TEMA 14a: EXPLANTES

I. INTRODUCCION:
Los explantes son tejidos vivos separado de su órgano propio y
transferido a un medio artificial de crecimiento. El nombre “explante” es
una versión castellanizada del vocablo inglés “explant”; acuñado
especialmente para identificar a los tejidos vegetales cultivados in vitro y
sin otro significado.
La selección del explante es un aspecto clave para tener éxito en el
Cultivo de Tejidos, ya que dependiendo de su ubicación en la planta, del
tipo de tejido que contiene, de su edad cronológica y fisiológica, de su
contenido endógeno de hormonas, entre otros, se comportará de una
manera o de otra. (Albany,2006)

II. EXPLANTES:
Los explantes son tejidos vivos separados de su órgano propio y
transferido a un medio artificial de crecimiento. El nombre “explante” es
una versión castellanizada del vocablo inglés “explant”; acuñado
especialmente para identificar a los tejidos vegetales cultivados in vitro y
sin otro significado. (Alvarado,1998)
Estos son órganos, fragmentos de tejidos, o células vegetales que son
separados de una planta.

Virtualmente tienen la capacidad de formar callos y órganos in vitro ;

pueden servir para iniciar los estudios de la organogénesis; sin embargo
relativamente pocos explantes tienen la habilidad para producir callos,
yemas y brotes.

Son explantes: hipocótilos, anteras, polen, células aisladas, cotiledones,

hojas, raíces, entrenudos, ápices, etc.
Pueden provenir de plantas mantenidas in vivo o in vitro.
 Su selección debe realizarse de acuerdo a los fines de la investigación,
para lo cual se debe tener en cuenta la calidad de la planta donante, la
edad fisiológica y ontogenética del órgano donante, el tamaño del
explante y, en algunos casos, la época de la recolección. Cuando no hay
brotes en la zona basal, se deben seleccionar las yemas laterales más
cercanas a la rama principal.
Los explantes constituidos por tejidos inmaduros son especialmente
apropiados para la regeneración, dada su mayor plasticidad
morfogenética. Los explantes grandes generalmente poseen un
potencial regenerador considerablemente mayor que los pequeños.
Los explantes seleccionados deben ser desinfectados por métodos
químicos para eliminar los contaminantes superficiales (hongos,
bacterias, levaduras, actinomicetos).
El potencial organogénico de un explante es inversamente proporcional
a su edad fisiológica.

III. SELECCIÓN, SEPARACIÓN Y DESINFECCIÓN DEL EXPLANTE:

La introducción de cualquier especie vegetal al cultivo in Vitro, se hace

necesario superar algunas barreras previas como son: la de la elevada
contaminación por microorganismos, principalmente bacterias y hongos
de conviven con las plantas. Para ello debe realizarse la evaluación de
productos desinfectantes y formas de aplicación, así como la parte de la
planta (explante) más adecuado que permitan un buen desarrollo de los
mismos en el medio de cultivo nutritivo, que viene a ser una segunda
etapa en este tipo de trabajos de investigación.
Una vez superada la etapa indicada, ya se puede iniciar la propagación
masiva de dicha especie y formar un banco de germoplasma in Vitro
para asegurar su conservación y disponibilidad de material para futuras
investigaciones o intercambios científicos. (Hernán Perla, 2007)
La selección y separación de un tipo de explante debe tener en cuenta
el objetivo que se persigue y considerar que, posterior a su separación
de la planta, la desinfección de los explantes, que debe hacerse en
cámara de flujo laminar, debe tener como paso previo el lavado con
agua de caño y agua destilada.
 Para la desinfección u otros pasos del proceso del cultivo que se hacen
en la cámara de flujo laminar ésta se debe encender 15 minutos antes
de su uso, evitando la interrupción o inversión del flujo de aire.
Los instrumentos utilizados deben ser colocados directamente en alcohol
de 96%, o en el esterilizador seco (incinerador bacteriológico), y
finalmente, evitar introducir la cabeza (cabellos) en el interior de la
cámara. En algunos laboratorios se conectan lámparas ultravioleta
durante la noche para desinfectar el aire.

La contaminación puede originarse de varias fuentes: tejido vegetal,

medio de cultivo, área de trabajo, ambiente de los cuartos de cultivo y el
operador.

