Laboratorio Microbiología General I.

Asesora: Carmen Camacho Venegas.

Morales Sánchez Paola.
Grupo 2652. Equipo #3.
Cuestionario práctica #14: Fisiología bacteriana.
1. Elaborar una tabla para las siguientes pruebas de ensayo:

Caldo RMVP Caldo con SIM

nitrato
pH 6.9 7.3
Estado físico Líquido Líquido Semisólido
Siembre y Por inoculación Se agregan 5 Por punción profunda
cantidad de directa a partir del gotas de cada utilizando aguja de
inóculo cultivo en estudio. reactivo a un inoculación recta. Inocular
cultivo puro. el centro del tubo, y la
punción debe abarcar 2
tercios de profundidad del
medio de cultivo desde la
superficie.
Utilidad Utilizado para la Reactivo para la Se emplea para la
realización del prueba de identificación/diferenciación
ensayo de rojo de reducción de de miembros de la familia
metilo y Voges nitratos a nitritos Enterobacteraceas en
Proskauer. o gas de función de la producción de
Es útil para la nitrógeno libre. hidrógeno, sulfuro, indol y
clasificación de la movilidad.
enterobacterias.
Temperatura y En aerobiosis, a Dejar a En aerobiosis, a 35-37 °C,
tiempo de 35-37 °C de 48 a temperatura durante 18-24 horas.
incubación 72 horas. ambiente hasta 2
minutos.
A 2-8 °C.
Reactivos Solución acética Agregar de 3 a 5 gotas de
necesarios de ácido reactivo Kovacs
sulfanílico. Reactivo Ehrlich
Reactivo Griess A
y B.
Tiempo 72 horas. 24-48 horas 24 horas
máximo
Interpretación Observar el color Observar la movilidad y el
. Examinar los que se forma e color del medio del medio
tubos y revelar interpretar como de cultivo. Luego realizar la
las pruebas resultado positivo prueba de indol.
bioquímicas. o negativo.
Pruebas del rojo Resultado
de metilo: añadir positivo:
unas gotas de desarrollo de
una solución de color rosado-rojo
rojo de metilo al luego del
0.04%, observar agregado de los
 el color del reactivos Griess
medio. A y B. El
microorganismo
Prueba del Voges reduce los
Proskauer: añadir nitratos a nitritos.
0.6 mL de alfa Resultado
naftol al 5% en negativo:
alcohol etílico ausencia del color
absoluto y 0.2 mL rosado-rojo luego
de hidróxido de del agregado del
potasio al 40% a reactivo Griess A
2.5 mL de cultivo. y B.
Agitar
vigorosamenteel
tubo, y dejar a
temperatura
ambiente durante
10-15 minutos.
Observar el color
de la superficie
del medio.
Reporte de Prueba del rojo Prueba positiva: Aparición de precipitado
resultados de metilo. Desarrollo del negro = prueba positiva a
Resultado color rosado-rojo sulfuro de hidrógeno.
positivo: color luego del Aparición de anillo rojo =
rojo. agregado de Zinc. prueba + a producción de
Resultado indol.
negativo: color El crecimiento de más allá
amarillo. de la zona de incubación
indica movilidad.
Prueba de Voges
Proskauer.
Resultado
positivo:
desarrollo de un
color rojo en
pocos minutos
después de una
completa
agitación del
tubo.
Resultado
negativo:
ausencia de color
rojo.

