COLORACION DE GRAM

NOMBRES:

Alejandra Carrillo Vanegas

Jenny Carolina Poveda Rivera
July Milena Buitrago Pachón
Liliana Morales Ballén
Yuli Andrea Tinjacá Bolívar
Tania Geraldine Castro Villarraga

INSTRUCTOR

Joselito Muñoz

FICHA
1905353

JORNADA NOCHE

29/02/2020

CDA -CHIA
Hans Christian Joachim Gram
(Copenhague, 1853-1938) Microbiólogo y médico danés. La vida y la actividad
investigadora de Hans Christian Gram transcurrió en Copenhague, donde fue
profesor de patología y terapéutica en la universidad de dicha ciudad.

En 1884, durante su viaje a Berlín, diseñó y presentó

el método microbiológico de tinción de bacterias que lleva su nombre. Se compone
de yodo, yoduro potásico y agua, y permite teñir determinados elementos por
contraste con otros o con el fondo. El método de Gram permite clasificar a las
bacterias en dos tipos fundamentales, Gram positivas y gramnegativos.

COLORACION DE GRAM

La tinción de Gram, también conocida como coloración de Gram, es una técnica

de laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiológicos de las
bacterias. Sobre todo en muestras clínicas. El objetivo de Gram era conseguir una
prueba con la que fuera posible diferenciar grupos de bacterias para así poder
estudiarlas y clasificarlas. La prueba resulto todo un éxito y pronto se convirtió en
una prueba muy útil no solo para el estudio de las bacterias sino también para
identificarlas rápidamente en una infección y entre una de las bacterias más
estudiadas de la Escherichia coli. Por su gran importancia en la flora intestinal,
esta bacteria de bacilos Gram negativos usa el método de tinción de Gram ya que
pertenece al gran grupo de bacterias Gram negativas que puede causar
infecciones en humanos. La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a
 una muestra de cualquier origen (esputo, orina, pus, etc.) que supuestamente
contenga bacterias no identificadas.
Los microorganismos Gram positivos, como el Staphylococcus aereus, adquiere
un color violeta después de la coloración de Gram debido a que contiene una
pared celular estructuralmente muy diferente a la de los microorganismos Gram
negativos, como la escherichia coli, que adquiere un color rosado.

Tinción simple con cristal violeta de Staphylococcus aureus. Tinción simple con cristal violeta de Staphylococcus aureus.
Microscopio óptico de campo claro (100x). Microscopio óptico de campo claro (100x).

COLORANTES Y SUS FORMULAS

CRISTAL VIOLETA:
El cristal violeta es un colorante orgánico, sintético y alcalino de triamino-
trifenilmetano. Se encuentra como un polvo con brillo metálico verde oscuro.
Recibe varios nombres, entre los cuales se puede mencionar cloruro de
hexametil pararosanilina o violeta de metilo, violeta de anilina, violeta de
genciana, etc.
El nombre del colorante cristal violeta fue tomado por su parecido al color de
los pétalos de las flores de violeta y genciana; su origen no tiene ninguna
relación con los extractos de estas flores.
El cristal violeta se obtiene mediante varias rutas, las cuales incluyen
reacciones de condensación, adición, cloración, entre otras. Todas tienen
como materia prima la N, N-dimetilanilina.

Se emplea como componente de las tintas usadas para realizar impresiones y

en la de los bolígrafos. Asimismo, se usa para teñir cuero, papel, detergentes,
fertilizantes, entre otros productos.

Fue muy utilizado como antiséptico. Tiene propiedades antimitóticas,

antibacterianas, antiparasitarias y antimicóticas. Su mecanismo de acción es
bacteriostático.

Es empleado en histología para teñir los cortes de tejidos y en microbiología

para colorear y clasificar las bacterias conforme a sus propiedades de tinción
con la coloración de Gram.

CARACTERISTICAS
En la imagen superior se tiene la estructura de la molécula de triamino-
trifenilmetano. Las esferas azules corresponden a los átomos de nitrógeno, y
en la cima, yace un nitrógeno con carga formal positiva, el cual atrae el anión
Cl– (esfera verde).

