SUSTRATO E INHIBIDOR Práctica

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Bioquímica
Laboratorio de Bioquímica general
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA
VELOCIDAD DE LA REACCIÓN E INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
Velocidad (UI) 0.17 0.34 0.54 0.96 0.106 0.11
INTEGRANTES Concentración
● Coss Sánchez Karina Lizbeth
Sección
de sustrato3 10 20 30 50 80 100
(mM)
● Gutiérrez Romero Karla Jazmín Grupo: 4QM1
Tabla 2. Inhibición enzimática
INTRODUCCIÓN
Tubo 1 2 3 4 5 6
Si la concentración de sustrato se aumenta y todas Absorbancia 0.083 0.226 0.411 0.702 0.787 0.807
las demás condiciones permanecen constantes, la Azúcar
velocidad aumenta hasta un punto máximo; un reductor
1.01 2.75 5.006 8.55 9.58 9.82
(μmoles/2.0
incremento posterior en la concentración de mL)
sustrato no produce un efecto sobre la velocidad de 0.50
Velocidad (UI) 0.10 0.27 0.85 0.95 0.98
reacción debido a que en estas condiciones, la
Concentración
enzima está “saturada” con el sustrato. de sustrato 10 20 30 50 80 100
(mM)
Por otra parte, la mayoría de las enzimas pueden
ser inhibidas por diversas sustancias químicas, un En el Anexo 1 se presenta la gráfica de velocidad
ejemplo es la anilina. Existen dos tipos de en unidades de invertasa contra concentración de
inhibidores enzimáticos: reversibles (aquellos que sustrato en mM, así como los cálculos
se combinan covalentemente a un grupo de la correspondientes.
enzima) e irreversibles (se combinan en forma no
covalente en la enzima o al complejo enzima- También se presenta el cálculo de la constante de
sustrato), disminuyendo la actividad catalítica de la Michaelis-Menten por el procedimiento gráfico de
enzima. Lineweaver-Burk
OBJETIVOS DISCUSIÓN DE RESULTADOS
o Analizar el efecto de la concentración del Uno de los factores clave que afectan la velocidad
sustrato sobre la velocidad de la reacción de reacción catalizada por una enzima es la
enzimática. concentración de sustrato presente [S]. A una
o Determinar la constante de Michaelis- concentración de sustrato baja, la velocidad de
Menten (KM) de forma gráfica por los reacción es proporcional a la concentración de
métodos de Michaelis-Menten y sustrato (reacción de 1er. Orden). A medida que la
Lineweaver-Burk. concentración de sustrato aumenta, deja de ser
o Determinar el tipo de inhibición producido proporcional a la concentración de sustrato (Orden
por una sustancia (anilina) sobre la de reacción mixto). Con un aumento posterior a la
actividad de la invertasa. concentración de sustrato, la velocidad de reacción
llega a ser independiente de la concentración del
RESULTADOS sustrato y se aproxima asintóticamente a una
velocidad constante. (Orden cero).
Tabla 1. Efecto de la concentración de sustrato sobre la
El complejo enzima-sustrato (ES), constituye la
actividad de la invertasa.
clave para entender el comportamiento cinético,
Tubo 1 2 3 4 5 6 cuando la enzima se combina de forma reversible
Absorbancia 0.143 0.284 0.446 0.791 0.876 0.918 con su sustrato, formando un complejo enzima-
Azúcar sustrato, el complejo ES, se descompone en
reductor
(μmoles/2.0
1.74 3.45 5.43 9.63 10.66 11.18 seguida, en un segundo plano, dando enzima libre
mL) y el producto de la reacción.
debido a que estos cuentan con un Km diferente,
pero con la misma velocidad máxima, dando como
resultado una relación competitiva entre el
Figura 1. Reacción catalizada por la invertasa complejo enzima-sustrato.
En cualquier momento de una reacción catalizada De acuerdo con los datos informados, el valor de
por una enzima, existe en 2 formas, la forma libre o Km de la sacarasa invertasa es de 28μm, valor que
sin reaccionar E y la forma combinada ES. A baja se aleja al obtenido experimentalmente (-394.83),
[S], la mayor parte de la enzima estará en la forma del efecto de la concentración de sustrato sobre la
sin combinar E. Aquí, la velocidad será actividad de la invertasa. Sin embargo, en el
proporcional a [S] porque el equilibrio de la experimento con inhibidor la Km es mayor (154.68),
ecuación (Figura 1) estará desplazado hacia la por lo que se podría decir que la anilina es un
formación de ES a medida que [S] aumenta. inhibidor competitivo ya que en estas condiciones
la Km es diferente pero la velocidad permanece
La velocidad inicial máxima de la reacción igual, Además. se observa en la gráfica que la
catalizada se observará cuando toda la enzima velocidad disminuye al aumentar sustrato.
esté formando un complejo con el sustrato ES, la
concentración de E será relativamente baja. En Cuando existe un inhibidor, su velocidad disminuye
estas condiciones, la enzima está “saturada” con el aproximadamente a 0.251 porque los inhibidores
sustrato, de modo que el aumento adicional de [S] disminuyen la actividad catalítica. Para tener una
no tendrá efecto sobre la velocidad. Esta condición clara idea de que inhibidor es la anilina, se realizó
se producirá cuando [S] sea lo suficientemente alta el método gráfico de Linweaver-Burk graficando
como para que toda la enzima libre haya formado con los valores inversos de velocidad (1/V) y la con
un complejo ES. centración del sustrato (1/S) donde se determinó
que la anilina es un inhibidor no competitivo
El efecto de saturación es una característica porque se cruza el eje vertical arriba del eje
distintiva de la catálisis enzimática y es el horizontal debido a que los valores de km son
responsable de la meseta observada en la Figura diferentes y el inhibidor se une a un lugar diferente
2. del sitio activo. Los datos informados nos dicen que
De acuerdo con los resultados obtenidos de la anilina es un inhibidor reversible no competitivo,
absorbancia, se pudo obtener por medio de la lo podemos comprobar con los gráficos y cálculos
interpolación en nuestra curva tipo de azucares realizados.
reductores la concentración de azucares
reductores que se tenían en cada una de nuestras
muestras problemas; con este resultado, se calculó
la velocidad de reacción para cada tubo y se
realizó la gráfica correspondiente.
Podemos observar que la concentración de
sustrato influye en la velocidad de reacción debido
a que cuando éste se encuentra a mayor
concentración, la velocidad de reacción es
mayoritaria, sin embargo, hay un punto máximo en
el cual, después de éste la enzima comienza a
disminuir su actividad enzimática debido a que ya
no hay más sustrato con cual reaccionar,
disminuyendo la actividad enzimática. Figura 2.Gráfica del efecto de la concentración de
sustrato sobre la velocidad de la reacción.
Por otra parte, tomando en cuenta la presencia de
un inhibidor se puede observar que la enzima se ve CONCLUSIONES
afectada por dicha sustancia, observando que hay
una competencia entre la enzima con el inhibidor,
o Entre mayor cantidad de sustrato, mayor
será la actividad enzimática hasta un punto
determinado, un incremento posterior en la
concentración de sustrato no produce un
efecto sobre la velocidad de reacción.
o La anilina es un inhibidor reversible no

