INDICE

INTRODUCCION
I. JUSTIFICACION
II. MARCO TEORICO

2.1. ENZIMA GLUCOSA ISOMERASA

2.1.1. Historia
El proceso puramente químico de la isomerización de glucosa a
fructosa con catalizadores técnicos a altos valores de pH fue un
fracaso. Se forman productos colaterales coloreados oscuros y de
mal sabor, cuya separación sería demasiado cara.

En 1957 se descubrió la xilosa isomerasa, que aparte de xilosa a

xilulosa también puede isomerizar glucosa a fructosa. Puesto que la
actividad colateral representa una variante intersante
económicamente, al enzima se denomina hoy principalmente
glucosa isomerasa. La glucosa isomerasa es una enzima intracelular
y se origina a partir de microorganismos diferentes, por ejemplo, de
Streptomyces.

En 1960 se patentó en Estados Unidos el correspondiente proceso

enzimático. En 1966, unos investigadores japoneses en la ciudad de
Chiba describieron un proceso industrial que utiliza la glucosa
isomerasa soluble. En el proceso de isomerización de la glucosa se
obtiene como producto una mezcla de glucosa y fructosa. Esta
mezcla puede usarse en lugar de la sacarosa cristalina como jarabe,
puesto que su capacidad edulcorante es muy grande.

En Estados Unidos, la Clinton Corn Procesing Company empezó en

1967 la producción de jarabe de glucosa-fructosa mediante una
glucosa isomerasa soluble. Este jarabe contenía inicialmente, sin
embargo, sólo un 15% de fructosa. Además, pronto quedó claro que
el proceso de la glucosa isomerasa sólo puede ser rentable
económicamente sólo si se utiliza de nuevo la cara enzima. Por surte,
la glucosa isomerasa es una enzima ideal para la inmovilización. Es
estable a altas temperaturas, y puesto que tanto el sustrato (glucosa)
como el producto (fructosa) son moléculas muy pequeñas, hay pocos
problemas de difusión si la enzima inmovilizada se empaqueta en
columnas. Las moléculas de glucosa y fructosa no llevan carga
eléctrica, por lo que la glucosa isomerasa podría unirse a un derivado
de celulosa cargado como material portador; de lo contrario, el
sustrato y el producto “permanecerían pegados" electrostáticamente
al portador.

En 1968 la Clinton Corn Procesing Company llevó a cabo un proceso

discontinuo con una enzima inmovilizada, que liberó un 42% de
fructosa. En 1972 consiguió desarrollar un sistema que trabaja
continuamente con glucosa isomerasa inmovilizada.

Esta próspera solución tecnológica por sí sola no bastaba, sin

embargo, para el reconocimiento del procedimiento era decisiva la
situación del mercado.

En los años 1960 el precio del azúcar era de 15 a 20 centavos por

kilogramo. El jarabe de fructosa no podía producirse más barato en
ningún caso. En ese momento prevalecían también las desventajas
del proceso enzimático. Además de la fuerza de los prejuicios, era
importante un acercamiento a la industria: se tuvo que desarrollar un
sistema complicado de filtros de presión y un aparato para la
separación del metal pesado cobalto, que se utilizó como
estabilizador de la enzima.

Pero en noviembre de 1974 aumentó el precio del azúcar a 1 dólar y

25 centavos el kilogramo. El proceso de la isomerasa se hizo muy
atractivo de la noche a la mañana. Al mismo tiempo, la compañía
danesa Novo Industry A/S inmovilizó un preparado de glucosa
isomerasa que era más batato, sin adición de cobalto y soportando
la presión en grandes reactores industriales, por lo que no era nada
raro encontrarlos en columnas de siete metros de altura.

En 1976, solamente en Estados Unidos se produjeron 750 t de

glucosa isomerasa y con ellas 800000 t de jarabe de fructosa al 42%.
Puesto que el precio del azúcar a finales de 1976 cayó de nuevo a
15 centavos por kilogramo, se estableció y se impulsó el nuevo
proceso ya exitoso. El jarabe de fructosa al 42% se produjo a precios
menores que la sacarosa. En 1978 se dio otro paso adelante.
Mediante los nuevos procedimientos de separación se obtuvo un
jarabe de fructosa al 55%. Era solamente un 15 a 25% más caro que
el jarabe al 42%. Para bebidas ácidas, como la Coca-Cola (valor de
pH de 4.0), fue necesario un jarabe con al menos un 55% de fructosa
para remplazar a la sacarosa. Con ello tuvo éxito en un mercado
importante el aumento masivo del jarabe de fructosa.

