Completo Micro PC3

ASIGNATURA : MICROBIOLOGÍA MÉDICA I
CICLO : IV
SEMESTRE ACADEMICO : 2020-II
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA
PROFESIONAL DE MEDICINAHUMANA
“Dr. Wilfredo Erwin Gardini Tuesta”
ACREDITADA POR SINEACE

RE ACREDITADA INTERNACIONALMENTE POR RIEV
PRÁCTICAS N° 17, 18, 19

"AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS:
GENERO Pseudomonas , Brucella , Enterobacterias
SEDE ICA
DOCENTES : LEGUA BARRIOS MIRIAM JESUS
ECOS ESPINO JULIO CESAR
SANCHEZ CORDOVA FANY
REYES RUIZ AYDA LILIANA
VILCA CHACALTANA FREDDY

➢ COMPETENCIA
• Conocer e identificar las metodología de estudio de
Pseudomonas , Brucella .
Pseudomonas
MUESTRA
Depende del cuatro clínico y del tipo de
infección, , pus, sangre orina , LCR, lavados
bronquiales, esputo y tracto genital femenino.
II.- SIEMBRA EN Incubadora a

I.-GRAM 37°C x 24-48 h
MEDIOS DE CULTIVO
III.-Agar nutritivo IV.-Agar Mac-Conkey V.- Agar sangre VI.- Caldo nutritivo
Test de Catalasa Test de Oxidasa
Lectura: Lectura: Lectura: Lectura:

• forma de las colonias • forma de las colonias • forma de las colonias • Pigmento
• Pigmento • lactosa • Tipo de hemolisis verde y Olor a
• GRAM • GRAM • GRAM uvas
PRUEBAS BIOQUÍMICA O DIFERENCIALES
ANTIBIOGRAMA
Siembra de la cepa Pseudomona
PIOCIANINA: color azul

y soluble en
CLOROFORMO
CALDO NUTRITIVO CALDO TRIPTICASA

SIEMBRA EN AGAR NUTRITIVO
Incubadora a
37°C x 24 h
Siembra por estría y agotamiento
Agar nutritivo
(medio apropiado Cetrimide) Colonias grandes, consistencia mucoide
de superficie lisa, rugoso, con pigmento azul verdoso (pioverdina
o piocianina), olor dulce a uva
SIEMBRA EN MEDIO : AGAR SANGRE
Incubadora a
37°C x 24 h
Siembra por estría y agotamiento

Colonias grandes, consistencia mucoide
de superficie lisa, rugoso Beta hemolisis, con
pigmento azul verdoso, olor dulce a uva
SIEMBRA EN MEDIO : AGAR MAC CONKEY
Incubadora a
37°C x 24 h
Siembra por estria y agotamiento
Colonias grandes de superficie lisa, borde

ondeado, consistencia mucoide, lactosa (-)
COLORACION GRAM
.. Previamente fijado al calor,
. Tiñe con cristal violeta
Durante 1 minuto.
. tiñen de color azul-violeta.
. Lavar con agua
Añadir Lugol,
. actuar 2 minutos células siguen
de color azul-violeta.
Decolorar con alcohol
acetona por 30 segundos
. Las células Gram +
siguen azul-violeta.
. Las Gram negativas
se decoloran..
. Se lava con agua
Tinción de contraste
Con safranina 2 minutos.
Las células G+ se ven azul-violeta
GRAM DE CULTIVO Las G- rosas o rojas
Bacilos cortos Gram (-)
Agar semisólido ( MIO ) AGAR TSI
Movilidad y aeróbico
NO FERMENTACION
Prueba de oxidasa
Prueba de catalasa
Oxidasa (+)
Catalasa (+)
Brucella
MUESTRA
sangre, líquido cefalorraquídeo, médula ósea o
biopsias de ganglios linfáticos e hígado.
II.- SIEMBRAR 5ml de SANGRE

EN HEMOCULTIVO
Incubadora a
37°C x 4-5 días Agar / caldo RUIZ CASTAÑEDA
Test de Catalasa Test de Oxidasa
Lectura: Lectura:
• forma de las colonias • forma de las colonias
• lactosa • Pigmento
• GRAM • GRAM
PRUEBAS BIOQUÍMICA O DIFERENCIALES
ANTIBIOGRAMA
HEMOCULTIVO Medio de Agar / caldo RUIZ
CASTAÑEDA
Crecen : Colonias pequeñas

húmedas y brillantes
PASOS PARA UN HEMOCULTIVO
LECTURA A MEDIOS DIFERENCIALES
INHIBICIÓN POR FUCSINA