MIO Fenilalanina Agar almidón

desaminasa
pH 6.5 7.3 7.2
Estado físico Semisólido Sólido
Siembre y A partir de un A partir de un Se puede sembrar
cantidad de cultivo puro del cultivo puro de 18- mediante las siguientes
inóculo microorganismo en 24 horas, sembrar técnicas.
 estudio, sembrar un inóculo denso Pour plate: inocular 0.1
por punción estriando la a 2 mL de la muestra
profunda utilizando superficie del directa o de su dilución.
aguja de medio. Verter un volumen del
inoculación. medio de cultivo fundido
y enfriado a 40-45 °C.
Homogeneizar mediante
movimientos de vaivén y
rotación. Deja solidificar.
Filtración por
membrana: el volumen a
filtrar dependerá de la
probable contaminación
de la muestra.
Utilidad Medio utilizado en Medio de cultivo Medio de cultivo
la identificación de utilizado para recomendado por el
miembros de la diferenciar Standard methods for
familia Morganella the examination of water
Enterobacteriaceae morganii biogrupo 1 and wastewater y por la
en base a la y 2, Proteus spp Y farmacopea europea 6°
movilidad, Providencia spp, de edición para el recuento
producción de indol la mayoría de otros de microorganismos
y actividad miembros de la heterótrofos en aguas
enzimática omitina familia tratadas.
decarboxilasa. Enterobacteriaceae,
en base a la
presencia de la
enzima denilalanina
desaminasa.
Temperatura y En aerobiosis, a En aerobiosis, a 35- Consultar la
tiempo de 35-37 °C durante 37 °C, durante 24 metodología en el
incubación 18-24 horas. horas. Standard Methods for
the Examination of
Water and Wastewater
sección 9215cA o en la
Farmacopea Europea 6°
Edición.
Reactivos Reactivo Kovac’s Fenilalanina.
necesarios Reactivo Ehrlich
Tiempo 24 horas. 24 horas.
máximo
Interpretación Observar la Agregar 4 a 5 gotas Realizar el recuento de
movilidad y el color de fenilalanina colonias y expresarlo
del medio de reactivo. teniendo en cuenta la
cultivo. Luego Rotar el reactivo alícuota de muestra
realizar la prueba con suavidad sobre sembrada.
de indol. el pico de flauta.
Observar el color
dentro de los
primeros 5 minutos.
Reporte de Movilidad. Positivo: desarrollo
resultados Resultado positivo: del color verde
presencia de pálido a intenso en
turbidez o el pico de flauta y
crecimiento más en el líquido de
 allá de la línea de condensación.
siembra. Negativo: sin
Resultado cambio de color. El
negativo: medio permanece
crecimiento amarillo debido al
solamente en la color del reactivo.
línea de siembra.

Omrnitina
decarboxilasa.
Resultado positivo:
color púrpura.
Resultado
negativo: color
amarillo. A veces
se puede
desarrollar un color
violáceo en la
superficie del
medio.

Prueba del indol.

Agregar al medio
de cultivo 3-5 gotas
de indol.
Resultado positivo:
color rojo
Resultado
negativo: el color
del reactivo,
revelador
permanece
incoloro-
amarillento.

2. Elaborar una tabla para las siguientes pruebas bioquímicas o medios de ensayo:

Caldo rojo de Urea de Gelatina nutritiva

fenol Christensen
pH 7.4 6.8 7.0
Estado físico Líquido Sólido. Semisólido
Siembre y Inocular los A partir de un Inocular los tubos
cantidad de tubos con el cultivo puro del punzando con una aguja
inóculo organismo de microorganismo (alambre recto).
prueba en estudio, estriar
la superficie del
medio en el pico
de flauta.
Se recomienda
no punzar la capa
profunda para
controlar el color.
Utilidad Es un medio sin Medio utilizado Se utiliza para investigar la
carbohidratos para diferencias presencia de
 agregados que se microorganismos microorganismos
utiliza como base en base a la proteolíticos, como lo
para la adición de actividad demuestra la licuefacción
los carbohidratos ureásica. de la gelatina,
para determinar Se utiliza para especialmente en el
las identificar análisis bacteriológico del
reacciones de bacterias que agua.
fermentación de hidrolizan urea,
los tales como
microorganismos. Proteus spp.
Debe ser capaz Otras
de soportar el enterobacterias y
crecimiento de estafilococos.
organismos de
prueba
Temperatura y Incubar a 35±2 °C En aerobiosis, a 35-37 °C de 1 a 7 días.
tiempo de durante 18-48 35-37 °C, durante
incubación horas. 18-24 horas.
Los
microorganismos
que hidrolizan la
urea lentamente
pueden requerir
hasta 72 horas de
incubación.
Indicador de pH Rojo fenol Rojo de fenol. Puede emplearse el carbón
activado en polvo.
Interpretación Observar el Microorganismos Prueba positiva: no pp
del viraje cambio de color. que hidrolizan la alrededor de la siembra.
La aparición de urea: el medio de Prueba negativa: pp
un color amarillo cultivo es de color alrededor de la siembra.
es el indicador de rosado-rojizo.
fermentación, con Microorganismo
o sin producción que no hidrolizan
de gas la urea: el medio
de ultivo
permanece de
color amarillo.