Actualmente, la producción mundial asciende a aproximadamente

100000 toneladas de glucosa isomerasa al año. Se producen nueve
a diez millones de toneladas de jarabe de fructosa. En Estados
Unidos se prefiere utilizar jarabe de fructosa en las bebidas. La
glucosa isomerasa hoy se obtiene e inmoviliza sobre todo a partir de
Streptomyces. Para ello se presentan principalmente las células
bacterianas muertas, que aún está completamente intacta. A
menudo se conectan unas con otras en una red mediante
glutaraldialdehído y así se estabiliza.

Enormemente interesante es la fructosa para productores de

alimentos: se capta más rápido que otros azucares y por tanto es
ideal para bebidas deportivas. Aumenta el sabor a fruta y también a
chocolate, y enmascara el gusto amargo de las sustancias sustitutas
del azúcar. La fructosa reduce el punto de congelación en los helados
y así los hace más blandos, más cremosos y agradablemente
“sabrosos”. De acuerdo con las pruebas clínicas, los diabéticos
pueden controlar su nivel de glucosa mucho mejor con alimentos que
contienen fructosa que con los que contienen sacarosa o almidón.

2.1.2. Descripcion

La isomerasa de glucosa es una enzima que cataliza la reacción de

isomerización de D-glucosa a D-fructosa; D-xilosa a D-xilulosa,
respectivamente. La primera reacción in vitro, mientras que la
segunda reacción ocurre in vivo (Bhosale et al.,1996). Los ejemplos
de microorganismos productores de indicaciones geográficas y sus
rendimientos se presentan en Cuadro 2.1. Dado que la enzima
realiza la reacción de isomerización de glucosa a fructosa,se ha
utilizado para la producción de JMAF (Antrim, et al., 1979; Rehm y
Reed, 1982).
 La producción de JMAF se realiza en tres pasos. En primer lugar, la
amilasa se utiliza para almidón licuado. En segundo lugar, el almidón
está esconcariado por amiloglucosidasa y una enzima
desmbrantadora. Finalmente, usando GI, la glucosa se convierte en
fructosa. Producto obtenido al final de estos pasos es un jarabe de
maíz con un endulzado considerablecapacidad superior a la
sacarosa (Bhosale et al., 1996).
La producción de JMAF es el área de uso más dominante de la
indicación geográfica. 107toneladas de JMAF esproducidos
utilizando indicaciones geográficas inmovilizadas al año. DuPont
Industrial Biosciences (anteriormenteGenencor) y Novozymes A/S
son los principales productores de isomerasa de glucosa
inmovilizados(DiCosimo et al., 2013).

Figura 1. Reacciones enzimáticas catalizadas por GI.

Fuente: Las indicaciones geográficas también se utilizan para la producción de

etanol al mejorar la conversión de azúcares de biomasa celulósica (Wang et
al., 1980-a; Chandrakant y Bisaria, 2000).

Cuando la hemicelulosa de la biomasa celulósica se despolimeriza,

azúcares de pentosa como la D-xilosa que no pueden ser utilizados
por levaduras comunes se producen (Wang et al., 1980-b). En 1980,
se utilizaron diferentes formas de isomerasis de glucosa para
convertir D-xilosa a Dxilulosa y la fermentación de D-xilulosa a etanol
se logró utilizando Schizosaccharomyces pombe y Kluyveromyces
lactis (Wang et al., 1980-a).
La caracterización de GI fue lograda por Marshall y Kooi por primera
vez en 1957 con enzima isomerizante D-glucosa obtenida de
Pseudomonas hydrophila. Eso se dijo que la enzima utiliza D-xilosa
como sustrato, pero también fue capaz de utilizar D-glucosa como
una alternativa con un valor de 160 veces mayor Km. En el proceso
de producción de GI, se requería utilizar medios que contenían xilosa
y la reacción se logró con el arsenato.

2.1.3. Temperatura y pH óptimos

La Glucosa Isomerasa tiene una temperatura óptima que oscila entre

60 y 80°C, que aumenta en presencia de cobalto (Blacklow, et al.
1988). Enzimas obtenidas de terófilos como Streptomyces spp.,
Bacillus spp., Actinoplanes missouriensis y
Thermustermosulfurogenes exhiben mayor estabilidad a
temperaturas más altas que los mesófilos como Lactobacillus y
Escherichia spp. PH óptimo de GI oscila entre 7.0-9.0 (Bhosale et al.,
1996).