IV. CULTIVO DEL EXPLANTE:

Los explantes para su cultivo son introducidos en los recipientes que

contienen medio de cultivo y luego de darle a los recipientes un
sellado determinado éstos son llevados a la cámara de incubación
denominado también cámara de cultivo o cuarto de conservación para
la incubación respectiva. El cuarto de incubación es un espacio
controlado que está diseñado para el control del ambiente físico
además para en él controlar la temperatura, la iluminación y el
fotoperíodo y en algunos casos menos frecuentes, la humedad del
aire y su composición. Los modelos de cámaras de cultivo son
muchos, algunos son de espacios reducidos, frecuentemente móviles,
mientras en la mayoría son verdaderos recintos acondicionados para
el control del ambiente interior.
Los recipientes que contienen los explantes no deben tener un sellado
excesivo, de lo contrario dentro del recipiente puede acumularse
etileno, dióxido de carbono, asociada con una pobre oxigenación lo
cual tiene un efecto tóxico en muchas especies. El uso de recipientes
de mayor tamaño puede disminuir la presión parcial de estos gases y
así reducir su efecto tóxico en muchas especies. Los gases que
afectan el crecimiento y organogénesis in vitro son etileno, oxígeno,
polifenoles, dióxido de carbono y acetaldehído.

IV.1 INCUBACION:

Su incubación debe realizarse en condiciones controladas por lo

menos en lo que se refiere a la luz y a la temperatura. Las
respuestas morfogenéticas pueden variar según la temperatura de
incubación, así como por la calidad de la luz.
Por lo general los cultivos in vitro son mantenidos a una temperatura
constante para un crecimiento óptimo (alrededor de 18 a 24ºC). Éste
intervalo puede variar en función del tipo de cultivo, del órgano del
que se ha obtenido el explante, de la época del año, de la edad de la
planta madre, del fotoperíodo, etc.

IV.2 VARIOCIONES DE TEMPERATURA

La variaciones de temperatura pueden alterar los niveles
hormonales de las plantas y de esta manera afectar los procesos
organogénicos.
La temperatura además de afectar el crecimiento del cultivo puede
inducir determinados procesos fisiológicos; ejemplo, temperatura
bajas (del orden de 4 a 5ºC) permiten superar los períodos de
dormancia de algunas leñosas y la conservación prolongada de
determinados cultivos in vitro, mientras que una temperatura
constante de 20ºC induce la formación de raíces en la mayoría de
coníferas.

IV.3 TEMPERATURA
La temperatura de la cámara de incubación está influenciada por la
del ambiente de la sala donde se sitúe y el calor generado por las
fuentes de luz que se dispone. Su control se efectúa mediante un
sistema de refrigeración-calefacción controlado a través de un
termostato. Para aumentar una homogeneidad de la temperatura se
hace circular el aire dentro de la cámara mediante un sistema de
ventilación. Casi todas las cámaras disponen de un programador
(termostato) que permite regular la temperatura a la que está la
cámara en cada momento.

IV.4 LUZ
En la cámara de incubación los requerimientos de luz para inducir
los procesos de diferenciación involucran: intensidad (W/m 2 ),
duración (fotoperíodo) y calidad de luz (longitud de onda-espectro
luminoso). Estos requerimientos son distintos para los tejidos
mantenidos in vitro y las plantas mantenidas in vivo (invernaderos),
donde tienen un comportamiento autótrofo. Los procesos
fotosintéticos que se dan a este nivel son bajos. Este nivel puede
inducir o favorecer la organogénesis. Las variaciones del fotoperíodo
puede activar receptores que estén involucrados en los procesos de
diferenciación. En algunas especies se ha inducido la organogénesis
al tranferir explantes a la luz, luego de haber sido sometidos a un
período de oscuridad por varias semanas.
La iluminación de la cámara de incubación se consigue disponiendo
de una serie de unidades productoras de luz situadas de tal forma
que iluminan toda la superficie útil de la cámara.
Estas unidades generalmente son fluorescentes y pueden estar
situadas de formas distintas:

- Horizontales: los fluorescentes son colocados sobre el techo de

cada área de cultivo, origina mayor uniformidad de la luz en todo
el área pero calienta el techo pudiendo causar una distribución
irregular dela temperatura.
- Verticales: los fluorescentes son colocados en los laterales de la
cámara de cultivo, origina una distribución más irregular de la luz
en el área de cultivo pero genera menos problemas con la
distribución del calor.
Las reactancias para que funcionen los fluorescentes son situados
en el exterior de la cámara para evitar que el calor generado por
ellas dificulte el control de la temperatura.

IV.5 FOTOPERIODO

El número de luz diarias que recibe el cultivo se logra consiguir

controlando mediante un programador (timer analógico o digital)
conectado al circuito de iluminación, la misma que puede estar
 relacionado con el programador de temperaturas. Por lo general, en
la mayoría de las cámaras de cultivo donde crecen las plantas el
fotoperíodo es 16 horas luz.

V. BIBLIOGRAFIA
Albany N, Vilchez J, León de Sierralta S, Molina M, Chacín P (2006)
Una metodología para la propagación in vitro de Aloe vera L. Rev.
Fac. Agron. 23: 213-222

Alvarado-Capó Y (1998) Contaminación microbiana en el cultivo in

vitro de plantas. En: Pérez Ponce J (Ed) Propagación y Mejora
Genética de Plantas por Biotecnología, pp. 81-104. IBP. Santa Clara.
Hernan Perla Gonzales. (2007). Evaluación de métodos de
desinfección y tipos de explante de la especie vegetal Piper
oradendron Trel. & Standl., para el establecimiento de su cultivo in
Vitro.Guatemala

TEMA 14b: MICROPROPAGACION

I. INTRODUCCION

La micropropagación es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos

utilizados para multiplicar plantas asexualmente de forma rápida, eficiente y en
grandes cantidades.

La micropropagación consiste en tomar pequeñas secciones del tejido

de una planta o estructuras enteras, como yemas, y cultivarlas en
condiciones artificiales para regenerar plantas completas. La
 micropropagación es especialmente útil para conservar plantas valiosas,
mejorar especies en aquellos casos en que es difícil hacerlo por otros
medios (como sucede con muchos árboles), acelerar el mejoramiento de
plantas y obtener abundante material vegetal para la investigación. Por
lo que respecta a los cultivos y especies hortícolas, la micropropagación
es actualmente la base de una amplia industria comercial en la que
participan cientos de laboratorios en todo el mundo. Además de sus
ventajas en cuanto a la rapidez de la multiplicación, la micropropagación
puede utilizarse para generar material de plantación libre de
enfermedades, especialmente si se combina con equipo de diagnóstico
para la detección de enfermedades. Ha habido intentos de utilizar más
ampliamente la micropropagación en la silvicultura. En comparación con
la propagación vegetativa por estacas, la micropropagación ofrece tasas
superiores de multiplicación que permiten una difusión más rápida del
material de plantación, aunque los costos más altos y la disponibilidad
limitada de los clones deseados impiden que se adopte más
ampliamente (Chelebio, 2007)

II. MICROPROPAGACION

La micropropagacion está basada en el concepto de la totipotencia

celular.

La cual consiste en reproducir plantas por medio dela estimulación de

capacidades naturales existentes, como el desarrollo de brotes de
yemas axilares o terminales (microestacas). Se puede obtener plantas a
través del rescate de embriones cigóticos o de la formación de brotes
adventicios (organogénesis) o de embriones somáticos (embriogénesis
somática).
Se le considera como el proceso de propagación clonal de plantas por lo
cual se le considera como el cultivo aséptico de meristemas, puntas
apicales, yemas adventicias, axilares y laterales; teniendo como principal
objetivo multiplicar (clonar) con eficacia un gran número de plantas, con
un fenotipo igual al individuo parental en un período corto.
Como técnica permite producir, según la especie, un gran número de
individuos a partir de una sola plántula.
Ésta sugerido como el sistema más eficiente y directo para retener las
características genéticas de una planta “élite”, a partir de material
proveniente de plantas adultas, que adicionalmente favorecen la
multiplicación de “ecotipos” o cultivares” seleccionados por su
adaptación a sitios particulares o la selección por sus características
biológicas comerciales.
 Actualmente se practica con éxito en especies hortícolas, ornamentales
y más recientemente en especies leñosas por las ventajas siguientes:

- Incremento acelerado del número de plantas derivadas por

genotipo.
- Reducción del tiempo de multiplicación, posibilidad de multiplicar
grandes cantidades de plantas en una superficie reducida.
- Bajos costos.
- Tiempos económicamente cortos.
- Mayor control sobre la sanidad del material que se propaga.
- Facilidad para transportar el material in vitro de un país a otro.
- Menos restricciones aduaneras.
- Posibilidad de multiplicar rápidamente una variedad de la cual
sólo existan pocos individuos.
- Disminución del control químico costoso y dañino, para el
ambiente.
- Distribución de material libre de virus.
- Mejoramiento de las condiciones fitosanitarias del material
propagado y distribuido.
- Rescate de especies amenazadas a través de un banco de
Germoplasma seguro y fácil de distribuir.