competitivo
o El valor de la constante de Michaelis –

Menten (Km) es de -394.83 y de 154,68
para el de inhubición.
BIBLIOGRAFÍA
● Lehninger, A.L. (2000). Principios de

bioquímica. 3° ed. Ediciones Omega, S.A.
España, pp. 243-258
● Bohinski,R. C. (1991). Bioquímica. 5° ed,
Addison-Wesley Iberoamericana, Argentina,
Brasil, pp.147-156
ANEXO 1
1.2
0.8
Velocidad (UI)
0.6
Sustrato
inhibición
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentració n del sustrato (mM)
Figura 1. Gráfica de velocidad en unidades de invertasa contra concentración de sustrato en mM.
12
10
f(x) = 100.25 x − 0.65

R² = 0.97
8
1/Vi
6
f(x) = 55.36 x + 0.14
R² = 0.99
4
0
-0.02 0 0.02Concentración
0.04 de sustrato
0.06 0.08 0.1 0.12
Linear (Concentración de sustrato)
1/[s]
Figura 2. Cálculo de la constante de Michaelis-Menten por el procedimiento gráfico de Lineweaver-Burk

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OBJETIVOS DISCUSIÓN DE RESULTADOS

o La anilina es un inhibidor reversible no

o El valor de la constante de Michaelis –

● Lehninger, A.L. (2000). Principios de

Figura 1. Gráfica de velocidad en unidades de invertasa contra concentración de sustrato en mM.

f(x) = 100.25 x − 0.65

Figura 2. Cálculo de la constante de Michaelis-Menten por el procedimiento gráfico de Lineweaver-Burk

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