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    EMSA

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    Julian Casax
    Este documento describe dos técnicas de biología molecular: EMSA y footprinting. EMSA se usa para detectar la unión de proteínas a fragmentos de ADN mediante electroforesis en geles no desnaturalizantes. Footprinting identifica los sitios de unión proteína-ADN protegiendo secuencias unidas de endonucleasas y revelando ausencias en la digestión. Ambas técnicas son útiles para estudiar factores de transcripción y regulación génica.

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    Julian Casax
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    Este documento describe dos técnicas de biología molecular: EMSA y footprinting. EMSA se usa para detectar la unión de proteínas a fragmentos de ADN mediante electroforesis en geles no desnaturalizantes. Footprinting identifica los sitios de unión proteína-ADN protegiendo secuencias unidas de endonucleasas y revelando ausencias en la digestión. Ambas técnicas son útiles para estudiar factores de transcripción y regulación génica.

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    Este documento describe dos técnicas de biología molecular: EMSA y footprinting. EMSA se usa para detectar la unión de proteínas a fragmentos de ADN mediante electroforesis en geles no desnaturalizantes. Footprinting identifica los sitios de unión proteína-ADN protegiendo secuencias unidas de endonucleasas y revelando ausencias en la digestión. Ambas técnicas son útiles para estudiar factores de transcripción y regulación génica.

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    EMSA

    Fundamento
    Si una proteína es capaz de unirse a un fragmento de DNA migrará más
    lentamente en un gel de electroforesis. De esta manera, un fragmento únicamente
    de DNA migrará más rápidamente, pero al estar unido a una proteína se
    retrasa porque el complejo es más grande. Es importante que la electroforesis
    sea en condiciones no desnaturalizantes para conservar las estructuras y los
    lugares de unión.

    Metodología
    1. Preparación un gel de poliacrilamida al 5-15% dependiendo del tamaño del
    complejo de proteína / ácido nucleico esperado.

    2. Preelectroforesis: el buffer de carga que contiene glicerol se corre a 10 V para


    asegurarse de que no haya defectos en el gel.

    3. Preparación de la muestra y electroforesis: las muestras que contienen solo


    DNA, solo proteína, solo anticuerpo, DNA + proteína, DNA + proteína + Ab,
    proteína + Ab y DNA + anticuerpo se preparan en un buffer y se incuban juntos
    durante 30 minutos. Las concentraciones de DNA y proteínas deberán optimizarse
    para cada caso.

    4. Electroforesis: las muestras se cargan en el gel y se realiza la electroforesis.

    5. Detección de bandas electroforéticas mediante autorradiografía.

    Aplicaciones
     Observar si una proteína es capaz de unirse al DNA.
     Dilucidar el sitio de unión de la proteína.
     Reconocimiento de factores transcripciones, regiones reguladoras, etc.
    Footprinting
    Fundamento
    Es una técnica que nos permite detectar las interacciones DNA-proteína, el
    proceso se fundamenta en que si una proteína está unida a una secuencia del
    DNA, esta secuencia se encuentra protegida de la acción de endonucleasas.

    Metodología

    1. Se amplifica el fragmento de DNA que contiene el sitio en el que se une la


    proteína.
    2. Se marca uno de los extremos de las moléculas de DNA con una molécula
    radioactiva (Ejemplo: APT radioactivo), se han sustituído las moléculas
    radioactivas por fluorocromos.
    3. Se digiere el DNA con una endonucleasa (Ejemplo: DNAasa; esta enzima
    corta el DNA de forma aleatoria, a diferencia de las enzimas de restricción
    que lo cortan en secuencias determinadas). El resultado es una mezcla de
    fragmentos radioactivos de longitud variable, en la que el fragmento más
    pequeño representa un sólo nucléotido.
    4. Se separan los fragmentos radioactivos por electroforesis y se revela el
    autoradiograma. Cuando la proteína se une a su sitio en el DNA, la
    endonucleada no podra cortar esta secuencia, por lo que los fragmentos
    cubiertos por el represor no apareceran en el autoradiograma. La ausencia
    de estos representa el "footprinting".
    5. La misma muestra de DNA sin proteger por el represor se somete a un
    proceso normal de secuenciación, comparándose con el autoradiograma
    anterior.

    Aplicaciónes
     La aplicación más común es analizar la regulación transcripcional que
    ejercen diversas proteínas.
     Estudiar la interacción de Histonas con el DNA.
     Evaluar la fuerza de unión DNA-proteína al variar las concentraciones de la
    proteína.

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