2.1.4. Estudios sobre el Mecanismo de Reacción y los Sitios Activos

Se creía que el mecanismo catalítico de la isomerasa de xilosa

implicaba catálisis de base general dirigida por histidina (Carrell et al.,
1989). Posteriormente se evaluo los estudios cristaltodopicos de
rayos X de enzimas (Henrick et al., 1989; Farberet al., 1989; Collyer
and Blow, 1990; Collyer et al., 1990) obtenidos de Arthrobacter o
Streptomyces y propiedades bioquímicas de las enzimas termofílicas
expresada por el gen xilosa mutageneizado dirigido por el sitio que
se obtuvo de Clostridium thermosulfurogenes, se sugirió un
mecanismo alternativo (Lee, etal., 1990-a).Xylose issomerasa (XI)
convierte aldosas en cetosa en tres pasos (Figura 2.3) (Kovalevsky
et al., 2010). El primer paso incluye la unión enzimática desustrato y
la abertura del anillo del sustrato. El segundo paso es la
isomerización del sustrato que se cree que procede por el mecanismo
de cambio de hidruro asistido por iones metálicos.
Finalmente se produce el cierre y liberación del anillo del producto
(Henrick et al., 1989; Farber etal., 1989; Collyer and Blow, 1990;
Collyer et al., 1990; Lee, et al., 1990-a). en lugar dede la reacción de
apertura del anillo, el paso determinante de la velocidad es el paso
de isomerización (Lee, et al.,1990-a). Dado que la diferencia entre D-
glucosa y D-xilosa es causada por un CH2OH en la posición C-6 en
la configuración atómica, este grupo adicional es que se cree que es
la razón de las diferencias en la afinidad de sustrato entre la glucosa
y xilosa (Mengshiaoet al., 1991).

Figura 2. Reacción de interconversión de D-glucosa a D-fructosa. (1)

apertura del anillo (2)isomerización (3) cierre del anillo

Fuente: (Kovalevsky et al., 2010).

2.1.5. Estructura de la isomerasa de glucosa

Dependiendo del microorganismo, las Glucosas Isomerasas varían
de 44 a 191 kDa en peso molecular y tienen dos o cuatro sub
unidades unidas por bonos no covalentes. En algunos casos también
se producen, forma de recorte de IG (Chauthaiwale et al., 1984).
Glucosa isomerasa obtenida de Thermus thermopilus es un
homotador que consta de cuatro subunidades idénticas (monómero).
Una subunidad de GI tiene 387 aminoácidos en el 44000 Da (Dekker,
1991). (1994) declaró que las estructura de los tetrámeros y el dimer
estaban activos, mientras que la forma monómero de la enzima
Inactivo. La estructura 3D de la isomerasa de xilosa obtenida de
Thermus thermophilus es figura 3. Hay dos dominios en los
monómeros de la estructura tetramrica. Cada monómero consta de
diez -hebras, 16 -hélices y cinco 310 hélices.

Dominio I (residuos 1 a 321) se pliega como contactos de 8 barriles y

de dominio II (residuos 322 a 387) Dominio I (Chang et al., 1999).La
enzima se activa mediante la formación de homotésmeros seguida
de dos enlaces ion a cada sitio activo de cuatro monómeros (Janis et
al., 2008). Uso de cristalografía de rayos X junto con la técnica de
difracción de neutrones, sitios vinculantes de IG obtenidos de
Streptomyces rubiginosus fue examinado por Kovalevsky et al.
(2010). Requisito de dos cationes metálicos divalentes de GI para
actividad y los sitios relacionados fueron nombrados de acuerdo a su
afinidad con los iones. El sitio metálico que tenía afinidad con los
iones Mg+2, Mn+2, Co+2, Cd+2 y Pb+2 fue llamado M1; mientras que el
sitio de metal que mostró una afinidad más amplia por los iones
divalentes fue llamado M2. El sitio activo de unión de metales de la
IG nativa se presenta en la Figura 4 (Kovalevsky et al., 2010).

Figura 3. Estructura 3D de la xilosa isomerasa obtenida de Thermus

thermophilus. Las cadenas de proteínas se colorean desde el terminal N
hasta el terminal C usando un gradiente de color del arco iris (espectral).

Fuente: (Kovalevsky et al., 2010)

 Figura 4. El sitio activo de unión de metales de la IG nativa

Fuente: (Kovalevsky et al., 2010).

2.1.6. PROPIEDADES DE LA ENZIMA GLUCOSA ISOMERASA

Las propiedades enzimáticas y fisicoquímicas de la GI

provienen de varios organismos que han sido ampliamente
estudiados. El conocimiento de las propiedades específicas
de la enzima, como su estabilidad, la especificidad del
sustrato y el requisito de iones metálicos es importante para
evitar su inactivación y evaluar su idoneidad para la aplicación
en la producción de HFCS.

