Universidad de Guayaquil

Ciencias
Carrera: Química y Farmacia
Químicas
Informe de Prá cticas de Laboratorio
PRACTICA Preparaciones teñidas.- tinción doble y diferencial: Tinción de bacterias ácido alcohol
N° 4 resistentes (Ziehl - Neelsen)
NOMBRE: LAURA SANELY RIVERA CAMPOVERDE
GRUPO: 3
Objetivos de la práctica de laboratorio
1. Aprender las técnicas para identificar la morfología de las bacterias ácido-alcohol resistentes.
2. Aplicar el método de Ziehl-Neelsen para diferenciar las bacterias no ácido alcohol resistentes de las
alcohol ácido resistentes.
3. Identificar las diferentes agrupaciones de las diferentes bacterias
Marco Teórico
La tinció n de Ziehl-Neelsen es la técnica comú nmente usada en el diagnó stico rutinario de tuberculosis. Es una
técnica rá pida, fácil y de bajo costo, lo que permite que se pueda realizar en casi cualquier laboratorio clínico.
Esta tinció n permite diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la
decoloració n con alcohol-á cido y aquellos que no lo son.
La sensibilidad de esta tinció n para identificar bacilos ácido-alcohol resistentes es del 74% y la especificidad del
98%, teniendo un límite de detecció n de 5,000-10,000 bacilos/mL de muestra. El agente etioló gico de la
tuberculosis fue descrito por Heinrich Hermann Robert Koch, quien, basá ndose en las características de las
micobacterias, desarrolló una de las primeras tinciones utilizando azul de metileno seguido de la tinció n de
Bismarck. Sin embargo, fueron los trabajos de Paul Ehrlich los que definieron la resistencia a la decoloració n por
alcohol-á cido, y las ú ltimas modificaciones a la tinció n fueron realizadas por los científicos alemanes Franz Ziehl
y Karl Adolf Neelsen.
La tinció n se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparació n ligeramente para solubilizar las ceras,
lípidos y otros á cidos grasos de la pared celular para que permita el paso libre del colorante, el cual tiene una
enorme afinidad por los á cidos micó licos presentes en la pared. Al enfriar con agua, los componentes de la pared
vuelven a solidificar, resistiendo la acció n abrasiva del alcohol-á cido, y el azul de metileno se utiliza como
contratinció n
Las muestras clínicas ú tiles para su uso son mú ltiples, como el líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido
sinovial, líquido pericá rdico, biopsias para cultivo, abscesos, aspirados, crecimiento de colonias aisladas en
medios de cultivo, expectoraciones, aspirados endotraqueales y lavados bronquio alveolares. Una tinció n
positiva es aquélla en la que se observan bacilos á cido-alcohol resistentes, los cuales son de color rojo fucsia.
[ CITATION Lóp141 \l 12298 ]
Dentro de las bacterias á cido alcohol resistentes encontramos dos importantes pató genos: Mycobacterium
tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de la tuberculosis y la lepra
respectivamente. Estas bacterias pertenecen al Phyllum Actinobacteria, un grupo grande y complejo de
bacterias gram positivas, que incluye a la Familia Mycobacteriaceae caracterizada por contener en sus paredes
celulares un alto contenido lipídico, ceras con una gran diversidad de á cidos micó licos, moléculas de 60 a 90
á tomos de carbono. La presencia de estos lípidos, en la cara externa de la pared, hacen que estas bacterias sean
muy resistentes a la acció n de compuestos químicos presentes en su entorno, característica que se utiliza para
aislar estos microorganismos: uno de los medios má s frecuentes es el Loewenstein-Jensen con verde malaquita
que permite el crecimiento selectivo de estos microorganismos.
[ CITATION Váz102 \l 12298 ]
Requiere de tres colorantes:
 Mezcla en fucsina-fenol: capaz de teñ ir células en caliente. El fenol facilita la penetració n de la fucsina en
la envoltura celular.
 Decolorante: mezcla de á cido y alcohol.
 Colorante de contraste: azul de metileno.
MATERIALES MEDIOS DE REACTIVOS EQUIPOS
CULTIVO/CEPAS
Algodón Caldo nutritivo Alcohol Mechero
 PASO TÉCNICA RESULTADO
AAR- AAR+
Fósforos Cepas varias Azul de metileno(0.3 Microscopio
Primer Fucsina fenicada %)
Se tiñ en rojo Se tiñ en rojo
colorante
Gasa 5 minutos con calor Carbol fucsina o fenol
fucsina
No se decoloran
Decolorante
Placas portaobjetosAlcohol á cido ÁSe decoloran
cido clorhídrico
(0.36 N) en etanol
Permanecen rojas
Asa de inoculación Solució n Aceite de cedro Permanecen rojas
Colorante de
Papel filtro Hidro-alcohó lica Se tiñ en azul
contraste (Mycobacterium)
Azul de metileno1 minuto
Elaborado por: QF. Mariana Rendó n M. MSc.
Procedimiento
 Preparar el frotis con una muestra microbiana
 Fijar
 Tinció n
1. Cubrir toda la preparació n con Carbol fucsina o fenol fucsina. Calentar en el mechero, sin que
hierva por 5 minutos. Añ adir carbol fucsina o fenol fucsina perió dicamente la placa no debe
quedar seca. Lavar con agua el exceso de colorante.
2. Decolorar con la solució n ácido-alcohol hasta observar un color rosado (30 segundos.). Lavar
para detener la decoloració n.
3. Teñ ir con azul de metileno por 1 minuto. Lavar el exceso de colorante
4. Secar la muestra
5. Leer con objetivo de inmersió n, en el sentido de las manecillas del reloj 100 campos y contar los
BAAR por campo.

