CENTRO DE CIENCIAS BASICAS

DEPARTAMENTO DE QUIMICA

LABORATORIO DE BIOQUIMICA I

REPORTE No. 8:
“Obtención de la caseína por pH isoeléctrico”

ALUMNOS:
Castañeda Palos Luis Daniel
Lezama Luevano Gabriel Sebastián
Morales González Diego Mauricio
Rangel Sosa José Rodrigo
Torres López Flavio Ricardo

ING. BIOQUIMICA

Semestre: 3° Grupo: “A”

PROFESOR: M. en C.
Javier Martínez Rodríguez

Aguascalientes, Ags.
30 de octubre del 2019
 PRACTICA No. 8
“Obtención de la caseína por pH isoeléctrico”

OBJETIVO:
 Que el alumno aprenda la influencia del punto isoeléctrico en la solubilidad de las
proteínas.

INTRODUCCION:

En bioquímica es muy común aislar y purificar proteínas para estudiar su composición, su estructura
y de ser posible su función, como es e caso de las enzimas. Para dicha purificación se emplean
métodos basados en sus propiedades de solubilidad.

Cada proteína tiene una composición de aminoácidos específica que las hace diferentes unas de
otras y, por lo tanto, su comportamiento en disoluciones también es diferente. Por lo general las
proteínas fibrosas son solubles en agua y resistentes a la degradación enzimática, sin embargo, con
soluciones de cierta fuerza iónica se pueden solubilizar. Las proteínas globulares son relativamente
mas solubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica, aunque algunas coagulan cuando se
calientan. (Badui, D., 1990)

La composición de aminoácidos, es también responsable del comportamiento de las proteínas en

diferentes condiciones de pH. Así al acidificar o alcalinizar una determinada proteína, ésta puede
llegar a su punto isoeléctrico, es decir, alcanzar una carga neta de cero y por lo tanto precipitar.

La leche es un producto rico en proteínas, tales como las caseínas y globulinas, además de contener
carbohidratos y ácidos grasos. De la leche se puede separar la caseína por precipitación en su punto
isoeléctrico (pH 4.6). (Rendina, G., 1974)

El huevo también es un producto con una buena cantidad de nutrientes, tal como la ovoalbúmina, la
cual se clasifica como fosfoglucoproteína por tener hidratos de carbono y fósforo. La precipitación
de esta proteína con una solución saturada de (NH 4 ) 2 SO 4 permite aislarla del resto de las
proteínas que se encuentran en la clara del huevo.

Existen factores que afectan el estado nativo de las proteínas, sin embargo, éstas pueden someterse
a una purificación parcial empleando técnicas bioquímicas sencillas como la centrifugación, diálisis
y cromatografía. (Voet, D. y col,1995)
MATERIAL REACTIVOS
Vasos de precipitados de 250 ml Ácido acético al 1%
Parrilla NaOH 1.25%
Termómetro Leche Pasteurizada
Pipetas de 5 y 10
Probeta de 100 ml
Potenciómetro

DIAGRAMA DE FLUJO:

a) Precipitación de la proteína por pH isoeléctrico.

b) Insolubilización de las proteínas por calor.

RESULTADOS:

Imagen 1. Adición de ácido acético. Imagen 2. pH marcado por el

potenciómetro.

Imagen 3. Calentamiento previo al filtrado. Imagen 4. Desnaturalización de la leche al

intentar regresarla a su estado natural
disolviendo en agua destilada.
 Imagen 5. Separación de la caseina por
filtrado.

DISCUSION DE RESULTADOS:

Castañeda Palos Luis Daniel

Las proteínas tienen un comportamiento anfótero, ya que por un lado su grupo carboxilo es
considerado ácido debido a que en su forma disociada libera un protón, mientras que también su
grupo amino le da ese doble y contrario comportamiento. Es precisamente la existencia de alguno
de estos grupos en su radical el que determina lo que se conoce como punto isoeléctrico, el punto
isoeléctrico se refiere a que las cargas entre los grupos amino y carboxilo es igual a cero, esto
ocasiona a que las fuerzas hidrofóbicas que estabilizan la estructura de las proteínas se pierdan
provocando que precipiten, así la alta concentración iónica de las proteínas da como resultado una
muy baja solubilidad en las soluciones. Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los
radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y
aniónicos. Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo
suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico
estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lisina están protonados (-NH3+).
Un método muy recurrido y en lo particular usado en esta práctica fue la precipitación en medio ácido
de la caseína, para ello se recurrió a una solución de ácido acético para precipitar a la caseína. En
la leche se produce la precipitación parcial de la caseína porque los grupos ácidos se protonan y
dejan de repelerse las micelas debido a una bajada de PH causada por el ácido láctico. El proceso
tiene lugar con cualquier ácido. La precipitación con ácido acético se da dependiendo de la cantidad
y fortaleza del ácido agregado, la precipitación es más o menos drástica y completa, dando productos
de consistencia pastosa, como la leche ácida, o en forma de gel, como en el caso de leche hasta
una precipitación completa con separación del suero si se emplea ácido acético en caliente. Con la
acción del calor se pudo observar la formación de un precipitado blanco, así como también fue
notable la formación de nata, el precipitado parecía tener algunas de las características que presenta
el queso, pues era una textura similar, su olor, aunque permanecía similar al de la leche generaba
el aroma a queso. La caseína a forma proteínas globulares y fibrosas puede dar forma a los
productos formados, en este caso al de los quesos o yogures.

Lezama Luevano Gabriel Sebastián

El punto isoeléctrico es el pH al que un poli anfolito tiene carga neta cero. El concepto es
particularmente interesante en los aminoácidos y también en las proteínas. A este valor de pH, la
solubilidad de la sustancia es casi nula. Esto se debe a que los grupos que facilitan la disolución en
agua están en los lugares que les corresponde, en este caso los grupos tanto hidroxilo como el
protón que se disocia en el caso de un ácido débil están en la proteína lo que dificulta su solubilidad
en agua, Los aminoácidos pueden existir como sal interna, llamada zwitterión. Esto ocurre porque
un protón del oxígeno del grupo carboxilo es atraído por el grupo amino (-NH 2 ), ya que al nitrógeno
le sobraban dos electrones de valencia, que está en posición alfa y quedando este como grupo
amoníaco (-NH 3 + ).

La precipitación de moléculas ya sea proteínas o aminoácidos se debe en base a su conformación

que contiene un grupo amino un carboxilo y un grupo R, este último suele ser bastante largo y en
algunas veces ciclado mediante enlaces de condensación de carbonos lo que hace aún más difícil
su solubilidad en agua si no están disociados, o en forma de catión/anión. La caseína es una
fosfoproteína (heteroproteína) presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos
fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra asociado con el calcio, formando
agregados que se denominan micelas de caseína. A diferencia de muchas otras proteínas, las
caseínas no precipitan fácilmente por acción del calor, dado que, al ser ricas en prolina, tienen pocos
tramos con estructura primaria definida. A pH ácido las micelas pierden su carga y su capacidad de
repelerse, y las caseínas se agregan. Cuando se obtiene industrialmente, este material se le llama
caseína ácida. La coagulación mediada por la acidificación es el proceso que se produce en los
yogures. En la cuajada se produce la coagulación enzimática. En los quesos, dependiendo del tipo,
se puede producir una combinación de ambos efectos. Cuando se alcanza el punto isoeléctrico de
la caseína se neutralizan sus cargas, lo que impide que esta proteína interactúe con las demás
moléculas presentes en la solución, con este impedimento la proteína termina precipitándose lo que
hace más fácil su aislamiento del resto de la solución. Pero en este punto cabe y es importante
remarcar que la única proteína que alcanza su punto isoeléctrico a 4.6 es la caseína lo que permite
que el aislamiento sea sencillo y eficaz, con un alto grado de pureza.

Morales González Diego Mauricio

Para comenzar, en la presente práctica se obtuvo la caseína, la cual al ser una proteína liposoluble
se encuentra en la porción grasa de la leche y dicha proteína se obtuvo por medio de su pH
isoeléctrico.