Especificidad de sustrato
La capacidad de la enzima para isomerizar una amplia
variedad de sustratos tales como pentosas, hexosas,
alcoholes de azúcar y fosfatos de azúcar, fueron investigados.
Aunque la especificidad hacia el sustrato de la enzima de
diferentes fuentes cambia; la enzima fue capaz de utilizar D-
ribosa, L-arabinosa, L-ramnosa, D-alosa y 2-desoxiglucosa,
así como sustratos más comunes, D-glucosa y D-xilosa. La
isomerización máxima se obtuvo con los sustratos que tienen
grupos hidroxilo en los carbonos 3 y 4 en la posición
ecuatorial, como la glucosa y xilosa. La relación de conversión
D-glucosa a D-fructosa catalizada por GI de varios
organismos en forma soluble o inmovilizada estaban en el
rango de 26 a 59%. Los valores de Km de la enzima para D-
glucosa y D-xilosa estaba en el rango de 0.086 a 0.920 M, y
0.005 a 0,093 M, respectivamente.

Requisito de iones metálicos e inhibidores

GI requiere un catión divalente como Mg2+, Co+2 o Mn2+, o una
combinación de estos cationes, para una actividad máxima.
Aunque tanto Mg2+ como Co+2 son esenciales para la
actividad, juegan roles diferentes. Mientras que Mg2+ es
superior a Co+2 como activador, Co+2 es responsable de la
estabilización de la enzima para realizar la conformación
ordenada, especialmente la estructura cuaternaria de la
enzima. Ligandos de iones metálicos directos en GI de
Bacillus coagulans. Se ha reportado de la presencia de cuatro
iones de Co+2 por cada tetrámero de GI de Streptomyces
griseofuscus. La actividad catalítica de GI fue inhibida por
metales tales como Ag+1, Hg+2, Cu+2, Zn+2 y Ni+2 y, en cierta
medida, por Ca+2. Otros inhibidores conocidos de GI son
xilitol, arabitol, sorbitol, manitol, lyxose y Tris.

Estructura de subunidad
Las constantes de sedimentación y los pesos moleculares de
GI varían de 7.55 a 11.45 y de 52,000 a 191,000,
respectivamente. La estructura de la subunidad y la
composición de aminoácidos de GI revelan que es un
tetrámero o un dímero de similar o idénticas subunidades
asociadas con enlaces no covalentes y carece de enlaces
disulfuro entre cadenas.
El IG extracelular del Bacillus sp., es un trímero. Se ha
reportado la existencia de isoenzimas de GI de Streptomyces
phaechromogenes. Las isoenzimas difieren en sus
aminoácidos N-terminal y en los patrones peptídicos de la
asimilación con tripsina, Achromobacter proteasa I y bromuro
de cianógeno. Cada una de las isoenzimas eran un tetrámero
de subunidades no idénticas.
 El efecto de los desnaturalizantes como la urea, el clorhidrato
de guanidina, dodecil sulfato de sodio y calor sobre la
actividad de GI de Arthrobacter y Streptomyces spp. fueron
investigados. La disociación y el desarrollo del GI tetramérico
de Streptomyces sp. cepa NCIM 2730 reveló que el tetrámero
y el dímero son las especies activas mientras que el
monómero es inactivo. La aparición de un intermediario
parecido a un glóbulo fundido en el camino plegable del GI se
demostró por primera vez. La estructura terciaria intacta en
lugar de la estructura secundaria es responsable de la
actividad biológica de GI.

Fig. 5 Mecanismo de acción de IG. (a) cis-Enediol. (b) Transferencia de

protones. (c) Cambio de hidruro. Las cajas indican los átomos de
hidrógeno que se transfieren estereoespecíficamente.

Fuente: (MICROBIOLOGICAL REVIEWS (1996))

 Temperatura y pH óptimos
La temperatura óptima de GI varía de 60 a 80°C y aumenta
en presencia de Co2+. El rango de pH óptimo de IG,
generalmente está entre pH 7.0 y 9.0. La enzima de
Lactobacillus brevis tiene un pH óptimo más bajo (entre 6 y 7),
que es deseable para aplicaciones comerciales de IG. Las
enzimas de Streptomyces spp., Bacillus spp., Actinoplanes
missouriensis, y Thermus thermosulfurogenes son estables a
altas temperaturas, pero la de Lactobacillus y Escherichia spp.
son menos estables.

Estudio de sitios activos

Las identidades de los aminoácidos involucrados en o cerca
del sitio activo del GI se descifró con modificadores químicos
específicos del grupo y por cristalografía de rayos X.
Evidencia de histidina esencial y se han presentado residuos
de carboxilato en GI. El entorno estructural del aminoácido
funcional ha sido determinado por modificación química y
posterior mapeo de péptidos diferenciales en el GI. Se
reconoce que el GI cataliza la isomerización de la glucosa, así
como de la xilosa. Sin embargo, si las reacciones ocurren en
el mismo sitio o en dos sitios diferentes no se conocía. La
presencia de un único sitio activo para la isomerización de
glucosa y xilosa se demostró usando un método de cinética
de reacción.

