TEMA 5.

-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS

Podemos decir que el cultivo de tejidos es el conjunto de técnicas que nos permiten mantener células
in vitro
con una gran aproximación a sus propiedades y funciones in vivo.
Dependiendo del grado de preservación de la estructura del tejido u órgano de origen y del tiempo de
su
duración distinguimos diferentes tipos de cultivos:
 Cultivo de órganos.
 Explantes primarios.
 Cultivo de células.
 Cultivo organotípico

CULTIVO DE ÓRGANOS: Se coloca el órgano, o porción del mismo, sobre una rejilla situada en la
interfase líquido-gas de un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos.
- Permite mantener la estructura característica del tejido “in vivo”. Ventaja
- Se conservan las interacciones histológicas. s:
- Mantiene los tipos celulares diferenciados.
- Representa una buena réplica del tejido de origen. Desventaj
as:
- La proliferación celular es muy limitada.
- No se puede propagar, por lo que se necesita un nuevo explante para cada
experimento.
- Difícil de mantener durante un tiempo prolongado.
- Heterogeneidad de las muestras.

EXPLANTE PRIMARIO: Se coloca un fragmento de tejido o de órgano en la interfase sólido-líquido de

1
un soporte de vidrio o de plástico. Las células se adhieren a la superficie y las células de la periferia del
explante pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte.
CULTIVO DE CÉLULAS: Es el tipo de cultivo más utilizado. Está formado por células dispersas
obtenidas por
disgregación celular. Las células sueltas obtenidas (se han perdido las interacciones célula-
célula y célula-matriz extracelular) son capaces de proliferar en el medio de cultivo proporcionado.
Existen dos tipos de cultivos celulares: MONOCAPA y en SUSPENSIÓN.

 DISGREGACIÓN CELULAR CON TRIPSINA FRÍA:

Las porciones de tejido se incuban en tripsina a 40C durante 6-18 horas permitiendo la penetración con
una mínima actividad tríptica. La digestión se puede hacer en 20-30 minutos a 370C

 DISGREGACIÓN CELULAR CON TRIPSINA CALIENTE:

Pequeñas porciones de tejido se incuban con tripsina a 370C y las células disociadas deben
recolectarse por centrifugación cada media hora. La tripsina se neutraliza con suero en medio de
cultivo.
 DISGREGACIÓN CELULAR CON COLAGENASA:
 DISGREGACIÓN CELULAR POR MÉTODOS MECÁNICOS:

OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS CULTIVO DE LAS CÉLULAS

Una vez obtenidas células independientes por medio de los métodos de disgregación celular expuestos,
han de ser cultivadas en medios de cultivo adecuados, promoviendo así su multiplicación. Existen dos
tipos de cultivo celular primario:
• Cultivos en monocapa: las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o vidrio).
El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferación celular. Es el método utilizado para
la mayoría de las células excepto para las hematopoyéticas.
 TEMA 5.-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS
• Cultivos en suspensión: las células se encuentran dispersas en el medio de cultivo. Este tipo
de cultivo se restringe a las células hematopoyéticas, células madre, líneas celulares
transformadas y células tumorales.

Cuando las células ocupan toda la superficie disponible se dice que han alcanzado la confluencia. En
esta etapa, las células establecen contactos entre ellas (en los cultivos en monocapa) o agotan los
nutrientes del medio de cultivo (en los cultivos en suspensión), hechos que inhiben su proliferación y el
crecimiento se detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que trasplantar las células a un nuevo
soporte. Esta operación se denomina subcultivo o pase.
OBTENCIÓN DE LÍNEAS CELULARES:
Las células del cultivo primario en monocapa se dispersan por métodos enzimáticos y se pasan a un
nuevo frasco de cultivo. En el caso de células en suspensión, sencillamente se diluyen en medio fresco.
Los sucesivos cultivos así formados se denominan líneas celulares.
La formación de una línea celular a partir de un cultivo primario implica que:
• Acaban predominando uno o dos tipos celulares: los que tienen mayor tasa de crecimiento.
• La población celular se hace uniforme y homogénea.
• Sus características se conservan durante las sucesivas generaciones.