Hugh Leifson TSI Citrato de Simmons

pH 7.2 7.3 6.9
Estado físico Semisólido Sólido. Sólido.
Siembre y Inocular por A partir de un Estriar la superficie del
cantidad de picadura (con cultivo puro puro medio de cultivo.
inóculo hilo de siembra) del microorganismo
dos tubos por en estudio, con
cada bacteria. aguja de
inoculación inocular
el medio de cultivo,
picando el fondo y
extendiendo sobre
la superficie del
mismo.
Utilidad Indica del tipo de Medio Medio utilizado para la
 metabolismo universalmente diferenciación de
energético: empleado para la enterobacterias en base a
respiratorio (O) o diferenciación de la capacidad de usar
fermentador (F). enterobacterias, en citrato como única fuente
base a la de carbono y energía.
fermentación de los
hidratos de
carbono, glucosa,
lactosa y sacarosa
y a la producción de
ácido sulfhídrico.
Temperatura y Incubar a 37 °C En aerobiosis, a 35- En aerobiosis, a 35-37 °C
tiempo de durante 24 horas 37 °C durante 18 a durante 24-72 horas.
incubación 24 horas. Algunos microorganismos
pueden requerir hasta 7
días de incubación.
Indicador de Púrpura de Rojo de fenol. Azul de bromotimol.
pH bromocresol
Interpretación Determinar cual Observar el color Positivo: crecimiento
del viraje de los cultivos ha del medio de cultivo bacteriano con un intenso
producido ácidos y la producción de color azul en el pico de
(en su caso). gas. flauta.
Volver a incubar Superficie Negativo: ausencia de
otras 24 horas. alcalina/profundidad crecimiento y
Determinar de ácida (pico permanencia del color
nuevo la rojo/fondo amarillo): verde del medio de
producción de el microorganismo cultivo.
ácidos. solamente fermenta
la glucosa.
Superficie
ácida/profundidad
ácida (pico
amarillo/fondo
amarillo): el
microorganismo
fermenta glucosa,
lactosa y/o
sacarosa.
Superficie
alcalina/profundidad
alcalina (pico
rojo/fondo rojo): el
microorganismo es
no fermentador de
azúcares.
La presencia de
burbujas o la
ruptura del medio
de cultivo indican
que el
microorganismo
produce gas.

LIA
 pH 6.7
Estado físico Sólido
Siembre y A partir de un
cantidad de cultivo puro del
inóculo microorganismo en
estudio y mediante
el uso de aguja de
inoculación,
inocular el medio de
cultivo, picando el
fondo y
extendiendo sobre
la superficie del
mismo.
Utilidad Medio de cultivo
utilizado para
diferenciar
microorganismos,
especialmente
Salmonella spp,
basado en la
descarboxilación y
desaminación de
lisina y en la
producción de ácido
sulfhídrico.
Temperatura y En aerobiosis, a 35-
tiempo de 37 °C durante 18-
incubación 24 horas.
Indicador de pH Púrpura de
bromocresol.
Interpretación Descarboxilación
del viraje de la lisina.
Resultado positivo:
superficie
alcalina/profundidad
alcalina (pico
violeta/fondo
violeta).

Determinación de la
lisina.
Resultado positivo:
superficie rojiza/
profundidad ácida.
Esto sucede con
cepas del género
Proteus,
providencia y
algunas de
Morganella spp.

Producción de SH2:
Resultado positivo:
ennegrecimiento
 del medio de cultivo
(especialmente en
el límite entre la
superficie y
profundidad).
Resultado negativo:
el medio de cultivo
permanece sin
cambio de color.

3. ¿Por qué el medio TSI no debe leerse antes de 18 horas ni después de 24 horas
de incubación?
Antes de las 18 horas no se lee porque el pico de flauta estaría acido, dado que en
tan breve tiempo la glucosa aún no sé decir a degradado completamente y daría
un falso positivo. Por otro lado no se debe de leer después las 24 horas porque
tanto el pico flauta como el fondo del medio aparecerían alcalinos (color rojo), lo
que indica que la bacteria decir a terminado de degradar todos los azúcares y por
normalmente comienza a degradar las peptonas, dando al medio un pH alcalino.,
lo cual daría un resultado falso.

4. ¿Cómo se interpretan los resultados de obtenidos a partir del medio TSI?