2.1.7. ISOMERIZACION ENZIMATICA VERSUS ISOMERIZACION

QUIMICA
La conversión química de glucosa en fructosa se conoce desde hace
100 años y constituye una de las reacciones colectivas conocidas
como la transformación Lobry de Bruyn Alberda van Ekenstein. Estas
reacciones generalmente se llevan a cabo a pH y temperatura
elevados. La posibilidad de producir fructosa químicamente a partir
de glucosa ha sido estudiada por Barker et al. (12) La reacción es
inespecífica y conduce a la formación de azúcares no metabolizables
como la psicosa y otros productos coloreados indeseables. Es difícil
alcanzar una concentración de fructosa de más del 40% por este
método.

Además, la fructosa producida químicamente tiene sabores y dulzura

reducida, que no se puede remediar fácilmente. Por lo tanto, no se
puede usar comercialmente. Por otro lado, la conversión enzimática
de glucosa en fructosa ofrece varias ventajas, como (i) especificidad
de la reacción, (ii) requerimiento de condiciones ambientales de pH
y temperatura, y (iii) no formación de productos secundarios. Por lo
tanto, se prefiere la conversión enzimática a la isomerización química
de glucosa a fructosa, y hoy el proceso que involucra IG ha
experimentado una expansión considerable en el mercado industrial.

2.1.8. IMPORTANCIA DE LA GLUCOSA ISOMERASA

La gIucosa isomerasa (Sweetzyme) sirve como un modelo

interesante para estudiar relaciones de estructura y función mediante
técnicas avanzadas de ingeniería bioquímica y genética.

Además de su importancia académica, ha recibido una mayor

atención por parte de las industrias por su uso en la producción de
JMAF y por su posible aplicación en la producción de etanol a partir
de hemicelulosas.

2.1.9. ORGANISMOS DE FUENTE

La enzima glucosa isomerasa está ampliamente distribuido en

procariotas (Tabla 1). Después de su descubrimiento en
Pseudomonas hydrophila, se descubrió que una gran cantidad de
bacterias y actinomicetos producen IG que está activo en ausencia
de arseniato. Entre las bacterias del ácido heterolactico,
Lactobacillus brevis produjo el mayor rendimiento de enzima. La
enzima era activa a pH bajo pero inestable a alta temperatura y por
lo tanto no era adecuada para la explotación económica. Los
informes sobre la secreción extracelular de GI no son comunes. Se
ha informado que el GI extracelular es producido por Streptomyces
 glaucescens y S. flavogriseus , por lo que la liberación de la enzima
de las células se atribuyó a un cambio en la permeabilidad de la
pared celular y la lisis parcial de las células. Las xilosa isomerasas
extracelulares de Chainia sp. y un Bacillus sp. Alcalotérmico. se han
purificado hasta la homogeneidad mediante técnicas de purificación
convencionales tales como filtración en gel, cromatografía de
intercambio iónico y electroforesis en gel de poliacrilamida
preparativa. Además de Streptomyces spp., Varias especies de
Bacillus son buenos productores de IG. Se ha documentado la
aparición de IG en algunas levaduras como Candida utilis y Candida
boidinii . Aspergillus oryzae es el único hongo que posee actividad
gastrointestinal. Se ha informado de la existencia de IG en la malta
de cebada y el germen de trigo . Los organismos que son
comercialmente importantes como productores de IG se enumeran
en la Tabla 2. Dado que GI es un tema de gran importancia
comercial, gran parte de la información sobre nuevos organismos
productores y procesos desarrollados se encuentra en forma de
patentes.

TABLA 1. ORGANISMOS PRODUCTORAS DE GLUCOSA AMILASA

ESPECIES
Actinomyces olivocinereus, A. phaechromogenes
Actinoplanes missouriensis
Aerobacter aerogenes, A. clocacae, A. levanicum
Arthrobacter spp.
Bacillus stearothermophilus, B. megabacterium, B. coagulans
Bifidobacterium spp.
Brevibacterium incertian, B. pentosoaminoacidicum
Chainia spp.
Corynebacterium helvolum
Flavobacterium arborescens, F. devorans
Lactobacilius brevis, L. buchneri, L. fermenti, L. mannitopoeus, L. gayonii,
L. plantarum, L. pentosus
Luconostoc mesenteroides
Microbispora rosea
Microellobosporia flavea
Micromonopora coerula
Mycobacterium spp.
Nocardia asteroids. N. corallia, N dassonvillei.
Paracolabacterium aerogenoides
Pseudonocardia spp.
Pseudomonas hydrophila
Sarcina spp.
 Staphylococcus biblia, S. flavovirens, S. echinatus
Streptococcus achromogenes, S. phaeochromogenes, S. fracliae, S.
reseochromogenes, S. olivaceus.
Streptomyces olivochromogenes, S. venezaelie, S. wedmorensis
Streptosporangium algum, S. oulgare
Thermopolyspora spp.
Thermus spp.
Xanthomonas spp.
Zymonomas mobilis
Fuente: SNEHALATA H. (1996). Molecular and Industrial Aspects of Glucose
Isomerase.