INHIBICIÓN POR THIONINA
Producción de H2S
COLORACION GRAM
Cocobacilo Gram (-)

PRUEBA DE ANTIGENOS FEBRILES
PRUEBA DE AGLUTINACIÓN CON ANTÍGENO ROSA
DE BENGALA
Método de tamizaje indirecto

Se trata de un método en tarjeta
Resultado cualitativo
Brucellas inactivadas y teñidas
Se informa como positiva o negativa según
resultado de aglutinación ( SAT )
Test de Aglutinación Cuantitativa
Positivo : Se observa
particulas en el medio
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Prueba de
Prueba de catalasa oxidasa
Catalasa positiva
Oxidasa positiva
Ureasa positiva
Hidrólisis de la urea
CICLO : IV
SEMESTRE ACADEMICO : 2020-1

PRÁCTICAS N° 17, 18, 19 "AISLAMIENTO E

IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS:COPROCULTIVO
SEDE ICA
DOCENTES : LEGUA BARRIOS MIRIAM JESUS
SÁNCHEZ CÓRDOVA FANNY

➢ COMPETENCIA
• Organizar las metodologías en el aislamiento
identificación de bacterias patógenas en el
diagnóstico en coprocultivo .
MUESTRA
Heces patológicas Incubadora a
37°C x 24-48 h
II.- SIEMBRA EN
MEDIOS DE CULTIVO
III.-Agar manitol salado IV.-Agar Mac-Conkey V.- Agar SS VI.-Agar Sabouraud
I.-GRAM
Lectura: Lectura: Lectura: Lectura:

• forma de las • forma de las colonias • forma de las colonias • Desarrollo y
colonias • lactosa • lactosa lectura de las
• Manita • GRAM • HS2 colonias
• GRAM • GRAM • Azul de
lactofenol
Test de Catalasa PRUEBAS BIOQUÍMICA O DIFERENCIALES
Test de Oxidasa ANTIBIOGRAMA

TOMA DE MUESTRA PARA COPROCULTIVO
Examen macroscópico de heces
Color
Consistencia
Sangre
Restos alimenticios
Moco
PH
Técnicas del examen microscópico
Examen microscopico directo simple

Técnicas del examen microscópico método de concentración:
sedimentación
Observaciones en examen microscópico heces
SIEMBRA EN MEDIO ENRIQUECIDO
MUESTRA DE HECES MEDIO ENRIQUECIDO

SIEMBRA EN AGAR MANITOL SALADO
Incubadora a
37°C x 24-48 h
Incubar a
37 °C
24 horas
Cabe la posibilidad que salga negativo

por que no aísla a las enterobacterias.
Siembra por dispersión y agotamiento
Salvo que se encuentre una afección por
Staphylococcus
SIEMBRA EN AGAR MACCONKEY
Diferencia a las
fermentadoras
y no
fermentadoras
de lactosa
Incubar a 37°C
X 24 horas
Crecimiento
de colonias
de Shiguella
Incubadora a
37°C x 24-48 h
SIEMBRA EN AGAR SABOURAUD Incubadora a
37°C x 24-48 h
Incubar a
37 °C
24 horas
Crecimiento opcional
Solo si hubiere presencia de hongos o levaduras
SIEMBRA EN AGAR SALMONELLA - SHIGUELLA Los que fermentan lactosa
forman colonias de color rojo
por el indicador
De Ph rojo neutro
Incubar a
37 °C
24 horas

Salmonella y Shigella. Son lactosa negativa y El
tiosulfato sódico y el citrato férrico permiten la
Incubadora a detección de producción de ácido sulfhídrico,
37°C x 24-48 h como lo demuestran las colonias con centros
de color negro
SE REALIZA UNA COLORACION GRAM DE LA
MUESTRA BIOLÓGICA
Bacilos cortos Gram (-)

PRUEBAS BIQUIMICAS PARA
IDENTIFICACION DE ESPECIE - Agar Urea
- Agar Indol
- Agar TSI
- Prueba Rojo de Metilo
- Prueba de Vogues
Proskauer
- Agar Citrato
- Prueba de Catalasa
- Prueba de Oxidasa
Las pruebas de metabolismo nos ayudan a identificar a cada una de

las diferentes especies de enterobacterias
ANTIBIOGRAMA : PRUEBA DE SENSIBILIDAD
PARA ENTEROBACTERIAS
Tabla de porcentaje de sensibilidades, resistencia totales e
intermediarias a los principales antibióticos según antibiogramas
Tabla de porcentaje de sensibilidades, resistencia totales e
intermediarias a los principales antibióticos según antibiogramas
https://youtu.be/PDQbBK3w4F0 procedimiento de un coprocultivo 4.30m
https://youtu.be/JyXqgYUyyks ANALISIS COPROLOGICO 10.15 M