Imagen recuperada de:

https://campusvirtual.ug.edu.ec/pluginfile.php/1113049/mod_resource/content/1/819-989-1-PB.pdf
 Cuadro de Sistematización Técnica de Ziehl-Neelsen
Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc.

REPORTE DE RESULTADOS
NEGATIVO No se encontraron bacilos
NEGATIVO á cido-alcohol resistentes en 100 campos
observados
1-9 BAAR
POSITIVO (+) Informar el nú mero de bacilos observados
en 100 campos
Menos de 1 bacilo por campo en
POSITIVO (++)
promedio, en 100 campos observados Cuadro
de De 1 a 10 bacilos por campo en promedio reporte
de
POSITIVO (+++) MÀ S DE 100
en 50 campos observados
Má s de 10 bacilos por campo en 20
POSITIVO (++++)
campos observados
resultados de la Baciloscopia
Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc
Resultados obtenidos

Para tener buenos resultados se requiere de una buena preparació n de la técnica, tanto en el frotis como en la
tinció n de Ziehl Neelsen, en la imagen podemos observar algunos errores que nos llevan a resultados erró neos

Imagen recuperada de https://files.sld.cu/tuberculosis/files/2009/12/tb-labs-baciloscopia1.pdf

 Mycobacterium phlei
Las flechas señ alan estos bacilos ácido-alcohol
resistentes teñ idos de rojo mientras que organismos
que no poseen esta característica son rá pidamente
decolorados y se tiñ en con el colorante de contraste
en este caso azul de metileno.

Mycobacterium spp
Las flechas indican los bacilos ácido- alcohol
resistentes teñ idos de color rojo fucsia, y se agrupan
en cadenas, mientras que los que no son acido-
alcohol se tiñ en de azul que es el color de contraste

 Mycobacterium tuberculosis
Los bacilos acido-alcohol resistentes tienen entre 1 y
l0 µm de largo. Con la coloració n de Ziehl Neelsen se
observan como bastoncitos delgados, ligeramente
curvos, rojo fucsia, destacá ndose claramente contra
el fondo azul.

Imá genes recuperada de : https://files.sld.cu/tuberculosis/files/2009/12/tb-labs-baciloscopia1.pdf

Conclusiones
1. Por medio de los videos explicativos, adquirimos los conocimientos adecuados para diferenciar entre las
bacterias no acido alcohol resistentes y las acido alcohol resistentes, aplicando como método la técnica de
tinció n de Ziehl Neelsen.
2. Identificamos la morfología de los bacilos acido alcohol resistentes.
Recomendaciones
1. Seguir las normas de bioseguridad
2. Cumplir con los tiempos adecuados en la tinció n
3. Realizar un frotis correctamente para poder observar buenos resultados

Bibliografía
López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña, S., Cerón-González, G., & Franco-
Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Medigaphic, 3(1), 10-18.
Obtenido de https://campusvirtual.ug.edu.ec/pluginfile.php/1113058/mod_resource/content/1/ir141b.pdf
Vázquez, C., Martín, A., de Silóniz, I., & Serrano, S. (2010). Técnicas básicas de Microbiología, Observación de
bacterias. reduca, 3(5), 15-38.
https://files.sld.cu/tuberculosis/files/2009/12/tb-labs-baciloscopia1.pdf