TABLA 2. PRODUCTORES COMERCIALES DE GI

ORGANISMO NOMBRE COMERCIAL FABRICANTE

 Actinoplanes Gist Brocades and

Maxazyme
Missousriensis Anheuser-Busch Inc.

 Bacilus
coagulans
Sweetzyme a Novo- Nordisk b
Optisweet Miles Kali-Chemie
 Streptomyces
rubiginosus

 Streptomyces
Phaechromogenes
Spezyme Reynolds Tobacco
 Arthrobacter sp.
Swetase Miles Laboratories Inc.
 Streptomyces
olivaceus

a: Organismo más usado industrialmente

b: Empresa más conocida

Fuente: SNEHALATA H. (1996). Molecular and Industrial Aspects of Glucose Isomerase.

2.1.10. PRODUCCION DE GLUCOSA ISOMERASA

El costo de producción de la enzima es un factor importante en la

evaluación de su idoneidad para la aplicación industrial. Se han
realizado intensos esfuerzos para optimizar los parámetros de
fermentación para la producción de IG con el fin de desarrollar
tecnología económicamente viable.

La investigación se centra en tres aspectos principales: (1) mejora de

los rendimientos de GI, (2) optimización del medio de fermentación
con especial referencia al reemplazo de xilosa por un sustituto más
barato y la eliminación del requerimiento de iones Co2+, y (3)
inmovilización de la enzima.

Mejora del rendimiento

Los rendimientos de GI de varios organismos productores potentes

se enumeran en la Tabla 3; oscilan entre 1,000 y 35,000 U.litro-1. Se
logró una mejora adicional en el rendimiento y las propiedades de la
enzima mediante la mejora de la cepa, usando mutagénesis
convencional o tecnología de ADN recombinante.

Varias cepas de importancia comercial fueron sometidas a

mutagénesis para producir niveles elevados de enzima o para la
producción constitutiva de enzima. Se obtuvo un aumento del 60%
en el nivel de enzima mutagenizando Streptomyces wedmorensis
con etilenimina y N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina. La irradiación
UV de Streptomyces olivochromogenes dio como resultado una cepa
mutante con un 70% de actividad incrementada. Se obtuvo un
mutante constitutivo de Bacillus coagulans con el doble de actividad
del progenitor seleccionando los mutantes en función de su
resistencia a la 2-desoxiglucosa. Lee ha informado sobre dos
mutantes constitutivos de mayor rendimiento que muestran sus
mayores rendimientos en lactosa, y uno de ellos muestra una mayor
actividad en glucosa que en xilosa. Se aisló una serie de mutantes
constitutivos y de alto rendimiento GI mediante la aplicación de
múltiples irradiaciones UV a Streptomyces acidodurans. Uno de los
mutantes producidos por la mutagénesis de metanosulfonato de etilo
produjo 1.500 U ml21 cuando se cultivó solo con glucosa, mientras
 que el progenitor produjo 10 U ml21 en condiciones similares. La
mejora de la cepa por manipulación genética se describe en una
sección posterior.

TABLA 3. Producción de GI por diferentes organismos

Condiciones Óptimas
Rendimiento
Organismo Temp (°C)
(U/litro)
pH

 Actinoplanes 2,500 –
75 7.0
missouriensis 35.200

 Bacillus
10,500 70 NA a
licheniformis

 Streptomuces
560 - 2500 70 7.2
wedmorensis

 Streptomyces
4,800 –
olivochromogenes 60 7.5
11,440

a: No aclarado

Fuente: SNEHALATA H. (1996). Molecular and Industrial Aspects of Glucose Isomerase.

Optimización del medio de fermentación

El IG generalmente se produce por fermentación aireada sumergida.
La optimización del medio de fermentación se ha estudiado
ampliamente con el fin de desarrollar una tecnología de fermentación
económicamente viable para la producción de IG.
Los esfuerzos de investigación se dirigieron principalmente a: el
reemplazo de xilosa por otro inductor económico; evaluación del
efecto de fuentes de nitrógeno más baratas en el rendimiento de la
enzima; optimización del pH y la temperatura para la producción
máxima de enzimas; y sustitución de iones Co2+ por otros iones
metálicos divalentes en el medio de fermentación. No existe una
composición concreta de medio para la mejor producción de la
enzima a partir de diferentes microorganismos.

