net/life-
 Comprendimos que los aminoácidos sciences/Overview-of-the-
pueden ser solubles o pocos Isoelectric-Point-(Spanish).aspx
solubles con el agua, dependiendo
del grupo de aminoácido en el que  Martínez E. 2017 Recuperado de :
se encuentren, ya sea hidrofóbico o http://www.ehu.eus/biomoleculas/bu
hidrofílico. ffers/buffer3.htm

 Determinamos el punto isoeléctrico  Castillo C. 2015 Recuperado de :

De los aminoácidos “glicina y ácido http://campus.usal.es/~quimfis/apoy
glutámico” los cuales logramos
o/Felipe/practicas/GLICINA.PDF
identificar observando la gráfica de la
titulación.

 Fueron aplicados conocimientos

teóricos y prácticos con respecto a
las a los aminoácidos.