La estructura es plana en los tres anillos aromáticos, debido a la hibridación sp2 de

sus átomos de carbono. Nótese que, aunque el anillo superior sea aromático,
no contiene las líneas punteadas en su interior. Esto significa que la
resonancia de sus enlaces dobles no se encuentra favorecida.

La molécula del cristal violeta es notoriamente polar. ¿Por qué? Porque los
tres átomos electronegativos de nitrógeno ceden su par de electrones libres
a los anillos aromáticos, y parte de esta densidad electrónica es atraída por el
átomo de nitrógeno con carga parcial positiva (N+). Esta polaridad se
evidencia en su alto punto de ebullición, muy superior al del agua.

FÓRMULA MOLECULAR: C25H30ClN3

PESO FÓRMULA: 407.99 g/mol

PUNTO DE FUSIÓN: 205 ºC

PUNTO DE EBULLICIÓN: 560.86 ºC

DENSIDAD: 1.19 g/cm3 (20ºC)

SOLUBILIDAD: Soluble en agua 50 g/L a 27ºC.

El cristal violeta es insoluble en éter, es soluble en agua, cloroformo y

alcohol. Cuando el cristal violeta esta disuelto en agua, va a tomar una
coloración azul o violeta.

PKA: 9.4 a 25ºC

El color va a variar con la acidez de la solución, a un pH mayor a 1 el

colorante es verde, mientras que a pH inferiores a 1 el color es amarillo. Esta
variación en el color refleja los diferentes cambios de carga de la molécula.

REACTIVIDAD: Es sensible a la luz, incompatible con ácidos y agentes

oxidantes fuertes, entre otras características.

¿CÓMO SE OBTIENE?

El cristal violeta ha sido obtenido por diversas rutas. Fue preparado por
primera vez por Caro y Kern, dos químicos alemanes que hicieron reaccionar
dimetilanilina con fosgeno.

Esta reacción dio como resultado un producto intermedio, la 4,4`-bis

(dimetilamino) benzofenona, conocida también como cetona de Michler.
Seguidamente esta cetona se hizo reaccionar con más dimetilanilina con
oxicloruro de fósforo y ácido clorhídrico.

Al reactivo mixto de iodo con el cloruro de cristal violeta se le conoce como

violeta de genciana. Otra manera de preparar el cristal violeta es mediante la
reacción de condensación de dimetilamina y formaldehido, dando como
resultando un colorante blanco.

Dependiendo de las condiciones de pH, luz o calor, este colorante blanco

puede sufrir transformaciones reversibles que oscilan entre dos colores,
pasando por el incoloro

USO EN LA COLORACIÓN DE GRAM:

El cristal violeta forma parte de los componentes del método de la coloración de

Gram. Este permite clasificar las bacterias como bacterias Gram positivas, o
bacterias Gram negativas. Algunas de ellas, sin embargo, no se colorean con el
Gram.

SOLUCIÓN DE LUGOL ESTABILIZADA CON PVP PARA LA COLORACIÓN DE

GRAM

La solución de Lugol es una solución acuosa que contiene yodo (I2) y yoduro de
potasio en una relación 1:2.

Usada para la coloración de Gram, la solución yodada de Lugol es necesaria para

formar el complejo colorante-yodo de las bacterias Gram-positivas. También
puede ser utilizada como un antiséptico y desinfectante para la desinfección de
emergencia del agua potable, y como un reactivo para la detección del almidón en
el laboratorio de rutina y otras pruebas médicas.

Las soluciones madre de I2 - KI en agua son inestables. El yodo se puede perder

por evaporación y esto puede influir sobre el resultado de la coloración, así como
afectar las condiciones de trabajo en esa área. Las piezas de acero inoxidable de
los instrumentos de coloración también pueden verse afectadas por el yodo en la
solución de Lugol. Si la concentración de yodo disminuye en la solución de Lugol,
los frotis bacterianos pueden ser más susceptibles a la decoloración.