Cada organismo o cepa requiere sus propias condiciones especiales

para la producción máxima de enzimas.

Inmovilizacion de la glucosa isomerasa

En relación con la enzima nativa, la glucosa isomerasa inmovilizada
tiene muchas ventajas tales como una mejor termoestabilidad,
reducción de costos debido a la reutilización de enzimas y proceso
continuo en producción industrial.

El mayor mercado para IG fue por su forma inmovilizada (Bhosale et

al., 1996). Desde la inmovilización de glucosa

Se desarrolló la isomerasa (Takasaki, 1965), la técnica de

inmovilización gastrointestinal ha sido un tema de gran interés. Varios
métodos para inmovilizar GI han sido descritos. Se han utilizado
varios materiales de soporte para diferentes niveles de glucosa
isomerasas. Se utilizaron diferentes agentes químicos para reticular
covalentemente materiales de soporte con enzima o enzimas entre sí
(Antrim, 1979; Muller-Schulte, 1990; Pawar, 1994; Schafhauser,
1992).

Además de la inmovilización de enzimas libres de células, la

inmovilización de células enteras es otra forma importante de GI
inmovilizado. Debido a que GI es una enzima intracelular, la
inmovilización de células enteras puede ser la mejor manera de
utilizar GI con reducción de costo y menos daño enzimático.
Sin embargo, la inmovilización de células enteras tiene un menor
carga enzimática que la inmovilización enzimática libre de células que
resulta en una menor productividad en producción industrial.

Algunas propiedades bioquímicas de GI pueden cambiar después de

la inmovilización, como cambio óptimo de pH, aumento de la
temperatura de reacción y mejor termoestabilidad.

2.1.11. APLICACIONES DE LA ENZIMA GLUCOSA ISOMERASA

Producción de jarabe de maíz alto en fructosa

El desarrollo del mercado en la producción de HFCS fue
marcado por una aceptación gradual de HFCS y del HFCS
enriquecido (55% de fructosa) como sustitutos de la sacarosa
por los productores de refrescos.
La materia prima más común utilizada para la producción de
HFCS en los Estados Unidos es la maicena fabricada por el
proceso de molienda húmeda. La producción de HFCS a partir
de almidón comprende tres procesos principales: (i)
licuefacción de almidón por α-amilasa, (ii) sacarificación del
almidón por la acción combinada de amiloglucosidasa y una
enzima desramificadora, y (iii) isomerización de glucosa por
GI.
El producto final es un jarabe de maíz que contiene una
mezcla de glucosa y fructosa y por lo tanto con mayor
capacidad edulcorante que la de sacarosa.
Otras fuentes de almidón como el trigo, la tapioca y el arroz
se utilizan para menor extensión en otras partes del mundo.
Los subproductos de la industria de molienda de maíz es
importante para decidir la economía de la producción de
HFCS. El consumo mundial anual Se estima que el HFCS
alcanzó los 10 millones de toneladas (peso seco) en 1995
(deRaadt et al., 1994). En la actualidad, el HFCS es casi por
completo el reemplazó de la sacarosa en los Estados Unidos,
y solo una moderada tasa de crecimiento (3 a 4%) se espera,
en su producción a nivel mundial.
Ventajas del jarabe de maíz alto en fructosa como
edulcorante
La creciente demanda de azúcar refinada, junto con su alto
costo de producción y conocimiento de los efectos adversos
de sacarosa e invertir el consumo de azúcar en la salud
humana, requirió la búsqueda de sustitutos aceptables de la
sacarosa. Una gran cantidad de edulcorantes artificial no
clorhidrato y no carbohidrato, como sacarina, ciclamato,
acesulfamo-K, aspartamo, y thaumatin han sido descubiertos
y descartados sobre la base de problemas de salud u otros
inconvenientes. Incorporación de aspartamo en refrescos los
hace menos dulces después de un almacenamiento
prolongado, porque el aspartamo se hidroliza lentamente a pH
bajo. La taumatina, un edulcorante proteico ideal, es 2,000
veces más dulce que la sacarosa pero tiene un sabor distintivo
y desagradable sabor. HFCS, una mezcla de equilibrio de
glucosa y fructosa (1: 1) es 1.3 veces más dulce que la
sacarosa y 1.7 veces más dulce que la glucosa, la capacidad
edulcorante de la glucosa es del 70 al 75% que el de la
sacarosa, mientras que la fructosa es dos veces más dulce
que la sacarosa (Barker, 1976). El HFCS se fabrica a partir de
una sustancia totalmente no dulce, llamada almidón. El precio
del HFCS es 10 a 20% más bajo que la sacarosa sobre la
base de su poder edulcorante.
La industria alimentaria prefiere el HFCS, ya que no plantea
el problema de la cristalización como es el caso de la
sacarosa. Además, la D-fructosa juega un papel importante
como edulcorante diabético. porque solo es reabsorbido
lentamente por el estómago y no influye en el nivel de glucosa
en sangre. Los principales usos de Los HFCS se encuentran
en bebidas, repostería, conservas e industrias de confitería.