Para esto , se tomaron 150 ml de leche entera cuyo pH se encontró alrededor de 6.6 y 6.8. Enseguida
se le añadió ácido acético hasta ajustar el pH de la leche a 4.6, dicho pH correspondió a su punto
isoeléctrico. Después de ajustar el pH, la leche se calentó en la parrilla hasta alcanzar una
temperatura de 40°C, una vez alcanzada esta temperatura se observó que se comenzó a formar una
precipitación blanca en un líquido blanquecino casi amarillento, pero más transparentoso, dicho
líquido era la parte acuosa y la precipitación era la parte grasa de la leche, dicha separación de fases
fue lógica, ya que, la leche es una emulsión.

Dicho fenómeno sólo ocurre cuando la caseína se encuentra en su punto isoeléctrico, es decir,
cuando el pH de la leche es de 4.6 las proteínas no presentan carga neta, es decir, el número de
cargas negativas y positivas es la misma, por lo tanto, su carga neta es de 0 y como consecuencia
la proteína precipita. Esto se debe a que, a un pH elevado, todas las moléculas de la caseína están
cargadas negativamente, ya que se desprotonan los grupos amino y ácidos de sus aminoácidos. A
un pH bajo, todas las moléculas están cargadas positivamente, ya que tanto el grupo amino como el
grupo ácido de sus aminoácidos se encuentran protonados.

En cualquiera de los casos las moléculas se repelen las unas a las otras al tener la misma carga,
por lo que no se unen y no dan lugar a ningún precipitado. A un valor intermedio de pH, el punto
isoeléctrico de la caseína, las moléculas no tienen carga neta y no se repelen. Sin embargo, las
moléculas tienen zonas de carga positiva o negativa, por lo que la zona positiva de una molécula
puede atraer la zona negativa de otra. Estas atracciones pueden aglutinar las moléculas de la
proteína haciendo que precipite de su disolución, que en este caso fue la leche entera.

Cabe mencionar, que el filtrado obtenido un aspecto más grumoso debido a que la leche utilizada
fue descremada.

Enseguida se tomaron 100 ml del filtrado obtenido anteriormente, es decir, la parte acuosa de la
leche, y dicha sustancia se calentó hasta alcanzar una temperatura de 90°C y se mantuvo así durante
20 minutos, esto con el objetivo de insolubilizar las proteínas lactoalbumina y lactoglobulina
(proteínas hidrosolubles), pues al aumentar la temperatura las proteínas se desnaturalizan en el
medio acuoso y por lo tanto se precipitan. Pasados los 20 minutos se dejó enfriar hasta 40°C, se
dejó reposar 10 minutos y se filtró, al realizar este paso se observaron grumos de color amarillo
pálido.

Rangel Sosa José Rodrigo

Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una
característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del
pH del medio.

Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren
y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre
unido a la proteína de forma covalente (irreversible).

Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres
formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos. Cualquier proteína tendría
una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos
COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino
de Arginina y lysina estarían protonados (-NH 3 + ).

De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada
negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO - ) y los
grupos amino estarían en su forma neutra (NH 2 ).
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero.
A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI).

En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que
la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar
su agregación.

Si suponemos una proteína formada únicamente por aminoácidos sin grupos laterales ionizables la
carga neta de la proteína dependería exclusivamente de la protonación / desprotonación de los
grupos amino y carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están formadas por multitud de
aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y la carga va a depender de los grupos ionizables
que poseen los aminoácidos que la componen y del pH del medio.

Torres López Flavio Ricardo

Se inició a trabajar colocando 250ml de leche en un vaso de precipitado, donde poco a poco se fue
disminuyendo el pH por medio de la adición de ácido acético, de esta forma se le añadió una
considerable cantidad a la leche, hasta llegar a un pH de 4.6, tras lo cual la leche que antes era
liquida comenzó a presentar grumos, indicando los componentes de la leche de la fase liquida se
estaban separando y que la proteína caseína comenzaba a desnaturalizarse.

Posteriormente se colocó a calentar la mezcla de ácido acético con leche en una parrilla hasta los
40°C, llegado a ese punto se mantuvo la temperatura casi constante durante 5 minutos, de esta
forma al pasar el tiempo establecido la solución se volvió más grumosa y menos homogénea, pues
se apreciaba una distinción en diferentes partes de la mezcla.