El problema de la pérdida de yodo puede ser superado mediante el uso de

polivinilpirrolidona (PVP) en la solución de I2 - KI. El PVP forma un complejo con el
yodo. Este complejo es más estable y tiene una vida útil más larga. El material
tratado con una solución de Lugol estabilizada con PVP dará los mismos
resultados con respecto a la diferenciación de las bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas en comparación con la solución estándar de Lugol.

En el procedimiento estándar de Gram, los colorantes de anilina en el tejido celular

de los microorganismos forman un complejo de color rojo colorante-yodo cuando
están expuestos al yodo. En los microorganismos Gram-positivos, el complejo
colorante-yodo posteriormente no se puede disolver de las células por los agentes
decolorantes, como el alcohol o la acetona. Las células siguen siendo de color
azul oscuro. En los microorganismos Gram-negativos, el complejo colorante-yodo
se disuelve y la célula se vuelve roja como consecuencia de la contratinción.

Ambas soluciones de Lugol (el tipo estándar y el tipo estabilizado) están

disponibles para las coloraciones bacteriológicas de Merck KGaA (Darmstadt,
Alemania), o EMD Chemicals (Gibbstown, NJ, EUA) en los EUA Los protocolos
correspondientes se encuentran disponibles en Internet o por demanda.

SAFRANINA
La safranina es un colorante meriquinoide, llamado así por poseer en su
estructura química de 2 anillos bencenoides y de 2 anillos quinoides, siendo estos
últimos los que proporcionan el color rojo.

También es llamada dimetil safranina o rojo básico 2 en su forma resumida, ya

que su nombre científico es 3,7-diamino-2,8-dimetil-5- fenil-fenaziniumcloro dimetil
safranina y la fórmula química es C20H19N4 Cl.

La safranina es un colorante monocromático y, según las características de la

fórmula química, es una sustancia con carga positiva. Por tanto, tiene afinidad con
estructuras cargadas negativamente. Estas estructuras serán teñidas de color rojo.

Esta propiedad le confiere aplicabilidad en muchas técnicas histológicas para teñir

diversas estructuras celulares, tanto de organismos eucariotas como procariotas.

La safranina es utilizada como colorante de contraste en importantes y conocidas

técnicas de uso rutinario en bacteriología. Estas técnicas son: la tinción de Gram-
Hucker, la tinción de Scheffer Fulton para esporas o la tinción de cápsulas
bacterianas, entre otras.
CARACTERISTICAS:

El color del azafrán (especia obtenida de los estigmas de la flor de Crocus sativus)
fue la inspiración para colocarle el nombre a este colorante. Del término azafrán
proviene el nombre de safranina. Eso se debe a la gran similitud entre el color del
azafrán y la coloración que brinda este colorante.

La safranina se consigue como cristales o en polvo, siendo ambas presentaciones

solubles en agua. El colorante de safranina no posee olor. Tiñe las estructuras de
color rojo. Las estructuras que atraen el colorante de safranina se denominan
safranófilos.

Estructuralmente la safranina es compleja, posee dos anillo bencenoides a los

extremos y en el centro están ubicados los dos anillos quinoides donde se
encuentra el catión N+. El centro de la estructura es el sistema encargado de
proporcionar el color. Por esta característica este colorante es clasificado dentro
de la categoría II.

TINCIÓN DE GRAM

Se realiza un extendido con suspensión bacteriana y se fija al calor. Se cubre la

lámina con cristal violeta por 1 minuto. Luego se coloca lugol como solución
mordiente por 1 minuto. Posteriormente, se decolora con alcohol acetona y
finalmente se contratiñe con safranina por 30 segundos.

Las bacterias Gram positivas se tiñen de color violeta azuloso y las bacterias
Gram negativas de rojo.