Normalmente, las líneas celulares tienen una vida finita que, según el tipo de célula, se puede
prolongar entre 20 y 100 generaciones. Superado ese límite, las células entran en una etapa que se
denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar y mueren. Sin embargo, algunas
células, como las tumorales, evitan la senescencia y dan lugar a líneas celulares continuas, que crecen
indefinidamente. Estas células pueden surgir de forma espontánea (exposición a radiaciones ionizantes
o a carcinógenos químicos) o inducida (infección vírica o transfección de ADN) y son el resultado de un
cambio genotípico denominado transformación (pérdida de la sensibilidad al estímulo asociado con el
control del crecimiento)
2 la primera línea celular continua humana. Son las denominadas células HeLa, células extraídas
En 1952 se obtuvo
a partir de un tumor de cuello del útero de una paciente afroamericana que se llamaba Henrietta Lacks. Con la
ayuda de las células HeLa se han desarrollado terapias génicas y medicamentos para el tratamiento del cáncer de
mama, de la leucemia o de la enfermedad del Parkinson entre otros. Se calcula que desde el desarrollo de la línea
de células HeLa se han producido aproximadamente 50 toneladas de material celular.
CULTIVOS HISTOTÍPICOS Y ORGANOTÍPICOS:
Los cultivos histotípicos son cultivos de un solo tipo celular que consigue alcanzar una elevada
densidad celular (tal y como ocurre en los tejidos). Los cultivos organotípicos constan de varios tipos
celulares que interaccionan entre sí de una forma que intentan parecerse lo más posible al órgano
original. El objetivo final de este tipo de cultivos es la creación “in vitro” de tejidos u órganos
completamente funcionales que puedan ser utilizados en injertos o en trasplantes. Los cultivos
organotípicos constituyen la base de una nueva disciplina denominada ingeniería de tejidos.
DETERMINACIÓN DEL NÚMERO Y VIABILIDAD CELULAR:
 CONTADOR DE CÉLULAS
El sistema consta de dos electrodos, uno en el interior de un tubo con un pequeño orificio que se
introduce en la suspensión de partículas a contar, y un segundo electrodo que se introduce
directamente en dicha suspensión. Los electrodos registran y transmiten al equipo de amplificación y
análisis de la señal las oscilaciones de resistencia que detectan. Cada vez que una célula atraviesa el
orificio se produce una variación de la resistencia proporcional al tamaño. Estos datos se registran y se
analizan.
 CÁMARA DE NEUBAUER:
El hueco que queda entre la cámara y el cubreobjetos es de 0,1mm
VIABILIDAD CELULAR:
Se podría decir que las células viables son aquellas que están vivas. Se puede determinar el número de
células vivas gracias a la tinción con colorantes específicos como el azul trypan o la eritrosina. Estos
colorantes son capaces de atravesar la membrana citoplasmática no íntegra de las células muertas,
 TEMA 5.-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS
pero no la membrana íntegra de las células vivas. Así las células viables aparecerán sin teñir y las
inviables teñidas.

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 TEMA 5.-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS

4.1.-INTRODUCCIÓN
El análisis citogenético consiste en la visualización de los cromosomas, a través del cariotipo. Hay que
diferenciar entre cariotipo constitucional y cariotipo hematológico.
El cariotipo constitucional, está presente en todas las células de un individuo, excepto en las
sexuales y se mantiene invariable a lo largo de toda la vida del individuo.
El cariotipo hematológico, en los procesos oncohematológicos la dotación cromosómica de
algunos tipos de células puede variar dependiendo de la evolución del proceso.
Para la visualización de cromosomas es esencial que se encuentren en estados de máxima
condensación, en metafase.
Una vez realizado el cultivo y obtenidos los cromosomas metafásico, para la visualización de
los cromosomas al microscopio, hay que extender los cromosomas en un portaobjetos y
aplicar técnicas de tinción y bandeado.
4.2.-TÉCNICAS DE OBTENCIÓN Y MANTENIMIENTO DE LOS CULTIVOS
El objetivo de los cultivos celulares es obtener un número suficiente de células en metafase
para análisis cromosómico
4.2.1.-TIPOS DE CULTIVOS CELULARES
 Cultivos en suspensión, las células cultivadas estan en suspensión en el medio de
cultivo. Es el empleado en linfocitos o de médula ósea, y suelen ser de vida corta 24-
72 horas.
 Cultivos en monocapa, las células se pegan al fondo del frasco y forman colonias.
Para fibroblastos y células de tejidos sólidos. De larga duración (8-15 dias) y los
nutrientes se agotan y hay que hacerles pases.
Un subcultivo consiste en despegar las células de un cultivo en monocapa y
resembrarlas4 en otros frascos con el fin de estimular la división celular.
En función si se realizan o no subcultivos, se clasifican en primarios y secundarios que se
derivan de los resembrados.
Dependiendo de la forma en que mantienen el PH del medio se puden clasificar en:
 Cultivos cerrados, recipientes cerrados y llevan HEPES para amortiguar los cambios
de PH
 Cultivos abiertos, se dejan abiertos en la incubadora de CO2
4.2.2.-DETERMINACIÓN DEL NÚMERO Y VIABILIDAD CELULAR
La densidad óptima para cultivos de médula ósea es de 106 células/mL. Para determinar el
número existen varios métodos manuales, como es el contaje al microscopio con una cámara
de Neubauer, o automaticos como el Coulter.
La viabilodad biológica, es el porcentaje de células vivas con respecto al número total de
células. Se puede determinar mediante la utilización de tintes como la eritosina o el azul
trypan.
4.2.3.-MUESTRAS PARA ANÁLISIS CROMOSÓMICO
Diferentes muestras (sangre, médula, tejidos….). No obstante, dependiendo de personas
nacidas (postnatales), no nacidas (prenatales), productos de abortos o procesos
oncohematológicos, se utiizan respectivas muestras.
Tipo de estudio Tipo de muestra
Posnatales  Linfocitos de sangre periférica
Prenatales  Fibroblastos procedentes del líquido
amniótico
 Vellosidades coriales
 Sangre del cordon umbilical
(cordocentesis)
 TEMA 5.-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS
Productos de  Cualquier tipo de tejido
abortos
Oncohematológi  Médula ósea
cosl  Sangre periferica
Las células deben ser extraidas y conservadas en condiciones esteriles. Las células
sobreviven durante unos dias si se refrigeran 4-10 Cº como máximo 24h. pero
mueren si se congelan o exponen a altas temperaturas
4.3.-CULTIVO DE LINFOCITOS DE SANGRE PERIFERICA PARA ESTUDIOS
CITOGENÉTICOS
La sangre periferica es el tejido humano más facil de obterner. Se suele utiliza sangre total,
en lugar de células blancas solas, ya que los eritrocitos y los otros componentes celulares no
interfieren.
La Fitohematoglutinina, es un agente mitógeno, que se comportad de una manera similar
a un agente extraño, estimulando así la división de los linfocitos T.
4.3.1.-CONDICIONES PREANALÍTICAS DE LAS MUESTRAS
A) OBTENCIÓN
Tipo de paciente Procedencia
Niños y adultos Sangre periferica por
venopunción
Mortinatos Punción intracardica
Recien nacidos Sangre capilar
Fetos durante el embarazo o Sangre del cordón umbilical
en el momento del
nacimiento 5
B) CONSERVACIÓN
Las muestras deben procesarse lo antes posible, aunque pueden conservarse 2-4 dias a 4ºC.
No deben congelarse nunca ni someterse a altas temperaturas. NO USAR EDTA, ya que es
tóxico para las células y afecta negativamente. Usar HEPARINA DE LITIO (TUBO VERDE)
C) RECHAZO
Las muestras coaguladas o que no se encuentran en el contenedor adecuado, daran lugar a
fallo en los cultivos. No obstante, si la muestra es muy preciada, se puede intentar el cultivo.
4.3.2.-SIEMBRA DE LA MUESTRA
A) CANTIDAD DE SANGRE QUE SEMBRAR
Volumen de sangre Volumen de medio
(ml)
Adulto normal 0.8 10
Niños y jovenes 0.6 10
Embarazadas y 1 10
posparto
B) MEDIOS PARA EL CULTIVO DE LINFOCITOS
El medio generalmente utilizado para linfocitos humanos es el RPMI 1640 (con o sin L-
Glutanina). Factor limitante (necesita sí o sí para el crecimiento celular)
 L-Glutanina
 Fitohematoglutinina
 Antibioticos
 HEPES, con indicador PH (rojo fenol)
 Suero FCS
 TEMA 5.-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS

C) PROTOCOLO DE PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO COMPLETO

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 TEMA 5.-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS

INTRODUCCIÓN
El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes
purificados o de soluciones orgánicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las
condiciones fisicoquímicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aíslan del
medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estará formado por cuatro
elementos:1. la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células.2. las condiciones físico-
químicas y fisiológicas del medio.3. la naturaleza y composición de la fase gaseosa.4. las condiciones
de incubación, especialmente la humedad y la temperatura.
1.El sustrato de cultivo
La mayor parte de las líneas celulares crecen en forma de monocapa unidas a un soporte más o menos
sólido. El crecimiento en suspensión está usualmente restringido a algunas líneas celulares
especialmente de células hematopoyéticas y tumores ascíticos. Según si la línea celular precise o no
unirse al sustrato para proliferar se dice que es dependiente o independiente de anclaje.
Materiales usados como sustrato
Los tipos de sustrato más empleados en la actualidad son los siguientes:
a) Vidrio. Empleado usualmente como sustrato de cultivo tiene como ventajas su escaso coste y
su facilidad de limpieza y esterilización. Asimismo, es especialmente útil para su posterior
observación al microscopio por su calidad óptica.
b) Plástico desechable. Empleado como material desechable estéril por irradiación. El plástico
más empleado es el poliestireno, de buena calidad óptica debido a que es hidrofóbico requiere
un tratamiento mediante irradiación-gamma, químico, o mediante descargas eléctricas que
produzca una superficie mojable. Otros plásticos que se emplean son polivinil-cloruro,
policarbonato (PVC), politetrafluoretileno (teflón, PTFE), thermanox (TPX).
c) Microsoportes ("microcarriers"). Se trata de soportes plásticos (poliestireno, Nunclon,
GIBCO), sephadex (FlowLab. y Pharmacia) y poliacrilamida (BioRad) en forma de pequeñas bolas
("beads") a las que se unen las células dependientes de anclaje. Estas bolas con las células
adheridas 7 se mantienen en suspensión.
d) Otros sustratos artificiales Se han desarrollado técnicas para crecer células de glía en
sustratos metálicos, de paladio o en discos de acero.
e) Superficies tratadas. La adherencia y crecimiento de las células en un frasco mejora en
muchos casos si la superficie ha sido tratada con el medio de crecimiento de otro cultivo, debido
a la presencia de colágeno ofibronectina liberada por las células, o bien sobre superficies
recubiertas de proteínas de matriz extracelular (fibronectina, colágeno, vitronectina, Matrigel,
etc...). Así, se pueden tratar los recipientes de cultivo confibronectina (1 ngr/ml) añadido al
medio, o con colágeno. El tratamiento con colágeno desnaturalizado aumenta la adhesión de
muchos tipos celulares, y especialmente de las células epiteliales. Otros tratamientos que se
han usado han sido: gelatina (músculo), poli-D-lisina (algunos teratomas de ratón).
f) "Feeder layers". Se ha descrito previamente que algunos tipos celulares para crecer en cultivo
y expresar sus características diferenciadas precisan de suplementos específicos. Una manera
de obtener estos suplementos es la de hacerlos crecer sobre los restos de monocapas de otros
tipos celulares. Estas monocapas previas se esterilizan o se inhibe su crecimiento (normalmente
por irradiación X o gamma). Este efecto podría ser debido a dos posibilidades: suplementación
del medio, o modificación del sustrato. Una de las monocopas más empleadas son los
fibroblastos de ratón 3T3 irradiados.
g) Matrices tridimensionales. Son sustratos en los que las células penetran, estableciendo una
distribución tridimensional: geles de colágeno, esponja de celulosa sola, o recubierta de
colágeno, o "gelfoam". En estas matrices muchos tipos celulares crecen y se establecen de una
manera análoga a como lo hacen en el tejido de un origen: células epiteliales de mama se
organizan en disposición tubular, mientras que las células del carcinoma de mama lo hacen de
una forma mucho más desordenada.
h) Sustratos no adherentes. Son sustratos que no permiten la adhesión celular, por ejemplo,
agar, agarosa, omethocel (metilcelulosa de alta viscosidad). Son de utilidad en situaciones en
las que no conviene que exista dispersión de las células derivadas de una originaria, por
ejemplo, en los procesos de aislamiento de colonias infectadas por virus.
 TEMA 5.-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS
i) Interfaces líquido-gel o líquido-líquido. Se han observado en algunas situaciones
proliferación celular y adhesióna las interfases líquido-líquido o líquido-gel, a pesar de que se
desconocen exactamente los mecanismos.
j) Haces microcapilares permeables Son cámaras de crecimiento de células formadas por un
recipiente cilíndrico en el que se siembra, y en el interior del cual hay un haz de capilares
plásticos permeables adecuados para que las células se adhieran. Los capilares se encuentran
conectados a un circuito de recambio del medio. Este dispositivo ofrece una gran superficie de
crecimiento apta para el crecimiento celular, y un eficaz sistema de recambio del medio (por ej.
Vitafiber Chamber de Amicon).
1.2 Recipientes de cultivo.
Tal como se ha descrito previamente, el material más utilizado como sustrato es el plástico desechable,
en forma de diferentes tipos de recipientes. Los más comunes son:
- Placas de Petri (ventiladas). Disponibles en 3 tamaños: 3.5, 6.0 y 10 cm de diámetro son las
más empleadas cuando se trata de crecer las células para usar directamente en experimentos.
No es recomendable, por su escasa estanqueidad, emplearlas para el mantenimiento de líneas.
- Multiplacas Es una variante de las placas de Petri. Placas de varios pocillos, desde 6 a 96
pocillos.