CICLO : IV
SEMESTRE ACADEMICO : 2020-II

"ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DE LOS

GÉNEROS :Leptospira,Treponema,Bartonella.
SEDE ICA
DOCENTE: LEGUA BARRIOS , MIRIAM JESUS
SANCHEZ CORDOVA FANY

ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DE LOS

GÉNEROS: Leptospira, Bartonella,
Treponema.
Leptospira sp
Leptospira
TOMA DE MUESTRA
OBSERVACIÓN
EN CAMPO PRUEBAS
OSCURO SEROLÓGICAS
CULTIVO
MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
Coloraciones: Coloración de Fontana Tribondeau
Se colorean por métodos especiales

como coloración vago
kiktenko,
Fontana Tribondeau (contiene nitrato
de plata)
o también rojo de Congo
Impregnación argentica, que es una precipitación de

sales de plata, que se depositan en las estructuras
celulares lo que aumentan su espesor y permite ver los
microorganismos de un color pardo oscuro sobre un
fondo claro, para formas espiraladas de bacterias
Cultivo de Leptospira en medio semisólido
Medios de Fletcher medios especiales

modificado , Korthoff y líquidos, semisólidos y
Schüffner son los mas sólidos enriquecidos con
empleados. La base de suero de conejo o
esos medios esta carnero al 8-10%, a una
constituida por suero de temperatura óptima de
conejo diluido, agar, 28 – 30ºC, en un
peptona, caldos simples y periodo de incubación
sales. membrana de 5- 10 días, en
corioalantoidea de huevos condiciones de
embrionados de gallina aerobiosis
Treponema pallidium
Treponema pallidium : coloraciones
Inmunofluorescencia directa
OBSERVACIÓN
EN CAMPO
OSCURO
Tinciones de plata; argenticas

Fontana - tribondeau
Cultivo Treponema pallidium
CULTIVO IN VIVO ;
PRUEBA DE
PRUEBAS
INFECTIVIDAD EN
SEROLÓGICAS
TESTÍCULO DE
CONEJO
Pruebas serológicas para sífilis
V.D.R.L.
ANTÍGENOS TREPONÉMICOS O
ANTÍGENOS NO TREPONÉMICOS
(cardiolipina purificada del corazón
de buey)
R.P.R
Pruebas Prueba de Floculación (VDRL),
para sífilis
Reactivo
Prueba de Floculación (VDRL), el antígeno

VDRL es una solución alcohólica que
contiene 0.03% de cardiolipina, 0.9% de
colesterol y lecitina purificada; esta
prueba esta basada en que las partículas
del antígeno lípido (cardiolipina)
permanecen dispersas en suero normal y
en enfermos se combina con la reagina de
la sífilis (la reagina es una mezcla de IgM e No reactivo
IgA dirigidos contra algunos antígenos).
RESULTADOS
Prueba semicuantitativa de V.D.R.L.
https://youtu.be/YsB8LW2CJRA prueba rápida para sífilis 6.48 m
https://youtu.be/fp7dBdjJr54 sífilis y su diagnostico cualitativa y

semicuantitativa 7.25mts
Bartonella
TOMA DE MUESTRA Bartonella bacilliformis
Obtención de muestra de tejido por biopsia

de las verrugas del paciente
Muestra de Sangre
Frotis sanguíneo de Bartonella bacilliformis
Tinciones : Giemsa, Leishman, Wrigth

TINCIONES PARA BARTONELLA
Agar columbia con sangre Hemocultivo monofásico

de carnero
Medio de cultivo de B.bacilliformis
.No crecen en medio de agar

Mac Conkey o agar nutritivo.
• No fermentan los azúcares,
son bioquímicamente inertes.
• No crece a 37 ºC.
• Son oxidasa negativa,
catalasa positiva, ureasa e
indol negativo.
HEMOCULTIVO
Medio gel de fase Hemocultivo monofásico
Medio Bifásico
son moviles
https://youtu.be/rmKx5JWmo4I tinción Giemsa 8.41m
https://youtu.be/GXgTpEbTrk4 toma de muestra para hemocultivo