Después de esto se filtró la mezcla, en un vaso de precipitado diferente se colocó encima una gasa
doblada donde poco a poco se vertió la solución, separando la caseína, ya solidificada pero aun
húmeda, del resto de los contenidos de la leche, obteniendo así un pseudoqueso.

Se tomó después una pequeña porción del producto solido obtenido y se colocó en otro vaso de
precipitado con agua destilada al cual se le añadió también hidróxido de sodio, de esta forma se
intentó solubilizar una vez más intentando reformar la leche entera, regresando al pH original,
durante esta prueba se observó que sin importar que tanto se aumentara el pH lo más cercano al 6-
7 original de la leche no se revertía a su estado original, indicando que este es un proceso
irreversible, pues las proteínas no solo se separaron sino que también se desnaturalizaron por ambos
pH y el aumento de temperatura.

Después el líquido residual del filtrado se colocó en calentamiento durante 15 minutos a casi 90
grados, aun cuando el manual indicaba más tiempo se decidió retirar la mezcla debido a que aún
contenida en ella se encontraba una gran cantidad de caseína y otros sólidos en suspensión, lo que
causaba que el vaso comenzará a hacer movimientos bruscos e incluso salpicar un poco del
contenido, ya retirado el líquido se enfrió se observaron los cambios.

Al final se secó la caseína y se observó que se obtuvo una cantidad muy pequeña, seguramente
debido a que al momento de filtrar la gasa no fue doblada lo suficiente y permitió el paso de una gran
cantidad de sólidos, lo que también explica por qué el filtrado en calentamiento presento el
comportamiento violento que provoco que se retirara antes de tiempo. El producto obtenido fue un
queso en toda regla, blanco, fibroso y con algo de elasticidad, lo que indica que efectivamente se
logró la separación de la caseína.
CONCLUSIONES:

Castañeda Palos Luis Daniel

El efecto de las cargas eléctricas en las proteínas nos permite realizar gran variedad de procesos
como se comprobó en esta práctica, ya que el punto isoeléctrico desencadena varios cambios en la
estructura proteínica como el cambio de la leche para formar queso. Esta técnica es de gran utilidad
en la industria de los lácteos ya que no sólo permite obtener queso, sino que también yogurt, crema
y nata. La caseína al ser una proteína se desnaturalizo ya que perdió su estructura nativa por efecto
de la variación del pH ya que pasó de un pH de 6.4 que es el de la leche a un punto isoeléctrico de
4.6 que es el de la caseína.

Ahora bien, podemos atribuirle a esto que la acción de la desnaturalización por diferentes factores
favorece el equilibrio de cargas en la proteína. La caseína como ya se dijo está formada por una gran
variedad de proteínas globulares y fibrosas que también influyen en la forma del queso.

Lezama Luevano Gabriel Sebastián

En esta práctica pude aprender la importancia y la influencia del punto isoeléctrico en una proteína
y por consiguiente en una solución con las mismas, considero que al ser una de las biomoléculas
principales en todos los seres vivos es importante que se comprenda su funcionamiento. En lo que
corresponde a la práctica en su vista más general, pude darme una aproximación de como funcionan
las empresas lácteas y acerca de la producción de productos de la misma índole de aquí siendo la
principal aplicación del término que se ha aprendido

Morales González Diego Mauricio

Entre la variedad de nutrientes que contiene la leche se encuentran proteínas como caseína,
lactoalbúminas y lactoglobulinas, las cuales pudieron identificarse bajo procesos bastante
convencionales.

La caseína, presente principalmente en leche y sus derivados, es una proteína conjugada de la leche
del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación, llegando a un pH isoeléctrico de y
forma una masa blanca, de tal manera que el objetivo se cumple. Además pudo identificarse que la
desnaturalización de la caseína no es un proceso reversible, por lo que se produce una coagulación.

Conocimientos adquiridos durante la teoría fueron reforzados, además de conocer la importancia

que tienen las características de las proteínas a nivel industrial, pues principalmente en la industria
láctea, la precipitación de caseína es parde de una gran variedad de productos.