Enriquecimiento de fructosa
La principal aplicación de JMAF es el endulzamiento de
bebidas. Una concentración de 55% de JMAF coincide con la
dulzura de sacarosa y permite una sustitución del 100%. Su
precio es del 10 al 20%. más bajo que el precio de la sacarosa,
basado en el poder edulcorante. UN 42% de concentración de
JMAF se utiliza en la cocción, lácteos e industrias de confitería
y para preparar conservas, mermeladas, gelatina y salsa de
tomate. Sin embargo, su aplicación en estas industrias está
limitado por algunos de los inconvenientes inherentes al
JMAF; su naturaleza higroscópica y viscosa, tendencia al
oscurecimiento e incapacidad para cristalizar. En los procesos
comerciales, 42% de fructosa generalmente se produce en la
mezcla de equilibrio; esta necesita ser enriquecido para sus
principales aplicaciones. El método más reciente para
enriquecer fructosa implica la complejación de fructosa
mediante la adición de compuestos de borato durante la
isomerización (Takasaki, 1971). El grado de enriquecimiento
dependía de la concentración de glucosa y la cantidad de
borato añadido. Este método resultó en la producción de
jarabes que contenían 80% de fructosa.
Sin embargo, el costo de remoción y recuperación de borato
evitó el éxito económico de este proceso. La conversión
completa más directo de glucosa a fructosa siempre ha sido
el sueño de las industrias de molienda y refinación de maíz.
Otra ruta para aumentar el rendimiento de fructosa usando D-
glucose era producir una concentración de equilibrio sobre
impulso transitorio de productos (Schray, 1971).
Otro enfoque para producir 55% de fructosa es aumentar la
temperatura de isomerización a más de 70°C (Antrim, 1979)
conduce a un aumento en la concentración de JMAF en un
50% o más. Las exclusiones moleculares resinosas han sido
usadas para aumentar la concentración de fructosa. Un jarabe
que contiene más del 90% de fructosa se obtuvo formando
complejos de fructosa-oxianionicas con germanate.
Las técnicas de cromatográfica moderna con resinas de
intercambio iónico son las mejores para separando fructosa
de glucosa. Un jarabe que contiene 95% de fructosa está en
el mercado en Francia y se vende en forma cristalina.

Disminución del pH de isomerización

El pH óptimo para la isomerización está entre 7.0 y 9.0. La
actividad de la enzima disminuye rápidamente a valores de
pH más bajos. El pH bajo es preferible por la estabilidad del
monosacárido y para la compatibilidad del proceso con
sacarificación de almidón por α-amilasa. La materia prima
más común utilizado para la producción de JMAF es almidón
de maíz fabricado por molienda húmeda de maíz.
Licuefacción y sacarificación del almidón implica la
participación de α-amilasa, glucoamilasa y enzima de
desramificación, las cuales tienen un pH óptimo en el rango
de 4.5 a 6.2, mientras que para la isomerasa está entre pH
7.0 y 8.0. Un gran ahorro en costos será posible si los dos
procesos pueden realizarse simultáneamente al mismo pH en
un solo reactor.
La isomerización a pH bajo es ventajosa porque reduce la
formación de los compuestos carbonílicos coloreados en
temperaturas más altas y pueden conducir a menores costos
de intercambio iónico y purificación de carbono. El IG de
Thermus aquaticus, es activo a pH 3.5 y está completamente
activo a pH 5.5. El término "proceso uni-pH" implica un
proceso en el que la licuefacción, sacarificación e
isomerización son llevados a cabo al mismo pH,
preferiblemente a un pH de 4.5 a 5.0, que es el pH óptimo
para amilasa y amiloglucosidasa. La presencia de Ca+2 es un
requisito previo para la acción de la amilasa mientras que
Ca+2 es un inhibidor de GI. La glucosa isomerasa estable al
ácido son resistentes a la inhibición por Ca+2 son útiles en un
proceso uni-pH. Una IG de un Thermoanaerobacter sp. fue
caracterizado con vistas a desarrollar un proceso de un solo
paso para producción de edulcorantes.
La combinación de sacarificación e isomerización es un
desarrollo ideal en el progreso de la producción de JMAF, y
es probable que esté en funcionamiento una vez que sea
estable al ácido, termoestable, y tolerante a Ca2+. Estas
especificaciones se encontrarán ya sea por cribado o por
ingeniería de proteínas de las existentes enzimas utilizadas
para la producción comercial de JMAF.