III. FASES DEL PROCESO DE MICROPROPAGACIÓN:

III.1 Desinfección de las yemas de la plantas o desinfección de

semilla:
 Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos
apartir de los cuales se obtendrán los explantos. Los
explantospueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces
o semillas.Antes de extraer los explantos se hará una
desinfección de losfragmentos de planta madre para eliminar los
contaminantesexternos.

III.2 Introducción del material seleccionado in vitro:

Luego de la desinfección superficial, las semillas o lasyemas

dependiendo del material seleccionado, se ponen en mediode
cultivo estéril. En un período de una semana o quince
días,comienza el proceso de germinación o regeneración de
nuevostejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

III.3 Preparación o elección de la planta madre:

Se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado

de desarrollo adecuado.
Para obtener los explantes las plantas madre se deben
mantener en un período de tiempo que puede ser semanas o
meses en un invernadero o en campo, pero en las que se debe
controlar las condiciones fitosanitarias y la formación de brotes
(crecimiento de los domos meristemáticos).
De la planta madre escogida se debe aislar los fragmentos a
partir de los cuales se obtendrán los explantes. Antes de aislar
los explantes, se hará una desinfección de los fragmentos de la
planta madre, para eliminar los contaminantes externos.
Desinfectado el material vegetal ésta se debe mantener en
condiciones de asepsia.

III.4 Establecimiento del cultivo in vitro :

Los explantes deben ser aislados de los fragmentos separados

de la planta madre que han estado mantenidos en asepsia.
Los explantes aislados se ponen en cultivo colocándolos en un
medio de iniciación o introducción, dentro de un tubo de cultivo o
cualquier recipiente, para poder controlar la sanidad y la
viabilidad de los explantes.

III.5 Multiplicación de los brotes:

Los explantes sobrevivientes en el medio de introducción (fase

1) orieginan brotes (de procedencia axilar o adventicia) con
varios entrenudos.
 En algunas plantas, los nuevos brotes se deben subcultivar
periódicamente en un nuevo medio de cultivo. Estas operaciones
deben ser realizadas en la cámara de flujo laminar.

III.6 Enraizamiento:

Constituye la fase en la cual las plántulas crecidas in vitro deben

pasar a un proceso de adaptación o aclimatación a las
condiciones medioambientales del invernadero o del campo.

También es llamada fase tres incluye los procesos de

enraizamiento de microestaquillas (explantes) o plántulas que no
formaron la raíz (algunos forestales y frutales); aunque en la
mayoría de las plantas, que se propaga por cultivo de tejidos, no
es necesario realizar este proceso, por formar simultáneamente
las raíces. Para enraizar los explantes se utilizan, principalmente
dos métodos:

III.7 Enraizamiento in vitro :

Los brotes de las plántulas obtenidas en la fase de multiplicación

son transferidas a un medio de enraizamiento, especialmente
formulado para este caso que puede ser libre de reguladores de
crecimiento o que contenga auxinas, citoquininas o una
combinación de ambos.
Acá en los brotes no es necesario que las hojas estén muy bien
desarrolladas para realizar la fotosíntesis.
Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar en
asepsia.

III.8 Enraizamiento ex vitro :

Los explantes deben ser transferidos a un sustrato limpio,

aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de
turba con arena, perlita o vermiculita.
Es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de
organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien
desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la
planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse.

