Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

Instituto de Ciencias Biomédicas

Departamento de Ciencias de la Salud

Práctica # 3. Reacciones de identificación de proteínas

y punto isoeléctrico.

Grupo A

Práctica #3. Reacciones de identificación de proteínas

y punto isoeléctrico.

Objetivos:
 Identificar proteínas por la presencia de enlaces peptídicos y grupos
aromático y cuantificarlas mediante la técnica de Biuret.
 Identificar el punto isoeléctrico en la práctica.

Introducción
La proteínas son moléculas orgánicas que contienen carbono, hidrogeno, oxígeno
y nitrógeno, algunas también contiene azufre. Si se separaran y pasaran todos los
grupos de compuestos orgánicos de una célula, las proteínas serias las de mayor
peso. En una sola célula pueden encontrarse centenares de proteínas diferentes
que, en conjunto, constituyen el 50% o más del peso seco de la célula. Este grupo
de biomoleculas destaca por ser los componentes esenciales en todos los aspectos
de la estructura y la función de las células. Las enzimas son proteínas que aceleran
las reacciones bioquímicas pero también tienen otras funciones. Así como
monosacáridos son los elementos constitutivos de los carbohidratos, los
aminoácidos son las moléculas que componen a las proteínas, mediante la
formación de enlaces peptídico entre el grupo amino y grupo carboxilo de los
aminoácidos (Tortora y Funke, 2007).

Para el análisis de proteínas, el bioquímico necesita de una extracción previa de la

proteína en partículas que desea estudiar, este procedimiento se conoce como
purificación. Posteriormente se realiza una prueba o ensayo para identificar alguna
propiedad específica de la proteína, por lo tanto, un resultado positivo indica que la
proteína está presente. Encontrar un ensayo eficaz es a menudo difícil, pero en
tanto que el ensayo es más específico, más eficaz es la purificación. Se han
purificado miles de proteínas en forma activa en base a sus características como
solubilidad, tamaño, carga y afinidad especifica de unión (Berg, 2008).

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos se

basan en: a) la propiedad intrínseca de la proteína para absorber la luz, b) para la
formación de derivados químicos, c) la capacidad que tienen las proteínas de unir
ciertos colorantes. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la
cantidad de proteínas y las reacciones son bastante específicas, de manera que
muy pocas sustancias interfieren (Bradford, 1976).

Entre los métodos cualitativos para la identificación de aminoácidos, los cuales son
específicos para cada aminoácido, se encuentra la reacción xantoproteica, la cual
permite identificar aminoácidos con el grupo bencénico (tirosina, fenilalanina,
triptófano). También es posible reconocer la presencia de estos aminoácidos en una
determinada proteína mediante esta reacción (Ballestero et al., 2014). En la
reacción se da la nitración del anillo bencénico (con ácido nítrico concentrado)
únicamente de los aminoácidos tirosina y triptófano dando lugar a productos de color
amarillo, este caso es para aminoácidos en solución ya que si se prueba una
solución de proteína que contenga tirosina o triptófano se formara un precipitado
blanco ante la adición del ácido y, solo después de calentar, el precipitado se tornara
amarillo (Véjar, E. 2005). Existen, además, pruebas que permiten identificar
simplemente la presencia de polipéptidos o proteínas. Un ejemplo es la prueba de
Biuret la cual simplemente reconoce uniones peptídicas y por eso es una prueba
general para proteínas y polipéptidos (Ballestero et al., 2014). Esta prueba presenta
una coloración violeta ante la reacción del reactivo de Biuret forman un complejo de
coordinación con los pares de electrones no compartidos del átomo de nitrógeno
del enlace peptídico (Guarnizo y Martinez, 2009).

Materiales y métodos
Antes de comenzar con los experimentos se dejó en la plancha un vaso de
precipitado calentando para tenerlo a punto de ebullición al momento de
necesitarse.

Para la reacción de Biuret se prepararon 5 tubos de ensayo. En el primer tubo de

ensayo se colocó 1 mililitro de agua destilada, en el segundo tubo se agregó 1
mililitro de tirosina 1%, al tercero se le agrego 1 mililitro de gelatina 0.5%, el cuarto
tubo se le agrego 1 mililitro de peptona 0.5% y al quinto tubo de le agrego 1 mililitro
de albumina 0.5%. Posteriormente, se le agrego 1 mililitro de reactivo de Biuret a
cada tubo de ensayo. Al finalizar, se llevaron todos los tubos al vortex para mezclar
y se dejaron reposar los tubos por 15 minutos para observar cambios y registrarlos.