- Frascos de Roux (botellas ventiladas o no). Disponibles en diferentes tamaños, son
recomendables para el mantenimiento de las líneas y la producción de células, o bien para el
crecimiento de células en suspensión.
- "Roller bottles” Se trata de tubos, con una cara plana sobre la que se fija el cultivo, y que se
incuban en los incubadores dotados de "roller". Existen variantes con una gran superficie de
adhesión (espirales de plástico...) y que se destinan a la producción de gran número de células
2. LA FASE GASEOSA
Los componentes más significativos de la fase gaseosa son el oxígeno y el dióxido de carbono.
2.1 Oxígeno
Las necesidades8de oxígeno para la mayor parte de los cultivos celulares son cubiertas con la tensión
atmosférica, aunque existen cultivos, especialmente los cultivos de órganos que requieren una tensión
de oxígeno superior (del95%) posiblemente debido a la geometría del órgano y a las dificultades de
difusión del gas en su interior. Se ha propuesto que los requerimientos de selenio en el medio podrían
ser debidos a su papel en la detoxificación de radicales de oxígeno, especialmente en los medios sin
proteínas séricas.
2.2 Dióxido de carbono
El dióxido de carbono juega un complejo papel en el medio debido a que influye la cantidad de CO2
disuelto, el pH y la cantidad de iones HCO3. De modo que para establecer un pH determinado se debe
tener en cuenta especialmente los niveles de bicarbonato sódico y la tensión de CO2 Cada medio tiene
una concentración recomendada de bicarbonato y tensión de CO2 para alcanzar el pH correcto. Sin
embargo, se emplean otras sustancias tamponadoras en la formulación de muchos medios en la
actualidad, lo que permite una estabilidad superior del pH en el medio, así como una mayor capacidad
tamponadora (los denominados Good's buffers :HEPES, Tricita. Una alternativa es la suplementación
del medio con piruvato. Esto permite a muchos tipos celulares incrementar su producción de CO2
endógeno, haciéndolas independientes de la aportación de CO2exógeno.En resumen, los cultivos
crecidos a baja densidad en un recipiente abierto precisan una atmósfera de CO2, cuya concentración
esté en equilibrio con el bicarbonato sódico en el medio. A concentraciones celulares muy reducidas
(por ej. durante el clonaje) es necesario añadir CO2 en la fase gaseosa de los frascos cerrados. Cuando
la concentración celular es más elevada puede no ser necesario añadir CO2 a frascos cerrados, pero si
en frascos abiertos. En los casos en los que la densidad celular sea elevada, con mucha producción de
ácido es recomendable, por la elevada producción de CO2 endógeno, mantener abierto el recipiente de
modo que se pueda eliminar el exceso. En estos casos es especialmente recomendable suplementar el
medio con HEPES para asegurar un correcto control del pH del medio.
3. PROPIEDADES FÍSICAS
3.1 pH y capacidad tamponadora.
El pH óptimo de crecimiento para la mayoría de tipos celulares es de 7.4, aunque existen pequeñas
variaciones: algunas líneas normales de fibroblasto crecen mejor entre pH 7.4 y 7.7, y células
 TEMA 5.-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS
transformadas lo hacen en el margen de pH de 7.0 a 7.4, células epidérmicas pueden ser mantenidas a
pH 5.5.
El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a pH 7.4, naranja a pH
7.0, amarillo a pH 6.5, azul-rojo a pH 7.6 y púrpura a pH 7.8.
El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de evitar los cambios bruscos de pH. La solución
tamponadora más empleada sigue siendo el tampón bicarbonato, que equilibra el CO2
atmosférico, a pesar de su escasa capacidad tamponadora, debido a: su bajo coste, baja toxicidad, y
beneficios nutricionales para el cultivo. HEPES es la solución tamponadora de elección por su elevada
capacidad tamponadora en el rango 7.2 a 7.6, y se emplea en concentraciones de 10 a 20 mM. Cuando
se usa conjuntamente con CO2 externo, debe estar a concentración doble del bicarbonato para un
tamponamiento adecuado.
3 .2 Osmolaridad
Muchas células en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolaridad del medio, creciendo
bien en el rango de 260 a 320 mOsm/kg, con pequeñas variaciones dependiendo de la especie
considerada. Es recomendable emplear medios ligeramente hipotónicos para compensar la
evaporación durante el periodo de incubación, especialmente en incubadores sin control de la
humedad ambiente. La osmolaridad se controla mediante la determinación del punto de congelación o
la elevación de la presión de vapor. Hay que tener en cuenta que la adición de HEPES, de drogas
disueltas en ácidos fuertes y la neutralización posterior pueden afectar fuertemente a la osmolaridad
del medio.
3.3 Temperatura
La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células, de ahí la importancia de
un buen control de ésta en la incubación. Influye asimismo en el pH del medio, por lo que se
recomienda o bien ajustar el pH del medio 0.2 unidades por debajo del óptimo, a temperatura
ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso suero, dejar equilibrar o/n en la estufa y después
ajustar el pH, antes de añadirlo al cultivo.
3.4 Viscosidad
La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca
influencia sobre9el crecimiento. Sí es importante para evitar el daño celular en la agitación del cultivo
(menor daño a más viscosidad) y en la tripsinización. Se puede incrementar la viscosidad,
especialmente en medios libres de suero, añadiendo al medio carboxi-metil-celulosa o
polivinilpirrolidona.
3.5 Tensión superficial
La tensión superficial se ha de mantener baja, y en general sólo se ve alterada por la aparición de
espumas en los cultivos en suspensión donde se burbujea CO2
. En estos casos es recomendable emplear un agente antiespumante de silicona pues en éstos casos se