La elección del método de enraizamiento va a depender

totalmente de la especie y de sus características:
 porcentajes de enraizamiento
 supervivencia final, que varían enormemente de una
especie a otra.
 Cuando el enraizamiento y aclimatación se pueden realizar
simultáneamente, sin que haya demasiada pérdida de plantas,
tanto los costos como eficiencia de la producción se ven muy
favorecidos.
Son factores que se consideran en el enraizamiento de
microestaquillas tanto in vitro como ex vitro :
 el tamaño de la microestaquilla
 su cobertura foliar
 los reguladores de crecimiento utilizados en la inducción
 las condiciones medioambientales de temperatura
 luz
 humedad

Una técnica híbrida para el enraizamiento de las

microestaquillas es la combinación de las ventajas del
enraizamiento in vitro y ex vitro . Para esto las microestaquillas
son incubadas inicialmente en un medio estéril, que incluye
hormonas para la inducción de raíces y azúcares, durante un
período de 3 a7 días para la inducción-inicio de las raíces.
Esto se hace en un medio sólido o líquido, normalmente en
oscuridad. Luego el material es repicado en un medio no estéril
o incluso transplantado a tierra, para la fase de elongación y
desarrollo de las raíces, que mejora de esta forma en muchos
casos el resultado final de aclimatación y supervivencia. En las
microestaquillas de algunos frutales como del género Annona se
deben utilizar otras estrategias como incubar en luz y en
oscuridad, además del medio de cultivo y otros factores físicos y
químicos mencionados.

III.9 Aclimatación:

Es un proceso lento de adaptación de las plántulas del estado

in vitro al de ex vitro que se debe realizar con mucho cuidado,
por constituir esta fase la más crítica en el proceso de cultivo
de tejidos vegetales.

Constituye una fase muy importante del cultivo de tejidos

vegetales por las razones siguientes:

 Los explantes recién enraizados son muy sensibles

a los cambios ambientales.
 Si los explantes enraizados in vitro como ex vitro en
el momento en que se extraen los explantes de los
recipientes de enraizamiento están poco adaptados a
crecer en un invernadero, ya que los explantes han
enraizado y crecido en ambientes con una humedad
 relativa muy elevada y, generalmente, tienen estomas
perezosas para responder al descenso de la humedad
relativa, demasiados lentos para evitar la desecación del
explante.
 Cuando los explantes crecen en ambientes tan
húmedos también suele implicar la falta de una cutícula
cérea bien desarrollada, la barrera para evitar la pérdida de
agua a lo largo de toda la superficie de la planta.
 Los explantes en aclimatación tienen que desarrollar
sistemas de adaptación como es el caso de la lignificación,
cubiertas cuticulares, estomas y estructuras fotosintéticas.

Se pretende en la aclimatación que las plantas crecidas in vitro

y que sólo han estado expuestas a un microambiente escogido,
por ofrecer unas condiciones mínimas de estrés y cuasi
óptimas para la multiplicación de las plántas, se adapten a
ambientes ex vitro en donde éstos no son asépticas, ni la luz ni
la temperatura y humedad están controladas, en el que
además, el crecimiento tiene que ser de un proceso autotrófico
y no heterotrófico como in vitro.

Para la adaptación en algunos se recomienda que los

explantes deben de plantarse en contenedores cubiertos por un
plástico transparente, par mantener la humedad relativa
elevada y hacerlos enraizar en el laboratorio o ponerlos en
“multipots”, dentro de un invernadero en un área sombreada
con “fog-system” o “mist-system”. Esto con la finalidad de
aclimatar gradualmente.
Algunos investigadores ha propuesto realizar simultáneamente
el enraizamiento y la aclimatación, trasplantando las
microestaquillas directamente en el campo, después de una
etapa previa de endurecimiento in vitro . tras la inducción del
enraizamiento, las plántulas aún en condiciones in vitro , deben
ser sometidas a una elevada intensidad luminosa, un
fotoperíodo más corto y una temperatura inferior a la normal,
durante un tiempo de por lo menos dos semanas para
favorecer la lignificación y el desarrollo cuticular y estomático
del material y permitir su transplante directo al campo, en
condiciones controladas de humedad, luz y nutrientes.

IV. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 CHILEBIO – ANTONIO. 2007. MICROPROPAGACION. BELLET 77, OF. 607, PROVIDENCIA,

SANTIAGO, CHILE. 
 http://www.slideshare.net/Prof.JIrizarry/modulo-22- micropropagacion-
de-plantas-pdf
 http://www.fagro.edu.uy/~fisveg/docencia/cursos%20posgrado% 20y
%20optativos/curso%20de%20micropropagacion/mateoricos
/Micropropagacin%202009.pdf
 https://www5.uva.es/guia_docente/uploads/2012/427/52016/1/D
ocumento11.pdf