El segundo experimento fue la reacción Xantoproteica, donde se prepararon la

misma serie de tubos que en la reacción de Biuret y con las mismas cantidades, 1
mililitro de agua destilada en el primer tubo, 1 mililitro de Tirosina 1% en el segundo
tubo, 1 mililitro de gelatina 0.5% en el tercero, 1 mililitro de peptona 0.5% en el cuarto
tubo y 1 mililitro de Albumina 0.5%. A diferencia de la reacción de Biuret, a cabo
tubo de ensayo se le agrego 1 mililitro de ácido nítrico (HNO3), se mezcló en el
vortex y se calentó a ebullición por 5 minutos en el vaso de precipitado
anteriormente preparado. Pasados los 5 minutos, se enfrió a chorro de agua
evitando que entrara al tubo. Finalmente se colocaron los tubos en el soporte para
agregarles por la pared 1 mililitro de hidróxido de sodio 5N (NaOH), sin mezclar. Se
observaron resultados.

El tercer experimento fue de punto isoeléctrico donde se prepararon 10 tubos

diferentes. Preparando una pipeta de 10 mililitros y otra de 2 mililitros, procedimos
a agregar diferentes cantidades de agua a cada tubo (se decidió utilizar las dos
pipetas debido a las cantidades tan exactas que exige el experimento), por lo cual
el primer paso fue agregar las unidades de mililitro correspondientes de agua a cada
tubo con la pipeta de 10 mililitros; es decir que, al primer tubo se le agregaron 8
mililitros de agua, al segundo se le agregaron 7 mililitros de agua; al tercero, cuarto
y quinto se le agregaron 8 mililitros de agua a cada uno, al sexto tubo se le
agregaron 7 mililitros de agua, al séptimo tubo se le agregaron 5 mililitros de agua,
al octavo solo 1 mililitro, al noveno 7 mililitros y al décimo tubo se le agregaron 5
mililitros de agua. Posteriormente, procedió a agregar las unidades decimales de
las cantidades con la pipeta de 2 mililitros, siendo 0.38 mililitros de agua agregados
al primer tubo, 0.75 mililitros de agua al segundo y al tercer tubo, 0.5 mililitros de
agua al cuarto tubo, 0.4 mililitros de agua al noveno tubo y se agregaron 0.8 mililitros
de agua al décimo tubo. El siguiente paso a seguir fue agregar ácido acético 0.01N
con una pipeta limpia de 2 mililitros; Al primer tubo (con 8.38 mililitros de agua) se
le agregaron 0.62 mililitros de ácido acético y al segundo tubo (con 7.75 mililitros de
agua) se le agregaron 1.25 mililitros de ácido acético. Después, con otra pipeta de
2 mililitros limpia, se le agrego ácido acético 0.1N del tubo 3 al tubo 8, al tercer tubo
(con 8.75 mililitros de agua) se le agregaron 0.25 mililitros de ácido, 0.5 mililitros de
ácido al cuarto tubo (con 8.5 mililitros de agua), 1 mililitro de ácido al quinto tubo
(con 8 mililitros de agua), 2 mililitros de ácido al sexto tubo (con 7 mililitros de agua),
4 mililitros de ácido al séptimo tubo (con 5 mililitros de agua), 8 mililitros de ácido al
octavo tubo ( con 1 mililitro de agua). A los 2 tubos restantes se les agrego ácido
acético 1.0N con una pipeta limpia de 2 mililitros, donde al noveno tubo (con 7.4
mililitros de agua) se le agregaron 1.6 mililitros de ácido y al décimo tubo (con 5.8
mililitros de agua) se le agregaron 3.2 mililitros de ácido acético 1.0N.
Posteriormente, con otra pipeta limpia de 2 mililitros se le agrego 1 mililitro de
albuminato 0.1N a cada tubo. Finalmente se mezclaron en el vortex todos los tubos
y se observaron resultados.

Resultados y discusión

Reacción de Biuret.