Código MEH-OT-01
Versión V.2
MICROBIOLOGÍA MÉDICA Documento de Aprobación
Fecha de Aprobación 09-07-2018
GUÍA DE PRÁCTICA Nº Página 58 de 95
PRACTICA Nº 17
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO PSEUDOMONAS
INTRODUCCION
La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son móviles con flagelos
polares monotricos y multitricos, poseen cápsula, no forman esporas, no son exigentes para su
desarrollo “In Vitro”.
Pseudomona aeruginosa es la especie más frecuentemente asociada con enfermedad humana,

principalmente quemaduras severas, pero también se aíslan de orina, sangre, lavados bronquiales,
esputo y tracto genital femenino. En pacientes comprometidos pueden causar infecciones con
riesgo de vida fatales.
La detección del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnóstica de P.

aeruginosa, la mayoría de los aislamientos producen también el pigmento fluoresceina y desarrollan
bien a 42°C.
MATERIAL
 Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo.

 Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150
 Agar nutritivo en Placa Petri
 Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150
 Agar semi-sólido en tubo de 13 x 100
 Medio TSI
 Reactivo de Oxidasa
 Frasco con cloroformo
 Set de colorantes Gram
 Láminas portaobjetos
PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el método de Gram.
2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las técnicas conocidas.
3. Incubar a 37°C por 24- 48 horas.
RESULTADOS
COLORACION DE GRAM: Bacilos pequeños, Gram negativos.
CALDO NUTRITIVO: Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento de color verdoso

y un olor característico.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
AGAR MAC CONKEY: Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa. MEDIO TSI: No
hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este género no fermentan los carbohidratos
[utilizan los carbohidratos sólo por vía oxidativa en el medio de oxidación- fermentación (OF)].
AGAR NUTRITIVO: Describir la colonia, observar la difusión del pigmento en el Agar, y realizar la
prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.
CALDO TRIPTICASE: Agregar 1 ml de cloroformo para extraer el pigmento de la piocianina.
PROTOCOLO
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRACTICA Nº 18
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO BRUCELLA

HEMOCULTIVO Y SEROLOGIA
INTRODUCCION
Son microorganismos pequeños, usualmente cocobacilares, inmóviles no formadores de esporas.

Son Gram negativos y necesitan una tinción prolongada con la fucsina básica de por lo menos 2
minutos en lugar de los 30- 60 segundos de tinción convencional de Gram.
La enfermedad conocida como Brucelosis o “Fiebre Malta” es causada por las siguientes especies
Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus.
Su multiplicación y desarrollo “in vitro” es muy lento, necesitan de medios especiales como el Agar
Brucella o Caldo tripticasa soya.
Para la identificación de especies se utiliza una serie bioquímica para observar la producción de
H2S, hidrólisis de la urea, desarrollo en medios especiales con fucsina 0.002 %, Thionina 0.002 % y
requerimiento de CO2.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
Este microorganismo puede ser aislado de la sangre, líquido cefalorraquídeo, médula ósea o
biopsias de ganglios linfáticos e hígado.
I: HEMOCULTIVO
Para el Hemocultivo se utiliza el medio de doble fase (sólido + líquido) de Ruiz- Castañeda. La
incubación debe hacerse en una atmósfera de 5- 10% de CO2 a 35- 37°C. Las colonias aparecen entre
el 4 al 5 día, pero los cultivos deben ser incubados hasta los 30 días antes de ser descartado como
negativo.
II: SEROLOGIA Para el diagnóstico serológico se utilizan las técnicas de:
1. Aglutinación rápida en placa
2. Aglutinación lenta en tubo (Wright)
3. Prueba de aglutinación del 2- mercaptoethanol (2- ME)
4. Prueba modificada de Coombs (antiglobulina)
5. ELISA
MATERIAL
 Tubo con cepa de Brucella

Código MEH-OT-01
Versión V.2
 Frascos con medio de Ruiz- Castañeda

 Muestra de sangre total de paciente
 Agar fucsina en placa
 Agar Thionina en placa
 Suero positivo y suero control negativo
 Antígeno estandarizado de Brucella
 Láminas excavadas
 Pipetas de 0.2 ml
 Palito mondadientes
 Set de coloración de Gram
PROCEDIMIENTO
I: HEMOCULTIVO
Agregar 5 ml. de sangre de paciente sospechoso a Brucelosis en el medio de Ruiz- Castañeda, e