Sin dejar de lado la importancia que tiene el consumo de alimentos de calidad y gran contenido
proteico, la leche es esencial en el desarrollo de un ser humano u otros mamíferos.
Rangel Sosa José Rodrigo

El objetivo de la practica se cumplio exitosamente ya que se logro identificar el punto isoeléctrico en

la solubilidad de la caseína, mediante el experimento con la leche entera. Se pudo llevar a cabo de
manera correcta la precipitación de la caseína por el pH isoeléctrico, también se logro realizar la
insolubilización de la caseína por calor, en donde se calentó la caseína precipitada durante 20
minutos, y al momento de filtrar se observo una masa blanca, con una consistencia muy parecida al
queso fresco.

Finamente se realizaron las observaciones del proceso y los resultados a presentar. Concluimos que
esta técnica es una muy importante ya que es la base para un proceso industrial en masa como seria
la realización de queso, tambien esta es una de las maneras de demostrar las propiedades químicas
de las proteínas. Los usos principales del conocimiento adquirido se resume en la industria lechera,
farmacológica, y química.

Torres López Flavio Ricardo

Se logró la obtención de la caseína por medio del cambio de pH de la leche por efecto de la adición
de ácido acético.

El queso es un producto derivado de la leche que ha sido fabricado por la humanidad durante miles
de años, además de que es un alimento consumido alrededor del mundo, por ello conocer su
preparación es un requerimiento básico para todo ingeniero bioquímico, pues una de las áreas más
grandes de aplicación es la de los alimentos.

La caseína, o el queso, puede ser obtenida por diversos métodos, pero el producto obtenido tiene
características diferentes con cada uno, esto otorga variedad a la preparación y permite una gran
cantidad de posibilidades en cuestión de texturas, colores y sabores, como causa de esto se puede
elegir uno o varios métodos dependiendo del producto deseado.

Las proteínas pueden ser desnaturalizadas por diversos factores, entre los cuales se encuentran el
pH y la temperatura, utilizando esto se pueden separar de una solución permitiendo extraerlas y
darles algún uso deseado.

CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué la mínima solubilidad de las proteínas está en su punto isoeléctrico?

A concentraciones iónicas altas, la solubilidad de las proteínas disminuye tanto que hace
que precipiten. Cuando el pH del medio es igual al del punto isoeléctrico de las proteínas, pierden su
carga eléctrica neta, y con ello su solubilidad. (Peña et al, 2004)

2. ¿Qué pasa a la caseína precipitada por pH isoeléctrico al adicionársele NaOH?

Se dispersa bien en un medio alcalino, como una solución acuosa de hidróxido de sodio:
NaOH, formando sales como caseinatos de sodio. Esto debido a que las fosfoproteínas presentes
en la caseína son insolubles en agua. (Laboratorios de Bioquímica. Visitado por última vez: 27/10/19)
 3. ¿Qué diferencia existe entre punto isoeléctrico y pk?

El punto isoeléctrico es el pH al cual el promedio de cargas del ácido poliprótico es igual a

cero. Mientras que el punto isoiónico, es el pH que se obtiene cuando se disuelve en agua el ácido
puro y neutro poliprótico HA (el híbrido nuetro). (Harris D, 2007)

4. Menciona cuatro proteínas con diferentes puntos isoeléctricos

(Peña et al, 2004)

BIBLIOGRAFIA:

1. Badui, D. S. 1990. Química de los Alimentos. Editorial Alambra Mexicana S. A., México
2. Rendina, G. 1974. Técnicas de Bioquímica aplicada. Nueva Editorial Interamericana, S. A.
México.
3. Voet, D. y Voet, G. J. 1995. Bioquímica, Omega Ediciones, Barcelona.
4. Arroyo A, Gómez A, Peña A, Tapia R. (2004). Bioquímica. Ciudad de México: Limusa. pp.
96,99.
5. Harris D. (2007). Análisis químico cuantitativo. Barcelona, España: Reverte. pp. 218.
6. Laboratorios de Bioquímica. Visitado por última vez: 27/10/19.
https://sites.google.com/site/laboratoriosbioquimica/bioquimica-i/obtencion-de-caseina-
reaccion-de-biuret-y-punto-isoelectrico