produce un aumento de la desnaturalización de proteínas y se incrementa el riesgo de contaminación
si la espuma alcanza el cuello del recipiente de cultivo.
4. Condiciones fisiológicas
Hacen referencia a la composición del medio. Ya se indicó que la principal dificultad para el
establecimiento de las líneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces
de reemplazar al medio "natural" como extractos embrionarios, hidrolizados de proteína o sueros.
R.P.M.I. 1640 .
Medio diseñado para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas en suspensión. Tiene
un amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados.4.
Todo medio de cultivo está formado por los siguientes elementos:
 Soluciones salinas equilibradas (BSS).
 Aminoácidos.
 Vitaminas.
 Otros suplementos orgánicos de bajo peso molecular.
 Hormonas y factores de crecimiento (suero).
 Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos).
Cultivo de linfocitos en sangre periférica
Mediante el cultivo de linfocitos en sangre periférica y utilizando técnicas especiales, es posible
observar y analizar los cromosomas con el microscopio. Se estimula el crecimiento de los linfocitos con
el uso de diferentes lectinas, una de ellas es la fitohemaglutinina. El ordenamiento de los cromosomas
 TEMA 5.-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS
según su tamaño y la localización del centrómero, se llama cariotipo. Los cromosomas no solamente
tienen un número constante en cada especie, sino además presentan estructura y morfología definidas.
Cada cromosoma consta de dos cromatides unidas por el centrómero. De acuerdo con la localización
del centrómero hay tres tipos de cromosomas en el humano: metacéntrico, submetacéntrico y
acrocéntrico. Los cromosomas humanos se han ordenado en siete grupos que se designan por las
letras (A - G). En años recientes gracias a las técnicas llamadas en bandas, es posible identificar con
precisión cada uno de los pares de cromosomas que constituyen el cariotipo. Estas técnicas han
permitido establecer correlaciones más precisas entre los síndromes clínicos dismorfológicos y las
alteraciones cromosómicas que los ocasionan. La técnica en bandas GTG es la más utilizada.
Utilidad del cariotipo en linfocitos de sangre periférica
El estudio citogenético y el cariotipo no sirve para diagnosticar cualquier padecimiento genético. Se
debe sospechar que el paciente tiene una alteración cromosómica y por tanto el cariotipo será de
utilidad: A) Cuando los pacientes presentan malformaciones múltiples que no se pueden englobar en
alguno de los síndromes de etiología multifactorial o monogénica conocidos.B) Paciente con retardo
mental, a quien se le hayan descartado otras causas de patología prenatal o postnatal condicionante
como: hipoxia neonatal, secuelas de meningoencefalitis, errores innatos del metabolismo y otros.C)
Paciente con ambigüedad de genitales.D) Pacientes con desarrollo inadecuado de caracteres sexuales
secundarios.E) Pacientes con esterilidad o infertilidad.F) Pacientes con predisposición a neoplasias
como el síndrome de Bloom, Anemia de Fanconi, Xerodermapigmentoso y Ataxia Telangiectasia.G)
Pacientes con algunos tipos de cáncer de tejido neoplásico. Para realizar esta prueba se requiere de
una muestra de sangre periférica heparinizada, de aproximadamente entre 3 y 5 ml.
Fitohemaglutinina
La fitohemaglutinina (conocida como PHA por la abreviación de phytohemaglutinin.) Es una lectina
Hemaglutinina, una lectina vista en posición lateral. Las Lectinas son proteínas que se unen a azúcares
con una elevada especificidad para cada tipo distinto. Su principal papel está en los fenómenos de
reconocimiento, tanto anivel molecular como celular. Por ejemplo, algunas bacterias utilizan lectinas
para acoplarse a las células del organismo hospedador durante la infección .La PHA fue reconocida por
su capacidad para aglutinar eritrocitos y leucocitos. Además estimula inespecíficamente la proliferación
de células T y es10esta característica mitogénica lo que le da su principal aplicación.
CARIOTIPOS
Nomenclatura para cromosomas normales y aberraciones cromosómicas constitucionales.
Cariotipo: arreglo sintetizado de los cromosomas. Se estudia usualmente en la metafase celular.
Número y morfología de los cromosomas
 Técnicas sin bandeo:
Cuando se construye el cariotipo los autosomas se numeran del 1 al 22 en orden decesciente de
tamaño y los cromosomas sexuales se llaman X y Y. Los símbolos p y q desigana el brazo corto y largo
de cada cromosoma. Cuando los cromosomas se tiñen mediante técnicas que no producen bandas, se
pueden ordenar en 7 grupos por tamaño y posición del centrómero:
 Técnicas de bandeo cromosómico.
Producen patrones de bandas en los cromosomas metafísicos.
- Banda: Parte de un cromosoma, que es claramente distinguible de los segmentos adyacentes,
por aparecer más clara o más oscura con una o más técnicas de bandeo. Las bandas que se
tiñen oscuras con un método pueden aparecer oscuras con otro.
Tipos de Bandas:
*T. Giemsa Las bandas G oscuras corresponden a las Q brillantes
Nomenclatura de bandas cromosómicas:
Las técnicas de bandeo fluorescente, permitieron la completa individualización de los cromosomas y se
pudo comprobar que el cromosoma 21 asociado al síndrome de Down en realidad es más pequeño que
el 22pero ambos mantuvieron el número ya asignado. Cada cromosoma en las células somáticas
humanas está formado por una serie de bandas continuas. Las bandas se ubican en regiones a lo largo
de los brazos cromosómicos y las regiones tienen límites definidos que pueden ser los extremos de los
brazos, los centrómeros y ciertas bandas. Las regiones y las bandas se enumeran desde el centrómero
hacia el telómero del brazo correspondiente.
 TEMA 5.-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS

1-B BIEN 16- 31-D MAL 46-C MAL

ANULADA
2-D MAL 17-C BIEN 32-B MAL 47-A MAL
3-C BIEN 18-B BIEN 33-A MAL 48-A BIEN
4-B MAL 19-B MAÑ 34-B BIEN 49-A BIEN
5-C BIEN 20-B BIEN 35-C BIEN 50-D MAL
6-A MAL 21-C BIEN 36-D MAL 51-B MAL
7-B MAL 22-B MAL 37-A BIEN 52-A MAL
8-C BIEN 23-B MAL 38-C MAL 53-A BIEN
9- 24-C MAL 39-C MAL 54-C BIEN
ANULADA
10-A BIEN 25-A BIEN 40-B BIEN 55-B MAL
11-C BIEN 26-C MAL 41-D BIEN 56-A MAL
12-C BIEN 27-A BIEN 42-D MAL 57-C BIEN
13-A BIEN 28-C MAL 43-C BIEN 58-D BIEN
14-B BIEN 29-A MAL 44-C BIEN 59-
ANULADA
15-C MAL 30-D BIEN 45-C MAL 60-B MAL

11

29 BIEN 28 MAL
 TEMA 5.-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS

TINCIÓN DE LAS EXTENSIONES

El bandeo G (o bandeo GTG) es un procedimiento mediante el cual los cromosomas son expuestos a la
acción enzimática controlada (normalmente se emplea la tripsina). Al ser posteriormente teñidos
(colorante Giemsa), presentan un patrón de bandas oscuras y claras característicos que permite su
identificación. De esta manera nos permite detectar aneuploidías (ganancias y/o pérdidas
cromosómicas) y aberraciones estructurales.

Las bandas G, que son las que se observan más fuertemente teñidas, representan las zonas en las que
se ha producido un menor grado de digestión del cromosoma. Generalmente, coincide con zonas ricas
en bases A-T (representan un 55-60% del total), que están muy condensadas y son pobres en genes
constitutivos.
Por el contrario, las bandas más claras se corresponderán con regiones poco condensadas del
cromosoma ricas en bases G-C. Estas zonas, a diferencia de las anteriores, serán ricas en genes
constitutivos.
Figura 1: Cariotipo de alta resolución 46,XY con un nivel de bandas estimado de 750 bandas
Figura 2: Cariotipo de rutina 46,XY con un nivel de bandas estimado de 450 bandas.
SINCRONIZACIÓN DEL CULTIVO:
El metotrexato (ácido 4-amino-10-metil fólico) es un antimetabolito y un análogo del ácido fólico. Es el
principio activo de algunos fármacos que se emplean en el tratamiento de algunos tipos de cáncer o en
enfermedades como la artritis reumatoide o la psoriasis.
El mecanismo de acción de este compuesto consiste en el bloqueo del ciclo celular justo antes de la
síntesis de ADN, pues induce una disminución de la timidina. De esta forma se pueden parar todas las
células en la misma fase y, al revertir el bloqueo (se puede lograr adicionando timidina o
bromodesoxiuridina) se reinicia el crecimiento celular de una forma sincronizada.
La bromodesoxiuridina (BrdU o 5-bromo-2-desoxiuridina) es un nucleótido sintético análogo a la
timidina que tiene la ventaja de inhibir ligeramente la condensación de los cromosomas.
REACTIVO CRA “CHROMOSOME RESOLUTIONADDITIVE”: Este reactivo previene la contracción de
los cromosomas12 y favorece la elongación de los mismos haciéndoles perder las uniones químicas que
mantienen su estructura superenrollada.
EL BROMURO DE ETIDIO tiene gran afinidad por unirse al ADN, por lo que suele emplearse para
poder visualizar el ADN con luz ultravioleta en la electroforesis en gel de agarosa. Asimismo, y dada
esta afinidad, también puede emplearse como agente anticontráctil, pero se debe tener mucha
precaución al manipularlo debido a su gran toxicidad.
PROTOCOLO DE BANDAS GTG:

 Madurar a 600C Solución de tripsina (a 370C) 18-28 seg.

 Lavar con agua destilada
 Teñir con colorante Giemsa
 Lavar con agua corriente

CULTIVO CELULAR EN DIAGNÓSTICO PRENATAL

1.-CULTIVO CELULAR DE FIBROBLASTOS DE LÍQUIDO AMNIÓTICO
Los fibroblastos son células que forman parte del epitelio respiratorio, digestivo y urogenital del feto y
que, al desprenderse, pasan al líquido amniótico donde se encuentran en suspensión. La obtención del
líquido amniótico se realiza por amniocentesis. Esta técnica se basa en una punción transabdominal
ecoguiada mediante la cual se accede al saco amniótico donde se encuentra el líquido a obtener.
La cantidad óptima de líquido amniótico a obtener es de 20ml, que se dividen en dos alícuotas de 10ml
para realizar el cultivo por duplicado (para cada muestra se empleará diferente medio de cultivo y
diferente incubador), evitando así tener que realizar otra amniocentesis en caso de que uno de los
cultivos falle.

CULTIVO CELULAR EN DIAGNÓSTICO PRENATAL

1.-CULTIVO CELULAR DE FIBROBLASTOS DE LÍQUIDO AMNIÓTICO
Los medios de cultivo más empleados son el medio de Ham ́s F10 y el medio de Chang, siendo el
segundo más completo. Los fibroblastos requieren de una base sólida sobre la que fijarse y crecer, por
lo que no es válido el tipo de cultivo en suspensión visto hasta el momento. Deben ser sembrados en
 TEMA 5.-OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS
frascos Roux o equivalentes. No es necesario añadir agentes mitógenos, pues los fibroblastos se
dividen de forma espontánea.
Es importante no mover el cultivo durante los tres primeros días tras la siembra para asegurarnos de
que sedimentan los fibroblastos y se adhieren correctamente al fondo, de lo contrario no crecerán.
A los 6 días se debe evaluar el
crecimiento de los fibroblastos con un
microscopio de fase invertida. A partir
del sexto día es importante revisar a
diario el crecimiento celular para evitar
el contacto entre las células, pues
inhibiría la división celular.
El medio de cultivo se debe cambiar
dos veces por semana para evitar el
agotamiento de los nutrientes.
Aproximadamente se deberá mantener
el cultivo durante 15 días para alcanzar
un desarrollo óptimo.
En caso de que los cultivos vayan muy
lentos se pueden hacer subcultivos resembrando en nuevos frascos Roux. Para ello se seguirá el
protocolo descrito al principio del tema.
Es imprescindible tripsinizar previamente al sacrificio del cultivo, pues en este caso las células se
encuentran adheridas al fondo formando una monocapa.
CULTIVO CELULAR EN DIAGNÓSTICO PRENATAL
2.-CULTIVO DE VELLOSIDADES CORIALES
Disgregación mecánica de las células de las vellosidades seleccionadas. Tratamiento con tripsina o
colagenasa de las vellosidades previamente tratadas mecánicamente.
Tras la disgregación mecánica y química de las células de las vellosidades se cultivan siguiendo un
protocolo muy similar al descrito para los fibroblastos del líquido amniótico.
El medio BIOAMF213 es específico para el cultivo de células de líquido amniótico y vellosidades coriales.
CULTIVO CELULAR EN DIAGNÓSTICO PRENATAL
3.-CULTIVO CELULAR DE SANGRE PROCEDENTE DE CORDÓN UMBILICAL (CORDOCENTESIS)
La muestra de sangre obtenida pertenece al feto y se cultiva siguiendo el mismo protocolo que el
descrito para la sangre
periférica.