incubar por 4 a 5 días a 37°C. Se debe esperar hasta 30 días para descartar el cultivo.
COLORACION
Realizar un frotis de la cepa desarrollada en Caldo trypticase y colorearla por el método de Gram,
siguiendo las recomendaciones señaladas anteriormente.
II: SEROLOGIA
1. Con la pipeta de 0.01 colocar una gota de suero negativo en el primer círculo de la 2da. Línea de
la lámina excavada.
2. Con la pipeta de 0.01 ml colocar en la lámina excavada, las siguientes cantidades de suero
positivo: 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml respectivamente.
3. A cada alícuota de suero añadir una gota de antígeno, equivalente a 0.03 ml.
4. Mezclar cuidadosamente por rotación, con ayuda de un palito mondadientes empezando por el
suero negativo y la dilución más alta 1:400
5. Dejar en reposo por espacio de 3 minutos, luego rotar la lámina durante un minuto y dejar en
reposo por 4 minutos más.
6. A los 8 minutos no más, observar la presencia de grumos (aglutinación) que indica una reacción
positiva antígeno- anticuerpo y el titulo de anticuerpo alcanzado.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRACTICA Nº 19
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS: COPROCULTIVO
INTRODUCCION
En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias (Escherichia
coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y aerobios, algunos de los
cuales son patógenos para el Hombre y causantes de enfermedades.
El diagnóstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante el

COPROCULTIVO, es decir el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el
aislamiento del agente patógeno bacteriano.
La mayoría de las Enterobacterias tienen una acción invasiva penetrando en la mucosa intestinal
produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisión es generalmente por ingesta de
alimentos contaminados con heces humanas.
Escherichia coli, bacilo Gram negativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en

determinadas condiciones patógena para el hombre, poseen factores de virulencia que les permite
causar infecciones en el tracto gastrointestinal así como en el sistema urinario. La E. coli
enterotoxigénico (ECET) es la causa común de la "Diarrea del viajero" y produce en el organismo
enterotoxinas potentes y poseen factores de colonización; la E.coli enteroinvasiva (ECEI) y la E.coli
enterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.
Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cápsula producen infecciones
oportunistas en el huésped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio y
urinario son los lugares de infección más comunes, es difícil distinguir entre colonización e infección
y son productoras de endotoxinas.
Salmonella typhi, bacilo Gram negativo móvil con flagelos peritricos son exclusivas del hombre y
causan la fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la
Salmonella paratyhi A, B ó C.
El género Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmóviles, causan la
Disentería bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y
fiebre. La especie S. dysenteriae es la más virulenta.
El género Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, móviles con flagelos
peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de
infecciones urinarias, heridas crónicas adquiridas generalmente en el hospital
MATERIALES
 Muestra de heces.
 Placas Petri con Agar Mac Conkey
 Placas Petri con Agar SS
Código MEH-OT-01
Versión V.2
 Placas con Agar Manitol

 Tubos con Agar Sabouraud
 Tubos con medio TSI, LIA
 Tubos con caldo peptonado
 Tubos con Citrato de Simmons
 Tubos con caldo MR-VP
 Frasco con Lugol
 Reactivo para Citocromo-oxidasa
 Reactivo de Kovacks (prueba de indol)
 Reactivo para Rojo de metilo
 Láminas portaobjeto y cubreobjeto
 Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidróxido de Potasio al 40%)
 Juego de colorantes para Gram
 Material básico para laboratorio
PROCEDIMIENTO
1. Realizar un estudio macroscópico de la muestra de heces (consistencia, color, presencia de

sangre, moco, etc.)
2. Realizar un estudio microscópico de la muestra con Lugol y suero fisiológico y Gram.
3. Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos:
a) Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. de solución
salina.
b) Tomar una asada de la suspensión de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey, Agar
SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37°C por 24 horas.
c) Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciación bioquímica: TSI, LIA, Caldo
peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37°C por 24 horas.
LECTURA
EN AGAR MAC CONKEY, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la Lactosa y
las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en las
colonias que son SH2.
EN AGAR MANITOL Y AGAR SABOURAUD, observar el desarrollo de colonias y anotar las

características.
EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma el
medio un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
EN LIA (Agar, Lisina, Hierro ), observar si hay descarboxilación y desaminación de la Lisina y