La reacción de Biuret es eficiente como una prueba para la cuantificación de

polipéptido y proteínas, sin embargo no es la más precisa para el análisis cualitativo,
ya que la reacción es dependiente de la estructura del aminoácido, es decir, si la
cadena lateral –R es voluptuosa o no, influyendo de esta manera en la formación
del complejo con el reactivo de Biuret.

Identificación de proteínas mediante la reacción de Biuret.

El reactivo de Biuret es una prueba que nos permite identificar entre péptidos y
proteínas. Contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de
NaOH).
La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la
formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu+2, (el cual podemos
observar en la figura 1) esto es por la capacidad de los péptidos para secuestrar en
el medio básico, iones cu2+ y dar lugar a un complejo color morado. Cuando la
reacción de biuret da negativa, queda de color azul (como lo podemos apreciar en
la figura 2)
 Fig. 1. Formación de un Fig. 2. Diferencia de
complejo de coordinación coloración en la
entre los iones. reacción de Biuret.

En este experimento las proteínas que fueron sometidas al reactivo de Biuret, que
en su composición tiene NaOH (Que no participa en la reacción pero es
indispensable por su aportación alcalina al medio) junto con el sulfato cúprico, se
observó que reaccionó con la solución de albúmina y peptona, y esta se tornó de
color violeta lo que nos indicó que la reacción fue positiva. Mientras que la tirosina
y gelatina no dieron positivo por su bajo valor proteico (Véjar, 2014).

El experimento realizado en el laboratorio mostró la siguiente coloración en los

diferentes tubos colocados (mostrada en la figura 3). En ellos podemos observar
que los tubos donde se encontraba el agua destilada, la tirosina 1% y la gelatina
0.5% quedan transparentes (aunque en la gelatina se notaba un poco de coloración
violeta). Mientras que en los tubos donde se contenía a los reactivos de peptona al
0.5% y la albúmina al 0.5% podemos notar esta coloración de forma más clara. La
albúmina se encontraba en una tonalidad violeta más intensa que la peptona.

Fig. 3. Tubos con los diferentes reactivos

utilizados en la práctica de laboratorio.
Importante para su visualización de color.

Reacción de xantoproteica.
 La reacción xantropoteica demostró ser un método
preciso para la identificación de aminoácidos con el
grupo bencénico ya que, en el experimentó 2, se
observó un cambio en la coloración en el tubo
esperado, es decir, el tubo que contenía tirosina, un
aminoácido cuya cadena lateral posee el grupo
bencénico.

La prueba da resultado positivo en aquellas

proteínas con aminoácidos portadores de grupos
aromáticos, especialmente en presencia de tirosina.
Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali, se torna color amarillo
oscuro. La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución
electrofílica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el ácido nítrico
dando un compuesto coloreado amarillo a pH ácido. Según las guías químicas es
una reacción cualitativa, más no cuantitativa (esto se debe al hecho de que nos
permite determinar si la muestra es una proteína soluble en agua, pero no aporta
información relevante para cálculos estequiométricos). Por ende determina la
presencia o no de proteínas.

Esta reacción se usa para detectar la presencia de proteínas solubles en una

solución. Se realiza mediante el uso de HNO3 concentrado que, en presencia de
proteínas o aminoácidos con restos aromáticos torna la solución de un color amarillo
oscuro.

Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden ser nitrados
produciendo un compuesto Amarillo. La producción de un producto coloreado
Amarillo al añadir ácido nítrico es una prueba para la presencia de tirosina o
triptófano en una proteína. La adición de base fuerte hace que el color se torne más
oscuro hacia anaranjado. Las manchas amarillas en la piel causadas por ácido
nítrico son el resultado de la reacción xantoproteíca (Vázquez, 2014).

En el experimento se mostró esta coloración amarillenta mencionada en los tubos

de ensayo donde se encontraba la albúmina, la peptona y la tirosina. Debido a los
grupos aromáticos que en estos se tiene (figura 4).

Fig. 4. Visualización del color

amarillo en los tubos de ensayo
de la albúmina, la peptona y la
tirosina.
Punto isoeléctrico.

Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se

dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que
la carga total que adquieren depende del pH del medio. Así, todas las proteínas
tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de
los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que
se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible). Debido a la
composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en
tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.
Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo
suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico
y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lysina
estarían protonados (-NH3 + ). De igual forma si la proteína se encuentra en un
medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los
grupos carboxilo estarían desprotonados (COO - ) y los grupos amino estarían en
su forma neutra (NH2). De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH
característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto
isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las
cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad
para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación. Si
suponemos una proteína formada únicamente por aminoácidos sin grupos laterales
ionizables la carga neta de la proteína dependería exclusivamente de la protonación
/ desprotonación de los grupos amino y carboxilo terminal. En la realidad las
proteínas están formadas por multitud de aminoácidos unidos mediante enlaces
peptídicos y la carga va a depender de los grupos ionizables que poseen los
aminoácidos que la componen y del pH del medio (Serpa, 2014).

En el laboratorio, se realizó la práctica del punto isoeléctrico con tres componentes

fundamentales: el agua, el ácido acético (que se encontraba en diferentes
concentraciones – 0.01N, 0.1N y 1.0N) y el albuminato. Estos componentes serian
depositados en diferentes tubos de ensayo con diferentes volúmenes en cada uno
de ellos. La práctica estaba compuesta por 10 tubos de ensayo. Estos tubos de
ensayo, cuando se les comenzó a verter los diferentes volúmenes de los
componentes se observó que algunos de ellos se tornaron más turbio y se pidió que
se identificara en cual de esos tubos de ensayo se empezaba a notar la turbidez. La
turbidez resultante comenzaba en el tubo de ensayo 6 (figura 5 y 6) en donde se
aplicó 7mL de agua, 2mL de ácido acético al 0.1N y 1mL de albuminato al 0.1N.
 Fig. 5. Verificación de la turbidez Fig. 6. Verificación de la turbidez
en los tubos de ensayo en los tubos de ensayo
(visualizados de costado). (visualizados de frente).

Para la comprobación de lo realizado en el laboratorio se llevó a cabo una serie de

cálculos para determinar si el punto isoeléctrico se encontraba en dicho tubo de
ensayo. Para lo cual se utilizó las siguientes formulas:

Con ellas se comprobó los resultados observados en la práctica. La utilización de

las formulas se dio en todos los tubos presentes. Iniciando por el primero hasta el
décimo. Lo que se hizo fue utilizar las concentraciones del ácido, la cantidad de mL
usados (la suma de los mililitros de agua con el ácido) y los mL totales (considerando
a la base: albuminato). Lo mismo se hizo con la base. Esta información nos sería
útil en la fórmula de concentración y volumen, que fue despejada para poder ser
utilizada. Cuando la fórmula de concentración y volumen obtenía los resultados de
los ácidos y las bases podíamos continuar con la fórmula del pH. Recordando que
estas fórmulas fueron utilizadas en cada uno de los tubos de ensayo. Las formulas
se exponen a continuación. OJO: las formulas encontradas del lado izquierdo
corresponden con los datos de los ácidos, mientras que las formulas del lado
derecho corresponden a las bases.

TUBO 1
TUBO 2

TUBO 3

TUBO 4
TUBO 5

TUBO 6

TUBO 7

TUBO 8
TUBO 9

TUBO 10

Las operaciones realizadas arrojan que el punto isoeléctrico de la practica fue

realmente el tubo de ensayo número 5, ya que si revisamos los resultados en pH de
los tubos, nos daremos cuenta que el pH del tubo 5 va coincidir con el número de
pKa. Esto nos da como conclusión que el punto isoeléctrico que se observó en
laboratorio es erróneo, las causas de este error pudieron haberse originarse debido
al pipeteado.

Conclusión
  Se logró identificar la presencia de las enlaces peptídicos y enlaces
aromáticos mediante la técnica de Biuret.
 Por medio de la técnica de Biuret se permite la determinación de proteínas
totales del líquido encefaloraquideo y junto con el análisis de la glucosa en el
mismo reactivo constituye un parámetro para la diferenciación de trastornos
neurológicos o patologías relacionados con el sistema nervioso central.
 Se logró identificar y calcular correctamente el punto isoeléctrico.
 Conocer el punto isoeléctrico permite conocer la disociación de las proteínas
tales como la caseína presente en la leche y así como conocer su
funcionamiento o reacción dentro del estómago.

Bibliografía
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