 Fermentación de glucosa (Alc / Ac): Superficie roja, fondo amarillo. La
bacteria fermentó glucosa comenzando a degradarlas peptonas (de ahí el
color rojo en la superficie).
 Fermentación tanto de glucosa, lactosa y / o sacarosa (Ac / Ac): Fondo y
superficie del cultivo amarillos. Tanto la glucosa, como sacarosa y / o
lactosa, fueron degradadas aeróbicamente y anaeróbicamente a ácidos
terminales.
 No fermenta glucosa, lactosa, ni sacarosa ( Alc / Alc): Los microorganismos
no fermentan la glucosa, lactosa, ni la sacarosa, por lo que el
microorganismo comienza a degradar las peptonas que contiene el medio
para la alimentación. Fondo y superficie de color rojo.
 Producción de gases (H2S): Aparición de burbujas, rotura o burbujas del
agar del fondo del tubo, formación de precipitado negro .
 No productor de gases Solo se observan los Cambios de color, el pecado
Producción de burbujas, Formación de precipitado, etc.

5. ¿Cómo se observa la desaminación de la lisina en el medio LIA?

La L-lisina es desaminada por la enzima lisina deshidrolasa dando como productos
un ácido orgánico y amoniaco.
Al ser detectados estos productos por el indicador púrpura de bromocresol, el
medio vira de color púrpura a color rojo-anaranjado en la superficie y amarillo en el
fondo. Considerando esta prueba como positiva y reportándola como
desaminación de la lisina.

6. ¿Por qué es importante leer la prueba de rojo de metilo a las 48 horas en

incubación?
 Si se leen los resultados de la prueba muy pronto, éstos serían equívocos, dado
que los organismos RM positivos no habrán tenido tiempo suficiente para
metabolizar por completo los productos ácidos iniciales acumulados por
fermentación de la glucosa.

7. ¿Cómo se interpreta la prueba oxidación-fermentación? ¿Cómo se reportan los

posibles resultados obtenidos a partir del medio O/F de Hugh-Leifson?
La interpretación se da como:
 Oxidación y fermentación = color amarillo
 No oxidativo y no fermentador = color azul o verde.

 Reacciones con hidratos de carbono

o Ácido: A
o Ácido y gas: AG
o Sin cambios o reacción alcalina: NC
 Determinaciones OF
o Fermentativo: F, Ferm
o Oxidativo: O, Oxi
o Ni oxidativo ni fermentativo: NR (no reaccionó), NF (no fermentativo)
 Movilidad
o Móvil: +
o Inmóvil: -

8. Esquematice la reacción de desaminación de la L-ornitina y L-lisina.

 Descarboxilación de L-lisina

Lisina descarboxilasa
Lisina Cadaverina +CO2

 Descarboxilación de la ornitina

Ornitina descarboxilasa
L-ornitina Putrescina (diamina) + CO2

9. Si el medio SIM se encuentra totalmente ennegrecido a causa de la producción de

H2S ¿Cómo interpretaría la prueba de motilidad?
Podría determinarse por medio de la turbidez del medio, ya que si la bacteria
presentó movilidad, se tuvo que diseminar a lo largo del medio y por tanto, éste se
observaría turbio, además de que al ennegrecerse todo el tubo, nos indicaría que
la bacteria se diseminó por el medio y por tanto presentó movilidad.

10. ¿Qué importancia tiene la identificación de las bacterias?

En clínica la rápida y correcta identificación del microorganismo o
microorganismos causantes de una infección puede ser trascendental para la
implantación del tratamiento adecuado. De ahí la importancia de las pruebas que
se seleccionen para llegar a dicha identificación.
El método más extendido para llegar a la identificación de microorganismos se
basa en la realización de la batería de pruebas bioquímicas, a través de las
cuales se va a detectar el metabolismo del microorganismo, enzimas que posee,
características de resistencia a determinadas sustancias, etc.
Además, hay que recordar que las bacterias juegan un papel fundamental en la
naturaleza y en el hombre (la presencia de una flora bacteriana normal es
indispensable), además, hemos visto el interés de su estudio para la comprensión
de la fisiológica celular, de la síntesis de proteínas y de la genética de las mismas.

 Referencias bibliográficas.
 MacFaddin J. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica. 3° ed. Buenos Aires, Argentina: Editorial Médica
Panamericana: 2003.
 Tortora G, Funke B, Case C. Microbiology an introduction. 8th ed. San
Francisco: Benjamin Cummings, 2004.
 Carroll KC, Butel J, Morse S. Jawetz Melnick & Adelbergs Medical
Microbiology. 27 Edition. McGraw-Hill Education / Medical; 2005.