producción de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilación de la lisina se eleva el pH del medio
debido a la producción de aminas, pH= 5.2 ( color amarillo), pH 6.8 (color púrpura) [indicador
púrpura de bromocresol]
EN CALDO PEPTONADO, observar la producción de Indol por las bacterias, al agregar el reactivo de
Kovac tornándose rojo grosella.
EN CITRATO DE SIMMONS, se tornará de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como fuente
de energía y alcaliniza el medio. (Formación de Hidróxido de amonio). Positivo (color azul), negativo
(color verde).
EN CALDO MR, observar el color rojo que toma cuando se le añade el Rojo de metilo. Cuando hay
producción de ácidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo color amarillo).
EN CALDO VP, observar el color rojo en anillo que se forma después de 15 minutos cuando se le
añade alfa-naftol y KOH por la producción de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo), negativo
(color amarillo).
PRUEBA DE CITOCROMO- OXIDASA agregando una gota del reactivo oxidasa sobre la colonia y
observar a los 5 minutos un intenso color azul si son productoras de la enzima en caso contrario no
habrá ningún cambio de color
COLORACION DE GRAM observar los bacilos Gram negativos.
CON SUERO FISIOLOGICO Y LUGOL observar la muestra de heces y verificar si hay movilidad
utilizando objetivos de 40 aumentos
DIFERENCIACION BIOQUÍMICA
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRACTICA Nº 20
ESTUDIO E IDENTIFICACION DE VIBRIO CHOLERAE
INTRODUCCION
Los miembros de la familia Vibrionaceae, se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los
géneros: Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. El género Vibrio comprende muchas especies siendo las
de importancia médica Vibrio cholerae, causante del cólera epidémico; V. parahaemolyticus,
causante de gastroenteritis; V. vulnificus, causante de bacteriemia, infecciones en heridas cutáneas,
celulitis; y V. alginoliticus, responsable de otitis externa, infección de heridas cutáneas, tejidos
blandos.
Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos, en parejas
o en cadenas que semejan espirilos, muy móviles, poseen un flagelo polar, no forman esporas, sin
cápsula, aerobios y oxidasa positivo.
La última pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa.
Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato,
citrato, sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos.
MATERIAL
 Placa Petri con medio TCBS sembrada con V. cholerae y V. parahaemolyticus

 Tubos con TSI
 Tubos con LIA
 Tubo con Caldo peptonado
 Tubo con MR-VP
 Tubo con Citrato de Simmons
 Desoxicolato de sodio al 0.5 %
 Set de coloración de Gram
 Microscopios
 Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO Y LECTURA
1. En Agar TCBS (thiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de V.
cholerae, de 2-4 mm de diámetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente,
circulares, de color amarillo (resultado de la utilización del citrato y formación de ácidos a
partir de la utilización de la sacarosa)
Código MEH-OT-01
Versión V.2
En Agar TCBS las colonias de V. parahaemolyticus se observan colonias circulares, de

aspecto verde- gris translucido; V. alginolyticus se observa de color amarillo (sacarosa
positiva)
2. En medio TSI, observar si hay acidez en la superficie y en el fondo por metabolismo de la

sacarosa, no produce H2 S.
3. En el caldo peptonado, detectar la presencia de indol
4. En el medio LIA observar si hay decarboxilación de la Lisina.
5. En el medio MR- VP detectar la producción del acetil-metil-carbinol
6. En el medio Citrato de Simmons, observar la formación o no de hidróxido de amonio
7. Realizar un frotis de ambas especies y colorear con Gram
8. Realizar la prueba de la “cuerda positiva”, colocando una gota de la solución de Desoxicolato

sobre una lámina portaobjetos, luego con el asa de siembra en aro transferir una colonia de V.
cholerae, mezclar y observar que se produce una suspensión viscosa al retirar el asa “como una
cuerda larga” que se torna más pegajosa después de 60 segundos más.
9. Realizar las lecturas en los medios diferenciales bioquímicos sembrados.
PROTOCOLO
Código MEH-OT-01
Versión V.2
RESULTADOS
1. Realizar esquemas de lo observado en la práctica
2. Realizar las pruebas bioquímicas correspondientes.

Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRACTICA Nº 21
ESTUDIO E IDENTIFICACION DEL GENERO LEPTOSPIRA
INTRODUCCION
Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente unidas,
muy móviles, con una longitud de 6 a 20 µm y 0.1 µm de diámetro, sus extremos semejan a ganchos
semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos).
El género Leptospira (Noguchi, 1917) pertenece a la Familia Leptospiraceae, Orden Spirochetales;

comprende 6 especies patógenas Leptospira interrogans con 18 variantes serológicas, L. noguchi,
L. santarosai, L. borgpetersenii, L. weilii, L. kirhneri y L. inadai, y mas de 200 serovares saprofitos

comprendidos dentro de Leptospira biflexa. Se diferencian por su virulencia, sus propiedades
antigénicas, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, la prueba de la endonucleasa de
restricción o la composición de su DNA.
La Leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial. Los reservorios naturales son los roedores
y una gran variedad de animales silvestres y domésticos, los cuales eliminan con la orina el agente
etiológico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de transmisión puede ser
directo (orina, órganos de animales infectados) o indirecto (a través del agua o material
contaminado. La puerta de ingreso al organismo humano es a través de lesiones de la piel y mucosas
incluyendo la conjuntiva ocular.
Se colorean por métodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y
coloración de Kiktenko, ya que toman débilmente los colorantes de anilina. Son visibles al
microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas.
Desarrolla en medios especiales líquidos, semisólidos y sólidos enriquecidos con suero de conejo o
carnero al 8-10%, a una temperatura óptima de 28 – 30ºC, en un periodo de incubación de 5- 10
días, en condiciones de aerobiosis.
Para el diagnóstico definitivo de Leptospirosis se requiere de:
1. Aislamiento de la Leptospira a partir de muestras clínicas (sangre, líquido cefalorraquídeo, orina)

en medios de cultivo o inoculación en hámster o cobayo.
2. Evidencia serológica en sueros pareados con incremento cuádruple del título de diagnóstico inicial
de 1:100
MATERIAL
 Cultivo de Leptospira en medio semisólido de Fletcher- modificado

 Lamina control coloreada por el método de Kiktenko, Vago, Fontana Tribondeau, o Rojo de
Congo.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
 Microscopio.
LECTURA
En el medio semisólido de Fletcher- modificado observar el desarrollo de las Leptospiras en todo

el tubo y la formación de un anillo a unos milímetros de la superficie del medio En la coloración de
Kiktenko las Leptospiras se tiñen de un color rosado- violeta en fondo incoloro, presentándose
sueltas o entrelazadas, semejando la letra C ó S, generalmente con los extremos en forma de
semigancho y con las espiras bien unidas. En la observación al microscopio de campo oscuro, las
leptospiras se observan como un “collar de perlas” son muy móviles, realizan movimientos de
translación, rotación y al rededor de su eje.
RESULTADOS
1. Características del cultivo observado.
2. Realiza esquema de la observación en las láminas coloreadas

Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRACTICA Nº 22
ESTUDIO E IDENTIFICACCON DE BARTONELLA
INTRODUCCIÓN
La familia Bartonelaceae comprende cinco (5) especies, siendo B. bacilliformes la causante de la

Bartonelosis humana o Enfermedad de Carrión y se transmite a través de la picadura de un insecto
alado hematófago conocido como Lutzomya.
Bartonella bacilliformes presenta un marcado polimorfismo (bacilar, cocobacilar, cocoide), su

tamaño varía entre 1- 3 m de longitud por 0.25- 0.30 m de diámetro, presenta flagelos unipolares
en número de 1 a 10. En los cultivos jóvenes predominan las formas bacilares (forma virulenta), y
en cultivo viejo la forma cocoide (no virulenta)
Se colorea escasamente con los colorantes de anilina (Gram negativas), pero si tiene afinidad por
los colorantes derivados de Romanowski (Giemsa, Leishman, Wright).
Desarrolla en aerobios y microaerobiosis, a una temperatura óptima de 29°C en medios

enriquecidos con peptona, triptosa, y plasma (gel de fases) y medio bifásico con sangre y plasma,
durante un periodo de incubación de 5- 10 días. Su crecimiento es lento por lo general semanas,
enturbia el medio con sedimento y a veces se observa películas o témpanos en la superficie de la
parte líquida del medio.
Puede ser aislada de la sangre (Hemocultivo) en la fase hemática de la enfermedad, de las lesiones
eruptivas (fase verrucosa o histioide) y del LCR en los casos de neurobartonelosis.
En el laboratorio se puede aislar la bacteria por Hemocultivo (fase hemática) usando el agar de
fases, medio de aislamiento primario, por cultivo del verrucoma (fase eruptiva); se pueden realizar
pruebas serológicas (aglutinaciones, fijación de complemento, Elisa, etc.), ó por Infección de los
hematíes humanos por Bartonella (Danza de los hematíes) e Inhibición del movimiento de los
hematíes por acción de anticuerpos específicos antibartonella
MATERIAL
 Frotices coloreados por Leishman, Wrigth ó Giemsa procedentes de cultivo.

 Cultivo de la bacteria en Medio Agar Gel de Fases
 Cortes histológicos de verrucoma coloreados con Hematoxilina eosina
PROCEDIMIENTO E INTERPRETACIÓN
Observar al microscopio las láminas coloreadas y apreciar la morfología y tinción de Bartonella. En

las láminas coloreadas observar las bacterias en forma de empalizada y en forma aislada.
En los cultivos observar la turbidez del medio, la formación de sedimento y la formación de películas
o témpanos
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Realizar esquemas de las observaciones realizadas.
PRACTICA Nº 23
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE TREPONEMA – PRUEBA DE VDRL ó RPR
INTRODUCCIÓN
Las espiroquetas constituyen un grupo grande y heterogéneo de microorganismos espirilares

móviles, dentro de las cuales se encuentra la familia Treponemataceae que comprende tres géneros
de microorganismos patógenos para el hombre: Treponema ( T. pallidum, causa la sífilis, T. pertenue,
produce el pián, T. carateneum, produce el pinto), Borrelia ( B. recurrentis produce la fiebre
recurrente, B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme), y Leptospira que origina infecciones
generales con fiebre, ictericia y meningitis.
La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 0.2 m de ancho y 5
a 15 m de largo, son móviles y giran constantemente, no se tiñen bien con los colorantes de anilina
y es difícil su cultivo en medios artificiales.
PRUEBAS DE DIAGNOSTICO
1. Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (líquidos tisulares) pueden
observarse en un microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas móviles características.
2. Por inmunofluorescencia usando suero antitreponema marcado con fluoresceina
3. Pruebas serológicas para sífilis, estas pueden usar antígenos treponémicos o antígenos no
treponémicos (cardiolipina purificada del corazón de buey)
4. Prueba de Floculación (VDRL), el antígeno VDRL es una solución alcohólica que contiene 0.03% de
cardiolipina, 0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba esta basada en que las partículas
del antígeno lípido (cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y en enfermos se combina
con la reagina de la sífilis (la reagina es una mezcla de IgM e IgA dirigidos contra algunos antígenos).
5. Prueba de aglutinación (RPR) En la prueba rápida para reaginas plasmáticas (RPR), las "reaginas"
presentes en el suero de individuos infectados con Treponema pallidum, se detectan por acción de
las mismas con antígeno de cardiolipina, lecitina y colesterol adsorbido sobre partículas de carbón.
La reacción produce una aglutinación visible macroscópicamente, favorecida por las partículas de
carbón. Las reacciones inespecíficas se evitan con el empleo de antígeno altamente purificado y el
agregado de cloruro de colina, por lo que no es necesario inactivar la muestra
MATERIALES
 Suero problema
 Laminas excavadas
 Antígeno VDRL o RPR
 Pipetas graduadas
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PROCEDIMIENTO (VDRL)
Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero calentado (baño María a 56°C x 30’) sobre la lámina
excavada
Añadir una gota del antígeno VDRL sobre el suero y rotar durante cuatro (4) minutos
Observar al microscopio con objetivo de menor aumento la formación de floculos cuando la

reacción es positiva.
PROCEDIMIENTO (RPR)
I.PRUEBA CUALITATIVA
Llevar a temperatura ambiente los reactivos y la muestra antes de realizar el ensayo. En cada uno
de los círculos de la tarjeta de reacción colocar con un gotero plástico provisto: Muestra o Controles
1 gota (50 ul) Con el extremo cerrado del gotero distribuir la muestra uniformemente en todo el
círculo.
Con el gotero metálico provisto, en posición vertical, agregar en el centro del círculo:
Reactivo A 1 gota (17 ul)
SIN MEZCLAR, hacer rotar horizontalmente la tarjeta de reacción en forma manual o con agitador
rotativo a 100 rpm durante 8 minutos. Observar la presencia o ausencia de aglutinación al cabo de
este tiempo. Tiempos de lectura mayores pueden dar lugar a falsos resultados
II- PRUEBA SEMICUANTITATIVA
Efectuar diluciones seriadas 1:2, 1:4, 1:8, hasta 1:64 empleando solución fisiológica y proceder de
la misma manera que en la técnica cualitativa. El título estará dado por la inversa de la última
dilución que se observe reactiva.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
Reactivo: presencia de aglutinación visible en forma de grumos negros sobre el fondo claro que
indica presencia de "reaginas" en la muestra.
No reactivo: aspecto gris homogéneo que indica ausencia de "reaginas" en la muestra.
RESULTADOS
N (No reactivo) ........................ Ausencia de floculos
RD (Reactivo débil) .................. Floculos pequeños
R (Reactivo) .............................. Floculos medianos y grandes

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 Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo.

COLORACION DE GRAM: Bacilos pequeños, Gram negativos.

CALDO NUTRITIVO: Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento de color verdoso

CALDO TRIPTICASE: Agregar 1 ml de cloroformo para extraer el pigmento de la piocianina.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO BRUCELLA

Son microorganismos pequeños, usualmente cocobacilares, inmóviles no formadores de esporas.