Algunos laboratorios han dejado de usar la técnica de Gram-Hucker para adoptar

la técnica modificada de Gram-Kopeloff. En esta última se sustituye la safranina
por fucsina básica. Esto es debido a que la safranina tiñe débilmente a especies
de los géneros Legionella, Campylobacter y Brucella.
 ALCOHOL- ACETONA

 
Es un compuesto químico con formula química CH3 (CO) CH3 es
Un líquido incoloro de olor característico.
 
USO: En la tinción de Gram para realizar la decoloración.

¿COMO FUNCIONA?
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración,
ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram
positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.

FUCSINA BÁSICA O ANILINA ROJA

En bacteriología se usa en solución fenicada semejante a la de la violeta de

genciana. Esta solución se prepara triturando en un mortero 1 g de fucsina básica
en 10 ce de alcohol de 90°, y cuando está bien disuelta se añade lentamente, y sin
dejar de agitar, 4 g de ácido fénico. En el mortero se vierten varios centímetros
cúbicos de agua destilada para arrastrar el colorante al echarlo en el frasco, el
cual se completa el volumen de 100 ce. A las 24 horas se filtra la solución.

La fucsina básica se usa también en solución acuosa o hidroalcohólica. La

coloración se obtiene en 15-20', y debe diferenciarse en alcohol absoluto.

La fucsina es una sustancia colorante, de color rojo tirando a púrpura. La fucsina

tiene muchas aplicaciones en el campo de la medicina. Se utiliza, principalmente,
en la tinción de Gram (prueba bacteriológica que se utiliza para hacer
un diagnóstico): colorea las bacterias Gram-negativas en rojo.

- Peso molecular: 337,8555

- Fórmula molecular: C20 H20 ClN3

- Composición: C 71,10 %. H 5,97 %. Cl 10,49 %. N 12,44 %

ESQUEMA DE LAS DIFERENCIAS ESTRUCTURALES ENTRE BACTERIAS

GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS

GRAM POSITIVAS + GRAM NEGATIVAS -

Las bacterias Gran positivas poseen La pared celular de las bacterias Gran
una pared celular gruesa constituida negativas está constituida por una
por peptidoglicano, pero no cuentan capa fina de peptidoglicano y una
con membrana celular externa. membrana celular externa, cuyo
componente estructural único son los
 lipopolisacáridos.

Las bacterias G+ retienen el cristal- Las bacterias G- no son capaces de

violeta después de la decoloración y retener el cristal-violeta después de la
aparecen de color azul intenso decoloración y son teñidas de rojo con
(purpura). safranina.

Morfología ultramicroscópica de las bacterias: estructuras internas

Pared celular

Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cápsulas y cubiertas

mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato
contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura
rígida que da forma a la célula. Las paredes celulares pueden destruirse o
romperse en condiciones especiales.

Constituyentes importantes de la pared celular son los aminoácidos, amino

azúcares, azúcares y grasas. Estas sustancias (proteínas, Hidratos de carbono,
grasas) están enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared
celular.

Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-

positivas y Gram-negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las
paredes de las bacterias Gram-positivas contienen menos aminoácidos que las
Gram-negativas; el contenido graso es mucho más elevado en las gram-negativas
que en las Gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del
mecanismo de la reacción al Gram (ver las dos imágenes juntas).
FUENTES:

https://labdemicrobiologia.wixsite.com/scientist-site/reactivos-de-la-tinci-n-de-gram

https://www.lifeder.com/safranina/

https://www.labmedica.es/microbiologia/articles/294733948/solucion-de-lugol-
estabilizada-con-pvp-para-coloracion-de-gram.html

https://www.lifeder.com/cristal-violeta/

https://www.ecured.cu/Anexo:Colorantes_artificiales_b%C3%A1sicos

https://salud.ccm.net/faq/22350-fucsina-definicion#simili_main

https://www.itwreagents.com/italy/es/product/fucsina-basica-ci-42510-para-diagnostico-
clinico/251332

http://www.telmeds.org/wp-content/uploads/2016/11/Tincion-de-Gram.pdf

https://www.academia.edu/32255940/LA_COLORACION_DE_GRAM.pdf

https://www.biografiasyvidas.com/biografia/g/gram.htm

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm