Usp Vol5 PDF

2019
USP 42 FARMACOPEADE LOS ESTADOSUNIDOS DE

AMÉRICA
NF 37 FORMULARIONACIONAL
Volumen 5 Autorizados por la Convención de la Farmacopea de

los Estados Unidos de América. Preparados por el Consejo
de Expertos y sus Comites de Expertos
Oficial desde el 1º de mayo de 2019
La designación "USP NF 2019" en la cubierta de esta publicación es solo para

fines de identificación. La publicación contiene dos compendios separados: la
Farmacopeade los EstadosUnidos de América, Cuadragésima Segunda Revisión,
y el Formulario Nacional, Trigésima Séptima Edición.
THE UNITED STATESPHARMACOPEIAL CONVENTION

12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852,
Estados Unidos de América
GUÍA DE IMPLEMENTACIÓNDEL PERÍODODE SEISMESES
La Farmacopeade los EstadosUnidosde América-FormularioNacionaly sus suplementos son oficiales a los seis meses
después de su publicación al público. Los compendios USP-NF,publicados el 1° de noviembre de cada año, son oficiales
desde el 1° de mayo del siguiente año. Se ha adoptado la implementación de este plazo de seis meses para que los usuarios
dispongan de más tiempo para lograr que sus métodos y procedimientos cumplan con los requisitos nuevos y revisados de
USP-NF.
La tabla siguiente indica las fechas oficiales de los compendios USP-NFy sus suplementos. Los compendios de USP41-NF
36, de 2018 y sus suplementos, Anunciosde RevisiónIntermedia(IRA,por sus siglas en inglés) y Boletinesde Revisión(Revision
Bulletins) de la mencionada edición, serán oficiales hasta el 1° de mayo de 2019, fecha en la que los compendios de USP
42-NF 37 serán oficiales.
Fecha de
Publlcaclón Publlcaclón Fecha Oficia! Oficia! hasta
USP42-NF 37 1 noviembre 2018 1 mayo 2019 1 mayo 2020 (excepto cuando sean reemplazados por suplementos,
IRAsv Boletinesde Revisión)
PrimerSuplementode 1 febrero 2019 1 agosto 2019 1 mayo 2020 (excepto cuando sean reemplazados por el Segundo
USP42-NF 37 SuolementoIRAsv Boletinesde Revisión)
SegundoSuplementode 1 junio 2019 1 diciembre 2019 1 mayo 2020 (excepto cuando sean reemplazados por IRAsy Bo/eti-
USP42-NF 37 nes de Revisión)
USP43-NF 38 1 noviembre 2019 1 mayo 2020 1 mayo 2021 (excepto cuando sean reemplazados por suplementos,
IRAsv Boletinesde Revisión)
La siguiente tabla proporciona detalles de los IRAsque aplicarán a los compendios de USP42-NF 37.
Fecha de Publicación Fecha de Entrega de Fecha de Publlcaclón

IRA de PF los Comentarlos de IRA Fecha Oficia! de IRA
45/1) 2 enero 2019 31 marzo 2019 31 mavo 2019 1 iulio 2019
45(2) 1 marzo 2019 31 mavo 2019 26 iulio 2019 1 sentiembre 2019
45(3) 1 de mavo de 2019 31 iulio 2019 27 seotiembre 2019 1 noviembre 2019
45(4) 1 iulio 2019 30 seotiembre 2019 22 noviembre 2019 1 enero 2020
45(5) 3 seotiembre 2019 30 noviembre 2019 31 enero 2020 1 marzo 2020
45(6) 1 noviembre 2019 31 enero 2020 27 marzo 2020 1 mavo 2020
Los Boletinesde Revisiónpublicados en el sitio Web de la USP serán oficiales a partir de la fecha especificada en el Boletínde
Revisión.
OBSERVACIONES
Y ADVERTENCIA
En relacióncon los Derechosde Patenteso Marcasde los EstadosUnidosde América-La inclusión en la Farmacopeade los
EstadosUnidoso en el FormularioNacionalde una monografía sobre cualquier fármaco respecto al cual puedan existir
_perechos de patentes o de marcas no se considerará, ni pretende ser, una garantía de derecho o privilegio protegido por
·.dicha patente o marca, ni una autoridad para ejercer dicho derecho o privilegio. Tales derechos y privilegios están adjudica-
dos al propietario de la patente o marca y ninguna otra persona podrá ejercerlos sin permiso expreso, autoridad o licencia
otorgados por el propietario de dicha patente o marca.
Con relaciónal Usode Textosde la USP o del NF-Se destaca el hecho de que los derechos de autor de los textos de la USP
y el NF están debidamente protegidos. Los autores y demás personas que deseen usar partes del texto deberán solicitar
permiso al Secretario de la Junta Directiva de la Convención de la USP (USPC).
Copyright © 2018 The United States Pharmacopeial Convention

12601 Twinbrook Parkway, Rockville,MD 20852
Todoslos derechosreservados.
ISSN: 1930-2924
ISBN:978-1-936424-88-7
Impreso en los Estados Unidos de América
USP 42-NF 37 Contenidoiii
Contenido
VOLUMEN 1 Lista Detallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxxvii
Advertencias
Declaración de la Misión y Prefacio . . vii AdvertencIas
· y RequIsI
· ·tos Genera1es ......... . 1
Integrantes del Ciclo de Revisión Guía para los Capítulos Generales . . . . 15

2015-2020 ....................... xiii
Funcionarios ........................... xiii LJSP

42
Junta Directiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii
Consejo de Expertos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii

Monografías
Comités de Expertos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiv
Monografías Oficiales de USP42, A-H. . . . . . . . 23
In Memóriam . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi
Miembros y Delegados de la Índice

Convención de la Farmacopea
de los Estados Unidos de América Índice Combinado de USP42 y NF 37 ....... 1-1
a partir del 31 de mayo de 2018 . .. xxii
Reconocimiento para los Donantes

de Materiales de Referencia y de
VOLUMEN 2
Monografias en 2017 ............ xxix
Acta Constitutiva .................. xxxi Advertencias

Gobierno de la USP ................ xxxii Advertencias y Requisitos Generales .......... ix
Estatutos ............................. xxxii
Normas y Procedimientos ................ xxxii Guía para los Capítulos Generales .... xxi
Políticas de la USP...................... xxxii

Monografías
Monografías Oficiales de USP42, I-Z ...... 2381
Incorporaciones ................... xxxv
Artículos Incorporados a USP42 mediante

Suplementos ........................ xxxv
Índice
Índice Combinado de USP42 y NF 37 ....... 1-1
Artículos Nuevos que Aparecen en USP42
Ausentes en USP41 y sus Suplementos .... xxxvi
Artículos Incluidos en USP41 Ausentes

en USP42 .......................... xxxvi
iv Contenido USP42-NF 37
VOLUMEN 3 VOLUMEN 4
Advertencias Advertencias
Advertenciasy RequisitosGenerales . . . . . . . . . . ix Advertenciasy RequisitosGenerales 6103
Guía para los Capítulos Generales .... xxi Guía para los Capítulos Generales .. 6117
Salud Global Reactivos, Indicadores y

Monografías Oficiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4739 Soluciones . ..................... 6123
Especificacionesde Reactivos.. . . . . . . . . . . . 6128
Suplementos Dietéticos Indicadoresy PapelesIndicadores . . . . . . . . . 6214
Monografías Oficiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 741 Soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6217
SolucionesAmortiguadoras . . . . . . . . . . . . 6217
NF37 SolucionesColorimétricas . . . . . . . . . . . . . 6219
SolucionesReactivo. . . . . . . . . . . . . . . . . . 6219
Incorporaciones SolucionesVolumétricas............... 6231
Artículos Incorporados a NF 37 mediante Columnas Cromatográficas . . . . . . . . . . . . . . 6247
Suplementos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5583
Artículos Nuevos que Aparecen en NF 37 Tablas de Referencia
Ausentesen NF 36 y sus Suplementos.... 5583
Envasespara DispensarCápsulasy Tabletas.. 6253
Artículos Nuevos que Aparecen en NF 37 ... 5583
Descripcióny Solubilidad Relativade Artículos
Lista Detallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5584 de la USPy del NF. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6264
SolubilidadesAproximadas de Artículos de la
Excipientes USPy del NF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6329
ExcipientesUSPy NF, Agrupados por PesosAtómicos ....................... 6338
Categoría . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5585
Vidas Medias de Radionucleidos
Seleccionados...................... 6339
Monografías Tabla Alcoholimétrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6340
Monografías Oficiales de NF 37 . .......... 5595 Tabla de ViscosidadIntrínseca. . . . . . . . . . . . 6342
Índice Capítulos Generales

Índice Combinado de USP42 y NF 37 ....... 1-1 Verpágina 6117 para detallesdel contenido
Pruebasy ValoracionesGenerales . . . . . . . . . 6405
RequisitosGeneralespara Pruebasy
Valoraciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6405
Aparatos para Pruebasy Valoraciones . . . . . . 6451
PruebasMicrobiológicas . . . . . . . . . . . . . . . . 6456
USP42-NF 37 Contenidov
Pruebasy ValoracionesBiológicas . . . . . . . . . 6490
Pruebasy ValoracionesQuímicas. . . . . . . . . . 6602 Guía para los Capítulos Generales . . 7281

Pruebasy DeterminacionesFísicas. . . . . . . . . 6859
Capítulos Generales
Índice Verpágina 7281 para detallesdel contenido
Índice Combinado de USP42 Y NF 37 ....... 1-1 Información General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7287
SuplementosDietéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . 8935
VOLUMEN5 Índice
Índice Combinado de USP42 y NF 37 ....... 1-1
Advertencias
Advertenciasy RequisitosGenerales . . . . . . . 7267
USP 42-NF 37 AdvertenciasGenerales7267
Advertencias y Requisitos
Generales
Aplicablesa las Normas,Pruebas,

Valoraciones y Otras Especificaciones
de la Farmacopeade los EstadosUnidos
1. Título y Revisión .................... 7269 6.70. Reactivos........................... 7275

6.80. Equipo ............................ 7275
2. Estado Oficial y Reconocimiento
Legal ................................ 7269 7. Resultados de Pruebas .............. 7275
2. lTI. Texto Oficial ........................ 7269 7 .1O. Interpretación de los Requisitos ........... 7275
2.20. Artículos Oficiales .................... 7269 7.20. Reglas para Redondeo ................. 7276
2.30. Reconocimiento Legal ................. 7269
8. Términos y Definiciones ............. 7276
3. Cumplimiento de las Normas ........ 7270 8.1 O. Abreviaturas ........................ 7276
3.1 O. Aplicabilidad de las Normas ............. 7270 8.20. Aproximadamente ................... 7276
3.20. Indicación de Cumplimiento ............. 7271 8.30. Contenido de Alcohol ................. 7276
8.40. Pesos Atómicos ..................... 7276
8.50. Determinaciones con Blancos ........... 7276
4. Monografías y Capítulos Generales .. 7271 8.60. Concomitantemente .................. 7276
4.1 O. Monografías ........................ 7271 8.70. Desecador ......................... 7276
4.20. Capítulos Generales ................... 7272 8.80. Logaritmos ......................... 7276
8.90. Cepas Microbianas ................... 7276
8.1 OO.Inapreciable ........................ 7276
5. Componentes de las Monografías ... 7272 8.110. No menos de (NLT)y No más de (NMT) ... 7276
5.1 O. Formulas Moleculares .................. 7272 8.120. Olor .............................
5.20. Sustancias Agregadas .................. 7276
7272 8.130. Por ciento .........................
5.30. Descripción y Solubilidad ............... 7272 7277
5.40. Identificación ........................ 8.140. Concentraciones Porcentuales ........... 7277
7273 8.150. Presión ...........................
5.50. Valoración ...... ; ................... 7273 7277
5.60. Impurezas y Sustancias Extrañas .......... 8.160. Tiempo de Reacción .................. 7277
7273 8.1 70. Peso Específico .....................
5.70. Pruebas de Desempeño ................ 7273 7277
8.180. Temperaturas ...................... 7277
5.80. Estándares de Referencia USP ............ 7273 8.190. Tiempo ........................... 7277
8.200. Transferir .......................... 7277
6. Prácticas y Procedimientos de 8.21 O. Vacío ............................ 7277
Prueba .............................. 7274 8.220. Desecador al Vacío ................... 7277
6.1 O. Prácticas Seguras de Laboratorio .......... 7274 8.230. Agua ............................ 7277
6.20. Procedimientos Automatizados ........... 7274 8.240. Pesos y Medidas .................... 7277
6.30. Métodos y Procedimientos Alternativos y
Armonizados .......................... 7274 9. Prescripción y Dispensación ......... 7278
6.40. Con Respecto a la Sustancia Seca, Anhidra, 9.10. Uso de Unidades M'étricas .............. 7278
Incinerada o Exenta de Disolventes ........... 7274 9.20. Cambios en Volumen .................. 7278
6.50. Preparación de Soluciones .............. 7274
6.60. Unidades Necesarias para Completar una
Prueba ............................... 7275
7268 AdvertenciasGenerales USP 42-NF 37
1O. Conservación, Envasado, Almacena- 10.1O. Envasadoy Almacenamiento............ 7279

miento y Etiquetado ................. 7279 10.20. Etiquetado ........................ 7279
USP42 AdvertenciasGenerales7269
ADVERTENCIASY
REQUISITOSGENERALES
La sección de Advertenciasy RequisitosGenerales~ e_nlo Cambio en la redacdón:
sucesivo,AdvertenciasGenerales)presenta las supos1c1ones
básicas, definicionesy condiciones que se usan por defecto 2. ESTADOOFICIALY RECONOCIMIENTOLEGAL
para la interpretaciónY.aplicaciónde la ~armacop~ad_elos 2.1O. Texto Oficial
EstadosUnidosde Amenca(USP,por su,ssiglas ~n 1~gles)y
del FormularioNacional (NF, por sus siglas en 1~gles). El Officia/ text (fexto oficial)de los compendios USPy NF
Los requisitosestableci~osen estas A?vertenc,asGenerales se publican en el sitio USP-NFOnline (www.uspnf.com)en
se aplican a todos los art1culosre~onoc1dosen la USPy ~n el la edición identificadacomo "CURRENTLY OFFICIAL" (Ac-
NF (en lo sucesivo,los "compendios") y a todos los cap1tu- tualmente Oficial)y en las RevisionesAceleradasque reem-
los generales, a menos que se especifiquealgo diferente. plazan el texto en el sitio USP-NFOnline,tal como se des-
cribe más adelante.
1. TÍTULOY REVISIÓN Las revisionesde rutina se publican en el sitio USP-NF
Eltítulo completo de esta publicación(que consiste en Onliney se oficial!zanen la fec_hai_f!dicada, po_r_logeneral
cinco volúmenes e incluyesus Suplementos)es Farmacopea seis meses despues de su pubhcac1on.Las Rev1s1ones Acele-
de los EstadosUnidosde América,Cuadragésima Primera Re- radas reemplazan el texto en el sitio USP-NFOnliney se
visión y FormularioNacional,TrigésimaSexta Edición.Estos oficializanen la fecha indicada. En el sitio Web de la USPse
títulos pueden abreviarsea USP42, a NF 37 y a USP42-NF pueden encontrar enlaces a las RevisionesAceleradasde las
37. La Farm?copeade los Es~ados f.!nidos,~u,a~ragésimaPr\- monografíaso capítulos generales reemplazados en la
mera Revisiony el FormulanoN~~tonal,Trig~s1maSexta Edi- USP-NFOnline.
ción reemplazan a todas las rev1s1ones anteriores. Cuando se La USPy el NF también_se encuentran disp?~ibles en ver-
emplean las siglas "USP," "NP' o "U~P-NP' sin ningún otro sión impresa y en mem?ria fla_shUSB.Las rev1s1?~es de ru-
calificativo las mismas se refieren únicamente a USP42, NF tina se suministranal mismo tiempo que la vers1onUSP-NF
37, y a su~ Suplementos,duranteel tie,mpoq~e e~tos com: Online. Eltexto oficialpublicado en los Suplementosreem-
pendios estén vigentes. Los mismos t1t~~osisin ninguna dis- plaza a aquél previamente public_adoen la "'.~rsiónimpresa o
tinción, se aplican tanto a la presentac1onimpresa como a en memoria flash USB.Estasversionestamb1en son reempla-
la electrónica de este contenido. Aunque la USPy el NF s_e zadas por las RevisionesAceleradas,según se describió
publican en forma conjunta y comparten est~s ~dvertenc,as anteriormente.
Generales,cada uno de ellos constituye por s1mismo un En el caso de encontrarse_cualquier diferen~i_a
entre las
compendio separado. versiones impresa o memoria flash USBy el s1t10USP-NF
Esta revisiónes oficiala partir del 1º de mayo de 2019, a Online, el sitio USP-NFOnlineserá preponderante.
menos que se indique algo diferente mediante un texto
específico. 2.20. ArtículosOficiales
Los Suplementosde la USPy el NF se publican Un artículo oficial es un artículo reconocido en la USPo el
periódicamente. . NF. Se considera que un artículo está reconocido e incluido
LasAcceleratedRevisions(RevisionesAceleradas)se publi- en un compendio cu~ndo se publica s~ _monografíaen el
can periódicamente en el sitio Web de la USPbajo la sec- compendio y se le asigna una fecha of1c1al a la misma en
ción Official Text(f exto Oficial)(http:/ /www.uspnf.com/es/ forma específicao general. , , ..
texto-oficial),con el fin de oficializarrevi_sio~es en for~a Eltítulo especificadoen una monograf1a_esel tttLflo,o(tctal
más rápida que a través del proceso ordinario de pu~hca- . para ese artículo. Los nombres que ~~ consideren sin~>n!mos
ción de normas de los compendios U~~-;-NF. Los lnt~nm Rev,- de títulos oficialesno pueden ser ut1hzad.ospara su~t1tu1r a
sion Announcements(Anunciosde Rev1s1on lnter~ed1a) S?~ los nombres oficiales. ._Paralos medicamentos que incorpo-
RevisionesAceleradasa la USPy el NF que contienen rev1s10- ran un sensor para detectar que se haya administrado ef
nes oficialesy sus fechas de entrada en ~ig,encia. .. producto, el título oficialserá el título especificadoen la
Los RevisionBulletins(Boletinesde Rev1s1on) son Re'-:'ISlones monografía del .medicamento pertinente más las palabras
Aceleradasdel texto oficialo aplazamientosq~~ r~qu1~ren "con sensor"•.&.USP4i
una publicaciónurgente. Por_logeneral, se _of~ciahzan inme- Los artículosoficialesincluyentanto_sus~a!'lcias ofici'!les
diatamente, a menos que se indique algo distinto en el Bole- como productosoficiales.Una sustanciaof,c,a/es un farmaco,
tín de Revisión. excipiente, ingrediente dietético u otro ingrediente, o un ,
Las Erratasson RevisionesAceleradasque comprenden las componente de un dispositivoterminado para el cual el ti-
correccionesa ítems publicados erróneamente. Asimismo,el tulo de la monografía no incluye indicaciónalguna sobre la
sitio Web de la USP,en el apartado "OfficialText" (f exto naturaleza de la forma terminada.
Oficial)incluye anuncios sobre la disponibilidadde nuevos Un producto oficial es un _produc~ofarma~éuti~<;>, suple-.
Estándaresde ReferenciaUSPy anuncios sobre pruebas o mento dietético, preparacion magistral o dJspos1t1vo termi-
procedimientos que se mantienen en suspenso ha~ta que se nado para el cual se provee una monograf1a.
encuentren disponibles los Estándaresde ReferenciaUSP 2.30. ReconocimientoLegal , . .
requeridos. Los compendios USP_yNF estan reconoc~dospor las legis-
lacionesy reglamentaciones_demuchos pa1sesdel n:iundo.
Lasautoridades reglamentarias pueden hacer cumphr las
normas presentadas en la USPy el NF; n? obstante, debido
a que el rec?noci~iento de lo~compendios USPy_NF puede
variar de pa1sa pa1s,se recomienda que los_usuarios conoz-
can las legislacionesy reglamentacionesarhcables. En los
Estados Unidos de acuerdo con la Federa Food, Drug, and
Cosmetic Act (Ley Federalde Alimentos,Medicamentosy
7270 AdvertenciasGenerales USP 42
Cosméticoso FDCA),tanto la USPcomo el NF están recono- ción (incluyendo,p.ej., iniciativasde Calidad por Diseño,
cidos como compendios oficiales.Un medicamento con un Tecnologíade ProcesamientoAnalíticoy Análisisde Libera-
nombre reconocido en USP-NFdebe cumplir con las normas ción en Tiempo Real),por lo general se siguen para asegu-
farmacopeicasde identidad o se le considerará adulterado, rar que el articulo cumpla con las normas farmacopeicas
rotulado incorrectamente (misbranded) o ambos. Ver, p.ej., hasta su fecha de caducidad, siempre que se almacene con-
la FDCA§ 501(b) y 502(e)(3)(b); ver también las reglamen- forme a las instruccionesprovistas.Todos los artículosfarma-
taciones de la FDA,el Título 21 del CFR§ 299.5(a&b). Para copeicos comercializadosdeberán fabricarse de modo que,
evitar que se les considere adulterados, los medicamentos al ser examinados usando estas valoracionesY.procedimien-
deben cumplir además con las normas farmacopeicasde tos de prueba, cumplan con todos los requisitosfarmacopei-
contenido, calidad y pureza, a menos que se declaren en el cos aplicables(AdvertenciasGenerales,monografíasy cap1tu-
etiquetado todos los aspectos en los que el medicamento los generales). Por consiguiente, se espera que todo articulo
difiere.Ver, p.ej., FDCA§ 501(b) y Título 21 del CFR§ oficialcumpla con las normas farmacopeicasen caso de ser
299.5(c). Asimismo,para evitar que se les considere rotula- analizado,y todo artículo oficialanalizado según se indica
dos incorrectamente, los medicamentos reconocidos en los en la monografía pertinente debe cumplir con tales normas
compendios USP-NFdeben también envasarsey etiquetarse para demostrar el cumplimiento.
de conformidad con las normas farmacopeicas.Ver la FDCA Algunaspruebas, tales como las pruebas de Disolucióny
§ 502(9). Uniformidadde Unidadesde Dosificación,requieren el análisis
Un suplemento dietético que declara cumplir con las es- individualde múltiplesunidades de dosificacióncon un es-
pecificacionesde USPse considerará como un alimento in- quema de decisiones.Sin embargo, aunque estas _pruebas
correctamente rotulado (misbranded food) si incumplieralas utilicen el análisisde varias unidades de dosificacion,son, de
mismas.Ver la FDCA§ 403(s)(2)(D). hecho, una única determinación. Estosprocedimientos no
La ejecución de las normas USPes responsabilidadde la deben confundirsecon los planes de muestreo estadístico.
FDAy demás autoridades gubernamentales en los EE.UU.y La similitudcon los procedimientos estadísticosparecería su-
ciernaspaíses. La USPno cfesempeñaningún papel en la gerir una intención de hacer inferenciasa grupos más gran-
ejecucion de las normas. des de unidades, pero, en todos los casos, las declaraciónes
3. CUMPLIMIENTODE LASNORMAS sobre el cumplimiento de la norma farmacopeica son aplica-
3.1O.Aplicabilidadde las Normas bles únicamente a las unidades analizadas.Los compendios
Lasnormas para un artículo reconocido en los compen- no indican ni prohíben las repeticiones,las mediciones múl-
dios (USP-NF)se expresan en la monografía del artículo, en tiples, el rechazo estadístico de valores aberrantes o las ex-
los capítulos generales aplicablesy en las AdvertenciasGene- trapolaciones de los resultados a poblaciones más grandes,
rales.La identidad, el contenido, la calidad y la pureza de ni tampoco la necesidad y frecuencia adecuada del análisis
un artículo se determinan mediante pruebas, procedimien- de las r.artidas; dichas decisionesse basan en los objetivos
tos y criteriosde aceptación oficiales,y demás requisitosin- del analisis.La frecuencia del análisisy el muestreo se dejan
cluidos en la monografía, en los capítulos generales aplica- libres a las preferenciaso instruccionesde aquéllos que lle-
bles o en las AdvertenciasGenerales.Los "capítulos generales van a cabo los análisispara determinar el cumplimiento con
aplicables"son aquellos con numeración menor de 1000 o las normas y a los demás usuarios de USP-NF,incluidosfa-
superior a 2000 que se hacen aplicablesa un artículo me- bricantes, compradores o autoridades reglamentarias.
diante referenciaen las AdvertenciasGenerales,en una mo- Los productos oficialesse preparan de acuerdo con los
nografía o en otro capítulo general aplicable con numera- principiosreconocidos de buenas prácticas de fabricacióny
ción menor de 1000. Cuando los requisitosde una a partir de ingredientes que cumplen con las normas de USP
monografía sean diferentes a los de las AdvertenciasGenera- o NF,siempre que existan normas para dichos ingredientes
les o efe un capítulo general aplicable, los requisitosde la (para suplementos dietéticos, ver la sección 3.10.20 Aplicabi-
monografía se aplicarány reemplazarána los requisitosde lidad de las Normas a DispositivosMédicos,SuplementosDie-
las AdvertenciasGeneraleso capitulas generales aplicables, téticosy a SusComponentese Ingredientes).
aunque la monografía no haga mención expresa de las Lassustanciasoficialesse elaboran se!;Júnprincipiosreco-
diferencias. nocidos de buenas prácticas de fabricacióncon ingredientes
Loscapítulos generales con numeración entre 1000 y que cumplen con las especificacionesestablecidas para ase-
1999 tienen únicamente fines informativos.No contienen gurar que las sustancias resultantes cumplan con los requisi-
pruebas, valoracionesni otros requisitos obligatoriosaplica- tos de las monografíasoficiales.
bles a artículos oficiales,aunque se citen en un capítulo ge- 3.10.10. Aplicabilidadde las Normas a Productos
neral con numeración inferiora 1000, una monografía o Farmacéuticos,Fármacosy Excipientes
estas AdvertenciasGenerales.Loscapítulos generales con nu- Las normas correspondientes efe los compendios USPo NF
meración superior a 2000 se aplican únicamente a artículos se aplican a cualquier artículo comercializadoen los Estados
destinados para su uso como ingredientes dietéticos y suple- Unidos que (1) se reconozca en el compendio y (2) que se
mentos dietéticos. Lascitas a capítulos generales en las mo- destine o etiquete para su uso como medicamento o como
nografíasdel NF se refieren a los capítuíos generales del ingrediente de un medicamento. Dichos artículos (productos
compendio USP. farmacéuticos,fármacos y excipientes) incluyen medicamen-
La USPpermite la adopción temprana de las normas revi- tos para humanos (ya sea dispensados con receta, "de venta
sadas con antelación a la fecha oficial,a menos que se espe- libre" o de otro tipo), así como medicamentos para anima-
cifique algo distinto al momento de la publicación.Cuando les. Las normas correspondientes se aplican a dichos artícu-
las normas revisadaspara un artículo existente hayan sido los, independientemente de que se agregue o no la deno-
publicadas como "texto oficial"aprobado (conforme a lo minación "USP"o "NF". Las normas se aplican por igual a
aprobado en la sección2.1O)pero aún no han alcanzado su los artículoscon títulos oficialeso nombres derivados por
fecha de oficialización(seis meses después de su publica- transposicionesde las palabras que componen los títulos ofi-
ción, a menos que se especifiquealgo distinto; ver "fecha ciales, o por transposiciónen el orden de los nombres de
oficial",sección2.20), el cumplimiento con la norma revi- dos o mas fármacos en los títulos oficiales,o cuando se usan
sada no excluirá una determinación o indicaciónde cumpli- sinónimos con la intención o efecto de sugerir un grado
miento con las normas farmacopeicas,a menos que la USP significativode identidad con el título o nombre oficial.
especifiquealgo distin!o prohibiendo la adopción temprana 3.10.20. Aplicabilidadde las Normas a Dispositivos
en una norma en particular. Médicos, SuplementosDietéticosy a SusComponentese
Lasnormas en monografías, capítulos generales pertinen- Ingredientes
tes y AdvertenciasGeneralesson aplicablesdurante toda la Un artículo reconocido en la USPo el NF debe cumplir
vida del artículo, desde su producción hasta su caducidad. con las normas farmacopeicassi el artículo es un dispositivo
Lasespecificacionesdel fabricante y las prácticas de fabrica- médico, componente destinado para un dispositivomédico,
suplemento dietético, ingrediente dietético u otro ingre- con las normas farmacopeicas, las siglas deben aparecer
diente destinado para su incorporación en un suplemento junto al título oficial del artículo. Las siglas no deberán apa-
dietético, y si declara en su etiquetado que cumple con los recer dentro de símbolos, como por ejemplo círculos, cua-
compendios USPo NF. drados etc., y deberán estar en letras mayúsculas.
En general, los suplementos dietéticos se elaboran con. in- Si un suplemento dietético no cumple con todos los re-
gredientes que cumplen con las normas de los compendios quisitos farmacopeicos aplicables, pero contiene uno o más
USP,NF, o FoodChemicalsCodex.Cuando no existen ta~es, ingredientes dietéticos u otros ingredientes reconocidos en
normas, las sustancias pueden usarse en suplementos d1ete- los compendios USPo NF, se puede indicar que tales ingre-
ticos siempre que hayan demostrado una calidad de grado dientes individuales cumplen con las normas USPo NF o
alimenticio aceptable utilizando otros procedimientos que son de calidad USPo NF siempre y cuando la denomi-
adecuados. nación se limite a los ingredientes individuales y no se insi-
3.10.30. ~licabilidad de las Normasa la Prácticade la núe que el suplemento dietético cumple con las normas en
PreparacionMagistral (Nuevo) USP.
Las normas sobre preparación magistral de la USP,Prepa- 4. MONOGRAFÍAS Y CAPÍTULOS GENERALES
ración Magistral-PreparacionesNo Estériles(795} y Prepara- 4.10. Monografías
ción Magistral-PreparacionesEstériles(797}, según corres- Las monografías establecen el nombre, definición, especi-
ponda, son aplicables a la práctica o actividad de la ficaciones y demás requisitos relacionados con el envasado,
preparación magistral independientemente de si existe una almacenamiento y etiquetado del artículo. Las especificacio-
monografía para 1~preparación ry,agistral o si estos c~pítulos nes consisten en pruebas, procedimientos y criterios de
son referidos en dicha monograf1a. En los Estados Unidos de aceptación que ayudan a asegurar la identidad, contenido,
América, los capítulos (795} y (797} no son apli~ables a ~e- calidad y pureza del artículo. Para los requisitos generales
dicamentos preparados magistralmente por entidades regis- relacionados con secciones específicas de la monografía, ver
tradas con la FDAcomo instalaciones de tercerización (out- la sección 5. Componentesde las Monografías.
sourcing) conforme a lo definido en la Ley Federal de . Debido a que, en ocasiones, las monografías no propor-
Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (FDCA, por sus si- cionan normas para todas las características relevantes, algu-
glas en inglés) § 503B, debido a q~~ se requiere que <;Jic~as nas sustancias oficiales pueden ajustarse a las normas USPo
instalaciones cumplan con los requ1s1tosde buenas practicas NF, pero diferir en lo que respecta a propiedades no norma-
de fabricación vigentes de la FDA. Las preparacion~s magis- lizadas que son relevantes para su uso en preparaciones es-
trales, incluidos los medicamentos preparados magistral- pecíficas. Para asegurar_la reemplazabilidad ~n esos_casos,. se
mente por instalaciones tercerizadas, también pueaen estar recomienda a los usuarios comyrobar la equ1valenc1afuncio-
sujetas a las monografías aplicables; ver la sección 2.20 Artí- nal o determinar tales caracteristicas antes de su uso.
culos Oficialesy la sección 4. 1O Monografías. 4.10.10. Aplicabilidadde los Procedimientosde Prueba
3.20. Indicaciónde Cumplimiento Una monografía individual puede incluir más de una
Un producto farmacéutico, fármaco o excipiente puede prueba, procedimiento y/o criterio de aceptación para el
usar la denominación "USP" o "NF" junto a su título oficial mismo atributo. A menos que se especifique de otro modo
o en otra parte de la etiqueta únicamente cuando: (1) existe en la monografía, se debe cumplir con todas las pruebas. En
una monografía en el compendio especificado y (2) el artí- algunos casos, las instrucciones de la monografía permiten
culo cumple con la identidad estipulada en el compendio la selección de pruebas que reflejen atributos de artículos
correspondiente. producidos por diferentes fabricantes, tales como distintas
Cuando se determina que un producto farmacéutico, fár- formas polimórficas, impurezas, hidratos y disolución. Las
maco, preparación magistral o excipiente difiere de las nor- instrucciones de las monografías indican las pruebas, proce-
mas USPo NF pertinentes ~e. contenido! c~lidad o purez~ ,al dimientos y/o criterios de aceptación que se deben usar, y
aplicar las pruebas, proced1m1entos y criterios de aceptac1on el requisito de etiquetado.
establecidos en el compendio correspondiente, estas dife- El orden en el que se presentan estas pruebas en la mo-
rencias deben indicarse de forma clara en la etiqueta. nografía se basa en el orden en el que son aprobadas por el
Cuando un producto farmacéutico, fármaco, preparación
magistral o excipiente no cumple con la identidad estipu-
f
Comité de Expertos ertinente para su inclusión en la mo-
nografía. La Prueba no es necesariamente la prueba para
lada en los compendios USPo NF o se le ha agregado una el producto innovador o para el producto de referencia. De-
sustancia que interfiere con las pruebas y procedimientos pendiendo de las instrucciones de la monografía, por lo re-
establecidos, se le debe asignar un nombre diferente y total- gular no se requiere una declaración en el etiquetado si se
mente distinto de cualquier otro nombre reconocido en los usa la Prueba 1.
compendios USPo NF. 4.10.20. Criteriosde Aceptación
Un dispositivo médico, suplemento dietético o ingrediente Los criterios de aceptación consideran errores analíticos y
o componente de un dispositivo médico o suplemento die- variaciones inevitables durante la fabricación y preparación
tético puede usar la denominación "USP" o "NF" junto a su magistral, así como el deterioro hasta un grado considerado
título oficial o en otra parte de la etiqueta, únicamente aceptable en condiciones prácticas. La existencia de criterios
cuando (1) existe una monografía en el compendio especifi- de aceptación farmacopeicos no constituye razón para ase-
cado y (2) el artículo cumple con las normas de la mono- verar que una sustancia oficial cuya pureza se aproxima al
grafía y demás normas aplicables en ese compendio. 100% "excede" la calidad farmacopeica. De igual manera,
La denominación "USP" o "NF" en la etiqueta de un artí-
el hecho de que un artículo se haya preparado usando crite-
culo no debe ni puede interpretarse como un aval por parte rios más estrictos que los especificados en la monografía no
de la USP ni tampoco debe interpretarse como una confir- constituye una razon válida para aseverar que el artículo ex-
mación por parte de la USP de que tal artículo cumple con cede los requisitos farmacopeicos.
las normas pertinentes de la USP. La USP puede iniciar una Un producto oficial debe formularse con la intención de
acción lega si se declara o presenta un artículo como un suministrar el 100% de la cantidad de cada ingrediente de-
artículo oficial en uno de los compendios de la USP y ésta clarado en la etiqueta. Cuando debido a requisitos legales
determina que tal aseveración no fue hecha de buena fe. aplicables, se requiera que la cantidad mínima de una sus-
La denominación "USP-NF" puede usarse en la etiqueta tancia presente en un suplemento dietético sea mayor 9ue
de un artículo, siemr,re que dicha etiqueta también lleve el criterio de aceptación inferior permitido por la monogra-
una frase tal como 'Cumple con las normas NF publicadas
fía, el criterio de aceptación superior de la monografía
por la USP", indicando el compendio particular que corres-
ponde aplicar. puede incrementarse en una cantidad correspondiente.
Los criterios de aceptación especificados en las monogra-
Cuando se usan las siglas "USP", "NF", o "USP-NF" en la
etiqueta de un artículo para indicar que el artículo cumple fías individuales y en los capítulos generales para preparacio-
nes magistrales se basan en los atríbutos de calidad que se
7272 AdvertenciasGenerales USP42
espera podrían caracterizar un artículo preparado magistral- nes de Calidaddel Productopara FormasFarmacéuticasParen-
mente a partir de fármacos e ingredientes a granel de terales,PruebasEspecíficas, Vehículosy sustanciasagregadas,
acuerdo con los procedimientos establecidos o con los prin- Sustanciasagregadas.)
cipios reconocidos de buenas prácticas de preparación ma- En la preparación de ungüentos y supositorios, se pueden
gistral descritos en estos compendios. variar las proporciones de las sustancias que constituyen la
4.20. CapítulosGenerales base para mantener la consistencia adecuada en diferentes
A cada capítulo general se le asigna un número que apa- condiciones climáticas, siempre que no se varíe la concen-
rece entre paréntesis angulares junto al título (p.ej., Croma- tración de los fármacos y que no se afecte la biodisponibili-
tografía (621)). Los capítulos generales pueden contener lo dad, la eficacia terapéutica o la seguridad de la preparación.
siguiente: 5.20.20.1. En PreparacionesMagistrales
• Descripciones de pruebas y procedimientos para su apli- Las preparaciones magistrales para las que se proporciona
cación en monografías individuales, una composición completa deben contener únicamente los
• Descripciones y especificaciones de condiciones y prác- ingredientes indicados en las fórmulas, a menos que se ex-
ticas de preparacion magistral, ceptúe específicamente en este documento o en la mono-
• Información general para la interpretación de requisitos grafía individual. Se pueden presentar desviaciones en los
farmacopeicos, procesos especificados o en los métodos de preparación ma-
• Descripciones de prácticas generales de almacena- gistral, pero no en sus ingredientes o proporciones, siempre
miento farmacéutico, dispensación y envasado, o que la preparación final cumpla con las normas pertinentes
• Guías generales para fabricantes de sustancias oficiales o y se prepare siguiendo el proceso especificado.
productos oficiales. Cuando la monografía de una preparación magistral exige
Cuando una monografía hace referencia a un capítulo ge- una cantidad de un ingrediente expresada con respecto a la
neral, los criterios de aceptación pueden presentarse des- sustancia seca, no es necesario secar el ingrediente antes de
pués de dos puntos. utilizarlo, siempre que se tome debida cuenta del a9ua u
Algunos capítulos pueden servir como descripciones gene- otras sustancias volátiles presentes en la cantidad utilizada.
rales introductorias de una prueba o técnicas analíticas. Ade- Existen formulaciones de alcohol especialmente desnatura-
más, pueden hacer referencia a otros capítulos generales lizado que se usan de acuerdo con los estatutos y reglamen-
que contengan técnicas, detalles de los procedimientos y, taciones federales de la Interna! Revenue Service (Oficina de
en ocasiones, criterios de aceptación. Recaudación de Impuestos de los EE.UU.o IRS).Puede
5. COMPONENTESDE LASMONOGRAFÍAS usarse una formulación apropiada de alcohol especialmente
5.10. FórmulasMoleculares desnaturalizado en lugar de Alcohol en la fabricación de
Las fórmulas moleculares de las sustancias oficiales que se preparaciones farmacopeicas destinadas para uso interno o
usan en la definición del contenido requerido de un artículo para uso tópico, siempre que el desnaturalizante sea volátil
farmacopeico tienen por objeto designar las entidades quí- y no se quede en el producto terminado. Un producto ter-
micas, tal como aparecen en el nombre químico completo minado destinado a aplicación tópica sobre la piel puede
del artículo, con una pureza absoluta (100%). contener alcohol especialmente desnaturalizado, siempre
que el desnaturalizante sea un ingrediente normal en la pre-
5.20. SustanciasAgregadas paración o una sustancia agregada permitida; en ambos ca-
Las sustancias agregadas se presumen inadecuadas para sos, el desnaturalizante se debe identificar en la etiqueta de
su inclusión en un artículo oficial y por lo tanto quedan la preparación tópica. Cuando se indigue un proceso en la
prohibidas, si su presencia afecta negativamente la biodispo- monografía individual, toda preparacion elaborada magis-
nibilidad, la eficacia terapéutica o la seguridad del artículo tralmente con alcohol desnaturalizado debe ser idéntica a la
oficial; o interfieren con las pruebas y valoraciones prescritas que se obtiene mediante el proceso indicado en la
para determinar el cumplimiento de las normas farmacopei- monografía.
cas (ver 3.20 Indicaciónde Cumplimiento).
El aire contenido en el envase de un artículo oficial puede 5.20.20.2. En SuplementosDietéticos
extraerse o reemplazarse por dióxido de carbono, helio, ar- Pueden agregarse ingredientes adicionales a los productos
gón o nitrógeno, o una mezcla de estos gases, siempre que de suplementos dietéticos siempre que tales ingredientes:
sea apropiado. No es necesario declarar en el etiquetado el (1) cumplan con los requisitos reglamentarios aplicables y
uso de alguno de dichos gases. (2) no interfieran con las valoraciones y las pruebas prescri-
tas para determinar el cumplimiento de las normas
5.20.10. SustanciasAgregadasen SustanciasOficiales
farmacopeicas.
Las sustancias oficiales pueden contener únicamente las
sustancias agregadas específicas permitidas por la monogra- 5.30. Descripcióny Solubilidad
fía individual. Tales sustancias agregadas no deberán exce- Una prueba cuantitativa de solubilidad se considera una
der la cantidad re9uerida para lograr el efecto deseado. Si prueba de pureza, únicamente cuando se describe y designa
se permite tal adición, la etiqueta debe indicar los nombres como tal en una monografía.
y las cantidades de las sustancias agregadas. Una monografía puede incluir información relacionada
con la descripción del artículo. La información de "descrip-
5.20.20. SustanciasAgregadas(Excipientese ción y solubilidad" correspondiente a un artículo también
Ingredientes) en ProductosOficiales aparece en la tabla de referencia Descripcióny Solubilidad
A menos que se especifique algo diferente en la monogra- Relativade Artículosde la USPy del NF. La tabla de referencia
fía individual, pueden agregarse sustancias y excipientes indica solo las propiedades de los artículos que cumplen con
adecuados tales como agentes antimicrobianos, bases far- las normas de la monografía. La tabla de referencia está
macéuticas, transportadores, recubrimientos, saborizantes, destinada principalmente para aquéllos que usan, elaboran y
conservantes, estabilizantes y vehículos a un producto oficial dispensan fármacos y/o artículos relacionados. Aunque la in-
para mejorar su estabilidad, utilidad o apariencia, o para fa- formación proporcionada en las monografías y la informa-
cilitar su preparación. ción en la tabfa de referencia puede ayudar indirectamente
Se pueden emplear excipientes y sustancias agregadas ex- a la evaluación preliminar de un artículo, dicha información
clusivamente para impartir color a los productos oficiales, no constituye en sí misma una norma o prueba de pureza.
excepto para aquéllos destinados a la administración paren- La solubilidad aproximada de una sustancia farmacopeica
teral u oftálmica, siempre que cumplan con las reglamenta- se indica mediante uno de los siguientes términos
ciones de la FDApara el uso de colorantes y que sean ade- descriptivos:
cuadas en todos los otros aspectos. 0Jer también
MedicamentosInyectablesy en Implantes(1), PruebasComu-
Partes de Disolvente Reque- Además de las pruebas prescritas en la monografía indivi-

rldas para dual, se deben aplicar otras pruebas y criterios de acepta-
Término Descrlntlvo 1 Parte de Soluto ción adecuados para detectar y controlar impurezas que pu-
Muv soluble Menos de 1 dieran resultar de cambios en los métodos de
Fácilmente soluble De 1 a 10 procesamiento o que provengan de fuentes externas,
cuando su presencia no concuerde con las buenas prácticas
Soluble De 10 a 30
de fabricación o las buenas prácticas farmacéuticas
Moderadamente soluble De 30 a 100 aplicables.
Poco soluble De 100 a 1000
5.60.1 O. Otras Impurezasen los Artículosde la USPy el
Muv ooco soluble De 1000 a 10 000 NF
Prácticamente insoluble o lnsolu- Mayor que o igual a Cuando una monografía de los compendios USPo NF in-
ble 10 000 cluye una valoración o prueba de impurezas orgánicas cro-
matográfica, diferente de una prueba de disolventes resi-
5.40. Identificación duales, y el procedimiento de la monografía no detecta una
La prueba farmacopeica bajo el título Identificaciónse impureza presente en la sustancia, se deben expresar la can-
proporciona como una ayuda para verificar la identidad de tidad e identidad de la im) ureza, si se conocieran ambas,
los artículos según se indica, p.ej., en la eti9ueta de sus bajo el encabezado Otra(s lmpureza(s)en el etiquetado
envases, y para establecer si se trata del articulo nombrado (certificado de análisis) de la sustancia oficial.
en USP-NF.La prueba de Identificaciónpara un artículo en La presencia en una sustancia oficial de cualquier impu-
particular puede comprender uno o más procedimientos. reza no declarada en el etiquetado constituye una desvia-
Cuando se lleva a cabo una prueba farmacopeica de Identi- ción de la norma si el contenido es de O,1% o mayor. La
ficación,se deben cumplir todos los requisitos de todos los suma de las Otras Impurezascombinada con las impurezas
procedimientos especificados para satisfacer los requisitos de detectadas por los métodos de la monografía no puede ex-
la prueba. El incumplimiento de un artículo con los requisi- ceder del 2,0% (ver ImpurezasComunes(466)), a menos
tos de una prueba de Identificaciónprescrita (es decir, que que en la monografía se indique algo diferente.
no cumpla con los requisitos de todos los procedimientos Las siguientes categorías de fármacos quedan excluidos de
especificados que componen dicha prueba) indica que el los requisitos de Otras Impurezas:
artículo está rotulado incorrectamente y/o adulterado. • Productos de fermentación y derivados semisintéticos
5.50. Valoración obtenidos a partir de ellos,
Las pruebas de valoración para preparaciones ma9istrales • Radiofármacos,
no han sido concebidas para evaluar una preparacion ma- • Productos biológicos,
gistral antes de su dispensación, sino como pruebas oficiales • Productos obtenidos por biotecnología,
para casos en los que exista duda o controversia acerca de • Péptidos,
la conformidad de la preparación con las normas oficiales. • Productos botánicos y
5.50.10. Unidadesde Potencia(Biológica) • Productos crudos de origen animal o vegetal.
Para las sustancias que no pueden ser caracterizadas com- No debe incluirse ninguna sustancia conocida como tó-
pletamente por medios químicos o físicos, o que requieren xica en Otras Impurezas.
la confirmación de la funcionalidad o de una estructura ter- 5.60.20. DisolventesResidualesen los Artículosde la USP
ciaria, puede ser necesario expresar las cantidades de activi- yel NF
dad biológica en unidades de potencia biológica, definidas Todos los artículos de los compendios USPy NF están su-
por un estándar de referencia designado como patrón ofi- jetos al control pertinente de disolventes residuales, incluso
cial. Para casos en los que los materiales de referencia se cuando la prueba no esté indicada en la monografía indivi-
han discontinuado, las unidades internacionales de potencia dual. Los disolventes que se empleen durante los procesos
pueden definirse en términos de masa molecular, como en de fabricación deben ser de calidad adecuada. Asimismo, se
el caso de las vitaminas A, D y E. debe tomar en consideración la toxicidad y el nivel residual
Cuando se encuentran disponibles, los Estándares Biológi- de cada disolvente y limitar los disolventes conforme a los
cos Internacionales de la Organización Mundial de la Salud principios definidos y los requisitos especificados en Disol-
(OMS) definen las Unidades Internacionales (UI). Las mono- ventesResiduales (467), según los métodos generales indica-
grafías de la USPhacen referencia a las unidades asignadas dos en dicho capítulo u otros métodos adecuados.
por los Estándares de Referencia USP directamente como 5.60.30. ImpurezasElementalesen Medicamentosy
Unidades Internacionales (UI) o como "Unidades USP". Para SuplementosDietéticosUSP
al9unos productos biológicos, las unidades de potencia se Las impurezas elementales se controlan en los medica-
asignan en comparación con el correspondiente Estándar de mentos oficiales de acuerdo con los principios definidos y
los Estados Unidos de América (U.S. Standard) establecido los requisitos especificados en ImpurezasElementales-Límites
por la FDA(ver ProductosBiológicos(1041 )), existan o no (232). Los contaminantes elementales en suplementos die-
Unidades Internacionales o Unidades USP definidas. Se debe téticos oficiales se controlan de acuerdo con los principios
tener en cuenta que para el etiquetado relacionado con el definidos y los requisitos especificados en ContaminantesEle-
producto, r,.ej., en envases, no se requiere utilizar la frase mentalesen SuplementosDietéticos(2232).
completa 'Unidades USP de [nombre del producto]" que 5.70. Pruebasde Desempeño
aparece en muchas monografías de la USPen la sección de Cuando las determinaciones de uniformidad de contenido
etiquetado. El término "Unidades USP" se puede utilizar en se hayan efectuado usando la misma metodología analítica
el etiquetado del producto de conformidad con los requisi- especificada en la Valoración,tomando debida cuenta de las
tos farmacopeicos de la USP, siempre y cuando quede claro diferencias en la preparación de la muestra, el promedio de
que, basándose en el contexto, la potencia se declara en todas las determinaciones individuales de uniformidad de
términos de Unidades USP de [nombre del producto]. En contenido puede usarse como el resultado de la Valoración.
dichos casos, debe quedar claro que "Unidades USP" y
"Unidades USP de [nombre del producto]" comparten el 5.80. Estándaresde ReferenciaUSP
mismo significado. Los Estándares de Referencia USP son materiales auténti-
cos que han sido aprobados como adecuados para su uso
5.60. Impurezasy SustanciasExtrañas como estándares de comparación en las pruebas y valora-
Las pruebas para determinar la presencia de sustancias ex- ciones de la USPo el NF. 0/er Estándaresde ReferenciaUSP
trañas e impurezas se establecen para limitarlas a cantidades (11).) Cuando una rrueba o valoración de los compendios
que no sean objetables en las condiciones normales de em- USPo NF indique e uso de un Estándar de Referencia USP,
pleo del artículo (ver también Impurezasen Fármacosy Pro- solo se considerarán concluyentes los resultados obtenidos
ductos Farmacéuticos (1086)). usando el Estándar de Referencia USP especificado. Cuando
un procedimiento exija el uso de un artículo farmacopeico y siempre que la monografía indique una prueba para Pérdida
no de un Estándar de Referencia USP como material de refe- por Secado,Determinaciónde Agua o Pérdidapor Incineración,
rencia, se debe utilizar una sustancia que satisfaga todos los respectivamente. Cuando la presencia de humedad u otro
requisitos indicados para dicho artículo en la monografía ofi- material volátil puede interferir con el procedimiento, la mo-
cial. Si alguna norma nueva de la USPo del NF requiere el nografía individual especifica que es necesario secar la sus-
uso de un Estándar de Referencia USP nuevo que aún no tancia con anterioridad, paso que es obligatorio.
esté disponible, dicha parte de la norma que contiene el La expresión "exenta de disolventes" significa que se de-
requisito no será oficial hasta que el material de referencia ben corregir los cálculos por la presencia de disolventes co-
USP especificado esté disponible. nocidos, según se determinan usando los métodos descritos
Salvo que la etiqueta del estándar de referencia indique en el capítulo (467), a menos que la monografía propor-
una potencia o contenido específicos, se asume que el es- cione una prueba de límite de disolventes orgánicos.
tándar de referencia tiene una pureza del 100,0% para la La expresión "previamente secada(o)" sin otro calificativo
ªf licación oficial. A menos que se indique algo diferente en
e procedimiento de la monografía individuar o en un capí-
si9nifica que la sustancia se debe secar según se indica en
Perdidapor Secado(731) o Determinaciónde Agua (921) (de-
tulo general, los Estándares de Referencia USP deben usarse terminación gravimétrica).
de acuerdo con las instrucciones de sus etiquetas. Cuando se indique secar al vacío sobre un desecante, se
6. PRÁCTICASY PROCEDIMIENTOSDE PRUEBA debe utilizar un desecador al vacío, una pistola para secado
6.10. PrácticasSegurasde Laboratorio al vacío u otro instrumento apropiado para secado al vacío.
Al realizar procedimientos farmacopeicos, se deben se9uir 6.40.10. Incinerar hasta PesoConstante
prácticas seguras de laboratorio, las cuales incluyen medidas "Incinerar hasta peso constante" significa que deberá con-
precautorias, equipo de protección y prácticas de trabajo tinuarse la incineración a 800 ± 25º, a menos que se indique
acordes a las sustancias químicas y procedimientos usados. algo diferente, hasta que dos pesadas consecutivas, la se-
Antes de realizar cualquier procedimiento descrito en los gunda de las cuales se realiza después de un periodo adicio-
compendios, el analista debería conocer los peligros asocia- nal acorde con la naturaleza y cantidad del residuo, no difie-
dos con las sustancias químicas y las técnicas y medios de ran en más de 0,50 mg por g de sustancia tomada.
protección contra dichos riesgos. Estos compendios no tie- 6.40.20. Secadohasta PesoConstante
nen como objetivo describir tales peligros o medidas de "Secado hasta peso constante" significa que deberá conti-
protección. nuarse el secado hasta que dos pesadas consecutivas, la se-
6.20. ProcedimientosAutomatizados gunda de las cuales se realiza después de un periodo adicio-
Los procedimientos automatizados y manuales que em- nal de secado acorde con la naturaleza y cantidad del
plean los mismos fundamentos químicos se consideran equi- residuo, no difieran en más de 0,50 mg por g de sustancia
valentes siempre y cuando el sistema automatizado sea cali- tomada.
ficado apropiadamente como adecuado para ejecutar el 6.50. Preparaciónde Soluciones
método manual farmacopeico y el procedimiento analítico 6.50.1O. Filtración
sea verificado en las condiciones del equipamiento nuevo. Cuando en un procedimiento se indica "filtrar'' sin otro
6.30. Métodos y ProcedimientosAlternativosy calificativo, el líquido se debe pasar a través de un papel de
Armonizados filtro adecuado o dispositivo equivalente hasta que el fil-
Se define como método o procedimiento alternativo a trado sea transparente. Dados los posibles efectos del filtro,
cualquier método o procedimiento diferente al método o se pueden desechar los volúmenes iniciales del filtrado.
procedimiento farmacopeico para el artículo en cuestión. El 6.50.20. Soluciones
método o procedimiento alternativo debe ser validado por A menos que se especifique de otro modo, todas las solu-
completo (ver Validaciónde Procedimientos Farmacopeicos ciones deben prepararse con Agua Purificada. Las soluciones
(1225)) y debe producir resultados comparables a los que se para mediciones cuantitativas deben prepararse usando ana-
obtienen con el método o procedimiento farmacopeico, litos medidos o pesados con exactitud (ver la sección 8.20
dentro de los límites establecidos para cada caso. Los méto- Aproximadamente).
dos o procedimientos alternativos se pueden desarrollar P.ºr Una expresión tal como "(1 en 1O)" significa que 1 parte
una variedad de razones, que incluyen entre otras, simplifi- en volumende un líquido debe diluirse con, o que 1 parte
car la preparación de muestra, mejorar la precisión y la en peso de un sólido debe disolverse en, una cantidad sufi-
exactitud, acortar el tiempo de corrida, o adaptar mejor a la ciente de diluyente o disolvente para que el volumen de la
automatización que el metodo o procedimiento farmaco- solución final sea de 1O partes medidas en volumen.Por
peico. Solamente aquellos resultados obtenidos por los mé- ejemplo, una solución 1 en 1O se prepara diluyendo 1 ml
todos y procedimientos suministrados en los compendios se- de un líquido o disolviendo 1 g de un sólido, en disolvente
rán concluyentes. suficiente para obtener 1O ml de solución. Expresiones simi-
Para evaluar métodos y procedimientos alternativos como lares a "(20:5:2)" significan que los números respectivos de
reemplazos o agregados potenciales a la norma, estos se partes, medidas en volumen, de los líquidos señalados de-
deberían remitir a la USP (ver la sección 4.1O. Monografías). ben mezclarse, a menos que se indique algo diferente.
En ciertos capítulos generales se indica que el texto en
cuestión está armonizado con el texto correspondiente de la 6.50.20.1. Ajuste de Soluciones
FarmacopeaEuropeay/o la Farmacopea Cuando un procedimiento exige una concentración espe-
Japonesay que estos cífica, se puede usar una solución con otra normalidad o
textos son intercambiables. Por ello, si el cumplimiento de
un requisito de una sustancia o preparación fuera determi- molaridad, siempre que se tenga en cuenta la diferencia en
nado usando un método intercambiable de una estas farma- la concentración y no se aumente el error de la medición.
copeas, también debería cumplir los requisitos de la USP-NF. En las pruebas y valoraciones se pueden tomar cantidades
Sin embar90, si apareciera una diferencia, o en el caso de proporcionalmente mayores o menores que las especificadas
controversia, solo el resultado obtenido mediante el procedi- de las sustancias a analizar y los correspondientes Estándares
miento y/o método dado en la USPserá concluyente. de Referencia, siempre y cuando las mediciones produzcan
una exactitud equivalente o mejor.
6.40. Con Respectoa la SustanciaSeca,Anhidra, A menos que se indique algo diferente, las concentracio-
Incineradao Exenta de Disolventes nes de analitos deben prepararse de modo que queden den-
A menos que se especifique algo diferente, todos los cál- tro del diez por ciento (10%) del valor indicado. En el caso
culos se efectúan con respecto a la sustancia "tal como se de que un procedimiento se adapte al intervalo de trabajo
encuentra". de un instrumento, las concentraciones de las soluciones
Se pueden realizar los procedimientos de las pruebas so- pueden diferir del valor indicado en más de diez por ciento
bre la sustancia sin secar o sin incinerar y calcular los resul- (10%), realizando los cambios apropiados en los cálculos
tados con respecto a la sustancia seca, anhidra o incinerada,
asociados. Todo cambio realizado debe quedar dentro del 6.80.10.1. Pipeta
intervalo validado del instrumento. Cuando se especifica el uso de una pipeta, ésta se puede
Cuando se indica el ajuste del pH mediante un ácido o sustituir por una bureta adecuada. Cuando se indica el uso
base y no se indica la concentración, se pueden usar con- de una pipeta calibrada "para contener'', ésta se puede sus-
centraciones apropiadas de dicho ácido o base. tituir por un matraz volumétrico adecuado.
6.50.20.2. SolucionesReactivo 6.80.10.2. Proteccióncontra la Luz
La información acerca de las Soluciones Reactivo (SR) se Cuando se indique el uso de recipientes con protección
encuentra en el apartado SolucionesReactivoen la sección actínica o resistentes a la luz, se pueden utilizar recipientes
Reactivos,Indicadoresy Solucionesde los compendios especialmente tratados para proteger el contenido contra la
USP-NF.El uso de una Solución Reactivo alternativa o cam- luz, o recipientes transparentes que se hayan recubierto o
bios en la Solución Reactivo utilizada puede requerir de envuelto adecuadamente para volverlos opacos.
validación. 6.80.20. Instrumentos
6.50.20.3. SolucionesIndicadoras Es posible sustituir el instrumento especificado por otro
Cuando se especifica el uso de una SR indicadora en un instrumento siempre que el instrumento sustituto se base en
procedimiento, se deben agregar aproximadamente 0,2 mL los mismos principios fundamentales de operación y tenga
ó 3 gotas de dicha solución, a menos que se indique algo una sensibilidad y exactitud equivalente o mayor; tales ca-
diferente. racterísticas se deben calificar como apropiadas. Si se men-
6.60. UnidadesNecesariaspara Completar una Prueba cionara una marca o un proveedor de un material, un ins-
A menos que se especifique algo diferente, se debe tomar trumento o una pieza de equipo, o el nombre y la dirección
un número suficiente de unidades para asegurar un resul- de un fabricante o distribuidor (por lo general pueden apa-
tado analítico adecuado. recer como notas al pie de página), esta información se
6.60.1O. Tabletas brinda solo por conveniencia y no implica aprobación, aval
Cuando en el procedimiento de una monografía de Table- o certificacion.
tas se indica pesar y reducir a polvo fino no menos de un 6.80.20.1. Columnasy Tubos Cromatográficos
cierto número de Tabletas, se entiende que se debe pesar y El término "diámetro" se refiere al diámetro interno (DI).
reducir a polvo un número contado de Tabletas. La porción 6.80.20.2. Otros Tipos de Tubosy Tuberías
tomada de Tabletas reducidas a polvo debe ser representa- El término "diámetro" se refiere al diámetro externo (DE).
tiva del total de Tabletas y pesada con exactitud. 6.80.20.3. Baño de Varor
6.60.20. Cápsulas Cuando se indique e uso de un baño de vapor, se usa
Cuando en el procedimiento de una monografía de Cáp- vapor vivo fluente u otra fuente de calor regulado a una
sulas se indique vaciar, tanto como sea posibíe, el contenido temperatura equivalente.
de no menos de cierto número de Cápsulas, se entiende 6.80.20.4. Baño de Agua
que se debe abrir cuidadosamente un número contado de A menos que se especifique algo diferente, un baño de
Cápsulas y se debe retirar cuantitativamente, combinar, agua requiere agua en ebullición vigorosa.
mezclar y pesar con exactitud el contenido de las mismas. 6.80.30. Dispositivosde Medición de Temperatura
La porcion tomada del contenido mezclado de las Cápsulas Los dispositivos de medición de temperatura adecuados
debe ser representativo del contenido total de las Cápsulas y para las pruebas farmacopeicas cumplen con especificacio-
pesado con exactitud. nes que son rastreables a un estándar del National lnstitute
6.70. Reactivos of Standards and Technology (Instituto Nacional de Normas
La ejecución adecuada de las pruebas y valoraciones far- y Tecnología de los EE.UU.o NIST) o equivalente. Los dispo-
macopeicas y la confiabilidad de los resultados dependen, sitivos de medición de temperatura pueden ser del tipo li-
en parte, de la calidad de los reactivos utilizados en estos quido en vidrio o un tipo de indicador de temperatura aná-
procedimientos. A menos que se especifique algo diferente, logo o digital, tal como un dispositivo de temperatura con
se deben usar reactivos que cumplan con lo establecido en resistencia, termistor o termopar. La estandarización de ter-
las especificaciones de la edición vigente de ReagentChemi- mómetros se lleva a cabo con una frecuencia de análisis
cals publicada por la American Chemical Society (ACS). establecida con una temperatura estándar rastreable al NIST.
Cuando tales especificaciones no existan o cuando por dis- Por ejemplo, se puede consultar la edición vigente de las
tintas razones la pureza re9uerida de un reactivo fuera dife- normas El de la American Societr of Testing of Materials
rente, se suministran especificaciones farmacopeicas de reac- (Sociedad Estadounidense para e Análisis de Materiales o
tivos de calidad aceptable (ver la sección Reactivos, ASTM)para termómetros de líquido en vidrio.
Indicadoresy Solucionesen USP-NF).Los reactivos no trata-
7. RESULTADOS DE PRUEBAS
dos por ninguna de estas especificaciones deben ser de
grado adecuado para la realización del método de valora- 7.10. Interpretación de los Requisitos
ción o prueba en cuestión. Los resultados analíticos observados en el laboratorio (o
La inclusión en los compendios de estos reactivos, indica- los calculados a través de determinaciones experimentales)
dores y soluciones empleadas como reactivos, no implica se comparan con los criterios de aceptación especificados
que tales sustancias tengan utilidad terapéutica. Cualquier para deter~inar si el artículo cumple con los requisitos
referencia a la USPo el NF en sus etiquetados debe incluir farmacope1cos.
también el término "reactivo" o "grado reactivo". La USP El valor de informe, que por lo general se obtiene combi-
puede proveer reactivos en caso de que no se encuentren nando valores de varias determinaciones individuales, se
comercialmente disponibles. compara con los criterios de aceptación. El valor de informe
6.80. Equipo
es el resultado final de un procedimiento completo de medi-
ción, según se ha documentado.
A menos que se indique algo diferente, la especificación
de un tamaño o tipo definido de recipiente o de aparato es Cuando los criterios de aceptación se expresan de forma
solo una recomendación. Es posible usar otras dimensiones numérica en estas Advertencias Generales mediante la espe-
o tipos siempre que sean adecuados para el uso pretendido. cificación de un límite superior y/o inferior, los valores per-
mitidos incluyen los valores especificados, pero no los valo-
6.80.1O. Aparatos de Medición res fuera del límite o límites. Los criterios de aceptación se
Cuando se indique el uso de matraces volumétricos u consideran significativos hasta el último dígito señalado.
otros dispositivos para medir, pesar o clasificar en forma
7.10.5. ConcentracionesNominalesen Ecuaciones
exacta, se deben emplear estos equipos u otros que posean, Cuando se especifica una "concentración nominal", calcu-
al menos, una exactitud equivalente.
lar la concentración basándose en la cantidad declarada en
la etiqueta. En los procedimientos de valoración, la corree-
ción por contenido de agua típicamente se indica en la De- ciento). Cuando un procedimiento exige alcohol deshidra-
finiciony en la etiqueta del Estándarde ReferenciaUSP.Para tado, alcohol absoluto o alcohol anhidro, se debe usar el
otros procedimientos, la corrección por contenido y/o po- artículo de la monografíaAlcoholDeshidratadode la USP.
tencia valorados se realizaantes de usar la concentracion en 8.40. PesosAtómicos
la ecuación provista en la monografía. Los pesos atómicos usados para calcular pesos molecu-
7.10.1O. Equivalenciaen ProcedimientosVolumétricos lares y los factores en las valoracionesy en otras partes
Lasinstruccionesde los procedimientosvolumétricoscon- donde éstos aparezcan, son los establecidos por la IUPAC
cluyen con una declaración de equivalenciaentre el peso Commissionon lsotopic Abundances and AtomicWeights
def analito y cada mL de soluciónvolumétrica normalizada. (Comisiónde AbundanciasIsotópicasy PesosAtómicosde la
En tales equivalencias,se entenderá que el número de cifras Unión Internacionalde Química Pura y Aplicada).
significativasen la concentración de la soluciónvolumétrica 8.50. Determinacionescon Blancos
corresponde al del número de cifrassignificativasen el peso Cuando se indique realizar"cualquier corrección necesa-
del analito. Siempre que corresponda, se deben hacer co- ria" por medio de una determinacion con un blanco, tal
rreccionesen todas las valoracionesvolumétricasbasándose determinación debe efectuarse usando las mismas cantida-
en la determinación con un blanco (ver Volumetría(541 )). des de los mismos reactivostratados de la misma manera
7.20. Reglaspara Redondeo que la solución o mezcla que contiene la porción de sustan-
Losvalores observados o calculadosdeben redondearse al cia que se va a analizar o valorar, pero omitiendo dicha
mismo número de decimales que el expresado para el lí- sustancia.
mite. No deberá efectuarse el redondeo antes de concluir 8.60. Concomitantemente
los cálculoscorrespondientes para obtener el valor de in- Eltérmino "concomitantemente" indica que las determi-
forme. Los cálculosintermedios (p.ej., la pendiente de la naciones o mediciones deben efectuarse en sucesión
curva de linealidad)pueden redondearse para propósitos de inmediata.
informe, pero si se requiere realizarcálculosadicionalesse
deben utilizarlos valores originalessin redondear. Los crite- 8.70. Desecador
rios de aceptación son números fijosy no se redondean. La instrucción"en un desecador" indica el uso de un reci-
Cuando se requiere redondear una cifra, se considera so- piente cerrado herméticamente, de tamaño y diseño ade-
lamente el dígito que se encuentra a la derecha del último cuados, que mantiene una atmósfera de bajo contenido de
lugar decimal en la expresión del límite. Si este dígito es humedad mediante un desecante adecuado, por ejemplo,
menor de 5, se elimina sin cambiar el dígito que lo precede. cloruro de calcio anhidro, perclorato de magnesio, pentó-
Si este dígito es igual o mayor a 5, se eliminay el d1gito xido de fósforo o gel de sílice.Vertambién Taseccion 8.220
que lo precede se aumenta en 1. Desecadoral Vacío.
8. TÉRMINOSY DEFINICIONES 8.80. Logaritmos
Los logaritmosempleados son logaritmosen base 1O.
8.10. Abreviaturas
• ERcorresponde a un Estándarde ReferenciaUSP. 8.90. CepasMicrobianas
• SC corresponde a una SoluciónCalorimétrica. Cuando se cita e identificauna cepa microbiana por el
• SRcorresponde a una SoluciónReactivo. número de catálogo de la AmericanType Culture Collection
• SV corresponde a una SoluciónVolumétricaestandari- (ColecciónEstadounidensede Cultivosde Referenciao
zada de conformidad con las instruccionesprovistasen ATCC),la cepa específicadebe emplearse directamente o, si
la monografía individualo en la sección Reactivos,Indi- se hacen cultivossucesivos,no deben usarse más de cinco
cadoresy Solucionesde USP-NF. pasajes a partir de la cepa original.
8.20. Aproximadamente 8.100. Inapreciable
Eltérmino "aproximadamente" indica una cantidad que Eltérmino "inapreciable" indica una cantidad que no ex-
puede variar dentro del 10%. cede de 0,50 mg.
Si se especificauna medición como "medida con exacti- 8.110. No menos de (NLT) y No más de (NMT)
tud" o "pesada con exactitud" se deben seguir las especifi- Lassiglasen inglés "NLT"(not less than) significany se
caciones de los capítulos generales AparatosVolumétncos traducen como "no menos de". Lassiglasen in~lés "NMT"
(31) y Balanzas(41), respectivamente. (not more than) significany se traducen como 'no más
8.30. Contenido de Alcohol de".
Los porcentajes de alcohol, como los indicados en Conte- 8.120. Olor
nido de Alcohol,son porcentajes en volumen de C2HsOHa Lostérminos "inodoro", "prácticamente inodoro", "un
15,56°. Cuando se exige el uso de alcohol, alcohol etílico o débil olor característico"y expresionessemejantes, indican
etanol en una fórmula, prueba o valoración,se debe usar el la evaluaciónde una cantidad adecuada de material recien-
artículo de la monograf1aAlcoholde la USP.Cuando se hace temente abierto después de la exposiciónal aire durante 15
referenciaa "C2HsOH",significaetanol absoluto (100 por minutos. La asignación de un olor es solo descriptivay no
Ejemplos de Redondeo de Valores Numéricos

oara Comoaraclón con los Reaulsltos
Reoulslto Farmacooelco Valor Sin Redondear Resultado Redondeado Cumole
Límite de valoración ~98,0% 97,96% 98,0% Sí
97,92% 97,9% No
9795% 980% Sí
Límite de valoración :S:101,5% 101,55% 101,6% No
101,46% 101,5% Sí
10145% 1015% Sí
Prueba de límite :S:0,02% 0,025% 0,03% No
0,015% 0,02% Sí
0027% O 03% No
Prueba de límite :S:3ppm 3,5 ppm 4 ppm No
3,4 ppm 3 ppm Sí
2,5 ppm 3 ppm Sí
deberá considerarsecomo una norma de pureza para un reglamentacionespara agua potable de la Unión Europea o
lote particular de un artículo. de Japón, o en las Guías para la Calidad del Agua Potable
8.130. Por ciento de la OrganizaciónMundial de la Salud. Las monografías
La expresión "por ciento" usada sin otros calificativos pueden requerir especificacionesadicionales.
significa: 8.230.30. Agua en un Procedimiento Farmacopeico
• Porcentajede peso en peso, para mezclas de sólidosy Cuando se exige agua en un procedimiento farmaco-
semisólidos; peico, se entiende que debe emplearse el artículo Agua Puri-
• Porcentajede peso en volumen, para solucioneso sus- ficada de la monografía USP,a menos que se especifique
pensiones de sólidos en líquidos; algo diferente. Se proveen definicionespara otros tipos de
• Porcentaje de volumen en volumen, para solucionesde agua en la sección Reactivos,Indicadoresy Solucionesy en el
líquidosen líquidos;y capítulo Agua para Uso Farmacéutico(1231 }.
• Porcentaje de peso en volumen, para solucionesde 8.240. Pesosy Medidas
gases en líquidos. En general, se emplea el Sistema Internacionalde Unida-
Por ejemplo, una solución al 1 por ciento se prepara disol- des (SI) para pesos y medidas, de acuerdo con lo estable-
viendo 1 g de un sólido o semisólido,o 1 mL de un líquido, cido y revisado por la Conférencegénéra/edespoids et mesu-
en disolvente suficientepara obtener 100 mL de solución. res (ConferenciaGeneral de Pesos y Medidas). Para los
8.140. Concentraciones Porcentuales propósitos farmacopeicos,el término "peso" se considera si-
Las concentraciones porcentuales se expresan según se in- nónimo de "masa".
dica a continuación: La molalidad se representa por medio del símbolo m pre-
• Porcentajede Pesoen Peso(p/p) se define como el nú- cedido por un número que es el número de moles de soluto
mero de g de un soluto en 100 g de solución. contenidos en 1 kilogramodel disolvente desi9nado.
• Porcentajede Pesoen Volumen(p/v) se define como el La molaridad se representa por medio del s1mboloM pre-
número de g de un soluto en 100 mL de solución. cedido por un número que es el número de moles del so-
• Porcentajede Volumenen Volumen(v/v) se define como luto designado contenidos en una cantidad del disolvente
el número de mL de un soluto en 100 mL de solución. designado suficiente para preparar 1 litro de solución.
8.1 SO. Presión La normalidad se representa por medio del símbolo N
La presión se determina usando un manómetro o baró- precedido por un número que es el número de equivalentes
metro adecuado, calibrado en términos de la presión ejer- de soluto contenidos en una cantidad de disolventesufi-
cida por una columna de mercurio de la altura indicada. ciente para preparar 1 litro de solución.
8.160. Tiempo de Reacción Elsímbolo para grados (º) sin una unidad de medición
Eltiempo de reacción es de S minutos a menos que se calificadorarepresenta los grados centígrados (Celsius).
especifiquealgo diferente. Listadode Símbolosy Prefijoscomúnmente usados para
unidades métricas del SI y otras unidades:
8.170. Peso Específico
El Peso específicoes el peso de una sustancia en aire a
25° dividido por el peso de un volumen igual de agua a la Unidades Símbolo Comentarlos
misma temperatura. lonaitud
8.180. Temperaturas metro m
A menos que se indique algo diferente, las temperaturas centímetro cm
se expresan en grados centígrados (Celsius)y todas las me- milímetro mm
diciones se hacen a 25°. Cuando se especificacalor mode- Anteriormentereferido
rado, se indica toda temperatura no mayor de 45º (113º F). micrómetro 11m como micrón
8.190. Tiempo Anteriormentese usaba
A menos que se especifiquealgo diferente, las reglas para el símbolo mµ (para
redondeo, según se describen en la sección 7.20 Reglaspara nanómetro nm milimicrón)
Redondeo,se aplican a todos los tiempos especificados. Ánastriim Á laual a O 1 nm
8.200. Transferir Masa
Eltérmino "transferir" indica una manipulación
cuantitativa. kiloaramo ka
aramo a
8.210. Vacío
Eltérmino al "vacío" especificala exposicióna una pre- milinramo m□
sión menor de 20 mm de mercurio (2,67 kPas),a menos Elsímbolo µg se usa en

que se indique algo diferente. la USPy el NF para re-
8.220. Desecador al Vacío presentar microgra-
Un "desecador al vacío" es un desecador que mantiene mos, pero los
una atmósfera de baja humedad a una presion reducida de microgramosse pue-
no más de 20 mm de mercurio (2,67 kPas)o a la presión den representar como
indicada en la monografía individual. "mcg" para propósi-
tos de etiquetado y
8.230. Agua
prescripción.Eltérmi-
8.230.10. Agua como Ingrediente de un Producto Oficial no "gamma", simboli-
Cuando aparece como un ingrediente en un producto ofi- zado por la letra
cial, el agua cumple con los requisitosde la monografía de griega y, se usa con
agua adecuada en la USPo el NF. frecuencia para desig-
8.230.20. Agua en la Fabricación de Sustancias Oficiales nar el microgramo en
En la fabricación de sustancias oficiales,el agua usada microgra- la literaturade bioquí-
debe cumplir con los requisitos para agua potable estableci- mo ua mica.
dos en las National PrimaryDrinkingWater Regulations(Re- nanoaramo na
glamentaciones PrimariasNacionalespara Agua Potable) de oicoaramo
fa U.S. EnvironmentalProtection Agency (Agenciade Protec- ºª
ción Ambientalde los EstadosUnidos de América)o en las
Unidades Símbolo Comentarlos Unidades Símbolo Comentarlos

También referido como hercio Hz Unidad de frecuencia
la unidad de masa kilohercio kHz
atómica unificaday es meaahercio MHz
igual a 1/12 veces la
masa de un átomo no electronvol-
tio eV
enlazado de carbono
dalton Da 12. kiloelec-
kilodalton kDa tronvoltio keV
Tiemoo megaelec-
tronvoltio MeV
secundo s
Radiación
minuto min
Unidad del SI para la
hora h
actividad de radionu-
Volumen becauerelio Ba cleidos
1 Les igual a 1000 kilobecque-
cm3 ( centímetros cú- relio kBa
litro L bicos) megabec-
decilitro dl auerelio MBa
1 ml es igual a 1 cm', gigabec-
en ocasionesse deno- auerelio GBa
mililitro ml mina ce.
Unidad para la activi-
microlitro ul dad de radionucleidos
Tempera- que no forma parte
tura curio Ci del SI
Celsius ºC milicurio mCi
Cantidad microcurio uCi
de Sus- nanocurio nCi
tanda
Otros
Históricamentereferido aceleración
como peso molecular debida a Usada para expresar la
en gramos o peso la grave- velocidad de centrifu-
mol mol atómico en aramos dad a aación
milimol mmol revolucio- Usada para expresar la
micromol umol nes por velocidad de centrifu-
femtomol fmol minuto mm aación
También referidocomo
peso equivalenteen
gramos. Se usa en el Prefijos Seleccionados del SI
cálculo de concentra-
Nombre Símbolo Factor
ción de sustancia en
unidades de normali- aiaa G 109
dad. Estaunidad ac- meaa M 106
tualmente ya no kilo k 103
representa la de uso deci d 10-1
preferido en química centi c 10-2
eauivalente Ea analíticao metroloaía.
mili m ]Q-l
miliequiva-
lente mEa micro u 10-•
Presiónosmótica de
nano n 1o-•
una solución, relacio- oico D 10-12
nada con la concen- femto f 10-1s
tración de una
osmol Osmol sustancia 9. PRESCRIPCIÓN Y DISPENSACIÓN
miliosmol mOsmol 9.10. Uso de UnidadesMétricas
Presión Las prescripciones de artículos farmacopeicos se escribirán
oascal Pa usando unidades métricas para indicar la cantidad y/o con-
tenido deseados, a menos que se indique algo diferente en
kilooascal kPa la monografía individual [ver también la anterior sección
libras por 5.50.1O. Unidadesde Potencia(Biológica)].Si la prescripción
pulgada de una cantidad se hace en otro sistema de medición, se
cuadrada osi debe dispensar solo una cantidad equivalente a la prescrita
milímetro usando el sistema métrico. No se deben usar las abreviatu-
de mer- ras para los términos "Unidades" o "Unidades Internaciona-
curio mmHa laual a 133 322 Pa les" para fines de etiquetado o prescripción. No se deben
Unidades usar unidades del sistema apotecario en el etiquetado.
eléctricas 9.20. Cambiosen Volumen
amoerio A En la dispensación de medicaciones prescritas, pueden ob-
voltio V viarse los pequeños cambios de volumen que se producen
milivoltio mV debido a variaciones en la temperatura ambiente.
10. CONSERVACIÓN,ENVASADO,ALMACENAMIENTOY 10.20. Etiquetado

ETIQUETADO Todos los artículos en la USPo el NF están sujetos a los
10.10. Envasadoy Almacenamiento requisitos de etiquetado especificados en el capítulo (7), a
Todos los artículos en los compendios USPo NF están menos que se provean requisitos diferentes en una mono-
sujetos a los requisitos de envasado y almacenamiento espe- grafía individual.
cificados en el capítulo general Requisitosde Envasadoy Al-
macenamiento(659), a menos que se provean requisitos dis-
tintos en una monografía individual.
USP42 Guíapara los CapítulosGenerales7281
Guía para los Capítulos

Generales
(Para obtener la lista alfabética completa de los capítulos generales de esta Farmacopea, consulte "Capítulos Generales" en el
índice.)
PRUEBASY VALORACIONESGENERALES (90) Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y

Pruebas de Funcionalidad ............... 6538
(91) Valoración de Pantotenato de Calcio ........ 6542
(92) Factores de Crecimiento y Citokinas Usados en la
Requisitos Generales para Fabricación de Productos de Terapia Celular .....
Pruebas y Valoraciones ..................................... 6546
(111) Diseño y_Análisis de Valoraciones Biológicas .. 6550
(1) Medicamentos Inyectables y en Implantes (115) Valoración de Dexpantenol .............. 6554
(Parenterales)-Pruebas de Calidad (121) Valoración de Insulina ................. 6555
del Producto ........................ 6405 (121.1) Procedimientos Analíticos Fisicoquímicos
(2) Medicamentos Orales-Pruebas de Calidad del para Insulinas ....................... 6558
Producto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6411 (123) Pruebas de Identidad Biológica de Glucagón .... .
(3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas ..................................... 6561
de Calidad del Producto . . . . . . . . . . . . . . . . 641 7 (124) Valoraciones Biológicas de Eritropoyetina .... 6566
(4) Medicamentos para Mucosas-Pruebas de (126) Pruebas de Identidad Biológica de
Calidad del Producto .................. 6426 Somatropina ........................ 6568
(5) Medicamentos Nasalesy para Inhalación- (127) Recuento de Células CD34+ por
Información General y Pruebas de Calidad Citometría de Flujo ................... 6570
del Producto ........................ 6430 (129) Procedimientos Analíticos para Anticuerpos Mono-
(7) Etiquetado ........................... 6439 clonales Recombinantes de Uso Terapéutico .. 6575
(11) Estándares de Referencia USP . . . . . . . . . . . . . 6448 (130) Atributos de Calidad de la Proteína A ...... 6582
(151) Prueba de Piró~enos .................. 6590
Aparatos para Pruebas y Valoraciones (161) Dispositivos Medicas-Pruebas de Endotoxinas
Bacterianas y Pirógenos ................ 6592
(17) Etiquetado de Envasesde Medicamentos (162) Prueba de Potencia Antitoxina Diftérica en
de Venta Bajo Receta .................. 6451 lnmunoglobulinas Humanas ............. 6595
(31) Aparatos Volumétricos .................. 6454 (165) Activador de Precalicreína .............. 6597
(41) Balanzas ............................ 6455 (171) Valoración de Actividad de Vitamina B,2 •••• 6599
Pruebas Microbiológicas Pruebas y Valoraciones Químicas

(51) Pruebas de Eficacia Anti microbiana ......... 6456 Pruebas de Identificación
(55) Indicadores Biológicos-Pruebas de
Resistencia.......................... 6459 (181) Identificación-Bases Orgánicas
(61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Nitro9.enadas ........................ 6602
Pruebas de Recuento Microbiano ......... 6462 (191) Identificación-Pruebas Generales ......... 6602
(62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: (193) ldentificación-Tetraciclinas ............. 6608
Pruebas de Microorganismos Específicos . . . . 6468 (197) Pruebas Espectroscópicas de
(63) Pruebas para Micoplasmas ............... 6476 Identificación ........................ 6609
(71) Pruebas de Esterilidad .................. 6482 (198) Pruebas de Identidad por Espectroscopía
de Resonancia Magnética Nuclear para Polisa-
Pruebas y Valoraciones Biológicas cáridos Bacterianos Usados en la Fabricación de
Vacunas ........................... 6612
(81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas ... 6490 (201) Prueba de Identificación por Cromatografía
(85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas . . . . . . . . . 6510 en Capa Delgada ..................... 6617
(87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro .... 6517 (202) Identificación de Aceites Fijos por Cromato-
(88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo .... 6519 grafía en Capa Delgada ................ 6619
(89) Enzimas Usadas como Materiales Auxiliares en (203) Procedimiento de Cromatografía en Capa
la Fabricación de Productos Farmacéuticos ... 6525 Delgada de Alta Resolución para Identifi-
(89.1) Colagenasa 1 ••••••••••••••••••••••• 6529 cación de Artículos de Origen Botánico ..... 6620
(89.2) Colagenasa 11 ••••••••••••••••••••••• 6534
7282 Guía para los CapítulosGenerales USP 42
Pruebas de Límite (580) Valoración de Vitamina C ............... 6844

(581) Valoración de Vitamina D ............... 6847
(206) Aluminio ........................... 6622 (591) Determinación de Cinc ................ 6857
(207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro de
Enoxaparina Sódica ................... 6623 Pruebas y Determinaciones Físicas
(208) Valoración de Actividad Anti-Factor Xa y
Anti-Factor lla para Heparinas No Frawonadas y (601) Medicamentos Nasalesy para Inhalación:
de Bajo Peso Molecular ................ 6629 Pruebas de Calidad de Desempeño
(209) Determinaciones de Peso Molecular de de Aerosoles, Atomizadores y Polvos ...... 6859
Heparinas de Bajo Peso Molecular ......... 6633 (602) Propelentes ......................... 6885
(21 O) Análisis de Monosacáridos .............. 6635 (603) Aerosoles Tópicos .................... 6886
(211) Arsénico ........................... 6641 (604) Velocidad de Fuga .................... 6887
(212) Análisis de Oligosacáridos .............. 6643 (61 O) Métodos de Muestreo Microbiológico
(221) Cloruros y Sulfatos ................... 6657 Alternativos para Productos Nasales
(223) Dimetilanilina ....................... 6657 e Inhaladores No Estériles ............... 6888
(226) 4-Epianhidrotetraciclina ................ 6658 (611) Determinación de Alcohol .............. 6890
(227) 4-Aminofenol en Medicamentos que (616) Densidad Aparente y Densidad por Asenta-
(;ontienen Acetaminofeno .............. 6659 miento de los Polvos .................. 6892
(228) Oxido de Etileno y Dioxano ............. 6660 (621) Cromatografía ....................... 6896
(232) Impurezas Elementales-Límites .......... 6663 (630) Comparación Visual ................... 6908
(233) Impurezas Elementales-Procedimientos .... 6667 (631) Color y Acromatismo .................. 6909
(241) Hierro ............................. 6671 (641) Totalidad de la Disolución .............. 6910
(251) Plomo ............................ 6672 (643) Carbono Orgánico Total ................ 6911
(261) Mercurio ........................... 6673 (645) Conductividad del Agua ................ 6912
(267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio ..... 6677 (651) Temperatura de Solidificación ............ 6916
(268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento .. 6918
de Nitrógeno ....................... 6680 (660) Envases-Vidrio ...................... 6924
(271) Prueba para Sustancias Fácilmente ( 661) Sistemas de EnvasesPlásticos y sus Materiales
Carbonizables ....................... 6684 de Construcción ..................... 6931
(281) Residuo de Incineración ................ 6684 ( 661.1) Materiales Plásticos de Construcción ..... 6939
(291) Selenio ............................ 6685 (661.2) Sistemas de EnvasesPlásticos para Uso
Farmacéutico ........................ 6960
Otras Pruebasy Valoraciones (670) Envases-Componentes Auxiliares ......... 6965
(671) Envases-Pruebas de Desempeño ......... 6974
(301) Capacidad Neutralizante de Ácido ........ 6686 (691) Algodón ........................... 6981
(311) Valoración de Alginatos ................ 6687 (695) Cnstalinidad ........................ 6984
(341) Agentes Antimicrobianos-Contenido ...... 6688 (696) Caracterización de Sólidos Cristalinos por Micro-
(345) Valoración de Acido Cítrico/Citrato y Fosfato .... . calorimetría y Calorimetría de Disolución .... 6984
..................................... 6693 (697) Contenido en Envasespara Inyectables ..... 6987
(351) Valoración de Esteroides................ 6694 (698) Volumen de Entrega .................. 6988
(381) Tapones Elastoméricos para Inyectables ..... 6695 (699) Densidad de Sólidos .................. 6991
(391) Valoración de Epinefrina ................ 6701 (701) Desintegración ...................... 6993
(401) Grasas y Aceit~s Fijos .................. 6702 (705) Atributos de Calidad para Tabletas Cuyo
(411) Valoración de Acido Fálico .............. 6716 Etiquetado Indica Ranurado Funcional ...... 6996
(413) Análisis de Impurezas en Gases Medicinales .. 6720 (711) Disolución ......................... 6998
(415) Valoración de Gases Medicinales .......... 6721 (721) Intervalo de Destilación ................ 7009
(425) Antibióticos-Valoración Yodométrica ...... 6724 (724) Liberación de Fármacos ................ 701 O
(429) Medición del Tamaño de Partícula por (729) Distribución del Tamaño de Glóbulos en
Difracción de Luz ..................... 6725 Emulsiones Inyectables de Lípidos ......... 7018
(431) Determinación de Grupos Metoxilo ....... 6731 (730) Esyectroquímica de Plasma ............. 7022
(441) Valoración de Niacina o Niacinamida ...... 6732 (731) Perdida por Secado ................... 7026
(451) Volumetría con Nitrito ................. 6738 (733) Pérdida por Incineración ............... 7026
(461) Determinación de Nitrógeno ............ 6738 (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X .... .
(466) Impurezas Comunes .................. 6739 ..................................... 7027
(467) Disolventes Residuales ................. 6741 (736) Espectrometría de Masas ............... 7032
(469) Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol (741) Intervalo o Temperatura de Fusión ........ 7038
en Sustancias Etoxiladas ................ 6763 (755) Llenado Mínimo ..................... 7041
(471) Combustión en Matraz con Oxígeno ...... 6765 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética
(481) Valoración de Riboflavina ............... 6766 Nuclear ............................ 7043
(501) ~ales de BasesOrgánicas Nitrogenadas ..... 6772 (771) Productos Oft;álmicos-Pruebas de Calidad .. 7052
(503) Acjdo Acético en Péptidos .............. 6772 (776) Microscopja Optica ................... 7059
(503.1) Acido Trifluoroacético en Péptidos ....... 6774 (781) Rotación Optica ..................... 7062
(507) Procedimientos para la Determinación de (782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular
Proteínas ........................... 6775 Vibracional ......................... 7064
(511) Valoración de un Esteroide Aislado ........ 6780 (785) Osmolalidad y Osmolaridad ............. 7071
(525) Dióxido de Azufre .................... 6781 (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de
(531) Valoración de Tiamina ................. 6787 Partícula por Tamizado Analítico .......... 7074
(541) Volumetría ......................... 6796 (787) Partículas Subvisibles en Inyectables de
(551) Valoración de Vitamina E ............... 6799 Proteínas Terapéuticas ................. 7079
(561) Artículos de Origen Botánico ............ 6807 (788) Partículas en Inyectables ............... 7082
(563) Identificación de Artículos de Origen (789) Partículas en Soluciones Oftálmicas ........ 7086
Botánico ........................... 6823 (790) Partículas Visibles en Inyectables .......... 7087
(565) Extractos Botánicos ................... 6836 (791) pH ............................... 7088
(571) Valoración de Vitamina A ............... 6839
(795) Preparación Magistral-Preparaciones No (1050.1) Diseño, Evaluacióny Caracterización

Esteriles............................ 7092 de Procedimientosde DepuraciónViral ..... 7567
(797) Preparación Magistral-Preparaciones (1051) Limpiezade Materialde Vidrio .......... 7579
Esteriles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71O1 (1052) ArtículosObtenidos por Biotecnología-
(800) Fármacos Peligrosos-Manipulación Análisisde Aminoácidos................ 7580
en Instalacionesde Cuidados de la Salud .... 7150 (1053) ElectroforesisCapilar ................. 7594
(801) Polarografía ........................ 7171 (1054) ArtículosObtenidos por Biotecnología-
(811) Finura de Polvos ..................... 7176 lsoelectroenfoque .................... 7602
(821) Radioactividad....................... 7177 (1055) ArtículosObtenidos por Biotecnología-
(823) Fármacos para Tomografíade Emisiónde Posi- Mapeo de Péptidos ................... 7605
trones para Uso en PreparacionesMagistrales, (1056) ArtículosObtenidos por Biotecnología-
l,nvestigaciónClínicay EstudiosCientíficos... 7184 Electroforesisen Gel de Poliacrilamida...... 7612
(831) Indice de Refracción .................. 7196 (1057) ArtículosObtenidos por Biotecnología-
(841) ~eso Específico...................... 7196 Valoraciónde ProteínasTotales ........... 7620
(846) Area SuperficialEspecífica............... 7197 (1058) Calificaciónde Instrumentos Analíticos .... 7627
(852) Espectroscopíade AbsorciónAtómica ...... 7201 (1059) Desempeño de Excipientes............. 7634
(853) Espectroscopíade Fluorescencia.......... 7205 (1061) Color-Medición Instrumental .......... 7665
(854) Espectroscopíaen el InfrarrojoMedio ...... 7212 (1062) Caracterizaciónde la Compresión de Tabletas ...
(855) Nefelometnay Turbidimetría ............ 7216 ..................................... 7668
(857) EspectroscopiaUltravioleta-Visible ......... 7224 (1063) Metodología de Celda de Corte para
(861) Suturas-Diámetro ................... 7231 Pruebas de Fluidezde Polvos ............ 7680
(871) Suturas-Sujeción de Agujas............. 7232 (1064) Identificaciónde Artículosde Origen
(881) Resistenciaa la Tensión ................ 7233 Botánicopor Cromatografíaen Capa
(891) AnálisisTérmico ..................... 7234 Delgada de Alta Resolución ............. 7691
(905) Uniformidadde Unidades de Dosificación... 7239 (1065) Cromatografíalónica ................. 7701
(911) Viscosidad-Métodos Capilares........... 7243 (1066) AmbientesFísicosque Favorecenel Uso
(912) Viscosidad-Métodos Rotatorios .......... 7245 Seguro de los Medicamentos ............ 7704
(913) Viscosidad-Método de Bola Rodante ...... 7250 (1072) Desinfectantesy Antisépticos ........... 7718
(914) Viscosidad-Métodos por Medida de Presión.... . (1074) Guías para la Evaluaciónde la Seguridad
..................................... 7252 Biológicade los Excipientes ............. 7724
(921) Determinaciónde Agua ................ 7253 (1078) Buenas Prácticasde Fabricaciónpara
(941) Caracterizaciónde SólidosCristalinos ExcipientesFarmacéuticosa Granel ........ 7729
y ParcialmenteCristalinospor Difracción (1079) Buenas Prácticasde Almacenamientoy
de RayosX sobre Polvo(DRXP)........... 7259 Distribuciónpara Medicamentos .......... 7750
(1079 .1) Almacenamientoy Transporte de Medicamentos
en Investigación ..................... 7761
INFORMACIÓN
GENERAL (1080) ExcipientesFarmacéuticosa Granel-
Certificadode Análisis ................. 7765
(1004) Medicamentos para Mucosas-Pruebas de (1084) Análisisde Glicoproteínasy Glicanos-
Desempeño ......................... 7287 ConsideracionesGenerales .............. 7773
(1005) EmisiónAcústica .................... 7290 (1086) Impurezasen Fármacosy Productos
(101 O) Datos Analíticos-Interpretación y Farmacéuticos....................... 7784
Tratamiento......................... 7294 (1087) DisoluciónIntrínsecaAparente-Procedi-
(1024) Suero Bovino....................... 7311 mientos de Pruebas de Disoluciónpara
(1025) Pancreatina ........................ 7325 Disco Rotatorioy Disco Estacionario ....... 7787
(1027) Citometría de Flujo .................. 7335 (1088) EvaluaciónIn Vivoe In Vitrode Formas
(1029) Guías de Buenas Prácticasde Farmacéuticas ....................... 7792
Documentación ...................... 7353 (1090) Evaluaciónde Desempeño del Producto
(1030) Capítulos de ValoracionesBiológicas-Infor- FarmacéuticoSólidoOral y la lntercambia-
mación General y Glosario .............. 7357 bilidad, Biodisponibilidad,Bioequivalenciay
(1031) Biocompatibilidadde los MaterialesUsados en Disolución .........................
Envasesde Medicamentos, Dispositivos 7805
(1091) Etiquetado de Ingredientes Inactivos...... 7817
Médicos e Implantes .................. 7369 (1092) Procedimientode Disolución:Desarrollo
(1032) Diseñoy Desarrollode Valoraciones
Biológicas..........................
(1033) Validaciónde ValoracionesBiológicas .....
7379 (1094) ¿á~~~~~~p~~~b~; -d~.Di;~l~~ió~.y....... 7818
7401 Atributosde Calidad Relacionados......... 7840
(1034) Análisisde ValoracionesBiológicas........ 7418 (1097) Procedimientospara el Muestreo de Polvos
(1039) Quimiometría ...................... 7432 a Granel ...........................
(1041) Productos Biológicos................. 7849
7452 (1099) Límiteen el Número de Grandes Desvia-
(1043) MaterialesAuxiliarespara Productos Celulares, ciones al Evaluarla Uniformidadde Contenido
Génicosy de IngenieríaTisular ........... 7454 en Muestras de Gran Tamaño............ 7863
(1044) Crioconservaciónde Células ............ 7463 (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas-
(1046) Productos Derivadosde Célulasy Tejidos... 7477
(1047) Productos de Terapia Génica ........... 7511
ConsideracionesGenerales .............. 7864
(1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas-
(1048) Calidad de Productos Biotecnológicos:Análisisde
la ConstrucciónExpresableen CélulasUsadas Ensayopor lnmunoadsorciónLigado a
para la Producciónde Productos Proteínicos Enzimas(ELISA)...................... 7873
(1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas-
Obtenidos con ADNRecombinante........ 7543 Análisispor lnmunotransferencia.......... 7885
(1049) Calidad de Productos Biotecnológicos:Pruebas
(1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas--
de f.stabilidadde Productos Biotecnol6gicos Resonanciade Plasmón Superficial ........ 7898
o Biológicos ........................ 7546 (1106) Ensayosde lnmunogenic1dad-Diseño y
(1050) Evaluaciónde la Seguridad Viralen Productos
BiotecnológicosObtenidos de Líneas Validaciónde lnmunoensayos para Detectar
Celularesefe Origen Humano o Animal ..... 7551 AnticuerposAntifármacos............... 7915
7284 Guía para los CapítulosGenerales USP42
(1106.1) Ensayosde lnmunogenicidad-Diseño y (121O) Métodos Estadísticospara la Validación

Validacionde Ensayospara Detectar de ProcedimientosAnalíticos............. 8333
Anticuerpos NeutralizantesAntifármacos .... 7933 (1211) Garantíade Esterilidad................ 8345
(1111) ExamenMicrobiológico de Productos No (1216) Friabilidadde las Tabletas.............. 8355
Estériles:Criterios de Aceptación para (1217) Fuerzade Ruptura de las Tabletas........ 8356
PreparacionesFarmacéuticasy Sustancias (1222) Productos Farmacéuticoscon Esterilización
de Uso Farmacéutico .................. 7955 Terminal-Liberación Paramétrica ......... 8360
(1112) Determinación de Actividad de Agua en (1223) Validaciónde Métodos Microbiológicos
ProductosFarmacéuticosNo Estériles ...... 7957 Alternativos ......................... 8363
(1113) Caracterización,Identificación y (1223.1) Validaciónde Métodos Alternativos para
Tipificación de Cepas Microbianas......... 7959 ValoracionesMicrobiológicas de
(1115) Control de Biocargade Fármacosy Medi- Antibióticos ......................... 8378
camentos No Estéri[es ................. 7964 (1224) Transferenciade ProcedimientosAnalíticos.. 8385
(1116) Control Microbiológico y Monitoreo de (1225) Validación de ProcedimientosFarma-
Arpbientesde ProcesamientoAséptico ...... 7972 8387
(1117) Optimas Prácticasde Laboratorio (l 226)i~)f¡~!ció~ d~·p~¿~ed·i~i~nt¿s· F~r~a·-· · · · ·
Microbiológico ...................... 7986 copeicos ........................... 8393
(1118) Dispositivosde Monitoreo-Tiempo, (1227) Validaciónde RecuperaciónMicrobiana en
Temperaturay Humedad ............... 7993 Artículos Farmacope1cos ................ 8395
(1119) Espectroscopíaen el Infrarrojo Cercano .... 7999 (1228) Despirogenizacion................... 8399
(1120) EspectroscopíaRaman ................ 8006 (1228.1) Despirogenizaciónpor Calor Seco ...... 8404
(1121) Nomenclatura ..... , ................. 8015 (1228.3) Despirogenizaciónpor Filtración ....... 8409
(1125) TécnicasBasadasen Acidos Nucleicos- (1228.4) Despirogenizaciónpor Enjuague ....... 8412
Generalidades...... ,. ................ 8018 (1228.5) Indicadoresde Endotoxinaspara
(1126) TécnicasBasadasen Acidos Nucleicos- Despirogenización.................... 8415
Extracción,Detección X Secuenciación...... 8023 (1229) Esterilizaciónde Artículos Farmacopeicos... 8420
(1127) TécnicasBasadasen Acidos Nucleicos- (1229.1) Esterilizacióncon Vapor de Agua por
Amplificación ....... , ................. 8035 Contacto Directo ..................... 8426
(1128) TecnicasBasadasen Acidos Nucleicos- (1229.2) Esterilizacióncon Calor Húmedo de
Micromatrices ...... ,. . . . . . . . . . . . . . . . . 8046 LíquidosAcuosos..................... 8430
(1129) TécnicasBasadasen Acidos Nucleicos- (1229.3) Monitoreo de la Biocarga ............ 8435
Genotipificación..... , ................. 8053 (1229.4) Esterilizaciónde Líquidos por Filtración ... 8438
(1130) TécnicasBasadasen Acidos Nucl~icos- (1229.5) IndicadoresBiológicos para
Enfoquespara Detectar Trazasde Acidos Esterilización........................ 8447
Nucleicos(Análisisde ADN Residual)..... 8058 (1229.6) Esterilizaciónen FaseLíquida .......... 8450
(1132) Medición de ProteínaResidual (1229.7) Esterilizaciónpor Gases.............. 8453
de CélulasHuéspeden Productos (1229.8) Esterilizaciónpor Calor Seco .......... 8456
Biofarmacéuticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8062 (1229.9) Integradorese IndicadoresFisicoquímicos
(1136) Envasadoy Reenvasado-Envases para Esterilización .................... 8458
Unitarios ........................... 8088 (1229.1O) Esterilizaciónpor Radiación .......... 8459
(1151) FormasFarmacéuticas................ 8100 (1229.11) Esterilizaciónen Fasede Vapor ........ 8464
(1152) MedicamentosVeterinariosUsadosen (1229.12) Nuevos Métodos de Esterilización...... 8465
Alimentos para Animales ............... 8129 (1229.13) Esterilizaciónen el Sitio ............. 8466
(1160) Cálculosen la PrácticaFarmacéutica...... 8131 (1229.14) Desarrollodel Ciclo de Esterilización.... 8468
(1163) Garantíade Calidad en la Preparación (1229.15) Esterilizaciónde Gasespor Filtración.... 8471
Magistral ........................... 8158 (1230) Agua para Uso en Hemodiálisis.......... 8472
(1168) PreparacionesMagistralespara EstudiosClí- (1231) Agua para Uso Farmacéutico ........... 8474
nicos de Investigaciónen Fase1 •••••••••• 8166 (1234) Vacunaspara Uso Humano-Vacunas
(1174) Fluidezde Polvos.................... 8175 de Polisacaridosy Glicoconjugados ........ 8518
(1176) Balanzaspara Prescripcionesy Aparatos (1235) Vacunaspara Uso Humano-
Volumétricos Usadosen Preparaciones ConsideracionesGenerales.............. 8536
Magistrales ......................... 8179 (1237) Métodos de PruebasVirológicas ......... 8556
(1177) BuenasPrácticasde Envasado........... 8186 (1238) Vacunaspara Uso Humano-Vacunas
(1178) BuenasPrácticasde Reenvasado......... 8189 Bacterianas......................... 8579
(1180) PlasmaHumano .................... 8192 (1240) Análisisde Virus en PlasmaHumano para
(1181) Microscopía Electrónicade Barrido ....... 8217 FabricaciónPosterior .................. 8594
(1184) Pruebasde Sensibilización ............. 8227 (1241) InteraccionesAgua-Sólido en Sistemas
(1191) Consideracionessobre Estabilidaden la Farmacéuticos....................... 8605
Prácticade Dispensación ............... 8239 (1251) Pesadaen una BalanzaAnalítica ......... 8610
(1195) Guía sobre Cambios Significativosen (1265) Información Escritade los Medicamentos
ExcipientesFarmacéuticosa Granel ........ 8244 Recetados-Guías .................... 8616
(1197) BuenasPrácticasde Distribución para (1285) Preparaciónde Muestras Biológicaspara
ExcipientesFarmacéuticosa Granel ........ 8256 AnálisisHistológico e lnmunohisto-
(1207) Evaluaciónde la lnte~ridad del químico ........................... 8618
Envase-Productos Esteriles.............. 8281 (1285.1) Tinción con Hematoxilina y Eosinade Cortes
(1207.1) Pruebasde Integridad de Envases de Tejidos para ExamenMicroscópico ...... 8623
en el Ciclo de Vida del Producto- (1467) DisolventesResiduales-Verificaciónde
Seleccióny Validación ProcedimientosFarmacopeicosy Validación
de Métodos de Prueba................. 8289 de ProcedimientosAlternativos ........... 8626
(1207.2) Tecnolo9íaspara Pruebasde Fuga (1601) Productos para Nebulización-Pruebas de
en la Integridad de Envases ............. 8304 Caracterización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8629
(1207.3) Tecnologíaspara Pruebasde Calidad (1602) Espaciadoresy CámarasEspaciadoras
de Selladode Envases ................. 8324 con VálvulasQue Se Usancon Aerosoles
(1208) Pruebasde Esterilidad-Validación de Sistemas para Inhalación-Pruebas
Aisladores .......................... 8327 de Caracterización.................... 8633
(1644) Teoríay Prácticade Medicionesde

Conductividad Eléctricade Soluciones...... 8648
(1660) Envasesde Vidrio-Evaluaciónde la
Durabilidadde la SuperficieInterna ........ 8655
(1661) Evaluaciónde Sistemasde EnvasesPlásticos
y sus Materialesde Construcción
con Respectoa su Impacto sobre la
Seguridad del Usuario ................. 8661
(1663) Evaluaciónde SustanciasExtraíbles
Relacionadascon EnvasesFarmacéuticosy
Sistemasde Administración ............. 8669
(1664} Evaluaciónde SustanciasLixiviablesen DIETÉTICOS
SUPLEMENTOS
Medicamentos Relacionadascon Envases (2021) Pruebas de Recuento Microbiano-
Farmacéuticosy Sistemasde
Administración ...................... 8686 Suplementos Nutricionalesy Dietéticos ..... 8935
(1664.1) Medicamentos Nasalesy para Inhalación (2022) ProcedimientosMicrobiológicospara
Oral .............................. 8700 ComP,r:obarla Ausenciade Microorganismos
(1724) MedicamentosSemisólidos-Pruebas de Esg~c1t1~os-Suplementos Nutricionales
Desempeño ......................... 8708 8940
·d·e·I~~· · · · · · · · ·
(2023~ A~~~~~~~\;,i~~¿bi~lógic~~
(1730) Espectroquímicade Plasma-Teoría y
Práctica............................ 8721 Suplementos Nutricionalesy Dietéticos
(1 735) Espectrometríade Fluorescenciade No Estériles......................... 8947
RayosX-Teoría y Práctica .............. 8728 (2030) InformaciónComplementaria para
(1736) Aplicacionesde la Espectrometríade Artículosde Origen Botánico ............ 8950
Masas ............................. 8748 (2040) Desintegracióny Disoluciónde
(1761) Aplicacionesde la Espectroscopíade Suplementos Dietéticos ................ 8961
ResonanciaMagnética Nuclear ........... 8771 de Peso de Suplementos
(2091) yar]a_ción
(1771) Productos Oftálmicos-Pruebas de D1etet1cos.......................... 8970
Desempeño ......................... 8793 (2232) Contaminantes Elementalesen
(1782) Espectroscopíade DicroísmoCircular Suplementos Dietéticos ................ 8971
Vibracional-Teoríay Práctica ............ 8794 (2250) Detección de Suplementos Dietéticos
(1787) Mediciónde PartículasSubvisiblesen Irradiados .......................... 8975
lnye~tablesde ProteínasTerapéuticas ...... 8809 (2251) ;iondeo de Fármacosy Análogosde
(1788) Metodos para la Determinaciónde Partículas FarmacosNo Declarados ............... 8978
en Inyectablesy SolucionesOftálmicas ..... 8824 (2750) Prácticasde Fabricaciónpara
(1790) InspecciónVisualde Inyectables ......... 8839 Suplementos Dietéticos ................ 8996
(1821) R~dioactividad-Teoríay Práctica ........ 8860
(1823) Farmacos para Tomografíapor Emisión
de Positrones-Información ............. 8875
USP 42 Información General/ (1004) Medicamentos para Mucosas 7287
Capítulos Generales
1nformaciónGeneral
Los capítulos de esta sección son de carácter informativo y no contienen normas, pruebas, valoraciones, ni otras especifica-
ciones de cumplimiento obligatorio para ningún artículo farmacopeico, a excepción de las citas de Leyes y reglamentos federa-
les que puedan ser aplicables. Las citas de Leyes y reglamentos federales se incluyen en esta sección debido a que no son de la
autoría de la Farmacopea. Las revisiones o reformas de los requisitos federales que afecten el contenido de estas citas se publi-
carán en los Suplementosde los compendiosUSP-NFa la brevedad posible. Los requisitos oficiales de los artículos farmacopeicos
se establecen en las AdvertenciasGenerales,las monografías individuales y en los capítulos referentes a Pruebasy Valoraciones
Generalesde esta Farmacopea.
(1004) MEDICAMENTOS
PARAMUCOSAS-PRUEBAS
DEDESEMPEÑO
INTRODUCCIÓN
Los medicamentos para mucosas liberan fármacos en el cuerpo mediante la vía mucosa. Para los propósitos de este capítulo,
la vía mucosa de administración de fármaco se divide en siete superficies de membrana caracterizadas como ótica, oftálmica,
nasal, orofaríngea, uretral, vaginal y rectal. Los medicamentos para mucosas incluyen una amplia variedad de formas farma-
céuticas tales como soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, geles, insertos, tiras, aerosoles, atomizadores,
películas, gomas de mascar medicadas, tabletas, tabletas de disolución bucal y supositorios. Algunas de estas formas farmacéu-
ticas también se administran mediante otras vías. Por ejemplo, las cremas pueden administrarse por la vía mucosa (vaginal) y
también por la vía tópica. En estos productos se realizan dos categorías de pruebas: calidad del producto y desempeño del
producto. Estas pruebas proveen garantías sobre la calidad entre partidas, la reproducibilidad, la confiabilidad y el desempeño
de un medicamento. Las pruebas de calidad del producto se llevan a cabo para evaluar atributos tales como valoración, identi-
ficación y uniformidad de contenido y forman parte de la monografía oficial (ver Medicamentospara Mucosas-Pruebas de Cali-
dad del Producto(4)). Las pruebas de desempeño del producto se llevan a cabo para evaluar la liberación de fármacos a partir
de la forma farmacéutica. Para ciertos medicamentos para mucosas, la determinación del tamaño aerodinámico de partícula o
del tamaño de glóbulo puede servir como una prueba de desempeño del producto.
Cuando existe una prueba de desempeño farmacopeica para una forma farmacéutica administrada por una vía no mucosa,
tal como una prueba de disolución para una tableta oral, dicha prueba podría tener aplicación para la forma farmacéutica ad-
ministrada por una vía mucosa (p. ej., tabletas bucales o tabletas sublinguales).
PRUEBASDE DESEMPEÑOPARA MEDICAMENTOS

PARA MUCOSAS
Las pruebas de desempeño para los diversos medicamentos para mucosas pueden dividirse ampliamente en dos categorías:
1) los procedimientos de prueba que usan o que pueden adoptar metodología de los capítulos generales existentes y 2) prue-
bas que requieren trabajo de desarrollo adicional antes de que puedan ser recomendadas.
El capítulo Procedimientode Disolución:Desarrolloy Validación(1 092) debe tenerse como una referencia para el desarrollo de
una prueba de liberación de fármacos (p. ej., seleccionar el medio de liberación de fármacos, el aparato/procedimiento o el
método analítico). Para varios medicamentos para mucosas, pueden ser aplicables los procedimientos de liberación de fárma-
cos descritos en Disolución(711 ), Liberaciónde Fármacos(724) y MedicamentosSemisólidos-Pruebasde Desempeño(1724).
En algunas instancias, pueden ser adecuados aparatos con minicanastilla o minipaletas. Dichos aparatos son parecidos al de
Disolución(711 ), Aparato 1 (Aparato con Canastilla)y Disolución(711 ), Aparato 2 (Aparato con Paleta), con dimensiones reduci-
das para ajustarse a volúmenes de medio <500 mL ( 7,2). Se encuentran disponibles comercialmente diversos diseños. Sin em-
bargo, al día de hoy, dichos aparatos no están estandarizados.
Debido a los entornos diversos y específicos que caracterizan la vía de administración por mucosa, los investigadores pueden
optar por usar "medio fisiológico" para la liberación de fármacos de la forma farmacéutica específica. Es posible que el uso de
7288 (1004) Medicamentos para Mucosas/ Información General USP42
dicho medio no sea esencial para la prueba de desempeño del producto y que, en muchos casos, un amortiguador simple sea
suficiente. Para mayor información, se provee una referencia (3) para la composición de dicho medio.
Aerosolesy EspráisNasales
Las pruebas de desempeño para aerosoles nasales y linguales y atomizadores nasales se relacionan en gran medida con la
distribución del tamaño de gotita o de partícula y la distribución del tamaño aerodinámico. Los procedimientos del capítulo
MedicamentosNasalesy para Inhalación: Pruebasde Calidadde Desempeñode Aerosoles,Atomizadoresy Polvos(601) pueden
aplicarse a productos administrados por vías mucosas. Cuando un fármaco se encuentra presente como un sólido con un me-
canismo de liberación modificado en la dosis administrada, se debe intentar determinar la disolución de las partículas (4).
Cremas, Gelesy Ungüentos
Las pruebas de liberación de fármacos para cremas, geles y ungüentos pueden llevarse a cabo usando un procedimiento
descrito en el capítulo (1724).
Emulsiones
Las pruebas de desempeño para emulsiones incluyen la determinación del tamaño de glóbulos y la prueba de disolución/
liberación de fármacos. El tamaño de glóbulos puede determinarse usando un procedimiento descrito en Distribucióndel Tama-
ño de Glóbulosen EmulsionesInyectablesde Lípidos(729). La prueba de liberación de fármacos puede realizarse usando Disolu-
ción (711), Aparato 2 (Aparato con Paleta)o una celda de difusión vertical según se describe en MedicamentosSemisó/idos-
Pruebasde Desempeño(1724), Determinaciónde la Velocidadde Liberaciónde FármacoUsandoun Aparato de Celdade Difusión
Vertical.
Películas
Se puede usar Liberaciónde Fármacos(724), Aparato 5 (PaletasobreDisco)para determinar la liberación de fármacos a partir
de formas farmacéuticas peliculares. Se puede usar una minicanastilla para la prueba de liberación de fármacos de películas.
Gomas
Para las gomas, las pruebas de desempeño incluyen liberación de fármacos a partir de la formulación. La FarmacopeaEuro-
pea (5) describe un dispositivo. La liberación del fármaco a partir de la formulación requiere una actividad de masticado que
renueva la superficie expuesta al medio. La velocidad de liberación será en parte una función de la frecuencia de masticado
que es simulada por el aparato de prueba. Las gomas pueden requerir acondicionamiento a la temperatura de la boca para
deformarse plásticamente por la acción de las platinas oscilantes del aparato de prueba.
Los parámetros importantes para el aparato incluyen: volumen del medio de disolución, distancia entre las superficies de
masticado superior e inferior, ángulo de rotación recomendado, temperatura y frecuencia de masticado. El medio de disolu-
ción seleccionado, los tiempos de prueba y el volumen muestreado también son aspectos importantes a considerar.
Insertos
La prueba de liberación de fármacos para insertos puede realizarse usando Disolución(711 ), Aparato 1 (Aparato con Canasti-
lla) o Disolución(711 ), Aparato 2 (Aparato con Paleta).
Tabletas de DisoluciónBucal
La prueba de liberación de fármacos para tabletas de disolución bucal puede realizarse usando Disolución(711 ), Aparato 1
(Aparato con Canastilla);Disolución(711 ), Aparato 2 (Aparato con Paleta)con agitación rápida (175 rpm); o Disolución(711 ),
Aparato 3 (Cilindro Oscilante).
Supositorios
Existen dos tipos de supositorios: 1) hidrofílicos (solubles en agua) y 2) lipofílicos (solubles en aceite o que se funden). La
liberación de fármacos (disolución) para supositorios solubles en agua puede realizarse usando Disolución(711 ), Aparato 1
(Aparato con Canastilla);Disolución(711 ), Aparato 2 (Aparato con Paleta)o Disolución(711 ), Aparato 4 (Celdade Flujo).La prue-
ba de liberación de fármacos para supositorios lipofílicos puede requerir modificaciones en el procedimiento de disolución para
evitar interferencia analítica de los glóbulos de aceite. Se han propuesto diversos métodos alternativos ( 6-8). Puede ser útil el
aparato de celda de flujo que usa la celda para supositorios. La selección del método dependerá de la naturaleza de la formula-
USP42 InformaciónGeneral/ (1004) Medicamentos para Mucosas 7289
ción. La Figura 1 presenta una vista esquemática de la celda de flujo [Disolución(711 ), Aparato 4 (Celdade Flujo)] específica-
mente destinada para la disolución de supositorios. La parte inferior (1) se compone de dos cámaras adyacentes conectadas a
un dispositivo de desbordamiento. El medio de disolución pasa a través de la Cámara A y se somete a un flujo ascendente. El
flujo en la cámara B se dirige de forma descendente hacia un orificio de salida de calibre pequeño que conduce de forma as-
cendente hacia el ensamblaje de filtro. La parte media (2) de la celda tiene una cavidad diseñada para recolectar excipientes
lipofílicos que flotan en el medio de disolución. Una rejilla de metal sirve como filtro grueso. La parte superior (3) sostiene una
unidad de filtro para filtros de papel, fibra de vidrio o celulosa.
Tubo capilar
Cápsula
V")
V")
M
V")
00
M
Tamiz con
punto
Figura 1. La celda de flujo diseñada para supositorios (dimensiones en mm).
Suspensiones
La prueba de disolución para suspensiones puede realizarse como está descrito en Disolución(711 ), Aparato 2 (Aparato con
Paleta).Se puede usar un aparato con minipaleta de volumen pequeño.
Tabletas Sublinguales y Tabletas Bucales
La prueba de liberación de fármacos para estas formas farmacéuticas puede realizarse usando Disolución(711 ), Aparato 1
(Aparato con Canastilla)o Disolución(711 ), Aparato 2 (Aparato con Paleta). Las minicanastillas o las minipaletas también pueden
usarse para la prueba de liberación de fármacos de tabletas bucales y sublinguales.
REFERENCIAS
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259.
(1005) EMISIÓN ACÚSTICA
INTRODUCCIÓN
Las técnicas ultrasónicas se pueden categorizar en dos tipos específicos: emisión acústica (modo pasivo) y espectroscopía
ultrasónica (modo activo). Ambas técnicas tienen muchas aplicaciones.
La técnica de emisión acústica se basa en la detección y análisis de sonidos producidos por un proceso o sistema. En esencia
esto es equivalente a escuchar el proceso o sistema, aunque estos sonidos a menudo están muy por encima de las frecuencias
que el oído humano puede detectar. Por lo general, las frecuencias son audibles hasta 15 kHz aproximadamente.
En el caso de la espectroscopía ultrasónica, el instrumento está diseñado para generar ondas de ultrasonido en un intervalo
de frecuencia definido. Estas ondas viajan a través de la muestra y se miden por medio de un receptor. Se puede establecer
una analogía con la espectroscopía UVvisible o la espectroscopía IR, por cuanto el espectro ultrasónico detectado refleja cam-
bios en la velocidad o atenuación del sonido debido a la interacción con una muestra a través de un intervalo de frecuencias.
Sin embargo, puesto que el alcance de este capítulo se limita a la emisión acústica, no discutiremos en detalle la espectrosco-
pía ultrasónica.
La emisión acústica es bien conocida en el estudio de la mecánica de fractura, y por lo tanto, se usa ampliamente entre los
científicos de materiales. También se usa mucho como una técnica de pruebas no destructiva y se aplica en forma rutinaria
para la inspección de alas de aviones, recipientes de presión, estructuras y componentes de soporte de carga. La emisión acús-
tica también se usa en ingeniería para monitorear el desgaste de máquinas.
En términos de aplicaciones farmacéuticas, la dependencia de la medición de la emisión acústica de propiedades físicas co-
mo el tamaño de las partículas, la resistencia mecánica y la cohesividad de los materiales sólidos permite el uso de esta técnica
para el control y detección del punto final de procesos como la granulación de alta velocidad, secado en lecho fluido, molien-
da y micronización.
PrincipiosGenerales
Las emisiones acústicas se pueden propagar por diferentes modos. En sólidos, los modos compresionales y de corte o trans-
versales son importantes. Los modos compresionales tienen la velocidad más alta y por lo tanto alcanzan el detector acústico
(o transductor de emisión acústica) primero. Sin embargo, en la mayoría de las aplicaciones de emisión acústica en procesos,
existen muchas fuentes y cada una de ellas produce descargas cortas de energía; por consiguiente, los diferentes modos no se
pueden resolver fácilmente. Por ejemplo, la señal detectada en la pared de un vaso es una mezcla compleja de muchas formas
de ondas superpuestas provenientes de muchas fuentes y modos de propagación.
En las interfases, dependiendo de la impedancia acústica relativa de los dos materiales, mucha de la energía se refleja de
vuelta hacia la fuente. En un lecho fluido, por ejemplo, las emisiones acústicas solo serán detectadas a partir de partículas que
impacten directamente las paredes del lecho próximas al transductor.
Un método conveniente de estudiar la emisión acústica de los procesos es usar el "nivel medio de señal". Se puede usar un
convertidor de valor eficaz a corriente continua (convertidor RMS a CC; RMS-to-DC, por sus siglas en inglés) para convertir la
señal portadora de amplitud modulada (AM) en una señal de corriente continua (CC) que varía más lentamente. Esto se cono-
ce como nivel medio de señal (ASL,por sus siglas en inglés). ElASLpuede entonces muestrearse digitalmente (por lo general a
una frecuencia de muestreo de aproximadamente 50 Hz) y almacenarse electrónicamente para el procesamiento adicional de
la señal.
La forma más sencilla de estudiar los datos acústicos consiste en examinar cambios en el ASL.Sin embargo, se puede recabar
otra información al examinar el espectro de potencia del ASL.El espectro de potencia se calcula tomando el cuadrado comple-
jo del espectro de amplitud y se puede obtener efectuando una Transformada Rápida de Fourier (TRF)sobre el registro de da-
USP42 Información General/ (1005) Emisión Acústica 7291
tos digitalizados sin procesar. Los espectros de potencia se pueden promediar para producir un cálculo confiable de la densi-
dad espectral de potencia o para obtener una "huella digital (fingerprint)" de un régimen de proceso particular. La interpreta-
ción del espectro de potencia se complica por el hecho de que la señal acústica originada en el sistema se distorsiona por va-
rios factores, incluyendo la transmisión, reflexión y características de la señal de transferencia.
La forma del espectro de potencia en el registro del ASLes una función de la dinámica del proceso. Los procesos periódicos
(p. ej., mezclado mecánico o burbujeo periódico de un lecho fluido) muestran alta potencia a determinadas frecuencias discre-
tas. Los procesos aleatorios muestran propiedades de tipo parpadeante (flicker noise), donde la potencia es inversamente pro-
porcional a la frecuencia, o propiedades del ruido blanco en donde la potencia es independiente de la frecuencia. La amplitud
del espectro de potencia también se ve afectada por la energía de las emisiones acústicas producidas por el proceso. Por ejem-
plo, si se está procesando un material duro, la emisión acústica producida por el impacto de las partículas será mayor que la
producida por un material blando.
INSTRUMENTACIÓN
Por lo general, los sensores piezoeléctricos se usan para detectar y cuantificar las señales acústicas producidas por un proce-
so. Los transductores piezoeléctricos se fabrican a partir de sólidos cristalinos piezoeléctricos conectados a circuitos de control
de transductores por contactos eléctricos. Cuando está configurado como un detector, una onda acústica que incide sobre el
elemento piezoeléctrico se transforma en una señal eléctrica en el circuito de control del transductor. Cuando se lo configura
como generador acústico, una señal eléctrica aplicada al elemento piezoeléctrico por el circuito de control genera una onda
acústica que puede propagarse por el medio al cual está conectado el transductor. Por lo general, esto significa que los detec-
tores de emisión acústica pueden funcionar también como generadores de ondas acústicas y esta característica se usa para
garantizar el buen desempeño del sensor según se describe más adelante (ver Calificacióny Verificaciónde Instrumentosde Emi-
sión Acústica).
En las aplicaciones generales de emisión acústica, a menudo se usan sensores con frecuencias de resonancia diferentes (p.
ej., 70 y 190 kHz, aunque frecuencias más altas podrían ser más apropiadas a menores escalas de funcionamiento), que com-
prenden varios pasos de banda. A medida que el sonido (ultrasonido) del intervalo de frecuencia apropiada alcanza estos sen-
sores, se genera una señal eléctrica cuya amplitud es directamente proporcional a la energía (amplitud) de las ondas de sonido
incidentes.
Estas señales se procesan por medio de:
(1) un preamplificador (que incluye filtrado de señales),
(2) un convertidor RMS a CC,
(3) un amplificador de ganancia variable y
(4) una terminal de recolección de datos conectada a una computadora, la cual cuenta también con un software de control.
El equipo de emisión acústica por lo general permite usar varios sensores simultáneamente, con la incorporación de múlti-
ples canales electrónicos en un solo instrumento.
Procesamientode la Señal
La señal de un transductor resonante se asemeja a una señal de radio de amplitud modulada (AM). A la frecuencia de reso-
nancia del transductor, la señal consiste en una onda transportadora cuya amplitud es modulada por el proceso. Para demodu-
lar la señal se usa un convertidor RMS a CC. La potencia de salida de este dispositivo es la señal o envolvente de modulación.
El envolvente se vuelve a muestrear digitalmente a una frecuencia apropiada para el proceso. Por ejemplo, 50 Hz es la tasa
habitual de muestreo digital para un secador de lecho fluido o un granulador de alta velocidad.
FACTORES
QUEAFECTANLA MEDICIÓN
Los siguientes factores pueden afectar los datos acústicos obtenidos y deben tenerse en consideración al instalar un sistema
de emisión acústica.
1 . Falla o Daño Físico-Al igual que cualquier otro tipo de sensor, los sensores de emisión acústica pueden fallar con el tiem-
po o como resultado de daño físico. Es importante verificar la función del sensor como parte del mantenimiento de rutina
del instrumento. Si se instalan múltiples sensores en el mismo recipiente, se puede generar una señal activa desde un sen-
sor y ésta se puede usar para verificar la detección en otro sensor. Este ejercicio debería garantizar que los sensores estén
detectando las señales acústicas generadas por el proceso. Al comenzar, en la mitad y al final del proceso se debe deter-
minar y monitorear también la "señal acústica aceptable mínima" para los sensores, que sea estadísticamente válida, con
el fin de garantizar el desempeño de los sensores durante una corrida del proceso. Esto se puede establecer a partir de
experimentos rutinarios de la señal de mantenimiento o basándose en los datos históricos de los sensores.
2. Problemasde Interfasedel Sensor-Los sensores se instalan por lo general en la pared exterior del recipiente usado en el
proceso. Para asegurar el sensor a la pared exterior se pueden usar varios tipos de adhesivos (temporales o permanentes).
Durante las limpiezas y movimientos repetidos del recipiente, se puede alterar la unión del sensor al recipiente. La verifica-
ción de la integridad de la instalación debe formar parte del mantenimiento rutinario. En forma similar al punto 1 tratado
7292 (1005) Emisión Acústica / Información General USP42
anteriormente, se puede usar una señal activa para garantizar la unión apropiada entre el sensor y el recipiente, lo cual
ayuda a confirmar la correspondencia de la impedancia acústica.
3. Influenciadel RuidoMecánico-El uso de altas frecuencias reduce significativamente la contribución del ruido mecánico a la
señal acústica detectada, especialmente en funcionamiento a menor escala, aunque no lo elimina completamente. Si se
analiza el efecto de varios ajustes de motor, por ejemplo, se puede determinar si la señal acústica detectada es una fun-
ción del ruido mecánico. Si el efecto es significativo, puede ser necesario usar frecuencias más altas. Es importante recono-
cer y considerar la contribución del ruido mecánico, no importa qué tan reducido sea, a medida que los motores enveje-
cen o se reemplazan.
4. Influenciade las Característicasde la Pareddel Recipiente-Dado que los sensores se colocan a menudo en la pared exterior
del recipiente, el espesor de dicha pared puede afectar la calidad de la señal detectada. Si el recipiente está encamisado,
la amplitud de la señal acústica se puede reducir. Si se agregan más sensores al recipiente se puede mejorar la calidad de
la señal. Como alternativa, se puede obtener un aumento en la señal si se colocan sensores en un lugar donde exista con-
tacto entre las paredes exteriores e interiores, lo que básicamente proporciona una guía de onda entre el sensor y la fuen-
te de sonido. Las guías de onda se pueden incluir también en el diseño del equipo de fabricación para permitir el manito-
reo de la emisión acústica. Es necesario efectuar la validación apropiada para garantizar que esto no afecte adversamente
el desempeño del equipo.
5. Efectode las Propiedadesde los Materiales-Durante el funcionamiento, la señal acústica recolectada es una suma de diver-
sos eventos que ocurren en el proceso. Por ejemplo, la señal acústica generada cuando las partículas golpean la pared en
un granulador es una función de las propiedades materiales de los gránulos (es decir, densidad, tamaño, porosidad). Por
lo tanto, los cambios significativos en cualquiera de estos parámetros pueden afectar la señal acústica y la calidad de la
predicción resultante.
6. Influenciade FactoresRelacionadoscon el Proceso-En forma similar al punto 5 mencionado anteriormente, las propiedades
relacionadas con el proceso (es decir, fuerza del impacto, frecuencia del impacto, cantidad de material) pueden afectar
también la señal acústica y la calidad de la predicción resultante.
7. Impacto de las CondicionesAmbientales-Por último, también se debe tener en cuenta la influencia de los factores ambien-
tales (es decir, temperatura, humedad).
Los datos de emisión acústica recolectados son específicos del recipiente o equipo. No es aconsejable aplicar a un equipo un
modelo generado en otro, porque la información acústica puede diferir como resultado de los problemas comentados en los
puntos 3, 4 y 5.
Calificación y Verificación de Instrumentos de Emisión Acústica

Se debe adoptar un enfoque de aptitud del sistema en lo que respecta al desempeño del instrumento, estableciendo la ópti-
ma configuración de las mediciones y comparando después el desempeño del instrumento con los valores obtenidos durante
el uso rutinario con aquellos obtenidos durante la calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés).
Este enfoque ofrece respuesta a las inquietudes relacionadas con el muestreo porque, a diferencia de otros sistemas analíti-
cos en línea, los transductores pueden ubicarse óptimamente y conectarse para recibir la señal máxima sin modificación del
recipiente.
Las tasas de muestreo tienen que cumplir con el teorema de muestreo de Nyquist, el cual afirma que una señal se debe
muestrear a una tasa que sea el doble del componente de frecuencia más alto en la señal. Se debe usar un filtro de paso bajo
para retirar los componentes de frecuencia que sean mayores que la mitad de la frecuencia de muestreo (frecuencia de
Nyquist). Si no se cumple con este criterio se puede incurrir en solapamiento (aliasing).
Debido a la naturaleza de los transductores piezoeléctricos y dado que las frecuencias de resonancia son propiedades natura-
les de los cristales, no es necesario analizar la variación (reproducibilidad) o derivar en el dominio de frecuencia. Esto puede ser
necesario si se usan otros tipos de transductores. Cualquier cambio considerable en el dominio de frecuencia se registrará co-
mo un descenso en la intensidad de la potencia a la frecuencia de resonancia y por lo tanto está cubierto por los análisis de
intensidad de potencia.
Las dos áreas principales para la verificación del desempeño del instrumento son la intensidad de la potencia y la temporiza-
ción. Cualquier cambio en la intensidad de la señal afectará la señal cruda y el ASLy, por lo tanto, afectará también el espectro
de la potencia. Como consecuencia de los cambios en el proceso (p. ej., variación en dureza o humedad en las partículas que
impactan la pared del recipiente) o de los cambios en la conducción acústica del proceso al transductor se pueden presentar
cambios en la intensidad de la potencia.
La reproducibilidad de la conducción acústica se debe evaluar usando un segundo transductor para registrar un pulso o
"ping" en la frecuencia de resonancia del sensor receptor. Este valor de reproducibilidad representa el ruido de la señal y pue-
de usarse en cálculos del límite de detección (LOO, por sus siglas en inglés) y el límite de cuantificación (LOQ, por sus siglas en
inglés), donde LOO se define como tres veces el ruido de la señal y LOQ es diez veces el ruido de la señal. El ruido a nivel de la
señal de fondo (en la emisión acústica, esta señal de fondo se debe principalmente al ruido del amplificador) se debe calcular a
partir de veinte valores secuenciales de ASLadquiridos a la frecuencia de muestreo usada para el funcionamiento normal. Esta
prueba se debe repetir a la inversa con el fin de establecer que se pueden obtener valores de intensidad estadísticamente simi-
lares en ambos canales.
USP42 Información General/ (1005) Emisión Acústica 7293
La reproducibilidad a corto plazo permite calcular el ruido. Sin embargo, no proporciona una medida de la integridad de la
conducción acústica en el tiempo o, más específicamente, de los cambios causados por el proceso (p. ej., variaciones en las
propiedades adhesivas con cambios del proceso tales como calentamiento y enfriado). La prueba de ruido se debe repetir
mientras se ejecutan los parámetros normales de procesamiento (usando un recipiente vacío) y se debe calcular la deriva en el
ASL.Se deben tomar las precauciones necesarias para garantizar que la deriva en la señal (debido a la variación normal en los
parámetros del proceso) no impacte los modelos quimiométricos usados para la determinación del punto final. Para los gráfi-
cos de tendencia, se debe demostrar que la deriva no es estadísticamente significativa; caso contrario, se deberá corregir la
deriva. Los valores de ruido, deriva y ASLabsoluto se deben registrar y guardar, y repetir las pruebas si se hacen cambios al
equipo de procesamiento o al sistema de emisión acústica. Si no se hacen cambios, las pruebas se deben repetir todos los me-
ses. De esta forma se puede demostrar que la calidad de la conducción acústica está intacta y cualquier cambio a la intensidad
de la señal se puede aislar y atribuir al proceso mismo.
Durante el uso rutinario se recomienda ejecutar la prueba de ruido (como se describe anteriormente) antes de cada corrida
del proceso y calcular la intensidad de la potencia y el ruido. Estos valores se deben registrar y comparar con los generados
tanto durante el uso previo como durante la instalación. El impacto de la desviación con respecto a valores previos dependerá
del modelo de predicción y se debe considerar mediante la validación del método.
Los datos de ruido (de lo anterior) se pueden usar también para calcular el tiempo de vuelo del pulso. Si la activación del
pulso y la recepción de la señal están sincronizados, se puede medir el tiempo tomado por el pulso para transmitir a través del
recipiente. Esta es una buena indicación de la medición electrónica, así como de la condición general de la conducción acústi-
ca. Sin embargo, esta prueba se debe considerar como una medición de la condición del "sistema" y se debe ejecutar solo si
se han hecho cambios al equipo del proceso o al sistema de emisión acústica, o cada 6 meses. La correlación de los tiempos
medidos con los históricos debe ser estadísticamente válida. De no ser así, esto es un indicador de que el sistema de emisión
acústica puede necesitar recalificación por parte del fabricante o proveedor del instrumento o de que hay cambios en la con-
ducción acústica.
Todas estas pruebas requieren el uso de un pulso acústico generado eléctricamente. Una falla en cualquiera de las pruebas
antes mencionadas se puede atribuir a la generación misma de la señal. Se recomienda que el sistema de generación de pulsos
eléctricos sea recalificado y certificado de acuerdo con estándares rastreables al Instituto Nacional de Estándares y Tecnología
(NIST,por sus siglas en inglés) cada 12 meses.
ANÁLISIS
DELOSDATOS
La emisión acústica de granuladores y secadores de lecho fluido se conoce como emisión acústica continua. La emisión acús-
tica continua es afásica (es decir, la señal no tiene comienzo ni interrupción). Esto significa que no es necesario usar las técnicas
de procesamiento de la señal que preservan la fase. El análisis espectral de potencia es una técnica útil para procesar las señales
de emisión acústica. La información en los espectros de potencia, a diferencia de las señales crudas de emisión acústica, es
coherente en el corto plazo, permitiendo promediar la señal. Esto proporciona un mejor cálculo de la densidad espectral de
potencia que el proporcionado por un único espectro de potencia.
Para detectar puntos finales en procesos de lotes (p. ej., punto final de granulación o secado) es apropiado un modelo multi-
variado cualitativo (p. ej., PCA o SIMCA).Efectuar la siguiente secuencia de operaciones:
(1) Entrenamiento o Calibración-Obtener los espectros de emisión acústica que sean representativos del punto final.
(2) Modelado-Crear un modelo multivariado que describa la distribución de las señales de emisión acústica en el punto final.
(3) Predicción-Comparar los espectros de emisión acústica contra el modelo. Monitorear el ajuste al modelo (expresado por
lo general en términos de un número de desviaciones estándar). A medida que el sistema se aproxima al punto final, el
ajuste mejora y se establece la finalización del proceso una vez que el modelo concuerda con los criterios predefinidos. El
modelo de predicción se genera a partir de los espectros de emisión acústica obtenidos del proceso funcionando en con-
diciones normales. Las perturbaciones (p. ej., la aglomeración indeseada en los equipos de recubrimiento) se detectan ob-
servando las desviaciones estadísticamente válidas con respecto al modelo.
El modelado adaptativo también se ha propuesto para la detección de perturbaciones. Esto implica generar continua-
mente modelos multivariados a medida que se adquieren las señales de emisión acústica. La desviación inusual de la señal
de emisión acústica indica la ocurrencia de una perturbación del proceso. La ventaja del modelo adaptativo es que no es
necesario efectuar un paso de calibración por separado.
GLOSARIO
Amplitud: La magnitud o potencia de una forma de onda variable.

Convertidor RMS a CC (RMS-to-DC, por sus siglas en inglés): Es un dispositivo electrónico que convierte una señal alterna
a un nivel de voltaje proporcional a la potencia promedio en la señal.
Densidad Espectral de Potencia: La medida de la potencia de emisión acústica en cada elemento de resolución del espectro
de potencia.
EmisiónAcústicaContinua: Señales de emisión acústica que no se pueden separar en el tiempo y son típicas de procesos
farmacéuticos tales como granulación y secado en lecho fluido.
7294 (1005) Emisión Acústica / InformaciónGeneral USP42
Espectro de Potencia: El espectro de potencia de una señal es una representación de la potencia de la señal en función de la
frecuencia. El espectro de potencia se calcula a partir de la señal del dominio tiempo por medio de un algoritmo de Transfor-
mada Rápida de Fourier (TRF).Resulta útil estudiar las señales de emisión acústica en el dominio espectral o de frecuencia, ya
que a menudo el espectro es característico del mecanismo. Se pueden obtener mejoras en la relación señal-ruido al promediar
un número de espectros de potencia, ya que estos son coherentes.
Filtrado de Señal: Filtrar una señal significa atenuar las frecuencias por fuera de un rango prescrito. En trabajos de emisión
acústica, se usa el filtrado de paso de banda para mejorar la relación señal-ruido al atenuar el ruido fuera del ancho de banda
del sensor. Elfiltrado de paso bajo se usa para eliminar frecuencias más altas que la frecuencia Nyquist con el fin de evitar el
solapamiento.
Frecuencia Nyquist: La frecuencia Nyquist está definida como la mitad de la tasa de muestreo digital y es la frecuencia más
alta que se puede reproducir confiablemente.
Frecuencia Resonante: La frecuencia a la cual es más sensible un sensor de emisión acústica. Los sensores de emisión acústi-
ca resonantes tienen una frecuencia de resonancia claramente definida, pero por lo general son sensibles a otras frecuencias.
Ganancia: Elfactor de amplificación para un componente, expresado generalmente en términos de decibeles (dB).
Ganancia en dB = 20 log 10 (Voltajede,.1;daVoltajedeentrada).
Impedancia Acústica: La impedancia acústica (Z) se define como Z = pv (donde pes la densidad y ves la velocidad del soni-
do). Es un dato importante que informa la proporción de la energía del sonido transmitida de un medio a otro y la cantidad de
energía reflejada en la interfase.
Modelado Adaptativo: Es un método que predice el estado de un proceso sin el uso de un modelo generado previamente
(es decir, no hay un entrenamiento ni un paso de calibración previos).
Modo de Corte (Gzalladura): Un modo transverso de transmisión acústica que se presenta solo en sólidos.
Modo Compresiona!: Un modo longitudinal de transmisión acústica encontrado en sólidos, líquidos y gases.
Modo Transversal: Un modo de propagación de la onda donde el desplazamiento del material es perpendicular a la direc-
ción de la propagación. Estos modos solo se encuentran en materiales sólidos.
Nivel Medio de Señal (ASL): Una medida de la potencia promedio en una señal de emisión acústica.
Paso de Banda: El intervalo de frecuencias dentro de las cuales funciona un componente.
Piezoeléctrico: Un material que al comprimirse genera un campo eléctrico. Los materiales piezoeléctricos se usan en la cons-
trucción de sensores de emisión acústica. Un material común es el titanato de circonio y plomo (PZT).
Propiedades de Tipo Parpadeante (flickernoise): Un tipo de señal asociada con muchos procesos naturales. Las característi-
cas del ruido parpadeante son: la potencia del ruido es directamente proporcional a la señal y tiene aproximadamente una
distribución de densidad espectral de 1/f (f = frecuencia).
Ruido Blanco: El ruido blanco se caracteriza por un espectro de potencia de densidad espectral uniforme y está asociado con
procesos puramente aleatorios.
Solapamiento (aliasing): Los componentes espurios de baja frecuencia que aparecen en la señal y son en realidad frecuen-
cias por encima de la frecuencia Nyquist.
Transductor de Emisión Acústica: Un dispositivo en estado sólido que incorpora por lo general un elemento piezoeléctrico
para convertir la onda de emisión acústica a una señal eléctrica.
(101 O) DATOSANALÍTICOS-INTERPRETACIÓNY TRATAMIENTO
INTRODUCCIÓN
Este capítulo proporciona información acerca de las prácticas aceptables para el análisis e interpretación uniforme de los da-
tos obtenidos de los análisis químicos y otros análisis. Se describen además algunos métodos estadísticos básicos para la eva-
luación de datos y se analiza en cierto detalle el tratamiento de los resultados aberrantes y la comparación de procedimientos
analíticos.
[NOTA-No debe inferirse que las herramientas de análisis mencionadas en este capítulo conforman una lista exhaustiva. Pue-
den utilizarse otros métodos estadísticos igualmente válidos a criterio del fabricante y demás usuarios de este capítulo.]
La garantía de calidad de los productos farmacéuticos se logra combinando una serie de prácticas, que incluyen un diseño
robusto de la formulación, validación, análisis de materias primas, análisis durante el proceso y pruebas del producto final. Ca-
da una de estas prácticas depende de procedimientos de prueba confiables. Durante el proceso de desarrollo, se desarrollan y
validan procedimientos de prueba para asegurar que los productos fabricados estén perfectamente caracterizados. Las pruebas
del producto final permiten comprobar que los productos son uniformemente seguros y eficaces, y que cumplen con sus espe-
cificaciones.
Las mediciones son intrínsecamente variables y la USP reconoce tal variabilidad para las pruebas biológicas desde hace mu-
cho tiempo. La necesidad de tener en cuenta esta variabilidad cuando se analizan datos de pruebas biológicas, por ejemplo, se
trata en el capítulo Análisisde ValoracionesBiológicas (1034). Las mediciones de análisis químicos comúnmente utilizadas para
analizar productos farmacéuticos también son intrínsecamente variables, aunque en menor grado que las pruebas biológicas.
USP42 InformaciónGeneral/ (101O) Datos Analíticos 7295
No obstante, en muchos casos los criterios de aceptación son proporcionalmente más estrictos y, en consecuencia, debe tener-
se en cuenta esta menor variabilidad aceptable cuando se analizan datos obtenidos por procedimientos analíticos. Si no se ca-
racteriza ni se especifica la variabilidad de una medición junto con el resultado obtenido, los datos solo pueden interpretarse
en el sentido más limitado. Por ejemplo, si se especifica que la diferencia entre los promedios de los resultados obtenidos por
dos laboratorios al analizar el mismo conjunto de muestras es del 10%, la interpretación es limitada en cuanto a la importancia
de dicha diferencia a menos que se especifique la variabilidad dentro de cada laboratorio.
Este capítulo proporciona indicaciones para el tratamiento e interpretación científicamente aceptables de los datos. Se des-
criben además herramientas estadísticas que pueden resultar útiles para la interpretación de los datos analíticos. Muchas esta-
dísticas descriptivas, como la desviación estándar y la media, son de uso difundido. Otras herramientas estadísticas, como las
pruebas de resultados aberrantes, pueden realizarse utilizando diferentes métodos científicamente válidos, de los cuales tam-
bién se incluyen ejemplos y sus aplicaciones. El marco dentro del cual se interpretan los resultados de una prueba farmacopei-
ca se describe en detalle en Advertenciasy RequisitosGeneralesl. Resultadosde Pruebas.En el Apéndice7 al final de este capítu-
lo, se incluye una selección de referencias útiles para obtener información adicional sobre las herramientas estadísticas aquí
descritas. La USP no avala específicamente las referencias citadas, que no constituyen una lista exhaustiva. Puede encontrarse
información adicional sobre cualquiera de los métodos citados en este capítulo en la mayoría de los textos de estadística.
PRE-REQUISITOS
PARALASPRÁCTICAS
Y PRINCIPIOS
DE LABORATORIO
La correcta aplicación de los principios estadísticos a los datos de laboratorio supone que estos datos han sido obtenidos de
forma rastreable (es decir, documentada) y sin sesgo. Para asegurarse de ello, son útiles las prácticas siguientes.
Mantenimiento Adecuado de Registros
Los registros de laboratorio deben mantenerse con suficiente detalle para que otros analistas igualmente calificados puedan
reconstruir las condiciones experimentales y revisar los resultados obtenidos. Por lo general, al obtener datos, deben utilizarse
más decimales que los requeridos en la especificación y las cifras solo deben redondearse una vez realizados los cálculos finales,
conforme a lo establecido en las Advertenciasy RequisitosGenerales,7.20 Reglaspara Redondeo.
Consideraciones Relativas al Muestreo
Un muestreo eficaz es un paso importante para la evaluación de un atributo de calidad de una población. El objetivo del
muestreo es proporcionar datos representativos (la muestra) para estimar las propiedades de la población. La manera en que
se obtiene dicha muestra depende totalmente de la pregunta que se busca responder con los datos de la muestra. Por lo gene-
ral, un proceso aleatorio se considera la manera más adecuada de seleccionar una muestra. De hecho, es necesario utilizar una
muestra aleatoria e independiente para asegurar que los datos obtenidos produzcan estimaciones válidas acerca de las propie-
dades de la población. La generación de una muestra no aleatoria o "de conveniencia" conlleva el riesgo de que las estimacio-
nes estén sesgadas. Eltipo de muestreo aleatorio más directo se conoce como muestreoaleatoriosimpley es un proceso en el
que cada unidad de la población tiene la misma probabilidad de aparecer en la muestra. No obstante, en algunos casos, este
método de selección de muestra aleatoria no es óptimo ya que no garantiza la misma representatividad en relación con todos
los factores (es decir, tiempo, lugar, máquina) que podrían influir en las propiedades críticas de la población. Por ejemplo, si se
requieren 12 horas para fabricar todas las unidades de un lote y es fundamental que la muestra sea representativa de todo el
proceso de producción, no sería adecuado tomar una muestra aleatoria simple al finalizar la producción ya que no se puede
garantizar que contenga una cantidad similar de unidades fabricadas en cada período del proceso de 12 horas. En estos casos
es mejor tomar una muestraaleatoriasistemática,seleccionando al azar una unidad del proceso de producción a intervalos o
en lugares sistemáticamente seleccionados (p. ej., muestreando cada 30 minutos, entre las unidades producidas durante ese
período) para asegurarse de incluir en la muestra unidades tomadas durante todo el proceso de fabricación. Se requerirá otro
tipo de procedimiento de muestreo aleatorio si, por ejemplo, un producto se introduce en los viales usando cuatro máquinas
de llenado diferentes. En este caso, sería importante tomar una muestra aleatoria de los viales de cada una de las máquinas de
llenado. Una muestraaleatoriaestratificada,método que consiste en tomar una muestra al azar del mismo número de viales en
cada una de las cuatro máquinas de llenado, cumple con este requisito. Independientemente del motivo del muestreo (p. ej.,
prueba de liberación de partida), debe establecerse un plan de muestreo que indique detalladamente cómo se debe obtener la
muestra para asegurar que sea representativa de toda la población y que los datos resultantes tengan la sensibilidad requerida.
La estrategia de muestreo óptima depende del conocimiento de los procesos de fabricación y medición analítica. Una vez defi-
nido el plan de muestreo, es probable que incluya cierto elemento de selección aleatoria. Por último, debe obtenerse una can-
tidad de muestra suficiente para el análisis original, los análisis de verificación subsiguientes y otros análisis. Se recomienda
consultar a un estadístico para identificar la estrategia de muestreo óptima.
Las pruebas que se describen en el resto de este capítulo suponen que se ha realizado un muestreo aleatorio simple.
7296 (101 O) Datos Analíticos / Información General USP42
Uso de Estándaresde Referencia

Cuando una prueba o valoración de los compendios USPo NFindique el uso de un Estándar de Referencia USP,solo se con-
siderarán concluyentes los resultados obtenidos usando el Estándar de Referencia USP especificado con respecto a la demostra-
ción del cumplimiento de la norma USP o NF. Aunque las normas USP son aplicables durante toda la vida de un artículo, desde
su producción hasta su caducidad, la USP no especifica cuando se deben realizar las pruebas ni la frecuencia de análisis. Por lo
tanto los usuarios de los compendios USPy NF deben aplicar una variedad de estrategias y prácticas para asegurar que los
artículos cumplan con los requisitos farmacopeicos y mantengan dicho cumplimiento, incluyendo el momento y la necesidad
de realizar las pruebas. Dichas estrategias y prácticas pueden incluir el uso de estándares secundarios rastreables al Estándar de
Referencia USP,para complementar o sustentar cualquier análisis realizado con el propósito de demostrar de manera conclu-
yente el cumplimiento con los estándares farmacopeicos aplicables. Debido a que la asignación de un valor a un estándar es
uno de los factores más importantes de la exactitud de un análisis, es fundamental hacerlo correctamente.
Verificacióndel Desempeñodel Sistema

La verificación de un nivel del desempeño aceptable de un sistema analítico que se utiliza en forma rutinaria o continua pue-
de ser una práctica valiosa. Esto se puede lograr analizando una muestra de control a intervalos adecuados o examinando
otros factores, como la variación entre estándares, las relaciones señal-ruido de fondo, etc. Si se realiza un seguimiento del
parámetro medido, por ejemplo graficando los resultados del análisis de una muestra de control, se pueden detectar cambios
en el desempeño que requieren el ajuste del sistema analítico. El Apéndice1 proporciona un ejemplo de una gráfica de control.
Validacióndel Procedimiento
Todos los procedimientos analíticos deben validarse según se especifica en Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos
(1225). Los procedimientos analíticos publicados en la USP-NFse han validado y cumplen con los requisitos reglamentarios de
Buenas Prácticas de Fabricación vigentes establecidos en el Código de Reglamentos Federales. Los procedimientos validados
pueden utilizarse para analizar una nueva formulación (por ejemplo, un nuevo producto, forma de dosificación o producto
intermedio de un proceso) únicamente después de verificar que la nueva formulación no interfiere con la exactitud, linealidad
ni precisión del método. No puede suponerse que un procedimiento validado puede medir correctamente el ingrediente acti-
vo de una formulación que es diferente a la utilizada para establecer la validez original del procedimiento. [NOTASOBRE
TERMINOLOGÍA-La definición de exactitud en el capítulo (1225) y en ICH Q2 corresponde únicamente a ausencia de sesgo. Para
el Vocabulario Internacional de Metrología (VIM, por sus siglas en inglés) y la documentación de la Organización Internacional
de Normalización (ISO, por sus siglas en inglés), exactitudtiene un significado distinto. Para ISO, exactitud combina los concep-
tos de ausencia de sesgo (denominada certeza)y precisión. Este capítulo sigue a la definición del capítulo (1225), que corres-
ponde únicamente a veracidad.]
PRINCIPIOSDE MEDICIÓNY VARIACIÓN

Todas las mediciones son, en el mejor de los casos, estimaciones del valor real ("verdadero" o "aceptado"), ya que contie-
nen una variabilidad aleatoria (también denominada error aleatorio) y, en algunos casos, un error sistemático (sesgo). En con-
secuencia, el valor medido difiere del valor real debido a la variabilidad intrínseca de la medición. Si un conjunto de medicio-
nes consta de resultados individuales representativos del todo, pueden usarse métodos estadísticos para estimar propiedades
informativas de la totalidad y otras pruebas estadísticas para determinar si es probable que dichas propiedades cumplan con
los requisitos establecidos. Los análisis estadísticos resultantes deben considerar la variabilidad asociada con el proceso de me-
dición, así como la variabilidad de la entidad que se está midiendo. Las mediciones estadísticas usadas para evaluar la dirección
y magnitud de estos errores incluyen la media, la desviación estándar y expresiones derivadas de éstas, como el coeficiente de
variación porcentual (%CV,también denominado desviación estándar relativa porcentual o %RSD). La variabilidad estimada
puede usarse para calcular intervalos de confianza para la media, o mediciones de variabilidad, e intervalos de tolerancia que
capturan una proporción especificada de las mediciones individuales.
El uso de mediciones estadísticas debe complementarse con el buen juicio, especialmente con respecto al muestreo repre-
sentativo. Los datos deberían ser congruentes con las suposiciones estadísticas usadas para el análisis. Puede ser necesario el
uso de métodos alternativos para la evaluación de los datos si se considera que una o más de estas suposiciones han sido viola-
das. En particular, la mayoría de las mediciones estadísticas y pruebas citadas en este capítulo suponen que la distribución de la
población total es una distribución normal y que la muestra analizada es un subconjunto representativo de dicha población. La
distribución normal (o gaussiana) tiene forma de campana, es simétrica respecto de su centro y tiene ciertas características
requeridas para que estas pruebas sean válidas. No siempre se puede esperar que los datos sigan una distribución normal, pu-
diéndose requerir de una transformación para que se ajusten a la misma. Por ejemplo, existen variables que tienen distribucio-
nes cuyo gráfico muestra una cola más larga hacia la derecha que hacia la izquierda. Por lo general, estas distribuciones pue-
den volverse aproximadamente normales mediante una transformación logarítmica. Un método alternativo sería el uso de pro-
cedimientos estadísticos "independientes de la distribución" o "no paramétricos" que no requieren que la población tenga
USP42 Información General/ (101 O) Datos Analíticos 7297
una distribución normal. Cuando el objetivo es determinar un intervalo de confianza para la media o para la diferencia entre
dos medias, por ejemplo, la suposición de normalidad no es tan importante debido al teorema de límite central. No obstante,
debe verificarse la normalidad de los datos para calcular intervalos de confianza válidos para desviaciones estándar y relaciones
de las desviaciones estándar, para realizar algunas pruebas de resultados aberrantes y para determinar límites de tolerancia es-
tadística válidos. En este último caso, la normalidad es una suposición fundamental. Los métodos gráficos simples, como gráfi-
cos de puntos, histogramas y gráficos de probabilidad normales, son útiles para verificar esta suposición.
Una medición analítica simple puede ser útil para evaluar la calidad si la muestra proviene de un lote que se ha preparado
utilizando un proceso documentado debidamente validado y si los errores analíticos son bien conocidos. El resultado analítico
obtenido puede condicionarse incluyendo una estimación de los errores asociados. En algunos casos puede considerarse el uso
de promedios ya que la variabilidad asociada con un valor promedio siempre es menor que la variabilidad de las mediciones
individuales. La opción de utilizar mediciones individuales o promedios depende de la aplicación de la medición y su variabili-
dad. Por ejemplo, cuando se obtienen mediciones múltiples con la misma alícuota de muestra, como en el caso de varias in-
yecciones de muestra en un método de HPLC,por lo general es aconsejable promediar los datos obtenidos, por la razón que
se mencionó anteriormente.
La variabilidad se asocia con la dispersión de observaciones en torno al centro de una distribución. El parámetro estadístico
más comúnmente utilizado para medir el centro es la media de la muestra (x):
n
-
L,X1
i=1 X1+X2+ ... +Xn
X=--=---""------"
n n
La variabilidad del procedimiento analítico puede estimarse de varias maneras diferentes. La evaluación más común y útil de
la variabilidad de un procedimiento es la determinación de la desviación estándar basada en mediciones independientes repe-
tidas' de una muestra. La desviación estándar de la muestra, s, se calcula por la fórmula:
n 2
¡ (x;-x)/(n - 1)
/ =1
en donde X; es la medición individual en un conjunto de n mediciones; y xes la media de todas las mediciones. A continua-
ción, se calcula la desviación estándar relativa porcentual (%RSD) como:
%ASO= ~X • 100%
y se expresa como un porcentaje. Si los datos requieren la transformación logarítmica para lograr la normalidad (p. ej., para
valoraciones biológicas), existen métodos alternativos. 2
Debe realizarse un estudio de precisión para obtener una mejor estimación de la variabilidad del procedimiento. El estudio
de precisión puede diseñarse para determinar la precisión intermedia (que incluye los componentes de variabilidad "entre aná-
lisis" e "intra-análisis") y la repetibilidad (variabilidad "intra-análisis"). Los estudios de precisión intermedia deben permitir
cambios en las condiciones experimentales que podrían esperarse, como por ejemplo diferentes analistas, diferentes prepara-
ciones de reactivos, diferentes días y diferentes instrumentos. Para realizar un estudio de precisión, la prueba debe repetirse
varias veces. Cada análisis debe ser completamente independiente de los demás para obtener estimaciones exactas de los dife-
rentes componentes de variabilidad. Además, dentro de cada análisis, deben realizarse determinaciones repetidas para estimar
la repetibilidad. Ver un ejemplo de un estudio de precisión en el Apéndice2.
1 Lasmedicionesmúltiples(o, por equivalencia,los erroresexperimentalesasociadoscon las medicionesmúltiples)son independientesentre sí cuando se puede

suponerque representanuna muestraaleatoriade la población.En estasmuestras,la magnitud de una mediciónno estáinfluenciadapor otra mediciónni influye
en la magnitud de ninguna otra medición. La falta de independencia implica que las mediciones están correlacionadas en función del tiempo o del espacio. Consi-
deremos,por ejemplo,una placade microtitulaciónde 96 pocillos.Supongamosque, por causadesconocida,se produceun error experimentalcon valor bajo
(error negativo)en una muestracolocadaen la primeracolumna y que entoncesestamismacausaproduceun valor bajo para una muestracolocadaen la segun-
1
da columna; en este caso, las dos mediciones resultantes no son estadísticamente independientes. Una manera de evitar dichas posibilidades sería aleatorizar la
colocaciónde lasmuestrasen la placa.
2 Cuando los datos se han transformado logarítmicamente (base e) para lograr la normalidad, la %RSD es:
%ASO= 100% · ✓e-~- 1·
Estopuede aproximarserazonablementesegún:
%ASO= 100% • (e'-1)
en donde ses la desviación estándar de los datos transformados logarítmicamente (base e).
4
Puede considerarse un intervalo de confianza en la interpretación de los datos. Estos intervalos se calculan a partir de varios
datos usando la media (x) y la desviación estándar de la muestra(s) según la fórmula:
- s - s )
(X - ta/2, n - 1 fn ,X + ta/2, n - 1 fn
en donde tª 12,n- 1 es un número estadístico que depende del tamaño de la muestra (n), el número de grados de libertad (n - 1)
y el nivel de confianza deseado (1 - a). Sus valores se obtienen a partir de las tablas publicadas de la distribución t de Student.
El intervalo de confianza proporciona una estimación del intervalo donde cae la media de la población "verdadera" (µ) y, ade-
más, evalúa la confiabilidad de la media de la muestra como una estimación de la media verdadera. Si se repitiera la misma
configuración experimental una y otra vez y se calculara cada vez un intervalo de confianza del 95% (por ejemplo) para la
media verdadera, entonces se esperaría que el 95% de dichos intervalos incluyera la media verdadera, µ. No se puede afirmar
con seguridad si el intervalo de confianza derivado de un conjunto de datos específicos obtenidos contiene µ. No obstante,
suponiendo que los datos representan mediciones independientes entre sí generadas en forma aleatoria a partir de una pobla-
ción normalmente distribuida, el procedimiento usado para determinar el intervalo de confianza garantiza que el 95% de di-
chos intervalos de confianza contienen µ. Debe tenerse en cuenta que es importante definir la población apropiadamente para
capturar todas las fuentes de variación pertinentes. [NOTASOBRE TERMINOLOGÍA-La documentación de la Organización Interna-
cional de Normalización (ISO) utiliza diferente terminología para algunos de los conceptos aquí descritos. En la documenta-
ción de la ISO, al término s/✓n, comúnmente denominado como error estándar de la media, se denomina incertidumbre es-
tándar. Asimismo, la ISO denomina al término tª 12 , 0 _ 1 S/✓n como incertidumbre expandida, mientras que denomina a tª , _ 1
12 0
como factor de cobertura. Cuando la desviación estándar se calcula combinando los estimados de variabilidad de diversas
fuentes, recibe el nombre de incertidumbre estándar combinada. Algunas de estas fuentes podrían tener estimaciones no esta-
dísticas de incertidumbre, denominadas incertidumbres Tipo B, como la incertidumbre en la calibración de una balanza.]
RESULTADOSABERRANTES
Ocasionalmente, los resultados analíticos observados son muy diferentes de los esperados. Las observaciones aberrantes,
anómalas, contaminadas, discordantes, falaces, sospechosas o absurdas, así como otros tipos de valores erráticos, se denomi-
nan resultados aberrantes. Al igual que todos los resultados de laboratorio, estos resultados aberrantes se deben documentar,
interpretar y manejar. Dichos resultados pueden ser mediciones exactas de lo que se está midiendo aunque diferentes de los
valores esperados. En otros casos, debido a un error en el sistema analítico, los resultados pueden no ser típicos, aunque la
entidad que se mide sea típica. Cuando se obtiene un resultado aberrante, deben realizarse investigaciones sistemáticas del
laboratorio y, en algunos casos, de los procesos para establecer la causa de ese resultado. Los factores que deben considerarse
al investigar un resultado aberrante incluyen, entre otros, error humano, error de instrumentación, error de cálculo y deficien-
cias del producto o de sus componentes. Si se encuentra una causa no relacionada con la deficiencia del producto o de sus
componentes, pueden repetirse las pruebas con la misma muestra, en lo posible, o con una muestra nueva. Deben examinarse
la precisión y exactitud del procedimiento, el Estándar de Referencia USP,las tendencias del proceso y los límites de la especifi-
cación. Los datos pueden considerarse no válidos, según esta investigación documentada, y eliminarse de los cálculos posterio-
res.
Si no se encuentra una causa atribuible que se pueda documentar para el resultado aberrante de laboratorio, el resultado
puede analizarse, como parte de toda la investigación, para determinar si se trata de un resultado aberrante.
No obstante, se requiere una cuidadosa consideración cuando se utilizan estas pruebas. Pueden producirse dos tipos de
errores en las pruebas de los resultados aberrantes: (a) identificar observaciones como resultados aberrantes cuando en reali-
dad no lo son; y (b) no identificar resultados aberrantes que sí existen. Cualquier conclusión acerca de la aceptabilidad de los
datos en que se observan resultados aberrantes requiere una interpretación cuidadosa.
La "designación de resultado aberrante" es el reconocimiento informal de valores de laboratorio sospechosos que deben in-
vestigarse con métodos más formales. La elección de la técnica correcta para la identificación de resultados aberrantes suele
depender del reconocimiento inicial del número y ubicación de los valores. Frecuentemente, la designación de resultado abe-
rrante se hace visualmente con técnicas gráficas. La "identificación de resultados aberrantes"es el uso de pruebas de significan-
cia estadística para confirmar que los valores no cumplen con el modelo estadístico conocido o supuesto.
Cuando se utilizan adecuadamente, las pruebas de resultados aberrantes son herramientas valiosas para los laboratorios far-
macéuticos. Existen varias pruebas para detectar resultados aberrantes. Se incluyen en el Apéndice3 ejemplos ilustrativos de
tres de estos procedimientos: la Prueba de Desviación Estudentizada Extrema (ESD, por sus siglas en inglés), la Prueba de Di-
xon y la Regla de Hampel.
La elección de la prueba de resultados aberrantes adecuada depende del tamaño de la muestra y de las suposiciones de
distribución. Muchas de estas pruebas (p. ej., la Prueba ESD) requieren la suposición de que los datos generados por el labora-
torio puedan considerarse como una muestra aleatoria de una población normalmente distribuida, posiblemente después de
su transformación. Si se realiza una transformación de los datos, la prueba de resultado aberrante se aplica a los datos transfor-
mados. Las transformaciones más comunes incluyen tomar el logaritmo o la raíz cuadrada de los datos. Existen otros métodos
para la manipulación de un resultado aberrante simple y un resultado múltiple que también pueden utilizarse, e incluyen prue-
bas que utilizan medidas robustas de dispersión y tendencia central, como por ejemplo la mediana y la desviación absoluta de
la mediana y métodos de análisis exploratorio de datos (EDA,por sus siglas en inglés). El "Acomodamiento de resultados abe-
rrantes" es el uso de técnicas robustas, tales como pruebas basadas en el orden o rango de cada valor en el conjunto de datos
en lugar del valor real, para producir resultados que no estén adversamente influidos por la presencia de resultados aberrantes.
El uso de dichos métodos reduce los riesgos asociados con ambos tipos de error en la identificación de resultados aberrantes.
El "rechazo de resultados aberrantes" es la eliminación efectiva del resultado aberrante identificado del conjunto de datos.
No obstante, una prueba de resultado aberrante no puede ser el único medio para eliminar un resultado aberrante de los da-
tos de laboratorio. Una prueba de resultado aberrante puede resultar útil como parte de la evaluación de la significancia de ese
resultado, junto con otros datos. Las pruebas de resultado aberrante no son válidas en aquellos casos en que se está evaluando
la variabilidad del producto, como por ejemplo la uniformidad del contenido, la disolución o la determinación de la velocidad
de liberación. En estos casos, un valor considerado como resultado aberrante puede ser en realidad un resultado exacto de un
producto no uniforme. Todos los datos, especialmente los resultados aberrantes, deben conservarse para su análisis futuro. Los
datos inusuales, cuando se observan en el contexto de otros datos históricos, por lo general no son tales sino que reflejan las
influencias de fuentes adicionales de variación.
En resumen, el rechazo o la conservación de un resultado aparentemente aberrante puede ser una fuente grave de sesgo.
Deben tenerse en cuenta las características de las pruebas, así como el conocimiento científico del proceso de fabricación y el
procedimiento analítico, para determinar el origen del resultado aparentemente aberrante. Una prueba de resultado aberrante
nunca puede reemplazar una investigación de laboratorio exhaustiva sino que debe realizarse únicamente cuando la investiga-
ción no es concluyente y no se observaron desviaciones en la fabricación o pruebas del producto. Incluso si dichas pruebas
estadísticas indicaran que uno o más valores son resultados aberrantes, deben conservarse igualmente en los registros. La in-
clusión o exclusión de resultados aberrantes en los cálculos para evaluar la conformidad del producto con los criterios de acep-
tación debe basarse en el juicio científico y en las normas internas del fabricante. Suele ser útil realizar los cálculos con y sin los
resultados aberrantes para evaluar su impacto.
Los resultados aberrantes que se atribuyen a errores en el proceso de medición deben informarse (es decir, mediante una
nota al pie de página), pero no incluirse en los cálculos estadísticos posteriores. Al evaluar si el producto cumple con un criterio
de aceptación en particular, es importante definir si el resultado a informar (el resultado que se compara con los límites) es un
valor promedio, una medición individual u otra cosa. Por ejemplo, si el criterio de aceptación se establece para un promedio,
entonces no es estadísticamente apropiado requerir que las mediciones individuales también cumplan con el criterio, ya que la
variabilidad asociada con el promedio de una serie de mediciones es menor que la de cualquier medición individual.
COMPARACIÓN DE PROCEDIMIENTOSANALÍTICOS
Con frecuencia es necesario comparar dos procedimientos para determinar si hay una diferencia importante en sus resulta-
dos promedios o sus variabilidades. El objetivo de un experimento de comparación de procedimientos es generar datos ade-
cuados que permitan evaluar la equivalencia de los dos procedimientos en toda una gama de valores. En esta sección se descri-
ben algunos de los factores que se deben tener en cuenta al realizar dichas comparaciones.
Precisión
La precisión es el grado de coincidencia entre los resultados de pruebas individuales cuando el procedimiento analítico se
aplica repetidamente a una muestra homogénea. Para considerar que un procedimiento alternativo tiene una precisión "com-
parable" a la del procedimiento vigente, su precisión (ver Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos(1225), Valoración)no de-
be ser peor que la del procedimiento vigente en un valor considerado importante. Una disminución en la precisión (o aumen-
to en la variabilidad) puede aumentar el número de resultados que no cumplan con las especificaciones requeridas. Por el con-
trario, un procedimiento alternativo que proporciona una precisión superior es aceptable.
Una manera de comparar la precisión de dos procedimientos es estimando la varianza de cada procedimiento (la varianza
de la muestra, s2, es el cuadrado de la desviación estándar de la muestra) y calculando un intervalo de confianza superior unila-
teral para la relación de varianzas (verdaderas), en donde relación se define como la varianza del procedimiento alternativo
dividida por la varianza del procedimiento vigente. Se incluye un ejemplo basado en esta suposición en el Apéndice4 El límite
de confianza superior unilateral debe compararse con un límite superior considerado aceptable, a priori, por el laboratorio ana-
lítico. Si el límite de confianza superior unilateral es inferior a este límite aceptable superior, la precisión del procedimiento al-
ternativo se considera aceptable, ya que el uso del procedimiento alternativo no llevará a una pérdida importante de precisión.
Debe tenerse en cuenta que si el límite de confianza superior unilateral es inferior a uno, se ha comprobado que el procedi-
miento alternativo tiene una precisión superior a la del procedimiento vigente.
El método de intervalo de confianza que se acaba de describir es preferible a la prueba F en dos muestras para evaluar la
significancia estadística de la relación de varianzas. Para realizar la prueba F de dos muestras, la relación de varianzas calculada
con las muestras se compara con un valor crítico basado en los valores tabulados de la distribución F para el nivel de confianza
deseado y el número de grados de libertad de cada varianza. La mayoría de los textos de estadística incluyen tablas con los
valores F.Si la relación calculada excede este valor crítico, se dice que existe una diferencia estadísticamente significativa en la
precisión de los dos procedimientos. No obstante, si la relación calculada es inferior al valor crítico, esto no prueba que los
4
procedimientos tienen la misma precisión o una precisión equivalente, sino que no hay suficiente evidencia para probar que
existe una diferencia estadísticamente significativa.
Exactitud
La comparación de la exactitud de los procedimientos (ver Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos(1225), Valoración)
proporciona información útil para determinar si el nuevo procedimiento es equivalente, en general, al procedimiento vigente.
Un método sencillo para realizar esta comparación es calcular un intervalo de confianza para la diferencia entre las medias ver-
daderas, donde la diferencia se calcula restando la media del procedimiento vigente de la media de la muestra obtenida con el
procedimiento alternativo.
El intervalo de confianza debe compararse con un límite inferior y un límite superior considerados aceptables, a priori, por el
laboratorio. Si el intervalo de confianza cae totalmente dentro del rango aceptable, los dos procedimientos pueden considerar-
se equivalentes, ya que la diferencia promedio entre ellos es insignificante en la práctica. El límite inferior y el superior del inter-
valo de confianza solo muestran el tamaño de la posible diferencia real entre los dos procedimientos y no si la diferencia se
considera tolerable. Dicha evaluación solo puede realizarse dentro del contexto científico adecuado. Este enfoque a menudo se
denomina Pruebas Unilaterales Dobles (TOST, por sus siglas en inglés; ver Apéndice6).
El método del intervalo de confianza que se acaba de describir es preferible a la aplicación de una prueba t para evaluar la
significancia estadística de la diferencia en promedios. Una manera de realizar la prueba tes calculando el intervalo de confian-
za y examinando si contiene o no el valor cero. Los dos procedimientos muestran una diferencia estadísticamente significativa
en promedios si el intervalo de confianza excluye el valor cero. Una diferencia estadísticamente significativa puede no tener
una magnitud suficiente para tener importancia práctica en el laboratorio ya que puede haber surgido de datos muy precisos o
de una muestra de un tamaño mayor. Por otra parte, es posible que no se encuentre ninguna diferencia estadísticamente signi-
ficativa, lo cual ocurre cuando el intervalo de confianza incluye el valor cero y, de todas maneras, no puede descartarse una
diferencia práctica importante. Esto podría ocurrir, por ejemplo, si los datos son muy variables o si el tamaño de la muestra es
demasiado pequeño. En consecuencia, si bien el resultado de la prueba t indica si se ha observado o no una diferencia estadís-
ticamente significativa, no determina la presencia o ausencia de una diferencia de importancia práctica.
Determinacióndel Tamañode la Muestra

La determinación del tamaño de la muestra se basa en la comparación de la exactitud y precisión de los dos procedimien-
tos3 y es similar al método utilizado para evaluar la hipótesis acerca de diferencias de promedio y relaciones de varianza, res-
pectivamente, aunque el significado de algunos de los datos es diferente. El primer componente que se debe especificar es o,
la diferencia aceptable más grande entre los dos procedimientos que, si se logra, permite llegar a una conclusión de equivalen-
cia. Es decir, si los dos procedimientos difieren en no más de o,en el promedio, se consideran aceptablemente similares. La
comparación puede ser bilateral como se acaba de expresar, considerando una diferencia de oen cualquier dirección, como
cuando se comparan medias. Alternativamente, puede ser unilateral, como cuando se comparan varianzas, en cuyo caso es
deseable una reducción en la variabilidad y se considera que los métodos son equivalentes si la relación entre las varianzas
(método nuevo/método vigente como una proporción) no es más de 1,0 + o.El investigador deberá especificar el o basándose
en el conocimiento del procedimiento vigente y/o en su uso, o bien puede calcularlo. Un factor que se debe tener en cuenta
cuando hay que cumplir con ciertas especificaciones es que el nuevo procedimiento no debe diferir demasiado del procedi-
miento vigente para que no se generen resultados fuera de la especificación. En estos casos, se elige un 6 que represente una
baja probabilidad de que esto ocurra, por ejemplo, comparando la distribución de datos para el procedimiento vigente con los
límites de especificación. Esto puede hacerse gráficamente o usando un intervalo de tolerancia, del que se incluye un ejemplo
en el Apéndice5. En general, la elección de o depende de los requisitos científicos del laboratorio.
Los dos componentes siguientes se refieren a la probabilidad de error. Los datos podrían llevar a una conclusión de similitud
cuando los procedimientos son inaceptablemente diferentes (según lo definido por el 6). Esto se llama falso positivo o error de
npo l. El error también podría darse en sentido opuesto, es decir, los procedimientos podrían ser similares pero los datos no
permiten esa conclusión. Esto se llama falso negativo o error de npo 11.Con los métodos estadísticos, no es posible eliminar
completamente la posibilidad de cualquiera de estos errores. No obstante, al elegir bien el tamaño de la muestra, la probabili-
dad de cada uno de estos errores puede reducirse aceptablemente. La probabilidad máxima aceptable de un error de Tipo 1
comúnmente se denomina a y suele considerarse del orden del 5%, pero puede elegirse otro valor. La probabilidad máxima
deseada de un error de Tipo II comúnmente se denomina f3 . Con frecuencia, J3se especifica indirectamente eligiendo un nivel
deseado de 1 - /J, que se denomina la "potencia" de la prueba. En el contexto de pruebas de equivalencia, la potencia es la
probabilidad de concluir correctamente que dos procedimientos son equivalentes. Normalmente, se toma una potencia del
orden del 80% o 90% (correspondiente a un p de 20% o 10%), aunque pueden elegirse otros valores. El protocolo para el
experimento debe especificar el 6, el a y la potencia. El tamaño de la muestra depende de todos estos componentes. Se inclu-
ye un ejemplo en el Apéndice5. Aunque el Apéndice5 solo determina un valor único, suele ser útil determinar una tabla de
tamaños de muestras para diferentes opciones de 6, a y potencia. Dicha tabla permite una elección mejor fundamentada del
3 En general, el tamaño de la muestra requeridopara compararla precisiónde dos procedimientos es mayor que el requeridopara compararsu exactitud.
USP42 InformaciónGeneral/ (101 O) Datos Analíticos 7301
tamaño de la muestra para equilibrar mejor los recursos y los riesgos (conclusiones falsamente negativas y falsamente positi-
vas).
APÉNDICE
Apéndice 1: Gráficasde Control
La Figura 1 muestra una gráfica de control para valores individuales. Existen varios métodos diferentes para calcular el límite
de control superior (UCL, por sus siglas en inglés) y el límite de control inferior (LCL,por sus siglas en inglés). Un método
utiliza el intervalo móvil, que se define como la diferencia absoluta entre dos mediciones consecutivas (x; - x,_1). Estos interva-
los móviles se promedian (MR) y se usan en las siguientes fórmulas:
UCL=x+3~:
x y
en donde es la media de la muestra d2 es una constante comúnmente usada para este tipo de gráfica, que está basada en
el número de observaciones asociadas con el cálculo del intervalo móvil. Cuando n = 2 (dos mediciones consecutivas), como
aquí, d2 = 1,128. Para el ejemplo de la Figura 1, el MR era de 1,7:
UCL=102,0+3 \; =106.5
1 8
LCL=102,0-3 \; =97.5
1 8
Existen otros métodos que permiten detectar mejor pequeñas variaciones en la media del proceso, como la suma acumulativa
(también conocida como "CUSUM") y el intervalo móvil exponencialmente ponderado ("EWMA").
-------------- ------------- UCL = 106,5

ñi 105
:,
"O
·s;
'6
.s
,_
Media= 102,0
o
~100
- - - - --- - - -- - - - - --- - - -- - - - -- - LCL = 97, 5
O 50 100
Número de Observación
Fig. 1. Gráfica de control para cada X o mediciones individuales de muestras de control. En este ejemplo particular, la media
de todas las muestras (X) es 102,0, el UCLes 1 06,5 y el LCLes 97,5.
Apéndice2: Estudiode Precisión

La Tabla 1 muestra datos obtenidos de un estudio de precisión. En este estudio se hicieron cinco análisis independientes y,
dentro de cada análisis, se obtuvieron los resultados de tres determinaciones repetidas.
Tabla 1. Datos de un Estudio de Precisión
Nº del Anállsls
Nº de la Repetklón 1 2 3 4 5
1 100,70 99,46 99,96 101,80 101,91
2 101,05 99,37 100,17 102,16 102,00
3 101,15 99,59 101,01 102,44 101,67
' %RSD(desviaciónestándar relativa porcentual)= 100% x (desviaciónestándar/media)
Tabla 1. Datos de un Estudio de Precisión (Continuación)

Nº del Anállsls
Nº de la Repetición 1 2 3 4 5
Media 100,97 99,47 100,38 102,13 101,86
Desviación
Estándar 0,236 0,111 0,556 0,321 0,171
%RSDª 0,234% 0,111% 0,554% 0,314% 0,167%
• %RSD
(desviación
estándarrelativa
porcentual)=
100%x (desviación
estándar/media)
1:a bla 1A 1:a bla d e Ana'11SS1 d e V.a rlanza para os Datos p resent ad osenaaa
1 Ti bt 1
Fuente de Grados de Libertad Suma de Cuadrados Cuadrados Medios•
Variación (df) (SS) (MS) f = MS./MS,.,
EntreAnálisis 4 14,200 3,550 34,886
lntra-análisis 10 1,018 0,102
Total 14 15,217
• LosCuadrados Medios
Entre(MS
8) = SSEntn!dfEntre
y losCuadrados
Medios
lntra(MSw)
= SS1ntrafdf
10tr,
Un análisisde varianza (ANOVA)con los datos de la Tabla 1 genera la tabla ANOVA(Tabla 1A). Como había un número igual
de determinaciones repetidas por análisisen el estudio de precisión, los valores de VarianzaAná!;,;,
y Varianza••Ppueden conse-
guirse directamente de la tabla ANOVA.Lassiguientes ecuaciones calculan la variabilidadasociada con los análisisy las deter-
minaciones repetidas, donde MS;ntrarepresenta el cuadrado medio de "error'' o "intra-análisis"y MSentre
representa el cuadrado
medio "entre análisis".
VarianzaRep
= MS;ntra
= O,102
Varianza MSentre- MSinlra 3,550-0,102 1,149

Análisis Nº repeticiones por
análisis 3
[NOTA-Unapráctica común consiste en utilizar un valor de O para VarianzaAnái;,;, cuando el valor calculado es negativo]. Las
estimaciones también pueden obtenerse con determinaciones repetidas desiguales, pero las fórmulas son más complejas. Mu-
chos programas de software estadístico pueden manejar fácilmente determinaciones repetidas desiguales. Es importante estu-
diar la magnitud relativa de los dos componentes de la varianza cuando se diseña e interpreta un estudio de precisión. Elcono-
cimiento adquirido puede enfocarse en cualquier esfuerzo de mejoramiento del procedimiento continuo y, lo más importante,
se puede utilizar para asegurar que los procedimientos tienen la capacidad de respaldar los usos para los que están destinados.
Al definir cuidadosamente lo que constituye un resultado (es decir, un valor de informe), se está aprovechando el poder de
promediar, con lo que se puede lograr prácticamente cualquier precisión deseada. Esto significaque, al basar el valor de infor-
me en un promedio a través de determinaciones repetidas y/o análisis,en vez de en un solo resultado, es posible reducir la
%RSDy hacerlo de manera predecible.
La Tabla2 muestra la varianza computada y la %RSDde la media (es decir, del valor de informe) para diferentes combina-
ciones de número de análisisy número de determinaciones repetidas por análisis,usando las siguientes fórmulas:
Varianzade la media =
VarianzaA,áns;,
+ VarianzaRep
(Nºdeanálisis) (Nºde anál)(Nºderep.poranál.)
Desviación
estándarde la media= ,/ Varianzade la media
RSD= Desviaciónestándar de la media x 00%
1
Promediode todos los resultados
Por ejemplo, la Varianzade la media, Desviaciónestándarde la media y %RSDde una prueba de dos análisisy tres determina-
ciones repetidas por cada análisisson 0,592; 0,769 y 0,76%, respectivamente, según se indica a continuación.
Varianzade la media = 1· 149 + O,102 =0 592

2 (2·3) '
Desviaciónestándar de la media=✓0,592 =0,769

RSD=(0,769/100,96) x 100% =0,76%
en donde 100,96 es la media para todos los datos en la Tabla 1. Como se muestra en la Tabla2 aumentar el número de análi-
sis de uno a dos permite obtener una reducción más importante en la variabilidad del valor de informe que aumentar el núme-
ro de determinaciones repetidas por análisis.
T
No se hicieron suposiciones de distribución sobre los datos de la Tabla 1 ya que el propósito de este Apéndice es mostrar los
cálculos en un estudio de precisión.
Tabla 2. El Impacto Previsto del Plan de Prueba (Nº de Anállsls y Nº de Determinaciones Repetidas por Anállsls) sobre la Precisión
de la Media
Nºde
Nºde Determinaciones Repe- Varianza Desviación Estándar
Anállsls tldas por Análisis de la Media de la Media %RSDª
1 1 1,251 1,118 1,11
1 2 1,200 1,095 1,09
1 3 1,183 1,088 1,08
2 1 0,625 0,791 0,78
2 2 0,600 0,775 0,77
2 3 0,592 0,769 0,76
ª La %RSDse calculó utilizando un valor de la media de 100,96 (como divisor), basado en los 15 puntos de datos presentados en la Tabla1.
Apéndice 3: Ejemplosde Pruebasde ResultadosAberrantes para Datos Analíticos
Considerando el siguiente conjunto de 1O mediciones: 100,0; 100, 1; 100,3; 100,0; 99,7; 99,9; 100,2; 99,5; 100,0 y 95,7
(media= 99,5, desviación estándar= 1,369), ¿hay algún resultado aberrante?
PRUEBADE DESVIACIÓNESTUDENTIZADA
EXTREMA(ESD) GENERALIZADA
Esta prueba es una versión modificada de la Prueba ESD que permite analizar hasta un número previamente especificado, r,
de resultados aberrantes de una población normalmente distribuida. Para la detección de un solo resultado aberrante (r = 1),
el procedimiento de ESD generalizado también se conoce como prueba de Grubb. No se recomienda la prueba de Grubb para
la detección de múltiples resultados aberrantes. Supongamos que res igual a 2 y que n es igual a 1 O.
Etapa 1 (n = 10): Normalizar cada resultado restando la media de cada valor y dividiendo esta diferencia por la desvia-
ción estándar (ver la Tabla3).4
Tabla 3 Resultados de la Prueba ESDGeneralizada
n = 10 n=9
Datos Normalizados Datos Normalizados
100,3 +0,555 100,3 +1,361
100,2 +0,482 100,2 +0,953
100,1 +0,409 100,1 +0,544
100,0 +0,336 100,0 +0,136
100,0 +0,336 100,0 +O,136
100,0 +0,336 100,0 +O,136
99,9 +0,263 99,9 -0,272
99,7 +0,117 99,7 -1,089
99,5 -0,029 99,5 -1,905
95,7 -2,805
Media= 99,54 99,95
SD= 1,369 0,245
Tomar el valor absoluto de estos resultados, seleccionar el valor máximo (R1 = 2,805), y compararlo con un valor crítico ta-
bulado, previamente especificado, )..1 (2,290) basado en el nivel de significancia seleccionado (por ejemplo, 5%). El valor máxi-
mo es más grande que el valor tabulado y se determina que no concuerda con los datos restantes. Las fuentes de los valores )..
se incluyen en muchos textos de estadística. Las tablas estadísticas deben usarse con cautela para asegurarse de utilizar las no-
taciones correctas (es decir, el nivel de error aceptable) cuando se extraen los valores de la tabla.
Etapa 2 (n = 9): Eliminar la observación correspondiente al resultado normalizado absoluto máximo del conjunto de da-
tos originales, de modo tal que n sea ahora igual a 9. Nuevamente, determinar la media y desviación estándar (Tabla 3, las dos
columnas de la derecha), normalizar cada valor y tomar el valor absoluto de estos resultados. Determinar el máximo de los
valores absolutos de los 9 resultados normalizados (R2 = 1,905), y compararlo con )..2 (2,215). El valor máximo no es mayor
que el valor tabulado.
4
La diferencia entre cada valor y la media se denomina residual. Existenotras pruebas de resultados aberrantes residuales estudentizados donde el residual, en
lugar de dividirse por la desviación estándar, se divide por la desviación estándar multiplicada por la raíz cuadrada de n - 1 dividido por n.
7304 (101 O) Datos Analíticos / InformaciónGeneral USP42
Conclusión: El resultado de la primera etapa, 95,7, se declara resultado aberrante, pero el resultado de la segunda etapa,
99,5, no es un resultado aberrante.
PRUEBASTIPO DIXON
La Prueba de Dixon puede ser unilateral o bilateral, dependiendo de si se decide con anterioridad que únicamente se consi-
derarán resultados aberrantes en uno de los lados. Al igual que con la prueba de ESD, la Prueba de Dixon supone que los
datos, en ausencia de resultados aberrantes, provienen de una sola población normal. Siguiendo la estrategia usada para la
prueba de ESD, se procede como si no se hubiera tomado una decisión a priori en relación con uno de los lados y se utiliza
una Prueba de Dixon bilateral. A partir del análisis de los datos del ejemplo, se observa que los dos más pequeños son los que
se examinarán como resultados aberrantes. La Prueba de Dixon permite el análisis de dos resultados aberrantes de manera
simultánea; sin embargo, estos procedimientos están más allá del alcance de este Apéndice. El procedimiento por pasos que se
discute a continuación no es un procedimiento exacto para realizar una prueba para el segundo resultado aberrante, ya que el
resultado de la segunda prueba depende del primero. Debido a que el tamaño de la muestra también se reduce en la segunda
etapa, el resultado final es un procedimiento que no suele tener la sensibilidad de los procedimientos exactos de Dixon.
Etapa 1 (n = 10): Los resultados se ordenan según su magnitud (es decir, Xnes la observación más grande, Xnes la se-
gunda observación más grande, etc., y X1 es la observación más pequeña). Las relaciones de la Prueba de Dixon se basan en el
tamaño de la muestra (en este ejemplo, n = 1O); para declarar que X1 es un valor aberrante, se calcula la relación, r11, según la
fórmula siguiente:
Se utilizaría otra relación si el dato más grande se analiza como resultado aberrante. El resultado r 11 se compara con un valor
r11; o,osen una tabla de valores críticos. Si r11 es mayor que r1l; o,os,se declara que es un resultado aberrante. Para el conjunto de
datos anterior, r11 = (99,5 - 95,7)/(100,2 - 95,7) = 0,84. Esta relación es mayor que r11, o,os,que es 0,52979 al nivel de signifi-
cancia del 5% para una Prueba de Dixon bilateral. Lasfuentes de los valores r 11, o,osse incluyen en muchos textos de estadísti-
ca.5
Etapa2: Eliminar la observación más pequeña del conjunto de datos original, de modo que n ahora sea 9. Se utiliza la
misma ecuación rw pero se requiere un nuevo valor crítico r11,o,os paran= 9 , 11, 0, 05 = 0,56420), Ahora r 11 = (99,7 - 99,5)/
(100,2 - 99,5) = 0,29, que es menor que r11, o,osy no es significativo al nivel del 5%.
Conclusión: Por lo tanto, 95,7 se declara como resultado aberrante, mientras que 99,5 no es un resultado aberrante,
REGLADE HAMPEL
Paso7-EI primer paso para aplicar la Regla de Hampel es normalizar los datos. No obstante, en lugar de restar la media de
cada dato y dividir la diferencia por la desviación estándar, se resta la mediana de cada dato y las diferencias resultantes se
dividen por la MAD (ver a continuación). El cálculo de MAD se realiza en tres etapas. En primer lugar, se resta la mediana de
cada dato. A continuación, se obtienen los valores absolutos de las diferencias, que se denominan desviaciones absolutas,Por
último, se calcula la mediana de las desviaciones absolutas y se multiplica por la constante 1,483 para obtener la MAD.6
Paso2-EI segundo paso es tomar el valor absoluto de los datos normalizados. Cualquier resultado mayor que 3,5 se decla-
ra como un resultado aberrante. La Tabla4 resume los cálculos.
El valor de 95,7 vuelve a identificarse como un resultado aberrante. Luego, este valor puede extraerse del conjunto de datos
y volver a aplicarse la Regla de Hampel a los datos restantes. La tabla resultante aparece como la Tabla5. Al igual que en los
ejemplos anteriores, 99,5 no se considera un resultado aberrante.
Tabla 4. Resultados de la Prueba Usando la Regla de Hampel
n = 10
Desviaciones
dela Desviaciones Normalizadas
Datos Mediana Absolutas Absolutas
100,3 0,3 0,3 1,3S
100,2 0,2 0,2 0,90
100,1 0,1 0,1 0,4S
100 o o o
100 o o o
100 o o o
5
Los valores críticos para r en este ejemplo se toman de la Referencia 2 en Apéndice7, Pruebasde Resultados
Aberrantes.
6 Suponiendo una distribución normal subyacente, 1,483 es una constante utilizada de modo que la MAD resultante es un estimador uniforme de la desviación
estándar de la población. Esto significa que a medida que aumenta el tamaño de la muestra, MAD se acerca a la desviación estándar de la población.
Tabla 4. Resultados de la Prueba Usando la Regla de Hampel (Continuación)

n= 10
Desviaciones
99,9 -0,1 0,1 0,45
99,7 -0,3 0,3 1,35
99,5 -0,5 0,5 2,25
95,7 -4,3 4,3 19,33
Mediana= 100 0,15
MAD= 0,22
Tabla 5. Resultados de la Prueba Reutlllzando la Regla de Hampel

n=9
Desviaciones
100,3 0,3 0,3 2,02
100,2 0,2 0,2 1,35
100,1 0,1 0,1 0,67
100 o o o
100 o o o
100 o o o
99,9 -0,1 0,1 0,67
99,7 -0,3 0,3 2,02
99,5 -0,5 0,5 3,37
Mediana= 100 0,1
MAD= 0,15
Apéndice 4: Comparación de Procedimientos-Precisión
El siguiente ejemplo muestra el cálculo de un intervalo de confianza del 90% para la relación de varianzas (verdaderas) a fin
de comparar la precisión de dos procedimientos. Se supone que la distribución subyacente de las mediciones de la muestra
está bien caracterizada por distribuciones normales. Para este ejemplo, supongamos que el laboratorio aceptará el procedi-
miento alternativo si su precisión (medida por la varianza) no es más de cuatro veces mayor que la del procedimiento vigente.
Para determinar el tamaño de muestra adecuado para la precisión, existe un método de tanteos sucesivos utilizando la si-
guiente fórmula:
donde n es el tamaño de muestra más pequeño requerido para proporcionar la potencia deseada, que es la probabilidad de
afirmar correctamente que el procedimiento alternativo tiene una precisión aceptable cuando los dos procedimientos realmen-
te tienen la misma precisión; a es el riesgo de afirmar erróneamente que el procedimiento alternativo tiene una precisión acep-
table; y 4 es el límite superior permitido para un aumento en la varianza. Los valores F se encuentran en tablas comúnmente
disponibles de valores críticos de la distribución F. Fª,n _1, n _1 es el percentil a superior de una distribución Fcon numerador n
- 1 y denominador de n - 1 grados de libertad; es decir, el valor excedido con la probabilidad a. Supongamos inicialmente
que el laboratorio estimó necesario un tamaño de muestra de 11 por procedimiento (1 Ogrados de libertad para el numerador
y el denominador); el cálculo de la potencia sería el siguiente: 7
Pr [F> ¼Fa,n -l, n _1] = Pr [F> 1/•Fa,os;
10, 10] = Pr [F> (2,978/4)] = 0,6751
En este caso, la potencia fue de solo 68%; es decir, aunque los dos procedimientos tenían varianzas exactamente iguales, con
solo 11 muestras por procedimiento, existe solamente una probabilidad de 68% de que el experimento lleve a datos que per-
mitan concluir que la varianza ha aumentado no más de cuatro veces. Lo más común es elegir un tamaño de muestra que
tenga una potencia de al menos 80% y en algunos casos de 90% o más. Para determinar el tamaño de muestra adecuado,
7
Esto podría calcularse usando una planilla de cálculo de computadora. Por ejemplo, en Microsoft® Excel la fórmula sería: FDIST((R/A)*FINV(atta, n-1, n- 1), n
- 1, n - 1), donde Res la relaciónde varianzasa las que se determinala potencia (p. ej., R ==1, que fue el valor escogido en los cálculosde potencia provistosen la
Tabla6) y A es la relación máxima para aceptación (p. ej., A= 4). Atta es el nivel de significancia, normalmente 0,05.
pueden probarse diversos números hasta encontrar una probabilidad que exceda el límite aceptable (p. ej., potencia> O,90).
Por ejemplo, la determinación de la potencia para tamaños de muestra de 12-20 se muestran en la Tabla6. En este caso, la
suposición inicial de un tamaño de muestra de 11 no fue adecuada para comparar la precisión, pero 15 muestras por procedi-
miento proporcionarían un tamaño de muestra lo suficientemente grande para una potencia del 80%, o 20 por procedimiento
para una potencia del 90%.
Tabla 6. Determinaciones de Potencia para Diferentes Tamaños de Muestras (Específicas para el Ejemplo del Apéndice4)
Tamaño de la Muestra Pr[F> ¼ F .. , _ ] ..
12 0,7145
13 0,7495
14 0,7807
15 0,8083
16 0,8327
17 0,8543
18 0,8732
19 0,8899
20 0,9044
Típicamente, el tamaño de la muestra para las comparaciones de precisión debe ser mayor que para las comparaciones de
exactitud. Si el tamaño de la muestra para comparar la precisión es demasiado grande y no es factible llevar a cabo el estudio
en el laboratorio, existen algunas opciones. La primera es reconsiderar la elección de un aumento permitido en la varianza.
Para aumentos mayores permitidos en la varianza, el tamaño de la muestra requerida para una potencia fija es más pequeño.
Otra alternativa es planificar un análisis intermedio con un tamaño de muestra más pequeño, con la posibilidad de continuar
con un tamaño de muestra más grande, si fuera necesario. En este caso, es muy recomendable buscar ayuda profesional de un
experto en estadística.
Supongamos ahora que el laboratorio opta por una potencia de 90% y obtiene los resultados presentados en la Tabla7
basados en los datos generados con 20 análisis independientes por procedimiento.
Relación= varianza del procedimiento alternativo/varianza del procedimiento vigente= 45,0/25,0 = 1,8
Límite inferior del intervalo de confianza= relación/~ 05 = 1,8/2, 168 = 0,83
Límite superior del intervalo de confianza= relación/F,95 = 1,8/0,461 = 3,90
Tabla 7. Ejemplo de Mediciones de Varianza para Anállsls Independientes (Específicos para el Elemplo del Ar,éndice4)
Varianza Tamaño de la Grados de
Procedimiento ( desviación estándar) Muestra Libertad
Alternativo 45,0 (6,71) 20 19
Vigente 25,0 (5,00) 20 19
Para esta aplicación, se utiliza un intervalo de confianza del 90% (bilateral) cuando se busca una prueba unilateral del 5%.
Esta prueba es unilateral ya que solo importa el aumento en la desviación estándar del procedimiento alternativo. Hay que
tomar algunas precauciones al usar intervalos bilaterales de esta manera, ya 9ue deben tener colas iguales-los intervalos más
comunes tienen esta propiedad, Como el límite de confianza superior unilateral, 3,90, es inferior al límite permitido,4,0, el es-
tudio ha demostrado que el procedimiento alternativo tiene una precisión aceptable. Si se hubieran obtenido los mismos resul-
tados de un estudio con un tamaño de muestra de 15-como si se hubiera elegido una potencia del 80%-el laboratorio no
hubiera podido concluir que el procedimiento alternativo tiene una precisión aceptable (límite de confianza superior de 4,47).
Apéndice 5: Comparación de Procedimientos-Determinación de la Máxima Diferencia

Aceptable, o,Entre Dos Procedimientos
Este Apéndice describe un método para determinar la diferencia, 6, entre dos procedimientos (alternativo-vigente), diferen-
cia que, si se logra, también permite concluir que dos procedimientos son equivalentes. Si no existe otra información previa
que guíe al laboratorio en la elección del 6, ésta es una manera razonable de proceder. En este Apéndice se describen los cálcu-
los del tamaño de la muestra en diferentes situaciones.
DETERMINACIÓNDELINTERVALO
DE TOLERANCIA
Suponer que no se conocen la media ni la desviación estándar del proceso, pero una muestra de tamaño 50 produjo una
media y una desviación estándar de 99,5 y 2,0, respectivamente. Estos valores se calcularon usando los últimos 50 resultados
generados por este procedimiento específico para una muestra (de control) en particular. Con esta información, pueden calcu-
larse los límites de tolerancia según la siguiente fórmula:
USP42 InformaciónGeneral/ (101 O) Datos Analíticos 7307
x±K 5
x
en donde es la media, s es la desviación estándar, y K se basa en el nivel de confianza, la proporción de resultados a capturar
en el intervalo y el tamaño de la muestra, n. Hay disponibles Tablas que proporcionan los valores de K. En este ejemplo, el
valor de K requerido para incluir el 95% de la población con una confianza del 95% para 50 muestras es de 2,382. 8 Los límites
de tolerancia se calculan de la siguiente manera:
99,5 ± 2,382 X 2,0
en consecuencia, el intervalo de tolerancia es de (94,7; 104,3).
COMPARACIÓNDE LOS LÍMITESDE TOLERANCIACON LOS LÍMITESDE LA ESPECIFICACIÓN
Supongamos que el intervalo especificado para este procedimiento es de (90,0; 110,0) y que la media y la desviación están-
dar del proceso no han cambiado desde que se estableció este intervalo. Pueden definirse las siguientes cantidades: el límite
inferior de la especificación (LSL,por sus siglas en inglés) es 90,0; el límite superior de la especificación (USL, por sus siglas en
inglés) es 110,0; el límite de tolerancia inferior (LTL,por sus siglas en inglés) es 94,7 y el límite de tolerancia superior (UTL, por
sus siglas en inglés) es 104, 3. Calcular la diferencia aceptable, (o), de la siguiente manera:
A= LTL- LSLpara LTL2: LSL
(A= 94,7 - 90,0 = 4,7);
8 = USL- UTLpara USL2: UTL
(8 = 110,0 - 104,3 = 5,7); y
¡¡ =mínimo (A, 8) = 4,7
+-A- +-B-
90,0 94,7 104,3 110,0
Figura 2. Gráfica de los valores calculados anteriormente.
Con esta opción de ¡¡ y suponiendo que los dos procedimientos tienen una precisión comparable, el intervalo de confianza
para la diferencia en medias obtenidas con los dos procedimientos (alternativo-vigente) debe encontrarse entre -4,7 y +4,7
para afirmar que no existe ninguna diferencia importante entre los dos procedimientos.
Los laboratorios analíticos de control de calidad a veces utilizan límites de tolerancia del 99%, en cuyos casos el intervalo es
mayor. Usando el ejemplo anterior, el valor de K requerido para incluir el 99% de la población con una confianza del 99% para
50 muestras es de 3,390. Los límites de tolerancia se calculan de la siguiente manera:
99,5 ± 3,390 X 2,0
El intervalo de tolerancia más amplio resultante es de (92,7; 106,3). De la misma manera, el nuevo LTLde 92,7 y UTLde 106,3
producirían un ¡¡ más pequeño:
A= LTL- LSLpara LTL;,:LSL
(A= 92,7 - 90,0 = 2,7);
8 = USL- UTLpara USL2: UTL
(8 = 110,0 - 106,3 = 3,7); y
¡¡=mínimo (A, 8) = 2,7
Aunque un fabricante puede elegir cualquier¡¡ que funcione adecuadamente para la determinación de equivalencia, la elec-
ción de un ¡¡ más grande, aún cuando lleva a un n más pequeño, presenta el riesgo de una pérdida de capacidad para la discri-
minación entre procedimientos.
TAMAÑO DE LA MUESTRA
Existen fórmulas que pueden utilizarse para un ¡¡ específico, suponiendo que se conocen las varianzas de la población y que
son iguales, para calcular el número de muestras que se debe analizar por procedimiento, n. El nivel de confianza y la potencia
también deben especificarse. [NOTA-Potencia se refiere a la probabilidad de llegar a la conclusión correcta de que dos proce-
dimientos idénticos son equivalentes.] Por ejemplo, si¡¡= 4,7 y se supone que las varianzas de las dos poblaciones son iguales
8 Existentablasde factoresde toleranciaque indicanlosvaloresaproximadosy, en consecuencia,difierenligeramentede losvaloresaquí informados.

a 4,0; entonces, para una prueba de un nivel del 5% 9 y una potencia del 80% (con los correspondientes valores z de 1,645 y
1,282, respectivamente), el tamaño de la muestra aproximado se calcula según la siguiente fórmula:
2a 2 2
n2 B2 (za+ Z¡:,12)
4
n;;, ~ \ (1,645 + 1,282)2 = 3,10
(4,7)
En consecuencia, suponiendo que cada procedimiento tiene una varianza poblacional, cr2, de 4,0, el número de muestras, n,
requerido para concluir con una probabilidad de 80% de que los dos procedimientos son equivalentes (el intervalo de confian-
za del 90% para la diferencia en las medias verdaderas se encuentra entre -4,7 y +4,7) cuando, en realidad, son idénticos (la
diferencia de medias verdadera es cero) es 4. Como se utilizó la distribución normal en la fórmula anterior, 4 es en realidad un
límite inferior en el tamaño de muestra requerido. Si es factible, podría convenir un tamaño de muestra más grande. Los valo-
res de z para niveles de confianza comunes se presentan en la Tabla8. La fórmula anterior se basa en tres suposiciones: 1) la
varianza usada en el cálculo del tamaño de la muestra se basa en una cantidad de datos previos suficientemente grande que
pueden tratarse como conocidos; 2) se utiliza la varianza conocida previa en el análisis del nuevo experimento, o el tamaño de
la muestra para el nuevo experimento es lo suficientemente grande como para que la distribución normal sea una buena apro-
ximación a la distribución t; y 3) el laboratorio está seguro de que no existe ninguna diferencia real en las medias, que es el
caso más optimista. No es común que se den estas tres suposiciones. La fórmula anterior debe tratarse con más frecuencia
como una aproximación inicial. Las desviaciones de estas tres suposiciones conlleva la necesidad de utilizar un tamaño de
muestra más grande. En general, se recomienda recurrir a alguna persona familiarizada con los métodos necesarios.
Tabla 8. Valores Comunes para una Distribución Normal Estándar
Valores z
Nlvel de Confianza Unilateral (ex) BIiaterai ( cx/2)
99% 2,326 2,576
95% 1,645 1,960
90% 1,282 1,645
80% 0,842 1,282
Cuando se requiere una transformación logarítmica para lograr la normalidad, la fórmula de tamaño de la muestra debe
ajustarse ligeramente según se indica a continuación. En lugar de formular los problemas con respecto a la varianza de la po-
blación y la diferencia aceptable más grande, o, entre los dos procedimientos, ahora se formula con respecto a la %RSD de la
población y la diferencia proporcional aceptable más grande entre los dos procedimientos.
en donde
a¡=log((%RSD/100) + 1) 2
of= (109(P+ 1))2

y p representa la diferencia proporcional aceptable más grande entre los dos procedimientos(alternativo-vigente)/(vigente) y
se supone que las %RSDs de la población son conocidas e iguales.
Apéndice 6: Análisisde Equivalenciay PruebasUnilaterales Dobles
En un análisis estadístico clásico de hipótesis, existen dos hipótesis, la nula y la alternativa. Por ejemplo, la hipótesis nula
puede indicar que dos medias son iguales, entonces la hipótesis alternativa indicaría que difieren. Con este enfoque clásico, se
rechaza la hipótesis nula en favor de la alternativa si la evidencia contra la hipótesis nula es suficiente. Un error común es inter-
pretar la incapacidad de rechazar la hipótesis nula como evidencia de que dicha hipótesis es verdadera, cuando en realidad la
incapacidad de rechazar la hipótesis nula solo quiere decir que la evidencia contra ésta no fue suficiente. Por ejemplo, el proce-
dimiento usado podría tener una variabilidad demasiado alta o el número de determinaciones ser demasiado pequeño.
La consecuencia de esta interpretación es que, cuando se busca demostrar la similitud, como en el caso de la comparación
de los resultados obtenidos por dos laboratorios, es necesaria la similitud como hipótesis alternativa. La prueba estadística que
emplea la similitud como hipótesis alternativa recibe el nombre de análisis de equivalencia. Es importante entender que "equi-
9 Cuando se analiza la equivalencia, una prueba de nivel del 5% corresponde a un intervalo de confianza del 90%.
valencia" aquí no significa"igualdad". La equivalenciadebe entenderse como "suficientementesimilar'' para la necesidad de

los dos laboratorios.Talcomo se indicó anteriormente en este capítulo, el nivelde similitudque se considera suficientees un
aspecto que debe decidirse con antelación.
Como ejemplo específico,supóngase que se está interesado en comparar resultados promedio, como cuando se transfiere
un procedimiento de un laboratorio a otro. (Dicha aplicación probablemente también incluiríauna comparación de precisión;
ver el Apéndice4.) Se debe definircon antelación que la diferenciaentre las medias no debe ser mayor que un valor positivo,6,
para que los resultados promedio puedan considerarse equivalenteso suficientemente similares.(ElApéndice5 provee reco-
mendaciones para la selección de o.) Entonces, las hipótesis son:
Alternativa(H,): Jµ1 - µ 2 J ::;6
Nula (H0): Jµ, - µ2 > 6
1
donde µ1 y µ2 son las dos medias que se están comparando.

Elenfoque de pruebas unilateralesdobles (TOST,por sus siglasen inglés) consiste en convertir las hipótesis de equivalencia
anteriores en dos hipótesis unilaterales.Lajustificaciónes que es posible determinar Iµ,- µ21:,6 siempre y cuando se puedan
demostrar tanto
µ 1 - µ 2 :, +6 como µ 1 - µ2 2::-6
En su condición de pruebas unilaterales,se pueden tratar como pruebas-t unilateralesestándar. Para que la prueba de las
hipótesis de equivalenciatenga el nivela, ambas pruebas unilateralesdeben realizarseal nivela (por lo regular, aunque no
necesariamente, 0,05). A menudo, la prueba unilateraldoble se llevaa cabo usando un intervalode confianza.En este caso, se
rechaza la hipótesis nula en favor de la hipótesis de equivalenciasi el intervalo de confianza bilateral 100(1 - 2a)% está com-
pletamente contenido en (-6, +6). Éste es el enfoque descrito anteriormente en la sección Exactitud.
Apéndice 7: Fuentes de Información Adicionales
Esposible utilizaruna gran variedad de pruebas estadísticaspara evaluar un conjunto de datos. Este capítulo presenta varias
pruebas que permiten interpretar y manejar datos analíticos,pero pueden emplearse muchas otras pruebas semejantes. En es-
te capítulo simplemente se ilustra el análisisde datos usando métodos estadísticamente aceptables. Como se menciona en la
Introducción,las pruebas específicasse incluyencon fines ilustrativosúnicamente y USPno avala ninguna de estas pruebas co-
mo único método para el tratamiento de los datos analíticos.Puede encontrarse informaciónadicionaly pruebas alternativas
en las referenciasenumeradas a continuación o en muchos textos de estadística.
Gráficas de Control:
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USP42 InformaciónGeneral/ (1024) Suero Bovino 7311
(1024) SUERO BOVINO
INTRODUCCIÓN
El suero bovino es la fracción líquida de la sangre coagulada de buey (Bostaurus,entre otras especies), de la que se han
eliminado células, fibrina y factores de coagulación. Desde la aparición del cultivo celular moderno, los fabricantes de produc-
tos biológicos han usado ampliamente el suero bovino como suplemento de crecimiento para cultivos celulares. Su composi-
ción altamente nutricional de proteínas, factores de crecimiento, hormonas, aminoácidos, vitaminas, azúcares, lípidos, oligoe-
lementos y demás componentes sustenta una amplia gama de aplicaciones de cultivo celular para la investigación y fabrica-
ción comercial de vacunas, productos biológicos de origen natural y recombinantes (en lo sucesivo, productos biológicos), teji-
dos obtenidos por ingeniería y otros productos celulares terapéuticos destinados para uso humano o veterinario. El Suero Fetal
Bovino (FBS,por sus siglas en inglés) es el tipo predominante de suero usado en las aplicaciones de investigación. El suero de
ternero (de animales recién nacidos o mayores) se usa con mucho menor frecuencia, aunque por su bajo costo, sería amplia-
mente usado en la fabricación comercial.
Al igual que con otros productos de origen animal, el suero bovino conlleva el riesgo potencial de introducir agentes extra-
ños en el cultivo celular. Los fabricantes de suero y reguladores deben adoptar procedimientos rigurosos de obtención y análi-
sis, además de estrictas guías de procesamiento y producción para asegurar la calidad del suero bovino.
Con el objetivo de incrementar la calidad y seguridad de los productos biológicos producidos con suero bovino, y de mitigar
las exigencias reglamentarias, los desarrolladores han investigado alternativas a la suplementación con suero, lo que ha resulta-
do en formulaciones de medios exentos de suero para aplicaciones específicas. Aunque se reconoce que debe evitarse el uso
de suero bovino siempre que exista la opción de emplear medio exento de suero, hay casos en los que resulta técnicamente
imposible o poco práctico.
Este capítulo describe cuestiones relacionadas con la obtención, producción y caracterización de suero bovino para asegurar
su uso seguro. ElApéndice7 presenta una lista de guías y documentos reglamentarios pertinentes. Los fabricantes de suero y
los usuarios finales de suero (fabricantes de productos biológicos) deben considerar y aplicar, según se requiera, los controles y
procedimientos establecidos en este capítulo para asegurar el uso seguro de componentes de suero bovino en la investigación
y fabricación farmacéutica.
Tipos de Suero Bovino
• El suero fetal bovino (FBS)se obtiene de fetos, previo al parto, de hembras reproductoras bovinas sanas que se consideran
aptas para consumo humano mediante inspección ante y postmortem realizada por veterinarios autorizados. El suero se
recolecta en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental.
• El suero de ternero recién nacido (también conocido como suero de bovino recién nacido) se obtiene de animales con
una edad menor de 20 días en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental.
• El suero de ternero se obtiene de animales con una edad entre 20 días y 12 meses en mataderos sujetos a inspección y
registro gubernamental.
• El suero de bovino donante (también conocido como suero de ternero donante) se obtiene mediante el sangrado repeti-
do de animales donantes pertenecientes a manadas donantes controladas, y sujetas a inspección y registro gubernamen-
tal. Los animales tienen entre 12-36 meses de edad.
• El suero de bovino adulto se obtiene de ganado con una edad mayor de 12 meses que se declara apto para consumo
humano en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental.
SUEROBOVINO:HISTORIAY TIPOS DE USOS
Historia del Uso de Suero Bovino
El suero animal y demás materiales biológicos complejos se han empleado durante aproximadamente 100 años en el cultivo
de células de mamíferos. Fueron varios los factores que llevaron a la adopción de suero bovino como suplemento estándar
para el cultivo de tejidos. En comparación con el suero de otras especies animales (caballo, cabra), el suero bovino se obtiene
fácilmente por lo que resulta más económico. Muchos investigadores deciden usar suero fetal en sus sistemas experimentales
debido a las inquietudes relacionadas con anticuerpos presentes en suero de recién nacido y de adulto que podrían provocar
una reacción cruzada con las células en cultivo y ocasionar lisiscelular mediada por complemento. A fin de terminar con tales
inquietudes, se comenzó a usar calor para inactivar el complemento potencialmente presente en el suero. Los estudios de FBS
realizados en la década de 1950 en el cultivo de células humanas de baja densidad para dilucidar mecanismos de crecimiento
celular demostraron que (1) el componente albúmina puede actuar como portador de moléculas pequeñas esenciales; (2) la
fetuína, una glicoproteína que se presenta en altos niveles en la fracción alfa globulina, facilita la adhesión y extensión celular;
y (3) la fetuína inhibe considerablemente la tripsina, y tal actividad antiproteolítica puede jugar un papel en la capacidad de la
fetuína para estimular el crecimiento celular.
7312 (1024) Suero Bovino / Información General USP42
Durante las décadas de 1960 y 1970, la suplementación con suero de los medios de cultivo de tejidos se convirtió en una
práctica normal, lo que facilitó tanto la investigación biomédica como los primeros procesos de fabricación de vacunas a gran
escala. La suplementación con suero redujo la necesidad de optimizar las formulaciones de medios para diferentes tipos de
células. Además, se demostró que el FBSproporcionaba una variedad de factores de crecimiento polipeptídicos. Presuntamen-
te, la albúmina promovía el crecimiento celular debido a sus capacidades para funcionar como proteína portadora de molécu-
las pequeñas o lípidos, para unir iones metálicos, para servir como amortiguador del pH, y para proteger a las células de la
ruptura. Asimismo, se encontraron funciones similares en otros componentes del suero como transferrina, hormonas y otros
factores de adhesión derivados del suero como fibronectina, vitronectina y laminina.
Usosdel Suero Bovino
El suero es una mezcla compleja de macromoléculas requerida para el crecimiento celular y la producción de virus, y su uso
como materia prima presenta diversos retos, entre los que se incluyen su composición lote a lote y el riesgo de contaminación
por agentes adventicios. El desarrollo de medios exentos de suero ha reemplazado al suero en algunas aplicaciones biotecnoló-
gicas nuevas de fabricación; sin embargo, muchas líneas celulares usadas en la fabricación aún no han sido adaptadas a estos
medios exentos de suero. Las restricciones reglamentarias y los retos científicos por lo general vuelven poco práctico alterar los
procesos de fabricación existentes en los que se usa suero como materia prima.
En ocasiones, el FBSes necesario para el bioprocesamiento de células y tejidos, lo cual a menudo implica el cultivo de células
provenientes de explantes y biopsias de tejidos. Además, para algunos procesos biológicos puede ser necesario mantener ca-
racterísticas celulares específicas durante el cultivo. El FBSa menudo parece facilitar tales procedimientos y puede afectar el
comportamiento biológico de los tipos de células exigentes (fastidious cells). Se ha demostrado que el FBSafecta la transcrip-
ción de genes importantes para el desarrollo, la apoptosis y la expresión génica relacionada con la apoptosis, además de que
proporciona factores neuroprotectores y antioxidantes, todo lo cual puede ser beneficioso para la supervivencia y el desarrollo
de células en cultivo. Por lo tanto, el FBSseguirá jugando un papel importante como suplemento para cultivos celulares en la
producción de terapias celulares y de tejidos.
En la mayoría de los procesos de fabricación de vacunas de virus los medios usados para la expansión de cultivos celulares y
la infección/producción de virus se suplementan con diferentes tipos de suero a diversas concentraciones. En estos procesos, el
suero bovino ayuda a generar una masa de células en un estado fisiológico óptimo para una replicación viral eficiente.
RECOLECCIÓN
Y PRODUCCIÓNDE SUEROBOVINO
Recolecciónde Sangre
Para todos los tipos de suero bovino, la sangre se debe recolectar en instalaciones sujetas a inspección y registro guberna-
mental (mataderos y granjas de donantes). La sangre debe ser recolectada por operarios capacitados siguiendo los procedi-
mientos escritos aprobados por el fabricante de suero y usando dispositivos de recolección desechables para un solo uso o
equipo de recolección reutilizable que cuente con procedimientos de limpieza validados.
SUERODE BOVINODONANTE
Para cada lote de suero de animales donantes, los fabricantes de suero deben asegurar la rastreabilidad a la manada donante
mediante registros de producción y certificados de salud y de origen de los animales. Los animales donantes están sujetos a
inspecciones veterinarias regulares y se les desangra varias veces siguiendo los procedimientos establecidos. Debe ser posible
rastrear a los animales introducidos a la manada por origen, raza e historial de crianza. Los recolectores deben introducir nue-
, vos animales a la manada siguiendo procedimientos especificados y aprobados que incluyen inspección y análisis del animal
previos a la compra, transporte adecuado, un periodo de cuarentena, examen y análisis veterinario durante el periodo de cua-
rentena y criterios de liberación de los animales en cuarentena para la producción del suero. Los recolectores no deben vacu-
nar a los animales donantes contra la diarrea viral bovina (DVB).Los recolectores deben someter los animales a análisis para
determinar la presencia de cualquier agente y anticuerpo de los que se declara estar exenta la manada.
SUERODE TERNERORECIÉNNACIDO, SUERODE TERNEROY SUERODE BOVINOADULTO
Los certificados de salud y de origen de los animales y/o los registros de producción de suero deben asegurar que los fabri-
cantes de suero puedan rastrear el origen del suero bovino derivado de animales sacrificados hasta el matadero. Los fabricantes
de suero deben requerir que los mataderos mantengan la documentación del origen de los animales para sacrificio. La sangre
se debe recolectar de animales que hayan sido sacrificados para consumo humano en mataderos inspeccionados por la autori-
dad competente del país de origen. Los inspectores deben inspeccionar a los animales de manera rutinaria tanto antemortem
como postmortem para verificar clínicamente la presencia de infecciones y enfermedades parasitarias, además de otros proble-
mas o condiciones relacionados con la salud de los animales. Los animales deben estar exentos de evidencia clínica de enfer-
medades infecciosas al momento del sacrificio. Deben implementarse procedimientos de recolección sanguínea que preven-
gan la contaminación cruzada con otros tejidos y fluidos corporales y el ambiente aledaño. El procedimiento de sacrificio es-
tándar consiste en un método aprobado de aturdimiento del animal seguido de desangrado.
SUEROFETALBOVINO
Las especificaciones de producto y los procedimientos de análisis para FBSse presentan en el capítulo general propuesto
SueroFetal Bovino-Atributos de Calidady Pruebasde Funcionalidad(90). Los fabricantes de suero deben recolectar la sangre
fetal bovina a partir de fetos bovinos provenientes de hembras reproductoras que hayan sido sacrificadas. Las hembras repro-
ductoras deben ser declaradas aptas para consumo humano y deben haber sido sacrificadas en mataderos inspeccionados por
la autoridad competente del país de origen. Los inspectores deben examinar a todos los animales tanto antemortem como
postmortem para verificar clínicamente la presencia de infecciones y enfermedades parasitarias, además de otros problemas o
condiciones relacionados con la salud de los animales. Los animales deben estar exentos de evidencia clínica de enfermedades
infecciosas al momento del sacrificio. El útero debe extraerse y transportarse a un espacio dedicado para recolección de sangre
fetal bovina, en donde el personal de recolección sanguínea evalúa el feto para detectar signos de muerte fetal, que incluyen
hinchazón, decoloración de la piel, olor, deformación, y caída del pelaje. Asimismo, los recolectores deben verificar el color, la
cantidad y la claridad del fluido amniótico. Los fabricantes de suero deben recolectar la sangre de fetos aceptables mediante
punción cardíaca en un sistema cerrado de recolección en condiciones diseñadas para minimizar la contaminación microbiana.
Los fabricantes deben implementar procedimientos que prevengan la contaminación cruzada con otros tejidos fetales y fluidos
corporales y el ambiente aledaño.
Recolección y Procesamiento del Suero

La separación (recolección) del suero y demás actividades de procesamiento deben ser realizadas por personal capacitado
siguiendo procedimientos escritos y aprobados. El suero primero se separa y combina, y luego se filtra y deposita en envases
limpios y desinfectados. Si el suero se somete a uno o más tratamientos de inactivación viral en el proceso de producción, los
fabricantes de suero deben validar los procesos de inactivación viral contra una gama de virus pertinentes. Se recomienda in-
cluir al virus de la diarrea viral bovina (VDVB)en cualquier estudio de validación viral debido a que este virus es ubicuo.
SEPARACIÓN
Y RECOLECCIÓNDELSUERO
El procesamiento de sangre bovina y la separación (recolección) del suero deben realizarse en una manera que minimice la
contaminación bacteriana y micoplasmática, lo cual a su vez minimiza los niveles de endotoxinas en el producto del suero. El
procesamiento cuidadoso y rápido de la sangre ayuda a minimizar la hemólisis, lo que mejora aún más la calidad del producto
del suero. Después de la recolección, primero se deja que la sangre coagule durante un periodo específico y en condiciones
controladas, y luego se centrifuga en una centrífuga refrigerada. Posteriormente, el suero se separa del coágulo, generalmente
por centrifugación, se combina y mezcla en un recipiente de combinación, se transfiere a envases etiquetados, y se congela, a
menos que se esterilice inmediatamente por filtración. Los fabricantes de suero deben describir cada etapa del proceso y reali-
zar las actividades de procesamiento del suero, incluyendo la recolección de muestras y las pruebas de control de calidad du-
rante el proceso, siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.
COMBINACIÓNDE SUEROSANTESDELFILTRADO
Debido a la limitada cantidad de sangre que se puede recolectar de cada animal, los fabricantes de suero combinan el suero
bruto de muchos animales para crear lotes de tamaño comercial. Después de descongelar el suero bruto y antes de la filtra-
ción, el suero se combina en un recipiente de combinación y se mezcla a una velocidad y temperatura controladas. Las combi-
naciones o lotes de suero de bovino donante pueden consistir en muchas recolecciones separadas de miembros individuales
de la manada. Los lotes de FBSpueden consistir en el suero combinado de miles de animales. Los fabricantes de suero deben
describir cada etapa del proceso de combinación de sueros previa al filtrado y deben realizar la descongelación del suero, la
combinación previa al filtrado y las actividades de mezclado siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.
FILTRACIÓN
El suero combinado se mezcla y se pasa asépticamente a través de filtros con un tamaño de poro de 0,2 µm o menor, de-
pendiendo de la aplicación prevista. Deben validarse los procesos de filtración. Se ha demostrado que la filtración triple usando
filtros con un tamaño de poro de O,1 µm resulta en un alto grado de eliminación de micoplasmas. Aunque la filtración puede
eliminar algunos virus de gran tamaño y agregados virales del suero, los virus generalmente no pueden eliminarse por comple-
to mediante esta técnica. Además, no se ha demostrado que los filtros eliminen el agente causante de la encefalopatía espon-
giforme bovina (BSE,por sus siglas en inglés). Después de la filtración, los fabricantes de suero llenan envases estériles con el
suero filtrado mediante procesamiento aséptico en un ambiente adecuadamente controlado. Los fabricantes de suero deben
7314 (1024) Suero Bovino/ Información General USP42
describir cada etapa del proceso de filtración y deben realizar las actividades de filtrado, llenado y recolección de muestras de
suero siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.
RADIACIÓN
El tratamiento del suero por radiación gamma es muy común y representa uno de los métodos más efectivos de inactivación
viral. la dosis mínima usada con más frecuencia es de 25 kilograys (kGy). Algunos países especifican requerimientos de dosis
mayores (>30 kGy) para suero importado. la radiación gamma puede inactivar virus, micoplasma y bacterias, pero los usuarios
finales del suero deben asegurarse de que el proceso de radiación gamma no afecte negativamente sus aplicaciones específi-
cas. la radiación puede tener efectos adversos sobre la calidad del suero, los cuales tienden a incrementarse a mayores dosis.
la validación de la radiación gama presenta dos aspectos: (1) la administración de la dosis en una configuración de carga
definida y (2) la capacidad de inactivación. Los parámetros críticos del proceso de radiación incluyen la temperatura del pro-
ducto (suero), el tamaño y la configuración del envasado, la distribución de dosímetros y la dosis mínima/máxima definida de
radiación recibida. Los dosímetros deben usarse para monitorear las posiciones de dosis alta y dosis baja en cada aplicación de
radiación. Si el fabricante de suero declara haber realizado inactivaciones, éstas deben estar sustentadas mediante estudios de
inactivación viral bien diseñados por el mismo fabricante.
(uv)
TRATAMIENTOULTRAVIOLETA
los fabricantes de suero pueden usar tratamiento UV para inactivar virus, micoplasmas y bacterias, sin embargo deben vali-
dar el proceso para demostrar su eficacia. Además, los fabricantes deben ser conscientes de que el tratamiento UV puede tener
un efecto adverso sobre la calidad del suero y por consiguiente deben considerar los efectos del tratamiento UV para cada
aplicación, como deben hacerlo también los usuarios finales del suero.
INACTIVACIÓNCON CALOR
La inactivación con calor implica elevar la temperatura del suero a >56º durante al menos 30 minutos para inactivar el com-
plemento. La inactivación con calor también puede inactivar virus, micoplasmas y bacterias, aunque puede tener un efecto
adverso sobre la calidad del suero, por lo que los fabricantes deben validar la aptitud del procedimiento para aplicaciones es-
pecíficas. En comparación con la radiación, la inactivación con calor proporciona una garantía de inactivación significativamen-
te menor.
ESTUDIOSDE DEPURACIÓNVIRAL
El capítulo general Evaluación

de la SeguridadViralen ProductosBiotecnológicos
Obtenidosde LíneasCelularesde OrigenHuma-
no o Animal(1050) y otros documentos reglamentarios proporcionan guías sobre la realización de estudios de depuración viral
que ayudan a validar los procesos de eliminación/inactivación. Los fabricantes de suero deben también realizar estudios forma-
les con agregado (spiking) de virus pertinentes y representativos (modelo), y deben analizar y comparar muestras de suero con
virus agregado e inactivado, controles negativos y controles positivos.
TRATAMIENTO
CON CARBÓN
Algunos fabricantes de suero usan tratamientos con carbón/dextrano para reducir los niveles de hormonas del suero.
DIÁLISIS
Algunos fabricantes utilizan diálisis o diafiltración para eliminar componentes de bajo peso molecular del suero.
LIMPIEZAY ESTERILIDAD
DELEQUIPO
Las tuberias y sistemas de acero inoxidable usados en la fabricación de suero bovino deben limpiarse y esterilizarse para pre-
venir la contaminación cruzada y el crecimiento de agentes adventicios. Los fabricantes de suero deben validar sus procesos de
limpieza para la eliminación e inactivación de agentes de interés. Posteriormente, los fabricantes deben implementar controles
de proceso que verifiquen de manera rutinaria los cidos de limpieza. La esterilización por vapor en el sitio (sterilization-in-pla-
ce) es una técnica de esterilización común y efectiva. Los fabricantes de suero que usan esta tecnología deben validar los ciclos
de vapor para demostrar su uniformidad y capacidad para destruir esporas bacterianas resistentes al calor. Los fabricantes pue-
den, alternativamente, usar sistemas desechables estériles que no requieren de validación de limpieza.
USP42 Información General/ (1024) Suero Bovino 7315
Control de Calidad
RASTREABILIDAD
Recolección en Mataderos: Los materiales recolectados en EE.UU.deben obtenerse de instalaciones registradas en el De-
partamento de Agricultura de EE.UU.(USDA, por sus siglas en inglés). Los fabricantes de suero deben conservar documenta-
ción que permita rastrear un sublote de suero específico hasta el matadero donde se recolectó. Los mataderos mantienen re-
gistros del origen del animal. La práctica industrial general es conservar esta información como parte del Registro Maestro del
Dispositivo (DMR, por sus siglas en inglés). Los requisitos generales de conservación de registros en mataderos autorizados por
el USDAse citan en el Título 9 del Código de Reglamentaciones Federales (en lo sucesivo CFR, por sus siglas en inglés) 320.
Los materiales recolectados en países aprobados por el USDA para la importación de productos bovinos a EE.UU.deben
cumplir con los requisitos de la autoridad competente del país de origen. Además, los fabricantes de suero deben conservar
registros de análisis de seguridad requeridos por el USDApara materiales importados (si fuera requerido) como parte de su
Registro Histórico del Dispositivo (DHR, por sus siglas en inglés).
Los fabricantes de suero deben consultar el Título 9 del CFR 309 y el Título 9 del CFR 31 O con respecto a los requisitos de
inspección de animales para diversas enfermedades antes y después del sacrificio. Se recomienda cumplir con tales requisitos
para materiales recolectados fuera de EE.UU.
Recolección en Manadas Donantes: Los fabricantes de suero deben mantener la rastreabilidad hasta la granja de anima-
les donantes en la que se recolectó la sangre de los animales donantes. En la mayoría de los casos, los fabricantes de suero
identifican de manera individual a los animales de la granja y conservan registros sobre las fechas de sangrado y procesamien-
to, lo que permite rastrear la recolección sanguínea hasta un animal en particular. Los animales deben ser inspeccionados con
regularidad por un veterinario autorizado o individuo designado bajo la guía de un veterinario, quienes deben certificar que los
animales están libres de enfermedades y son aptos para consumo humano, de conformidad con el Título 9 del CFR 309.
ALMACENAMIENTO
Y ESTABILIDAD
DELPRODUCTO
El suero debe almacenarse en estado de congelación a una temperatura de -1 Oº o menor. El suero se congela tan rápido
como sea posible para preservar la calidad del producto y se almacena en condiciones controladas de almacenamiento. Los
fabricantes de suero deben establecer la estabilidad del producto del suero para respaldar la fecha de caducidad propuesta. La
fecha de caducidad típica para el suero bovino es de 5 años a partir de la fecha de filtración y envasado. El uso de cualquier
tipo de suero bovino después de la fecha de caducidad indicada depende de la aplicación y el usuario del suero debe estable-
cer la aptitud continua del producto para su uso.
Etiquetado
Las etiquetas del producto terminado deben contener la siguiente información: descripción del producto, número de lote,
condiciones de almacenamiento, nombre y dirección del fabricante y una declaración que indique el uso previsto. Los materia-
les destinados para propósitos de investigación están exentos de las reglamentaciones de etiquetado (Título 21 del CFR 801 ).
Por lo general, los fabricantes de suero proporcionan un Certificado de Análisis (COA, por sus siglas en inglés) específico del
lote, el cual se clasifica como parte del etiquetado del producto. Ver los requisitos para el COA en la sección siguiente.
Certificación/Documentación
CERTIFICADODE ANÁLISIS
El COA debe proveer información sobre un lote de suero específico, incluidas las pruebas realizadas y los resultados de las
mismas (de acuerdo con las especificaciones de liberación del fabricante del suero), así como los identificadores críticos del
etiquetado tales como número de lote, número de catálogo, descripción del tipo de suero bovino, país de origen y fecha de
fabricación o caducidad, o ambas. Este documento es distinto al certificado de salud emitido por la autoridad competente del
país de origen.
CERTIFICADODE ORIGENY CERTIFICADODELESTADODE SALUDDELANIMAL
El Certificado de Origen establece el país en el que se recolectó la sangre bovina, así como la certificación veterinaria de la
salud de los animales antes y después de la recolección (Título 9 del CFR 327.4).
DOCUMENTOSDE IMPORTACIÓN/EXPORTACIÓN
Los documentos de importación/exportación incluyen una certificación formal del estado de las enfermedades animales en
el país de origen y las disposiciones de certificación negociadas/acordadas, las cuales varían de país a país. Cada país define sus
7316 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 42
requisitos de importación/exportación a fin de controlar la introducción de enfermedades animales exóticas y su impacto eco-
nómico, así como evaluaciones de seguridad del producto (riesgo vs. investigación, diagnóstico y/o beneficios terapéuticos).
INFORMESDE PRODUCCIÓN
Los informes de producción son generalmente registros de partidas que documentan las materias primas de manera identifi-
cable y rastreable, métodos de producción (centrifugación o filtración) usados en la fabricación, limpieza de equipo e instala-
ciones, pruebas de control de calidad y personal que realiza las actividades requeridas. La materia prima con Certificados de
Origen o registros de producción de suero facilita la rastreabilidad hasta el origen de la sangre que se usó para crear el suero.
Cuando se usa suero como una materia prima para fabricación, la documentación del proceso también ayuda a demostrar la
fabricación controlada del suero bovino.
EVALUACIÓNDE RIESGODE BSE

A pesar del bajo potencial de riesgo de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE,por sus siglas en inglés) en el suero
bovino, diversas agencias reguladoras de EE.UU.e internacionales han desarrollado guías para ayudar a manejar y reducir aún
más los riesgos potenciales de transmisión. Ante la ausencia de métodos de prueba apropiados para detectar al agente infec-
cioso en fluidos como la sangre, la recomendación acordada por varias agencias reguladoras es adoptar buenas estrategias de
evaluación de riesgos. Esta sección del capítulo proporciona algunos antecedentes de la enfermedad y los métodos de detec-
ción vigentes; además señala estrategias de evaluación de riesgos y de reducción de riesgos para prevenir potencialmente la
transmisión de la enfermedad a través del uso de suero en la fabricación de productos medicinales.
Descripción de la Enfermedad
Las TSE son enfermedades animales y humanas transmisibles que se caracterizan por una degeneración del cerebro, relacio-
nada con severos signos y síntomas neurológicos. Debido a las epidemias de TSE en ganado bovino, denominadas BSE,las
cuales se transmitieron a otras especies, los funcionarios de salud pública están preocupados por el riesgo de infección de TSE,
incluida la posibilidad de transmisión de TSE por el uso de productos terapéuticos que se fabrican usando suero bovino. Se han
encontrado títulos bajos en el fluido cerebroespinal, pulmón, tejido linfático, bazo, riñón, hígado e íleon del ganado bovino
infectado con BSE.Los estudios han demostrado que la transfusión sanguínea a partir de una oveja infectada con BSEo prurito
lumbar pero sin enfermedad evidente puede infectar a una oveja que no ha sido expuesta previamente a la infección. Aunque
siempre está presente el riesgo de contaminación cruzada, a la fecha, ningún estudio ha demostrado que la enfermedad pue-
de transmitirse a partir de la sangre de ganado bovino con BSE.Los embriones de ganado bovino afectado por BSEno han
transmitido enfermedades a ratones. Los terneros nacidos de hembras reproductoras que recibieron embriones de ganado bo-
vino afectado por BSEhan sobrevivido por hasta 7 años, y el examen practicado a los cerebros de las hembras reproductoras
no afectadas y de sus crías no revelaron encefalopatía espongiforme.
Estrategias de Detección
Ninguno de los procedimientos actualmente disponibles cuenta con una sensibilidad validada que sea suficiente para llevar a
cabo la detección antemortem en animales asintomáticos, aunque se encuentran en desarrollo métodos analíticos para la de-
tección y cuantificación en materiales de baja infectividad como la sangre. La prueba clásica de diagnóstico para TSE es el exa-
men histológico postmortem de tejido cerebral para confirmar la característica degeneración vacuolar. Otras opciones de análi-
sis incluyen pruebas inmunohistoquímicas que pueden confirmar la presencia de PrPSc, la conformación anormal específica
para la enfermedad de la proteína priónica (PrP), en las regiones vacuoladas del cerebro; y pruebas inmunoquímicas como
transferencias Western y enzimoinmunoensayos que pueden detectar PrPSc en tejidos con títulos altos o moderadamente al-
tos. Estas pruebas generalmente toman menos tiempo que el examen histológico (6-8 horas vs. semanas, respectivamente) y
se pueden automatizar parcial o totalmente. Aunque muchas de éstas pruebas son postmortem, los estudios han demostrado
la viabilidad de las pruebas antemortem de muestras de tejido linfoide obtenido de las amígdalas o de la membrana nictitante
de animales infectados. Las pruebas inmunoquímicas requieren de una extensa recolección y preparación de muestras y pue-
den ser demasiado caras para emplearse como pruebas y monitoreos de rutina de la enfermedad en manadas grandes. Las
estrategias de diagnóstico deben considerar la sensibilidad del análisis en ciertos tejidos, así como la capacidad de la prueba
para detectar la infectividad en los animales antes del desarrollo de signos clínicos de enfermedad. Los resultados negativos no
aseguran la ausencia de infectividad. La detección de infectividad es posible si se inocula el tejido sospechoso en animales ex-
perimentales intracranealmente donde el agente causante puede amplificarse. Esta metodología de detección de baja infectivi-
dad puede tomar desde meses hasta años para arrojar un resultado positivo.
Estrategiasde Evaluacióny Reducciónde Riesgos
Los fabricantes de suero deben emplear estrategias de reducción de riesgos para eliminar el peligro de contaminación cruza-
da de sangre fetal con otros tejidos, que incluyan la obtención apropiada de artículos de origen animal y el uso de prácticas
que han demostrado eliminar o minimizar el riesgo de transmisión de TSE mediante productos alimenticios o para el cuidado
de la salud. Los usuarios finales del suero deben realizar una evaluación de riesgos relacionada con su estrategia de obtención
del material en la que se considere la cantidad de suero bovino usada en su aplicación, y deben realizar auditorías a los provee-
dorespara asegurar la rastreabilidad del origen, manejo y sistemas de control de calidad apropiados.
ORIGENY EDADDE LOS ANIMALES
Los fabricantes de suero deben monitorear la rastreabilidad de cada lote de suero para asegurar la calificación del suero bovi-
no, según se describió previamente en las secciones Recoleccióny Procesamientodel Sueroy Control de Calidad.Además de la
rastreabilidad, la selección cuidadosa de materiales de origen es el criterio más importante para la seguridad de los productos
medicinales. La certificación de origen debe estar disponible por parte del proveedor y los fabricantes deben conservar esta
información en sus archivos. Las recomendaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU.(FDA, por sus
siglas en inglés) prohíben el uso en productos regulados por la FDA(con excepción de la gelatina) de cualquier material bovi-
no originario de países con casos reportados de BSEautóctona. La regla vigente propuesta califica al FBScomo una fuente
improbable de material infeccioso de BSE,puesto que la evidencia actual sugiere que la transmisión de BSEde la vaca al terne-
ro es poco probable. La regla propuesta indica además que los materiales de ganado bovino prohibidos no incluyen materiales
derivados de fetos de terneros provenientes de vacas inspeccionadas y aprobadas, siempre que los materiales se hayan obteni-
do mediante procedimientos que puedan prevenir la contaminación con materiales de riesgo especificados. Para productos
biológicos veterinarios, los reglamentos vigentes aplicados por el Centro de Productos Biológicos Veterinarios del USDA(US-
DA's Center for Veterinary Biologics o CVB)indican que los ingredientes de origen animal deben obtenerse de países sin o con
un riesgo bajo de BSE,según lo definido por el Centro Nacional de Importaciones y Exportaciones de EE.UU.y el Título 9 del
CFR94.18.
Las fuentes de materiales más satisfactorias provienen de países con las siguientes características:
• Sin casos reportados de BSEautóctona
• Notificación obligatoria de pruebas positivas
• Verificación obligatoria clínica y en el laboratorio de casos sospechosos
• Prohibición de uso de harina de carne y huesos que contengan proteínas de animales rumiantes como fuente alimenta-
ción de animales rumiantes
• Sin importación de ganado bovino de países donde se haya presentado una alta incidencia de BSE
• Sin importación de progenie de hembras afectadas
La infectividad de la BSEpuede incrementarse con la edad del animal. Aunque el suero bovino se considera un material de
bajo riesgo de transmisión de TSE, algunos usuarios finales consideran prudente obtener el suero a partir de hembras repro-
ductoras menores de una edad máxima establecida. Si los fabricantes no pueden determinar la fecha de nacimiento de la
hembra reproductora, deben considerar tanto la fecha de implementación de la prohibición alimentaria en el país de origen y
el periodo de incubación de BSEa fin de determinar la seguridad de la fuente. En julio de 1988 se impuso una prohibición
alimentaria para animales rumiantes en el Reino Unido. Estas consideraciones son específicas del lote, por lo que las auditorías
del proveedor de materia prima deben incluir una revisión de los registros.
PROCESODE PRODUCCIÓN
El usuario final debe contar con sistemas de fabricación para monitorear el proceso de producción y para delinear la partida
(definición de partida, separación de partidas y limpieza entre partidas). El control de contaminación cruzada potencial con
material posiblemente infeccioso es de primera importancia. Debido a la resistencia documentada de los agentes de TSE a la
mayoría de los procedimientos de inactivación, la obtención controlada de materiales es el criterio más importante para lograr
una seguridad aceptable del producto.
Siempre que sea posible, los fabricantes deben identificar las etapas que teórica o demostrativamente eliminen o inactiven
agentes durante la fabricación del material. Los fabricantes deben continuar sus investigaciones sobre métodos de eliminación
e inactivación para identificar etapas/procesos que ayuden a asegurar la eliminación o inactivación de agentes de TSE. Los fa-
bricantes deben diseñar procesos de producción usando métodos disponibles que presenten la mayor probabilidad de inacti-
var o eliminar agentes de TSE. Por ejemplo, la exposición prolongada de tejidos a calor húmedo alto y pH elevado inactiva al
agente de BSE.No obstante, dichos tratamientos son inapropiados para la extracción de muchos otros tipos de artículos bovi-
nos tales como el suero, debido a que estos tratamientos conllevan a la destrucción del material. Los procedimientos conven-
cionales químicos y bioquímicos de extracción y aislamiento pueden ser suficientes para eliminar al agente infeccioso. Técnicas
similares pueden ser efectivas para otros artículos bovinos. La investigación adicional ayudará a desarrollar una comprensión de
la metodología más apropiada para los estudios de validación. Las cuestiones a considerar durante la validación de un proceso
para eliminar los agentes de TSE incluyen lo siguiente:
• La naturaleza del material contaminado intencionalmente (spiked material) y su relevancia para la situación natural
7318 (1024) Suero Bovino/ Información General USP42
• Diseño del estudio (incluyendo metodologías de reducción de escala de los procesos)

• Método para detectar al agente (ensayos in vitro o in vivo) después de la contaminación intencional y después del trata-
miento
• Caracterización y estandarización de materiales de referencia para la contaminación intencional
• Tratamiento y análisis de datos (ver Diseñoy Análisisde Va/oracionesBiológicas(111))
Debido a que ningún estudio ha validado con éxito métodos analíticos para la detección de pequeñas cantidades del agente
de TSE, los estudios de validación para depuración de TSE por lo general emplean la inyección intracraneal de material en pro-
ceso en roedores para la amplificación y detección de infectividad residual potencial.
ANÁLISISY CONTROLDE AGENTESADVENTICIOS
Introducción
Los procedimientos de análisis rigurosos, las guías estrictas de procesamiento y producción, y las evaluaciones de riesgos
apropiadas ayudan a asegurar la seguridad de los diferentes tipos de suero bovino. Esta sección analiza pruebas específicas que
pueden detectar y controlar agentes adventicios.
Análisis de Agentes Adventicios

Los análisis de agentes adventicios requeridos para la evaluación de siembras maestras, células maestras y productos brutos y
finales se describen en el Título 9 del CFR 113.53 y en las directivas de la Agencia Europea para la Evaluación de Productos
Medicinales (EMEA,por sus siglas en inglés) (EMEA/CVMP/743/00 y EMEA/CPMP/BWP/1793/02). Los métodos de análisis se-
ñalados en estos documentos pueden detectar una amplia gama de agentes microbianos bovinos en productos de suero. Estos
métodos de análisis cumplen con los requisitos de la mayoría de las agencias reguladoras mundiales. Los fabricantes de suero
deben analizar una muestra representativa de cada lote de suero para determinar la presencia de agentes adventicios. El análi-
sis se realiza después de la filtración pero antes de cualquier procesamiento destinado a inactivar o eliminar virus.
La filtración con filtros con un tamaño de poro de 100 nm (O,1 µm) es un método aceptado de eliminación de micoplasmas,
mientras que la radiación gamma (> 25 kGy cuando está congelado) y los tratamientos químicos (p.ej. con betapropiolactona)
son métodos aceptados de inactivación de virus y micoplasmas; los fabricantes de suero usan rutinariamente estas herramien-
tas en las instalaciones de producción y análisis. Estos tratamientos no eliminan anticuerpos que puedan interferir con algunas
aplicaciones. Además, los tratamientos no aseguran la eliminación ni la inactivación total de virus, pero pueden reducir signifi-
cativamente el riesgo de actividad viral. La serie de análisis para determinar la ausencia de agentes adventicios en el suero bovi-
no generalmente incluye lo siguiente:
• Análisisde esterilidad bacteriana y fúngica, según se describe en el Título 9 del CFR 11 3.26
• Análisisde micoplasmas según se describe en el Título 9 del CFR 113.28
• Análisisviral según se describe en el Título 9 del CFR 113.53
Los procedimientos descritos en Pruebasde Esterilidad(71) confirman la ausencia de infección bacteriana y fúngica. En lo que
respecta a virus, únicamente el cultivo usando células sustrato adecuadas puede indicar infectividad y replicación viral. Aque-
llos que usan suero para investigación o producción deben analizar el suero para demostrar la ausencia de agentes adventicios
de una manera que sea congruente con la aplicación prevista del producto, teniendo en cuenta que el análisis únicamente
indica la presencia o ausencia de agentes adventicios dentro de los límites de los procedimientos de análi5i5u5ado5.
Análisis de Micoplasmas
La contaminación con micoplasmas en el cultivo de tejidos puede surgir de muchas fuentes de origen animal, incluido el
suero, pero resulta con mayor regularidad de la contaminación cruzada de cultivos infectados. Los micoplasmas son contami-
nantes particularmente insidiosos en el cultivo celular debido a que
• no pueden visualizarse mediante microscopia de luz incluso a alta densidad (> 10 7 unidades formadoras de colonias/mL);
• no ocasionan cambios observables de turbidez o pH del fluido de cultivo;
• no se pueden eliminar rutinariamente mediante filtros de esterilización individuales, aunque se puede lograr la eliminación
a través de una serie de tres filtros de O,1 µm;
• los antibióticos tradicionales que se usan en el cultivo celular no los afectan; y
• provocan una variedad extremadamente amplia de efectos adversos en el cultivo de tejidos.
El capítulo Pruebaspara Micopfasmas(63) describe la detección clásica de micoplasmas.
Además de estos métodos, los procedimientos de detección más recientes incluyen los ensayos luminiscente y de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). El capítulo TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Amplificación
(1127) describe los principios generales de los ensayos de PCR. El ensayo sensible luminiscente de 20 minutos mide una activi-
dad enzimática específica de molicutes que convierte el difosfato de adenosina a trifosfato de adenosina mediante una reac-
ción de luciferasa/luciferina. Los resultados son inequívocos y semicuantitativos. Los métodos de PCR son rápidos y sensibles y
su funcionamiento es bastante fiable, aunque los resultados falsos positivos ocasionales representan una preocupación en lo
que respecta a laboratorios de servicios de análisis comerciales. La PCR puede detectar fragmentos de ADN micoplasmáticos
no infecciosos.
AnálisisViral
Los procedimientos de análisis viral para productos de suero se citan en el Título 9 del CFR 11 3.52 y en el Título 9 del CFR
113.53. Además, existen otros documentos que pueden incluir análisis equivalentes o pertinentes, como por ejemplo EMEA/
CVMP/7 43/00-Rev.2 del Comité para Productos Medicinales Veterinarios (Committee for Veterinary Medicinal Products o
CVMP) Guía Revisadade Requisitosy ControlesAplicadosal SueroBovinoUsadoen la Producciónde ProductosMedicinalesVeterina-
rios Inmunológicos(RevisedGuidelineon Requirementsand ControlsApplied to BovineSerumUsedin the Productionof lmmunologi-
cal VeterinaryMedicinal Products)y EMEA/CPMP/BWP/1793/02 del Comité para Productos Medicinales de Patente (Committee
for Proprietary Medicinal Products o CPMP) Guíassobre el Usode SueroBovinoen la Fabricaciónde ProductosMedicinalesBiológi-
cosde UsoHumanos(Note for Guidance on the Use of Bovine Serum in the Manufacture of Human Biological Medicinal Pro-
ducts). Los fabricantes de suero deben realizar análisis de virus que cumplan con esta reglamentación, usando por lo menos
dos líneas de células detectoras diferentes y sensibles, de las cuales una debe ser de origen bovino. Las pruebas incluyen el
cultivo de células detectoras en medios de cultivo celular suplementados con el suero de prueba al 15% durante al menos 21
días. Las células se subcultivan por lo menos dos veces durante este periodo, generalmente a los 7 y 14 días posteriores a la
inoculación. Una vez terminado el último subcultivo (después de un total de al menos 21 días de incubación), las células se
examinan para detectar signos generales de amplificación del virus. Los siguientes puntos finales se usan para la detección ge-
neral de virus: examen microscópico celular para agentes citopatogénicos tales como el virus de la rinotraqueitis bovina infec-
ciosa, tinción celular y examen microscópico para cuerpos de inclusión, y prueba de hemadsorción para detectar agentes he-
madsorbentes tales como Pl-3. Además de esta serie de análisis y al finalizar el último subcultivo (después de un total de al
menos 21 días de incubación), las células se tiñen con anticuerpos específicos fluorescentes contra los siguientes agentes vira-
les específicos:
• BVDV
• Parvovirus bovino
• Adenovirus bovino
• Virus de la lengua azul
• Virus respiratorio sincicial bovino
• Reovirus
• Virus de la rabia
Además de los virus listados anteriormente, otros virus pueden ser agentes causantes de enfermedades y que requieren de
análisis en diversas aplicaciones del suero bovino. El usuario final del suero es el responsable de determinar si el análisis com-
pleto del Título 9 del CFRes suficiente y si se deben analizar otros agentes virales específicos. Ejemplos de virus específicos no
cubiertos por la guía de análisis viral vigente pueden incluir akabane, virus del herpes bovino tipo 1 (VHB-1), virus de la parain-
fluenza tipo 3 (Pl-3), leucemia bovina, rotavirus bovino, circovirus bovino, poliomavirus bovino, coronavirus, torovirus, entero-
virus bovino, astrovirus bovino, virus de fiebre aftosa (VFA)y peste bovina. El Apéndice2 proporciona una descripción general
de estos virus, así como de aquellos para los que se requiere de análisis. El análisis de riesgos extensivo por parte del usuario
final del suero debe determinar el alcance del análisis y las opciones para el tratamiento del suero.
Estrategiasde Evaluacióny Detección de Riesgos
Los fabricantes de suero y los usuarios finales de suero deben llevar a cabo evaluaciones integrales de riesgos basadas en
datos científicos (p.ej. análisis de modos y efectos de falla) a fin de comprender de mejor manera el perfil de seguridad del
producto del suero. Se pueden tomar en cuenta los siguientes elementos de evaluación de riesgos, aunque es posible incluir
otros elementos según sea apropiado: país de origen, región del país, estado de enfermedad animal del país/región de origen,
edad del animal, proceso de recolección sanguínea, método de aturdimiento del animal y método de desangrado, proceso de
fabricación del suero, tipo de sistema de calidad de producción, controles de producción durante el proceso, análisis del pro-
ducto final, inactivación del virus, segregación del equipo, procedimiento de limpieza del equipo, capacitación del personal,
uso/aplicación del suero, tipo de producto farmacéutico y uso previsto.
La barrera de especies proporciona un grado de protección en contra de infecciones por algunos agentes etiológicos anima-
les. Esta barrera no es una alternativa para asegurar de manera proactiva que los productos farmacéuticos se fabriquen única-
mente a partir de materias primas de origen animal que presentan niveles indetectables de agentes adventicios. La inoculación
de organismos viables en especies no anfitrionas conlleva el riesgo de que los organismos puedan cruzar la barrera de especies.
Por lo tanto, un régimen apropiado de análisis del material del suero debe incluir exámenes para determinar la presencia de
contaminantes potenciales relacionados con la especie de origen y la especie objetivo. Los tratamientos del suero para inactivar
agentes virales son un factor para establecer el régimen de análisis adecuado para un material en particular. El nivel de riesgo
más bajo de contaminación se relaciona con materiales biológicos que se esterilizan de manera terminal.
Un nivel de riesgo igual a cero es imposible e irrazonable. Los fabricantes de suero deben describir completamente los regí-
menes de análisis específicos en las especificaciones del producto, los cuales variarán dependiendo del tipo y origen del suero.
Por tanto, las pautas de detección descritas en este capítulo únicamente son ejemplificativas y es posible que no se requiera de
7320 (1024) Suero Bovino/ InformaciónGeneral USP42
la detección de todos los virus citados para un material en particular. Algunos fabricantes pueden realizar ciertas pruebas sobre
el producto terminado o los materiales en proceso en lugar de realizarlas sobre los componentes individuales. Los fabricantes
también deben evaluar el efecto de dilución en relación con el límite de detección del procedimiento de análisis. La interferen-
cia con el crecimiento o neutralización de actividad viral por parte del suero puede ser indicativo de un anticuerpo específico o
de ciertos factores inespecíficos de enmascaramiento del agente viral por parte del suero. Se recomienda que los fabricantes de
suero consideren esta posibilidad al momento de determinar un nivel adecuado de tratamiento en sus estudios de inactivación
viral o aplicaciones de análisis viral.
Los fabricantes de suero deben confirmar que la especie de origen es bovina para asegurar la ausencia de otros agentes no
bovinos. Los fabricantes deben realizar análisis de virus extraños en cultivos celulares apropiados (ver Métodosde PruebasViro-
lógicas(1237) para seleccionar adecuadamente las líneas celulares, dependiendo del ensayo y del agente buscado). Si fuera
necesario, se deben realizar estudios de seroconversión en especies animales susceptibles al virus, usando una respuesta inmu-
ne mediada por anticuerpos en la especie anfitriona como método de detección. Los estudios deben usar este procedimiento
después de una etapa de inactivación para detectar si el virus estaba presente antes del proceso de inactivación viral.
Los procesos de fabricación de suero deben realizarse de manera congruente, siguiendo los procedimientos de fabricación
establecidos, con sistemas de calidad adecuados incorporados al proceso de producción. Además, la segregación de equipo
(por especies de origen), los procedimientos de limpieza de equipo e instalaciones, y la capacitación de personal son elemen-
tos importantes en la evaluación de riesgos del proceso.
Consideraciones de Seguridad
Los usuarios finales de suero bovino de donante pueden requerir que el suero no presente anticuerpos detectables contra el
VDVBu otros agentes específicos, de modo que los usuarios puedan propagar cultivos celulares usados en la producción de
vacunas, en el análisis de diagnóstico, y en la preparación de kits de pruebas, especialmente para el mantenimiento de reservas
de células maestras y de siembra. Se encuentran disponibles más de 40 tipos de células para la producción de productos bioló-
gicos veterinarios, pero menos de 1O tipos de medios para su propagación. Algunos investigadores han propuesto medios
exentos de suero como alternativa para propagar ciertas células y virus; sin embargo, esto significa adaptar los procedimientos
de cultivo, lo que puede alterar las células y cambiar los resultados de producción. Si se importan sueros nuevos o diferentes a
EE.UU.,los usuarios finales del suero requerirán confirmación de origen, especies y documentación de origen de los sueros en
países libres de FAy peste bovina.
CARACTERIZACIÓN
DE SUEROBOVINO
Introducción
Ante la ausencia de requisitos específicos del producto final, se debe analizar cada lote de FBSpara confirmar que el suero
cumpla con los requisitos del capítulo general propuesto SueroFetal Bovino-Atributos de Calidady Pruebasde Funcionalidad
(90). Esta sección describe diversos procedimientos claves de caracterización para todos los demás tipos de suero. Estos proce-
dimientos no son obligatorios pero representan guías que los fabricantes pueden considerar para sus aplicaciones individuales.
La tabla de la sección Hemoglobinapresenta ejemplos de especificaciones para los diversos tipos de suero bovino.
Identificaciónde Especies
El suero bovino debe someterse a ensayos de identificación tanto ínter como intraespecies para confirmar la identidad de la
especie y la integridad de los productos del suero, así como para asegurar que no se encuentren presentes agentes no bovinos.
El ensayo más comúnmente usado para la identificación de la especie bovina se basa en el perfil electroforético de proteínas
específicas del suero. Con la electroforesis, las proteínas del suero por lo general se separan hasta en seis fracciones: albúmina,
alfa 1, alfa 2, beta 1, beta 2 y gamma globulinas.
Otros procedimientos usados para la determinación de especies bovinas incluyen la inmunodifusión radial (IDR)y el método
de difusión doble de Ouchterlony. Estos procedimientos permiten mediciones cualitativas o cuantitativas de los niveles de in-
munoglobulina G en el suero. El método por IDRse basa en la difusión de un antígeno desde un pocillo circular en un gel
homogéneo que contiene un antisuero específico para cada antígeno en particular. Se forma un círculo de antígeno y anticuer-
po precipitados y continúa creciendo hasta que alcanza el equilibrio. Los diámetros de los anillos son una función de concen-
tración de antígeno. El método de Ouchterlony es una prueba de difusión doble en gel en la que el antígeno y el anticuerpo
difunden uno hacia el otro en un medio semisólido hasta un punto en el medio en el que se alcanza una concentración óptima
de cada uno, formando un precipitado. Las placas de Ouchterlony contienen pocillos cilíndricos-un pocillo de antígeno cen-
tral de 8 mm de diámetro, rodeado por seis pocillos de antisuero de 3 mm-que posibilitan el monitoreo simultáneo de múlti-
ples sistemas de antígeno-anticuerpo y la identificación de antígenos particulares en una preparación. El capítulo general pro-
puesto SueroFetal Bovino-Atributos de Calidady Pruebasde Funcionalidad(90) describe el procedimiento aceptado.
Hemoglobina
La hemoglobina es una proteína de subunidades múltiples que forma una unión inestable y reversible con el oxígeno en los
eritrocitos. La forma cargada de oxígeno se denomina oxihemoglobina y es de color rojo brillante. La forma que no está carga-
da de oxígeno se denomina desoxihemoglobina y es de color azul púrpura. La oxihemoglobina es la forma predominante en
los eritrocitos.
El bajo contenido de hemoglobina en los sueros es ampliamente aceptado como una buena indicación general de procesa-
miento rápido y cuidadoso de la sangre que se usará para el suero. Los eritrocitos son frágiles y se rompen fácilmente, liberan-
do hemoglobina en el suero. La manipulación brusca de la sangre recolectada, el pobre control de temperatura o los retrasos
en el procesamiento elevan el contenido de hemoglobina en el suero. Los niveles aceptables de hemoglobina pueden variar
dependiendo de la aplicación prevista. Los niveles de hemoglobina se miden usando procedimientos espectrofotométricos (ver
Espectroscopía Ultravioleta-Visible(857)) según se describe en el capítulo general propuesto SueroFetalBovino-Atributos de Cali-
dad y Pruebasde Funcionalidad(90).
Suero de Suero Suero de

Ternero de Bovino Bovino
FBS Recién Nacido Suero de Ternero Donante Adulto
Prueba de Esterilidad No se detecta No se detecta No se detecta No se detecta No se detecta
crecimiento crecimiento crecimiento crecimiento crecimiento
Micoplasmas No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan
Análisis de virus No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan
Hemoglobina (mq/dl) <30 <30 <30 <30 <30
Proteínas totales (g/dl) 3,0-4,5 3,5-6,0 5,0-8,0 5,0-8,0 6,0-10,0
pH 7,00-8,00 7,00-8,00 7,00-8,00 7,00-8,00 7,00-8,00
Osmolalidad (mOsmol/Kq) 280-360 240-340 240-340 240-340 240-340
Perfil Químico
El análisis de componentes tales como colesterol, alfa globulina, beta globulina, gamma globulina, albúmina, creatinina, bili-
rubina, glucosa, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, fósforo, potasio, calcio y sodio por lo general no se con-
sidera un criterio para liberación del lote de suero bovino. Algunos fabricantes no realizan análisis de manera rutinaria sino úni-
camente como análisis auxiliares. En algunas ocasiones, los laboratorios clínicos hospitalarios pueden llevar a cabo los análisis.
Los niveles de estas sustancias químicas en el suero son importantes para los usuarios finales y se pueden usar también para
evaluar la variabilidad de lote a lote.
Niveles de Endotoxinas
Aunque los niveles altos de endotoxina no son adecuados para aplicaciones que involucren inyectables, los niveles acepta-
bles en suero bovino varían dependiendo de la aplicación prevista. Algunos fabricantes pueden pasar por alto la importancia
de los niveles bajos de endotoxinas en el suero bovino usado en aplicaciones de cultivo celular. Las endotoxinas influyen en
más de 30 actividades biológicas, algunas de las cuales incluyen activación de macrófagos, estimulación mitogénica y la induc-
ción de interferones y de factor estimulante de colonias (para algunas aplicaciones, estas pueden ser actividades positivas). Las
endotoxinas también pueden conllevar a citoxicidad al iniciar la activación del complemento. Los métodos más comúnmente
usados para la detección de endotoxinas son el procedimiento semicuantitativo de coagulación con lisado de amebocitos de
Limulus y el método cromogénico cinético cuantitativo descritos en Pruebade EndotoxinasBacterianas(85). Tanto para el ensa-
yo de coagulación como el ensayo cromogénico cinético, un ensayo válido de endotoxinas requiere de tratamiento apropiado
por calor o dilución a fin de evitar efectos adversos de sustancias interferentes en el suero. Los investigadores deben incluir un
control de producto positivo en cada ensayo para confirmar que se ha superado cualquier interferencia por el tratamiento por
calor o dilución.
Osmolalidad
La prueba de osmolalidad está diseñada para evaluar la concentración de electrolitos en el suero bovino. Las sustancias quí-
micas que afectan la osmolalidad del suero incluyen sodio, cloruro, bicarbonato, potasio, proteínas y glucosa. Los fabricantes
de suero deben medir la osmolalidad de cada partida de suero para verificar el cumplimiento con las especificaciones del pro-
ducto, usando equipos calibrados con estándares rastreables al Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (National lnstitu-
te of Standards and Technology). El capítulo Osmo/alidady Osmolaridad(785) describe la forma en que se determina la osmo-
lalidad mediante disminución del punto de congelamiento de la solución de suero bovino. Los científicos emplean por lo me-
nos dos estándares para calibrar el instrumento. La osmolalidad de cada muestra se calcula y relaciona con el contenido de
agua del suero y se expresa en mOsmol/kg H20.
7322 (1024) Suero Bovino/ InformaciónGeneral USP42
Nivel de Proteínas Totales
El nivel de proteínas totales en el suero se mide para verificar la edad del animal y el cumplimiento con las especificaciones
del producto. El capítulo ArtículosObtenidospor Biotecnología-Valoracióde n ProteínasTotales(1057) describe dos procedimien-
tos, los métodos de Biuret y de Bradford, para determinar la concentración de proteína. El usuario final debe evaluar el nivel
aceptable de proteína en el suero basándose en la aplicación prevista.
Propiedades de Crecimiento Celular
Se debe analizar la capacidad de cada lote de suero para sustentar el crecimiento in vitro de líneas celulares específicas. Los
sueros bovinos son muy variables por lo que lotes distintos pueden producir resultados diferentes. Debido a esta variabilidad,
los usuarios finales deben caracterizar y estandarizar las líneas celulares que usarán para este tipo de análisis. Los usuarios fina-
les deben diseñar procedimientos de crecimiento celular que les ayuden a verificar la eficacia del suero bovino en la promoción
del crecimiento celular. Los fabricantes de suero se beneficiarán del monitoreo de la promoción de crecimiento celular durante
varias generaciones de subcultivos para detectar cualquier evidencia de citoxicidad o cambios en la morfología celular. Los fa-
bricantes de suero usan distintos tipos de células, y los estudios de crecimiento y las líneas celulares usadas por los fabricantes
de suero también pueden variar de aquellos aplicados por los usuarios finales del suero. Al evaluar las propiedades de creci-
miento de una línea celular específica en respuesta a un lote específico de suero, los fabricantes de suero deben tomar en
cuenta la eficiencia del plaqueo y/o la promoción de crecimiento o algunas otras pruebas de funcionalidad que califiquen al
lote de suero para su uso previsto.
La eficiencia del plaqueo a baja densidad celular es un método preferido para analizar la capacidad de proliferación y la su-
pervivencia de células individuales en condiciones óptimas de crecimiento. Este procedimiento puede revelar diferencias en la
velocidad de crecimiento dentro de la población y es capaz de distinguir entre cambios en la velocidad de crecimiento (tama-
ño de las colonias) y la supervivencia de las células (número de las colonias). La cinética del crecimiento es otro aspecto impor-
tante en el diseño de experimentos celulares. Determinar la curva de crecimiento de cada línea celular ayuda a definir condi-
ciones de cultivo óptimas, debido a que la variación en el suero y otros aditivos de crecimiento pueden tener influencia sobre
los parámetros de crecimiento, lo cual puede afectar el resultado del experimento.
Ante la ausencia de pruebas específicas diseñadas para sus productos particulares, los usuarios del suero pueden referirse a
las pruebas de funcionalidad descritas en el capítulo general propuesto SueroFetalBovino-Atributosde Calidady Pruebasde
Funcionalidad (90) para determinar si un lote de suero es adecuado para sus aplicaciones. Este capítulo proporciona guías sobre
cómo realizar las pruebas de promoción de crecimiento y de eficiencia del plaqueo.
Citotoxicidad In Vitro
Los fabricantes de suero deben usar una línea celular apropiada para analizar cada lote de suero y deben realizar estudios de
crecimiento a través de varias generaciones subcultivadas para asegurar que el suero no tenga efectos citotóxicos sobre las cé-
lulas. La elección de una línea celular depende del uso previsto del suero. Los ensayos de crecimiento celular y de citotoxicidad
deben realizarse en el lote final de suero después de cualquier etapa de inactivación viral o de cualquier procesamiento adicio-
nal.
CONCLUSIÓN
Es probable que el suero bovino se mantenga como un componente importante en la fabricación de muchos productos bio-
lógicos, en particular de aquellos que dependen del cultivo celular. Al igual que otros materiales similares, la calidad del suero
bovino es intrínsecamente variable. Por consiguiente, los usuarios finales del suero deben establecer pruebas, procedimientos y
criterios de aceptación adecuados para la introducción de materiales en el proceso de una aplicación particular que utilice sue-
ro. Lo anterior puede requerir el análisis de múltiples lotes de suero bovino para determinar aquellos lotes que cumplen con la
especificación (ver la sección Caracterización de SueroBovino).
Los fabricantes de productos terapéuticos que usan suero bovino son responsables de asegurar y documentar su calidad, así
como el impacto sobre la calidad, seguridad y eficacia del producto final. Además, es importante asegurar que el desempeño
de cada lote de suero sea equivalente durante la fabricación. El suero también puede interferir con la purificación del producto
final; por lo tanto, es importante comprender el efecto del suero bovino sobre el proceso de fabricación a fin de entender el
efecto que pueden tener varios procesos sobre el producto final. Por último, es posible disminuir los riesgos a través del diseño
de procesos que incluyan etapas que eliminen adecuadamente el material bovino mediante dilución, separación o inactiva-
ción, así como el desarrollo de ensayos analíticos para evaluar el contenido residual del material bovino durante los procesos y
en el producto terapéutico final. Diversos ensayos sensibles pueden proporcionar un medio cuantitativo para detectar el mate-
rial bovino en niveles de picogramos.
APÉNDICES
Apéndice1: ReferenciasReglamentariasPertinentes
El suero bovino y los productos relacionados con el suero usados en la fabricación de productos biológicos se encuentran
reglamentados en el contexto de Requisitospara Ingredientesde Origen Animal Usadosen la Producciónde ProductosBiológicos
(Requirementsfor lngredientsof Animal Origin Usedfor the Productionof Biologics),Título 9 del CFR 113.53. En la actualidad,
cada fabricante de suero realiza estudios de detección para identificar virus contaminantes. Debido a la potencial comercializa-
ción internacional del suero, los fabricantes de suero necesitan tener en cuenta otros requisitos reglamentarios. Los fabricantes
pueden usar los documentos listados en este capítulo como guía para la determinación de contaminación por agentes adventi-
cios en sueros bovinos. Debido al riesgo que conllevan los productos de suero derivado de animales, los fabricantes de suero y
los usuarios finales deben asegurar que el país de origen del material cumpla con los requisitos reglamentarios aplicables. Aun-
que en la actualidad ningún ensayo de desempeño celular demuestra la ausencia de BSEen el suero, los fabricantes de suero
deben cumplir con los requisitos reglamentarios de los países donde el suero se obtiene y comercializa a fin de asegurar un
riesgo mínimo de infección por BSE/TSE.
Más allá de los capítulos de USPpertinentes referidos en este capítulo, la siguiente lista incluye documentos reglamentarios
así como las mejores prácticas para el desarrollo, fabricación, control de calidad y garantía de calidad del producto y los proce-
sos.
CFR
• Título 9 del CFR94.18 (CVB,2001)
• Título 9 del CFR 113.46
• Título 9 del CFR 320
• Título 21 del CFR 211 Subparte E
• Título 21 del CFR801.1
• Título 21 del CFR809.1 O
FDA
• FDA.Center for Biologics Evaluation and Research (CBER).2000. Letter to manufacturers of biological products (Carta a
los fabricantes de productos biológicos). Disponible en http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/SafetyAvailability/
ucm105877.htm
• Use of materials derived from cattle in medicinal products intended for use in humans and drugs intended for use in rumi-
nants (Uso de materiales derivados de ganado bovino en productos medicinales destinados para uso en humanos y medi-
camentos destinados para uso en animales rumiantes) (Regla propuesta). FederalRegister(RegistroFederal).2007; 72(8):
1582-1619. Disponible en http://www.reginfo.gov/public/
Reglamentos Internacionales y Documentos Guía
• CPMP/Biotechnology Working Party/EMEA(CPMP/BWP/EMEA).1996. Note for guidanceon virus validation studies(Nota
de orientaciónsobre estudiosde validaciónde virus): the design,contribution and interpretation of studiesvalidating the inacti-
vation and removalof viruses(diseño,contribucióne interpretaciónde estudiospara validar la inactivacióny eliminaciónde
virus). Disponible en http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/
WC500003684.pdf
• CPMP/BWP/EMEA.2003. Note for guidanceon the useof bovineserum in the manufacture of human biologica/medicinalpro-
ducts (Nota de orientaciónsobreel uso de suerobovino en la fabricaciónde productosmedicina/esbiológicospara uso huma-
no). Disponible en http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/
WC500003675.pdf
• EMEA/CVMP/743/00-Rev.2del Committee for Veterinary Medicinal Products (Comité para Productos Medicinales Veteri-
narios o CVMP). Revisedguideline on requirementsand controlsapplied to bovineserum usedin the production of immunologi-
cal veterinarymedicinalproducts (Guía revisadasobre requisitosy controlesaplicadosal suerobovino usado en la producciónde
productosmedicina/esinmunológicospara uso veterinario).Disponible en http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/docu-
ment_library/Scientific_guideline/2009/10/WC500004575.pdf
• CPMP/CVMP.Note for guidanceon minimising the risk of transmitting animal spongiformencephalopathyagents vía human
and veterinarymedicinalproducts (Nota de orientaciónsobrela minimización del riesgode transmisiónde agentesde encefalo-
patía espongiformeanimal medianteproductosmedicinalespara uso humano y veterinario).Disponible en http:/ /
www.ema.europa.eu/docs/en_ GB/document_library /Scientific_guideline/2009 /09 /WC500003712.pdf
• Organización Mundial de la Salud (OMS), Organización Mundial de Sanidad Animal. Códigosanitario para los animales
terrestres. Disponible en http://www.oie.int/doc/ged/D10905.pdf
7324 (1024) Suero Bovino / Información General USP42
• OMS. 2006. WHOguidelineson tissueinfectivity distribution in transmissiblespongiformencephalopathies(Guíasde la OMS

sobre la distribución tisular de la infectividadde encefalopatíasespongiformestransmisibles).http://www.who.int/bloodpro-
ducts/cs/TSEPUBLISHEDREPORT.pdf
Apéndice 2: Virus a Consideraren el Análisisde Suero Bovino
A continuación se presenta una descripción general de los virus que los fabricantes pueden considerar al determinar la au-
sencia de agentes adventicios en suero bovino. La lista se proporciona únicamente para propósitos de información general. La
lista de análisis requeridos se proporciona en este capítulo en la sección AnálisisViral.
Akabane-Virus transmitido por insectos que ocasiona anormalidades congénitas del sistema nervioso central de animales
rumiantes. La enfermedad debida al virus de Akabaneha sido reconocida en Australia, Israel, japón y Corea. Se han encontrado
anticuerpos contra este virus en varios países en el Sureste Asiático, el Medio Oriente y África. La enfermedad afecta a los fetos
de ganado bovino, ovejas y cabras. Se ha demostrado serológicamente la infección asintomática en caballos, búfalos y vena-
dos (aunque no en humanos ni cerdos) en áreas endémicas.
Lengua Azul-Enfermedad viral infecciosa no contagiosa transmitida por artrópodos que afecta principalmente a animales
rumiantes domésticos y salvajes. La infección por el virus de la lengua azul es común a nivel mundial pero por lo general es
subclínica o moderada. Elvirus de la lengua azul corresponde a la especie tipo del género Orbivirusde la familia Reoviridae. Se
han identificado 24 serotipos a nivel mundial, aunque no todos los serotipos existen en una sola área geográfica: p. ej., se han
reportado únicamente 5 serotipos (2, 1O, 11, 13 y 17) en los EE.UU.La distribución a nivel mundial es análoga a la distribución
espacial y temporal de las especies vector de los jejenes Culicoides,que representan el único transmisor natural significativo del
virus.
Adenovirus bovino-Se relaciona con un amplio espectro de enfermedades. El adenovirusbovino tipo 3 es el serotipo más
comúnmente asociado con la enfermedad respiratoria bovina. Los adenovirusbovinosson virus de ADN que se han separado
en dos géneros: el Mastadenoviruso adenovirusmamíferoy el Aviadenoviruso adenovirusaviar. El género Mastadenoviruscom-
prende numerosos serotipos específicos de especie, de los cuales se han identificado nueve en el ganado bovino. También se
han podido aislar adenovirusepiteliotrópicosde animales rumiantes que por lo general son clínicamente inaparentes. La enfer-
medad clínica está dictada por varios factores que incluyen la cepa del virus, la infección concurrente, el estrés, las condiciones
ambientales y las prácticas de manejo.
Virus del herpes bovino tipo 1 (VHB-1 )-Se relaciona con diversas enfermedades en el ganado bovino entre las que se
incluyen la rinotraqueitis infecciosa bovina, vulvovaginitis pustular infecciosa, balanopostitis, conjuntivitis, aborto, encefalomie-
litis y mastitis. Las infecciones por VHB-1están muy extendidas en la población de ganado bovino. La forma respiratoria es la
más común en el ganado bovino de engorde a corral.
Leucemia bovina-Oncovirus exógeno tipo C de la familia Retroviridae. La leucemia bovina es una enfermedad viral del
ganado bovino adulto que se caracteriza por la neoplasia de linfocitos y nodos linfáticos. La infección ocurre por la transferen-
cia iatrogénica de linfocitos infectados seguida por una respuesta de anticuerpos permanente. Aunque la prevalencia de la in-
fección en una manada puede ser elevada, solo unos pocos animales desarrollan linfosarcoma fatal. La infección se propaga
por el contacto con la sangre contaminada de un animal infectado.
Reovirus bovino-Virus de ácido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) con viriones esféricos sin envoltura de 60-80 nm
de diámetro, los cuales ocasionan enfermedades respiratorias bovinas.
Virus respiratorio sincicial bovino (VRSB)-Virus de ARN clasificado como pneumovirus de la familia Paramixovirus. El
nombre del virus se deriva de su efecto citopático característico: la formación de células sinciciales. Además del ganado bovi-
no, las ovejas y cabras también pueden resultar infectadas por virus respiratorios sinciciales. El virus respiratorio sincicial huma-
no (VRSH)es un patógeno respiratorio importante en infantes y niños pequeños. El VRSHcomprende subtipos antigénicos y la
evidencia preliminar sugiere la existencia de subtipos antigénicos de VRSB.El VRSBestá distribuido por todo el mundo y es
autóctono de la población de ganado bovino. Las infecciones por VRSBrelacionadas con enfermedades respiratorias ocurren
predominantemente en ganado bovino joven para producción de carne y leche.
Rotavirus bovino-Virión esférico de ARNdc de 60-80 nm de diámetro que carece de envoltura. Es la causa viral más co-
mún de diarrea en terneros y corderos.
Virus de la diarrea viral bovina (VDVB)-Virus de ARN clasificado como Pestivirusde la familia Flaviviridae. El BDVBpuede
atravesar la placenta y parece ser es capaz de inducir la inmunosupresión, lo que permite el desarrollo de neumonía bacteriana
secundaria. Se ha informado que el VDVBes el virus asociado con mayor frecuencia con múltiples infecciones virales del tracto
respiratorio en terneros.
Fiebre aftosa (FA)-Enfermedad viral altamente infecciosa del ganado bovino, cerdos, ovejas, cabras, búfalos y especies de
artiodáctilos silvestres. En una población susceptible, la morbilidad se acerca al 100%. La enfermedad solo es fatal en raras oca-
siones, excepto en animales jóvenes. La FA es ocasionada por un Aftovirusde la familia Picornaviridae. Se conocen siete seroti-
pos inmunológicamente distintos y dentro de cada serotipo existe un gran número de cepas que presentan un espectro de
características antigénicas.
Virus de la parainfluenza tipo 3 (Pl-3)-Virus de ARN clasificado en la familia Paramixovirus. Aunque el Pl-3 es capaz de
ocasionar enfermedad, el virus por lo general se asocia con infecciones moderadas a subclínicas. El papel más importante del
Pl-3 es actuar como un iniciador que puede llevar al desarrollo de neumonía bacteriana secundaria. Las infecciones ocasiona-
das por Pl-3 son comunes en el ganado bovino.
USP42 InformaciónGeneral/ (1025) Pancreatina 7325
Parvovirus-Virus de ADN de cadena simple relativamente estable al calor de aproximadamente 20 nm de diámetro que se
ha aislado del ganado bovino pero que en condiciones naturales se desconoce si ocasiona enfermedades.
Rabia-Encefalomielitis viral aguda que afecta principalmente a carnívoros y murciélagos, aunque puede afectar a cualquier
mamífero. La rabia es ocasionada por Lisavirusde la familia Rabdovirus. Aunque generalmente están confinados a una especie
principal de reserva en un área geográfica, es común la extensión a otras especies.
Peste bovina-Morbillivirus estrechamente relacionado con los virus que ocasionan moquillo canino y sarampión. Las cepas
pueden variar en gran medida en cuanto a la gama de huéspedes y virulencia. El suero de ganado recuperado o vacunado
provoca una reacción cruzada con todas las cepas en las pruebas de neutralización, aunque se han demostrado diferencias
antigénicas menores. El virus es frágil y se inactiva rápidamente con calor y luz, pero permanece viable durante largos periodos
en tejidos enfriados o congelados. La peste bovina es endémica en muchos países de Asia y África. Históricamente, el virus se
ha distribuido en gran medida en Europa y África, pero a la fecha no se ha establecido por sí mismo en Norteamérica, Centroa-
mérica, las Islas del Caribe, Sudamérica, Australia ni Nueva Zelanda. La peste bovina se incluye en la lista de enfermedades
transmisibles de la Organización Mundial de Sanidad Animal (Oficina Internacional de Epizootias) de la OMS que tienen un
potencial de propagación muy rápida y seria, sin distinción de fronteras nacionales, que representan serias consecuencias so-
cioeconómicas o de salud pública, y que son de alta importancia en el mercado internacional de ganado y productos ganade-
ros.
(1025) PANCREATINA
ÍNDICE
1 . Introducción
2. Recolección de Páncreas y Producción de Pancreatina
3. Control de Calidad
4. Etiquetado
5. Certificación y Documentación
6. Análisis y Control de Agentes Infecciosos Adventicios
6.1 Información General
6.2 Estrategias de Evaluación de Riesgos
6.3 Pruebas de Identificación para Panel de Virus Relevantes
6.4 Depuración Viral por Etapas del Proceso de Fabricación
6.5 Análisis Viral
7. Caracterización de la Pancreatina
7.1 Descripción de las Propiedades Físico-Químicas
7.2 Contenido Proteico y Enzimático
7.2.1 Proteasas Pancreáticas
7.2.2 Lipasa y Colipasa Pancreática
7.2.3 Fosfolipasa Pancreática A2
7 .2.4 Amilasa Pancreática
8. Mediciones de la Actividad Enzimática
8.1 Actividad de Lipasa
8.2 Actividad de Proteasa
8.3 Actividad de Amilasa
9. Apéndice 1: Bibliografía Reglamentaria
1O. Apéndice 2: Bibliografía de Referencia
1. INTRODUCCIÓN
La pancreatina es una preparación de enzimas pancreáticas que contiene amilasa, proteasa y lipasa aislada de la glándula
pancreática del cerdo Susscrofa L. var. domesticusGray (Fam. Suidae). El páncreas es un órgano secretor que desempeña un
papel crucial en el proceso digestivo mediante la producción de bicarbonato para neutralizar el ambiente ácido en el duodeno,
hormonas que regulan diversas funciones catabólicas, y una variedad de enzimas digestivas para degradar los alimentos en el
intestino delgado. La pancreatina y los productos medicinales que contienen pancreatina se usan para facilitar la digestión y
absorción de alimentos (carbohidratos, grasa y proteínas) en pacientes con insuficiencia pancreática exocrina ocasionada por
fibrosis cística, pancreatitis crónica y otras condiciones que pueden causar una deficiencia en la secreción de enzimas pancreá-
ticas.
7326 (1025) Pancreatina / Información General USP42
Los productos de enzimas pancreáticas de origen porcino se han comercializado en los Estados Unidos para el tratamiento
de la insuficiencia pancreática exocrina desde antes de la promulgación de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cos-
méticos (Federal Food, Drug, and Cosmetic Act) de 1938. Las enzimas pancreáticas suplementarias están disponibles en medi-
camentos de venta con receta y de venta libre. Desde el 2004, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU.
(FDA, por sus siglas en inglés) ha ordenado que todos los medicamentos de enzimas pancreáticas comercializados en los
EE.UU.obtengan la aprobación de dicha agencia mediante una Solicitud para Nuevo Medicamento (NDA, por sus siglas en
inglés). Aunque los medicamentos de enzimas pancreáticas de venta libre están disponibles sin receta médica, estos se clasifi-
can como suplementos dietéticos en lugar de medicamentos. La pancreatina y la pancreolipasa tienen funciones e indicaciones
similares; sin embargo, la pancreolipasa, que está disponible solo como medicamento de venta con receta médica, contiene
más enzima lipasa activa y extracto pancreático purificado que la pancreatina.
Este capítulo describe las mejores prácticas relacionadas con la obtención y fabricación de materias primas de pancreatina
que se usan en los medicamentos de pancreatina y pancreolipasa; estas mejores prácticas ayudan a asegurar la seguridad y la
eficacia de los medicamentos preparados a partir de este ingrediente farmacéutico activo. El Apéndice1: BibliografíaReglamen-
taria provee una lista de documentos guía reglamentarios aplicables.
2. RECOLECCIÓN
DE PÁNCREASY PRODUCCIÓNDE PANCREATINA
La materia prima de origen animal (páncreas) destinada para procesamiento farmacéutico es un subproducto de la produc-
ción de carne y se recolecta en mataderos aprobados por la autoridad nacional competente e inspeccionados por la autoridad
veterinaria pertinente. Los animales a partir de los que se deriva la pancreatina deben cumplir con los requisitos de salud ani-
mal adecuados para consumo humano.
Un ejemplo de un proceso de fabricación típico se resume en la descripción y en el diagrama de flujo (Figura 1) a continua-
ción.
Las glándulas pancreáticas deben mantenerse congeladas para prevenir una pérdida de actividad enzimática durante su con-
servación y transporte. Después de que el fabricante acepta los materiales congelados, la pancreatina se extrae y se purifica en
condiciones que reducen la carga microbiológica y otras impurezas potenciales. Para lograr lo anterior, las glándulas pancreáti-
cas se maceran hasta obtener una suspensión espesa fina, la cual se trata con activadores para convertir los precursores de
enzimas pancreáticas inactivas (zimógenos) en enzimas activas. La activación se lleva a cabo en condiciones controladas; los
factores tales como tiempo, temperatura, fuerza iónica o concentración se controlan según lo definido en el proceso de cada
fabricante. Una vez que se ha completado la activación, esta etapa se detiene agregando acetona, alcohol isopropílico u otros
disolventes compatibles con enzimas. Después de separar la materia insoluble (cuando corresponda), la mezcla se combina
con disolvente para precipitar la pancreatina. El sobrenadante se separa y el residuo sólido se lava con disolvente. Finalmente,
la pancreatina se seca a la temperatura y vacío adecuados. La actividad biológica puede ajustarse y/o estabilizarse agregando
aditivos adecuados, tales como lactosa; sacarosa que contenga no más de 3,25% de almidón; pancreatina con bajo poder di-
gestivo; celulosa microcristalina; maltodextrina; o cloruro de sodio.
3. CONTROLDE CALIDAD
Cada lote de pancreatina se somete a un análisis de control de calidad apropiado. El análisis de control de calidad debe con-
siderar los requisitos de la monografía correspondiente, así como otros parámetros de calidad identificados. Dichas pruebas
deben incluir apariencia, identificación, pureza y actividad de la pancreatina. Se deben tener en cuenta las impurezas relacio-
nadas con el proceso y con el producto tales como los disolventes residuales de la extracción y precipitación, y la grasa.
El agua es crítica para la actividad y la estabilidad enzimática, por ende, se debe especificar y monitorear el contenido de
agua usando métodos analíticos apropiados como pérdida por secado (ver el capítulo (731) Pérdidapor Secado).Las valoracio-
nes que determinan la actividad enzimática se aplican para confirmar que la pancreatina cumple con los límites predefinidos
para los niveles de actividad de lipasa, amilasa y proteasas, que se consideran atributos críticos de calidad.
Debido al origen biológico de la pancreatina, el control de calidad incluye análisis microbiano así como pruebas para deter-
minar la ausencia de algunos agentes adventicios patógenos para humanos.
Glándulas pancreáticas de origen porcino
Glándulaspancreáticascongeladas(materia prima)
Molienda del material congelado
Activación de la enzima
con una proteasaapropiada (si aplica)
Detención de la activación con disolventesapropiados
Separaciónde la materia insoluble (si aplica) Residuo insoluble

(desechado)
Precipitaciónde pancreatinacon disolvente, p.ej.,

alcohol isopropílíco,etanol, etc. (si aplica)
Eliminacióndel sobrenadante
Lavadoy separación
Secadodel residuo sólido

(enzimasprecipitadas)
Pancreatina Seca (ingrediente farmacéutico activo)
Figura 1. Diagrama de flujo que presenta las etapas del proceso de fabricación de pancreatina.
4. ETIQUETADO
El producto debe etiquetarse de conformidad con los requisitos de la monografía y reglamentarios pero también de acuerdo
con los requisitos de los clientes cuando corresponda. La etiqueta contiene información tal como el nombre y la dirección del
fabricante, la fecha de fabricación, la fecha de reanálisis, la fecha de caducidad, el número de lote, las condiciones de almace-
namiento y las precauciones específicas (p. ej., "proteger de la humedad"), y una declaración que indique el uso previsto.
5. CERTIFICACIÓN
Y DOCUMENTACIÓN
El producto debe estar acompañado por los certificados y la documentación necesarios, cuando corresponda. La documen-
tación debe incluir un certificado de análisis u otro certificado que documente el cumplimiento con los requisitos de la mono-
grafía y los resultados de las pruebas de control de calidad; un certificado de origen indicando la especie animal; y certificacio-
nes con respecto a agentes adventicios, incluyendo, cuando corresponda, declaraciones sobre Encefalopatía Espongiforme
Transmisible/Encefalopatía Espongiforme Bovina. Asimismo, se debe incluir, cuando corresponda, otra información pertinente
y requerida, tal como la fecha de reanálisis o caducidad, almacenamiento y recomendaciones de envasado.
Elfabricante/proveedor debe ser capaz de proveer documentación para propósitos reglamentarios que contengan la si-
guiente información:
4
• Información sobre el número de aprobación/autorización de la agencia reglamentaria y la dirección completa del sitio de
fabricación de la pancreatina.
• Una declaración que indique que las materias primas de origen animal destinadas para procesamiento farmacéutico fue-
ron recolectadas y entregadas bajo la supervisión de las autoridades responsables/competentes.
• Una lista de los países de origen de las materias primas recolectadas.
• Una declaración que indique que, durante el transporte, las glándulas pancreáticas pueden ser identificadas como subpro-
ductos animales para propósitos farmacéuticos mediante documentación apropiada de acuerdo con los reglamentos lega-
les correspondientes (tales como certificados de salud animal expedidos por veterinarios oficiales o documentación técni-
ca de comercio).
• Una declaración que indique que las glándulas pancreáticas se recolectan en mataderos aprobados y que los animales de
los que se recolectaron las glándulas pancreáticas fueron sometidos a una inspección en conformidad con la legislación
vigente correspondiente y que se les declaró adecuados para consumo humano, o que no se detectaron señales visibles
de enfermedades transmisibles a humanos o animales al momento de la matanza .
6. ANÁLISISY CONTROLDE AGENTESINFECCIOSOS

ADVENTICIOS
6.1 Información General
Aunque no se han presentado informes que documenten enfermedades infecciosas después del uso de productos medicina-
les derivados de pancreatina, existe un riesgo teórico de transmisión de patógenos porcinos a partir de la pancreatina.
La seguridad de los productos de enzimas pancreáticas de origen porcino debe mejorarse mediante la implementación de
múltiples estrategias complementarias y/o superpuestas para el control, depuración y contención de agentes adventicios. Los
fabricantes deben emplear continuamente un método basado en posibles riesgos para mejorar la seguridad de estos productos
con respecto a los agentes adventicios, el cual incluya incorporar evaluaciones de riesgos, mitigación de riesgos y estrategias
de manejo de los materiales del proceso. Cuando resulte apropiado, se debe incluir un análisis que garantice que los beneficios
terapéuticos del producto son considerablemente mayores que los riesgos generados por su consumo, y simultáneamente se
garantice la disponibilidad del medicamento para los pacientes.
6.2 Estrategias de Evaluación de Riesgos
La Guía para la Industria: "Medicamentos para Insuficiencia Pancreática Exócrina" (Guidance for lndustry: Exocrine Pancrea-
tic lnsufficiency Drug Products) de la FDApromueve un método basado en riesgos para tratar el potencial de contaminación
viral de los productos de enzimas pancreáticas, de acuerdo con la ICH Q5A(Rl) y el capítulo (1 050) Evaluaciónde la Seguridad
Viral de ProductosBiotecnológicosObtenidosde LíneasCelularesde Origen Humano o Animal. En general, el perfil de riesgos de
agentes adventicios de productos biológicos está supeditado a una variedad de factores, entre los que se incluye el origen del
producto biológico, el tipo de las materias primas usadas, los procesos de fabricación y la vía de administración. Debido a que
los procesos de obtención y de fabricación pueden variar entre fabricantes, cada fabricante debe establecer e implementar una
evaluación individual de riesgos completa para agentes adventicios.
Aunque el alcance de la ICH Q5A(R1) abarca la evaluación de la seguridad viral de productos biotecnológicos derivados de
líneas celulares de origen humano y animal, los principios y los métodos de evaluación de riesgos pueden proveer los funda-
mentos para una estrategia de evaluación de riesgos en los productos de pancreatina. A través de la aplicación de los princi-
pios de la ICH Q5A(Rl), la estrategia de minimización de riesgos para proteger a los pacientes de la exposición inadvertida a
agentes adventicios debe reflejar una combinación de tres componentes:
1. Obtención: Uso de procedimientos de obtención cuidadosos para limitar el acceso de agentes adventicios al proceso de
fabricación. Debido a que el material de la pancreatina es un subproducto de la industria de la carne, es importante ase-
gurar que el ingrediente farmacéutico activo de pancreatina se produce únicamente a partir de animales adecuados para
consumo humano.
2. Depuración: Incorporación de etapas robustas de depuración en el proceso de fabricación. La eficacia de estas estrategias
depende de la resistencia de los agentes adventicios al tipo de inactivación física y química usado.
3. Análisis: El control y análisis de agentes adventicios en etapas adecuadas del proceso de fabricación para dar garantía de
que cualquier carga remanente de un agente adventicio potencialmente nocivo se encuentra en niveles suficientemente
bajos. Esto se logra usando ensayos de detección adecuados contra un panel de virus relevantes. En esta parte de la eva-
luación de riesgos, se debe tener en cuenta el riesgo potencial para la salud humana que presentan los virus de origen
porcino.
Para identificar agentes adventicios potenciales que pudieran estar presentes en una preparación de pancreatina, los fabri-
cantes deben identificar los agentes adventicios que están presentes en el cerdo y evaluar la probabilidad de su presencia en
los materiales de partida y en el ingrediente farmacéutico activo. Los capítulos (61) ExamenMicrobiológicode ProductosNo Esté-
riles: Pruebasde RecuentoMicrobianoy (62) ExamenMicrobiológicode ProductosNo Estériles:Pruebasde MicroorganismosEspecífi-
costratan el análisis de contaminación específica microbiana, según se define en las monografías pertinentes de productos re-
lacionados con pancreatina. Asimismo, los fabricantes deben evaluar específicamente la presencia potencial de virus porcinos.
En esta evaluación se deben identificar las etapas de fabricación que son capaces de eliminar o inactivar virus, y se debe de-
mostrar la eficiencia del proceso para eliminar y/o inactivar virus mediante estudios de validación viral que sigan las guías co-
rrespondientes. Una vez que se ha establecido la lista de virus críticos potencialmente presentes en el material de partida y/o
en el ingrediente farmacéutico activo, los fabricantes deberán decidir cuáles serán las etapas apropiadas del proceso para reali-
zar el análisis viral y establecer el nivel de análisis viral que se va a realizar para cada lote. Se deben desarrollar y validar pruebas
para virus específicos, y se deben establecer y usar criterios de aceptación para tomar decisiones de aceptación/rechazo de
partidas del ingrediente farmacéutico activo de pancreatina.
El potencial carácter zoonótico o no zoonótico del virus debe tenerse en cuenta al establecer criterios de aceptación.
6.3 Pruebasde Identificaciónpara Panel de Virus Relevantes
La estrategia de evaluación de riesgos descrita anteriormente requiere la identificación de contaminantes virales potenciales
de los materiales de partida de origen porcino. La Tabla 1 provee una descripción general de los virus envueltos y sin envoltura
que se conoce están presentes en cerdos y que pueden presentar un riesgo de contaminación al usar cerdos que se consideran
adecuados para consumo humano como fuente de materia prima. La evaluación de riesgos debe tratar al menos los virus lista-
dos; sin embargo, dependiendo del origen de los animales y de la capacidad del proceso de fabricación, la lista puede adaptar-
se y se pueden considerar virus adicionales (ver el ejemplo en la Figura2). Los fabricantes deben implementar sistemas para
identificar la emergencia de nuevos virus potencialmente relevantes.
Tabla 1. Identificación de Pellgros: Virus Presentes en Cerdos
Virus con Envoltura Virus sin Envoltura
Virus de la fiebre porcina clásica Virus de la encefalomiocarditis (EMC\f, por sus siglas en inglés )
Virus de la fiebre porcina africana (ASFV, por sus siqlas en inglés) Virus de la enfermedad vesicular porcina (SVDV, por sus siqlas en inqlés)
Virus de la influenza Virus de la fiebre aftosa (FMDV, por sus siglas en inglés)
Virus del Nilo Occidental (WNY, por sus siqlas en inqlés) Reovirus (REO, por sus siqlas en inqlés)
Virus de estomatitis vesicular 0fSV, por sus siglas en inalés) Virus de la hepatitis E porcina (swHEV, por sus siglas en inglés)
Virus de la encefalitis equina del este (EEEV,por sus sialas en inqlés) Rotavirus porcinos (pRota\f, por sus siglas en inalés)
Virus de la rabia (RABV, por sus siglas en inglés) Enterovirus porcino (PEYs, por sus siglas en inglés)
Virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS\f,por sus sig-
las en inglés) Parvovirus porcino (PP\f, por sus siglas en inglés)
Virus de la gastroenteritis transmisible (íGEV, por sus siglas en inglés) Circovirus porcino tipos 1 y 2 (PCVl /2, por sus siglas en inglés)
Virus de la pseudo rabia (SuHY-1, por sus siglas en inglés)
Virus Nipah
Retrovirus endógeno porcino (PERY,por sus siglas en inglés)
6.4 DepuraciónViral por Etapasdel Procesode Fabricación
Demostrar la depuración viral es un componente crítico para asegurar la seguridad general de los productos derivados de
pancreatina. El objetivo de los estudios de evaluación de depuración viral no es únicamente evaluar la capacidad del proceso
de fabricación para depurar contaminantes virales conocidos y estimar cuantitativamente el nivel general de reducción de virus
por parte del proceso de fabricación, sino también estimar la capacidad de las etapas del proceso de fabricación para depurar
virus en general. Los estudios de depuración viral para el proceso de fabricación de pancreatina deben llevarse a cabo de
acuerdo con la guía correspondiente vigente, ICH QSA(Rl).
Los procesos actuales de producción de pancreatina se consideran efectivos para inactivar virus con envoltura, de acuerdo a
los resultados de los estudios de depuración viral. Sin embargo, los virus sin envoltura son más resistentes a la inactivación
físico-química, lo que genera una mayor variabilidad en su inactivación. Los ejemplos de virus que se encuentran en la clasifica-
ción de alta resistencia viral al tratamiento y que presentan inactivación moderada a limitada, incluyen el parvovirus porcino y
el circovirus porcino 1/2 (ver la Figura2).
7330 (1025) Pancreatina/ Información General USP42
~
Evol=<>on do no,go,
Probab1hdadde
Virusp;;entes
teJ1dos porcinos
1nactivación
lis1coquímiG1
Virus con
envoltura
Ver !CHQSA(Rl)
para la descripcíón de los niveles de resistencia
Figura 2. Ejemplo de un método de evaluación de riesgos para la identificación de virus para el panel de prueba.
6.5 Análisis Viral

Se requiere una estrategia de análisis cuando no ha sido demostrada la capacidad del proceso para eliminar o inactivar un
virus específico a niveles apropiados. El potencial carácter zoonótico o no zoonótico del virus debe tenerse en cuenta al esta-
blecer criterios de aceptación, en términos de la sensibilidad del ensayo y del establecimiento de límites de especificación. Se
deberán rechazar las partidas de ingrediente farmacéutico activo que den positivo en las pruebas de virus zoonóticos. Como
parte del control de calidad, el análisis viral debe realizarse en cada lote de ingrediente farmacéutico activo. Las pruebas usadas
deben permitir la exclusión de cualquier carga de niveles potencialmente nocivos de agentes adventicios. El Título 9 del Códi-
go de Reglamentos Federales describe los requisitos que se deben cumplir en la valoración de productos biológicos porcinos
incluyendo vacunas de virus vivos y productos de anticuerpos, aunque no trata específicamente la pancreatina. La aplicación
de los principios del Título 9 del Código de Reglamentos Federales, ensayos para detectar virus porcinos, pueden, por ejemplo,
basarse en el monitoreo de cultivo celular con respecto a efectos citopatógenos durante un tiempo de incubación apropiado,
análisis de hemoadsorción, técnicas de tinción para virus específicos u otras combinaciones de los mismos (ver también el capí-
tulo (1237) Métodosde PruebasVirológicas). Además de las tecnologías y virus tratados en el Título 9 del Código de Reglamen-
tos Federales, se pueden usar nuevas tecnologías basadas en biología molecular, y además otros virus con potencial zoonótico
que sean identificados pueden requerir de análisis. Los ejemplos de virus específicos no tratados por la guía vigente para el
análisis de virus puede incluir el virus de la hepatitis E porcina.
Elfabricante debe justificar la elección del panel de virus relevantes, la selección de la etapa del proceso apropiada, la apti-
tud del método de prueba y la sensibilidad del método de prueba. Todas las pruebas para virus específicos deben desarrollarse
y validarse de acuerdo con las guías vigentes, por ejemplo, los capítulos (1225) Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos y
(1033) Validaciónde Valoraciones Biológicas,según corresponda, y se deben establecer y usar criterios de aceptación para tomar
decisiones de aceptación o rechazo de partidas del ingrediente farmacéutico activo de pancreatina.
7. CARACTERIZACIÓN
DE LA PANCREATINA
7.1 Descripción de las Propiedades Físico-Químicas
La pancreatina es un polvo amorfo de color ligeramente marrón a bronceado con un olor y sabor a carne cruda. La pancrea-
tina es parcialmente soluble en agua, forma una solución ligeramente turbia y es insoluble en alcohol y éter. Los siguientes
compuestos pueden degradar la pancreatina: ácidos minerales, hidróxidos álcali, agentes de oxidación y muchas sales metáli-
cas; adicionalmente la degradación de la pancreatina es favorecida por temperatura y humedad elevadas. Las soluciones que
contienen pancreatina deben ser filtradas con precaución, debido a la potencial retención de la lipasa y las proteasas en el
filtro. La actividad enzimática alcanza un máximo en soluciones neutras a débilmente alcalinas. La actividad disminuye rápida-
mente en soluciones ácidas o alcalinas fuertes. Lo mismo se aplica al calentamiento a ebullición de las soluciones acuosas que
contienen pancreatina. En formulaciones sin recubrimiento entérico, no se recomienda exponer el producto a un pH de 4,5 o
menos, debido a que se ha observado la pérdida casi total de actividad lipolítica.
Debido a que la pancreatina es de origen biológico, se encuentran presentes otros componentes además de las proteínas
enzimáticamente activas. Estos otros componentes incluyen proteínas, aminoácidos, péptidos, ácidos nucleicos y fragmentos
de los mismos, componentes de tejidos, grasa y sustancias inorgánicas. Estos componentes pueden tener un impacto sobre la
calidad del material final.
USP 42 InformaciónGeneral/ (1025) Pancreatina 7331
7.2 Contenido Proteico y Enzimático

La pancreatina contiene diferentes enzimas digestivas que en su mayoría son producidas y almacenadas como zimógenos
(precursores inactivos) en las células pancreáticas acinares. En condiciones fisiológicas, los zimógenos pancreáticos se transfor-
man en enzimas activas una vez que la secreción pancreática alcanza el intestino delgado superior. Una proteasa intestinal, la
enteroquinasa, desencadena el proceso de activación mediante la escisión del zimógeno de tripsina, el cual seguidamente acti-
va a las otras proteasas. Durante el proceso de producción, las enzimas presentes en la pancreatina son activadas por la tripsina
(ver la Figura 7).
La Tabla 2 resume algunas de las características importantes de las enzimas pancreáticas principales encontradas en la pan-
creatina.
Tabla 2. Características de las Enzimas Conocidas Presentes en la Pancreatlna Porcina
UnlProtKB/
Swlss-Prot Producidos Peso Longitud de
Número Aumento de como un Molecular la Punto
Nombre E.e. Número Sustratos Precunor (kDa) Secuencia lsoeléctrlco
23,8 (zimóge- 231 a.a. (zimó-
no), 23,5 (acti- geno), 223 a.a. 9,3 (zimógeno),
Tripsina 3.4.21.4 P00761.1 Proteínas Sí vado) (activado) 10,5 (activado)
29, 1 (zimóge- 268 a.a. (zimó-
no), 25,6 (acti- geno), 221 a.a.
Quimotripsina 3.4.21.1 G1ARD6 PIG Proteínas Sí vado) (activado) 8,7
250 a.a. (zimó-
geno), 240 a.a.
Elastasa 3.4.21.36 P00772.1 Proteínas Sí 25,9 {activado) (activado) 8,5
Carboxipeptida- 308 a.a.
sa Al 3.4.17.1 P09954 Proteínas Sí 34,7 (activado) (activado) Desconocido
Carboxipeptida- 305 a.a.
sa B 3.4.17.2 P09955.5 Proteínas Sí 34,7 (activado) (activado) 6,0
246 a.a. (zimó-
Calicreína, glan- geno), 239 a.a.
dular 3.4.21.35 P00752.4 Proteínas Sí 25-28 kDa (activado) 4,2-4,3
50, 1 (dos isofor-
mas de glicosi-
Triacilglicerol Triglicéridos, !ación, 450 a.a. 4,9 (lipasa A),
lipasa 3.1.1.3 P00591.2 diqlicéridos No lipasas A y B) (madura) 5,0 (lipasa B)
Sin actividad en- 1O,3 (procolipa-
zimática, cofac- sa A porcina), 93 a.a. (procoli-
tor de lipasa 1O,1 (procolipasa A), 95 a.a.
Colipasa P02703.3 pancreática Sí pasa B porcina) (procolipasa B) Desconocido
14,7 (zimóge- 146 a.a. (zimó-
no), 14 (activa- geno), 123 a.a.
Fosfolipasa A2 3.1.1.4 P00592 Fosfolípidos Sí do) (activado) 4,4-4,5
Colesterol
esterasa, Valores carentes
también deno- de uniformidad
minada éster Ésteres de coles- en la literatura
carboxílico terol, ésteres de que van de 65
lipasa (ECL),és- vitamina, mo- a 98 kDa.
ter carboxílico noglicéridos, Aunque se han
hidrolasa (ECH) Secuencia com- fosfolípidos, ga- identificado Composición
o lipasa estimu- pleta de ami- lactolípidos, formas proteo- completa de
lada por noácido algo de activi- líticas,aún aminoácido
sales biliares aún desconocí- dad en triglicé- se desconoce el aún desconocí-
(LESB) 3.1.1.13, 3.1.1.1 da en cerdos ridos No peso exacto. da en cerdos 4,2-4,8
5,95 (amilasa 1),
496 a.a. 5,45 (amilasa
a-Amilasa 3.2.1.1 P00690.3 Polisacáridos No 55,3 (maduro) 11)
7.2.1 PROTEASAS
PANCREÁTICAS
Las proteasas son enzimas que digieren proteínas en fragmentos de péptidos más pequeños y aminoácidos mediante la hi-
drólisis de los enlaces peptídicos. La pancreatina contiene cinco proteasas principales: tripsina, elastasa, quimotripsina, carboxi-
peptidasa A1 y carboxipeptidasa B. La tri psina, la quimotripsina y la elastasa se clasifican como endopeptidasas y serina protea-
sas debido a que escinden los enlaces peptídicos en el lado e-terminal de un amino ácido y tienen en sus sitios activos un
residuo de serina catalíticamente importante. Las carboxipeptidasas catalizan la hidrólisis de los aminoácidos de la posición del
extremo e-terminal en polipéptidos y, por lo tanto, se clasifican como exopeptidasas. Las carboxipeptidasas liberan secuencial-
mente residuos del e-terminal de proteínas y péptidos con una especificidad bien definida.
La tripsina actúa específicamente en el lado e-terminal de los residuos de aminoácidos con carga positiva, específicamente
lisina y arginina. El tripsinógeno es secretado por el páncreas como un precursor inactivo y se descarga dentro del duodeno
donde la enteroquinasa convierte el tripsinógeno en tripsina activa. La enteroquinasa es secretada en el duodeno por células
de la mucosa duodenal. La enteroquinasa elimina un octapéptido terminal del tripsinógeno y genera una cadena de polipépti-
do de tripsina activa entrecruzada por seis puentes disulfuro. La tripsina contiene un sitio de unión de calcio de alta afinidad
requerido para la estabilidad de la enzima.
La quimotripsina actúa preferentemente en el lado e-terminal de los residuos de tirosina, fenilalanina y triptófano. Se secreta
como un zimógeno inactivo, quimotripsinógeno, que es sometido a procesamiento proteólico por la tripsina para formar la
enzima activa. La quimotripsina une un ión de calcio por molécula.
La elastasa actúa sobre residuos pequeños de aminoácidos neutros tales como glicina y alanina, aunque también hidroliza
amidas y ésteres y se distingue porque actúa sobre la elastina. La elastasa es producida como un zimógeno y la forma activada
contiene cuatro puentes disulfuro. La elastasa une un ión de calcio por molécula.
La carboxipeptidasa A1 es una exopeptidasa que hidroliza el enlace peptídico adyacente al extremo C-terminal de una cade-
na de polipéptido, liberando así el aminoácido e-terminal. Escinde residuos aromáticos y voluminosos de aminoácido alifático
y presenta una actividad baja o nula con residuos de aminoácido de ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, lisina y prolina.
Contiene un ión de cinc por molécula. El ión de cinc es esencial para la actividad; si se elimina durante la diálisis, debe ser
reemplazado. Por lo tanto, la carboxipeptidasa A1 también se clasifica como una metaloproteasa.
La carboxipeptidasa B cataliza la hidrólisis de los aminoácidos básicos lisina, arginina y ornitina del extremo e-terminal de
una cadena polipeptídica. También puede tener una función en la degradación adicional de productos de digestión tríptica. La
enzima une un ión de cinc por molécula, que es una parte funcional necesaria para la actividad de la enzima, y, por lo tanto, la
carboxipeptidasa B también se clasifica como una metaloproteasa.
7.2.2 LIPASAY COLIPASAPANCREÁTICA
La lipasa pancreática (LP,también conocida como triacilglicerol acil hidrolasa) es una glicoproteína y es producida directa-
mente como una enzima activa por el páncreas. Dos isoformas de glicosilación de la LP,la lipasa A y la lipasa B, están presentes
en la pancreatina. Estas dos isoformas tienen composiciones idénticas de aminoácidos pero difieren ligeramente en sus patro-
nes de glicosilación, con lipasa A siendo más ácida que la lipasa B. La LP es una enzima soluble en agua que actúa sobre los
sustratos lípidos insolubles, triglicéridos, en la interfase de lípido-agua. Su actividad depende de la superficie específica del sus-
trato accesible a la enzima, y se incrementa con el estado de emulsificación de los lípidos. La LP hidroliza preferencialmente
enlaces éster en las posiciones C-1 y C-3 de triglicéridos y presenta un espectro amplio de especificidad de longitud de cadena
de ácido graso. Por lo tanto, la LP se muestra activa contra una amplia variedad de los triglicéridos que por lo general están
presentes en la dieta. Asimismo, actúa sobre los diglicéridos, pero su actividad sobre los monoglicéridos es muy baja. Principal-
mente convierte los triglicéridos en monoglicéridos y ácidos grasos libres; los productos de lipólisis de mayor polaridad se ab-
sorben en el intestino delgado. En presencia de diversos amfífilos tales como sales biliares a concentraciones micelares, la ab-
sorción de la LP en la interfase de lípido-agua puede verse obstruida, lo que reduce la actividad lipolítica.
Un pequeño cofactor proteico también producido por el páncreas, la colipasa, ayuda a la LP a anclarse a interfases ante la
presencia de amfífilos competitivos, restaurando así la actividad de la LP.La colipasa también es producida por el páncreas co-
mo un precursor, la procolipasa. La procolipasa es activada por la tripsina.
7.2.3 FOSFOLIPASA
PANCREÁTICA
A2
La fosfolipasa A2 (también conocida como PLA2secretora tipo 1B)es una enzima termoestable soluble en agua que cataliza
la hidrólisis dependiente de calcio de los grupos 2-acilo en 3-sn-fosfoglicéridos. Se produce como un precursor, que es activa-
do por la tripsina.
7.2.4 AMILASAPANCREÁTICA
La a-amilasa pancreática porcina (glucanohidrolasa 1,4-a-D-glucano) cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos 1,4-a-D
internos en polisacáridos que contienen tres o más unidades de o-glucosa con enlace a-1,4 para generar una mezcla de dextri-
nas, maltosa y glucosa. La amilasa existe en dos formas (1y 11)que tienen propiedades enzimáticas similares pero que difieren
en sus puntos isoeléctricos. Ambas formas moleculares de amilasa son glicoproteínas que contienen fucosa, galactosa, manosa
y diversos contenidos de glucosamina. Ambas amilasas constan de una sola cadena polipeptídica con cuatro puentes disulfuro
y contienen un ión de calcio fuertemente enlazado.
8. MEDICIONES
DE LA ACTIVIDADENZIMÁTICA
Aunque la pancreatina contiene una variedad de enzimas, por lo regular se caracteriza midiendo las actividades de las tres
clases de enzimas principales, lipasa, proteasa y amilasa.
8.1 Actividad de Lipasa
La actividad de lipasa de la pancreatina sobre los triglicéridos con ácidos grasos de cadena larga se debe principalmente a la
LP,lo que requiere la presencia de su cofactor específico, la colipasa, para actuar sobre emulsiones de triglicéridos en presencia
de sales biliares que son competidoras para la adsorción de lipasa en la superficie de las gotitas de lípidos. La colipasa y la
lipasa forman un complejo activo con una estequiometría 1 a 1. Las preparaciones comerciales de pancreatina por lo regular
contienen colipasa; sin embargo, se recomienda verificar que el proceso de fabricación del ingrediente farmacéutico activo
provee suficiente colipasa para la actividad de lipasa. Este control debe ser parte de una caracterización apropiada que se debe
realizar durante la validación del proceso del ingrediente farmacéutico activo.
Además de la LP,la pancreatina también contiene carboxil éster lipasa (CEL)pancreática, que hidroliza diversos sustratos lipí-
dicos. La actividad de la CELsobre los triglicéridos se considera generalmente muy baja, en comparación con la de la LP,y su
contribución con la actividad de la lipasa de la pancreatina es inapreciable, según se mide usando la valoración de actividad de
lipasa USP.
La valoración de actividad de lipasa descrita en la monografía USP de Pancreatinase basa en la determinación de la veloci-
dad con que la enzima digiere al aceite de oliva emulsificado con acacia (también conocida como goma arábiga)'. La actividad
de la muestra de prueba se calcula comparándola con una preparación estándar de la enzima con actividad conocida. El aceite
de oliva contiene triglicéridos con ácidos grasos de cadena larga que son representativos de los triglicéridos dietéticos. La acti-
vidad de lipasa se mide basándose en la valoración volumétrica de los ácidos grasos libres liberados del aceite de oliva por la
lipólisis producida por la lipasa presente en la pancreatina. Esta valoración volumétrica usando hidróxido de sodio se realiza a
un pH constante de 9,0 mediante valoración volumétrica de pH o potencioestática, en la que los ácidos grasos de cadena larga
se ionizan completamente. Vale la pena notar que este valor de pH no corresponde a las condiciones fisiológicas (el pH medio
del contenido del intestino delgado es cercano a 6,0 durante una comida), pero permite medir la actividad óptima de lipasa in
vitro.Debido a que la solución de la valoración de lipasa USP contiene ERSales Biliares USP,la detección de la actividad enzi-
mática requiere que tanto la lipasa como la colipasa estén presentes en la pancreatina. Una Unidad USP de lipasa se define
como la cantidad de enzima que, en las condiciones definidas con el sustrato definido, libera 1 µmol de ácido graso por minu-
to.
Se encuentran disponibles otras valoraciones de lipasa para monitorear la actividad de lipasa en la pancreatina. Al usar valo-
raciones de lipasa con sustratos no naturales, tales como tributirina, se recomienda confirmar que la muestra de pancreatina
analizada también sea activa sobre los triglicéridos de cadena larga, en particular usando la valoración de actividad de lipasa
USP con emulsión de aceite de oliva-acacia.
8.2 Actividad de Proteasa

La actividad proteolítica de la pancreatina sobre los polipéptidos y las proteínas es inherente a las enzimas tripsina, quimo-
tripsina, elastasa, carboxipeptidasa A1 y carboxipeptidasa B. Las dos proteasas pancreáticas principales son la tripsina y la qui-
motripsina, y junto con la elastasa, estas endopeptidasas generan pequeños polipéptidos a partir de proteínas más grandes. La
acción adicional de las exopeptidasas carboxipeptidasa A1 y B genera aminoácidos individuales durante la digestión.
La valoración espectrofotométrica USP para la actividad de proteasa a partir de pancreatina se basa en la velocidad de diges-
tión de caseína en las condiciones de la prueba. La actividad de la muestra de prueba se calcula comparándola con una prepa-
ración estándar de la enzima con actividad conocida. La caseína está compuesta por a (sl) y a (s2)-caseínas, p -caseína y K-
caseína, las cuales se fosforilan en los residuos de serina y carecen de puentes disulfuro. La conformaciónde la caseína es similar
a la de las proteínas globulares desnaturalizadas con poca o sin estructura terciaria .. Se recomienda a los usuarios evaluar a los
proveedores de sustrato de caseína con respecto a la consistencia de la dispersión.
La hidrólisis de caseína por parte de las proteasas pancreáticas genera aminoácidos individuales y péptidos pequeños, y su
liberación puede cuantificarse midiendo su absorción a 280 nm. Antes de esta medición, se deben separar las proteínas no
hidrolizadas y los péptidos grandes mediante una precipitación selectiva con ácido tricloroacético, seguida de filtración. Poste-
riormente, el filtrado se usa para la valoración espectrofotométrica de la actividad de proteasa, usando tirosina como calibra-
dor. Una Unidad USP de actividad de proteasa está contenida en la cantidad de pancreatina que hidroliza la caseína a una
velocidad inicial de modo que la cantidad de péptidos liberados por minuto y que no sean precipitados por el ácido tricloroa-
cético provea la misma absorbancia a 280 nm que 15 nmol de tirosina.
Se encuentran disponibles otras valoraciones para monitorear la actividad de proteasas individuales y totales en pancreatina,
y las asignaciones de unidades son específicas para cada sustrato. El éster etílico de N-acetil-L-tirosina se usa comúnmente en
las valoraciones volumétricas y espectrofotométricas ()..= 237 nm) de actividad de quimotripsina. De manera similar, el éster
etílico de N-benzoil-L-arginina se usa comúnmente en las valoraciones volumétricas y espectrofotométricas (l..=253 nm) de la
actividad de tripsina. En ambos casos, la valoración volumétrica se basa en la hidrólisis de enlaces éster por proteasas y la libe-
ración de grupos ácidos, mientras que la valoración espectrofotométrica se basa en las propiedades cromogénicas de estos áci-
dos. El éster metílico de tolueno-sulfonil-L-arginina es otro sustrato cromogénico (), = 247 nm) que se usa para medir la activi-
dad de tripsina. Sin embargo, estos sustratos no son proteínas y las valoraciones implican la escisión de un enlace de éster
carboxílico en lugar de un enlace peptídico.
Se han desarrollado otras valoraciones que usan péptidos cromogénicos como sustratos para mejorar la especificidad y la
sensibilidad. Asimismo, se han desarrollado valoraciones de proteasa más específicas y sensibles usando sustratos de péptidos
sintéticos cortos (de 3-5 residuos de aminoácidos) con un grupo cromogénico (4-nitroanilina) acoplado al extremo e-terminal
mediante un enlace amida. El grupo cromogénico es eliminado específicamente por proteasas y se mide fotométricamente. El
cambio en la absorbancia a 405 nm es directamente proporcional a la actividad de proteasa. Los sustratos específicos están
disponibles comercialmente para tripsina (acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida) y quimotripsina (clorhi-
drato de metil-O-succinoil-arginil-prolil-tirosina-4-nitril-anilida). La caseína marcada con isotiocianato de fluoresceína también
se usa como sustrato general para proteasa. La valoración se basa en que la fluorescencia de la fluoresceína es disminuida
cuando está unida a la caseína. Cuando las proteasas digieren a la caseína marcada con isotiocianato de fluoresceína en pépti-
dos más pequeños, la fluorescencia a 530 nm (excitación a 485 nm) se incrementa y se puede medir para determinar la activi-
dad de proteasa.
8.3 Actividad de Amilasa
La actividad glicolítica de la pancreatina se debe a las amilasas tipo u. Dichas enzimas catalizan la hidrólisis de los enlaces
internos u-1,4-glucano en polisacáridos que contienen tres o más unidades de o-glucosa con enlace u-1,4, lo que genera una
mezcla de maltosa y glucosa. Las dos isoformas principales (1y 11)de amilasas porcinas tienen propiedades enzimáticas idénti-
cas. En las últimas décadas, se han desarrollado varios métodos para valorar la actividad de amilasa; muchos de estos se basan
en la detección de la hidrólisis de almidón, puesto que este polímero es el sustrato natural de amilasa. El almidón consta de
dos tipos de moléculas, amilosa (por lo general 20%-30%) y amilopectina (por lo general 70%-80%). Ambos polímeros resul-
tan del ensamble de unidades de glucosa conectadas mediante enlaces de u-1,4-glucano; además, en la amilopectina, 1 de
cada 20 residuos aproximadamente, también tiene un enlace u-(1 ➔ 6), lo que forma puntos de ramificación.
La valoración de actividad de amilasa USP en la monografía de Pancreatinase basa en la velocidad de digestión del almidón
por la enzima, y la actividad de la muestra de prueba se calcula comparándola con una preparación estándar de enzima con
actividad conocida. El almidón es hidrolizado por la amilasa; los grupos reductores resultantes de la hidrólisis reaccionan con
yodo en solución alcalina; y el yodo en exceso se valora con tiosulfato. Una Unidad USP de actividad de amilasa se define co-
mo la cantidad de pancreatina que descompone el almidón a una velocidad inicial tal que se hidrolizan O,16 µEq de enlace
glicosídico por minuto en las condiciones de la valoración.
APÉNDICE1: BIBLIOGRAFÍA
REGLAMENTARIA
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USP42 Información General/ (1027) Citometría de Flujo 7335
APÉNDICE2: BIBLIOGRAFÍA
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(1027) CITOMETRÍADE FLUJO
INTRODUCCIÓN
La citometría de flujo es un método analítico que desempeña un papel crítico en la evaluación cuantitativa y cualitativa de
poblaciones de células en muestras de pacientes y de productos celulares. La capacidad de la citometría de flujo se basa en su
aptitud para analizar de manera rápida y confiable múltiples atributos de células individuales dentro de poblaciones de células
heterogéneas. A pesar del valor de los datos obtenidos mediante citometría de flujo, validar el método presenta desafíos-qui-
zás más que para otros métodos analíticos-debido a los errores y artefactos derivados de múltiples fuentes.
Aunque los métodos de la citometría de flujo también se pueden usar para clasificar y aislar células como parte del proceso
de fabricación para productos biológicos derivados de células y tejidos, el alcance de este capítulo se limita al uso de la citome-
tría de flujo como método analítico. Este capítulo presenta los aspectos técnicos del método, incluyendo el instrumental, el
manejo y la tinción de muestras y el análisis de datos. Las fuentes de error se consideran en el contexto de las características
técnicas, y en consideraciones de control de calidad, garantía de calidad y normalización. Por último, se presentan las aplica-
ciones actuales y principios de resolución de problemas del ensayo. Para información adicional sobre los fundamentos y aspec-
tos prácticos de la citometría de flujo, ver la edición vigente de Practica/FlowCytometry(Citometría de Flujo Práctica) (Shapiro,
2003).
La citometría de flujo se usa ampliamente en la caracterización de productos derivados de células y tejidos, aunque la mayo-
ría de los métodos de ensayo aún no han sido normalizados. Además de los aspectos relacionados con la complejidad técnica,
se presentan desafíos para la normalización de los métodos de citometría de flujo para clases o tipos específicos de productos
en relación con la naturaleza heterogénea de los mismos, incluso para aquellos con procesos de fabricación y usos clínicos si-
milares. Es posible que las innovaciones vigentes y futuras relacionadas con los instrumentos, los reactivos analíticos, los algo-
ritmos analíticos y la automatización, mejoren las capacidades de la tecnología, pero es poco probable que eliminen los desa-
fíos (p. ej., valoración biológica, pruebas de identificación y otras aplicaciones).
PRINCIPIOSDE OPERACIÓN,MÉTODOS,CALIDADY NORMALIZACIÓN

El proceso de citometría de flujo requiere que las células pasen por una fuente de luz fija que consiste en uno o más láseres,
de manera que cada célula, individualmente, se pueda observar o se puedan analizar sus características tales como tamaño,
7336 (1027) Citometría de Flujo / InformaciónGeneral USP42
granularidad y presencia de antígenos o moléculas intracelulares o en la superficie de la membrana. Las células se suspenden
en un líquido en el que el movimiento se controla mediante el tamaño y la configuración de las conexiones de tubos, cámaras
y bombas específicas del instrumento de citometría de flujo. El patrón de las señales de luz producido a partir de la interacción
de la luz láser con las células se captura mediante un sistema de detección, también específico del instrumento, y las señales
detectadas se transforman en datos que se pueden analizar y combinar con datos de otras células en una muestra dada. Los
datos de una suspensión de células se pueden expresar posteriormente en formatos visuales uni, bi o tridimensionales, o en
formatos numéricos, para caracterizar la muestra celular y sus subpoblaciones de manera cuantitativa y cualitativa.
Instrumental de Citometría de Flujo
A continuación se describen los citómetros de flujo, los cuales incorporan elementos para el procesamiento de señales ópti-
cas, electrónicas y de fluidos.
FLUIDOS
El sistema de fluidos mueve una mezcla a granel de células de manera que se forme una corriente de células individuales.
Dentro del citómetro de flujo, la suspensión de células individuales pasa a través de una región confinada en la que cada célula
es iluminada secuencialmente por una fuente de luz uniforme en el punto de observación (punto de análisis). La mayoría de
los instrumentos emplean una cámara de flujo (celda de flujo) la cual, después de que la muestra de células se introduce en la
punta de inyección de muestra, combina las células con fluido envolvente isotónico, usando un ensamble de boquilla cónica
diseñado geométricamente para producir un flujo laminar de fluido (Figura1). La boquilla de salida de líquido por lo general
tiene un orificio de 50-250 µm de diámetro, a través del cual sale el fluido a una alta velocidad de flujo. Las presiones diferen-
ciales entre la corriente de la muestra de células (presión más baja) y la corriente envolvente (presión más alta) trasladan las
células/partículas en una corriente confinada. La corriente coaxial resultante dentro de una corriente es altamente eficiente y la
corriente de la muestra en el punto de observación es, por lo general, ligeramente más grande que las células o partículas
contenidas en el interior. Un fabricante emplea, por lo menos, una metodología alternativa en la que la estrategia de corriente
coaxial se reemplaza mediante el uso de microcapilares para enfocar y dirigir las células. Posteriormente, se mide y analiza la
señal de luz desviada o emitida por la célula.
Puntade Inyección
de Muestra
Entradasde Fluido
Envolvente
Flujo Laminar
Puntode Observación
~ SalidadeFlujo
Figura 1. Diagrama esquemático de una celda de flujo.
ÓPTICA
Cuando las células se tiñen con colorantes fluorescentes o con reactivos con anticuerpos fluorescentes, la luz emitida por el
láser interacciona con el colorante fluorescente para producir una emisión estimulada que presenta ondas coherentes (parale-
las) de luz de longitud de onda, de fase y de polarización uniformes. Las señales de luz fluorescente generadas en la interac-
ción de la luz láser con las células se recolecta mediante un arreglo de detectores orientados en línea directa y a 90º con res-
pecto al rayo láser que ingresa. Los láseres para citómetros de flujo más comunes disponibles comercialmente (con longitudes
de onda correspondientes) son el láser de argón azul (488 nm), el láser de diodos rojos (635 nm) y el láser violeta (405 nm).
USP42 InformaciónGeneral/ (1027) Citometría de Flujo 7337
PROCESAMIENTODE SEÑALESELECTRÓNICAS
Y GENERACIÓNDE DATOS
Cuando una célula pasa a través del sistema óptico de un citómetro de flujo, los patrones de dispersión de luz o fluorescen-
cia de cualquier fluorocromo sobre la célula o dentro de la misma son detectados por varios tipos de fotodetectores o tubos
fotomultiplicadores (PMT, por sus siglas en inglés) que transforman la información sobre las características de la célula en una
lectura computarizada. Cada célula analizada genera un evento en cada parámetro (dispersión frontal, dispersión lateral, fluo-
rescencia) para el cual se mide. La Figura2 presenta un ejemplo de una configuración típica de un citómetro de flujo de dos
colores. Los diferentes tipos de células presentan conjuntos distintivos de señales en los diversos parámetros. Por ejemplo,
cuando la célula pasa a través de un haz de luz, a la luz deflectada en dirección frontal (por lo regular aproximadamente 20°
de la dirección frontal del láser) se denomina dispersión frontal y se recolecta usando un detector conocido como canal de
dispersión frontal (FSC, por sus siglas en inglés). La cantidad de deflexión en el FSC es proporcional al tamaño de la célula. La
luz deflectada a un ángulo de 90º se conoce como dispersión lateral y se recolecta mediante el canal de dispersión lateral (SSC,
por sus siglas en inglés). Este proporciona una medida de la complejidad estructural de la célula provocada por gránulos, rugo-
sidad de la membrana o núcleo, los cuales se asocian con un SSC más alto. La luz deflectada por otros PMT usando un filtro de
paso de banda específico se recolecta mediante canales de fluorescencia específicos (FL1 y FL2 en la Figura2). Los pulsos eléc-
tricos, que se originan de la luz detectada por los PMT, se procesan mediante una serie de amplificadores lineales y logarítmi-
cos. La amplificación logarítmica a menudo se usa para medir la fluorescencia de las células. Las Figuras3-7 presentan histo-
gramas para células teñidas con anticuerpos conjugados con fluorocromos específicos (ver la Tabla 1). Los anticuerpos son es-
pecíficos para algunos marcadores de grupos de diferenciación (CD, por sus siglas en inglés) analizados en lnmunofenotipifica-
ción(ver más adelante).
í FL1
PMT l
i--r
!:~TI
L_i
fl
Rayo Láser Detector
del FSC
Figura 2. Citómetro de flujo típico de 2 colores con detectores para FSC, SCC y fluorescencia.
Tabla 1. Fluorocromos Usados Comúnmente en Cltometría de FluJo

Excitación
Típica Pico de
Fluorocromo del Láser (nm) Emisión (nm)
Azul Cascada 375; 401 423
Azul Pacífico 403 455
Ficoeritrina-R (R-PE, por sus siglas en inglés) 480; 565 578
Conjugados PE-Cv5 480; 565; 650 670
Conjuqados PE-Cy7 480; 565; 743 767
Rojo 61 3 (Rojo Texas) 480; 565 613
Clorofil Peridina (PerCP, por sus siglas en inglés) 490 675
Fluoresceína (FITC) 495 519
Aloficocianina (APC) 650 660
Conjugados APC-Cy7 650; 755 767
7338 (1027) Citometría de Flujo / Información General USP42
La versatilidad de la citometría de flujo proviene de la capacidad de marcar con fluorescencia la superficie celular, el citoplas-
ma o el núcleo o productos de la célula. Los marcadores fluorescentes unidos a la célula se pueden excitar usando láseres para
emitir luz con longitudes de onda específicas y, posteriormente, esta luz se detecta y analiza de la manera descrita con anterio-
ridad. El tipo y la cantidad de fluorescencia detectada ofrece información cualitativa y cuantitativa sobre la célula.
Los fotodetectores convierten la luz en resultados analizables generando una pequeña corriente cuyo voltaje tiene una am-
plitud proporcional a la cantidad de luz. El voltaje se amplifica y convierte en señales eléctricas lo suficientemente grandes para
ser graficadas por la computadora de distintas maneras. De esta forma, el FSC, el SSC y los detectores fluorescentes recolectan
la luz y la convierten en señales eléctricas que pueden ser analizadas por la computadora. De esta manera, las señales deriva-
das de cada fotodetector se pueden medir por su intensidad (baja a alta) y clasificarse en canales. Los canales se disponen de
manera continua de tal forma que una población de células con muchas células grandes tendrán una gran cantidad de even-
tos en los canales más altos, y una con muchas células pequeñas tendrá una gran cantidad de evento en los canales más bajos.
ANÁLISISDE DATOS
Los datos generados por el citómetro de flujo pueden representarse de diversas maneras, de las cuales la más básica es el
histograma de un solo parámetro (Figura3), en el que los eventos con intensidades de luz similares (dispersión frontal, disper-
sión lateral o fluorescencia) se recolectan en canales y posteriormente se grafican. Esta gráfica demuestra el número de células
con características ópticas similares. La Figura4 es un ejemplo de gráficas que presentan dos parámetros de medición, una en
el eje x y una en el eje y, y el recuento de células como una gráfica de densidad (puntos) o mapa acotado. Los parámetros
podrían ser el SSC, el FSC o la fluorescencia. Estos parámetros se pueden recolectar en un canal.
Figura 3. Histograma de un solo parámetro que presenta la expresión del antígeno celular CD3 en una mezcla de células.
8,------
-------------------------------------,---
º'
º'
º'
00
o!
º'
N' 1,
O''------------------------r-"
o 200 400 600 800 1000
Altura del FSC
Figura 4. Gráfica de puntos de dos variables de células presentadas por el FSCy el SSC.
Una gráfica de puntos presenta un punto para cada célula, mientras que las gráficas de densidad y acotadas presentan un
mapa de calor o un mapa topográfico lineal, respectivamente, basándose en el número relativo de células en cada canal. El
histograma de dispersión frontal y dispersión lateral es el método más común para la identificación de diferentes tipos de célu-
las hematopoyéticas. La Figura5 presenta una gráfica acotada que es una representación tridimensional del número relativo de
células en los diversos canales.
"'"
o~------------------------~
,- i
o,.... C\I
o o
ü,....
CD5
Figura 5. Gráfica acotada de dos variables que presenta números relativos de células presentes en cada canal que coexpresa
2 marcadores CD.
Cuando las células se tiñen con anticuerpos para epitopes diferentes que portan dos fluorocromos diferentes, los datos se
presentan como una gráfica en la que los dos parámetros se grafican uno en función del otro. Se pueden establecer cursores
en cada eje para separar poblaciones positivas de poblaciones negativas para cada uno de los atributos. Esto resulta en una
representación gráfica de células que son positivas para ambos marcadores, negativas para ambos marcadores y positivas para
uno de los dos marcadores (Figura6).
PoblaciónPositiva PoblaciónPositiva
para 1 Marcador ~2 Marcadores
PoblaciónNe~tlva O O
00
000,,..
oox
PoblaciónPositiva
para 1 Marcador
Figura 6. Presentación esquemática de un histograma de 2 parámetros.

El citómetro de flujo permite al usuario establecer límites positivos y negativos para cada marcador. Los datos del citómetro
de flujo se recolectan en forma de lista, en la que cada señal electrónica de una célula respectiva se presenta en la secuencia en
la que se adquirió. Los archivos en modo de lista se pueden editar posteriormente para incluir o excluir algún evento. Una
ventaja básica de la citometría de flujo es la capacidad para separar los datos correspondientes a las células de interés del fon-
do y células muertas (p. ej., partículas o desechos no celulares) cuando se trata de dispersiones frontales y laterales y células de
otras poblaciones. El usuario debe decidir que señales son precisamente resultantes de la luz relacionada con las células, dise-
ñar ventanas electrónicas y ordenar a la computadora que considere positivos únicamente los eventos que caigan dentro de
dicha ventana. Las poblaciones celulares pueden variar ampliamente dependiendo de la fuente de tejido o de células y las ca-
racterísticas del citómetro de flujo usado. El uso de ventanas permite al usuario determinar las señales que se deben considerar
eventos reales, por lo que este proceso es de primordial importancia para normalizar los datos de la citometría de flujo (Figura
7).
1000
800
600
u
(/)
(/)
400
200
o
o 200 400 600 800 1000
FSC
S'
"'o
~N
ºº
o~
o
;2
10° 101 102 103 104
Lin
Figura 7. Generación de ventanas para una población celular con dispersión lateral baja y dispersión frontal alta, la cual es
diferente de otras poblaciones celulares en la muestra.
Se puede usar una técnica conocida como compensación para separar superposiciones espectrales de fluorocromos con lon-
gitudes de onda similares. Para citómetros de flujo análogos fabricados antes del final de la década de 1990, la compensación
debe establecerse antes de la adquisición de datos. En los instrumentos digitales modernos, la compensación se puede estable-
cer ya sea antes o después de la adquisición de datos. El ajuste de compensación puede ser más un arte que una ciencia, mien-
tras que una gran parte de la literatura se ha enfocado en los méritos relativos de diversos métodos para determinar la com-
pensación correcta para tipos celulares o condiciones experimentales. El analista debe contar con conocimientos considerables
acerca del tipo celular en análisis a fin de evitar errores en la fenotipificación que puedan resultar del ajuste inadecuado de
compensación.
El número de eventos contados debe ser adecuado para generar confianza estadística en los resultados. El instrumento se
puede ajustar de manera que la recolección de datos se lleve a cabo hasta que se haya medido cierto número de eventos en
un canal. Esta característica permite al operador variar la duración o el número de eventos de la muestra de modo tal que se
generen datos estadísticamente confiables. De esta manera, una muestra que mide un evento poco común analizará más célu-
las totales que una muestra que mide un evento común. El uso de archivos en forma de lista, los archivos de datos electrónicos
que representan a la mayoría de los datos no censurados, ofrece una ventaja debido a que estos archivos se pueden analizar
después de la adquisición de datos. Es necesario que los investigadores aseguren que todos los datos sin procesar, la documen-
tación, los protocolos, las muestras y los informes finales se archiven cuando concluye el estudio. Para asegurar la integridad y
calidad de los datos brutos recopilados, es necesario que los investigadores se apeguen a las Regulations for Good Laboratory
Practices (Reglamentaciones para Buenas Prácticas de Laboratorio o GLP) de la FDAde los EE.UU.,conforme a lo prescrito en el
Título 21 del CFRParte 58, Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies (Buenas Prácticas de Laboratorio para
Estudios de Laboratorio No Clínicos); y Parte 11, Electronic Records and Electronic Signatures (Registros y Firmas Electrónicos).
Citometría de Flujo: Elementos de un Procedimiento
Los métodos de citometría de flujo incluyen la manipulación, la preparación y la tinción de la muestra; configuración y ope-
ración del instrumento; recopilación, análisis y almacenamiento de datos; y medidas de control de calidad asociadas.
MANIPULACIÓN
Y TINCIÓN DE LASMUESTRAS
Recolección, Manipulación y Anticoagulación de las Muestras

Con el objetivo de generar conclusiones exactas sobre el producto farmacéutico derivado de células, el analista debe asegu-
rar que las muestras de productos celulares sean lo más representativas del producto completo. Las muestras de sangre, afére-
sis y productos de suspensión celular se deben mezclar bien antes del muestreo y se debe tener cuidado de obtener volúmenes
de muestra adecuados.
Las muestras celulares que contienen sangre/plasma humano deben someterse a un proceso de anticoagulación. La hepari-
na o los anticoagulantes basados en citrato (p. ej., Solución Anticoagulante A de Citrato Dextrosa) se recomiendan más que el
EDTA,ya que conservan de manera óptima las muestras que se deben manterner por más de unas pocas horas. En lo que
respecta a muestras que deben mantenerse por plazos más largos, pueden ser necesarios medios específicos de transporte/
almacenamiento, y se deben realizar estudios de validación para asegurar que dichas muestras sean equivalentes a las muestras
preparadas en el momento de ser analizadas por citometría de flujo.
Las muestras destinadas a lisis de sangre entera y tinción de antígenos de superficie se deben transportar y almacenar, de
preferencia, en un mezclador de oscilación lenta a temperatura ambiente. Las muestras fijadas o las preparaciones de células
vivas se deben almacenar a 4°. Cuando existe la posibilidad de que la muestra sea expuesta a temperaturas extremas, pueden
ser necesarios materiales con control de temperatura (empaques para temperatura ambiente, empaques fríos y aislamiento) y
se deben llevar a cabo estudios de validación para garantizar la integridad de la muestra. Para muestras críticas o de alto valor,
pueden ser necesarios dispositivos de monitoreo de temperatura durante el transporte.
Una vez obtenidas las muestras, se deben analizar lo más pronto posible. Resulta necesario prestar atención especial a aque-
llas situaciones en las que la proliferación celular y la depleción metabólica de fuentes de energía dentro del medio de trans-
porte/almacenamiento puedan generar apoptosis. Cuando no se requiere un recuento exacto o cuando se sospecha la presen-
cia de agentes infecciosos, se puede usar una solución comercial para lisado/fijación para aumentar el tiempo de almacena-
miento y reducir el riesgo de transmisión de enfermedades. Para muestras separadas mediante centrifugación en gradiente de
densidad, se recomienda el almacenamiento en una solución de paraformaldehído amortiguado (O,1% a 2,0%) después de
que ha ocurrido el marcado de las células.
Procesamiento, Tinción y Fijación de las Muestras
Los reactivos usados en el procesamiento, tinción y fijación de las muestras deben calificarse para su uso previsto. El docu-
mento Q6B de la ICH, Specifications: TestProceduresand AcceptanceCriteriafor Biotechnological/Biologica/ Products(Especifica-
ciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación para Productos Biotecnológicos/Biológicos), proporciona pautas
adicionales. Cuando se emplean kits de reactivos, se deben seguir las instrucciones del fabricante para el procesamiento de las
muestras.
El procesamiento de las muestras que requiere centrifugación, lavado, eliminación o lisis de eritrocitos (RBC,por sus siglas en
inglés), o separación en gradiente de densidad, por lo general se usa en muchas de las aplicaciones de la citometría de flujo,
pero puede introducir errores y artefactos. Se encuentran disponibles diversas técnicas y reactivos para la eliminación y lisis de
RBC.Para una calidad óptima, se recomiendan los reactivos de grado clínico [diagnósticos in vitro (IVD, por sus siglas en in-
glés) o específicos para analitos (ASR,por sus siglas en inglés)], aunque aún pueden presentarse artefactos. La centrifugación
en gradiente de densidad puede introducir errores relacionados con pérdidas de células variables entre las subpoblaciones que
se están midiendo. Estas fuentes de error y artefactos se pueden evitar analizando la sangre entera viva siempre que sea posi-
ble.
La mayoría de las instrucciones para el lisado de la sangre entera recomiendan la tinción a temperatura ambiente y en la
oscuridad. Muchos métodos incluyen una solución fijadora diluida para evitar el enmascaramiento (capping) y la internaliza-
ción de fluorocromo. Por el contrario, las preparaciones de células (preparaciones de células en gradiente de densidad, mues-
tras por aféresis, cultivo de tejidos) se deben teñir a 4º, lavarse con solución amortiguadora fría y almacenarse en frío hasta el
momento del análisis.
La fijación que también conserva los antígenos de la superficie celular se puede conseguir mediante conservantes de leucoci-
tos comerciales o con formaldehído o paraformaldehído amortiguados. f.xiste muy poca información sobre la validación de los
tiempos de almacenamiento, unión de anticuerpos o intensidad de fluorocromo. Cualquier laboratorio que considere el análi-
sis de partidas de muestras fijas debe validar estas técnicas de manera cabal antes de implementarlas.
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USO Y SELECCIÓNDE FLUOROCROMOS
Fluorocromos
Los fluorocromos se usan para la tinción directa de células o como agentes unidos a anticuerpos u otros reactivos para teñir
antígenos celulares u otras estructuras. La Tabla 1 cita ejemplos de fluorocromos comunes usados en citometría de flujo y sus
longitudes de onda de excitación y emisión. Las longitudes de onda (nm) pueden variar ligeramente, dependiendo del entor-
no. También se encuentran disponibles sondas sintéticas de fabricantes específicos.' Los fluorocromos deben coincidir con el
intervalo espectral para los conjuntos de láseres y filtros específicos del citómetro de flujo del usuario.
Al momento de seleccionar fluorocromos para fenotipificación multicolor, el operador debe referirse a los métodos estableci-
dos para el instrumento en particular. En general, los fluorocromos más brillantes se deben usar para detectar antígenos de los
que se espera presenten una baja expresión en la superficie de la célula. El brillo de los colorantes en tándem también se pue-
de reducir usando diversos fijadores, algunos de los cuales son menos problemáticos que otros. Cuando se diseña un procedi-
miento de flujo y de coloración en tándem multicolor que no ha sido previamente validado, el operador debe consultar con el
servicio técnico del fabricante, comparar las combinaciones de fijador y colorante en tándem y validar la combinación de fluo-
rocromo final para asegurar la uniformidad de muestra a muestra.
Los colorantes fluorescentes en tándem son moléculas fluorescentes conjugadas duales. Cuando las dos marcas están muy
cerca una de otra, la energía producida por el láser que excita al fluorocromo dador se transfiere al fluorocromo aceptor, libe-
rando un fotón a la longitud de onda de emisión del fluorocromo aceptor (también conocido como fluorescencia por transfe-
rencia de energía resonante o FRET,por sus siglas en inglés). Por ejemplo, el PECy5se excitará a la longitud de onda de excita-
ción para PE (565 nm), transferirá energía a Cy5 y emitirá a la longitud de onda de emisión para Cy5 (670 nm).
Anticuerpos Marcados con Fluorescencia
La mayoría de los anticuerpos disponibles comercialmente son monoclonales, pero puede haber disponibles reactivos poli-
clonales, recomendados, para algunas aplicaciones. La calidad y especificidad de un anticuerpo puede variar ampliamente. Los
anticuerpos dirigidos a un antígeno dado pueden diferir en su especificidad de unión para diferentes epitopes de antígenos o
en la fuerza de unión al mismo epitope. De ser posible, emplear combinaciones de fluorocromo-anticuerpo conjugadas de
grado IVDo ASR.La optimización de la concentración de los anticuerpos para la población de células deseada es específica del
protocolo pero por lo general se consigue usando concentraciones de anticuerpos en aumento con un número fijo de células
para establecer el brillo óptimo entre la autofluorescencia y la extinción. La extinción es provocada por el fenómeno de prozo-
na, que se presenta cuando un exceso de anticuerpos genera la inmunoprecipitación y pérdida de intensidad de la fluorescen-
cia. Los manuales de métodos tales como Current Protocolsin /mmunology (Protocolos Actuales de Inmunología (Coligan et al.
1994), presentan detalles adicionales.
Tinción del Antígeno de la Superficie de la Célula
Las técnicas de tinción del antígeno de la superficie varían dependiendo del tipo de muestra. Las técnicas de lisisde sangre
entera por lo general requieren el marcado de la superficie a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15-30 minutos,
seguido por lisis de eritrocitos (RBC,por sus siglas en inglés) y, si se desea, fijación. Las técnicas publicadas utilizan cloruro de
amonio (NH4 CI) para producir la lisis de sangre entera o muestras de médula seguido por el lavado y posterior marcado de
anticuerpos para inmunofenotipificación de leucemia. Las muestras de células mononucleares o de cultivo que se tiñen vivas
deben conservarse a 4º o en una solución amortiguadora con azida para evitar el enmascaramiento (capping) y la internaliza-
ción de anticuerpos.
Tinción Intracelular
Existen también diversos procedimientos normalizados para el marcado de antígenos intracelulares y cito9uinas. El operador
debe consultar el protocolo del fabricante y los reactivos estandarizados para estos procedimientos. Debido a que los reactivos
permeabilizantes varían entre procedimientos y fabricantes, no se deben mezclar ni homologar reactivos. Para el marcado de
citoquinas, a menudo se requiere de una etapa de activación y un bloqueo del Golgi para permitir que se acumule una canti-
dad suficiente de citoquina para su detección. Si no se dispone de reactivos o procedimientos estandarizados por parte del
fabricante o si se requiere el análisis de funciones especializadas, existe un gran número de procedimientos y técnicas habitua-
les en fuentes tales como Current Protoco/sin lmmunology (Protocolos Actuales de Inmunología) (Coligan et al., 1994).
Cuantificación de Antígenos
Algunas aplicaciones requieren cuantificar el número promedio y la densidad de moléculas de antígenos por célula para pro-
veer una imagen más completa del comportamiento inmunológico de las células (p.ej. en estudios en los que los antígenos
extracelulares se expresan de forma diferencial en relación con el estímulo de activación). La intensidad de una preparación de
células con anticuerpos marcados con fluorocromos se compara con la intensidad de un conjunto de estándares de microper-
las de fluorescencia recolectados a la misma configuración de voltaje del PMT. Los estándares se calibran en unidades de molé-
culas de fluorescencia soluble (MESF,por sus siglas en inglés), de las que se puede determinar la relación efectiva entre la fluo-
rescencia y el anticuerpo (F/P), el número de moléculas de antígeno por célula y la densidad de los sitios disponibles por célu-
la.
1 La serie AlexaFluor (Sondas lnVitrogen/Moleculares)

o la serie Cy (GE Healthcare).
CONFIGURACIÓNY OPERACIÓNDELINSTRUMENTO
Compensación
La mayoría de los fabricantes de instrumentos ofrecen software y reactivos de prueba (por lo regular perlas fluorescentes)
para configurar los PMT y la compensación a fin de captar valores hallados con las pruebas clínicas más comunes (p. ej., fenoti-
pificación de linfocitos, análisis de CD34). Asimismo, el operador debe emplear un control biológico tal como sangre conserva-
da o células mononucleares, las cuales se encuentran disponibles comercialmente. La compensación se debe establecer antes
de adquirir datos en instrumentos análogos. Los PMT de los instrumentos digitales deben instalarse de manera correcta puesto
que los valores para estas configuraciones no podrán cambiarse una vez que haya sido generado el archivo en forma de lista.
Cuando se examinan eventos poco comunes y/o se usan colorantes intracelulares (p. ej., 7-amino actinomicina D [7-MD], yo-
duro de propidio [PI, por sus siglas en inglés], Syto-16, entre otros.) en conjunto con anticuerpos marcados por fluorescencia,
el balance de voltaje de los PMT y la superposición espectral debe monitorearse muy de cerca.
La autofluorescencia (AF)es fluorescencia por encima de la línea base en ausencia de tinción con fluorocromo. Lo anterior se
presenta en algunas células, por lo regular en células mieloides (especialmente macrófagos alveolares) y en células primarias
cultivadas. Cuando resulte deseable o necesario, la AF puede medirse directamente en un voltaje de PMT fijo o se puede calcu-
lar a partir de un estándar de referencia de preparaciones de perlas fluorescentes (ver la sección Cuantificaciónde Antígenos
anterior). Evitar el uso de la longitud de onda de excitación a 488 ó 532 nm y la compensación espectral subsiguiente de la AF
como un fluorocromo adicional.
Adquisición de Datos y Estrategias para la Creación de Ventanas
Siempre que sea posible, los eventos deben presentarse en modo de lista, es decir, sin la creación de ventanas selectivas para
eventos. Las Ventanasvivas,definidas como la creación de ventanas selectivas para eventos durante la adquisición, se deben
emplear solo cuando el subconjunto deseado es lo suficientemente raro, y se deben analizar >2 millones de eventos totales
para contar un número de eventos significativo (100 o mayor) de la población deseada. Los datos en forma de lista se pueden
adquirir sin compensar cuando se emplea instrumental digital, pero la mayoría de los operadores indican que el análisis es mu-
cho menos difícily más rápido si los datos se encuentran en el intervalo de compensación apropiado antes de su adquisición.
Además, a menudo se recomienda establecer umbrales para exclusión de desechos. Por ejemplo, si se establece un umbral de
dispersión frontal se excluyen eventos por debajo de un tamaño predeterminado a fin de prevenir un archivo en forma de lista
de gran tamaño, que podría formarse si se contaran estos eventos.
Uso de Controles
Las preparaciones de perlas conjugadas con fluorocromo se usan para estandarizar los PMT y la compensación y para cuanti-
ficar la expresión de marcadores específicos. Asimismo, se recomienda ampliamente el uso de controles biológicos. Se deben
teñir las muestras de células con un control de isotipos y anticuerpos primarios y secundarios para evaluar la unión no específi-
ca, a menos que el laboratorio haya determinado mediante procedimientos rigurosos de validación que la unión no específica
no interfiere con los resultados del ensayo.
Las poblaciones de células con antígenos positivos y negativos (preparadas y teñidas de manera idéntica a las de los artículos
de prueba) proporcionan estándares internos de aptitud del sistema. Tales poblaciones de células de control también permiten
al laboratorio evaluar variaciones entre lotes en preparaciones de anticuerpos y reactivos de tinción.
Uso de Colorantes y Ventanas para Viabilidad Celular
Los colorantes para viabilidad celular tales como 7-MD, PI y yoduro TO-PRO se usan comúnmente para determinar la pro-
porción de células muertas en un producto de terapia celular. Estos colorantes por lo general se excluyen de las células vivas,
pero pasan a través de las membranas celulares de células muertas, tiñendo su ADN. La coloración para viabilidad de las célu-
las se puede combinar con la tinción intracelular o de la membrana de la superficie para evaluar subpoblaciones y la propor-
ción de células vivas y muertas teñidas con un marcador determinado. La tinción para viabilidad también se puede usar en
conjunto con un colorante de membrana en ensayos de citotoxicidad usando citometría de flujo. Estos colorantes para viabili-
dad no deben confundirse con la gran cantidad de reactivos para detección de apoptosis disponibles en la actualidad. Las téc-
nicas de validación para colorantes para viabilidad que no se usan en IVDimplican la preparación de una población de células
muertas que se agregan diluidas en serie a un producto de células vivas y, posteriormente se evalúa la fidelidad de la mezcla de
células con respecto a la población conocida tiñendo con el colorante de interés.
Enumeración de Células
El recuento celular absoluto, expresado como el número de células en un volumen de muestra dado, se puede determinar
por métodos de plataforma doble o simple. El método de plataforma doble se basa en un instrumento de recuento automati-
zado separado o en un método de recuento manual para enumerar primero la población de células. Después, se determina el
porcentaje de subgrupos de interés mediante citometría de flujo, el cual se multiplica por el recuento celular y el resultado se
divide por 1OO.Los métodos de plataforma simple enumeran la población de células y del subgrupo directamente contando
las células de la muestra simultáneamente con perlas de referencia que se han agregado al volumen de muestra en una con-
centración conocida. Las perlas de referencia a menudo se ofrecen como suspensión de perlas que se agrega a la muestra. De
manera alternativa, se puede agregar un volumen dado de muestra a un número conocido de pertas de referencia provistas
como una matriz de fase sólida en tubos de poliestireno. Estas metodologías están sujetas a error de pipeteo, por lo que se
debe tener mucho cuidado para asegurar la exactitud y reproducibilidad.
Configuración del Instrumento y Garantía de Calidad

Cada laboratorio debe tener un plan de calidad que defina los procedimientos operativos estándar para la configuración y
calibración del instrumento, así como el monitoreo, mantenimiento y limpieza regular del instrumento. Los registros del instru-
mento deben documentar estas actividades y a los operadores. En general, se debe seguir el programa del calidad del fabri-
cante para el instrumento a menos que se haya establecido una alternativa adecuada.
Los parámetros del instrumento, como por ejemplo la corriente láser, el voltaje, la respuesta y los voltajes de PMT durante la
calibración, deben ser monitoreados y registrados siempre que se utilice el instrumento. El monitoreo cuidadoso de los pará-
metros de configuración del instrumento puede ser de utilidad para detectar tendencias y predecir fallas en el láser o el PMT.
Asimismo, los resultados de las pruebas de control biológico deben monitorearse y registrarse para detectar y prevenir la deriva
del método analítico.
El laboratorio también debe participar en un programa de análisis de competencia que refleje su menú de pruebas. Depen-
diendo de las necesidades, esto puede variar de un programa formal como el administrado por el College of American Patho-
logists (Colegio de Patólogos Estadounidenses o CAP) a compartir muestras y análisis con otro laboratorio. Asegurar que los
operadores estén capacitados, calificados y que su competencia para realizar procedimientos específicos sea evaluada periódi-
camente ayudará a garantizar la uniformidad de las técnicas y los controles.
GESTIÓNDE DATOSY CONSIDERACIONES

ESTADÍSTICAS
Gestión y Almacenamiento de Datos

Los ensayos de control de calidad y los ensayos de análisis de muestras (en forma de lista) se deben almacenar de tal manera
que se cumpla con los requisitos reglamentarios aplicables al laboratorio. Lo anterior se puede lograr mediante transferencia a
discos duros, medios extraíbles o a un servidor tal como un sistema de información de laboratorio comercial. El almacenamien-
to de los resultados deberá ser rastreable en todo momento hasta el archivo en forma de lista FCS, la configuración del instru-
mento y los parámetros de control de calidad originales para la muestra en particular. Se debe crear un respaldo de datos para
evitar la pérdida de archivos. Se deben establecer procedimientos de almacenamiento y respaldo para registros manuales (en
papel) que podrán ser usados para cálculos y resumen de datos.
Análisis de Datos y Consideraciones Estadísticas
Para la mayoría de las aplicaciones de citometría de flujo, el análisis de datos implica presentar los datos de los archivos en
forma de lista o de las ventanas en vivo mediante una gráfica (gráfica de histograma de un solo parámetro, gráfica de puntos
de dos parámetros con regiones o gráfica tridimensional) y medir la distribución de eventos dentro de la gráfica. El análisis
adicional de datos dentro de poblaciones seleccionadas se puede llevar a cabo mediante ventanas para poblaciones de células
específicas. La descripción de los datos por lo regular incluye el porcentaje de eventos dentro de la población con una caracte-
rística dada (dispersión frontal, dispersión lateral, marcador fluorescente). El numerador es el número de eventos que presen-
tan la característica, mientras que el denominador puede ser el número de eventos totales contados o el número de eventos
contados que caen dentro de la ventana. Para gráficas bidimensionales, el análisis a menudo se lleva a cabo usando un softwa-
re informático que analiza e informa estadísticas regionales (p. ej., cuadrante). Debido a que los grupos de poblaciones de cé-
lulas pueden cambiar de posición en un archivo de datos con respecto al siguiente, se ha desarrollado un software para el
análisis de grupos.
El análisis estadístico de las aplicaciones cuantitativas de citometría de flujo difiere de las aplicaciones cualitativas en las que
una célula es considerada positiva o negativa para un marcador dado. Para una aplicación cuantitativa típica en la que se esti-
ma el número de moléculas en la superficie celular, la intensidad de fluorescencia media o mediana de las células de la muestra
marcadas con un anticuerpo fluorescente, unido a la molécula de interés, se puede comparar con controles apropiados, inclu-
yendo curvas estándar de células o partículas con cantidades conocidas de dicha molécula o anticuerpo.
Una consideración práctica común para el análisis por citometría de flujo de productos de terapia celular, en especial los
productos autólogos y alogénicos relacionados con el donante, es que el tamaño de la muestra que se debe analizar a menudo
está restringido debido al contenido limitado de células del producto terapéutico mismo. Esto genera desafíos especiales cuan-
do las células que contienen el marcador de interés se presentan como eventos poco comunes. En tales casos, antes de tomar
una decisión con respecto al tamaño de la muestra, el usuario debe considerar las expectativas de detección de eventos poco
comunes dentro de un número dado de células totales (es decir, la prevalencia, variabilidad, y el error de muestreo) en relación
con la precisión deseada del estimado.
Calidady Estandarización
La estandarización del uso de la citometría de flujo y de los equipos requiere de prácticas de validación, garantía de calidad
(QA) y control de calidad (QC). Aunque la citometría de flujo se usa ampliamente tanto en la investigación como en laborato-
rios clínicos, el análisis de células para el desarrollo de aplicaciones de diagnóstico clínico y terapéutico se encuentra en creci-
miento, lo que conlleva a requisitos reglamentarios más amplios y al énfasis en la normalización. Por ejemplo, tradicionalmen-
te, los operadores de citometría de flujo han empleado microesferas fluorescentes (perlas) o celdas para la configuración del
instrumento y el QC, a menudo basándose en las recomendaciones del fabricante. Sin embargo, no ha sido posible convenir
instrucciones uniformes para la aplicación de estos estándares de control a la configuración del instrumento y al QC.
USP 42 Información General/ (1027) Citometría de Flujo 7345
Cuando se aplica de manera apropiada, la validación proporciona evidencia documentada de que el proceso de fabricación
o análisis genera constantemente productos que cumplen con las especificaciones predeterminadas. Cuando se basa en una
comprensión cabal de los parámetros críticos del proceso, la validación ayuda a definir la calidad del producto y a garantizar
procesos de fabricación o análisis bien controlados y uniformes. La validación de métodos por citometría de flujo debe incluir
la calificación del instrumental, la validación del método analítico y la calificación del operador.
DOCUMENTACIÓN
Los procesos que cumplen con las BPLy las BPFrequieren de documentación adecuada tal como procedimientos operativos
estándar (SOP, por sus siglas en inglés) para todos los procesos del laboratorio. Los SOP deben ser actualizados periódicamente
y aprobados para reflejar las prácticas vigentes. La capacitación y la calificación son indispensables para que el personal de la-
boratorio tenga el nivel de competencia apropiado para su responsabilidad asignada. Las competencias del operador deben
ser revisadas y evaluadas de manera continua en relación con las SOP y los reglamentos.
La integración de procesos de calidad internos y externos es un elemento importante para la garantía de calidad. Dichos
procesos incluyen la validación del equipo, los controles y límites de fabricación y las especificaciones del producto. Los proce-
sos de validación de procesos y equipo por lo general requieren de calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés), la
calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y la calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés).
CALIFICACIÓN
DE EQUIPOSY ENSAYOS
La IQ establece que el instrumento sea recibido con su diseño y especificaciones originales, y que sea instalado adecuada-
mente en un ambiente apropiado. Por lo general, esto significa verificar los requisitos físicos y de la instalación para determinar
si el citómetro de flujo se puede instalar adecuadamente. Los factores de calificación verificados a menudo incluyen la tempe-
ratura, humedad, espacio y capacidades eléctricas de las instalaciones en relación con los requisitos del fabricante para el ins-
trumento. Los procedimientos de IQ también garantizan que todos los componentes de hardware y software se instalen ade-
cuadamente por el representante del fabricante del instrumento.
LAOQ demuestra que un instrumento funcionará de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Esto generalmente se
refiere al análisis de niveles de componentes por parte del representante del fabricante del instrumento o usando los manuales
de validación del fabricante que guía al usuario final para llevar a cabo esta función. Siempre que sea posible, estas pruebas
deben contar con especificaciones con límites de control cuantitativos correspondientes. Este análisis asegura que el hardware
y software del instrumento esté en condiciones de operar comparándolos con las especificaciones del fabricante.
La PQ demuestra que tanto el instrumento como las pruebas tienen un desempeño conforme a las especificaciones. Para
citometría de flujo, estas especificaciones, por lo general, son determinadas por el laboratorio que realiza el análisis por citome-
tría de flujo y a menudo incluyen las especificaciones diarias del instrumento y de las pruebas de control de la valoración. Para
valoraciones específicas, la PQ debe incorporar metodología normalizada, configuración y compensación específica para la
aplicación y especificaciones de linealidad, precisión y exactitud de los resultados informados de la valoración. En algunos citó-
metros de flujo digitales, puede ser necesario configurar la línea base del instrumento a fin de determinar la configuración ópti-
ma del instrumento para una valoración dada.
DESEMPEÑODELINSTRUMENTO
Las especificaciones de desempeño pueden ser identificadas por el fabricante del citómetro de flujo y posiblemente no abar-
quen todos los requisitos especificados por el operador. Después de identificar las especificaciones del fabricante, el laboratorio
debe establecer especificaciones que sean apropiadas para las configuraciones del hardware que se utilizarán, y se deben nor-
malizar las especificaciones. Por ejemplo, el fabricante puede tener una especificación base para un citómetro de flujo de doble
láser y cuatro colores. Si la especificación base requiere un láser de diodo rojo estándar a 635 nm, pero se sustituye con un
láser de helio-neón enfriado con aire a 633 nm, la especificación base deja de ser válida para el sistema. De manera similar, si
las especificaciones se basan en el uso de un filtro de paso de banda a 660 nm pero se sustituye con un filtro de paso largo a
675 nm, la especificación base deja de ser válida debido a las diferencias en las características del filtro de emisión.
MONITOREODELDESEMPEÑO
El desempeño del instrumento debe monitorearse a diario, usando perlas fluorescentes comercialmente disponibles. Los de-
tectores de luz tales como PMT,fotodiodos (PD, por sus siglas en inglés) y fotodiodos en avalancha (APD, por sus siglas en
inglés) se usan en la mayoría de los sistemas para detectar señales y sus ganancias se pueden cambiar para aumentar o dismi-
nuir la sensibilidad de los detectores. Por lo tanto, el monitoreo de las configuraciones de estos detectores es tan importante
como el monitoreo de las señales, y dichas configuraciones deben asociarse con cada archivo de datos sin procesar. La meto-
dología más simple consiste en mantener diariamente la misma configuración del detector del instrumento para medir la in-
tensidad de las señales de fluorescencia. Esta metodología debe implementarse para todos los parámetros que se deben validar
usando las perlas apropiadas. La sensibilidad del instrumento se basa en la capacidad del sistema de detección para resolver la
poblaciones de células o perlas con fluorescencia atenuada. Por esta razón, la medición del coeficiente de variación (CV) de
poblaciones de perlas con fluorescencia atenuada a moderadamente intensa es una forma de monitorear diariamente la sensi-
bilidad de la fluorescencia. Se deben usar las recomendaciones del fabricante del instrumento para monitorear el desempeño.
La temperatura ambiente alta puede afectar el desempeño del láser y del PMT y también debe monitorearse a diario.
La compensación incorrecta para la superposición espectral puede afectar en gran medida a los datos durante el análisis
multicolor. Se han establecido muchas metodologías para este propósito y se han usado algoritmos matemáticos recientes en
lugar del circuito análogo. Los algoritmos, tales como aquéllos que emplean álgebra de matrices, permiten al operador o a los
investigadores aplicar criterios objetivos para compensar la superposición espectral después de haber recopilado todos los da-
tos. En sistemas más antiguos, la metodología estándar ha consistido en compensar usando un ajuste de hardware de sustrac-
ción para los datos preliminares observados, antes de que se hayan recopilado todos los datos. Esta metodología puede ser
subjetiva y puede no generar resultados exactos como la compensación por métodos más novedosos. Las perlas de captura
unidas a anticuerpos son herramientas valiosas de compensación debido a que se pueden usar con los mismos colorantes de
anticuerpos y en tándem para todos los fluoróforos que se usarán en las células. Se debe validar el uso de perlas en lugar de
celdas para propósitos de compensación.
ESTÁNDARES
Los estándares de fluorescencia basados en microesferas para citometría de flujo han sido categorizados en base a su propó-
sito:
• Los estándares Tipo I son estándares de alineación que se usan para realizar ajustes en la alineación óptica del instrumen-
to. Estos son usados generalmente por los ingenieros de servicio del campo y por los usuarios de sistemas ajustados por el
operador para verificar la alineación de la señal óptica a fin de mejorar la sensibilidad del instrumento. Por lo regular, estas
partículas son pequeñas (se2 µm) y brillantes y proporcionan la iluminación más uniforme.
• Los estándares Tipo II son perlas de referencia y son los estándares de perlas más comúnmente usados. Estos estándares
por lo general se usan a diario, tienen una intensidad de fluorescencia tenue a moderada y pueden obtenerse con varios
fluoróforos insertados. Asimismo, se pueden usar para imitar células y, usando un software dedicado, determinar la sensi-
bilidad relativa del instrumento.
• Los estándares Tipo IIIse usan para calibrar la fluorescencia. Estos se usan para aplicaciones especializadas que requieren
la calibración de uno o más detectores de fluorescencia para cuantificación de moléculas de fluorocromo. La determina-
ción de la relación entre los fluoróforos y el anticuerpo (relación F/P) permite el cálculo subsiguiente del número de anti-
cuerpos unidos por célula.
CONFIGURACIÓNDELINSTRUMENTOY GARANTÍADE CALIDAD
La configuración del instrumento y la garantía de calidad deben ser actividades independientes de la valoración biológica.
Muchas variables relacionadas con el instrumental pueden producir artefactos en los resultados de la valoración biológica. Para
garantizar la calidad instrumental se puede usar: la configuración de la línea base y la configuración diaria.
Configuración de la Línea Base
En los instrumentos digitales más novedosos, se recomienda establecer una configuración de la línea base en la configura-
ción del instrumento que provea una sensibilidad óptima. Esta configuración no es un procedimiento diario, pero debe llevarse
a cabo si la configuración del instrumento ha sido cambiada o si se ha dado servicio al instrumento. Debido a que los voltajes
del PMT y la configuración del instrumento pueden afectar sobremanera la sensibilidad de éste último, este método debe usar-
se para generar objetividad y una sensibilidad mejorada. Los voltajes de PMT se pueden aumentar hasta un intervalo que pro-
vea un CV menor (Figura 8). Estas configuraciones pueden ser usadas para la valoración biológica, aunque no aplica para todos
los casos.
,,i____
íT
10000 ~----------------
490V 605V
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1000 - --------~-~--+----+--------
'•·,-.,._
-+-P1 FITC-A CV
• P1 PE-A CV
e
> •·.
P1 PerCP-Cy5-5-A CV
u '••---
....- ...t.....,.._
___________
_ P1 APC-Cy7-A CV
-·-P1 APC-A CV
-+-P1 PE-Cy7-A CV
10 ·f-----------------
200 400 600 800 1000
Voltaje de PMT
Figura 8. Los voltajes de PMT se pueden aumentar hasta un intervalo que provea una CV menor.
Configuración Diaria
Se pueden usar estándares npo 11,tales como partículas de referencia, para monitorear la intensidad de la señal, la separa-
ción de partículas moderadamente brillantes y tenues y la resolución de la señal. Las perlas con fluoróforo homologado pro-
porcionan una herramienta de compensación y un medio para saber si el instrumento es capaz de detectar tales longitudes de
onda. Sin embargo, las perlas con fluoróforo homologado no tienen la uniformidad de fluorescencia requerida para medir CV.
Basándose en el desempeño óptico del instrumento, los CV se miden mejor usando perlas duras teñidas con brillo moderado y
tenue tales como micropartículas teñidas con coumarina que se muestran fluorescentes en un intervalo espectral amplio.
Resulta fácil confundir los controles de valoración con los controles instrumentales. Las perlas proveen una fluorescencia uni-
forme y constante que no es posible obtener con células y, por consiguiente, son útiles para monitorear el desempeño del
instrumento. Por esta razón, resulta mejor emplear una preparación de células para control de proceso a fin de verificar la
compensación y la aceptabilidad del fluoróforo.
Los ajustes que se realizan al instrumento para configurarlo diariamente son, por lo general, los mismos que se usan para los
ensayos. No todas las valoraciones se pueden usar con la misma configuración instrumental, y no siempre es necesario llevar a
cabo estas actividades para cada configuración instrumental a menos que la validación así lo requiera.
Las actividades diarias incluyen configurar el instrumento de manera uniforme día por día, usar una amplia variedad de per-
las de intensidad tenue a moderada y monitorear parámetros clave, incluida la intensidad de fluorescencia de las perlas (abso-
luta y CV%), valores de PMT, temperatura, potencia y longitud de onda del láser.
CONTROLY GARANTÍADE CALIDADDE LAVALORACIÓN
La configuración instrumental para una valoración específica debe establecerse para demostrar que todas las poblaciones ce-
lulares pueden identificarse en gráficas bivariables para fluorescencia y dispersión de luz. Es de suma importancia que las po-
blaciones positivas estén en escala y apropiadamente compensadas. Esto es crítico cuando las células se excitan con láseres
rojos, los cuales no provocan que las células generen autofluorescencia significativa. Por esta razón, es importante verificar que
la configuración sea adecuada para que la población positiva se encuentre en la parte superior de su escala de fluorescencia,
puesto que puede ser extremamente difícil identificar las células negativas.
La compensación de fluorescencia es un ajuste crítico. Los instrumentos digitales ofrecen ajustes objetivos fuera de línea du-
rante el análisis; asimismo, se encuentran disponibles instrucciones detalladas para la configuración adecuada de la compensa-
ción. El uso de células o perlas de captura teñidas con un solo fluorocromo unido a anticuerpos es, por lo general, la mejor
metodología, aunque las mezclas de perlas marcadas con fluorocromo específicas también pueden funcionar bien para com-
pensar la adquisición y el análisis multicolor.
CONTROLESDE ISOTIPOS
Un control de isotipo es un control negativo de anticuerpo que no debe reaccionar con el antígeno de interés y que es el
mismo isotipo que el anticuerpo de prueba. La proteína de mieloma o la inmunoglobulina que no tiene especificidad para las
especies que se analizan, tienen la misma clase y subclase de cadena lg a medida que el anticuerpo de prueba se conjuga con
un fluorocromo idéntico al del anticuerpo de prueba. Resulta ideal que la unión sea mínima o nula cuando se usa el control de
isotipo en paralelo con la prueba. Aunque la unión idiotípica no específica ocurre con frecuencia, ésta es independiente del
isotipo del anticuerpo. Esto muy probablemente se relaciona con otras diferencias en la química del anticuerpo y puede ser
especialmente problemático con ensayos de detección de eventos poco comunes, tales como aquellos para ensayos de células
madre hematopoyéticas en sangre periférica.
7348 (1027) Citometría de Flujo / Información General USP 42
CONTROLESDE FLUORESCENCIA
MENOS UNO
Los controles de fluorescencia menos uno (FMO, por sus siglas en inglés) se usan para controlar la tinción no específica du-
rante un ensayo multicolor. Después de que sea establecida la compensación, se analiza un tubo que contiene todos los anti-
cuerpos marcados con fluorocromo, excepto por uno. Si la compensación se ha establecido de manera apropiada, cualquier
fluorescencia positiva en el parámetro correspondiente al anticuerpo marcado con fluorocromo faltante es ocasionada por tin-
ción no específica y puede ser indicativa de un exceso de anticuerpos o la degradación de los colorantes en tándem relaciona-
dos. Aunque los controles de FMO son muy útiles para estimar la sensibilidad de un detector particular en el contexto de otros
reactivos, los controles no toman en cuenta la unión específica que puede presentarse con la adición del anticuerpo de prueba.
El uso de los tubos de control de FMO es más apropiado para resolver problemas o para establecer un nuevo cóctel de reacti-
vos multicolor.
CONTROLESDURANTEEL PROCESO
Los controles durante el proceso, también conocidos como estándares de aptitud del sistema, toman en cuenta la prepara-
ción de la muestra y la adquisición de datos. Estos pueden incluir células de control conservadas, líneas de células o líneas de
células comercialmente disponibles, tales como sangre periférica común. Asimismo, los controles durante el proceso se pueden
usar para analizar nuevos lotes de reactivos de anticuerpos contra lotes antiguos.
CONTROLESBIOLÓGICOS
Cuando se comparan células tratadas o estimuladas con células sin tratar o sin estimular, en ocasiones, las células sin tratar o
sin estimular pueden representar el control más útil para establecer un límite positivo o negativo. No obstante, el uso de con-
troles de isotipo también puede aplicarse a estas situaciones, debido a que la estimulación puede llevar a la regulación crecien-
te de los receptores para Fe, lo que a su vez conlleva a un aumento en la tinción de fondo, cuya presencia puede dilucidarse
mediante un control de isotipo.
APLICACIONES
DE LA CITOMETRiA
DE FLUJOPARAMUESTRASCELULARES
Y PRODUCTOSDE
TERAPIACELULAR
Se ha desarrollado una gran variedad de aplicaciones de citometría de flujo para investigación, diagnóstico clínico y monito-
reo, desarrollo de fármacos y caracterización de productos celulares y evaluación de su calidad (es decir, controles para la libe-
ración del lote). Las aplicaciones clínicas tradicionales incluyen el monitoreo de la enfermedad por VIHy el diagnóstico y moni-
toreo de leucemia y linfoma. Los laboratorios de investigación farmacéutica y académica han ampliado la aplicación de la cito-
metría de flujo desde inmunofenotipificación hasta ensayos celulares funcionales, así como ensayos multiplex basados en mi-
croesferas capaces de medir parámetros funcionales múltiples en células individuales. Los ensayos funcionales de la actualidad
incluyen ensayos que permiten el estudio directo del estado de activación celular midiendo la producción de citoquinas intra-
celulares o la secreción de quimioquinas o citoquinas, usando un ensayo en emparedado de unión a ligandos en microesferas.
lnmunofenotipificación
La citometría de flujo permite caracterizar subtipos de leucocitos marcando células con anticuerpos monoclonales conjuga-
dos con fluorocromos. El sistema de grupo de diferenciación, CD, define anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos
únicos en la superficie celular. Muchas aplicaciones clínicas toman ventaja de las capacidades de la citometría de flujo para
medir múltiples antígenos CD en miles de células individuales.
ENUMERACIÓNDE CD4
Al inicio de la década de 1980, los investigadores descubrieron que el VIH infecta las células T CD4 positivas y que el recuen-
to de células T CD4 de la sangre periférica del paciente es un indicador útil del estado inmune. La enumeración de CD4 se ha
convertido en la prueba de diagnóstico más comúnmente usada en pacientes infectados con VIH para determinar la necesidad
de terapia antiretroviral (ARV)y para monitorear la efectividad de los fármacos ARV.Los recuentos de subconjuntos de células T
a menudo se expresan en términos de células por microlitro y como porcentaje de linfocitos, usando un reactivo estandariza-
do, software y sistema de instrumentos.
LEUCEMIA
Y LINFOMA
El análisis por citometría de flujo multidimensional permite identificar poblaciones de células aberrantes en la médula ósea,
en el tejido linfático y en la sangre periférica de pacientes con leucemia o linfoma. Esto se logra mediante cócteles de anticuer-
pos monoclonales pertinentes a la oncología o para linajes específicos. Mediante fluoróforos óptimos y configuraciones ópti-
cas/electrónicas mejoradas en instrumental de la citometría de flujo, se pueden detectar marcadores celulares adicionales para
identificar de manera más precisa fenotipos de células de leucemia o linfoma y para mejorar la evaluación del médico sobre el
estado del paciente. Los métodos de detección de eventos poco comunes han mejorado la capacidad de detectar enfermeda-
des residuales mínimas.
CÉLULASDENDRÍTICAS
Las células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) actúan como células que presentan antígenos que pueden influenciar la
naturaleza y potencia de la respuesta inmune a antígenos específicos. Este hallazgo ha llevado al desarrollo de las DC como
terapias celulares para cáncer, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes. Las DC tienen morfologías y fenotipifi-
caciones diversas y se pueden derivar de diferentes tipos de células. Es posible segregar dos linajes de DC principales, conoci-
das como DC mieloides y plasmocitoides, basándose en su expresión de CDl 1c y CDl 23, respectivamente. Asimismo, la ex-
presión de las moléculas coestimulantes CD80 y CD86 se puede monitorear para determinar el estado de madurez de las DC.
CÉLULASMADREY PROGENITORAS
La expresión de CD34 a menudo se usa para caracterizar las células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés)
en sangre periférica, sangre del cordón, médula ósea y preparaciones de HSC purificadas de estas fuentes. La identificación y
enumeración por citometría de flujo de HSC es posible mediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos para el epíto-
pe CD34 clase 111,junto con otros reactivos bien caracterizados, software de análisis y protocolos. La combinación de anticuer-
pos anti-CD45, anti-CD34 y un colorante de viabilidad tal como 7-AADse usa ampliamente en aplicaciones clínicas. El crecien-
te interés por el desarrollo de terapias celulares a partir de fuentes de tejido embriónico, fetal y adulto ha llevado al uso de una
amplia variedad de marcadores convencionales fenotípicos novedosos para caracterizar células de origen y su progenie más
diferenciada. Se están desarrollando ensayos por citometría de flujo como parte de baterías de ensayos para evaluar productos
celulares diferenciados derivados de fuentes de células madre pluripotentes. Estos ensayos ayudan a definir números apropia-
dos y tipos de poblaciones celulares deseadas, además de que ayudan a detectar células no deseadas tales como células pluri-
potentes residuales que pueden ser tumorigénicas en el receptor.
LEUCOCITOS
La leucoreducción de hemoderivados es un proceso que se usa para producir hemoderivados con un contenido de leucoci-
tos residuales de menos de 5 x 106 por unidad. Los datos clínicos sugieren que las reacciones febriles no hemolíticas posteriores
a la transfusión se pueden evitar mediante leucodepleción. La leucodepleción también previene la aloinmunización a antígenos
HLAen pacientes que requerirán repetidamente transfusión de hemoderivados. La citometría de flujo se usa a menudo para
cuantificar la contaminación leucocitaria en hemoderivados sometidos a leucodepleción.
PLAQUETAS
La citometría de flujo es un método útil y rápido para diagnosticar muchos trombocitopatías primarias asociadas con defec-
tos en glicoproteínas estructurales o funcionales (p. ej., expresión anormal de gpllb/llla en trombastenia de Glanzmann o gplb
en el síndrome de Bernard-Soulier). El uso de anaranjado de tiazol, un colorante fluorescente que se une al ARN, permite la
cuantificación de plaquetas inmaduras (plaquetas reticuladas). El recuento de plaquetas reticuladas se puede usar para deter-
minar la velocidad de trombopoyesis. Esta medición puede separar las trombocitopenias inexplicables en aquellas con un au-
mento en la destrucción y aquellas con defectos en la producción de plaquetas.
ERITROCITOS
Las mujeres Rhesus D negativo reciben inmunoglobulina Rh profiláctica para prevenir la aloinmunización de eritrocitos (RBC)
Rh(D)•. Si se sospecha hemorragia fetomaterna, la sangre de la madre se analiza para determinar la presencia y cantidad de
RBCfetales, usando anticuerpos contra el antígeno Rh(D) o la hemoglobina F marcados con fluorescencia.
El recuento de reticulocitos ayuda a determinar si la médula ósea responde adecuadamente a la necesidad del cuerpo de
RBCy ayuda a clasificar diversos tipos de anemia. Los recuentos de reticulocitos se .basan en la identificación de ribosomas y
ARN residuales en los RBCinmaduros sin núcleo. La enumeración de reticulocitos por citometría de flujo y su discriminación de
RBCmaduros emplea colorantes fluorescentes que se unen al ARN residual (p. ej., anaranjado de tiazol).
lnmunoensayos Basados en Perlas

Los ensayos por citometría de flujo basados en microesferas multiplex combinan una serie de partículas de tamaño discreto
y/o intensidad de fluorescencia con pares de anticuerpos homologados que permiten la detección simultánea de analitos solu-
bles múltiples en un citómetro de flujo. La capacidad del citómetro de flujo para discriminar partículas basándose en el tamaño
y color permite determinar múltiples resultados de un solo tubo o pocillo. Muchos investigadores emplean tales ensayos para
medir quimioquinas o citoquinas, kinasas, y anticuerpos anti-HLA secretados.
Ensayosde Proliferación
INCORPORACIÓNDELCOLORANTEEN ELADN
La Bromodesoxiuridina (BrdU) es un análogo de timidina que se puede incorporar en el ADN de las células durante la fase S
y que se puede detectar posteriormente usando anticuerpos monoclonales marcados específicos. Mediante la aplicación de
pulsos a un cultivo de células estimulado con BrdU, es posible identificar a las células que han proliferado (pasado a través de
la fase S) durante el tiempo del pulso. Este ensayo se ha convertido en una alternativa útil a la incorporación de 3H-timidina
como una medición de proliferación debido a su radioactividad nula y a que puede identificar fenotipos de células que prolife-
ran usando marcadores múltiples y citometría de flujo.
INCORPORACIÓNDELCOLORANTEEN PROTEÍNASCELULARES
O EN LA MEMBRANACELULAR
Loe colorantes para el rastreo de células tales como succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE,por sus siglas en inglés) y
PKH26 han demostrado ser útiles en la evaluación de la proliferación celular. El CFSEse une de manera covalente al citosol y a
las proteínas de la membrana, mientras que el PKH26 se une de manera no covalente a las membranas celulares. Cuando las
células se dividen, el marcado con CFSE/PKH26se divide equitativamente entre las células hijas, las cuales, por consiguiente,
tienen la mitad de fluorescencia que las células paternas. La fluorescencia de cada célula se divide adicionalmente por la mitad
con cada generación subsiguiente. Esta propiedad hace de los ensayos con CFSE/PKH26útiles, no solo para determinar la frac-
ción de células que han proliferado en un cultivo estimulado, sino también, en condiciones ideales, el número de generaciones
que han transcurrido. De esta manera, se pueden calcular las frecuencias precursoras de poblaciones pequeñas que han proli-
ferado durante varios días en cultivo.
EnsayosFuncionales
EXPRESIÓNDE CITOQUINASINTRACELULARES
Las técnicas de marcado de superficies celulares e intracelulares han sido aplicadas a la identificación de subconjuntos de
células con características funcionales específicas. Por ejemplo, una estimulación breve de las células, tales como PBMC con
antígenos proteicos o peptídicos, puede resultar en la expresión de los marcadores y citoquinas de activación, los cuales puede
medirse posteriormente junto con otros marcadores fenotípicos en la superficie de las células que responden. El uso de un inhi-
bidor de secreción tal como brefeldina A o monensina permite la acumulación intracelular de citoquinas. Posteriormente, las
células se fijan, permeabilizan y detectan por un método de citrometría de flujo. Dichos ensayos son útiles para monitorear
subpoblaciones de células T que responden a vacunas, agentes de enfermedades infeccionas o cáncer. Las propiedades funcio-
nales de otros tipos de células, incluidos monocitos, DC y células NK, también pueden monitorearse usando ensayos funciona-
les con estímulo apropiado.
QUINASAS
Los intermediarios fosforilados de la activación celular se pueden identificar usando anticuerpos fosfoespecíficos y citometría
de flujo. Estos reactivos son útiles para mapear mecanismos de señalización intracelulares, a menudo en el contexto de otros
marcadores fenotípicos de superficie celular. Por lo tanto, la citometría de flujo multicolor puede proveer una evaluación de
células individuales en estados de activación intracelular en poblaciones de células complejas. Estos ensayos pueden ser útiles
para la detección de estados de señalización alterados en células cancerosas o en la dirección terapias apropiadas basadas en
las propiedades de señalización de las células tumorales de un paciente.
APOPTOSIS
La apoptosis, comúnmente descrita como muerte celular, es el proceso de muerte celular ocasionada por procesos fisiológi-
cos regulados. El proceso apoptótico se presenta como una serie de cambios morfológicos, bioquímicos y moleculares en la
célula y se puede iniciar mediante estímulos externos o internos. Un evento central durante la apoptosis es la activación de
caspasas, una familia de enzimas proteolíticas. Las caspasas se sintetizan como proenzimas inactivas y se activan mediante
otras caspasas o moléculas similares. Éstas forman una cascada que puede llevar a la ruptura de varias proteínas citoplasmáticas
o nucleares. Se ha informado que la caspasa-3 es crucial para el proceso apoptótico, la cual se activa durante las etapas tem-
pranas de la apoptosis.
Los métodos por citometría de flujo para detectar células apoptóticas incluyen la medición de la morfología, cambios en la
estructura de la membrana, ruptura del ADN por endonucleasas y potencial de la membrana mitocondrial. Se han usado para
este propósito sustratos de caspasas naturales o artificiales o anticuerpos contra la forma activada de la enzima.
VIABILIDAD
DE LACÉLULA
La citometría de flujo a menudo se usa para discriminar células vivas de células muertas. El principio de exclusión con colo-
rante de ácido nucleico es la base de esta aplicación. Un colorante de ácido nucleico tal como PI o 7-AADse agrega a las célu-
las en suspensión. Durante el análisis por citometría de flujo, las células que muestran fluorescencia por encima del fondo se
consideran no viables debido a que no pueden excluir el colorante, el cual presenta fluorescencia cuando se une al ADN celu-
lar.
Ensayosde lnmunoglobulinaspor Citometría de Flujo
COMPATIBIUZACIÓNCRUZADAPOR CITOMETRÍADE FLUJO
Antes del transplante de órganos, se realiza la compatibilización cruzada por citometría de flujo (FCXM, por sus siglas en
inglés) en los receptores para detectar anticuerpos antiHLA que puedan ocasionar el rechazo. Los anticuerpos antiHLA se de-
tectan incubando leucocitos con determinado HLA,líneas de células B o perlas recubiertas con antígenos HLAcon la muestra
de suero, seguido por anticuerpos marcados con fluorescencia de inmunoglobulina antihumana. Los leucocitos se inmunoti-
ñen para identificar células T y B para distinguir entre la actividad de clase I y II de anti-HLA, respectivamente. Además, tam-
bién ha aumentado el uso del análisis de donaciones de sangre para detectar anticuerpos anti-HLA para identificar donantes
cuyos hemoderivados pueden presentar un mayor riesgo de ocasionar en los receptores lesiones pulmonares agudas relaciona-
das con la transfusión (TRALI,por sus siglas en inglés).
ANTICUERPOSNEUTRÓFILOSHUMANOS
Los anticuerpos contra neutrófilos humanos (anti-HNA, por sus siglas en inglés) pueden ocasionar neutropenia y se han rela-
cionado con las TRALI.Las neutropenias autoinmunes se pueden desarrollar en pacientes con trastornos autoinmunes tales co-
mo síndrome de Felty, lupus eritematoso sistémico y tiroiditis de Hashimoto. La ausencia de anticuerpos anti-HNA estrecha el
diagnóstico diferencial a causas no inmunes tales como deficiencia en la médula ósea, mielodisplasia o procesos de infiltración
medular. La citometría de flujo puede detectar anticuerpos antineutrófilos y puede confirmar el origen de la neutropenia o las
TRALI.
ANTICUERPOSCONTRAPLAQUETASHUMANAS
Los anticuerpos contra plaquetas humanas (anti-HPA, por sus siglas en inglés) se detectan mediante ensayos directos o indi-
rectos de inmunoglobulinas asociadas con plaquetas basados en citometría de flujo. En la púrpura trombocitopénica autoin-
mune, no se encuentran con tanta frecuencia anticuerpos libres circulantes (en el suero) como los anticuerpos unidos a pla-
quetas. En los casos de formación de aloanticuerpos, los anticuerpos del suero se pueden detectar sin evidencia de anticuerpos
asociados con plaquetas.
RESOLUCIÓN
DE PROBLEMASEN ENSAYOSDE CITOMETRÍA
DE FLUJO
Cuando se desarrolla un método de citometría de flujo, se debe determinar primero el propósito final del ensayo. Para ensa-
yos con propósitos de investigación, puede ser difícil estandarizar las muestras de células, reactivos y protocolos. Los ensayos
destinados para diagnóstico de pacientes o para calificar un producto celular para su liberación antes de la administración a un
paciente requieren de una estandarización más estricta de ensayos y muestras. Los requisitos reglamentarios, el tipo y etapa de
investigación clínica y el propósito final del ensayo determinan el nivel de rigor requerido para el ensayo.
El desarrollo de ensayos por citometría de flujo debe incluir el establecimiento y calificación de los parámetros y límites de
tinción, manipulación, instrumental y análisis. Si se asume que el método ha sido desarrollado adecuadamente, que los opera-
dores están bien capacitados, que el instrumento se ha ajustado de manera adecuada, que se han aplicado los controles apro-
piados para el ensayo y el instrumental y, si fuera necesario, que se han llevado a cabo validaciones del instrumental y del mé-
todo, los operadores pueden toparse con instancias en las que será necesario resolver ciertas problemáticas.
Los desafíos más comunes de la citometría de flujo son la alta fluorescencia o fondo con dispersión lateral, tasas anormales
de eventos, alta intensidad de fluorescencia y baja señal de fluorescencia. A continuación se describen metodologías para dis-
minuir estos problemas.
Alto Contenido de Partículasde Fondo
la manipulación de células en exceso (p. ej., demasiado vórtice), la fijación inadecuada y la contaminación bacteriana de las
células pueden incrementar las partículas de fondo. Asimismo, si el umbral frontal del instrumento se configura demasiado ba-
jo, los desechos celulares se detectarán como eventos. La manipulación suave de las células, los reactivos frescos y la configura-
ción adecuada del instrumental ayudan a garantizar perfiles de dispersión lateral uniformes.
Alta Fluorescenciade Fondo
la alta intensidad de la fluorescencia se puede atribuir a una concentración de anticuerpos en exceso, al lavado inadecuado
de las células o al bloqueo inadecuado del receptor Fe. Además, una ganancia inapropiadamente alta del instrumento PMT
puede resultar en un fondo elevado. la concentración de anticuerpos y la densidad celular uniformes, el lavado y bloqueo ade-
cuados y la configuración apropiada del instrumento ayudarán a evitar una fluorescencia de fondo anormalmente elevada
TasaAlta de Eventos
las tasas anormalmente altas de eventos a menudo se atribuyen a densidades altas de células durante la tinción del anticuer-
po o en la muestra de células finales. El mezclado inadecuado y la sedimentación de la muestra de células puede resultar en
tasas altas de eventos celulares, al igual que el uso de ventanas inapropiadas o poco uniformes.
Tasa Baja de Eventos
La aglomeración celular, las densidades celulares finales bajas, los bloqueos en los fluidos del instrumento o el uso de venta-
nas inapropiadas pueden, generalmente, resultar en una detección anormalmente baja de eventos. La limpieza, el' manteni-
miento y la configuración adecuadas del instrumento, así como los protocolos de tinción uniformes, pueden lograr resultados
uniformes con sensibilidad suficiente.
Alta Intensidad de Fluorescencia

Al igual que con alta fluorescencia del fondo, una alta fluorescencia celular promedio puede resultar de una cantidad en ex-
ceso de anticuerpos marcados, del lavado de células inadecuado o poco uniforme o del bloqueo inadecuado. La inclusión de
detergente en la solución amortiguadora de lavado, especialmente durante la tinción intracelular, puede ayudar a prevenir la
unión no específica de anticuerpos.
Intensidad Débil de Fluorescencia
Son muchos los factores que pueden generar una fluorescencia con intensidad débil. los parámetros del instrumento tales
como alineación deficiente del láser, compensación inadecuada, configuración inapropiada, configuraciones de ganancia poco
uniformes y respuesta débil del láser, pueden afectar negativamente la intensidad de la fluorescencia. Además, las cuestiones
relacionadas con la fisiología celular o la preparación de reactivos, tales como concentración insuficiente de anticuerpos, antí-
geno blanco lábil o secretado, reactivos de baja calidad o almacenados inadecuadamente (lo que resulta en decaimiento del
fluorocromo) o antígeno blanco inaccesible, pueden resultar en una señal débil. El desarrollo adecuado de ensayos, el mante-
nimiento apropiado del instrumental y el cumplimiento con protocolos calificados pueden mejorar la intensidad de la señal de
fluorescencia.
La citometría de flujo permite a los investigadores analizar células para una gran cantidad de aplicaciones diversas. El núme-
ro y alcance de los ensayos inmunofenotípicos y funcionales está en aumento. Es posible estudiar la presencia de proteínas, así
como los procesos celulares y la detección de poblaciones poco comunes o anormales. El lector debe referirse a la literatura
técnica para obtener detalles sobre la aplicación y el método.
REFERENCIAS
Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM, Strober W. Current Protocolsin lmmunology. Fourth ed. Hoboken, NJ:
John Wiley and Sons; 1994.
Shapiro HM. Practica/FlowCytometry.Fourth ed. Hoboken, NJ; John Wiley and Sons; 2003.
USP42 InformaciónGeneral/ (1029) Guías de Documentación 7353
(1029) GUÍASDE BUENASPRÁCTICAS

DE DOCUMENTACIÓN
INTRODUCCIÓN
Propósito
La documentación puede considerarse como la base de todos los sistemas de calidad debido a que para todas las operacio-
nes y procedimientos es esencial contar con registros claros, completos y exactos. Este capítulo general provee guías sobre
buenas prácticas de documentación para las industrias reguladas por las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP, por sus siglas
en inglés) que se van a usar en la producción y control de productos farmacéuticos, ingredientes farmacéuticos activos (API,
por sus siglas en inglés), excipientes, suplementos dietéticos, ingredientes alimentarios y dispositivos médicos. Este capítulo
describe los principios subyacentes de la documentación apropiada para operaciones de Buenas Prácticas de Fabricación para
ayudar al usuario durante el desarrollo de actividades reguladas por las Buenas Prácticas de Fabricación. Estas guías deben ser
útiles para construir las bases de un sistema de calidad que asegurarán una documentación apropiada, así como la integridad y
control de registros.
Alcance
Este capítulo abarca distintos niveles y tipos de documentación, incluyendo registros en papel y electrónicos que compren-
den datos sin procesar, informes, protocolos y procedimientos relacionados con los controles de fabricación y datos analíticos.
El capítulo también incluye recomendaciones sobre la información que debe registrarse para diversos tipos de documentos de
Buenas Prácticas de Fabricación. Se deben desarrollar sistemas electrónicos para cumplir con las guías descritas en este capítu-
lo.
Este capítulo no provee información sobre todos los requisitos legales vigentes aplicables ni tampoco afecta los requisitos
vigentes aplicables basados en las reglamentaciones de las Buenas Prácticas de Fabricación.
PRINCIPIOSDE LA BUENADOCUMENTACIÓN
Todas las etapas relacionadas con la fabricación, análisis, envasado o retención de productos farmacéuticos, ingredientes far-
macéuticos activos, excipientes, suplementos dietéticos, ingredientes alimenticios y dispositivos médicos deben estar docu-
mentadas.
Los principios de la buena documentación para registros manuales o electrónicos incluyen lo siguiente, según corresponda:
• Los registros deben ser claros, concisos, exactos y legibles.
• Las entradas de datos deben registrarse de forma oportuna al llevar a cabo las acciones.
• No está permitido antedatar ni posfechar.
• Todas las correcciones a las entradas originales deben firmarse con iniciales y fecharse (o capturarse dentro de un registro
de auditoría electrónica), incluyendo una explicación para casos en los que la razón del cambio no sea obvia.
• Las entradas de datos deben ser rastreables a la persona que realizó la entrada.
• Se deben definir abreviaturas y acrónimos poco comunes.
• Se debe contar con controles para proteger la integridad de los registros.
• En caso de que la tinta pudiera difuminarse con el tiempo (p. ej., papel térmico), se puede usar una copia como verifica-
ción de su exactitud, la cual debe firmarse con iniciales y fecharse.
• Los libros de notas, hojas de datos y hojas de trabajo deben ser rastreables.
• Es necesario un sistema de documentación adecuado para asegurar la integridad y la disponibilidad de registros vigentes
y archivados.
• Los registros deben mantenerse de acuerdo con los requisitos reglamentarios y ser legibles durante el periodo de reten-
ción.
• Todas las páginas deben estar numeradas. Los documentos adjuntos (documentos de soporte) deben paginarse con refe-
rencia al documento madre.
RECOLECCIÓN
Y REGISTRODE DATOS
Los formatos para la recolección y el registro de datos incluyen, pero no se limitan a lo siguiente:
• Formularios en papel, hojas de datos y hojas de trabajo
• Libros de notas y registros
• Impresiones de instrumentos
• Datos electrónicos obtenidos con un sistema, tal como un sistema de datos electrónicos, sistema de gestión de informa-
ción del laboratorio (LIMS,por sus siglas en inglés) o libro de registros electrónicos de laboratorio (ELN, por sus siglas en
inglés)
7354 (1029) Guías de Documentación / Información General USP42
Todos los datos deben registrarse de forma permanente, directa y legible al momento de realizar la actividad. Si se trata de
un registro en papel, entonces debe registrarse con tinta indeleble. Todas las entradas de datos deben ser rastreables a la per-
sona y la fecha en que se realizó la entrada. Además, los registros electrónicos deben cumplir con los requisitos del Codeof
FederalRegulations,Title 21 (Códigode ReglamentosFederales,Título21) (21 CFR), Parte 11.
Cualquier cambio en una entrada debe hacerse de tal forma que aún se pueda leer la entrada original, con una explicación
para casos en los que la razón del cambio no sea obvia. Los cambios deben ser rastreables a la persona y la fecha en que se
realizó el cambio. Para claridad, se pueden usar códigos previamente definidos, por ejemplo, FE=fecha errónea.
Las páginas de los libros de registros y las hojas de trabajo deben usarse de forma consecutiva y la información debe regis-
trarse cronológicamente. Los registros de Buenas Prácticas de Fabricación, tales como registros de partida, métodos de prueba
y especificaciones deben recibir identificadores únicos y usar control de versión para los documentos.
Se deben completar todos los campos de las entradas de datos. Las porciones de una página que no se utilicen deben atra-
vesarse con una sola línea y/o "N/A" (no aplica). Si el registro se hace en un sistema electrónico y el sistema provee rastreabili-
dad a cada persona y fecha en que se realizan las entradas, el campo puede dejarse en blanco.
Los decimales menores a uno deben ser precedidos por un cero. Las reglas de redondeo y guías sobre cifras significativas se
describen en las Advertenciasy RequisitosGenerales,7.20 Reglaspara Redondeo.
Todas las fechas deben expresarse en un formato que indique claramente el día, el mes y el año.
Todos los registros de Buenas Prácticas de Fabricación para recolección de datos deben someterse a una revisión apropiada y
firma por parte de una segunda persona para confirmar la exactitud, cumplimiento y completud de las entradas. Pueden re-
querirse firmas adicionales dependiendo de los Procedimientos Operativos Estándar locales para distintos niveles de revisión (p.
ej., realizado por, verificado por, comprobado por, revisado por, aprobado por) como etapas de responsabilidad.
Se debe contar con un registro oficial de las firmas e iniciales para cada empleado o puede estar incluido dentro del docu-
mento. Se debe contar con controles para designar los requisitos de aprobación de firmas y la delegación de la autoridad para
firma, cuando así se requiera.
En caso de que se hayan preparado copias verificadas de datos sin procesar, la copia verificada puede sustituir a la fuente
original como datos sin procesar.
Todas las hojas de datos con múltiples páginas o impresiones de instrumentos en papel deben firmarse/marcarse con inicia-
les en la primera o última página con una nota que indique el número total de páginas. La primera página y todas las páginas
subsiguientes deben identificarse de forma única con respecto a la actividad que se está realizando, tal como la referencia al
libro de registros, el número de estudio o la referencia a la hoja de trabajo.
DIFERENTES
TIPOS DE DOCUMENTOSDE BUENASPRÁCTICASDE FABRICACIÓN
Los siguientes documentos, o similares, deben incluir, pero no limitarse a la siguiente información.
Registrosde Laboratorio
Los registros de laboratorio deben organizarse para asegurar que los registros sean concisos, claros, legibles y exactos, y de-
ben detallar lo siguiente:
• Descripción de materiales, tales como reactivos. Esta información por lo general incluye el nombre del material, fabricante
y número de lote, título o concentración, datos de caducidad, grado (si se conoce) y referencia al libro de registros del
laboratorio si se prepara en el laboratorio
• Identificación del equipo usado. Esta información por lo general incluye el nombre del equipo, número de control único y
fecha de caducidad de la calibración, según corresponda
• Procedimientos usados
• Mediciones
• Fórmulas y cálculos
• Resultados y conclusiones
DocumentaciónRelacionadacon el Equipo
Todo el equipo usado en la fabricación, análisis, envasado o retención de materias primas, componentes, ingredientes far-
macéuticos activos, producto terminado u otros artículos similares deben mantenerse y calificarse para el uso previsto. La do-
cumentación relacionada con el equipo incluye lo siguiente:
• Políticas y procedimientos para la operación y mantenimiento
• Uso de equipo
• Registros de mantenimiento
• Registros de calibración o calificación
• Identificación de los instrumentos
USP42 InformaciónGeneral/ (1029) Guías de Documentación 7355
Desviacionese Investigaciones
Todos los resultados aberrantes, anormalidades y excepciones relacionadas con la fabricación, análisis, envasado o retención
de una materia prima, componentes, ingredientes farmacéuticos activos, producto terminado u otros artículos similares deben
ser documentados. Una vez documentadas, las desviaciones deben evaluarse e investigarse, según corresponda. Se debe con-
tar con procedimientos para documentar, evaluar e investigar dichos eventos. La documentación de la investigación debe in-
cluir lo siguiente:
• Descripción del evento
• Investigación del origen
• Evaluación de las tendencias de datos
• Responsabilidades de las personas involucradas en las investigaciones o desviaciones
• Evaluación del impacto
• Acción Correctiva y Acción Preventiva (CAPA,por sus siglas en inglés) con cronograma
• Revisión y aprobación
Registrosde Partida
Se crea un Registro de Partida Maestro (MBR,por sus siglas en inglés) como modelo para la fabricación de un producto
específico. Se usa un Registro de Partida Firmado, basado en el Registro de Partida Maestro, para documentar las etapas y ma-
teriales involucrados en la producción de una partida específica de una materia prima, componente, ingrediente farmacéutico
activo, producto terminado u otro artículo similar. Por lo general, las siguientes secciones se incluyen en un Registro de Partida
y deben ser aprobadas por un representante apropiado del sitio de fabricación o del sitio de envasado:
• Información de encabezado (p. ej., nombre del producto, número de partida, sitio de fabricación)
• Unidad de operación (p. ej., mezclado, recubrimiento, llenado)
• Proceso de fabricación
- Pesos esperados (materias primas)
- Condiciones (tiempo, temperatura)
- Desviaciones e investigaciones
• Muestreo o análisis durante el proceso
• Otra información crítica, según corresponda
• Plan de muestreo para liberación, estabilidad y retención
Certificado de Análisis
El propósito del Certificado de Análisis (CoA o "C of A", por sus siglas en inglés) es informar resultados analíticos para una
partida específica de una materia prima, componente, ingrediente farmacéutico activo, producto terminado u otro artículo si-
milar. Por lo general, las siguientes secciones se incluyen en un Certificado de Análisisy deben ser aprobadas por un represen-
tante apropiado del sitio de análisis:
• Información del proveedor, distribuidor o fabricante (según corresponda)
• Información del producto (nombre y contenido)
• Resultados de la partida específica, con el nombre de la prueba, criterios de aceptación y resultados para cada prueba
• Declaración de cumplimiento o equivalente
• Referencia al procedimiento y documento de especificación
• Referencia a la fuente de datos
• Aprobación y fecha
• Fecha de caducidad e información de reanálisis
ProcedimientosOperativos Estándar
El propósito de un Procedimiento Operativo Estándar es proveer instrucciones al personal capacitado con respecto a un con-
junto dado de actividades. Los Procedimientos Operativos Estándar deben ser claros y concisos. Las siguientes secciones por lo
general se incluyen en un Procedimiento Operativo Estándar:
• Propósito y alcance
• Instrucciones y procedimiento
• Responsabilidades y tareas
• Materiales o equipo, según corresponda
• Definiciones o referencias, según se requiera
• Historial de revisión
7356 (1029) Guías de Documentación / Información General USP42
Protocolos e Informes
Muchas tareas y actividades se realizan basándose en un protocolo predefinido y aprobado previamente. Posteriormente, los
resultados de estas actividades se documentan en un informe final con conclusiones. Ejemplos de dichas actividades incluyen
lo siguiente:
• Calificación del equipo
• Validación o verificación del método analítico
• Validación del proceso de fabricación
• Transferencia del método analítico o de la tecnología de fabricación
• Validación de limpieza
• Estudio o análisis de estabilidad
• Estudio de comparabilidad
El protocolo y el informe por lo general deben incluir las siguientes secciones:
• Propósito
• Plan o instrucciones
• Criterios de aceptación predeterminados
• Desviaciones o investigaciones o una referencia a los mismos (para fines de informe únicamente)
• Estimación o Evaluación (para fines de informe únicamente)
• Referencia de datos (para fines de informe únicamente)
Procedimientos Analíticos
Los procedimientos analíticos proveen instrucciones a un operador sobre cómo realizar una prueba analítica dada. Por lo
general, el procedimiento analítico incluirá las siguientes secciones:
• Propósito
- Información de la prueba
- Información del producto
• Información de seguridad, si aplica
• Materiales y equipo
• Procedimiento, según corresponda
- Aptitud del sistema
- Preparación de soluciones y reactivos
- Preparación de estándares y muestras
- Parámetros de los instrumentos
- Cálculos e informe
• Revisióny aprobación con fechas de aprobación
Documentación sobre Capacitación
El personal debe estar capacitado para realizar las tareas asignadas. La capacitación debe documentarse y los registros de la
capacitación deben conservarse y ser de fácil acceso. En general, la documentación sobre capacitación debe incluir lo siguien-
te:
• Descripción de la capacitación que incluya el nombre de la capacitación, la versión y el modo (auto-capacitación o provis-
ta por instructor)
• Fecha de culminación
• Información sobre el instructor, según corresponda
Retención de Documentos
Se debe establecer una política adecuada para retención y archivo de registros para los registros mencionados previamente.
El periodo requerido depende de los requisitos reglamentarios o de los procedimientos de la compañía; sin embargo, debe ser
de al menos 1 año posterior a la fecha de caducidad de la partida.
USP42 Información General J (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 7357
(1030) CAPÍTULOSDE VALORACIONES

BIOLÓGICAS-INFORMACIÓN
GENERAL
Y GLOSARIO
El compendio USP-NFcontiene cuatro capítulos generales relacionados con el desarrollo, validación y análisis de valoracio-
nes biológicas: Diseñoy Análisisde Va/oraciones Biológicas(111 ), Diseñoy Desarrollode Va/oraciones Biológicas(1032), Validación
de Valoraciones Biológicas(1033) y Análisisde Valoraciones Biológicas(1034). Este nuevo capítulo propuesto, Capítulosde Valora-
cionesBiológicas-InformaciónGeneraly Glosario(1030), provee información general y algo de material común para los capítu-
los (1032), (1033) y (1034), e incluye un glosario de términos relacionados con valoraciones biológicas.
El conjunto de capítulos de la USPsobre valoraciones biológicas se enfoca en valoraciones de potencia relativa. Estas valora-
ciones reconocen la variabilidad inherente en los sistemas de pruebas biológicas (tanto en animales como en células) que se
puede observar entre laboratorios y de un día a otro, la cual compromete la confiabilidad de una medida absoluta de la poten-
cia. En las valoraciones de potencia relativa, la actividad biológica de un material de Prueba se compara con la actividad de un
Estándar en un sistema de valoración en el que el uso de un Estándar reduce la influencia de la variabilidad inherente del siste-
ma en la estimación de la potencia relativa. Las valoraciones de potencia relativa también se enfocan en la variabilidad impor-
tante relacionada con la respuesta debida a las diferencias entre los materiales de Prueba y Estándar (si existiese dicha diferen-
cia). Se espera que la Prueba se comporte como una dilución o concentración del Estándar y debe presentar la propiedad de
similitud.Aunque están destinados para las valoraciones biológicas de potencia relativa, los principios y prácticas desarrollados
en estos capítulos pueden tener una aplicación más amplia-por ejemplo, en inmunoensayos y valoraciones por unión de re-
ceptor-ligando usadas para determinar la potencia relativa.
El capítulo (1032) provee información para científicos que se encuentren desarrollando una nueva valoración biológica. Con-
forme a lo mostrado en la Tabla1, el capítulo abarca una variedad de actividades realizadas durante el ciclo de vida de la valo-
ración, con énfasis en el desarrollo que lleva a la validación, incluyendo la selección del sistema de prueba y las consideraciones
del diseño (p. ej., diseño de las placas (plate layout)). Asimismo, el capítulo trata estrategias de análisis de datos que deben
considerarse durante el desarrollo (antes de la validación) pero que, de rutina, no se tratan posteriormente. Entre dichas estra-
tegias está la selección de un esquema de ponderación, transformación de datos, si los hubiere, y la selección de un modelo
estadístico. Los detalles estadísticos que sustentan estas secciones del capítulo (1032) se encuentran en el capítulo (1034).
Tabla 1 . Secciones Prlnclpa 1es d e 1capítu
' 1o Diseñoy Desarro//o de Va/oracionesBio/'oqicas(1032)
Sección Título de la Sección
1 Introducción
1.1 Propósitoy Alcance
1.2 Partes Interesadas
2 Aptitud de las ValoracionesBiológicaspara el Propósito
2.1 Desarrollodel Proceso
2.2 Caracterizacióndel Proceso
2.3 Liberaciónde Productos
2.4 Productos Intermedios del Proceso
2.5 Estabilidad
2.6 Calificaciónde Reactivos
2.7 lnteqridad de los Productos
3 Aspectos Fundamentales de la ValoraciónBiológica
3.1 ValoracionesBiológicasIn Vivo
3.2 ValoracionesBiológicasEx Vivo
3.3 ValoracionesBiológicas(Basadasen Células)In Vitro
3.4 Estándar
4 Aspectos Estadísticosde los ElementosFundamentales de las ValoracionesBiológicas
4.1 Datos
4.2 Suposiciones
4.3 Heterogeneidad de la Varianza,Ponderación y Transformación
4.4 Normalidad
4.5 Linealidadde los Datos de Concentración-Respuesta
4.6 Modelos Comunes de ValoraciónBiolóqica
4.7 Análisisde Aptitud
4.8 ValoresAberrantes
4.9 EfectosFijosy Aleatoriosen Modelos de Respuestade ValoracionesBiológicas
5 Etapas del Proceso de Desarrollode la ValoraciónBiolóqica
7358 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas / Información General USP42
Tabla 1. Secciones Principales del capítulo Diseñoy Desarrollode ValoracionesBiológicas(1032) (Continuación)

5.1 Diseño: Planificaciónde la Valoración,Distribuciónen Bloquesy Aleatorización
5.2 Desarrollo
5.3 Análisisde Datos durante el Desarrollode la Valoración
5.4 Validaciónde la ValoraciónBiológica
5.5 Mantenimiento de ValoracionesBiológicas
El capítulo (1034) provee información sobre los análisis de datos apropiados para las valoraciones biológicas de potencia re-
lativa comunes, incluyendo modelos de líneas paralelas, de cociente de pendientes, de curvas paralelas y cuantales. El capítulo
incluye además análisis que sustentan la evaluación de la aptitud del sistema y de la muestra, y métodos para combinar resul-
tados de valoraciones independientes (ver la Tabla2). Este capítulo es el más avanzado estadísticamente de los tres capítulos,
pero está diseñado para su uso por parte de biólogos y estadísticos. El material conceptual requiere únicamente de experiencia
estadística mínima. Las secciones sobre métodos requieren una experiencia estadística al nivel del capítulo DatosAnalíticos-
Interpretacióny Tratamiento(101 O)y estar familiarizado con la regresión lineal.
Tabla 2. Secciones Prlnclpales del capítulo Análisisde ValoracionesBiológicas(1034)
1 Introducción
2 AspectosGenerales del Análisisde los Datos de la ValoraciónBiolóqica
3 Modelos de Análisis
3.1 Respuestasde ValoraciónCuantitativasy Cualitativas
3.2 Generalidadesde los Modelos para RespuestasCuantitativas
3.3 Modelos de LíneasParalelaspara RespuestasCuantitativas
3.4 Modelos No Linealespara RespuestasCuantitativas
3.5 Modelos de Concentración-Respuesta de Cociente de Pendientes
3.6 ValoracionesDicotómicas(Cuantales)
4 Intervalosde Confianza
4.1 Combinación de Resultadosde MúltiplesValoraciones
4.2 Combinación de ValoracionesIndependientes (Métodos para Intervalosde ConfianzaBasadosen Muestras)
4.3 Métodos Basadosen Modelos
5 Fuentes Adicionalesde Información
El propósito del capítulo (1033) es dar continuación a los capítulos (1032) (desarrollo de valoraciones) y (1034) (desarrollo
de planos para el análisis de datos). En otras palabras, el capítulo (1033) supone una valoración biológica completamente de-
sarrollada (incluyendo un plano para el análisis de datos y al menos valores tentativos para los criterios de aptitud del sistema y
de la muestra, y el formato de la valoración biológica) y provee pautas sobre la validación de dicha valoración. El capítulo trata
las características de validación pertinentes a las valoraciones biológicas de potencia relativa y provee mayores detalles sobre
los métodos estadísticos usados en la validación que el capítulo Validaciónde Procedimientos Farmacopeicos (1225). Aunque los
principios y prácticas desarrollados en el capítulo (1033) están destinados para las valoraciones biológicas de potencia relativa,
pueden tener una aplicación más amplia. El capítulo enfatiza las metodologías de validación que proveen flexibilidad para
adoptar nuevos métodos de valoración biológica, nuevos medicamentos biológicos, o ambos (ver la Tabla3).
Tabla 3. Secciones Principales del capítulo Validaciónde ValoracionesBiológicas(1033)
1 Introducción
2 Fundamentos de la Validaciónde la ValoraciónBiolóqica
2.1 Protocolo de Validaciónpara ValoracionesBiológicas
2.2 Documentación de los Resultadosde la Validaciónde la ValoraciónBiológica
2.3 Diseño de Validaciónpara ValoracionesBiolóqicas
2.4 Estrateqiasde Validaciónde las Característicasde Desempeño de la ValoraciónBiológica
2.5 Criteriosde Aceptación Propuestos para la Validación
2.6 Mantenimiento de la Valoración
2.7 ConsideracionesEstadísticas
3 Ejemplode Validaciónde una ValoraciónBiológica
3.1 PrecisiónIntermedia
3.2 Exactitud Relativa
3.3 Intervalo
USP42 InformaciónGeneral/ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 7359
Tabla 3 Secciones Principales del capítulo Validaciónde ValoracionesBiológicas(1033) (Continuación)

3.4 Uso de los Resultados de la Validación para Caracterizar una Valoración Biológica
3.5 Confirmación de la Precisión Intermedia y Revalidación
4 Fuentes Adicionales de Información
Apéndice Medidas de Localización y de Dispersión para Variables de Distribución Loqarítmica Normal
GLOSARIO
Este glosario corresponde a valoracionesbiológicasy provee una perspectivafarmacopeica que es congruente con el conjun-
to de capítulos sobre valoracionesbiológicasdel compendio U5P-NF;asimismo,se considera complementario al uso autoriza-
do previo y ofrece un enfoque útil para el contexto de las valoracionesbiológicas.En muchos casos, los términos aquí citados
son de uso común, aunque carezcan de documentación, o se definen en el capítulo Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos
(1225) y en la Pauta Q2(Rl) de la lnternational Conference on Harmonization(ConferenciaInternacionalsobre Armonización
o ICH),Validationof Analytical Procedures:Textand Methodology(Validaciónde ProcedimientosAnalíticos:Texto y Metodolo-
gía).' (Elcapítulo (1225) y la Pauta Q2(Rl) de la ICHconcuerdan en las definiciones.)Este Glosariopretende apegarse a estos
usos precedentes, y se proveen notas cuando exista alguna diferenciabasada en el contexto de la valoraciónbiológica. Las
definicionesdel capítulo (1225) y de la pauta Q2(Rl) de la ICHse identifican,por ejemplo, mediante"(l 225)" si se tomó tal
como se encuentra, o "adaptado del capítulo (1225)" si se realizóalguna modificaciónmenor para su aplicaciónen las valora-
ciones biológicas.La mayoría de las definicionesse acompañan con notas que proveen mayor detalle sobre el contexto de las
valoracionesbiológicas.
Lostérminos se organizan alfabéticamente dentro de cinco secciones por temas:
l. Términos generales relacionadoscon las valoracionesbiológicas
11.Términos relacionadoscon la realizaciónde una valoraciónbiológica
111.Términos relacionadoscon la precisióny la exactitud
IV.Términos relacionadoscon la validación
V.Términosrelacionadoscon el diseño y análisisestadístico
La Tabla4 presenta cada término y la sección del Glosarioen la que se puede encontrar.
Tabla 4. Términos listados en el Glosario
Término Sección Término Sección
Exactitud 111 Modelo de efectos mixtos V
Análisis de varianza (ANOVA) V Generación de modelos estadísticos V
Procedimiento analítico [adaptado de Q2(R1)] 1 Anidado V
Valoración 1 Fuera de la especificación (005, por sus siqlas en inqlés) 11
Conjunto de datos de la valoración 1 Paralelismo (de las curvas de concentración-respuesta) V
Valoración biológica 1 Parcialmente cruzado V
Valoración biológica 1 Estimación puntual V
Distribución en bloques V Potencia [Título 21 del CFR 600. 3(s)] 1
Diseño completo por bloques V Precisión 111
Intervalo de confianza V Determinaciones pseudo-repetidas V
Cruzado (y parcialmente cruzado) V Valor P (probabilidad de significancia) V
Diseño de experimentos (DOE, por sus siglas en inglés) Límite de cuantificación (límite inferior de cuantificación;
[ICH Q8(R2)] V adaptado del capítulo (1225)) IV
Linealidad de las diluciones (adaptado del capítulo (1225)) IV Efecto aleatorio V
Valoraciones biológicas directas 1 Error aleatorio 111
Prueba de equivalencia V Factor aleatorio V
Tipos de errores 111 Aleatorización V
Cuadrado medio esperado V Intervalo (adaptado del capítulo (1225)) IV
Diseño experimental V Sesqo relativo 111
Unidad experimental V Potencia relativa 1
Factor V Repetibilidad ((1225)) 111
Diseño factorial V Determinaciones repetidas V
Efecto fijo V Valor de informe 1
Factor fijo V Reproducibilidad (1225) 111
1
Disponible en: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/lCH_products/Guidelines/Qua1ity/Q2_R1/Step4/Q2_R1_Guideline.pdf. Consultada el 29 de mar-
zo de 2012.
Tabla 4. Términos listados en el Glosario (Continuación)

Término Secdón Término Secdón
Variabilidad del formato 111 Robustez (adaptado del capítulo (1225)) IV
Formato de la valoración biolóaica 11 Corrida 1
Diseño factorial fraccionado V Aptitud de la muestra 11
Diseño factorial completo V Probabilidad de sianificancia V
Modelo lineal qeneral V Preparaciones similares 1
Coeficiente geométrico de variación 111 Similitud (algebraica) 1
Desviación estándar geométrica (GSD, por sus siglas en in-
glés) 111 Especificidad (1225) 111
Diseño en bloques incompleto V Error estándar de estimación V
1ndependencia V Control estadístico del proceso V
Valoraciones biolóqicas indirectas 1 Aptitud del sistema 11
Interacción V Error sistemático 111
Precisión intermedia (adaptado del capítulo (1225)) 111 Determinaciones repetidas verdaderas V
Nivel V Sesqo por truncado 111
Linealidad de las diluciones (adaptado del capítulo (1225)) IV Error tipo 1 V
Distribución logarítmica normal V Error tipo 11 V
Límite inferior de cuantificación (adaptado del capítulo
(1225)) IV Validación de la valoración IV
Cuadrado medio V Análisis de los componentes de la varianza V
l. TérminosGeneralesRelacionadoscon lasValoracionesBiológicas
Procedimiento analítico [adaptado de Q2(Rl)]: Descripción detallada de las etapas necesarias para realizar el análisis.
[NOTAS-1. El procedimiento puede incluir, entre otros, la preparación de la muestra, el Estándar de Referencia y los reacti-
vos; el uso de equipo; la generación de la curva estándar; el uso de fórmulas para los cálculos; etcétera. 2. La Pauta de la FDA2
provee una lista de la información que, por lo general, se debe incluir en la descripción de un procedimiento analítico.]
Valoración: Procedimiento analítico para determinar la cantidad de uno o más componentes o la presencia o ausencia de
uno o más componentes.
[NOTAS-1. El término Valorara menudo se usa como verbo sinónimo de analizar o evaluar, tal como en "Voy a valorar (ana-
lizar, evaluar) la presencia de impurezas en el material". En este glosario, valoraciónes un sustantivo y es sinónimo de procedi-
miento analítico (q.v.). 2. La frase correr la valoraciónsignifica llevar a cabo el procedimiento analítico conforme a lo especifica-
do. 3. En la práctica común, valoracióny corrida (q.v.) a menudo se usan de manera intercambiable. Para propósitos de este
glosario, dichos términos son diferentes. Además, se puede consultar valoraciónbiológicay conjunto de datos de la valoración.]
Conjunto de datos de la valoración: Se refiere al conjunto de datos usado para determinar una potencia o potencia relativa
únicas para todas las muestras incluidas en la valoración biológica.
[NOTAS-1. La definición de un conjunto de datos de la valoración se puede interpretar, según sea necesario, como conjunto
mínimo. Puede ser posible determinar una potencia o potencia relativa a partir de un conjunto de datos, pero dicho proceso
podría no realizarse adecuadamente. Esta definición no pretende dar a entender que un conjunto de datos de la valoración es
el conjunto mínimo de datos que se pueden usar para determinar una potencia relativa. En la práctica, un conjunto de datos
de la valoración debe incluir, por lo menos, datos suficientes para evaluar la similitud (q.v.). También puede incluir datos sufi-
cientes para evaluar otras suposiciones. 2. Esta definición tampoco implica que los conjuntos de datos de la valoración usados
en conjunto para determinar un valor de informe (q.v.) sean necesariamente independientes el uno del otro, aunque podría
ser conveniente que lo fueran. Cuando.una corrida (q.v.) consta de múltiples conjuntos de datos de la valoración, se debe
evaluar la independencia de los conjuntos de la valoración dentro de la corrida.]
Biovaloración, valoración biológica (En inglés, los términos bioassay y biological assay se usan de manera
intercambiable): Análisis (como el de un fármaco) para cuantificar la actividad/actividades biológicas de uno o más compo-
nentes mediante la determinación de su capacidad para producir una actividad biológica esperada en un cultivo de células
vivas (in vitro) o en organismos de prueba (in vivo), la cual se expresa en términos de unidades.
[NOTAS-1. Los componentes de una valoración biológica incluyen el procedimiento analítico, el diseño estadístico para la
recolección de datos y el método de análisis estadístico que eventualmente genera la potencia estimada o la potencia relativa.
2. Las valoraciones biológicas pueden ser directas o indirectas.
Valoraciones biológicas directas-Valoraciones biológicas que miden la concentración de una sustancia requerida para
obtener una respuesta específica. Por ejemplo, la potencia de la digitalis se puede estimar directamente a partir de la con-
centración requerida para detener el corazón de un gato. En una valoración directa, la respuesta debe ser clara y sin ambi-
2 FDA Guidance for lndustry. AnalyticalProcedures and Methods Validationfor Drugs and Biologics,Guidance for lndustry. 2015. http://www.fda.gov/ucm/
groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm386366.pdf. Consultada el 20 de abril de 2016.
USP42 Información General/ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 7361
güedades. La sustancia se debe administrar de tal manera que se pueda medir y registrar fácilmente la cantidad exacta
(umbral de concentración) requerida para obtener una respuesta.
Valoracionesbiológicas indirectas-Valoraciones biológicas que comparan la magnitud de las respuestas para concen-
traciones nominalmente iguales de las preparaciones de referencia y de prueba en lugar de las concentraciones de refe-
rencia y de prueba que son necesarias para lograr una respuesta específica. La mayoría de las valoraciones biológicas en
los compendios USP-NFson valoraciones indirectas que se basan en respuestas cuantitativas o cuantales (sí/no).]
Potencia [Título21 del CFR600.3(s)]: Habilidad o capacidad específica del producto, según se indica mediante pruebas de
laboratorio apropiadas o mediante datos clínicos adecuadamente controlados y obtenidos a través de la administración del
producto de la manera prevista, para provocar un resultado determinado.
[NoTAS-1. A diferencia de una muestra potente, una muestra impotente no tiene capacidad para producir la respuesta es-
pecífica esperada. Las muestras equipotentes producen respuestas iguales con dosis iguales. Por lo regular, la potencia se mide
con respecto a un Estándar de Referencia o preparación a la que se le ha asignado un valor individual único (p. ej., 100,0) para
la valoración; ver potencia relativa. En ocasiones, se usan calificadores adicionales para indicar el estándar físico empleado (p.
ej., "unidades internacionales"). 2. Algunos productos biológicos tienen usos múltiples y valoraciones múltiples. Para tales pro-
ductos, pueden existir diferentes lotes de referencia que no presentan respuestas ordenadas uniformemente en toda una colec-
ción de distintas valoraciones pertinentes. 3. [Título 21 del CFR610.1 O] Las pruebas para potencia consistirán en pruebas in
vitro o in vivo, o ambas, que habrán sido específicamente diseñadas para cada producto para indicar su potencia de manera
adecuada a fin de satisfacer la interpretación de potencia provista por la definición del Título 21 del CFR 600.3(s).]
Potencia relativa: Medida que se obtiene a partir de la comparación de una Prueba con un Estándar, basándose en la capa-
cidad para producir la potencia esperada.
[NOTAS-1. Una perspectiva frecuentemente utilizada se centra en que la potencia relativa es el grado en el que se diluye o
concentra la preparación de Prueba con respecto al Estándar. 2. La potencia relativa no tiene unidad y se proporciona en la
definición de cualquier material de prueba, únicamente con respecto al material de referencia y a la valoración.]
Valorde informe: Valor que se comparará con un criterio de aceptación.
[NOTAS-1. El criterio de aceptación para la comparación puede encontrarse en la monografía USPo haber sido establecido
por la compañía, p. ej., para la liberación del producto. 2. El término valor de informe está inseparablemente vinculado con el
"uso previsto" de un procedimiento analítico. Las valoraciones se llevan a cabo en muestras para generar resultados que pue-
dan usarse para evaluar algún parámetro. Las valoraciones pueden tener diferentes formatos o valores sumarios para diversos
propósitos (p. ej., liberación del lote vs calibración de un nuevo estándar de referencia). Elvalor de informe probablemente
será diferente incluso si la mecánica misma de la prueba es idéntica. La validación es necesaria para sustentar las propiedades
de cada tipo de valor de informe. En la práctica, puede existir un documento físico, que es el procedimiento analítico usado
para más de una aplicación, aunque dicho documento debe incluir por separado información detallada de cada aplicación.
Alternativamente, pueden existir documentos distintos para cada aplicación. 3. Cuando la variabilidad inherente de una res-
puesta biológica, o la del logaritmo de la potencia, impide obtener con un solo conjunto de datos de la valoración un valor lo
suficientemente exacto y preciso como para cumplir con una especificación, el formato de la valoración puede cambiarse, se-
gún se requiera. El número de bloques o repeticiones completas requeridas depende de la exactitud y precisión inherentes de
la valoración y del uso previsto del valor de informe. Resulta práctico mejorar la precisión de un valor de informe al informar la
potencia media geométrica de múltiples valoraciones. El número de valoraciones usado se determina mediante la relación en-
tre la precisión requerida para el uso previsto y la precisión inherente del sistema de valoración.]
Corrida: Se refiere a la realización del procedimiento analítico con el que se espera obtener precisión y veracidad uniformes;
generalmente, es la valoración, es decir, el trabajo que puede llevar a cabo un solo analista en un tiempo establecido con un
conjunto determinado único de factores de valoración (p. ej., preparaciones estándar).
[NOTAS-1. La corrida no necesariamente está relacionada con el conjunto de datos de la valoracion (q.v.). El término corrida
es específico para laboratorio y se relaciona con la capacidad física y el ambiente del laboratorio para realizar el trabajo de una
valoración. Un ejemplo de corrida sería la valoración simultánea de varias muestras por parte de un analista en un día de traba-
jo práctico. Durante el transcurso de una sola corrida, puede ser posible determinar múltiples valores de informe. Por el contra-
rio, un solo valor de informe puede incluir datos de múltiples corridas. 2. Desde un punto de vista estadístico, una corrida es la
consecución de los factores asociados con la precisión intermedia (q.v.). Por tanto, la variabilidad dentro de la corrida es la
repetibilidad. Se considera una buena práctica asociar las corridas con factores que representen fuentes significativas de varia-
ción en la valoración. Por ejemplo, si un número de pasajes celulares es una fuente importante de variación en la respuesta
obtenida de la valoración, entonces cada cambio en el número de pasajes celulares dará inicio a una nueva corrida. Si la va-
rianza asociada con todos los factores que se pudieran asignar a las corridas fuera inapreciable, entonces se podría ignorar la
influencia de las corridas en el análisis y el análisis se podría enfocar en combinar conjuntos de datos de análisis independien-
tes. 3. Cuando una corrida incluye múltiples valoraciones, es necesario tomar precauciones con respecto a la independencia de
los resultados de las valoraciones. Los factores que por lo general se asocian a corridas y que pueden generar una falta de inde-
pendencia incluyen preparaciones celulares, grupos de animales, analista, día, una preparación de un material de referencia
común y análisis con otros datos de la misma corrida. Aunque se puede infringir un estricto sentido de independencia debido
a que los conjuntos de valoraciones dentro de una corrida comparten ciertos elementos, el grado en el que se compromete la
independencia puede tener una influencia insignificante sobre los valores de informe obtenidos, lo cual se debe verificar y mo-
nitorear.]
Preparaciones similares: Se refiere a la propiedad que indica que la Prueba y el Estándar contienen el mismo componente
efectivo, o los mismos componentes efectivos en proporciones fijas, y todos los demás componentes no tienen efecto en algún
contexto específico de la valoración.
[N0TAS-1. Contar con preparaciones similares a menudo se resume como la propiedad que indica que la Prueba se com-
porta como una dilución (o concentración) del Estándar. 2. Las preparaciones similares son fundamentales en los métodos para
la determinación de la potencia relativa. El uso de preparaciones similares permite calcular, informar e interpretar una potencia
relativa. Ante la ausencia de preparaciones similares, no se puede informar ni interpretar una potencia relativa significativa. 3.
La consecuencia práctica de preparaciones similares es la similitud algebraica (q.v.). 0fer también Paralelismo,secciónV.)]
Similitud (algebraica): Las curvas de concentración-respuesta de la Prueba y el Estándar se relacionan algebraicamente de
manera constante con preparaciones similares.
[N0TAS-1. Entre los ejemplos de similitud se incluyen el paralelismo (q.v.) de las curvas de concentración-respuesta y la
igualdad de las ordenadas al origen en los modelos de cociente de pendientes. 2. El no poder demostrar estadísticamente la
falta de similitud entre una Referencia y una Prueba no se considera una demostración de similitud. Resulta apropiado demos-
trar la similitud en un enfoque de equivalencia; ver los capítulos (1032) y (1034). 3. La similitud es por lo regular un criterio de
aptitud de la muestra (q.v.). No obstante, se debe tomar en cuenta que la aptitud es una condición necesaria, pero no sufi-
ciente, para que las preparaciones sean similares. En la práctica, ante el desconocimiento de las diferencias entre los materiales
de Prueba y Estándar, la demostración de similitud se acepta como la demostración de preparaciones similares.]
11.Términos Relacionadoscon la Realizaciónde una Valoración Biológica
Configuración de la valoración biológica (también conocido como formato de la valoración): Estrategia de replicación
dentro de la corrida y entre corridas para la replicación de los conjuntos de datos de la valoración que se han determinado por
análisis de varianza para sustentar el uso de las valoraciones biológicas.
[NOTAS-1. Las modificaciones al formato de la valoración biológica pueden ocurrir a medida que se dispone de nueva infor-
mación sobre las fuentes de variabilidad. Dichas modificaciones no incluyen cambios en el esquema de dilución de las mues-
tras de Prueba o del Estándar ni en la estrategia de replicación (parte de lo que en ocasiones se denomina configuración de la
valoración biológica). La configuración de la valoración puede incluir dimensiones anidadas tales como diseño de la placa,
múltiples placas por día, placas individuales en múltiples días, entre otros. 2. La potencia relativa geométrica media determina-
da a partir del formato de la valoración biológica es el valor de informe, el cual se puede usar para evaluar el cumplimiento con
las especificaciones o como un componente de análisis subsiguiente (p. ej., evaluación de la estabilidad).]
Fuera de la especificación (OOS, por sus siglas en inglés): Se refiere a la propiedad de un valor de informe que cae fuera
de su criterio de aceptación especificado.
[NOTA-El término fuera de la especificaciónno es una propiedad de la valoración biológica, sino de las muestras de Prueba.
El término se introduce en el capítulo (1033) junto con el establecimiento de los criterios de aceptación para la validación que
limitan el riesgo de producir resultados de prueba fuera de la especificación debido a las características de desempeño de la
valoración biológica.]
Aptitud de la muestra: Una muestra es apta (se puede usar en la estimación de potencia) si su curva de respuesta cumple
con los límites sobre propiedades críticas definidas en el procedimiento de la valoración.
[NOTA-Las propiedades de la curva de respuesta se deben considerar desde un punto de vista general, es decir, incluyendo
valores aberrantes y variabilidad. La más significativa de estas propiedades para las valoraciones biológicas es la similitud (q.v.)
con la curva de respuesta del estándar. Asimismo, todos los sistemas de valoración tienen límites para el intervalo de valores
sobre los que pueden informar. En el caso de muestras que no cumple con uno o más de los criterios de aptitud de la muestra
en una valoración biológica, no se debe usar la estimación de potencia obtenida de dichas muestras como un valor de informe
o como un contribuidor para un valor de informe. Para más información consultar también el término sesgopor truncado en
este Glosario,así como las secciones Aptitud de la Muestra e Intervalo en el capítulo general (1032).]
Aptitud del sistema: Un sistema de valoración es adecuado para su uso previsto si es capaz de proveer mediciones legítimas
conforme a lo definido en el protocolo de la valoración.
[NOTA-La aptitud del sistema se puede considerar como la evaluación de la posibilidad de que exista evidencia acerca de
un problema en el sistema de valoración. Un ejemplo serían controles positivos y negativos cuando los valores fuera de sus
intervalos normales sugieren qué sistema de valoración no trabaja adecuadamente.]
111.
Términos Relacionadoscon la Precisióny la Exactitud
Exactitud (1225): Expresión de la proximidad entre los resultados de prueba obtenidos por el procedimiento y el valor real.
[NOTAS-1. La ICH y la USP ofrecen la misma definición de exactitud. No obstante, la ISO específicamente considera que la
exactitud tiene dos componentes, el sesgo y la precisión. 3 Esto significa que, para lograr la exactitud conforme a ISO, una me-
dición debe estar dentro de la diana (tener poco sesgo) y ser precisa. Por el contrario, la pauta Q2(Rl) de la ICH indica que la
exactitud, en ocasiones, se denomina "veracidad", aunque no define dicho término. La ISO define veracidadcomo "la proximi-
3
ISO. Nom,a Internacional 5725-1. Accuracy (Trueness and Precision) of Measurement Methods and Results-Part 1: General Principies and Definitions. Geneva,
Switzerland; 1994.
dad de acuerdo entre el valor promedio obtenido a partir de una serie grande de resultados de prueba y un valor de referencia
aceptado" e indica que "la veracidad, por lo general, se expresa en términos de sesgo". La pauta Guidance on Bioanalytical
Method Validation del año 2001 de la FDA4 define el término exactituden términos de la "proximidad de los resultados de
prueba medios,obtenidos por el método, con el valor verdadero (concentración) del analito" (énfasis agregado) y es, por lo
tanto, uniforme con el uso de la ICH. Este glosario adopta el enfoque de USP/ICH.Por tanto, exactitudse define como el acuer-
do entre la media (o los resultados esperados) de una valoración y el valor verdadero, y emplea la frase exactoy precisopara
indicar un sesgo bajo (exacto) y una variabilidad baja (preciso). 2. Se recomienda tomar precauciones considerables durante la
lectura o uso del término exactitud.Además de la falta de uniformidad entre la USP/ICHy la ISO,el uso común también es
poco uniforme. 3. Para propósitos de validación de una valoración biológica, los términos exactitudy sesgohan sido reempla-
zados con exactitudrelativay sesgorelativo.]
Tipos de errores: Dos fuentes de incertidumbre que afectan los resultados de una valoración biológica son el error sistemáti-
co y el error aleatorio.
Un error sistemático es aquél que se presenta repetidamente con una magnitud similar y dirección uniforme. Éste intro-
duce un sesgo en la determinación. El diseño experimental efectivo, que incluye aleatorización y/o división en bloques,
puede reducir el error sistemático.
Un error aleatorio es aquél cuya magnitud y dirección varían sin un patrón. El error aleatorio es una variabilidad o incerti-
dumbre inherente de la determinación. La conversión de error sistemático a aleatorio, a través del diseño experimental o
la aleatorización, incrementa la robustez de una valoración biológica y permite un análisis comparativamente simple de
los datos de la valoración, aunque puede requerir un tamaño de muestra mayor.
Variabilidad del formato: Se refiere a la variabilidad prevista para un formato de valoración biológica particular.
Coeficiente geométrico de variación: Determinado como antilog( 5)-1, donde S es la desviación estándar determinada en
la escala logarítmica.
[NOTA-El coeficiente geométrico de variación a menudo se informa como un porcentaje (%GCV, por sus siglas en inglés).
Es importante no confundir el %GCV con el %CV. El %GCV es una medición de dispersión pertinente a los datos analizados en
la escala [Y= log(X)] transformada logarítmicamente, mientras que el %CV es una medición pertinente a los datos analizados
en la escala (X) original.]
Desviación estándar geométrica (GSD, por sus siglas en inglés): Se refiere a la variabilidad de los valores transformados en
logaritmos de una respuesta logarítmica normal expresada como porcentaje en la escala sin transformar. Se determina como
antilog(S), donde Ses la desviación estándar determinada en la escala logarítmica.
[NOTA-Por ejemplo, si la desviación estándar de la potencia logarítmica es 5 usando logaritmo en base 2, la GSD de la po-
tencia es 100 • 2 5.]
Precisión intermedia (adaptado del capítulo (1225)): Expresa la precisión dentro del laboratorio relacionada con los cam-
bios en las condiciones operativas.
[NOTAS-1. Los factores que contribuyen a la precisión intermedia implican cualquier aspecto que pudiera cambiar dentro
de un laboratorio dado y que podrían afectar la valoración, e incluyen días distintos, analistas distintos, equipo distinto, entre
otros. Por consiguiente, la precisión intermedia tiene un alcance "intermedio" entre los extremos de repetibilidad (dentro de la
valoración) y reproducibilidad (entre laboratorios). 2. Cualquier declaración de precisión intermedia debe identificar los facto-
res variables. Por ejemplo, "La precisión intermedia asociada con los cambios de equipo y operador es .... " 3. Asimismo, podría
ser valioso identificar por separado la precisión asociada con cada fuente (p. ej., precisión entre analistas). Esto puede formar
parte del desarrollo y la validación de la valoración cuando tiene algún valor identificar aquellos factores que contribuyen de
manera importante a la precisión intermedia. 4. Cuando se informa la precisión intermedia, en particular para fuentes indivi-
duales, los analistas deben tener cuidado de distinguir entre la varianza de la precisión intermedia y los componentes de dicha
varianza. La varianzade la precisión intermedia incluye la repetibilidad y, por lo tanto, debe ser necesariamente al menos tan
grande como la varianza de repetibilidad. Un componentede la varianza, p. ej., para el analista, también forma parte de la
varianza de la precisión intermedia para el analista, pero puede ser insignificante y quizás no requiera tener una magnitud ma-
yor que la varianza de repetibilidad.]
Precisión ((1225)): Medición del grado de concordancia entre los resultados de pruebas individuales cuando el procedimien-
to se aplica repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea.
[NOTAS-1. La precisión se puede considerar en tres niveles: repetibilidad (q.v.), precisión intermedia (q.v.) y reproducibili-
dad (q.v.). 2. La precisión se debe investigar usando muestras auténticas y homogéneas. No obstante, si no es posible obtener
una muestra homogénea, la precisión puede investigarse usando muestras con cantidades agregadas conocidas que simulen
una muestra o solución muestra verdaderas. 3. La precisión a menudo se expresa como la varianza, desviación estándar, coefi-
ciente de variación o coeficiente de variación geométrica.]
Sesgo relativo: Medición del grado de diferencia entre el valor esperado (o medio) y el valor verdadero, expresado como
porcentaje del valor verdadero.
Repetibilidad ((1225)): Se refiere a la expresión de la precisión dentro de un laboratorio en las mismas condiciones operati-
vas durante un intervalo corto de tiempo.
4
FDA.Guidance for lndustry. Bioanalytical Method Validation. May 2001. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnforrnation/
Guidances/UCM070107.pdf. Consultada el 7 de diciembre de 2011.
[NOTAS-1. La pauta ICH Q2A indica que la repetibilidad también recibe el nombre de precisión "intravaloración". En el con-
texto de la valoración biológica, el mejor término es intracorrida,mientras que un "intervalo corto de tiempo" se usa para
describir dentrode la corrida.2. La idea de un "intervalo corto de tiempo" puede ser problemática con las valoraciones biológi-
cas. Si una corrida toma varias semanas y consta de un solo conjunto de valoraciones, entonces no sería posible determinar la
precisión intracorrida. Alternativamente, si una corrida consta de dos conjuntos de datos de las valoraciones y se puede llevar a
cabo en un solo día, sería posible evaluar la repetibilidad de la determinación de la potencia relativa.]
Reproducibilidad (1225): Expresa la precisión entre laboratorios.
[NOTAS-1. La reproducibilidad incluye contribuciones derivadas de la repetibilidad y de todos los factores que contribuyen
a la precisión intermedia, así como cualquier contribución adicional de las diferencias entre laboratorios. 2. La reproducibilidad
se aplica a estudios en colaboración, tales como aquéllos realizados para estandarización o portabilidad de la metodología. De-
pendiendo del diseño del estudio en colaboración, puede ser posible describir por separado los componentes de la varianza
asociados con las fuentes de variabilidad intra y entre laboratorios.]
Especificidad (1225): Se refiere a la capacidad de evaluar de manera inequívoca el analito en presencia de aquellos compo-
nentes cuya presencia resulta previsible.
[NOTAS-1. Por lo general, estos componentes pueden incluir impurezas, productos de degradación, componentes de la
matriz, entre otros. Ver el capítulo (1225) para más información. 2. Esta definición también se relaciona con la selectividad en
otras pautas para métodos analíticos. 3. La especificidad puede significar la medición del analito específico de interés y no la
de otro analito similar.]
Sesgo por truncado: Se refiere al sesgo que ocurre cuando no se observa o registra alguna porción de la distribución de las
respuestas.
[NOTAS-1. Cuando existe sesgo por truncado, la distribución de observaciones registradas no se corresponde con la distri-
bución real de respuestas. 2. El sesgo por truncado puede ocurrir en una valoración biológica que no informa estimaciones de
potencia logarítmica fuera de un intervalo de potencia establecido. Por ejemplo, se espera que una muestra con una potencia
real en un límite de este intervalo no produzca (informe) una estimación de potencia en aproximadamente la mitad de las
valoraciones en las que aparece. En este ejemplo, la media de las potencias observadas estará sesgada hacia la potencia logarít-
mica O.]
IV. TérminosRelacionadoscon la Validación

Linealidad de las diluciones (adaptado del capítulo (1225)): Se refiere a la capacidad (dentro de un intervalo determina-
do) de una valoración biológica para obtener potencias relativas medidas que sean directamente proporcionales a la potencia
relativa verdadera de la muestra.
[NOTAS-1. Para determinar la linealidad de las diluciones, en ocasiones denominada linealidad analítica de la valoración bio-
lógica, a través de un intervalo conocido de valores de potencia relativa, los analistas examinan la relación entre la potencia
logarítmica conocida y la potencia logarítmica media observada. Si dicha relación genera una línea esencialmente recta con
una ordenada al origen de O y una pendiente de 1, la valoración tiene una proporcionalidad directa. Si la gráfica genera una
línea esencialmente recta pero la ordenada al origen no es O o la pendiente no es 1, la valoración tiene una respuesta lineal
proporcional. 2. Evaluar si una pendiente es (cercana a) 1,0 requiere una equivalencia o intervalo de indiferencia a priori. Resul-
ta inadecuado en la práctica estadística analizar la hipótesis nula que indica que la pendiente es 1,0 contra la alternativa que
indica que no es 1,0 y concluir que una pendiente es 1,0 si esto no se rechaza. La linealidad analítica de la valoración biológica
se separa de la consideración de la forma de la curva de concentración-respuesta. La linealidad de la concentración-respuesta
no es un requisito de la linealidad analítica de la valoración biológica debido a que ésta última es posible independientemente
de la forma de la curva de concentración-respuesta. 3. La linealidad de las diluciones se trata en mayor detalle en el capítulo
(1033).]
Límite de cuantificación (límite inferior de cuantificación; adaptado del capítulo (1225)): Se refiere a la potencia relativa
conocida más baja para la que la valoración tiene una precisión y exactitud adecuadas.
[NOTAS-1. Esto se aplica a los resultados de valoración (potencia logarítmica) en lugar del valor de informe. 2. No es común
determinar el límite de cuantificación para las valoraciones biológicas de potencia relativa. Las valoraciones realizadas en ani-
males con puntos finales de determinación serológicos son ejemplos de uso de este término.]
Intervalo (adaptado del capítulo (1225)): El intervalo entre las potencias relativas conocidas superior e inferior (incluyendo
aquellas potencias relativas) por el que se demuestra que la valoración biológica tiene un nivel adecuado de precisión, exacti-
tud y linealidad analítica.
[NOTA-Esto se aplica a valores de informe (típicamente una media geométrica) en lugar de los resultados individuales de la
valoración.]
Robustez (adaptado del capítulo (1225)): Se refiere a una medida de la capacidad de un procedimiento analítico para
mantenerse intacto ante variaciones pequeñas pero deliberadas en los parámetros del método listados en la documentación
del procedimiento.
[NOTAS-1. La robustez es una indicación de la confiabilidad de la valoración biológica durante el uso normal. Por ejemplo,
un sistema de valoración de cultivo celular que es robusto para el número de pasajes de células puede proveer valores de po-
tencia con exactitud y precisión aceptables en todo un intervalo uniforme de números de pasajes. 2. La norma Q2(Rl) de la
ICH indica que:
USP 42 InformaciónGeneralJ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 7365
La evaluación de robustez se debe considerar durante la fase de desarrollo y depende del tipo de procedimiento que se
está estudiando. Ésta debe mostrar la confiabilidad de un análisis con respecto a las variaciones deliberadas en los paráme-
tros del método. Si las mediciones son susceptibles a variaciones en condiciones analíticas, éstas últimas se deben contro-
lar adecuadamente o se debe incluir una declaración precautoria en el procedimiento. Una consecuencia de la evaluación
de la robustez deberá ser que se establezca una serie de parámetros [q.v.] de aptitud del sistema (p. ej., prueba de resolu-
ción) para asegurar que la validez del procedimiento analítico se mantiene cada vez que se usa. 1]
Validación de la valoración: Proceso mediante el cual se demuestra y documenta que las características de desempeño del
procedimiento y su método subyacente cumplen con los requisitos para la aplicación prevista y que la valoración es, por tanto,
adecuada para su uso previsto.
[NOTA-Las validaciones formales se realizan prospectivamente de acuerdo con un plan escrito que incluye criterios de acep-
tación justificables sobre los parámetros de validación. Ver el capítulo (1033).]
V. Términos Relacionados con el Diseño y Análisis Estadístico
Análisis de varianza (ANOVA): Herramienta estadística usada para evaluar la contribución de factores experimentales en la
variabilidad.
Distribución en bloques: Agrupación de unidades experimentales relacionadas en diseños experimentales.
[NOTAS-1. La distribución en bloques a menudo se usa para reducir la variabilidad relacionada con un factor que no es de
interés primario. 2. Los bloques pueden consistir, por ejemplo, en grupos de animales (una jaula, una camada o un cargamen-
to), placas individuales de 96 pocillos, secciones de placas de 96 pocillos o placas enteras de 96 pocilllos agrupadas por analis-
ta, día o partida de células. 3. El objetivo es aislar, mediante diseño y análisis estadístico, un efecto sistémico, por ejemplo una
jaula, de modo que no obstruya las comparaciones de interés.
En un diseño completo por bloques todos los niveles de un factor de tratamiento (en una valoración biológica, los facto-
res de tratamiento primario son la muestra y la concentración) se pueden aplicar a las unidades experimentales para dicho
factor dentro de un solo bloque. Se debe tomar en cuenta que los dos factores de tratamiento muestray concentración
pueden tener unidades experimentales diferentes. Por ejemplo, si a todos los animales dentro de una jaula se les asigna la
misma concentración, pero se les asignan muestras únicas, entonces la unidad experimental para concentración es la jaula
y la unidad experimental para la muestra es el animal; la jaula es un factor de división en bloque para la muestra.
En un diseño en bloques incompleto el número de niveles de un factor de tratamiento excede el número de unidades
experimentales para dicho factor dentro del bloque.]
Intervalo de confianza: Se refiere a un intervalo aleatorio producido por un método estadístico que contiene un valor para-
metral verdadero (fijo pero desconocido) con un nivel de confianza declarado en una aplicación repetida del método estadísti-
co.
[NOTA-Ver el capítulo (101 O) para más información.]
Cruzado (y parcialmente cruzado): Se dice que dos factores están cruzados (o completamente cruzados) si cada nivel de
cada factor aparece con cada nivel del otro factor. Dos factores están parcialmente cruzados cuando no están completamente
cruzados, pero múltiples niveles de un factor aparecen con un nivel común del otro factor.
[NOTAS-1. Por ejemplo, en una valoración biológica en la que todas las muestras aparecen en todas las diluciones, las
muestras y las diluciones están (completamente) cruzadas. En un experimento de validación de valoración biológica en el que
dos de cuatro analistas llevan cada uno a cabo valoraciones con el mismo conjunto de muestras durante cada uno de seis días
y se usa un par diferente de analistas en cada día, los analistas están parcialmente cruzados con los días. 2. Cada factor se
puede aplicar a diferentes unidades experimentales, y los factores pueden ser totalmente cruzados y anidados (q.v.), lo que
genera un diseño de unidad dividida o de gráfica dividida (q.v.). 3. Hay que prestar especial cuidado a los experimentos con
factores que están parcialmente cruzados para llevar a cabo análisis adecuados. 4. Un diseño en bloques completo aleatorizado
(q.v.) es un diseño en el que un factor de bloque (que a menudo se trata como un factor aleatorio) se cruza con el factor de
tratamiento (que a menudo se trata como un efecto fijo).]
Diseño de experimentos (DOE, por sus siglas en inglés) [ICH Q8(R2)]5: Método estructurado y organizado para determi-
nar la relación entre factores que afectan un proceso y el resultado de dicho proceso.
[NOTA-El DOE se usa en el desarrollo de valoraciones biológicas y en la validación; ver los capítulos (1032) y (1033).]
Prueba de equivalencia: Se refiere a una prueba para demostrar la equivalencia (p. ej., similitud o cumplimiento con los cri-
terios de aceptación de la validación) de dos cantidades mediante el cumplimiento de un criterio de aceptación para un inter-
valo.
[NOTAS-1. Una prueba de equivalencia difiere de las pruebas estadísticas más comunes en la naturaleza de las hipótesis es-
tadísticas. La mayoría de las pruebas estadísticas comunes son pruebas de diferencia-es decir, la hipótesis nula estadística es la
ausencia de diferencias y la alternativa es que existe alguna diferencia, sin importar la magnitud o la importancia de la misma.
La diferencia puede estar entre una característica de dos poblaciones o entre una característica de una sola población y un
valor aceptado. En el análisis de equivalencia, la hipótesis nula es que la diferencia no es lo suficientemente pequeña, y la hipó-
tesis alternativa es que la diferencia es lo suficientemente pequeña para que no exista diferencia importante. En una prueba de
5
ICH. Guidance Q8(R2) Phannaceutical Development. November 2009. Disponible en http://www.fda.gov/downloads/Drugs/
GuidanceComplianceRegulatorylnfonnation/Guidances/UCM073S07.pdf. Consultado el 27 de diciembre de 2011.
diferencia estadística común, se puede concluir que no existen pruebas suficientes para establecer el incumplimiento con un
criterio de aceptación. Éste puede ser el resultado de un exceso de variabilidad y/o un diseño inadecuado. En una prueba de
equivalencia, se concluye que los datos cumplen con el criterio de aceptación (p. ej., las pendientes son paralelas). 2. El proce-
dimiento de pruebas doblemente unilaterales (TOST,por sus siglas en inglés) es un procedimiento estadístico común usado
para las pruebas de equivalencia. 3. El criterio de aceptación para el intervalo puede ser unilateral o bilateral. Un ejemplo de
intervalo unilateral es un criterio de aceptación de validación para una %GCV de no más de XX%.]
Cuadrado medio esperado: Expresión matemática de las varianzas estimadas mediante un ANOVAde cuadrados medios.
Diseño experimental: Se refiere a la estructura de asignación de tratamientos a unidades experimentales.
[NOTAS-1. La distribución en bloques (q.v.), la aleatorización (q.v.), la replicación (q.v.) y la selección específica del diseño
(ver el capítulo (1032)) son algunos aspectos del diseño experimental. 2. Los componentes importantes del diseño experimen-
tal incluyen el número de muestras, el número de concentraciones y la forma en que se asignan las muestras y concentracio-
nes a unidades experimentales y su agrupación en bloques. 3. El diseño experimental influye en la selección de la metodología
estadística que se debe usar para lograr el objetivo analítico.]
Unidad experimental: Se refiere a la unidad más pequeña a la que se asigna aleatoriamente un nivel de tratamiento distinto.
[NOTAS-1. La asignación aleatoria de los factores de tratamiento a unidades experimentales es esencial en las valoraciones
biológicas. 2. Los factores de tratamiento diferentes se pueden aplicar a unidades experimentales distintas. Por ejemplo, las
muestras se pueden asignar a las filas en una placa de 96 pocillos, y las diluciones se pueden asignar a las columnas de la
placa. En este caso, las hileras son las unidades experimentales para las muestras, las columnas son las unidades experimentales
para las concentraciones y los pocillos son las unidades experimentales para la interacción entre muestra y concentración. 3.
Una unidad experimental debe distinguirse de una unidad de muestreo, en cuya unidad más pequeña se registra una medi-
ción distinta (p. ej., un pocillo). Debido a que la unidad de muestreo es a menudo más pequeña que la unidad experimental,
tratar unidades de muestreo como si fueran unidades experimentales es un error fácil de cometer. Este error se denomina
pseudo-replicación (q.v.).]
Factor: Parámetro de la valoración o elemento operativo que puede afectar la respuesta de la misma y que varía en un expe-
rimento y entre experimentos.
[NOTA-En una valoración biológica, habrá por lo menos dos factores de tratamiento: muestra y concentración.
Un factor fijo (efecto fijo) es un factor que se controla y establece deliberadamente a niveles específicos en una valora-
ción biológica. Se realiza inferencia en los niveles usados en el experimento o en los niveles intermedios. En una valora-
ción biológica, la muestra y la concentración son ejemplos de factores fijos.
Un factor aleatorio (efecto aleatorio) es aquél que por lo general no puede ser controlado y cuyos niveles representan
una demostración de las formas en que dicho factor puede variar. En una valoración biológica, los organismos de prueba,
la placa y el día a menudo se consideran factores aleatorios. Tratar un factor como aleatorio o fijo dependerá del experi-
mento y de las preguntas formuladas.]
Diseño factorial: Se refiere al diseño experimental en el que se encuentran múltiples factores, los cuales están parcial o total-
mente cruzados.
En un diseño factorial completo, cada nivel de un factor se presenta con cada combinación de niveles de todos los de-
más factores. Por ejemplo, si los factores son la partida de reactivo y el tiempo de incubación, para un diseño factorial
completo, se deben incluir todas las combinaciones de tiempo de incubación y partida de reactivo.
Un diseño factorial fraccionado es un diseño reducido en el que cada nivel de un factor aparece únicamente con un
subconjunto de combinaciones de niveles de todos los demás factores, y algunos efectos de factores (efectos y/o interac-
ciones principales) se confunden deliberadamente con otras combinaciones de efectos de factores. Se debe prestar espe-
cial cuidado al considerar los diseños factoriales fraccionados para propósitos de detección y optimización. Se considera
que este diseño no presenta riesgos de perder información para la validación.
Modelo lineal general: Modelo estadístico lineal que relaciona factores de estudio, que pueden ser continuos o discretos,
con respuestas experimentales.
Independencia: Para que dos mediciones u observaciones A y B (datos brutos, conjuntos de valoraciones o potencias relati-
vas) sean independientes, los valores de A no deben verse afectados por las respuestas de By viceversa.
[NOTA-Una consecuencia de no reconocer la falta de independencia es la caracterización deficiente de la varianza. En la
práctica, esto significa que si dos mediciones de potencia o de potencia relativa comparten un factor común que podría in-
fluenciar el resultado de la valoración (p. ej., un analista, preparación celular, incubadora, grupo de animales o alícuota de
muestras estándar) entonces la suposición inicial correcta es que estas mediciones de potencia relativa no son independientes.
Lo mismo sucede con la falta de independencia cuando se estiman en conjunto dos mediciones de potencia o de potencia
relativa a partir del mismo modelo, o si se relacionan de alguna manera sin incluir en el modelo algún término que capture el
hecho de que hay dos o más mediciones de potencia. A medida que se gana experiencia en las valoraciones, se puede estable-
cer (y monitorear) un fundamento empírico razonable para tratar las mediciones de potencia como independientes incluso si
comparten un nivel común de un factor. Este es el caso cuando se ha demostrado que un factor prácticamente no tiene efecto
significativo en los resultados a largo plazo de la valoración biológica.]
Interacción: Se dice que dos factores interactúan cuando la respuesta de un factor depende del nivel del otro.
Nivel: Se refiere a la ubicación en la escala de medición de un factor.
[NOTAS-1. Los factores tienen dos o más niveles distintos. Por ejemplo, si un experimento de validación de valoración bioló-
gica emplea tres valores de tiempo de incubación y dos partidas de un reactivo clave, los niveles son las tres veces para el
factor tiempode incubacióny las dos partidas para el factor partida.2. Los niveles de un factor en una valoración biológica
pueden ser cuantitativos, tales como concentración, o categóricos, tales como muestra (es decir, de prueba y de referencia).]
Distribución logarítmica normal: Distribución de valores (respuestas o potencias de la valoración) en las que los logaritmos
de los valores tienen una distribución normal.
[NOTAS-1. La mayoría de las mediciones en la valoración biológica de potencia relativa presentan una distribución logarít-
mica normal. 2. La distribución logarítmica normal es una distribución sesgada que se caracteriza por un incremento en la va-
riabilidad con un aumento en el nivel de respuesta.]
Cuadrado medio: Cálculo dentro del ANOVAque representa la variabilidad asociada con un factor experimental.
Modelo de efectos mixtos: Modelo estadístico que incluye efectos fijos y aleatorios.
Generación de modelos estadísticos: Especificación matemática de la relación entre ingresos (Xs) y salidas (Ys) de un proce-
so, p. ej., la relación concentración-respuesta en la valoración biológica o la generación de un modelo de los efectos de fuen-
tes importantes de variación en la medición de potencia.
[NOTAS-1. La generación de modelos incluye métodos para capturar la dependencia que tiene la respuesta de las muestras,
la concentración, unidades experimentales y los grupos o distribución de factores en bloques en la configuración de la valora-
ción. 2. La generación de modelo para datos de la valoración biológica requiere tomar una gran cantidad de decisiones, algu-
nas de las cuales se basan en el diseño de la valoración y en los datos. Para datos continuos, se puede seleccionar entre mode-
los lineales o no lineales. Para datos discretos, se puede seleccionar entre modelos logit/log dentro de una familia más grande
de modelos lineales generalizados. Existe literatura enfocada en la limitación de valoraciones con diluciones en la que se aboga
por los modelos de Poisson y los modelos de binomios en cadena de Markov. Para los datos de la valoración biológica, se pue-
den usar modelos de efectos fijos o modelos de efectos mixtos. Por un lado, existe una mayor disponibilidad de software para
modelos de efectos fijos cuya configuración es menos exigente para los estadísticos. Por otra parte, los modelos mixtos tienen
algunas ventajas sobre los fijos: se acomodan más a los datos faltantes y, lo más importante, pueden permitir que cada bloque
tenga distintas pendientes, asíntotas, concentraciones medias efectivas, requeridas para inducir un efecto del 50% (EC50 ) o po-
tencias relativas. En particular, cuando el analista emplea modelos de líneas rectas ajustados a respuestas no lineales o en siste-
mas de valoración en los que la curva de concentración-respuesta varía entre bloques, el modelo mixto captura el comporta-
miento del sistema de valoración de manera más realista e interpretable. 3. Resulta esencial que cualquier metodología para la
generación de modelo para datos de la valoración biológica utilice todos los datos disponibles de manera simultánea para esti-
mar la variación (o, en un modelo mixto, cada una de varias fuentes de variación). Puede ser necesario transformar las observa-
ciones antes de generar el modelo; incluir un modelo de varianza; o ajustar un modelo de medias (en el que existe un efecto
previsto para cada combinación de muestra y concentración) para obtener estimaciones combinadas de variación.]
Anidado: Se dice que un factor A está anidado dentro de otro factor 8 si los niveles de A son diferentes para cada nivel de 8.
[NOTAS-1. Por ejemplo, en un experimento de validación de valoración biológica, dos analistas pueden cada uno llevar a
cabo valoraciones en cinco días. Si los días naturales para el primer analista son distintos de los del segundo analista, los días
están anidados dentro del analista. 2. Los factores anidados tienen una relación jerárquica. 3. Para que dos factores estén ani-
dados, deben cumplir con lo siguiente: a) aplicarse a unidades experimentales de diferentes tamaños; b) la unidad experimen-
tal más grande contiene más de una de las unidades experimentales más pequeñas; y c) el factor aplicado a la unidad experi-
mental más pequeña no está totalmente cruzado (q.v.) con el factor aplicado a la unidad experimental más grande. Cuando se
cumplen las condiciones (a) y (b), y los factores están parcialmente cruzados, entonces el experimento está parcialmente cru-
zado y parcialmente anidado. Hay que prestar especial cuidado a los experimentos con esta estructura para llevar a cabo análi-
sis adecuados.]
Paralelismo (de las curvas de concentración-respuesta): Calidad en la que las curvas de concentración-respuesta de la
muestra de Prueba y del Estándar de Referencia son idénticas en forma y presentan únicamente una diferencia horizontal que
es una función constante de la potencia relativa.
[NOTAS-1. Cuando las preparaciones de Prueba y de Referencia son similares (q.v.) y las respuestas de la valoración se grafi-
can en función de los logaritmos de las concentraciones, la curva resultante para la preparación de Prueba será la misma que
para el Estándar pero desviada horizontalmente por una cantidad que es el logaritmo de la potencia relativa. Debido a esta
relación, la similitud (q.v.) a menudo se equipara con paralelismo,pero son conceptos distintos. Ver la sección 3.5, Modelosde
Concentración-Respuesta de Cocientede Pendientes,del capítulo (1034), en los que las muestras con relaciones similares de con-
centración-respuesta tienen una ordenada al origen común (o casi común) pero pueden diferir en sus pendientes. 2. En la
práctica, no es posible demostrar que las formas de dos curvas sean idénticas. En lugar de esto, las dos curvas demuestran
tener una forma algebraica los suficientemente similar (equivalente). Se debe tomar en cuenta que similardebe interpretarse
como "se cuenta con evidencia de que las dos curvas son lo suficientemente cercanas en forma" en lugar de "no se cuenta
con evidencia de que las dos curvas sean diferentes en forma". 3. La evaluación de paralelismo depende del tipo de función
usada para ajustar la curva de respuesta. El paralelismo para una valoración no lineal que usa un ajuste logístico de cuatro pará-
metros significa que (a) las pendientes de las curvas de la Prueba y del Estándar de Referencia que cambian rápidamente (es
decir, la pendiente de la tangente con la curva, donde la primera derivada es un máximo) deben ser similares; y (b) las asínto-
tas superior e inferior de las curvas de la respuesta (mesetas) deben ser similares. Para análisis de líneas rectas, las pendientes
de las líneas deben ser similares.]
Estimación puntual: Estimación de un valor individual obtenida a partir de cálculos estadísticos.
7368 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas / InformaciónGeneral USP42
[NOTAS-1. Los ejemplos son el sesgo relativo promedio, la %CVG y la potencia relativa. 2. La estimación puntual puede ser
más relevante con una estimaciónde intervalo (intervalo de confianza; q.v.) que emplea un intervalo para expresar la incerti-
dumbre en la determinación de la estimación puntual.]
Determinacionespseudo-repetidas: Se refiere a la identificación incorrecta de muestras obtenidas a partir de unidades ex-
perimentales como independientes y, por tanto, como determinaciones repetidas verdaderas cuando en realidad no son inde-
pendientes.
[NOTAS-Lasdeterminaciones pseudo-repetidas resultan en inferencias erróneas debido a la asignación incorrecta de variabi-
lidad y a la aparición de un número de determinaciones repetidas aparentemente mayor al real. 2. El no reconocer las determi-
naciones pseudo-repetidas es peligroso puesto que se trata de un error fácil de cometer y sus consecuencias pueden ser serias.
Por ejemplo, las determinaciones pseudo-repetidas comúnmente surgen cuando los analistas realizan una serie de diluciones
para cada muestra en tubos (la serie de diluciones se puede realizar mediante diluciones en serie, mediante diluciones de un
solo punto o mediante cualquier esquema de dilución conveniente). Posteriormente, el analista transfiere cada dilución de ca-
da muestra a varios pocillos en una o más placas de valoración. Por consiguiente, los pocillos son determinaciones pseudo-
repetidas puesto que son simplemente alícuotas de un solo proceso de dilución y por tanto no representan preparaciones in-
dependientes. 3. Una manera simple para analizar datos obtenidos de determinaciones pseudo-repetidas es promediar las de-
terminaciones pseudo-repetidas (si se usa una transformación de los datos observados, ésta debe aplicarse antes de promediar
las determinaciones pseudo-repetidas) antes de ajustar cualquier tipo de modelo de concentración-respuesta. En muchos siste-
mas de valoración, promediar determinaciones pseudo-repetidas dejaría a la valoración sin ninguna determinación repetida.
Una forma más compleja de usar los datos que contienen determinaciones pseudo-repetidas consiste en emplear un modelo
mixto que trate las determinaciones pseudo-repetidas como un efecto aleatorio distinto. Aunque el valor de las determinacio-
nes pseudo-repetidas es generalmente limitado, pueden ser útiles cuando se cumplen dos condiciones: (a) la variación de las
determinaciones pseudo-repetidas (es decir, entre pocillos) es muy grande en comparación con la variación asociada con las
determinaciones repetidas y (b) el costo de las determinaciones pseudo-repetidas es mucho menor que el costo de las unida-
des experimentales repetidas.]
ValorP (probabilidadde significancia): Se refiere a la probabilidad de observar, en ensayos repetidos, que el resultado ex-
perimental es tan o más extremo que el observado si la hipótesis nula fuera verdadera.
[NOTAS-1. Más extremosignifica más lejano a la hipótesis nula. 2. Comúnmente, P< 0,05 se considera un umbral para indi-
car las diferencias estadísticamente significativas, aunque se puede usar cualquier valor para el umbral. Las bases para seleccio-
nar el umbral son los riesgos (costos) de tomar decisiones erróneas; ver error tipo/ y error tipo//.]
Aleatorización: Proceso de asignación para tratamiento de unidades experimentales basado en la probabilidad de que todos
los subgrupos de unidades de igual tamaño tengan la misma probabilidad de recibir un tratamiento determinado.
[NOTAS-1. El mecanismo de probabilidad puede ser un proceso físico sin sesgo (tirar dados sin sesgo, lanzar una moneda,
sacar de una urna bien revuelta), tablas de números aleatorios o números aleatorizados generados por computadora. Se debe
tener cuidado con la selección y uso del método. Resulta una buena práctica utilizar un generador de números aleatorios com-
putarizado validado. 2. El uso de aleatorización puede ayudar a prevenir que el error sistemático se asocie con muestras parti-
culares o con un patrón de dilución y que ocasione sesgo. Por ejemplo, en valoraciones biológicas de 96 pocillos, los efectos
de la placa pueden ser importantes y ocasionar sesgo en respuestas observadas o medidas sumarias. En estudios con animales,
son varios los factores relacionados con animales individuales que pueden influenciar las respuestas. Si no se demuestra de ma-
nera rutinaria que los factores extraños que influencian los estudios que usan placas o los estudios que usan animales han sido
eliminados o minimizados hasta un grado que los convierta en insignificantes, la aleatorización será esencial para obtener da-
tos sin sesgo requeridos para el cálculo de la potencia verdadera. 3. La aleatorización es una buena práctica incluso cuando
existen pruebas de que factores operativos (p. ej., ubicación, tiempo, lote de reactivo) tienen un efecto menor o nulo sobre el
sistema de valoración. Aunque la aleatorización puede no proteger una valoración individual (o quizás un bloque de una valo-
ración) de un factor operativo (quizás recientemente) importante, la aleatorización provee la seguridad de que los resultados
de un conjunto de valoraciones no presentan sesgo debido a factores operativos.]
Determinacionesrepetidas: Se refiere al proceso en el que múltiples unidades experimentales independientes reciben el
mismo nivel de un factor de tratamiento.
[NOTAS-1. El propósito de las determinaciones repetidas es minimizar los efectos de fuentes de variabilidad aleatoria incon-
trolables. 2. Las determinaciones repetidas pueden ocurrir completamente en bloques aleatorios o en todos los bloques. Por lo
general, las determinaciones repetidas dentro de bloques se denominan pseudo-replicación (q.v.). 3. La determinación repeti-
da de factores que contribuyen en mayor medida a la variabilidad, o factores que están en los niveles más altos en un diseño
anidado, por lo general generan la reducción más efectiva de variabilidad aleatoria.]
Determinacionesrepetidas verdaderas: Se refiere a las muestras basadas en unidades experimentales independientes.
Errorestándar de estimación: Se refiere a una medición de la incertidumbre de una estimación de un valor de informe u
otro parámetro debida a la variación del muestreo
[NOTAS-1. En las valoraciones biológicas, el enfoque se centra en la precisión (error estándar) de la potencia relativa. 2. Los
errores estándar se pueden minimizar con determinaciones repetidas adicionales. 3. Técnicamente, el error estándar de una
estimación es la desviación estándar de la distribución de muestreo de la estimación. El término error estándarse usa para dis-
tinguir entre este uso de desviación estándar (que depende del tamaño de la muestra) y el uso común en el laboratorio en el
que la desviación estándar (o coeficiente de variación) se usa para caracterizar la precisión de mediciones individuales obteni-
das de un procedimiento. Esta última precisión no depende del tamaño de la muestra.]
USP42 InformaciónGeneral/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 7369
Control estadístico del proceso: Conjunto de métodos estadísticos empleados para monitorear desviaciones y tendencias
en un proceso.
Errortipo 1: Se refiere al error cometido en la prueba de hipótesis estadística, en la cual se acepta la hipótesis alternativa
cuando ésta es falsa.
[NOTA-La probabilidad de un error tipo I por lo general se indica mediante a.]
Errortipo 11: Se refiere al error cometido en la prueba de hipótesis estadística, en la cual se rechaza la hipótesis alternativa
cuando ésta es verdadera.
[NOTA-La probabilidad de un error tipo II por lo general se indica mediante /J.]
Análisis de los componentes de la varianza: Análisis estadístico que separa las contribuciones a la variabilidad total de los
componentes asociados con los factores que influyen en la valoración tales como el analista, el día o el instrumento.
(1031) BIOCOMPATIBILIDADDE LOS MATERIALES

USADOSEN
ENVASES DE MEDICAMENTOS,DISPOSITIVOSMÉDICOSE IMPLANTES
Este capítulo proporciona pautas para la identificación y realización de los procedimientos para evaluar la biocompatibilidad
de los envases de medicamentos, cierres elastoméricos, dispositivos médicos e implantes. La biocompatibilidad se refiere a la
tendencia de estos productos a mantenerse biológicamente inertes durante todo su período de contacto con el organismo.
Los procedimientos de prueba de biocompatibilidad nombrados en este capítulo están diseñados para detectar las característi-
cas no específicas de reactividad biológica, físicas o químicas de los productos médicos o de los materiales usados en su cons-
trucción. Junto con las pruebas químicas, estos procedimientos biológicos se pueden usar para detectar e identificar la toxici-
dad inherente o adquirida de los productos médicos antes o durante su fabricación y procesamiento.
En los siguientes capítulos generales se hace referencia a los procedimientos de prueba preclínicos para evaluar la seguridad
de los elastómeros, plásticos u otros polímeros usados en la elaboración de productos médicos: MedicamentosInyectablesy en
Implantes(1 ), Pruebasde ReactividadBiológica,In Vitro (87), Pruebasde ReactividadBiológica,In Vivo(88), DispositivosMédicos-
Pruebasde EndotoxinasBacterianasy Pirógenos(161 ), TaponesElastoméricos para Inyectables(381 ), Sistemasde EnvasesPlásticos
y sus Materialesde Construcción(661 ), MaterialesPlásticosde Construcción(661.1) y Sistemasde EnvasesPlásticospara UsoFar-
macéutico(661.2). Los procedimientos de prueba in vitro e in vivo específicos para evaluar la biocompatibilidad de productos
médicos en pacientes se describen en (87) y en (88).
Los procedimientos para evaluar la biocompatibilidad de un producto médico o de los materiales empleados en su elabora-
ción se han categorizado como un panel de efectos biológicos (procedimientos de toxicidad): citotoxicidad, sensibilización,
irritación o reactividad intracutánea, toxicidad sistémica aguda, toxicidad subcrónica (repetida), genotoxicidad, implantación,
hemocompatibilidad, toxicidad crónica (duración de más de 10% de la expectativa de vida del animal de prueba o mayor de
90 días), carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo y biodegradación. 1 En la Tabla 1 se indican los capítulos
generales de la USP referentes a los procedimientos de toxicidad para estas categorías. Además, la pirogenicidad, un tema de
toxicidad especial, se evalúa en Pruebade Pirógenos(151) y en Pruebade EndotoxinasBacterianas(85). Actualmente no existen
capítulos generales que detallen los requisitos 2 de las pruebas de toxicidad subcrónica, genotoxicidad, toxicidad crónica, carci-
nogenicidad, hemotoxicidad, toxicidad reproductiva o biodegradación.
Tabla 1. Procedimientos de Determinación de Toxicidad en los Capítulos Generales de la USP
Efecto Biológico Capítulo General de la USP
Citotoxicidad Pruebasde ReactividadBiológica,In Vitro (87)*
Sensibilización Pruebasde Sensibilización(1184)
Irritación o reactividad intracutánea Pruebasde ReactividadBiolóqica,In Vivo(88)t
Toxicidad sistémica (toxicidad aguda) Pruebasde ReactividadBiológica,In Vivo(88)
Implantación Pruebasde ReactividadBio/óqica,In Vivo(88)
• Los capítulos generales adicionales que se refieren a este efecto biológico incluyen (161 ), (381), (661 ), (661. l) y (661.2).
t Los capítulos generales adicionales que se refieren a este efecto biológico incluyen (1 ), (161), (381 ), (661), (661.1) y (661.2).
ENVASESDE MEDICAMENTOS
Biocompatibilidad de los Envases de Plástico y de Otros Polímeros para Medicamentos
Los envases farmacéuticos consisten en un recipiente y un cierre. Los envases de plástico pueden estar formados por políme-
ros que tras su extracción no alteran la estabilidad del producto que contienen ni muestran toxicidad. Los requisitos de la
1
Documento ISO 10993-1 :1997 (o versión actualizada) titulado BiologicalEva/uationof Medica/Devices-Part 1: Eva/uationand Testing.
2
Ver OECD Guidelines far Testing of Chemicals en www.oecd.org.
7370 (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados/ Información General USP42
prueba de biocompatibilidad para los envases de medicamentos se especifican en (1), (661 ), (661.1) y (661.2). Según se indica
en estos capítulos, el plástico u otras porciones poliméricas de estos productos se prueban según los procedimientos definidos
en (87). los plásticos u otros polímeros que no cumplan con los requisitos de Pruebasde ReactividadBiológica,In Vitro(87) no
son materiales adecuados para envases de medicamentos. los materiales que cumplen con los requisitos in vitro están califica-
dos como materiales biocompatibles sin la necesidad de pruebas adicionales y se pueden usar para fabricar envases de medica-
mentos. Si se desea una designación de clase (clases 1-Vl) para los plásticos u otros polímeros, hay que realizar los procedi-
mientos de prueba adecuados que se presentan en la sección PruebasIn Vivoy Designaciónde Clase.
Cierres Elastoméricos
Los cierres elastoméricos son cierres que se pueden perforar con una jeringa y mantener su integridad debido a sus propie-
dades elásticas. Los materiales elastoméricos pueden estar compuestos de varias entidades químicas, incluyendo materiales de
relleno, pigmentos, plastificantes, estabilizadores, aceleradores, agentes vulcanizantes y un polímero natural o sintético. Estos
materiales se usan para la fabricación de un producto que tenga las propiedades físicas elastoméricas deseadas y a menudo
demuestran reactividad biológica-degeneración y malformación celular-cuando se someten a pruebas con cultivos celulares
in vitro.
La biocompatibilidad de un material elastomérico se evalúa según el protocolo de prueba de dos etapas especificado en
Procedimientos para PruebaBiológicaen (381 ). A diferencia de los plásticos u otros polímeros, un material elastomérico que no
cumple con los requisitos de las pruebas de la primera etapa (in vitro) puede aceptarse como material biocompatible si pasa
las pruebas de la segunda etapa (in vivo) que son la Pruebade InyecciónSistémicay la Pruebalntracutáneadescritas en (88). No
se hace distinción de clase ni de tipo entre los materiales elastoméricos que cumplen con los requisitos de las pruebas de la
primera etapa y los aceptables como materiales biocompatibles al cumplir con los requisitos de la segunda etapa. Los materia-
les elastoméricos no reciben una designación de clase 1-VI.
DISPOSITIVOS
MÉDICOSE IMPLANTES
Los dispositivos médicos e implantes etiquetados como apirógenos, en contacto directo o indirecto con el sistema cardiovas-
cular u otros tejidos blandos del cuerpo, cumplen con los requisitos descritos en (161 ). Los productos detallados en este capí-
tulo que cumplen con los criterios son equipos de administración de soluciones, equipos de extensión, equipos de transferen-
cia, equipos de administración de sangre, catéteres intravenosos, dializadores y tubos y accesorios para diálisis, equipos para
transfusión e infusión y catéteres para la administración intramuscular de fármacos. Los criterios descritos no se aplican a los
productos médicos tales como productos ortopédicos, guantes de látex y apósitos para heridas.
Los requisitos de prueba descritos o a los que se hace referencia en (161) incluyen los requisitos de Esterilidad,
Endotoxinas
bacterianas,Pirógenosy Otrosrequisitos.En (85) se define un procedimiento para evaluar la presencia de endotoxinas bacteria-
nas y los límites se definen en EndotoxinasBacterianasen (161 ). Para los dispositivos en que no se puede realizar la Pruebade
EndotoxinasBacterianas(85) debido a características de promoción o inhibición no eliminables, se aplica la Pruebade Pirógenos
(151 ). los procedimientos para evaluar dispositivos médicos que contienen vías estériles se definen en DispositivosEstérilesen
Pruebasde Esterilidad (71 ). En la Pruebade Seguridaden (88) se define un procedimiento para evaluar la seguridad de los dispo-
sitivos médicos.
Los componentes de plástico o de otros polímeros de los dispositivos médicos cumplen con los requisitos especificados para
los plásticos y otros polímeros en (661 ), (661.1) y (661.2); los fabricados con elastómeros cumplen con los requisitos en (381 ).
Según se indica en estos capítulos, la biocompatibilidad de las porciones de plástico, de otros polímeros y los elastómeros de
estos productos se analizan conforme a los procedimientos descritos en (87). Si también se requiere la designación de clase
para un plástico u otro polímero, se realizan procedimientos de prueba adecuados descritos en (88).
Al igual que para los cierres elastoméricos, los materiales elastoméricos que no cumplen con los requisitos in vitro pueden
estar calificados como materiales biocompatibles y usarse en la elaboración de dispositivos médicos si cumplen con los requisi-
tos de la Pruebade InyecciónSistémicay la Pruebalntracutáneaen (88). Al igual que para los envases de medicamentos, los
plásticos y otros polímeros que no cumplen con los requisitos de la prueba in vitro no son materiales aptos para ser utilizados
en dispositivos médicos.
PRUEBASIN VITRO,PRUEBASIN VIVOY DESIGNACIÓN

DE CLASEPARAPLÁSTICOSY OTROS
POLÍMEROS
Los requisitos de prueba especificados en (87) y (88) están diseñados para determinar la reactividad biológica de cultivos
celulares de mamíferos y la respuesta biológica de animales a los materiales elastoméricos, plásticos y de otros polímeros que
están en contacto directo o indirecto con el paciente. La reactividad biológica de estos materiales puede depender tanto de las
características de sus superficies como de sus componentes químicos extraíbles. Los procedimientos de prueba detallados en
estos capítulos a menudo se pueden realizar con el material o un extracto del material en análisis, a menos que se especifique
algo diferente.
USP42 InformaciónGeneral/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 7371
Preparaciónde Extractos
La evaluación de la biocompatibilidad de un producto médico completo a menudo no es realista; por lo tanto, el uso de
porciones o extractos representativos de materiales seleccionados puede ser la única alternativa práctica para realizar los ensa-
yos. Cuando se usan porciones representativas de los materiales o extractos de los materiales en análisis, es importante tener
en cuenta que las materias primas pueden sufrir cambios químicos durante la fabricación, el procesamiento y la esterilización
de un producto médico. Si bien la prueba in vitro de materias primas puede servir como un procedimiento de examen inicial
importante, hay que hacer una evaluación final de la biocompatibilidad de un producto médico con porciones del producto
terminado y esterilizado.
Los extractos se preparan de acuerdo con los procedimientos expuestos en (87) y en (88). Las extracciones se pueden reali-
zar a diversas temperaturas (121 º, 70º, 50º o 37°) durante diferentes intervalos de tiempo (1 hora, 24 horas o 72 horas) y en
medios de extracción diferentes. La elección del medio de extracción para los procedimientos de Pruebasde ReaetividadBiológi-
ca, In Vitro (87) incluye la Inyecciónde Clorurode Sodio(0,9% NaCI) o un medio de cultivo de tejidos con o sin suero. Cuando
se usa un medio con suero, la temperatura de extracción no puede exceder de 37º. El medio de extracción in vivo incluye los
medios descritos en (88) o el disolvente al cual se expone el medicamento o dispositivo médico.
Al elegir las condiciones de extracción, hay que seleccionar las variables de temperatura, disolvente y tiempo que mejor si-
mulen las condiciones "de uso" del producto. Se pueden realizar muchas pruebas en diferentes condiciones para simular varia-
ciones en las condiciones "de uso". Si bien la selección cuidadosa de las condiciones de extracción permite la simulación de las
condiciones de fabricación y procesamiento en la prueba de materias primas, se realizará una prueba de la biocompatibilidad
del producto con el producto terminado y esterilizado.
PruebasIn Vitro
Los procedimientos descritos en (87) incluyen una Pruebade Difusión en Agar (prueba de contacto indirecto), una Pruebade
ContactoDirectoy una Pruebade Elución(prueba de extracción). La muestra es biocompatible si los cultivos celulares no mues-
tran más que una reactividad leve (Grado 2) al material de prueba, como se describe en (87). La Pruebade Difusiónen Agar
está diseñada para evaluar la biocompatibilidad de los materiales elastoméricos. El material se coloca sobre una capa de agar
superpuesta a la monocapa celular, que protege a las células contra el daño físico debido al material y permite que las sustan-
cias químicas o materiales lixiviables difundan desde el elastómero y entren en contacto con la monocapa celular. Los extractos
de materiales elastoméricos se analizan colocando papel de filtro saturado con un extracto del elastómero sobre la superficie
del agar solidificado. La Pruebade ContactoDirectoestá diseñada para materiales elastoméricos o plásticos que no dañarán físi-
camente las células con las que entren en contacto directo. Toda sustancia química lixiviable difunde desde el material al me-
dio de crecimiento suplementado con suero y entra en contacto directo con la monocapa celular. La Pruebade Eluciónestá
diseñada para evaluar los extractos de materiales poliméricos. El material se puede aplicar directamente al medio de cultivo de
tejidos.
La realización de la Pruebade Difusión en Agar o la Pruebade Contacto Directojunto con la Pruebade Eluciónes el protocolo
de prueba preferido. La extracción del producto o los materiales para la Pruebade Difusión en Agar o la Pruebade Eluciónse
efectúa según se describe en Preparaciónde Extractos.
PruebasIn Vivo y Designaciónde Clase
De acuerdo con los requisitos de inyección e implantación especificados en la Tabla 1 en (88), los plásticos y otros polímeros
reciben una designación de clase entre la clase I y la clase VI. Para obtener la designación de clase de un plástico u otro polí-
mero, se producen extractos del material de prueba en diversos medios según los procedimientos especificados.
Para evaluar la biocompatibilidad, los extractos se inyectan por vía sistémica e intracutánea en ratones y conejos o cobayos.
Según los requisitos de inyección especificados, un plástico u otro polímero puede pertenecer inicialmente a la clase 1, 11,111o
V. Si además de la prueba de inyección, se realiza una prueba de implantación usando el material en sí, el plástico u otro polí-
mero puede clasificarse como clase IVo clase VI.
BIOCOMPATIBILIDAD
DE DISPOSITIVOSMÉDICOSE IMPLANTES
Además de la evaluación de productos médicos para propósitos farmacopeicos según los procedimientos especificados en
(1), (71 ), (87), (88), (161 ), (381 ), (661 ), (661.1) y (661.2), los dispositivos médicos e implantes se evalúan en cuanto a su capa-
cidad de sensibilización, toxicidad subcrónica, genotoxicidad, hemocompatibilidad, toxicidad crónica, carcinogenicidad, toxi-
cidad reproductiva o del desarrollo y biodegradación según lo exijan los organismos regulatorios.
Las pautas suministradas por los organismos regulatorios indican que el número de pruebas al que se somete un dispositivo
médico o un implante depende de los siguientes factores: (1) la similitud y singularidad del producto con respecto a los pro-
ductos previamente comercializados ("comparables") según se considera en el Diagrama de Flujo de Decisión; (2) la magnitud y
duración del contacto entre el producto y el paciente, según se describen en la Categorizaciónde DispositivosMédicos;y (3) los
materiales que componen el producto según se considera en los apartados Diagrama de Flujode Decisióny PruebaIn Vivoy
Designaciónde Clase.
Diagrama de Flujo de Decisión
Las pautas para la comparación de un dispositivo médico o un implante con productos previamente comercializados se pro-
porcionan en el Diagrama de Flujo de Biocompatibilidad (ver la Figura 1)3 según la adaptación del Blue Book Memorandum
#G95-1 de la FDA. El propósito del diagrama de flujo es determinar si los datos disponibles de dispositivos previamente comer-
cializados son suficientes para asegurar la seguridad del dispositivo en consideración. Según se indica en el diagrama de flujo,
los materiales de composición y las técnicas de fabricación de un producto se comparan con aquéllas de productos previamen-
te comercializados para dispositivos que entran en contacto directo con el cuerpo. Además, el diagrama de flujo exige una
evaluación de la toxicidad de todo material especial que no se haya usado en dispositivos comparables. Las respuestas a las
preguntas formuladas en el diagrama de flujo llevan a la conclusión de si los datos disponibles son suficientes o si se necesitan
pruebas adicionales para asegurar la seguridad del producto. Cuando se necesitan pruebas adicionales, en la sección Matriz de
Selecciónde Pruebase proporcionan las pautas para la identificación de los procedimientos de prueba adecuados.
Categorización de Dispositivos Médicos
Para facilitar la identificación de los procedimientos de prueba adecuados, los dispositivos médicos se dividen y subdividen
según se muestra en la Tabla2, de acuerdo con el tipo y grado de contacto con el cuerpo. Las principales categorías de dispo-
sitivos médicos son los dispositivos de superficie, los dispositivos de comunicación externa y los dispositivos de implante. Éstas
a su vez se subcategorizan. En la Tabla2 también se presentan algunos ejemplos de dispositivos médicos e implantes pertene-
cientes a cada una de las subcategorías.
Matriz de Selección de Prueba
la matriz proporciona pautas para la identificación de procedimientos apropiados de pruebas biológicas para las tres catego-
rías de dispositivos médicos: pruebas para Dispositivosde Superficie(ver la Tabla 3), pruebas para DispositivosExternosde Comu-
nicación(ver la Tabla4) y pruebas para Dispositivosde Implante (ver la Tabla5). Cada categoría de dispositivos se subcategoriza
y luego se subdivide aún más según la duración del contacto entre el dispositivo y el cuerpo. la duración del contacto se defi-
ne como (A) limitada (menos de 24 horas); (8) prolongada (de 24 horas a 30 días); o (C) permanente (más de 30 días). los
efectos biológicos que se incluyen en la matriz son citotoxicidad, sensibilización, irritación o reactividad intracutánea, toxicidad
sistémica, toxicidad subcrónica, genotoxicidad, implantación, hemocompatibilidad, toxicidad crónica, carcinogenicidad, toxi-
cidad reproductiva o del desarrollo y biodegradación. Los capítulos generales que contienen el procedimiento de prueba de
toxicidad para estos efectos biológicos se indican en la Tabla 1.
Cada subcategoría de la matriz tiene un panel asociado de requisitos de prueba. Generalmente, la cantidad de pruebas en el
panel aumenta cuando aumenta la duración del contacto entre el dispositivo y el cuerpo, y a medida que el dispositivo o im-
plante está en contacto más cercano con el sistema circulatorio. Dentro de varias subcategorías, la opción de realizar pruebas
adicionales a las requeridas se deberá considerar caso por caso. Para tomar decisiones con respecto a la inclusión de pruebas
reproductivas o de desarrollo, el fabricante deberá tomar en cuenta situaciones específicas, como por ejemplo el uso de dispo-
sitivos de implante permanente o dispositivos externos de comunicación para mujeres embarazadas y niños. En la matriz se
proporcionan las pautas para la identificación de posibles procedimientos de prueba adicionales para cada subcategoría de dis-
positivos médicos.
3 Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA ("Use of

lntemational Standard ISO-10993. 'Biological Evaluation of Medica! Devices-Part 1: Evaluation
and Testing."')
USP42 InformaciónGeneral/ (1031) Biocompatibilidadde los MaterialesUsados 7373
¿Material
en contacto
¿Mismo ¿Misma si ¿Contac- si

proceso de composición to con el cuerpo
dispositivo fabricación? química? es similar?
en el mer-
cado? NO
NO
NO
NO aceptable o
fecha de
análisis?
¿Con-
¿El ¿Es un
material del NO sí iene sustan~
metal, aleación NO
dispositivoes ciastóxicas:
metálica o
un polímero? Pb, Ni, Cd,
un mat. ce-
rámico? Zr,etc,?
SÍ SÍ
NO
Consu!tarel perfilde
¿Sufi-
toxicologíaespecíficodel NO SÍ
ciente justifica-
dispositivoparadefinir 1--,11'--------~---------<
ción provista?
laspruebasadecuadas
¿Se
cumplen los Si Requisitos de
requisttos de Biocompatibilidad
biocompa- Cumplidos
tibilidad?
NO
Material Tóxico
Figura1. Diagramade flujo de biocompatibilidad

Tabla 2. Claslflcaclón y Ejemplos de Dispositivos Médicos

Categoría del Subcategoría del
Dispositivo Dispositivo Tipo o Grado de Contacto Algunos Ejemplos
Electrodos, prótesis externas, cintas de fija-
Dispositivos en contacto solo con la superfi- ción, vendas para compresión y monitores
Piel cie de la piel intacta de varios tipos
lentes de contacto, catéteres urinarios, dis-
positivos intravaginales e intraintestinales
(tubos estomacales, sigmoidoscopios, co-
Dispositivos de Superficie lonoscopios, gastroscopios), tubos endo-
traqueales, broncoscopios, prótesis denta-
Dispositivos que se comunican con mem- les, dispositivos de ortodoncia y dispositi-
Membrana Mucosa branas mucosas intactas vos intrauterinos
Dispositivos en contacto con superficies Dispositivos para curación o apósitos para
Superficies lesionadas o corporales lesionadas o afectadas de algún úlceras, quemaduras y tejido de granula-
Afectadas modo ción, y parches oclusivos
Equipos para administración de soluciones,
Dispositivos en contacto con la vía sanguí- equipos de extensión, equipos de transfe-
nea en un punto y que sirven de conducto renda y equipos para administración de
Vía Sanquínea, Indirecta para ingresar al sistema vascular sangre
Dispositivos y materiales en comunicación laparoscopios, artroscopios, sistemas de
En Comunicación con Teji- con tejidos, hueso, o el sistema de pulpa y drenaje, cementos dentales, materiales de
Dispositivos Externos de Co-
do, Hueso o Dentina dentina oclusión dental y grapas para piel
municación
Catéteres intravasculares, electrodos tem-
porales de marcapasos, oxigenadores, tu-
bos y accesorios de oxigenador extracor-
poreo, dializadores, tubos y accesorios pa-
Dispositivos en contacto con sangre en cir- ra diálisis, hemoadsorbentes e inmunoad-
Sanqre en Circulación culación sorbentes
Ejemplos de los primeros son clavos ortopé-
dicos, placas, articulaciones de reemplazo,
prótesis óseas, cementos y dispositivos in-
traóseos; ejemplos de los segundos son
marcapasos, dispositivos de administra-
ción de fármacos, sensores y simuladores
neuromusculares, tendones de reemplazo,
Dispositivos de Implante Dispositivos principalmente en contacto implantes mamarios, laringes artificiales,
con huesos o con tejidos y fluidos de teji- implantes subperiosteales y pinzas de liga-
Tejido o Hueso dos dura
Electrodos de marcapasos, fístulas arterio-
venosas artificiales, válvulas cardíacas, in-
jertos vasculares, catéteres internos de ad-
Dispositivos principalmente en contacto ministración de fármacos y dispositivos de
Sanqre con sanqre asistencia ventricular
PAUTAS PARA LA SELECCIÓNDE LA DESIGNACIÓNDE CLASEDEL PLÁSTICOU OTRO

POLÍMEROPARA UN DISPOSITIVOMÉDICO
Para proporcionar pautas para la selección de la designación de clase adecuada de un plástico u otro polímero para un dis-
positivo médico, se asigna a cada subcategoría de los Dispositivosde Superficie(ver la Figura2) y los DispositivosExternosde
Comunicación(ver la Figura3) una designación según la Clase de Plástico de la USP (ver (88)). Si las pruebas para cada designa-
ción de clase de la USP no son suficientes para un dispositivo específico, el fabricante o profesional debe desarrollar un conjun-
to de pruebas adecuado. El número de clase numérica indicado aumenta en relación a la duración (riesgo) del contacto entre
el dispositivo y el cuerpo. En la categoría de Dispositivosde Implante es obligatorio usar exclusivamente la clase VI. La asigna-
ción de la designación de la Clase de Plástico de la USP se basa en las matrices de selección de prueba ilustradas en las Tablas
3, 4 y 5.
t-
USP42 Información GeneralJ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 7375
Dispositivos
de Superficie
Limitada' Permanente Urn1tada Permanente
USP Clase! USP Clase USP Clase USP Clase USP Clase
1 1 111 VI
Figura 2. Requisitos de USP para la clase de plástico y otros polímeros para dispositivos de superficie.
• Categorización basada en la duración del contacto: limitada-menos de 24 horas; prolongada-de 24 horas a 30 días;
permanente-más de 30 días. t Designación de la Clase de Plástico según la USP.
Dispositivos Externos
de Comunicación
Vía sanguínea En comunicación con Sangre en

indirecta tejido/hueso/dentina circulación
Limitada*
USP Claset USP Clase

IV VI
Figura 3. Requisitos de USP para la clase de plástico y otros polímeros para dispositivos externos de comunicación.
• Categorización basada en la duración del contacto: limitada-menos de 24 horas; prolongada-de 24 horas a 30 días;
permanente-más de 30 días. t Designación de la Clase de Plástico según la USP.
La asignación de una designación de clase de plástico u otro polímero a una subcategoría no está destinada a restringir el
uso de clases superiores de plásticos u otros polímeros. Si bien la clase asignada define la clase numérica más baja de plástico u
otro polímero que se puede usar en el dispositivo correspondiente, el uso de una clase numérica superior de plástico es opcio-
nal. Cuando un dispositivo se puede definir como perteneciente a más de una categoría de dispositivo, el plástico u otro polí-
mero debe cumplir con los requisitos de la clase numérica más alta.
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Categoría del Dlsnc, sltlvo Efecto Blológlcob '-1
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USP42 Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 7379
(1032) DISEÑOY DESARROLLO

DE VALORACIONES
BIOLÓGICAS
1 INTRODUCCIÓN
1. 1 Propósito y Alcance
El capítulo general Diseñoy Desarrollode Valoraciones Biológicas(1032) presenta metodologías para el desarrollo de procedi-
mientos de valoración biológica que cuentan con un diseño experimental sólido, capaces de proporcionar datos que pueden
ser analizados mediante principios estadísticos bien fundamentados, y adecuados para su uso específico.
El capítulo general (1032) forma parte del grupo de cinco capítulos generales enfocados en valoraciones de potencia relati-
va, en las cuales se cuantifica la actividad de un material de Prueba mediante su comparación con la actividad de un material
Estándar. No obstante, muchos de los principios se pueden aplicar a otros sistemas de valoración.
El propósito de este capítulo general es servir como guía para el diseño y el desarrollo de una valoración biológica para un
fármaco o producto farmacéutico destinado para su distribución comercial. Aunque la adopción de los métodos recomenda-
dos en este capítulo puede requerir de una importante inversión de recursos durante el desarrollo de la valoración, su imple-
mentación temprana puede generar beneficios. Finalmente, las perspectivas y los métodos descritos en este capítulo son los
recomendados entre una gran variedad de alternativas ofrecidas por la teoría y práctica contemporáneas de las valoraciones
biológicas.
ÉNFASISEN LA POTENCIARELATIVA
Debido a la variabilidad inherente de los sistemas de análisis biológicos (incluyendo aquellos que emplean animales, células,
instrumentos, reactivos y los que se emplean a diario y entre laboratorios), una medición absoluta de la potencia es más varia-
ble que una medición de la actividad pertinente a un Estándar, lo cual ha llevado a la adopción de la metodología de la poten-
cia relativa. Para poder suponer que los materiales Estándar y de Prueba son similaresbiológicamente, debería demostrarse una
similitudestadística(una consecuencia de la similitud del material de Prueba y del Estándar), y se podría esperar que la muestra
de Prueba se comporte como una concentración o dilución del Estándar. La potencia relativa es una medida sin unidad que se
obtiene a partir de la comparación de las relaciones dosis-respuesta de las preparaciones farmacéuticas de Prueba y Estándar.
Para los fines de la comparación relativa del material de Prueba con el Estándar, generalmente se asigna a la potencia del Es-
tándar un valor de 1 (o 100%). El Estándar puede ser un material establecido como tal por una organización nacional (p. ej., la
USP) o internacional (p. ej., la OMS), o puede tratarse de un Estándar interno.
1.2 Partes Interesadas
Este capítulo está dirigido tanto a expertos en estadística, como a analistas dedicados a la práctica de valoraciones biológi-
cas, quienes participan en el desarrollo de una valoración biológica. Este capítulo servirá al analista como guía para implemen-
tar la estructura y metodología de la valoración biológica a fin de alcanzar las metas analíticas, a la vez que demuestra de ma-
nera fidedigna la actividad biológica de interés; por otra parte, servirá al estadista para obtener información relacionada con las
limitaciones biológicas que pudieran ser difíciles de equilibrar con una práctica rigurosa de estadística.
2. APTITUDDE LASVALORACIONES
BIOLÓGICAS
PARA ELPROPÓSITO
Para evaluar la aptitud de una valoración para su uso previsto, el analista debe especificar claramente los propósitos con los
que se lleva a cabo la valoración biológica. Los usos comunes para una valoración biológica incluyen la liberación de lotes de
fármacos (ingredientes farmacéuticos activos) y productos farmacéuticos; la evaluación de estabilidad; la calificación del Están-
dar y de otros reactivos críticos; la caracterización de productos intermedios del proceso y formulaciones; la caracterización de
contaminantes y productos de degradación; y la validación de los cambios en el proceso de producción del producto. Los re-
quisitos de exactitud relativa, especificidad, precisión y robustez pueden ser diferentes para cada uno de los usos potenciales.
Una buena estrategia consiste en desarrollar y validar una valoración biológica para sustentar múltiples usos previstos; por
ejemplo, una valoración biológica desarrollada principalmente para la liberación de partidas puede servir para otros propósitos.
Las decisiones relacionadas con la aptitud para el propósito deben basarse en consideraciones científicas y estadísticas, así co-
mo en consideraciones prácticas tales como costos, tiempo de culminación del proceso y requisitos de rendimiento para la
valoración.
Cuando las valoraciones se usan para la liberación de lotes, una valoración biológica de modelo lineal permitiría evaluar la
similitud suficientemente. Para valoraciones biológicas que se usan para sustentar la estabilidad, la comparabilidad, para califi-
car materiales de referencia o reactivos críticos, o que se relacionan con cambios en los procesos de producción o valoración,
generalmente resulta útil evaluar la similitud usando la curva de concentración-respuesta completa, incluyendo las asíntotas (si
estuvieran presentes).
7380 (1032) Valoraciones Biológicas/ Información General USP42
2.1 Desarrollo del Proceso
Las valoraciones biológicas por lo general son necesarias para el desarrollo y la optimización de la fabricación de productos,
incluidos los procesos de formulación y aumento de la escala de producción. Las valoraciones biológicas pueden usarse para
evaluar las estrategias de purificación, optimizar el rendimiento del producto y medir la estabilidad del mismo. Dado que las
muestras tomadas durante todo el proceso se analizan y comparan con regularidad, es necesario estudiar cuidadosamente los
efectos de la matriz de muestras que pudieran afectar la respuesta de la valoración a fin de determinar la aptitud de una valo-
ración para su propósito. Para las mediciones de potencia relativa, puede ser necesario diluir el material Estándar en una matriz
adecuada para cuantificación. La precisión y exactitud de la valoración biológica deben ser suficientes para medir el desempe-
ño del proceso o para evaluar y comparar la estabilidad de las formulaciones propuestas.
2.2 Caracterizacióndel Proceso
Las valoraciones biológicas pueden llevarse a cabo para evaluar los efectos sobre la potencia de la droga relacionados con las
diferentes etapas de la fabricación del fármaco o con los cambios en el proceso de fabricación (p.ej. para demostrar la equiva-
lencia del producto antes y después de aplicar cambios en el proceso). Las valoraciones biológicas usadas en este tipo de apli-
cación pueden ser cualitativas o cuantitativas.
2.3 Liberaciónde Productos
Las valoraciones biológicas se usan para evaluar la potencia del fármaco antes de la liberación del producto comercial. En la
medida de lo posible, la valoración debe reflejar o imitar el mecanismo de acción conocido o esperado del producto. Cuando
la valoración biológica no incluye la biología funcional directamente relacionada con el mecanismo de acción, puede ser nece-
sario demostrar una relación entre las determinaciones de la potencia estimada por la valoración biológica y las obtenidas con
alguna otra valoración que refleje mejor o de manera distinta la actividad funcional hipotética.
Para las pruebas de liberación del producto, las especificaciones del mismo se establecen para definir valores mínimos o in-
tervalos de potencia aceptables para el producto. La precisión del valor de informe obtenido de la valoración biológica debe
sustentar el número de dígitos significativos establecidos en la especificación (ver el capítulo general Validaciónde Va/oraciones
Biológicas(1033)) y, junto con la exactitud relativa, sustentar el intervalo de la especificación. A fin de cumplir con estas especi-
ficaciones, el control de calidad de la fabricación deberá contar con especificaciones para la liberación del producto con límites
lo suficientemente estrechos como para acomodar cualquier pérdida de actividad por inestabilidad o incertidumbre en la valo-
ración de liberación.
2.4 ProductosIntermedios del Proceso
La evaluación de la valoración biológica de los productos intermedios del proceso puede proveer información con respecto a
la especificidad. Las estrategias de formulación y llenado pueden basarse en valoraciones biológicas para asegurarse de que el
producto farmacéutico, incluido aquél que se encuentra en el envase final, cumplirá con las especificaciones establecidas. Por
ejemplo, se pueden retener los materiales a granel sin formular y evaluar su potencia. Basándose en los resultados de potencia,
se puede decidir si los materiales a granel se combinan con otros lotes de material a granel, si se diluyen, o si se someten a
reprocesamiento. Para estos tipos de aplicaciones, las valoraciones biológicas deben ser capaces de medir la actividad del pro-
ducto en diferentes matrices. En algunos casos, se puede preparar un material Estándar distinto y utilizarlo para calcular la po-
tencia relativa del producto intermedio del proceso.
2.5 Estabilidad
Las valoraciones de potencia pueden usarse para evaluar la estabilidad de vacunas y productos obtenidos por biotecnología.
La información derivada de los estudios de estabilidad realizados durante el desarrollo en condiciones de almacenamiento rea-
les y/o aceleradas o sometidas a estrés, puede emplearse para establecer la duración de la vida útil, así como para identificar y
estimar velocidades y productos de degradación. Asimismo, se pueden usar estudios de estabilidad posteriores al otorgamien-
to de la licencia, a fin de monitorear la estabilidad del producto. Es importante contar con conocimientos acerca de la variabili-
dad a corto y largo plazo de la valoración biológica para garantizar un nivel aceptable de incertidumbre en las medidas de
potencia obtenidas.
2.6 Calificaciónde Reactivos
La caracterización cuantitativa de un nuevo Estándar requiere una medición exacta y precisa de la actividad biológica del
nuevo Estándar. Esta medición se usa para establecer que el lote del nuevo Estándar es equivalente al lote previo o para asig-
narle una potencia declarada con la que se puedan comparar las muestras de Prueba. Además, puede ser necesaria una deter-
minación repetida adicional (que va más allá del análisis de rutina) para lograr una mayor precisión en la medición de potencia
USP42 InformaciónGeneral/ (1032} Valoraciones Biológicas 7381
del nuevo material Estándar. Asimismo, la valoración biológica se puede usar para calificar un reactivo para cultivo celular tal
como suero fetal bovino. La aptitud para el propósito en dichos casos se vincula con la capacidad de la valoración para exami-
nar lotes de reactivo y para asegurar el rechazo de lotes que pudieran generar sesgo o comprometer las mediciones de poten-
cia relativa.
2.7 Integridad de los Productos
Las vacunas, los productos obtenidos por biotecnología y los productos biológicos pueden contener una población de mate-
rial heterogéneo, incluido el material que se espera predomine en el producto. Algunas impurezas del proceso y productos de
degradación pueden ser activos, parcialmente activos, inactivos o antagónicos a la respuesta medida en la valoración biológi-
ca. Para variantes o derivados del producto cuyos cambios en la estructura o en la composición relativa pudieran relacionarse
con cambios sutiles aunque característicos en la respuesta de la valoración biológica (p. ej., cambio en la pendiente o asíntota),
la valoración biológica puede resultar útil para detectar y medir dichos derivados o variantes. Los estudios que identifican cam-
bios característicos asociados con variantes del producto esperado ayudan a garantizar el desempeño uniforme del producto.
Siempre que resulte práctico, la valoración biológica debe estar acompañada de métodos ortogonales sensibles a las variantes
del producto, a las impurezas del proceso y/o a los productos de degradación.
3. ASPECTOSFUNDAMENTALES
DE LA VALORACIÓNBIOLÓGICA
3.1 Valoraciones Biológicas In Vivo
Las valoraciones de potencia in vivo son valoraciones biológicas en las que se administran grupos de diluciones de los mate-
riales Estándar y de Prueba a animales, y donde las relaciones de concentración-respuesta se usan para estimar la potencia.
Para algunas valoraciones con animales, el punto final es simple (p. ej., una valoración de aumento de peso corporal de la rata
para la hormona de crecimiento humano o una valoración de peso de los ovarios de la rata para la hormona estimulante del
folículo), pero otras requieren el procesamiento adicional de muestras recolectadas de los animales tratados (p. ej., recuento
de reticulocitos para eritropoyetina, esteroideogénesis para gonadotropinas, recuento de neutrófilos para factor estimulante de
colonias de granulocitos o titulación de anticuerpos después de la administración de vacunas). Con la llegada de líneas celula-
res específicas para el mecanismo fisiológico de acción (MOA, por sus siglas en inglés) hipotético, el uso de animales para la
medición de potencia ha disminuido de manera importante. Los costos, el bajo rendimiento, así como cuestiones éticas y de
otro tipo abogan contra el uso de valoraciones biológicas con animales. Asimismo, las agencias reglamentarias han promovido
la limitación responsable, siempre que sea posible, del uso de animales (ver The lnteragency Coordinating Committee on the
Validation of Alternative Methods, Mission, Vision, and Strategic Priorities; febrero de 2004). Cuando la actividad in vitrono
está plenamente asociada con la actividad in vivo(p. ej., EPO), la combinación de valoraciones in vitrobasadas en células y de
un método fisicoquímico adecuado (p. ej., IEF,análisis de glicanos) puede ser un reemplazo para las valoraciones in vivo. No
obstante, las valoraciones in vivopueden continuar siendo necesarias cuando las valoraciones in vitrono son capaces de detec-
tar diferencias críticas relacionadas con la función biológica prevista o esperada del fármaco.
Las respuestas fisiológicas de los animales a los fármacos biológicos (incluyendo vacunas) pueden predecir las respuestas de
los pacientes. La selección de animales de prueba por especie, cepa, género y madurez o intervalo de peso debe guiarse por el
objetivo de desarrollar un modelo representativo y sensible con el cual se evalúe la actividad de las muestras de Prueba.
Algunos métodos de valoración se adaptan al uso de colonias, en lugar de animales que no hayan sido previamente expues-
tos. Por ejemplo, las pruebas de pirógenos e insulina se benefician del uso de conejos de colonias que han sido previamente
expuestas, los cuales proveen una capacidad de respuesta confiable. Si los animales introducidos de manera reciente en la co-
lonia no responden según lo esperado después de administrarles varias veces un compuesto, se les deberá separar de la colo-
nia para que no provoquen futuros resultados de valoración inválidos o indeterminados. No obstante, para la valoración de
compuestos altamente antigénicos para pirógenos, se deben usar animales que no hayan sido previamente expuestos, a fin de
evitar resultados inexactos o confusos. Otras ventajas de las colonias incluyen condiciones ambientales controladas (macro/
ambiente y micro/gradilla), programas de alimentación, aprovisionamiento de agua y rutinas de crianza uniformes.
Se pueden usar datos históricos que incluyan registros de la colonia y datos de la valoración para identificar factores que
pudieran influenciar el desempeño de la valoración. Es posible reducir la influencia de factores que pudieran generar sesgo
mediante la aplicación de principios de aleatorización tales como la distribución de intervalos de peso a través de grupos de
dosis, asignación de grupos de los contenedores de transporte a jaulas distintas o uso de patrones generados por computadora
o de plataforma para inyección/dosificación. Para que el animal de prueba sea adecuado para su uso en una valoración bioló-
gica, éste debe estar sano y se le debe dar tiempo para que se estabilice en su ambiente. Los factores que se combinan para
influenciar el estado de salud del animal incluyen una nutrición adecuada, hidratación, exención de factores de estrés físicos y
sicológicos, saneamiento adecuado del lugar donde se hospeda, ciclo de luz controlado (diurno/nocturno), manipulación ex-
perimentada, inyecciones y sangrados diestros y ausencia de ruido o vibración. La observación diaria de los animales de prueba
es esencial para mantener su salud, además de que se debe contar con cuidados veterinarios para evaluar cualquier cuestión
que pudiera comprometer la validez de los resultados de la valoración biológica.
7382 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General USP42
3.2 ValoracionesBiológicasEx Vivo
Las células o tejidos de donantes humanos o animales se pueden cultivar en el laboratorio y usarse para evaluar la actividad
de una muestra de Prueba. En el caso de las citoquinas, la mayoría de las valoraciones emplean células del sistema hematopo-
yético o subconjuntos de células hematopoyéticas de sangre periférica, tales como células mononucleares de la sangre periféri-
ca o linfocitos de la sangre periférica. Para proteínas que actúan sobre tejidos sólidos, como por ejemplo factores y hormonas
del crecimiento, el tejido específico sobre el que actúan puede ser extraído de animales, disociado y cultivado durante un pe-
riodo limitado, ya sea como células adherentes o semiadherentes. Aunque un sistema de valoración ex vivo tiene la ventaja de
ser similar al ambiente natural, también puede sufrir de variabilidad importante entre donantes, así como dificultades relacio-
nadas con la disponibilidad de células apropiadas.
Las valoraciones biológicas que involucran el uso de tejidos o células de un animal (p. ej., el método de glucagón en hepato-
cito de rata) requieren un procesamiento similar al de las valoraciones in vivopara minimizar la variabilidad de la valoración y el
sesgo. El nivel de esfuerzo para manejar el sesgo (p. ej., mediante aleatorización) debe ser adecuado para los propósitos de la
valoración. Los factores adicionales que podrían afectar los resultados de la valoración incluyen la hora del día, el peso o madu-
rez del animal, el anestésico usado, los componentes de las soluciones amortiguadoras/reactivos, la temperatura y posición del
baño de incubación y la viabilidad de las células.
3.3 ValoracionesBiológicas(Basadasen Células) In Vitro
Resulta posible utilizar valoraciones biológicas que empleen líneas celulares que respondan a ligandos o agentes infecciosos
específicos para las valoraciones de liberación de lote. Estas líneas celulares pueden derivarse de tumores, inmortalizarse como
líneas celulares dependientes de factores o líneas celulares transfectadas con receptores adecuados obtenidas por ingeniería
genética. Asimismo, también es posible utilzar líneas celulares no transformadas que se puedan mantener durante un número
suficiente de pasajes (p. ej., fibroblastos). Independientemente de la línea celular, se espera una respuesta de potencia adecua-
damente equivalente durante un número de pasajes continuos. Los avances en la tecnología de ADN recombinante y el enten-
dimiento de los mecanismos de señalización celular han permitido la generación de líneas celulares modificadas por ingeniería
con respuesta mejorada, expresión estable de receptores y mecanismos de señalización, así como una estabilidad más perdura-
ble. Las respuestas celulares relacionadas con la proteína de interés dependen del mecanismo de acción del fármaco y de la
duración de la exposición. Dichas respuestas incluyen la proliferación celular, muerte celular, actividad antiviral, diferenciación,
secreción de citoquinas/mediador y activación de enzimas. Para las valoraciones que implican estas respuestas puede ser nece-
sario incubar las células durante varios días, tiempo en el cual puede presentarse contaminación, evaporación poco uniforme y
otros efectos de ubicación. Las autoridades reglamentarias han aceptado las respuestas comparativamente rápidas basadas en
mecanismos de señalización intracelular, tales como mensajeros secundarios, activación de proteína kinasa o expresión génica
del indicador. Finalmente, la mayoría de las líneas celulares usadas para valoraciones biológicas expresan receptores para múlti-
ples citoquinas y factores de crecimiento. Es posible que dicha falta de especificidad no sea perjudicial si se demuestra la espe-
cificidad de la muestra de Prueba.
El diseño de la valoración biológica basada en células debe reflejar el conocimiento que se tiene sobre los factores que influ-
yen sobre la respuesta de las células con respecto al analito activo. La variabilidad de la respuesta a menudo se refleja en pará-
metros tales como la pendiente, EC50 de la curva de concentración-respuesta o el intervalo de respuesta (respuesta máxima
menos mínima). Aunque la metodología de la potencia relativa minimiza los efectos de la variación de estos parámetros entre
valoraciones y entre bloques dentro de una valoración, en las estimaciones de la potencia relativa, dicha variabilidad de la res-
puesta puede ocasionar que una valoración sea difícil de administrar (es decir, puede ser difícil evaluar la aptitud del sistema).
Por consiguiente, aunque el desarrollo de la valoración se debe enfocar principalmente en las propiedades de potencia, tam-
bién resultan adecuados los esfuerzos para identificar y controlar la variación en la relación concentración-respuesta. En el caso
de valoraciones por bloques (p. ej., múltiples placas de cultivo celular en una valoración) con variación apreciable en la forma
de la curva entre bloques, un análisis que no incluya apropiadamente los bloques generaría estimaciones infladas de variación
dentro de la valoración, ocasionando que la evaluación de la similitud sea particularmente difícil. Se dispone de dos estrategias
para tratar la variación entre bloques: la primera es un esfuerzo del laboratorio para identificar y controlar fuentes de variación,
y la segunda es un esfuerzo estadístico para construir y emplear un diseño y análisis en bloques. La combinación de estas estra-
tegias puede resultar particularmente efectiva.
El desarrollo de una valoración biológica basada en células comienza con la selección o generación de una línea celular. Uno
de los primeros pasos importantes para desarrollar una valoración basada en células para la evaluación de un producto comer-
cial consiste en verificar que el uso de la línea celular de interés no se restrinja únicamente a investigación. De ser posible, para
asegurar el abastecimiento adecuado y uniforme de células para el análisis de productos, se debe generar un banco de células.
Resulta necesario documentar en la medida de lo posible la información relacionada con las características funcionales y gené-
ticas de la línea celular de la valoración biológica, incluyendo detalles del historial de la línea celular desde el origen hasta su
incorporación al banco, por ejemplo, la información sobre una línea celular recombinante que podría incluir la identificación
de la fuente de la línea celular madre (banco de células interno, almacén externo, etc.), de las secuencias de ADN usadas para
transfección, y del régimen subsiguiente de selección y análisis funcional que resultó en la selección de la línea celular. Aunque
no siempre resulta práctico, es convienente contar con información suficiente que permita recrear una línea celular similar en
caso necesario. La información pertinente puede incluir: identidad (p. ej., isoenzima, marcadores fenotípicos, análisis genéti-
USP42 InformaciónGeneral/ (1032) ValoracionesBiológicas 7383
co); morfología (p. ej., imágenes fotográficas archivadas); pureza (p. ej., análisis de detección de micoplasmas, bacterias, hon-
gos y virus); crioconservación; condiciones de descongelación y cultivo (p. ej., componentes de los medios, temperatura y mé-
todo de descongelación, métodos de propagación, densidades de siembra, condiciones de recolección); viabilidad de la des-
congelación (inmediatamente después de haber sido congelada y después de un tiempo de almacenamiento); características
de crecimiento (p. ej., tiempos de duplicación de las células); y estabilidad funcional (p. ej., ploidía).
La caracterización de células y la vigilancia relacionada con cuestiones del desempeño de la valoración que se reflejan en el
estado de las células son necesarias para asegurar la calidad y longevidad de los bancos de células que se usan en el entorno
de Control de Calidad. La salud general y el estado metabólico de las células al momento de la valoración biológica puede
influir de manera importante sobre los resultados de las pruebas. Cuando una línea celular ha sido caracterizada y está lista
para su inclusión en el banco, los analistas a menudo preparan un banco de dos niveles (Maestro y de Trabajo). El Banco de
Células Maestro se crea como fuente para el Banco de Células de Trabajo. El Banco de Células de Trabajo se obtiene a partir de
la expansión de uno o más viales del Banco de Células Maestro. El tamaño de los bancos depende de las características de
crecimiento de las células, del número de células requerido para cada valoración y de la frecuencia con que se realizará la valo-
ración. Algunas células pueden ser sensibles a la crioconservación, a la descongelación y a las condiciones de cultivo, por lo
que los bancos se deben preparar y caracterizar cuidadosamente antes de usarlos en estudios de validación y para su uso regu-
lar en el laboratorio de Control de Calidad.
Además, existen factores que pueden afectar la respuesta de la valoración biológica y la evaluación de la potencia, los cuales
son comunes en muchas valoraciones biológicas basadas en células: tipo de célula (adherente o no adherente); descongela-
ción de las células; densidad de plaqueo (durante la descongelación y durante el mantenimiento de la sucesión de siembra) y
confluencia (células adherentes); frascos de cultivo; crecimiento, montaje de placas y medios de valoración; requisitos del sue-
ro (fuente, inactivación con calor, irradiación con rayos gamma); condiciones de incubación (temperatura, C0 2, humedad,
tiempos de cultivo desde la descongelación); reactivos y técnicas para recolección de células (para células adherentes, método
de disociación); separación y clasificación de células; recuento de células; determinación de la salud de las células (velocidad de
crecimiento, viabilidad, rendimiento); número de pasajes de células y programa de pasajes; estabilidad de la línea celular (a
nivel genético, de receptor, de marcador, de expresión génica); y etapas de inanición o estimulación. La lista anterior no es
definitiva, por lo que el desarrollo de la valoración debe incluir analistas que cuenten con una amplia comprensión y experien-
cia con respecto a la línea celular. Estos analistas experimentados deben identificar factores que podrían influir en los resultados
de la valoración y, siempre que sea posible, establecer estrategias para un nivel de control adecuado.
3.4 Estándar
El Estándar es un reactivo crítico en las valoraciones biológicas debido a la necesidad de contar con un material de prueba
confiable contra el que se pueda comparar cuantitativamente una preparación de Prueba. Se puede asignar al Estándar una
cantidad de unidades o actividad específica que represente un material con una potencia total (100%). Siempre que sea posi-
ble, un Estándar debe ser representativo de las muestras que se van a analizar en la valoración biológica. El análisis que se lleva
a cabo para calificar un Estándar puede ser más riguroso que el análisis de rutina usado para la liberación del lote.
Un Estándar debe almacenarse en condiciones que ayuden a conservar toda su potencia durante el tiempo esperado de uso.
Con este propósito, el Estándar se puede almacenar en condiciones diferentes a las del almacenamiento normal del fármaco o
producto farmacéutico. Esto puede incluir una temperatura diferente (p. ej., -70º o -20º, en lugar de 2º-8°), un envase dife-
rente (p. ej., viales de plástico en lugar de jeringas), una formulación diferente (p. ej., formulación liofilizable o la adición de
proteínas portadoras tales como albúmina sérica humana, estabilizantes, etc.). El material Estándar debe analizarse para deter-
minar su estabilidad en intervalos apropiados. Los criterios de aptitud del sistema para la valoración biológica tales como res-
puesta máxima o de fondo, pendiente EC50 o potencia del control de la valoración, pueden usarse para detectar cambios en la
actividad del Estándar. Se pueden realizar estudios de estabilidad acelerados para estimar las velocidades de degradación y pa-
ra establecer características reconocibles de inestabilidad del Estándar.
En las etapas posteriores del desarrollo clínico, el Estándar puede prepararse usando el proceso de fabricación empleado en
los ensayos clínicos claves. Si la formulación del Estándar es diferente de la usada en el proceso de fabricación del producto
farmacéutico, será importante demostrar que la evaluación de la similitud y la estimación de la potencia realizadas en la valora-
ción no son afectadas por las diferencias en la formulación. Un Estándar inicial puede recibir el nombre de EstándarPrimario.
Los Estándares subsiguientes se pueden preparar usando procesos de fabricación vigentes y se pueden denominar Estándares
de Trabajo.Puede ser necesario implementar distintos Procedimientos Operativos Estándares, a fin de establecer tales estánda-
res para cada producto. En ocasiones, las mediciones de potencia pueden presentar sesgo si la actividad del Estándar cambia
gradualmente. Asimismo, se puede observar una pérdida de similitud si, con el tiempo, el Estándar sufre cambios en la glicosi-
lación. Resulta prudente archivar alícuotas de cada lote de Estándar para evaluar la comparabilidad con Estándares posteriores
y para investigar cualquier desviación en la valoración.
4. ASPECTOSESTADÍSTICOSDE LOS ELEMENTOSFUNDAMENTALES

DE LAS VALORACIONES
BIOLÓGICAS
Los elementos estadísticos del desarrollo de valoraciones biológicas incluyen el tipo de datos, la medición de la respuesta a
concentraciones variadas, el diseño de la valoración, el modelo estadístico, el tratamiento de los datos previo al análisis, los
métodos de análisis de datos, la prueba de aptitud y el análisis de valores aberrantes. Tales componentes forman el sistema de
valoración biológica que se utilizará para estimar la potencia de una muestra de Prueba.
4.1 Datos
Existen, fundamentalmente, dos tipos de datos de valoración biológica: cuantitativos y cuantales (categóricos). Los datos
cuantitativos pueden ser continuos (que no se limitan a observaciones discretas; p. ej., recopilados de un instrumento), de re-
cuento (p. ej., unidades formadoras de placas) o discretos (p. ej., títulos de dilución determinados por punto final). Los datos
cuantales a menudo son dicotómicos; por ejemplo, vida/muerte en un modelo de respuesta animal o positivo/negativo en un
ensayo de infectividad basado en placa que resulte en la destrucción de una monocapa celular después de la administración de
un agente infeccioso. Los datos cuantitativos se pueden transformar en datos cuantales seleccionado un umbral que distinga
una respuesta positiva de una respuesta negativa. Dicho umbral se puede calcular a partir de datos obtenidos de un control
negativo, por ejemplo, sumando (o restando) una medida de incertidumbre (tal como dos o tres veces la desviación estándar
de las respuestas de control negativo) al promedio del control negativo. Los analistas deben ser cuidadosos con respecto a la
transformación de datos cuantitativos en datos cuantales, puesto que dicha operación resulta en una pérdida de información.
4.2 Suposiciones
Una suposición clave para el análisis de la mayoría de las valoraciones biológicas es que las muestras Estándar y de Prueba
contienen el mismo analito efectivo o población de analitos y, por consiguiente, se puede esperar que se comporten de mane-
ra similar en la valoración biológica. A esto se le denomina similitud. Tal como se presentará en mayor detalle en el capítulo
general Análisisde Datos de ValoracionesBiológicas(1034) para modelos estadísticos específicos, la similitud biológica implica la
presencia de similitud estadística (para modelos de líneas paralelas y curvas paralelas, las curvas del Estándar y de la muestra de
Prueba son paralelas; para modelos de cociente de pendiente, las líneas del Estándar y de la muestra de Prueba tienen una
misma ordenada al origen). Cualquier afirmación contraria es falsa. La similitud estadística (líneas paralelas, curvas paralelas o
misma ordenada al origen, según corresponda) no asegura la similitud biológica. No obstante, incumplir con la similitud esta-
dística puede tomarse como evidencia contra la similitud biológica. Por lo tanto, la existencia de un par Estándar-muestra de
Prueba que pase la evaluación de similitud estadística es una condición necesaria, pero no suficiente, para cumplir con la supo-
sición clave de la similitud biológica. En consecuencia, la similitud biológica sigue siendo, inevitablemente, una suposición. Las
desviaciones de la similitud estadística que presenten valores constantes a través de valoraciones repetidas pueden indicar efec-
tos de la matriz o diferencias reales entre los materiales Estándar y de Prueba. Lo anterior resulta cierto incluso si la desviación
de la similitud estadística es lo suficientemente pequeña como para sustentar la determinación de una potencia relativa.
En muchas valoraciones, múltiples compuestos proporcionarán curvas de concentración-respuesta similares, por lo que pue-
de resultar razonable emplear un sistema de valoración biológica para describir o incluso comparar las curvas de respuesta de
diferentes compuestos. No obstante, no es apropiado informar la potencia relativa a menos que las muestras Estándar y de
Prueba contengan únicamente el mismo analito o población de analitos activos. Los productos biológicos a menudo presentan
variaciones entre lotes con respecto a la distribución de analitos (es decir, la mayoría de los productos biológicos contienen un
producto de interés y, en niveles aceptablemente bajos, algunos contaminantes del proceso que pueden mostrarse activos en
la valoración biológica). Por lo tanto, la evaluación de la similitud es, al menos en parte, una evaluación que determina si la
distribución de analitos en la muestra de Prueba es lo suficientemente cercana a la distribución en la muestra Estándar como
para que la potencia relativa sea significativa; en otras palabras, la valoración es una comparación de características. Cuando
existe evidencia (derivada de métodos diferentes a la valoración biológica) de que las muestras Estándar y de Prueba no contie-
nen los mismos compuestos activos, no se cumple con la suposición de similitud biológica, por lo que no es apropiado infor-
mar la potencia relativa.
Otras suposiciones estadísticas comunes en el análisis de valoraciones biológicas cuantitativas son la varianza constante de
las respuestas alrededor de un modelo ajustado (ver la sección 4.3 Heterogeneidadde la Varianza,Ponderacióny Transformación
para un análisis más profundo), residuos normalmente distribuidos (un residuo es la diferencia entre una respuesta observada y
la respuesta prevista por el modelo) e independencia de los residuos.
La varianza constante, normalidad e independencia están interrelacionadas en la práctica de la valoración biológica. Para va-
loraciones biológicas con una respuesta cuantitativa, se puede usar una transformación de datos bien seleccionada para obte-
ner una varianza aproximadamente constante y una distribución de residuos casi normal. Una vez que se ha impuesto la trans-
formación, queda pendiente tratar la suposición de independencia reflexionando sobre la estructura del diseño de la valora-
ción biológica en el modelo de análisis. La independencia de los residuos es importante para evaluar la aptitud del sistema y de
la muestra.
4.3 Heterogeneidadde la Varianza, Ponderacióny Transformación

Los análisis simples de los datos de valoraciones biológicas cuantitativas requieren que los datos presenten una distribución
aproximadamente normal con una varianza casi constante cercana de un extremo a otro del intervalo de los datos. Para los
modelos de regresión lineal y no lineal, la varianza referida en este capítulo es la varianza residual derivada del ajuste del mode-
USP42 InformaciónGeneral/ (1032) Valoraciones Biológicas 7385
lo. A menudo, no se observa la varianza constante; la heterogeneidadde la varianza se puede manifestar como un incremento
en la variabilidad con un incremento en la respuesta. Si las varianzas no son iguales, pero los datos se analizan como si lo fue-
ran, la estimación de la potencia relativa aún podría ser razonable; no obstante, si no se trata la varianza inconstante alrededor
del modelo de concentración-respuesta ajustado se obtendrá una estimación poco confiable de la varianza dentro de la valora-
ción. Asimismo, la evaluación de la similitud estadística puede no ser exacta y no se deben usar los errores estándar ni los inter-
valos de confianza para todos los parámetros (incluyendo un intervalo para la potencia relativa basado en el Teorema de Fie-
ller). Los intervalos de confianza para la potencia relativa que combinan estimaciones de potencia de múltiples valoraciones
pueden ser erróneos si se usa el error dentro de la valoración para calcular el intervalo de confianza.
La constancia de la varianza se puede evaluar mediante gráficas de residuos, análisis Box-Cox (o ley del poder) o la prueba
de Levene. Con la prueba de Levene, en lugar de basarse en el valor p, el cambio obtenido en la estadística es útil como funda-
mento para juzgar si se ha mejorado o deteriorado la homogeneidad. La varianza se evalúa mejor en un conjunto grande de
datos de valoración. Resulta inapropiado usar únicamente la varianza entre determinaciones repetidas de la valoración vigente,
debido a que existen muy pocos datos para determinar de manera adecuada varianzas verdaderamente representativas, espe-
cíficas para cada concentración. Los datos sobre la varianza son escasos durante el desarrollo; resulta prudente reevaluar la va-
rianza durante la validación y monitorearla periódicamente durante el uso continuo de la valoración.
Dos métodos usados para mitigar la heterogeneidad de la varianza son la transformación y la ponderación. La falta de va-
rianza constante puede tratarse mediante una transformación adecuada. Asimismo, la transformación puede mejorar la norma-
lidad de los residuos y el ajuste de algunos modelos estadísticos a los datos. Se debe seleccionar una transformación para un
sistema de valoración durante el desarrollo, verificarla durante la validación, usarla de manera uniforme en las valoraciones de
rutina y verificarla periódicamente. Los datos de la valoración biológica comúnmente se presentan con la concentración trans-
formada por logaritmo; las valoraciones de cociente de la pendiente se presentan con la concentración en la escala original.
La transformación se puede aplicar a los datos de la respuesta, así como a los datos de la concentración. Las opciones comu-
nes para una transformación de la respuesta incluyen la transformación logarítmica, por raíz cuadrada (para recuentos), recí-
proca y, para el recuento de datos con asíntotas conocidas, por logit del porcentaje de máxima respuesta. Las transformacio-
nes logarítmicas son de uso común, debido a que convierten un segmento útil de la relación concentración-respuesta en un
segmento casi lineal y debido a su facilidad para transformar de vuelta a la escala original para fines de interpretación. Se pue-
de llevar a cabo un ajuste log-log con datos que presentan un comportamiento no lineal. Asimismo, existen otras alternativas
disponibles, p. ej., los datos se pueden transformar mediante la inversa de la función del Poderde la Media (POM, por sus siglas
en inglés). Un coeficiente del Poder de la Media de k = 2 corresponde a una transformación logarítmica de los datos. Para un
análisis más extenso de las relaciones entre datos transformados por logaritmos y datos sin transformar, ver el Apéndicedel
capítulo general Validaciónde ValoracionesBiológicas(1033).
Se debe tomar en cuenta que la transformación de los datos requiere la reevaluación del modelo usado para ajustar los da-
tos. Desde el punto de vista estadístico, no existe nada especial con respecto a la escala original de medición; resulta aceptable
cualquier transformación que mejore la concordancia con las suposiciones. No obstante, los analistas deben reconocer que las
transformaciones, la selección del modelo estadístico y la selección del esquema de ponderación están interrelacionadas. El uso
de una transformación puede afectar la selección del modelo estadístico, es decir, transformar la respuesta mediante un loga-
ritmo o raíz cuadrada, por ejemplo, puede cambiar la forma de la curva de respuesta y, para un modelo lineal, puede cambiar
el intervalo de concentraciones cuyas respuestas sean casi rectas y casi paralelas.
Para valoraciones con varianza no constante, una opción razonable es la adopción de un análisis ponderado. Aunque la pon-
deración no puede tratar la falta de normalidad residual, se considera una metodología estadística válida para poner énfasis en
datos más precisos. Idealmente, las ponderaciones se pueden basar en la inversa de la varianza prevista dentro de la valoración
(o dentro de los bloques) de cada respuesta donde los factores que predicen la varianza son independentes de las respuestas
observadas en una valoración específica.
En la práctica, muchas valoraciones biológicas presentan variaciones relativamente grandes en el logaritmo EC50 (en compa-
ración con la variación en el logaritmo de la potencia relativa) entre valoraciones (y, en ocasiones, entre bloques dentro de la
valoración). Cuando no se trata en el modelo de varianza, esta variación en el logaritmo EC50 provoca lo que parece ser una
gran variación en las respuestas cercanas a la media logarítmica EC50, lo cual a menudo resulta en ponderaciones demasiado
bajas para las observaciones cercanas al EC50 •
Si la valoración es lo suficientemente estable (baja variabilidad en el EC50), la varianza puede considerarse alternativamente
como una función de la concentración. Aunque no es lo ideal, podría ser razonable una metodología que utiliza varianzas de-
pendientes de la concentración cuando las ponderaciones se estiman a partir de un gran número de valoraciones, las varianzas
son pequeñas, cualquier desequilibrio en el número de observaciones de todas las concentraciones es tratado en el modelo de
varianza y no se presentan observaciones inusuales (valores aberrantes). Esta posibilidad se puede examinar graficando la va-
rianza de la respuesta en cada concentración (de preferencia, combinada a través de múltiples valoraciones) en función de la
concentración y luego contra una función de la concentración (p. ej., concentración cuadrada). La varianza será proporcional a
la función de concentración donde esta línea trazada se aproxime a una línea recta. La pendiente aparente de esta línea es
informativa, debido a que una línea horizontal indica que no es necesaria la ponderación. Si se puede encontrar una función
que genere una gráfica lineal, entonces las ponderaciones se consideran proporcionales a la recíproca de dicha función. Dicha
función puede no existir, en particular si la variación es mayor (o menor) en ambos extremos del intervalo de concentración
estudiado.
Independientemente de si se emplea un modelo o datos históricos, el objetivo es capturar la variabilidad relativa en cada
concentración. No es necesario asumir que el nivel de variabilidad absoluto de la valoración en uso es idéntico al de los datos
usados para determinar la ponderación, sino que únicamente los intervalos de las varianzas entre concentraciones sean unifor-
mes con los datos históricos o con los datos usados para determinar la función de la varianza.
La capacitación y experiencia apropiadas en métodos estadísticos son esenciales para determinar una estrategia para generar
un modelo de varianza adecuada. Las fuentes de variabilidad pueden identificarse de manera errónea si se emplea el modelo
incorrecto de varianza. Por ejemplo, los datos pueden presentar una variación constante a lo largo de una curva logística de
concentración-respuesta de cuatro parámetros, pero también puede tener una variación apreciable en el parámetro EC50 entre
bloques dentro de la valoración, o entre valoraciones. Si no se reconoce la variabilidad entre bloques o entre valoraciones, po-
dría parecer que esta valoración tiene una gran variación en la respuesta para concentraciones cercanas al valor promedio a
largo plazo del EC50 • Un modelo ponderado con ponderaciones bajas para concentraciones cerca del EC50 podría representar
erróneamente una característica principal del sistema de valoración.
4.4 Normalidad
Muchos métodos estadísticos para el análisis de respuestas cuantitativas suponen la normalidad de los residuos. Si no se
cumple la suposición de normalidad, la estimación de la potencia relativa y su error estándar pueden considerarse razonables,
pero las pruebas de aptitud y un intervalo de confianza para la estimación de la potencia relativa podrían ser inválidos. La ma-
yoría de los métodos usados en este capítulo son razonablemente robustos frente a desviaciones de la normalidad, por lo que
el objetivo es detectar anormalidades importantes. Durante el desarrollo de la valoración, y con el objeto de descubrir desvia-
ciones importantes de la normalidad, se pueden usar herramientas gráficas tales como una gráfica de probabilidad normal o
un histograma (o una herramienta similar como las gráficas de tallo y hoja o de caja) de los residuos a partir del ajuste del
modelo. El histograma debe ser unimodal y simétrico. La gráfica de probabilidad normal debe aproximase a una línea recta¡
una gráfica de probabilidad normal que no es recta (p. ej., curva en un extremo, en ambos extremos, o en la parte media)
indica la presencia de anormalidad. Un patrón sobre una línea recta es indicativo de anormalidad. El comportamiento anormal
puede deberse a mediciones que son logarítmicas normales y presentan una variabilidad mayor a niveles más altos de respues-
ta. Lo anterior se puede considerar un patrón cóncavo en los residuos en una gráfica normal.
Las pruebas estadísticas de normalidad pueden no ser útiles. De acuerdo con la discusión previa sobre análisis estadístico de
la constancia de la varianza, cambiar el valor de una estadística de la prueba de normalidad, en lugar de basarse en un valor p,
funciona para juzgar si la normalidad se ha mejorado o empeorado. En lo que respecta a la evaluación de la varianza, se debe
evaluar la normalidad en un conjunto de datos tan grande como sea posible durante el desarrollo, reevaluarlos durante la vali-
dación y monitorearlos periódicamente durante el uso de la valoración. Las desviaciones importantes de la normalidad a me-
nudo pueden mitigarse mediante una transformación adecuada. La falta de evaluación y mitigación de desviaciones importan-
tes de la normalidad conlleva el riesgo de inhabilitar la detección apropiada de valores aberrantes, así como una pérdida en la
capacidad de obtener estimaciones confiables de variación.
4.5 Linealidad de los Datos de Concentración-Respuesta
Algunos análisis de valoraciones biológicas suponen que la forma de la curva de concentración-respuesta es una línea recta
o se aproxima a una línea recta para un intervalo limitado de concentraciones. En dichos casos, se puede evaluar un modelo
de respuesta lineal para determinar si se justifica para los datos disponibles. Los métodos de análisis de diferencias para evaluar
la linealidad enfrentan los mismos problemas que los métodos de análisis de diferencias aplicados al paralelismo-más datos y
una mejor precisión incrementan la posibilidad de detectar la falta de linealidad. Debido a que casi siempre la falta de lineali-
dad afecta la estimación de la potencia, los analistas deben evaluar las desviaciones de la linealidad de manera rutinaria si de-
sean emplear un modelo de respuesta lineal para estimar la potencia.
Si el examen de una gráfica revela claramente una desviación de la linealidad, es suficiente para concluir la falta de lineali-
dad. Sin embargo, una alta variabilidad de los datos puede ocultar una desviación de la linealidad. Por consiguiente, una me-
todología general para linealidad puede corresponder con la usada para la similitud, que se desarrolla de manera más elabora-
da en la sección 4.7 Análisisde Aptitud y Aplicacióndel Análisisde Equivalencia para Similitud(paralelismo).
(1) Especificar una medida de desviación de la linealidad que se pueda combinar con todas las muestras o que sea específica
para una muestra. Las posibilidades incluyen la suma de la falta de linealidad de coeficientes cuadrados o cuadráticos.
(2) Se puede emplear una de las cuatro metodologías del Paso2 de AplicacióndelAnálisisde Equivalencia para Similitud(para-
lelismo)para determinar, durante el desarrollo, un intervalo de valores aceptables (intervalo de aceptación) para la medida
de la falta de linealidad.
(3) Determinar un intervalo de confianza bilateral del 90% en la medición de la falta de linealidad, siguiendo el procedimien-
to de Pruebas Doblemente Unilaterales (fOST, por sus siglas en inglés) y comparar el resultado con el intervalo de acepta-
ción según se determina en (2).
A menudo, se seleccionará un subconjunto de concentraciones medidas en la valoración para establecer una curva lineal de
concentración-respuesta, el cual puede identificarse gráficamente. Las concentraciones en los extremos del intervalo deben ser
examinadas cuidadosamente, debido a que a menudo tienen un gran impacto sobre la pendiente y los cálculos derivados de
la pendiente. Si la intención en la valoración final es usar únicamente concentraciones en el intervalo lineal, se debe seleccionar
un intervalo de concentraciones que genere líneas rectas paralelas para las potencias relativas esperadas durante el uso rutina-
rio de la valoración; de otro modo, la valoración no pasará las pruebas de paralelismo cuando la potencia produzca valores de
respuesta de la valoración que estén fuera del intervalo lineal de respuesta. Cuando la potencia está fuera del intervalo lineal,
podría resultar apropiado ajustar la concentración de la muestra basándose en dicha potencia estimada y analizar de nuevo
para obtener un resultado de potencia válido. Las valoraciones repetidas en conjunto con las valoraciones válidas pueden ge-
nerar una estimación de potencia sesgada, debido al proceso selectivo de repetir valoraciones cuando la respuesta está en los
extremos de la curva de concentración-respuesta.
El problema es más complejo para valoraciones en las que existe incluso una modesta variación en la forma o ubicación de la
curva de concentración-respuesta de corrida a corrida o entre bloques dentro de una valoración. En tales valoraciones, puede
resultar apropiado seleccionar subconjuntos para cada muestra en cada valoración, o incluso en cada bloque dentro de una
valoración. Se debe tomar en cuenta que un modelo de efectos fijos eliminará la necesidad de subconjuntos diferentes en blo-
ques diferentes, pero un modelo de efectos mixtos puede revelar y acomodar diferentes subconjuntos en diferentes bloques
(ver la sección 4.9 EfectosFijosy Aleatoriosen Modelosde Respuestade Va/oracionesBiológicas).
Las pautas adicionales con respecto a la selección de subconjuntos de datos para la estimación de potencia relativa mediante
modelo lineal incluyen: usar al menos tres, y de preferencia cuatro, concentraciones adyacentes; que la pendiente del segmen-
to lineal sea lo suficientemente pronunciada; que las líneas que se ajustan a las muestras Estándar y de Prueba sean rectas; y
que las líneas de regresión para el ajuste sean paralelas. Una forma de derivar un criterio de pronunciamiento es calcular una
estadística t para evaluar si la pendiente es significativamente diferente de cero. Si la pendiente no es significativa, es posible
que la valoración biológica tenga un desempeño deficiente; lo anterior se puede observar como un aumento de variación en
los resultados de potencia. Otro aspecto que sustenta el requisito de pronunciamiento adecuado de la pendiente es el uso de
algoritmos para la selección de subconjuntos. Sin un criterio de pronunciamiento de la pendiente, un algoritmo para la selec-
ción de subconjuntos, que busca identificar subconjuntos de tres o más puntos de datos contiguos que sean rectos y paralelos,
podría seleccionar concentraciones en una asíntota. Evidentemente, dichos subconjuntos son inapropiados para su uso en la
estimación de la potencia. El pronunciamiento o la importancia del pronunciamiento de la pendiente deben depender de la
valoración. Este criterio debe establecerse durante el desarrollo de la valoración y, posiblemente, redefinirse durante la valida-
ción de la valoración.
4.6 Modelos Comunes de Valoración Biológica
La mayoría de las valoraciones biológicas consisten en una serie de concentraciones o diluciones de una muestra de Prueba y
de un material Estándar. Un modelo matemático se ajusta a los datos de concentración-respuesta y, posteriormente, se puede
calcular una potencia relativa a partir de los parámetros del modelo. La selección del modelo puede depender de si se están
analizando datos cuantitativos o cualitativos.
Para datos cuantitativos, los modelos que emplean perfiles de respuestas paralelas, los cuales sustentan la evaluación compa-
rativa para determinar la potencia relativa, pueden ofrecer ventajas estadísticas. Si se emplean dichos modelos, las concentra-
ciones o diluciones por lo general se modifican usando una escala geométrica, p. ej., en incrementos duplicativos, logarítmicos
o de logaritmo medio. Si se usa el modelo de cociente de la pendiente, las concentraciones o diluciones se pueden espaciar de
igual manera en la concentración, en lugar del logaritmo de la concentración. Es posible usar diversas funciones para ajustar
un modelo de respuesta paralelo a datos cuantitativos, incluyendo una función lineal, una función polinómica de orden mayor,
una función logística de cuatro parámetros (sigmoidea simétrica) y una función logística de cinco parámetros para sigmoideas
asimétricas. Dichas funciones requieren un número suficiente de concentraciones o diluciones para ajustarse al modelo. Para
evaluar la falta de ajuste de cualquier modelo, es necesario contar con al menos una concentración (o dilución) -preferible-
mente varias- más que el número de parámetros que se estimarán en el modelo. Asimismo, por lo regular se usa por lo me-
nos una concentración -de preferencia dos- para sustentar cada asíntota.
En ocasiones, se selecciona un modelo lineal debido a su eficiencia aparente y facilidad de procesamiento. Debido a que los
perfiles de respuesta de la valoración biológica son, por lo general, no lineales, el laboratorio puede realizar un experimento
con un amplio intervalo de concentraciones para identificar la región aproximadamente lineal del perfil de concentración-res-
puesta. Para datos que siguen un modelo logístico de cuatro parámetros, éstas son las concentraciones cercanas al centro de la
región de la respuesta, a menudo una respuesta de 20% a 80% cuando se modifica nuevamente la escala de los datos para las
asíntotas. Se deben tomar precauciones apropiadas cuando se emplea un modelo lineal, debido a las diversas razones por las
que una región aparentemente lineal podría cambiar. Es posible identificar una región lineal estable después de acumular sufi-
ciente experiencia con la valoración y con la variedad de muestras que se espera analizar con la misma. Los datos que siguen la
función logística de cuatro parámetros también se pueden linealizar mediante transformación. La región inferior de la función
es aproximadamente lineal cuando los datos se transforman con logaritmos (ajuste log-log).
Por lo regular, los datos cuantales se ajustan usando modelos matemáticos más complejos. Se puede utilizar un modelo de
probita o de logit para estimar un percentilo de la curva de respuesta (a menudo el percentilo 50) o, de manera más directa, la
potencia relativa de la Prueba con respecto al Estándar. El análisis Spearman-Karber es un método sin modelo que se puede
emplear para la determinación del percentilo 50 de una curva de concentración-respuesta cuantal.
7388 (1032) Valoraciones Biológicas / InformaciónGeneral USP42
4.7 Análisis de Aptitud
La evaluación de la aptitud del sistema y de la aptitud de la muestra son necesarias para asegurar la calidad de los resultados
de la valoración biológica. La aptitud del sistema en la valoración biológica, al igual que en otros métodos analíticos, consta de
criterios previamente especificados mediante los cuales se evalúa la validez de una valoración (o, posiblemente, una corrida
que contenga varias valoraciones). Los analistas pueden evaluar la aptitud del sistema determinando si algunos de los paráme-
tros de la respuesta del Estándar y algunas propiedades (p. ej., variación residual) de los datos se encuentran en sus intervalos
habituales. A fin de obtener altas tasas de aceptación en la valoración, se recomienda aceptar grandes fracciones de estos inter-
valos habituales (99% o más) y evaluar la aptitud del sistema usando únicamente unos pocos parámetros de respuesta del Es-
tándar sin correlación. La selección de los parámetros de aptitud del sistema y de sus intervalos también se puede informar
mediante estudios empíricos o de simulación que midan la influencia de los cambios sobre un parámetro en la estimación de
la potencia.
La aptitud de la muestra en una valoración biológica se evalúa mediante criterios previamente especificados para la validez
de la estimación de la potencia de una muestra de Prueba individual y, por lo regular, se enfoca en la evaluación de la simili-
tud. Es necesario establecer los criterios de aptitud del sistema y de la muestra durante el desarrollo de la valoración biológica y
antes de su validación. Cuando se cuente con poca experiencia con respecto a la valoración biológica, dichos criterios pueden
considerarse provisionales.
APTITUDDELSISTEMA
Los parámetros de aptitud del sistema se pueden seleccionar basándose en el diseño y en el modelo estadístico. No obstan-
te, independientemente del diseño o modelo, los parámetros de aptitud del sistema debe estar directamente relacionados con
la calidad de la valoración biológica. Dichos parámetros por lo regular se basan en muestras estándar y de control. Por ejem-
plo, en las valoraciones de líneas paralelas, los valores bajos de la pendiente del Estándar a menudo generan estimaciones de
potencia de baja precisión. En lugar de rechazar las valoraciones con pendientes bajas, el uso de valoraciones repetidas adicio-
nales podría resultar más efectivo para los analistas hasta que pueda mejorarse el sistema de valoración para generar estimacio-
nes de potencia con una precisión más alta de manera constante. El monitoreo del intervalo de niveles de respuesta y ubica-
ción de las asíntotas asociadas a controles o con la muestra del Estándar puede ser particularmente importante para establecer
niveles de respuesta apropiados. Cualquier desviación o tendencia en alguno de los criterios puede ser indicativa de la degra-
dación de un reactivo crítico o del material Estándar. Se deben implementar métodos de Control Estadístico de Procesos (SPC,
por sus siglas en inglés) para detectar tendencias en los parámetros de aptitud del sistema.
Dos medidas comunes de aptitud del sistema son la evaluación de la idoneidad del modelo (capacidad de ajuste) y de la
precisión. El uso de determinaciones repetidas en un diseño completamente aleatorizado permite separar un término de error
puro de la evaluación de falta de ajuste. Se debe tener cuidado al derivar un criterio para la falta de ajuste; el uso de un térmi-
no de error puro incorrecto puede provocar una evaluación artificial. La falta de ajuste de la suma de cuadrados obtenida a
partir del ajuste del modelo al Estándar puede ser una medida útil de idoneidad del modelo, dependiendo de las concentracio-
nes usadas y de cómo difieran los datos obtenidos del modelo. Es posible establecer un umbral basándose en el análisisde
sensibilidad(evaluación de la sensibilidad de la valoración a los cambios en el analito) y/o datos históricos, más allá de los cua-
les el valor de falta de ajuste indica que los datos no son adecuados. Se debe tomar en cuenta que los datos de Prueba no se
usan en esta parte; la idoneidad del modelo para la Prueba es parte de la aptitud de la muestra.
Existen dos alternativas a considerar para evaluar la precisión. Un método emplea el error cuadrático medio (varianza resi-
dual) a partir del ajuste del modelo con el Estándar únicamente. Dado que esta metodología puede tener pocos grados de
libertad para la estimación de la varianza, podría resultar más útil emplear un error cuadrado medio combinado a partir de
ajustes de modelos separados con el Estándar y la Prueba. Una vez que se haya seleccionado la medida, se usan datos históri-
cos y análisis de sensibilidad para determinar un umbral de aceptación.
APTITUDDE LAMUESTRA
La aptitud de la muestra en la valoración biológica por lo general consiste en la evaluación de la similitud, la cual únicamen-
te se puede realizar dentro del intervalo de valoración. La potencia relativa se puede informar únicamente a partir de muestras
que presenten una similitud con el Estándar, que tengan la calidad requerida para el ajuste del modelo y que hayan sido dilui-
das para generar un EC50 (y potencia) dentro del intervalo del sistema de valoración.
SIMILITUD
En el contexto de evaluación de similitud, el análisis de hipótesis clásico (diferencia)evalúa la hipótesis nula que establece
que una medida (un parámetro de no similitud que mide la diferencia entre las curvas de concentración-respuesta del Están-
dar y de la Prueba) es cero, con una hipótesis alternativa implícita que establece que la medida no es cero o que no se han
cumplido las suposiciones estadísticas. El criterio habitual (la "prueba de diferencia") que indica que el valor p debe ser mayor
que cierto valor crítico para poder declarar que la muestra es similar a la referencia controla la probabilidad de que las mues-
tras sean falsamente declaradas como no similares; éste es el riesgo del productor, que muestras adecuadas sean rechazadas. El
riesgo del consumidor (es decir, el riesgo de que muestras no similares se declaren similares) se controla mediante la precisión
de la medida de ausencia de similitud y la cantidad de determinaciones repetidas en la valoración; por lo regular, la evaluación
de éstas es muy deficiente, dejando sin control el riesgo del consumidor.
En contraste con el análisis de diferencias, el análisis de equivalencia para similitud (es decir, evaluar si un intervalo de con-
fianza del 90% para una medición de ausencia de similitud está contenido dentro de los límites de equivalencia especificados)
permite únicamente una probabilidad del 5% de que muestras con medidas de ausencia de similitud que están fuera de los
límites de equivalencia sean declaradas similares (controlando así el riesgo del consumidor). Con el análisis de equivalencia,
resulta práctico examinar y administrar el riesgo del productor asegurando que la valoración cuente con suficientes determina-
ciones repetidas para tener una buena precisión al estimar las medidas de ausencia de similitud.
Para la comparación de pendientes, se han usado tradicionalmente las pruebas de diferencia para establecer el paralelismo
entre una muestra de Prueba y la muestra Estándar. No obstante, el uso de esta metodología no permite al laboratorio concluir
que las pendientes sean iguales, puesto que los datos pueden ser demasiado variables o el diseño de la valoración puede ser
demasiado débil para establecer una diferencia. Sin embargo, el laboratorio puede concluir que las pendientes son lo suficien-
temente similares usando la metodología del análisis de equivalencia.
El análisis de equivalencia presenta ventajas prácticas en comparación con el análisis de diferencias, incluyendo que una ma-
yor cantidad de determinaciones repetidas resulta en una mejor precisión de la valoración, la cual incrementará las probabili-
dades de que las muestras cumplan con los criterios de similitud; que una menor cantidad de determinaciones repetidas o de
precisión de la valoración reducirá las probabilidades de que las muestras cumplan con los criterios de similitud; y que se obtie-
nen metodologías sólidas para combinar datos de múltiples valoraciones de la misma muestra para comprender de mejor ma-
nera si una muestra es verdaderamente similar al Estándar o no.
Debido a las ventajas asociadas con el uso del análisis de equivalencia en la evaluación de similitud, los analistas pueden
cambiar las valoraciones existentes a análisis de equivalencia o pueden implementar métodos de análisis de equivalencia cuan-
do se realizan cambios a las valoraciones existentes. Con este propósito, es conveniente examinar el riesgo de que la valoración
no apruebe muestras adecuadas. Este riesgo depende de la precisión del sistema de valoración, de la estrategia para determi-
naciones repetidas en el sistema de valoración y de los valores críticos de los parámetros de similitud (esto constituye un análi-
sis de capacidaddel proceso).Una metodología para cambiar una valoración establecida a partir del análisis de diferencia a un
análisis de equivalencia (para similitud) consiste en usar la capacidad de proceso de la valoración para establecer valores críti-
cos para parámetros de similitud. Esta metodología resulta razonable para una valoración establecida, debido a que los riesgos
(de declarar falsamente muestras como similares o no similares) son implícitamente aceptables, dado el historial de uso exitoso
de la valoración.
Las medidas de similitud se pueden basar en los parámetros de la curva de concentración-respuesta y pueden incluir la pen-
diente para una valoración de línea paralela recta; la ordenada al origen para una valoración de cociente de la pendiente; la
pendiente y asíntotas para una valoración logística de líneas paralelas de cuatro parámetros; o la pendiente, las asíntotas y el
parámetro de falta de simetría en un modelo de sigmoideo de cinco parámetros. En algunos casos, estas medidas de similitud
tienen un significado interpretable y práctico en la valoración; algunos cambios en la forma de la curva, por ejemplo, pueden
relacionarse con cambios específicos (tales como la presencia de un contaminante activo específico) en el producto. Siempre
que sea posible, discutir dichos cambios y sus probables efectos será de gran valor para establecer los límites de equivalencia.
APLICACIÓNDELANÁLISISDE EQUIVALENCIA
PARASIMILITUD(PARALELISMO)
Conforme a lo indicado anteriormente, muchos procedimientos estadísticos para evaluar la similitud se basan en una hipóte-
sis nula que indica la presencia de similitud y en la hipótesis alternativa que indica un estado de ausencia de similitud. Poste-
riormente, la incapacidad para determinar que la similitud es improbable desde el punto de vista estadístico se toma como una
conclusión de similitud. Sin embargo, dicha incapacidad para establecer un fundamento probabilístico de ausencia de similitud
en realidad no prueba la existencia de similitud. El análisis de equivalencia ofrece un método para que el analista llegue a una
conclusión (si los datos así lo requieren) de similitud suficienteal tiempo que controla el riesgo de hacerlo inadecuadamente. A
continuación se proporciona una secuencia para el proceso de aplicación del análisis de equivalencia.
Paso 1: Seleccionaruna medida de ausenciade similitud.
Para el caso de líneas paralelas, ésta puede ser la diferencia o el cociente de las pendientes. (El cociente de las pendientes
puede ser menos sensible al valor de la pendiente. Enmarcar la diferencia de la pendiente como un cambio proporcional a
partir del Estándar en lugar de usar unidades de pendiente absolutas tiene la ventaja de ser invariable a las unidades en los
ejes de concentración y respuesta.) Para una valoración de cociente de la pendiente, la medida de ausencia de similitud
puede ser la diferencia en las ordenadas al origen entre las muestras de Prueba y Estándar. Nuevamente, enmarcar esta
diferencia como una proporción del intervalo de respuesta (posiblemente transformado) del Estándar para hacer que la
medida sea invariable a las unidades de la respuesta podría presentar ventajas.
La determinación de similitud se puede basar en los parámetros individuales, de uno en uno; para el modelo logístico de
cuatro parámetros, la similitud entre las muestras Estándar y de Prueba se pueden evaluar de manera discreta para la asín-
tota superior, la pendiente y la asíntota inferior. Si se utilizan curvas sigmoideas con parámetros adicionales para ajustar
los datos de la valoración biológica, también es importante considerar el tratamiento de la similitud entre las preparacio-
nes Estándar y de Prueba de los parámetros de curva adicionales (p. ej., parámetro de asimetría del modelo de cinco pará-
metros). Como alternativa, la evaluación de similitud se puede basar en una sola medida compuesta de falta de paralelis-
mo, tal como la suma de paralelismode cuadrados.Ésta se determina como la diferencia en la suma residual de errores
cuadrados (RSSE,por sus siglas en inglés) entre el valor obtenido del ajuste de las curvas del Estándar y de la Prueba por
separado y el valor obtenido de la imposición de paralelismo:
Suma de paralelismo de cuadrados = RSSEP- RSSE,- RSSE,
donde los subíndices P, S y T denotan el modelo Paralelo, el modelo Estándar y el modelo de Prueba, respectivamente.
Para cualquier medida compuesta, el analista debe considerar la ponderación relativa implícita de la importancia de las
tres (o más) regiones de la curva y si la ponderación es apropiada para el problema en cuestión. Por ejemplo, para la suma
de paralelismode cuadradoscon modelos no lineales, la ponderación provista a la comparación de las asíntotas depende
de la cantidad de datos en la valoración en uso sobre y cerca de las asíntotas.
Paso2: Especificarun intervalo de valoresaceptables,por lo regular denominadointervalo de equivalenciao "zona de indiferen-
cia", para la medida de falta de similitud.
El desafío de implementar un análisis de equivalencia radica en establecer límites de equivalencia apropiados para las me-
didas de ausencia de similitud. Idealmente, se cuenta con información disponible para vincular la variación en las medidas
de similitud con diferencias significativas en la función biológica (según se miden con la valoración biológica). La informa-
ción puede estar disponible a partir de la evaluación de valoraciones ortogonales. Las cuatro metodologías siguientes pue-
den usarse para determinar este intervalo. Si se han especificado límites farmacopeicos para una medida definida de falta
de similitud, entonces la valoración debe satisfacer dichos requisitos.
a. La primera metodología consiste en compilar datos históricos que comparen el Estándar contra sí mismo y usar di-
chos datos para determinar el intervalo de equivalencia como un intervalo de tolerancia para la medida de falta de
paralelismo. La ventaja de usar datos históricos radica en que dan control al laboratorio sobre la tasa de incumpli-
miento falso (la tasa de incumplimiento de una muestra que es en realidad una muestra aceptable). La desventaja es
que no hay control sobre la tasa de cumplimiento falso (la tasa de cumplimiento de una muestra que pudiera tener
una diferencia inaceptable en el desempeño con respecto al Estándar). La especificación del intervalo de equivalencia
desarrollado de esta manera se basa únicamente en la capacidad de la valoración. Los laboratorios que emplean esta
metodología deben ser precavidos debido a que una valoración imprecisa que requiera mejoría podría generar un
intervalo de equivalencia tan amplio que no sería posible contar con una discriminación útil para ausencia de simili-
tud.
b. La metodología (a) es simple de implementar en la rutina y se puede emplear con diseños de valoraciones que no
ofrezcan estimaciones confiables de variación dentro de la valoración y, por ende, intervalos de confianza. No obs-
tante, existe el riesgo de que las valoraciones con cantidades de variación dentro de la valoración, mayores a las habi-
tuales, puedan cumplir inapropiadamente. Por consiguiente, la alternativa preferida a la metodología (a) es determi-
nar un intervalo de tolerancia para el intervalo de confianza para la medida de falta de paralelismo. Lo siguiente re-
sulta particularmente apropiado para cambiar una valoración existente, con un conjunto importante de datos históri-
cos sobre las muestras Estándar y de Prueba obtenidos a partir de una metodología de análisis de diferencia, a una
metodología de equivalencia:
i. Para cada valor de la medida de falta de paralelismo obtenido a partir de los datos históricos, se debe determi-
nar un intervalo de confianza de 95%, (m,n).
ii. Para cada intervalo de confianza, determinar su desviación máxima del paralelismo perfecto. Esto es máx(lml,
lnl) para diferencias, máx(l /m,n) para cocientes y simplemente n para cantidades que deben ser positivas, tales
como la suma de cuadrados.
iii. Determinar un intervalo de tolerancia para las desviaciones máximas obtenidas en (ii), el cual será un intervalo
de tolerancia unilateral para estas cantidades necesariamente positivas. Se prefiere una metodología de intervalo
de tolerancia no paramétrico.
iv. Se concluye que los nuevos datos son "suficientemente paralelos" si el intervalo de confianza para la medida de
falta de paralelismo cae completamente dentro del intervalo determinado en (iii).
Las metodologías (a) y (b), basándose en la capacidad del ensayo, controlan únicamente la tasa de incumplimiento
falso y pasan por alto la tasa de cumplimiento falso. La incorporación de información de fuentes distintas a la evalua-
ción de la capacidad de la valoración provee control sobre la tasa de cumplimiento falso. Las metodologías (c) y (d)
son medios que se pueden usar con este propósito.
c. La tercera metodología comienza con datos históricos que comparan el Estándar consigo mismo y agrega datos que
comparan el Estándar con fallas conocidas, p. ej., muestras degradadas. Comparar los valores de la medida de ausen-
cia de similitud para datos para los que sea apropiada una conclusión de similitud (Estándar contra sí mismo) y para
datos para los que no sea apropiada una conclusión de similitud, p. ej., muestras degradadas. Basándose en esta
comparación, determinar un valor de la medida de ausencia de similitud que discrimine entre los dos casos. Si se
emplea esta metodología, se debe utilizar un intervalo de muestras para el que no sea apropiada una conclusión de
similitud, incluyendo muestras con la más mínima ausencia de similitud importante. Para modelos no lineales, esta
comparación también se puede usar para determinar aquellos parámetros que deben evaluarse; algunos pueden no
ser sensibles a las fallas que pueden ocurrir con la valoración específica o con la recolección de muestras no similares.
d. La cuarta metodología se basa en combinar un análisis de sensibilidad de la curva de valoración para parámetros de
ausencia de similitud con lo que se conozca acerca del producto y de la valoración. Lo anterior es particularmente útil
si se dispone de información que vincule un cambio en una o más medidas de ausencia de similitud con las propie-
dades del producto. Estas medidas pueden ser directas (p. ej., cambios en la conformación de una proteína) o indi-
rectas (p. ej., cambios en la eficiencia o seguridad de un modelo animal). Otra metodología complementaria es un
análisis de sensibilidad limitada, el cual combina el juicio del analista y del biólogo con respecto a la lectura de la
magnitud de los cambios en un parámetro de ausencia de similitud que sean significativos, mediante experimentos
de simulación y/o en el laboratorio, para demostrar los umbrales para parámetros de similitud que ofrecen protec-
ción contra una ausencia de similitud importante. Asimismo, los análisis de riesgo se pueden informar utilizando el
índice terapéutico del fármaco.
Paso3. Examinarsi el valorde la medidade falta de similitudse encuentradentro del intervalode equivalenciade valoresacep-
tables.
Para las metodologías (a) y (b), comparar el valor obtenido de la medida de falta de paralelismo (a) o su intervalo de
confianza (b) con el intervalo obtenido al inicio del Paso 2. El valor debe estar dentro de los límites si se utiliza (a), o el
intervalo de confianza debe estar completamente dentro de los límites si se utiliza (b).
Una alternativa a la metodología descrita anteriormente [para (a)] consiste en usar un valor promedio (histórico) para la
varianza del cociente o diferencia en un parámetro de similitud-obtenido a partir de algún número de valoraciones indi-
viduales-para calcular un intervalo de aceptación para una estimación puntual del parámetro de similitud. Esta metodo-
logía es más simple de implementar en la rutina y se puede usar con diseños de valoraciones que no sean capaces de
proveer estimaciones fidedignas de variación dentro de la valoración, aunque existe un precio. La metodología de análisis
de equivalencia que se basa en las mediciones de variación específica de la valoración (dentro de la valoración) (es decir,
los intervalos de confianza) presenta una postura conservadora en el sentido de que no aprobará la similitud de las mues-
tras de valoraciones con cantidades mayores a las habituales de variación dentro de la valoración. El uso de una región de
aceptación para un parámetro de similitud -en lugar de una región de aceptación para intervalos de confianza para el
parámetro de similitud-pierde dicho conservadurismo y, por ende, no es la opción preferida ante la existencia de alterna-
tivas.
Para la metodología (c), se puede emplear una metodología que esencialmente trate el paralelismo como un problema de
diferenciación. La selección del punto de corte en la metodología (c) debe tomar en cuenta las tasas de decisiones de
falsos positivos y falsos negativos (así como los riesgos aceptables para el laboratorio) y debe reflejar con precisión la varia-
bilidad entre valoraciones. Por lo tanto, resulta razonable comparar la estimación puntual de la medida de falta de parale-
lismo con el punto de corte y no usar intervalos de confianza. Esta metodología es más simple de implementar en la ruti-
na y se puede usar con diseños de valoraciones que no son capaces de proveer estimaciones confiables de variación den-
tro de la valoración.
Para la metodología (d), se debe demostrar que la medida de ausencia de similitud es significativamente mayor que el
punto final inferior del intervalo de aceptación y significativamente menor que el punto final superior. (Si el intervalo de
aceptación es unilateral, se realiza únicamente la prueba individual aplicable.) Este es el uso de la metodología de Pruebas
Doblemente Unilaterales. En la mayoría de los casos, la metodología de Pruebas Doblemente Unilaterales se puede imple-
mentar de manera simple calculando un intervalo de confianza bilateral del 90%, que corresponde a una prueba de equi-
valencia del 5%. Si este intervalo de confianza cae totalmente dentro del intervalo de equivalencia especificado al inicio
del Paso 2, entonces se habrá demostrado con suficiencia la similitud. Para modelos de líneas paralelas, se puede usar (1)
un intervalo de confianza basado en el valor de la diferencia de las pendientes ±k veces el error estándar de dicho valor o
(2) el Teorema de Fieller para el cociente de las pendientes. Para modelos de cociente de pendientes, se emplea el interva-
lo de confianza para la diferencia de las intersecciones. Para modelos no lineales, existe evidencia de que estos métodos
simples de intervalo de confianza no alcanzan el nivel de confianza declarado, mientras que los métodos basados en perfi-
les de probabilidad o remuestreo son más apropiados.
INTERVALO
El intervalo para una valoración biológica de la potencia relativa es el intervalo entre las potencias superior e inferior para las
que la valoración biológica presenta niveles de precisión adecuados, exactitud relativa, linealidad del logaritmo de potencia y
tasas de éxito para la aptitud del sistema y de la muestra. Resulta fácil determinar si una muestra, que es similar a un Estándar,
tiene o no una potencia relativa dentro del intervalo (validado) del sistema de valoración. Para muestras que no son similares
de conformidad con los criterios establecidos, resulta más complicado determinar si se puede obtener una estimación de la
potencia relativa para la muestra. En una valoración no lineal de líneas paralelas, se puede suponer que una muestra que no
presenta datos sobre una asíntota está fuera del intervalo de potencia de la valoración. En una valoración de línea recta parale-
la, una muestra que no tiene tres o más puntos en la porción pronunciada de la curva de respuesta puede estar fuera del inter-
valo de potencia de la valoración. Para muestras que no hayan mostrado similitud con la referencia, resulta inapropiado infor-
mar la potencia o generar un cociente de los EC50 a partir de ajustes no restringidos. Puesto que dichas muestras pueden estar
fuera del intervalo de la valoración, podría ser útil cambiar la dilución de la muestra de prueba para una valoración subsiguien-
te, basándose en una estimación de la actividad relativa. Esta actividad relativa estimada puede obtenerse mediante el cociente
entre las concentraciones del Estándar y la Prueba que genera respuestas que coinciden con la respuesta de referencia en el
EC50 de referencia.
4.8 ValoresAberrantes
Es necesario analizar los datos de la valoración biológica para detectar valores aberrantes antes del análisis de la potencia
relativa. Los valores aberrantes pueden ser simples eventos aleatorios o una señal de un problema sistemático en la valoración
biológica. El error sistemático que genera valores aberrantes puede deberse a un error de dilución en una o más concentracio-
nes de una muestra de Prueba o del Estándar, o debido a un error mecánico (p. ej., mal funcionamiento del sistema). Se pue-
den tener en cuenta diversas metodologías para detectar valores aberrantes. La inspección visual se utiliza con frecuencia, aun-
que se debe aumentar su alcance con una metodología más objetiva para prevenir un posible sesgo.
Un valor aberrante es un dato que aparentemente está fuera de lugar con respecto a los otros datos presentes. Un valor
aberrante puede tener una causa distinta e identificable, como por ejemplo, un error en la práctica, mal funcionamiento del
equipo o un error de registro de datos, o simplemente puede ser un valor inusual con respecto a la variabilidad comúnmente
observada y puede aparecer sin una causa identificable. La pregunta esencial con respecto a un valor aberrante es: ¿El valor
aberrante aparente se obtiene a partir de la misma población que los otros datos menos discrepantes o forma parte de otra
población? Si proviene de la misma población y, por lo tanto, el dato es un valor inusual (aunque legítimo) obtenido de casua-
lidad, entonces el dato debe mantenerse. Si proviene de otra población y el valor inusual del dato se debe a un error humano
o al mal funcionamiento de un instrumento, entonces el dato debe omitirse de los cálculos. En la práctica, a menudo se desco-
noce la respuesta a esta pregunta básica y las investigaciones sobre las causas a menudo son inconclusas. La administración de
valores aberrantes se basa en procedimientos y prácticas para generar la mejor respuesta posible a dicha pregunta esencial y
para guiar hacia una respuesta correcta.
El capítulo general DatosAnalíticos-Interpretacióny Tratamiento(101 O) trata la designación, la identificación y el rechazo de
valores aberrantes, e incluye métodos estadísticos. Asimismo, el Capítulo General (101 O) cita fuentes adicionales de informa-
ción que pueden ofrecer una revisión exhaustiva de la metodología estadística pertinente. El Capítulo General (101 O) no ofrece
comentarios explícitos con respecto al análisis de valores aberrantes en regresiones lineales o no lineales. Se pueden usar técni-
cas de análisis de valores aberrantes apropiadas para datos obtenidos de la regresión de la respuesta sobre la concentración.
Este capítulo ofrece algunos comentarios sobre valores aberrantes para el contexto de valoraciones biológicas a fin de enfatizar
o complementar la información del capítulo (101 O).
De todos los procedimientos empleados para el análisis de compuestos farmacéuticos y fármacos biológicos, se puede espe-
rar que la valoración biológica presente la mayor tendencia a producir datos aberrantes. La administración de valores aberran-
tes es adecuada para los datos de valoración biológica en al menos dos niveles: cuando se puede verificar un dato individual o
un grupo de datos (p. ej., datos a una concentración) en función de las respuestas esperadas para la muestra y la concentra-
ción; y, por separado, cuando se pueden verificar la uniformidad de las estimaciones de potencia relativa de una valoración en
función de otras estimaciones independientes de la potencia del mismo material.
Tres aspectos importantes de la administración de valores aberrantes son la prevención, la designación y la identificación.
La prevención de valores aberrantes se prefiere por razones obvias, y se facilita mediante procedimientos que sean menos
propensos a errores y mediante verificaciones que sean sensibles a los tipos de errores que, dada la experiencia obtenida en el
desarrollo de la valoración, podrían esperarse. En efecto, el error nunca se convierte en un valor aberrante puesto que se pre-
vee su ocurrencia.
Una buena práctica re9uiere examinar los datos para detectar valores aberrantes y designar ("marcado") las observaciones
sobre aparentes valores aberrantes para su investigación. Si la investigación detecta una causa, entonces el dato aberrante se
puede excluir del análisis. Debido a la presencia común de variabilidad importante en la respuesta de las valoraciones biológi-
cas, es probable que una investigación del laboratorio sobre la observación de valores aberrantes no determine una causa. Sin
embargo, la falta de evidencia relacionada con la causa de un valor aberrante no es una indicación clara de que se requiera un
análisis estadístico de valores aberrantes. El conocimiento sobre el intervalo típico de la variabilidad de la respuesta de la valo-
ración debe usarse como justificación para utilizar análisis estadísticos para valores aberrantes.
La identificación de valores aberrantes consiste en utilizar reglas para confirmar que los valores no son uniformes con el mo-
delo estadístico conocido o asumido. En el caso de valores aberrantes sin una causa determinada, resulta tentador el uso de
procedimientos estadísticos de identificación de valores aberrantes para descartar valores inusuales. Descartar datos basándose
únicamente en consideraciones estadísticas debe realizarse con la menor frecuencia posible. El descarte falso de datos conlleva
a estimaciones de variabilidad demasiado optimistas y puede sesgar las estimaciones de potencia. El laboratorio debe monito-
rear la tasa de incumplimiento para su procedimiento de valores aberrantes y debe tomar acciones cuando ésta sea significati-
vamente más alta de lo esperado.
Los procedimientos estadísticos para la identificación de valores aberrantes depende de suposiciones con respecto a la distri-
bución de datos sin valores aberrantes. La identificación de datos como valores aberrantes podría significar únicamente que la
suposición con respecto a la distribución es incorrecta. Si es común la reducción de valores aberrantes debido a consideracio-
nes estadísticas, en particular si los valores aberrantes tienden a presentarse en valores o respuestas altos, entonces esto puede
indicar que los datos requieren de algún ajuste, por ejemplo una transformación logarítmica, como parte del procedimiento de
valoración. Dos metodologías para la evaluación estadística de valores aberrantes están basadas en determinaciones repetidas
y en modelos.
METODOLOGÍASBASADASEN DETERMINACIONES
REPETIDAS
Cuando se llevan a cabo determinaciones repetidas en concentraciones de una muestra de Prueba y del Estándar, se puede
emplear un criterio de "variabilidad extra" (EV,por sus siglas en inglés) para detectar valores aberrantes. Los datos históricos
pueden analizarse para determinar el intervalo en la variabilidad comúnmente observada entre determinaciones repetidas y
dicha distribución de intervalos se puede usar para establecer un extremo en el intervalo que puede señalar un valor aberrante.
Las métricas que pueden emplearse incluyen el intervalo simple (repetición máxima menos repetición mínima), la desviación
estándar, o el coeficiente de variación o desviación estándar relativa (RSD, por sus siglas en inglés) entre determinaciones repe-
tidas. No obstante, si la valoración biológica presenta heterogeneidad en la variabilidad, las suposiciones con respecto a la dis-
persión uniforme de datos son infundadas. Los analistas pueden usar un criterio variable a través de distintos niveles de la valo-
ración biológica, o pueden transformar los datos a una escala que produzca una variabilidad homogénea. La transformación se
puede llevar a cabo con una metodología de Poder de la Media, según se discutió con anterioridad. Cuando está presente la
heterogeneidad, es muy probable que exista una falta de normalidad, por lo que se debe usar el intervalo en lugar de la des-
viación estándar o la desviación estándar relativa.
Las acciones tomadas al detectar un valor aberrante potencial dependen en parte del número de determinaciones repetidas.
Si se detecta una variabilidad extra dentro de un par (n = 2) a una concentración de una muestra de Prueba o del Estándar, no
siempre resultará claro cuál de las determinaciones repetidas es aberrante, por lo que el laboratorio deberá eliminar la concen-
tración de cualquier otro procesamiento adicional. Cuando se llevan a cabo más de dos determinaciones repetidas en cada
dilución, el laboratorio puede optar por una estrategia que identifique cuál de los extremos puede ser el valor aberrante. Como
alternativa, el laboratorio puede optar por eliminar la dilución del procesamiento adicional.
METODOLOGÍASBASADASEN MODELOS
Las metodologías basadas en modelos se pueden usar para detectar valores aberrantes dentro de los datos de la valoración
biológica. Estas metodologías emplean los residuos derivados del ajuste de un modelo apropiado. En general, si se emplean
métodos basados en modelos para identificar valores aberrantes potenciales, los modelos usados pueden realizar menos supo-
siciones sobre los datos que los modelos usados para evaluar la aptitud y la potencia estimada. Por ejemplo, un modelo de
regresión no paramétrico (suavizado) puede ser útil.
Por último, una alternativa para descartar datos aberrantes consiste en usar métodos robustos que sean menos sensibles a la
influencia de observaciones de valores aberrantes. El uso de la mediana en lugar de la media para describir el centro de los
datos es un ejemplo de una perspectiva robusta. Asimismo, una regresión empleando el método de cuadrados mínimos, que
sustenta muchos de los métodos tratados en este capítulo, no es robusta ante la presencia de valores aberrantes. El uso de
métodos tales como una regresión robusta puede ser adecuado, pero no está cubierto en los capítulos de valoraciones biológi-
cas de la USP.
4.9 Efectos Fijos y Aleatorios en Modelos de Respuesta de Valoraciones Biológicas
La elección de tratar factores como fijos o aleatorios es importante para el diseño de las valoraciones biológicas, los experi-
mentos de desarrollo, el análisis estadístico de datos y la validación de la valoración biológica. Los efectos fijos son factores
para los que todos los niveles, o todos los niveles de interés, se presentan discretamente, como muestra, concentración, tem-
peratura y duración de la descongelación, y tiempo de incubación. Los datos para una respuesta a cierto nivel o a una combi-
nación de niveles de un factor fijo puede predecir respuestas futuras. Se espera que los efectos fijos ocasionen un cambio uni-
forme en las respuestas. Los analistas estudian los efectos fijos controlándolos en el diseño y examinando los cambios en las
medias a distintos niveles del factor.
Los efectos aleatorios son factores cuyos niveles en una corrida particular de una valoración se consideran representativos de
los niveles que pudieran estar presentes. Es decir, no se espera que ningún valor específico del factor aleatorio tenga influencia
sobre la respuesta, si no que dicho valor pueda variar dependiendo de cierta distribución de valores esperada y que, por consi-
guiente, pueda ser una fuente de variabilidad. Por ejemplo, no se desea predecir la respuesta de la valoración para un día espe-
cífico, pero existe interés en predecir la variación en la respuesta relacionada con el factor "día". Los ejemplos de los efectos
aleatorios incluyen el lote de reactivo, el operador o el día si no existe interés en lotes de reactivos, operadores o días específicos
como fuentes de variabilidad. Los analistas pueden estudiar los efectos aleatorios midiendo los componentes de varianza que
corresponden a cada efecto aleatorio. Los componentes de varianza solo se pueden estimar de manera adecuada si existe un
número apreciable de niveles de cada efecto aleatorio. Si, por ejemplo, se cuenta únicamente con dos o tres lotes de reactivo o
analistas presentes, la estimación de la variación asociada con dichos factores será deficiente.
Realizar una selección correcta con respecto a la forma de tratar un factor como fijo o aleatorio es importante para el diseño
de la valoración y para informar apropiadamente su precisión. Por ejemplo, tratar todos los factores como fijos conlleva a su-
bestimar la variabilidad de la valoración, puesto que ignora todas las fuentes de variabilidad distintas a las determinaciones
repetidas. El objetivo es identificar las fuentes específicas de variabilidad que puedan ser controladas para incluir de manera
apropiada aquellos factores en el diseño y, posteriormente, incluir otros factores como aleatorios.
Si el factor puede cambiar de aleatorio a fijo o viceversa, el factor debe incluirse en el modelo generalmente como un efecto
aleatorio. Por ejemplo, cuando los lotes de reactivo no pueden ser controlados, por lo regular se considera que diferentes lotes
ocasionan variabilidad, por lo que el lote de reactivo se consideraría un efecto aleatorio. No obstante, si se ha detectado un
gran cambio en los valores de respuesta en un lote determinado, se puede llevar a cabo una comparación entre un conjunto
de lotes usando un lote de reactivo como efecto fijo. De manera similar, la secuencia o ubicación dentro de la valoración (p.
ej., bloque, placa, fila de la placa, columna de la placa o pocillo) se puede considerar como una fuente de variación aleatoria o
una fuente de un efecto constante (fijo).
Los diseños de valoraciones que constan de múltiples factores son eficientes, pero requieren de las técnicas estadísticas co-
rrespondientes que incorporen los factores en el análisis como efectos fijos o aleatorios. Cuando todos los factores son fijos, el
modelo estadístico recibe el nombre de modelo de efectos fijos. Si todos son aleatorios, se le denomina modelo de efectos
aleatorios. Si algunos factores son fijos y otros son aleatorios, se trata de un modelo de efectos mixtos. Se debe tomar en cuen-
ta que los conceptos de efectos fijos y aleatorios aplican a modelos para respuestas cuantitativas, cualitativas e integrales. Para
diseños de valoración que incluyan múltiples unidades experimentales (p. ej., muestras asignadas a conjuntos de tubos y con-
centraciones asignadas a tubos pre-placas), resulta particularmente efectivo un modelo de efectos mixtos en el que las unida-
des experimentales se tratan como efectos aleatorios. La presencia de diseños con efectos aleatorios cruzados (p. ej., cada ope-
rador usó material de una o más partidas de reactivo, pero muchas partidas de reactivos fueron empleadas por múltiples ope-
radores) agrega todavía más complejidad. Esto puede ocasionar desafíos metodológicos y de cálculo adicionales para el ajuste
del modelo, en especial cuando los diseños están desequilibrados.
5. ETAPASDEL PROCESODE DESARROLLODE LA VALORACIÓN BIOLÓGICA

Dada la ubicuidad de las valoraciones basadas en células y la motivación para emplear un sistema de valoración biológica
para ofrecer un contexto de discusión, el desarrollo de una valoración biológica basada en células se utilizará para ilustrar las
etapas del continuum del desarrollo de la valoración biológica.
5.1 Diseño: Planificaciónde la Valoración, Distribuciónen Bloquesy Aleatorización
La mayoría de las valoraciones basadas en células se llevan a cabo usando una placa de cultivo celular (placa de microtitula-
ción de 6; 12; 96 ó 384 pocillos). Idealmente, una placa puede proporcionar un sustrato uniforme para tratamientos experi-
mentales en todos los pocillos, incluyendo las etapas posteriores al lavado e incubación. No obstante, independientemente de
las condiciones de la valoración con las que se pretenda minimizar el potencial de sesgo (p. ej., buena técnica del analista,
calibración cuidadosa de pipetas, tiempo de incubación controlado y temperatura), se pueden observar gradientes sistemáti-
cos en la placa, independientes de los tratamientos experimentales. Estos gradientes pueden ocurrir a través de filas, columnas
o desde el borde hacia el centro de la placa, y a menudo se denominan efectosdeplaca. Incluso los efectos de placa modera-
dos o inconsistentes deben tratarse durante el desarrollo de la valoración, mediante estrategias de distribución de placa, distri-
bución en bloques, aleatorización y determinaciones repetidas.
Los efectos de placa se pueden evaluar en un ensayode uniformidaden el que se usa en todos los pocillos de la placa un solo
tratamiento experimental, como por ejemplo una concentración de valoración seleccionada a partir de la sección media de la
curva de concentración-respuesta. La Figura1 ofrece un ejemplo de lo que puede llegar a observarse; una tendencia de la
señal a disminuir de derecha a izquierda es evidente. En este caso, se descubrió que la lavadora de placas estaba lavando de
manera más enérgica el lado izquierdo de la placa y fue necesario ajustarla para proveer una intensidad de lavado uniforme y
eliminar el gradiente. Otro efecto de placa común es un patrón de crecimiento celular diferencial en el que los pocillos exter-
nos de la placa cultivan células de tal manera que se atenúa la señal de la valoración. Éste es un problema tan persistente que a
menudo se opta por no utilizar los pocillos externos de la placa de valoración. Debido a que los efectos de ubicación son muy
comunes, se deberían evitar los diseños que emplean determinaciones repetidas (p. ej., de muestra por combinaciones de con-
centración) en pocillos adyacentes.
Uniformidad
■ '.i000-2500
AFU
01500-2000
"1000-1500
■ 500.1000
mo.500
Figura 1. Gráfica de cambio en la respuesta de la valoración a través de la placa.
La Distribuciónen Bloqueses el agrupamiento de unidades experimentales relacionadas en diseños experimentales. Los blo-
ques pueden consistir en placas individuales de 96 pocillos, secciones de placas de 96 pocillos o placas de 96 pocillos agrupa-
das por analista, por día o por partida de células. El objetivo es aislar cualquier efecto sistemático de modo que no oscurezca
los efectos de interés. Un diseñocompletoen bloquesocurre cuando todos los niveles de un factor de tratamiento (en una valo-
ración biológica, los factores de tratamiento primario son la muestra y la concentración) se aplican a unidades experimentales
para dicho factor dentro de un solo bloque. Un diseñoincompletoen bloquesocurre cuando el número de niveles de un factor
de tratamiento excede el número de unidades experimentales para dicho factor dentro del bloque.
La Aleatorizaciónes un proceso de asignación de tratamiento a unidades experimentales basado en probabilidad de tal ma-
nera que todas las unidades experimentales tengan la misma probabilidad de recibir un tratamiento determinado. Aunque re-
sulta complicada en la práctica, la aleatorización de tratamientos experimentales ha sido defendida como la mejor metodolo-
gía para minimizar el sesgo de la valoración o, más precisamente, para proteger los resultados de la valoración de fuentes co-
nocidas y desconocidas de sesgo, convirtiendo el sesgo en varianza. Aunque la aleatorización de muestras y concentraciones
en pocillos individuales de placas puede no resultar práctico, la distribución de la placa puede diseñarse para minimizar los
efectos de placa, alterando las posiciones de la muestra a través de las placas y el patrón de diluciones dentro y a través de las
placas. Cuando se requieren múltiples placas en una valoración, el diseño de distribución de la placa debe, por lo menos, alter-
nar posiciones de muestras a través de las placas dentro de una corrida de valoración para evitar un posible sesgo introducido
por los analistas o el equipo en un día determinado. Resulta prudente emplear una rotación equilibrada de distribuciones en
las placas de modo que la recolección de determinaciones repetidas (cada una de las cuales utiliza una distribución distinta)
proporcione algo de protección contra fuentes problables de sesgo.
La Figura2 presenta un diseño de valoración en patrones que carece de aleatorización y es susceptible al sesgo. Las dilucio-
nes y las determinaciones repetidas de las preparaciones de Prueba (A y B) y del Estándar (R) se colocan juntas de manera
secuencial en la placa. El sesgo debido a un efecto de placa o incubadora puede influenciar parte o la totalidad de las concen-
traciones de una de las muestras. Se debe tomar en cuenta que en las Figuras2 a 5 los pocillos exteriores de la placa se dejan
como blancos para proteger contra el efectodel borde.
7396 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General USP 42
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
8
e A3 A4 A5
D B3 84 85 88 89
E B3 84 85 88 89
F R3 R4 R5 R8 R9
G
H
Figura 2. Placa con patrones muy marcados.
Una distribución que ofrece algo de protección de los efectos de placa y que se puede realizar de forma manual es un diseño
degráficaen filas,que se presenta en la Figura3. En dicha distribución, las muestras se distribuyen aleatoriamente en filas de
una placa y se llevan a cabo series de diluciones en distintas direcciones en diferentes secciones (bloques) de la placa para
mitigar el sesgo a través de las columnas de la placa. Una ventaja extra del diseño de gráfica en tiras es su capacidad para
detectar efectos de ubicación mediante la interacción de la muestra y la dirección de la dilución (de izquierda a derecha o
viceversa).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
8
e A5 A6 A7
D 84 85 86 B7 88 89
E R7 R6 R5 R4 R3 R2
F A7 A6 A5 A4 A3 A2
G
H
Figura 3. Diseño de una gráfica en tiras
La Figura4 presenta una alternación de las posiciones de la Prueba (muestra de Prueba 1 = "l "; muestra de Prueba 2 = "2")
y del Estándar ("R") en múltiples placas, dentro de una sola corrida de valoración; esto ofrece protección contra los efectos de
fila en la placa. Combinar los dos métodos ilustrados en las Figuras3 y 4 puede ayudar a convertir de manera efectiva el sesgo
de la placa en varianza de la valoración. Posteriormente, se puede tratar la varianza de la valoración, según se requiera, me-
diante un número mayor de determinaciones repetidas de la valoración (mayor número de placas en una valoración).
USP42 Información GeneralJ (1032) Valoraciones Biológicas 7397
Fila de la Placa Placa 1 Placa 2 Placa 3
B R 2 1
e 1 R 2
o 2 1 R
E R 2 1
F 1 R 2
G 2 1 R
Figura 4. Valoración de placas múltiples con posiciones de Prueba y Estándar variadas.
El diseñode gráfica dividida, una alternativa que asigna muestras a las filas de las placas de manera aleatoria y que distribuye
aleatoriamente las diluciones (concentraciones) dentro de cada fila, se presenta en la Figura5. Dicha estrategia puede ser difícil
de implementar, incluso con el uso de instrumentos robóticos.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
8
e
D
E
F
G
H
Figura 5. Diseño de gráfica dividida.
ESTRATEGIA
DE DILUCIÓN
Las concentraciones de valoración de una muestra de Prueba y del Estándar se pueden obtener de diversas maneras. Los
laboratorios a menudo llevan a cabo diluciones en serie, en las que cada dilución se prepara a partir de una dilución previa, en
sucesión. Como alternativa, el laboratorio puede preparar diluciones completamente independientes a partir de la muestra de
Prueba y del Estándar para obtener series de concentraciones independentes. Estas dos estrategias resultan en las mismas con-
centraciones nominales, pero tienen propiedades distintas con respecto al error. Las diluciones seriales están sujetas a la propa-
gación del error a través de las series de diluciones y un error de dilución cometido en una dilución temprana tendrá como
resultado observaciones correlacionadas no independientes. Las correlaciones también se pueden introducir empleando pipe-
tas multicanal. Las diluciones independientes ayudan a mitigar el sesgo que resulta de los errores de dilución.
Es importante mencionar que cuando se trabaja para mejorar la precisión, las reducciones más grandes de varianza se logran
mediante determinaciones repetidas en los niveles más altos posibles de los efectos aleatorios anidados. Lo anterior resulta par-
ticularmente efectivo cuando dichos niveles altos son fuentes de variabilidad. Por ejemplo: llevar a cabo muchas determinacio-
nes repetidas en un día para una valoración que se sabe presenta una gran variación entre días no es una forma efectiva de
mejorar la precisión de los valores de informe.
5.2 Desarrollo
Una meta del desarrollo de la valoración biológica es obtener una exactitud relativa de la valoración biológica y una preci-
sión de la estimación de potencia óptimas. Un punto final del desarrollo de la valoración consiste en el desarrollo completo del
procedimiento de valoración, un protocolo para la realización de la valoración biológica. El procedimiento debe incluir detalles
suficientes para que un laboratorio calificado con un analista capacitado pueda realizar el procedimiento de manera rutinaria.
Una parte estratégica del desarrollo es buscar que se mantenga el desempeño. Los procedimientos operativos estándar para
7-
calificación de reactivos y de técnicos, así como para la calibración del Estándar de trabajo, ayudan a completar el paquete de
desarrollo de la valoración biológica.
LAMETODOLOGÍADE UN FACTORA LAVEZ CONTRAEL DISEÑO DE EXPERIMENTOS
El desarrollo de la valoración biológica avanza a través de una serie de experimentos en los que las condiciones y los niveles
de los factores de la valoración se varían para identificar aquéllos que sustentan una valoración biológica confiable y robusta,
calificada para el uso rutinario. Dichos experimentos se pueden llevar a cabo mediante la metodología de un factor a la vez
(OFAT,por sus siglas en inglés), estudiando cada parámetro por separado para identificar condiciones ideales, o mediante el
uso de un diseño de experimentos de factores múltiples (DOE, por sus siglas en inglés). El diseño de experimentos de factores
múltiples es una estrategia eficiente y efectiva para desarrollar una valoración biológica y mejorar el desempeño de la misma,
ayudando de esta manera a obtener un sistema de medición que cumple con los requisitos. En comparación con la metodolo-
gía de un factor a la vez, el diseño de experimentos de factores múltiples por lo regular requiere una menor cantidad de expe-
rimentos y también ofrece una perspectiva sobre las interacciones de los factores que afectan el desempeño de la valoración
biológica. El desarrollo de la valoración mediante un diseño de experimentos de factores múltiples puede proseguir a través de
una serie de etapas: mapeo del proceso y análisis de riesgos, examen, optimización de la respuesta y confirmación.
MAPEO DELPROCESOY ANÁLISISDE RIESGOS
La optimización de la valoración biológica puede comenzar con un examen sistemático y una evaluación de riesgos para
identificar aquellos factores que podrían influenciar la respuesta de la valoración biológica. Resulta útil visualizar factores de la
valoración biológica empleando un mapa del proceso de la misma, como por ejemplo, un diagrama de causa y efecto o de
espina de pescado. Mediante el uso del mapa de proceso como guía, el laboratorio puede examinar los factores que podrían
afectar el desempeño de la valoración, tales como pH de la solución amortiguadora, temperatura de incubación y tiempo de
incubación. Históricamente, la experiencia con una o más de las etapas de la valoración biológica, junto con un juicio científico
fundamentado, pueden identificar factores claves que requieran de evaluación adicional. Una herramienta que se puede em-
plear para priorizar factores es un análisis del modo y los efectos de la falla. Los factores generalmente se contabilizan combi-
nando su potencial para influenciar la respuesta de la valoración y su probabilidad de ocurrir. El laboratorio debe prestar aten-
ción para reconocer interacciones potenciales entre los factores de la valoración.
EXAMEN
Una vez que se han identificado los factores claves mediante el mapeo del proceso y el análisis de riesgos, el laboratorio
puede llevar a cabo un experimento inicial para explorar los efectos para los que podría ser necesario aplicar controles. Los
diseños de examen como los de tipo factorial y factorial fracciona! se emplean comúnmente con este propósito. Existe softwa-
re disponible para ayudar al practicante con la selección del diseño y el análisis subsiguiente. No obstante, el analista debe
tener cuidado de comprender sus suposiciones sobre la selección del diseño y el análisis para asegurar la identificación exacta
de los factores experimentales.
OPTIMIZACIÓNDE LARESPUESTA
Un diseño de examen, por lo general, podrá detectar unos cuantos factores importantes de entre aquéllos que se estudian.
Dichos factores se pueden estudiar aún más en un diseño de optimización de la respuesta. Los diseños de optimización de la
respuesta, tales como los diseños centrales compuestos, se llevan a cabo para determinar las configuraciones óptimas para las
combinaciones de factores de la valoración biológica, a fin de obtener la respuesta adecuada. La información obtenida a partir
de la optimización de la respuesta se puede representar como una superficie de respuesta y puede emplearse para establecer
intervalos que provean un desempeño aceptable de la valoración y que se incorporarán en el procedimiento de la valoración
biológica.
En el lenguaje de Calidad por Diseño (QbD, por sus siglas en inglés), la "región" en la que los niveles combinados de varia-
bles de ingreso y parámetros del proceso han demostrado proveer un desempeño aceptable de la valoración se describe como
el espaciodeldiseñopara la valoración biológica. Establecer un verdadero espacio del diseño para una valoración biológica re-
presenta un desafío; no todos los factores y niveles de factores aleatorios se incluirán en el Diseño de Experimentos de Factores
Múltiples del desarrollo, y no existe certeza de que el espacio del diseño no sea sensible a factores aleatorios no estudiados. De
manera similar, no se puede asegurar del todo que la valoración (espacio de diseño) sea robusta para factores aleatorios que se
estudian usando muestras pequeñas (o muestras de niveles no aleatorias). Los elementos del Diseño de Experimentos de Facto-
res Múltiples que se pueden considerar incluyen el uso de bloques; confusión deliberada entre interacciones que son de poco
interés o que no se consideran importantes; diseño robusto (diseños de superficie de respuesta con efectos aleatorios); y uso
de diseños de gráfica dividida, gráfica en tiras o lote dividido.
CONFIRMACIÓN
El modelo matemático que representa el desempeño de la valoración como una función de cambios en los factores claves de
la valoración es una aproximación; por consiguiente, se acostumbra a confirmar el desempeño en las configuraciones ideales
de la valoración biológica. La confirmación puede adquirir la forma de un ensayo de calificación en el que se lleva a cabo la
valoración, de preferencia en múltiples ocasiones independientes usando valores óptimos para factores. Alternativamente, el
laboratorio puede determinar que la valoración fue adecuadamente desarrollada y que se puede proseguir con la validación.
La calificación es una buena práctica, no un requisito reglamentario. La decisión de llevar a cabo corridas de calificación confir-
matorias o de proceder con la validación depende de la fuerza de la información acumulada obtenida durante el desarrollo.
5.3 Análisis de Datos durante el Desarrollo de la Valoración
El análisis de los datos de la valoración biológica durante el desarrollo de la valoración permite a los analistas tomar decisio-
nes en relación con el modelo estadístico que se utilizará para el análisis de rutina, incluyendo la transformación y/o la ponde-
ración de datos, así como el desarrollo de criterios de aptitud del sistema y de la muestra. El análisis también ofrece informa-
ción relacionada con los elementos de la estructura del diseño que deberían usarse durante la detección de valores aberrantes
y el ajuste de un modelo completo. Lo anterior puede incluir además un plan para seleccionar subconjuntos de datos, como
por ejemplo una porción lineal para análisis, o para valoraciones biológicas no lineales, una estrategia de reducción del modelo
para muestras similares al Estándar. Una vez que estas decisiones han sido tomadas y que se muestras sólidas durante la valida-
ción, no será necesario volverlas a evaluar con cada desempeño de la valoración. A continuación se presenta una metodología
de proceso para permitir la toma de dichas decisiones.
Paso 1: Seleccionarun modelo estadísticoapropiado (ver también la sección4. 6 ModelosComunesde ValoraciónBiológica).
Debido a la complejidad de las valoraciones biológicas y a la motivación para emplear una metodología que se considere
fidedigna, los modelos analíticos adecuadamente estandarizados son comunes en el campo de los análisis de valoraciones
biológicas. No obstante, existen muchas consideraciones implícitas en la selección del modelo estadístico más apropiado.
Primero, el modelo debe ser adecuado para el tipo de punto final de la valoración-continuo, recuento o dicotómico.
Segundo, el modelo debe incorporar la estructura del diseño de valoración. Para cualquier diseño distinto al completa-
mente aleatorizado, existirán términos en el modelo para los elementos estructurales. Por ejemplo, la distribución en blo-
ques dentro de las placas, la ubicación de la jaula en la instalación que alberga los animales, el día, entre otros. Una terce-
ra consideración, aplicable a los puntos finales continuos, implica decidir si se usa un modelo de regresión o un modelo
de media (un análisis del modelo de varianza que se ajusta a una media distinta en cada nivel de dilución de cada muestra
analizada), con términos de error apropiados. Un modelo de media puede ser apropiado en esta etapa debido a que no
realiza ninguna suposición sobre la forma de la curva de concentración-respuesta.
Paso2: Ajustar el modelo estadísticoseleccionadoa los datos sin la suposiciónde paralelismoy posteriormenteevaluar la distri-
bución de los residuos,examinándolosespecíficamente para detectar desviacionesde la normalidad y de la varianza constante.
Transformar los datos según se requiera o, si fuera necesario, seleccionar un esquema de ponderación (ver la sección 4.3
Heterogeneidadde la Varianza,Ponderacióny Transformación).Usar un cuerpo de datos de valoración, a partir de valoracio-
nes independientes, tan grande como sea posible. El objetivo primario es tratar cualquier desviación de la normalidad y
de la varianza constante de las respuestas en todo el intervalo de concentraciones en la valoración. El paso 2 probable-
mente alternará entre imponer una transformación y evaluar la distribución de los residuos.
Paso3: Examinarpara detectar valoresaberrantesy eliminarlosde manera apropiada.
Esta etapa, por lo regular, sigue a la selección inicial de una transformación adecuada y/o método de ponderación. El mo-
delo usado para detectar valores aberrantes idealmente contiene los elementos importantes de la estructura del diseño de
la valoración, permite curvas no similares y realiza menos suposiciones con respecto a la forma funcional de la curva de
concentración-respuesta que el modelo usado para evaluar la similitud. Ver la Sección 4.8. ValoresAberrantesy el capítulo
general (101 O) para información sobre la detección y eliminación de valores aberrantes. En algunos casos, los valores abe-
rrantes pueden ser tan severos que un modelo razonable podría no ajustarse, por lo que los residuos no estarían disponi-
bles. En tales casos, resulta necesario examinar los datos brutos para detectar valores aberrantes antes de intentar el ajuste
del modelo.
Durante el desarrollo de la valoración, se debe desarrollar una estrategia para la investigación y tratamiento de una obser-
vación de valores aberrantes, incluyendo cualquier límite sobre la cantidad aceptable de valores aberrantes. Estas instruc-
ciones deben incluirse en el Procedimiento Operativo Estándar de la valoración. La buena práctica incluye registrar el pro-
ceso de una investigación, las pruebas para valores aberrantes aplicadas y los resultados de las mismas. Se debe tomar en
cuenta que los procedimientos para valores aberrantes deben considerarse de manera independiente a la investigación y
el tratamiento de un resultado fuera de la especificación (OOS, por sus siglas en inglés) (valor de informe). Las decisiones
para eliminar un valor aberrante del análisis de los datos no debe tomarse basándose en el efecto que sufrirá el valor de
informe (p. ej., un resultado potencial fuera de la especificación). La eliminación de datos como valores aberrantes no de-
be practicarse con regularidad. Si se eliminan muchos valores como valores aberrantes de una corrida, dicha corrida se
debe considerar sospechosa.
Paso4: Reajustarel modelo con la transformacióny/o ponderaciónpreviamenteimpuesta (Paso2) sin las observacionesidenti-
ficadascomo valoresaberrantes(Paso3) y volvera evaluar la idoneidad del modelo.
Paso5: Cuandoresultenecesarioo deseable,seleccionarun esquemapara identificarlossubconjuntosde datos para su uso en

la estimaciónde potencia,ya sea el modelolinealo no lineal(verla sección4.5 Linealidadde los Datosde Concentración-
Respuesta).
Paso6: Calcularuna estimaciónde potencia relativaanalizandolos datos de la Pruebay del Estándaral mismo tiempomedian-
te un modelo que deberá tener líneaso curvasparalelaso interseccionesidénticas.
5.4 Validaciónde la Valoración Biológica
La validación de la valoración biológica es un estudio basado en protocolos que demuestra que el procedimiento es adecua-
do para su uso. Se puede considerar una metodología por etapas para la validación, tal como en una validación "adecuada
para el uso pretendido" para sustentar la liberación de material de ensayo clínico, y una validación final exhaustiva antes de
tramitar la Solicitud para Productos Biológicos Terapéuticos (BLA,por sus siglas en inglés) o la Solicitud para Autorización de
Comercialización (MAA,por sus siglas en inglés). Se deben establecer y describir de manera clara los controles de aptitud del
sistema preliminar y de la muestra en el procedimiento de la valoración; dichos factores se pueden determinar basándose en la
experiencia adicional obtenida en el ejercicio de validación. El capítulo (1033) ofrece una discusión exhaustiva sobre la valida-
ción de valoraciones biológicas.
5.5 Mantenimiento de ValoracionesBiológicas

Aunque se trata de operaciones discretas, el desarrollo y la validación de una valoración biológica llevan a la realización de
actividades continuas. Las mejoras de la valoración se pueden implementar a medida que cambia la tecnología, conforme el
laboratorio se vuelve más versado con el procedimiento y los cambios a la metodología de la valoración biológica requieran la
reevaluación del desempeño de la misma. Algunos de estos cambios pueden ser respuestas a un desempeño inesperado du-
rante el procesamiento de rutina. Se deben monitorear las acciones correctivas usando procedimientos de control rutinario.
Los cambios importantes pueden requerir de un estudio para verificar que la valoración biológica sigue siendo adecuada para
su uso. Se puede emplear una metodología de análisis de equivalencia para demostrar que el cambio ha generado un desem-
peño adecuado. Asimismo, se puede llevar a cabo un estudio de orientación estadística para demostrar que el cambio no com-
promete las características de desempeño de la valoración previamente aceptables.
TRANSFERENCIA
DE LAVALORACIÓN
La transferencia de la valoración supone un uso pretendido conocido de la valoración biológica en el laboratorio receptor y
la capacidad requerida asociada para el sistema de valoración. Estos dos factores demarcan implícitamente, aunque quizás no
precisamente, los límites relacionados con la cantidad de sesgo y la pérdida de precisión permitida entre laboratorios. Para uti-
lizar dos laboratorios de manera intercambiable para sustentar un producto será necesario tomar en cuenta la variación entre
laboratorios, además de la precisión intermedia para los requisitos de tamaño de las muestras a fin de determinar la capacidad
del proceso. Para información y ejemplos relacionados con la interrelación entre sesgo, capacidad del proceso y validación, ver
Ejemplode Validaciónde ValoracionesBiológicasen el capítulo general (1033).
MEJORAMIENTO
O ACTUALIZACIÓN
DE UN SISTEMADE VALORACIÓNBIOLÓGICA
Una nueva versión de una valoración biológica puede mejorar la calidad de sesgo, precisión, intervalo, robustez, especifici-
dad, disminuir los costos de operación u ofrecer otras ventajas convincentes. Se puede utilizar un estudio puente al momento
de mejorar o actualizar una valoración biológica para comparar el desempeño de la nueva valoración con la ya establecida.
Además, se puede usar una variedad de muestras (p. ej., liberación del lote, estabilidad, sometidas a estrés, isoformas críticas)
para demostrar la equivalencia de las potencias estimadas. Aunque los sistemas de valoración pueden presentar algunas dife-
rencias (p.ej, una valoración biológica en animales frente a una valoración biológica basada en células), si las valoraciones em-
plean tanto el mismo Estándar como el mismo mecanismo de acción, existe una expectativa razonable de obtener potencias
comparables. Si la nueva valoración emplea un Estándar diferente, el requisito mínimo para una comparación aceptable es una
pendiente de uno en la relación logarítimica lineal entre las potencias estimadas. Un aspecto importante a considerar sobre
esta recomendación es que cualquier precisión deficiente o valoración con sesgo que se haya usado previamente podría tener
un impacto duradero sobre los requisitos de las determinaciones repetidas, incluso si la valoración se reemplaza posteriormen-
te con una valoración mejorada.
(1033) VALIDACIÓNDEVALORACIONES
BIOLÓGICAS
1. INTRODUCCIÓN
Las Valoraciones Biológicasforman una parte integral de la evaluación de calidad requerida para la fabricación y comercializa-
ción de muchos productos biológicos y de algunos medicamentos no biológicos. Las valoraciones biológicas que comúnmente
se utilizan para estimar la potencia de un fármaco se pueden distinguir de las pruebas químicas por su dependencia de un
sustrato biológico (p. ej., animales, células vivas o complejos funcionales de receptores diana). Debido a los múltiples factores
operativos y biológicos que surgen de su fundamento biológico, por lo general presentan una mayor variabilidad que las prue-
bas químicas.
Las valoraciones biológicas representan una de las diversas pruebas fisicoquímicas y biológicas con procedimientos y criterios
de aceptación que controlan los atributos críticos de calidad de un medicamento biológico. Conforme a lo descrito en las
Guías de la ICH titulada Specifications: Test Procedures And Acceptance Criteria For Biotechnological/Biological Products
(Q6B), sección 2.1.2, las técnicas de valoración biológica pueden medir la respuesta biológica de un organismo al producto;
una respuesta bioquímica o fisiológica a nivel celular; velocidades de reacción enzimáticas o respuestas biológicas inducidas
mediante interacciones inmunológicas; o unión de ligandos y receptores. A medida que surgen nuevos medicamentos biológi-
cos y nuevas tecnologías, es probable que aumente el alcance de las metodologías de valoración biológica. Por lo tanto, el
presente capítulo general, Validación de Valoraciones Biológicas (1033) se centra en metodologías que ofrecen flexibilidad para
adoptar nuevos métodos de valoración biológica, nuevos medicamentos biológicos, o la combinación de ambos para evaluar
la potencia del fármaco.
Las buenas prácticas de fabricación requieren que los métodos de prueba usados para evaluar el cumplimiento de los pro-
ductos farmacéuticos con los requisitos de calidad cumplan con los estándares apropiados de exactitud y confiabilidad. La vali-
dación de la valoración es el proceso de demostrar y documentar que las características de desempeño del procedimiento y de
su método de base cumplen con los requisitos para la aplicación prevista y que la valoración es, por lo tanto, adecuada para su
uso previsto. El capítulo general de la USP Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y la guía ICH Q2(Rl) describen las
características (parámetros) de desempeño de la valoración que se deben evaluar para procedimientos que sustenten produc-
tos farmacéuticos de pequeñas moléculas. Aunque resulta fácil evaluar estos parámetros de validación para muchos tipos de
medicamentos bien caracterizados por procesos químicos, aún no se ha delineado claramente su interpretación y aplicabilidad
para algunos tipos de valoraciones biológicas. Este capítulo trata la validación de valoraciones biológicas desde el punto de
vista de la medición de actividad, en lugar de mediciones de masa o fisicoquímicas, con el propósito de alinear las característi-
cas del desempeño de la valoración biológica con los usos en la práctica de las valoraciones biológicas.
La evaluación del desempeño de las valoraciones biológicas es un proceso continuo, pero debe realizarse una vez completa-
do el desarrollo. La validación de valoraciones biológicas se guía por un protocolo de validación que describe los objetivos y el
diseño del estudio de validación. El capítulo general (1033) ofrece objetivos de validación relacionados con las valoraciones
biológicas de la potenciarelativa.Las valoraciones biológicas de la potencia relativa se basan en una comparación de las res-
puestas de la valoración biológica para una muestra de Prueba contra las de un Estándar designado y ofrecen una medida
cuantitativa de la actividad biológica de la Prueba con respecto a la del Estándar.
Los parámetros de validación discutidos incluyen exactitudrelativa,especificidad, precisiónintermediae intervalo.Los laborato-
rios pueden usar la linealidadde las diluciones para verificar la exactitudrelativay el intervalodel método. Aunque la robustez no
es un requisito de validación, el presente capítulo general (1033) recomienda evaluar la robustez de la valoración biológica
antes de la validación. Asimismo, el capítulo (1033) describe metodologías para el diseño de la validación (selección de mues-
tras y estrategia para determinaciones repetidas), criterios de aceptación de la validación, análisis e interpretación de datos y,
finalmente, monitoreo del desempeño de la valoración biológica a través del control de calidad. Además, se analiza la docu-
mentación de los resultados de la validación de la valoración biológica, con respecto a los experimentos previos a la validación
que se llevan a cabo para optimizar el desempeño de la valoración biológica. Para los objetivos del presente capítulo general
(1033), el término "valoración biológica" deberá interpretarse con el sentido de "valoración biológica de la potencia relativa".
2. FUNDAMENTOSDE LA VALIDACIÓNDE LA VALORACIÓNBIOLÓGICA

El objetivo de la validación de la valoración biológica radica en confirmar que las características operativas del procedimiento
sean las adecuadas para el uso previsto del procedimiento. Las cuestiones implicadas en el desarrollo de una valoración bioló-
gica se describen con mayor detalle en el capítulo general (1032) y se asume que han sido resueltas al momento en que la
valoración biológica entra en la etapa de validación. Dichas decisiones deberán incluir una identificación de los componentes
de una valoración y de una corrida para la valoración biológica. Las diluciones (concentraciones) múltiples del Estándar y de
una o más muestras de Prueba constituyen un conjuntode determinaciones repetidas(también conocido como conjunto míni-
mo), que contiene un sustrato de prueba (p. ej., un grupo de animales o frascos de células) en cada dilución para cada mues-
tra (Pruebas y Estándar). Una corridase identifica como el trabajo realizado durante un periodo en el que existe una expectati-
va razonable de que la exactitud (certeza) y la precisión en el sistema de valoración se mantengan estables. En la práctica, una
corrida con frecuencia consiste en el trabajo realizado por un solo analista en un laboratorio, con un conjunto de equipo, en
7402 (1033) Valoraciones Biológicas/ InformaciónGeneral USP42
un tiempo corto (típicamente un día). Una valoración es el conjunto de datos usados para evaluar la similitud y potencia esti-
mada para cada muestra de Prueba relativa a un Estándar. Una corrida puede contener múltiples valoraciones, una sola valora-
ción o parte de una valoración. Se pueden combinar múltiples valoraciones para generar un valor de informe para una mues-
tra. Elvalor de informe es el valor que se compara con una especificación de producto.
Para valoraciones que implican grupos en cada dilución (p. ej., 6 muestras, cada una en 1O diluciones, en los pocillos no
localizados en los bordes de cada una de las placas de cultivo celular de 96 pocillos usadas) los grupos (placas) constituyen
bloquesestadísticos que deben ser elementos en la valoración y en los análisis de validación (los bloques se analizan en el capí-
tulo (1032)). Las determinaciones repetidas dentro de los bloques para muestras de Prueba no son generalmente rentables.
Este capítulo no proporciona un mayor análisis sobre los bloques, pues éste se encuentra disponible en el capítulo general
(1032).
Inicialmente, se asigna un valor de 1,0 ó 100% a la cantidad de actividad (potencia) del Estándar, y la potencia de la mues-
tra de Prueba se calcula comparando las curvas de concentración-respuesta para el par de la Prueba y el Estándar, cuyo resul-
tado es una medida sin unidad, que es la potencia relativa de la muestra de Prueba con respecto a la potencia del Estándar. En
algunos casos, se asigna un valor al Estándar correspondiente a otra propiedad, como por ejemplo, la concentración de proteí-
na. En dicho caso, la potencia de la muestra de Prueba es la potencia relativa multiplicada por el valor asignado del Estándar.
Una suposición de las valoraciones biológicas de líneas paralelas o de curvas paralelas (p. ej., logísticas de cuatro parámetros)
es que las curvas de dosis-respuesta generadas usando un Estándar y una Muestra de Prueba tienen una forma de curva similar
(paralela), que se diferencia únicamente por un cambio horizontal en la dosis logarítmica. Para valoraciones biológicas de co-
ciente de pendientes, las curvas generadas para las muestras Estándar y la Muestra deben ser lineales, pasar a través de una
misma ordenada al origen y diferir únicamente en sus pendientes. La información sobre cómo evaluar el paralelismo se propor-
ciona en los capítulos generales (1032) y (1034).
Para establecer la exactitud relativa y el intervalo de la valoración biológica, la validación de las muestras de Prueba se puede
construir usando una serie de diluciones del Estándar para evaluar la linealidad de las diluciones (linealidad de la relación entre
la potencia relativa conocida y la medida). Asimismo, el estudio de validación debe generar una estimación representativa de
la variabilidad de la determinación de potencia relativa. Aunque los estudios de robustez por lo general se realizan durante el
desarrollo de la valoración biológica, se pueden incluir en la validación factores claves de estos estudios, tales como el tiempo y
la temperatura de incubación y, para valoraciones biológicas basadas en células, el número de pasajes de células y el número
de células, en particular si interactúan con otro factor que se introduzca durante la validación (p. ej., un reactivo sensible a la
temperatura cuya sensibilidad varía entre lotes). Debido a la potencial influencia sobre la valoración biológica de factores como
múltiples analistas, instrumentos o procedencia de los reactivos, el diseño de la validación de la valoración biológica debe con-
siderar dichos factores. La variabilidad de la potencia causada por estos elementos combinados define la precisiónintermedia
(IP, por sus siglas en inglés) de la valoración biológica. Un estudio adecuado de la variabilidad de los valores de potencia obte-
nidos, incluyendo el impacto de factores intravaloración y entre corridas, puede ayudar al laboratorio a confirmar una estrate-
gia de análisis adecuada y a predecir la variabilidad inherente del valor de informe (que puede ser el promedio de múltiples
determinaciones de potencia). Las estimaciones de variabilidad también se pueden usar para establecer la magnitud de las di-
ferencias que se pueden distinguir entre muestras analizadas en la valoración biológica. 0/er la sección 3.4 Usode los Resultados
de la Validaciónpara la Caracterizaciónde Va/oracionesBiológicas.)
Para demostrar la especificidad (también conocida como selectividad) se requiere evidencia sobre la falta de influencia de los
componentes de la matriz tales como componentes del proceso de fabricación o productos de degradación, de modo que las
mediciones cuantifiquen únicamente la molécula diana. Otros métodos analíticos pueden complementar una valoración bioló-
gica mediante la medición o identificación de otros componentes en una mezcla.
2.1 Protocolo de Validación para Valoraciones Biológicas
Un protocolo de validación para valoraciones biológicas debe incluir el número y los tipos de muestras que se estudiarán en
la validación; el diseño del estudio, incluyendo los factores entre corridas e intracorridas; la estrategia para determinaciones
repetidas; los parámetros de validación predeterminados y los criterios de aceptación diana justificados para cada parámetro; y
el plan propuesto para el análisis de los datos. Se debe tomar en cuenta que, con respecto al cumplimiento de los criterios de
aceptación, el no encontrar un efecto importante desde el punto de vista estadístico no representa una base adecuada para
definir un desempeño aceptable en una valoración biológica; el cumplimiento con los criterios de aceptación se puede evaluar
de mejor manera usando una metodología de equivalencia.
Asimismo, se deben especificar los criterios de aceptación para la valoración, corrida y muestra, tales como la aptitud del
sistema y la similitud, antes de realizar la validación. Dependiendo del grado de desarrollo de la valoración biológica, los crite-
rios se pueden proponer como tentativos y se pueden actualizar con los datos de la validación. Los incumplimientos de la valo-
ración, de la corrida o de las muestras se pueden reevaluar de acuerdo con criterios definidos en el protocolo de la validación
y, con justificación sólida, incluirse en la evaluación general de la validación. Pueden ser necesarios ensayos de validación adi-
cionales para sustentar cambios en el método.
El protocolo de validación de la valoración biológica debe incluir criterios de aceptación diana para los parámetros de valida-
ción propuestos. Los pasos a tomar cuando no se cumpla un criterio de aceptación diana se deben especificar en el protocolo
de validación y pueden resultar en un límite en el intervalo de potencias que se puede medir en la valoración biológica o en
una modificación de la estrategia de determinaciones repetidas en el procedimiento de la valoración biológica.
2.2 Documentación de los Resultados de la Validación de la Valoración Biológica
Los resultados de la validación de la valoración biológica deben documentarse en un informe de validación. El informe de
validación debe sustentar la conclusión que indica que el método es adecuado para su uso o debe indicar una acción correcti-
va (tal como un incremento en la estrategia de determinaciones repetidas) que se llevará a cabo para generar resultados lo
suficientemente confiables como para conseguir que sea apto para el propósito. El informe debe incluir los datos brutos y los
resultados intermedios (p. ej., se deben proveer las estimaciones de los componentes de la varianza además de la precisión
intermedia general) que facilitarían la reproducción del análisis de validación de la valoración biológica por parte de un revisor
independiente. Las estimaciones de los parámetros de validación se deben informar para cada nivel y a nivel general, según
corresponda. Las desviaciones del protocolo de validación deben documentarse con su respectiva justificación. Las conclusio-
nes obtenidas del estudio se deben describir claramente con referencias a las acciones de seguimiento, según sea necesario.
Las acciones de seguimiento pueden incluir enmiendas en el sistema o en los criterios de aptitud del sistema o modificaciones
a la estrategia de determinaciones repetidas de la valoración biológica. Se pueden incluir referencias a experimentos de prevali-
dación como parte del informe del estudio de validación. Los experimentos de prevalidación pueden incluir experimentos de
robustez, en los que se hayan identificado los parámetros de la valoración biológica y se hayan establecido intervalos para pa-
rámetros significativos; asimismo, pueden incluir experimentos de calificación, en los que se haya llevado a cabo el procedi-
miento final para confirmar el desempeño satisfactorio durante la operación de rutina. Las conclusiones derivadas de los expe-
rimentos de prevalidación y calificación realizados durante el desarrollo contribuyen a la descripción de las características ope-
rativas del procedimiento de valoración biológica.
2.3 Diseño de Validación para Valoraciones Biológicas
La validación de valoraciones biológicas debe incluir muestras representativas de los materiales que se analizarán en la valo-
ración biológica y debe establecer de manera efectiva las características de desempeño del procedimiento. Para evaluar la exac-
titud relativa, se deben usar los niveles de potencia relativa de la muestra que delimitan el intervalo de potencias y que son
susceptibles de análisis en la valoración biológica. De tal manera, se pueden estudiar muestras que abarcan un amplio intervalo
de potencias para un medicamento o producto biológico con un amplio intervalo de especificación o para un producto con
una inestabilidad inherente, pero se puede usar un intervalo más estrecho para un producto más duradero. Se requiere un
mínimo de tres niveles de potencia, pero se recomiendan cinco para una evaluación fidedigna. Si se cumplen los criterios de
valoración para exactitud relativa y precisión intermedia, los niveles de potencia seleccionados constituirán el intervalo de la
valoración biológica. Como resultado, se obtendrá un intervalo limitado a partir de los niveles que no cumplan con sus crite-
rios de aceptación diana. También se pueden generar muestras para la validación de la valoración biológica sometiendo una
muestra a un nivel de estrés que pudiera observarse en la práctica rutinaria (es decir, investigaciones de estabilidad). Asimismo,
las influencias de la matriz de la muestra (excipientes, constituyentes del proceso o componentes de combinación) se pueden
estudiar estratégicamente variando de manera intencionada dichas influencias con el analito de interés, usando una metodolo-
gía multifactorial, lo cual a menudo habrá de realizarse durante el desarrollo, antes de generar los datos de liberación y estabili-
dad.
El diseño de la valoración biológica debe considerar todas las facetas del proceso de medición. Las fuentes de variabilidad en
las mediciones de la valoración biológica incluyen la preparación de la muestra, factores intracorridas y factores entre corridas.
La estimación representativa de la variabilidad de la valoración biológica requiere tomar en cuenta dichos factores. La prepara-
ción de la muestra de Prueba y del Estándar se deben llevar a cabo de manera independiente durante cada corrida de valida-
ción.
La estrategia de determinaciones repetidas usada en la validación debe reflejar el conocimiento adecuado de los factores que
pudieran influenciar la medición de la potencia. La variabilidad intracorridas puede verse afectada: por los factores operativos
de la valoración biológica que por lo general se establecen durante el desarrollo (temperatura, pH, tiempos de incubación,
etc.); por el diseño de la valoración biológica (número de animales, número de diluciones, determinaciones repetidas por dilu-
ción, espaciado de diluciones, etc.); por los criterios de aceptación de la valoración y de la muestra; y por el análisis estadístico
(cuando los puntos finales primarios son la evaluación de similitud para cada muestra y las estimaciones de potencia para las
muestras de referencia). Las restricciones operativas y el diseño de la valoración biológica (fórmulas dentro y entre corridas que
resultan en un valor de informe para un material de prueba) por lo general se especifican durante el desarrollo y pueden con-
vertirse en una parte del procedimiento operativo de la valoración biológica. La precisión intermedia se estudia mediante corri-
das independientes del procedimiento, posiblemente mediante el uso de un diseño experimental que altera aquellos factores
que pueden impactar el desempeño del procedimiento. Los experimentos (incluyendo aquéllos que implementan diseños for-
malizados de experimentos [DOE, por sus siglas en inglés]) con estructuras de diseño anidado o cruzado pueden revelarfuen-
tes importantes de variabilidad en el procedimiento, así como asegurar una estimación representativa de variabilidad a largo
plazo. Durante la validación no es necesario emplear el formato requerido para obtener el valor de informe de una solución de
Prueba. Un experimento de validación bien diseñado que combine fuentes de variabilidad entre corridas e intracorridas provee
estimaciones de componentes independientes de la variabilidad de la valoración biológica. Estos componentes se pueden usar
para verificar o pronosticar la variabilidad del formato de la valoración biológica.
Un análisis extenso de los datos de validación debe incluir resúmenes gráficos y estadísticos de los resultados de los paráme-
tros de validación y su cumplimiento con los criterios de aceptación diana. El análisis debe seguir las especificaciones del plan
de análisis de datos descrito en el protocolo de validación. En la mayoría de los casos, el logaritmo de la potencia relativa debe
analizarse para cumplir con las suposiciones de los métodos estadísticos (ver la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas,Escala
del Análisis).Dichas suposiciones incluyen la normalidadde la distribución a partir de la que se muestrearon los datos y la ho-
mogeneidadde la variabilidada través del intervalo de resultados observados en la validación. Es posible explorar tales suposi-
ciones usando técnicas gráficas tales como gráficas de caja y gráficas de probabilidad. La suposición de normalidad se puede
investigar usando análisis estadísticos de normalidad a través de una colección de datos históricos de tamaño adecuado. Se
deben buscar métodos alternativos de análisis cuando las suposiciones pudieran ser cuestionables. Los intervalosde confianza
deben calcularse para los parámetros de la validación usando los métodos descritos en este capítulo y en el capítulo general
DatosAnalíticos-Interpretacióny Tratamiento(101 O).
2.4 Estrategiasde Validaciónde las Característicasde Desempeñode la Valoración Biológica
Los parámetros que deben verificarse en una valoración biológica son: exactitudrelativa,especificidad,precisión intermedia
(que incorpora la repetibilidad) e intervalo.Otros parámetros discutidos en el capítulo general (1225) y en la guía ICH Q2(Rl ),
tales como el límite de detección y el límite de cuantificación, no han sido incluidos en este capítulo debido a que, por lo
general, no son relevantes para una valoración biológica que informa la potencia relativa. No obstante, éstos pueden ser rele-
vantes para la validación de una valoración auxiliar, tal como la empleada para contabilizar los elementos que responden o
medir la respuesta en conjunto con una valoración de potencia in vivo.Asimismo, la linealidad no forma parte de la validación
de una valoración biológica, excepto por su relación con la exactitud relativa (linealidad de las diluciones). A continuación, se
presentan estrategias para tratar los parámetros de validación de la valoración biológica.
EXACTITUDRELATIVA
La exactitudrelativade una valoración biológica de potencia relativa es la relación entre la potencia relativa medida y la po-
tencia relativa conocida. La exactitud relativa en la valoración biológica se refiere a una pendiente unitaria (pendiente = 1) en-
tre el logaritmo de la potencia relativa medida y el logaritmo de la potencia relativa conocida. La metodología más común
para demostrar la exactitud relativa para las valoraciones biológicas de potencia relativa es mediante la construcción de poten-
cias diana a través de la dilución del material estándar o de una muestra de Prueba con una potencia conocida. Este tipo de
estudio a menudo se denomina estudiode linealidadde las diluciones.Los resultados obtenidos de un estudio de linealidad de
las diluciones se deben evaluar usando el sesgo relativo estimado en niveles individuales y mediante una tendencia en el sesgo
relativoa través de los niveles. El sesgorelativoen niveles individuales se calcula de la manera siguiente:
Sesgo Relativo= 100. ( Potenci~ Medida 1)%

Potencia Diana
La tendencia en el sesgo se mide por la pendiente estimada del logaritmo de la potencia medida en función del logaritmo
de la potencia diana, el cual se debe ajustar a un criterio de aceptación diana. Si no existe una tendencia en el sesgorelativoa
través de los niveles, el sesgo relativoestimado en cada nivel se puede ajustar a un criterio de aceptación diana previamente
especificado y definido en el protocolo de validación (ver la sección 3 Ejemplode Validaciónde una ValoraciónBiológica).
Especificidad-Para productos o productos intermedios asociados con matrices complejas, la especificidad implica demostrar
la ausencia de interferencia de componentes de la matriz o de componentes relacionados con el producto que se esperaría
que estuvieran presentes. Lo anterior se puede evaluar mediante la dilución paralela del Estándar con o sin la adición de canti-
dades conocidas del compuesto potencialmente interferente. Si las curvas son similares y la potencia cumple con las expectati-
vas de una comparación entre Estándares, la valoración biológica es específica para el compuesto. Para estas evaluaciones, tan-
to la similitud como la potencia se pueden evaluar usando análisis de equivalencia apropiados.
La especificidad también se puede referir a la capacidad de la valoración biológica para distinguir entre moléculas biofarma-
céuticas diferentes pero relacionadas. Se debe buscar un buen entendimiento con respecto a la molécula y a cualquier forma
relacionada, así como de las oportunidades de que moléculas relacionadas se introduzcan en la valoración biológica.
Precisión Intermedia-Debido a la potencial influencia sobre la valoración biológica de factores tales como analistas, instru-
mentos o procedencia de los reactivos, el diseño de la validación de la valoración biológica debe considerar dichos factores. La
variabilidad general a partir de las mediciones tomadas en una variedad de condiciones normales de análisis dentro de un la-
boratorio define la precisión intermedia de la valoración biológica. La precisión intermedia (IP, por sus siglas en inglés) es el
término usado por la ICH y la USP para referirse a lo que comúnmente se conoce como variabilidad entre corridas. Las medi-
das de precisión intermedia analizan la influencia de factores que variarán con el tiempo después de haber implementado la
valoración biológica. Dichas influencias, por lo general, son inevitables e incluyen factores tales como cambios de personal
(nuevos analistas), recepción de lotes de nuevos reactivos, entre otros.
Cuando se ha planeado la valoración usando un Diseño de Experimento multifactorial, se puede explorar el impacto de cada
factor gráficamente para establecer contribuciones importantes a la variabilidad de la potencia. La identificación de factores
importantes debe guiar hacia los procedimientos que buscan controlar sus efectos, como por ejemplo, ampliar las restricciones
para las condiciones operativas intravaloraciones o procedimientos de calificación estratégicos para factores entre corridas tales
como analistas, instrumentos y lotes de reactivos.
Las contribuciones de los factores de estudio de la validación a la precisión intermedia general de la valoración biológica se
pueden determinar mediante un análisisde componentesde la varianza aplicado a los resultados de la validación. La mejor for-
ma de llevar a cabo el análisisde componentesde la varianza es utilizar un software estadístico que sea capaz de realizar un
análisis de modelo mixto con una estimación de probabilidad máxima restringida (RMLE,por sus siglas en inglés).
Un análisis de componentes de la varianza genera estimaciones de componentes de la varianza tales como
·2
0 1ntra
y
·2
OEntre
que corresponden a la variación intracorridas y entre corridas, y que se pueden usar para estimar la precisión intermedia de la
valoración biológica, así como la variabilidad del valor de informe para distintos formatos de valoraciones biológicas (variabili-
dad del formato). La precisión intermedia expresada como el coeficiente geométricoporcentual de variación (%GC\/, por sus
siglas en inglés) se obtiene con la siguiente fórmula, usando para este caso el logaritmo natural de la potencia relativa en el
análisis (ver la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas,Escaladel Análisis):
Precisión Intermedia= 100, (eMº"'H';,. -1)%
La variabilidad del valor de informe derivado del análisis realizado con n conjuntos de determinaciones repetidas en cada una
de las k corridas (variabilidad del formato) es igual a:
Variabilidaddel Formato= 100. (eN,,./k• G,;,,./(nk}_ 1)%
Esta fórmula se puede usar para determinar un formato de análisis adecuado para varios usos de la valoración biológica (p. ej.,
análisis de liberación y evaluación de la estabilidad).
Intervalo-El intervalo de la valoración biológica se define como las potencias verdadera o conocida para las que se ha demos-
trado que el procedimiento analítico tiene un nivel adecuado de exactitud relativa y de precisión intermedia. El intervalo es
normalmente derivado del estudio de la linealidad de las diluciones y, por lo menos, debe cubrir el intervalo de especificación
del producto para la potencia. Para los análisis de estabilidad y para minimizar la necesidad de diluir o concentrar muestras de
Prueba con altas o bajas potencias para ajustarlas al intervalo de la valoración biológica, resulta beneficioso validar la valoración
biológica usando un intervalo más amplio.
2.5 Validación de los Criterios de Aceptación Diana
Se debe optar por una validación de los criterios de aceptación diana para minimizar los riesgos inherentes al tomar decisio-
nes derivadas de las medidas de la valoración biológica y para que la capacidad de la técnica sea razonable. Cuando existe una
especificación de producto, los criterios de aceptación deben justificarse basándose en el riesgo de que las medidas podrían
caer fuera de la especificación del producto. Se pueden usar las consideraciones derivadas de un índice de capacidad del pro-
ceso (Cp, por sus siglas en inglés) para informar los límites del sesgorelativo (RB, por sus siglas en inglés) y la precisión interme-
dia de la valoración biológica. Este capítulo emplea el siguiente índice de capacidad del proceso:
C USL-LSL
pm ✓ 2 2 2
6 •crP,oo,cto + RB + crRA
donde el Límite de Especificación Superior (USL, por sus siglas en inglés) y el Límite de Especificación Inferior (LSL,por sus
siglas en inglés) son la especificación superior e inferior de liberación, el sesgo relativo, (RB) es un límite para el grado de sesgo
relativo en la valoración
O~roducto
ª2 RA
son la varianza del producto de interés (es decir, la variabilidad entre lotes) y la varianza de la valoración de liberación (RA, por
sus siglas en inglés) (con formato asociado) respectivamente. (Ver en la sección 3, Ejemplode una Validaciónde ValoraciónBioló-
gica, un ejemplo de determinación de
ª2 RA
y de la capacidad de procesamiento.) Esta formulación requiere conocer con anticipación la variabilidad diana del producto o
la inclusión de una selección aleatoria de lotes para estimar estas características como parte de la validación. Debido al conoci-
miento limitado sobre el desempeño de la valoración, del historial de fabricación y de las especificaciones finales durante el
desarrollo, esta metodología puede usarse simplemente como guía para definir los criterios de aceptación de la validación.
La selección de un límite con respecto a la capacidad del proceso es una decisión empresarial. La proporción de lotes que se
pronostica estarán fuera de sus límites de especificación es una función de la capacidad de proceso. Algunos laboratorios nece-
sitan una capacidad de proceso correspondiente a un índice de capacidad del proceso mayor o igual a 1,3. Esto corresponde a
una posibilidad aproximada de 1 en 1O000 de que un lote con potencia en el centro del intervalo de especificación caiga por
fuera de los límites de especificación.
Cuando no se hayan establecido las especificaciones para un producto, se puede formular una restricción para el sesgorelati-
vo o la IP basándose en la capacidad de la técnica de la metodología de la valoración biológica. Por ejemplo, aunque las valo-
raciones químicas y los inmunoensayos a menudo son capaces de obtener un porcentajede coeficientede variación(%CV, por
sus siglas en inglés, o desviación estándar relativa porcentual, %RSD) de casi un solo dígito, se puede establecer una restricción
más liberal a las valoraciones biológicas, tales como valoraciones biológicas de potencia en animales, que operan con una va-
riabilidad mucho mayor (medida como %GCV, que se puede comparar con el %CV; ver el Apéndice).En este caso, el objetivo
de la validación puede ser la caracterizacióndel método, usando los resultados de la validación para establecer un formato de
valoración con el que se espera generar medidas de producto fidedignas. El protocolo de validación debe incluir una justifica-
ción sólida para los criterios de aceptación aceptables o para el uso de una caracterización.
2.6 Mantenimiento de la Valoración

La implementación de la valoración biológica se lleva a cabo una vez que ésta ha sido validada. No obstante, resulta impor-
tante monitorear su comportamiento con el paso del tiempo, lo cual se logra fácilmente manteniendo diagramas de controles
estadísticosdel proceso(SPC, por sus siglas en inglés) para parámetros adecuados de la curva de respuesta del Estándar y de la
potencia de las muestras de Control de Calidad de la valoración. El propósito de estos diagramas es identificar en una etapa
temprana cualquier cambio o desvío en la valoración biológica. Si se observa una tendencia en cualquiera de los diagramas de
controles estadísticos del proceso, se deberá identificar la razón de dicha tendencia. Si la resolución requiere modificar la valo-
ración biológica o si se ha presentado una modificación seria en la valoración biológica por otras razones (por ejemplo, un
cambio tecnológico mayor), la valoración biológica deberá revalidarse o vincularse a la valoración biológica original mediante
un estudio puente adecuadamente diseñado con criterios de aceptación que utilicen análisis de equivalencia.
2.7 Consideraciones Estadísticas

Algunas consideraciones estadísticas se relacionan con el diseño de la validación de una valoración biológica y con el análisis
de los datos. Asimismo, se relacionan con las propiedades de las mediciones de la valoración biológica, así como con las herra-
mientas estadísticas que se pueden usar para resumir e interpretar los resultados de validación de la valoraciones biológicas.
ESCALADELANÁLISIS
La escala del análisis de la validación de una valoración biológica, en la que los datos son las potencias relativas de las mues-
tras en el estudio de validación, se debe tomar en cuenta para obtener conclusiones fidedignas del estudio. El presente capítu-
lo asume que se han establecido previamente métodos apropiados para calcular la potencia relativa a partir de los datos brutos
de la respuesta de la valoración biológica (según se indica en el capítulo general (1034)). Las mediciones de potencia relativa
por lo general están normalmentedistribuidasen logaritmos.Las medidas distribuidasnormalmenteen logaritmos presentan ses-
go y se caracterizan por la heterogeneidadde la variabilidad, donde la desviación estándar es proporcional al nivel de respuesta.
Los métodos estadísticos citados en este capítulo requieren que los datos sean simétricos, aproximándose a una distribución
normal, aunque algunos otros procedimientos requieren de homogeneidadde la variabilidad en las mediciones a través del in-
tervalo de potencia. Por lo regular, el análisis de potencia posterior a la transformaciónlogarítmica genera datos que se acercan
más al cumplimiento de ambos requisitos. La base de la transformación logarítmica no es de importancia, siempre que se
mantenga una base uniforme durante todo el análisis. De esta forma, por ejemplo, si el logaritmo natural (logaritmo en base e)
se usa para transformar las mediciones de potencia relativa, los resultados recopilados se convierten de nuevo a la escala de la
valoración biológica utilizando la base e.
La distribución de las mediciones de potencia deben evaluarse como parte del desarrollo de la valoración biológica (según se
describe en (1 032)). Si se determina que las mediciones de potencia están distribuidas con normalidad, la validación se puede
llevar a cabo usando los métodos descritos en el capítulo general Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos (1225).
Como consecuencia de la transformación logarítmica habitual (para valoraciones de líneas paralelas) de mediciones de po-
tencia relativa, existen ventajas cuando los niveles seleccionados para el estudio de validación se encuentran espaciados unifor-
memente en la escala logarítmica. Un ejemplo con cinco niveles sería 0,50; 0,71; 1,00; 1,41 y 2,00. Los niveles intermedios se
obtienen como la media geométrica(GM, por sus siglas en inglés) de dos niveles adyacentes. De esta forma, por ejemplo, el
nivel medio entre 0,50 y 1,0 se deriva de la manera siguiente:
GM=.j0,50-1,0 =0,71
Asimismo, las medidas recopiladas de la validación se ven influenciadas por la escala logarítmica normal. La respuesta pro-
nosticada debe informarse como la media geométricade las mediciones individuales de potencia relativa, mientras que la varia-
bilidad se expresa como %GCV. El GCV se calcula como el antilogaritmo de la desviación estándar, S109, de mediciones de po-
tencia relativa transformadas. La fórmula provista es:
GCV = antilog(S 10g)- 1
La variabilidad se expresa como GCV en lugar de RSD de la distribución logarítmica normal a fin de conservar la continuidad
usando la transformación logarítmica (ver la discusión adicional en el Apéndicede este capítulo). Los intervalos que pueden
calcularse a partir de la GCV serán uniformes con respecto a los intervalos calculados a partir de la media y de la desviación
estándar de los datos transformados en logaritmos. La Tabla 1 presenta un ejemplo del cálculo de la media geométrica (GM,
por sus siglas en inglés) y el sesgo relativo asociado, con el %GCV para una serie de mediciones de potencia relativa realizadas
con muestras analizadas en el nivel 1,00. El logaritmo base e se usa en la ilustración.
Tabla 1 Ilustración de los Cálculos de Media Geométrica y %GCV
Potencia Relativa 1 In de la Potencia Relativa
1,1299 0,1221
0,9261 -0,0768
1,1299 0,1221
1,0143 0,0142
1,0027 0,0027
1,0316 0,0311
1,1321 0,1241
1,0499 0,0487
Promedio 0,0485 GM = 1,0497

RB=4,97%
SD 0,0715 %GCV=7,4%
1 La potencia relativa es la media geométrica de las potencias duplicadas medidas en las ocho corridas del ejemplo provisto en la Tabla4.
En este ejemplo, la media geométrica de las mediciones de potencia relativa se calcula como el antilogaritmo de las medicio-
nes promedio del logaritmo de potencia relativa y luego se expresa como sesgo relativo, la desviación porcentual a partir de la
potencia diana:
GM = ePromed;o = e0,0485 = 1,0497
RB =100-(~-1]%=100-(
Diana
·º
1 497
1,00
-1)%=4,97%
y el coeficiente de variación geométricoporcentual (%GCV) se calcula como:

%GCV = 100. (eD-ación Ertánda, - 1)%=100, (e0,071S - 1 )% = 7,4%
Se debe tomar en cuenta que el %GCV calculado para este ejemplo no es igual a la IP determinada en el ejemplo de validación
de valoración biológica para el nivel 1,00 (8,5%); ver la Tabla 6. Este ejemplo utiliza el promedio de determinaciones repetidas
dentro de la corrida, mientras que la IP en el ejemplo de validación representa la variabilidad de las determinaciones repetidas
individuales.
Informe de Resultados de Validación Mediante Intervalos de Confianza-Las estimaciones de los parámetros de validación
de la valoración biológica deben presentarse como una estimaciónpuntual junto con un intervalo de confianza. Una estimación
puntual es el valor numérico obtenido para el parámetro, como por ejemplo la media geométrica GM o el %GCV. La interpre-
tación más común de un intervalo de confianza es en forma de un intervalo probable del valor verdadero del parámetro. El
ejemplo previo determina un intervalo de confianza de 90% para el logaritmo de la potencia relativa promedio, Cl,n, según se
indica a continuación:
Cl,n=Promedio± Id,-SD/ Jñ
=0,0485±1,89-0,0715/ ✓8 =(0,0007; 0,0963)
Para el sesgo relativo, esto significa que:

0.0007 ) ( 0.0963 )
CIRB=100- -ª--1 %;100- -ª--1 %=(0,07%, 10,1%)
( 1,00 1,00
La constante estadística (1,89) se deriva de una tabla t, con grados de libertad iguales al número de mediciones menos uno
(grados de libertad= 8 - 1 = 7). Se puede formular un intervalo de confianza para la IP o para la variabilidad del formato
usando métodos para componentes de varianza; este capítulo general no abarca dichos métodos.
Evaluación del Cumplimiento de los Criterios de Aceptación-Los resultados de la validación de la valoración biológica se
comparan con criterios de aceptación diana a fin de demostrar que la valoración biológica es adecuada para su uso. El proceso
para establecer el cumplimiento de los parámetros de validación con respecto a los criterios de aceptación para la validación
no debe confundirse con establecer el cumplimiento de las mediciones de potencia relativa para las especificaciones del pro-
ducto. Las especificaciones del producto deben proveer información sobre el proceso para establecer criterios de aceptación
para la validación.
Una práctica común consiste en aplicar criterios de aceptación al parámetro de validación estimado. Esto, sin embargo, no
se toma en cuenta para la incertidumbre en el parámetro de validación estimado. Una solución es mantener el intervalode
confianzaen el parámetro de validación con respecto al criterio de aceptación, lo cual es una metodología estadística estándar
que se usa para demostrar el cumplimiento con las expectativas y que recibe el nombre de análisisde equivalencia.No se debe
confundir con la práctica de realizar una prueba de significancia, como por ejemplo, una prueba t, que busca establecer una
diferencia a partir de algún valor diana (p. ej., sesgo relativo de 0%). Una prueba de significancia relacionada con un valor P
>0,05 (equivalente a un intervalo de confianza que incluye el valor diana para el parámetro) indica que no existe suficiente
evidencia para concluir que el parámetro es diferente al valor diana. Esto no es lo mismo que concluir que el parámetro cum-
ple con el valor diana. El diseño del estudio puede tener muy pocas determinaciones repetidas,o los datos de validación pueden
ser demasiado variables para descubrir una diferencia significativa del valor diana. Asimismo, una prueba de significancia pue-
de detectar una pequeña desviación del valor diana que sea de poca importancia. Estos escenarios se ilustran en la Figura1.
~'-----f
---
I-----:------
~L---------------------------
a b e
Figura 1 . Uso de intervalos de confianza para establecer que los resultados de validación cumplen con un criterio de acepta-
ción.
La línea sólida horizontal representa el valor diana (posiblemente un sesgo relativo de 0%) y las líneas punteadas forman los
límites de aceptación inferior (LAL)y superior (UAL).En el escenario a, el límite de confianza incluye la diana y, por consiguien-
te, se puede concluir que no existe evidencia suficiente para establecer una diferencia con respecto a la diana (la metodología
de la prueba de significancia). No obstante, aunque la estimaciónpuntual (el diamante sólido) cae dentro del intervalo de
aceptación, el intervalo se extiende fuera del rango, lo que significa que el sesgo relativo verdadero puede estar fuera del inter-
valo aceptable. En el escenario b, el intervalo cae dentro del intervalo de aceptación, lo que significa que cumple con el criterio
de aceptación. El intervalo en el escenario c también cae dentro del rango de aceptación, pero excluye la diana. Por lo tanto,
para el escenario c, aunque la diferencia de la estimación puntual a partir de la diana es estadísticamente significativa, ces
aceptable debido a que el intervalo de confianza cae dentro de los límites de aceptación diana.
Mediante el intervalo de confianza de 90%, calculado previamente, se puede establecer si la valoración biológica tiene un
sesgo relativo aceptable en el nivel 1,00 en comparación con un criterio de aceptación diana no mayor de, por ejemplo,
+12%. Debido a que el intervalo de confianza de 90% para el sesgo relativo porcentual (0,07%, 1O,1%) cae dentro del inter-
valo (100*[(1 /1, 12) - 1]%, 100*[(1, 12/1) - 1]%) = (- 11 %, 12%), se puede concluir que existe un sesgo relativo aceptable en
el nivel 1,00. Se debe tomar en cuenta que un intervalo de confianza de 90% se usa en una prueba de equivalencia en lugar
de un intervalo de confianza convencional de 95%. Esto es una práctica común y es igual que la metodología de pruebasdo-
blementeunilaterales(TOST,por sus siglas en inglés) usada en el análisis de bioequivalencia farmacéutica.
Riesgos Implícitos en la Toma de Decisiones y en el Número de Corridas de Validación-La aplicación de análisis estadísti-
cos, incluyendo la evaluación del cumplimiento de un parámetro de validación con sus criterios de aceptación, implica riesgos,
uno de éstos es que el parámetro no cumpla con su criterio de aceptación inclusive si la propiedad asociada con dicho pará-
metro es satisfactoria; mientras que el otro riesgo, por el contrario, consiste en que el parámetro cumpla con su criterio de
aceptación aunque dicho parámetro sea verdaderamente insatisfactorio. Un aspecto relacionado con dichos riesgos es el tama-
ño de la muestra.
Los dos tipos de riesgo se pueden controlar simultáneamente mediante un diseño estratégico, incluyendo la selección del
número de corridasque se llevarán a cabo en la validación. Específicamente, el número mínimo de corridasrequeridas para
establecer el cumplimiento con un criterio de aceptación para sesgo relativo se obtiene mediante la fórmula siguiente:
2 A 2
n > ( ta,gl +t/112,gl) (jlP
92
donde ta,gly tµ ,91son los puntos de distribución de una distribución t de Student; a y fJ son errores unilaterales tipo I y tipo 11,
y representan los riesgos asociados con generar la conclusión errónea en la validación; gl son los grados de libertad relaciona-
dos con el diseño del estudio (por lo general, n - 1);
es una estimación preliminar de precisión intermedia; y 0 es la desviación aceptable (criterio de aceptación diana).
Por ejemplo, si un criterio de aceptación para sesgo relativo es ± O,11 log (es decir, 0 = O,11), la variabilidad de la valoración
biológica es
CJp
1
= 0,076 log
y a = fJ = 0,05,
(1,89+2,36}2 0,0762
n > --------- - 8 corridas
- 0,1f
Se debe tomar en cuenta que esta formulación de tamaño de la muestra asume la ausencia de sesgo intrínseco en la valora-
ción biológica. Una solución más conservadora incluye algo de sesgo diferente a cero en la determinación del tamaño de la
muestra, lo cual resulta en un mayor tamaño de la muestra para compensar el impacto del sesgo sobre las conclusiones de la
validación. En el ejemplo actual, el tamaño de la muestra se incrementa a 1O corridas, si se asume un sesgo intrínseco igual a
2%. Asimismo, debe tomarse en cuenta que este cálculo representa una solución recurrente (puesto que los grados de libertad
dependen de n) que requiere software estadístico o un algoritmo que emplee metodología iterativa.
Además, es necesario considerar que la selección de a y fJ debe justificarse basándose en los riesgos correspondientes de
generar una conclusión errónea a partir de la validación.
Generación de un Modelo para Resultados de Validación Usando Modelos de Efectos Mixtos-Muchos análisis relaciona-
dos con la validación de una valoración biológica deben tomar en cuenta múltiples factores de diseño, tales como efectosfijos
(p. ej., nivel de potencia), así como efectosaleatorios(p. ej., analista, corrida y determinaciones repetidas). Los modelos estadís-
ticos compuestos por efectos fijos y aleatoriosreciben el nombre de modelosde efectosmixtos y, por lo general, requieren de
software estadístico sofisticado para su análisis. Los resultados del análisis se pueden resumir en una tabla de análisisde varian-
za (ANOVA,por sus siglas en inglés) o en una tabla de estimaciones de los componentes de la varianza. El objetivo principal
del análisis es estimar parámetros críticos en lugar de establecer la significancia de un efecto. Los resultados de la generación
del modelo ofrecen estimaciones de parámetros junto con sus erroresestándarde estimaciones que se pueden emplear para
establecer el cumplimiento del criterio de aceptación. De esta forma, el sesgorelativo promedio en cada nivel se obtiene como
una porción del análisis junto con su variabilidad asociada. Éstos constituyen un intervalo de confianza que se compara con el
criterio de aceptación, conforme a lo descrito anteriormente. Cuando resulta posible combinar las varianzas de los niveles, la
generación de un modelo estadístico también puede determinar el sesgorelativo general y la precisión intermedia, combinan-
do la información obtenida a través de los niveles utilizados en la validación. De manera similar, los modelos de efectos mixtos
se pueden usar para obtener los componentes de la varianza para factores del estudio de validación y para combinar los resul-
tados a través de las muestras y niveles del estudio de validación.
Diseño Estadístico-Los diseños estadísticos, tales como el Diseño de Experimento multifactorial o anidado, pueden usarse pa-
ra organizar valoraciones y corridas en una validación de valoración biológica. Resulta útil incorporar aquellos factores que se
piense podrían influenciar la respuesta de la valoración biológica y que varían durante el uso a largo plazo del procedimiento
en estos diseños. Usando estos métodos de diseño, es posible caracterizar las fuentes de variabilidad y se puede desarrollar un
plan de análisis estratégico para administrar la variabilidad de la valoración biológica.
La Tabla2 presenta un ejemplo de un Diseño de Experimento multifactorial que incorpora múltiples analistas, múltiples pre-
paraciones de cultivo celular y múltiples lotes de reactivos en el plan de validación.
741 O (1033) Valoraciones Biológicas/ Información General USP42
Tabla 2. EJemp10
1 d e un D seño d e ExP<rlmento Mu 1t lfactorial con 3 Factores
Lote de
Corrida Analista Preparación de Células Reactivo
1 1 1 1
2 1 1 2
3 1 2 1
4 1 2 2
5 2 1 1
6 2 1 2
7 2 2 1
8 2 2 2
En este diseño, cada analista lleva a cabo la valoración biológica con ambas preparaciones de células y con ambos lotes de
reactivo. Éste es un ejemplo de diseño factorial completodebido a que todas las combinaciones de factores se llevan a cabo en
el estudio de validación. Para reducir el número de corridas en el estudio, se pueden emplear diseños factorial fraccionarios
cuando se hayan identificado más de tres factores. Por ejemplo, si resultara práctico para un analista realizar cuatro valoracio-
nes en una corrida, se podría usar un diseño de unidad dividida considerando a los analistas como el factor de la gráfica com-
pleta y la preparación de células y el lote de reactivo como los factores secundarios de la gráfica. A diferencia de los experi-
mentos de comprobación, el diseño de validación debe incorporar la mayor cantidad de factores en la mayor cantidad de ni-
veles posible para obtener una estimación representativa de la precisión intermedia. Siempre que sea posible, se deberán em-
plear más de dos niveles de un factor en el diseño. Lo anterior se puede lograr de una forma menos estructurada, sin relación
alguna con el diseño factorial estricto. Las corridas de validación se deben aleatorizar siempre que sea posible para mitigar las
influencias potenciales del orden o tiempo de corrida.
La Figura2 presenta un ejemplo de validación que emplea un diseño anidado (determinaciones repetidas anidadas dentro de
la placa; la placa anidada dentro del analista).
Figura 2. Ejemplo de un diseño anidado usando dos analistas.
Para estos dos tipos de diseños, así como para las combinaciones de los mismos, se pueden estimar componentes de variabi-
lidad a partir de los resultados de la validación. Estos componentes de variabilidad se pueden usar para identificar las fuentes
significativas de variabilidad, así como para derivar un formato de valoración biológica que cumpla con los requisitos de preci-
sión del procedimiento. Se debe tomar en cuenta que las fuentes significativas de variabilidad podrían haber sido identificadas
durante el desarrollo. En dicho caso, la validación debe confirmar tanto el impacto de estos factores como el cumplimiento del
formato de la valoración con los requisitos de precisión.
Cifras Significativas-El número de cifras significativas en un resultado informado a partir de una valoración biológica se rela-
ciona con la precisión de ésta última. En general, una valoración biológica con un %GCV entre 2% y 20% sustentará dos cifras
significativas. El número de cifras significativas no debe confundirse con el número de lugares decimales-los valores de infor-
me iguales a 1,2 y O,12 tienen el mismo número (dos) de cifras significativas. Este estándar de redondeo es adecuado para
mediciones en escala logarítmica que presentan una variación constante en la escala logarítmica y una variabilidad proporcio-
nal, no aditiva, en la escala original (o en la escala usada originalmente para interpretación). Se debe tomar en cuenta que el
redondeo se presenta al final de una serie de cálculos cuando la medición final se informa y se emplea para tomar decisiones,
tales como el cumplimiento con las especificaciones. De esta forma, si la medición final es un valor de informe obtenido a
partir de múltiples valoraciones, el redondeo no debe realizarse antes de determinar el valor de informe. Asimismo, las especifi-
caciones deben declararse con el número apropiado de cifras significativas.
3. EJEMPLO DE VALIDACIÓN DE UNA VALORACIÓN BIOLÓGICA
A continuación se presenta un ejemplo que ilustra los principios descritos en este capítulo. La valoración biológica se utilizará
para sustentar un intervalo de especificación de 0,71 a 1,41 para el producto. Usando la capacidad de proceso descrita en la
sección 2.5 Validaciónde Criteriosde AceptaciónDiana, se deriva una tabla que muestra la tasa proyectada de resultados fuera
de la especificación para diversas restricciones de sesgo relativo y precisión intermedia. La capacidad del proceso se calcula con
respecto a la variabilidad de un valor de informe usando tres corridas independientes de la valoración biológica (ver la discu-
sión anterior sobre variabilidad del formato). Se asume que la variabilidad del producto es igual a O en los cálculos. El laborato-
rio podría optar por incluir una variabilidad de producto diana. Se puede obtener una estimación de la variabilidad del produc-
to diana a partir de los datos de un producto que, por ejemplo, se fabrica usando un proceso similar.
Tabla 3. Capacidad del Proceso y Probabllldad de Resultados Fuera de la Especificación para Diversas Restricciones
de Sesgo Relativo y Precisión Intermedia
Límite de Especifica-
ción Inferior-Límite de Probabilidad (resultados fuera de la
Especificación Supe- Precisión Intermedia Sesgo Capacidad del Pro- especificación)
rior (%) Relativo (%) ceso (%)
0,71-1,41 20 20 0,54 10,5
0,71-1,41 8 12 0,94 0,48
0,71-1,41 10 5 1,55 0,0003
El cálculo se presenta para una precisión intermedia igual a 8% y un sesgo relativo igual a 12% (n = 3 corridas):
Cpm ln(1,41)-ln(0,71) 0,
94
6 v[ln(1,08)]2 /3+[In(1, 12)]'
Probabilidad (resultados fuera de la especificación)= 2, <I>(-3• 0,94) = 0,0048 (0,48%),

donde <I>representa la función de distribución acumulativa normal estándar.
A partir de la Tabla3, se puede esperar un desempeño aceptable (una probabilidad menor de 1% de obtener un resultado
fuera de la especificación debido al sesgo y a la variabilidad de la valoración biológica), si la precisión intermedia es ~8% y el
sesgo relativo es ~1 2%. La fórmula de tamaño de la muestra provista en la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas,
Riesgosde la
Tomade Decisiones y Númerode Corridasde Validación,se puede usar para derivar el número de corridas requeridas para esta-
blecer el cumplimiento con el criterio de aceptación para un sesgo relativo igual a 12% (usando %GCVP,ea,,ón = 8%; a=
in,em,edia
/3 = 0,05):
n 2 (1.89 + 2,36)2.[1~(1,08)]2 "8 corridas
[ln(1, 12)]
Por consiguiente, serían necesarias ocho corridas para tener un 95% de probabilidad de cumplir con el criterio de acepta-
ción diana para sesgo relativo si el sesgo relativo verdadero es cero. Tomar en cuenta que el cálculo del tamaño de la muestra
asume que se llevará a cabo un singulete de las muestras de validación en cada corrida de validación. El uso de múltiples con-
juntos para determinaciones repetidas y/o múltiples valoraciones proporcionará información valiosa la cual permitirá separar
las estimaciones para variabilidad intracorrida y entre corridas, y reducirá el riesgo de incumplimiento de los criterios de acep-
tación diana de la validación.
En la validación se estudian cinco niveles del analito diana: 0,50; 0,71; 1,00; 1,41 y 2,00. Dos analistas capacitados generan
dos corridas en cada nivel usando dos lotes de medios. Se pueden tomar en cuenta otros factores e incorporarlos en el diseño
usando una distribución factorial fraccionaria. El laboratorio debe esforzarse para diseñar la validación con la mayor cantidad
posible de niveles para cada factor a fin de obtener el mejor modelo para el desempeño a largo plazo de la valoración biológi-
ca. En este ejemplo, cada analista lleva a cabo dos corridas en cada nivel usando cada lote de medios. Una corrida consiste en
una serie de diluciones completas del Estándar, conforme a lo descrito en el procedimiento operativo de la validación biológi-
ca, junto con dos series de diluciones independientes de la muestra de Prueba. Lo anterior genera mediciones por duplicado
de la potencia relativa en cada corrida; ver la Tabla4 para todas las observaciones de potencia relativa. Es necesario considerar
que las dos estimaciones de potencia en cada nivel de potencia en una corrida no son independientes debido a los analistas y
lotes de medios en común.
Tabla 4. Ejemplo de Valldaclón de una Valoración Blológlca con Dos Analistas, Dos Lotes de Medios
y Corridas por Nlvel para cada Combinación de Anallsta y Lote
Lote de Medios/
Analista 1/1 1/2 2/1 2/2
Corrida 1 2 1 2 1 2 1 2
0,50 0,5215 0,4532 0,5667 0,5054 0,5222 0,5179 0,5314 0,5112
0,50 0,5026 0,4497 0,5581 0,5350 0,5017 0,5077 0,5411 0,5488
0,71 0,7558 0,6689 0,6843 0,7050 0,6991 0,7463 0,6928 0,7400
0,71 0,7082 0,6182 0,8217 0,7143 0,6421 0,6877 0,7688 0,7399
1,00 1,1052 0,9774 1,1527 0,9901 1,0890 1,0314 1,1459 1,0273
1,00 1,1551 0,8774 1,1074 1,0391 0,9233 1,0318 1,1184 1,0730
1,41 1,5220 1,2811 1,5262 1,4476 1,4199 1,3471 1,4662 1,5035
1,41 1,5164 1,3285 1,5584 1,4184 1,4025 1,4255 1,5495 1,5422
2,00 2,3529 1,8883 2,3501 2,2906 2,2402 2, 1364 2,3711 2,0420
2,00 2,2307 1,9813 2,4013 2,1725 2,0966 2,1497 2,1708 2,3126
4
2,00-
~ 1,41-
'c
~
i
,; 1,00- Analista 1
0::
rn Analista 2
·g _ unea Unitar\a
~
a. 0,71-
o.so-
1 1 t 1 t
o.so 0,71 1,00 1,41 2,00
PotenciaRelativaConocida
Figura 3. Gráfica de los resultados de la validación en función de los niveles de muestra.
Se utiliza una gráfica para revelar cualquier irregularidad en los resultados experimentales. En particular, una gráfica adecua-
damente preparada puede revelar una falla en la concordancia de los resultados de la validación con los niveles de validación,
así como heterogeneidadde la variabilidad a través de los niveles (ver la discusión sobre transformación logarítmica en la sec-
ción 2.7 Consideraciones Estadísticas).La gráfica del ejemplo de la Figura3 incluye la línea unitaria (línea con una pendiente
igual a 1, la cual pasa por el origen). Los datos del analista 1 y del analista 2 se desalinearon deliberadamente con respecto a la
potencia esperada para permitir una visualización y comparación claras de los conjuntos de datos obtenidos por cada analista.
Se puede llevar a cabo un análisis formal de los datos de validación mediante el siguiente procedimiento: (1) una evaluación
de la variabilidad (precisión intermedia) debe preceder a una evaluación de la exactitud o especificidad de la potencia relativa
a fin de establecer que se cumple la suposición de que se pueden combinar las varianzas a través de los niveles de muestra; y
(2) se evalúa la exactitudrelativaen niveles separados o mediante un análisis combinado, dependiendo de qué tan bien se
puedan combinar los datos a través de los niveles. Estas etapas se demuestran usando los datos de validación del ejemplo,
junto con algunos detalles de los cálculos para propósitos ilustrativos. Debe tomarse en cuenta que los cálculos ilustrados en
las secciones siguientes son apropiados únicamente con un conjunto de datos equilibrados. Los diseños o conjuntos de datos
sin equilibrar y faltos de mediciones de potencia relativa deben analizarse usando un análisis de modelo mixto con estimación
de probabilidad máxima restringida (REML,por sus siglas en inglés).
3.1 PrecisiónIntermedia
Los datos en cada nivel se pueden analizar usando un análisisde componentesde la varianza.Con datos equilibrados, como
en el ejemplo actual, se pueden medir los componentes de la varianza a partir de un ANOVAestándar de sentido único. La
Tabla5 presenta un ejemplo del cálculo realizado en un solo nivel (0,50).
Tabla 5. Anállsls de Componentes de la Varianza Realizado a las Medklones del Logaritmo de la Potencia Relativa en el Nlvel 0,5
Fuente ql* Suma de Cuadrados Cuadrado Medio Cuadrado Medio Esperado
Corrida 7 0,055317 0,007902 Var(Error) + 2 Var(Corrida)
Error 8 0,006130 0,000766 Var(Error)
Correaida total 15 0,061447
Estimacionesde los Componentes de la Varianza
Var(Corrida) = 0,003568
Var(Error) = 0,000766
• gl = grados de libertad
La parte superior de la tabla representa un ANOVAestándar. No han sido incluidos los analistas ni los lotes de medios debido
al pequeño número de niveles (2 niveles) para cada factor. Elfactor "Corrida" en este análisis representa las corridas combina-
das a través del analista mediante combinaciones de lotes de medios. El Cuadrado Medio Esperado es la combinación lineal de
componentes de la varianza que genera el cuadradomedio(MS, por sus siglas en inglés) para cada fuente. Las estimaciones de
componentes de la varianza se derivan solucionando la ecuación "Cuadrado Medio Esperado = Cuadrado Medio" para cada
componente. Para comenzar, el cuadradomediopara estimaciones de Error Var(Error), el componente de variabilidad dentro
de la corrida, es
Var(Error)= MS(Error) = 0,000766

De manera subsiguiente, se calcula el componente de variabilidad entre corridas, Var(Corrida), estableciendo el cuadrado me-
dio por Corrida con la expresión matemática para el cuadrado medio esperado y, posteriormente, resolviendo la ecuación para
Var(Corrida) de la manera siguiente:
MS(Corrida) = Var(Error) + 2 · Var(Corrida)
Var(Corrida)= MS(Corrid~)• MS(Error)
o,007902 - 0,000766 O 003568

2 '
Estas estimacionesde los componentesde la varianza se combinan para establecer un valor de 0,50 a la precisión intermedia
general de la valoración biológica:
IP = 100. (e,JVa<(Comdal•2·Va«e,co,¡ -1)%
= 100. (eJ0,003568-0.000766 -1)º/o = 6,8%
El mismo análisis se realizó con cada nivel de la validación y se presenta en la Tabla 6.

Tabla 6. Estimaciones de Componentes de la Varianza y Variabilidad General para Cada Nivel de Validación y el Promedio
Nivel
Componente 0,50 0,71 1,00 1,41 2,00 Promedio
Var(Corrida) 0,003568 0,000648 0,003639 0,003135 0,002623 0,002723
Var(Error) 0,000766 0,004303 0,002954 0,000577 0.002258 0,002172
General 6,8% 7,3% 8,5% 6,3% 7,2% 7,2%
Se puede realizar un análisis combinado si los componentes de la varianza son similares a travésde los niveles, Por lo gene-
ral, se emplea el método heurístico para esta evaluación. Es posible mantener el cociente de la varianza máxima y la varianza
mínima a un valor no mayor de 1O (se usa 1O debido al número limitado de corridas realizadas en la validación). En este ejem-
plo, los cocientes asociados con el componente de la varianza entre corridas, 0,003639/0,000648 = 5,6 y con el componente
dentro de la corrida, 0,004303/0,000577 = 7,5, cumple con el criterio de 1O veces.Si el cociente hubiese excedido de 1O y si
se hubiese debido a un exceso de variabilidad en uno o otro de los extremos en los niveles analizados, dicho extremo habría
de eliminarse de los análisis adicionales y el intervalo tendría que limitarse para excluir dicho nivel.
El análisis puede continuar usando un software estadístico capaz de aplicar un modelo de efectosmezcladosa los resultados
de la validación. Dicho análisis debe tomar en cuenta cualquier desequilibrio en el diseño, los efectos aleatorios como el analis-
ta o el lote de medios y los efectos fijos, tales como cada uno de los niveles (ver la sección 2.7 ConsideracionesEstadísticas,
Generaciónde un Modelo para los Resultadosde la ValidaciónUsandoModelosde EfectosMixtos). Los componentes de la varianza
se pueden determinar por separado para el analista y el lote de medios a fin de caracterizar sus respectivas contribuciones a la
variabilidad general de la valoración biológica.
En el ejemplo, se puede obtener el promedio de los componentes de la varianza a travésde niveles para informar la preci-
sión intermedia de la valoración biológica. Este método de combinación de estimaciones es exacto únicamente, si un diseño
balanceado ha sido empleado en la validación (p. ej., la misma estrategia para determinaciones repetidas en cada nivel). Se
empleó un diseño balanceado para el ejemplo de validación, de modo que la precisión intermedia se puede informar como
7,2%GCV.
Debido a la recomendación para informar los resultados de la validación con alguna medida de incertidumbre, se puede
calcular un límite superior de confianza unilateral de 95% para la precisión intermedia de la valoración biológica. La literatura
contiene métodos para calcular los límites de confianza para componentes de la varianza. El límite superior en la precisión in-
termedia para el ejemplo de valoración biológica es 11,8% GCV.El límite superior de confianza no se calculó por separado en
cada nivel debido a la limitación de datos un nivel individual con respecto al diseño general del estudio.
3.2 Exactitud Relativa
El análisis puede proceder con una evaluación de la exactitud relativa en cada nivel. La Tabla 7 presenta el promedio y el
intervalo de confianza de 90% de los resultados de la validación en la escala logarítmica, así como la potencia correspondiente
y el sesgo relativo.
Tabla 7. Potencia Promedio v Sesao Relatlvo en Nlveles lndlvlduales

Loqarltmo de Potencia Potencia Sesao Relatlvo
(90% Intervalo de Con- (90% Intervalo (90% Intervalo
Nivel nª Promedio fianza) Promedio de Confianza) Promedio de Confianza)
0,50 8 -0,6613 (-0,7034; -0,6192) 0,52 (0,49; 0,54) 3,23% (-1,02; 7,67)
0,71 8 -0,3419 (-0,3773; -0,3064) 0,71 (0,69; 0,74) 0,06% (-3,42; 3,67)
1,00b 8 0,0485 (0,0006; 0,0964) 1,05 (1,00; 1,10) 4,97% (0,06; 1o,12)
1,41 8 0,3723 (0,3331; 0,4115) 1,45 (1,40; 1,51) 2,91% (-1,04; 7,03)
2,00 8 0,7859 (0,7449; 0,8269) 2,19 (2,11; 2,29) 9,72% (5,31; 14,32)
ª Análisis realizado a los promedios de los duplicados de cada corrida.
b Cálculo ilustrado en la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas,Escaladel Análisis.
Elanálisis se ha realizado al promedio de los duplicados de cada corrida (n = 8 corridas) puesto que las mediciones duplica-
das se correlacionan dentro de una corrida mediante factores compartidos de precisión intermedia (analista, lote de medios y
corrida, para este caso). Se puede usar una gráfica de sesgo relativo contra el nivel para examinar los patrones de los resultados
experimentales y para establecer el cumplimiento del criterio de aceptación diana para sesgo relativo (12%).
12%
.........
J.----+---L
. . J--f
0,50 0,71 1,00 2,00
Figura 4. Gráfica de intervalos de confianza de 90% para sesgo relativo contra el criterio de aceptación. Tomar en cuenta
que el criterio de aceptación inferior es igual a 100 • [(1/1, 12) - 1] = -11 %.
La Figura4 presenta un sesgo positivo promedio en todos los niveles de muestra (es decir, el sesgo relativo promedio es
positivo en todos los niveles). Esta uniformidad se debe en parte a la falta de independencia de los resultados de la valoración
biológica en todos los niveles. Asimismo, no parece haber una tendencia en el sesgo relativo en todos los niveles. Esto último
indicaría que una comparación de muestras con potencias relativas medidas de manera diferente (por ejemplo, muestras de
estabilidad) presenta sesgo, lo que posiblemente podría resultar en una conclusión errónea. Elanálisisde tendencia se puede
llevara cabo usando una regresión del logaritmo de la potencia relativa en función del logaritmo del nivel. Se puede conside-
rar la introducción de un criterio de aceptación durante el desarrollo de la validación de la valoración biológica para una ten-
dencia en la exactitud relativa a través del intervalo.
Después de establecer que no existe una tendencia significativaen todos los niveles, el analista procede a realizar una eva-
luación de la exactitud relativa en cada nivel. La valoración biológica presenta sesgo relativo aceptable en los niveles que van
de 0,50 a 1,41, produciendo límites de confianza de 90% (equivalentes a una prueba t doblementeuni/ateraOque caen dentro
de la región de aceptación de sesgo relativo de -11 % a 12%. Elintervalo de confianza de 90% en 2,0 cae fuera de la región
de aceptación, lo que indica que el sesgo relativo puede exceder de 12%.
Se puede realizar un análisis combinado usando un software estadístico capaz de aplicar un modelo de efectosmixtos a los
resultados de la validación. Elanálisistoma en cuenta exactamente el diseño del estudio de validación. Asimismo,el análisis
acomoda los efectosaleatoriostales como analista, lote de medios y corrida (ver la sección 2.7 ConsideracionesEstadísticas,Ge-
neraciónde un Modelopara Resultadosde ValidaciónUsandoModelosde EfectosMixtos).
3.3 Intervalo
Las conclusiones derivadas de la evaluación de la precisión intermedia y la exactitud relativa se pueden usar para establecer el
intervalo de la valoración biológica que demuestra un desempeño satisfactorio. Basándose en el criterio de aceptación para
una precisión intermedia igual a 8% GCV(ver la Tabla6) y para un sesgo relativo igual a 12% (ver la Tabla 7), el intervalo de la
valoración biológica es de 0,50 a 1,41 . En este intervalo, el nivel 1,0 presenta una estimación ligeramente mayor que la esti-
mación de precisión intermedia (8,5% contra el criterio de aceptación diana :,;8,0%), lo cual se puede deber a la variabilidad
de la estimación que resulta de un conjunto de datos pequeño. Debido a lo anterior y a otros resultados de la Tabla6, se pue-
de concluir que se ha demostrado una precisión intermedia satisfactoria a lo largo del intervalo.
3.4 Usode los Resultadosde la Validaciónpara Caracterizaruna ValoraciónBiológica
Cuando el estudio se ha realizado para estimar las características de la valoración biológica (caracterización), también se
pueden usar las estimacionesde los componentesde la varianzapara predecir la variabilidad en diferentes formatosde valoración
biológica y determinar así un formato con el nivel de precisión deseado. La variabilidad pronosticada para k corridasindepen-
dientes, con n series de diluciones individuales de la preparación de prueba dentro de una corrida, se proporciona mediante la
fórmula siguiente para variabilidaddel formato:
Variabilidad del Formato= 100 . (e✓ Va,(Camda)/k + Va,(Em,,}/(nk¡_ 1)
Usando estimaciones de los componentes de la varianza entre corridas e intracorrida a partir de la Tabla6 [Var(Corrida) =
0,002723 y Var(Error)= 0,002172], si la valoración biológica se realiza en tres corridasindependientes, la variabilidad pronosti-
cada del valor de informe(media geométrica de los resultados de potencia relativa) es igual a:
Variabilidad del Formato = 100 . (e✓o,0021m, + 0,002112111· ,) - 1) = 4, 1%
Este cálculo se puede expandir para que incluya diversas combinaciones de corridasy conjuntos mínimos(asumiendo que los
números de muestras, diluciones y determinaciones repetidas en los conjuntos mínimos se mantengan constantes) dentro de
las corridasconforme a lo mostrado en la Tabla8.
Tabla 8. Varlabllldad del Formato para Diferentes Combinaciones de Número de Corridas (k) y Número de Con¡untos Mínimos
dentro de la Corrida (n)
Número de Corridas (k)
Determinaciones
Repetidas ( n) 1 2 3 6
1 7,2% 5,1% 4,1% 2,9%
2 6,4% 4,5% 3,6% 2,6%
3 6,0% 4,2% 3,4% 2,4%
6 5,7% 4,0% 3,3% 2,3%
Resulta claro que el medio más efectivo para reducir la variabilidad del valor de informe(la potencia media geométrica en
todas las corridas y conjuntos mínimos) es mediante corridas independientes del procedimiento de la valoración biológica. Asi-
mismo, los límites de confianza para los componentes de la varianza usados para derivar la precisión intermedia se pueden
usar para establecer la variabilidad del formato de la valoración biológica.
Las fuentes significativas de variabilidad deben incorporarse a corridas para lograr la reducción de la varianza. Un análisis
más extenso del ejemplo de validación de la valoración biológica incluiría al analista y al lote de medios en el modelo estadísti-
co. Las estimaciones de los componentes de la varianza obtenidos a partir de dichos análisis se presentan en la Tabla9.
Tabla 9. Estimaciones de Probabllldad Máxima Restringida de los Componentes de la Varlana Asociados con el Analista, el Lote de
Medios y la Corrida
Varlana Estimado del Componente
Var{Lote de Medios) 0,0000
Var(Analista) 0,0014
Var(Analista*Lote de Medios) 0,0000
Var(corrida(Analista*Lote de Medios)) 0,0019
Var(Error) 0,0022
Idealmente, la identificación del analista como un factor significativo de la valoración biológica se debe tratar durante el de-
sarrollo de la valoración biológica. Sin embargo, el laboratorio puede optar por tratar la contribución aparente de la variabili-
dad entre analistas mediante capacitación o usando múltiples analistas en el desarrollo del formato de la valoración para el
desempeño de rutina de la valoración biológica.
Las estimaciones de variabilidad entre corridas e intracorrida también se pueden usar para determinar los tamaños de las
diferencias (número de diferencias) que se pueden distinguir entre las muestras analizadas de la valoración biológica. Para k
corridas, con n conjuntos mínimos dentro de cada corrida, usando un valor crítico bilateral aproximado, a partir de la distribu-
ción normal estándar con z = 2, el número de diferencias críticas entre los valores de informe para dos muestras que se anali-
zan en las mismas corridas de la valoración biológica se proporcionan mediante la fórmula siguiente:
Número de Diferencias Críticas= e2 · ✓var/Comda)/k+Vm-/ErrorJ//nk)
Cuando las muestras han sido analizadas en corridas diferentes de la valoración biológica (tales como muestras para estabili-
dad a largo plazo), el número de diferencias críticas se provee (asumiendo que se usa el mismo formato para analizar las dos
series de muestras) mediante:
Número de Diferencias Críticas= ei- ✓2-{Va,(Con-;daJ/k+va,(frrorJ//nk)]
Para la comparación de muestras, el laboratorio puede seleccionar un diseño (formato de valoración biológica) que cuente con
una precisión adecuada para detectar un número de diferencias significativo entre muestras.
3.5 Confirmación de la Precisión Intermedia y Revalidación

La estimación de la precisión intermedia derivada de la validación presenta una alta incertidumbre debido al pequeño núme-
ro de corridas realizadas. Después de que el laboratorio acumula experiencia adecuada con la valoración biológica, la estima-
ción puede ser confirmada o actualizada mediante el análisis de las mediciones de las muestras de control, tal como la variabili-
dad de un control positivo. Dicho análisis se puede llevar a cabo con el control preparado y analizado al igual que una muestra
de Prueba (es decir, una serie de diluciones y estrategia para determinaciones repetidas idénticas o similares). Esta evaluación
se realizará después de haber llevado a cabo suficientes valoraciones para obtener una estimación alternativa de la precisión
intermedia de la valoración biológica, incluida la implementación de cambios (p. ej., analistas diferentes, lotes de reactivos cla-
ves diferentes y preparaciones celulares diferentes) relacionados con el protocolo de valoración estandarizado. La precisión in-
termedia de la valoración biológica se debe modificar a manera de enmienda en el informe de validación en caso de que la
evaluación revele una disparidad importante de los resultados.
La valoración biológica debe revalidarse siempre que se apliquen cambios sustanciales en el método, los cuales incluyen, pe-
ro no se limitan a cambios tecnológicos o cambios en la lectura. La revalidación puede constar de una repromulgación total de
la validación de la valoración biológica o de un estudio puente que compare los métodos actuales y los modificados.
APÉNDICES
Apéndice 1: Medidas de Ubicación y Dispersión para Variables Normalmente Distribuidas en
Logaritmos
Los procedimientos estadísticos comunes, tales como ANOVAo la estimación del intervalo de confianza, presentan dos su-
posiciones: (1) la variación en la respuesta de la valoración biológica alrededor de su media está normalmente distribuida y (2)
la desviación estándar de los valores de la respuesta observados es constante en un intervalo de respuestas que son de interés.
Se dice que dichas respuestas tienen una "distribución normal" y una "estructura de error sumatorio". Cuando no se cumplen
estas dos condiciones, podría resultar útil considerar una transformación antes de emplear procedimientos estadísticos comu-
nes.
A menudo se determina que la variación en las respuestas de la valoración biológica son anormales (sesgadas hacia valores
más altos) con una desviación estándar aproximadamente proporcional (o casi) a la respuesta media. Dichas respuestas por lo
regular tienen una "estructura de error multiplicativo" y siguen una "distribución normal logarítmica" con un coeficiente de
variación porcentual (%CV) que es constante en todo el intervalo de respuesta de interés. En tales casos, se encontrará que
una transformación logarítmica de la respuesta de la valoración biológica es aproximadamente normal con una desviación es-
tándar casi constante en el intervalo de respuesta. Después de aplicar la transformación logarítmica, se cumplen las dos suposi-
ciones y se pueden llevar a cabo procedimientos estadísticos comunes con la respuesta transformada en logaritmos. La siguien-
te discusión asume una distribución normal logarítmica para la respuesta de la valoración biológica.
Esto se refiere a un valor de respuesta de valoración biológica observado, X, que se encuentra en la "escala original de medi-
ción" y a una respuesta transformada en logaritmos, Y= log(X), que se encuentra en la "escala transformada en logaritmos".
Aunque los procedimientos estadísticos comunes pueden ser apropiados únicamente en la escala transformada en logaritmos,
se pueden recopilar las respuestas de la valoración biológica estimando las mediciones de ubicación (p. ej., media o mediana),
las mediciones de dispersión (p. ej., desviación estándar) o intervalos de confianza en cualquiera de las escalas de medición,
siempre que se indique la escala que se está utilizando. El %CV es útil en la escala original cuando es constante en el intervalo
de respuesta. Por la misma razón, la desviación estándar (SD, por sus siglas en inglés) es relevante en la escala transformada en
logaritmos. Informar los resúmenes estadísticos basándose en la escala transformada en logaritmos (Y) ofrece ventajas. No obs-
tante, a menudo se puede obtener información importante al transformar de nuevo las medidas informadas a su escala origi-
nal de medición (X).
Para cualquier valor dado de X, solo existe un valor único de Y = log(X), y viceversa. Algo similar ocurre con las mediciones
de ubicación y dispersión, en donde existe una correspondencia única entre cada medición de ubicación y dispersión obteni-
das en la escala original y transformada en logaritmos. Además, así como existe una relación simple entre X e Y = log(X), exis-
ten relaciones simples que permiten la conversión entre las medidas correspondientes de cada escala, según se indica a conti-
nuación en la TablaA-1. En dicha tabla, "Promedio" y "Desviación Estándar'', siempre que aparezcan, harán referencia a medi-
ciones calculadas en la escala transformada en logaritmos (Y).
USP42 InformaciónGeneral/ (1033> Valoraciones Biológicas 7417
Tabla A-1. Comparación de Mediciones de Ubicación y Dispersión

Escala de Medición
Transformada en Loga-
Medición ritmos (Y) Origina! (X)
Media geométrica (GM)
Ubicación Media (promedio)

= fil j,:e1
X; =ePcomed;o
Desviación estándar geométrica
Dispersión Desviación estándar (SD) (GSD) = eso
Intervalos de confianza Inferior Promedio - k · SDNñ GM/GSDklm
(k es una constante apropiada GM. csDklm
Superior Promedio+ k · SD/;/ñ
basada en la distribución t o
una aproximación grande ancho (superior - inferior) Cociente(superior/inferior)
de la muestra z) Tamaño = 2 · k · SD/;/ñ = GSD2k/m
Coeficiente de variación
porcentual (%CV) %GCV= 100 · (GSD-1) %CV = 100✓e'º' -1 <%GCV
La media geométrica (GM, por sus siglas en inglés) no debe malinterpretarse como una estimación de la media de la varia-
ble de la escala original (X), sino que es una estimación de la mediana de X. La mediana es una medición más apropiada de
ubicación para variables con distribuciones de error sesgadas tales como las distribuciones normales logarítmicas, así como las
distribuciones de error simétricas, donde la mediana es igual a la media.
De manera similar, la desviación estándar geométrica (GSD, por sus siglas en inglés) no se debe malinterpretar como la des-
viación estándar de la variable de la escala original (X). Sin embargo, la desviación estándar geométrica es un factor multiplica-
tivo útil para obtener intervalos de confianza en la escala original (X), que se correspondan con los de la escala transformada
en logaritmos (Y), según lo presentado en la tabla anterior. Una desviación estándar geométrica con un valor de 1 corresponde
a una ausencia de variación (desviación estándar con un valor de Y= O). El cociente entre los límites de confianza Superior e
Inferior, en la escala no transformada (X), será igual a la GSD2kim, según se aprecia en la TablaA-1.
El coeficiente de variación geométrica porcentual (%GCV) se aproxima al %CV en la escala original (X) cuando el %CV es
menos de 20%. Es importante no confundir estas mediciones de dispersión. El %GCV es una medida relevante para la escala
transformada en logaritmo (Y) y el %CV es una medida relevante para la escala original (X). Dependiendo del marco de refe-
rencia preferido, puede ser útil una o incluso ambas mediciones.
Apéndice2: Fuentesde Información

1. Limpert E, Stahel WA, Abbt M. (2001) Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. BioScience 51 (5):
341-252.
2. Kirkwood TBL.(1979) Geometric means and measures of dispersion. Biometrics 35: 908-909.
3. Bohidar NR. (1991) Deterrnination of geometric standard deviation for dissolution. Drug Development and Industrial
Pharrnacy 17(1 O): 1 381-1 387.
4. Bohidar NR. (1993) Rebuttal to the "Reply". Drug Development and Industrial Pharmacy 19(3): 397-399.
5. Kirkwood TBL.(1993) Geometric standard deviation-reply to Bohidar. Drug Development and Industrial Pharmacy
19(3): 395-396.
6. (101 O) Datos Analíticos- Interpretación y Tratamiento. USP 34. En: USP34-NF 29. Volúmen 1. Rockville(MD): Farmaco-
pea de los Estados Unidos de América; c2011. p. 419.
7. Tan CY.(2005) RSD and other variability measures of the lognormal distribution. Pharmacopeial Forum 31 (2): 653-655.
Apéndice3: FuentesAdicionalesde Información
Para información adicional y métodos alternativos, se pueden consultar las referencias citadas a continuación.
1. ASTM. Standard Practice for Using Significant Digits in Test Data to Determine Conformance with Specifications, ASTM
E29-08. Conshohocken, PA:ASTM; 2008.
2. Berger R, Hsu J. Bioequivalence trials, intersection-union tests and equivalence confidence intervals. Stat Sci 1996;1 l (4):
283-319.
3. Burdick R, Graybill F. Confidencelntervals on VarianceComponents.New York: Marcel Dekker; 1992:28-39.
4. Haaland P. ExperimentalDesignin Biotechnology.New York: Marcel Dekker; 1989;64-66.
5. Schofield TL. Assay validation. In: Chow SC, ed. Encyclopediaof BiopharmaceuticalStatistics.2nd ed. New York: Marcel
Dekker; 2003.
6. Schofield TL. Assay development. In: Chow SC, ed. Encyclopediaof BiopharmaceuticalStatistics.2nd ed. New York: Marce!
Dekker; 2003.
7. Winer B. StatisticalPrincipiesin ExperimentalDesign.2nd ed. New York: McGraw-Hill; 1971 :244-251.
7-
7418 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas / Información General USP42
(1034) ANÁLISISDE VALORACIONES

BIOLÓGICAS
1. INTRODUCCIÓN
Aunque los avances en la caracterización química han reducido el uso de las valoraciones biológicas para valorar muchos
productos, éstas continúan siendo esenciales para la determinación de la potencia y para garantizar la actividad de una gran
cantidad de proteínas, vacunas, mezclas complejas y productos de terapia celular y génica, además de su importante papel en
el seguimiento de la estabilidad de productos biológicos. El capítulo general Análisisde Va/oracionesBiológicas(1034) pretende
abarcar las pautas para el análisis de los resultados de las valoraciones biológicas descritas en la Farmacopeade los EstadosUni-
dos de América(USP)y de las valoraciones biológicas no pertenecientes a la USP,pero que intentan cumplir con las pautas de
calidad de los análisis de valoración biológica recomendados por la USP.Se debe tomar en cuenta que el énfasis del diseño y la
validación de los análisis se tratan en los capítulos complementarios (Diseñoy Desarrollode ValoracionesBiológicas(1032) y
Validaciónde ValoracionesBiológicas(1033), respectivamente).
Los temas tratados en el capítulo (1034) incluyen conceptos y métodos estadísticos de análisis para el cálculo de la potencia
y de los intervalos de confianza para una variedad de valoraciones biológicas de potencia relativa, incluyendo aquéllos citados
en la USP.El capítulo (1034) está destinado para su uso principalmente por parte de aquéllos que no cuentan con una capaci-
tación o conocimientos extensos en estadística, así como estadísticos que no cuentan con experiencia en el análisis de valora-
ciones biológicas. Las secciones que presentan principalmente conceptos requieren una mínima base de conocimiento de esta-
dística. No obstante, la mayor parte del capítulo y todas las secciones de métodos requieren que aquéllos que no sean exper-
tos en estadística posean conocimientos mínimos al nivel tratado en el capítulo general de la USPDatos Analíticos-Interpreta-
ción y Tratamiento(101 O)y de regresión lineal. La mayor parte de las secciones 3.4 ModelosNo Linealespara Respuestas Cuanti-
tativas y 3.6 ValoracionesDicotómicas(Cuanta/es)requieren una base de conocimiento de estadística más extensa y, por consi-
guiente, está dirigido principalmente a estadísticos. Asimismo, el capítulo (1034) introduce métodos selectos complejos cuya
implementación requiere la guía de un estadístico experimentado.
Aunque se reconoce la posibilidad de uso de procedimientos alternativos, se recomienda emplear las metodologías del pre-
sente capítulo (1034). Asimismo, la información del capítulo (1034) se presenta asumiendo el uso de computadoras y software
adecuado para el análisis de datos. Dicha perspectiva no libera al analista de su responsabilidad ni de las consecuencias relacio-
nadas con la selección del diseño y análisis de una valoración biológica.
2. ASPECTOSGENERALES
DELANÁLISISDE LOSDATOSDE LA VALORACIÓN
BIOLÓGICA
A continuación se presenta una lista de pasos a seguir que ayudarán a guiar el análisis de una valoración biológica. La pre-
sente sección asume que se ha utilizado un conjunto de pasos similares en la toma de decisiones durante el desarrollo y poste-
rior verificación durante la validación y por lo tanto, no es necesario seguir estos pasos rutinariamente. Dichas etapas y decisio-
nes se tratan en el capítulo de información general Diseñoy Desarrollode Va/oracionesBiológicas(1032). La Sección 3, Modelos
de Análisis,ofrece información detallada para los diversos modelos considerados.
1. Como parte del análisis elegido, se debe seleccionar el subconjunto de datos que se utilizará para determinar la potencia
relativa, usando el esquema previamente especificado. Se deben excluir únicamente aquellos datos que se sepa provienen
de problemas técnicos conocidos, tales como pocillos contaminados, curvas de concentración-respuesta no monotónicas,
etc.
2. Es necesario ajustar el modelo estadístico para detectar valores aberrantes potenciales, conforme a lo seleccionado duran-
te el desarrollo, incluyendo cualquier ponderación y transformación. Esto se lleva a cabo primeramente sin asumir simili-
tud alguna entre las curvas de la Prueba y del Estándar, pero se deben incluir elementos importantes de la estructura de
diseño, idealmente empleando un modelo que realice menos suposiciones acerca de la naturaleza de la función de la res-
puesta que el modelo usado para evaluar la similitud.
3. Se debe determinar cuáles de los valores aberrantes potenciales se van a eliminar y se debe ajustar el modelo que se va a
emplear para la evaluación de la aptitud. Por lo general, antes de eliminar valores aberrantes, se lleva a cabo una investi-
gación de sus causas. Algunos sistemas de valoración pueden emplear una regla estadística de eliminación de valores abe-
rrantes (no investigativa), aunque la eliminación de valores aberrantes mediante dicho método no debe usarse con regu-
laridad. Una metodología para valores aberrantes "extraños" consiste en seleccionar la regla para valores aberrantes de
modo que el número esperado de identificaciones de valores aberrantes falsos positivos no sea mayor de uno; p. ej., utili-
zar una prueba al 1o/osi el tamaño de la muestra es aproximadamente 1OO.Si se encuentra un gran número de valores
aberrantes por encima del esperado a partir del uso de la regla, se debe cuestionar inmediatamente la valoración.
4. Se debe evaluar la aptitud del sistema. La aptitud del sistema evalúa si la preparación Estándar de la valoración y cualquier
control usado se comportaron de manera uniforme con respecto al desempeño anterior de la valoración. Si una valora-
ción (o una corrida) no cumple con la aptitud del sistema, se debe descartar toda la valoración (o corrida) y no se debe
informar ningún resultado excepto la falla de la valoración (o corrida). La evaluación de la aptitud del sistema por lo regu-
lar incluye la idoneidad del ajuste del modelo usado para evaluar la similitud. Para los modelos lineales, la idoneidad del
modelo puede incluir la evaluación de la linealidad de la curva del Estándar. Si no se cumple el criterio de aptitud para
USP42 Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 7419
linealidad del Estándar, la exclusión de una o más concentraciones de los extremos podría resultar en el cumplimiento con
dicho criterio. Otros ejemplos de posibles criterios de aptitud del sistema incluyen blanco, controles positivos, máx/mín,
máx/fondo, pendiente, IC50 (o EC50) y variación alrededor del modelo ajustado.
5. Se debe evaluar la aptitud de la muestra para cada muestra de Prueba. Esto se hace para confirmar que los datos para
cada muestra de Prueba cumplen con las suposiciones necesarias. Si una muestra de Prueba no cumple con la aptitud de
la muestra, los resultados de dicha muestra se informan como "No Cumple con la Aptitud de la Muestra". No obstante,
aún se pueden informar las potencias relativas para otras muestras de Prueba de la valoración. La similitud es el más pro-
minente de los criterios de aptitud de la muestra, como el paralelismo en modelos paralelos o la equivalencia de las orde-
nadas al origen para modelos de cociente de pendiente. Para modelos no lineales, la evaluación de la similitud implica
todos los parámetros de la curva distintos a EC50 (o IC50).
6. Para aquellas muestras de Prueba en la valoración que cumplen con el criterio de similitud con el Estándar (es decir, cur-
vas de concentración-respuesta lo suficientemente similares o subconjuntos de concentraciones lineales similares), se de-
ben calcular las estimaciones de potencia relativa asumiendo la similitud entre la Prueba y el Estándar, es decir, analizando
los datos de la Prueba y del Estándar de manera conjunta usando un modelo limitado para tener líneas o curvas exacta-
mente paralelas u ordenadas al origen idénticas.
7. Por lo regular, una sola valoración no es suficiente para obtener un valor de informe, mientras que los resultados de po-
tencia de múltiples valoraciones se pueden combinar en una sola estimación de potencia. Repetir los pasos 1-6 la canti-
dad de veces especificada en el protocolo de valoración o en la monografía, antes de determinar una estimación final de
potencia y un intervalo de confianza.
8. Generar una estimación de la varianza y una medición de incertidumbre de la estimación de potencia (p. ej., intervalo de
confianza). Ver la sección 4, Intervalosde Confianza.
Un paso no mostrado es el reemplazo de datos faltantes. La metodología estadística y el software más modernos no requie-
ren números iguales en cada combinación de concentración y muestra, por lo que, a menos que se indique algo distinto en la
monografía específica, el analista no se verá obligado a reemplazar los valores faltantes.
3. MODELOSDE ANÁLISIS
Se puede utilizar con éxito una variedad de funciones matemáticas para describir una relación de concentración-respuesta.
La primera consideración tenida en cuenta al seleccionar un modelo es la naturaleza de la respuesta de la valoración. ¿Se refie-
re a un número, un recuento o a una categoría, como por ejemplo, Vivo/Muerto? La naturaleza identificará los posibles mode-
los que podrán tomarse en consideración.
Las demás consideraciones para la selección de un modelo incluyen la necesidad de incorporar elementos del diseño en el
modelo y los posibles beneficios de los modelos de medias en comparación con los modelos de regresión. Con el propósito de
presentar los puntos esenciales de las opciones de modelos, la sección 3, Modelosde Análisisasume un diseño completamente
aleatorio, de modo que no contempla elementos del diseño, y presenta los modelos en su forma de regresión.
3.1 Respuestas de Valoración Cuantitativas y Cualitativas
Los términos cuantitativa y cualitativa se refieren a la naturaleza de la respuesta de valoración usada en la construcción del
modelo de concentración-respuesta. Se pueden usar valoraciones con respuestas cuantitativas o cualitativas para cuantificar la
potencia del producto. Se debe tomar en cuenta que las respuestasde la valoración en las concentraciones medidas no son la
potencia relativa de la valoración biológica. Los analistas deben comprender las diferencias entre respuestas, las funciones de
concentración-respuesta y la potencia relativa.
Una respuesta cuantitativa produce un número en una escala continua. Los ejemplos comunes incluyen las respuestas espec-
trofotométricas y de luminiscencia, los pesos y medidas corporales y los datos calculados relativos a la curva estándar (p. ej.,
concentración de citoquina). Los modelos para respuestas cuantitativas pueden ser lineales o no lineales (ver las secciones 3.2-
3.5).
Una medición cualitativa resulta en una respuesta clasificable en categorías. Para la valoración biológica, las respuestas cuali-
tativas son generalmente cuantales, lo que significa que conllevan a dos posibles categorías tales como Positiva/Negativa, 0/1,
o Muerto/Vivo. Las respuestas cuantales se pueden informar como proporciones (p. ej., la proporción de animales en un grupo
que presentan una propiedad). Los modelos cuantales se presentan en la sección 3.6. Las respuestas cualitativas pueden tener
más de dos categorías posibles, tales como las determinaciones de título por punto final. Los modelos para más de dos catego-
rías no se consideran en este capítulo general.
Las respuestas de la valoración también pueden ser recuentos, tales como el número de placas o colonias. Las respuestas a
manera de recuentos en ocasiones se tratan como cuantitativas, en otras ocasiones como cualitativas y en algunas más se utili-
zan modelos específicos para números enteros. La selección a menudo se basa en el intervalo de recuentos. Si el recuento es
en su mayoría Oy en raras ocasiones es mayor de 1, la valoración se puede analizar como cuanta! y la respuesta es Alguna/
Ninguna. Si los recuentos son grandes y abarcan un intervalo amplio, tal como de 500 a 2500, entonces la valoración se pue-
de analizar como cuantitativa, posiblemente después de aplicar una transformación a los recuentos. Para dichos análisis, a me-
nudo resulta útil una transformación cuadrática del recuento, a fin de cumplir de mejor manera con la homogeneidad de las
varianzas. Si el intervalo de recuentos incluye o es cercano a O, pero O no es el valor preponderante, puede ser preferible em-
7420 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ InformaciónGeneral USP42
plear un modelo específico para las respuestas de números enteros. La regresión de Poisson y los modelos de regresión de
binomios negativos representan a menudo buenas opciones. El presente capítulo general no proporciona información adicio-
nal sobre modelos específicos para números enteros.
Las valoraciones con respuestas cuantitativas se pueden convertir en respuestas cuantales. Por ejemplo, lo que podría impor-
tar es definir si se excedió algún umbral definido. Entonces, el modelo podría ser cuantal-de umbral excedido o no. En gene-
ral, los sistemas de valoración presentan estimaciones más precisas de potencia cuando el modelo emplea toda la información
en la respuesta. El uso de un umbral superior o inferior, en lugar de las respuestas cuantitativas medidas, podría subestimar el
desempeño de una valoración.
3.2 Generalidades de los Modelos para Respuestas Cuantitativas
En las valoraciones cuantitativas, la medición es un número en una escala continua. Los valores de densidad óptica obteni-
dos en las valoraciones basadas en placas son dichas mediciones. Los modelos para valoraciones cuantitativas pueden ser linea-
les o no lineales. Aunque ambos presentan una diferencia aparente en los niveles de complejidad, los modelos de líneas parale-
las (lineales) y de curvas paralelas (no lineales) comparten muchos aspectos en común. Debido a la forma diferente de sus
ecuaciones, las valoraciones de cociente de pendiente se consideran por separado (sección 3.5 Modelosde Concentración-Res-
puesta de Cocientede Pendientes).
Suposiciones-Los modelos básicos de líneas paralelas, curvas paralelas y cociente de pendiente comparten algunas suposi-
ciones. Todos incluyen un término residual, e, que representa el error (variabilidad), el cual se asume que es independiente de
medición a medición y que tiene una varianza constante de concentración a concentración y de muestra a muestra. A menu-
do, se asume que el término residual también sigue una distribución normal. Las suposiciones de independencia e igualdad de
varianzas a menudo se infringen, por lo que el objetivo del análisis es incorporar la falta de independencia y la desigualdad de
las varianzas en el modelo estadístico o en el método de estimación.
A menudo, la falta de independencia surge a causa del diseño o la realización de la valoración. Por ejemplo, si la valoración
consiste en respuestas obtenidas de múltiples placas, es probable que las observaciones de la misma placa compartan alguna
influencia en común que no se comparte con las observaciones de otras placas. Éste es un ejemplo de correlación intraplacas.
Una metodología simple para tratar esta falta de independencia es incluir un término de bloque en el modelo estadístico para
placas. Con tres o más placas, éste debe ser un término de efectos aleatorios de modo que se obtenga una estimación de la
variabilidad entre placas.
En general, el modelo debe reflejar en detalle el diseño. Las ecuaciones básicas del modelo provistas en las secciones 3.3-3.5
se aplican únicamente a diseños completamente aleatorizados. Cualquier otro diseño requerirá términos adicionales en el mo-
delo estadístico. Por ejemplo, si las placas o porciones de las placas se usan como bloques, serán necesarios los términos para
bloques.
Cálculode la Potencia-Una suposición primaria subyacente de los métodos que se usan para el cálculo de la potencia relati-
va es la suposición de la similitud. Dos preparaciones son similares si contienen el mismo componente efectivo o los mismos
componentes efectivos en las mismas proporciones. Si esta condición se mantiene, la preparación de Prueba se comporta co-
mo una dilución (o concentración) de la preparación Estándar. La similitud se puede representar matemáticamente de lama-
nera siguiente: FTes la función de concentración-respuesta para la Prueba y F, es la función de concentración-respuesta para
el Estándar. El modelo matemático subyacente para la similitud es:
Fiz) = Fs(pz), [3.1]
donde z representa la concentración y p representa la potencia relativa de la muestra de Prueba con respecto a la muestra
Estándar.
Los métodos para estimar p en algunos de los modelos de concentración-respuesta comunes se analizan más adelante. Para
modelos lineales, la distinción entre modelos de líneas paralelas (sección 3.3 Modelosde LíneasParalelaspara RespuestasCuanti-
tativas) y modelos de cociente de pendiente (sección 3.5 Modelosde Concentración-Respuestade Cocientede Pendientes)se ba-
sa en si ajustar las líneas rectas al logaritmo de concentración o a la concentración generará un mayor alineamiento entre el
modelo y los datos en un intervalo de concentraciones de interés.
3.3 Modelos de Líneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas
En esta sección, un modelo lineal se refiere a una relación de concentración-respuesta. El logaritmo de la concentración, x, y
la respuesta, y, sigue una función de línea recta (lineal). y puede ser la respuesta en la escala conforme se mida o una transfor-
mación de la respuesta. La forma funcional de esta relación es y= a + bx. Los ajustes de líneas rectas se pueden usar para
porciones de las curvas de concentración-respuesta no lineales, aunque esto requiere de un método para seleccionar las con-
centraciones a usar para cada una de las muestras de Prueba y Estándar (ver el capítulo general (1032}).
Modelode Medias contra Regresión-Un modelo lineal de concentración-respuesta casi siempre se analiza mediante la regre-
sión de cuadrados mínimos. Dicho análisis genera estimaciones de los coeficientes desconocidos (ordenadas al origen y pen-
diente) y sus errores estándar, así como mediciones de la aptitud del ajuste [p. ej., R2 y error cuadrático medio (RMSE,por sus
siglas en inglés)].
USP42 InformaciónGeneral/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 7421
La regresión lineal funciona mejor cuando se pueden usar todas las concentraciones y existe una curvatura inapreciable en
los datos de concentración-respuesta. Otro método estadístico para analizar las curvas de concentración-respuesta lineales es
el modelode medias.Éste es un método de análisis de varianza (ANOVA,por sus siglas en inglés) que ofrece algunas ventajas,
particularmente cuando no se usan una o más concentraciones de una o más muestras para estimar la potencia. Puesto que el
modelo de medias incluye una media distinta para cada combinación única de muestra y dosis (así como un bloque u otros
efectos asociados con la estructura del diseño) es equivalente a un modelo de regresión polinómica saturado. Por consiguien-
te, un modelo de medias provee una estimación del error que es independiente de la falta de ajuste de la regresión. Por el
contrario, una estimación de error basada en la regresión residual es una mezcla del error de la valoración, según se estima en
el modelo de medias, combinada con la falta de ajuste del modelo de regresión. Al menos en este sentido, el error del modelo
de medias es una mejor estimación de la variación del error residual en el sistema de valoración.
Modelos de Concentración-Respuesta de LíneasParalelas-Si el modelo general de concentración-respuesta (3.1 Respuestas
de ValoraciónCuantitativasy Cualitativas)se puede hacer lineal en x = log(z), entonces la ecuación resultante es:
y = u + /Jlog(z) + e = u + /Jx + e,
donde e es el residuo o término de error y la intersección, u, y la pendiente, /J, diferirán entre la Prueba y el Estándar. Con la
suposición de paralelismo (pendientes iguales), el modelo se vuelve
=
Ys a + /Jlog(z) + e =a5 + fJx + e
[3.2]
Yr =a+ fJlog(pz) +e= [a+ fJlog(p)] + fJx + e= ar+ /Jx + e,
donde S es el Estándar, Tes la Prueba, u 5 = u es la ordenada al origen para el Estándar y Ur = u + /Jlog(p) es la ordenada al
origen para la Prueba (ver la Figura3. 1).
-----·
,,,,.·""··.,.
- stándar
- Prueba
tog10 de !a Concentración
Figura 3.1. Ejemplo de un modelo de líneas paralelas.
Cuando las líneas de concentración-respuesta son paralelas, según se muestra en la Figura3.1, una separación o desplaza-
miento horizontal indica una diferencia en el nivel de actividad biológica que se está valorando. Esta diferencia horizontal es
numéricamente log(p), el logaritmo de la potencia relativa, y se encuentra como la distancia vertical entre las líneas ur y u 5
dividida por la pendiente, /J. La potencia relativa es entonces
y
p=antilog ( a -a )
Estimaciónde Modelosde LíneasParalelas-Losmodelos de líneas paralelas se ajustan usando el método de cuadrados míni-
mos. Si se mantiene la suposición de varianzas iguales, se seleccionan los parámetros de la ecuación [3.2] para minimizar
[3.3]
donde los acentos circunflejos representan estimaciones. Ésta es una regresión lineal con dos variables independientes, T y x,
donde T es una variable que es igual a 1 para observaciones a partir de la Prueba y O para observaciones a partir del Estándar.
La sumatoria en la ecuación [3.3] es para todas las observaciones de la Prueba y del Estándar. Si la suposición de varianzas
iguales no se mantiene, pero se sabe que la varianza es inversamente proporcional a un valor, w, que no depende de las res-
puestas en curso, es decir, las y, y se puede determinar para cada observación, entonces el método se pondera con cuadrados
mínimos
. ' )2
¿w(y-as-8T-J3x [3.4]
La ecuación 3.4 es apropiada únicamente si las ponderaciones se determinan sin usar la respuesta, es decir las y, de los datos
en curso (ver el capítulo (1032) para pautas para la determinación de ponderaciones). En las ecuaciones [3.3] y [3.4] /J es
igual que la /J de la ecuación [3.2] y o= ar - as = p log p. Por tanto, la estimación de la potencia relativa, p, es
7422 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ Información General USP42
p =antilog(½)
El software estadístico y las hojas de cálculo comúnmente disponibles ofrecen rutinas para cuadrados mínimos. No todo el
software disponible puede proveer análisis ponderados.
Ver la sección 4 para información sobre métodos para obtener un intervalo de confianza para la potencia relativa estimada.
Para un intervalo de confianza basado en la combinación de las estimaciones de la potencia relativa de múltiples valoraciones,
se deben usar los métodos de 19.s~cción 4.2. Para un intervalo de confianza a partir de una sola valoración, usar el Teorema de
Fieller (sección 4. 3) aplicado a oI /3.
Mediciónde Falta de Paralelismo-El paralelismo para modelos lineales se evalúa considerando la diferencia o el cociente de
las dos pendientes. Para la diferencia, esto se puede llevar a cabo ajustando el modelo de regresión,
y= a 5 + oT + fJ5x + yxT + e
donde ¡¡= ar - a 5, y= /Jr - /J5, y T = 1 para los datos de Prueba y T = O para los datos del Estándar. Posteriormente, se emplea
el intervalo de confianza de distribución t estándar para y. Para el cociente de las pendientes, se ajusta
y= a 5 + oT + /J5x(l - T) + /JrXT+ e
y se usa el Teorema de Fieller, ecuación [4.3], para obtener un intervalo de confianza para /Jrf/J5•
3.4 Modelos No Lineales para Respuestas Cuantitativas
Los modelos no lineales de concentración-respuesta son, por lo regular, funciones con forma de S y se presentan cuando el
intervalo de concentraciones es lo suficientemente amplio como para que las respuestas sean limitadas por asíntotas superiores
e inferiores. El más común de estos modelos es la función logística de cuatro parámetros provista a continuación.
La variable y representa la respuesta observada, mientras que z representa la concentración. Una forma del modelo logístico
de cuatro parámetros es
y=D+--
A-O
6
+e [3.5]
1+(¿)
Una forma alternativa, pero equivalente, es
d
y;a 0 + [ ]+e
1+antilog M(logz-b)
Las dos formas se corresponden de la manera siguiente:

Asíntota inferior: D = a0
Asíntota superior: A= a0 + d
Pendiente: B = M (en relación con la pendiente de la curva en el EC50 )
Concentración efectiva al 50% (EC50 ): C = antilog(b) (también se puede denominar ED50 ).
Resulta adecuada cualquier base logarítmica conveniente; a menudo conviene trabajar con logaritmo en base 2, en particu-
lar cuando las concentraciones están en serie duplicativa.
La curva logística de cuatro parámetros es simétrica al rededor del EC50 cuando se grafica en función del logaritmo de con-
centración, debido a que las velocidades de acercamiento de las asíntotas superior e inferior son las mismas (ver la Figura3.2).
Para valoraciones en las que no se mantiene dicha simetría, se podrían aplicar las funciones del modelo asimétrico. Estos mo-
delos no se analizan en mayor medida en este capítulo general.
log10 de !a Concentración
Figura 3.2. Ejemplos de sigmoides simétricos (logísticos de cuatro parámetros) y asimétricos.
En muchos casos, el analista tiene que tomar algunas decisiones estratégicas durante el desarrollo de la valoración (ver Dise-
ño y Desarrollode Va/oracionesBiológicas(1032)). Por ejemplo, las respuestas se pueden transformar y ajustar a un modelo de
curva logística de cuatro parámetros o se pueden ponderar y ajustar a una curva sigmoidea asimétrica. Asimismo, a menudo
T
USP42 InformaciónGeneral/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 7423
resulta importante incluir términos en el modelo (por lo general efectos aleatorios) para tratar la variación en las respuestas (o
parámetros de la respuesta) asociados con bloques o unidades experimentales en el diseño de la valoración. Para valoraciones
simples en las que las observaciones son independientes, estas decisiones estratégicas son bastante sencillas. Para valoraciones
realizadas con diluciones agrupadas (como en el caso de pipetas multicanal), valoraciones con diluciones en serie o diseños de
valoración que incluyen bloques (como en el caso de múltiples placas por valoración), ignorar la estructura del diseño a menu-
do se considera una violación seria de las suposiciones estadísticas. Para dichas valoraciones, una buena metodología implica
una transformación que aproxime una solución a una varianza no constante, a una falta de normalidad y a una asimetría, com-
binada con un modelo que capture las partes importantes de la estructura del diseño.
Modelosde Concentración-Respuesta de CurvasParalelas-Elconcepto de paralelismo no se restringe a modelos lineales. Para
curvas no lineales, paralelas o medias similares, las curvas de concentración-respuesta se pueden superponer siguiendo un des-
plazamiento horizontal de una de las curvas, según se muestra en la Figura3.3 para curvas logísticas de cuatro parámetros. En
términos de los parámetros de la ecuación [3.5], esto significa que los valores de A, D y B para la Prueba son los mismos que
para el Estándar.
1091o de la Concentración
Figura 3.3. Ejemplo de curvas paralelas de un modelo no lineal.
Las ecuaciones correspondientes a la figura (con el término de error, e, agregado) son

A-D
Ys=D+--s+e
1+(t)
A-D
Yr =D+---s +e
1+(PJ)
o
A-D
Ys=D+ [ ]+e
1+antilog M(logz-b)
A-D
Yr=D+ [ ]+e
1+antilog M(logz-b+logp)
Log pes el logaritmo de la potencia relativa y la distancia horizontal entre las dos curvas, al igual que para el modelo de
líneas paralelas. Puesto que el EC50 del estándar es antilog(b) y el de la Prueba es antilog(b - log p) = antilog(b )/ p, la potencia
relativa es el cociente de EC50 (estándar sobre Prueba) cuando se mantiene el modelo de curvas paralelas.
Estimacióndel Modelode CurvasParalelas-la estimación de modelos de curvas paralelas no lineales es similar a la de los
modelos de líneas paralelas, posiblemente después de la transformación de la respuesta y posiblemente con la ponderación.
Para el modelo logístico de cuatro parámetros, las estimaciones de los parámetros se determinan minimizando:
2
I - A-6
[ y-D 1+antilog [M(logz-b+iT)] )
sin ponderación, o
'
,L.w
[
y-D
- A-6
_ _
1+antilog[ M(logz-b+rr)] ] [3.6]
con ponderación. (Al igual que para la ecuación [3.4], la ecuación [3.6] es apropiada únicamente si las ponderaciones se deter-
minan sin usar las respuestas, es decir las y, de los datos en curso.) En cualquiera de los casos, la estimación de res la estima-
ción del logaritmo de la potencia relativa. Para algunos paquetes de software, podría ser más fácil trabajar con d = A - D.
Los parámetros de la función logística de cuatro parámetros y aquéllos de los modelos sigmoideos asimétricos no son posi-
bles de calcular mediante rutinas de regresión de cuadrados mínimos ordinarias (lineales). Se deben usar programas informáti-
cos con técnicas de estimación no lineales.
Los analistas no deben usar el ajuste de regresión no lineal para evaluar el paralelismo o estimar la potencia si se presenta
alguno de los siguientes casos: a) se dispone de información inadecuada sobre las asíntotas; o b) una comparación de los erro-
res combinados de una regresión no lineal con los errores combinados de un modelo de medias determina que el modelo no
lineal no se ajusta de manera adecuada; o c) otras medidas apropiadas de aptitud del ajuste determinan que el modelo no
lineal no es apropiado (p. ej., las gráficas de residuos presentan evidencia de un "gancho").
se deben usar los métodos de la sección 4.2. Para un intervalo de confianza de una sola valoración, se requieren técnicas avan-
zadas, tales como perfiles de probabilidad o método de remuestreo (bootstrapping), para obtener un intervalo de confianza
para el logaritmo de la potencia relativa, r.
Mediciónde Falta de Paralelismo-Evaluar el paralelismo de un modelo logístico de cuatro parámetros significa evaluar el
parámetro de la pendiente y las dos asíntotas. Durante el desarrollo (ver el capítulo (1032)), se debe tomar una decisión con
respecto a qué parámetros son importantes y la forma en que se medirá la falta de paralelismo. Tal como se analiza en el capí-
tulo (1032), la medida de falta de similitud puede ser una medida compuesta que considere todos los parámetros juntos en
una sola medición, tal como la suma de cuadrados de paralelismo (ver el capítulo (1032)), o se puede considerar cada paráme-
tro por separado. En el último caso, la medida puede consistir en funciones de los parámetros, tal como una asíntota dividida
por la diferencia de asíntotas o el cociente de las asíntotas. Para cada parámetro (o función de parámetros), los intervalos de
confianza se pueden calcular mediante métodos de remuestreo o de perfil de probabilidad. Dichos métodos no se presentan
en este capítulo general.
3.5 Modelos de Concentración-Respuesta de Cociente de Pendientes
Cuando una regresión lineal se ajusta bien a los datos de concentración-respuesta no transformados, se puede usar un mo-
delo de cociente de pendientes. Las ecuaciones para el modelo de cociente de pendientes cuando se asume la similitud son:
Ys=a+[Jz+e=a+[J sz+e
(3.7]
Yr= a+ /J (pz)+e= a+ /J ,pz.+ e= a+ /Jrz+ e
Una característica que identifica el modelo de concentración-respuesta de cociente de pendientes, la cual se puede observar
en los resultados de un estudio de intervalos, es que las líneas para diferentes potencias de un estudio de intervalos tienen la
misma ordenada al origen y diferentes pendientes. Por consiguiente, una gráfica para el estudio de intervalos tiene forma de
abanico. La Figura3.4 presenta un ejemplo de un modelo de concentración-respuesta de cociente de pendientes. Se debe
tomar en cuenta que la ordenada al origen común no necesariamente está en el origen.
Concentración
Figura 3.4. Ejemplo de un modelo de cociente de pendientes.

Una valoración con un modelo de concentración-respuesta de cociente de pendientes para medir la potencia relativa cons-
ta, como mínimo, de una muestra Estándar y una muestra de Prueba, cada una medida en una o más concentraciones y, por
lo general, una respuesta medida sin muestra (concentración cero). Debido a que las concentraciones no se transforman en
logaritmos, a menudo se espacian equitativamente sobre la escala original, en lugar de la escala logarítmica. El modelo consis-
te en una ordenada al origen común, una pendiente para los resultados de la muestra de Prueba y una pendiente para los
resultados de la muestra Estándar como en la ecuación [3.7]. La potencia relativa se determina entonces a partir del cociente
de las pendientes:
Potencia Relativa=
Pendiente de la muestra de Prueba/Pendiente de la muestra Estándar=
/Jp//J =p
Suposicionesy Estimaciónpara Modelosde Cocientede Pendientes-las suposiciones para el modelo de cociente de pendien-
tes son las mismas que para los modelos de líneas paralelas: Los términos residuales son independientes, tienen una varianza
constante y podría ser necesario que tuvieran una distribución normal. El método de estimación también es el de cuadrados
mínimos. Esto se puede implementar con o sin ponderación, según se demuestra en las ecuaciones [3.8] y [3.9], respectiva-
mente.
[3.8]
¿w y-C1-/3 z(1-T)-J3rzT )2
(
A
5
A
[3.9]
La ecuación [3.9] es apropiada únicamente si las ponderaciones se determinan sin usar la respuesta, es decir las y, de los
datos en curso. Ésta es una regresión lineal con dos variables independientes, z(l - T) y zT, donde T = 1 para los datos de la
Prueba, y T = O para los datos del Estándar. /JTes la pendiente estimada para la Prueba, /J,es la pendiente estimada para el
Estándar y, por tanto, la estimación de la potencia relativa es
Puesto que el modelo de cociente de pendiente es un modelo de regresión lineal, se pueden usar la mayoría de los progra-
mas estadísticos y hojas de cálculo para obtener la estimación de la potencia relativa. En algunos sistemas de valoración, en
ocasiones resulta apropiado omitir la concentración cero (p. ej., si los controles sin dosis se manejan de manera distinta en la
valoración) y algunas veces una o más de las concentraciones altas (p. ej., si existe un efecto de gancho en el que las concen-
traciones más altas no contienen las respuestas más altas). La discusión sobre el uso de un modelo de medias y la selección de
subconjuntos de concentraciones para valoraciones biológicas de líneas rectas paralelas se aplica también a las valoraciones de
cociente de pendientes.
se deben usar los métodos de la sección 4.2. Para un intervalo de confianza a partir de una sola valoración, usar el Teorema de
Fieller (sección 4.3) aplicado a
Mediciónde Faltade Similitud-Para modelos de cociente de pendientes, la similitud estadística corresponde a ordenadas al
origen iguales para el Estándar y la Prueba. Para evaluar la suposición de similitud, es necesario contar con al menos dos con-
centraciones diferentes a cero para cada muestra. Si las ordenadas al origen no son iguales, la ecuación [3.7] se convierte en
Ys= ªs + fJsz+ e
Yr= ªr + /JrZ + e
Las desviaciones de la similitud a menudo se miden mediante la diferencia de las ordenadas al origen, ªr - a5 • Una manera
fácil de obtener un intervalo de confianza es ajustar el modelo,
y= ªs + oT + /3,z(1 - T) + /3rZT+ e,
donde o= aT - a 5 y usar para o el intervalo de confianza estándar basado en la distribución t.
3.6 Valoraciones Dicotómicas (Cuantales)
Para valoraciones cuantales, la medición de la valoración tiene un resultado dicotómico o binario, p. ej., en valoraciones con
animales, el animal está muerto o vivo, o se puede observar o no cierta respuesta fisiológica. Para valoraciones celulares, la
respuesta cuantal puede relacionarse con la aparición o no de una respuesta más allá de algún umbral en la célula. En una
titulación viral basada en células o en valoraciones de formación de colonias, la respuesta cuantal puede ser un límite de res-
puesta en número entero, como por ejemplo un número entero de partículas o colonias. Cuando es posible determinar fácil-
mente la presencia de algunas partículas-pero no su número real-entonces la valoración se puede analizar como cuantal.
Cabe tomar en cuenta que si la reacción se puede cuantificar en una escala continua, por ejemplo, con una densidad óptica,
entonces la valoración no es cuantal.
ModelosParaAnálisisCuanta/es-la clave para los modelos de respuestas cuantales es trabajar con la probabilidad de una
respuesta (p. ej., probabilidad de muerte), al contrario de las respuesta cuantitativas en las que el modelo es para la respuesta
misma. Para cada concentración, z, un animal tratado, por ejemplo, tiene una probabilidad de responder a dicha concentra-
ción, P(z). A menudo, la curva P(z) se puede aproximar a una curva sigmoidea cuando se grafica en función del logaritmo de
concentración, según se muestra en la Figura3.5. Esta curva muestra que la probabilidad de respuesta se incrementa con la
concentración. La concentración que corresponde a una probabilidad de 0,5 es el EC •
50
,75
'C
m
'C
:o ,50
'ª
a. ,25
10910de la Concentración
Figura 3.5. Ejemplo de curva sigmoidea para P(z).

El modelo de la curva sigmoidea a menudo se genera basándose en la distribución normal o en la distribución logística. Si se
emplea la distribución normal, el análisis resultante se denomina análisis de probitas, y si se emplea la distribución logística, el
análisis se denomina análisis logit o logístico. Los modelos de probitas y logit son prácticamente indistinguibles, por lo que
cualquiera representa una opción aceptable. La selección de uno u otro se puede basar en la disponibilidad de software que
satisfaga las necesidades de análisis e informe del laboratorio. Debido a que los modelos logísticos cuentan con una disponibili-
dad de software mayor (a menudo denominado de regresión logística) la presente discusión se enfocará en el uso e interpreta-
ción del análisis logit. Las consideraciones discutidas en esta sección para el análisis logit (usando una transformación logística)
también se aplican a los análisis de probitas (usando una transformación con probitas).
ModeloLogit-EI modelo logit para la probabilidad de respuesta, P(z), se puede expresar en dos formas equivalentes. Para la
cruva sigmoidea,
P(z)
1+ antilog [-/30 -/31 log(z)]
1
donde log(ED5o) = - p 0/ p 1 • Una forma alternativa presenta la relación con los modelos lineales:
Transformaciónlogit deP =log(~) =/3+/3,log(z)

0 [3.10]
1-P
La forma lineal a menudo se presenta usando logaritmos naturales y es útil recordar que muchas de las consideraciones, en
particular la linealidad y el paralelismo, analizadas para los modelos de líneas paralelas en la sección 3.3 Modelosde LíneasPara-
lelaspara RespuestasCuantitativastambién se aplican a los modelos cuantales.
Para un análisis logit con preparaciones Estándar y de Prueba, T representa una variable que toma el valor 1 para animales
que reciben la preparación de Prueba y O para animales que reciben el Estándar. Entonces, asumiendo el paralelismo de las
curvas de Prueba y Estándar, el modelo logit para estimar la potencia relativa es:
log(~) = /3 1 log(z) + /3
0 +{3 2T
1-P
El logaritmo de la potencia relativa de la Prueba en comparación con la preparación Estándar es, por lo tanto, p if P • Las
1
dos curvas de la Figura3.6 son sigmoideas paralelas del Estándar y de la Prueba. (Si se presentaran las formas lineales corres-
pondientes de la ecuación [3.1 O], éstas serían dos líneas rectas paralelas.) El logaritmo de la potencia relativa es la distancia
horizontal entre las dos curvas, de la misma forma que para los modelos lineales y logísticos de cuatro parámetros provistos
para respuestas cuantitativas (secciones 3.3 Modelosde LíneasParalelas para RespuestasCuantitativasy 3.4 ModelosNo Lineales
para RespuestasCuantitativas).
USP42 InformaciónGeneral/ (1034) Análisisde ValoracionesBiológicas 7427
ode la Concentración
1091
Figura 3.6. Ejemplo de Curvas Sigmoideas Paralelas.
Estimaciónde los Parámetrosdel Modeloy de la PotenciaRelativa-Se encuentran disponibles dos métodos para estimar los
parámetros de los modelos logit y de probitas: la probabilidad máxima y los cuadrados mínimos ponderados. La diferencia no
tiene importancia práctica y el laboratorio puede aceptar la selección realizada por el software. Lo siguiente asume un progra-
ma de software de regresión logística general. El software especializado debe ser similar.
Tomando en cuenta la forma de la ecuación [3.1 O], se observa una similitud con la regresión lineal. Existen dos variables
independientes, x = log(z) y T. Para cada animal, existe una variable dependiente sí/no, para la que a menudo se usa el código
1 para sí o respuestay O para no o sin respuesta.Aunque las valoraciones biológicas a menudo se diseñan con números iguales
de animales por concentración, esto no es un requisito de análisis. Utilizando los parámetros estimados por el software, los
cuales incluyen p o, p 1 y p 2 y sus errores estándar, se obtiene la estimación del logaritmo natural de la potencia relativa:
~
Estimacióndel logaritmode la potencia relativa :::::;
/3,
se deben usar los métodos de lq se<;:ción4.2. Para un intervalo de confianza a partir de una sola valoración, usar el Teorema de
Fieller (sección 4.3) aplicado a /J2I /J,.El intervalo de confianza para la potencia relativa es, por lo tanto [antilog(L), antilog(U)],
donde [L, U] es el intervalo de confianza para el logaritmo de la potencia relativa.
Suposiciones-lassuposiciones para los modelos cuantales tienen dos partes. La primera se relaciona con las suposiciones
subyacentes con respecto a la probabilidad de respuesta de cada animal o unidad en la valoración biológica. Éstas son suposi-
ciones difíciles de verificar que dependen del diseño de la valoración. La segunda parte concierne a las suposiciones para el
modelo estadístico para P(z). Las más importantes de éstas son el paralelismo y la linealidad. Estas suposiciones se pueden veri-
ficar de buena manera al igual que los análisis de líneas paralelas para respuestas cuantitativas.
En la mayoría de los casos, los análisis cuantales asumen un modelo de probabilidad binómico estándar, que es una selec-
ción común para la distribución de datos dicotómicos. Las suposiciones claves del binomio se basan en que a una concentra-
ción dada, cada animal tratado a dicha concentración, tiene la misma probabilidad de responder y los resultados para cual-
quier animal son independientes de los de los otros animales. Este conjunto básico de suposiciones se puede infringir de mu-
chas maneras. La más destacada de éstas es la presencia de efectos de la camada, donde los animales de la misma camada
tienden a presentar una respuesta más parecida entre ellos que los animales de diferentes camadas. Los efectos de la jaula, en
los que las condiciones ambientales o el cuidado dado a cualquier jaula específica hace que los animales de dicha jaula sean
más o menos propensos a responder al tratamiento experimental, violan las suposiciones de idéntica probabilidad y de inde-
pendencia. Estas violaciones de las suposiciones y otras similares (que podrían ser una selección deliberada del diseño) no impi-
den el uso de modelos logit o de probitas. No obstante, son indicaciones de que podría requerirse una metodología más com-
pleja para el análisis que la presentada en este capítulo (ver el capítulo (1032)).
Verificaciónde las Suposiciones-Elmodelo estadístico para P(z) asume linealidad y paralelismo. Para evaluar el paralelismo,
se puede modificar la ecuación [3.1 O] de la manera siguiente:
log(~) =/30 +/31 log(z)+/32 T +/3

3 T * log(z)
1-P
En este caso, p 3 es la diferencia de pendientes entre la Prueba y el Estándar y debe ser lo suficientemente pequeña. [Eltérmino
T*log(z) se conoce como un términode interacciónen la terminología estadística.] La medición de falta de paralelismo también
se puede expresar en términos del cociente de las pendientes, (P 1 + p 3)/ p 1 • Para intervalos de confianza basados en modelos
para estas mediciones de falta de paralelismo, se recomiendan los métodos de remuestreo o de probabilidad del perfil. Dichos
métodos no se presentan en este capítulo general.
Para evaluar la linealidad, resulta una buena práctica comenzar con un examen gráfico. De acuerdo con la ecuación [3.1 O],
ésta sería una gráfica de log[(y + 0,5)/(n - y+ 0,5)] en función del log(concentración), donde y es el número total de respues-
tas en la concentración y n es el número de animales en dicha concentración. (Las correcciones 0,5 mejoran las propiedades
de este cálculo como una estimación de log[P/(1 - P)],) Las líneas para el Estándar y la Prueba deben ser líneas rectas paralelas,
al igual que en el modelo lineal en valoraciones cuantitativas. Si la relación es monotónica pero no parece ser lineal, entonces
el modelo de [3.1 O] se puede expandir con otros términos. Por ejemplo, se puede agregar un término cuadrático en log(con-
7428 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ Información General USP 42
centración): [log(concentración)]2. Si fuera necesario transformar la concentración en algo distinto del logaritmo de la concen-
tración, entonces el análogo del modelo cuantal de las valoraciones de cociente de pendientes es una opción. Esto último es
posible; sin embargo, debido a que no se usa con frecuencia, no se analizará en mayor profundidad en el presente capítulo
general.
ValoresAberrantes-La evaluación de valores aberrantes es más difícil en las valoraciones cuantales que en las valoraciones
cuantitativas. Debido a que la respuesta de la valoración solo puede ser sí o no, ninguna respuesta individual puede ser inusual.
Lo que parece caer dentro de la categoría de valor aberrante es una sola respuesta a una concentración baja o una sola falta de
respuesta a una concentración alta. Asumiendo que no se ha encontrado ninguna causa (p. ej., incapacidad de administrar
adecuadamente el fármaco al animal), no existe fundamento estadístico para distinguir un valor aberrante de un evento extra-
ño.
MétodosAlternativos-Se pueden aceptar alternativas a los análisis cuantales simples aquí descritos, dependiendo de la natu-
raleza del desafío analítico. Uno de esos desafíos es la falta de independencia entre unidades experimentales, según se puede
apreciar en los efectos de la camada en valoraciones con animales. Algunas de las metodologías que se pueden emplear son
las Ecuaciones de Estimación Generalizadas (GEE, por sus siglas en inglés), los modelos lineales generalizados y los modelos de
efectos mixtos lineales generalizados. Un Análisis con Ecuaciones de Estimación Generalizadas producirá errores estándar e in-
tervalos de confianza cuya validez no dependerá del cumplimiento de la suposición de independencia.
Además, existen métodos que no realizan ninguna elección particular de la ecuación del modelo para la curva sigmoidea.
Un ejemplo que se aprecia comúnmente es el método Spearman-Karber.
4. INTERVALOS DE CONFIANZA
El informe del resultado de una valoración debe incluir una medición de la incertidumbre de dicho resultado. Esto es, a me-
nudo, un error estándar o un intervalo de confianza. Un intervalo (e, d), en el que e es el límite de confianza inferior y des el
límite de confianza superior, es un intervalo de confianza de 95% para un parámetro (p. ej., la potencia relativa) si el 95% de
tales intervalos al repetir el experimento incluyeron el valor real del parámetro. Un intervalo de confianza se puede interpretar
como valores indicativos del parámetro que son uniformes con respecto a los datos. Esta interpretación de un intervalo de con-
fianza requiere satisfacer diversas suposiciones. Las suposiciones también deben cumplirse cuando en una monografía se utiliza
el ancho o el ancho medio [(d-c)/2] como una medida para determinar si existe la precisión adecuada para informar una po-
tencia. El ancho del intervalo en ocasiones se emplea como un criterio de aptitud sin la interpretación de confianza. En tales
casos, no es necesario cumplir con las suposiciones.
Los intervalos de confianza pueden ser basadosen modeloso basadosen muestras.Un intervalo basado en modelos se basa
en los errores estándar para cada una o más de las estimaciones del logaritmo de la potencia relativa que provienen del análisis
de un modelo estadístico particular. Los intervalos basados en modelos no deberán usarse cuando sea posible utilizar intervalos
basados en muestras. Los intervalos basados en modelos requieren que el modelo estadístico incorpore correctamente todos
los efectos y correlaciones que influencian la estimación de precisión del modelo. Éstos incluyen, pero no se limitan a dilucio-
nes en serie y efectos de placa. La sección 4.3 MétodosBasadosen Modelosdescribe el Teorema de Fieller, un intervalo basado
en modelo de uso común.
Los métodos basados en muestras combinan estimaciones independientes del logaritmo de la potencia relativa. Pueden sur-
gir múltiples valoraciones debido a que la necesidad de dicho método se determinó durante el desarrollo y la validación, o
debido a que el procedimiento de valoración fija un ancho máximo aceptable del intervalo de confianza y podrían ser necesa-
rias dos o más valoraciones independientes para cumplir con el rec¡uisito de ancho específico. Algunos métodos basados en
muestras no requieren que el modelo estadístico incorpore correctamente todos los efectos y correlaciones. No obstante, esto
no debe interpretarse como un descarte del valor de tratar las correlaciones y demás factores que influencian la precisión den-
tro de la valoración. La precisión dentro de la valoración se emplea en la evaluación de la similitud y es una porción de la varia-
bilidad, la cual es el fundamento para los intervalos basados en muestras. Por lo tanto, es importante minimizar la variabilidad
dentro de la valoración hasta donde resulte práctico. Los intervalos basados en muestras se discuten en la sección 4.2 Combi-
naciónde Valoraciones
Independientes(Métodospara Intervalosde ConfianzaBasadosen Muestras).
4.1 Combinaciónde Resultadosde MúltiplesValoraciones

A fin de mitigar los efectos de la variabilidad, resulta adecuado llevar a cabo determinaciones repetidas de valoraciones bio-
lógicas independientes y combinar sus resultados para obtener un valor de informe único. Posteriormente, dicho valor de in-
forme único (y no los resultados individuales de la valoración) se compara con cualquier criterio de aceptación aplicable. Du-
rante el desarrollo y validación de la valoración, los analistas deben evaluar si sería útil combinar los resultados de dichas valo-
raciones y, en caso afirmativo, la forma en que se va a proceder.
Existen dos preguntas principales que se deben tratar cuando se considera la forma de combinar los resultados de múltiples
valoraciones:
¿Sonmutuamente independienteslas valoraciones?
Un conjunto de valoraciones se puede considerar mutuamente independiente cuando las respuestas de alguna de éstas
no depende en ninguna forma de la distribución de las respuestas de las valoraciones restantes. Esto implica que los erro-
res aleatorios en todos los factores esenciales que influencian el resultado (por ejemplo, diluciones del estándar y de la
USP 42 Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 7429
preparación que se va a examinar o la sensibilidad del indicador biológico) en una valoración debe ser independiente de
los errores aleatorios correspondientes de las otras valoraciones. Por consiguiente, las valoraciones en días sucesivos que
emplean las diluciones originales y reservadas del Estándar no son valoraciones independientes. De manera similar, si las
respuestas, en particular la potencia, dependen de otros reactivos compartidos por las valoraciones (p. ej., preparaciones
celulares), las valoraciones podrían no ser independientes.
Las valoraciones no necesitan ser independientes para que los analistas combinen los resultados. Sin embargo, los méto-
dos para valoraciones independientes son mucho más simples. Asimismo, combinar resultados de valoraciones depen-
dientes puede requerir suposiciones sobre la forma de la correlación entre los resultados de las valoraciones que, en el
mejor de los casos, podrían ser difíciles de verificar. Existen métodos estadísticos disponibles para valoraciones dependien-
tes, aunque no se presentan en este capítulo general.
¿Son homogéneoslos resultadosde las valoraciones?
Los resultados homogéneos solo presentan diferencias debidas a errores aleatorios dentro de las valoraciones. Cualquier
contribución de factores asociados con la precisión intermedia impide la homogeneidad de los resultados. Los factores de
precisión intermedia son aquéllos que varían entre las valoraciones dentro de un laboratorio y pueden incluir analistas,
equipo y condiciones ambientales. Existen pruebas estadísticas para heterogeneidad, pero la falta de heterogeneidad esta-
dísticamente significativa no se toma como una garantía de homogeneidad, por lo que no se recomienda prueba alguna.
Si los analistas emplean un método que supone la homogeneidad, ésta debe ser evaluada durante el desarrollo, docu-
mentada durante la validación y monitoreada durante el uso continuo de la valoración.
Además, antes de que se puedan combinar los resultados de las valoraciones, los analistas deben considerar la escala en la
que se llevará a cabo dicha combinación. En general, la combinación se debe realizar usando la escala en la que las estimacio-
nes de parámetros se distribuyen aproximadamente de manera normal. Así, para las potencias relativas basadas en un método
de líneas paralelas, de curvas paralelas o cuanta!, las potencias relativas se combinan en la escala logarítmica.
4.2 Combinación de Valoraciones Independientes (Métodos para Intervalos de Confianza Basados

en Muestras)
Los analistas pueden usar diversos métodos para combinar los resultados de valoraciones independientes. Un método simple
descrito a continuación (Método 1) asume una distribución común de las potencias relativas en todas las valoraciones, por lo
que es un método recomendable. Asimismo, se proporciona un segundo procedimiento que puede ser útil si se puede docu-
mentar la homogeneidad de la potencia relativa en todas las valoraciones. Se ofrece una tercera alternativa que puede ser útil
si no se cumplen las suposiciones para los Métodos 1 y 2. La alternativa de analizar todas las valoraciones juntas usando un
modelo de efectos mixtos lineal o no lineal no se discute en este capítulo general.
Método 1-Resu/tados de Va/oracionesIndependientesa partirde una Distribuciónde Va/oracionesComún-El siguiente es un
método simple que asume la independencia de las valoraciones. Se asume que los resultados de la valoración individual (loga-
ritmos de las potencias relativas) se derivan de una distribución normal común con algo de varianza diferente a cero. Esta su-
posición de distribución común requiere que todas las valoraciones que se van a combinar hayan usado el mismo diseño y
procedimientos de laboratorio. Queda implícito que las potencias relativas pueden diferir entre las valoraciones. Por lo tanto,
este método captura la variabilidad entre valoraciones con respecto a la potencia relativa. Se debe tomar en cuenta que las
potencias relativas individuales no deben redondearse antes de combinar los resultados.
Suponiendo que R¡es el logaritmo de la potencia relativa de la im•valoración de N resultados de valoraciones que se van a
combinar. Para combinar los N resultados, la media, la desviación estándar y el error estándar de la R¡se calculan de la manera
usual:
N
Media R= ¿R/N
1::1
Desviación Estándar S = -1-f (R; -R)2

N-1 ,=,
Error Estándar SE= SI JN
Posteriormente, se determina un intervalo de confianza del 100(1 - a)% como
R± 4, -1,n/2SE,
donde 4, _ ,,aii es el punto porcentual superior a/2 de una distribución t con N - 1 grados de libertad. La cantidad
,,n,
4, _ 2SE es la incertidumbre expandida de R. El número, N, de valoraciones que se van a combinar es, por lo general, peque-
ño, y, por consiguiente, el valor de t es a menudo grande.
Puesto que los resultados se combinan en la escala logarítmica, el resultado combinado se puede informar en la escala sin
transformar como un intervalo de confianza para la potencia media geométrica, estimada mediante antilog(R),
antilog(R-tN-1,n/2SE),
antilog(R±tN-1,n/2sE)
7430 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ Información General USP 42
Método2-Resultados de Va/oracionesIndependientesy Suposiciónde Homogeneidad-Este método se puede usar siempre

que se cumplan las siguientes condiciones:
(1) Las estimaciones de potencia individual forman un conjunto homogéneo con respecto a la potencia que se está estiman-
do. Se debe tomar en cuenta que esto significa documentar (a menudo durante el desarrollo y la validación) que los fac-
tores de precisión intermedia no contribuyen a la variabilidad entre valoraciones. Los resultados individuales deben pare-
cer uniformes con respecto a la homogeneidad. En particular, las diferencias entre éstos debe ser uniforme con respecto a
sus errores estándar.
(2) Las estimaciones de potencia se derivan de valoraciones independientes.
(3) El número de grados de libertad de los errores residuales individuales no es pequeño. Esto es necesario para determinar
de manera adecuada todas las ponderaciones.
Cuando no se cumplen estas condiciones, no es posible aplicar este método, por lo que deberá usarse el Método 1, el Méto-
do 3 o algún otro método. Además, se debe tomar en cuenta que el Método 2 (debido a que asume la ausencia de variabili-
dad entre valoraciones) a menudo resulta en intervalos de confianza más estrechos que el Método 1, pero esto no es justifica-
ción suficiente para usar el Método 2 ante la falta de cumplimiento de las condiciones citadas anteriormente.
Cálculode Coeficientesde Ponderación-Se asume que los resultados de cada una de las N valoraciones han sido analizados
para proporcionar N estimaciones del logaritmo de potencia con límites de confianza asociados. Para cada valoración, i, el in-
tervalo logarítmico de confianza para el logaritmo de potencia o el logaritmo de la potencia relativa y un valor L;se obtienen
restando el límite de confianza inferior del límite de confianza superior. (Esta fórmula, usando el L;,acomoda intervalos de con-
fianza asimétricos tales como el Teorema de Fieller,sección 4.3 MétodosBasadosen Modelos).Un peso W; para cada valor del
logaritmo de la potencia relativa, R;,se calcula de la manera siguiente, donde t; tiene el mismo valor que el usado en el cálculo
de los límites de confianza en la im•valoración:
W = 41~ [4.1]
i L~
Cálculode la MediaPonderaday de los Límitesde Confianza-los productos W;R;se forman para cada valoración y su suma se
divide por el peso total para todas las valoraciones para proporcionar el logaritmo de la potencia relativa media ponderada y
su error estándar de la manera siguiente:
N N
Media R= I W;R/2..,
W,
i=1 1=1
Error Estándar SE= 1/ )tw,

Posteriormente, se determina un intervalo de confianza del 100(1 - u)% en la escala logarítmica como
[4.2]
donde ½<.a, 2 es el punto porcentual superior u/2 de una distribución t con grados de libertad, k, igual a la suma del número de
grados de libertad para el error de cuadrados medios en las valoraciones individuales. Posteriormente, este intervalo de con-
fianza puede transformarse nuevamente a la escala original, al igual que en el Método 1.
Método 3-Resultados de ValoracionesIndependientesSin la Suposiciónde una Distribuciónde Va/oracionesComún-El Método
3 es un método aproximado que se puede considerar cuando no se cumplen las condiciones del Método 1 (distribución de
valoraciones común) o el Método 2 (homogeneidad).
La variación observada tiene entonces dos componentes:
• la variación intravaloración para la valoración i:
2
5; =1/W,
• la variación entre valoraciones:
2 1 N, -.2 1f '
se=-IIR,-R) --..:.,S,
N-1 ;-, N _,
Posteriormente, se calcula un coeficiente de ponderación para cada valoración como
W' __ 1_
' - s~+s~
el cual reemplaza W, en la ecuación [4.1] y donde ten la ecuación [4.2] a menudo se aproxima mediante el valor 2.
4.3 Métodos Basados en Modelos
Muchos intervalos de confianza son del tipo:

Intervalo de confianza = valor± k veces el error estándar de dicho valor.

Para tales casos, siempre que se pueda determinar fácilmente el multiplicador k (p. ej., a partir de una tabla de distribución
t), informar el error estándar e informar el intervalo de confianza serán altamente equivalentes, puesto que se podrá determi-
nar fácilmente el intervalo de confianza a partir del error estándar. No obstante, los logaritmos de las potencias relativas para
modelos de líneas paralelas y algunas parametrizaciones de modelos no lineales, así como las potencias relativas de los mode-
los de cocientes de pendientes, son cocientes. En tales casos, los intervalos de confianza no son simétricos alrededor del loga-
ritmo de la potencia relativa o de la potencia estimadas, por lo que se requiere el Teorema de Fieller. Para estos casos asimétri-
cos, se debe informar el intervalo de confianza, puesto que el error estándar por sí mismo, no captura la asimetría.
El Teorema de Fieller es la fórmula para el intervalo de confianza para un cociente. Suponiendo que R = a/b es el cociente
para el que se requiere un intervalo de confianza. Para las estimaciones de a y b, se cuenta con sus respectivos errores están-
dar, SE. y SEb,y con una covarianza entre ellos, denominada Cov. (La covarianza es una medición del grado de relación de las
estimaciones de a y b, y es proporcional a la correlación entre las estimaciones de a y b.) La covarianza puede ser O, al igual
que para algunas parametrizaciones de análisis de líneas paralelas estándares, aunque no es un requisito. Posteriormente, el
intervalo de confianza para R es según se indica a continuación:
~
R_gC:ov ± 1(1-g)SE' +R'SE'-2RCov+!JCov' )f
{ SE; b ~ ' b SE;
1-g
en donde
t2SE2
g=-.-º
b'
y tes el valor desviado apropiado de t que dependerá del tamaño de la muestra y del nivel de confianza seleccionado (por lo
general 9S%). Si g > 1, esto significa que el denominador, 6, no presenta una diferencia estadísticamente significativa a Oy el
uso del cociente no es sensible para dichos datos.
Para aquellos casos en los que las estimaciones de a y b no guardan una correlación estadística (Cov = O), la fórmula del
intervalo de confianza se simplifica a
[4.3]
5. FUENTESADICIONALES
DE INFORMACIÓN
Se pueden usar una variedad de métodos estadísticos para analizar los datos de las valoraciones biológicas. Este capítulo pre-
senta diversos métodos, pero también se pueden emplear muchos otros métodos similares. Es posible encontrar información
adicional, así como procedimientos alternativos en las referencias citadas a continuación y en otras fuentes.
1. BlissCI. TheStatisticsof Bioassay.New York: Academic Press; 1952.
2. BlissCI. Analysis of the biological assays in U.S.P. XV.Drug Stand. 1956;24:33-67.
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dose-response curves. Am J Physiol.1978;235:E97-E102.
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95% confidence leve!. Anal Chem. l 991;63:39-48.
7432 (1039) Quimiometría / Información General USP42
(1039) QUIMIOMETRÍA
1. INTRODUCCIÓN
1 .1 Alcance y Propósito
1.2 Resumen del Documento
1.3 Audiencia
2. CONCEPTOS DE QUIMIOMETRÍA
3. CICLO DE VIDADELMODELO
3.1 Desarrollo del Modelo: Calibración
3.2 Validación del Método
3.3 Monitoreo del Modelo
3.4 Actualización del Modelo y Transferencia del Método
3.5 Revalidación
4. APLICACIONESDE LAQUIMIOMETRÍA
4.1 Cualitativas
4.2 Cuantitativas
GLOSARIO
APÉNDICE
REFERENCIAS
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Alcancey Propósito

Este capítulo provee guías con respecto a las prácticas científicas adecuadas para el análisis quimiométrico y la interpretación
de datos multivariantes para aplicaciones farmacopeicas e industriales. Las prácticas quimiométricas establecidas, que incluyen
calibración y validación, para aplicaciones que emplean distintas tecnologías analíticas (p .ej., espectroscópicas, cromatográfi-
cas, entre otras) y para diferentes propósitos (p. ej., identificación por huella dactilar, identificación, clasificación, predicción de
propiedades, entre otros) se tratan mediante un enfoque de ciclo de vida. Se describen aplicaciones cualitativas y cuantitativas.
Este capítulo trata la forma en que se asegura la calidad y el desempeño del método mediante la gestión apropiada del ciclo
de vida de un modelo basado en quimiometría, que incluye selección de algoritmos apropiados, calibración, validación, verifi-
cación, transferencia y etapas de mantenimiento continuas.
Este capítulo puede considerarse suplementario a otros capítulos de guías, tales como DatosAnalíticos-Interpretación y Tra-
tamiento(101 O), los cuales tratan principalmente el análisis y la interpretación de datos univariantes.
[NOTA-No se debe inferir que las herramientas de análisis multivariante mencionadas en este capítulo constituyen una lista
exhaustiva. Se pueden usar otros modelos igualmente válidos a discreción del fabricante y de los demás usuarios de este capí-
tulo.]
1.2 Resumen del Documento
El siguiente mapa conceptual (Figura 1) provee una representación visual del contenido de este capítulo. Este diagrama tiene
el propósito de ayudar al lector mostrando la forma en que se relacionan entre sí los diversos conceptos y las prácticas de qui-
miometría.
USP42 InformaciónGeneral/ (1039) Quimiometría 7433
Desarrollo
c1áo~E§ioA
·
DEl MODHO. .
(lUIMIOMÉTRtCO
Exactitud Ht!n,unl¡,nlll~ ~ dphr,1,

Cl<lll<"\ (O~lilil11Vd~
l·terram1f'ntasyapltcd•
dcnecs coantltativas !Jrnfo11rnd~dJD1sclur1on
lmpurezd~
Figura 1. Resumen del documento.
1.3 Audiencia
Este capítulo provee instrucciones para el técnico en quimiometría que desarrolla modelos para una aplicación dada usando
técnicas quimiométricas y para el analista que opera el modelo dentro de un procedimiento analítico. El técnico en quimiome-
tría encontrará apoyo con respecto a la selección de algoritmos para una aplicación dada y guías para asegurar el desempeño
del modelo durante todo su ciclo de vida. El analista obtendrá información relacionada con las fortalezas y limitaciones de las
técnicas quimiométricas con respecto al uso para sustentar sus aplicaciones.
2. CONCEPTOSDE QUIMIOMETRÍA
La quimiometría se definió originalmente como la disciplina química que usa métodos matemáticos, estadísticos, entre
otros, que emplean la lógica formal para lograr dos objetivos: 1) diseñar o seleccionar experimentos y procedimientos de me-
dición óptimos; y 2) proveer la máxima cantidad de información química pertinente mediante el análisis de datos químicos.
(7,2) Más específicamente, la "quimiometría" se ha convertido en la aplicación de métodos multivariantes para el análisis de
datos químicos o relacionados, aunque los algoritmos en cuestión se pueden usar para extraer información casi de cualquier
dato medido, independientemente del origen-químico, físico, biológico, farmacéutico, entre otros. Este capítulo no se enfoca
en el desarrollo de procedimientos o métodos óptimos ni en la aplicación de diseño de experimentos, sino en el análisis de
datos multidimensionales recolectados a partir de un instrumento analítico, tal como datos espectroscópicos y cromatográfi-
cos. Un conjunto de datos multivariantes (es decir, datos multivariantes obtenidos a partir de un número de muestras u obje-
tos) forma una tabla o matriz de datos m x n. La matriz se representa mediante X, siendo m el número de muestras u objetos y
n el número de variables medidas para cada muestra (Figura2).
Por consiguiente, las técnicas de análisis de datos consideradas en este capítulo serán de naturaleza multivariante. Depen-
diendo del propósito del tratamiento de los datos, se aplicarán diferentes herramientas. Inicialmente, las técnicas de manipula-
ción de datos pueden dividirse en dos categorías: no supervisadas y supervisadas. Las herramientas no supervisadas usan úni-
camente la matriz X para extraer información, pero en el análisis de datos supervisado las muestras también se describen me-
diante un vector y, además de la matriz X. Esta es una tabla m x 1 que contiene información de propiedades para cada mues-
tra (p. ej., concentración, actividad de inhibición de enzimas). Las técnicas de análisis de datos supervisadas se usan para cons-
truir un modelo entre la matriz X y el vector y. En las ecuaciones que se usan en los modelos quimiometricos, los datos descri-
ben empíricamente sus varianzas subyacentes, tanto para propósitos supervisados como no supervisados. Las diferentes técni-
cas o herramientas aplicadas para los distintos propósitos se tratan con más detalle en 4. Aplicacionesde la Quimiometría.
La técnica no supervisada de uso más común es el análisis de componentes principales o PCA, por sus siglas en inglés, y la
supervisada más común es la regresión de mínimos cuadrados parciales o PLS,por sus siglas en inglés. Por su naturaleza, estas
técnicas son proyecciones latentes (ver la Figura2) que transforman un gran número de variables X potencialmente correlacio-
nadas, tales como intensidades a diferentes tiempos de retención o a distintas longitudes de onda, en un número más peque-
ño de variables no correlacionadas (componentes principales o variables latentes), dentro de lo posible. Tal como se observa
en la Figura2, el espacio multi dimensional de n variables original se transforma en un espacio de dos componentes principa-
les. Cuando las muestras del espacio original de datos se proyectan en este espacio de menores dimensiones, las coordenadas
resultantes de la muestra se denominan puntuaciones (seores) (T). La visualización de las puntuaciones junto con dos o más
componentes principales forma una gráfica de puntos que contiene información sobre las relaciones entre distintas muestras.
Las cargas (P) son una combinación lineal de las variables originales y de los coeficientes o pesos usados en esta combinación
lineal. Las cargas para variables latentes específicas también pueden graficarse en lo que se denomina una gráfica de cargas. La
gráfica de cargas contiene información sobre la importancia relativa de las variables originales. Tanto las gráficas de puntos
como las gráficas de cargas permiten comprender y visualizar la estructura subyacente de los datos (es decir, la presencia de
grupos/agrupamientos y/o exclusiones) dentro de un espacio dimensional reducido. La matriz de variables (E) producida por
el modelo se define como el error residual. La información de la muestra a lo largo de los ejes de la varianza común es captura-
da por los componentes principales del modelo. La varianza que no es tenida en cuenta por dichos componentes principales
(error residual) se deja en cada variable para cada muestra, formando la matriz residual (E).
X E
--•
variable
muestra¡
¡ =
Descomposición de datos mediante proyección:
Figura 2. Representación esquemática de técnicas de proyección latente.
3. CICLODE VIDA DELMODELO

Los modelos quimiométricos que forman parte de procedimientos analíticos se desarrollan para cumplir un propósito prede-
finido. Por lo general, el propósito previsto es una declaración que describe lo que se va a medir, el formato de los resultados y
el nivel de desempeño requerido con el resultado, y debe estar de acuerdo con el perfil analítico esperado. El perfil analítico
esperado puede especificar los criterios de desempeño para las características claves de los resultados del procedimiento analí-
tico y/o las probabilidades de riesgo en las decisiones que se esperan al usar el procedimiento analítico rutinariamente.
La calibración del modelo abarca un proceso iterativo que implica la selección del conjunto de muestras para uso en el desa-
rrollo del modelo quimiométrico, la selección de un algoritmo quimiométrico apropiado con el algoritmo de pre procesamien-
to necesario, y la evaluación del desempeño del modelo de acuerdo con los parámetros predefinidos para el perfil analítico
esperado. Durante la etapa de validación, se demuestra el desempeño del método para cumplir con el propósito previsto y el
perfil analítico esperado. El conocimiento adquirido durante la calibración y evaluación de los parámetros específicos y sus co-
rrespondientes límites se usa para evaluar el desempeño y definir un protocolo de mantenimiento del método que se usará
para la etapa de monitoreo, antes de la implementación para uso rutinario. Los cambios 9ue afecten el desempeño del modelo
deberían resultar en un conjunto definido de actividades para actualizarlo. Durante el ciclo de vida, también se podría necesi-
tar una actualización del modelo al realizar una transferencia del método a otro sitio de fabricación, o de un equipo a otro. El
grado de la revalidación será definido por la magnitud de la actualización del modelo. La Figura3 muestra un diagrama de
flujo de lo expuesto.
Lt
Propósitoesperado
(parte del ATP)
No
Sí
,------------------
1Uso de Rutina
Sí
No
y
Actualizar
Figura 3. Diagrama de flujo del ciclo de vida de un modelo quimiométrico.
3.1 Desarrollo del Modelo: Calibración
El objetivo de la calibración multivariante es desarrollar un modelo que vincule variables predictoras (p. ej., valores de absor-
bancia para el intervalo de longitudes de onda espectrales) con variables de respuesta, tales como concentraciones de ciertos
compuestos químicos. Por lo general, las variables de respuesta son más difíciles o costosas de obtener que las variables predic-
toras. La calibración es una etapa crítica, debido a que los detalles del modelo final se ven influenciados por muchos factores,
que incluyen la selección de muestras, las variables, un algoritmo y las opciones de pre procesamiento, así como la calidad del
método de referencia inicialmente usado (cuando sea aplicable) para medir las variables de respuesta. Por ende, no siempre se
sigue el orden aquí descripto para los componentes individuales de la calibración del modelo, y podrían repetirse etapas indivi-
duales de forma iterativa dependiendo de los resultados obtenidos en las etapas subsiguientes. Para lograr un buen desempe-
ño, el modelo de calibración debe ser robusto frente a las variaciones esperadas.
SELECCIÓNDE LA MUESTRA
La selección de muestras para el modelo de calibración es una etapa crítica para el desarrollo del modelo. Se deben usar
fundamentos científicos sólidos para seleccionar las muestras representativas de calibración con respecto a dos criterios: el ti-
po/intervalo de variabilidad, y el número de muestras. Las muestras se deben seleccionar de modo que el intervalo de sus valo-
res de respuesta abarquen todo el intervalo esperado de variación de respuesta para la aplicación prevista. El intervalo y tipo
de variación en los predictores pueden incluir la variabilidad relevante de factores distintos a la propiedad que se está predi-
ciendo, tales como el tamaño de partícula, el uso de diferentes lotes de ingredientes para la preparación de la muestra, la va-
riación entre analistas y días, y otras fuentes de variación. En el entorno de fabricación, se deben usar de muestras que repre-
senten partidas dentro y fuera de la especificación. Se recomienda decidir los factores y la variabilidad que serán incluidos en
las muestras de calibración considerando los riesgos. Uno de los métodos más comunes consiste en realizar un análisis de los
efectos en modo de falla (FMEA,por sus siglas en inglés) o un estudio de viabilidad para evaluar los efectos de dichos factores.
A medida que aumenta la complejidad del modelo de calibración (es decir, el tipo y el intervalo de variabilidad en las varia-
bles predictoras y de respuesta), también se incrementa el número de muestras que se requieren. En general, cuanto mayor
sea el número de muestras, mayor será la probabilidad de lograr los resultados correctos en todo el intervalo de calibración.
Asimismo, la distribución de las muestras de calibración también merece atención. Se prefiere una distribución uniforme de las
muestras, aunque no se requiere para todos los casos, dependiendo de los aspectos específicos de la aplicación. Se debe justifi-
car el número y la distribución de las muestras de calibración con fundamentos científicos sólidos. Cuando la obtención de
nuevas muestras de calibración se vuelve costosa, se usan comúnmente enfoques de diseño experimental o bases de datos
históricas como alternativas para construir modelos de calibración.
Los datos obtenidos a partir de muestras seleccionadas (es decir, un número seleccionado de filas de la matriz X de la Figura
2) deben someterse a clasificación adicional. Los análisis de datos exploratorios (ver Ejemplosde AplicaciónCualitativa) pueden
ser valiosos para entender la estructura de los datos, detectar potenciales conjuntos o grupos de muestras, identificar exclusio-
nes y seleccionar muestras representativas. Las exclusiones pueden detectarse usando parámetros que describan qué tan bien
se ajusta un modelo de observación dado dentro del espacio del modelo (p. ej., T2de Hotelling para métodos de variables
latentes) y la distancia al subespacio del modelo (p. ej., residual para métodos de variables latentes).
PROCESAMIENTO
PREVIO
El objetivo del procesamiento previo es implementar transformaciones matemáticas en las columnas de la matriz X (Figura2)
para amplificar la variación de interés dentro del conjunto de datos y atenuar la variación no pertinente tanto para las variables
como para las observaciones. El procesamiento previo es un paso inicial importante para la mayoría de los análisis de datos y
se puede aplicar de manera iterativa con la selección de variables. La comprensión de los datos de la muestra y/o de la técnica
analítica subyacente debe guiar la selección inicial de opciones de procesamiento previo. También se puede obtener informa-
ción que sirva para guiar el procesamiento previo a través de un análisis preliminar de los datos multivariantes (ver Ejemplosde
AplicaciónCualitativa). Las selecciones iniciales pueden modificarse o perfeccionarse dentro del contexto de la subsiguiente op-
timización del desempeño del modelo. Este proceso es casi siempre cíclico en la práctica; la comparación entre diversas estra-
tegias de procesamiento previo lleva a una mejor comprensión de los datos, lo que puede mejorar aún más el procesamiento
previo para maximizar la relación señal-ruido.
Sin embargo, existen dos puntos en los que hay que tener cuidado. El procesamiento previo debe usarse de forma cuidado-
sa debido a lo siguiente: 1) un procesamiento previo excesivo puede atenuar la señal y aumentar variaciones indeseadas; y 2)
muchos métodos quimiométricos pueden admitir datos con ruido y visualmente poco atractivos. Además, en algunos casos
donde el mismo instrumento realiza el procesamiento previo, puede ser imposible saber exactamente qué modificaciones han
sufrido los datos, debido a que muchos algoritmos usados por proveedores de instrumentos están patentados. El técnico en
quimiometría debe ser cuidadoso y estar informado de cualquier procesamiento previo aplicado a los datos que se van a utili-
zar.
El procesamiento previo puede ser un tratamiento matemático de los datos tales como transformación, normalización o al-
gún otro. El procesamiento previo de muestras (filas de matriz de datos) puede incluir centrado alrededor de la media o la
mediana, ajustes de escala y otros procedimientos. Las variables (columnas de la matriz de datos) también pueden ser transfor-
madas, alineadas (p. ej., recorte de tiempo de corrida (time warping)) o ajuste de escala (p. ej., ajuste automático de escala). El
centrado alrededor de la media es probablemente el método de procesamiento previo más común. Por ejemplo, el uso de
datos centrados alrededor de la media en el modelo de regresión elimina el término de ordenada al origen, lo que resulta en
un modelo potencialmente simplificado. Asimismo, es común eliminar la contribución lineal o polinomial de la línea base (p.
ej., corrección de sesgo/deriva), o aplicar técnicas de filtración digital, tales como derivadas, transformada de ondícula, filtro
de Fourier o filtro de Savitzky-Golay para eliminar o atenuar las desviaciones lineales y la contribución del ruido. Normalización
es el ajuste de la escala de las observaciones, lo que da a los objetos un impacto similar sobre la creación del modelo al: 1)
tener en cuenta factores que tienen impacto sobre la medición y que son distintos del analito de interés (p. ej., la variabilidad
de longitud de paso de la muestra ocasionada por el tamaño de partícula, el volumen de la muestra, o el espesor de la table-
ta); 2) corregir por variación en la concentración o masa de un analito para modelos cualitativos; y 3) atenuar artefactos de la
medición (p. ej., deriva del desempeño del instrumento). Cuando las variables están altamente correlacionadas, como en las
mediciones espectroscópicas, la normalización se realiza mediante variación normal estándar (SNV,por sus siglas en inglés) y
corrección multiplicativa de la dispersión (multiplicative scatter correction MSC, por sus siglas en inglés). A menudo, estas nor-
malizaciones se llevan a cabo en cada una de las muestras (filas).
Para los casos en los que las variables tienen unidades, sensibilidades o relaciones señal-ruido diferentes, por lo general se
aplica un ajuste de escala de las variables para corregir dichos factores; por lo general se usa el ajuste automático de la escala,
pero el analista puede considerar otras alternativas, tales como usar las desviaciones estándar combinadas de determinaciones
repetidas de mediciones como parámetros de ajuste de escala/ponderación. Estas normalizaciones por lo general se llevan a
cabo en cada una de las variables (columna). No existen guías para decidir qué enfoque de procesamiento previo es el mejor
para un conjunto de datos dado. A menudo se trata de un proceso de ensayo y error a medida que el analista aplica diversas
técnicas de procesamiento para encontrar la mejor. También se pueden aplicar combinaciones de técnicas de procesamiento
previo a un conjunto de datos dado.
SELECCIÓNDE ALGORITMOS
Se han probado muchos algoritmos diferentes en las aplicaciones quimiométricas, con distintos grados de éxito. Los méto-
dos incluyen algoritmos relativamente simples, tales como regresión lineal multivariante y sus modificaciones (regresión pon-
derada o robusta); los ampliamente usados enfoques de variables latentes, tales como regresión de componentes principales y
regresión de mínimos cuadrados parciales; métodos locales, tales como método de k-vecinos más cercanos (k-nearest neigh-
bors o kNN); y los métodos más sofisticados, tales como máquinas de vector de soporte (SVM, por sus siglas en inglés) y redes
neuronales artificiales. Se pueden encontrar más detalles sobre las herramientas algorítmicas de uso más común en 4. Aplicacio-
nes de Quimiometría. En general, es difícil predecir qué algoritmo producirá los mejores resultados para un conjunto de datos
particular. La multitud de elecciones para la selección de la muestra, la selección de variables y la normalización y el procesa-
miento previo de datos-así como la combinación de parámetros de ajuste para cada algoritmo-pueden afectar significativa-
mente el desempeño del modelo de calibración. En ocasiones, la elección del algoritmo se repite incluso con las etapas de
selección de muestra, la selección de variables y el procesamiento previo. Por ende, la elección del algoritmo puede depender
de la tarea en curso, de la disponibilidad de software y de la familiaridad del experto con el método. Otro aspecto a considerar
es que algunos algoritmos proveen herramientas útiles para diagnósticos e interpretación-tales como gráficas de regresión de
mínimos cuadrados parciales de puntuaciones, cargas y coeficientes, mientras que en ocasiones se hace referencia a otros co-
mo "cajas negras", debido a que sus funcionamientos internos pueden ser difíciles de interpretar (p. ej., redes neuronales).
Es importante tener en cuenta que muchos algoritmos son de naturaleza empírica. Casi siempre, se puede desarrollar algún
tipo de modelo. Por ende, los resultados deben evaluarse de forma crítica para asegurar que los resultados generados por el
modelo son pertinentes y correctos, y que el desempeño del modelo cumple con los requisitos del perfil analítico esperado.
Esto se puede lograr mediante validación cruzada y, en última instancia, mediante validación con el conjunto de datos de
prueba independientes que no se usó para desarrollar el modelo.
SELECCIÓNDE VARIABLES
El propósito previsto de la selección de variables es identificar un subconjunto de variables predictoras (es decir, la columna
de la matriz X en la Figura2) que puede mejorar el desempeño del modelo. La justificación subyacente de la selección de va-
riables en quimiometría se basa en dos aspectos. Primero, algunas variables predictoras pueden ser irrelevantes para el propósi-
to esperado e, idealmente, estas variables deben minimizarse o eliminarse del modelo. Por ejemplo, solo longitudes de onda
específicas del intervalo total generado por el espectrómetro pueden contener información relevante para la variación en los
niveles de la variable de respuesta. La selección de variables para este propósito debe basarse primeramente en principios y
experiencia. La inclusión de predictores no relacionados, tales como regiones espectrales irrelevantes, podría degradar poten-
cialmente el desempeño del modelo. Se puede usar un número menor de variables a partir de los datos procesados previa-
mente para lograr un desempeño superior, tales como exactitud, precisión y robustez.
La segunda parte de la justificación para la selección de variables es evitar el sobreajuste. El sobreajuste es la situación en la
que el modelo no solo describe la variabilidad pretendida en los datos, sino también incluye el ruido en el modelado. Esto
último tiene un efecto negativo sobre las propiedades predictivas del modelo. Por lo general, en quimiometría el número de
variables predictoras (cientos o miles) es mayor que el número de observaciones (docenas a cientos). A continuación, se pre-
sentan dos estrategias generales para manejar el problema del sobreajuste. Una estrategia es seleccionar de forma manual o
computacional solamente un subconjunto de variables predictoras y usarlas para el desarrollo del modelo. Las variables predic-
toras pueden seleccionarse de forma manual (p. ej., seleccionando ciertas longitudes de onda espectrales características de un
compuesto dado) o usando una variedad de métodos estadísticos de selección, tales como regresión paso a paso (o escalona-
da), y usando mediciones estadísticas univariantes simples, tales como la prueba F, la prueba t, el coeficiente de correlación, las
relaciones señal-ruido, los umbrales de intensidad, la importancia de las variables en la medida de proyección o los algoritmos
genéticos. Los enfoques multivariantes pueden usar cargas de variables de componentes principales, discriminantes lineales o
coeficientes de regresión para definir las características claves.
En la segunda estrategia para evitar el sobreajuste, no se seleccionan variables. Los métodos de variables latentes-regresión
de mínimos cuadrados parciales y regresión de componentes principales- por su naturaleza son capaces de dar selectivamen-
te un peso mayor a las variables predictoras importantes y quitar peso a las menos importantes. Estas nuevas variables latentes,
o componentes, se representan como combinaciones lineales de las variables observadas. Si se combinan con la selección de
variables, el desempeño de los modelos de variables latentes podría potencialmente mejorarse, debido a que algunas variables
predictoras solo contienen ruido, lo cual perturba el proceso de construcción del modelo.
Seleccionar un subconjunto de las variables predictoras que son informativas reducirá el tamaño del conjunto de datos, pro-
veerá eficiencia computacional y obtendrá mejores modelos para el procesamiento posterior. Una advertencia sobre dichas
aplicaciones, tales como autentificación consiste en que la eliminación de las variables predictoras que están desprovistas de
información puede impedir el reconocimiento de adulterantes u objetos novedosos que tienen características de estas variables
predictoras excluidas.
7438 (1039) Quimiometría / InformaciónGeneral USP42
VALIDACIÓNCRUZADA
En la práctica, la validación cruzada se usa para obtener un estimado del desempeño del modelo y para ajustar los paráme-
tros de un algoritmo (p. ej., el número de componentes para la regresión de mínimos cuadrados parciales). Esto se logra me-
diante la división repetitiva de los datos (es decir, el número de filas de la matriz X en la Figura2) en un conjunto de calibra-
ción, el cual se usa para desarrollar el modelo, y un conjunto de análisis (o conjunto de validación interna), que se usa para
hacer predicciones y comparar los valores reales y predichos.
El enfoque de validación cruzada n-iteraciones se usa comúnmente para dividir los datos en n subconjuntos para realizar la
validación cruzada. En cada una de las n iteraciones, se usan n-1 subconjuntos para desarrollar el modelo, el cual se usa para
predecir la nm•división de datos remanente. El procedimiento se repite hasta que se predicen todos los subconjuntos. Poste-
riormente, el error entre los valores de referencia y los predichos durante la validación cruzada se registra como la raíz cuadra-
da del error cuadrático medio de la validación cruzada (RMSECV,por sus siglas en inglés). Existen múltiples enfoques para la
división de datos en n segmentos. Independientemente de la forma en que se decida dividir los datos de calibración originales,
un aspecto que merece atención es que cualquier partida usada en la calibración y en la validación cruzada no debe conside-
rarse o reusarse como un conjunto de datos independiente para el método de validación. La forma más sencilla se denomina
validación cruzada dejando uno fuera (LOOCV,por sus siglas en inglés), donde las muestras se eliminan una por vez. La valida-
ción cruzada dejando uno fuera puede implicar cálculos computacionales intensos; sus resultados pueden verse afectados en
gran medida por valores aberrantes y son menos uniformes que los resultados de otras formas de validación cruzada. También
es posible dividir los datos de acuerdo con la información previa, tal como un subconjunto por partida dado el conjunto de
datos históricos disponibles para múltiples partidas. Otra opción para validación cruzada es el método de muestreo con reem-
plazamiento (bootstrapping), en el que en cada iteración se muestrea de forma aleatoria cierta proporción de datos para crear
un conjunto de calibración, mientras que los datos remanentes se usan como conjunto de análisis. El procedimiento se repite
muchas veces (por lo regular 100 o más ciclos) para obtener un estimado estable del error de predicción.
La medición de error es el factor de mérito de uso más común para caracterizar el desempeño del modelo durante la valida-
ción cruzada. El propósito previsto del método determina la naturaleza de los errores, tal como la tasa de clasificación errónea
(misclassification rate) para métodos cualitativos y el error de predicción para métodos cuantitativos. Independientemente de
las aplicaciones cualitativas o cuantitativas, comúnmente se usan dos medidas para caracterizar el error dentro de la validación
cruzada: la raíz cuadrada del error cuadrático medio de calibración (RMSEC,por sus siglas en inglés) y la raíz cuadrada del
error cuadrático medio de la validación cruzada (RMSECV,por sus siglas en inglés). La raíz cuadrada del error cuadrático medio
de calibración se calcula para las muestras cuando se dejan en la calibración, el cual se reduce monótonamente con cada fac-
tor adicional (es decir, componente principal) agregado al modelo. En comparación, la raíz cuadrada del error cuadrático me-
dio de la validación cruzada que se calcula durante la validación cruzada se reducirá hasta que se agregue el último factor sig-
nificativo (es decir, que contenga una señal relevante). Posteriormente, a medida que se incorpora cada factor adicional en el
modelo, la raíz cuadrada del error cuadrático medio de la validación cruzada aumentará, lo que indica que los datos de cali-
bración están siendo sobre ajustados. Se hace referencia a la gráfica de la raíz cuadrada del error cuadrático medio de calibra-
ción y/o la raíz cuadrada del error cuadrático medio de la validación cruzada versus el número de factores en el modelo como
gráfica de la suma de los cuadrados de los errores residuales de predicción. En general, la mejor práctica es evitar la inclusión
de factores más allá del mínimo de la línea de la gráfica de la raíz cuadrada del error cuadrático medio de la validación cruza-
da. Además, la correlación entre los valores predichos y observados (p. ej., R2) también se usa comúnmente para evaluar el
desempeño de los métodos cuantitativos. Finalmente, los resultados de la validación cruzada son significativos únicamente
cuando los conjuntos de calibración y análisis son comparables (es decir, se trazan a partir de la misma población). De otro
modo, la extrapolación puede llevar a predicciones incorrectas.
3.2 Validación del Método
El objetivo de la validación es demostrar que el desempeño de un método es adecuado para el propósito previsto. La valida-
ción de un modelo y la validación de un método son dos actividades distintas. La validación del modelo por lo regular implica
el uso de un conjunto de validación interna o validación cruzada para evaluar los parámetros apropiados de un modelo me-
diante el error e incertidumbre de la identificación o la cuantificación. Los parámetros a menudo incluyen el intervalo de las
variables, el tipo de procesamiento previo, la clasificación del modelo, y la elección del algoritmo, entre otros. Estas actividades
han sido tratadas en detalle en 3. 7 Desarrollodel Modelo: Calibración.En comparación, la validación del método debe basarse
en un conjunto de validación externa totalmente independiente y debe seguir los requisitos de validación descritos en Valida-
ción de ProcedimientosFarmacopeicos (1225), de acuerdo con la categoría del tipo de método. El criterio de aceptación debe
justificarse para el propósito previsto. Durante el ciclo de vida, es necesaria la revalidación del método después de la transfe-
rencia o actualización del modelo. La estrategia de validación y revalidación del método debe estar basada en riesgos y en
conceptos científicos y debe ser apropiada para su nivel de impacto.
Las características típicas de desempeño para validación de métodos son especificidad, exactitud, precisión, linealidad, inter-
valo y robustez para modelos cuantitativos, y especificidad y robustez para modelos cualitativos. Los parámetros y sus descrip-
ciones se tratan a continuación. Además de los parámetros típicos de desempeño, los parámetros tales como límite de detec-
ción (LOD, por sus siglas en inglés), límite de cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés), sensibilidad, sensibilidad analítica y
Lt
USP42 Información General/ (1039) Quimiometría 7439
resolución efectiva podrían no requerirse para propósitos de validación, aunque podrían ser útiles para entender el límite del
desempeño del método para una aplicación analítica específica y la técnica analítica con la que se asocia un modelo.
CARACTERÍSTICAS
DE DESEMPEÑOPARAVALIDACIÓNDELMÉTODO
Las secciones siguientes proveen descripciones y parámetros de los atributos de la validación del método.
Exactitud: Se recomienda la comparación estadística entre valores predictivos y valores de referencia. Para aplicaciones cuan-
titativas, la raíz cuadrada del error cuadrático medio de predicción (RMSEP,por sus siglas en inglés), el error cuadrático de
predicción (SEP,por sus siglas en inglés) y el sesgo son las medidas típicas de exactitud del método. Para aplicaciones cualitati-
vas, tal como la clasificación, en ocasiones la tasa de clasificación errónea o la tasa de predicción correcta pueden usarse para
caracterizar la exactitud del método. Para asegurar que un modelo es lo suficientemente exacto al analizarlo con un conjunto
de prueba independiente, la raíz cuadrada del error cuadrático medio de predicción es a menudo comparable con la raíz cua-
drada del error cuadrático medio de calibración y la raíz cuadrada del error cuadrático medio de la validación cruzada, y se
cumple con los requisitos para el perfil analítico esperado.
Precisión: Las medidas de rutina de la raíz cuadrada del error cuadrático medio de predicción y error cuadrático de predic-
ción abarcan tanto exactitud como precisión. La evaluación de la precisión puede implicar una deterrninación de la incerti-
dumbre asociada con el resultado a informar y un análisis de varianza de los componentes que deterrnina un "presupuesto de
error" que a su vez cuantifica las fuentes de variación que contribuyen a la incertidumbre. Para estimar solamente la precisión,
se puede usar la desviación estándar a través de los varios resultados para deterrninaciones repetidas y análisis independientes
sobre la misma muestra dentro del método, a través de varios días, varios analistas, varios instrumentos y varios laboratorios.
Especificidad: Para métodos cualitativos y cuantitativos, siempre que sea posible se debe demostrar y validar el significado
químico o físico subyacente del modelo quimiométrico. Por ejemplo, se debe demostrar el significado científico de las variables
(tal como intervalo espectral) usado para la construcción del modelo, el procesamiento previo de los datos, los vectores de
regresión y los vectores de carga [para regresión de mínimos cuadrados parciales, regresión de componentes principales, análi-
sis discriminante de regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA,por sus siglas en inglés) y análisis de componentes
principales]. La especificidad también podría validarse por la tendencia de componentes de la muestra (matriz y otros com-
puestos diferentes a los analitos presentes en la muestra) a afectar de manera adversa la capacidad del método quimiométrico
para informar resultados con exactitud o precisión. El nivel de especificidad puede evaluarse por medio de la precisión y exacti-
tud en presencia de cantidades variables de sustancias potencialmente interferentes. Las sustancias a analizar pueden identifi-
-
carse considerando la metodología física/química subyacente y el enfoque de generación de modelo.
La especificidad puede evaluarse incluyendo muestras adulteradas, subestándar o no auténticas. Las muestras auténticas,
que están tanto dentro como por fuera de los criterios esperados, pueden no estar disponibles por razones prácticas o econó-
micas. Por ejemplo, puede no ser posible, debido a los costos, obtener muestras que no cumplan con el criterio esperado para
un proceso controlado a gran escala. Siempre que sea posible, se debe considerar un panel de exclusión con muestras que no
cumplan con el criterio esperado para incrementar la confianza de la especificidad de la medición. Se pueden usar muestras
fuera del criterio esperado simuladas (tales como muestras de experimentos a pequeña escala) para validar la aptitud del pro-
cedimiento para el propósito e intervalo previsto. En todos los casos, la idoneidad de las muestras de validación debe justificar-
se con criterios de inclusión y exclusión apropiados.
Para métodos cualitativos, el método debe demostrar capacidad para identificar o clasificar las muestras de forma correcta.
La curva de la característica operativa del receptor (ROC, por sus siglas en inglés) o la probabilidad de identificación (POI, por
sus siglas en inglés) son parámetros de uso común (se puede encontrar información detallada sobre curvas de la característica
operativa del receptor en 4.1 Cualitativas y en la Figura 6). El enfoque de la característica operativa del receptor pretende ilus-
trar la tasa de verdaderos positivos (TPR, por sus siglas en inglés) y la tasa de falsos positivos (FPR,por sus siglas en inglés) a lo
largo de un intervalo de umbrales de decisión. Un buen método de identificación debe generar una curva de característica
operativa del receptor con el área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) cercana a 1 . Para la mayoría de los métodos de
identificación bien diseñados, la probabilidad de una identificación positiva es casi cero cuando el analito no está presente, y la
probabilidad debe acercarse a 1 a medida que crece la cantidad o la concentración del analito.
Linealidad: El algoritmo usado para la construcción del método quimiométrico puede ser lineal o no lineal, siempre que sea
apropiado para el modelado de la relación entre la señal analítica y el analito. Las medidas comúnmente usadas para evaluar el
ajuste del modelo o sus propiedades predictivas son el coeficiente de correlación, la pendiente, la ordenada al origen y, y la
suma de cuadrados residuales de la gráfica entre los resultados predictivos versus los observados. Tener en cuenta que se espe-
ra que la gráfica de resultados residuales versus los resultados observados en todo el intervalo analítico no presente patrón al-
guno.
Intervalo: El intervalo de un método debe ser apropiado para el uso previsto (p. ej., especificación).
Robustez: Los factores típicos a considerar incluyen la variabilidad normal de materiales (p. ej., variabilidad entre lotes), va-
riabilidad del entorno operativo, variabilidad del instrumento, tal como el mantenimiento menor de instrumentos, y la variabi-
lidad de los parámetros del método, tal como el número de espectros promediados en un espectrómetro. En conjunto con los
resultados de validación, la estrategia de desarrollo del método-tal como el diseño del conjunto o biblioteca de calibración y
la elección de los parámetros del modelo-se puede tener en cuenta para demostrar la robustez del método.
7440 (1039) Quimiometría / InformaciónGeneral USP42
MUESTRASDE VALIDACIÓN
Otros aspectos generales que se deben considerar para la validación del método quimiométrico incluyen las muestras de
validación. Las muestras de validación deben ser independientes de las muestras de calibración a fin de demostrar la capacidad
predictiva del modelo. Ser independientes significa que las muestras de validación no fueron usadas en el conjunto de calibra-
ción o para la optimización del modelo. Por lo general, se usa validación interna o validación cruzada durante la calibración del
modelo para la optimización de parámetros, pero no se considera suficiente para la validación final del método. Las muestras
de validación deben seleccionarse basándose en el perfil analítico esperado y en las características de desempeño deseadas del
modelo. La robustez del método se basa en la evaluación de muestras auténticas con fuentes típicas de varianza. Para produc-
tos farmacéuticos o suplementos dietéticos, pueden incluirse muestras de validación de escala de producción nominal, tales
como las producidas de forma rutinaria para las pruebas de estabilidad, de liberación o de proceso. Para artículos botánicos,
pueden incluirse la identidad taxonómica, el origen geográfico, la temporada de recolección, entre otras variantes. Para mate-
riales obtenidos de fuentes naturales, tales como muchos ingredientes y excipientes alimenticios, las variables, tales como el
origen geográfico o microbiológico del material, las condiciones de procesamiento, la composición de impurezas y otros atri-
butos pertinentes, pueden incluirse en el conjunto de muestras de validación.
CRITERIOSDE ACEPTACIÓNY DE DIAGNÓSTICO
Al igual que con cualquier otro procedimiento analítico, los criterios de aceptación para un método quimiométrico deben
ser definidos antes de la ejecución del protocolo de validación. Si el modelo quimiométrico fue desarrollado usando datos deri-
vados de una técnica secundaria [p. ej., infrarrojo cercano (NIR, por sus siglas en inglés) o Raman] con valores de referencia
derivados de un procedimiento analítico primario [p. ej., gravimétrico, espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR,
por sus siglas en inglés) o cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés)], el perfil analítico espe-
rado para la validación no puede exceder de aquél obtenible mediante el método primario. Pueden ocurrir algunas excepcio-
nes, por ejemplo, puede ser posible lograr una precisión superior usando un procedimiento secundario, aunque la exactitud se
vería limitada a la de la técnica de referencia.
Además de aquellos atributos tratados en Características de Desempeñopara Validacióndel Método, la validación del método
también debe tener en cuenta la configuración de límites de diagnóstico para un modelo multivariante antes de la implemen-
tación para uso rutinario. Las muestras que están fuera del espacio del modelo se consideran valores aberrantes y no son ade-
cuados para obtener una predicción del modelo que sea posible informar. El diagnóstico del modelo debe tener una capacidad
demostrada de señalar a cualquiera de las muestras que esté fuera del espacio del modelo. Para configurar los límites de diag-
nóstico, se deben considerar dos casos. El primero es determinar la distribución estadística del apalancamiento (leverage) y de
los residuales dentro del conjunto de datos para la calibración. El segundo es preparar muestras de validación que estén dentro
y fuera del espacio del modelo para evaluar el límite. Por ejemplo, para un método de uniformidad de contenido basado en
espectroscopía del infrarrojo cercano, las muestras que estén dentro del espacio del modelo y las que estén fuera del espacio
del modelo podrían ser muestras que contengan concentraciones de ingrediente farmacéutico activo (API, por sus siglas en
inglés) que estén a nivel de la cantidad declarada pretendida y muestras fuera del intervalo previsto del método respectiva-
mente.
3.3 Monitoreo del Modelo
Durante todo el ciclo de vida del modelo, pueden ocurrir cambios que pueden afectar el desempeño del modelo. Se debe
contar con procedimientos para la verificación continua del desempeño del modelo y su actualización, y la revalidación del
procedimiento en caso necesario. No existe un orden específico entre el monitoreo del modelo, la actualización del modelo y
la transferencia del modelo. Se deben aplicar fundamentos científicos sólidos para determinar una secuencia apropiada para la
aplicación prevista.
Se debe desarrollar una estrategia de control para verificar el desempeño del modelo durante su ciclo de vida y documentar-
la como parte del desarrollo del modelo y de la validación del procedimiento. La estrategia debe identificar los elementos ne-
cesarios para el monitoreo y la evaluación continua del desempeño del modelo. Además, se debe contar con un plan para
monitorear, analizar y ajustar el modelo, con una frecuencia de medición que permita la identificación de desviaciones relacio-
nadas con aspectos críticos del modelo. El nivel de mantenimiento debe considerarse parte de las actividades de evaluación de
riesgos y debe ser adecuado para la criticidad del modelo. Cuando aplique, se debe calificar el instrumental analítico usado
para generar los datos para el modelo, además de someterlo a un plan de verificación continuo (para obtener guías pertinen-
tes, ver los capítulos generales relacionados con el instrumental analítico aplicable).
La garantía continua del desempeño del modelo durante todo su ciclo de vida debe incluir lo siguiente:
• Monitoreo y revisión continuos del modelo
• Análisis de la Evaluación de riesgos
• Evaluación de los cambios posteriores a la implementación y mantenimiento predefinido del modelo
• Actualización del modelo y revalidación del procedimiento, según se requiera
La revisión continua de un modelo debe suceder en intervalos predefinidos y también debe ser iniciada por eventos que
pudieran tener un impacto sobre el desempeño del modelo. Ejemplos de dichos eventos incluyen cambios en el fabricante o la
USP42 InformaciónGeneral/ (1O39) Quimiometría 7441
variabilidad de materias primas; cambios en los procesos previos que pudieran alterar la matriz de la muestras (p. ej., configu-
ración de equipo u operación del proceso); derivas en la predicción del modelo; y resultados fuera de la especificación (OOS,
por sus siglas en inglés) o fuera de tendencia (OOT, por sus siglas en inglés) dados por el modelo (depende de la causa de
origen de los resultados que están fuera de la especificación o fuera de la tendencia). Además de los detonantes que se basan
en el resultado de la predicción del modelo, se deben incluir los detonantes basados en parámetros de diagnóstico del modelo
y en las reglas de acción correspondientes. Los modelos multivariantes pueden verse afectados de forma más significativa por
los datos aberrantes característicos que los modelos univariantes. Se requiere especial cuidado para lo siguiente: 1) justificar
estadísticamente el diagnóstico de modelos multivariantes; 2) verificar con datos derivados del desarrollo del modelo y del pro-
ceso de validación del procedimiento; y 3) implementar diagnósticos multivariantes para el monitoreo como parte de la estra-
tegia de control. La comparación de las predicciones del modelo y de los procedimientos de referencia u ortogonales debe
llevarse a cabo de forma periódica o como parte de la investigación iniciada por el proceso de revisión.
El uso de diagnósticos del modelo, al aplicarlo a una muestra nueva, asegura que la predicción del modelo sea válida con
respecto a los conjuntos de calibración y validación usados durante el desarrollo del modelo y la validación del procedimiento,
además de que asegura que el resultado no constituya un valor aberrante. La observación de un valor aberrante significa que
el resultado es inválido, pero no es una indicación confiable de un resultado fuera de la especificación; un resultado fuera de la
especificación es una observación producida por un modelo cuando la predicción cae fuera de los criterios de aceptación y los
diagnósticos del modelo están dentro de los umbrales. En el caso de modelos cualitativos, los resultados que están por fuera
del cumplimiento deben tratarse como valores aberrantes y generar una investigación; el resultado de dicha investigación indi-
cará si el resultado está fuera de la especificación.
El proceso de revisión para un modelo debe generar una decisión con respecto a la necesidad de una extensión del manteni-
miento del modelo; dicha decisión puede ser el resultado de una evaluación de riesgos o el resultado de un flujo de trabajo
para decisiones ya predefinido. La criticidad y el uso del modelo definirán la extensión del mantenimiento del modelo, lo cual
puede incluir la acción de restringir las condiciones del modelo; ajustar el conjunto de calibración (se pueden agregar, reem-
plazar o retirar muestras); o incluso reconstruir completamente el modelo. La decisión y la justificación correspondientes deben
basarse en fundamentos científicos sólidos y documentarse.
3.4 Actualización del Modelo y Transferencia del Método

La actualización del modelo debe considerarse parte de la verificación del procedimiento analítico y tanto la justificación co-
mo las actividades deben documentarse como parte del ciclo de vida del procedimiento analítico. Antes de realizar una actuali-
zación del modelo, es crítico entender el factor causal subyacente que ha dado pie a la actualización. Las razones para la actua-
lización del modelo pueden dividirse en dos categorías generales.
La primera categoría es cuando el conjunto de calibración simplemente requiere una expansión. En este caso, nada ha cam-
biado realmente en términos de la respuesta del instrumento a analitos específicos. En su lugar, el modelo original ya no es
válido debido a la expansión del intervalo de la calibración original, a la adición de nuevos analitos o a la ocurrencia de otras
variaciones imprevistas (p. ej., cambios en la distribución del tamaño de partícula o la derivación de un proceso químico a un
nuevo estado estacionario). Por ende, el rango de calibración debe expandirse con muestras que presentan dicha variación.
La segunda categoría es cuando las muestras son las mismas, pero la función de respuesta del sistema de medición ha cam-
biado. Esto a menudo se debe a cambios en los componentes de medición (nueva fuente de luz, opacidad en los elementos
ópticos, cambio de registro de longitud de onda) o puede deberse a la transferencia del método entre instrumentos diferentes.
Esto, en esencia, es un problema de estandarización del instrumento. Los cambios en instrumentos o procedimientos de medi-
ción con el paso del tiempo pueden resultar en un modelo de calibración inutilizable, en cuyo caso sería necesaria una actuali-
zación del modelo o se debe desarrollar un modelo nuevo.
En la práctica, existen múltiples técnicas de actualización del modelo que podrían aplicarse a cada categoría de actualización
del modelo. Algunas técnicas de actualización son relativamente sencillas y simples de implementar, mientras que otras son
técnicamente complejas. La selección de un enfoque apropiado de actualización del modelo debe basarse en un entendimien-
to cabal del factor causal subyacente. Como regla general, se deben considerar primero los métodos simples de actualización
(p. ej., ajuste de pendiente y sesgo, según se describe a continuación).
Antes de iniciar cualquier trabajo de mantenimiento del modelo, una buena práctica es confirmar que la construcción básica
del modelo original-tal como el procesamiento previo de datos y la selección de variables-sigue siendo apropiada. Para las
actualizaciones de modelos basados en aplicaciones tanto cualitativas como cuantitativas, se recomienda un enfoque de proce-
samiento previo sencillo y un enfoque de selección de variables con fundamentos científicos en el modelo original para tratar
los desafíos relacionados con la actualización del modelo. Estos enfoques son igualmente aplicables a las diferencias ocasiona-
das por instrumentos, condiciones de medición o matrices de la muestra.
AJUSTEDE PENDIENTEY SESGO
Uno de los métodos de actualización de modelo más simples es el procesamiento posterior de las predicciones con un ajuste
de sesgo, un ajuste de pendiente, o ambos. Este enfoque se a menudo usa para aplicaciones cuantitativas. Para algunas aplica-
ciones cualitativas, este enfoque también puede ser útil, dependiendo de la naturaleza del método. Se espera que los ajustes
de sesgo/pendiente funcionen en un conjunto limitado de circunstancias. Por ejemplo, si la matriz de las muestras que se están
7442 (1039) Quimiometría / Información General USP 42
prediciendo fuese sistemáticamente distinta del conjunto de muestras de calibración/validación, las predicciones del modelo
serían erróneas por un valor constante. Sin embargo, los ajustes de sesgo/pendiente no corregirían variaciones nuevas en los
datos, tales como variaciones derivadas de una matriz diferente (p. ej., nuevos analitos/sustancias interferentes). Por lo tanto,
no se recomienda aplicar ajustes de pendiente/sesgo si no se cuenta con un entendimiento cabal del factor causal subyacente.
Se puede obtener una orientación mediante la inspección de los residuales correspondientes a los nuevos datos obtenidos me-
diante el uso del modelo existente o, como alternativa, realizar un análisis exploratorio suplementario con técnicas tales como
el análisis de componentes principales (ver 4. Aplicacionesde la Quimiometría).
EXPANSIÓNDE LACALIBRACIÓN
Al expandir el conjunto de calibración original, se debe considerar el número de muestras nuevas que se van a agregar, el
impacto (utilidad) de las muestras agregadas sobre la composición general del nuevo conjunto de calibración, y como distri-
buir las nuevas muestras entre los conjuntos de calibración y validación. Puede ser apropiado simplemente aumentar los con-
juntos de calibración y de validación originales con todas las muestras nuevas, o puede ser recomendable usar un subconjunto
de las muestras nuevas y las originales. Múltiples enfoques, tales como el enfoque de algoritmo Kennard-Stone y de vecino
más cercano, están disponibles para ayudar en la selección de muestras nuevas para agregarlas a un conjunto de calibración
existente, aunque en general todos los enfoques usan métodos para identificar muestras nuevas basándose en una alta utilidad
(es decir, influencia sobre el modelo). Las gráficas de puntuaciones multivariantes P. de Hotelling, y sus límites correspondien-
tes también son enfoques eficaces para lograr dicho objetivo.
TRANSFERENCIA
DE CALIBRACIÓN
Los métodos de estandarización del instrumento y de transferencia de calibración se usan para transformar la función de
respuesta de un sistema de medición de manera tal que corresponda con el de un sistema de medición de referencia. El siste-
ma de medición de referencia puede constar de un analizador completamente distinto, o puede ser el mismo analizador antes
de que experimente un cambio en la respuesta de la función. La gran mayoría de estos métodos por lo general requieren el
uso de muestras de transferencia estables que se miden en el instrumento original y requieren la estandarización del instru-
mento al mismo tiempo. Además, los enfoques comúnmente usados para la estandarización del instrumento también podrían
aplicarse para tratar de forma efectiva los desafíos que resultan de cambios en la matriz de muestras y las condiciones de medi-
ción.
3.5 Revalidación
Antes de la re implementación de un modelo multivariante, se debe establecer un procedimiento apropiado de revalidación

usando criterios equivalentes a los usados en el protocolo de validación original. Esta revalidación es necesaria para documen-
tar la validez del modelo como parte de la verificación del procedimiento analítico. La naturaleza y el grado del procedimiento
de revalidación, incluyendo aspectos, tales como la justificación científica y los enfoques experimentales, deben basarse en la
causa de la actualización y la naturaleza de la acción correctiva requerida para establecer el desempeño adecuado. La revalida-
ción debe documentarse como parte del ciclo de vida del procedimiento analítico.
4. APLICACIONES
DELAQUIMIOMETRÍA
Según se trata en 2. Conceptosde Quimiometría,los análisis quimiométricos pueden realizarse de manera supervisada o no
supervisada, dependiendo de la disponibilidad de los datos y de las particularidades de una aplicación dada. Esta sección pro-
vee una explicación de estos distintos escenarios de análisis, así como de las herramientas quimiométricas (es decir, algoritmos)
que se usan comúnmente. Adicionalmente, se describirán en detalle varias aplicaciones específicas.
4.1 Cualitativas
ASPECTOSGENERALES
Los análisis quimiométricos cualitativos pueden realizarse mediante enfoques supervisados o no supervisados. No obstante,
para poder incorporarlos en los procedimientos analíticos que son alternativas a los métodos farmacopeicos, se debe verificar
el desempeño de cualquier modelo quimiométrico, según se describe en 3. Ciclode Vidadel Modelo.Esto podría no ser posible
si se conoce muy poco sobre las muestras que se están analizando. Sin embargo, los análisis no supervisados desempeñan un
papel de apoyo importante durante el desarrollo de alternativas quimiométricas para los procedimientos farrnacopeicos dentro
del marco del ciclo de vida, y se recomienda su uso antes del desarrollo de los enfoques supervisados subsiguientes (se pro-
veen ejemplos en Ejemplosde AplicaciónCualitativa).
Los procedimientos farmacopeicos cualitativos son aquellos que buscan proveer el valor de algún descriptor categórico para
una muestra desconocida. Ejemplos de propiedades categóricas incluyen los siguientes (entre otros):
USP 42 Información General/ (1039) Quimiometría 7443
• Identidad química: celulosa microcristalina versus ingrediente activo farmacéutico

• Morfología: polimorfo A versus B; monoclínico versus triclínico
• Autenticidad de la muestra: auténtico versus no auténtico o adulterado
• Origen de la muestra: fábrica A versus B; lote ABC-001 versus lote XYZ-002
Se puede crear un modelo efectivo de las propiedades categóricas usando algoritmos quimiométricos supervisados que
aprovechen ya sea la proximidad o la distancia en espacios multivariantes, lo que resulta en una asignación cualitativa de
muestras a una o más clases, dependiendo de la aplicación ytécnica usada. De acuerdo con el capítulo (1225), los procedi-
mientos basados en modelos de este tipo son adecuados para su incorporación en los métodos de Categoría IV para identifica-
ción, y deben validarse para demostrar la especificidad adecuada para el uso previsto. La "identificación" es un término que,
por lo general se usa para describir un rango de escenarios de análisis; se describen algunos comunes en HerramientasCualita-
tivas.
Las técnicas supervisadas usadas para propósitos de clasificación, además de la información analítica del sensor, emplean in-
formación discreta relacionada con las muestras en el conjunto de datos (p. ej., etiquetas de clase). Se pretende definir los
límites de los agrupamientos (o clases), proveyendo criterios estadísticos, además de las técnicas de visualización (p. ej., gráfica
de puntuaciones de componentes principales a partir de un análisis de componentes principales). Posteriormente, los límites
pueden usarse como criterios de aceptación para la inclusión o exclusión de nuevas muestras en una clase dada. Se encuentran
disponibles diversas herramientas útiles para el analista para la construcción del modelo, tales como el análisis discriminante
lineal (LDA,por sus siglas en inglés), el análisis discriminante cuadrático (QDA, por sus siglas en inglés), el modelado indepen-
diente suave de analogía de clase (SIMCA,por sus siglas en inglés), el método de K-vecinos más cercanos, y el análisis discrimi-
nante de regresión de mínimos cuadrados parciales. También se pueden usar técnicas más complejas siempre que se justifi-
quen. Cada tipo de modelo tiene sus fortalezas y debilidades propias. Si un algoritmo particular no provee el nivel deseado de
desempeño, se puede seleccionar un algoritmo distinto. Estos aspectos se tratan con mayor detalle en HerramientasCualitati-
vas.
Para el desarrollo, la optimización y la validación del modelo, las técnicas de clasificación y discriminación siguen los mismos
procesos descritos en 3. Ciclode Vida del Modelo. Estas técnicas desarrollan un umbral o límites para realizar las asignaciones de
clases. La forma más simple de clasificación es un sistema de dos clases (p. ej., bueno/malo o A/B). Cuando el modelo clasifica
una muestra nueva como buena o mala (A o B), se denomina técnica de discriminación. La clasificación es la técnica para asig-
nar una muestra nueva como A, B, ya sea A o B o ni A ni B. La tasa de error del modelo es el número total de clasificaciones
incorrectas divididas por el número total de muestras. Dependiendo de los requisitos de la aplicación y de los niveles de riesgo
asociados, las tasas de error pueden ser específicas para una clase o combinadas entre clases. Los detalles específicos de la apli-
cación determinarán si la asignación de una muestra a más de una clase sería un resultado aceptable. Para casos en los que
esto deba evitarse, se deben establecer apropiadamente los umbrales de clasificación durante el desarrollo del modelo para
garantizar resultados de una sola clase.
HERRAMIENTAS
CUALITATIVAS
Análisis de componentes principales: El análisis de componentes principales es una herramienta de análisis exploratorio de
uso común brevemente descrita en 2. Conceptosde Quimiometría.El análisis de componentes principales es una técnica de re-
ducción de variables y actúa sobre los datos definiendo nuevas variables, los denominados componentes principales (ver la
Figura2). Los componentes principales son ortogonales y se definen en la dirección de la varianza más grande (remanente) de
los datos. Los resultados del análisis de componentes principales se tratan en términos de puntuaciones y cargas de compo-
nentes principales, los cuales pueden graficarse de forma bidimensional (y en ocasiones tridimensional) para visualizar agrupa-
mientos de muestras o exclusiones (gráficas de puntuaciones, ver la Figura4), mientras que las gráficas de cargas proveen in-
formación sobre las variables originales. Las puntuaciones son las proyecciones de las muestras sobre los componentes princi-
pales, mientras que las cargas proveen los pesos (coeficientes) por los que se multiplican los valores de las variables originales
para generar la puntuación del componente para una muestra particular. Las cargas presentan una gran cantidad de informa-
ción con respecto a las variables en la matriz que son prominentes y que se pueden usar para "entender'' la información captu-
rada por las variables latentes que proveen los fundamentos para la distribución de la muestra observada en la gráfica de pun-
tuaciones (Figura4). Los componentes principales también pueden usarse como base para los modelos cuantitativos por regre-
sión de componentes principales (ver 4.2 Cuantitativas).
N
~
e:
QJ
QJ
e: i--·+--""--+--+·+···-!---,•-··➔--1--+-·-+-·+·--i----i
o
·~ i---+-+···+-+----i--++---i->-+--·+-+--t·-·-1
::,
1: f-····+····+··+···--,-.__,..-f.-""".-+--···'-+-·+--'--·-+· -1
::,
Cl.
Puntuaciones en PCl
Figura 4. Gráfica de puntuaciones del análisis de componentes principales: proyección de PC1 versus PC2.
Algoritmos de Agrupamiento: El objetivo de los análisis de agrupamiento (clustering) es la repartición de datos en diferen-
tes grupos. Algunos métodos, tales como el análisis de agrupamiento jerárquico (HCA, por sus siglas en inglés), resulta en es-
tructuras con forma de árbol denominadas dendrogramas (Figura5) que proveen información sobre grupos de muestras u ob-
jetos excluyentes que se presentan en el conjunto de datos. Los dendrogramas pueden construirse de muchas formas distintas
y, por ende, pueden presentar distintos aspectos del conjunto de datos. Una primera posibilidad, que se denomina métodos
divisivos o descendentes (top-down), inicia a partir de un conjunto de datos completo, el cual se divide en pasos consecutivos
hasta que cada objeto es un agrupamiento individual o todos los elementos de un agrupamiento cumplen con un criterio de
similitud dado. En el segundo escenario, que se denomina métodos aglomerativos o ascendentes (bottom-up), se realiza lo
opuesto. Comenzando a partir de objetos/agrupamientos individuales, aquellos que son más similares se fusionan hasta que
todo conforma un agrupamiento. De las dos opciones, los enfoques ascendentes tienden a ser menos intensos desde la pers-
pectiva computacional, son parte de la mayoría de los paquetes de computación, y se usan con mayor frecuencia.
Los parámetros usados para expresar la (falta de) similitud entre objetos o agrupamientos (ver el eje y en la Figura5) pueden
ser mediciones basadas en la correlación (p. ej., coeficiente de correlación, r para similitud o 1-1~ para falta de similitud), me-
diciones basadas en la distancia (p. ej., distancia euclidiana), o una combinación de ambas (p. ej., distancia de Mahalanobis).
Los dos agrupamientos se vinculan en el dendrograma a la altura relacionada con esta medición de (falta de) similitud. El pará-
metro aplicado se expresa de tal manera que los agrupamientos/objetos vinculados en la parte baja (es decir, cercanos al eje x)
son similares, mientras que aquellos vinculados en la parte alta son distintos. Existen muchos métodos o criterios distintos que
se usan para decidir qué objetos/agrupamientos se fusionan consecutivamente [p. ej., vinculación (o enlace) simple, vincula-
ción completa, vinculación promedio (ponderada), y vinculación centroide]. Dependiendo del criterio aplicado, los dendrogra-
mas pueden lucir muy diferentes. Trazar líneas horizontales de forma arbitraria (ver la Figura5) divide el conjunto de datos en
diferentes grupos, lo cual ocasionalmente puede vincularse con las propiedades de la muestra. Las muestras aberrantes están
vinculadas muy arriba en los dendrogramas, más a menudo como agrupamientos de un solo objeto. La estabilidad de los re-
sultados del agrupamiento puede verse afectada por muchos factores, tales como el ruido en los datos, el tamaño de la mues-
tra, la elección del algoritmo, la medición de distancia, entre otros. Los métodos divisivos tienden a producir resultados más
estables que los métodos aglomerativos, aunque casi nunca se usan.
I
~ 1
-e
~ 0,81---------+---+--------+--1-----1-----
'"'
,e
~0,6·
~
10,4
u
-e
~ 0,2
i
u,~~~~~~~~~~~~~~~~~-
Figura 5. Dendrograma basado en agrupamiento jerárquico para 27 objetos. Abscisa: números de objetos.
Modelado paramétrico: La autentificación de un material o producto formulado con propósitos de garantía de calidad pue-
de lograrse mediante el modelado paramétrico multivariante del perfil químico (p. ej., espectro o cromatograma). Estos méto-
dos, en ocasiones, se denominan como "clasificadores de una clase". Básicamente, se desarrolla un modelo paramétrico de
forma estadística o empírica con un límite de confianza alrededor de los datos derivados de muestras auténticas conocidas. Los
modelos paramétricos describen el comportamiento o la estructura de la mayoría de los datos a partir de una clase individual,
asumiendo que existe una distribución (por lo general, una normal multivariante) en dichos datos. Las predicciones contra un
modelo paramétrico identifican puntos de desviación fuera de los límites significativos de dicha distribución. Mientras que los
enfoques de clasificación o discriminación proveen identificación (según se describió anteriormente) de la muestra desconoci-
da, los modelos paramétricos designarán la muestra desconocida ya sea como perteneciente a la clase auténtica o como un
valor aberrante, o presentando características distintas a las definidas por la distribución. Algunas técnicas de discriminación
también optimizarán la separación de clases y pueden tener una selectividad mayor, pero tendrán una tendencia a fallar cuan-
do se enfrenten con un objeto que no pertenezca a alguna de las clases. Por el contrario, los métodos del modelado paramétri-
co rechazarán cualquier muestra que no caiga dentro del límite de confianza establecido para el modelo. Quizás el algoritmo
de modelado paramétrico de uso más común es SIMCA,el cual usa el análisis de componentes principales para modelar los
datos y T2de Hotelling y residuales Q (DmodX) para definir los límites. En algunas instancias, los enfoques de modelado para-
métrico resultarán en "clasificaciones suaves" en las que una muestra puede ser asignada a más de una clase. Para satisfacer los
requisitos de uso farmacopeico, se debe definir previamente la acción apropiada para casos de asignación de clases ambiguas,
o se deben establecer y justificar las tasas de error a y /J error de acuerdo con el riesgo.
EJEMPLOSDE APLICACIÓNCUALITATIVA
Análisis exploratorio: Se usan algoritmos no supervisados de forma rutinaria para los análisis de datos exploratorios iniciales,
los cuales preceden los ejercicios formales de calibración y validación. La exploración no supervisada de datos puede indicar
rápidamente, ante la ausencia de cualquier conocimiento previo, si existen clases distintas o valores aberrantes dentro de la
combinación de datos disponibles. Por ejemplo, en la Figura4 se muestra un ejemplo gráfico en el que un análisis de compo-
nentes principales aplicado a datos espectroscópicos fue usado para diferenciar entre muestras de distintos proveedores. Los
modelos exploratorios generan variables latentes que pueden ser inspeccionados para identificar las variables originales con las
cantidades más grandes de señales de analitos relevantes para transportar a modelos subsiguientes o para guiar y/o verificar
los resultados de los enfoques de selección de variables. Esto puede ocurrir durante la fase de análisis de un estudio de diseño
de experimentos para evaluar qué factores se van a incluir en los diseños y/o en las calibraciones subsiguientes. Además, los
análisis exploratorios pueden usarse para probar y optimizar empíricamente diversas opciones de pre procesamiento de señales
para maximizar la contribución relativa de la señal deseada del analito en función de señales de fuentes de interferencia (p. ej.,
efectos de dispersión, diferencias en la longitud de paso óptico, propiedades físicas de la muestra, y deriva del instrumento).
Pruebas de identidad de materiales: El análisis de identificación se realiza de manera rutinaria para todos los ingredientes
activos farmacéuticos, excipientes, medicamentos y materiales de envasado para autentificarlos y verificar el uso de los mate-
riales correctos en la fabricación, en el análisis de liberación, y en las operaciones de envasado. El capítulo Pruebasde Identifica-
ción Espectrofotométrica (197) ilustra una de las técnicas analíticas de uso más amplia para la identificación, la espectroscopía IR
por transformada de Fourier. Por lo general, el análisis de identificación implica comparar el espectro de la muestra con el es-
pectro de una muestra de referencia y evaluar el nivel de concordancia entre ambos. Se pueden aplicar diversos algoritmos
quimiométricos para la identificación, y el desarrollo y el mantenimiento generales del modelo deben seguir las pautas provis-
tas en 3. Ciclode Vida del Modelo. Todos los métodos para el análisis de identidad son métodos de clasificación supervisados
debido a que estos algoritmos utilizan ya sea un espectro de referencia individual o un conjunto de espectros de referencia a
partir de materiales con identidad conocida. Los algoritmos pueden aplicarse en un espacio de variables originales o en un
espacio de variables transformadas (tal como un espacio de variables latentes) después del procesamiento previo de los datos.
De acuerdo con el capítulo (1225), los modelos de este tipo son adecuados para la incorporación en los métodos de Catego-
ría IVpara la identificación y deben, como mínimo, validarse para demostrar su especificidad adecuada para el uso previsto.
Un ejemplo de enfoque para la verificación del desempeño es la documentación de la tasa de verdaderos positivos y la tasa de
falsos positivos. La tasa de verdaderos positivos es el porcentaje de muestras que se identifican de forma correcta, mientras que
la tasa de falsos positivos es el porcentaje de muestras que se identifican de manera incorrecta. La tasa de verdaderos positivos
también es referida como sensibilidad, y la tasa de falsos positivos o FPR,por sus siglas en inglés, es referida como especifici-
dad. Independientemente del enfoque usado, siempre hay una compensación entre la tasa de verdaderos positivos y la tasa de
falsos positivos, y dicho comportamiento de compensación y desempeño general del procedimiento se visualizan de mejor
manera en una gráfica de curva de la característica operativa del receptor (ver la Figura 6).
Una curva clásica de la característica operativa del receptor se genera graficando la tasa de verdaderos positivos sobre la or-
denada y la tasa de falsos positivos sobre la abscisa. Cada punto de la curva de la característica operativa del receptor represen-
ta un par de la tasa de verdaderos positivos y de la tasa de falsos positivos obtenido a un umbral específico. El umbral es por lo
general un número generado por el algoritmo, y cuando se excede, este corresponde a una identificación positiva. El valor del
umbral se determina durante el proceso de desarrollo del procedimiento. El umbral puede ser el valor P del contraste de hipó-
tesis (o prueba de significación), el umbral del índice de calidad de impacto (hit quality indexo HQI), el umbral de la distancia
de Mahalanobis, el umbral de puntuación discriminante de regresión de mínimos cuadrados parciales, u otro umbral.
IDEAL
'\ Curva de caracteristlc.a operativa del receptor
1,0 *
--1
..
"O
!l
0,5 1,0
tasa de falsos positivos
AUC: área bajo la curva (O-1)
Figura 6. Gráfica de una curva de la característica operativa del receptor que muestra el área bajo la curva (3).
Durante el desarrollo del procedimiento, se examina un número conocido de muestras positivas y negativas, y se registra el
resultado del algoritmo para cada muestra. El desempeño del método cuando opera en un umbral particular t se caracteriza
mediante un par único de tasa de verdaderos positivos/tasa de falsos positivos, y se puede producir la curva completa de ca-
racterísticas operativas graficando los pares de tasa de verdaderos positivos/tasa de falsos positivos en un intervalo de umbrales
de decisión. Una identificación falsa positiva corresponde a un umbral de decisión que es demasiado bajo. Los falsos positivos
pueden minimizarse elevando el umbral de decisión. Sin embargo, los umbrales de decisión excesivamente altos pueden pro-
ducir una identificación falsa negativa.
Un buen método de identificación debe generar una curva de característica operativa del receptor que produzca uno o más
pares de tasa de verdaderos positivos/tasa de falsos positivos en la esquina superior izquierda de la gráfica, según se muestra
en la Figura6. Esta característica se captura de mejor manera mediante el área bajo la curva. Un método de decisión aleatorio
es representado por la línea diagonal con un área bajo la curva de 0,5, mientras que un buen método de identificación debe
tener un área bajo la curva más cerca de 1. La forma de la curva de característica operativa del receptor depende de una com-
binación de las propiedades espectrales de la muestra y del algoritmo quimiométrico usado para la identificación. La caracteri-
zación de la curva de la característica operativa del receptor es una tarea fundamental relacionada con el desarrollo y la valida-
ción del método.
Para un modelo de dos clases, los falsos positivos y los falsos negativos son las muestras asignadas de forma incorrecta. Junto
con los verdaderos positivos y verdaderos negativos, proveen el fundamento para la sensibilidad y la especificidad del modelo.
El analista puede desear enfocarse en un tipo de error (a o p) más que en el otro y, por ende, podría cambiar el modelo para
ser más conservador al seleccionar un umbral. Los umbrales pueden usarse como criterios de acción o criterios de evaluación.
Análisis de autentificación de materiales complejos: Los nutracéuticos y muestras de origen botánico pueden tener mezc-
las complejas de numerosos componentes. La autenticación se basa en la evaluación de la presencia de múltiples analitos y sus
concentraciones relativas, así como la demostración potencial de la ausencia de adulterantes y/o materiales relacionados. Por
ende, la autenticación en este escenario es un proceso de decisión multivariante que es apropiado para los enfoques quimio-
métricos. Por lo regular, un patrón tipo "huella dactilar'' característico que incorpora información derivada de varios analitos (y
adulterantes, potencialmente) que están presentes en la muestra se obtiene aplicando una combinación de técnicas de separa-
ción y caracterización o mediciones espectroscópicas. La información sobre composición química en la huella dactilar provee la
base para el reconocimiento de un patrón multivariante. En particular, las técnicas con selectividad analítica excepcional, tales
como espectrometría de masas y espectroscopía de resonancia magnética nuclear, han surgido como herramientas poderosas
de generación de huellas dactilares, en especial cuando se usan como detectores en separaciones cromatográficas de muestras
de componentes múltiples. La identificación tipo huella dactilar cromatográfica está reconocida como un procedimiento de
identificación viable para medicamentos herbolarios por la Organización Mundial de la Salud y la Administración de Alimentos
y Medicamentos de los EE.UU.(4,5)
Dependiendo del origen y la pureza de la muestra, puede ser apropiado desarrollar un modelo de clasificación multivariante
usando la identificación tipo huella dactilar completa o un subconjunto seleccionado de picos. Los enfoques de selección de
variables pueden ser útiles para determinar el enfoque óptimo, dependiendo de la naturaleza de las muestras y/o del perfil
analítico esperado. Es crucial que las muestras tengan una etiqueta de clase asociada o propiedad cuantitativa (actividad) obte-
nida mediante una técnica de referencia objetiva (independiente de la usada para generar la huella dactilar) para permitir un
modelado supervisado y la verificación subsiguiente del desempeño del modelo. Se debe procurar asegurar la inclusión de
fuentes y niveles apropiados de variabilidad en el desarrollo del modelo, así como pruebas de verificación del desempeño basa-
das en el uso que se le pretende dar a la prueba.
Se encuentran disponibles diversas herramientas útiles para el analista para la construcción del modelo, tales como LOA,
QDA, SIMCA,kNN, y PLS-DA.También se pueden usar técnicas más complejas siempre que se justifique (p. ej., máquinas de
vector de soporte).
Los métodos quimiométricos para la autentificación de muestras con componentes múltiples se corresponden con el capítu-
lo Validaciónde Procedimientos Farmacopeicos (1225), Validación,DatosRequeridos para la Validación,CategoríaIV. Se pueden
usar diversos métodos numéricos para verificar el desempeño predictivo. Según se trató en HerramientasCualitativaspara la
USP42 Información General/ (1039) Quimiometría 7447
identificación de materiales puros, el desempeño predictivo puede verificarse mediante comparación de la tasa de verdaderos
positivos y la tasa de falsos positivos una vez que se ha establecido un umbral de clasificación apropiado para la aplicación. Es
crucial finalizar este umbral antes de la validación formal del método analítico general.
Clasificación: Esta es una técnica de aprendizaje supervisada. El objetivo de la calibración es construir una regla de clasifica-
ción basada en un conjunto de calibración en el que se conocen tanto X como Y (etiquetas de clase). Una vez obtenida, la
regla de clasificación puede entonces ser usada para la predicción de nuevos objetos cuyos datos X están disponibles.
Los modelos de clasificación pueden dividirse en dos grupos principales: duras y suaves. La clasificación dura se enfoca direc-
tamente en el límite de decisión sobre clasificación sin producir un estimado de probabilidad. Los ejemplos de técnicas de cla-
sificación dura son el método de K-vecinos más cercanos y los sistemas expertos. La clasificación suave estima la probabilidad
condicional de las clases y luego realiza la asignación de clases basándose en la probabilidad estimada más grande. SIMCAes
una técnica de clasificación suave de uso común. En cualquiera de los escenarios, los umbrales para determinar los límites de
clase son importantes y deben establecerse durante el desarrollo del método basándose en la tasa de verdaderos positivos y
tasa de falsos positivos resultantes, cuyos requisitos son determinados por el perfil analítico esperado. Estas tasas también de-
ben verificarse como parte de la validación del procedimiento.
En muchas aplicaciones, es inaceptable tener una muestra clasificada en dos clases. Además, si una muestra no está clasifica-
da bajo ninguna clase, la muestra se considera como excluida con respecto al conjunto de calibración. Por ejemplo, un modelo
de clasificación construido a partir de los espectros en el infrarrojo cercano de cuatro materiales (A, B, C, D) tiene cuatro clases.
Cualquier material que tenga una fuente de varianza (p. ej., contenido de agua distinto) que no haya sido observada previa-
mente y que se incluya en la calibración del modelo puede no estar clasificado y, por ende, debe identificarse como una exclu-
sión y debe investigarse. De forma similar, cuando un espectro de otro material (E) se aplica al modelo, el modelo no debe ser
capaz de clasificarlo en una clase dada. Si se esperan ejemplos similares en el futuro, entonces el modelo debe revisarse para
incluir las muestras aberrantes en el conjunto de calibración, ya sea para suplementar los datos de calibración para clases exis-
tentes o para crear una clase completamente nueva, dependiendo de la naturaleza de los valores aberrantes y de los requisitos
específicos de la aplicación.
4.2 Cuantitativas
ASPECTOSGENERALES
Cuando un procedimiento analítico se quiere usar para determinar uno o más componentes o propiedades de la muestra
que tienen valores que pueden variar continuamente en lugar de categóricamente, entonces se requiere un modelo cuantitati-
vo. De manera similar al proceso de modelado cualitativo, los modelos quimiométricos cuantitativos se generan de manera
supervisada usando el bloque independiente X y las variables dependientes y para asegurar el desempeño predictivo óptimo.
La diferencia surge con respecto a la naturaleza de y, que en las aplicaciones cuantitativas son valores continuos/numéricos (en
lugar de clases o categorías). De acuerdo con el capítulo (1225), los modelos quimiométricos cuantitativos son adecuados para
incorporarlos en los métodos de las Categorías 1,11o IIIpara la determinación del contenido de fármaco o medicamento termi-
nado, niveles de impureza o características de desempeño, respectivamente. Las pruebas que se usan durante el procesamien-
to, ya sea aplicadas de una manera fuera de línea o de una manera en-línea que producen el valor para una variable continua,
también representarían usos apropiados de los modelos quimiométricos cuantitativos. Se deben usar los requisitos específicos
de los análisis de acuerdo con el perfil analítico esperado (ver 3. Ciclode vida del modelo) para guiar los parámetros de valida-
ción que demuestren el desempeño.
HERRAMIENTAS
CUANTITATIVAS
Existe un amplio rango de herramientas algorítmicas necesarias para aplicaciones cuantitativas; para descripciones más com-
pletas, ver el Apéndice,FuentesAdicionalesde Información. En este capítulo se describen brevemente las herramientas de uso
común. Como en el caso de cualquier modelo quimiométrico, la herramienta debe corresponderse con el perfil analítico espe-
rado, y viceversa. Ciertas ventajas y desventajas son características de cada herramienta, y el técnico en quimiometría debe
considerarlas todas al justificar su uso.
RegresiónLinealMúltiple (MLR, por sussiglasen inglés): Esta herramienta establece una correlación entre una variable
dependiente (o y, variable de respuesta) y múltiples variables independientes (o x, variables explicativas) ajustando una ecua-
ción lineal a los datos observados. La regresión lineal múltiple tiene dos amplias aplicaciones, según se indica a continuación.
La primera aplicación amplia de la regresión lineal múltiple es establecer un modelo que explique la importancia o la magni-
tud del efecto sobre la variable de respuesta, y esto por lo general se usa en la exploración de diseños experimentales o en el
análisis de la respuesta. Por lo general, las variables de ingreso son mutuamente independientes y, por diseño, representan
magnitudes grandes. A menudo, se incluyen términos de alto orden tales como términos al cuadrado y términos de interac-
ción, y se usa un procedimiento paso a paso para excluir aquellos términos que menos contribuyan al modelo. Se recomienda
tener cuidado de evitar tener muchas variables en el modelo, debido a que incluir muchos términos producirá un sobreajuste
del modelo. El parámetro estadístico R2 ajustado se usa a menudo para estimar si existen demasiados factores en el modelo,
aunque otros parámetros también pueden ser apropiados. El R2 ajustado es una modificación del coeficiente estándar de deter-
minación que tiene en cuenta el número de términos del modelo y el número de muestras, lo que resulta en una gráfica de R2
(ajustada) que tiene un valor máximo más allá del cual cualquier término adicional resultará en un sobreajuste.
La segunda aplicación amplia de la regresión lineal múltiple es establecer un modelo de predicción para propósitos analíti-
cos. La regresión lineal múltiple puede usarse para ajustar un modelo predictivo a un conjunto de datos observado de valores y
y x. El modelo establecido puede usarse para predecir el valor y a partir del valor x en muestras nuevas. El modelo de predic-
ción creado a partir de los datos x correlacionados es adecuado para explorar la relación entre y y x individuales.
El modelo de predicción por regresión lineal múltiple puede usarse en un procedimiento o método para una prueba farma-
céutica oficial. Por ejemplo, un filtro de infrarrojo cercano, el cual tiene un uso específico tal como análisis de agua en el pro-
ducto, produce un "espectro" de tan solo unos pocos datos.
El desarrollo y la validación pueden seguir los mismos procedimientos que se usan con modelos de variables latentes tales
como PLS. Durante el desarrollo y la validación de un modelo de regresión lineal múltiple: 1) se requiere usar un procesamien-
to previo de datos apropiado; 2) se usa validación cruzada para estimar el desempeño del modelo; y 3) se usa un conjunto de
datos independiente para evaluar el modelo.
Una limitación de la regresión lineal múltiple es que el desempeño predictivo del modelo puede verse negativamente impac-
tado cuando las variables modeladas son colineales. El problema de la colinealidad no es exclusivo de la regresión lineal múlti-
ple. Se mitiga en el modelado por PLSmediante la generación de un nuevo conjunto base de variables latentes ortogonales
(no colineales) que son combinaciones lineales de las variables originales. Sin embargo, esto no es pertinente para los modelos
de regresión lineal múltiple. En los modelos de regresión lineal múltiple, la selección o transformación de variables (p. ej., cen-
trado de la media) puede ser necesaria para evitar o reducir la colinealidad en el conjunto de calibración. Aunque los modelos
de regresión lineal múltiple tienen algunos parámetros de diagnóstico para identificar valores aberrantes y muestras altamente
utilizadas en la calibración, no cuentan con los parámetros de diagnóstico (tales como T2de Hotelling y prueba de residuales
X) que ofrecen la PLSdurante la predicción de muestras nuevas.
Regresión de componentes principales (PCR, por sus siglas en inglés): Este es un enfoque de modelado de dos etapas en
el que primero se realiza un análisis de componentes principales en los datos del bloque X para obtener un conjunto base de
componentes principales. Los componentes principales se usan posteriormente en combinación con los datos y para desarro-
llar un modelo de regresión para predecir los valores y.
Mínimos cuadrados parciales (PLS, por sus siglas en inglés): Este es uno de los algoritmos quimiométricos de uso más
común para los escenarios de modelado cuantitativo y cualitativo (PLS-DA,ver HerramientasCualitativas).La ventaja computa-
cional que ofrece la PLSsobre la regresión lineal múltiple y la PCR es que los componentes principales se derivan en el algorit-
mo de mínimos cuadrados parciales usando los datos X y y de manera simultánea. Esto a menudo resulta en modelos predicti-
vos que requieren menos variables latentes en comparación con la regresión de componentes principales, con lo que se mejo-
ra la robustez. La regresión de mínimos cuadrados parciales es capaz de manipular relaciones moderadamente no lineales,
mientras que la regresión de componentes principales y la regresión lineal múltiple son técnicas de modelado lineal. Además,
se puede modelar más de una variable y usando los mismos datos del bloque X mediante diferentes enfoques algorítmicos. La
regresión de PLS-1 resulta en un modelo independiente para cada variable y. La regresión de PLS-2producirá un solo modelo
capaz de predecir de manera simultánea los valores de dos o más variables y. Las ventajas relativas de cada enfoque pueden
variar entre aplicaciones. Por ejemplo, si se requiere un procesamiento previo matemático diferente para resolver cada compo-
nente que se va a predecir, modelos separados de PLS-1 pueden proveer un desempeño mejorado en comparación con un
modelo PLS-2 individual .
EJEMPLOS DE APLICACIÓN CUANTITATIVA
Valoración de la forma farmacéutica y/o uniformidad del contenido: La valoración del contenido de ingrediente farma-
céutico activo en la forma farmacéutica final comúnmente se realiza mediante la medición de una muestra retirada a partir de
un compuesto homogéneo de un número de unidades de dosificación individuales (p. ej., tabletas o cápsulas). El resultado
cuantitativo posteriormente se informa como un "contenido promedio" (expresado como porcentaje de la cantidad de ingre-
diente farmacéutico activo) para la partida analizada. La uniformidad del contenido puede analizarse usando un método simi-
lar a la valoración, pero las mediciones se llevan a cabo en muestras individuales. El resultado informado se basa principalmen-
te en la variabilidad de los resultados de valoración entre las unidades de dosificación individuales analizadas. Los métodos de
valoración y la uniformidad de contenido tienen el propósito de caracterizar el componente "principal" en la muestra en cues-
tión y se consideran pruebas de Categoría I de acuerdo con las definiciones establecidas en el capítulo (1225). En la mayoría
de los casos, el analito esperado será el ingrediente activo en la muestra, aunque también existen valoraciones cuantitativas
para otros componentes en el compendio.
Para formas farmacéuticas sólidas, la mayoría de los procedimientos de valoración se basan en HPLC.El análisis con HPLC
toma mucho tiempo y a menudo implica el uso de grandes volúmenes de disolvente para la fase móvil. Sin embargo, la HPLC
es altamente lineal y a menudo se calibra usando matemática univariante (es decir, una variable medida es directa y únicamen-
te proporcional a la concentración de la muestra).
Por el contrario, los métodos alternativos para la valoración que se basan en espectroscopía (p. ej., espectroscopía en el in-
frarrojo cercano y Raman) a menudo ofrecen la ventaja de rápidas velocidades de análisis y no son destructivos. Sin embargo,
en muchos casos la señal de analito puede no presentar el mismo grado de linealidad o señal-ruido que con el método de
HPLCcorrespondiente. Además, ninguna variable está directa y únicamente relacionada con la concentración de interés. Por
esta razón, los modelos multivariantes, a menudo basados en PLS,comúnmente se usan en procedimientos espectroscópicos
para valoración y uniformidad de contenido.
Para las pruebas de Categoría 1,es crucial demostrar la exactitud, precisión, especificidad, linealidad e intervalo de resultados
durante la validación del procedimiento analítico general. Cada uno de estos aspectos de desempeño implica consideraciones
durante el desarrollo o la validación del modelo multivariante que son distintas a las relacionadas con las técnicas univariantes.
La mayoría de los métodos espectroscópicos no son cuantitativos en un sentido absoluto. Por ejemplo, los modelos desarro-
llados usando datos del infrarrojo cercano o Raman deben calibrarse con respecto a una técnica de referencia primaria (a me-
nudo espectroscopía con HPLCo RMN). Debido a la naturaleza no destructiva del infrarrojo cercano y de Raman, es sencillo
analizar un conjunto dado de muestras usando una de estas técnicas y, posteriormente, analizar de manera subsiguiente el
mismo conjunto de muestras mediante espectroscopía con HPLCo RMN para obtener los valores de contenido de referencia.
Este enfoque es típico para valoraciones de formas farmacéuticas sólidas, no obstante, vale la pena tener en cuenta que los
valores de referencia para valoraciones de algunas formas farmacéuticas, ingredientes activos farmacéuticos, polimorfos o exci-
pientes pueden derivarse de otras técnicas tales como datos gravimétricos registrados durante la preparación de la muestra de
calibración. Los modelos quimiométricos se desarrollan mediante una calibración multivariante usando datos espectrales del
infrarrojo cercano o Raman y los valores de contenido a partir de la técnica de referencia. La exactitud se determina usando la
diferencia absoluta entre las predicciones del modelo y los valores de referencia. La precisión se determina usando la desvia-
ción estándar de los resultados del procedimiento por sí solos, tales como análisis de determinaciones repetidas de la misma
muestra. Por ende, la precisión es una medida del desempeño para el procedimiento analítico en su totalidad. El modelo mis-
mo será absolutamente preciso. Esto significa que, dados los mismos datos espectrales, siempre se generará el mismo resulta-
do numérico. Teniendo en cuenta lo anterior, la precisión puede verse influenciada por los aspectos específicos de la estrategia
del modelado quimiométrico (p. ej., pre procesamiento, algoritmo de modelado, número de variables latentes) y, por ende, se
debe evaluar la precisión durante el desarrollo del modelo, así como durante la validación. Es importante tener en cuenta que
la exactitud de los modelos quimiométricos no será capaz de exceder la exactitud de la técnica analítica de referencia usada
para calibrar el modelo. Sin embargo, en algunos casos puede ser posible exceder la precisión de la técnica de referencia.
El intervalo del método será determinado por las muestras de calibración que se usan para el desarrollar del modelo multiva-
riante. De acuerdo con el capítulo (1225), se recomienda que las muestras de calibración de valoración tengan contenidos de
analitos en el intervalo de 80%-120% de la cantidad esperada. Para evaluar la uniformidad del contenido, el intervalo reco-
mendado es 70o/o-l 30% de la cantidad esperada. En algunos casos, tanto los resultados de la valoración como los de uniformi-
dad pueden obtenerse a partir del mismo conjunto de mediciones de las muestras. Promediar un número requerido de resulta-
dos de valoración de unidades de dosificación individuales proveerá un valor equivalente al parámetro "contenido promedio".
El cálculo del "valor de aceptación" (ver Uniformidadde Unidadesde Dosificación(905)) usando este resultado medio combina-
do con la desviación estándar para el mismo conjunto de resultados de unidades de dosificación individuales proveerá unifor-
midad en los resultados de contenido. En este caso, se debe usar un conjunto de calibración individual que abarque el interva-
lo más amplio de los dos intervalos recomendados (70%-130%).
Cuando no resulta práctico obtener un intervalo lo suficientemente amplio de valores de contenido en las muestras de cali-
bración producidas a escala de fabricación comercial, las muestras de calibración también pueden producirse a una escala me-
nor o en el laboratorio. En este escenario, se deben extremar las condiciones para replicar las propiedades físicas representati-
vas de la escala comercial. Asimismo, se debe tener cuidado de verificar que exista una mínima influencia de las diferentes es-
calas de producción en los resultados de las muestras. Pueden requerirse la incorporación de muestras a escala comercial en el
proceso de validación del modelo (y/o procedimiento) para verificar la exactitud y precisión de los resultados del modelo (y/o
procedimiento) contra cualquier diferencia y/o variabilidad en las propiedades físicas. Los algoritmos de procesamiento mate-
mático (p. ej., normalización, segundas derivadas) deben optimizarse tanto como sea posible durante el análisis de los datos
exploratorios iniciales (ver Ejemplosde AplicaciónCualitativa) para mitigar la influencia que pudieran tener dichos factores en la
predicción. Por ejemplo, se sabe que el espesor, el tamaño de partícula y las diferencias en la densidad pueden llevar a cambios
en la pendiente espectral y a desviaciones de la línea base de los espectros del infrarrojo cercano. Dependiendo del efecto es-
pecífico que esté presente, una selección inapropiada del procesamiento previo puede no corregir totalmente las diferencias
espectrales, lo que lleva a errores en la predicción.
El desempeño predictivo y el ajuste de los modelos quimiométricos debe demostrarse mediante la linealidad de una gráfica
de los resultados del modelo en función de los valores de referencia o nominales del analito esperado, idealmente usando los
resultados a partir de un conjunto de muestras independientes. La señal analítica sin procesar puede demostrar una relación no
lineal con las concentraciones de analito de referencia. Asimismo, se pueden usar múltiples variables latentes para la construc-
ción del modelo quimiométrico. Sin embargo, el aspecto clave del modelo que debe demostrarse que varía linealmente con la
concentración de analito es el resultado del modelo, no los datos. Una gráfica de la predicción de residuales en función de la
concentración puede ayudar a revelar cualquier falta de ajuste sistemática. Cualquier observación de patrones en esta gráfica
de residuales puede indicar la necesidad de realizar una revisión de: 1) el número de variables latentes incluidas en el modelo,
2) la matemática del procesamiento previo o 3) el tipo de algoritmo usado para el modelado.
La demostración de la especificidad del procedimiento para la valoración puede basarse en fuentes probables de interferen-
cia o en la sustitución del material basada en un entendimiento de las propiedades materiales de los componentes de la mues-
tra y del procesode fabricacióny/o la cadenade suministro.Unamanerade hacerloseríaverificarque un placebode la uni-
dad de dosificación produce constantemente resultados bajos de la valoración que están fuera de la especificación. Otra estra-
tegia puede ser verificar que unidades de dosificación de un producto distinto (en especial uno fabricado en la misma instala-
ción y/o analizado en el mismo laboratorio) resultan en valores de valoración que están siempre fuera de la especificación.
Pruebas de límite de impurezas: Análisis de rutina son necesarios para la determinación de impurezas y/o productos de de-
gradación en productos intermedios, fármacos a granel y productos farmacéuticos terminados. El análisis para este propósito
puede tomar la forma de una prueba de límite (Categoría 11,(1225)).
Por lo regular, estas pruebas de impurezas se basan en HPLCu otros métodos (p. ej., valoración volumétrica Karl Fischer para
agua). Estos procedimientos analíticos son altamente lineales y por lo regular se calibran usando matemática univariante. No
obstante, estos métodos a menudo llevan tiempo e implican el muestreo manual, que presenta desventajas, en especial para
productos de alta potencia o para aquellos con productos intermedios tóxicos producidos durante la síntesis del ingrediente
activo farmacéutico.
Por el contrario, los métodos alternativos para valoración basados en espectroscopía (p. ej., en el infrarrojo cercano o Ra-
man) ofrecen la ventaja de una mayor velocidad de análisis y, de mayor importancia, la eliminación total de muestreo humano
debido a la naturaleza no invasiva de la medición. Sin embargo, estas ventajas por lo regular se compensan por una sensibili-
dad reducida (límite de detección) y una respuesta del sensor potencialmente no lineal a lo largo del intervalo requerido de
concentración del analito como el método de referencia correspondiente. Por esta razón, los enfoques multivariantes que com-
binan pre procesamiento espectral y modelos de variables latentes a menudo se emplean en los métodos espectroscópicos
para dichas pruebas de límite. ( 6) No obstante, debido a los desafíos potenciales relacionados con la obtención de una sensibi-
lidad adecuada para una prueba de límite basada en espectroscopía, se deben emplear cuidadosos estudios de desarrollo y
viabilidad.
Para una prueba de límite de los procedimientos de Categoría 11,a menudo se usa un conjunto de calibración que contiene
concentraciones variadas del analito de interés usado para caracterizar el desempeño de dicho procedimiento analítico. Aun-
que no se requiere, estos parámetros de desempeño podrían incluir exactitud, intervalo, linealidad, entre otros. El uso de los
parámetros de desempeño depende de la naturaleza de la prueba de límite.
Por el contrario, se considera crítico ilustrar la especificidad y el límite de detección durante la validación de una prueba de
límite de acuerdo con el capítulo {1225). Para la especificidad, a menudo se usa una comparación entre el vector de regresión/
carga y un espectro representativo del componente puro de interés. Además, medir los efectos de la matriz sobre la determi-
nación del analito dentro del intervalo especificado es otro enfoque útil para demostrar que el procedimiento analítico es espe-
cífico para el analito de interés sin el impacto de otras variables introducidas en el conjunto de calibración. Asimismo, se puede
demostrar evidencia de la especificidad del método mediante el cálculo de un cociente de selectividad derivada del conjunto
de datos de calibración, definido como la varianza de los espectros reconstruidos del modelo dividida por aquélla de los espec-
tros residuales. Se espera que el cociente de selectividad en la banda de absorción del analito sea mayor con respecto a otras
regiones espectrales.
Con respecto al límite de detección, no existe un estimador generalmente aceptado para modelos de regresión de mínimos
cuadrados parciales. Una práctica común para determinar el límite de detección implica calcular una relación señal-ruido es-
pectral. Para representar el ruido se pueden usar los resultados del modelo para análisis de determinaciones repetidas de una
muestra blanco. Como alternativa, se puede obtener una aproximación del ruido usando el error estándar de un modelo mul-
tivariante. Se han sugerido otros enfoques más elaborados para tratar la naturaleza multivariante de los modelos de regresión
de mínimos cuadrados parciales. (7) Con cualquier enfoque, se debe verificar experimentalmente el límite de detección esti-
mado usando muestras con niveles de analito en o cercanos a dicha concentración. Debido a que el límite de detección obte-
nible a través del método espectroscópico será probablemente mayor que el obtenible mediante un enfoque cromatográfico,
se vuelve crucial demostrar que el límite de detección basado en el modelo quimiométrico cumple con los re9uisitos del perfil
analítico esperado.
Prueba de disolución: La disolución in vitro es una prueba de desempeño crucial para formas farmacéuticas sólidas que se
usa para predecir los perfiles de liberación de fármacos in vivo durante el desarrollo del medicamento y para evaluar la unifor-
midad entre lotes para propósitos de control de calidad. Se pueden usar modelos quimiométricos para predecir la disolución
de medicamentos a partir de propiedades medidas relevantes del producto, y el método que emplee dicho modelo puede es-
tablecerse como un procedimiento alternativo. Como alternativa, el perfil de disolución puede modelarse mediante varias res-
puestas a partir de distintos tiempos de muestreo en la curva de disolución usando modelos individuales.
Se pueden recopilar datos de disolución como un perfil (es decir, una serie de valores obtenidos a diversos tiempos de mues-
treo), aunque los criterios de aceptación pueden depender de un tiempo de muestreo individual. Al construir un modelo qui-
miométrico, es esencial que el modelo sea capaz de predecir el perfil completo. El número y el lapso de tiempo transcurrido
entre los tiempos de disolución en el perfil de disolución variarán dependiendo del tipo de producto (p. ej., liberación inmedia-
ta versus modificada/prolongada). Un enfoque común es transformar el perfil en un valor individual, el cual posteriormente
funciona como una variable dependiente (o y, variable de respuesta). Esta variable, en combinación con otra variable medida,
se puede usar para restablecer el perfil de disolución. La transformación puede lograrse ajustando los datos del perfil de disolu-
ción a un modelo mecanístico (tal como una ecuación de velocidad de primer orden o sus variantes) o un modelo empírico
(tal como una función Weibull). Después de la transformación, se pueden usar unas pocas variables (por lo general, dos o tres
variables) para representar el perfil de disolución. Por lo general, las dos variables son un factor de velocidad de disolución y un
factor de meseta; puede ser necesaria una tercera variable tal como un tiempo de latencia o demora. Elfactor de velocidad de
disolución, que representa la velocidad de disolución, será la variable dependiente para el modelado. Elfactor de meseta repre-
senta la cantidad final de fármaco en la solución, la cual debe ser igual al contenido de fármaco para la mayoría de los produc-
USP 42 Información General/ (1039) Quimiometría 7451
tos. Estos dos factores se usan para restablecer el perfil. Por lo tanto, el modelo para predicción de la disolución se usa para
predecir la velocidad de disolución.
La clave para diseñar un modelo exitoso es definir las variables de ingreso. El factor de meseta puede obtenerse a partir de
datos de contenido de fármaco, mientras que el factor de velocidad de disolución puede modelarse a partir de un conjunto de
datos de atributos químicos y físicos del producto o del producto intermedio. Se deben usar los conocimientos necesarios so-
bre las propiedades fisicoquímicas así como conceptos de ingeniería para identificar y justificar los datos de entrada pertinentes
que tienen un impacto potencial sobre la disolución del producto. Esto por lo general implica la evaluación de riesgos y una
etapa adicional de recolección de datos tal como un estudio de diseño de experimento a pequeña escala. Los datos de entrada
por lo general incluyen los atributos medidos de los materiales en diversas etapas de procesamiento (tal como datos del tama-
ño de partícula para gránulos o mezclas; mediciones en el infrarrojo cercano para mezclas o tabletas; y propiedades físicas de
las tabletas).
Existen dos enfoques para definir las muestras en la calibración del modelo: muestras-partida y muestras individuales de uni-
dades de dosificación. Para el enfoque de muestra-partida, cada partida de producto se trata como una muestra y las variables
de datos de entrada son los atributos medios de la partida. El enfoque de unidades de dosificación individuales consiste en
medir los atributos de las unidades de dosificación individuales (tales como la medición en el infrarrojo cercano de cada table-
ta). Las variables de entrada de ambos enfoques pueden suplementarse con otras propiedades de la materia prima según lo
justifiquen los atributos de calidad críticos.
La validación del método de predicción de disolución basado en modelo puede ser diferente de la validación típica del mé-
todo de disolución y HPLC,dependiendo del enfoque específico usado. El método de disolución y HPLCpone más énfasis en la
precisión, puesto que la disolución se trata como un método de Categoría IIIen el capítulo (1225).
En el enfoque de muestra-partida, el método basado en el modelo trata la disolución como una propiedad de la partida más
que como una propiedad de las tabletas individuales, y la exactitud es el punto central de la validación o verificación del méto-
do. Por ejemplo, cada partida forma una muestra, por lo que no se considera realista tener un conjunto de muestras de valida-
ción grande. Este enfoque genera un perfil para cada partida, y el resultado a cierto tiempo de muestreo puede usarse para
evaluar la calidad de la partida de producto. La evaluación de la variabilidad debe estar alineada con los criterios de Disolución
(711 ). La variabilidad del resultado de disolución final puede evaluarse mediante el análisis de las variaciones de los datos de
entrada. Las posibles formas de evaluar la variación de la muestra (partida) incluyen el análisis de la variación de los datos de
entrada, simulaciones, así como dividir una partida en múltiples subpartidas.
En la estrategia de unidades de dosificación individuales, el método basado en el modelo evalúa unidades individuales de
dosificación. Si se analiza una gran cantidad de tabletas, se obtiene un n grande, en esta situación se deben usar con precau-
ción los criterios de aceptación del capítulo (711 ). El técnico en quimiometría puede proponer criterios de aceptación siempre
que se demuestre que dichos criterios (mediante simulación u otros medios) son criterios de aprobación equivalentes o más
estrictos que los del capítulo (711 ). En la validación o verificación del método, es deseable contar con al menos una muestra
que presente una disolución baja (cercana o por debajo de la especificación), y el método basado en el modelo quimiométrico
debe demostrar su capacidad de distinguir dicha muestra de baja disolución de las muestras normales.
GLOSARIO
Una gran cantidad de términos comunes de quimiometría han sido definidos dentro del texto de este capítulo. En esta sec-
ción se proveen definiciones de algunos términos adicionales que sirven como referencia para su uso dentro del texto. Para
una descripción más completa, consulte los textos listados en el Apéndice,FuentesAdicionalesde Información.
Modelo de calibración: Expresión matemática usada para relacionar la respuesta de un instrumento analítico con las propie-
dades de las muestras o para capturar la estructura subyacente de un conjunto de datos de calibración.
Conjunto de calibración: Recopilación de datos usada para desarrollar una clasificación o modelo quimiométrico.
Derivadas: El cambio en la intensidad con respecto a la variable de medición (es decir, la abscisa). Las derivadas son útiles
para eliminar desviaciones de la línea base (constantes o lineales) debidas a propiedades de la muestra, o para resaltar peque-
ños cambios en una señal, ayudando a mejorar la selectividad y la sensibilidad (p. ej., un pico espectroscópico o cromatográfi-
co con un hombro adyacente).
Validación interna: Aplicación de estadística de re muestreo tales como validación cruzada. Los subconjuntos del conjunto
de datos de calibración se someten a una variedad de procesos estadísticos para identificar el modelo de calibración que mejor
se ajusta a los datos disponibles. Cada modelo se caracteriza mediante un parámetro estadístico. Para la validación cruzada, el
conjunto entero de datos de muestras se divide en muestras individuales o grupos de muestras, los cuales se eliminan de forma
individual del resto de las muestras y se analizan como elementos desconocidos contra un modelo de calibración que se cons-
truye usando el resto de las muestras. El indicador estadístico característico es el error estándar de validación cruzada (SECV,
por sus siglas en inglés).
Matriz: Estructura de datos bidimensionales que consta de columnas y filas usadas para organizar datos de entrada o resulta-
dos durante análisis quimiométricos. La práctica común consiste en que cada fila corresponda con una muestra individual y
que cada columna corresponda con una variable individual.
Conjunto de validación: Conjunto de datos que desafía los atributos de desempeño del modelo. El conjunto de datos de
validación es independiente del conjunto de datos de capacitación, aunque el análisis de los datos de capacitación provee una
visión positiva del desempeño y, por ende, permite ajustar iterativamente el procesamiento previo y el modelo hasta que dicha
visión positiva cumpla con las expectativas. Entonces, es necesaria una validación o validación cruzada para calibrar de manera
adecuada el desempeño del modelo. El desempeño del modelo con el conjunto de datos de validación será siempre igual o
peor que su desempeño con el conjunto de datos de capacitación. Si no se cumplen los atributos de desempeño, entonces el
técnico en quimiometría debe evaluar si el modelo se sobreajusta o tiene un ajuste insuficiente a los datos y si son necesarias
iteraciones del modelo para cumplir con la tasa de error aceptable. Si estos esfuerzos fallan, se recomienda volver un paso
atrás, modificar las condiciones de procesamiento previo y llevar a cabo la misma tarea nuevamente.
APÉNDICE
Fuentes Adicionales de Información
Se han escrito muchos libros sobre la quimiometría y el análisis de multivariantes. Varios términos que no se encuentran en
el glosario podrían estar disponibles en la siguiente lista breve de fuentes adicionales de información.
• Massart DL, Vandeginste BGM, Buydens LMC, De Jong P, Lewi PI, Smeyers-Verbeke 1,eds. Handbookof Chemometricsand
Qua/imetrics:Part A. 1st ed. Amsterdam: Elsevier Science B.V.;1997.
• Vandeginste BGM, Rutan se, eds. Handbookof Chemometricsand Qualimetrics:Part B. 1st ed. Amsterdam: Elsevier Science
B.V.;1998.
• Mocak J. Chemometrics in medicine and pharmacy. Nova Biotechnologicaet Chimica.2012;11 (1):11-25.
• Singh 1,Juneja P, Kaur B, Kumar P. Pharmaceutical applications of chemometric techniques. ISRNAnal Chem.201 3; article
ID 795178. http://www.hindawi.com/joumals/isrn/2013/795178/. Ingresado el 25 de mayo de 2016.
• Brown S, Tauler R, Walczak B, eds. ComprehensiveChemometrics:Chemicaland BiochemicalData Ana/ysis.1st ed. Amster-
dam: Elsevier Science B.V.;2009.
• Varmuza K, Filzmoser P. lntroduction to Multivariate StatisticalAnalysisin Chemometrics.Boca Raton, FL: CRC Press (Taylor &
Francis Group ); 2009.
REFERENCIAS
1. Massart DL, Vandeginste BGM, Buydens LMC, De long P, Lewi PI, Smeyers-Verbeke J, eds. Handbookof Chemometricsand
Qualimetrics:Part A. 1st ed. Amsterdam: Elsevier Science B.V.;1997.
2. Massart DL, Vandeginste BGM, Deming SM, Michotte Y, Kaufman L. Chemometrics:A Textbook.1st ed. Amsterdam: Else-
vier Science B.V.;1988.
3. Brown CD, Davis HT. Receiver operating characteristics curves and related decision measures: a tutorial. Chemometrlnte/1
Lab Syst.2006;80:24-38.
4. World Health Organization. General guidelines for methodologies on research and evaluation of traditional medicine. Ge-
neva, Switzerland: World Health Organization; April 2000. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/66783/1/
WHO_EDM_TRM_2000.l .pdf. Ingresado el 25 de mayo de 2016.
5. Food and Drug Administration. Guidance for industry: botanical drug products. Rockville, MD: Food and Drug Adminis-
tration; )une 2004. http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/
ucm070491.pdf. Ingresado el 25 de mayo de 2016.
6. Lambertus G, Shi Z, Forbes R, Kramer TT, Doherty S, Hermiller 1,et al. On-line application of near-infrared spectroscopy
for monitoring water levels in parts per million in a manufacturing-scale distillation process. Appl Spectrosc.2014;68(4):
445-457.
7. Allegrini F, Olivieri AC. IUPAC-consistent approach to the limit of detection in partial least-squares calibration. Anal Chem.
2014;86:7858-7866.
(1041) PRODUCTOS BIOLÓGICOS
Algunos productos como por ejemplo antitoxinas, antivenenos, sangre, hemoderivados, antisueros, elementos auxiliares pa-
ra el diagnóstico inmunológico, toxoides, vacunas y artículos relacionados que se producen bajo licencia en conformidad con
los términos de la Ley federal de Servicios de Salud Pública (Estat. 58 682) aprobada el 1 de julio de 1944 como enmienda, se
han conocido durante mucho tiempo como "productos biológicos". Sin embargo, en la Tabla 111,Parte F de la Ley, el término
"productos biológicos" se aplica al grupo de productos autorizados en conjunto. A los efectos de esta Farmacopea, el término
"productos biológicos" hace referencia a aquellos productos que deben estar autorizados según la Ley y cumplir con el Regla-
mento sobre Alimentos y Medicamentos-Código de Reglamentos Federales, Título 21, Partes 600-680, relativas al control fe-
deral de estos productos (excepto ciertos elementos de diagnóstico), según la administración del Centro de Investigación y
Evaluación de Productos Biológicos (Center for Biologics Evaluation and Research) o, en el caso de los elementos auxiliares de
USP 42 Información General/ (1041) Productos Biológicos 745 3
diagnóstico pertinentes, del Centro de Dispositivos y Radiología (Center for Devices and Radiological Health) de la Administra-
ción Federal de Alimentos y Medicamentos.
Cada lote de un producto biológico autorizado está aprobado para su distribución cuando se ha determinado que el lote
cumple con los requisitos de control específicos para dicho producto según establezca la Administración. El otorgamiento de
licencias incluye la aprobación de una serie específica de pasos de producción y de pruebas de control durante el proceso, así
como especificaciones sobre el producto final que deben cumplirse lote por lote. Estos pasos solo pueden alterarse después de
la aprobación del Centro de Investigación y Evaluación de Productos Biológicos y con el apoyo de la información apropiada
que demuestre que el cambio generará un producto final con una seguridad, pureza, potencia y eficacia iguales o superiores.
Ningún lote de un producto biológico autorizado será distribuido por el fabricante antes de completar las pruebas especifica-
das. Las disposiciones generalmente aplicables a los productos biológicos incluyen pruebas de potencia, seguridad general, es-
terilidad, pureza, agua (humedad residual), pirógenos, identidad y materiales constituyentes (Artículos 610.1 O a 610.15 y ver
Pruebasde Seguridad-ProductosBiológicosen Pruebasde ReactividadBiológicaIn Vivo(88), Pruebasde Esterilidad (71 ), Determi-
naciónde Agua(921 ), Pruebade Pirógenos(151) y Pruebade EndotoxinasBacterianas(85)). Los materiales constituyentes inclu-
yen ingredientes, conservantes, diluyentes y adyuvantes (los cuales generalmente deben cumplir con las normas farmacopei-
cas), vacunas producidas en cultivos celulares de proteína extraña (la cual se excluye si no origina suero) y antibióticos diferen-
tes de la penicilina agregados al sustrato de producción de vacunas virales (para las cuales hay disponibles monografías oficia-
les sobre antibióticos y sustancias antibióticas). También es necesario realizar pruebas de seguridad adicionales específicas en
vacunas vivas y algunos otros elementos. Cuando el Centro de Investigación y Evaluación de Productos Biológicos (Apartado
610.20) pone a disposición las preparaciones estándar, dichas preparaciones se especifican para la comparación de potencia o
pruebas de virulencia. El Estándar de Opacidad de los EE.UU.se utiliza para calcular la concentración bacteriana de ciertas va-
cunas bacterianas y para evaluar cultivos de desafío en las pruebas realizadas a dichas sustancias. (',fertambién Unidadesde
Potenciaen las Advertenciasy RequisitosGenerales,5.50.10 Unidadesde Potencia(Biológica).)
Las Monografías Farmacopeicas cumplen la Reglamentación sobre Alimentos y Medicamentos al cubrir los aspectos de iden-
tidad, calidad, pureza, potencia, envasado y almacenamiento, que resultan de particular interés para los farmacéuticos y médi-
cos responsables de la compra, el almacenamiento y el uso de productos biológicos. Las revisiones de los requisitos federales
que afectan a las monografías de la USP serán los temas centrales de los Suplementosde la USPtan pronto como sea factible.
Vehículos y Sustancias Agregadas-Los vehículos y las sustancias agregadas adecuados para productos biológicos son los
que se enumeran en la Reglamentación sobre Alimentos y Medicamentos.
Envases para Inyecciones-Los envases para productos biológicos que deban ser administrados por vía inyectable cum-
plen con los requisitos de Requisitosde Envasadoy Almacenamiento(659), Envasadode Inyectables.
Volumen en Envase-Los volúmenes de los envases de productos biológicos que deban ser administrados por vía inyecta-
ble cumplen con los requisitos de Contenidoen Envasespara Inyectables(697).
Etiquetado-Los productos biológicos que deban ser administrados por vía inyectable cumplen con los requisitos de Eti-
quetado(7), Etiquetasy Etiquetadopara MedicamentosInyectables.Además, la etiqueta del envase final para cada producto bio-
lógico indica lo siguiente: el título o nombre propio (el nombre con el cual el producto fue autorizado según la Ley de Servi-
cios de Salud Pública), el nombre, la dirección y el número de licencia del fabricante, el número de lote, la fecha de caducidad
y la dosis individual recomendada para envases multidosis. La etiqueta del envase incluye todo lo mencionado anteriormente,
con la siguiente adición: el conservante utilizado y la cantidad; el número de envases, si hubiera más de uno; la cantidad de
producto contenida en el envase; la temperatura de almacenamiento recomendada; una leyenda, si fuera necesario, que indi-
que que debe evitarse la congelación; y cualquier otra información semejante requerida por la Reglamentación sobre Alimen-
tos y Medicamentos.
Envasado y Almacenamiento-El etiquetado indica la temperatura de almacenamiento recomendada (ver Requisitosde En-
vasadoy Almacenamiento(659)). Cuando los productos cuya etiqueta indica que deben almacenarse a una temperatura entre
2º y 8º están almacenados en un refrigerador, se deben tomar precauciones para asegurarse de que no se congelen. Los dilu-
yentes envasados con productos biológicos no deben congelarse. Algunos productos (como se define en el Apartado 600.15)
deben mantenerse a temperaturas especificadas durante el transporte.
Fecha de Caducidad-Para los artículos farmacopeicos, la fecha de caducidad identifica el tiempo durante el cual se puede
esperar que el artículo cumpla con los requisitos de la monografía Farmacopeica, siempre que se almacene en las condiciones
de almacenamiento prescritas. Esta fecha limita el tiempo durante el cual el producto puede ser dispensado o utilizado (ver
Advertenciasy RequisitosGenerales,3.1OAplicabilidad de las Normas,página 1). Sin embargo, para los productos biológicos, la
fecha indicada en cada lote determina el período de vigencia, que comienza en la fecha de fabricación (Apartado 610.50) y
más allá de la cual existen dudas razonables de que el producto pueda generar los resultados específicos y conserve la seguri-
dad, pureza y potencia requeridas (Apartado 300.3 (1) y (m)). Dicho periodo de vigencia puede comprender un periodo de
almacenamiento en fábrica durante el cual se mantiene en las condiciones prescritas en el almacenamiento del fabricante, se-
guido de un periodo tras ser retirado de allí. Las monografías individuales suelen indicar este último período y también (entre
paréntesis) el período de almacenamiento en fábrica permisible. Si el producto se conserva en el almacenamiento del fabrican-
te durante un periodo superior al indicado (entre paréntesis), la fecha de caducidad se determina reduciendo en la proporción
correspondiente el periodo de vigencia después de la salida del almacenamiento del fabricante.
7454 (1043) Materiales Auxiliares/ Información General USP42
(1043) MATERIALES
AUXILIARES
PARAPRODUCTOSCELULARES,
GÉNICOSY DE INGENIERÍATISULAR
INTRODUCCIÓN
La fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular requiere de una amplia variedad de reactivos y materia-
les, muchos de los cuales son únicos o complejos. Estos materiales incluyen productos provenientes del plasma o del suero,
extractos biológicos, antibióticos, citocinas, medios de cultivo, anticuerpos, matrices poliméricas, dispositivos de separación,
medios de gradiente de densidad, toxinas, medios condicionados suministrados por "capas de células de alimentación", sus-
tancias químicas puras, enzimas y soluciones amortiguadoras de procesamiento. Muchos de estos artículos se usan para asegu-
rar la supervivencia y favorecer la proliferación de determinadas poblaciones celulares, aunque su mecanismo de acción puede
no estar completamente elucidado. Algunos ejemplos son el suero fetal bovino (FBS,por sus siglas en inglés) y diversos suple-
mentos de medios. Otros artículos, como la toxina del cólera altamente purificada, se introducen en el flujo de procesamiento
durante la fabricación para ejercer un efecto bioquímico específico y se eliminan por lavado inmediatamente en pasos subsi-
guientes del procesamiento para evitar la toxicidad posterior no deseada. Los productos biológicos terminados elaborados en
estos procesos a menudo son mezclas complejas que, en algunos casos, no se pueden caracterizar totalmente. Es necesario
examinar cuidadosamente los materiales utilizados en la elaboración, para evitar la introducción de agentes adventicios o im-
purezas tóxicas, y para garantizar la máxima seguridad, eficacia y uniformidad del producto final.
En la fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular, a estos reactivos y materiales se los conoce colectiva-
mente como materiales auxiliares (AM, por sus siglas en inglés). Los AM también se conocen como productos auxiliares, reacti-
vos auxiliares, coadyuvantes del proceso ("processing aids") y reactivos de procesos. Los AM se trataron por primera vez bajo el
sinónimo de productos colaterales en la Notificación de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Uni-
dos, "Application of Current Statutory Authorities to Human Somatic Cell Therapy Products and Gene Therapy Products" (Re-
glamentación Vigente para Productos de Terapia Celular Somática Humana y Productos de Terapia Génica) (Diario Oficial
58(197), 14 de octubre de 1993 ((Federal Register 58(197), Oct. 14, 1993) páginas 53248-53251 ). Este documento estable-
ció la autoridad de la FDApara reglamentar productos de terapia celular somática humana y productos de terapia génica. AM
también es sinónimo de "materiales de proceso" que fueron definidos en 21 CFRParte 1271, "Current Good Tissue Practice
for Manufacturers of Human Cellular and Tissue-based Products; lnspection and Enforcement; Proposed Rule (Buenas Prácticas
Vigentes para Fabricantes de Productos Tisulares y de Células Humanas; Inspección y Ejecución; Norma Propuesta" (Diario Ofi-
cial 66(5), 8 de enero de 2001 ((Federal Register 66(5), January 8, 2001) páginas 1508-1559). Los AM pueden ser análogos a
"componentes", y en algunos casos, "envases" según se describe en las reglamentaciones sobre las buenas prácticas de fabri-
cación vigentes (cGMP, por sus siglas en inglés) para productos farmacéuticos terminados según se define en 21 CFR211.80 a
211.94 y 211.l0l(b) y(c).
La propiedad que define a los AM es que no están destinados a estar presentes en el producto final. Son materiales que se
usan como ayuda en el procesamiento y la purificación o agentes que ejercen su efecto sobre la sustancia terapéutica. Los ma-
teriales o componentes destinados a estar en la forma farmacéutica del producto final (por ejemplo, materiales genéticos, so-
portes biopoliméricos, soluciones amortiguadoras fisiológicas) no son AM. Los bancos de células y los bancos de virus tampoco
se consideran AM; hay una serie de guías que describen los requisitos para su certificación. Sin embargo, los virus "auxiliares" y
plásmidos "auxiliares" se pueden considerar AM cuando no están destinados a formar parte del producto final.
La calidad de un AM puede afectar la estabilidad, seguridad, potencia y pureza de un producto celular, génico o de ingenie-
ría tisular. Por ejemplo, se puede desconocer el mecanismo mediante el cual un AM ejerce su efecto y puede no comprenderse
el impacto que tiene la variación normal de un AM sobre la calidad y seguridad del producto terapéutico. Otra posibilidad es
que los AM de origen humano o animal podrían presentar un riesgo de transmisión de una enfermedad infecciosa. Otros AM,
si se administran a seres humanos, pueden provocar una reacción inmunitaria. Finalmente, un AM con propiedades tóxicas
que se introduzca en un proceso de fabricación y no se elimine de manera satisfactoria en pasos subsiguientes del proceso,
expondrá al paciente a una sustancia tóxica y puede alterar la eficacia de la entidad terapéutica. Estos riesgos que afectan la
calidad y seguridad del producto terapéutico frecuentemente aumentan en el caso de productos celulares, génicos y de inge-
niería tisular, como consecuencia de la capacidad limitada de llevar a cabo pruebas exhaustivas en proceso y de liberación. Por
ejemplo, la falta de pasos de retención en proceso o vida útil limitada pueden crear la necesidad de administrar los productos
celulares, génicos o de ingeniería tisular antes de obtener los resultados de las pruebas en proceso o de liberación finales. En
otros casos, la escasez de tejido donante adecuado o la compleja logística en el transporte de materiales biológicos puede limi-
tar la cantidad de material disponible para efectuar pruebas. Para minimizar estos riesgos, cuando sea posible hay que imple-
mentar rigurosos procedimientos de calificación de los materiales y aplicar con prudencia controles del proceso de fabricación.
Con frecuencia, estos nuevos productos terapéuticos se crean utilizando procesos biológicos complicados. Los AM emplea-
dos en estos procedimientos se pueden seleccionar principalmente por sus contribuciones funcionales o efectos biológicos es-
peciales. Cuando sea posible, es preferible que los AM sean productos terapéuticos aprobados o autorizados porque están bien
caracterizados, poseen un perfil toxicológico establecido y están fabricados según procedimientos controlados y documenta-
dos. Por otra parte, el AM puede estar destinado al "uso en investigación" y por lo tanto puede carecer del nivel de calificación
necesario para su uso en la producción de un producto terapéutico. En cada caso, el fabricante del producto celular, génico o
USP42 Información General/ (1043) Materiales Auxiliares 7455
de ingeniería tisular debe elaborar protocolos de calificación amplios y científicamente válidos para garantizar la rastreabilidad,
consistencia, aptitud, pureza y seguridad del AM. En los casos en que los AM sean productos aprobados para su uso con fines
terapéuticos, el nivel de calificación probablemente sea menos amplio que el de un material destinado a fines de investigación.
No obstante, aún es necesario determinar su aptitud en el proceso de fabricación cuando el AM se utiliza de forma distinta al
uso previsto o a lo indicado en el etiquetado. El propósito de este capítulo es ofrecer una guía para elaborar programas de
calificación apropiados para AM que se empleen en la fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular.
CALIFICACIÓN DE MATERIALES AUXILIARES
La calificación es el proceso de obtener y evaluar datos para establecer el origen, la identidad, la pureza, la seguridad bioló-
gica y la aptitud general de un AM especifico. La responsabilidad de la calificación del AM recae en quien desarrolla o fabrica el
producto celular, génico o de ingeniería tisular. Esta sección resume a grandes rasgos las bases para que un fabricante pueda
establecer programas razonables y científicamente válidos para calificar los AM, aunque la amplia naturaleza de los productos
celulares, génicos y de ingeniería tisular, al igual que la de los AM empleados para producir estos productos hacen difícil reco-
mendar pruebas o protocolos específicos para un programa de calificación. La documentación completa y rigurosa es la piedra
angular de cualquier programa de calificación.
Un programa de calificación bien diseñado se torna más amplio a medida que progresa el desarrollo del producto. En las
primeras etapas de desarrollo del producto, el enfoque principal es respecto a la seguridad. En las etapas posteriores, se deben
desarrollar actividades de producción y calificación del AM en forma amplia para respaldar la consiguiente concesión de la li-
cencia del producto celular, génico o de ingeniería tisular. En algunas ocasiones, es posible que no hayan proveedores de sus-
tancias complejas o únicas que han demostrado ser esenciales para el control del proceso o la producción y que las producen
de conformidad con las cGMP. En estas situaciones, el fabricante debe elaborar una estrategia científicamente válida para la
calificación. Un programa de calificación para los AM que se utilicen en la fabricación de productos celulares, génicos y de
ingeniería tisular debe cubrir los siguientes aspectos: (1) identificación, (2) selección y aptitud para usarlos en la fabricación, (3)
caracterización, (4) calificación del proveedor y (5) control y garantía de calidad.
Identificación
El primer paso de cualquier programa de calificación es listar todos los AM que se emplean en la fabricación de un producto
determinado e indicar en qué parte del proceso de fabricación se van a utilizar. Se debe establecer el origen y el uso previsto
de cada material y se debe determinar la cantidad o concentración necesaria de cada material. Además se deben identificar
fuentes alternativas de cada material.
Selección y Aptitud para el Uso
Quienes desarrollan productos celulares, génicos y de ingeniería tisular deben establecer y documentar los criterios de selec-
ción de AM y los criterios de calificación para cada proveedor al principio de la fase de diseño del desarrollo del producto. Los
criterios de selección deben incluir evaluaciones de pureza microbiológica y química, identidad y actividad biológica pertinen-
tes al proceso de fabricación específico. Es importante abordar estos temas al principio del desarrollo del producto porque la
calificación de ciertos AM, que inicialmente pueden ser considerados necesarios, puede ser imposible o demasiado costosa,
justificando de este modo la investigación de productos alternativos o sustitutos. Entre los ejemplos se encuentran algunos ma-
teriales de origen animal o humano que en algunos casos tienen fuentes alternativas (como por ejemplo, de origen vegetal o
por síntesis química).
Los AM de origen animal o humano se deben seleccionar cuidadosamente debido a los posibles riesgos de enfermedades
infecciosas o zoonóticas asociadas a estos materiales. Hay que seleccionar proveedores que puedan proporcionar documenta-
ción sobre el país de donde provienen los AM de origen animal para responder a las inquietudes respecto a la encefalopatía
espongiforme bovina y otras enfermedades de interés agrícola, como tuberculosis y brucelosis. En muchos casos, se debe do-
cumentar la cadena de custodia de los AM de origen animal (es decir, matadero ➔ centro de procesamiento intermedio ➔
centro de procesamiento final). Los proveedores de AM de origen humano deben poder proporcionar documentación respec-
to a la rastreabilidad del material. Por ejemplo, los AM obtenidos de plasma humano deben provenir de establecimientos auto-
rizados que controlen el conjunto de donantes y examinen a los donantes individuales para verificar que no padezcan enfer-
medades infecciosas humanas importantes. En algunos casos, los proveedores de AM de origen animal y humano suministran
diferentes categorías de materiales, siendo algunas más adecuadas para usar en la fabricación de productos celulares, génicos y
de ingeniería tisular que otras categorías. Por ejemplo, se puede obtener FBSque haya sido procesado para reducir el riesgo de
contaminación viral bovina sometiéndolo a procesos validados de irradiación y nanofiltración. Además, muchos componentes
obtenidos de animales y de plasma humano se someten a tratamientos químicos (tratamiento con detergentes o disolventes) o
físicos (exposición al calor durante períodos prolongados) que, mediante exhaustivos estudios de validación, han demostrado
reducir significativamente el riesgo de contaminación microbiana o viral adventicia asociada a los AM iniciales. Se prefiere utili-
zar dichos AM en procesos de fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular porque reducen significativa-
mente los riesgos asociados al material original.
Se puede reducir la complejidad de la evaluación del riesgo mediante el empleo de uno de varios métodos cuantitativos o
semicuantitativos, como el análisis de los efectos en modo de falla (FMEA,por sus siglas en inglés), el despliegue de la función
de calidad (QFD, por sus siglas en inglés), o el análisis de riesgos y punto crítico de control {HACCP,por sus siglas en inglés).
Estos programas generalmente asignan un valor puntual a cada parámetro de riesgo de un AM, que da como resultado punta-
jes acumulativos que facilitan darle prioridad al esfuerzo y los recursos para disminuir los riesgos asociados a los AM. Por ejem-
plo, un AM que tenga un fuerte perfil de seguridad y se utilice en cantidades mínimas en los pasos iniciales del proceso de
fabricación y se lave minuciosamente para eliminarlo del sistema acumula un puntaje bajo. Por el contrario, un AM que se sepa
que es tóxico y se emplee en las etapas finales del proceso presenta más posibilidades de aparecer como residuo en el produc-
to final y se le debe asignar un puntaje más alto. También se pueden asignar puntos según la clasificación del riesgo (ver Clasi-
ficacióndel Riesgo).
Caracterización
Es necesario desarrollar o adoptar e implementar pruebas específicas de caracterización de control de calidad para cada AM.
El conjunto de pruebas para cada AM debe evaluar diversos atributos de calidad, entre los que se incluyen la identidad, pure-
za, funcionalidad y ausencia de contaminación microbiana o viral. El nivel de prueba apropiado para cada AM proviene de su
perfil de evaluación de riesgos y del conocimiento obtenido durante el desarrollo. Se deben establecer especificaciones de
prueba para cada AM, para asegurar la uniformidad y el funcionamiento del proceso de fabricación. Los criterios de aceptación
se deben establecer y justificar sobre la base de datos obtenidos a partir de lotes utilizados en estudios preclínicos y estudios
clínicos iniciales, de lotes empleados para demostrar la uniformidad de la fabricación y de datos pertinentes del desarrollo, co-
mo los que surgen del desarrollo de procedimientos analíticos y estudios de estabilidad.
Algunos AM de naturaleza biológica pueden ser difíciles de caracterizar totalmente. Como estos materiales ejercen su in-
fluencia a través de acciones biológicas complejas y las pruebas bioquímicas pueden no predecir el desempeño de los AM en el
proceso, puede ser necesario realizar pruebas funcionales o de desempeño. La variabilidad en el desempeño de dichos mate-
riales puede tener un efecto perjudicial sobre la potencia y la uniformidad del producto terapéutico final. Algunos ejemplos de
pruebas complejas de funcionalidad de los AM son las pruebas de promoción del crecimiento de lotes individuales de FBSen la
línea celular utilizada en la fabricación, pruebas de desempeño de preparaciones de enzimas digestivas y valoraciones in vitro
de citotoxicidad en cultivo de tejidos (ver aspectos de Pruebasde Desempeño).
Calificación del Proveedor
Se debe calificar a los proveedores de AM lo antes posible. Una auditoría temprana de las instalaciones de fabricación del
proveedor, incluyendo sus GMP y su programa de prueba de AM, son elementos básicos de un programa de calificación de un
proveedor. Para poder considerar confiable a un proveedor es esencial revisar los procedimientos de procesamiento y del pro-
grama de documentación del proveedor. Además, los proveedores certificados por medio de un programa de inspección ISO o
auditados por otros organismos gubernamentales suelen contar con sistemas de calidad robustos. Los informes de auditorías
anteriores de proveedores de EE.UU.obtenidos a través de la Ley de Libertad de Información (FOI, por sus siglas en inglés)
pueden mejorar el proceso de calificación.
Es importante establecer una buena relación de trabajo con un proveedor. En algunos casos, el proveedor puede ofrecer nor-
mas de fabricación más exigentes, servicios de formulación de acuerdo a las especificaciones del cliente o sustitución de com-
ponentes de calidad inferior previa solicitud, con o sin costos adicionales. Una buena relación es esencial si se justifica una in-
vestigación más extensa de proveedores de AM. Además es crítico asegurar que el proveedor tome las medidas correspondien-
tes para evitar la contaminación cruzada entre sus productos durante la fabricación. Los proveedores deben estar familiarizados
con los principios de validación, especialmente la validación de limpieza, al igual que la validación de inactivación viral y la
validación de esterilización. Finalmente, se deben establecer sistemas para que los proveedores suministren a los clientes certifi-
cación por escrito de cambios de procesamiento o de origen, mucho antes de la puesta en práctica de los cambios, de modo
que los clientes puedan evaluar sus consecuencias posibles.
Control de Calidad y Garantía de Calidad

Como los componentes del programa de calificación tienen varios aspectos y deben cumplir con las cGMP, deben ser con-
trolados por una unidad de garantía de calidad y control de calidad (QAU, por sus siglas en inglés). Las acciones típicas de
QAU comprenden los siguientes sistemas o programas: (1) recepción de entrada, separación, inspección y liberación de mate-
riales antes de su uso en la fabricación, (2) auditoría y certificación del proveedor, (3) pruebas de verificación del certificado de
análisis, (4) políticas y procedimientos formales para materiales que no cumplen con las especificaciones, (5) prueba de estabi-
lidad y (6) almacenamiento de muestras de archivo.
USP42 InformaciónGeneral/ (1043) Materiales Auxiliares 7457
CLASIFICACIÓN
DELRIESGO
Se debe crear un programa de calificación racional y científicamente válido para cada AM, que tome en cuenta su origen y
los procesos empleados en su fabricación. Cuando estén disponibles, se prefieren los AM que sean productos terapéuticos
aprobados o autorizados porque están bien caracterizados con un perfil toxicológico probado y están fabricados según proce-
dimientos controlados y documentados. Los productos biológicos autorizados, fármacos aprobados y dispositivos médicos o
materiales implantables aprobados o autorizados que han sido incorporados en procesos de fabricación de productos celula-
res, génicos o de ingeniería tisular presentan un perfil de seguridad conocido o más favorable para el paciente que las versio-
nes no aprobadas o no autorizadas. Los programas de calificación para estos AM deben reflejar la inspección amplia y minucio-
sa de estos artículos durante su desarrollo y fabricación. En consecuencia, se debe poner mayor énfasis en la investigación del
impacto de la variabilidad inherente de estos AM sobre la función del producto final. Por ejemplo, un fabricante puede utilizar
seroalbúmina humana, destinada a ser administrada a seres humanos, como suplemento para un medio de cultivo celular para
un producto celular. Debido a que el producto celular se comercializa como un producto biológico autorizado, no es necesario
repetir todas las pruebas realizadas por el proveedor como parte de la calificación del material. Por otra parte, el efecto de la
variabilidad de un lote a otro sobre la velocidad de crecimiento celular o el mantenimiento de una propiedad celular diferen-
ciada puede ser una área de investigación aconsejable. Como alternativa, la estabilidad de este material a la concentración em-
pleada en el procesamiento o su potencial de interacción con otros componentes del proceso, también pueden ser áreas que
vale la pena investigar. En consecuencia, estos criterios respecto a la calificación de AM se concentran en los AM como una
fuente potencial de variabilidad que puede influir en la potencia y seguridad del producto final. Los programas de calificación
para estos AM deben ser amplios para minimizar el riesgo al consumidor y garantizar la detección de lotes inaceptables o adul-
terados.
El programa de calificación también debe tener en cuenta la cantidad de AM empleado en la fabricación, al igual que su
punto de introducción en el proceso de fabricación. Un ejemplo pertinente es el uso de FBScomo suplemento de un medio de
cultivo de tejidos empleado para aumentar una población de células madre de un tejido específico para su eventual adminis-
tración a un paciente (ver PerspectivaGeneralde la Fabricaciónen ProductosDerivadosde Célulasy Tejidos(1 046)). Un programa
de calificación para tal AM debe incluir (a) la garantía de que el suero proviene de un país o región que esté libre de encefalo-
patía espongiforme bovina (BSE,por sus siglas en inglés); (b) la garantía de que el ganado de origen se controla y que los
resultados de las pruebas de detección de enfermedades importantes en el correspondiente entorno agrícola son negativos
(por ejemplo, tuberculosis, brucelosis, fiebre aftosa); (c) el análisis del suero para verificar su esterilidad, detectar micoplasma,
contenido de endotoxinas y virus adventicios bovinos vinculados a este material; 1 (d) la revisión y archivo del certificado de
análisis del fabricante; (e) la evaluación entre lotes de la aptitud del suero para aumentar de manera uniforme una población
celular representativa utilizando una valoración de control de calidad estandarizada para el cultivo de células; y (f) la auditoría
del proveedor en su establecimiento para asegurar que la proveniencia y el procesamiento del material sean aceptables según
una unidad QA responsable.
Para ayudar a los fabricantes y a aquellos que desarrollan el producto en el diseño de sus programas de calificación para una
variedad de AM, en las Tablas1-4 se presentan niveles de categorías de riesgo de muestra, que se proporcionan como una
guía. El riesgo también depende de la cantidad y la etapa en la que se usa el AM en el proceso de fabricación. Las Tablas 1-4
no consideran el efecto de la cantidad ni la etapa de uso.
Nivel 1
Estos AM presentan un riesgo bajo; son materiales altamente calificados muy adecuados para usar en la fabricación. El AM es
un producto biológico, un fármaco aprobado, un dispositivo médico aprobado o autorizado o está destinado al uso como ma-
terial biológico implantable. En general, estos componentes o materiales se obtienen como un sistema de envase estéril o for-
ma farmacéutica para el uso que se indica en su etiqueta, pero en vez de esto se emplean para un uso "no indicado en la
etiqueta" en el proceso de fabricación del producto celular, génico o de ingeniería tisular.
Nivel2
Estos AM presentan un riesgo bajo; son materiales bien caracterizados y muy adecuados para usar en la fabricación. Están
destinados para usarse en la fabricación de fármacos, productos biológicos o dispositivos médicos, incluyendo los productos
celulares, génicos y de ingeniería tisular como AM, y se producen con las cGMP pertinentes. La mayoría de materiales de ori-
gen animal están excluidos de esta categoría.
1 La mayoría de los proveedores realizan

pruebas para detectar agentes adventiciosde conformidad con 9 CFR113, establecido por el Centro de Productos Bioló-
gicos Veterinarios,Serviciode InspecciónSanitariaAnimaly Vegetal(Center for VeterinaryBiologics,Animaland Plant Health lnspection Service)del Departamento
de Agriculturade EstadosUnidos. Estaspruebas pueden diferirde las utilizadaspara analizarproductos desarrolladospara uso humano (por ejemplo, micoplasma).
Nivel 3
Estos AM son materiales que presentan un riesgo moderado y que requieren un nivel más alto de calificación que los ante-
riores. Frecuentemente, se producen para uso diagnóstico in vitro y no están destinados a la producción de productos celula-
res, génicos o de ingeniería tisular. En algunos casos, puede ser necesario mejorar los procesos de fabricación del AM para em-
plearlo en la fabricación de estos productos (por ejemplo, modificación del proceso de producción de un anticuerpo monoclo-
nal de grado diagnóstico para incluir pasos robustos de eliminación de virus en la purificación).
Nivel4
Este es el mayor nivel de riesgo de AM. Es necesario efectuar una exhaustiva calificación antes de emplearlos en la fabrica-
ción. El material no se produce de conformidad con las cGMP. Los AM no están destinados para la producción de productos
celulares, génicos o de ingeniería tisular. Este nivel de riesgo comprende sustancias tóxicas con mecanismos biológicos de ac-
ción conocida y también incluye materiales líquidos más complejos, de origen animal, que no se someten a procedimientos de
eliminación o inactivación de virus adventicios. Estos materiales pueden requerir (a) un mejoramiento de los procesos de fabri-
cación del AM; (b) tratamiento del AM para inactivar o eliminar agentes adventicios, sustancias causantes de enfermedades o
contaminantes específicos (por ejemplo, priones, virus animales); (c) análisis de cada lote de material para asegurar la ausencia
de agentes adventicios, sustancias causantes de enfermedades o contaminantes específicos; (d) validación del proceso de fabri-
cación del producto celular, génico o de ingeniería tisular para evaluar la uniformidad en la eliminación de una sustancia tóxica
conocida o pruebas de liberación de lote capaces de demostrar niveles de reducción seguros; o (e) validación del proceso de
fabricación del producto celular, génico o de ingeniería tisular para evaluar la uniformidad en la eliminación o inactivación de
agentes adventicios, sustancias causantes de enfermedades o contaminantes específicos asociados al material. Los encargados
de desarrollar el producto deben evaluar en las etapas iniciales de desarrollo la necesidad de estos materiales e investigar sus-
tancias o fuentes alternativas.
Tabla 1. Riesgo del AM Nlvel 1
Materiales de Riesgo Bajo, Altamente Callflcados, Destinados a Usarse como Fármaco Terapéutico o Producto Blológlco,
D1spos llv
t o Médlcoo Mate rla 11mpanta
1 ble
Uso Común en la Fabricación de
Productos Celulares, Génicos Acciones de
Elemplo y de Ingeniería Tlsular Callflcaclón o Reducción del Rlesqo
Insulinarecombinante para inyección Aditivopara medio de cultivo de células Referenciacruzada del DMF(cuando sea
posible o práctico)
Líquidoconservador de órganos Líquidobiológico de proceso empleado en el
transporte o procesamiento de tejidos Certificadode análisis
Seroalbúmina humana para inyección Medio de cultivo de células Evaluarel efecto de un lote a otro sobre el
funcionamiento del proceso1
Líquidosestériles para inyección Líquidobiológico de proceso empleado en trans-
porte de tejidos, procesamiento de células, purifi- Evaluarla eliminaciónen el producto final
cación
Materialesbiológicosimplantables (estructuras de Armazones,matrices para cultivo de células inmo-
colágeno formado, silicona,poliuretano destina- Evaluarla estabilidad del AMmientras se al-
vilizadas 2
macena antes de usar en la fabricación
das a implantación quirúrgica)
Desoxirribonucleasarecombinante para inhalación Enzimade proceso empleada en la fabricación de
o inyección vectores virales, procesamiento de células madre
Antibióticospara inyección' Aditivode líquido de transporte de medio de culti-
vo celulary biopsia para reducir el riesgo de con-
taminación bacteriana
Anticuerposmonoclonales inyectables Accióninmunológica dirigida a poblaciones celula-
res específicaspara su selección o eliminación
Citocinasinyectables Medio de cultivo de células
Vitaminaspara inyección;nutrientes, sustancias Aditivode medio de cultivo de células empleado
químicas o excipientes definidos para inyección en la expansión de células, la diferenciacióncelu-
lar controlada y pasos de activación o fabricación
de un vector viral
BolsasIV,tuberías y equipos de transferencia, bol- Sistemasde cierre de recipientes de almacena-
sas para crioconservación,jeringas, agujas miento, sistemas cerrados de transferencia asépti-
ca
1 VerPruebasde Desempeño.
2 A menudo losAM se conservanen alícuotaso se almacenanen diferentesconcentraciones,
en distintassolucionesamortiguadoraso bajo condicionesdiferen-
tes a las establecidasen la etiquetao validadaspreviamente.Hayque generardatos que demuestrenla estabilidady conservaciónde la actividaddel AMen las
condicionesque seanespecíficas
a su usoen la fabricación.
3
No se deben usar antibióticosbeta lactámicoscomo AM,debido al riesgode hipersensibilidad
del paciente.

Materiales de Riesgo Balo, Bien Caracterizados, Destinados a Usarse como AM, Produddos de Conformidad con las GMP
Uso Típico en la Fabrlcadón
de Producto Celular, Génico Acdones de Callflcaclón o
Etemplo o de lngenleria Tisular Reducdón del Riesgo
Factores de crecimiento recombinantes, citocinas 1 Aditivo de medio de cultivo de células Referencia cruzada del DMF (cuando sea
Perlas inmunomaqnéticas Separación inmunomaqnética de células Certificado de análisis
Suero humano AB Aditivo de medio de cultivo de células Evaluación del efecto de un lote a otro so-
bre el funcionamiento del proceso 2
Progesterona, estrógeno, vitaminas, sustancias quí- Aditivos de medio de cultivo de células, agentes de
micas purificadas (grado USP) Evaluación de la eliminación en el producto
inducción, componentes de soluciones amorti-
final
guadoras
Soluciones amortiguadoras para procesos estériles Líquido biológico de proceso empleado en el Evaluación de la estabilidad del AM mien-
transporte de tejidos, procesamiento de células, tras se almacena antes de usarse en la fa-
purificación bricación 3
Polímeros, armazones e hidrogeles biocompatibles Armazones, matrices para cultivo de células inmo- Cuando sea pertinente, confirmar los resul-
vilizadas tados de la prueba del certificado de análi-
sis que sean esenciales para el producto
(podría incluir la valoración funcional)
Enzimas proteolíticas Enzima de proceso Auditoría al proveedor
Medios de cultivo de tejidos Aditivo de medio de cultivo de células
Anticuerpos monoclonales Acción inmunológica dirigida a poblaciones celula-
res especificas para su selección o eliminación
Medios de qradiente de densidad Separación de células por centrifugación
1 Estos AM se deben producir a partir de fuentes recombinantes, que no sean de mamíferos (es decir, desarrollados microbiológicamente en ausencia de com-
ponentes de origen animal en los medios de cultivo).
2 Ver Pruebasde Desempeño.
3 A menudo losAM se conseivanen alícuotaso se almacenanen diferentesconcentraciones,en distintassolucionesamortiguadoraso bajo condicionesdiferen-
tes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservación o actividad del AM bajo las
condicionesque seanespecificasa su usoen la fabricación.

Materiales de Riesgo Moderado, No Destinados a Usarse como AM
(frecuentemente produddos para su uso en diagnóstico In vltro o materiales grado reactivo)
Uso Típico en la Fabricación
de Productos Celulares, Génicos o de Acdones de Callflcadón o
E¡emplo lngenleria Tisular Reducdón del Riesgo
Factores de crecimiento recombinantes, citocinas Aditivo de medio de cultivo de células Referencia cruzada del DMF (cuando sea
Certificado de análisis
Evaluación del efecto de un lote a otro so-
bre el funcionamiento del proceso 1
Evaluación de la eliminación en el producto
final
Evaluación de la estabilidad del AM mien-
tras se almacena antes de usarse en la fa-
bricación 2
Cuando sea pertinente, confirmar los resul-
tados del certificado de análisis que sean
esenciales para el producto (podría incluir
la valoración funcional)
Medios de cultivo de tejidos Aditivo de medio de cultivo de células Auditoría al proveedor
Anticuerpos monoclonales (de grado diagnóstico Acción inmunológica dirigida a poblaciones celula- Mejorar el proceso de fabricación del mate-
producidos en cultivo de células) res especificas para su selección o eliminación rial según las GMP
Soluciones amortiguadoras de proceso Líquido biológico de proceso empleado en el
transporte de tejidos, procesamiento celular, puri- Elaborar especificaciones internas estrictas
ficación
1 Ver Pruebasde Desempeño.
2
A menudo losAM se conservanen alícuotaso se almacenanen diferentesconcentraciones,en distintassolucionesamortiguadoraso bajo condicionesdiferen-
tes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservación o actividad del AM bajo las
condicionesque seanespecíficasa su uso en la fabricación.
Tabla 3. Riesgo del AM Nivel 3

Materiales de Riesgo Moderado, No Destinados a Usarse como AM
(frecuentemente d ,
producl os para su uso en dlaqnostlco In vltro o materiales grado reactivo) (Continuación)
Uso Típico en la Fabricación
de Productos Celulares, Génicos o de Acciones de Callflcaclón o
Elemplo Ingeniería Tisular Reducción del Riesgo
Nuevos polímeros, armazones, hidrogeles Armazones, matrices para cultivo de células inmo- Determinar si son necesariaslas pruebas de
vilizadas biocompatibilidad,citotoxicidad o análisis
de agentes adventicios,de un lote a otro
Enzimasproteolíticas Enzimade proceso
Sustanciasquímicas purificadas(grado reactivo) Aditivosde medio de cultivo, agentes de induc-
ción, componentes de solucionesamortiguadoras
1 VerPruebasde Desempeño.
2 A menudo losAM se conseivanen alícuotaso se almacenanen diferentesconcentraciones,
en distintassolucionesamortiguadoraso bajo condicionesdiferen-
tes a lasestablecidasen la etiqueta o validadaspreviamente.Hayque generardatos que demuestrenla estabilidady conservacióno actividaddel AMbajo las
condicionesque sean específicasa su uso en la fabricación.
Tabla 4. Riesgo del AM Nivel 4

Materiales de Alto Riesgo
Uso Típico en un Producto Celular, Génico, Acciones de Callflcaclón o
Ejemplo o de Ingeniería Tisular Reducción del Riesgo
FBS Aditivode medio de cultivo de células
Igual que en Tabla3, más
Extractosde origen animal (incluyendo humano) Aditivode medio de cultivo de células
Polímeros,armazones e hidrogeles de origen ani- Armazones,matrices para cultivo de células inmo-
mal vilizadas Verificarla rastreabilidadal país de origen
Enzimaspurificadas Enzimade proceso
Anticuerposo proteínas derivados de ascitis Accióninmunológica dirigida a poblaciones celula- Asegurarque el país de origen esté califica-
res específicaspara su seleccióno eliminación do como seguro con respecto a enferme-
Célulashumanas o animales utilizadascomo capas Sustrato de cultivo de células o fuente de compo- dades animales pertinentes a la fuente, in-
de alimentación nentes de medios cluida TSE(por sus siglasen inglés)
-~I
Entidadesquímicas con toxicidad conocida (p.ej. Agentes de selección utilizadosen cultivo de célu-
metotrexato, toxina de cólera, hemolisinaforma- las para mejorar o mantener la expresión transgé- Pruebas de análisisde agentes adventicios
dora de poros de Staphy/ococcus aureus;enteroto- nica, aumentar la proliferacióncelular, mejorar la para detectar virus pertinentes a la fuente
xinas A y B de Staphylococcus,toxina del síndrome supervivenciacelular durante la crioconservación, de origen animal
de shock tóxico) superantígenos para la activaciónde linfocitosT
PRUEBADE DESEMPEliiO
En los casos en que los AM se eligen por su capacidad para proporcionar una cierta función biológica en la elaboración del
producto terapéutico, la prueba de desempeño se torna un componente fundamental de su calificación general. Esto es parti-
cularmente cierto cuando el AM desempeña un papel crítico en la modulación de un efecto bioquímico complejo y ejerce un
gran impacto sobre el rendimiento de la fabricación del producto, su pureza o la potencia del producto final. Estos AM tienden
a ser sustancias o mezclas complejas, frecuentemente de origen biológico y pueden presentar gran variabilidad entre lotes.
Como resultado, estos AM en general no tienen una prueba de identidad simple, ni pueden ser fácilmente caracterizados por
pruebas físicas o químicas. El desarrollo de valoraciones de desempeño bien definidas para AM complejos no solo asegura la
reproducibilidad del proceso y la calidad del producto final, sino que en muchos casos también cumple con los criterios de
pruebas de identidad conforme a 21 CFR21 l .84(d).
En algunos casos, la calificación inicial de un AM para usarse en la fabricación debe ser la investigación del efecto que tiene
la cantidad del AM sobre la respuesta deseada (aumento del rendimiento, pureza o potencia del producto terapéutico). La
cantidad de AM empleada en la fabricación debe ser seleccionada para que produzca el efecto deseado de manera uniforme, a
la vez que minimice los problemas mediante la eliminación del AM en los pasos subsiguientes del procesamiento. Dicha prue-
ba a menudo evalúa el atributo funcional importante que se espera del AM en un proceso de fabricación a escala reducida o
simulado. A continuación se indican algunos ejemplos:
• Si un AM se agrega a los medios de cultivo porque favorece la proliferación celular o la secreción de un agente terapéuti-
co esencial, la valoración podría demostrar que cada lote de AM produce la velocidad o cantidad esperada de prolifera-
ción celular o el nivel esperado de agente terapéutico segregado.
• Si se usa un anticuerpo monoclonal para purificar un cierto tipo de célula, se podría demostrar que el nuevo lote de anti-
cuerpo monoclonal purifica la población celular con la recuperación y pureza esperada para el tipo de célula deseado.
• Si se usa una desoxirribonucleasa para descomponer el ADN celular, se podrían analizar los nuevos lotes para verificar la
capacidad de la desoxirribonucleasa para descomponer el ADN.
• Si se usa un tipo especial de gradiente de densidad para purificar un vector o célula, se podría demostrar que los nuevos
lotes del material utilizado para obtener el gradiente pueden purificar el vector o célula hasta un grado satisfactorio.
• Si se usa un plásmido o vector viral en la producción de un vector de terapia génica (por ejemplo, función auxiliar), se
podría demostrar que los nuevos lotes del vector auxiliar producen las cantidades esperadas del vector de terapia génica.
• Si se produce terapia celular en un biorreactor de fibra hueca, se podría demostrar que los nuevos lotes del biorreactor
producen la cantidad prevista de producto celular.
La valoración usada podría evolucionar a medida que el proceso de fabricación se desarrolla y las relaciones críticas entre el
AM y el producto final se comprendan mejor.
Debido a que la mayoría de las pruebas de desempeño producen resultados relativos, a menudo resulta útil valorar un lote
nuevo de AM conjuntamente con un lote aprobado de AM o un estándar de referencia oficial, si se dispone de alguno. La
comparación simultánea ayuda a reducir la variabilidad debida a diferentes lotes de células o vectores y ayuda a distinguir la
variabilidad asociada a los diferentes lotes de AM. Si la prueba de desempeño implica valoraciones para demostrar que el nue-
vo lote de AM no afecta el perfil de impurezas del producto terapéutico final, ya sea generando nuevas impurezas o aumentan-
do el nivel de impurezas existentes, es útil valorar ambos respecto al nivel de impurezas totales, al igual que buscar la presencia
de nuevas impurezas. Un análisis de inmunodetección en general puede evaluar solamente el nivel de impurezas totales. Por
ejemplo, un Western blot del producto de terapia génica que se investiga tanto con anticuerpos del producto como con anti-
cuerpos de proteínas de células anfitrionas, es útil para detectar nuevas especies de proteínas y aumentos significativos de los
niveles de impurezas de las células anfitrionas. Esta calificación inicial se incrementa por medio de una valoración de desempe-
ño que tiene una lectura cuantitativa con un cambio marcado en la señal cuando se introduce en la valoración un cambio
importante en la cantidad de AM (por ejemplo, respuesta de dosis). Una respuesta tipo umbral (es decir, hay dos niveles de
respuesta para el AM y la respuesta no cambia ni con cambios grandes en el AM por debajo de una dosis determinada ni por
encima de una dosis determinada) puede hacer más difícil seleccionar una concentración de AM que dé como resultado el
efecto deseado de manera uniforme y minimice los niveles residuales del AM en el producto terapéutico final.
EVALUACIÓN Y ELIMINACIÓN DEL NIVEL RESIDUAL DE MATERIALES AUXILIARES
Los AM no están destinados a estar presentes en la forma farmacéutica final en los productos celulares, génicos y de ingenie-
ría tisular. Su presencia en el producto final podría provocar efectos indeseables en la persona que los reciba o tener un efecto
perjudicial en la potencia del producto. Los efectos indeseables en seres humanos consisten en la toxicidad directa del AM o en
una respuesta inmunogénica no deseada. Algunos ejemplos incluyen lo siguiente:
• Al generar una vacuna contra un tumor utilizando una biopsia de tumor de un paciente como material inicial, se introdu-
ce una entidad química para desnaturalizar las proteínas de la superficie celular y los antígenos del tumor para aumentar
su antigenicidad. Se sabe que la entidad química es muy tóxica.
• Se pueden agregar antibióticos a una solución de transporte para células humanas para contrarrestar la contaminación
microbiana asociada con el procedimiento de obtención. Los niveles residuales del antibiótico pueden afectar la capaci-
dad de proliferación del producto celular final producido por bioingeniería. Los antibióticos residuales también pueden
provocar una respuesta anafiláctica en algunos individuos.
• El FBS,empleado en el cultivo de un injerto de piel humana realizado mediante bioingeniería, puede provocar una res-
puesta de anticuerpos humorales contra las proteínas bovinas.
• Las inmunoglobulinas aglomeradas de ratón, una traza de impureza en una preparación purificada de anticuerpo mono-
clonal de ratón dirigido contra una población celular para inmunoselección, pueden ser inmunógenas.
• Una citocina empleada como inmunomodulador en la creación de una vacuna autóloga contra tumores producida por
modificación génica, puede provocar una reacción grave en el receptor.
• La toxina del cólera, empleada como parte de un medio de cultivo celular para un producto de terapia celular destinado a
la administración intravenosa, resultará sumamente tóxica para el receptor si no se elimina durante el procesamiento.
Estos riesgos se pueden mitigar si se diseñan procesos que incluyen pasos de eliminación satisfactoria del AM, mediante dilu-
ción, separación o inactivación, y se desarrollan valoraciones de detección analítica para evaluar los niveles de AM durante el
procesamiento y en el producto terapéutico final. Las estrategias de evaluación y eliminación de AM residuales se deben consi-
derar en las fases iniciales del desarrollo del proceso. Hay dos métodos diferentes para evaluar los niveles de AM residual en el
producto terapéutico final: (1) Los estudios de validación pueden demostrar que el proceso es capaz de eliminar más del AM
de lo que estaría presente en el peor caso hipotético. (2) Los niveles residuales de un AM se pueden medir en cada lote en un
paso apropiado durante el proceso de fabricación.
La validación de un AM con frecuencia se realiza mejor agregando al producto impuro con el "peor caso" o niveles superio-
res de AM y demostrando que el proceso de purificación es capaz de eliminar el AM hasta "niveles no detectables". De este
modo se pueden generar factores de depuración para cada paso de purificación de manera análoga a la realizada en estudios
de depuración viral. Al diseñar los estudios de validación se deben incluir los tres factores siguientes: (1) La valoración debe ser
capaz de cuantificar con exactitud el AM en cada matriz de muestra. (2) Si la validación se lleva a cabo a una escala menor que
la utilizada en la producción de lotes de rutina, es necesario demostrar la comparabilidad entre este proceso en pequeña escala
y el proceso completo. En general esto significa que el proceso en pequeña escala se realiza con los mismos parámetros críticos
que el proceso completo y que el producto generado en cada paso tiene una pureza y rendimiento similares. (3) Igual que con
cualquier tipo de estudio con muestras adicionadas, se debe demostrar que el nivel adicional más alto de AM no ha afectado el
proceso de purificación. Si se emplea el segundo método de medición de niveles residuales de AM en cada lote, la especifica-
ción de la cantidad máxima de AM en el producto terapéutico final se basa en la cantidad de AM en los lotes utilizados en
estudios toxicológicos o clínicos o en datos toxicológicos conocidos.
El desarrollo de valoraciones analíticas sensibles y reproducibles para AM es otro componente importante de un método de
reducción del riesgo. Dos tipos de valoraciones son útiles en la evaluación de los niveles de impurezas residuales de AM: una
prueba límite y una prueba cuantitativa. Ambas pruebas deben ser exactas, precisas, robustas y tener un límite de detección
bajo. Se pueden llevar a cabo valoraciones para detectar AM residuales en el producto antes de formularlo (por ejemplo, en el
fármaco) para evitar cualquier tipo de interferencia de los componentes empleados en la formulación con la valoración de AM
residuales o en el producto farmacéutico final. En dichas valoraciones a menudo se incluyen controles de recuperación de can-
tidades agregadas conocidas para demostrar que la matriz de muestra no inhibe la detección del AM. Preferentemente, las
valoraciones se deben diseñar para que detecten todas las formas de AM, entre las que se incluyen aglomerados, fragmentos o
conjugados. Se ha demostrado que las proteínas aglomeradas son especialmente inmunógenas.
Las valoraciones inmunológicas como ELISAson las más comúnmente usadas para evaluar niveles residuales de AM. Se ha
empleado un ELISApara seroalbúmina bovina (BSA)para evaluar niveles residuales de FBS.La tecnología de reacción en cade-
na de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), se ha utilizado para evaluar los niveles residuales de ADN de células anfitrio-
nas. El marcado de células con 3H timidina o la ejecución de PCR para una secuencia génica específica de células de soporte
son dos maneras de evaluar los niveles residuales de células de soporte. Si el "lavado" del AM se logra mediante una minuciosa
dilución asociada a otras acciones de procesamiento, puede resultar útil calcular el factor de dilución para el AM durante este
proceso. En algunos casos, es suficiente asegurar que el AM se redujo a niveles seguros para el desarrollo clínico inicial. Duran-
te el desarrollo clínico posterior se deben obtener datos que permitan confirmar la eliminación por lavado del AM en los pasos
esperados. Este método es particularmente útil cuando ya se conocen los niveles terapéuticos y la toxicidad del AM. En otros
casos, se debe obtener información sobre la seguridad y tolerancia del AM (en estudios preclínicos de toxicología o posterior-
mente con estudios clínicos en seres humanos) para determinar los niveles seguros o no tóxicos que se deben lograr. Estos
datos pueden ser necesarios incluso para un AM que esté aprobado para usar con fines terapéuticos si se va a utilizar de una
forma diferente a la que establece su uso indicado o su etiquetado o si la vía de administración o nivel de dosificación del AM
puede presentar riesgos que previamente no se han encontrado o considerado.
CONCLUSIÓN
Si bien se emplean muchos tipos de AM durante la fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular, se les
ha dado menos importancia que a los productos finales. Sin embargo, no se puede exagerar la importancia de la calidad del
AM para la calidad del producto final. Las diferentes partidas de AM de buena calidad deben cumplir uniformemente con las
características de desempeño indicadas, si se seleccionan cuidadosamente y se usan como corresponde. Los AM de calidad
insuficiente afectan la calidad y la eficacia del producto final y ponen en peligro la salud de los pacientes. En consecuencia, la
implementación de un programa de calificación de AM que considere los riesgos asociados al AM, la etapa de fabricación en la
que se use y la cantidad de AM utilizado durante la fabricación, asegurará la seguridad y eficacia del producto final.
APÉNDICE
Los AM utilizados en productos celulares, génicos y de ingeniería tisular se regularán en el contexto del proceso de fabrica-
ción de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular. Algunos AM pueden ya estar aprobados para usos diferentes a la
fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular. Se prefiere obtener AMque sean productos terapéuticos
aprobados cuando estén disponibles porque están bien caracterizados con un perfil toxicológico establecido y fabricados se-
gún procedimientos controlados y documentados. La siguiente lista de documentos ofrece una guía normativa pertinente y
una descripción de las mejores prácticas en el desarrollo de productos y procesos, fabricación, control de calidad y garantía de
calidad:
• Pruebasde ReactividadBiológica,In Vitro (87)
• Pruebasde ReactividadBiológica,In Vivo(88)
• ProductosDerivadosde Célulasy Tejidos(1 046)
• ArtículosObtenidospor Biotecnología-Análisisde Aminoácidos(1052)
• Electroforesis
Capilar(l 053)
• ArtículosObtenidospor Biotecnología-lsoelectroenfoque(1054)
• ArtículosObtenidospor Biotecnología-Mapeo de Péptidos(1055)
• ArtículosObtenidospor Biotecnología-Electroforesisen Gel de Poliacrilamida(1056)
• ArtículosObtenidospor Biotecnología-Valoraciónde ProteínasTotales(1057)
• 21 CFR211 Subparte E, 211.80 a 211.94 y 211.101
• 21 CFR 312
• 21 CFR 314
• 21 CFR801.109 (b )(1)
• 21 CFR807.81 a 21 CFR807.97
• 21 CFR812
•21 CFR814
USP42 Información General/ (1044) Crioconservación de Células 7463
• Center for Biologics Evaluation and Research de la FDA(CBER)"Draft Guidance for Monoclonal Antibodies Used as Rea-
gents in Drug Manufacturing" (1999)
• Center for Biologics Evaluation and Research de la FDA(CBER)"Points to Consider in the Characterization of Cell Unes
Used to Produce Biologicals" (1993)
• Center for Devices and Radiological Health de la FDA(CDRH) "Class II Special Controls Guidance Document: Tissue Cultu-
re Media for Human ex vivo Tissue and Cell Culture Processing Applications; Final Guidance for lndustry and FDARevie-
wers" (1 6 de mayo de 2001)
• CDRH Blue Book Memorandum C95-1
• ISO 10993-1: 1997 Evaluación Biológica de Dispositivos Médicos-Parte 1: Evaluación y Análisis "Biological Evaluation of
Medical Devices-Part 1: Evaluation and Testing"
• Conferencia Internacional de Armonización (ICH, por sus siglas en inglés) QSA "Guidance for Viral Safety Evaluation of
Biotechnology Products Derived from Cell Unes of Human and Animal Origin"
• Conferencia Internacional de Armonización (ICH) QSD "Guidance on Quality of Biotechnological/Biological Products: De-
rivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products"
• Public Health Service Guideline on lnfectious Diseases lssues in Xenotransplantation (18 de octubre de 2000)
(1044) CRIOCONSERVACIÓN
DE CÉLULAS
INTRODUCCIÓN
La crioconservación es el proceso de enfriar y almacenar células, tejidos u órganos a temperaturas muy bajas para mantener
su viabilidad. El propósito de la crioconservación es almacenar células por largos periodos para permitir su uso futuro en aplica-
ciones in vitro o in vivo, procurando que luego de la descongelación su función sea suficientemente representativa de la fun-
ción previa a la congelación de las células. La crioconservación también minimiza los riesgos de mutación genética o desarrollo
de subpoblaciones debidos a la replicación celular. Dependiendo de la aplicación, luego de la crioconservación se debe realizar
una suficiente evaluación de la capacidad de división, proliferación, diferenciación, expresión de genes o producción de proteí-
nas u otra propiedad funcional específica.
Este capítulo presenta las mejores prácticas para la crioconservación, el mantenimiento y el uso de un amplio rango de célu-
las, productos de terapia celular y bancos de células derivadas de una variedad de fuentes, incluyendo cultivos humanos, ani-
males y microbianos (el capítulo también contiene un Apéndicecon documentos de guía adicionales que son útiles para tipos
de células y aplicaciones particulares). Las células crioconservadas proveen una fuente disponible de células viables que se pue-
den usar, directa o indirectamente, para los propósitos de pruebas de diagnóstico, terapia, fabricación de medicamentos y va-
cunas, y para valoraciones biológicas que se usan para evaluar la potencia de fármacos y vacunas terapéuticos. En algunos ca-
sos, las células mismas, después de la crioconservación y la descongelación, constituyen una terapia para pacientes y, en otros
casos, las células se propagan o manipulan de otra manera ex vivo para generar el producto (p. ej., una terapia celular de
expansión de cultivo, una proteína terapéutica, un anticuerpo monoclonal o una vacuna). En todos los casos, la crioconserva-
ción apropiada es esencial para conservar las propiedades celulares requeridas y, como objetivo final, para su aplicación en pro
del avance de las terapias para pacientes.
PRINCIPIOSDE LA CRIOCONSERVACIÓN
Consideraciones Generales
Es crítico entender el papel del agua y la necesidad de eliminarla adecuadamente de las células o anular su capacidad para
formar cristales de hielo, los cuales dañan la membrana celular, para lograr una crioconservación exitosa. Cuando las células se
congelan en suspensión acuosa, a menudo son destruidas. No obstante, en la década de 1940, Polge y otros científicos descu-
brieron las propiedades crioprotectoras del glicerol. Desde entonces, se han identificado diversos químicos que se denominan
genéricamente agentescrioprotectores. El mecanismo de acción de los agentes crioprotectores es complejo y no se ha podido
entender en su totalidad. Sin embargo, de acuerdo con la teoría comúnmente aceptada de la acción coligativa,los agentes
crioprotectores incrementan la concentración de soluto tanto dentro como fuera de la célula, con lo que se suprime la forma-
ción de hielo. Para este propósito, los denominados agentes crioprotectores de penetración (o intracelulares) [p. ej., dimetilsul-
fóxido (DMSO), glicerol, propanodiol y metanol] deben ser capaces de cruzar la membrana celular con facilidad y penetrar la
célula sin presentar una toxicidad significativa. Existe también un grupo de agentes crioprotectores no penetrantes (o extrace-
lulares) (p. ej., sacarosa y trehalosa) cuyo mecanismo de acción parece estar relacionado, al menos en parte, con su interacción
estabilizante con las membranas celulares. Esta propiedad también puede explicar las actividades crioprotectoras de algunos
compuestos de alto peso molecular tales como almidón hidroxietílico y polivinilpropileno. Los modelos teóricos de crioprotec-
7464 (1044) Crioconservación de Células/ Información General USP42
ción por lo general evocan la teoría coligativa, pero aún no se ha establecido una explicación completa de la acción de los
agentes crioprotectores.
Una forma alternativa de conservación celular, comúnmente denominada vitrificación,mediante la cual la suspensión de cé-
lulas se carga de altos niveles de agentes crioprotectores de penetración (a menudo varios agentes combinados), induce un
estado similar al vítreo en el que el agua celular y extracelular no puede formar cristales de hielo con facilidad. Cuando las
suspensiones de células preparadas de esta manera se enfrían posteriormente con mucha rapidez (velocidades de enfriamiento
de 100º-1 000º /minuto o superiores) la viscosidad extrema evita la ósmosis y las moléculas de agua son incapaces de formar
hielo. Este procedimiento se ha usado ampliamente para estructuras complejas, incluyendo una variedad de tejidos humanos,
vegetales y animales, y puede ayudar a conservar aquellas preparaciones celulares con grados variables de permeabilidad celu-
lar o cuando la crioprotección estándar no es capaz de entregar el rango de condiciones requerido para conservar la viabilidad
en todos los tipos de células que componen los tejidos.
Los agentes crioprotectores tienen actividades biológicas que van más allá de sus propiedades crioprotectoras. Algunos
agentes, como el DMSO, pueden afectar la membrana celular, el citoesqueleto y la expresión genética, y pueden ser tóxicos
para las células después de una exposición prolongada. Por lo tanto, durante el desarrollo de nuevos protocolos de crioconser-
vación, los analistas deben realizar un ensayo de toxicidad en el que las células se expongan al agente crioprotector durante un
rango de intervalos de tiempo para evaluar la pérdida de viabilidad o la alteración de su funcionalidad.
Elementos Clave de la Práctica de Crioconservación
El desarrollo del método para cualquier muestra celular o producto terapéutico que se va a crioconservar debe tratar los si-
guientes elementos:
PROCESAMIENTO
Y CARACTERIZACIÓN
PREVIOSA LACONGELACIÓN
Es crítico optimizar la condición de las células inmediatamente antes de la crioconservación para lograr un resultado exitoso.
El carácter y el grado del procesamiento previo a la congelación depende del estado de las células originales extraídas para su
conservación, de la composición de la suspensión de células y de las etapas de procesamiento específicas que llevan a la crio-
conservación. El procesamiento previo a la congelación puede incluir la selección de subpoblaciones, la expansión ex vivo o la
incubación con factores de activación o cebado.
Se deben establecer las características previas a la crioconservación y la identidad de las células durante las etapas tempranas
del desarrollo del proceso. Particularmente para los bancos de células, se debe documentar el estado de las células y las condi-
ciones óptimas de crecimiento, las características y la autenticidad, y se debe contar con un historial bien documentado (con
rastreabilidad a un banco de células calificado o una fuente aceptable). El estado y el historial de las células por lo general se
describen en términos del carácter y el número de manipulaciones y pasajes de cultivo a partir de las células primarias o del
aislado original. Las células finitas o primarias a menudo se crioconservan en un pasaje temprano para mantener la integridad
del tejido original, aunque se pueden clonar y expandir líneas celulares continuas, con lo que se asegura una población de
células homogénea. Se recomienda preparar bancos de células a partir de una preparación individual o población expandida
de células, puesto que a menudo resulta necesario combinar las células de múltiples vasos de cultivo para su congelación. No
se deben combinar células de cultivos con diferentes historiales de pasaje ni, evidentemente, de diferentes donantes. En ambos
casos, los analistas deben mantener registros detallados de los procedimientos.
Con el fin de preparar la crioconservación de células cultivadas, las células deben recolectarse durante la fase exponencial o
más rápida de crecimiento y antes de que el cultivo entre en la fase estacionaria. La recolección de células durante esta fase
asegura que las células sean más viables y uniformes. La concentración óptima de células dependerá del tipo de célula, del
propósito y de la mejor recuperación posible. Por lo regular, esto se encuentra entre 106 y 10 7/mL para bancos de células de
fabricación, pero puede ser diferente para otros propósitos. También puede ser beneficioso completar la renovación del medio
de crecimiento un día antes de recolectar las células. Además, la mayoría de las suspensiones de células se benefician del lava-
do por centrifugación y de la resuspensión en un medio isotónico hasta alcanzar una concentración celular específica. El proce-
samiento previo a la congelación no debe resultar en células que estén bajo estrés antes del inicio del proceso de congelación
o las pérdidas celulares durante la congelación o después de la descongelación serán mayores que las esperadas.
Es importante optimizar las condiciones de crecimiento de una línea celular o de células primarias para mantener una alta
viabilidad de las células en el cultivo. Por lo regular, las células que crecen de manera activa y en una fase exponencial presen-
tan una relación baja entre citoplasma y volumen nuclear, lo que lleva a la crioconservación exitosa con crioprotectores de
penetración. Las condiciones de cultivo inapropiadas o por debajo de las condiciones óptimas pueden generar una viabilidad
menor y estados celulares que serán menos robustos para la conservación y la recuperación. Se debe optimizar el medio de
cultivo y usar el mismo medio durante todos los experimentos; asimismo, se debe calificar cada partida de materiales deriva-
dos de animales (p. ej., suero) y demás reactivos de cultivo (p. ej., ver la guía de la OMS 201 Oy la guía de la FDA201 O referi-
das en el Apéndice).Si fuera posible, se recomienda no usar componentes derivados de animales en el medio de cultivo, en
particular para células usadas para terapia o como sustratos de fabricación.
De conformidad con la guía de la OMS 201 O y basándose en una evaluación de riesgos, se debe analizar el Banco Maestro
de Células o el Banco de Células de Trabajo para determinar la presencia de agentes adventicios. Idealmente, se deben analizar
muestras de células para determinar la presencia de agentes adventicios antes de la congelación. El régimen específico de aná-
USP 42 InformaciónGeneral/ (1044) Crioconservación de Células 7 465
lisis para determinar la presencia potencial de contaminación microbiana o viral de las células depende de la fuente donante,
del historial del cultivo y del uso previsto. Se deben mantener registros detallados del historial de las células como fundamento
para una evaluación de riesgos apropiada a fin de dirigir cualquier análisis suplementario que pueda ser requerido (p. ej., expo-
sición a virus bovinos en albúmina sérica bovina). Los requisitos reglamentarios específicos para el análisis de células, o donan-
tes de las células, para productos destinados para un uso en particular (p. ej., terapias celulares o fabricación de vacunas) se
basan en experiencias anteriores relacionadas con agentes clave que deben incluirse o considerarse. El capítulo general de la
USPProductosDerivadosde Célulasy Tejidos(1046) contiene guías sobre requisitos de análisis de esterilidad y seguridad para
productos de terapia celular.
REACTIVOS
Y ENVASES
Todos los crioprotectores, envases, entre otros, deben ser adecuados para su propósito, conforme a lo indicado en las pautas
reglamentarias pertinentes. Por lo regular, se usan bolsas, crioviales y pajuelas de plástico desechables y estériles para un solo
uso en crioconservación. Las especificaciones del fabricante deben ser revisadas cuidadosamente para asegurar que el material
usado para fabricar el crioenvase es apropiado para su uso a la temperatura de almacenamiento, que es químicamente compa-
tible con el contenido, que minimiza el potencial de lixiviables y extraíbles, y que asegura la integridad del cierre del envase.
Cuando se usen pajuelas, entonces la contención primaria o secundaria durante el almacenamiento será importante para pre-
venir el contacto directo de las células conservadas con el nitrógeno líquido. Los crioviales deben seleccionarse basándose en
su capacidad para proveer al banco de células una integridad adecuada.
La conservación de células por lo general requiere el uso de soluciones especializadas que contienen una base (por lo gene-
ral una solución salina isotónica) con los agentes crioprotectores (con mayor regularidad, DMSO, pero en ocasiones glicerol) y
en ocasiones proteínas (suero fetal bovino, suero o plasma humano, medio acondicionado o albúmina humana). Puede ser
necesario determinar la composición óptima para los diferentes tipos de células.
Los tipos de viales, etiquetas, tinta o marcadores usados deben tolerar las temperaturas extremas del nitrógeno líquido. Las
marcas en la etiqueta deben ser legibles y, de ser posible, contar con código de barras. La información mínima que se debe
incluir en la etiqueta es el nombre o la descripción de la población celular, la fecha de crioconservación, el número de lote y el
número de pasajes, si fuera necesario. Puesto que la mayoría de las crioetiquetas son muy pequeñas, se puede incluir informa-
ción adicional en la documentación relacionada. En algunas aplicaciones, también puede ser necesario numerar los viales de
manera secuencial dentro de un solo lote como parte de la información mínima de la etiqueta a fin de permitir un mejor con-
trol sobre el movimiento de los viales de un banco individual, y para identificar sectores del banco que pudieran haberse some-
tido a condiciones diferentes de crioconservación.
ADICIÓNDE SOLUCIÓNCRIOPROTECTORA
Las soluciones crioprotectoras por lo general son hipertónicas y no son fisiológicas. Por ejemplo, una solución de DMSO al
10% usada comúnmente en la conservación celular tiene una concentración aproximadamente 1,4 osmolar (Osmol/L). Las cé-
lulas introducidas en este tipo de solución se deshidratan rápidamente a medida que el agua abandona la célula para reducir la
diferencia de potencial osmótico entre el interior y el exterior de la célula. El DMSO permea lentamente la célula para lograr el
reequilibrio, lo cual puede ocasionar variaciones en el volumen que pueden resultar en una pérdida de viabilidad celular. Por
ende, las soluciones de crioconservación comúnmente se agregan a una suspensión de células en adiciones por etapas o gra-
dualmente (p. ej., usando una bomba con jeringa) o dispensando lentamente por la pared del envase para evitar pérdidas co-
mo resultado del estrés por ósmosis. El método para introducir o eliminar una solución de crioconservación debe desarrollarse
y evaluarse tomando en cuenta su impacto sobre la viabilidad y la funcionalidad celular.
En el caso del DMSO, una entalpía latente elevada del mezclado resulta en el calentamiento de la muestra al mezclar las dos
soluciones. Este calentamiento puede ser lo suficientemente elevado para dañar las células, por lo que las soluciones que con-
tienen DMSO comúnmente se enfrían antes de mezclarlas. El preenfriamiento de la solución reduce el calentamiento asociado
con el mezclado de la solución, reduce los cambios en el volumen osmótico que experimentan las células y reduce las pérdidas
celulares asociadas con la exposición al DMSO. El tiempo que las células se exponen al crioprotector antes de la congelación
debe limitarse, mientras que el tiempo máximo permisible, sin efectos nocivos, debe determinarse durante el trabajo de desa-
rrollo para el uso de rutina.
ENFRIAMIENTO
Por lo general, se usan dos tipos distintos de congelación para las células: enfriamiento a velocidad controlada (usando con-
geladores programables) y enfriamiento pasivo (que incluyen el uso de envases con aislamiento). Las fuentes de nitrógeno lí-
quido se equipan con congeladores a velocidad controlada. La temperatura de la cámara debe controlarse incrementando o
reduciendo el flujo de gas de nitrógeno frío en la cámara de acuerdo con una etapa preprogramada. Los protocolos de conge-
lación a velocidad controlada generalmente implican diversas etapas, cada una de las cuales debe ser evaluada y calificada pa-
ra un tipo específico de células.
El uso de congelación a velocidad controlada provee un control más preciso del entorno de congelación y, por ende, puede
proveer una recuperación posterior a la descongelación más uniforme (y mayor) para células que pueden tener un rango más
estrecho de velocidades de enfriamiento asociadas con la supervivencia máxima o células que son sensibles a la temperatura a
la que se forma el hielo en la solución extracelular. Las sondas de temperatura colocadas cerca de las células que se están con-
gelando, o en una suspensión simulada de células que se somete simultáneamente a crioconservación, se usan para monito-
rear el proceso de congelación y para proveer un control del proceso. Si la liberación de calor latente de la fusión se retarda o
no se controla adecuadamente, las células que se someten a crioconservación pueden resultar dañadas y pueden presentar
una disminución en la viabilidad después de la descongelación.
Pueden ocurrir interrupciones en la congelación a velocidad controlada durante el protocolo las cuales, por lo general, son
ocasionadas por fallas en una válvula del congelador o aparato de criogenia de velocidad controlada. Se deben preparar proto-
colos para manejar las interrupciones durante el proceso de congelación así como planes de respaldo.
La congelación pasiva implica colocar un producto en un congelador (aproximadamente -80º o -150°) y permitir que la
muestra se enfríe descontroladamente. Se usa un aislante o cajas especialmente diseñadas para reducir la velocidad de enfria-
miento de la muestra. Se debe evaluar y calificar la velocidad de enfriamiento promedio lograda para la mayoría de los proce-
sos así como la uniformidad de las curvas de congelación para los propósitos deseados. En general, el control del entorno tér-
mico durante la congelación resulta en una mejor recuperación posterior a la descongelación, aunque ciertas células presentan
una recuperación posterior a la descongelación comparable cuando se enfrían de manera pasiva.
ALMACENAMIENTO,
SEGURIDAD
Y TRANSPORTE
CRIOGÉNICOS
Después de completar el proceso de congelación, los productos son transferidos de congeladores a velocidad controlada o
mecánicos a unidades de almacenamiento criogénico. Algunos cultivos celulares microbianos pueden mantenerse adecuada-
mente en congeladores mecánicos, aunque esto debe demostrarse. Se debe minimizar el entibiamiento de la muestra al trans-
ferir el producto celular del dispositivo de congelación al lugar de almacenamiento. Se pueden usar mesas frías o dispositivos
de transferencia con aislamiento para minimizar el entibiamiento durante la transferencia. Las células que acaban de ser crio-
conservadas por lo regular se colocan en una unidad de almacenamiento criogénico para cuarentena antes de completar el
análisis para detectar la presencia de agentes adventicios. Después del análisis, las células que arrojan resultados negativos en
la determinación de agentes adventicios pueden ser liberadas para su transferencia a unidades de almacenamiento criogénico
a largo plazo.
El sistema de inventario (o depósito) para el mantenimiento de las células crioconservadas debe tener un diseño de fácil ac-
ceso que minimice la manipulación de las muestras, además de que se debe limitar el número de accesos por día a un depósi-
to puesto que la exposición a temperaturas más altas puede comprometer la viabilidad celular y, por consiguiente, la estabili-
dad a largo plazo. Los bancos de células (p. ej., bancos maestros de células) u otros cultivos celulares a los que se accede con
poca frecuencia deben almacenarse por separado de los bancos de células de trabajo o de otros cultivos celulares a los que se
accede con mayor regularidad. La recuperación frecuente a partir del banco/cultivo celular puede ocasionar cambios en la
temperatura. Esta actividad no debe comprometer la estabilidad a largo plazo ni el desempeño del banco/cultivo celular usado
con poca frecuencia. Asimismo, resulta valioso dividir un banco y almacenarlo en sitios múltiples para reducir los riesgos debi-
dos a un evento catastrófico en un sitio particular.
Al almacenar células crioconservadas, los analistas deben asegurar que la temperatura de almacenamiento no se eleve por
encima de una temperatura crítica denominada temperatura de transición vítrea. Para el almacenamiento a largo plazo de
muestras que requieren de atención y cuidados especiales tales como líneas celulares y cultivos celulares primarios, esta tempe-
ratura crítica no es superior a -1 30º para muestras no clínicas y no es superior a -150º para material clínico (para proveer un
margen de error adecuado) en la fase de vapor del congelador de nitrógeno líquido. Los congeladores de nitrógeno líquido
son propensos a gradientes de temperatura en la fase de vapor basándose en la forma y el diseño del congelador y el nivel de
nitrógeno líquido. Aunque el almacenamiento de células crioconservadas en nitrógeno líquido prolonga su longevidad, los
riesgos asociados con el uso de envases inadecuados (p. ej., explosión de viales o ruptura de bolsas) han derivado en un mayor
uso del almacenamiento en fase de vapor de nitrógeno. La fase de vapor de nitrógeno líquido provee un entorno más conve-
niente y seguro para la recuperación de viales. Cuando el congelador de nitrógeno líquido se configura adecuadamente, la
temperatura de trabajo en la fase de vapor es, por lo regular, -150º o menor. Se debe calificar el congelador de nitrógeno
líquido, además de que se debe verificar de manera rutinaria la temperatura de la fase de vapor para asegurar que dicha tem-
peratura no sobrepase los -1 30º para líneas celulares u otro material congelado, o sobrepase los -150º para material usado en
aplicaciones clínicas (p. ej., terapias celulares).
Los sistemas de monitoreo de temperatura deben permitir el registro y el almacenamiento del historial de temperaturas para
propósitos de control de calidad. Las unidades de almacenamiento deben estar conectadas a alarmas y a los sistemas de moni-
toreo de la instalación. Las unidades de almacenamiento crítico deben equiparse con un sistema de alarma de niveles múltiples
para asegurar el respaldo del monitoreo y de la respuesta. Las unidades de almacenamiento deben monitorearse de manera
rutinaria para detectar fallas en la temperatura ocasionadas por interrupciones eléctricas y cualquier otro fallo potencial. En ca-
so de fallas del equipo o eléctricas, se debe contar con refrigeración de respaldo.
La operación apropiada de un depósito requiere monitorear la temperatura, los niveles de nitrógeno líquido y el llenado au-
tomático. Asimismo, se recomienda contar con un respaldo para enfriamiento de emergencia (p. ej., almacenamiento criogé-
nico de respaldo vacío) en caso de que falle el congelador.
USP42 InformaciónGeneral/ (1044) Crioconservación de Células 7467
Únicamente el personal capacitado para este propósito debe tener acceso a los productos o las muestras crioconservadas. En
algunos casos, la verificación por parte de una segunda persona será necesaria para propósitos de rastreabilidad de la fuente. El
personal designado para la implementación de los protocolos debe estar capacitado en procedimientos operativos estándar
(POE). Los sistemas de rastreo de muestras que incorporan software y en ocasiones códigos de barras para identificación, regis-
tro y rastreo de muestras congeladas son particularmente útiles para los depósitos grandes de muestras y pueden facilitar la
recuperación rápida de muestras y minimizar el tiempo que el depósito completo se expone al riesgo de desviaciones de tem-
peratura. Además, se recomienda que todos los cambios a los inventarios del crioalmacenamiento se registren en bitácoras
cercanas a la unidad de almacenamiento.
Los productos y muestras tales como células primarias, líneas celulares y productos de terapia celular por lo regular se trans-
portan entre sitios de recolección, procesamiento, almacenamiento y uso. Las células crioconservadas por lo regular se trans-
portan en transportadores de vapor de nitrógeno líquido con sistemas de monitoreo de temperatura para asegurar que la tem-
peratura de la unidad no sobrepase los -130º para líneas celulares ni los -150º para material clínico durante el proceso de
transporte. Los contenedores para transporte están sujetos a vibraciones y tensiones mecánicas importantes durante el trans-
porte y se deben evaluar de manera regular para asegurar su funcionamiento óptimo. Los estudios de validación del transporte
deben abarcar las condiciones más exigentes e incluir los datos de monitoreo de temperatura para materiales críticos.
Las células crioconservadas, independientemente de si se transportan dentro del país o internacionalmente, deben transpor-
tarse cumpliendo con las reglamentaciones para el correo local, del US Department of Transportation (Departamento del
Transporte de EE.UU.)y de la lnternational Air Transport Association (Asociación de Tansporte Aéreo Internacional). Los empa-
ques también deben cumplir con los demás requisitos reglamentarios para cuarentenas, prevención y seguridad biológica. Las
células crioconservadas deben recuperarse, envasarse y transportarse de una manera que no interfiera con la integridad de las
células. Para la mayoría de las células crioconservadas, puede ser adecuado el transporte en hielo seco durante periodos cortos,
pero se debe validar el proceso de transporte y demostrar que no tiene un impacto adverso sobre las células, además de que
se deben incluir monitores de temperatura. No obstante, algunas células pueden requerir de transporte en fase de vapor de
nitrógeno líquido (Dewars). Puede ser necesaria la validación previa de los métodos de transporte para determinar la mejor
opción y se debe realizar una evaluación de riesgo previa a la validación incluso si se está considerando una sola opción de
transporte. Con el envío, los transportistas deben incluir instrucciones para el almacenamiento apropiado al recibir las células.
DESCONGELACIÓN
Las células que se congelan usando métodos convencionales (congelación a velocidad controlada o pasiva) o mediante vitri-
ficación, se deben descongelar con la mayor rapidez posible y el proceso de descongelación inicia tan pronto como la muestra
congelada se retira del almacenamiento. Las velocidades lentas de entibiamiento generan daños por recristalización o exposi-
ción de las células a altas concentraciones extracelulares de agentes crioprotectores, los cuales pueden producir muerte celular.
Se debe desarrollar el procedimiento de descongelación más apropiado (temperatura, gradiente y tiempo) para cada producto
de terapia celular y línea celular. Estos productos y líneas celulares por lo general se descongelan en un baño de agua tibia, o
en el caso de preparaciones celulares terapéuticas, en un baño de perlas o termobloque. El baño de agua debe limpiarse con
regularidad y debe contener agua estéril o Agua para Inyección.La temperatura del baño también debe monitorearse. Muchos
laboratorios clínicos emplean bolsas de plástico para envolver y contener el envase primario durante la descongelación rápida
a fin de reducir el riesgo de contaminación del producto en caso de que se comprometiera la integridad del envase interno.
Como alternativa, se pueden usar baños de perlas tibios (por lo general a aproximadamente 37°) para reducir los riesgos de
contaminación. Las velocidades de descongelación deben ser lo más rápidas posible (>1º/s para la mayoría de las células de
mamíferos). El aumento de las temperaturas del baño por encima de 42º para incrementar la velocidad de entibiamiento se
debe realizar con extremo cuidado debido a que las temperaturas hipertérmicas pueden dañar las células, induciendo necrosis
o apoptosis.
PROCESAMIENTO
Y EVALUACIÓN
POSTERIORA LADESCONGELACIÓN
Puesto que las soluciones para crioconservación no son fisiológicas, es normal llevar a cabo algunos procesos posteriores a la
descongelación. Para células conservadas en DMSO, las células por lo general se lavan o diluyen inmediatamente después de la
descongelación debido a que este agente crioprotector es dañino, en particular para las células congeladas y descongeladas.
Las células son más sensibles a expandirse que a contraerse, por lo que los protocolos de eliminación o dilución del agente
crioprotector deben optimizarse cuidadosamente para prevenir pérdidas celulares derivadas de la dilución o eliminación.
La cuantificación de la viabilidad de las células después de la congelación es importante y puede realizarse usando una varie-
dad de métodos, dependiendo de los requisitos de las células posteriores a la congelación. Se deben establecer límites míni-
mos de viabilidad basándose en la experiencia, además de que se deben desechar los productos descongelados con viabilida-
des por debajo de los límites establecidos. Los procesos de crioconservación someten a las células a tensiones importantes que
pueden alterar la función metabólica, la estructura de la membrana, entre otros. Por lo tanto, resultan críticos el desarrollo y la
validación de ensayos adecuados posteriores a la descongelación. La función posterior a la descongelación generalmente se
evalúa usando la integridad física (p. ej., integridad de la membrana), la actividad metabólica, la actividad mecánica (acopla-
miento o contracción), la actividad mitótica o el potencial de injerto. La selección del ensayo depende en gran medida de la
función deseada de la célula después de la descongelación. La integridad de la membrana es la que se usa con mayor frecuen-
cia. Hoy en día, los colorantes como el azul de tripán se usan con menos regularidad para medir la integridad física posterior a
la descongelación debido a que el colorante es difícil de validar en células congeladas y descongeladas. El método para anali-
zar la viabilidad debe seleccionarse y calificarse con cuidado para el tipo de célula en particular que se está midiendo con un
protocolo que especifique los diluyentes y el tiempo. El uso de colorantes fluorescentes es cada vez más frecuente para deter-
minar la integridad física de las células posterior a la descongelación. Los métodos rigurosos de evaluación posterior a la des-
congelación generalmente implican múltiples mediciones de la viabilidad celular y, en particular, al menos dos ensayos inde-
pendientes para medir la viabilidad posterior a la descongelación. Por ejemplo, la adherencia al sustrato y la proliferación pos-
terior a la descongelación se usan comúnmente para evaluar la viabilidad. A medida que aumenta la complejidad de la función
celular deseada después de la descongelación, también crece la necesidad de una evaluación posterior a la misma. Por ejem-
plo, la evaluación posterior a la descongelación de células madre puede requerir la valoración de la integridad de la membrana
así como de la proliferación y de la capacidad de las células para diferenciarse en linajes diferentes después de la congelación.
Los ensayos posteriores a la descongelación deben desarrollarse y validarse cuidadosamente para evitar sesgos en las medicio-
nes. Una cierta fracción de células se lisarán durante la congelación y los métodos para medir la recuperación celular deben
incluir una evaluación completa de las pérdidas celulares (células que se han lisado así como céluas que están intactas pero que
no son viables). La estabilidad de las células crioconservadas se puede asegurar mediante la descongelación y el análisis perió-
dicos de un vial de las células (ver también la pauta ICH Q5D).
El análisis de agentes adventicios después de la preparación de los bancos maestros de células y de los bancos de células de
trabajo debe ser parte de la rutina, y los capítulos generales de la USPEvaluaciónde la SeguridadViral en ProductosBiotecnológi-
cos Obtenidosde LíneasCelularesde Origen Humano o Animal (1050) y Métodos de PruebasVirológicas(1237) proveen guías de
análisis adicionales (ver también la guía de la FDA201 O citada en el Apéndice).El análisis de contaminación micobacteriana,
que podría no ser detectada en un análisis de esterilidad estándar, también se puede considerar para algunos sustratos celula-
res. Se deben recuperar y analizar viales representativos para determinar la presencia de contaminación (bacterias, hongos,
Micoplasmasy virus). Se encuentra disponible una gran cantidad de métodos bien establecidos para detectar Micoplasmasen
cultivos celulares (ver el capítulo general de la USPPruebaspara Micoplasmas(63)).
El registro de las partidas debe ser detallado e incluir el historial de las células y de todas las actividades, desde la recepción
hasta la liberación de los bancos celulares o de los productos para su uso. El registro debe incluir información detallada sobre el
proceso de crioconservación, incluyendo el procedimiento, el equipo usado (con un identificador único) y un registro impreso
del perfil de congelación. La viabilidad de las células crioconservadas deben monitorearse con el paso del tiempo para confir-
mar la efectividad del proceso de congelación y de las condiciones de almacenamiento. La información registrada en cada ar-
chivo de partida de una línea celular debe ser rastreable a la fuente original y todos los documentos deben mantenerse yac-
tualizarse de acuerdo con el sistema de gestión de calidad en uso.
CRIOCONSERVACIÓN
DE PRODUCTOSDE TERAPIACELULAR
DERIVADOSDE CÉLULAS
HUMANAS
Los métodos de conservación de células se utilizan para asegurar la estabilidad del producto durante las etapas de retención,
almacenamiento y transporte para un amplio rango de productos basados en células humanas (el capítulo (1046) ofrece infor-
mación adicional). Las células se pueden conservar en suspensión líquida durante unos cuantos días, pero invariablemente
ocurrirán cambios cuantitativos y cualitativos en el producto celular con el paso del tiempo. Aunque la conservación en estado
de congelación también afecta al producto celular, ésta permite una conservación de las características específicas del produc-
to más predecible durante intervalos de tiempo mucho más prolongados.
Para cualquier producto celular determinado, la decisión de usar la crioconservación depende principalmente del tiempo de
la administración del producto final en relación con la recolección a partir de la fuente de las células y de las etapas de fabrica-
ción del producto. Muchos productos autólogos y alogénicos para pacientes específicos se mantienen en suspensión líquida,
sin crioconservación, desde la fuente inicial de las células hasta la formulación final, y se liberan como productos frescos des-
pués de un tiempo relativamente corto. No obstante, muchas aplicaciones clínicas requieren la crioconservación de la fuente
de las células, de los productos intermedios o del producto final. En estos casos, la crioconservación puede permitir la optimi-
zación del flujo de trabajo durante la fabricación, la culminación del análisis de liberación de lotes, el mantenimiento y gestión
de un inventario de productos, el transporte del producto al sitio clínico y la coordinación de la administración del producto
con el régimen médico o quirúrgico del paciente. Por ejemplo, la sangre del cordón umbilical se crioconserva y almacena en
bancos públicos para su transporte subsiguiente y almacenamiento temporal en centros de transplante clínicos, en donde se
descongela inmediatamente antes de su infusión en un paciente.
El desarrollo de un proceso de crioconservación para una terapia celular clínica debe considerar las consecuencias para el
producto, para el paciente y para la viabilidad general de la terapia. Para el producto celular, el fabricante debe asegurar que
las pérdidas celulares esperadas debidas a la crioconservación y la descongelación ocurran de una manera que sea razonable-
mente predecible y debe asegurar que el producto final que se administra al paciente cumplirá con las especificaciones de nú-
mero, viabilidad y características funcionales de las células.
Para el paciente, la crioconservación puede afectar la eficacia y la seguridad del producto final. Por ejemplo, el DMSO crio-
protector se asocia con el riesgo de toxicidades predecibles gastrointestinales, cardiovasculares y neurológicas que dependen
de la dosis que generalmente se adscriben a la liberación de histamina. Se debe estimar o medir el DMSO residual en el pro-
ducto final. El DMSO está categorizado por la ICH como un disolvente o excipiente Clase 3 (de riesgo relativamente bajo) en
productos farmacéuticos, y se consideran aceptables sin justificación cantidades de hasta 50 mg/día o menos (ver la norma
ICH Q3C). Los productos celulares crioconservados con frecuencia contienen 10-20 veces esta cantidad, a menos que se laven
después de la descongelación. Pueden presentarse incluso cantidades mayores de DMSO con la administración de múltiples
productos crioconservados, lo que ocurre comúnmente con el transplante de células madre autólogas de la sangre periférica.
Por lo regular se usa un límite de DMSO de 1 g/kg peso del receptor/día en la práctica de la terapia celular clínica. Asimismo se
deben tomar en cuenta los procedimientos para prevenir la toxicidad del DMSO. Resulta una práctica clínica común premedi-
car a pacientes con difenhidramina u otros agentes antihistamínicos para prevenir la toxicidad del DMSO. Asimismo, se pue-
den considerar métodos de lavado del producto ya sean manuales (centrifugación) o automáticos, aunque deben validarse pa-
ra asegurar una recuperación y función celular posteriores al lavado adecuadas.
El uso de productos de terapia celular crioconservados puede requerir que el sitio clínico reciba, almacene, descongele y lle-
ve a cabo otras etapas de preparación finales en el producto crioconservado. La evaluación de viabilidad requiere tomar en
cuenta las capacidades del sitio con respecto al personal especializado, capacitación, equipo e instalaciones para llevar a cabo
dichas tareas.
Si la crioconservación se planea como parte del proceso de fabricación, los equipos de desarrollo deben considerar el efecto
de la crioconservación sobre el número y las características de las células y debe requerir métodos confiables de enumeración
celular y de evaluación de la viabilidad y la función de las células. Durante las corridas de desarrollo, a menudo se realizan más
ensayos que los que serán eventualmente requeridos para los análisis durante el proceso y del producto final. Esto se hace para
evaluar los efectos que tiene cada manipulación sobre el producto. Debido a que algunas células pueden ser más susceptibles
que otras a los daños por congelación-descongelación, estos estudios deben incluir la evaluación de pérdidas selectivas de
subpoblaciones celulares importantes dentro del producto.
Tal como se describe en la Introducción,el resultado de un protocolo de crioconservación se ve afectado por diversos proce-
sos críticos. A continuación se tratan brevemente cuestiones exclusivas de las terapias celulares.
Procesamiento Previo a la Congelación
Si las células se recolectan en presencia de plasma, las muestras deben procesarse adecuadamente con un anticoagulante
para prevenir la coagulación. Además, algunas células son propensas a aglutinarse o a agregarse al ser centrifugadas, y algunos
productos celulares pueden presentar daños o pérdidas excesivas de una o más poblaciones dentro del producto. Las células
recolectadas de cultivos adherentes o no adherentes pueden incluir cantidades importantes de células muertas o frágiles. Por
ende, las etapas de centrifugación y lavado deben ser optimizadas y también específicas para el contenido del producto celu-
lar, el volumen de suspensión, el medio de suspensión y el envase, junto con una evaluación apropiada del producto celular
antes y después de estas manipulaciones. El procesamiento previo a la congelación no debe resultar en células que estén estre-
sadas (p. ej., células que presenten marcadores apoptóticos tempranos o respuestas por golpe de temperatura elevados) antes
del inicio del proceso de congelación, o las pérdidas celulares serán mayores que las esperadas.
Reactivos y Envases
Se deben usar reactivos y envases de grado clínico siempre que sea posible (ver MaterialesAuxiliarespara ProductosCelulares,
Génicosy de IngenieríaTisular(1043)). Resulta una práctica común usar bolsas o crioviales de plástico desechables y estériles de
un solo uso que han sido calificados para el proceso de crioconservación y las condiciones de almacenamiento subsiguientes
específicos. Los medios de crioconservación para productos de terapia celular por lo regular consisten en soluciones isotónicas
basadas en sales con uno o más crioprotectores, por lo regular el DMSO crioprotector intracelular a una concentración final del
5%-10% con o sin un crioprotector extracelular como almidón hidroxietílico. Resulta común el uso de aditivos de proteínas de
origen humano tales como albúmina sérica humana, suero o plasma, aunque pueden requerir de calificación extensa, por lo
que se deben evitar cuando sea posible y evaluarse otras alternativas. En ocasiones se utilizan aditivos tales como heparina de-
rivada de animales, anticoagulantes basados en citratos y ADNasa. Muchos centros formulan sus propios medios de criocon-
servación, pero el uso de medios de crioconservación comerciales, que por lo regular incluyen DMSO al 5%-10% y otros com-
ponentes de patente, se ha incrementado entre los fabricantes de terapias celulares para eliminar la variabilidad y la necesidad
de actividades de calificación adicionales relacionadas con la formulación local.
Adición de Solución Crioprotectora y Enfriamiento

Los procedimientos para la introducción o eliminación de una solución de crioconservación debe evaluarse antes de la con-
gelación para asegurar que las pérdidas celulares resultantes de esta etapa se mantengan al mínimo. El medio de crioconserva-
ción por lo general se agrega a la suspensión de células en etapas o gradualmente (p. ej., usando una bomba con jeringa) para
evitar pérdidas como resultado del estrés por ósmosis. Resulta común preenfriar el medio de crioconservación y mantener la
suspensión de células y la mezcla frías usando compresas frías, una frazada fría o una superficie de trabajo fría para prevenir
daño celular relacionado con el calor durante la adición del DMSO. Una vez que se agrega el medio de crioconservación, la
suspensión de células por lo general se transfiere a la cámara preenfriada de un congelador de velocidad controlada. Durante
el proceso de congelación, se genera un registro, o curva de congelación, de la temperatura de la cámara y del producto con
el paso del tiempo para su inclusión en el registro de producción. Las temperaturas del producto se pueden registrar usando
una sonda colocada en la superficie externa de la bolsa del producto o desde el interior de un producto comparable en una
bolsa o vial de simulación que se somete a congelación de manera paralela.
Almacenamiento y Transporte
Los productos de terapia celular crioconservados por lo regular se almacenan y transportan a temperaturas de~ 150º o me-
nores. La FDArequiere la detección y el análisis de evidencia de enfermedades transmisibles solo para donantes alogénicos de
productos de terapia celular y no para donaciones autólogas. Sin embargo, cuando sus productos deben ser almacenados,
muchos centros analizan donantes autólogos y productos segregados derivados de donantes autólogos quienes se sabe que
padecen enfermedades transmisibles. Un informe sobre contaminación cruzada con hepatitis B de productos celulares dentro
de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido llevó a las prácticas actualmente vigentes de almacenamiento en la fase
de vapor de nitrógeno líquido y al uso de bolsas para envoltorio para reforzar la contención del producto. El almacenamiento
en fase de vapor de nitrógeno líquido se puede asociar con gradientes de temperatura verticales: los productos en la parte
superior del tanque de almacenamiento pueden estar expuestos a una temperatura más cálida que los almacenados en la par-
te inferior del mismo. Los gradientes de temperatura deben ser monitoreados y se deben minimizar los gradientes de tempera-
tura verticales, p. ej., mediante el uso de deflectores metálicos de calor. Las bolsas para envoltorio pueden reducir la velocidad
de entibiamiento de la muestra si se usan durante el proceso de descongelación subsiguiente y su uso debe calificarse como
parte de la validación general del proceso de crioconservación.
El transporte de productos de terapia celular crioconservados a menudo se logra usando contenedores criogénicos secos que
contienen material absorbente que se puede cargar con nitrógeno líquido para mantener temperaturas de fase de vapor por
un plazo de hasta 2 semanas cuando se cargan adecuadamente. Se deben usar registradores de datos para documentar el
historial de temperatura durante el transporte. Además, dichos contenedores y procedimientos de transporte deben validarse
antes de transportar los productos de terapia celular para uso clínico en los envases.
Entibiamiento (Descongelación)
Aunque la descongelación de los productos de terapia celular en el área adyacente a la cama de un paciente antes de la
infusión se ha considerado una práctica clínica común, hoy en día el uso de personal capacitado en un ambiente de laborato-
rio controlado se reconoce como el método preferido para la descongelación debido a que permite un proceso más estandari-
zado y un grado mayor de control cuando el personal debe responder a una falla en el envase, lo cual puede requerir la recu-
peración de producto en un entorno más estéril. La descongelación del producto por lo regular se realiza mediante inmersión
en baños de agua a 37º usando bolsas para envoltorio a fin de minimizar la pérdida de producto y la contaminación en caso
de fallas en el envase primario. Las bolsas pueden amasarse suavemente durante la descongelación para reducir los gradientes
de temperatura en toda la bolsa y para acelerar la descongelación. El producto se retira del baño de agua cuando todavía hay
algo de hielo presente en el producto pero la mayoría del producto se ha descongelado.
Procesamiento Posterior a la Descongelación
El DMSO es tóxico para las células en suspensión líquida. La toxicidad puede reducirse diluyendo o lavando la suspensión de
células antes de la infusión o de la manipulación adicional. Debido a que las células crioconservadas descongeladas son más
sensibles a la expansión volumétrica cuando las células pasan de una solución hipertónica a una solución isotónica, las solucio-
nes y métodos de dilución y lavado deben diseñarse y validarse cuidadosamente. El lavado de células usando una centrífuga
convencional o un dispositivo automático puede resultar en tensión mecánica adicional para las células, por lo que las pérdidas
celulares deben evaluarse con un método apropiado antes de implementar un método específico en la práctica clínica.
Prácticas de Control de Calidad
La gestión de calidad de la crioconservación, el almacenamiento y la descongelación de productos de terapia celular clínica

deben incorporar elementos del sistema de calidad que se adhieran a las Buenas Prácticas para Tejidos (BPTv)y a las Buenas
Prácticas de Fabricación (BPFv)vigentes, incluyendo calificación del personal, controles de la instalación, control de documen-
tos, control de equipo y materiales, control de etiquetas y uso de Procedimientos Operativos Estándar validados (Título 21 del
CFR 1271, 21 O y 211 ). Las prácticas de control de calidad específicas para la crioconservación incluyen por lo regular la evalua-
ción y documentación de curvas de congelación para todos los productos, la retención de segmentos del sistema de tubos y
viales para análisis subsiguiente y el monitoreo regular de la calidad del producto después de la descongelación. Las prácticas
requeridas por las Buenas Prácticas para Tejidos vigentes y que se aplican a todos los productos basados en células y tejidos
humanos incluyen medidas para asegurar registros y etiquetados exactos y completos, a fin de asegurar que el paciente reciba
el producto correcto y para permitir el rastreo del producto celular desde la recolección hasta la infusión. Las implicaciones
prácticas de estos requisitos son que el etiquetado y los registros, incluyendo los sistemas de inventario, para productos crio-
conservados deben diseñarse para prevenir errores en la identificación de productos. Las verificaciones de la identidad de los
productos que se trasladan dentro y fuera del almacenamiento crioconservado se llevan a cabo de manera rutinaria, p. ej., con
dos personas verificando la etiqueta del producto contra los registros. Si fuera necesario para la verificación adicional de la
identidad del producto, el contenido de un segmento del sistema de tubos acoplado a la bolsa de producto puede desconge-
larse y analizarse antes de descongelar todo el producto. La guía ISBT128, un sistema internacionalmente reconocido de eti-
quetado de productos sanguíneos y de terapia celular, incorpora el uso de nomenclatura de productos y códigos de barras
uniformes para productos desde su obtención de la fuente donante hasta su administración (ver el Apéndice).
CÉLULASMADREHEMATOPOYÉTICAS
Los estudios sobre las respuestas de las células madre hematopoyéticas a la congelación comenzaron en la década de 1950,
y las células madre hematopoyéticas crioconservadas se han usado ampliamente en la práctica clínica durante los últimos 30
años. El método más común de crioconservación de células madre hematopoyéticas para aplicaciones clínicas implica el uso
de DMSO al 10% y un congelador de velocidad controlada ajustado a una velocidad de enfriamiento de 1º/minuto. Otro mé-
todo, de uso menos común, implica el uso de congelación pasiva del producto de células madre hematopoyéticas en un con-
gelador mecánico a -80º y el uso de una solución de DMSO al 5% + almidón hidroxietílico al 6%. Las células por lo regular se
congelan a densidades de 30-50 x 10 6 células/ml. Se ha demostrado que el exceso de citocritos en un 20% (v/v) reduce la
recuperación celular. La evaluación posterior a la descongelación de la muestra consiste en la enumeración de células nuclea-
das, células CD34+viables y unidades formadoras de colonias hematopoyéticas, junto con el cálculo subsiguiente de recupera-
ciones a partir de valores de precongelación correspondientes.
Las células madre hematopoyéticas crioconservadas para uso clínico se pueden obtener a partir de la médula ósea, la sangre
periférica movilizada o la sangre de cordón umbilical. Cada fuente tiene requisitos únicos para su conservación. Por ejemplo,
los productos de células progenitoras de sangre periférica contienen un mayor número de células y se pueden congelar en
bolsas múltiples con concentraciones celulares relativamente altas. Los protocolos para la conservación de células de cordón
umbilical pueden incluir el uso de bombas con jeringas para introducir soluciones de crioconservación mientras se minimiza el
estrés por ósmosis. Para células de cordón umbilical, las soluciones especializadas a menudo se usan después de la descongela-
ción para diluir o eliminar el DMSO al tiempo que se minimiza el estrés por ósmosis para las células.
CÉLULASMADREMESENQUIMÁTICAS
La investigación sobre el uso clínico de células madre mesenquimáticas ha aumentado rápidamente desde mediados de la
década de 1990. Los métodos confiables, seguros y eficientes de crioconservación y almacenamiento tienen una importancia
crítica, en especial para los productos de células madre mesenquimáticas alogénicas estandarizados y de propiedades defini-
das, fabricados en múltiples dosis de producto para el tratamiento de un gran número de pacientes con una variedad de indi-
caciones clínicas.
Debido a que las células madre mesenquimáticas se han generado en cultivos que contienen suero fetal bovino, los medios
de crioconservación para dichas células han incorporado con regularidad suero fetal bovino. En la actualidad, se encuentra en
exploración diversas alternativas al suero fetal bovino irradiado con rayos gamma para la expansión de cultivos antes de la crio-
conservación, además de que la crioconservación ha resultado ser exitosa en medios que contienen DMSO al 5%-10% y otros
componentes sin fuentes bovinas de proteína. Aunque no existe un método uniforme de procesamiento de las células poste-
rior a la descongelación, algunos protocolos incluyen la dilución o el lavado de las células para mitigar los efectos del DMSO.
Las aplicaciones clínicas emergentes para las células madre mesenquimáticas pueden requerir la dosificación repetida del pro-
ducto celular, lo cual es una práctica que requiere atención a la inmunogeicidad potencial de los componentes del medio de
crioconservación, p. ej., suero fetal bovino u otras proteínas.
La evaluación posterior a la descongelación de las células madre mesenquimáticas por lo regular ha incluido el uso de colo-
rantes para evaluar la integridad de la membrana tales como azul triptano, expresión de antígenos de la superficie y evidencia
de que las células son capaces de diferenciarse en múltiples linajes. Debido a que el mecanismo de acción de las células madre
mesenquimáticas puede implicar las propiedades inmunomoduladoras o tróficas de las células, la evaluación posterior a la des-
congelación también debe incluir la función celular pertinente.
CÉLULASLINFOIDES
Los linfocitos se usan para una variedad de aplicaciones clínicas incluyendo inmunoterapia para tratar cáncer, infecciones
virales y enfermedades autoinmunes. La terapia basada en linfocitos puede constar de poblaciones mezcladas de linfocitos o
subpoblaciones de linfocitos que han sido seleccionadas o activadas ex vivo, p. ej., células T reguladoras, células asesinas natu-
rales y células T activadas. Al igual que con las células hematopoyéticas, los linfocitos por lo general se crioconservan usando
una solución de DMSO al 10% y una velocidad de enfriamiento controlado de 1º/minuto.
Los linfocitos pueden experimentar una extensa apoptosis después de la descongelación, la cual puede influir sobre la efica-
cia clínica de las células. Las poblaciones altamente purificadas de linfocitos pueden presentar niveles más altos de apoptosis
posterior a la descongelación que las poblaciones mezcladas de linfocitos. Se han utilizado estrategias tales como la inhibición
de caspasa y el rescate con citoquina para disminuir la apoptosis de los linfocitos posterior a la descongelación.
CONSERVACIÓN
DE LÍNEASDE CÉLULASMADREPLURIPOTENTES
HUMANAS
Las células madre pluripotentes son células que parecen tener la capacidad de (1) autorrenovarse y replicarse indefiidamente
y (2) generar células que son representativas de los tres tejidos de la capa germinal necesarias para crear todas las células del
cuerpo humano como ha quedado demostrado por su capacidad de generar teratomas en ratones inmunodeficientes. Los dos
tipos predominantes de líneas de células madre usadas para la investigación in vitro en el laboratorio son las células madre
embrionarias humanas y las células madre pluripotentes inducidas humanas. Las células madre embrionarias humanas se deri-
van de blastocistos excedentes donados mediante aislamiento y cultivo de la masa celular interna del blastocisto (el tejido que
habría evolucionado para formar el embrión). Las células madre pluripotentes inducidas humanas se crean mediante reprogra-
mación artificial de células somáticas (mediante la liberación de factores de reprogramación usando una variedad de métodos)
para producir células que expresen las propiedades críticas de las células madre pluripotentes citadas anteriormente. Las célu-
las madre pluripotentes inducidas humanas se pueden derivar de una variedad de tipos de células somáticas usando una varie-
dad creciente de métodos para asegurar la expresión de ciertos factores de reprogramación. Se sabe que una variedad de culti-
vos derivados de tejidos albergan poblaciones de células madre in vitro (p. ej., grasa subcutánea, médula ósea, cordón y san-
gre de ombligo fetal, células germinales primordiales de la cresta neural fetal y cultivos de esferoides de células madre neura-
les) que han demostrado tener una capacidad limitada para la replicación in vitro y que no se han establecido como líneas de
células madre diploides pluripotentes estables. Dichos cultivos no se tratan en este capítulo; las siguientes secciones abarcan
específicamente líneas de células madre embrionarias humanas y las células madre pluripotentes inducidas humanas.
Las líneas de células madre pluripotentes son cultivos celulares complejos de componentes múltiples y pueden contener una
variedad de poblaciones celulares distintas con grados mayores o menores de diferenciación o compromiso de linaje. No obs-
tante, se debe mantener la autorrenovación, que es la propiedad clave de un cultivo de células madre. Asimismo, las células
deben conservar su capacidad de experimentar división asimétrica para generar dos células hijas diferentes: una que sea una
célula madre idéntica a la célula progenitora y otra con un grado reducido de potencia (es decir, la capacidad de generar lina-
jes celulares diferentes).
Desarrollo de Metodologías Actuales para Células Madre Pluripotentes
En la actualidad, cada laboratorio tiene una metodología preferida, por lo que no existe un enfoque dominante para el uso
rutinario, y parece posible obtener niveles aceptables de viabilidad posterior a la descongelación y recuperación, ya sea por
vitrificación o por crioconservación a velocidad lenta controlada; sin embargo, en esta sección se describe un método común
que resulta en una mejor recuperación celular. En resumen, esta técnica implica colocar colonias de células madre embriona-
rias humanas en una solución de vitrificación compuesta de DMSO al 20% + etilenglicol al 20% (EG) + sacarosa 0,5 mol/L
después de equilibrar con soluciones de DMSO + EG de menor concentración. Las colonias se cargan en pajuelas y se sumer-
gen en nitrógeno líquido. Otro método común implica colocar colonias en una solución que consta de DMSO al 10% (v/v) y
usando un dispositivo de congelación pasiva o un congelador de velocidad controlada diseñado para lograr una velocidad de
enfriamiento promedio de aproximadamente 1º /minuto.
Las muestras de células madre pluripotentes inducidas o de células madre embrionarias humanas tienen requisitos especiales
de almacenamiento y transporte. Todas las muestras crioconservadas o vitrificadas deben almacenarse a temperaturas por de-
bajo de la temperatura de transición vítrea de la muestra, y para las muestras vitrificadas esta temperatura es mucho más baja
(p. ej., -150º) que para las muestras de células crioconservadas de manera común. Asimismo, las fluctuaciones en las tempera-
turas durante el almacenamiento o transporte pueden llevar a la cristalización y, por ende, a la degradación de la muestra.
Debido a que las muestras vitrificadas son sensibles a estas fluctuaciones de la temperatura, se deben transportar a temperatu-
ras de nitrógeno líquido y no transportarse en hielo seco.
Los desafíos para la conservación confiable y reproducible de líneas de células madre pluripotentes recaen no solo en el pro-
ceso de conservación mismo, sino también en los procesos de preparación, crioprotección y recuperación. Específicamente, los
métodos de recolección y manipulación antes de la crioconservación pueden resultar en pérdidas celulares importantes. Los
procedimientos de procesamiento deben ser tan reproducibles como sea posible y además debe usarse un Procedimiento
Operativo Estándar para mejorar la reproducibilidad de los resultados de la conservación. Además, la generación efectiva de
bancos de líneas de células madre pluripotentes enfrenta los desafíos impuestos por los métodos mediante los cuales las células
regularmente se exponen a pasajes y se recolectan para conservación (es decir, colonias individuales disecadas y transferidas
como pequeños fragmentos de colonia a matraces para cultivos frescos para su expansión o a un medio de conservación para
su congelación). Primero, para evitar la pérdida extensa de viabilidad en las células recolectadas con anterioridad, los cultivos
usados para crear un banco pueden, en efecto, requerir conservación en partidas pequeñas durante un día de trabajo. Segun-
do, la preparación de bancos de células madre pluripotentes que comprenden combinaciones más pequeñas de fragmentos
de colonias celulares no solo es larga y laboriosa, sino que también imposibilita la homogeneización de la preparación de las
células antes de preparar las alícuotas en los viales, tal como sucedería con métodos más tradicionales de conservación de lí-
neas de células. Por ende, se ve comprometida la uniformidad entre viales de líneas de células madre pluripotentes. Tercero,
congelar células madre pluripotentes como fragmentos de colonias conserva las uniones de brechas que se forman entre las
células, lo que potencialmente lleva a la propagación intercelular de cristales de hielo y la pérdida extensa de viabilidad.
Para evitar algunos de estos problemas, los analistas pueden usar la desagregación enzimática de colonias para simplificar y
acelerar la recolección de células y para mejorar la crioconservación de suspensiones de una sola célula más homogéneas antes
de la conservación. Como medida precautoria, algunos laboratorios eligen realizar la desagregación enzimática únicamente
antes de la crioconservación, pero no para el cultivo de rutina. Siempre que sea posible, los analistas deben usar agentes enzi-
máticos que no provengan de fuentes animales para la disociación celular. Otra característica importante de las líneas de célu-
las madre pluripotentes es la variable pero común incidencia de diferenciación no dirigida que ocurre dentro de las colonias y
que puede variar considerablemente a lo largo de muchas colonias en un cultivo. Las colonias con una alta proporción de célu-
las diferenciadas deben desecharse debido a que las células diferenciadas son un componente indeseable de un cultivo de cé-
lulas madre pluripotentes y pueden afectar las propiedades de las células no diferenciadas dentro de la colonia.
Puntos a Considerar para la Conservación de Líneas de Células Madre Pluripotentes
Los analistas deben considerar una variedad de factores importantes durante la conservación de líneas de células madre plu-
ripotentes que se deben tratar en los niveles de preparación, recolección, generación de bancos y análisis de inventarios crio-
conservados.
EVALUACIÓN
Y RECOLECCIÓN
Los analistas deben observar los cultivos celulares de manera regular. Se deben desechar los cultivos que presentan altos ni-
veles de células diferenciadas. Un investigador o instalación individual de generación de bancos debe contar con un programa
de control de calidad que evalúe la diferenciación de cultivos de manera regular, además de desarrollar niveles de umbral de
diferenciación aceptable en un cultivo. El protocolo de recolección, seguido del equilibrio de la muestra con agentes criopro-
tectores se debe llevar de manera expedita para minimizar las pérdidas celulares debidas a la recolección.
PROCESODE GENERACIÓNDE BANCOS
Los procedimientos convencionales de generación de bancos de células requieren el desarrollo de un banco de células maes-
tro y de un banco de células de trabajo. Las células del banco de células maestro deben conservarse a un número de pasajes
temprano (Pl O-P20) para que el trabajo experimental y de desarrollo de la línea celular se lleve a cabo en células al menor
número de pasajes posible. El primer banco de células de trabajo debe establecerse con el número mínimo de pasajes para
lograr el número de células requerido. Posteriormente, a fin de promover la uniformidad, los bancos de células de trabajo se
pueden volver a colocar en el mismo nivel de pasaje usando células del banco maestro según se requiera.
VIABILIDAD
Determinar la viabilidad y la función posterior a la descongelación de las células madre pluripotentes puede ser complicado
y a menudo se lleva a cabo de manera incorrecta. El método más común de evaluación posterior a la descongelación es el uso
de un colorante para evaluar la integridad de la membrana. Como una medida de la viabilidad, la fracción de células con
membranas intactas se compara con aquéllas que presentan membranas afectadas. Otro método relativamente común es
cuantificar las formaciones de colonias de células madre pluripotentes, en el cual se cuenta el número total de colonias sem-
bradas en una placa antes y después de un cierto tiempo de incubación. Este método también evalúa otras características fun-
cionales de las células, tales como su capacidad para adherirse y proliferar. Se debe tomar en cuenta que los procedimientos
tales como la recolección y la crioconservación pueden inducir la apoptosis. La tinción para marcadores apoptópicos tempra-
nos (fosfatidilserina en la superficie celular) o tardíos (Anexina VI) puede proveer información sobre la salud general de los cul-
tivos congelados o descongelados.
HOMOGENEIDAD
Tal como se describió con anterioridad, la conservación de fragmentos de colonias por vitrificación puede exacerbar la ca-
rencia de homogeneidad entre viales o pajuelas de células. Cuando se establecen bancos más grandes de células madre pluri-
potentes, los analistas deben analizar viales de prueba desde las posiciones tempranas, medianas y tardías en la secuencia de
llenado del banco de células para determinar la viabilidad, la velocidad de crecimiento y los marcadores clave según se indica
en Viabilidad.
CUALIDADDE LA CÉLULAMADRE
Para verificar que una línea de células madre pluripotentes no ha perdido ninguna de sus características de célula madre
durante la conservación, los analistas deben verificar la expresión de un número de marcadores clave relacionados con las célu-
las madre. Un estudio extenso analizó 59 líneas de células embrionarias humanas y un panel de 94 genes y resolvió cinco mo-
léculas relacionadas con células madre para las cuales el ARNm se expresó de manera constante en las células embrionarias
humanas. Estos genes hoy en día se incluyen en las tarjetas de genes de microfluidos comercialmente disponibles que se dise-
ñan específicamente para la investigación de poblaciones de células madre. Resulta crucial demostrar que las células madre
7474 (1044) Crioconservación de Células/ InformaciónGeneral USP42
pluripotentes han conservado su pluripotencia, posteriormente se puede realizar una variedad de pruebas de caracterización,
incluyendo la formación de teratoma en ratones inmunodeficientes, la formación de cuerpos embrionarios trilaminares y la di-
ferenciación dirigida para demostrar que el cultivo puede producir representantes de cada uno de los tres tejidos de capa ger-
minal que son necesarios para formar todas las células del cuerpo humano.
ESTABILIDAD
GENÉTICA
En ambas líneas de células madre pluripotentes inducidas y de células madre embrionarias humanas, resulta común el surgi-
miento de clones de cariotipo anormal en el pasaje extendido y el sobrecrecimiento del cultivo. Por ende, los analistas deben
monitorear los cultivos para detectar dichas células anormales. Tradicionalmente, esto se ha llevado a cabo mediante estudios
cariotípicos de células en metafase usando tinción con Giemsa. La ocurrencia de células no diploides, incluso a una incidencia
muy baja, puede ser problemática. Los documentos guía tales como la 2009 lnternational Stem Cell Banking lnitiative (Iniciati-
va Internacional para la Generación de Bancos de Células Madre) son útiles para determinar si dichos cultivos deben desechar-
se. No obstante, los procedimientos más recientes tales como la hibridación de arreglo comparativo de genomas y el arreglo
de polimorfismo de un solo nucleótido proveen análisis mucho más detallados de estabilidad genética y se pueden usar en
paralelo con bandeo con Giemsa para proveer una mayor confianza en términos de estabilidad genética.
MEJORESPRÁCTICAS
Además de seguir las buenas prácticas para cultivos celulares, los analistas deben tomar en cuenta la disponibilidad de una
guía específica que contenga principios y mejores prácticas para la adquisición, generación de bancos, análisis y almacena-
miento de células madre embrionarias humanas para propósitos de investigación (ver la referencia a la ISCB2009 en el Apéndi-
ce). Esta guía es útil para las líneas de células madre pluripotentes inducidas y de células madre embrionarias humanas.
SUSTRATOSCELULARES
USADOS EN LA PRODUCCIÓNY CARACTERIZACIÓDE
N PRODUCTOS
TERAPÉUTICOS
OBTENIDOSPOR BIOTECNOLOGÍA Y PRODUCTOSTERAPÉUTICOS
BIOLÓGICOS
Una amplia variedad de células recombinantes y no recombinantes se crioconservan y usan en la producción y caracteriza-
ción de productos biológicos y obtenidos por biotecnología humanos (se encuentra disponible más información en la guía ICH
QSD Derivationand Characterisationof CellSubstratesUsedfor Bíotechnologícal/BíologicProducts al [Derivación y Caracterización
de Sustratos Celulares Usados Para Productos Biotecnológicos/Biológicos]). Los grupos principales incluyen líneas de células de-
rivadas de mamíferos (incluyendo humanos), insectos (principalmente polillas) y cepas seleccionadas de bacterias y levaduras.
Los sustratos microbianos más comunes usados para la producción de productos humanos obtenidos por biotecnología son
cepas recombinantes de Escherichiacoli, Píchíapastoriso Saccharomyces spp. (levaduras). Independientemente del alto grado
de diversidad entre los tipos de células usadas para fabricar productos biológicos y obtenidos por biotecnología, existe un sor-
prendente grado de uniformidad entre las prácticas de crioconservación, y los mismos principios se aplican a células usadas
para la fabricación y a aquéllas usadas en pruebas para determinar la presencia de agentes adventicios y potencia de los pro-
ductos.
Por lo regular, se usa un sistema de generación de bancos de células de dos o tres niveles para el mantenimiento de líneas
de células de fabricación o cepas microbianas. Para aquéllos que usan un sistema de tres niveles, el banco del primer nivel
puede denominarse banco de investigación, de siembra, de inventario, de adquisición, banco previo al banco de células maes-
tro o banco de células parentales. La fuente del banco de células previo al banco de células maestro puede ser un laboratorio
de investigación o desarrollo, o las células pueden adquirirse en un depósito comercial. Es recomendable caracterizar el banco
de células parentales antes de usarlo en la clonación. El banco de células maestro o inventario de células maestro del segundo
nivel (o primer nivel en un sistema de dos niveles) se prepara directamente de este banco de células parentales con mínimos
pasajes o generaciones celulares. El banco de células maestro o el inventario de células maestro se analiza extensamente para
confirmar la pureza, el fenotipo, el genotipo, la expresión de proteínas u otros atributos importantes. El banco de células de
trabajo o inventario de células de trabajo se deriva a partir de viales del banco de células maestro después de pasajes sucesivos
en cultivo. El banco de células de trabajo es el sustrato de células de fabricación cuyo tamaño se incrementa a través de subcul-
tivos repetidos para sembrar el biorreactor de producción final, el fermentador o el lote de vasos de cultivo (p. ej., frascos ro-
dantes). En cada nivel del sistema de banco de células, la crioconservación adecuada es primordial para el éxito del desarrollo
del producto y de la fabricación. En algunos casos, las células del final de producción también se puede acumular en bancos
para propósitos de análisis como parte de la calificación del banco de células.
LíneasCelularesde Mamíferos e Insectos

Las líneas celulares de mamíferos son los sustratos celulares preferidos para la producción de moléculas de proteínas comple-
jas. Las células de mamíferos poseen la maquinaria biológica intrínseca necesaria para la glicosilación postranslacional de pro-
teínas que a menudo es crítica para la estabilidad y bioactividad en humanos. Ambas líneas celulares diploides y heteroploides
USP42 Información General/ (1044) Crioconservación de Células 7475
(incluyendo hibridomas) se usan para la producción de productos terapéuticos obtenidos por biotecnología. Las líneas celula-
res diploides son sustratos de vacunas comunes [p. ej., Wl-38 y MRC-5 (líneas celulares de fibroblastos humanos), BHK-21 (lí-
nea celular de riñón de hamster bebé) y MDCK (riñón canino Madin-Darby)]. Además, la línea celular Vero de mono verde
africano (una línea de células heteroploides) se usa para varias vacunas autorizadas en EE.UU.Hoy en día, las líneas celulares
heteroploides de uso común incluyen varias líneas celulares recombinantes de Ovario de Hámster Chino y de riñón embriona-
rio humano. Los métodos de crioconservación están bastante bien estandarizados para estas líneas celulares. No obstante,
puede resultar útil para los investigadores investigar la toxicidad de los diversos crioprotectores y concentraciones al usar un
nuevo sustrato celular.
Las líneas celulares de insectos han probado su capacidad para producir diversos polipéptidos recombinantes. Las líneas ce-
lulares más comunes se derivan de las polillas Spodotera frugiperda y Trichoplusiani, y sus líneas celulares establecidas se deno-
minan Sf9 y Tn5 (o "High Five"), respectivamente. La producción de proteínas recombinantes emplea la infección por baculo-
virus recombinante para la transferencia de genes heterólogos. Aunque las líneas celulares de insectos requieren diferentes fac-
tores nutricionales, temperaturas de incubación más bajas y mayor osmolaridad que sus contrapartes mamíferas, los mismos
elementos esenciales de crioconservación se aplican a ambos grupos.
Además de las guías provistas en la sección ElementosClave de la Práctica de Crioconservación,se deben tomar en cuenta
estos puntos adicionales para sustratos de líneas celulares animales:
PROCESAMIENTOPREVIOA LACONGELACIÓN
Los analistas deben asegurar que las células no están contaminadas y que aún son viables. Para células diploides, los analistas
deben fomentar el crecimiento hasta un nivel de pasaje que mantenga la diploidía y esté por debajo del nivel previsto para su
uso. Los analistas combinan cultivos celulares y realizan un recuento de células para determinar el número de células viables
disponibles para la generación de bancos. Las células recolectadas se centrifugan a una velocidad relativamente baja durante
un tiempo corto, p. ej., 100-200 x g durante 5-1 O minutos, de preferencia usando una centrífuga refrigerada.
AGENTESCRIOPROTECTORES
Y CRIOENVASES
El agente crioprotector de membrana permeable preferido es el DMSO al 5%-10% (v/v) diluido en medio de cultivo fresco.
Para algunas líneas celulares sensibles, el medio acondicionado para cultivo de células se puede agregar para complementar el
medio de crioconservación. El DMSO debe ser estéril y de grado para cultivo de tejidos (pureza >99%). El crioenvase más
apropiado es un vial con tapa de rosca de polipropileno preesterilizado diseñado para almacenamiento criogénico en fase de
vapor de nitrógeno líquido.
INTRODUCCIÓNDELMEDIO DE CRIOCONSERVACIÓN
Inmediatamente después de la centrifugación de las células, el medio de crecimiento se elimina de los pellets de células y las
células se resuspenden suavemente mediante la adición lenta de medio de crioconservación que a menudo se enfría previa-
mente para muchos tipos de células. La suspensión de células se diluye inmediatamente con un volumen apropiado de medio
de crioconservación basándose en el recuento de células viables y la densidad celular deseada (por lo regular, los bancos de
células se producen a una densidad de células viables de aproximadamente 1 x 10 7 células/mL). Tal como se mencionó en la
sección anterior, el medio de crioconservación es altamente hipertónico, por lo que se debe limitar el tiempo de exposición. La
suspensión de células final se transfiere a un vaso en el que las células se pueden mezclar suavemente durante el llenado del
vial para facilitar la uniformidad del banco de células.
ENFRIAMIENTO,CONGELACIÓNY ALMACENAMIENTO
CONTROLADOS
Los viales pueden llenarse manualmente usando un dispositivo de pipeteo manual o usando una máquina de llenado auto-
mático de viales. En cualquier caso, los viales a menudo se refrigeran a medida que el llenado progresa para minimizar los
efectos tóxicos potenciales del DMSO a temperaturas más altas. Se deben establecer límites de tiempo para todo el proceso de
llenado y registrarse en el registro de partida. Inmediatamente después de llenar los viales, los analistas deben transferirlos a un
congelador de velocidad controlada o, como alternativa, en un congelador estático ultrafrío (p. ej., -80º) usando un envase
aislado y diseñado para el enfriamiento controlado. Cualquier sistema de congelación controlada debe calificarse adecuada-
mente para asegurar que las velocidades de enfriamiento esperadas se apliquen para todos los viales dentro de la carga. Al usar
un congelador de velocidad controlada, los analistas determinan programas de enfriamiento óptimos de manera empírica, pe-
ro una velocidad en el intervalo de 1°-5º /minuto después de la transición a través del calor de la fusión debe ser aceptable
para la mayoría de las líneas celulares (en temperaturas más frías que aproximadamente -40º, la velocidad se puede incremen-
tar, p. ej., 1Oº/minuto). Después de que los viales se hayan congelado hasta una temperatura de aproximadamente -80° o
menor en el sistema de congelación, se transfieren lo más pronto posible a unidades de almacenamiento en fase de vapor de
nitrógeno líquido.
ENTIBIAMENTO
Y DESCONGELACIÓNDELVIAL
En general, las células congeladas a una velocidad de congelación lenta deben descongelarse a la mayor velocidad posible
para maximizar la viabilidad celular. Para asegurar la uniformidad de la temperatura, los viales deben transferirse directamente
desde el almacenamiento en fase de vapor de nitrógeno líquido a un transportador en fase de vapor (seco) portátil para su
transporte al laboratorio. En ocasiones, cuando no se cuente con un dispositivo Dewar de nitrógeno líquido, los viales pueden
empacarse en hielo seco, pero se debe demostrar que este proceso es adecuado debido a que puede resultar en cambios de
pH perjudiciales. Después de transferirlos al laboratorio, los viales se colocan directamente en un baño de agua tibia (p. ej., a
37º, asegurando que las tapas no queden sumergidas), en un baño de perlas o en un termobloque. Se debe tomar en cuenta
que las líneas celulares de insectos deben descongelarse a 27°-30º. Los viales deben agitarse para facilitar la descongelación
uniforme de las células. Inmediatamente después de la descongelación, los viales deben transferirse a la cabina de seguridad
biológica e higienizarse antes de abrirlos. Por lo regular, el medio de crecimiento se agrega lentamente a las células desconge-
ladas mientras se agita a fin de diluir el DMSO y reducir lentamente la osmolaridad del entorno posterior a la descongelación a
un nivel fisiológico.
PROCESAMIENTOPOSTERIORA LA DESCONGELACIÓN
Esta etapa se puede lograr con diversos métodos, pero los analistas deben conseguir una dilución suficiente del DMSO y
devolver a las células a su ambiente isotónico de crecimiento normal. Se debe minimizar la manipulación de las células inme-
diatamente después de la descongelación debido a las tensiones inducidas por el proceso de congelación-descongelación. Por
ejemplo, se debe minimizar el pipeteo y la centrifugación.
CEPASMICROBIANAS:E. COL/, LEVADURAY CEPASDE VACUNASBACTERIANAS

Las cepas de E.coli recombinantes cuentan con un registro de rastreo comprobado para la producción de una variedad de
productos obtenidos por biotecnología comercialmente disponibles, incluyendo análogos de insulina recombinantes, hormona
de crecimiento humana y hormona paratiroidea. En comparación con sus contrapartes mamíferas y derivadas de insectos, las
cepas de E. co/irecombinantes son relativamente simples de cultivar e incrementar el tamaño de los cultivos de producción
hasta volúmenes grandes de, p. ej., 40 000 L. No obstante, las bacterias carecen de la sofisticada maquinaria celular para cons-
truir moléculas de proteínas más complejas que requieren modificaciones postranslacionales tales como la glicosilación. Las le-
vaduras son células eucarióticas unicelulares que se pueden manipular genéticamente para producir un amplio rango de pro-
teínas recombinantes y péptidos con complejidad limitada. A pesar de las distancias evolucionarías entre los sustratos celulares
mamíferos y microbianos, se aplica el mismo conjunto de elementos esenciales para la crioconservación descritos con anteriori-
dad, con los siguientes puntos específicos:
PROCESAMIENTOPREVIOA LACONGELACIÓN
Los cultivos deben propagarse en matraces para agitación hasta una fase logarítmica tardía o estacionaria temprana usando
condiciones de crecimiento específicas para la cepa.
AGENTES
CRIOPROTECTORES
Y CRIOENVASES
El crioprotector de pared celular o de membrana celular permeable preferido es el glicerol (aunque también se usa en oca-
siones el DMSO) a concentraciones que por lo general van de 5%-10% (v/v). El glicerol sintético se debe usar para el registro
de productos comerciales junto con otras materias primas exentas de componentes de origen animal.
INTRODUCCIÓNEN EL MEDIO DE CRIOCONSERVACIÓN
Debido a que las células microbianas poseen paredes celulares para la protección y el sustento del contenido citoplásmico, la
manipulación física y los cambios osmóticos no tienen el mismo impacto negativo observado en las líneas celulares animales.
Inmediatamente después de la centrifugación, los pellets de células se resuspenden vigorosamente en medio de crioconserva-
ción (hasta una dilución basada en los requisitos del banco de células para el número de viales y las unidades formadoras de
colonias viables/mL). Esta etapa de dilución se puede basar en la medición activa de la densidad óptica del cultivo u otros en-
sayos de enumeración celular. La suspensión de células final se transfiere a un vaso en el que las células pueden mezclarse du-
rante el llenado de envasesfinales para facilitar la uniformidad del banco de células. Debido a la potencial toxicidad, los analis-
tas deben limitar el tiempo de exposición al glicerol, independientemente de la robustez relativa de las células microbianas.
Los viales pueden llenarse manualmente usando un dispositivo de pipeteo manual o usando una máquina de llenado automá-
tico de viales.
USP42 InformaciónGeneral/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 7477
ENFRIAMIENTO,CONGELACIÓNY ALMACENAMIENTO
CONTROLADOS
Una vez más, debido a su robustez inherente, las células microbianas no requieren un control tan estricto de la velocidad de
enfriamiento como las líneas celulares animales. Por consiguiente, la elección del sistema o método de congelación tiene un
efecto menor sobre la viabilidad del banco de células. Los crioenvases llenos simplemente pueden ser transferidos a un conge-
lador a aproximadamente -80º durante toda la noche seguido de una transferencia a la fase de vapor de nitrógeno líquido.
Como alternativa, podría omitirse el almacenamiento de los bancos de células microbianas en nitrógeno líquido y almacenar-
los a una temperatura de aproximadamente -80º. Sin embargo, si se dispone de almacenamiento en nitrógeno líquido, éste se
prefiere para el almacenamiento a largo plazo (p. ej., años). Si se utiliza un congelador de velocidad controlada, entonces debe
someterse a una calificación completa para asegurar que provea una velocidad de enfriamiento uniforme que esté dentro de
un intervalo esperado, p. ej., 1º-5º/minuto.
ENTIBIAMIENTO
Y DESCONGELACIÓNDELENVASE
El control de las velocidades de enfriamiento y entibiamiento resulta menos crítico para las células microbianas, aunque tam-
bién se deben descongelar lo más rápido posible usando un baño de agua tibia (p. ej., 30°-35º). Las temperaturas se pueden
ajustar a la temperatura de incubación de la cepa.
PROCESAMIENTOPOSTERIORA LA DESCONGELACIÓN
Se agrega medio de crecimiento para diluir las células descongeladas hasta un nivel deseado de unidades formadoras de
colonias/mL y para inducir la eliminación del glicerol intracelular.
Todas las células se crean de manera distinta y son divergentes por naturaleza. Los sustratos celulares usados para la fabrica-
ción de productos biológicos y obtenidos por biotecnología humanos están separados por un amplio periodo evolutivo. Afor-
tunadamente para las personas dedicadas a los cultivos celulares industriales, las estrategias de crioconservación se reúnen en
un conjunto de principios y métodos compartidos que se traducen a lo largo de las vías evolutivas.
APÉNDICE
Guías Útiles
• FDA. Guidance for industry: characterization and qualification of cell substrates and other biological materials used in the
production of viral vaccines for infectious disease indications. 201 O. http://www.fda.gov/downloads/biologicsb1oodvacci-
nes/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/vaccines/ucm202439.pdf. Consultado el 24 de septiembre de
2012.
• ICCBBA.OECD best practices guidelines for BRCs[128 Standard Technical Specifications]. 2007. http://www.iccbba.org/.
Consultado el 01 de octubre de 2012.
• ICH. Q5D Derivation and characterisation of cell substrates used for biotechnological/biological products. 1997. http://
www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/lCH_Products/Guidelines/Quality/Q5D/Step4/Q5D_Guideline.pdf. Consultado el
25 de julio de 201 3.
• Coecke S, Balls M, Bowe G, et al. (2005). Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAMTask
Force on Good Cell Culture Practice, Altern Lab Anim. 2005; 33(3):261-287.
• Andrews PW, Arias-Diaz J,Auerbach J,et al. Consensus guidance for banking and supply of human embryonic stem cell
lines for research purposes: lnternational Stem Cell Banking lnitiative. Stem Cell Rev.2009; 5(4):301-314.
• WHO. Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medici-
nal products and for characterization of cell banks. 201 O. http://www.who.int/biologicals/Cell_Substra-
tes_clean_version_ 18_April.pdf. Consultado el 26 de julio de 2013.
(1046) PRODUCTOSDERIVADOS
DE CÉLULAS
Y TEJIDOS
INTRODUCCIÓN
Este capítulo general proporciona una visión cabal sobre los aspectos a considerar para el desarrollo de productos derivados
de células y tejidos. El Glosariode Términosy Definicionesproporciona una lista de términos comúnmente usados en este cam-
po. Las terapias celulares y tisulares emplean productos médicos que contienen células humanas o animales que se administra-
rán en humanos para reparar, reemplazar, regenerar o aumentar una célula, tejido u órganos enfermos, lesionados o disfuncio-
nales de un receptor. Las células o tejidos pueden ser recolectados para su uso sin manipulación o se pueden propagar, expan-
7478 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ InformaciónGeneral USP42
dir, tratar farmacológicamente o alterar de otra manera sus características biológicas ex vivo antes de la administración. La di-
versidad de indicaciones clínicas y tipos de productos derivados de células y tejidos se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1. Ejemplos de Productos de Terapia Celular
Indicación Producto
Células madre y progenitoras hematopoyéticas que se han recolectado, propa-
Transplante de células madre hematopoyéticas después de la terapia gado, seleccionado y/o tratado para eliminar células contaminantes mediante
de ablación dispositivos y/o reactivos
Células T, células asesinas naturales (o Células NK, por sus siglas en inglés), cé-
lulas dendríticas o macrófagos expuestos a péptidos específicos del cáncer pa-
ra producir una respuesta anticancerígena; células cancerosas autólogas o alo-
génicas modificadas genética o bioquímicamente e irradiadas para producir
Cáncer una respuesta anticanceríqena
Diabetes Células fJ de los islotes pancreáticos encapsuladas
Células madre/progenitoras autólogas o alogénicas; miocitos del músculo es-
Infarto de miocardio Quelético; células madre cardíacas
Enfermedad del injerto contra el anfitrión Células madre mesenquímales alogénícas
Queratinocitos autólogos o fibroblastos dérmicos alogénicos en un andamiaje
Cicatrización de heridas biocompatible
Defectos focales en el cartílaqo de la rodilla Condrocitos autóloqos o aloqénicos con o sin andamiaje biocompatíble
Reparación ósea Células madre mesenquímales en un andamiaje biocompatíble
Células progenitoras neuronales derivadas de tejidos embrionarios, fetales o
adultos; células modificadas genéticamente para secretar factores neurotrófi-
Enfermedades neurodeqenerativas cos, con o sin encapsulación
Enfermedad infecciosa Células T activadas
Enfermedad autoínmune Células T reguladoras (T=)
Lesión de la médula espinal Células proqenitoras neuronales
Células autólogas o alogénicas en bíomateríales biocompatibles (geles) o es-
Reparación o regeneración de órganos tructura de andamiaje en 3 dimensiones
Los productos de terapia celular se pueden modificar mediante tratamiento con materiales genéticos de integración o no
integrados (ADN, ARN,ARN pequeño de interferencia, etc.) con el objetivo de cambiar el patrón de expresión genética. Por lo
general, se extraen células de un paciente, se modifican fuera de su cuerpo y luego se retornan al paciente. Las agencias regla-
mentarias consideran al producto celular modificado genéticamente ex vivo como un producto de terapia génica. Una gran
parte de la información de este capítulo general es pertinente al procesamiento, caracterización, fabricación y administración
de células modificadas genéticamente. Sin embargo, la información detallada acerca del uso de varios sistemas de transferen-
cia de genes, consideraciones para el monitoreo del paciente, análisis genético y demás consideraciones pertinentes a produc-
tos de terapia génica, se tratan en el capítulo general Productosde TerapiaGénica(1047).
Este capítulo general describe aspectos relacionados con la fabricación, la obtención de componentes y la caracterización de
productos derivados de células y tejidos para asegurar su seguridad y eficacia. El Apéndicepresenta una lista de guías y docu-
mentos reglamentarios relevantes. Los fabricantes de productos derivados de células y tejidos deben considerar y aplicar los
controles y procedimientos descritos en este capítulo para asegurar el uso seguro de los productos en humanos. Se están desa-
rrollando y validando continuamente nuevas metodologías, las cuales serán incluidas en la Farmacopea de los Estados Unidos
(USP)a medida que se encuentren disponibles. Las monografías de USPpara productos tisulares específicos y derivados de teji-
dos describen las especificaciones de prueba con las que debe cumplir el producto durante toda su vida en el mercado. El
término producto celularse refiere a células o tejidos de humanos o animales vivos que han sido manipulados o que se usan de
modo tal que se reglamentan como terapias celulares somáticas, conforme a lo definido por la US Food and Drug Administra-
tion (Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU.o FDA).El término producto derivadode tejidosse refiere a tejidos
humanos que se reglamentan de conformidad con las buenas prácticas para tejidos (GTP, por sus siglas en inglés). El término
productosde combinaciónse refiere a células combinadas con dispositivos médicos, tales como un andamiaje natural o sintéti-
co.
Consideracionespara la Incorporaciónde Conceptosdel Sistemade Calidad en las Etapas

Tempranasdel Desarrollode ProductosDerivadosde Célulasy Tejidos
Los requisitos reglamentarios vigentes y futuros continuarán presentando desafíos a los que desarrollan productos derivados
de células y tejidos en lo que respecta a incorporar atributos robustos de calidad en etapas tempranas de la fase de diseño para
asegurar el énfasis en la seguridad del paciente mediante un alto grado de entendimiento del proceso. Los sistemas de calidad
modernos que armonizan las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes (BPFv)con otros sistemas reglamentarios farmacéuticos
generados fuera de EE.UU.[tales como la lnternational Conference on Harmonization (Conferencia Internacional sobre Armo-
nización o ICH) y la lnternational Organization for Standardization (Organización Internacional para la Estandarización o ISO)]
y el sistema de calidad para dispositivos médicos de la FDAse reconocen como las nuevas normas mundiales. Estas nuevas
normas incluyen conceptos para desarrollo de producto tales como Calidad por Diseño (QbD, por sus siglas en inglés) y Tec-
nología Analítica de Procesos (PAT,por sus siglas en inglés). Asimismo, estos sistemas de calidad integran métodos para el me-
joramiento continuo y la gestión de riesgos que promueven la adopción de los avances científicos más recientes y de tecnolo-
gías innovadoras de fabricación.
El uso de los principios de Gestión de Riesgo de Calidad (QRM, por sus siglas en inglés) en etapas tempranas del desarrollo
del producto puede ser útil para la identificación de áreas de riesgo que pueden mitigarse antes de que sean incorporadas al
proceso de fabricación y afecten la seguridad y eficacia del producto. Los que desarrollan productos derivados de células y
tejidos deben emplear técnicas de gestión y evaluación de riesgos como componentes claves de sus sistemas de calidad. La
gestión de riesgosse define como un proceso sistemático para la identificación, evaluación y control de riesgos a favor de la
calidad del producto derivado de células o tejidos durante todo el ciclo de vida del producto. El uso de técnicas de QRM pue-
de ayudar a conseguir productos seguros y eficaces mediante la evaluación de riesgos para el paciente, la determinación de
límites en el espacio de diseño o el ranking de atributos de calidad. La QRM también ayuda a establecer y mantener un estado
de control mediante el uso de gestión de riesgos para conducir el control del proceso. Por último, la QRM se puede usar para
facilitar el mejoramiento continuo dando prioridad a las oportunidades de mejoramiento. El nivel de esfuerzo, formalidad y
documentación del proceso de gestión de riesgos debe ser acorde al nivel de riesgo, debe basarse en conocimientos científicos
y, finalmente, debe estar vinculado con la protección del paciente.
Los elementos de gestión de riesgo se han convertido en un paradigma aceptado y se pueden encontrar fácilmente en do-
cumentos guía reglamentarios de la FDAe internacionales, especialmente el documento ICH Q9. Para facilitar esta evaluación,
se han desarrollado diversas herramientas, las cuales proporcionan medios cuantificables para priorizar riesgos de manera que
se puedan identificar y corregir los elementos de más alto riesgo de un proceso.
Dependiendo del objetivo del programa de gestión de riesgo, los análisis de riesgo pueden presentar un grado mayor o me-
nor de formalidad. De manera preliminar, los análisis de riesgo menos formales entran en acción cuando es necesario acelerar
una evaluación de riesgos, por ejemplo para la resolución de un incumplimiento de fabricación. Resulta necesario un sistema
de evaluación de riesgos más formal para el desarrollo de procesos o productos, lo cual es especialmente importante cuando
se deben priorizar recursos limitados. Los sistemas formalizados se integran en herramientas bien establecidas que pueden
cuantificar riesgos en cada fase o etapa de la fabricación. Estos sistemas también se pueden usar para la evaluación de opcio-
nes de materias primas, establecimiento de prioridades de validación, alteraciones en las instalaciones, cambios de equipo y
deliberaciones sobre servicios.
Las herramientas formales de análisis de riesgos incluyen el mapeo del proceso, el análisis preliminar de riesgos, el Análisis de
Riesgo y Puntos Críticos de Control (HACCP,por sus siglas en inglés), el Análisis de Riesgo y Operabilidad (HAZOP,por sus
siglas en inglés), el Análisis por Árbol de Fallas (FTA,por sus siglas en inglés), el Análisis de Modo y Efecto de Fallas (FMEA,por
sus siglas en inglés) y el Análisis de Modo, Efecto y Criticidad de Fallas (FMECA,por sus siglas en inglés).
En lo que respecta a productos derivados de células y tejidos, el FMEAse ha usado comúnmente para identificar, cuantificar
y priorizar riesgos. El FMEApuede asignar una clasificación numérica en una de tres categorías:
• Severidad,que es la consecuencia de una falla;
• Ocurrencia,que es la probabilidad de que ocurra la falla basándose en experiencias o incumplimientos anteriores; y
• Detección,que se basa la capacidad para detectar la falla.
Se asigna una clasificación numérica a cada categoría (por lo regular del 1 al 5 o del 1 al 1O) que corresponde a la severidad de
la variación con respecto al intervalo del parámetro operativo, la probabilidad de una variación y la posibilidad de detectar una
variación antes de que afecte el producto. Los números menores denotan una probabilidad remota de detección, mientras que
los números más altos denotan la posibilidad de una falla o efecto de riesgo. El producto de los valores de severidad, ocurren-
cia y detección representa un Número de Prioridad de Riesgo (RPN, por sus siglas en inglés). Durante el proceso de evaluación
de riesgos se priorizan los RPN y se puede dirigir la solución más inmediata a las áreas de riesgo más elevado.
COMPONENTESUSADOS EN LA FABRICACIÓN
DE PRODUCTOSDERIVADOSDE CÉLULASY
TEJIDOS
Introducción
Los fabricantes de productos derivados de células y tejidos deben asegurarse de que todos los componentes usados en la
fabricación sean adecuadamente calificados. Los ejemplos de componentes usados en la fabricación de productos de terapia
celular o tisular incluyen células y tejidos de origen; biomateriales naturales o sintéticos; materiales auxiliares requeridos duran-
te la fabricación pero que no están destinados a aparecer en el producto terapéutico final; y excipientes usados en la formula-
ción de productos de terapia celular o tisular.
La calificación es el proceso de adquisición y evaluación de datos para establecer el origen, identidad, pureza, seguridad bio-
lógica y aptitud general de un componente específico para garantizar la calidad. La diversidad de productos de terapia celular
y tisular y de los materiales usados para producirlos dificulta recomendar pruebas o protocolos específicos para un programa
de calificación. Por lo tanto, se deben desarrollar programas racionales y científicamente sólidos para cada componente.
Las actividades de calificación de materiales cambiarán a medida que los productos pasen de la etapa de estudios clínicos a
la de obtención de autorizaciones y comercialización. Un programa de calificación bien diseñado se hace más exhaustivo a
medida que progresa el desarrollo del producto. Durante las etapas tempranas del desarrollo del producto, las cuestiones de
7480 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP42
seguridad deben ser el foco principal de un plan de calificación de materiales. En las etapas posteriores, las actividades de califi-
cación de materiales deben desarrollarse completamente y cumplir con las BPFv.
Calificación de las Fuentes de Células y Tejidos
Diversas células y tejidos derivados de humanos y animales sirven como material de origen para productos derivados de cé-
lulas y tejidos. Las células de donantes que se pueden utilizar en los productos de terapia celular provienen de diferentes fuen-
tes:
1. Las células propias del paciente (productos celulares autólogos)
2. Las células de otro ser humano (productos celulares alogénicos)
3. Las células derivadas de animales (productos celulares xenogénicos)
El origen de las células usadas para una terapia celular o tisular determinada depende en gran medida de la compatibilidad,
pureza y disponibilidad. El uso de células autólogas presenta la ventaja de un mínimo nivel de inquietudes con respecto al re-
chazo inmunológico. No obstante, no siempre se cuenta con una fuente autóloga o o ésta no siempre es apropiada cuando el
tipo de célula es disfuncional, maligna, difícil de obtener o si está contaminada.
La alternativa es una fuente de células alogénicas compatibles que esté fácilmente disponible. La incompatibilidad inmunoló-
gica representa la principal preocupación con respecto al uso de fuentes de células alogénicas pues puede llevar al rechazo de
la terapia celular o tisular administrada. En receptores inmunocomprometidos, las células de donante pueden reaccionar con
las células del paciente, lo que puede resultar en la enfermedad del injerto contra el anfitrión, poniendo en riesgo la vida del
paciente. A pesar de las potenciales complicaciones del uso de células o tejidos de donantes alogénicos y ante la ausencia de
otras alternativas, la relación riesgo-beneficio es a menudo favorable. Existen diversas metodologías que sortean con éxito las
barreras inmunológicas para el uso de fuentes alogénicas. Los fármacos inmunosupresores desarrollados para el transplante de
órganos sólidos, así como los avances en la inducción de tolerancia inmune se aplican cada vez más al transplante de células.
Algunas células alogénicas desencadenan reacciones inmunológicas mínimas, incluso en receptores HLAincompatibles. Los
ejemplos incluyen células madre mesenquimales, algunas células dérmicas y epidérmicas y fibroblastos.
Pese a los avances en la derivación de nuevos tipos de células terapéuticas, particularmente células madre (células de adulto,
fetales, embrionarias y de pluripotencia inducida), la capacidad de generar ciertos tipos de células o tejidos aún está muy lejos
de ser alcanzada. Por consiguiente, los procesos actuales usan células y tejidos xenogénicos para tratar diversas enfermedades
o condiciones en los seres humanos. El uso de células xenogénicas debe atender inquietudes relacionadas con el rechazo in-
munológico y la transmisión de virus animales a los seres humanos (ver FuentesAnimalesde Célulasy Tejidos,más adelante).
Algunos principios generales para la obtención de tejidos incluyen lo siguiente: (1) los sistemas deben permitir la rastreabili-
dad retrospectiva del material hasta el donante, mientras se cumple la legislación sobre privacidad; (2) deben tomarse medidas
para prevenir la transmisión de enfermedades infecciosas del donante al receptor; y (3) la obtención y el procesamiento asépti-
cos deben garantizar la seguridad del producto final, debido a que no es posible la esterilización terminal de productos que
contienen células y tejidos vivos. La FDAha promulgado un conjunto de reglamentos específicos, referidos como Buenas Prác-
ticas para Tejidos (GTP), que tratan específicamente la necesidad de obtener y procesar tejidos de una manera tal que evite la
transmisión de una enfermedad transmisible. Se deben seguir las GTP y/o BPFpara productos de terapia celular o tisular, de-
pendiendo del origen de la célula y de su lugar en el ciclo de vida del producto.
ELEGIBILIDAD
DELDONANTE
La FDAha promulgado un conjunto integral de reglamentos que rigen el uso de tejidos y células humanos destinados para
implantes, transplantes, infusión o transferencia a un receptor humano. Se hace referencia a estos materiales como células y
tejidos o productos derivados de células y tejidos humanos (HCT/P, por sus siglas en inglés). El cumplimiento con los requisitos
de elegibilidad de donantes es de suma importancia para la obtención de HCT/P para uso médico, debido a que estos instru-
yen que es obligatorio revisar los registros médicos pertinentes de un donante para evaluar los factores de riesgo y la evidencia
clínica de agentes infecciosos transmisibles. Esto incluye la obtención de un historial médico y la realización de un examen
físico al donante para detectar enfermedades transmisibles. Asimismo, los donantes deben someterse a análisis de laboratorio
adecuados usando kits de prueba autorizados o aprobados por la FDApara enfermedades y agentes de enfermedades específi-
cos relevantes (RCDAD,por sus siglas en inglés). El examen de detección de enfermedades requerido será cada vez más amplio
a medida que se identifiquen nuevos RCDADy se encuentren disponibles kits de prueba aprobados o autorizados por la FDA.
Dos fuentes de información sobre el examen de detección de enfermedades transmisibles son: la Guidanceon EligibilityDeter-
mination for Donorsof Human Ce/Is,Tissues,and Ce/fufarand Tissue-Based Products(Guía sobre la Determinaciónde Elegibilidadde
Donantesde Célulasy Tejidosy ProductosDerivadosde Célulasy TejidosHumanos)de la FDAy la Circularof lnformation (Circular
Informativa) de la MBB (http://www.aabb.org/Content/About_Blood/Circulars_of_lnformation/aabb_coi.htm). No se requiere
determinar la elegibilidad de donante para HCT/P autólogos.
USP42 InformaciónGeneral/ (1046) ProductosDerivadosde Célulasy Tejidos 7481
CÉLULASY TEJIDOSO PRODUCTOSDERIVADOSDE CÉLULASO TEJIDOSHUMANOS
Los HCT/P se pueden obtener de donantes comunes sanos, donantes cadavéricos o pacientes enfermos, por ejemplo, de
cáncer. Se debe evaluar la aptitud del tejido obtenido de pacientes con cáncer y otras enfermedades antes de la recolección
para asegurar la seguridad y el funcionamiento adecuados del producto de terapia celular final. Asimismo, la reglamentación
del Título 45 del CFR Parte 46 se aplica a todas las investigaciones en humanos financiadas por el gobierno federal. Esta regla-
mentación requiere que el uso de cualquier tejido extraído de donantes humanos sea examinado y aprobado por una Junta de
Revisión Institucional. Asimismo, esta reglamentación incluye consideraciones especiales para la investigación en presos, niños,
mujeres embarazadas o tejidos gestacionales. En todos los casos, se debe obtener el consentimiento adecuado, por escrito, del
donante o del pariente más cercano, que incluya una descripción del tejido a extraer y del uso previsto.
Se debe minimizar el riesgo de transmisión de enfermedades al operador de la fabricación mediante capacitación adecuada
sobre la manipulación de materiales potencialmente infecciosos y mediante el uso de equipo y vestimenta de protección. Los
tejidos deben obtenerse usando controles y condiciones ambientales que permitan la recuperación aséptica con un alto grado
de seguridad.
Las células progenitoras hematopoyéticas (HPC, por sus siglas en inglés) son uno de los tipos de célula más utilizados para el
transplante humano. Estas células se pueden obtener de la médula ósea, de la sangre periférica o de la sangre del cordón um-
bilical. El origen de las células depende del paciente, la enfermedad y el protocolo clínico. Los métodos de procesamiento de
las células son similares, independientemente de su origen. Las HPC se pueden obtener de donantes saludables o pacientes
con trastornos hematológicos. Además de las reglamentaciones sobre HCT/P de la FDA, la American Association of Blood
Banks (Asociación Estadounidense de Bancos de Sangre o AABB), la Foundation for the Accreditation of Hematopoietic Cell
Therapy (Fundación Para la Acreditación de la Terapia de Células Hematopoyéticas) y el National Marrow Donor Program (Pro-
grama Nacional de Donantes de Médula o NMDP) han publicado guías y normas aplicables a la recolección y el procesamien-
to de estos materiales.
Para fuentes de células o tejidos obtenidos de muestras quirúrgicas o de donantes cadavéricos, se aplican las prácticas co-
rrientes de salas de operación de hospitales. La calidad del aire en una sala de operación con acceso limitado típica es adecua-
da para dichos procedimientos. El personal de recolección debe tener la capacitación adecuada en todos los aspectos relativos
a la recuperación de tejidos: lavado quirúrgico, vestimenta, comportamiento dentro de la sala de operación, anatomía, prepa-
ración del sitio de intervención y técnica aséptica. Se requiere especial cuidado cuando la obtención de tejidos u órganos re-
quiera la manipulación prolongada del intestino, lo cual conlleva el riesgo de que se produzca una punción involuntaria del
intestino. Si el tejido contiene flora microbiana (p. ej., la piel), puede ser desinfectado adecuadamente en el momento de la
extracción con agentes antimicrobianos o bactericidas y un lavado minucioso.
FUENTESANIMALESDE CÉLULAS
Y TEJIDOS
Resultaría ideal que los productos de terapia celular constaran de células humanas fabricadas con una mínima exposición a
materiales derivados de animales. Sin embargo, en la actualidad, importantes necesidades médicas no satisfechas pueden ser
potencialmente tratadas mediante productos de terapia celular de células o tejidos animales, tales como los islotes pancreáti-
cos destinados al tratamiento de la diabetes. Las fuentes humanas de islotes pancreáticos están disponibles únicamente de
páncreas donados al momento de la muerte. La calidad de los islotes del donante de órganos es variable y el suministro dispo-
nible es inadecuado para satisfacer la potencial demanda. Un método consiste en obtener islotes pancreáticos de fuentes ani-
males apropiadamente calificadas para su uso subsiguiente en humanos (xenotransplante).
Los desarrolladores que pretenden usar células o tejidos animales en un producto de terapia celular deben tratar adecuada-
mente las cuestiones de salud pública y deben desarrollar metodologías para reducir el riesgo potencial de introducción y pro-
pagación de agentes infecciosos zoonóticos en la población general humana. La PHSGuidelineon lnfectious Visease/ssuesin
Xenotransplantation (Guía sobre Cuestiones Relacionadas con Enfermedades Infecciosas en Xenotransplantes del Servicio de Sa-
lud Pública de EE.UU.)(enero de 2001) describe riesgos potenciales. La guía de la FDASourceAnimal, Product, Preclinical,and
Clínica//ssuesConcerningthe Useof Xenotransplantation Productsin Humans (Aspectos sobre Fuentes Animales, Productos, Pre-
clínicos y Clínicos Relacionados con el Uso de Productos de Xenotransplante en Humanos) (abril 2003) presenta métodos y
expectativas actuales para minimizar los riesgos de los productos celulares xenogénicos.
El uso de tejido animal en la fabricación de productos de terapia celular requiere que el tejido se obtenga de una manera
controlada y documentada y que provenga de animales libres de patógenos designados, que hayan sido criados en cautiverio
en países o regiones geográficas con sistemas adecuados de prevención y control de enfermedades. Asimismo, el cuidado y
uso de animales debe ser aprobado por una comisión institucional acreditada para el cuidado y uso de animales. Los animales
donantes deben tener un linaje documentado, provenir de manadas o colonias cerradas y estar en programas de manteni-
miento y control de salud. Las instalaciones para albergar a estos animales deben estar certificadas por el USDA(Departamento
de Agricultura de los Estados Unidos) (para animales vertebrados grandes) o por la Association for Assessment and Accredita-
tion of Laboratory Animal Care lnternational (Asociación para la Evaluación y la Acreditación del Cuidado de Animales de Labo-
ratorio; AAALAC,por sus siglas en inglés) (para animales vertebrados pequeños) y deben cumplir con las recomendaciones es-
tablecidas por la Cuide for the Careand Useof LaboratoryAnimals (National Research Council, 1996) (Guía para el Cuidado y la
Utilización de Animales de Laboratorio del Consejo de Investigación Nacional, 1996), que se puede obtener a través de la AAA-
LAC(www.aaalac.org). Estas instalaciones deben contar con veterinarios y demás personal capacitado que garantice la salud
de los animales y la prevención de enfermedades. Los procedimientos empleados en las instalaciones deben estar documenta-
dos y se deben guardar registros. Los programas de mantenimiento y control de salud deben basarse en la atención veterinaria
estándar para cada especie, incluyendo exámenes físicos, monitoreo, pruebas de diagnóstico de laboratorio y vacunaciones.
Un método de partidas sucesivas o de ingresosy egresostotales (ali-in-ali-out) para trasladar a los animales en las instalaciones
puede minimizar el potencial de transmisión de agentes infecciosos.
Los componentes alimenticios deben estar documentados y excluir material reciclado o procesado a fin de reducir el riesgo
de enfermedades priónicas.
Para garantizar al máximo la seguridad del producto, tanto los donantes animales como sus tejidos deben ser examinados
en varias etapas del proceso para descartar la presencia de agentes microbianos. Estas pruebas de control deben emplear ensa-
yos que sean lo suficientemente sensibles y específicos para detectar bacterias, micoplasma, hongos o virus de interés. Los ani-
males donantes deben someterse a estudios de detección de enfermedades pertinentes antes de la extracción del tejido. Las
necropsias posteriores a la recuperación de tejidos, los programas de animales centinela y el archivo de órganos, tejidos, san-
gre y otras muestras de donantes también garantizan la seguridad del tejido animal para aplicaciones de terapia celular.
En general, se aplican condiciones de extracción aséptica similares en la obtención de tejido animal y humano. El tejido debe
obtenerse usando controles y condiciones ambientales que permitan la recuperación aséptica con un alto grado de seguridad.
Se deben utilizar instalaciones especialmente diseñadas para la extracción de tejidos, por lo general, en estrecha relación con la
instalación que alberga a los animales. Las características y atributos recomendados para las instalaciones de extracción de teji-
do animal deben incluir lo siguiente: (1) organización de etapas tales como afeitado, sedación y preparación para la sala de
operaciones en salas diferentes con controles ambientales apropiados; (2) filtración de partículas del aire de alta eficiencia
(HEPA,por sus siglas en inglés); (3) instalaciones contiguas pero separadas para continuar con el procesamiento de tejidos; y
(4) áreas destinadas al retiro de cadáveres. Todo lo relacionado a la capacitación del personal, la manipulación y la punción del
intestino, y la desinfección se aplican a la extracción quirúrgica tanto de tejidos humanos como animales (ver la sección Células
y Tejidoso ProductosDerivadosde Célulasy TejidosHumanosanterior). Cuando los investigadores establecen líneas celulares ani-
males para su uso como capa de células alimentadoras, es necesario crear, analizar y caracterizar bancos de células, según se
indica en la siguiente sección.
SISTEMADE BANCOSDE CÉLULAS
Un banco de células es un conjunto de células obtenidas de células combinadas o derivadas de un único don celular o tejido
de donante que se almacena en bolsas o viales en condiciones definidas que mantienen la estabilidad genotípica y fenotípica.
El sistema de bancos de células por lo general se compone de un banco maestro de células (MCB, por sus siglas en inglés) y un
banco de células de trabajo (YvCB,por sus siglas en inglés), aunque es posible emplear otras metodologías. El MCB se produce
de acuerdo con las BPFvy, preferentemente, se obtiene de una fuente calificada (exenta de agentes adventicios) con antece-
dentes conocidos y documentados. Las células y tejidos humanos se deben obtener mediante un contratista autorizado para
adquisición de tejidos con un programa de calificación de donante que cumpla con el Título 21 del CFR 1271. ElWCB se ob-
tiene o produce mediante la expansión de uno o más viales del MCB. El WCB, o el MCB en los ensayos iniciales, se convierte
en la fuente de células para cada partida producida para uso humano. Los sistemas de bancos de células contribuyen en gran
medida a la uniformidad en la producción de partidas debido a que el material celular inicial es siempre el mismo. No obstan-
te, no siempre es posible o factible crear un banco de células, de modo que se pueden usar células primarias apropiadamente
analizadas y calificadas en lugar de crear bancos de células. Como mínimo, el MCB y el WCB deben analizarse para determinar
su identidad, esterilidad, pureza, viabilidad y la presencia de virus y micoplasma.
CALIFICACIÓN
DE BANCOSDE CÉLULAS
El análisis de seguridad y la caracterización de bancos de células son etapas importantes para obtener un producto final uni-
forme que mantenga una uniformidad de lote a lote y que se mantenga exento de agentes adventicios. La norma ICH QSA,
Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Unes of Human or Animal Origin (Evaluación de Seguridad
Viral de Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal) proporciona recomendaciones
específicas para el análisis de bancos de células para agentes virales. Aunque esta guía no está específicamente destinada para
los productos derivados de células o tejidos, por lo general se pueden aplicar las mismas pruebas. Pueden ser necesarios análi-
sis de virus adicionales dependiendo del predominio de enfermedades virales endémicas en la población donante. Los análisis
para calificar los MCB se realizan una sola vez y se pueden hacer con una alícuota del material del banco o con cultivos de
células derivados del banco de células. Se deben establecer especificaciones de manera prospectiva para la calificación del
MCB. Es importante documentar los antecedentes del MCB, los métodos y reactivos empleados para crear el banco y las con-
diciones de almacenamiento. Todos los materiales auxiliares requeridos para la producción de los bancos, tales como medios,
sueros, citoquinas, factores de crecimiento y enzimas también deben ser calificados, documentados y analizados de manera
apropiada.
USP42 InformaciónGeneral/ (1046) Productos Derivadosde Célulasy Tejidos 7483
ANÁLISISDE SEGURIDADDE LOS MCB Y WCB
Banco Maestro de Células (MCB)-EI análisis de seguridad para calificar el MCB incluye análisis para demostrar la ausencia
de agentes adventicios y virus endógenos. Los análisis de agentes adventicios deben incluir pruebas de detección de bacterias,
hongos, micoplasma y virus. La ausencia de virus adventicios debe comprobarse utilizando sistemas de prueba tanto in vitro
como in vivo y pruebas adecuadas específicas para la especie.
Banco de Células de Trabajo (WCB)-EI análisis de seguridad para el WCB es menos extenso y por lo general se enfoca en
el potencial de introducción de virus adventicios o en la activación de virus latentes durante el cultivo adicional requerido para
crear el WCB. Asimismo, se debe llevar a cabo el análisis de seguridad del final de la producción (EOP, por sus siglas en inglés)
para asegurar que las células se puedan expandir en un número máximo conocido de generaciones, a la vez que continúen
generando un producto aceptable. Para información acerca de los tipos de análisis de virus adventicios que deben realizarse a
las células del MCB, del WCB y EOP, consulte el capítulo Evaluaciónde la SeguridadViral en ProductosBiotecnológicosObtenidos
de LíneasCelularesde Origen Humano o Animal (1050).
CARACTERIZACIÓN
DE LOS MCB Y WCB
La caracterización de los MCB y WCB incluye el análisis de identidad para establecer el origen de las especies, p. ej., análisis
de isoenzimas para confirmar el origen humano de las células. No obstante, la caracterización de los bancos de células debe
incluir evaluaciones adicionales como las que se mencionan a continuación:
• Cinética de crecimiento y tiempo de duplicación de la población
• Evaluación morfológica
• Porcentaje de confluencia en el pasaje
• Conteos de células
• Viabilidad (pre y poscrioconservación)
• Expresión fenotípica de tipos celulares deseados e indeseados (pre y poscrioconservación)
• Monitoreo de marcadores bioquímicos únicos (pre y poscrioconservación)
• Evaluaciones de actividad funcional (pre y poscrioconservación)
• Análisis de expresión génica y proteica (pre y poscrioconservación)
• Expresión de antígenos de histocompatibilidad inmunologica (HLA/MHC)
• Identificación genética molecular
• Estabilidad cromosómica
Materiales para Andamiajes Biocompatibles
La mayoría de los materiales para andamiajes naturales o sintéticos se reglamentan como dispositivos médicos, aunque los
andamiajes derivados de tejidos humanos, tales como la dermis se reglamentan como HCT/Ps. Siempre que sea posible, se
deben usar andamiajes que hayan sido previamente aprobados para otros usos clínicos, pues dichos materiales deberían haber
sido sometidos previamente a análisis exhaustivos de seguridad y calidad. Para aplicaciones en productos derivados de células
o tejidos, el material de andamiaje debe permitir la unión, proliferación y migración de células, y por lo regular resulta desea-
ble una alta porosidad para facilitar la siembra de células dentro del material. El andamiaje debe proveer una difusión adecua-
da de nutrientes para la salud de las células y la liberación de productos excretados por las células. El material debe contar con
una resistencia mecánica adecuada y debe ser susceptible a la manipulación, modificación química y fabricación. El material
del andamiaje debe ser biocompatible, relativamente inerte e inmunológicamente benigno.
Por lo general, los andamiajes se pueden clasificar como duros o blandos. Los andamiajes duros se usan en aplicaciones que
requieren una forma específica, tales como la formación de un vaso sanguíneo o una vejiga. Los andamiajes blandos se usan
en aplicaciones en las que es necesario que el producto se amolde flexiblemente con una forma existente del cuerpo.
Los materiales del andamiaje pueden ser polímeros sintéticos o naturales, biodegradables o permanentes. La biodegradación
permite la reabsorción o eliminación del andamiaje por parte del cuerpo sin manipulación. La velocidad de degradación del
andamiaje debe coincidir con la velocidad de formación o regeneración del tejido. La estructura del andamiaje natural debe
reemplazar al andamiaje que se degrada de tal manera que mantenga la integridad estructural del tejido u órgano que se está
regenerando. Por ejemplo, un vaso sanguíneo recientemente formado debe tolerar tanto la presión sanguínea interna como
las fuerzas mecánicas externas.
El polímero biodegradable sintético que se usa de manera más común es el ácido poliglicólico (PGA, por sus siglas en in-
glés). El ácido Poliláctico (PLA,por sus siglas en inglés) también se usa ampliamente, en ocasiones en combinación con el PGA.
Estos polímeros se degradan dentro del cuerpo, se eliminan fácilmente antes de la degradación y tienen un extenso historial de
uso en materiales de sutura. La policaprolactama (PCL), que presenta una velocidad de degradación menor a la del PLAo el
PGA, se usa en aplicaciones que requieren de una larga presencia en el cuerpo.
La matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) y sus derivados son materiales naturales que se usan para andamiajes
en la fabricación de productos de combinación de células y biomateriales. Las proteínas tales como el colágeno o la fibrina y
los polisacáridos como el quitosano o los glicosaminoglicanos (GAG) también han sido usados en el crecimiento de células
para fabricar productos de combinación. El colágeno es por mucho el sustrato más popular para células y ha sido moldeado en
lt
andamiajes para una variedad de productos, principalmente en aplicaciones para la piel de ingeniería tisular. Los agentes de
entrecruzamiento tales como el glutaraldehído y las carbodiimidas solubles en agua se han usado para mejorar la fuerza de los
andamiajes naturales. Dependiendo del origen del material, los andamiajes naturales pueden ser inmunogénicos.
Cuando las células deben proliferar después de la siembra, el andamiaje y el sistema de cultivo de apoyo debe permitir el
intercambio de nutrientes y productos de desecho. Una matriz gruesa e impermeable conducirá a zonas de tejido necrótico.
Muchos dispositivos de tejido están diseñados de tal manera que puedan ser eventualmente retirados del paciente.
Se debe establecer la seguridad y biocompatibilidad del andamiaje y de los materiales que entran en contacto con el pro-
ducto. Se debe llevar a cabo una batería completa de las pruebas recomendadas por los capítulos Pruebasde ReactividadBioló-
gica, In Vitro (87), Pruebasde ReactividadBiológica,In Vivo(88), y los documentos ISO 10993 o el FDABlue Book (Libro Azul de
la FDA)G95-1. Los residuos del proceso y los productos de degradación derivados de la preparación del andamiaje deben
cuantificarse y se deben establecer límites. Es necesario establecer condiciones de estabilidad y almacenamiento de los materia-
les del andamiaje.
Calificaciónde Materiales Auxiliares
Los productos auxiliares incluyen una amplia variedad de materias primas y componentes usados en la fabricación. Pueden
incluir materiales relativamente simples o sustancias complejas como medios de cultivo, amortiguadores, factores de creci-
miento, citoquinas, componentes de cultivo y procesamiento, anticuerpos monoclonales y dispositivos de separación de célu-
las.
Los materiales auxiliares no están destinados a estar presentes en el producto terapéutico final. Por lo general, las formula-
ciones de medios definidos incluyen componentes como la albúmina y la transferrina, purificadas a partir de fuentes humanas
o animales. La purificación, el procesamiento y el análisis exhaustivo de estos componentes minimizan aún más el riesgo de
contaminación viral o microbiana, si bien no lo eliminan. Las cantidades residuales de materiales auxiliares usados en el proce-
so de fabricación, incluyendo proteínas recombinantes u otros componentes de medios definidos, pueden ser potencialmente
antigénicos por lo que se debe evaluar su eliminación del producto final y se deben establecer límites apropiados cuando sea
necesario.
Los riesgos conocidos se asocian con el uso de materiales auxiliares en la producción de productos de terapia celular. La cali-
dad de los materiales auxiliares utilizados en la elaboración de un producto de terapia celular puede influir en la seguridad,
potencia y pureza del producto. Idealmente, cada uno de los materiales auxiliares empleados en la fabricación de un producto
de terapia celular o tisular debe elaborarse en condiciones que cumplan con las BPFv.No obstante, las sustancias complejas o
únicas que resultan esenciales para el control de procesos o la producción pueden no estar disponibles a través de proveedores
que las producen de acuerdo con las BPFv.En este caso, el fabricante de productos de terapia celular o tisular debe desarrollar
una estrategia científicamente sólida para calificar la materia prima. Un programa de calificación de materiales auxiliares utiliza-
dos en la fabricación de productos de terapia celular y tisular debe incluir los siguientes puntos: (1) identificación y selección,
(2) aptitud para uso en la fabricación, (3) caracterización y criterios de aceptación, (4) calificación del proveedor y (5) garantía
de calidad. Se deben generar archivos históricos de los lotes para cada material auxiliar.
El cumplimiento con las especificaciones establecidas se debe comparar con los datos provistos en el Certificado de Análisis.
La rastreabilidad es esencial y se deben anotar los números de lote para cada material auxiliar en los registros de producción
del producto derivado de células. Se debe consultar el capítulo de información general de USP MaterialesAuxiliarespara Pro-
ductosCelulares,Génicosy de IngenieríaTisular(1043) para información específica sobre la implementación de un programa de
calificación apropiado para estos materiales. Otros capítulos de USP tratan aspectos que se deben considerar con respecto a la
calificación de materiales auxiliares específicos (p. ej., SueroBovino(1024), SueroFetalBovino-Atributos de Calidady Pruebasde
Funcionalidad(90) y Factoresde Crecimientoy CitoquinasUsadosen la Fabricaciónde Productosde TerapiaCelular(92)).
Calificaciónde Excipientes
Durante las etapas finales del proceso de fabricación, es posible incluir excipientes o sustancias que incrementan la estabili-
dad de las células terapéuticas. Los ejemplos de excipientes incluyen medios de cultivo, solución salina USP u otras soluciones
de electrolitos aprobadas para inyección, proteínas exógenas tales como albúmina sérica humana o crioprotectores tales como
dimetil sulfóxido (DMSO). Los excipientes no están destinados a ejercer un efecto terapéutico directo sobre el paciente, sino
que están destinados a contribuir con el mantenimiento de los atributos de calidad del producto celular final. Debido a que los
excipientes se administrarán al paciente junto con las células, se debe poner especial atención a su calificación. En general,
siempre que sea posible, deben usarse excipientes que ya hayan sido aprobados por la FDApara uso humano. Si se usan exci-
pientes no aprobados, debe realizarse una evaluación de la seguridad completa. Para los excipientes novedosos, tales como
soluciones para crioconservación, pueden ser necesarios estudios de seguridad preclínicos apropiadamente diseñados.
USP42 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 7485
FABRICACIÓN
DE PRODUCTOSDERIVADOSDE CÉLULASO TEJIDOS
Introducción
La fabricación de productos derivados de células o tejidos requiere de diversas de operaciones y manipulaciones por parte de
individuos bien capacitados en técnicas de procesamiento aséptico. La competencia técnica del personal es fundamental para
la seguridad y eficacia del producto. Los productos autólogos presentan más retos para el procesamiento celular y tisular pues-
to que deben desarrollarse procedimientos para segregación de lotes, autorización de línea y procesos operativos a fin de redu-
cir las posibilidades de confundir lotes para pacientes específicos (ver Consideraciones
sobreel Diseñoy la Operaciónde Instala-
cionesa continuación).
Aislamiento y Selección de Células

Los principios generales para el procesamiento de tejidos humanos o animales después de su extracción aséptica son inde-
pendientes del origen de la célula o tejido. La fabricación de productos celulares puede llevarse a cabo en una instalación de
fabricación ubicada en las inmediaciones del sitio clínico o en una instalación de fabricación de productos celulares central dis-
tante. El material celular o tisular de origen debe ser envasado en envases estériles a prueba de fugas y transportado desde el
área de extracción al lugar de procesamiento en condiciones controladas que mantengan la viabilidad de las células. El medio
líquido en el cual se sumergen las muestras durante el transporte debe ser óptimo para mantener la viabilidad de células y
tejidos. Este medio de transporte puede complementarse con antibióticos. Los niveles de antibiótico en los amortiguadores del
proceso deben disminuirse y, finalmente, eliminarse durante las etapas subsiguientes del procesamiento, de modo que los anti-
bióticos no estén presentes en el producto celular final. En el caso de productos sanguíneos o de tejidos con gran cantidad de
sangre, el medio de transporte o solución amortiguada de electrolitos debe contener un anticoagulante.
AISLAMIENTO
Por lo general, se realiza una disección de órganos o tejidos sólidos para dejar expuesta la región deseada. Este material se
puede usar tal como está para transplante o se puede someter a procesamiento adicional. Si se desean organoides multicelula-
res (por ejemplo, los islotes de Langerhans) o suspensiones de célula única, el tejido se puede someter a disgregación mecáni-
ca o enzimática. La disgregación física se puede lograr con instrumentos que homogeneizan el material impartiendo grandes
fuerzas de corte o dividiendo el tejido en partes más pequeñas. Alternativamente, el material se puede comprimir o pasar a
través de tamices con tamaños de malla determinados.
La digestión enzimática de tejido conectivo extracelular es otro método común para disociar el tejido sólido, en la cual se
usan diversas enzimas, incluyendo colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, hialuronidasa, papaína y quimotripsina. Se pueden
agregar enzimas con actividad nucleasa, como la desoxirribonucleasa, para contribuir en la digestión de los ácidos nucleicos
liberados de las células dañadas y evitar la aglomeración excesiva de las células. Al final de la incubación, la suspensión de célu-
las puede ser sometida a una acción de bombeo leve para dividir aún más los cúmulos multicelulares hasta lograr el tamaño o
la composición deseados. Habitualmente, los métodos de disgregación enzimática y física se combinan para lograr el resultado
deseado.
Debido a que las células sanguíneas o de médula ósea son intrínsecamente suspensiones, la manipulación mecánica por lo
general se limita a la extracción de plasma y agregados, lo cual se consigue mediante centrifugación y filtración.
Las actividades de aislamiento de células y tejidos que implican etapas abiertas de manipulación deben llevarse a cabo en
una cabina de seguridad biológica ISO 5 (clase 100). El entorno de la cabina de seguridad biológica debe ser adecuado para
mantener operaciones de procesamiento aséptico. Para HCT/P que sufren una manipulación mínima en sistemas cerrados, es-
tos entornos pueden estar controlados pero sin clasificación. No obstante, para productos de terapia celular y tisular que se
manipulan y fabrican de conformidad con las BPFv,el entorno de la cabina de seguridad biológica debe estar controlado y
clasificado, por lo general como un cuarto limpio ISO 7 (clase 1O 000). Se deben tomar precauciones para segregar los aisla-
dos tisulares y celulares específicos del paciente.
SELECCIÓN
Por lo general, las suspensiones de células son una mezcla de tipos celulares que pueden requerir procesamiento adicional, a
fin de aislar una población celular de interés y para reducir el nivel de tipos celulares no deseados, tales como células tumorales
potencialmente contaminantes. Diversas técnicas de aislamiento y separación de células proporcionan un alto rendimiento de
poblaciones celulares puras.
Las poblaciones celulares se pueden enriquecer selectivamente variando la fuerza y la duración del centrifugado. La separa-
ción también se puede lograr mediante centrifugación isopícnica, donde la suspensión de células se centrifuga en un medio de
gradiente que abarca todas las densidades de las células de la muestra. Las centrífugas de elutriación de flujo continuo espe-
cialmente diseñadas separan poblaciones celulares sometiendo una suspensión de células a fuerzas centrífugas y de corriente
líquida opuestas en una cámara especial dentro del mecanismo del rotor. Las poblaciones celulares se separan dentro del rotor
e~-
según sus tamaños y densidades y se eluyen selectivamente fuera de la cámara del rotor al aumentar la fuerza de corriente
líquida. Finalmente, otros métodos implican la adición de agentes de alta densidad como el almidón hidroxietílico a la suspen-
sión celular. Los procedimientos de concentración y separación como estos con frecuencia ocasionan la pérdida de células de-
bido a la aglomeración y agregación.
La separación celular también se puede lograr aplicando técnicas que toman ventaja de las características citológicas o bio-
químicas únicas de distintas poblaciones celulares. La aglutinina de soja agrega células que contienen un grupo glicosídico par-
ticular que se expresa en células maduras de la sangre pero no en células madre, permitiendo el enriquecimiento de las células
madre. Los linfocitos poseen el antígeno CD2 que actúa como receptor de eritrocitos ovinos. Al agregar eritrocitos ovinos a la
mezcla de células, los linfocitos forman rosetas alrededor de los eritrocitos ovinos y posteriormente se separan mediante centri-
fugación diferencial. Algunas aplicaciones aprovechan la capacidad de ciertas poblaciones de células de adherirse a la superfi-
cie de sustratos sólidos específicos, como el plástico para cultivo de tejidos, materiales revestidos de colágeno y los andamiajes
de polímeros naturales y sintéticos. El tipo celular unido específicamente se recupera selectivamente en la superficie y se retira
de la suspensión de células inicial.
Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra proteínas específicas de superficie de células se pueden usar tanto para la se-
lección positiva como para la selección negativa de células. Por ejemplo, una población celular unida con anticuerpos mono-
clonales puede ser retirada de la suspensión celular después de su exposición a partículas magnéticas recubiertas con anticuer-
pos antimonoclonales. Las partículas magnéticas y sus células unidas se retiran de la suspensión celular magnéticamente. Las
suspensiones de células no marcadas se pueden verter o incubar sobre superficies, como matraces de plástico o microesferas
recubiertas de anticuerpos monoclonales para aislar poblaciones celulares particulares. Además, se pueden separar diferentes
tipos de células, utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS,por sus siglas en inglés), mediante la
unión de anticuerpos con marcadores fluorescentes a un tipo de célula particular.
Otras técnicas enriquecen poblaciones de células destruyendo células no deseadas. Por ejemplo, algunos anticuerpos mono-
clonales unidos a células son capaces de fijar y activar el complemento que se agrega exogénicamente, provocando lisis celu-
lar. Algunos procedimientos utilizan agentes citotóxicos o inhibidores mitóticos para destruir selectivamente células no desea-
das. Estos métodos por lo regular se dirigen a subpoblaciones celulares con altas tasas de crecimiento, tales como las células
tumorales. Finalmente, un anticuerpo se puede conjugar con un grupo tóxico, como la ricina, y permitir que el agente citotó-
xico alcance la población celular deseada. La mayoría de estos procedimientos requieren varias etapas de lavado para garanti-
zar la eliminación de las células muertas, fragmentos de células y agentes citotóxicos del producto celular final.
Expansióny Diferenciaciónde CélulasEx Vivo
EXPANSIÓNEXVIVO
Un aspecto fundamental para los fabricantes de productos celulares y tisulares es la capacidad de producir y administrar al
paciente una dosis terapéuticamente relevante de la población celular requerida. Según la aplicación de que se trate, el pro-
ducto puede ser de un tipo celular puro y homogéneo, o una mezcla de diferentes tipos celulares funcionales. Hay muchas
poblaciones de células blanco presentes en bajos niveles o baja pureza en los tejidos complejos de fuentes primarias. En estos
casos, la producción de una dosis terapéutica se puede lograr solo mediante el enriquecimiento y la expansión ex vivo específi-
cos de las células requeridas.
La expansión ex vivo de células se puede presentar en cultivos en suspensión (p. ej., células T o células madre hematopoyéti-
cas y progenitoras), cultivos adherentes (p. ej., células madre mesenquimales, células madre embrionarias, células madre pluri-
potentes inducidas, células madre neuronales o fibroblastos dérmicos) o una mezcla de ambos (p. ej., expansión del estroma
medular). Existen numerosas tecnologías para el cultivo de células. Las células se pueden propagar en matraces de cultivo de
tejidos (matraces T), frascos tipo rodantes, andamiajes poliméricos o bolsas flexibles, permeables a gases, por lo general, den-
tro de incubadoras con control de temperatura, humedad y composición gaseosa. Los sistemas para cultivo de células multica-
pa de alta capacidad compuestos por sistemas de bolsas múltiples de plástico para cultivo de tejidos y biorreactores que em-
plean microportadores permiten llevar a cabo la expansión, recolección y formulación en un sistema cerrado. Las unidades de
fermentación de pequeña escala tradicionales se pueden usar para la expansión de células en cultivos en suspensión. Asimis-
mo, es posible expandir células adherentes en esas unidades ya sea proporcionado una superficie de adherencia (microporta-
dores, perlas recubiertas o discos) o adaptando las células para propagarlas en un cultivo en suspensión. Algunos sistemas de
cultivo se diseñan específicamente para la propagación de células para aplicaciones terapéuticas. Estos por lo general, son sis-
temas cerrados que usan cartuchos desechables para el biorreactor en unidades de procesamiento automático con control di-
recto de temperatura, composición gaseosa y velocidad de perfusión de medios. En algunas ocasiones el software automatiza-
do permite el rastreo de paciente-donante, así como documentar las condiciones de cultivo y las manipulaciones. Estas carac-
terísticas son útiles en el diseño e implementación de los programas de Control de Calidad (QC) de liberación de producto y
para la documentación de Garantía de Calidad (QA) de corridas de procesamiento.
En cultivos adherentes, las células por lo general se recolectan de la superficie en la que se han expandido. Los métodos de
liberación incluyen la agitación física, la ruptura enzimática, la quelación de iones metálicos y la inhibición competitiva de mo-
léculas de adhesión o de matriz. Como se describió anteriormente, debe tenerse en cuenta la fuente, la seguridad, la toxicolo-
gía y el análisis de residuos para cualquier reactivo utilizado para liberar células adherentes durante la fabricación. Algunos sis-
temas específicos para ciertos productos no requieren la liberación de células adherentes. Las células se expanden en un anda-
miaje sintético o natural biocompatible que luego se aplica en forma tópica (por ejemplo, sustitutos de piel modificados por
ingeniería) o las células se cultivan dentro o fuera de fibras para perfusión ex vivo (por ejemplo, hepatocitos en dispositivos de
fibra hueca para tratar hepatopatías).
En todos los casos, se deben optimizar los parámetros estándar de cultivo de células para maximizar la eficiencia del proceso.
Tales parámetros incluyen la composición del material celular de origen, la densidad de siembra inicial, la composición de los
medios, la velocidad de recambio de los medios, la temperatura, la composición gaseosa, el pH y la velocidad de entrega. Se-
gún la naturaleza del producto, es necesario definir el efecto potencial de los parámetros del proceso sobre la potencia y la
función de las células blanco.
Biorreactores-Se requieren biorreactores y dispositivos especializados para la fabricación de productos de combinación tri-
dimensionales. Estos biorreactores sostienen los andamiajes/matrices biocompatibles para la fabricación de la construcción.
Aunque el biorreactor puede proporcionar un sistema cerrado para la fabricación de construcciones, éste genera el reto de
acceder al andamiaje para la siembra de células y durante la obtención de muestras para el análisis de liberación de producto
mientras se mantiene la esterilidad. Los biorreactores son, por lo general, dispositivos de un solo uso, con lo cual se evita la
contaminación cruzada entre productos. De preferencia, el producto no será reenvasado para su transporte y entrega. Por
ejemplo, los biorreactores también pueden servir como envase final para el transporte del producto.
La prueba de envase-cierre se debe llevar a cabo en todos los sistemas de envase-cierre finales. Se debe verificar la compati-
bilidad para la esterilización del biorreactor y del andamiaje y el proceso de esterilización debe ser validado para cada configu-
ración de producto. Los productos lixiviables y extraíbles de los materiales en contacto con el producto tales como biorreacto-
res y componentes de envasado deben cuantificarse y se deben establecer límites.
En los sistemas cerrados de biorreactores puede ser difícil observar o muestrear células. La medición de parámetros metabóli-
cos puede servir de método sustituto susceptible de validación con el que se puede evaluar la tasa de proliferación y predecir
el momento de la recolección del producto celular. Debe definirse bien la relación entre tales parámetros y la viabilidad, la
potencia y la función del producto celular. Puede ser necesaria la purificación y el enriquecimiento de las células blanco des-
pués de la expansión mediante métodos como los descritos anteriormente.
DIFERENCIACIÓN
Algunos productos de terapia celular requieren diferenciación de linaje o funcional de las células de origen. Por ejemplo, a
través de los procesos de expansión de células madre hematopoyéticas, normalmente se generan productos que contienen
una mezcla de células madre multipotentes, células progenitoras comprometidas hacia un linaje y células diferenciadas hacia
un linaje. La composición de estos productos se puede manipular mediante diversas combinaciones de factores de crecimiento
y citoquinas durante el proceso de expansión. Lo opuesto se aplica a los procesos en los que las células maduras son desdiferen-
ciadaspara permitir que luego vuelvan a comprometerse hacia un linaje determinado (por ejemplo, los condrocitos en la repa-
ración de cartílago). Algunos ejemplos específicos de la manipulación ex vivo son la producción de células T específicas para
antígenos destinados a tratar determinadas enfermedades o la obtención de tipos de células terapéuticas a partir de células
madre embrionarias. Antes de su liberación para uso clínico, las células blanco diferenciadas resultantes deben ser completa-
mente caracterizadas. Puede ser necesario evaluar el potencial de desdiferenciación de células multipotentes que hayan sido
sometidas a diferenciación para garantizar la seguridad del producto. Cuando las células hayan sido expandidas y subsiguien-
temente diferenciadas, se puede llevar a cabo el análisis de cariotipo o ensayos de transformación in vitro para demostrar que
las células son aceptables para uso clínico.
MANIPULACIÓNGENÉTICAEXVIVO
La modificación genética de células ex vivo es un procedimiento común de procesamiento que se usa para alterar el patrón
de expresión génica en una población definida. La introducción de materiales genéticos integrantes o no integrantes (ADN,
ARN,ARN pequeño de interferencia) se lleva a cabo a fin de inducir la expresión de nuevos genes y productos o para inhibir la
expresión génica endógena. La modificación genética ex vivo en entornos de transplante autólogo implica la manipulación de
una población de células recolectada o expandida de un paciente y la readministración subsiguiente de las células al donante.
En un entorno de transplante alogénico común, una población de células estable y modificada genéticamente que ha sido
caracterizada y de la cual se ha generado un banco, se administra a una amplia población de pacientes. Con el propósito de
controlar la enfermedad del injerto contra el anfitrión en transplantes alogénicos de médula ósea, las células T de donantes
seleccionadas han sido tratadas con genes letales, como el de la timidina quinasa, que hacen que las células sean susceptibles
al tratamiento con ganciclovir después del transplante. Entre los ejemplos de productos de terapia celular autólogos genética-
mente modificados se incluye la transducción de células tumorales con citoquina u otros genes inmunomoduladores, linfocitos
transducidos con receptores para antígenos tumorales y la introducción en linfocitos recolectados de un vector de ribozima
antiviral como una estrategia para tratar la infección por virus de inmunodeficiencia humana. Entre los ejemplos de productos
alogénicos de terapia celular se incluyen líneas de células tumorales genéticamente modificadas e irradiadas que se usan como
vacunas contra tumores y células encapsuladas transfectadas con un gen para expresar un factor neurotrófico para una admi-
nistración localizada de proteína terapéutica en el sistema nervioso central.
Las células genéticamente modificadas ex vivo se consideran productos de terapia génica. Las cuestiones relacionadas con
los productos de terapia génica se tratan en detalle en el capítulo general Productosde TerapiaGénica(1047), en especial lo
7488 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 42
referente a la producción del vector o material genético usado para conseguir la transferencia génica, las estrategias de prue-
bas analíticas, la seguridad del paciente y el monitoreo. La fabricación, procesamiento de células y las metodologías de control
de procesos tratadas con anterioridad se pueden aplicar a los procedimientos usados para manipulación genética. Con fre-
cuencia, las poblaciones celulares genéticamente modificadas se aíslan y expanden o seleccionan antes de la introducción del
material genético. Se cuenta con equipo y procesos especializados para la introducción de material genético el cual debe ser
validado y monitoreado. Las cuestiones relacionadas con la generación de bancos de células y estabilidad aplican a líneas de
células usadas en productos alogénicos de terapia celular que se establecen y crioconservan en MCB y WCB. Por último, las
cuestiones relacionadas con el análisis y la administración de la población de células genéticamente modificadas se analizan
más adelante en este capítulo.
Formulaciónde ProductosDerivados de Célulasy Tejidos
Las metodologías para formular productos derivados de células y tejidos dependen en gran medida del tiempo de almacena-
miento planeado para las células antes de la administración al paciente. Para algunos productos derivados de células, el tiempo
entre el fin de la fabricación y la administración al receptor previsto puede medirse en el orden de horas a días. Otros produc-
tos derivados de células pueden crioconservarse para extender su vida útil. Una metodología distinta para formular productos
derivados de células y tejidos puede implicar la adición de un andamiaje natural o sintético que pueda facilitar el manejo, la
protección de las células de la respuesta inmune y la creación de una forma específica que contribuya con el efecto terapéuti-
co. Las consideraciones para formular cada uno de estos tipos de productos derivados de células y tejidos se analizan a conti-
nuación.
PRODUCTOSDERIVADOS
DE CÉLULAS
Y TEJIDOSNO CRIOCONSERVADOS
Los productos que constan de suspensiones de células para administración en pacientes dentro de las horas posteriores a su
fabricación con frecuencia se formulan en soluciones amortiguadas estériles, adecuadas para administración directa. Para otros
productos derivados de células y tejidos no crioconservados, es posible extender la vida útil de horas a días, usando soluciones
que contengan nutrientes y antioxidantes apropiados. En la mayoría de los casos, estos excipientes no están destinados para su
administración directa a pacientes. Por consiguiente, puede ser necesario eliminar los excipientes antes de la administración al
paciente (ver Preparacióny Administracióndel Sitio Clínico).Cuando se va a administrar un amortiguador para formulación no
aprobado a pacientes, se debe llevar a cabo un análisis toxicológico preclínico.
PRODUCTOSDERIVADOS
DE CÉLULAS
Y TEJIDOSCRIOCONSERVADOS
La mayoría de las formulaciones de medios de crioconservación de células se suplementan con DMSO del 5% al 10% con o
sin almidón hidroxietílico (por lo general al 6%) y una proteína plasmática como albúmina sérica humana del 4% al 10% en
una solución salina balanceada. El DMSO previene la deshidratación al alterar la concentración aumentada de soluciones extra-
celulares no penetrantes durante la formación de hielo. La solución polimérica de hidroxietilo de alto peso molecular protege a
las células de la deshidratación puesto que el agua se incorpora en cristales de hielo extracelulares. El uso de proteínas, a me-
nudo, determina una recuperación y viabilidad máximas de células después de descongelar. En ocasiones se usa suero (de 5%
a 90%) en lugar de proteínas específicas. Algunas formulaciones para crioconservación están completemente exentas de pro-
teína.
La concentración óptima de células para crioconservación depende del tipo de célula y debe determinarse empíricamente,
pero por lo general oscila entre 106 y 107 células por ml. La homogeneidad y viabilidad de la población de células que se
crioconservan también puede diferir después de la descongelación y se debe evaluar cuidadosamente. En los casos en los que
el producto final derivado de células o tejidos está destinado para descongelación y administración inmediata, la presencia de
DMSO en el amortiguador de la formulación somete al paciente a un nivel incrementado de toxicidad relacionada con la infu-
sión, aunque esto se relaciona con el volumen administrado y con la concentración final del crioconservante. Referirse a la sec-
ción Preparacióny Administracióndel Sitio Clínicopara consideraciones adicionales.
CÉLULASCOMBINADASCON ANDAMIAIES
BIOCOMPATIBLES
Muchos productos de terapia celular y tisular se administran en conjunto con un andamiaje biocompatible. Por ejemplo, los
productos para cicatrización de heridas o sustitutos de piel contienen células sembradas en un andamiaje. La estructura bioquí-
mica y física del andamiaje y el método para combinar células con el andamiaje son específicos para cada producto.
Las células se pueden cargar en un dispositivo de membrana semipermeable para administración. Por lo regular, el tamaño
de poro de la membrana es lo suficientemente grande para permitir que los factores terapéuticos secretados por las células
pasen, pero es lo suficientemente pequeño para evitar que las inmunoglobulinas y las células anfitrionas entren en contacto,
destruyan o monten una respuesta inmune con las células terapéuticas. El dispositivo puede ser una fibra hueca o una cápsula
semipermeable con células en el interior que secretan compuestos terapéuticos o bien puede formar parte de un sistema más
grande de bombas y filtros, como módulos de fibra hueca con hepatocitos para tratar hepatopatías.
T
USP 42 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 7489
Las células se pueden sembrar en un andamiaje tridimiensional y se les permite propagarse y formar una estructura parecida
al tejido. En el producto resultante, las células se orientan de una manera única, que es importante para el uso previsto del
producto (p. ej., substitutos de piel).
Las células se pueden encapsular en un gel o solución de polímero entrecruzable y la estructura implantable resultante pue-
de funcionar como vaso de cultivo, como un medio para proteger a las células del sistema inmune del anfitrión, o como una
manera de moldear las células en una forma definida. Algunos de los polímeros utilizados son alginato, ácido hialurónico, colá-
geno, quitina o polímeros sintéticos. Se han implantado células /3 de los islotes pancreáticos encapsuladas en pacientes para
tratar la diabetes. Para tratar la incontinencia urinaria, se han mezclado condrocitos con alginato a fin de formar una estructura
al inyectarlos.
Las células se pueden adherir a andamiajes con formas definidas que posteriormente se implantan. Algunos ejemplos inclu-
yen células precursoras osteogénicas en andamiajes de hueso humano cadavérico desmineralizado, cerámica de hidroxiapatita,
cerámica de hidroxiapatita-fosfato tricálcico o vidrio biodegradable, que se pueden usar en la reparación de defectos óseos.
MÉTODOSANALÍTICOS
La complejidad y el alcance de las terapias celulares se reflejan en la amplia variedad de métodos analíticos que se usan para
establecer controles durante el proceso y criterios de liberación del producto final. Se deben seleccionar especificaciones de
calidad para productos celulares y tisulares para confirmar la calidad, seguridad y potencia del producto. Las pruebas seleccio-
nadas deben ser específicas para cada producto y deben contar con criterios de aceptación adecuados a fin de garantizar pará-
metros de calidad uniformes y dentro de los límites aceptables de variación biológica, pérdida de actividad, cambios fisicoquí-
micos o degradación durante la vida útil del producto. El desarrollo y el establecimiento de especificaciones para productos
celulares y tisulares deben respetar los principios descritos en el documento de la ICH Q6B Specifications:TestProceduresand
AcceptanceCriteriofor Biotechnological/Biological Products(Especificaciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación
para Productos Biotecnológicos/Biológicos).
Las especificaciones se establecen a partir de una caracterización minuciosa del producto durante la fase de desarrollo y un
entendimiento del proceso y su capacidad. La caracterización debe incluir mediciones de las propiedades fisicoquímicas, la se-
guridad, la pureza, las impurezas derivadas del proceso y del producto, la potencia, la viabilidad, la esterilidad y la cantidad.
Los fabricantes deben desarrollar especificaciones para cada producto desarrollado a partir de esta información mediante la
aplicación de métodos estadísticos apropiados. Los datos deben incluir lotes usados en los estudios preclínicos y clínicos, y de-
ben incluir además datos de validación de ensayo y proceso que pueden estar correlacionados con la evaluación de estabili-
dad, seguridad y eficacia.
Los controles durante el proceso y las especificaciones para el producto deben estar sustentadas usando un estándar de refe-
rencia apropiado. Un producto autólogo puede basarse en un estándar de referencia generado a partir de células o tejidos de
procesamiento de un donante saludable o de una fuente que proporciona células y tejidos a instituciones de investigación. El
estándar de referencia garantiza que el proceso, según se mide en los ensayos de liberación, no cambie de manera importante
con el tiempo y que verifique que una prueba produzca resultados aceptables, es decir, que se cumplen los requisitos de apti-
tud del sistema. El estándar de referencia se fabrica a partir de un lote producido en condiciones controladas y cumple con
todas las pruebas de proceso y de liberación final. Además, este estándar de referencia está sujeto a un nivel adicional de ca-
racterización, que incluye pruebas que no se suelen realizar para la liberación de productos. No es necesario que el estándar de
referencia esté almacenado en la misma dosis, formulación o temperatura que el producto final. Sin embargo, se debe deter-
minar la estabilidad del estándar de referencia.
Alternativamente, se puede usar un estándar de trabajo. En ese caso, debe comportarse en la prueba de forma similar al
estándar de referencia. El cambio a un nuevo estándar de referencia debe incluir muchas pruebas y todas ellas se deben reali-
zar paralelamente al estándar de referencia existente. Se debe evaluar, con sumo cuidado, el impacto de cualquier cambio en
las propiedades del nuevo estándar de referencia antes de adoptarlo. Una opción de estándar de referencia para un producto
celular con una vida útil corta, o para una aplicación autóloga o específica para un paciente, puede ser un banco de células
donantes normales del tipo celular apropiado. Este banco de células se puede utilizar para asegurar que el proceso de fabrica-
ción es capaz de generar un producto uniforme.
Controles durante el Proceso
Los procesos de fabricación deben contar con criterios bien definidos para decidir si se avanza o no se avanza, en etapas
clave durante el proceso. Los controles durante el proceso son valoraciones o pruebas realizadas para garantizar que la calidad
y la cantidad del producto en proceso sean suficientes para fabricar un producto final aceptable. Entre los ejemplos de contro-
les durante el proceso se incluyen:
• Enumeración y viabilidad
• Microbiológicos (esterilidad, endotoxinas, micoplasma)
• Expresión de marcadores fenotípicos o genotípicos
• Verificación de morfología contra estándares de referencia visuales
• Producción de una sustancia bioactiva deseada

• Determinación de duplicaciones de población, número de pasaje, edad del cultivo
• Valoraciones de impurezas potenciales del proceso
• Monitoreo de parámetros del sistema de cultivo (% CO2, humedad relativa %, pH, glucosa, lactato, etc.)
• Pruebas funcionales tales como unidades formadoras de colonias (UFC) y expresión de proteínas específicas de las células.
La razón principal para establecer pruebas de control durante el proceso es garantizar que se obtenga el producto correcto
con calidad y desempeño específicos. La razón secundaria para la realización de pruebas durante el proceso consiste en reco-
lectar datos de caracterización del proceso y del producto útiles en la evaluación del impacto de los cambios o desviaciones en
el proceso. El material intermedio en proceso que no cumple con los criterios de control durante el proceso no debe usarse
para la fabricación adicional. Este material se puede reprocesar cuando se cuenta con procedimientos para tales actividades. El
material reprocesado debe cumplir con las especificaciones originales durante el proceso y se debe definir el efecto del repro-
cesamiento sobre otros atributos de calidad, tales como la estabilidad, antes de que el material pueda someterse a fabricación
adicional. Cuando se van a combinar varios sublotes (p. ej., células recolectadas de diversos vasos de cultivo) para procesa-
miento adicional, los sublotes que no cumplen con los criterios especificados no deben incluirse en la combinación, incluso si
la combinación que contenga estos sublotes no aprobados cumpliese con los criterios de valoración en proceso.
Durante el desarrollo del proceso clínico, los ensayos para calidad y desempeño del producto deben realizarse después de la
mayoría de las etapas de procesamiento para determinar los pasos críticos así como los ensayos más sensibles a las desviacio-
nes en el proceso. Se deben usar controles de proceso estadísticos y parámetros críticos para establecer límites para validacio-
nes de proceso e investigaciones de fabricación. Se deben usar herramientas de muestreo estadístico para asegurar un tamaño
de muestra válido. Los controles durante el proceso deben llevarse a cabo para procesos totalmente validados para asegurar
que estos continúen bajo control. Los resultados de estos ensayos deben someterse a un análisis de tendencia y se deben to-
mar medidas para corregir los problemas cuando éstos surjan.
Especificaciones
de Liberaciónde Producto Final
Las terapias celulares reglamentadas como productos biológicos deben cumplir con las secciones aplicables del Título 21 del
CFR211 y del Título 21 del CFR61 O para garantizar que cumplan con su identidad, pureza, potencia, seguridad microbiológi-
ca y demás atributos esenciales, tales como la viabilidad.
Debido a que no es posible emplear la esterilización terminal de un producto celular vivo, esencialmente se requiere que
todos los productos derivados de células cumplan con los criterios de aceptación para pruebas de producto tales como esterili-
dad, micoplasma y endotoxina-por lo general, un resultado negativo o la falta de crecimiento demuestran la esterilidad y la
ausencia de micoplasma; asimismo, los productos deben demostrar <5 unidades de endotoxina (UE) por kilogramo de peso
corporal del paciente. En el caso de las inyecciones intratecales, el límite de endotoxina especificado es más estricto :S:0,2UE
por kilogramo de peso corporal del paciente. El análisis de virus adventicios se realiza en contadas ocasiones en el producto de
terapia celular final debido a que las células o bancos de células de origen y los materiales auxiliares de origen biológico ya han
sido sometidos a análisis para detectar agentes virales de interés antes de la fabricación.
Para casi todos los demás criterios de liberación de producto final, tales como aquellos para identidad, pureza y potencia, los
procedimientos analíticos con métodos y criterios de aceptación son específicos para el producto derivado de células indivi-
dual. La Tabla2 ofrece una visión general de las pruebas de liberación de producto final previstas para productos de terapia
celular y lista ejemplos de metodologías que se usan para cumplir con los requisitos de las pruebas.
TabJa2. Visión General de Anállsls de Liberación de Produdo Flnal
Prueba de Liberación Ejemplos Criterios
Esterilidad USP(71) Negativo
Micoplasma Método de cultivo directo e indirecto (FDAPoints to Consider [Puntos a Negativo; no detectado
Considerar])
Endotoxina USP(85) <5 UE/kq(s;0,2 UE/kgintratecal)
• Determinaciónde marcador de superficie
• Análisisde isoenzimas
• Identificacióngenética
• Morfología
• Bioensayo
Identidad • Marcador bioquímico Específicodel producto
• Porcentajede célulasviables
• Porcentajede marcadores específicosde expresión de células
• Límitespara tipos no deseados de células
Pureza • Límitespara contaminantes del proceso (p. ej., suero) Específicodel producto
T
Tabla 2. Visión General de Anállsls de Liberación de Producto Flnal (Continuación)

Prueba de Liberación Ejemplos Criterios
• Número de célulasviables
• Ensayode formación de colonias
• Cambio en la expresión de genes específicos
• Secreciónde macromoléculasdeseadas
• Inducciónde efecto secundario (p. ej., antígenos de leucocitos
humanos (HLA))
• Evidenciade actividad metabólica
Potencia • Evidenciade función celular Específicoel producto
• Número de célulasviables
• Enumeraciónde población celularespecífica
• ADNtotal
Dosis • Proteínatotal Específicodel producto
• Apariencia
• Morfología
Otros • Tamaño Específicodel Producto
ESTERILIDAD
Los productos derivados de células deben cumplir con los requisitos de las pruebas de liberación del producto final, inclu-
yendo la esterilidad. Asimismo, las pruebas de esterilidad con frecuencia se llevan a cabo durante el proceso para establecer la
pureza microbiana de las células que requieren de mayor tiempo de cultivo. Las pruebas de esterilidad adecuadas incluyen la
prueba descrita en el Título 21 del CFR61 0.12 y en el Capítulo de pruebas generales de USP Pruebasde Esterilidad(71 ). Estos
métodos de prueba basados en cultivos requieren de 14 días y, por consiguiente, únicamente son adecuados para productos
de terapia celular con vidas útiles prolongadas (p. ej., después de la crioconservación). Muchos productos de terapia celular
tienen vidas útiles cortas y deben administrarse a los pacientes antes de que los resultados de la prueba de 14 días estén dispo-
nibles. En tales casos, la FDAha identificado una metodología que permitirá la administración de productos derivados de célu-
las a pacientes en dicha situación [ver Guidancefor FDAReviewersand Sponsors:Content and Reviewof Chemistry,Manufacturing,
and Control (CMC) lnformation for Human SomaticCe/1Therapylnvestigational New Drug Applications(/NDs)] (Guía para Reviso-
res y Auspiciadores de la FDA:Contenido y Revisión de Información Química, de Fabricación y Control (CMC) para Nuevas
Aplicaciones Farmacológicas lnvestigativas (IND) de Terapia Celular Somática en Humanos):
• Prueba de esterilidad durante el proceso de una muestra tomada de 48 a 72 horas antes de la recolección final o después
de la última adición de medio a los cultivos.
• Una prueba rápida de detección microbiana, como por ejemplo, tinción de Gram u otro procedimiento en el producto
final formulado.
• Prueba de esterilidad que cumpla con el Título 21 del CFR610.12 en el producto final formulado.
Cuando se usa esta metodología alternativa, los criterios de liberación para esterilidad se basan en un resultado negativo de
la tinción de Gram y en resultados que demuestren la ausencia de crecimiento en la prueba de esterilidad durante el proceso
de 48 a 72 horas. En caso de que la prueba de esterilidad de 14 días arroje resultados positivos después de que el producto
haya sido administrado al sujeto, el fabricante deberá informar sobre la falla en la esterilidad, los resultados de la investigación
de la causa, así como cualquier acción correctiva a manera de enmienda a la IND dentro de los 30 días hábiles posteriores a la
recepción inicial del resultado de prueba de cultivo positivo.
Debido a las inquietudes relacionadas con la sensibilidad de una tinción de Gram y a la incapacidad para obtener resultados
completos de esterilidad durante 14 días después de la administración al paciente, existe un extenso interés en el uso de méto-
dos microbiológicos rápidos como alternativa al método de cultivo de 14 días. Esto se analiza en Métodologíasde PruebaAlter-
nativas.
MICOPLASMA
El Micoplasma y el ureaplasma son los microorganismos libres vivientes más pequeños. El micoplasma carece de pared celu-
lar rígida y su tamaño oscila entre 0,2 y 0,3 µm. Se puede observar el micoplasma con una forma redonda o filamentosa en un
cultivo de células usando un microscopio de campo oscuro o de contraste de fases. En agar sólido, el diámetro de las colonias
de micoplasma puede variar de aproximadamente 15 a 300 µm, mientras que las colonias más grandes se distinguen por una
típica apariencia de "huevo frito".
El micoplasma es ubicuo y se puede aislar de prácticamente cualquier mamífero. El micoplasma ha representado histórica-
mente uno de los principales problemas de contaminación de cultivos de tejidos, debido a que tiende a ser difícil de controlar
y requiere de ácidos nucleicos preformados provistos por componentes de los medios. Estos componentes pueden encontrarse
fácilmente en los materiales de cultivo de células que se usan durante la fabricación. El micoplasma puede surgir de compo-
nentes de cultivo bovinos o de otros animales, de materiales de células o tejidos de pacientes asintomáticos, o posiblemente
de operadores que lo liberan durante la fabricación.
7492 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ InformaciónGeneral USP42
Se recomienda llevar a cabo el análisis de micoplasma para todas las materias primas de origen humano o animal y es indis-
pensable como ensayo de liberación de lote para productos derivados de células. La FDAha publicado un documento (Points
to Considerin the Characterizationof Ce//LinesUsedto ProduceBiologicals[Puntos a Considerar durante la Caracterización de
Líneas Celulares Usadas para Producir Productos Biológicos) que describe en detalle los métodos aceptados para el cultivo y
aislamiento de micoplasma. Los métodos para la detección de micoplasma también se describen en el capítulo de pruebas
generales de USP Pruebaspara Micoplasma(63). Debido a que los ensayos clásicos requieren un mes de análisis para su culmi-
nación, se están desarrollando y validando métodos alternativos para la detección rápida de micoplasma. Esto se analiza en
Métodologíasde PruebaAlternativas.
ENDOTOXINAS
Las endotoxinas ejercen diversos efectos biológicos en la membrana celular de los mamíferos y pueden afectar la secreción y
producción de citoquinas, pueden provocar fiebre en los receptores o pueden servir como mitógenos poderosos. Debido a la
posibilidad de los ampliamente variados efectos biológicos de las endotoxinas sobre los cultivos de células y tejidos, se deben
evaluar las materias primas y los componentes usados para la fabricación de productos derivados de células para determinar la
presencia de endotoxinas como parte del proceso de calificación de materias primas. El control de endotoxinas en la fabrica-
ción de productos de terapia celular es un elemento esencial de cualquier programa de control de calidad.
La presencia de endotoxinas en productos administrados a pacientes representa una preocupación de seguridad importante.
El capítulo de pruebas generales de USP Pruebade EndotoxinasBacterianas(85) describe una variedad de métodos para la me-
dición de endotoxinas que se basan en el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus.Este ensayo se puede validar para una
amplia gama de productos biofarmacéuticos. Una característica importante de la valoración con respecto a los productos de
terapia celular es la capacidad de realizar el ensayo antes de la liberación de productos con vidas útiles cortas.
IDENTIDAD
El análisis de liberación de lote para productos celulares debe incluir una prueba de identidad. Esta prueba se emplea clara-
mente para identificar al producto. Su complejidad depende de la naturaleza del producto específico y de la gama de produc-
tos que se fabriquen. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo análisis más extensos y rigurosos para un producto de terapia celu-
lar autólogo en una instalación de fabricación en la que se preparan múltiples productos para pacientes, comparando con un
producto de terapia celular alogénico que es el único producto fabricado en una instalación.
Las pruebas de identidad para productos derivados de células deben ser pertinentes al tipo de célula y a las manipulaciones
realizadas durante el procesamiento. Con frecuencia, se usan marcadores de superficie diferenciales para determinar la identi-
dad del producto. Los inmunoensayos por citometría de flujo son los métodos más comunes para detectar y cuantificar estos
marcadores. La identificación y cuantificación de subgrupos individuales de células se realiza mediante análisis multiparamétri-
co, por lo general, según el tamaño y la granularidad, y de uno o más marcadores de identidad. Otros ejemplos de pruebas de
identidad incluyen análisis isoenzimáticos para confirmar las especies de origen, los cuales serían preferibles si el producto
constara de células xenogénicas. Se puede emplear la morfología celular para distinguir tipos de células específicas. Existe una
creciente tendencia al uso de tecnologías de identificación genética tales como repeticiones cortas en tándem para establecer
la identidad de líneas celulares (p. ej., células madre embrionarias humanas usadas para derivar tipos de células terapéuticas).
PUREZA
Los métodos de pureza cuantifican específicamente los componentes activos deseados del producto. Las impurezas son con-
taminantes residuales relacionados con el producto o el proceso que se pueden detectar en el producto final. El requisito de
analizar una impureza particular para la liberación de un lote dependerá de: (1) la capacidad demostrada del proceso de fabri-
cación y purificación para eliminar o inactivar la impureza mediante la validación del proceso y (2) el potencial de toxicidad o
el impacto funcional sobre el producto asociado con la impureza.
Entre los ejemplos de impurezas relacionadas con el proceso asociadas con productos de terapia celular se incluyen los com-
ponentes residuales del medio de producción (p. ej., suero, antibióticos o citoquinas exógenas), materiales auxiliares usados en
el procesamiento subsiguiente (downstream processing) (p. ej., nucleasas o proteasas) y lixiviables (p. ej., plastificantes de tu-
berías o plásticos para cultivo). Las impurezas pueden ser bioactivas (p. ej., citoquinas u hormonas) o inmunogénicas (p. ej.,
agregados, productos de degradación o proteínas derivadas de animales). Las impurezas pueden tener otros efectos perjudi-
ciales, dependiendo de la dosis del producto.
Las impurezas relacionadas con el producto son específicas a cada tipo de producto. Los ejemplos incluyen restos celulares,
presencia de células no diferenciadas en un producto derivado de células que debe contener tipos específicos de células tera-
péuticas diferenciadas; niveles inaceptables de células no viables; células competentes para la replicación en un producto celu-
lar que debe contener células mitóticamente inactivadas; o cambios en la composición de células funcionales posteriores a la
crioconservación y descongelación. Las metodologías analíticas para evaluar la pureza requieren la cuantificación de las impu-
rezas o su separación física del producto. Se debe hacer hincapié en demostrar la uniformidad del perfil de impurezas del pro-
USP42 Información General J (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 7493
dueto. Puede ser posible valorar el proceso de fabricación al grado que se pueda limitar el análisis de liberación de lote especí-
fico para impurezas.
El análisis de impurezas es a menudo extenso durante la caracterización del producto y la validación del proceso cuando se
está demostrando la uniformidad de la fabricación y del proceso de purificación. El análisis de impurezas como parte del análi-
sis de liberación del lote debe reflejar los riesgos de seguridad asociados con la impureza y la capacidad del proceso para elimi-
nar sistemáticamente tal impureza.
POTENCIA
La potencia se define, de conformidad con el Título 21 del CFR 600.3(s), como "la capacidad específica del producto, con-
forme a lo indicado por pruebas de laboratorio apropiadas o por datos clínicos adecuadamente controlados obtenidos me-
diante la administración del producto en la forma prevista, para generar un resultado determinado." Junto con la dosis, lapo-
tencia define la actividad biológica de cada lote (ver Ensayospara Determinaciónde Dosis,a continuación). La relación entre las
mediciones de potencia del producto durante el desarrollo y la fabricación con la seguridad y eficacia clínicas es clave para su
uso en la liberación de partidas. La potencia se puede evaluar mediante valoraciones biológicas in vitre o in vivo o una combi-
nación de éstas. Es común que estas valoraciones tengan coeficientes de variación entre 30% y 50%. Estas valoraciones requie-
ren un material de referencia representativo, bien definido, que se pueda utilizar como control positivo para la valoración. El
control positivo sirve para calificar el rendimiento de una valoración individual. El desarrollo de las valoraciones de potencia
debe centrarse en la caracterización y control de la variabilidad. Las valoraciones de alta precisión son herramientas eficaces
para controlar la calidad del producto. La información relacionada con la variabilidad de la valoración de potencia se debe in-
corporar en el diseño de estudios de estabilidad y la metodología estadística propuesta para asignar la fecha de caducidad (ver
Estabilidadmás adelante).
Los tipos de valoraciones que se pueden emplear para establecer la potencia de un producto derivado de células son muy
variados y dependen de las características únicas y la vida útil del producto. Para algunos productos derivados de células tales
como células progenitoras hematopoyéticas, las valoraciones de potencia del producto han sido correlacionadas con la eficacia
clínica. En este caso, el ensayo tradicional por formación de colonias que cuantifica células progenitoras tales como las unida-
des formadoras de colonias-granulocito-macrófago (UFC-GM) ha sido relacionado con los resultados clínicos de injerto en al-
gunos estudios. Para otros productos derivados de células, se han usado los modelos de enfermedades de animales in vivo
para establecer la potencia del producto. Si el producto derivado de células libera una macromolécula bioactiva, la valoración
de potencia se puede basar en unidades de actividad liberada. Por ejemplo, la producción de insulina como respuesta a los
cambios en los niveles de glucosa puede ser la base de un ensayo de potencia para células destinadas para el tratamiento de
diabetes.
Los productos específicos para pacientes tales como las inmunoterapias autólogas presentan retos relacionados con la de-
mostración de la actividad terapéutica en un sistema de ensayo in vitro o in vivo. Las metodologías novedosas para medir la
potencia, como la correlación de la evolución clínica con otras pruebas de caracterización, como las pruebas de identidad,
pueden ser apropiadas y deben ser analizadas con las autoridades reglamentadoras en las primeras etapas del desarrollo. Por
ejemplo, la capacidad de determinar marcadores específicos de identidad de superficie celular empleando técnicas de citome-
tría de flujo o tinciones vitales puede ser una medición aceptable de la potencia, si está validada adecuadamente y se correla-
ciona con el resultado clínico. La FDAha emitido pautas que analizan la posibilidad de uso de una matriz de ensayos biológi-
cos y no biológicos, incluyendo tanto ensayos cualitativos como cuantitativos, para establecer la potencia del producto. La in-
formación contenida en estas pautas es particularmente importante para productos derivados de células con una vida útil cor-
ta o mecanismos de acción complejos o actividades biológicas múltiples (ver Guidancefor lndustry: PotencyTestsfor Cel/ularand
Gene TherapyProducts[Guía para la Industria: Pruebas de Potencia para Productos de Terapia Celular y Génica).
Por lo general, se requiere de una valoración de potencia validada antes de la aprobación reglamentaria. Durante los estu-
dios clínicos investigativos, las autoridades reglamentarias por lo general requieren que, antes de iniciar los ensayos clínicos
claves, se cuente con una valoración o valoraciones bien definidas destinadas a establecer la potencia del producto. Se reco-
mienda ampliamente la implementación temprana de una o más valoraciones candidatas destinadas a establecer la potencia
del producto. Los datos de estas valoraciones candidatas de potencia o funcionales pueden ser particularmente importantes al
evaluar cambios propuestos en la fabricación, durante la transferencia de tecnología y para determinar la estabilidad del pro-
ducto.
ENSAYOSDE DETERMINACIÓN
DE DOSIS
El ensayo que mide, con precisión, la cantidad de producto se denomina ensayo de determinación de dosis y se selecciona
basándose en su exactitud y precisión. Un ensayo que mide la actividad terapéutica de un producto recibe el nombre de valo-
ración de potencia y se diseña para medir la función del producto. Este tipo de valoración es diferente al ensayo de determina-
ción de dosis. El diseño del ensayo depende del tipo de producto. En el caso de medicamentos, las valoraciones que miden la
cantidad de fármaco (dosis) se llaman valoraciones de contenido. Para estos medicamentos, las dosis de producto se pueden
definir como la concentración o cantidad del producto final administrado al paciente y por lo general se mide como masa de
producto. Para productos derivados de células, los atributos tales como el número viable de células terapéuticas a menudo se
usan para definir la dosis del producto.
Los productos de terapia celular se pueden dosificar con base en la enumeración de una o más poblaciones de células.
Cuando el producto se encuentra en una suspensión homogénea de célula única, el ensayo más utilizado es el número de
células viables. Estos ensayos pueden incluir la enumeración de todas las células, células nucleadas totales u otro subgrupo ce-
lular. Los ensayos de viabilidad por lo general se basan en la capacidad de las células de excluir un colorante supravital, como
el azul de tripán. Los resultados se expresan como el número de células que excluyen el colorante y, por lo tanto, se conside-
ran viables. Los compuestos fluorescentes que se unen a las proteínas nucleares y que son excluidos por las células viables pue-
den incorporarse a métodos de citometría de flujo para la determinación simultánea de viabilidad y marcadores de identidad
de las células.
El conteo de células se puede llevar a cabo rápidamente por métodos manuales o automatizados. El recuento manual por
enumeración visual de células en una cámara hematocitométrica es una técnica de fácil acceso, de exactitud aceptable, pero
de menor precisión que la mayoría de los métodos automatizados. Los instrumentos habituales para el recuento celular auto-
mático proporcionan una enumeración reproducible de células no nucleadas (eritrocitos y plaquetas) y de células nucleadas y
un recuento diferencial de células anteriormente nucleadas en poblaciones de leucocitos mononucleares y polimorfonucleares.
Una discriminación mayor de poblaciones celulares específicas, por lo general, requiere el análisis de fenotipos de superficie
celular por citometría de flujo u otros métodos (ver la sección Identidadanterior). La proporción de una subpoblación celular
específica puede determinarse por FACSo por citometría de flujo. Un ejemplo de ensayo de enumeración de células es la enu-
meración de células progenitoras hematopoyéticas CD34 positivas (CD34+).
Para productos que contienen células en una suspensión no homogénea, tales como células que se combinan con un bio-
material (p. ej., un andamiaje), se han usado medidas alternativas para la enumeración de células, incluyendo el área total de
una capa de células, el peso húmedo, las proteínas totales y el ADN total. Si se emplean estas medidas para determinar la dosis
del producto, se deben llevar a cabo pruebas complementarias para establecer la importancia.
Consideraciones para el Análisis de Liberación de Construcciones de Células y Biomateriales
Para algunos productos derivados de células tales como células combinadas con biomateriales para formar productos de
combinación, puede no ser factible analizar directamente la construcción de células y biomateriales. Con frecuencia se da este
caso cuando están implicadas células autólogas y la construcción de células y biomateriales consta de una sola unidad y no es
factible el muestreo de la construcción. En tales casos, los componentes individuales se analizan antes de ser combinados y la
construcción final no se somete a análisis directo. Las medidas indirectas tales como el muestreo del medio de cultivo se pue-
den emplear para tratar los requisitos reglamentarios. Se debe establecer la calidad y estabilidad de la construcción de células y
biomateriales formulada, así como la importancia de las medidas indirectas mediante estudios de validación durante el desa-
rrollo del producto.
Consideraciones sobre el Muestreo
Conforme a lo requerido por las BPF,se deben conservar muestras de producto después de haber completado el análisis de
liberación. Cuando se emplean estrategias de liberación rápida, es posible que los fabricantes deban conservar muestras adicio-
nales de manera que pueda reevaluarse la calidad del producto mediante metodologías de prueba alternativas o tradicionales,
si fuera necesario.
El muestreo para el análisis de liberación de lote debe basarse en la distribución potencial del parámetro analizado. Ver Desa-
rrollo del Protocolode Estabílídad(más adelante) para consideraciones adicionales. Se deben conservar muestras de cada lote
ante la posibilidad de que surjan problemas de seguridad o calidad con un lote. Aunque la vida útil del producto sea muy
breve, se pueden utilizar estas muestras retenidas para detectar impurezas y otras sustancias. La necesidad de un diseño ade-
cuado del plan de muestreo requiere de consideración especial. En estos casos, la validación del proceso ayudará a determinar
el diseño apropiado de muestreo estadísticamente fundamentado.
Métodos de Prueba Alternativos
Conforme a lo indicado en Especificaciones para la Liberaciónde ProductoFinal(anteriormente), los productos de terapia celu-
lar deben someterse a pruebas de esterilidad, micoplasma y endotoxina. Antes del uso clínico, se deben cumplir criterios de
aceptación adicionales para el análisis relacionado con la identidad, pureza, potencia, dosis y demás características pertinentes.
Excepto por la esterilidad, micoplasma y endotoxinas, la mayoría de los procedimientos de prueba y sus métodos centrales
usados para garantizar que el producto final cumple con los criterios de aceptación para liberación son únicos para el producto
y se pueden adaptar para cumplir con las características y aplicaciones específicas del producto derivado de células. En general,
se deben desarrollar métodos de prueba basándose en los mejores criterios científicos disponibles y deben ser adecuados para
su uso en un ambiente de fabricación que cumpla con las 8PM. Las valoraciones deben ser robustas, confiables y susceptibles
de validación y deben proporcionar resultados antes de la liberación para uso clínico. El capítulo Validaciónde Procedimientos
Farmacopeicos (1225) proporciona consideraciones básicas para la validación de métodos.
Para algunos productos de terapia celular, el tamaño de la muestra y el volumen de material requerido para el análisis, o el
tiempo necesario para obtener resultados de prueba puede consumir cantidades significativas del producto final o el tiempo
requerido para obtener resultados puede exceder la vida útil del producto o ambos. Esto crea problemas con el suministro
disponible de producto para tratar pacientes y en otras situaciones, descarta la posibilidad de obtener resultados antes de su
administración en pacientes, lo cual es un problema particular para la prueba de esterilidad farmacopeica así como para el
método de cultivo en caldo-agar para micoplasma, recomendado por la FDA.Por consiguiente, tanto la industria como las
autoridades reglamentarias han mostrado un interés considerable en facilitar el desarrollo de métodos de prueba alternativos
para estabilidad y micoplasma.
Las reglamentaciones de la FDApara productos biológicos tratan específicamente el uso de métodos equivalentes siempre
que garanticen que la seguridad, pureza, potencia y eficacia del producto biológico sean iguales o mayores a las garantías pro-
vistas por el método específico (Título 21 del CFR610.9). A continuación se describen algunos de los métodos de prueba alter-
nativos disponibles para esterilidad y micoplasma.
Existe una amplia variedad de tecnologías disponibles que continúa en desarrollo por parte de diseñadores de ensayos para
su uso en la industria de las terapias celulares. Los atributos que deben incluirse en cualquier revisión de tecnología propuesta
incluyen la exactitud para el propósito destinado, la velocidad de productividad, los costos, la aceptabilidad por parte de la
comunidad científica y las agencias reglamentarias, la simplicidad de la operación, los requisitos de capacitación y reactivos, la
reputación del proveedor, los servicios técnicos provistos por el vendedor y, finalmente, los requisitos de servicios y espacio.
La validación de estos métodos de prueba y la demostración de equivalencia, según se describen en el Título 21 del CFR
610.9, son obligatorias al momento de solicitar la autorización para productos biológicos (BLA,por sus siglas en inglés) o una
aprobación previa a la comercialización (PMA, por sus siglas en inglés).
ESTERILIDAD
Las plataformas de detección para métodos microbiológicos alternativos por lo general se han basado en el crecimiento, via-
bilidad, artefactos o ácidos nucleicos. Las tecnologías basadas en el crecimiento de microorganismos emplean medidas bioquí-
micas o fisiológicas que reflejan el crecimiento de microorganismos. Las muestras de prueba se transfieren a formulaciones de
medio tradicionales o mejoradas que estimulan la proliferación microbiana, y el crecimiento microbiano se detecta química o
espectrométricamente. La ventaja primaria de estos sistemas es la naturaleza automatizada de los resultados de prueba y la
recuperación de microorganismos para investigaciones de fallas y otras metodologías de caracterización microbiana. La FDAha
publicado pautas para validación de métodos microbiológicos rápidos basados en crecimiento (Guidancefor lndustry: Validation
of Growth-BasedRapidMicrobiologicalMethodsfor Sterility Testingof Cellularand GeneTherapyProducts,CBER,2008 [Guía para
la Industria: Validación de Métodos Microbiológicos Rápidos Basados en Crecimiento para Pruebas de Esterilidad de Productos
de Terapia Celular y Génica). Los principios de validación de métodos microbiológicos alternativos también se describen en el
capítulo de USP Validaciónde MétodosMicrobiológicosAlternativos(1223).
Las tecnologías basadas en la viabilidad no requieren de crecimiento celular. Estas tecnologías se basan en detectar la pre-
sencia de contaminantes vivos individuales mediante colorantes vitales, tintes o marcadores de superficie celular. Las células
marcadas con un sustrato metabólico de fluorocromo específico se recolectan en una membrana de detección.
Las tecnologías basadas en artefactos analizan componentes celulares o sondas moleculares que se designan específicamente
para una especie microbiana particular. Por ejemplo, las especies individuales se pueden caracterizar mediante patrones únicos
de composición de ácidos grasos después de que se han saponificado muestras de células enteras para inducir la formación de
ésteres metílicos. Otras tecnologías emplean espectrometría de masas por tiempo de vuelo.
Las tecnologías de ácidos nucleicos (NAT,por sus siglas en inglés) se basan en la amplificación de ADN mediante reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), tipificación de ARNr 16s ó 23s y secuenciación génica. Algunas tecnologías identifican microor-
ganismos mediante la secuenciación de una porción del cromosoma de un organismo desconocido y comparando la secuen-
cia de ARNr 16s con una base de datos. Esta tecnología es capaz de identificar hongos, micoplasma y bacterias, incluyendo
elementos de lento crecimiento y no fermentadores. Para más detalles sobre los métodos basados en PCR, ver el capítulo de
USP TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Amplificación(1127).
MICOPLASMAS
Las metodologías de análisis farmacopeico para micoplasma se desarrollan basándose en cultivos en agar y caldo y requieren
por lo menos 28 días para controlar adecuadamente la presencia de contaminación por micoplasma. Debido a esta limitante,
se han desarrollado una variedad de tecnologías de análisis rápido de micoplasma basadas en técnicas de amplificación de áci-
dos nucleicos tales como PCR, así como ensayos de hibridación de ácidos nucleicos no amplificados, ELISAy ensayos basados
en enzimas.
SISTEMASDE CALIDAD
Los sistemas de calidad entrelazan los diversos aspectos de la fabricación. Los programas de control de calidad (QC) y de
garantía de calidad (QA) deben ejercer control sobre las instalaciones y los procesos de fabricación, los procesos de validación
y las pruebas de las materias primas, los materiales en proceso, los productos a granel y el producto formulado final. Los pro-
gramas de capacitación y certificación representan el núcleo para contar con personal de fabricación técnicamente competen-
te. Se debe implementar un programa de documentación para sustentar todas las operaciones de fabricación, capacitación,
validación y calidad. Los cambios en los procesos y procedimientos deben seguir un programa formal basado en principios
bien establecidos de control de cambios.
Cuando se usan células o tejidos humanos alogénicos como material de origen para la fabricación de productos derivados
de células o tejidos, los donantes de células o tejidos deben ser sometidos a análisis de detección y pruebas adecuadas (ver la
sección Eligibilidadde Donantesanterior). En todos los casos, las células y tejidos humanos de origen deben manipularse de
conformidad con las Buenas Prácticas para Tejidos (GTP) según se describe en el Título 21 del CFR 1271.
Además de las GTP,se aplican las BPFvconforme a lo descrito por la FDAen el Título 21 del CFR21 O, 211, 600s (en especial
en el Título 21 del CFR61 O) y 820 a la fabricación de productos derivados de células y tejidos que están sujetos a la aproba-
ción previa a su comercialización. Las instalaciones, equipos y procesos de fabricación, al igual que las materias primas, siste-
mas de calidad y personal capacitado son algunos de los elementos fundamentales de las BPFv.Las BPFvse aplican al proceso
y a la planta de fabricación a lo largo de todo el desarrollo clínico. El grado de control se incrementa a medida que progresa el
desarrollo clínico y se espera el cumplimiento cabal con las BPFval momento de iniciar los ensayos clínicos Fase 111.
Es indispensable monitorear los datos obtenidos del análisis durante el proceso y de liberación del producto final. Los resulta-
dos fuera de especificación (OOS, por sus siglas en inglés), o incluso aquellos que están fuera de la tendencia, se deben investi-
gar antes de desechar el material. La Guidancefor lndustry: lnvestigating Out of Specification(00S) TestResultsfor Pharmaceuti-
cal Production(octubre de 2006) [Guía para la Industria: Investigación de Resultados de Pruebas Fuera de Especificación en la
Producción Farmacéutica] de la FDAofrece un enfoque sistemático para llevar a cabo una investigación. El resultado de un
ensayo puede rechazarse cuando se confirma que se ha presentado un error, tal como un error del analista, de cálculo o fallo
del equipo. Si la investigación determina que los resultados de las pruebas del producto no cumplen con los criterios de acep-
tación especificados, el lote debe ser rechazado. En algunas situaciones, especialmente con productos autólogos o alogénicos
específicos del paciente, puede ser necesario administrar un producto que no cumpla con todas las especificaciones o que pre-
senta únicamente resultados de prueba incompletos como medida para salvar la vida de un paciente. Sin embargo, se debe
contar con procedimientos que rijan la comunicación de resultados OOS al médico o a la persona responsable de tomar la
decisión del uso del producto y para proporcionar instrucciones para todas las pruebas de seguimiento, monitoreo del pacien-
te y comunicación de dichos resultados a todas las partes, incluyendo autoridades reglamentarias.
Conforme a lo descrito con anterioridad, un enfoque de gestión de riesgos efectivo en las etapas tempranas de desarrollo
del producto puede asegurar la más alta calidad de un producto derivado de células al proveer una medida proactiva para
identificar y mitigar problemas potenciales de calidad. La probabilidad de falla en los productos de terapia celular puede surgir
de una variedad de fuentes, incluyendo errores del personal, fallas en el procesamiento aséptico, fallas de los equipos, fallas de
las instalaciones y servicios, limpieza, desinfección y fallas en los componentes y materias primas. Un entendimiento proactivo
del riesgo puede ayudar a tomar mejores decisiones al momento de presentarse un problema de calidad. La gestión efectiva
de riesgos puede facilitar la toma de decisiones más informadas y adecuadas y puede ofrecer a las autoridades reglamentarias
una mayor garantía de la capacidad de un desarrollador para tratar riesgos potenciales. Dicha garantía puede afectar el grado
y nivel de supervisión reglamentaria directa. La gestión de riesgos de calidad se puede integrar en partes claves del sistema de
calidad tales como la gestión de cambios, la Acción Correctiva y Preventiva (CAPA,por sus siglas en inglés), las BPFv,la valida-
ción, entre otras, y se puede usar para establecer especificaciones coherentes y Parámetros Críticos del Proceso (CPP,por sus
siglas en inglés) para asegurar el cumplimiento de los atributos de calidad.
El análisis de riesgos es de naturaleza cualitativa. Se puede lograr usando experiencia y conocimientos sobre el proceso para
definir las categorías para la evaluación de riesgo que pueden formar la base de un sistema de evaluación y mitigación de ries-
gos después de identificar errores de fabricación. Por ejemplo, resulta una práctica común desarrollar categorías de riesgo de
incumplimento o desviaciones que puedan incorporarse a un procedimiento de investigación de incumplimiento o fallas. Las
categorías son particularmente útiles cuando es necesario acelerar la evaluación de riesgos para facilitar una CAPA.A continua-
ción se definen, a manera de ejemplo, los Niveles de Riesgo 1 a 4 los cuales se pueden adoptar como un medio para llevar a
cabo una evaluación preliminar de riesgos:
Nivel de riesgo1: AspectosTécnicos-No presenta ningún riesgo para el paciente y no impacta la seguridad y efectividad
del producto. Ejemplo: Falta de una firma en el registro de partida.
Nivel de riesgo2: Alerta-Puede presentar un riesgo para la seguridad del paciente o puede tener un impacto potencial
en la seguridad y eficacia del producto. Se debe volver a establecer el cumplimiento mediante justificación apropiada para
proceder después de su entrega a QA para su revisión y aprobación. Ejemplo: El tiempo de digestión de procesamiento de
biopsia está fuera del intervalo definido.
Nivel de riesgo3: No enviar/rechazarel lote-Puede presentar un riesgo para la seguridad del paciente o afectar la efica-
cia del producto incluso después de tomar acciones correctivas. No se permite su envío. Ejemplo: Los cultivos no demues-
tran un crecimiento celular adecuado.
Nivel de riesgo4: Eventoposteriora la distribución-Puede presentar un riesgo para la seguridad del paciente o un impac-
to potencial en la seguridad, potencia o pureza del producto. La señal de seguridad se identifica después de la distribu-
ción del producto. Ejemplo: La prueba de esterilidad fallida se conoce después de la distribución del producto.
Lt
DISEÑODE LAS INSTALACIONES

Y CONSIDERACIONES
OPERATIVAS
Las instalaciones de fabricación para productos de terapia celular y tisular deben ser cuidadosamente diseñadas para mante-
ner las operaciones de procesamiento aséptico de acuerdo con las BPF,al tiempo que abarca aspectos únicos del producto. Las
células o tejidos recibidos pueden tener biocarga u otros contaminantes por lo que puede ser necesario recibirlas y procesarlas
en un área segregada en cuarentena para evitar comprometer a la instalación principal. Asimismo, el procesamiento de tejido
para obtener células de interés puede requerir de equipo y procesos especializados que deben considerarse durante el diseño y
las operaciones subsiguientes de la instalación. Para fabricar productos de combinación que implican andamiajes biocompati-
bles, puede ser necesario que la instalación sea capaz de manejar operaciones que impliquen procesamientos, manipulaciones
y eliminaciones químicas. Esto puede presentar restricciones en el diseño de la instalación, especialmente para los sistemas de
manejo de aire en ambientes de cuartos limpios.
Aunque el principal hincapié en la fabricación de un producto derivado de células o tejidos se relaciona con la protección del
producto de contaminación involuntaria, es necesario evaluar y reducir los riesgos para el operador de fabricación mediante
capacitación adecuada en el manejo de patógenos transmitidos por la sangre y en el uso de equipo/vestimenta de protección.
La protección del operador y el procesamiento aséptico son complementarios e incluyen el uso de cabinas de seguridad bioló-
gica certificadas y de vestimenta de protección aséptica que consta de batas, guantes, mangas, máscaras quirúrgicas, protec-
ción para los ojos y cubiertas para la cabeza. El tejido humano debe obtenerse en condiciones y controles ambientales que
proporcionen un alto grado de garantía de recuperación aséptica.
El grado de control requerido para operaciones de procesamiento de células y tejidos depende de una variedad de factores,
incluyendo la complejidad de los procesos de fabricación aséptica, el sitio primario de fabricación y la vida útil del producto
final. Los procesos de fabricación que implican la manipulación abierta de células, incluso en una cabina de seguridad biológi-
ca, tienen mayor riesgo de contaminación que los procesos que se llevan a cabo en biorreactores cerrados o sistemas de bol-
sas, que utilizan dispositivos estériles de conexión y de sellado de tubos. Por lo regular, los cuartos limpios ISO 7 (clase 1O 000)
y las cabinas de seguridad biológica ISO 5 (clase 100) son componentes esenciales para procesos de fabricación de productos
de terapia celular, especialmente aquellos que implican manipulaciones abiertas.
El ambiente controlado de un cuarto limpio, cuidadosamente diseñado, construido, validado y mantenido puede minimizar
los riesgos de contaminación ambiental durante el procesamiento aséptico y reducirá la posibilidad de contaminación cruzada
de productos específicos para un solo paciente. Las presiones diferenciales entre la fabricación clasificada deben cumplir con el
documento guía de septiembre de 2004, SterileDrug ProductsProducedby AsepticProcessing-Current GoodManufacturing
Practice(Medicamentos Estériles Producidos Mediante Procesamiento Aséptico-Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes). Se
debe monitorear la calidad del aire en las instalaciones y las áreas de procesamiento de manera tal que se provea un alto nivel
de condiciones asépticas durante el procesamiento. Para pautas relacionadas con este tema, ver el capítulo Control Microbioló-
gico y Monitoreo de Ambientespara ProcesamientoAséptico(1116).
La limpieza de las instalaciones, la segregación de componentes y productos, así como los procedimientos de desinfección,
deben llevarse a cabo para evitar contaminación microbiana y contaminación cruzada entre lotes producidos en las instalacio-
nes.
Los productos celulares o tisulares basados en células autólogas representan un nivel de complejidad adicional para el diseño
y la operación de las instalaciones de fabricación. Para productos autólogos, se fabrica un lote de producto para cada persona
y se requiere de segregación completa durante la fabricación. A diferencia de los diseños de instalaciones para productos alo-
génicos, los cuales se basan en volumen en gran escala para lograr la máxima eficiencia de fabricación, las instalaciones para
productos autólogos requieren de una unidad de ampliación (a escala), lo cual debe considerarse durante el diseño y la opera-
ción de las instalaciones. La automatización puede emplearse de manera efectiva para gestionar la manipulación manual repe-
titiva de células. Es posible que la escala inicial de operación no justifique una inversión de capital inicial para automatización,
pero se debería considerar a medida que aumenta el tamaño de las operaciones de fabricación.
La segregación del producto en las instalaciones es otro punto clave a tomar en cuenta durante el diseño y la operación. La
supervisión del etiquetado y de QA se usan generalmente para el rastreo y la segregación. Técnicas tales como los códigos de
barra y las etiquetas de frecuencia radial (FR)pueden usarse para el rastreo y la segregación del producto. Para obtener pautas
sobre este tema, ver el Título 21 del CFR211.42, 211.11 3, 1271 y la Guidancefor lndustry: SterileDrug ProductsProducedby
AsepticProcessing-Current Good Manufacturing Practice(Guía para la Industria: Medicamentos Estériles Producidos Mediante
Procesamiento Aséptico-Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes) de la FDA,septiembre 2004.
El equipo de fabricación debe ser robusto, proveer productos uniformes y permitir la calibración periódica y el mantenimien-
to preventivo. La calificación es necesaria para el equipo del cual se derivan parámetros o mediciones críticas del proceso. En la
mayoría de los casos, esto incluye el software que controla las operaciones del equipo o sistemas. Los equipos críticos, como
las incubadoras o los congeladores, deben contar con sistemas de alarma capaces de emitir señales de falla de manera remota.
Asimismo, el equipo crítico debe estar conectado a un generador de respaldo para emergencias, el cual debe probarse periódi-
camente para verificar su estado operativo.
CONSIDERACIONES
SOBRELA VALIDACIÓNY CALIFICACIÓN
Los principios de validación recomendados por los documentos guía de la FDAy de la ICH, así como los capítulos de USP
(1225) y Validaciónde RecuperaciónMicrobiana de ArtículosFarmacopeicos(1227) aplican a los productos derivados de células y
7498 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 42
tejidos. La variación biológica en las células y tejidos de origen usados para fabricar la mayoría de los productos de terapia
celular o tisular pueden afectar los esfuerzos de la validación.
Las actividades de validación deben incluir la evaluación de riesgos, la capacitación y calificación del personal, la calificación
del equipo e instalaciones, la validación de métodos analíticos, el procesamiento aséptico, el proceso de fabricación y la limpie-
za.
La validación del proceso debe tomar en cuenta la seguridad, la uniformidad (rendimiento del proceso y por etapas, elimina-
ción de impurezas), la robustez (operador a operador, día a día) y la calidad del producto final (identidad, pureza, potencia). Es
necesario evaluar o calificar de manera apropiada los métodos analíticos usados para evaluar el proceso.
La validación de procesos para productos específicos del paciente como los productos autólogos celulares y tisulares presen-
ta problemas excepcionales. Primero, los materiales de partida para productos específicos del paciente por lo general se obtie-
nen de materiales del paciente o de un donante que corresponda, tales como material de biopsia, productos obtenidos por
aféresis, tejidos de desecho de procedimientos quirúrgicos y órganos de cadáveres que no califican para transplan 'te. El proce-
so puede requerir que los fabricantes acepten cierto intervalo en lo que respecta a la calidad y la cantidad del material de parti-
da, al tiempo que deben seguir produciendo un producto final que satisfaga los análisis de liberación. En segundo lugar, el
procesamiento manual de células y tejidos presenta un grado de variabilidad inherente. Se deben desarrollar etapas de proce-
samiento que resulten de manera exitosa y uniforme en componentes de proceso y productos finales apropiados, incluso si el
proceso se basa en materiales tisulares no estándares o variables. La validación del proceso debe tomar en cuenta dicha varia-
bilidad y debe garantizar que los puntos finales y críticos de la fabricación y del análisis cumplan en todo momento con las
especificaciones.
Las validaciones de procesos asépticos se deben llevar a cabo usando medios microbiológicos que demuestren que el perso-
nal de fabricación puede realizar los procedimientos y producir un producto libre de contaminación microbiana. Los procedi-
mientos destinados a mantener la segregación durante la fabricación se deben someter a desafío para verificar que la probabi-
lidad de contaminación cruzada o confusión entre lotes de producto para diferentes pacientes sea mínima.
Dependiendo de la variabilidad de las células o tejidos de origen y de la complejidad del proceso de fabricación, puede ser
necesario fabricar más de tres lotes de calificación para verificar la uniformidad y la robustez del proceso de fabricación. No
todos los esfuerzos de fabricación serán exitosos para productos de terapia autólogos y específicos del paciente. Sin embargo,
se debe establecer la tasa de éxito y realizar un seguimiento que permita a los fabricantes detectar cualquier reducción en di-
cha tasa y, en tal caso, tomar las medidas necesarias para corregir el problema. Las células primarias bien caracterizadas de un
banco de células se pueden utilizar en la validación del proceso si el perfil de los donantes se encuentra dentro del intervalo
deseado para la población de pacientes. También puede ser apropiado un análisis de tendencia de un número de administra-
ciones de producto estadísticamente aceptable.
Deben realizarse validaciones sobre la limpieza del equipo y las instalaciones a fin de demostrar la eficacia de los agentes de
limpieza sobre contaminantes estándar microbianos y fúngicos, así como contaminantes aislados de la planta de fabricación.
La medición de los residuos de los agentes de limpieza debe tratarse en las validaciones de limpieza del equipo. Deberá eva-
luarse el equipo, las instalaciones y los sistemas electrónicos de monitoreo y control, tales como los sistemas de monitoreo de
edificios y de control de inventarios.
El equipo y los métodos analíticos y de fabricación deben ser validados siguiendo los procedimientos descritos en el capítulo
(1225), además de los documentos guía emitidos por la ICH (ver Q2 Rl ). Se deben establecer planes de capacitación y se
deben llevar a cabo calificaciones del personal. Se deben realizar validaciones para el transporte de tejidos y el envío de pro-
ductos.
PREPARACIÓN
Y ADMINISTRACIÓN
DELSITIOCLÍNICO
Antes de llevar a cabo la administración de algunos productos derivados de células o tejidos, puede ser necesario realizar
modificaciones al producto o etapas de preparación. Estas modificaciones o etapas a menudo se realizan cerca del momento
de la administración y, por lo tanto, quedan fuera del control de fabricante original. La naturaleza de estas modificaciones de-
pende, en gran medida, de las características del producto.
Las etapas de preparación incluyen la descongelación, el lavado o filtrado para eliminar células o sustancias acumuladas du-
rante el almacenamiento, la transferencia a una solución infusible o la formulación con un vehículo o material estructural tal
como un andamiaje. Asimismo, las consideraciones sobre el paciente, tales como la necesidad de preparar dosis o modificar el
producto de acuerdo con la estructura anatómica, peso o volumen sanguíneo del paciente, pueden afectar dichas etapas.
Se deben establecer en el sitio clínico procedimientos adicionales y controles de proceso para todos los intervalos de almace-
namiento de producto, etapas de transporte y modificaciones, comenzando con una definición clara de puntos de control crí-
ticos. Los requisitos operativos incluyen la designación de un espacio físico adecuado para la manipulación aséptica, como por
ejemplo una cabina de seguridad biológica ISO 5 (clase 100), personal capacitado, procedimientos operativos estándar detalla-
dos y supervisión de la calidad. La naturaleza única e irremplazable de muchos productos derivados de células o tejidos incre-
menta la necesidad de contar con procedimientos bien establecidos para preparación y administración en el sitio clínico.
USP 42 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 7499
Manipulación del Producto
Antes de administrar productos médicos que contienen células, la preparación en el sitio puede implicar una o más manipu-
laciones. Las manipulaciones típicas incluyen lo siguiente:
Cambio en el Envase Final-El producto fabricado puede haber sido almacenado o transportado en un envase y es posi-
ble que necesite ser transferido a un envase diferente para su administración.
Cambio del Estado Físico o Temperatura-Puede ser necesario descongelar o entibiar el producto.
Cambio en Solución o Suspensión-Puede ser necesario disolver, diluir o suspender un producto en un líquido.
Combinación con un Material Biológico-Puede ser necesario combinar las células terapéuticas con un material de an-
damiaje tal como hojas de matriz extracelular descelularizadas, geles, tapones, cápsulas, esponjas, partículas o gránulos.
En otros casos, puede ser necesario agregar las células a un dispositivo médico existente tal como una unidad de filtración
de fibras huecas antes de su uso.
Mezclado o Preparación Magistral-Para algunos productos celulares, puede ser necesario el mezclado o la preparación
magistral en el sitio clínico.
Filtración o Lavado-La presencia de materiales no deseados en el producto fabricado, tales como partículas, desechos
celulares, metabolitos o compuestos remanentes de manipulaciones previas, puede requerir de etapas de lavado o filtra-
ción.
Muestreo-Puede ser necesario llevar a cabo un muestreo del producto final antes de su administración para probar la
formulación final.
Consideracionessobre las Instalacionesdel Sitio Clínico
Los requisitos de las instalaciones para llevar a cabo las etapas de preparación en el sitio o la administración de productos de
terapia celular dependen de los productos y de las manipulaciones requeridas. El principal determinante de las características
de las instalaciones es el grado de riesgo de contaminación microbiana relacionado con cada paso. Ver PreparaciónMagistral-
Preparaciones Estériles(797) para obtener pautas relacionadas con el tipo de manipulación y los niveles de control ambiental
requeridos para garantizar el manejo aséptico.
Descongelaciónde ProductosDerivados de Células
La descongelación se lleva a cabo rápidamente. Si se va a reinfundir o trasplantar una pequeña cantidad de células, no es
necesario extraer el DMSO de la suspensión, porque la mayoría de las preparaciones celulares pueden ser concentradas ade-
cuadamente para mantener la concentración de DMSO dentro de límites tolerables. El uso de DMSO ejerce dos efectos sobre
las células después de la descongelación: Se pueden agrupar si están dañadas y el DMSO reduce la viabilidad celular en minu-
tos. Si se debe extraer el DMSO o concentrar las células para la administración, por lo general, se diluye la suspensión de célu-
las descongelada de forma seriada (para evitar el choque osmótico) y se la vuelve a suspender en un medio con proteínas. La
viabilidad y potencia de las células se puede monitorear después de la descongelación, pero a menudo, la información es solo
para propósitos de recolección de datos y no una especificación que se debe cumplir para el uso clínico del producto celular.
Algunos productos de terapia celular necesitan ser transportados frescos (es decir, sin congelar). En algunas situaciones, los
componentes celulares se almacenan congelados pero se descongelan y aplican a los andamiajes en el sitio de fabricación a
temperatura ambiente o de refrigeración, justo antes de ser transportados. Es posible que los productos de combinación com-
puestos por células en un andamiaje requieran ser transportados a temperaturas superiores a las temperaturas de refrigeración
(es decir, temperatura ambiente) para evitar que las células se desprendan del andamiaje. Debido a que el producto preparado
recientemente (fresco) es metabólicamente activo, el envase para transporte debe estar diseñado y validado para mantener la
actividad metabólica del producto, además de cumplir con las pruebas de validación estándar de transporte. El metabolismo
puede lentificarse disminuyendo la temperatura de transporte, pero esto requiere de un control de temperatura confiable du-
rante el transporte. Debido a que los envases para transporte dependen en cierta medida de la temperatura exterior, estos
deben ser validados para mantener un estricto control de la temperatura en cualquier condición climática.
PruebasAdicionalesde Liberaciónde ProductosCelularesManipulados en el Sitio Clínico
Los productos de terapia celular que se someten a etapas de preparación o a manipulaciones en los sitios clínicos deben
someterse a controles o pruebas apropiadas que garanticen el cumplimiento de todas las especificaciones de calidad antes de
la liberación para su administración en pacientes. La naturaleza y el grado de las manipulaciones determina la necesidad de
aplicar requisitos de liberación o especificaciones críticas adicionales a las requeridas inmediatamente después de la fabricación
inicial.
Por lo general, las pruebas previas a la liberación incluyen lo siguiente:
• Inspección física del producto, incluyendo apariencia del producto (color, turbidez, partículas o materia extraña), integri-
dad del envase, temperatura y exactitud y conveniencia del etiquetado
• Revisión de los registros de proceso y/o certificado de análisis
• Para productos específicos del paciente, verificación del etiquetado del producto y de los registros relacionados con la
identidad del receptor
Los productos de alto riesgo (definidos en el capítulo (797)) deben someterse a pruebas adicionales. Para todos los produc-
tos de alto riesgo, se debe evaluar la necesidad de valoraciones de calidad adicionales de identidad, potencia y pureza de los
ingredientes activos y llevarlas a cabo cuando sea apropiado. Para productos de alto riesgo en la Categoría 11,llevar a cabo
pruebas de esterilidad y de endotoxinas.
Administración a Pacientes
Es posible que, dependiendo de la aplicación específica de la terapia celular o tisular, el personal para el cuidado del paciente
requiera llevar a cabo algunas etapas para preparar al paciente. Estas etapas ayudan a asegurar que el producto emitirá los
resultados terapéuticos esperados y ayudan a minimizar el riesgo de efectos adversos.
La determinación de la aptitud del paciente para la terapia, incluyendo la evaluación de histocompatibilidad, por lo general
ocurre antes de la preparación del producto. El estado clínico de un paciente puede cambiar después de la recolección de teji-
dos (debido a fiebre, infección, recurrencia o diseminación de tumores, o mal funcionamiento de órganos), por lo que se de-
ben revisar la condición general del paciente y su aptitud para la terapia antes de la administración del producto. Esta evalua-
ción puede incluir la historia clínica del paciente, una exploración física y estudios de laboratorio tales como hemogramas y
análisis químicos. Asimismo, se pueden llevar a cabo mediciones funcionales y físicas basales, análisis de laboratorio o estudios
de diagnóstico por imágenes pertinentes.
Puede ser necesario preparar al paciente antes del tratamiento, dependiendo de la ruta de administración. Para terapias ce-
lulares que requieren de administración intravenosa, puede ser necesario colocar un catéter venoso central a pacientes con cir-
culación periférica deficiente. Cuando se implantan en el paciente células o tejidos combinados con materiales estructurales, es
necesaria la preparación del sitio, para lo cual puede ser necesario establecer un acceso quirúrgico al sitio, eliminando tejido
degenerado o dañado, cortando el tejido adyacente para acomodar el implante y eliminando el tejido de un sitio secundario
para sujetar o sostener el implante. Por ejemplo, si se implantan productos celulares para la cicatrización de heridas, el sitio
para el injerto debe estar libre de infecciones y el lecho de la herida debe estar bien preparado. Para células de reparación de
defectos en cartílagos, es necesario preparar el sitio dañado. Antes de realizar la administración terapéutica en un sistema de
órganos (p. ej., el sistema broncoalveolar) o en una red vascular (p. ej., las arterias coronarias), puede ser necesario generar un
acceso en el paciente para el catéter mediante cirugía, endoscopía o dirigido por radiografías.
Para todos los casos, se debe evaluar cuidadosamente la necesidad la anestesia y medicación previa adecuadas. Por ejemplo,
cuando el DMSO se va a conservar en un producto celular crioconservado descongelado, puede ser necesario administrar un
antihistamínico al paciente antes de la administración. El examen previo a la administración también debe evaluar los trata-
mientos concomitantes que puedan interactuar con el producto de terapia celular o tisular y modificar sus efectos. Algunos
tratamientos pueden ser auxiliares de la terapia celular o tisular, tales como las citoquinas que promueven la proliferación o la
diferenciación del tejido infundido o implantado. Se deben evaluar los posibles efectos de otros fármacos usados comúnmente,
tales como antibióticos, antineoplásicos, anticoagulantes y agentes antiinflamatorios.
ADMINISTRACIÓN
DE TERAPIAS
CELULARES
A PACIENTES
Algunos productos de terapia celular o tisular son específicos del paciente debido a que se fabrican a partir de células, tejidos
o fuentes de tejido autólogos o alogénicos. Ciertos productos específicos del paciente tienen un potencial definido para el be-
neficio o daño por inmunorreactividad. Se deben establecer sistemas para impedir la administración de un producto de este
tipo al paciente equivocado. los sistemas recomendados incluyen procedimientos similares a aquellos usados en la administra-
ción de hemoderivados humanos por lo que al menos dos personas deben verificar la identidad del paciente y del producto
específico del paciente inmediatemente antes de la administración.
los productos de terapia celular y tisular se pueden administrar a través de una variedad de rutas que incluyen las rutas pa-
renterales comunes (intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraarterial) y el tracto respiratorio o gastrointestinal. Otras posi-
bilidades son su aplicación directa en la vasculatura regional, órganos, tejidos o cavidades corporales mediante agujas o catéte-
res o bien después de la exposición quirúrgica del tejido. Aunque la administración parenteral se puede llevar a cabo en insta-
laciones habituales para pacientes ambulatorios o internados, las otras vías pueden exigir lugares especializados, como una sala
de operaciones o sala de endoscopia asépticas. Con frecuencia se emplea una variedad de sistemas de administración tales
como catéteres, jeringas y líneas IV para administrar las células a los pacientes. Antes del uso clínico, los fabricantes deben ase-
gurarse que los componentes de estos dispositivos médicos sean compatibles con las células y con las soluciones de la formula-
ción. En todos los casos, deben existir procedimientos operativos estándar y un programa de calidad para garantizar que el
producto se administre de la manera prevista.
MONITOREOPOSTERIORA LAADMINISTRACIÓN
Se debe contar con políticas y procedimientos escritos para monitorear los resultados del paciente, así como para informar y
gestionar los eventos adversos. Los exámenes de evolución del paciente deben incluir indicadores capaces de detectar errores
o problemas relacionados con todo el proceso de fabricación, y se debe poner especial atención a las manipulaciones, al alma-
cenamiento o al transporte después de la fabricación. La gestión de las reacciones adversas debe incorporar procedimientos
para asegurar el examen médico rápido y el tratamiento de pacientes, además de un sistema para informar y evaluar los efec-
tos adversos que puedan identificar posibles defectos en el producto. Los informes incluirán información requerida por los pro-
gramas de monitoreo de eventos adversos federales o estatales.
ESTABILIDAD
ConsideracionesGenerales
La estabilidad de los productos celulares o tisulares y de los componentes usados para su fabricación variará dependiendo de
la naturaleza del producto, de su uso clínico previsto, de sus atributos específicos y de las condiciones de almacenamiento,
envasado y transporte. Por esta razón, generalmente no es posible generar pautas integrales que abarquen una amplia gama
de productos. De cualquier modo, el estudio de estabilidad siempre debe diseñarse basándose en principios científicamente
sólidos, así como en un conocimiento cabal del producto terapéutico final y su uso previsto. Los fabricantes también deben
evaluar la estabilidad de las etapas de retención durante el proceso, bancos de células, materias primas críticas y estándares de
referencia. Un programa de estabilidad bien diseñado y ejecutado ofrece un alto grado de garantía de que el producto será
estable durante su vida útil especificada.
Cuando sea factible, se deben llevar a cabo análisis de estabilidad, de conformidad con los principios descritos en las pautas
ICH QSC, presentadas en el capítulo Calidadde ProductosBiotecnológicos: Pruebasde Estabilidadde ProductosBiotecnológicos o
Biológicos(1049). Asimismo, se deben recolectar datos de estabilidad para materiales a granel y en proceso que se almacenan
antes del procesamiento y llenado final.
Dependiendo de la formulación usada y de las condiciones de almacenamiento, la vida útil puede variar de horas a años.
Para los casos en los que el producto tiene una vida útil corta o cuando se debe eliminar el estabilizador del producto, puede
ser necesario preparar la formulación final en el sitio clínico, justo antes de su administración. A menudo, la inestabilidad se
observa en forma de agregación en productos celulares y como falta de uniformidad estructural en productos tisulares. Se de-
be establecer la estabilidad del producto celular o tisular final mediante estudios de validación durante el desarrollo.
Para algunos productos celulares o tisulares, tales como productos celulares autólogos o específicos del paciente, los lotes
finales tienden a constar de volúmenes pequeños con una vida útil de apenas unas pocas horas o días. En dichos casos, los
protocolos de estabilidad deben basarse en materiales de donantes múltiples. En los estudios de estabilidad para validar el al-
macenamiento, transporte y fecha de caducidad, y debido a que a menudo resulta difícil obtener suficientes células o tejidos
de productos autólogos o específicos del paciente, se pueden usar células o tejidos de diversas fuentes tales como donantes
normales, repositorios tisulares para investigación, fuentes cadavéricas o células primarias de bancos bien caracterizados. No
obstante, los resultados obtenidos con tales células o tejidos "sustitutos" deben interpretarse con cuidado y de manera conser-
vadora hasta que los datos confirmen que las células autólogas o específicas del paciente en cuestión presentan perfiles de
estabilidad similares a los de las células o tejidos sustitutos.
Para productos de combinación que incluyen células y biomateriales, se debe considerar la estabilidad de ambos componen-
tes. Cuando se encuentran presentes materiales de andamiaje biodegradables, se debe tomar en cuenta la degradación del
andamiaje para determinar la estabilidad y la vida útil del producto de combinación.
Desarrollodel Protocolode Estabilidad
Los estudios formales de estabilidad para respaldar la obtención de la autorización y la recopilación de información de esta-
bilidad del producto en etapas tempranas deben detallarse en un plan por escrito que describa la forma en que se deben reco-
lectar y analizar los datos sobre la estabilidad para sustentar la fecha de caducidad. Los protocolos deben seguir el formato
recomendado en las pautas reglamentarias existentes y deben incluir el alcance, las condiciones de almacenamiento y el nú-
mero de lotes a analizar, el programa de análisis, los ensayos, el análisis de datos y las especificaciones del producto. Todo
ensayo empleado en un estudio de estabilidad formal para obtener la autorización debe ser validado antes de comenzar el
estudio. El diseño específico del estudio debe tomar en cuenta los desafíos razonablemente previstos que pueden surgir para el
producto. Por ejemplo, si la formulación del producto final se realiza en el sitio clínico, se deben realizar estudios de estabilidad
en esta formulación final para determinar el intervalo de tiempo y las condiciones de su conservación. Para células o tejidos
crioconservados, la estabilidad debe establecerse después de la crioconservación del producto final, de productos intermedios
del proceso o de cualquier etapa de retención.
Los estudios de estabilidad deben verificar que las condiciones de almacenamiento mantengan los atributos de calidad del
producto de manera que éste último cumpla con las especificaciones de estabilidad. Estas especificaciones pueden diferir de las
especificaciones de liberación, pero deben tratar la potencia del producto. Medir y calcular el deterioro de la actividad del pro-
ducto empleando metodologías estadísticas puede requerir de muestreos frecuentes durante un periodo prolongado, además
del análisis de múltiples lotes de producción para compensar la variabilidad de las valoraciones o productos.
Se deben llevar a cabo estudios iniciales para establecer una fecha de caducidad provisional antes de la administración al
primer paciente. Estos estudios también son útiles para determinar qué valoraciones son indicadoras de estabilidad, es decir,
los indicadores óptimos de degradación del producto. Debido a que los métodos farmacopeicos existentes no tratan las carac-
4
7502 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos / Información General USP42
terísticas únicas de todos los productos celulares y tisulares, los fabricantes deben desarrollar valoraciones que abarquen estas
características únicas.
Las validaciones de transporte representan un tipo especial de estudio de estabilidad con protocolos predeterminados, requi-
sitos de prueba y criterios de aceptación. Por lo regular, el producto se envasa y transporta en condiciones normales y extre-
mas, y el material se analiza antes y después del transporte para garantizar que aún cumple con los requisitos de liberación de
producto. Conforme a lo descrito en Almacenamientoy Transporte(a continuación), se debe poner especial atención a las con-
diciones específicas de estrés térmico, mecánico y radiológico que podrían afectar a los productos.
Condiciones de Desafío de la Estabilidad
El perfil indicador de la estabilidad de un producto celular o tisular puede variar con el tiempo por la influencia de una am-
plia variedad de condiciones ambientales, incluyendo temperatura, estrés mecánico y luz. En el desarrollo de un programa que
investigue los efectos de estos parámetros sobre la estabilidad de los productos, se deben considerar vías de degradación mul-
tifactoriales. Los estudios, basándose en la evaluación de riesgos, deben incluir condiciones que superen los intervalos de alma-
cenamiento especificados, es decir, condiciones de desafío como las encontradas durante períodos de almacenamiento, trans-
porte o manipulación anormales. Algunos ejemplos son el mal funcionamiento de incubadoras durante un breve periodo, fa-
llas de la incubadora o del almacenamiento en frío, períodos de fluctuaciones térmicas extremas ocasionadas por el transporte
hacia climas calurosos o fríos, condiciones hipobáricas en el sector de carga de una aerolínea comercial o temperaturas previsi-
bles en la sala de cirugía.
Una exposición breve a una condición ambiental muy alejada de un límite establecido y una exposición prolongada a un
ambiente que apenas exceda el límite establecido pueden ser igualmente dañinas. Si se aplican condiciones de almacenamien-
to diferentes, la velocidad lenta y constante de degradación del producto a una temperatura específica puede aumentar. Si
existe una justificación científica, se debe investigar el efecto de la luz sobre el perfil indicador de estabilidad. Se debe prestar
especial atención a los productos almacenados en fluidos que contienen componentes sensibles o que reaccionan con la luz
los cuales pueden dar origen a subproductos citotóxicos.
Los estudios análogos a los de envejecimiento acelerado habitualmente usados en programas de monitoreo de estabilidad
farmacéutica también son útiles para caracterizar la manera en que el producto se degrada y los ensayos que son indicadores
de la estabilidad. Por ejemplo, si un producto derivado de células se va a conservar en refrigeración (4º-6º) hasta su uso, en-
tonces los estudios realizados durante la etapa de retención del producto durante periodos prolongados a temperatura am-
biente (25º) pueden ofrecer información útil sobre la integridad del producto así como de los métodos analíticos usados. Estos
tipos de estudios deben llevarse a cabo antes de los estudios formales de estabilidad, de manera que los estudios formales in-
corporen en el protocolo los ensayos indicadores de estabilidad validados.
ALMACENAMIENTO
Y TRANSPORTE
Las condiciones de almacenamiento se seleccionan para preservar la pureza y la potencia a fin de que se mantengan las es-
pecificaciones del producto durante el almacenamiento, transporte y manipulaciones en el sitio clínico. Antes del uso en ensa-
yos clínicos, deben realizarse estudios iniciales para determinar si las condiciones de almacenamiento, transporte y manipula-
ción son aceptables. Se deben especificar las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad del producto. No es
necesario que las condiciones de almacenamiento y transporte sean las mismas que aquellas previstas para el producto comer-
cial, pero deben garantizar que se mantengan las especificaciones del producto más allá de la fecha de caducidad inicialmente
propuesta. Una vez que se hayan desarrollado los métodos indicadores de estabilidad y que se hayan seleccionado las condi-
ciones del cierre del envase final, almacenamiento y transporte, dichas condiciones deben ser valoradas, conforme a lo tratado
en la sección Estabilidad(anterior).
Para productos con vidas útiles cortas, se deben tomar en cuenta las condiciones de almacenamiento y transporte en con-
junto-incluso dentro de un solo sitio clínico- debido a que el transporte constituye la mayor parte del tiempo de almacena-
miento después de la fabricación. El producto debe ser colocado en un envase a prueba de fugas y resistente a la luz, con un
soporte físico adecuado, que garantice la estabilidad y la prevención de fugas durante las condiciones normales de transporte.
Se debe poner especial atención a la capacidad de los gases para penetrar el envase de transporte, especialmente si el produc-
to de terapia celular se almacena o transporta usando hielo seco o nitrógeno líquido.
Almacenamiento
Para cada tipo de producto de terapia celular, el fabricante debe establecer especificaciones de almacenamiento del produc-
to y condiciones de almacenamiento aceptables que incluyan el intervalo de temperatura o el nivel de nitrógeno líquido. Las
unidades de almacenamiento requieren de un sistema que monitoree y registre continuamente la temperatura y/o los niveles
de nitrógeno líquido. Esto incluye un sistema de alarma para notificar inmediatamente al personal del laboratorio sobre condi-
T
ciones de almacenamiento inaceptables. La estabilidad del producto durante el almacenamiento de rutina debe monitorearse
mediante un programa de estabilidad (ver la sección Estabilidadanterior).
La crioconservación es el principal modo de almacenamiento a largo plazo para células. Los productos celulares se criocon-
servan usando procedimientos de congelación a velocidad controlada o equivalentes que mantengan la viabilidad. Se debe
monitorear y documentar la temperatura de los productos durante la congelación y el almacenamiento de conformidad con
las políticas de la instalación. Asimismo, se debe valorar la estabilidad del producto en condiciones de retención tanto en la
instalación de fabricación como en el sitio clínico.
La velocidad de enfriamiento para soluciones celulares durante la crioconservación es importante debido a las lesiones mecá-
nicas y por deshidratación que resultan de la formación y crecimiento de cristales de hielo. Las temperaturas ideales dependen
del tipo de células y de la concentración del crioconservante. La velocidad de enfriamiento óptima para la mayoría de las célu-
las está entre 1º y 3° por minuto. Los congeladores con velocidad controlada que pueden duplicar de manera reproducible
esta velocidad de enfriamiento óptima son fundamentales cuando se congela un gran número de viales o grandes volúmenes
de células en bolsas. Una vez.enfriadas por debajo del punto de congelación, las células deben almacenarse a temperaturas por
debajo de -130°. Esto se puede conseguir mediante congeladores eléctricos o con nitrógeno líquido.
El almacenamiento de células en la fase de vapor de un congelador de nitrógeno líquido reduce el riesgo de contaminación
cruzada con otros materiales en el congelador. Se debe validar el equipo congelador y se debe mapear la temperatura de mo-
do que las células no estén sujetas a temperaturas por encima de -130º a medida que el nitrógeno líquido se evapora o duran-
te la apertura del congelador. Algunas células se pueden almacenar a -80º si se pretende usarlas dentro de unas pocas sema-
nas. Asimismo, es posible prevenir la contaminación cruzada usando envoltorios sellados para cubrir las criobolsas.
Una gran cantidad de productos derivados de células no pueden ser crioconservados. Debido a que las células mantienen su
metabolismo durante el almacenamiento, su período de caducidad es corto-en el orden de horas o días. La fecha de caduci-
dad se puede extender si se aumenta el volumen del medio de almacenamiento, si se ajusta la temperatura de almacenamien-
to o si se conecta una serie de bolsas o compartimientos que permitan cambiar el medio sin violar la esterilidad del sistema.
Además, se deben definir y monitorear las condiciones de almacenamiento en el sitio clínico. Aunque los centros de procesa-
miento de células o los centros médicos implicados en el transplante de médula ósea por lo general cuentan con congeladores
de nitrógeno líquido, la mayoría de las farmacias clínicas no cuentan con estos equipos. Las temperaturas y características de
almacenamiento deben definirse para cada producto. Es posible que el sitio clínico deba retener el producto en el envase para
transporte hasta que éste pueda administrarse al paciente. Cuando el descongelamiento y la administración del producto deri-
vado de células se llevan a cabo en el centro médico, el laboratorio que almacena o transporta las células debe colaborar estre-
chamente con el sitio clínico debido a que las células en una suspensión concentrada solo pueden sobrevivir durante unas po-
cas horas.
Transporte
Los envases para transporte y los procedimientos de transporte deben asegurar que las temperaturas se mantengan dentro
de los intervalos aceptables de duración del transporte y en condiciones de uso real. Estas condiciones incluyen temperaturas
dentro del envase para transporte, extremos de temperaturas en el exterior del envase para transporte (como las temperaturas
en la pista caliente de un aeropuerto o en el frío sector de carga de un avión) y demás desafíos de transporte (tales como rayos
x o vibración mecánica). Durante el desarrollo del producto, se deben realizar estudios de transporte para identificar las condi-
ciones adversas que podrían afectar a los productos. De manera subsiguiente, se deben seleccionar y validar los materiales de
refuerzo y aislamiento para armar un sistema de embalaje que proteja contra temperaturas extremas y condiciones mecánicas
adversas.
La mayoría de los productos se transportan mediante transportadores o sistemas de correo comerciales. En ocasiones, los
productos críticos son transportados a mano en aviones comerciales. Los transportistas comerciales deben obtener permisos
especiales para evitar las revisiones con equipo de rayos x en los aeropuertos. Se debe poner especial atención a las etiquetas
del envase para transporte ya que puede ser necesario mostrar información sobre riesgo biológico y específica del paciente en
áreas específicas del embalaje. Lasvalidaciones de transporte deben llevarse a cabo usando protocolos definidos con criterios
de aceptación predeterminados para asegurar que el producto cumpla con las especificaciones de calidad (incluyendo la po-
tencia) una vez.que alcance su destino final.
Los productos derivados de células crioconservados por lo regular se envían a sitios clínicos usando hielo seco o en transpor-
tadores secos de nitrógeno líquido. Se prefieren estos últimos, porque resulta más fácil mantener y monitorear la temperatura,
y permiten el monitoreo continuo de la temperatura del transportador, la cual puede ser recabada y registrada hasta 14 días. El
hielo seco y el nitrógeno líquido son materiales considerados peligrosos durante el transporte por lo que se deben etiquetar
adecuadamente.
ETIQUETADO
El etiquetado de productos de terapia celular está regulado por la FDAde conformidad con el Título 21 del CFR201, 601,
61O y 1271. En lo que respecta a productos bio16gicos, el Título 21 del CFR61O Subparte G describe los requisitos de etiqueta-
do de envase y embalaje. Siempre que sea posible, se debe adjuntar una etiqueta completa al envase del producto. Ésta inclu-
ye el nombre propio del producto obtenido del US Adopted Names (USAN)Council (Consejo de Nombres Adoptados en los
EE.UU.);el nombre, dirección y número de autorización del fabricante; el número de lote; la fecha de caducidad; para envases
multidosis, la dosis individual recomendada; la leyenda "Solamente Rx" para productos de venta bajo receta; instrucciones pa-
ra el dispensador para que proporcione, cuando se requiera, una Guía de Medicación a cada paciente; y si el envase no está
contenido en un empaque, todos los puntos requeridos para una etiqueta del empaque. Si la etiqueta es demasiado pequeña
para incluir toda esta información, se puede usar una etiqueta parcial, pero la siguiente información debe aparecer en dicha
etiqueta: el nombre expresado como nombre propio o nombre USAN;el número de lote y el nombre del fabricante; y para
envases multidosis, la dosis individual recomendada. Cuando se usan etiquetas parciales, el envase debe colocarse en un em-
paque que tenga una etiqueta que incluya todos los puntos requeridos para la etiqueta del empaque. Para los envases que no
pueden incluir ninguna etiqueta, el envase debe colocarse en un empaque que incluya toda la información requerida para una
etiqueta del empaque. Además, cuando la etiqueta se coloca en el envase, ésta no debe impedir la inspección del contenido.
Para productos con vidas útiles muy cortas, la fecha de caducidad debe ajustarse y corregirse a los husos horarios para propor-
cionar al usuario una evaluación exacta de la vida útil.
La etiqueta del empaque debe contener el nombre propio o USANdel producto, el nombre, dirección y número de autori-
zación del fabricante, el número de lote, la fecha de caducidad, el conservante usado y su concentración, o las palabras "Sin
conservante" si fuera apropiado, el número de envases, si contiene más de uno, la cantidad de producto en el envase, la tem-
peratura de almacenamiento recomendada, las palabras "Agitar Bien", "No Congelar'' u otras instrucciones según se indique,
la dosis individual recomendada para envases multidosis, la vía de administración, las sustancias sensibilizantes conocidas, el
tipo y la cantidad de antibióticos agregados durante la fabricación, los ingredientes inactivos si representan un factor para la
seguridad, el coadyuvante, el origen del producto cuando represente un factor para la administración segura, la potencia míni-
ma expresada en términos del estándar oficial de potencia o la declaración "No Existe un Estándar de Potencia de EE.UU."y,
finalmente, la declaración "Solamente Rx" para productos de venta bajo receta. Los reglamentos del Título 21 del CFR610.62
tratan la posición y prominencia del nombre propio o USANcon respecto a un nombre comercial.
Los requisitos adicionales de etiquetado son aplicables puesto que el Título 21 del CFR 1271.90 considera a los productos de
terapia celular como HCT/P. Para productos de terapia celular autólogos, el fabricante está exento de los requisitos para deter-
minar la elegibilidad del donante. No obstante, si no se realiza el análisis recomendado para contaminantes patógenos o mi-
crobianos antes de la liberación, la etiqueta debe contener la leyenda "SÓLO PARAUSO AUTÓLOGO"o "NO EVALUADO PARA
SUSTANCIAS INFECCIOSAS".La etiqueta debe contener la leyenda para Peligro Biológico (Biohazard) mostrada en el Título 21
del CFR 1271.3(h) con la leyenda "ADVERTENCIA: Explicar a los pacientes los riesgos de enfermedades transmisibles." Para
productos específicos del paciente, el nombre completo del paciente, sus iniciales o una combinación de los mismos debe apa-
recer en el etiquetado para garantizar que el producto se administre al paciente apropiado.
Asimismo, los reglamentos rigen el contenido y formato del etiquetado para productos farmacéuticos para prescripción en
humanos (incluyendo productos biológicos), también conocido como prospecto del empaque. Estos reglamentos, que aplican
a productos terapéuticos aprobados, entraron en vigor el 30 de junio de 2006. Los detalles sobre el contenido y el formato se
pueden encontrar en el Título 21 del CFR201.56 y 201.57. Estos cambios fueron diseñados para mejorar la capacidad de los
profesionales de la salud para acceder, leer y usar el etiquetado de medicamentos bajo receta. El principal cambio es la adición
de una sección de media página de información más relevante. La mayoría de los demás cambios implican la reorganización
de las secciones para trasladar al frente la información más crítica para la prescripción.
Además de los requisitos reglamentarios específicos de la FDA,diversos grupos han diseñado la ISBT128, una norma para
uniformar el etiquetado de productos de terapia celular, en la que ISBTson las siglas de la lntemational Society of Blood Trans-
fusion (Sociedad Internacional de Transfusión Sanguínea) y el 128 refleja la selección de la simbología de código de barras co-
nocida como Código 128. La ISBT128 define las estructuras de los datos y la colocación de códigos de barras y su texto co-
rrespondiente, legible a la vista, que aparece debajo del código de barras. Asimismo, la norma proporciona clasificaciones para
diferentes tipos de productos celulares, texto modificador para procesamiento de células, texto de manipulación para la forma
en que se fabrican las células, texto crioprotector para productos celulares congelados, así como otros textos diversos que de-
ben incluirse en las etiquetas. Aunque esta norma voluntaria cumple con los requisitos de diferentes organizaciones para el
etiquetado de productos celulares, actualmente no cumple con los requisitos reglamentarios de la FDA. Por consiguiente, las
etiquetas que cumplen con la ISBT128 deben complementarse con información adicional requerida por la FDA.
CONSIDERACIONES
PARA LA TRANSFERENCIA
DE TECNOLOGÍA
La transferencia de habilidades, conocimiento, tecnologías y métodos de fabricación necesarios para crear un producto deri-
vado de células o tejidos son esenciales para garantizar que los desarrollos científicos y tecnológicos sean accesibles a usuarios
que puedan desarrollarlos aún más y convertir la tecnología en nuevos productos, procesos, aplicaciones, materiales o servi-
cios. A continuación se resumen algunas consideraciones generales para las actividades de transferencia de tecnología.
El proceso para desarrollar un producto de terapia celular o tisular es complejo y a menudo implica varias rondas de transfe-
rencia de tecnología durante el ciclo de vida del producto. Algunos ejemplos de actividades de transferencia de tecnología
incluyen: desde la investigación de campo hasta la investigación traslacional; transferencia desde la investigación y el desarrollo
hasta la fabricación que cumpla con las BPF;y cambio en la instalación de fabricación (por ejemplo, de la fabricación interna al
fabricante contratista).
Los fabricantes deben anticipar la necesidad de transferir tecnología durante la etapa de investigación y desarrollo de un
proceso de terapia celular o tisular. Lo anterior debe resultar en buenas prácticas de documentación para investigación y desa-
rrollo del producto, incluyendo procedimientos de análisis. Los datos y resultados deben conservarse en forma de informes de
desarrollo o informes técnicos para proporcionar información histórica que pueda usarse como referencia y para solicitudes
reglamentarias. Asimismo, las materias, procedimientos y equipos críticos deben identificarse durante la transferencia de tec-
nología. El progreso de desarrollo del producto y del proceso debe monitorearse en función de hitos establecidos como parte
de la evaluación de riesgos y la identificación de brechas en el plan de transferencia de tecnología. La Tabla3 proporciona una
visión general de las etapas relacionadas con la transferencia de tecnología.
Tabla 3: Transferencia de Tecnoloqía-Etapas Fundamentales
• Definirel alcance, la estrategia y los riesgos asociados con el proyecto que será transferido
• Identificarbrechas generales y la capacidad de transferenciadel proceso
• Evaluarla disponibilidadde documentación tal como los procedimientosde fabricacióny análisis,pla-
nes de muestreo, datos y especificacionesdel producto en proceso y final, especificacionesde material
(incluyendoel origen, requisitosde análisisy cantidades requeridas para un procedimiento de fabricación
o de prueba), especificacionesde equipo, requisitosde capacitación especializados,requisitosde la insta-
!acióny requisitosde infraestructura
•Establecerun órgano de administraciónformado por líderes,expertos y mentores por parte del que
transfierey del que recibe la tecnología; determinar responsabilidadespara cada grupo e individuo
• Definircanales de comunicación e información
Preparación • Identificarmedicionesde desempeño, hitos y secuencias
• Establecerun plan de gestión de riesgos
• Establecerun plan maestro de transferenciade tecnología
• Desarrollarun plan de capacitación
• Establecerdocumentos en el centro receptor (especificaciones,SOP,registros de partidas y métodos de
prueba estándar)
• Operacionesde capacitación, calidad y apoyo del personal para la sostenibilidad
• Calificarmaterialesy proveedores
• Establecery ejecutar protocolos de comparabilidad/aptitud del equipo
• Calibrarel equipo en el centro receptor
• Calificaral personal, al equipo y las instalacionesen el centro receptor (incluyela ejecuciónde validado-
nes de procesamiento aséptico, llenado de medios estérilesy validacionesde limpieza)
• Establecery ejecutar calificacionesde métodos/valoraciones
• Establecerun programa de estabilidad de producto
• Realizarpruebas de ingenieríay uniformidad/calificación
Desarrolloe • Evaluarla necesidad de establecer la comparabilidady preparar solicitudesreglamentarias
Implementación • Establecery ejecutar calificacionesde transporte
• Recolectary establecer tendencias de datos de procesos/producto
• Monitorearla estabilidad del producto
• Gestionarel control de cambios
• Capacitary volvera calificaral personal
• Recalibrary volvera calificarel equipo
Mantenimiento • Actualizarlas solicitudesreglamentarias
El objetivo final de la transferencia de tecnología se centra en que el receptor reproduzca un proceso de manera uniforme
para producir productos comparables que cumplan con los reglamentos. Es común que los fabricantes desarrollen e imple-
menten mejoras en el proceso durante las etapas tempranas de transferencia de tecnología para respaldar la ampliación y la
fabricación para los ensayos clínicos de las Fases 1/11.Sin embargo, durante la transferencia de tecnología para estudios de la
Fase 111,ensayos claves o fabricación comercial, se deben evitar cambios en el proceso o productos debido a que pueden re-
querir de estudios clínicos adicionales y afectar negativamente el tiempo hasta su comercialización.
REGLAMENTACIONES
Y ESTÁNDARES
La Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos o Ley FD&C) y la Public
Health Service Act (Ley de Servicios de Salud Pública o Ley PHS) ofrecen el marco legal para la reglamentación de la FDApara
productos biológicos, incluyendo productos de terapia celular. La Tabla4 presenta una lista de términos de uso frecuente en la
reglamentación de productos de terapia celular. En 1993, la FDAnotificó que tenía la intención de reglamentar los productos
de terapia celular y génica como productos biológicos (Registro Federal l 993;58:53248-53251 ). La FDAdefinió productos de
terapia celular somáticos como células autólogas (es decir, obtenidas del mismo sujeto), alogénicas (es decir, intraespecies) o
xenogénicas (es decir, interespecies) que han sido propagadas, expandidas, seleccionadas, tratadas farmacológicamente o alte-
radas de otro modo ex vivo para su administración en humanos para la prevención, tratamiento, cura, diagnóstico o mitiga-
ción de enfermedades o lesiones. Para otros productos y medicamentos biológicos, se deben realizar ensayos clínicos que im-
pliquen productos de terapia celular somáticos con base en una solicitud para nuevo fármaco en investigación (IND). Después
de que el patrocinador presente evidencia suficiente sobre la seguridad del producto y de la eficacia clínica, se puede obtener
la aprobación de la FDApara la comercialización a través de una solicitud de autorización para Productos biológicos (BLA)o
PMA.
Conforme a lo definido por la FDA,los productos de terapia celular se consideran medicamentos y productos biológicos,
pero también HCT/P reglamentados con base en la Sección 351 y/o Sección 361 de la Ley PHS. Esto significa que los produc-
tos de terapia celular están sujetos a las BPFv(Título 21 del CFR21 O y 211 ), a los reglamentos para Productos Biológicos (Títu-
lo 21 del CFR61 O) y a los reglamentos para productos elaborados con células o tejidos humanos (Título 21 del CFR1271)
incluyendo las Buenas Prácticas para Tejidos vigentes.
En años recientes, la FDAha emitido diversas reglamentaciones y documentos guía para productos celulares y tisulares hu-
manos (HCT/P) (ver el Apéndicey www.fda.gov/cber/). Las reglamentaciones del Título 21 del CFR 1271 son de particular im-
portancia pues establecen un enfoque gradual basado en el riesgo de productos elaborados con células o tejidos humanos
(HCT/P). Dentro de este marco reglamentario, una gran cantidad de células o tejidos humanos convencionales no están suje-
tos a la aprobación previa a la comercialización y únicamente tienen que cumplir con las Buenas Prácticas para Tejidos vigen-
tes, incluyendo los requisitos de elegibilidad del donante. Este nivel más bajo de supervisión reglamentaria tiene como propósi-
to prevenir la introducción, transmisión o diseminación de enfermedades transmisibles. Cuando las células o tejidos humanos
son el material de partida para la creación de un producto derivado de células novedoso, se aplican requisitos reglamentarios
adicionales. Este nivel más alto de supervisión reglamentaria incluye el cumplimiento con las BPFv,las normas para productos
biológicos y la aprobación previa a la comercialización (ver el Título 21 del CFR 1271.1 O). Para casi todas las instancias, los
productos derivados de células descritos en este capítulo general deben cumplir con el nivel más alto de supervisión reglamen-
taria.
Además de las reglamentaciones y pautas específicas de terapia celular, resultan importantes y aplicables una gran cantidad
de pautas tales como aquellas relacionadas con el procesamiento aséptico, las expectativas de las BPFdurante el desarrollo y la
validación del proceso, entre otras (ver www.fda.gov). Asimismo, la ICH ha emitido documentos guía para la calificación de
productos derivados de células y tejidos (ver el Apéndice y www.ich.org). Algunas de las pautas y conceptos en estos documen-
tos se reproducen en los compendios USP-NF.
La vía reglamentaria para productos de terapia celular es paralela a la de los productos farmacéuticos y, a medida que el
producto se traslada de la investigación temprana a los ensayos clínicos claves y finalmente hasta su aprobación para comercia-
lización, el grado de control de fabricación aumenta en rigurosidad. Lo anterior tiene implicaciones para la unidad de fabrica-
ción y puede requerir que el sitio sea trasladado. Las organizaciones para el establecimiento de normas fomentan el uso de una
unidad de calidad plenamente funcional para supervisar el progreso de la fabricación. La información se encuentra disponible
en el sitio Web de la FDA,junto con referencias a los grupos a cargo de guiar a la comunidad médica y a la unidad de fabrica-
ción durante el desarrollo.
Además de los capítulos generales y monografías de USP para productos de terapia celular y tisular, diversas organizaciones
profesionales para el establecimiento de normas (ver la Tabla5 y el Apéndice)han trabajado estrechamente con las autoridades
reglamentarias para desarrollar normas y prácticas. Estas organizaciones garantizan que las normas se mantengan actualizadas
y que cumplan con las reglamentaciones gubernamentales. Estas normas representan una fuente complementaria de conoci-
miento en relación con la identificación de donantes, la selección y el análisis de donantes, las recolecciones de productos, el
procesamiento de productos celulares, la administración, el informe de eventos adversos y el seguimiento posterior al trata-
miento. El AATBha elaborado pautas para obtener tejido alogénico. Con el paso de los años, diversas organizaciones han in-
tentado armonizar normas, así como el desarrollo de circulares comunes que puedan compararse con los prospectos del em-
paque. Sin embargo, en la actualidad, cumplir con las normas de una organización no garantiza el cumplimiento con las nor-
mas de otras organizaciones.
Los programas de normas voluntarias generan una gran cantidad de beneficios para las instalaciones de fabricación que par-
ticipan de estos programas. Las organizaciones profesionales para el establecimiento de normas participan en talleres educati-
vos y diseminan información sobre asuntos operativos. Asimismo, mantienen una vigilancia estrecha sobre las actividades de la
FDAy la capacitación de inspectores. Además, la FDAconfía en la acreditación mediante el programa de normas voluntarias;
asimismo, las inspecciones no anunciadas de la FDAhan llevado al aumento en el nivel de cumplimiento por parte de las insta-
laciones de laboratorio y clínicas, lo que sin lugar a dudas ha incrementado la seguridad del paciente. Los terceros responsa-
bles de los pagos y los servicios de clasificación de hospitales han comenzado a usar informes de acreditación en su evaluación
de programas de calidad.
Tabla 4. Términos de Uso Frecuente en la Reqlamentaclón de Productos d e Terapia Ce11
u ar
TÉRMINO DEFINICIÓN
351 productos Reguladoscon base en la Sección 351 de la LeyPHS
Reguladoscon base en el 11tulo21 del CFR1271, Células,Tejidosy Productos Derivados
361 productos de Célulasy TejidosHumanos
BLA Solicitudde Autorizaciónpara Productos Biológicos
CBER Centro para la Evaluacióne Investigaciónde Productos Biolóqicos
CDRH Centro para Dispositivosy Salud Radiológica
BPF BuenasPrácticasde Fabricación
BuenasPrácticaspara Tejidos,11tulo221 del CFR1271, Células,Tejidosy Productos Derivados
GTP de Célulasy TejidosHumanos
Exenciónde Investigaciónde Dispositivos.
Una exención de investigaciónde dispositivos(IDE,por sus siglasen inglés) permite el uso del dispositi-
vo bajo investigaciónen un estudio clínicoa fin de recolectar datos de seguridad y eficaciarequeridos
para respaldar la solicitudde AprobaciónPreviaa la Comercialización(PA)o la entrega de una Notifica-
IDE ción Previaa la Comercialización[51O(k))a la FDA.
Tabla 4. Términos de Uso Frecuente en a Req1amentacl ó n de Productos d e Terapia Celular (Continuación)

TÉRMINO DERNICIÓN
Nuevo Fármacoen Investigación(IND,por sus siglasen inglés).
Un INDes una solicitudde autorizaciónpresentada ante la FDApara administrarun medicamento en
investigacióna humanos. Lasreglamentacionespara INDse pueden encontrar en el Título 21 del CFR
IND 312.
PMA AprobaciónPreviaa la Comercialización
a bl a 5. Organ zac ones para e1 Esta bl ecm

11 1 1ento d e Normas para Prod uctos d e 11erap1a Ce1u la r
LaAABB,anteriormente conocida como la AmericanAssociationof BloodBanks(Aso-
ciación Estadounidensede Bancosde Sangre), es una asociacióninternacionalque re-
presenta a individuose institucionesimplicadasen actividadesrelacionadascon la
AABB transfusióny las terapias celulares,incluyendomedicamentos de transplante. http://www.aabb.org/
LaAmericanAssociationof TissueBanks(AsociaciónEstadounidensede Bancosde Teji-
dos) es una organizacióneducativa y científica,exenta de impuestos, que facilitael
abastecimiento de tejidos transplantables de alta calidad para satisfacerlas necesida-
des de la nación. LaAATBpublica normas para asegurar que las actividadesde los
bancos de tejidos cumplan con las normas aceptables de desempeño técnico y ético.
LaAATBllevaa cabo un programa de acreditación para establecimientosque recolec-
tan, procesan, almacenan o distribuyentejido humano para transplante. Elpersonal
del banco de tejidos se somete a un programa de certificaciónpara asegurar que las
actividadesde bancos de tejidos se llevena cabo de manera profesional,cumpliendo
AATB constantemente con las normas de la asociación. http://www.aatb.orq/
LaASTMlnternational(ASTM),conocida originalmentecomo la AmericanSocietyfor
Testingand Materials(AsociaciónEstadounidensepara Análsisy Materiales),es una
de las organizacionesvoluntariaspara el desarrollode estándares más grandes del
mundo y proporciona normas técnicas para materiales,productos, sistemasy servi-
cios. Lasnormas de la ASTMlnternational se usan en la infraestructurade informa-
ASTM ción que guía el diseño, la fabricacióny la comercializaciónen la economía qlobal. http://www.astm.orq/
La Foundationfor the Accreditationof CellularTherapy (Fundaciónpara la Acredita-
ción de TerapiasCelulares)es una organizaciónsin fines de lucro fundada conjunta-
mente por la lnternational Societyfor CellularTherapy (Sociedad Internacionalpara
TerapiasCelulareso ISCT)y la AmericanSocietyof Bloodand MarrowTransplantation
(Sociedad Estadounidensede TransplanteDe Médulay Sanguíneo o ASBMT)para la
FACT inspeccióny acreditación voluntariaen el campo de la terapia celular. http://www.factwebsite.orq/
ElNational MarrowDonor Program (Programa Nacionalde Donantes de Médula) es
una organizaciónsin fines de lucro que opera el registro de donantes de células he-
matopoyéticasy de unidades sanguíneas de cordón umbilical,auspiciado por el go-
NMDP bierno federal, en los EstadosUnidos. http://www.nmdp.orq/
EllnternationalCouncilfor Commonalityin Blood BankingAutomation(Consejo lnter-
nacional sobre AspectosComunes de Automatizaciónde Bancosde Sangre) se esta-
bleció con el objetivo de implementar y gestionar la norma ISBT128, un sistema de
identificación,etiquetado y procesamiento de sangre, tejido y productos de terapia
ICCBBA celular humanos que emplean un sistema internacionalmentenormalizado. http://www.iccbba.org/
GLOSARIO
Aféresis: Procedimiento de extracción de sangre de un donante, retirando componentes seleccionados (p. ej., plaquetas o
leucocitos) y retransfusión del remanente al donante.
Agente Adventicio: Agente extraño que se introduce inadvertidamente; no es natural ni hereditario (como en la contamina-
ción microbiana, química o bioquímica de una sustancia purificada).
Alogénico: De un integrante no emparentado de la misma especie pero con un genotipo diferente.
Anticuerpos Monoclonales: Anticuerpos derivados de un único don celular.
Antígenos de Leucocitos Humanos (HLA,por sus siglas en inglés): Proteínas controladas por el complejo principal de his-
tocompatibilidad. Estas proteínas tienen un papel preponderante en la determinación de la compatibilidad para trasplantes.
Autólogo: Que se obtiene del organismo propio.
Bioensayo: Medición de la efectividad de un compuesto por su efecto en animales o células en comparación con una prepa-
ración estándar. 0f er también Potencia.)
Biotecnología: Toda técnica que utilice organismos vivos (o partes de estos) para producir o modificar productos, mejorar
plantas o animales o desarrollar microorganismos para usos específicos. La definición más nueva se refiere al uso industrial y
farmacéutico del ADN recombinante, fusión celular, nuevas técnicas de bioprocesamiento y terapia génica.
BPFv: Abreviatura para Buenas Prácticas de Fabricación vigentes.
CD34: Marcador 34 de superficie celular del grupo de diferenciación. El CD34 es una proteína que distingue a las células
madre y progenitoras de células sanguíneas más maduras.
Célula Dendrítica: Célula que sensibiliza las células Ta los antígenos.
Célula Madre: Célula inmortal capaz de proliferar y diferenciarse en distintos tipos de células especializadas. Se supone que
cada sistema de tejidos importante tiene su propia célula madre.
Célula Progenitora: Célula madre o ancestral generalmente ya comprometida a diferenciarse en un tipo o linaje celular es-
pecífico.
CélulasAlimentadoras: Células usadas en cocultivo para mantener células madre pluripotentes. Para hESC, las capas alimen-
tadoras típicas incluyen fibroblastos embrionarios de ratón o humanos tratados para evitar su división.
CélulasAsesinasNaturales (Células NK): Linfocitos citotóxicos que constituyen un componente principal del sistema inmu-
ne innato.
Célulasde la Médula Ósea: Una variedad de células indiferenciadas (células madre) y diferenciadas (linfocitos, granulocitos,
eritrocitos y plaquetas) que se encuentran en las cavidades internas de los huesos o la médula ósea.
Célulasde los Islotes: Células de los islotes /J del páncreas que secretan insulina.
CélulasEndoteliales: Células epiteliales de origen mesodérmico que recubren las cavidades internas del cuerpo como el co-
razón y los vasos sanguíneos y linfáticos.
CélulasEpiteliales: Células del revestimiento de distintos órganos. Ejemplos: células epiteliales respiratorias, intestinales o
vasculares.
CélulasMadre de Sangre del Cordón Umbilical: Células madre obtenidas de la sangre que se conserva en la placenta y en
el cordón umbilical que se mantienen unidos después del alumbramiento.
Célula Madre Embrionaria Humana (hESC,por sussiglasen inglés): Célula madre derivada de la masa celular interna del
blastocisto.
CélulasMadre Hematopoyéticas: Células madre que dan origen a todos los leucocitos, eritrocitos y plaquetas.
CélulasMadre Mesenquimales: Células madre multipotentes que pueden diferenciarse en una variedad de tipos de células.
CélulasMadre Neuronales: Células madre encontradas en el tejido neuronal que pueden dar origen a neuronas y células
gliales.
CélulasNo Diferenciadas: Células que no se han desarrollado en un tipo de célula o tejido especializado.
CélulasOsteogénicas: Provenientes del hueso o que participan en el crecimiento o reparación ósea.
CélulasSomáticas: Células que no son células germinales.
CélulasT: Linfocitos que adquieren su repertorio de funciones y su capacidad de discriminación autóloga en el timo, y son
responsables de la inmunidad mediada por células. Hay varios subgrupos de células T (células T colaboradoras, células T supre-
soras y células T citotóxicas).
Citoquina: Todo factor que actúa sobre las células; por lo general, una proteína que favorece el crecimiento.
Citoplasma: Material celular contenido entre la membrana celular y el núcleo.
Citotóxico: Capaz de causar la muerte celular.
Clasificadorde CélulasActivado por Fluorescencia(FACS,por sussiglasen inglés): Equipo que clasifica células basándo-
se en marcadores fluorescentes unidos a las células.
Clonal: Genes, células u organismos enteros derivados de y genéticamente idénticos a un único gen, célula u organismo an-
cestral común.
Colorante Supravital: Colorante que tiñe células vivas solamente.
Condrocitos: Células que producen los componentes del cartílago.
Cultivo en Suspensión: Células capaces de crecer en suspensión sin la necesidad de adherirse a un sustrato (soporte) para
generar la división celular.
Diferenciación: Proceso de cambios bioquímicos y estructurales mediante el cual las células adquieren forma y función espe-
cializadas.
ELISA: Enzimoinmunoensayo. lnmunoensayo que utiliza un antígeno o anticuerpo marcado con una enzima para detectar la
unión de una molécula a una matriz sólida.
Enfermedad del Injerto Contra el Anfitrión: Rechazo del tejido transplantado por parte del anfitrión. Es la causa principal
de muerte del paciente cuando se utiliza un tejido alogénico mal compatibilizado con el receptor.
EnsayoClonogénico: Procedimiento basado en la capacidad de producir un don de células.
Epidérmico: Perteneciente a la capa más externa y avascular de la piel, derivada del ectoderma embrionario.
Ex Vivo: Procedimiento que se lleva a cabo fuera de un organismo vivo. Se refiere al procedimiento médico en el que un
órgano, células o tejido se toman de un cuerpo vivo para un tratamiento o procedimiento y posteriormente se devuelven al
cuerpo vivo.
Exento de suero: Se refiere al medio de crecimiento celular que carece de componentes séricos.
Factor Estimulantede Coloniasde Granulocitosy Macrófagos (GM CSF,por sussiglasen inglés): Hormona natural que
estimula la producción de leucocitos, especialmente granulocitos y monocitos.
Factoresde Crecimiento: Factores responsables de regular la proliferación, función y diferenciación celular.
Fibroblastos: Células de tejido conectivo capaces de producir colágeno.
Formulado: Preparado de acuerdo con condiciones o métodos prescritos.
Granulocito: Uno de los tres tipos de leucocitos. Estas células digieren bacterias y otros parásitos.
Hemacitómetro: Dispositivo usado para el recuento manual de células.
Hematopoyético: Perteneciente o con influencia sobre la formación de células sanguíneas.
Hepatocitos: Células predominantes del hígado, que cumplen una función importante en el metabolismo y son productoras
de proteínas séricas. Por lo general, estas células no están en división pero si se dañan, se pueden dividir y regenerar hasta
reponer las células dañadas.
In Vivo: Procedimiento que se lleva a cabo dentro de un organismo vivo.
In Vitro: En el laboratorio (fuera del organismo). Lo contrario de in vivo (en el organismo).
Injerto: Proceso mediante el cual se implantan o trasplantan células, tejidos u órganos en otro organismo. Se refiere tanto a
los procesos mecánicos como biológicos necesarios para obtener un injerto plenamente funcional.
lnmunoensayo: Técnica para identificar sustancias basándose en el uso de anticuerpos.
lnmunofluorescencia: Técnica que combina una estrategia de detección con anticuerpos con un marcador fluorescente para
visualización que por lo general se usa en combinación con microscopía o con clasificación de células activada por fluorescen-
cia.
lnmunogénico: Sustancia capaz de inducir una respuesta inmunitaria; una forma de antígeno que induce una respuesta in-
munitaria, contrario a un tolerógeno, que induce tolerancia.
Linaje (Células Progenitoras Comprometidas, Células Diferenciadas): Vía específica de diferenciación celular que se pue-
de rastrear hasta una célula única de origen.
Líneas Celulares: Células que derivan de cultivos primarios de embriones, tejido u órganos. Estas líneas celulares pueden te-
ner una vida finita o pueden inmortalizarse (modificadas para replicarlas indefinidamente).
Linfocitos B (Células 8): Una clase de linfocitos provenientes de la médula ósea que producen anticuerpos.
Macrófago: Cualquiera de las diversas formas de fagocitos mononucleares que se encuentran en los tejidos y que surgen de
las células madre hematopoyéticas en la médula ósea.
Materiales auxiliares: Componentes usados durante la fabricación que no deben estar presentes en el producto final. Ejem-
plos: factores de crecimiento, citoquinas, anticuerpos monoclonales, dispositivos de separación de células y componentes de
medios.
Medicina Regenerativa: Campo interdisciplinario de investigación y aplicaciones clínicas emergente que se centra en la re-
paración, reemplazo o regeneración de células, tejidos u órganos para restaurar funciones deficientes usando una combinación
de métodologías que incluyen, de manera enunciativa mas no limitativa, el uso de moléculas solubles, terapia génica, trans-
plante de células madre, ingeniería tisular y reprogramación de tipos de células y tejidos.
Medio de Cultivo: Líquido que cubre las células en un vaso de cultivo y que contiene ingredientes para nutrir y sustentar las
células. El medio de cultivo también puede incluir factores de crecimiento que se agregan para producir cambios deseados en
las células.
Miocitos: Células fundamentales del tejido muscular. Células blanco para la inserción de genes que codifican proteínas secre-
toras.
Pasaje: Proceso en el que las células son desasociadas, lavadas y sembradas en nuevos cultivos después de una ronda de cre-
cimiento y proliferación celular. El número de pasajes es una buena indicación de la edad de los cultivos y de la estabilidad
esperada.
Potencia: Medición cuantitativa de la actividad biológica basada en el atributo del producto vinculado a las propiedades bio-
lógicas relevantes.
Producto Biológico: Cualquier virus, suero terapéutico, toxina, antitoxina o producto análogo aplicable a la prevención, tra-
tamiento o cura de enfermedades o lesiones en humanos. (El término producto análogo indica que incluye esencialmente pro-
ductos obtenidos por biotecnología y procedimientos que incluyen terapia génica, productos transgénicos y terapia celular so-
mática.)
Productos de Combinación: Productos terapéuticos que combinan fármacos, dispositivos y/o productos biológicos.
Queratinocitos: Células epidérmicas diferenciadas que constituyen la capa superior de las células de la piel.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés)-Técnica para amplificar una secuencia específica de
nucleótidos de ADN o ARN mediante ciclos de copiado que utilizan polimerasa, dando como resultado incrementos geométri-
cos en el número de copias.
Terapia Celular: Terapia que utiliza células completas para tratar una enfermedad, afección o lesión.
Transplante de Médula Ósea: Transplante de células de la médula ósea capaces de mantener las funciones hematológicas
indefinidamente. Técnica empleada en el tratamiento de trastornos inmunitarios (deficiencias inmunitarias combinadas graves,
tales como la deficiencia de ADA),trastornos hematológicos (anemia), metabólicos (enfermedad de Gaucher) y enfermedades
malignas (leucemia, linfoma o tumor sólido).
Validación del Proceso: Método para suministrar documentación probatoria de que el proceso de fabricación está controla-
do, es reproducible y capaz de generar uniformemente un producto que cumple con especificaciones predeterminadas.
Xenogénico: De una especie diferente.
Xenotransplante: Transplante de órganos de una especie a otra (por ejemplo, de cerdos a seres humanos).
751 O (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ InformaciónGeneral USP42
APÉNDICE
Lista de Referencias Reglamentarias Pertinentes
Las terapias celulares y los componentes de las terapias celulares están reglamentados por la FDAcomo productos biológi-
cos. Los requisitos generales se listan en la legislación nacional y en las guías internacionales. En los Estados Unidos, los requisi-
tos nacionales se codifican en diferentes secciones del Título 21 del CFR, mientras que los documentos guía de la FDA propor-
cionan recomendaciones adicionales. Los documentos guía internacionales se encuentran disponibles en la ICH, en la Euro-
pean Agency of Medicines (Agencia Europea de Medicamentos o EMA)y en la Organización Mundial de la Salud (OMS). Aun-
que el presente capítulo general hace una buena referencia a los documentos guía de la ICH, no ocurre lo mismo con los do-
cumentos de la OMS y de la EMEA,por lo que se recomienda a los fabricantes de productos derivados de células y tejidos
destinados a mercados fuera de los Estados Unidos referirse a las pautas pertinentes de las naciones correspondientes. De ma-
nera complementaria a los capítulos de USP referidos en este capítulo, la siguiente lista incluye documentos reglamentarios y
las mejores prácticas de desarrollo de productos y procesos, fabricación, control de calidad y garantía de calidad:
Código de Reglamentos Federales (CFR)
• Título 21 del CFR201.56-57
• Título 21 del 21 O
• Título 21 del CFR211
• Título 21 del CFR61 O
• Título 21 del CFR46
Documentos Guía de la FDA
• Draft Guidancefor FDAReviewersand Sponsors:Content and Reviewof Chemistry,Manufacturing, and Control (CMC) lnforma-
tion for Human SomaticCe//TherapylnvestigationalNew Drug Applications(INDs)
• Draft Guidancefor lndustry: PotencyTestsfor Cellularand GeneTherapyProducts
• Draft Guidancefor Jndustry:Current Good TissuePraetice(cGTP)and Additional Requirementsfor Manufacturersof Human
Ce/Is,7issues,and Cellularand Tissue-Based Products(HCT/Ps)
• Guidancefor lndustry: EligibilityDetermination for Donorsof Human Ce/Is,Tissues,and Cellularand Tissue-BasedProducts
(HCT/Ps),February 2007. http://www.fda.gov
• Guidancefor lndustry: SourceAnimal, Product,Prec/inical,and Clínica/lssuesConcerningthe Useof XenotransplantationPro-
ductsin Humans,April 2003. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnforrnation/
Guidances/Xenotransplantation/ucm07 4 354.htm
• PHSGuidelineon lnfectiousDisease/ssuesin Xenotransplantation,January 2001. http://www.fda.gov/Bio1ogicsBloodVacci-
nes/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/Xenotransplantation/ucm074727.htm
• Guidancefor Jndustry:lnvestigating Out-of-Specification(OOS) TestResultsfor Pharmaceutica/Production,October 2006.
www.fda.gov/down1oads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnforrnation/Guidances/UCM070287.pdf
• Guidancefor lndustry: Va/idationof Growth-BasedRapidMicrobiologicalMethods for Sterility Testingof Cellularand Gene-The-
rapy Products, CBER,2008. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/
Guidances/CellularandGeneTherapy/ucm072612.htm
• FDABlue Book G95-1, http://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/
ucm080735.htm
Documentos Reglamentarios Nacionales e Internacionales
• The United States Consensus Standard for the Uniforrn Labeling of Cellular Therapy Products using ISBT128, disponible
en: http://www.iccbba.org
• ISO 10993-1 :2003, Biological evaluation of rnedical devices-Part 1: Evaluation and testing, disponible en: http://
www.iso.org
• ICH Q2(Rl ): Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, disponible en: http://www.ich.org
• ICH Q5C: Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products, disponible en:
http://www.ich.org
• ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, disponible en:
http://www.ich.org
• ICH Q9: Quality Risk Managernent, disponible en: http://www.ich.org
• Narning Scheme for Cell Therapies by the United States Adopted Names (USAN) Council, disponible en: http://
www.arna-assn.org/
• Guide for the Care and Use of Laboratory Anirnals (National Research Council, 1996), disponible en: http://www.nap.edu/
USP42 InformaciónGeneral/ (1047) Productos de Terapia Génica 7511
(1047) PRODUCTOSDE TERAPIAGÉNICA
INTRODUCCIÓN
Los productos de terapia génica permiten la administración de ácidos nucleicos para modificar el material genético de las
células. Los productos de terapia génica son ampliamente clasificables con base en la metodología de administración e inclu-
yen lo siguiente: (1) vectores virales [virus que transportan los genes de interés pero, generalmente, sin el mecanismo de auto-
rreplicación in vivo]; (2) ácidos nucleicos en una formulación simple (ADN desnudo); y (3) ácidos nucleicos formulados con
agentes tales como los liposomas, que mejoran su capacidad para penetrar en la célula. Cuando la introducción del ácido nu-
cleico se lleva a cabo ex vivo, la población de células que se administra se convierte en el producto de terapia génica. Las pau-
tas específicas para la fabricación, el procesamiento, la caracterización y la administración de productos derivados de células se
proporcionan en el capítulo ProductosDerivadosde Célulasy Tejidos(1046).
La toma de decisiones con respecto a un vector génico puede ser compleja (ver Consideraciones de Diseñopara VectoresGéni-
cosen Fabricaciónde Productosde TerapiaGénica).Los virus más comúnmente utilizados incluyen retrovirus murinos, adenovi-
rus humanos y virus humanos asociados a adenovirus 0/AA). La definición de terapia génica de este capítulo considera inheren-
temente que la administración de ácidos nucleicos mediante transducción se expresa como ARNy posteriormente como pro-
teína. En la Tabla 1 se incluyen ejemplos de productos de terapia génica.
Tabla 1. Ejemplos de Productos de Terapia Génica
Cateqorías o Estrategias Indicación: Producto Administrado
Reemplazode genes Enfermedadcardiovascular:vector de factor de crecimiento en un andamiaje biocompatibleª
Corto plazo Fibrosisquística: vector para la regulación de la conductancia transmembrana
Largo plazo Hemofilia:vector para el factor VIIIó IX
Destruccióndirecta de células Cáncer: virus oncolíticos recombinantes
Cáncer: células tumorales autólogas, transducidas con genes para citoquinas u otros genes inmuno-
moduladores; linfocitostransducidos con receptores para antígenos tumorales
Inmunoterapia Artritis:linfocitosautólogos modificadosqenéticamente
Cáncer (tumor sólido):vector que inserta el gen de timidina quinasa (TK)o citosina desaminasa
(CD) en las células tumorales
Enfermedaddel injerto contra el anfitrión (GVHD,por sus siglas en inglés):Vectorque transduce el
Genes condicionalmente letalesb gen de TKo CD en las célulasT de donantes
Cáncer: vector con antioncogen
Alteracióndel gen mediante ARNantisentidos, Retinitispor citomegalovirus:vector antiviral
ribozimasy ARNinhibitoriosexpresados me- Virusde inmunodeficienciahumana (VIH):linfocitosautólogos transducidos con vector con ribozi-
diante un vector ma antiviral
Cáncer o VIH:vector que codificaanticuerpo monocatenario contra una proteína tumoral o viral,
lntracuerpos respectivamente
ª Esteproductofavorecela formaciónde nuevosvasossanguíneos.
b Lascélulascon genescondicionalmenteletales,asícomo suscélulasvecinas,se destruyendespuésde la administraciónde un segundofármacoin vivo. Parala
timidinaquinasa(TI<,por sus siglasen inglés),el fármacoes ganciclovir.Parala citosinadesarninasa(CD,por sus siglasen inglés),el fármacoes 5-fluorocitosina.
PROPÓSITOY ORGANIZACIÓN
DELCAPÍTULO
Los usos clínicos de los productos de terapia génica, sus procesos de fabricación y los esquemas analíticos para determinar la
identidad, dosis, potencia, pureza y seguridad están evolucionando a gran velocidad y son tan diversos como los productos
mismos. Este capítulo sintetiza las mejores prácticas vigentes y cuestiones inherentes a la fabricación, pruebas y administración
de productos de terapia génica. Por lo general, los capítulos de USPse concentran en los materiales disponibles comercialmen-
te. Sin embargo, este capítulo no solamente analiza productos con aplicaciones comerciales, sino que también está dirigido a
la producción de materiales para ensayos clínicos. Cuando usan diferentes enfoques para el material utilizado en ensayos clíni-
cos, en comparación con aquellos utilizados en productos comerciales, así se indica.
Cuando resulte apropiado, se hace referencia a las pautas aplicables incluyendo las pautas de calidad de la lnternational
Conference on Harmonization (Conferencia Internacional de Armonización, ICH) debido a que los principios aplican incluso si
los productos de terapia génica estuvieran fuera del alcance oficial. El Apéndicepresenta una lista de documentos reglamenta-
rios y guías aplicables a la terapia génica, a la par de una lista de términos de uso común en el campo de la terapia génica. La
perspectiva farmacopeica tradicional es desarrollar normas públicas que puedan aplicarse a un producto final en particular sin
proporcionar detalles de la producción. Este capítulo tiene como propósito identificar las situaciones en las que se pueden
adaptar las metodologías o normas tradicionales.
La amplitud de este capítulo se deriva de la diversidad de los productos y de las consideraciones especiales que requieren. La
fabricación se ha dividido en dos secciones: la primera analiza los aspectos generales de la fabricación y del desarrollo del pro-
ceso, mientras que la segunda analiza el diseño de vectores y temas sobre clases específicas. La Preparacióny AdministraciónIn
Situ aparece después de las secciones sobre fabricación, ya que el manejo de estos productos en la clínica requiere una infraes-
7512 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General USP42
tructura y experiencia profesional que no se encuentran comúnmente en un hospital convencional. Las otras secciones relacio-
nadas con la fabricación incluyen: MétodosAnalíticos;Estabilidad;Almacenamientoy Transporte;y Etiquetado.La sección Regla-
mentacionesy Normasresume las pautas existentes y resalta la necesidad de desarrollar y validar nuevas metodologías para
evaluar la calidad del producto. El Glosariode Términospresenta y define los términos y abreviaturas usados en este capítulo y
aquellos usados comúnmente en este campo.
ASPECTOSGENERALESDE LA FABRICACIÓN
Introducción
La fabricación de productos de terapia génica se ha dividido en dos secciones. Esta sección, AspectosGeneralesde la Fabrica-
ción, analiza cinco temas que se aplican a la fabricación de todos los productos de terapia génica: (1) materias primas, (2) ca-
racterización de materiales de bancos, (3) controles durante el proceso, (4) especificaciones y (5) validación. La segunda sec-
ción, Fabricaciónde Productosde TerapiaGénica,trata la fabricación de vectores de terapia génica, tanto virales como no vira-
les, y analiza en detalle el diseño de vectores génicos.
Todos los principios generales de las buenas prácticas de fabricación vigentes (BPFv)establecidas por la FDAen el Título 21
del CFR21 O, 211, 600s (en especial el Título 21 del CFR61 O) y 820, y en otros capítulos de USPaplican a la fabricación de
productos de terapia génica. Las instalaciones, equipos y procesos de fabricación, al igual que las materias primas, sistemas de
calidad y personal capacitado son algunos de los elementos fundamentales de las BPFv.Las BPFvaplican durante todo el desa-
rrollo clínico. Por lo regular, el nivel de control aumenta a medida que avanza el desarrollo clínico y, para el momento de ini-
ciar la fabricación como respaldo de la Fase III de los ensayos clínicos, se espera un cumplimiento total de las BPFv.Las instala-
ciones y el equipo deben diseñarse, edificarse y validarse cuidadosamente para sustentar el proceso de fabricación y para man-
tener la segregación requerida del producto/instalación. El mantenimiento preventivo y la calibración se deben llevar a cabo
de manera rutinaria en el equipo crítico. Las incubadoras, biorreactores y congeladores deben contar con sistemas de alarma
capaces de emitir señales de falla de manera remota. Se deben establecer sistemas de calidad para garantizar que la fabrica-
ción sea uniforme y controlada. Los sistemas incluyen, de manera enunciativa mas no limitativa, lo siguiente: control de cam-
bios, control de documentos, monitoreo del medio ambiente, capacitación, planes maestros de validación, análisis y liberación
de materias primas, aprobación de proveedores, análisis y liberación de productos, pruebas de estabilidad y acción correctiva/
preventiva (CAPA,por sus siglas en inglés).
Materiales Auxiliares 7
Se puede utilizar una amplia variedad de materias primas, incluyendo materiales auxiliares, en la fabricación de los produc-
tos. Las materias primas pueden incluir sustancias complejas tales como células, tejidos, fluidos biológicos, factores de creci-
miento y anticuerpos monoclonales. Algunos de estos materiales pueden mantenerse en el producto terapéutico final como
sustancias activas, crioconservantes o excipientes. Un material auxiliar tiene un efecto sobre el material terapéutico (por ejem-
plo, una citoquina puede activar una población de células) pero no está destinado a estar presente en el producto terapéutico
final. La calidad de las materias primas usadas en la elaboración de un producto de terapia génica puede influir en la seguri-
dad, potencia y pureza del producto. Por lo tanto, es necesario calificar este tipo de materiales para garantizar la uniformidad y
la calidad de todos los productos de terapia génica. Las actividades relacionadas con la calificación de materias primas cambia-
rán a medida que los productos avancen por las diferentes etapas de desarrollo clínico hacia la obtención de la autorización y
su comercialización. La amplitud de un programa de calificación bien diseñado se extiende a medida que progresa el desarro-
llo del producto. Un programa de calificación de materias primas utilizadas en la fabricación de productos de terapia génica
debe tratar cada una de las siguientes áreas: (1) identificación y selección, (2) aptitud para uso, (3) caracterización, (4) compo-
nentes derivados de animales y (5) garantía de calidad. Se debe considerar para todas las materias primas el momento y la
etapa en la que se usa cada una dentro del proceso de fabricación debido a que puede ser útil para definir criterios de selec-
ción. Se debe consultar el capítulo de USP,MaterialesAuxiliarespara ProductosCelulares,Génicosy de IngenieríaTisular(1 043),
para información específica sobre la implementación de un programa de calificación apropiado para estos materiales. Otros
capítulos de USPproveen información que se debe tomar en cuenta con respecto a la calificación y normas de materiales auxi-
liares específicos (p. ej., SueroBovino(1024), SueroFetalBovino-Atributos de Calidady Pruebasde Funcionalidad(90) y Factores
de Crecimientoy CitoquinasUsadosen la Fabricaciónde Productosde TerapiaCelular(92)).
Caracterización de Bancos de Células y de Virus
BANCOSDE CÉLULAS
Un banco de células es un conjunto de viales que contienen células almacenadas en condiciones definidas, con una compo-
sición uniforme y obtenidas a partir de células combinadas derivadas de un único don celular. El sistema de bancos de células,
por lo general, se compone de un banco maestro de células (MCB, por sus siglas en inglés) y un banco de células de trabajo
(WCB, por sus siglas en inglés), aunque existen otras categorizaciones posibles. El MCB se produce de acuerdo con las BPFvy,
preferentemente, se obtiene de una fuente repositoria calificada (exenta de agentes adventicios) con antecedentes conocidos y
documentados. ElWCB se obtiene o produce mediante la expansión de uno o más viales del MCB. El WCB, o el MCB en los
ensayos iniciales, se transforma en la fuente de células para cada partida producida para uso humano. Los sistemas de bancos
de células contribuyen en gran medida a la uniformidad en la elaboración de partidas de productos clínicos o autorizados,
debido a que el material celular inicial es siempre el mismo. Los bancos de células usados para la preparación de bancos de
virus o del producto clínico se deben caracterizar adecuadamente antes de su uso. Los aspectos relacionados con la elabora-
ción de bancos de células y su validación se analizan en los capítulos ProductosDerivadosde Célulasy Tejidos(1046), Calidadde
ProductosBiotecnológicos:
Análisisde la ConstrucciónExpresableen CélulasUsadaspara la Producciónde ProductosProteínicosOb-
tenidoscon ADN Recombinante(1048) y Evaluaciónde la SeguridadViralen ProductosBiotecnológicosObtenidosde LíneasCelula-
res de OrigenHumanoo Animal(1050).
BANCOSDE VIRUS
El banco de virus maestro (MVB, por sus siglas en inglés) es similar al concepto del MCB puesto que se deriva de un ciclo de
producción único y su composición es unifonme. El banco de virus de trabajo (YI/VB,por sus siglas en inglés) deriva directa-
mente del MVB.Tal como sucede con los bancos de células, el propósito de un banco de virus es contar con una fuente de
virus uniforme, libre de agentes adventicios, para su uso en la producción de partidas clínicas o de productos. De acuerdo con
las reglamentaciones de las BPFv,las pruebas para los bancos de células que se utilizarán en la producción de bancos de virus,
incluidas las pruebas de garantía de calidad, deben completarse antes de usar este banco de células para la producción de
bancos de virus.
CALIFICACIÓN
La caracterización de los bancos de células y de virus es un paso importante para la obtención de un producto final unifor-
me, manteniendo la coherencia entre lotes y la ausencia de agentes adventicios. Las pruebas para calificar los MCB o MVBse
realizan una vez y se pueden hacer con una alícuota del material del banco o con cultivos de células derivados del banco de
células. Se deben establecer especificaciones para la calificación del MCB o MVB. Es importante documentar el historial del
MCB o MVB, los métodos y reactivos empleados para crear el banco y las condiciones de almacenamiento. Todas las materias
primas requeridas para la producción de los bancos-los medios, los sueros, la tripsina y similares-también deben someterse
a pruebas para descartar la presencia de agentes adventicios.
CALIFICACIÓNDELBANCO MAESTRODE CÉLULAS
La Guidancefor lndustry:Human SomaticCe//Therapyand Gene Therapy(Guía para la Industria: Terapia Celular Somática Hu-
mana y Terapia Génica) de la FDA(marzo 1998) proporciona recomendaciones específicas para la calificación de los MCB. El
documento ICH QSD ofrece pautas adicionales. Se requiere de una descripción e historial de la línea celular, junto con una
descripción del proceso de congelamiento, condiciones de almacenamiento y número de viales preparados. La identidad de
las células debe analizarse usando marcadores genotípicos y/o fenotípicos. Para MCB que contienen secuencias de vectores, se
debe demostrar la presencia y la integridad del vector usando ensayos moleculares (mapeo de endonucleasa de restricción y/o
secuenciación de ácidos nucleicos) y/o medición de expresión génica del vector. La pureza se debe analizar para determinar la
ausencia de contaminación bacteriana, micoplásmica, fúngica y viral (diferentes a las secuencias de vectores). La ausencia de
virus adventicios debe comprobarse utilizando pruebas de virus tanto in vitro como in vivo y pruebas adecuadas específicas
para la especie, como la prueba de producción de anticuerpos murinos (MAP,por sus siglas en inglés). Se debe poner especial
atención a la detección del virus competente para la replicación (VCR)que surge de la recombinación del vector y las secuen-
cias virales. El MCB se califica adicionalmente llevando a cabo pruebas en células (obtenidas del MCB o del WCB) expandidas
hasta el límite de la edad celular para producción in vitro.
CALIFICACIÓNDELBANCO DE VIRUSMAESTRO
Las pruebas para el MVBson similares a las del MCB y deben incluir pruebas para determinar la ausencia de agentes adventi-
cios en general (tales como bacterias, hongos, micoplasmas o virus) y para organismos específicos de la línea celular de pro-
ducción, incluyendo VCR. Las pruebas de identidad del MVBdeben establecer las propiedades del virus y la estabilidad de es-
tas propiedades durante la fabricación.
CALIFICACIÓNDE BANCO DE CÉLULASO DE VIRUSDE TRABAJO
La caracterización del WCB o del WVBgeneralmente es menos exhaustiva y requiere lo siguiente: (1) pruebas para determi-
nar la ausencia de agentes adventicios que puedan haber sido introducidos durante la elaboración del WCB, (2) pruebas para
determinar la presencia de VCR,si corresponde, (3) pruebas de identidad de rutina para verificar la contaminación cruzada de
la línea celular y (4) demostración de que las alícuotas pueden ser utilizadas sistemáticamente para la elaboración del producto
7514 (1047) Productos de Terapia Génica / InformaciónGeneral USP42
final. Con esto se asume que el WCBy el WVBse prepararon en un ambiente controlado usando medios y equipos analizados
adecuadamente para determinar la ausencia de agentes adventicios. En caso contrario, es necesario realizar pruebas de libera-
ción adicionales.
Controles Durante el Proceso
Los procesos de fabricación deben incluir criterios bien definidos para decidir si se avanza o no se avanza, que se aplican a
los productos intermedios clave del proceso y se utilizan para combinar el material que ha atravesado una etapa del proceso
en varios sublotes. La calidad debe incorporarse al producto además de probarse durante la liberación de la partida. Los con-
troles en proceso son valoraciones o pruebas realizadas para garantizar que la calidad y la cantidad del producto intermedio en
proceso sean suficientes para fabricar un producto final de buena calidad. En la Tabla2 se incluyen ejemplos de controles du-
rante el proceso. Los controles durante el proceso se realizan principalmente para asegurar la obtención del producto correcto
con la calidad y el rendimiento previstos. El material intermedio del proceso que no cumple con los criterios de control durante
el proceso no debe usarse para la fabricación adicional. Este material se puede reprocesar cuando se cuenta con procedimien-
tos para tales actividades. El material reprocesado debe cumplir con las especificaciones de proceso originales antes de que
pueda usarse para fabricación adicional. Si se van a combinar varios sublotes para procesamiento adicional, los sublotes que no
cumplan con los criterios no se podrán incluir, aún si la combinación que contiene esos sublotes cumpliera con los criterios de
los ensayos de proceso. Durante el desarrollo clínico, los ensayos de calidad y rendimiento del producto se deben efectuar des-
pués de la mayoría de los pasos del procesamiento a efectos de determinar cuáles son los pasos críticos y cuáles los ensayos
más sensibles a desviaciones del proceso. La información así obtenida también se utiliza para establecer los criterios para los
ensayos seleccionados. Los controles de proceso se realizan para la validación completa de los procesos y para asegurar que
continúen bajo control. Los resultados de estos ensayos deben someterse a un análisis de tendencia y se deben tomar medidas
para corregir los problemas cuando éstos surjan.
Tabla 2, Elemplos de Apllcaclones de Controles Durante el Proceso
Tipo de Producto Atributo a Controlar
Cantidad de virus después del cultivo del virus
Actividad específica de virus en fracciones obtenidas después de una cromatografía en
columna
Cantidad de ADN de células anfitrionas en fracciones obtenidas después de una croma-
Terapia génica viral tografía en columna
Densidad óptica o cambio en el consumo de oxígeno durante el cultivo
Cantidad y forma de plásmido antes de la recolección del cultivo
Cantidad y forma de plásmido después de las etapas de extracción
Cantidad de pirógenos o endotoxinas después de las etapas de extracción en la combi-
Terapia génica no viral nación de plásmidos
Especificaciones
La selección de especificaciones para un producto de terapia génica debe centrarse en garantizar la seguridad y eficacia del
producto antes de su uso. Las pruebas seleccionadas deben ser específicas para cada producto y deben contar con criterios de
aceptación adecuados a fin de garantizar parámetros de calidad uniformes y dentro de los niveles aceptables de variación bio-
lógica, pérdida de actividad, cambios fisicoquímicos o degradación durante la vida útil del producto. El desarrollo y el estable-
cimiento de especificaciones para productos celulares y génicos deben respetar los principios descritos en el documento ICH
Q68 y deben cumplir con lo establecido en la Guidancefor FDAReviewersand Sponsors:Content and Reviewof Chemistry,Manu-
facturing, and Control (CMC) lnformation for Human Gene TherapylnvestigationalNew Drug Applications(INDs) (Guía para Revi-
sores y Auspiciadores de la FDA:Contenido y Revisión de Información Química, de Fabricación y Control (CMC, por sus siglas
en inglés) para Nuevas Aplicaciones Farmacológicas lnvestigativas (IND, por sus siglas en inglés) de Terapia Génica en Huma-
nos) de la FDA.
El establecimiento de especificaciones para un fármaco y medicamento forma parte de una estrategia general de control de
fabricación que incluye el control de materias primas, excipientes y bancos de células y virus; análisis durante el proceso; eva-
luación y validación del proceso; pruebas de estabilidad; y análisis de uniformidad de lotes. Al combinarse estos elementos se
tiene la garantía de que el proceso está controlado y que se mantienen los atributos clave de calidad del producto. Las especifi-
caciones adecuadas se establecen a partir de una caracterización minuciosa del producto durante la fase de desarrollo y de la
comprensión del proceso y su capacidad. La caracterización incluye mediciones de las propiedades fisicoquímicas, la seguri-
dad, la pureza, las impurezas derivadas del proceso y del producto, la potencia, la viabilidad, la esterilidad y la cantidad. Las
especificaciones para cada producto y sus ingredientes se deben desarrollar a partir de esta información mediante la aplicación
de métodos estadísticos apropiados. La información debe incluir lotes utilizados en estudios preclínicos y clínicos, además de
datos de validación de procesos y valoraciones, que pueden guardar correlación con las evaluaciones de seguridad y eficacia.
Las especificaciones deben incluir las variabilidades inherentes mostradas por el proceso de producción y las valoraciones. Para
estos tipos de productos, puede ser necesario volver a examinar algunas de las especificaciones de liberación de lotes que por
lo general se aplican a productos biológicos.
USP 42 Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 7515
Los procedimientos en una especificación para el producto se sustentan mediante estándares de referencia apropiados. El
estándar de referencia para el producto garantiza que éste último, según lo determinado por los ensayos de liberación, no
cambie significativamente con el tiempo. El estándar de referencia se fabrica usando el mismo proceso que para la producción
clínica y se somete a todas las pruebas durante el proceso y de liberación final. Asimismo, el estándar de referencia se somete a
caracterización adicional que no se lleva a cabo comúnmente como parte de la liberación del lote. El estándar de referencia no
requiere ser almacenado en la misma dosis, formulación o temperatura que el producto, aunque es necesario determinar su
estabilidad. El estándar de referencia verifica que una prueba produzca resultados aceptables (que cumpla con las pruebas de
aptitud del sistema). Es posible usar un estándar de valoración específico (estándar de trabajo) en la prueba; sin embargo, de-
be calibrarse en función del estándar de referencia y su comportamiento debe ser similar. El cambio a un nuevo estándar (lote)
de referencia debe incluir muchas pruebas y todas ellas se deben realizar paralelamente al estándar de referencia existente. Se
debe evaluar cuidadosamente el impacto de cualquier cambio en las propiedades del nuevo estándar de referencia antes de
ser adoptado.
Pueden ser necesarias especificaciones adicionales para producir un producto de terapia génica seguro y efectivo. Dichas es-
pecificaciones pueden relacionarse con algunos de los controles y límites de acción usados para mantener los estándares y la
uniformidad de materias primas, excipientes y del proceso de fabricación (ver MaterialesAuxiliaresy ControlesDurante el Proce-
so). Se deben establecer especificaciones para permitir la aceptación de las materias primas y excipientes utilizados en la for-
mulación final del producto. Asimismo, deben realizarse pruebas en las etapas de fabricación que requieren tomar decisiones
críticas o en etapas en las que la información obtenida sirve para confirmar la uniformidad del proceso. Deben establecerse
especificaciones de liberación para cada control del proceso. La heterogeneidad puede resultar del proceso de fabricación o
almacenamiento del producto. Por lo tanto, el fabricante debe definir el patrón de heterogeneidad dentro del producto y debe
establecer límites que mantengan la eficacia terapéutica y la seguridad del producto.
En algunos casos, se pueden establecer especificaciones para liberación del lote así como para la vida útil. Conforme a lo
analizado en el documento ICH Q5C y en el capítulo Calidadde ProductosBiotecnológicos:Pruebasde Estabilidadde Productos
Biotecnológicoso Biológicos(1049), el uso de diferentes especificaciones se debe respaldar con información suficiente para de-
mostrar que el rendimiento clínico no resulta afectado. Los criterios de aceptación se deben establecer y justificar a partir de
los datos obtenidos de lotes usados en estudios preclínicos y clínicos, y de lotes utilizados para demostrar la uniformidad en la
fabricación, y a partir de datos de desarrollo pertinentes, como los surgidos de procedimientos analíticos validados y estudios
de estabilidad. Los criterios de aceptación se deben correlacionar con evaluaciones de seguridad y eficacia.
Una vez que se han establecido las especificaciones, los resultados de prueba deben someterse a un análisis de tendencias.
Los resultados fuera de especificación (OOS, por sus siglas en inglés)-o incluso aquéllos que están fuera de la tendencia-
deben ser investigados antes de considerar el material para procesamiento adicional. El objeto de esta investigación es deter-
minar la causa del resultado discordante. El documento Guidancefor lndustry: lnvestigating Out of Specification(00S) TestRe-
sults for PharmaceuticalProduction[Guía para la Industria: Investigación de Resultados de Pruebas Fuera de Especificación en la
Producción Farmacéutica] de la FDAofrece un enfoque sistemático para llevar a cabo una investigación. Un resultado de ensa-
yo puede rechazarse cuando se confirma que se ha presentado un error, tal como un error del analista, de cálculo o fallo del
equipo. Si la investigación determina que el producto está fuera de la especificación, el lote debe ser rechazado. En situaciones
excepcionales, es posible que se deba administrar a un paciente un producto que no cumpla con todas las especificaciones.
No obstante, deben existir procedimientos establecidos para la comunicación de los resultados OOS al médico o a la persona
responsable de decidir si se utiliza o no el producto, y para dar indicaciones sobre pruebas de seguimiento, monitoreo del pa-
ciente y comunicación de dichos resultados.
Consideraciones de Validación
El potencial para producir una amplia variación biológica en productos de terapia génica, particularmente en tratamientos
para pacientes específicos, afecta el proceso de validación. No obstante, los principios básicos de validación del proceso para
cualquier producto biológico, incluidas las recomendaciones de la ICH, de los documentos guía de la FDA, de los capítulos
Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos (1225) y Validaciónde RecuperaciónMicrobiana de ArtículosFarmacopeicos(1227),
aplican a la validación de la mayoría de los productos de terapia génica. Las pautas para la validación de vacunas virales pue-
den ser pertinentes para los procesos de terapia génica que producen vectores virales. Las etapas de retención en un proceso
de fabricación deben ser validadas para garantizar que los productos intermedios del proceso estén dentro de la especificación
y que sea posible mantener los atributos de calidad del producto final. Es necesario validar los ensayos de liberación del pro-
ducto antes de producir los materiales para los ensayos clínicos clave de la Fase 111.
La validación del proceso demuestra que las operaciones unitarias del proceso de fabricación se llevan a cabo de manera
uniforme y pueden generar un producto de calidad que cumpla con las especificaciones. Debido a que los procesos biológicos
son propensos a variaciones, la uniformidad y robustez del proceso de fabricación deben determinarse validando el proceso en
al menos tres lotes. Los aspectos relacionados con la validación del proceso relevantes para los productos derivados de células
se tratan en el capítulo (1046).
Siempre que sea posible, se debe validar el proceso con respecto a la depuración del virus de acuerdo con los principios
discutidos en el documento ICH Q5A. Si lo anterior se complica debido a la naturaleza del vector para terapia génica (p.ej.
virus con envoltura), se debe considerar la caracterización adicional de células y componentes derivados de animales usados en
el proceso de producción. Cuando el producto de terapia génica se elabora en una instalación en la que se fabrican productos
4
7516 (1047) Productos de Terapia Génica/ InformaciónGeneral USP42
múltiples, se debe validar la limpieza del equipo y de los cuartos para productos múltiples, a fin de demostrar la efectividad de
los agentes de limpieza para inactivar o eliminar virus.
FABRICACIÓN
DE PRODUCTOSDE TERAPIAGÉNICA
Introducción
Los principios de fabricación de productos farmacéuticos o biológicos también son pertinentes al desarrollo de vectores de
terapia génica para uso en seres humanos. Se aplican los mismos requisitos de la BPFvpara garantizar la administración al pa-
ciente de un producto de alta calidad. Debido a la naturaleza de los sistemas de fabricación de productos de terapia génica, la
mayoría de los fabricantes se enfrentan con problemas de desarrollo tales como la capacidad de producción en escala, el rendi-
miento, la rentabilidad y la estabilidad del producto.
La mayoría de los vectores para terapia génica se producen únicamente en partidas relativamente pequeñas, necesarias para
satisfacer las necesidades de los ensayos clínicos iniciales que se llevan a cabo en un pequeño número de pacientes. No obs-
tante, la promisoria aplicación de terapia génica en poblaciones más grandes de pacientes ha generado el progreso de la pro-
ducción a escala y de la tecnología de purificación. Esta sección se enfoca en el diseño de vectores para terapia génica, así
como en la selección de tecnologías de producción adecuadas.
Consideraciones de Diseño para Vectores Génicos
TIPOS DE VECTORES
Un vector de terapia génica por lo general consta de: (1) el esqueleto del vector; (2) un promotor; (3) el gen terapéutico, ya
sea como ADNc o secuencia genómica; y (4) una señal de poliadenilación. Se ha desarrollado una amplia variedad de virus-
incluidos los retrovirus murinos y humano, adenovirus, parvovirus tales como el VAA,virus del herpes, poxvirus, virus toga y
sistemas de terapia con plasmidos no virales- para aplicaciones de terapia génica. Estos vectores (ver la Tabla 3) tienen capaci-
dades muy diferentes en lo que respecta al transporte de material genético y la duración de la expresión. Algunos vectores
virales se dirigen, por preferencia, a células en división, mientras que otros son capaces de transducir células en división o célu-
las que no están en división. Existen algunas variaciones importantes en la capacidad transgénica (es decir, se presentan limita-
ciones en cuanto al tamaño del fragmento extraño de ADN que se puede incorporar al genoma del vector). La magnitud, el
momento y la duración de la expresión génica requeridos para un producto de terapia génica dependen de la indicación clíni-
ca. Para algunas enfermedades como la deficiencia de adenosina desaminasa (ADA)o la hemofilia tipo A o tipo B, puede ser
necesaria una expresión génica prolongada de bajo nivel. La expresión breve de alto nivel puede ser más apropiada para el
cáncer, cuando se emplean genes que inducen la apoptosis o para enfermedades cardiovasculares cuando la prevención de la
hiperproliferación de células musculares lisas puede impedir la reestenosis de injertos de vena safena.
Tabla 3. Tipos de Vectores Génicos
Viral Novlral
Adenovlrl- Parvovlrl- Herpes-
Famllla Retrovlrldae dae dae vlrldae Togavlrldae Poxvlrldae
Vlnas de
la Leuce- Virus del
Ejemplos de mlaMurl- Herpes Poxvlrus Plásmldo
especies na VIH Adenovlrus VAA Slmple Slndbls (Vacclnla) derivado
Características del Vector
Límite de tama-
ño de inser-
ción 8 kb 8 kb 4,3-34 kb 4-5 kb 40-150 kb 5 kb 25-50 kb 12 kb
Puede ser inte- Puede ser inte- Sí, pero a muy
Integración al No, grado o epi- grado o epi- baja frecuen-
cromosoma Sí Sí episomal soma! soma! No No da
Expresión tera- Estable o transi- Estable o tran- Estable o tran-
péutica Estable Estable torio Estable sitorio Transitorio Transitorio sitorio
Localización del
vector Núcleo Núcleo Núcleo Núcleo Núcleo Citoplasma Citoplasma Núcleo
Tipos de células Únicamente En división y En división y En división y En división y En división y En división y En división y
transducidas en división quiescentes quiescentes quiescentes quiescentes quiescentes quiescentes quiescentes
Eficiencia de la
transferencia
génica Alta Alta Alta Alta Alta Alta Alta Baja
USP42 Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 7517
Tabla 3. Tipos de Vectores Génicos (Continuación)

Vlral Novlral
Adenovlrl- Parvovlrl- Herpes-
Familia Retrovlrldae dae dae vlrldae Toqavlrldae Poxvlrldae
Virus de
la Leuce- Virus del
Ejemplos de mla Murl- Herpes Poxvlrus Plásmldo
especies na VIH Adenovlrus VAA Simple Slndbls (Vacclnla) derivado
Características del Vector
Sí, a menos que
Expresión de se supriman
proteínas vira- los genes vira-
les No No les No Sí Sí Sí No
Se puede usar
como un sis-
tema de tera-
El tropismo se puede alterar pia con plás-
Otros mediante seudotipificación midos
CRITERIOSPARAEl DISEÑODE VECTORES
Se están desarrollando muchos tipos de vectores para terapia génica y el vector seleccionado para una aplicación clínica en
particular depende del estado de la enfermedad, de la célula blanco y de la vía de administración prevista. Conforme a lo mos-
trado en la Tabla3, la capacidad depende del tipo de vector, por lo que las aplicaciones clínicas que requieren de una gran
cantidad de material genético limitarán la selección del sistema de vectores. la carga útil de un sistema de vectores adquiere
mayor importancia cuando se diseñan vectores con ADN genómico o un vector que contiene secuencias reguladoras extensi-
vas.
los vectores también se seleccionan basándose en la duración pretendida de la expresión y de la célula blanco. Por ejemplo,
los vectores retrovirales se integran de manera estable en las células blanco y, por lo tanto, se adaptan bien a las células madre
o linfocitos que se espera experimentarán una división celular extensiva. Por el contrario, los vectores adenovirales y plasmídi-
cos son episomales y se pueden perder durante la división celular. No obstante, los vectores adenovirales son atractivos para el
desarrollo de vacunas y en aplicaciones contra el cáncer cuyo objetivo es eliminar las células tumorales. Otros vectores tales
como el VAA,no presentan una integración de alta eficacia, pero se pueden expresar a largo plazo en células que no están en
división, como por ejemplo neuronas o hepatocitos.
El tipo de célula blanco también tiene un papel importante en la selección de un sistema de vectores apropiado (ver Trans-
ducciónDirigida).Por ejemplo, el receptor de adenovirus y de virus Coxsackie B (CAR,por sus siglas en inglés) se expresa po-
bremente en tejidos hematopoyéticos, lo cual limita la utilidad del sistema de vectores para células hemoderivadas. los vecto-
res basados en retrovirus murinos requieren del ciclo celular y no se ajustan bien a la transducción de células que no están en
división tales como las neuronas.
El sistema inmune puede dirigir tanto a los componentes virales del vector como al transgén expresado. la presencia de
anticuerpos preexistentes o inmunidad celular para ciertos sistemas de vectores pueden limitar su utilidad. los vectores pueden
desencadenar una respuesta inmune innata que podría reducir la eficacia de la transferencia génica e inducir un evento adver-
so severo. Existe un gran número de metodologías de terapia génica actuales que buscan limitar la toxicidad y la respuesta
inmune mediante la administración del vector a células ex vivo. Sin embargo, la mayoría de las enfermedades aptas para tera-
pia génica requerirán la aplicación in vivo, mientras que la investigación en curso busca vectores con reconocimiento inmune
limitado.
la vía de administración y la manipulación de la dosis total del vector son estrategias que se pueden usar para compensar
algunas limitaciones de sistemas de vectores específicos. Además, existen ventajas y desventajas para la fabricación de cada
uno de los diferentes sistemas de vectores que se deben considerar al momento de planear una aplicación clínica. la uniformi-
dad de la producción favorece a los sistemas de fermentación o cultivo bien definidos, tales como vectores plasmídicos, retro-
virales o adenovirales. Para los sistemas de vectores virales que requieren funciones colaboradoras (ver más adelante), una línea
celular racionalmente diseñada puede superar las limitaciones de la capacidad de producción en escala y de la uniformidad
impuestas por las cotransfecciones. El empleo de una línea celular que se adapte al cultivo en suspensión puede influir sobre la
capacidad de producción en escala y la rentabilidad.
TRANSDUCCIÓNDIRIGIDA
Para que un vector sea eficaz, en primer lugar, tiene que hallar y transducir su célula blanco. los virus poseen una gama de
anfitriones naturales que está muy influenciada por los niveles de expresión de receptores específicos en la superficie celular, la
fase actual del ciclo celular y la vía de administración. las integrinas son una clase de receptores de adhesión celular que inte-
ractúan con la base del pentón o la proteína de la fibra de los adenovirus. las proteínas de la fibra y de la base del pentón de
7518 (1047) Productos de Terapia Génica/ InformaciónGeneral USP42
adenovirus median la unión al CAR,al CD46 y a las integrinas. Los virus asociados a adenovirus interactúan primeramente con
receptores de heparán sulfato proteoglicano y ácido siálico en la superficie de las células. Sin embargo, es necesaria la interac-
ción con los receptores secundarios tales como integrinas, laminina y factores de crecimiento para el ingreso eficiente de las
células y el tráfico de partículas de virus hacia el núcleo. Una variante anfotrópica del virus de la leucemia murina (VLM)co-
múnmente usada para aplicaciones de terapia génica, emplea la molécula transportadora de fosfato dependiente de sodio
RAM-1para ingresar a blancos celulares. Los niveles de expresión de cada uno de estos receptores varían de acuerdo con el
tipo de tejido, el cual dictamina la eficiencia de transducción del vector.
La gama de anfitriones y tejidos se puede modificar o dirigir mediante manipulación bioquímica y genética del vector. A lo
largo de la seudotipificación genética, se llevan a cabo muchas alteraciones en la especificidad celular y tisular de retrovirus-y
particularmente lentivirus. Durante este proceso, las proteínas de envoltura que dictaminan la unión e ingreso de virus median-
te un receptor celular específico de un virus se reemplazan con la proteína de envoltura de otro retrovirus o con una proteína
de un virus totalmente distinto tal como la glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular. La complejidad relativa de las
cápsides de adenovirus y de virus asociados con adenovirus permite modificarlas genéticamente de diferentes maneras. La sus-
titución de una proteína de un solo virus (p. ej., fibra de adenovirus o AW VPl, por sus siglas en inglés) por una de otro seroti-
po dentro de la misma familia es muy parecida al proceso de seudotipifiación para retrovirus. No obstante, las partículas de
virus en mosaico que se crean intercalando proteínas de cápsides individuales de varios serotipos virales distintos en un virión,
y las partículas quiméricas creadas por proteínas de cápsides de dos serotipos distintivamente diferentes en una partícula de
algún otro serotipo (p. ej., pentón de adenovirus 35 en fibra de adenovirus 41 en una partícula de adenovirus 5) pueden cam-
biar efectivamente los tipos de células y tejidos que puede transducir un vector. Aunque esta metodología puede parecer sen-
cilla, algunas modificaciones de proteínas de la cápside viral a nivel genético no facilitan la formación de partículas virales. A
pesar de que la mayoría de las modificaciones mejoran la captación de virus en un blanco celular específico, también pueden
incrementar la captación en algunos otros tejidos en los que no es deseable la transferencia génica. Por consiguiente, se debe
considerar y analizar cuidadosamente la selección de proteínas y ligandos en modelos preclínicos de enfermedades antes de
que estos vectores puedan usarse ampliamente.
Las proteínas del revestimiento viral y los vectores no virales se pueden modificar químicamente para dirigirlos hacia recep-
tores mediados por ligandos. Se pueden conjugar con ligandos dirigidos a las células mediante interacciones anticuerpo-virus
con anticuerpos biespecíficos. Los puentes moleculares como los complejos de biotina-avidina y los entrecruzadores químicos
tales como polietilenglicol (PEG) bifuncional ligados a proteínas unidas al receptor específicas de la célula se conjugan fácil-
mente con partículas virales y a menudo se incorporan en estrategias de dirección. Estas metodologías se pueden combinar
y/o intercambiar fácilmente con modificaciones genéticas y con los demás para crear vectores dirigidos efectivamente a varios
receptores. Aunque la metodología bioquímica evita complicaciones funcionales en la introducción de dominios extraños en
las proteínas virales, cada lote de vector se debe modificar puesto que la progenie del virus se restaurará a su tropismo original
codificado genéticamente. Los procesos bioquímicos también requieren el uso de múltiples reactivos, lo que puede complicar
la transferencia al sitio clínico.
Otra estrategia común y efectiva para dirigir vectores virales a células tumorales toma ventaja del ciclo de replicación del
virus. La supresión de genes críticos para la toma de los puntos de control de células funcionales para respaldar la replicación
normal de virus permite que el virus se replique únicamente en células cancerosas cuando aquellos puntos de control son de-
fectuosos o inactivos. Este efecto se puede mejorar aún más creando pequeñas mutaciones en genes para replicación de virus
dirigidos por promotores específicos para ciertos tumores y tejidos. Con respecto al ciclo celular, los adenovirus y los virus aso-
ciados con adenovirus infectan fácilmente células quiescentes y en división, mientras que los vectores retrovirales basados en el
virus de la leucemia murina son eficaces solo cuando transducen células en división rápida. Los vectores lentivirales pueden
infectar células quiescentes, como las de origen neuronal. En general, los vectores no virales pueden entrar a células en división
y que no están en división pero tienen una eficacia de transducción menor que los vectores virales. La eficacia de transducción
de vectores no virales se puede mejorar mediante la formulación e inyección directa en el tejido de interés.
INFLUENCIADELCOMPLEMENTOY DELSISTEMAINMUNEHUMORAL
Una de las barreras más importantes para la transferencia génica eficaz es la respuesta inmune humoral hacia el vector. Inde-
pendientemente de la vía de administración, de la célula blanco prevista y de la dosis, es probable que el vector encuentre
algún componente del sistema inmunitario. En el caso de los vectores virales, el sistema inmunitario humoral no puede distin-
guir con facilidad entre infecciones por virus salvajes y vectores virales recombinantes, porque la respuesta humoral está dirigi-
da contra proteínas en la envoltura o cápside viral. Las formulaciones de vectores no virales que contienen proteínas también
pueden desencadenar una respuesta inmunitaria humoral. Se pueden presentar respuestas humorales específicas o de reacción
cruzada preexistentes debido a la exposición natural a versiones salvajes de vectores virales o bien pueden desencadenarse du-
rante la administración, y la respuesta de los anticuerpos puede variar en cuanto a la capacidad para disminuir la transducción
génica en ciertos pacientes. Como la capacidad neutralizadora suele aumentar con las dosis múltiples, la administración repeti-
da también puede ser problemática. Algunos de estos problemas se pueden remediar mediante el uso de sistemas no virales.
Sin embargo, el nivel de eficacia de transducción de estos vectores actualmente no es suficiente para muchas de las aplicacio-
nes de transferencia génica. La eficiencia de transducción de todos los vectores también se ve comprometida de manera im-
portante por el sistema de complementos. Muchas proteínas de complemento tienen una afinidad natural por las proteínas de
la cápside viral. Esta interacción inicia la liberación de citoquinas y quimioquinas que facilitan la rápida eliminación del vector
~, 1
íT
de la circulación sistemática. La afinidad por lo general se eleva (especialmente en el caso de retrovirus) cuando las proteínas
celulares no humanas y los componentes de cultivo (p. ej., suero fetal bovino) se incorporan y/o recubren la partículas del virus
durante la producción a gran escala. El uso de líneas de células productoras de origen humano y de condiciones de cultivo
exentas de suero ha disminuido la inactivación de vectores mediante complemento.
Se han desarrollado diversas estrategias para mitigar y evitar la respuesta inmune humoral y la inactivación del complemen-
to. Incrementar la dosis de vector para compensar la actividad neutralizante de los anticuerpos y alterar los regímenes de dosi-
ficación para que coincidan con periodos de bajos títulos de anticuerpos son las opciones lógicas, pero la posible toxicidad
asociada con altas dosis de virus y la variabilidad individual de la respuesta inmune son consecuencias negativas potenciales de
esta metodología. Como alternativa, los vectores virales se pueden diseñar de modo que eludan el sistema inmunitario. Una
metodología consiste en aumentar la expresión de genes virales específicos que permiten al virus evadir la respuesta humoral
del anfitrión. Los virus recombinantes construidos de serotipos con velocidades de exposición limitadas tales como el adenovi-
rus simiano 7 pueden evitar la neutralización en aquellos expuestos previamente a serotipos más comunes. Los virus del mosai-
co y quiméricos también pueden evitar la neutralización. Ambas metodologías tratan efectivamente los aspectos de la transfe-
rencia génica eficaz en aquellos con inmunidad preexistente, aunque ambas requieren de investigación adicional en respuesta
a las inquietudes relacionadas con la seguridad y la producción a gran escala así como la inducción de respuestas inmunes en
poblaciones de pacientes que no han sido previamente sometidos a infección. La unión covalente de polietilenglicol (PEGila-
ción) a la cápside viral puede proteger a los virus de la neutralización y cortar la respuesta inmune. Los métodos farmacéuticos
tales como fijación de vectores virales en matrices de polímero y la administración de vectores a la mucosa (oral y nasal) tam-
bién pueden proteger a los vectores virales de la respuesta inmune humoral.
INFLUENCIADE LARESPUESTA
INMUNECELULAR
Una vez iniciada la expresión transgénica, la respuesta inmune celular elimina rápidamente células transducidas por vectores
virales y no virales. Esto reduce la efectividad terapéutica general de la transferencia génica de dosis de vector bajas a modera-
das y puede ser altamente tóxico cuando se administran dosis mayores. No se requiere de síntesis de proteína activa para la
respuesta inmune celular a proteínas de la cápside viral. Por ejemplo, las proteínas de la cápside de vectores de VAArecombi-
nante han mostrado longevidad, lo cual genera una respuesta inmune retardada y la eliminación de células transducidas por
vectores. La síntesis de novo de productos génicos virales también puede exacerbar las respuestas celulares del anfitrión. Se
han diseñado vectores virales con supresiones específicas del esqueleto para eliminar la expresión de genes de estructura viral y
reducir este efecto. Entre los ejemplos de dichos vectores se incluyen adenovirus sin genes virales (gutless), virus del herpes y
los virus asociados con adenovirus en los que todos los genes virales han sido suprimidos, lo que los vuelve dependientes de
otro virus colaborador para su replicación posterior. Algunas secuencias de plásmidos, en especial aquellas con dinucleótidos
CpG no metilados, pueden desencadenar una fuerte respuesta inmune celular y se han usado como adyuvantes en algunas
vacunas basadas en ADN. La amplificación de plásmidos en bacterias que expresan la metilasa CpG (M.Sssl), la eliminación de
secuencias CpG mediante mutagénesis dirigida y la eliminación de secuencias procarióticas innecesarias para crear plásmidos
mínimos han reducido la incidencia de respuestas celulares indeseadas. Una metodología no molecular para minimizar la res-
puesta celular contra el vector implica el uso de inmunosupresores (ciclosporina, sirolimus, dacluzumab) al momento de la ad-
ministración inicial del vector, además de los métodos parareducir la respuesta humoral (uso de vectors quiméricos, PEGila-
ción) descritos anteriormente.
ANTIGENICIDAD
DELPRODUCTODE TERAPIAGÉNICA
En muchos casos, el producto de terapia génica, los promotores asociados y los elementos mejoradores son antigénicos en
algunos blancos celulares. Cuando se utilizan proteínas que son retenidas en la célula blanco, las respuestas celulares pueden
eliminar la célula blanco. Si se necesita una expresión proteica sostenida, la respuesta inmune celular puede disminuir la efica-
cia de la terapia o abolirla por completo. En lo que respecta al tratamiento de enfermedades genéticas, los pacientes con mu-
tación nula que nunca han visto el producto transgénico, pueden presentar un mayor riesgo de respuesta inmune que los pa-
cientes que producen una proteína defectuosa Asimismo, truncar un gen, como el regulador de la conductancia transmembra-
na de la fibrosis quística (CFTR,por sus siglas en inglés) para alojarlo en un vector elegido puede resultar en la creación de un
antígeno distinto.
En otras aplicaciones, el producto transgénico es una proteína extraña, p. ej., timidina kinasa derivada del virus del herpes
simple (VHS)y que, por lo tanto, puede desencadenar una respuesta inmune. En algunos casos, éste es el efecto terapéutico
deseado, particularmente en la inmunoterapia antigénica contra el cáncer o una enfermedad viral. Los esfuerzos para minimi-
zar la respuesta inmune contra los elementos asociados con el casete transgénico incluyen el diseño de vectores con la capaci-
dad de realizar secuencias humanizadas de longitud completa para el transgén en cuestión, así como la administración de in-
munosupresores en la dosis inicial y en otros intervalos a lo largo del protocolo de tratamiento.
LOCALIZACIÓNDELVECTORDENTRODE LACÉLULABLANCO
Una vez que el vector llega a la célula blanco, varios factores pueden alterar la magnitud y la duración de la expresión génica
terapéutica; estos factores rigen la elección de un sistema apropiado de vectores para una indicación clínica específica. La loca-
lización del genoma del vector dentro de la célula, la fuerza de los elementos de control de la expresión génica, la estabilidad
del mensaje y la estabilidad de la proteína traducida influyen en el efecto terapéutico. Los vectores basados en Alfavirus, como
los que provienen del virus Sindbis o el virus del bosque Semliki, residen en el citoplasma y normalmente presentan un nivel
muy alto de expresión génica. Los vectores retrovirales, adenovirales o de otros virus otorgan ventajas en la administración
génica, con sus mecanismos naturales para la distribución nuclear del gen terapéutico y niveles razonables de expresión génica
a partir de promotores virales o de otro tipo. Los vectores plasmídicos no virales son episomales y, con frecuencia, susceptibles
a la degradación del ADN cuando se introducen en los endosomas celulares. Sin embargo, algunos sistemas no virales incorpo-
ran señales que los dirigen hacia el núcleo con el propósito de incrementar la eficiencia de la transcripción génica terapéutica.
EXPRESIÓNESPECÍFICA
DE TEJIDOS
Otra manera de controlar la expresión génica es la incorporación de promotores específicos de tejidos para estimular o limi-
tar la expresión del gen terapéutico. Lamentablemente, muchos promotores específicos para tejidos no proveen altos niveles
de expresión génica y la incorporación de estas secuencias en vectores virales puede resultar en la pérdida de especificidad o
en una expresión de bajo nivel en células que el promotor normalmente no expresa. Marcar el vector con secuencias reconoci-
das por el sistema de microARN también ha permitido la expresión específica de tejidos y puede ofrecer un control más estre-
cho que el comúnmente obtenido con sistemas de promotores específicos de tejidos.
En la actualidad, se usan promotores que responden a fármacos para controlar la expresión génica. Se han utilizado sistemas
de selección (tet-on) con rapamicina, mifepristona y tetraciclina para reprimir la expresión génica. Este tipo de regulación es
particularmente útil cuando la expresión constitutiva del transgén vector es tóxica.
IMPACTODELESTADODE REPLICACIÓNDELVECTOR
El estado de replicación es otra consideración importante para el diseño y la selección del vector. Los vectores virales suelen
construirse de modo que presenten una replicación incompetente o defectuosa para limitar su propagación descontrolada y su
patogenicidad. No obstante, la capacidad para replicarse y propagarse dentro de una población de células específica, p. ej.,
dentro de un tumor o en sitios metastáticos, puede significar una ventaja terapéutica importante sobre las células de tipo espe-
cífico blanco de vectores con replicación incompetente o defectuosa. La replicación se puede modificar mediante ingeniería
para condicionarla cuando, por ejemplo, interacciones específicas de genes virales se corresponden con los objetivos de la vía
intracelular por medio de supresiones dirigidas y/o cambios en el control de transcripción o translación. Cuando estas vías in-
tracelulares son defectuosas o están ausentes, como en las células cancerosas, el virus se puede replicar en ellas, pero cuando la
célula funciona normalmente, la replicación viral está reprimida. Entre los virus que han sido modificados por ingeniería genéti-
ca para replicación oncolítica selectiva se incluyen: adenovirus, VHS, vaccinia, virus de sarampión, picornavirus, virus de la in-
fluenza, virus Coxsackie y virus Sendai. Algunos virus que no se modifican genéticamente son inherentemente oncolíticos en
células humanas, p. ej., reovirus y el virus de la enfermedad de Newcastle.
Uno de los riesgos inherentes en el uso de vectores virales que se replican condicionalmente es que dichos sistemas pueden
presentar fugas, es decir, que el crecimiento del virus no se encuentra absolutamente restringido a un solo tipo de células.
Además, las rondas subsiguientes de viremia se vuelven aspectos a considerar durante la evaluación de la distribución/exposi-
ción y desprendimiento del tejido. La promisoridad terapéutica de estas metodologías depende de la confiabilidad con la que
se pueda seleccionar o modificar por ingeniería la condicionalidad de la replicación. Este potencial terapéutico podrá lograrse
únicamente si se equilibra con etapas para controlar los riesgos potenciales para pacientes (asociados con la competencia de la
replicación de los virus/vectores virales) y para tratar los problemas relacionados con el desprendimiento por exposición a ter-
ceros y las consideraciones ambientales.
Una contribución proactiva con el perfil de seguridad, y que al mismo tiempo toma ventaja de la información científica y
clínica actualmente disponible, consiste a menudo en usar como esqueleto del vector las cepas de virus que han sido usadas
para vacunas humanas. No obstante, debido a que el producto es competente para la replicación, presenta desafíos técnicos
específicos para el análisis de agentes adventicios y caracterización del producto.
Los vectores no virales normalmente se diseñan como sistemas no replicantes, pero algunos grupos están realizando experi-
mentos con plásmidos no virales replicantes para incrementar los niveles de expresión génica (debido a la baja eficacia de
transducción de la mayoría de los sistemas no virales) y para incrementar la duración de la expresión génica. Se necesitan más
estudios preclínicos para establecer la seguridad de estos sistemas. Asimismo, se han diseñado cromosomas artificiales para
aprovechar los mecanismos normales a fin de conservar la expresión génica en células blanco que se dividen rápidamente.
T
USP42 InformaciónGeneral/ (1047) Productosde TerapiaGénica 7521
INTEGRACIONDELVECTOR
La duración de la expresión génica también es una función de la persistencia del genoma del vector en células blanco. Los
vectores retrovirales pueden integrarse de manera estable al genoma de las células anfitrionas, lo que provee una expresión
prolongada. Los adenovirus y los vectores plasmídicos no virales, p. ej., aquellos que no se administran usando electropora-
ción, no se integran y la expresión por lo general decae con el tiempo. Los vectores de VAArecombinante por lo regular no se
integran, y cuando llegan a hacerlo, esto no ocurre en sitios específicos. Sin embargo, se han observado episomas estables en
algunos tipos de células, tales como células musculares.
La integración específica de sitio puede ser una característica deseable para vectores destinados a corregir trastornos genéti-
cos. El control del sitio de integración es conveniente para prevenir la mutagénesis por inserción, aunque en la actualidad, esto
no tiene la eficacia suficiente para ser considerado útil. La mutagénesis por inserción posee el potencial de matar una célula si
un gen de funcionamiento crítico se inactiva, o de predisponer la célula a una transformación maligna si un gen supresor de
tumores está inactivado. Los elementos promotores o mejoradores con vectores pueden conllevar la activación de oncogenes
celulares y se han asociado con la transformación maligna en niños que están siendo sometidos a transferencia génica retrovi-
ral para inmunodeficiencia combinada severa entrecruzada.
El éxito de cualquier producto de terapia génica depende de la relación entre el sistema de administración de vectores y los
requisitos de la enfermedad con respecto al sitio, nivel y duración de expresión génica terapéutica. En la actualidad resulta
improblable un vector universal, por lo que el desafío se centra en ajustar uno de varios vectores posibles a la enfermedad y al
gen que se va a administrar.
Estrategiasde Fabricacióny Purificación
CONSTRUCCIÓNDELVECTOR
Los vectores de transferencia de genes virales y no virales se construyen mediante protocolos estándar de biología molecular.
Para los vectores virales, el esqueleto del vector consiste en secuencias de ARN o ADN viral de las que se han suprimido las
regiones que codifican genes con estructura viral o las regiones para replicación. La región suprimida del vector por lo regular
se modifica con sitios específicos de endonucleasa de restricción que permiten la inserción del gen de interés. Para los vectores
no virales, el esqueleto del ADN plasmídico contiene múltiples sitios de restricción para clonación, así como los elementos bac-
teriales necesarios para producción de plásmidos. Los esqueletos de los vectores pueden albergar inserciones de genes únicas o
múltiples, según la cantidad máxima de secuencia que puedan llevar. El promotor que facilita la transcripción del gen inserta-
do puede ser un promotor viral relacionado, tal como una repetición terminal larga del virus de la leucemia murina (MuLV
LTR)o un promotor heterólogo que es específico del tejido, como el promotor alfa del cristalino (del ojo), o constitutivo, como
el promotor génico tardío de citomegalovirus (CMV). Por ejemplo, en una construcción de vectores retrovirales que contiene
dos insertos de genes, la transcripción de un inserto se regula a partir de la secuencia del promotor LTR5' y un segundo inser-
to de gen se puede ligar a un promotor heterólogo interno del virus simiano 40 (SV40).
El ADN complementario (ADNc) que contiene el gen terapéutico de interés, incluyendo sus intrones, se escinde de su fuen-
te usando enzimas de restricción y se inserta en el sitio de clonación múltiple del vector de transferencia de genes. La señal de
poliadenilación se puede extraer de múltiples fuentes, como el virus SV40 o el gen de la hormona de crecimiento humana. La
caracterización y las pruebas de vectores para terapia génica se describen en MétodosAnalíticos.
SISTEMASQUE COLABORANCON LAFUNCIÓN
A menudo, los vectores virales recombinantes se modifican para que tengan una replicación defectuosa, una condición crea-
da por supresión o modificación de los genes virales requeridos para la replicación y producción de virus infecciosos. Debido a
que a los vectores se les retiran algunos o todos los genes virales, se debe desarrollar un sistema para proveer proteínas virales
y para encapsular el vector en una partícula viral. Por lo general, esto se logra mediante dos métodos: transfección transitoria o
líneas celulares empaquetadoras estables.
En el método de transfección transitorio, se genera una serie de plásmidos diferentes, incluyendo un plásmido que contiene
el vector y otro vector que contiene los genes virales. Por ejemplo, los vectores retrovirales se pueden generar usando un siste-
ma de tres plásmidos: (1) el vector plasmídico que contenga el transgén; (2) un plásmido que contenga la región génica viral
gag/poi;y (3) un plásmido que contenga el virus con envoltura. Los trés plásmidos se transfectan a células, p. ej., HEK293 o
HTl 080, y los viriones que contienen vectores se recolectan después de dos o tres días. La separación del vector y de los genes
virales en plásmidos diferentes, junto con los diseños del vector que minimizan la homología entre el vector y las secuencias
virales, reducen la probabilidad de recombinación y regeneración de virus competente para la replicación. Se pueden emplear
metodologías similares para la mayoría de los sistemas de vectores virales.
El método de transfección transitoria tiene como ventaja un tiempo de producción rápida y la flexibilidad para cambiar los
componentes del vector o de las construcciones virales. No obstante, este método puede ser complejo al momento de am-
pliarlo para fabricación y se debe tener especial cuidado para obtener resultados de producción constantes. El uso de líneas
celulares empaquetadoras de vectores es un método alternativo. En este caso, los genes virales se introducen de manera esta-
7522 (1047) Productos de Terapia Génica / Información General USP42
ble en una línea celular inmortalizada que produce una expresión persistente de genes virales. Al igual que con la transfección
transitoria, los genes virales por lo general se expresan a partir de diferentes plásmidos para reducir el riesgo de recombina-
ción. Debido a que la integración de los plásmidos es poco frecuente, se requiere de tiempo y esfuerzo considerables para
aislar una línea celular empaquetadora con alto título y para generar un MCB. Las construcciones de vectores se pueden intro-
ducir a las células del MCB; asimismo, los investigadores pueden permitir el aislamiento de una línea celular estable que genere
el vector de interés analizando por la presencia de un don de alto título. Estas líneas celulares por lo general se expanden a
grandes números y a menudo producen vectores durante un periodo de hasta una semana a la vez, lo que facilita la amplia-
ción a escala del vector y la uniformidad del producto.
Los sistemas típicos que colaboran con la función son los siguientes:
Sistemas de Vectores Retrovirales-Las células empaquetadoras iniciales se basaban en la línea celular de fibroblasto muri-
no NIH 3T3. La línea celular PGl 3 (que expresa la envoltura del Virus de la Leucemia del Mono Gibbon) se ha usado amplia-
mente con una baja incidencia de eventos de recombinación que conllevan al VCR. En tiempos recientes, se han modificado
las líneas celulares humanas HEK293 y HTl 080 para servir como líneas celulares empaquetadoras para retrovirus. El uso de una
línea celular humana reduce la eliminación de partículas de vector por parte del sistema de complementos humanos (aunque
por lo general esto no representa una preocupación para vectores usados en protocolos ex vivo).
Sistemas de Vectores Adenovirales-Las células HEK293 se usan ampliamente para proveer la función El, necesaria para
replicación adenoviral eficaz que se suprime de los vectores adenovirales de primera generación. Asimismo, se han creado
otras lineas celulares complementarias, tales como las células A549 modificadas con El (carcinoma pulmonar humano) y la
línea celular PER.C6 (retinoblasto embrionario humano), para proveer El u otras funciones ausentes. La PER.C6 contiene la
región El bajo el control de un promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK, por sus siglas en inglés) y no posee secuencias ade-
novirales flanqueadas, a fin de eliminar la producción de adenovirus competentes para la replicación (ACR).
Sistemas de Vectores de VAA-Clásicamente, utilizan líneas celulares HEK293 infectadas por adenovirus, transitoriamente
transfectadas con plásmido colaborador de VAAque contiene los genes rep y cap necesarios para la replicación del VAAy la
formación de la cápside, respectivamente, y que son suprimidos del vector de VAA. En algunos sistemas de producción de
VAA,el adenovirus salvaje ha sido eliminado del proceso usando transfección triple de plásmidos que expresan genes tempra-
nos Ad, rep y cap, y el transgén del vector. La línea celular HeLa (del carcinoma cérvico uterino humano) también se ha em-
pleado como sistema de producción transitorio. En tiempos recientes, ambas líneas celulares han sido utilizadas para establecer
líneas celulares empaquetadoras transfectadas de manera estable que expresan los genes rep y cap y, en algunos casos, expre-
san las funciones adenovirales necesarias para la replicación del VAAcuando hay genes rep y cap (ARNde VA,El a, El b, E2a y
E4). También se han desarrollado sistemas de producción de VAAque usan VHS recombinante y Baculovirus.
Adenovirus Sin Genes Virales (Gutless)-Los sistemas de fabricación iniciales para el vector de adenovirus, también llama-
dos adenovirus sin genes virales (gutless) eran similares a los sistemas de fabricación de vector de VAA clásicos debido a que las
células HEK293 se transfectaban transitoriamente con plásmido colaborador que contenía las funciones adenovirales requeri-
das. El desarrollo de virus colaboradores que hospedan una señal de empaquetamiento flanqueada por sitios loxP y que com-
plementa a las líneas celulares HEK293 que expresan la recombinasa Cre del bacteriófago Pl de sitio específico ha mejorado de
sobremanera el rendimiento del virus sin genes virales. Esta tecnología reduce notoriamente la cantidad de contaminación de
virus colaborador previniendo el empaquetado del genoma del virus colaborador al tiempo que le permite replicarse y respal-
dar la replicación y encapsidación del vector sin genes virales.
VECTORESDE TERAPIAGÉNICAVIRAL
Los vectores retrovirales y adenovirales por lo regular han sido producidos a escala de laboratorio que no se ajusta a las BPF a
través de métodos de cultivo tradicionales para líneas celulares dependientes de suero y anclaje empleando matraces, bandejas
y frascos tipo roller. Inicialmente, los vectores de terapia génica se producían con estos métodos porque no se necesitaban
grandes volúmenes del producto para los primeros estudios clínicos. Los sistemas de bancos de células se emplean como fuen-
te de células y los bancos de virus, como fuente de virus para la producción clínica. En la mayoría de los casos, el sobrenadante
se recolecta, clarifica y se almacena congelado en bolsas a -70º. En muchos ensayos clínicos tempranos, el sobrenadante no
purificado ha sido usado para la transferencia génica ex vivo.
Se ha informado sobre métodos de producción en etapas iniciales a gran escala los cuales se usan comúnmente. Estos inclu-
yen métodos de cultivo en suspensión, en biorreactor y en lecho fijo o microtransportador. Algunos grupos han informado que
adaptan sus células de proceso a condiciones de cultivo sin suero. Las células se cosechan y lisan o se recolecta el sobrenadan-
te. La recolección se clarifica y purifica para eliminar los restos de células anfitrionas, el ADN de la célula anfitriona y demás
contaminantes derivados del proceso.
Tradicionalmente, los virus se purifican usando ultracentrifugación en gradiente, aunque esto demanda mucho tiempo y no
es adecuado para propósitos de producción a gran escala. La selección de pasos en procesos subsiguientes y su secuencia está
determinada por la naturaleza del virus en sí mismo y las etapas iniciales del proceso utilizado para fabricar el virus. Con el
desarrollo de procesos para la fabricación de vectores de terapia génica, se ha informado sobre una gran cantidad de etapas
diferentes de purificación, las cuales incluyen cromatografía de intercambio iónico y en celulosa sulfonada, cromatografía de
afinidad de iones cinc y cromatografía de exclusión por tamaño. Por lo regular, los tratamientos con ADNasa y otras nucleasas
se usan en el proceso a fin de reducir el ADN de la célula anfitriona o del plásmido. La producción de VAAy lentivirus se com-
plica por la necesidad de transfección o cotransfección transitoria del plásmido o del virus colaborador. En general, estos pro-
cesos han requerido líneas de células que necesitan anclaje, que son difíciles de producir a gran escala. El desarrollo de líneas
celulares transfectadas establemente permitiría la producción a gran escala.
MÉTODOSDE PURIFICACIÓN:VECTORESVIRALES
Retrovirus-A la fecha, la purificación de preparaciones de retrovirus para ensayos clínicos de la fase I ha sido mínima, es
decir, la concentración simple de sobrenadantes de cultivo es insuficiente para cumplir con las estrictas normas de calidad re-
queridas para terapia in vivo. Las técnicas de centrifugación y microfiltración son muy útiles para clarificar sobrenadantes de
cultivo y para eliminar desechos celulares. Asimismo, las técnicas de cromatografía de intercambio iónico, de exclusión por ta-
maño y de afinidad han sido empleadas para eliminar el exceso de sal, suero y contaminantes de bajo peso molecular también
concentrados con el virus.
Adenovirus-Los vectores adenovirales recombinantes a menudo se purificaban mediante ultracentrifugación de equilibrio
en un gradiente de densidad con cloruro de sodio. Este proceso aún se emplea para preparaciones de escala investigativa, aun-
que no es posible aumentar su escala ni es eficiente para cantidades más grandes de virus de grado clínico. Los métodos de
purificación más recientes que permiten aumentar la escala usan cromatografía de intercambio aniónico debido a la fuerte afi-
nidad de partículas de virus intactas para la resina con respecto a la de las proteínas de la cápside celular e individual. Las esti-
maciones de carga publicados para resinas de intercambio aniónico pueden variar entre 0,5 x 10 12 y 5 x 10 12 partículas de vi-
rus/ml de resina o entre O,14 mg de virus y 1,4 mg de virus/mL de resina. La filtración en gel y la cromatografía de afinidad de
metales inmovilizados a menudo se usan en las etapas de refinamiento siguiendo la purificación de intercambio aniónico de
productos derivados de adenovirus recombinantes.
Virus Asociados con Adenovirus-La toxicidad de cloruro de cesio, el agregado de partículas de VAA y el hecho de que el
adenovirus no se elimina por completo después de una extensa centrifugación complican la purificación de VAA mediante ul-
tracentrifugación de equilibrio en un gradiente de densidad con cloruro de cesio. Otro medio de separación de densidad, el
yodixanol, que es menos tóxico que el cloruro de cesio y que previene la agregación de VAA, se ha empleado en una sola
etapa de centrifugación. El pasaje de la fracción de VAA por una columna de afinidad que consiste en una matriz de soporte
heparinizada o en anticuerpos monoclonales producidos contra VAA2.aumentó en gran medida la pureza e infectividad de las
preparaciones finales. Estos métodos son apropiados únicamente para serotipos de VAA específicos. La cromatografía de inter-
cambio iónico es el método más potente y versátil de purificación de VAA, aunque la solución amortiguadora de pH, la con-
centración de detergente y el medio de la columna se deben ajustar para cada serotipo de VAA. La infectividad y pureza de las
preparaciones obtenidas de estas estrategias de purificación son comparables a las obtenidas por métodos cromatográficos de
afinidad y se completan en un periodo de tres horas.
PLÁSMIDOSO VECTORESNO VIRALES
Los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena circular que existen en bacterias, como moléculas extracromosómicas
autorreplicantes. Se han modificado para servir de sistemas de clonación, para contar con múltiples sitios de reconocimiento
por endonucleasas de restricción para la inserción del transgén clonado y para tener marcadores genéticos seleccionables para
identificar las células que portan el vector recombinante. Los vectores no virales basados en plásmidos se suelen utilizar como
sistemas de suministro de genes, tanto en terapias génicas in vivo como ex vivo. Estos vectores se encuentran en forma de
ADN desnudo o se complejan con lípidos u otros agentes que facilitan la transferencia a través de la membrana celular y el
transporte al núcleo de la célula sin degradación. Una ventaja del sistema de vector plasmídico es la producción eficiente de
grandes cantidades del vector que se caracteriza fácilmente y evita el riesgo de VCRasociado con muchos sistemas virales.
Los vectores no virales por lo regular se producen usando un sistema bacteriano de Escherichiacoli. Los plásmidos son trans-
fectados en E. coli y se selecciona y expande una colonia bacteriana única apropiada para crear un MCB. Después de volver a
seleccionar una colonia a partir de una placa bacteriana inoculada del MCB, se aísla el ADN del plásmido a partir de cultivos
cuyo tamaño varía entre 1 litro, a escala de laboratorio, y cientos de litros, en fermentadores bacterianos. El ADN plasmídico
puede ser purificado por varios métodos, como la cromatografía de afinidad o de intercambio iónico y los gradientes de densi-
dad de cloruro de cesio-bromuro de etidio. Estos últimos no se recomiendan para producir material de grado clínico.
PRODUCCIÓNY PROCESAMIENTO
DE VECTORESNO VIRALES
Un beneficio de los vectores no virales para la transferencia génica es que el proceso de producción es en realidad genérico y
se puede aplicar a cualquier preparación plasmídica independientemente de la composición o aplicación. Puesto que la dosis
humana promedio vigente de ADN plasmídico para transferencia génica y para vacunación es aproximadamente 1 mg, el de-
safío primario asociado con la producción de plásmidos a gran escala consiste en desarrollar un proceso económico y que se
pueda aumentar en escala. Por consiguiente, el desarrollo del proceso para vectores derivados de plásmidos permanece como
un área activa de investigación y desarrollo. Un proceso estándar de producción a gran escala de plásmidos de ADN recombi-
nante consta de las cinco operaciones unitarias siguientes.
Fermentación-Los procesos de fermentación deben respaldar el crecimiento de bacterias transformadas y maximizar la
cantidad de plásmido producido por cada célula. La E. co/i es la cepa más común empleada para la producción de plásmidos.
7524 (1047) Productos de Terapia Génica / Información General USP42
Los aminoácidos, nucleósidos y la relación entre el nitrógeno y carbono de los compuestos presentes en una formulación de
medio rico mejoran de gran manera el rendimiento de los plásmidos.
Recolección-Las células bacterianas se recolectan mediante centrifugación o microfiltración. La centrifugación en condi-
ciones que cumplan con las BPFpuede ser costosa, lo que hace de la microfiltración el método aceptado de recolección celu-
lar. Asimismo, la microfiltración permite eliminar los medios usados, los subproductos metabólicos, los desechos extracelulares
y las impurezas antes de la purificación.
Lisis-Las células bacterianas se deben lisar para liberar los plásmidos recombinantes. Éste es uno de los pasos más críticos
en el proceso de producción debido a que puede afectar significativamente la cantidad de formas de ADN usables [circular
cerrado en forma covalente (ccc, por sus siglas en inglés)] y no usable [cortado, parcialmente desnaturalizado y circular abierto
(oc, por sus siglas en inglés)] en una preparación. El método de lisismás usado para fabricación a escala clínica es el tratamien-
to con detergente alcalino y la precipitación de desechos celulares con acetato. Este método elimina una gran fracción de im-
purezas celulares generadas del lisado, al tiempo que incrementa la sensibilidad de los plásmidos para el mezclado y las con-
centraciones localizadas de detergente, las cuales son difíciles de manipular a gran escala. La lisis de células mediante exposi-
ción al calor tratan este problema y desnaturaliza de manera efectiva las proteínas celulares y el ADN bacteriano.
Asilamiento y Purificación-Algunos procesos incluyen etapas adicionales para eliminar desechos celulares y demás conta-
minantes derivados de los lisados bacterianos crudos mediante precipitación con detergentes, polietilenglicol o sal. Estos reac-
tivos afectan la estabilidad plasmídica y se eliminan mediante cromatografía en columna. La cromatografía de exclusión por
tamaño puede separar de manera eficaz el ADN plasmídico del ARN, proteínas y demás moléculas pequeñas presentes en el
lisado liberado. El grado de separación de ADN plasmídico de los contaminantes depende en gran medida del tipo y la con-
centración de sal en la solución amortiguadora de corrida. Las resinas usadas en la cromatografía de intercambio aniónico tie-
nen una alta afinidad para ADN plasmídico y proporcionan una concentración de muestra máxima. La cromatografía de inte-
racción hidrófoba y tiofílica aromática son los métodos preferidos para la separación selectiva de isoformas de ADN plasmídico
diferente y la reducción de endotoxina.
Preparación a Granel-Después de la purificación, el plásmido a granel se coloca en una solución amortiguadora adecua-
da y se formula mediante ultrafiltración usando una membrana con un tamaño de poro de 50-100 kDa.
Los plásmidos para uso clínico se deben someter a una caracterización de alto nivel. Se tiene amplio conocimiento de las
impurezas derivadas de las etapas de producción y procesamiento. Las pruebas necesarias para confirmar la identidad, pureza
y potencia de un producto derivado de plásmido están bien establecidas y se consideran de rutina. La Tabla4 resume estas
pruebas y la especificaciones vigentes establecidas por la FDAy la Organización Mundial de la Salud.
Tabla4
Nlvel
Aceptable del
Tipo de Ensayo Problemática Determinado mediante Producto Flnal
Contaminación cruzada con otros Digestión por restricción/electrofo-
Identidad productos resisen qel No disponible
ADN cromosómico bacteriano resi-
dual PCRen tiempo real <2 µg/mgADN
ARN residual HPLC analítica <0,2 µq/mq ADN
Ensayo BCA [(Valoración de proteí-
nas por el método de BCA ( ácido
Proteína bacteriana residual bicinconínico)] <3 µg/mgADN
Endotoxina Ensayo de LAL <1 O EU/mg ADN
Esterilidad Método descrito en el Título 21 del
(bacteriana y fúngica) CFR 610.12 Sin crecimiento
Solución transparente exenta de
Apariencia nspección visual
1 partículas
Fisiológico (7,0-7,4), pero puede
pH Medidor de pH ser específico del producto
Confirmación de plásmidos ( ccc vs
Pureza oc) HPLC o CGE >97% CCC
In vitro
ELISA
FACS
RT-PCR
Potencia Dosis declarada Absorbancia de luz (A,.n) Transgén/específico del plásmido
Introducción de Material Genético en Células-Células Modificadas Genéticamente
Una extensión común de la terapia celular implica la introducción de material genético, por lo general ADN, en células para
alterar su patrón de expresión génica. Aunque la discusión se centra en el ADN, el ARN o un derivado del ADN pueden ser
sometidos a procesos similares, excepto que la estabilidad y la solubilidad de cada ácido nucleico puede exigir la modificación
de ciertos pasos. El proceso general se suele denominar terapia génica ex vivo, ya que las células se extraen del paciente o del
donante y la introducción del material genético se lleva a cabo con las células fuera del cuerpo. A continuación, las células
modificadas genéticamente son administradas al paciente. El material genético introducido puede causar la expresión de nue-
vos genes y productos o inhibir la expresión de genes y productos ya expresados. Esta última posibilidad representa un tipo de
terapia antisentido. Este material genético se puede introducir con la misma variedad de reactivos implicados en la terapia gé-
nica: vectores virales, ácido nucleicos en una formulación simple (ADN desnudo) o ácidos nucleicos formulados con agentes
tales como liposomas que mejoran su capacidad de penetrar la célula. La mayoría de los pasos y consideraciones analizados se
aplican también a la introducción ex vivo de material genético en las células. El objetivo principal de la terapia ex vivo es desa-
rrollar procesos robustos que funcionen con la mayoría de las células de los pacientes o de los donantes, lo cual requiere de un
esfuerzo considerablemente mayor para las líneas celulares.
El método para introducir nuevo material genético en las células depende de la biología del sistema y la estabilidad deseada
de expresión génica. Si un vector retroviral simple, como por ejemplo el virus de la leucemia murina de Molony, se usa para la
transducción, las células deben estar en división activa, ya que el ADN del vector solo se integra al ADN celular durante la
replicación. Esto, habitualmente, conduce a una expresión prolongada del producto génico deseado. Los vectores adenovira-
les, el ADN desnudo o el ADN formulado se pueden introducir en las células que no están en división. No obstante, la expre-
sión génica será transitoria debido a que el ADN introducido por lo general será extracromosómico.
El desafío principal en la terapia génica ex vivo consiste en lograr una transducción o transfección eficiente, introduciendo
suficiente ADN en la célula antes de que se degrade el ADN. En el caso de la transducción por vectores retrovirales simples, las
células son estimuladas por reactivos que las colocan en la fase S (replicación) en el momento de aplicación del vector. En un
cultivo de células, la mayoría de los vectores retrovirales permanecen estables durante algunas horas. Dado que la difusión es
mínima, solo una pequeña fracción de partículas virales entra en contacto con las células durante este período. las siguientes
técnicas se pueden usar para incrementar el número de partículas virales que entran en contacto con la célula en un periodo
determinado:
1 . Maximización de la concentración de partículas virales y minimización del volumen de los medios durante la etapa de
transducción
2. Aplicaciones múltiples del virus
3. Centrifugación de partículas de virus en las células
4. Colocación de las células en un filtro y arrastre lento de los medios virales a través del filtro
5. Adición de polímeros que mejoran la unión a los medios. [NOTA-No se recomienda cocultivar las células blanco con el
productor viral. Esta técnica aumenta las posibilidades de recombinación y de producción de VCR.Asimismo, cualquier
producto para el que se utilice el cocultivo para transducir células humanas sería considerado un xenotrasplante si las cé-
lulas productoras no son de origen humano. El segundo tipo celular, ya sea humano o no, puede ocasionar inflamación.]
Cada una de estas técnicas tiene su propio conjunto de consideraciones que se deben tratar a fin de desarrollar un proceso
robusto. En la técnica 1, la reducción del volumen durante la transducción provoca un rápido agotamiento del medio, por lo
que debe agregarse medio suplementario pocas horas más tarde. En la técnica 2, las células pueden no estar ya en la fase
correcta del ciclo celular durante aplicaciones posteriores o pueden haberse tornado refractarias por transformación improduc-
tiva durante la aplicación anterior. Las técnicas 3 y 4 pueden funcionar bien en una escala muy pequeña, pero es posible que el
número de células que se puede transducir sea insuficiente para obtener una dosis eficaz. En la técnica 5, es posible que los
polímeros no provean ningún beneficio debido a que la unión del virus puede requerir de receptores específicos cuya densidad
superficial puede ser un factor limitante.
Consideraciones y técnicas similares pueden aplicarse a otras preparaciones de virus o de ADN. El problema de la difusión
lenta es aún más marcado en el caso de preparaciones de ADN. Factores como el tipo de célula donde se ha producido el
vector viral, los medios utilizados para la producción del vector y la pureza del vector pueden tener un efecto significativo so-
bre la eficacia de la transducción. Aunque algunos métodos pueden no requerir que las células se encuentren en ciclo activo,
en la práctica, la mayoría de los procesos requieren que las células sean capaces de replicación debido a las siguientes conside-
raciones:
1. las consideraciones de seguridad pueden instruir que solo las células que expresan el ADN nuevo sean devueltas al pa-
ciente, lo cual requiere la selección de estas células. Conforme a lo descrito anteriormente, el método de selección más
común emplea un gen resistente a los antibióticos que se cointroduce con el nuevo material genético.
2. Puede ser necesaria la propagación adicional para lograr la dosis terapéutica de células.
3. Las cuestiones económicas, biológicas o técnicas pueden dictar que la etapa de introducción del ADN se lleve a cabo a un
número celular bajo y que la población celular deseada se expanda a la dosis requerida.
Por lo tanto, para casi todos los casos, se deben desarrollar condiciones que permitan a la célula mantener su capacidad de
proliferación. La biología de las células, la tecnología disponible y la economía de procesos determinarán si las células se pro-
pagarán antes, después o durante la introducción del nuevo material genético. De hecho, la mayoría de los procesos expan-
den la población después de la introducción del nuevo gen.
La posible administración a pacientes de células que no expresan productivamente el gen depende de la biología de la apli-
cación, de la dosis requerida en comparación con la capacidad de manejo del sistema de fabricación y, principalmente, de la
toxicidad de la población de células no productivas. la selección de la población de células modificadas genéticamente, por lo
general, se lleva a cabo utilizando un gen marcador de resistencia a antibióticos, como la neomicina, que se introduce en la
célula junto con el material genético nuevo. Para la selección por neomicina, las células en cultivo se tratan con el antibiótico
G418, a una concentración y durante un período que han demostrado ser capaces de matar las células de expresión no pro-
~¡ 1
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ductiva, mientras permiten la proliferación de células de expresión productiva. De esta manera, se asume que las células que
son resistentes al antibiótico también expresan el ADN de interés. Esta expresión se debe analizar como un requisito de libera-
ción de lote o se debe verificar en una serie de simulacro de pruebas. Debido a que la mayoría de los antibióticos reducen la
proliferación celular, puede ser necesario optimizar la composición de los medios de cultivo para la selección y propagación
eficientes de las células modificadas genéticamente.
Después de la etapa de selección de antibióticos, puede ser necesaria una segunda fase de propagación celular exenta de
antibióticos a fin de lograr la dosis deseada y para enjuagar el G418 residual fuera del sistema. El medio seleccionado y el tiem-
po total que las células están en cultivo pueden ser críticos para mantener la expresión deseada de las funciones diferenciadas
originales. Otro problema relacionado con la selección de marcadores es que, generalmente, son genes no humanos. La expre-
sión de estos genes suele inducir una respuesta inmunitaria. El desarrollo del proceso suele realizarse con células de donantes
sanos. Es preciso tener en cuenta que en pacientes muy enfermos, puede ser difícil obtener células sanas que puedan ser esti-
muladas de modo que se repliquen en forma eficiente y sostenida.
La fabricación, el procesamiento celular y las cuestiones relacionadas con las pruebas analíticas relevantes para productos
derivados de células se analizan en el capítulo (1046}.
Formulación de Productos de Terapia Génica
Las formulaciones finales para productos de terapia génica aún se encuentran en etapas tempranas de desarrollo y, en la
actualidad, la mayoría de los vectores de transferencia génica se almacenan en solución a temperaturas ultra bajas. La formula-
ción exitosa de candidatos para transferencia génica se basa en un entendimiento cabal de las características fisicoquímicas y
biológicas únicas de cada sistema de vectores. Los factores tales como el pH de la solución, el contenido iónico y la osmolari-
dad influyen en la estabilidad térmica de los vectores virales y no virales. Los carbohidratos orgánicos tales como manitol, sor-
bitol, sacarosa y trehalosa han sido incorporados en las preparaciones para evitar la disrupción de la conformación nativa del
vector en solución, durante el proceso de congelación-descongelación y durante la liofilización. Los aminoácidos tales como
arginina y leucina han sido incorporados en formulaciones por sus efectos amortiguadores y para evitar la agregación. Los sur-
factantes tales como Tweens, Spans y Pluronics han demostrado ser efectivos para evitar la agregación, pero este efecto es
hasta cierto punto específico del vector debido a que algunos de los productos del vector se rompen fácilmente con estos
agentes. Asmismo, las proteínas de lípidos, de polímeros y extrañas (albúmina humana y gelatina) se han incorporado en mu-
chas preparaciones de vectores dada su capacidad para evitar la pérdida del vector derivada de la interacción directa con su-
perficies farmacéuticas y durante los ciclos de congelación-descongelación.
Antes de iniciar un programa formal de selección de formulaciones para un vector, se deben considerar los siguientes facto-
res.Se debe establecer la dosis requerida y/o la concentración de almacenamiento del producto final, así como los aspectos
específicos del sistema de envase y cierre y/o de administración. Además, se debe contar con métodos analíticos para evaluar
la potencia e identificar degradantes. Finalmente, deben definirse las expectativas de la formulación. Algunos criterios pragmá-
ticos para el diseño y la selección de formulaciones de vacunas para su uso a nivel mundial son: (a) el producto final debe
presentarse en una formulación que alcance una vida útil de 18 a 36 meses cuando se almacena a una temperatura de 2º -8º o
mayor, (b) la formulación debe tener un perfil de estabilidad aceptable a temperatura ambiente que cubra el almacenamiento
a corto plazo y el transporte en el campo, (c) debe proteger adecuadamente al vector de daños durante el ciclo de congela-
ción-descongelación y (d) debe constar de reactivos que sean farmacéuticamente aceptables y dentro de las concentraciones
fisiológicamente aceptables. Los cambios en la formulación durante el desarrollo clínico se deben respaldar con estudios preclí-
nicos y con datos de estabilidad. Para esto, se debe invertir tiempo suficiente para generar planes para cumplir con este requi-
sito.
A la fecha, es poco el trabajo descrito en el área de desarrollo de formulaciones de vectores retrovirales con aditivos aproba-
dos para uso humano. El esfuerzo más significativo para desarrollar formulaciones estables para transferencia génica se ha da-
do con adenovirus recombinantes. En los últimos tiempos, la identificación de mecanismos mediante los cuales los adenovirus
recombinantes se degradan en solución ha llevado al desarrollo de diversas formulaciones líquidas que estabilizan el virus por
un periodo de hasta 18 meses a 4°. Los virus asociados con adenovirus se consideran como uno de los vectores virales más
estables. Se ha documentado que este virus permanece estable durante aproximadamente 4 meses en solución salina amorti-
guada con fosfatos a 4º. La adición de crioprotectores y surfactantes previene la agregación de partículas de virus y extiende la
vida útil a un año. Asimismo, se han descrito formulaciones liofilizadas de ambos adenovirus y del VM con vidas útiles de siete
años a temperatura ambiente. Aunque se ha demostrado que los vectores no virales son generalmente robustos en soluciones
amortiguadoras estándar a 4º, su estabilidad se puede ver ampliamente influenciada por componentes extraños incluidos para
promover la dirección hacia el gen. Se debe considerar la naturaleza de dichos componentes al momento de desarrollar proto-
colos y estrategias de estabilidad (ver más adelante).
PREPARACIÓN
Y ADMINISTRACIÓIN
N SITU
Pueden ser necesarias una o más modificaciones del producto o etapas preparativas antes de la administración del producto
de terapia génica al paciente. Estas modificaciones o etapas a menudo se realizan cerca del momento de la administración y,
por lo tanto, se llevan a cabo en condiciones que quedan fuera del control del fabricante original. La naturaleza de estas modi-
ficaciones depende en gran medida de las características del producto en relación con una aplicación particular. Estas incluyen
USP42 InformaciónGeneral/ (1047) Productosde TerapiaGénica 7527
la descongelación, el lavado o la filtración para eliminar materiales indeseados relacionados con la fabricación del producto e
incluyen además el espacio físico definido con controles ambientales apropiados, personal capacitado, procedimientos operati-
vos estándar detallados y un programa de calidad integral.
La naturaleza única e irreemplazable de muchos productos de terapia génica, p. ej., células modificadas genéticamente, mu-
chos de los cuales se han originado de una fuente tisular autóloga o alogénica seleccionada, genera consideraciones especiales
para fabricación, liberación y administración del producto. Las cuestiones relacionadas con la administración de productos de-
rivados de células se tratan a detalle en el capítulo (1046).
PreparaciónIn Situ
MANIPULACIÓNDELPRODUCTO
Antes de la administración, la preparación in situ del producto de terapia génica puede requerir de una o más manipulacio-
nes, incluidas las siguientes:
• Cambio en el envase final-El producto fabricado puede haber sido almacenado o transportado en un envase pero pue-
de ser necesario transferirlo a un envase distinto para su administración.
• Cambio en el estado físico o la temperatura-Puede ser necesario descongelar un producto o entibiarlo del estado refri-
gerado.
• Cambio en la solución o suspensión-Puede ser necesario disolver, diluir o suspender un producto en un líquido.
• Adición a un material estructural biocompatible-Puede ser necesario combinar un producto de terapia génica con
una matriz o tejido estructural vivo, natural o sintético. Entre los ejemplos de material para matriz se incluyen fibras hue-
cas, láminas fibrosas, geles, tapones, cápsulas, esponjas o gránulos.
• Mezcla o preparación magistral con otros materiales no estructurales-Puede ser necesario mezclar o preparar magis-
tralmente un producto con fármacos, citoquinas, productos biológicos u otros materiales no estructurales.
• Filtración o lavado-Los materiales no deseados en el producto fabricado tales como partículas, desechos celulares, me-
tabolitos o compuestos remanentes de manipulaciones previas pueden requerir de etapas de lavado o filtración.
• Muestreo-Puede ser necesario el muestreo del producto final inmediatamente antes de la administración para algunos
protocolos clínicos.
REQUISITOSDE LASINSTALACIONES
Los requisitos de las instalaciones donde se llevan a cabo los procedimientos de preparación in situ o la administración de
productos de terapia génica dependen de la naturaleza de los productos, sus aplicaciones y las manipulaciones necesarias. El
principal determinante de las características de las instalaciones es el grado de riesgo de contaminación microbiana relaciona-
do con cada paso. La definición de condiciones de alto y bajo riesgo se puede establecer tomando en cuenta un marco similar
al definido para Preparaciones Magistrales Estériles de Nivel de Riesgo Bajo (PMEs)y PMEs de Nivel de Riesgo Alto en la sección
Nivelesde Riesgode ContaminaciónMicrobianaen las PMEdel capítulo PreparaciónMagistral-PreparacionesEstériles (797).
LIBERACIÓN
DELPRODUCTOFINAL
Los productos de terapia génica que se someten a etapas de preparación o manipulaciones in situ deben estar sujetas a veri-
ficaciones o pruebas adecuadas para asegurarse de que cumplan con las especificaciones de calidad antes de ser liberados para
su administración a pacientes. La naturaleza y el grado de las manipulaciones determinarán si deben agregarse requisitos de
liberación o especificaciones fundamentales a los ya exigidos inmediatamente después de la fabricación inicial. Los requisitos
previos a la liberación incluyen:
1 . La inspección física del producto, que, por lo general, incluye medidas para garantizar que el producto tenga el aspecto
adecuado en cuanto a color, turbidez, partículas o materia extraña, integridad del envase, temperatura del producto y
etiquetado apropiado y exacto;
2. Revisión de los registros de los procesos
3. Para productos específicos para un solo paciente, inspección administrativa del etiquetado del producto o de los registros
relativos a la identidad del receptor previsto
Además, los productos considerados como productos de alto riesgo de acuerdo con la descripción del capítulo (797) deben
someterse a análisis de producto adicionales. Para todos los productos de alto riesgo, se deben definir y efectuar ensayos de
calidad que contemplen la identidad, la potencia y la pureza de los principios activos. Los productos de alto riesgo en la cate-
goría II se deben someter a pruebas de esterilidad y de endotoxinas.
Administración a Pacientes
REQUISITOSPREVIOSA LAADMINISTRACIÓN
Dependiendo de la aplicación de terapia génica específica, el personal capacitado para el cuidado del paciente debe com-
pletar etapas para preparar al paciente para la administración del producto. El objetivo de estos pasos es asegurar que el pro-
ducto origine el resultado terapéutico previsto y minimizar el riesgo de efectos adversos. Los aspectos pertinentes a la adminis-
tración de productos derivados de células se tratan en el capítulo (1046). Por lo general, se debe llevar a cabo una reevalua-
ción extensa de la condición general del paciente y de su aptitud para la terapia cerca del momento de la administración del
producto. Por lo general, esta evaluación incluye el historial clínico del paciente, una exploración física y estudios de laborato-
rio tales como hemogramas y analítica. Además, el personal puede obtener mediciones funcionales y físicas basales, análisis de
laboratorio o estudios de diagnóstico por imágenes correspondientes a la aplicación específica. Algunos ejemplos de estos es-
tudios son las evaluaciones de la función pulmonar para un tratamiento destinado a mejorarla, la medición de los niveles en
sangre de una enzima que es el producto génico en una aplicación de terapia génica y el diagnóstico por imágenes de reso-
nancia magnética previo a las terapias contra el cáncer.
Pueden ser necesarias diversas intervenciones al paciente relacionadas con la vía de administración antes de la administra-
ción del producto. Para terapias que requieren de administración intravenosa, puede ser necesario colocar un catéter venoso
central a pacientes con acceso venoso deficiente. Para aplicaciones en las que se implantan en el paciente células modificadas
genéticamente o matrices combinadas con células, puede ser necesario preparar el sitio del implante en la sala de operaciones,
lo cual puede requerir de un acceso quirúrgico al sitio, eliminando tejido degenerado o dañado, cortando el tejido adyacente
para acomodar el implante y eliminando el tejido de un sitio secundario que se usará para sujetar o sostener el implante. Por
ejemplo, si se implantan productos para la cicatrización de heridas, es fundamental que el sitio para el injerto no esté infectado
y que el lecho de la herida esté bien preparado. Cuando las células modificadas genéticamente están destinadas a corregir
defectos del cartílago, se debe preparar el sitio dañado de manera que las células se puedan aplicar en un compartimiento
impermeable al agua. Para aplicaciones que implican la administración directa del producto a un sistema orgánico (por ejem-
plo, el sistema broncoalveolar) o red vascular (por ejemplo, las arterias coronarias), puede ser necesario acceder al sitio me-
diante endoscopia o cirugía.
Además de estos pasos, siempre se debe evaluar cuidadosamente la necesidad de anestesia y medicación previa adecuadas
antes de administrar el producto. El examen del paciente antes de la administración también debe evaluar los tratamientos
concomitantes que puedan interactuar con el producto de terapia génica y modificar sus efectos. Algunos tratamientos pue-
den considerarse auxiliares de la terapia génica, como las citoquinas que promueven la proliferación o la diferenciación del
tejido infundido o implantado. Se deben analizar otros fármacos frecuentes, como antibióticos, agentes antineoplásicos, anti-
coagulantes y antiinflamatorios, y determinar sus posibles efectos sobre la eficacia del producto de terapia génica.
TRATAMIENTO
DELPACIENTE
Algunos productos de terapia génica son específicos para el paciente debido a que se fabrican a partir de una fuente tisular
seleccionada, como tejido autólogo, alógeno seleccionado o xenógeno. Ciertos productos específicos del paciente tienen un
potencial definido para el beneficio o daño por inmunorreactividad. Se deben establecer sistemas para impedir la administra-
ción de un producto de este tipo al paciente equivocado. Los sistemas recomendados incluyen procesos similares a los emplea-
dos para administrar productos sanguíneos humanos, y dos personas, por lo menos, deben dedicar especial atención a la iden-
tificación correcta del paciente y al producto específico para el paciente inmediatamente antes de la administración. Estas
cuestiones se tratan a detalle en el capítulo (1046). Los productos de terapia génica se pueden administrar mediante diversas
rutas, las cuales incluyen inyección parenteral, inhalación y vías gastrointestinales. Otras posibilidades son su aplicación directa
en la vasculatura regional, órganos, tejidos o cavidades corporales mediante agujas o catéteres o bien después de la exposición
quirúrgica del tejido. Aunque la administración parenteral se puede llevar a cabo en instalaciones habituales para pacientes
ambulatorios o internos, las otras vías pueden exigir lugares especializados, como una sala de operaciones o sala de endosco-
pia asépticas. En todos los casos, deben existir procedimientos operativos estándar y un programa de calidad para garantizar
que el producto se administre de la manera prevista.
MONITOREODELPACIENTEPOSTERIORA LAADMINISTRACIÓN
Se debe contar con políticas y procedimientos escritos para monitorear la evolución de los pacientes y manejar los informes
de efectos adversos. El examen de evolución del paciente debe incluir indicadores capaces de detectar errores o problemas
relacionados con todo el proceso de fabricación, con especial atención a la manipulación, almacenamiento o transporte des-
pués de la fabricación inicial del producto. La gestión de las reacciones adversas debe incorporar procedimientos para asegurar
el examen médico rápido y el tratamiento de pacientes con posibles efectos adversos, así como un sistema para informar y
evaluar los efectos adversos que puedan señalar un posible defecto en el producto administrado. Los procedimientos de infor-
me incluyen suministrar detalles requeridos para los programas de informe de eventos adversos federales, estatales o de USP.
Se deben implementar procedimientos de seguimiento y monitoreo para pacientes que han recibido vectores de terapia gé-
nica o terapias génicas ex vivo. Siempre que sea relevante y posible de evaluar, se deben controlar la distribución biológica y
persistencia in vivo de vectores o células modificadas genéticamente. Cuando los vectores se administran directamente, la lo-
calización en la línea germinal puede ser un problema. Si bien es posible recurrir a estudios preclínicos para abordar este pro-
blema, se puede obtener información útil mediante el seguimiento del paciente. Cuando se administra un vector retroviral, se
debe controlar a los pacientes para detectar si los retrovirus son competentes para la replicación (RCR, por sus siglas en inglés),
de acuerdo con el documento Guidancefor Jndustry:SupplementalGuidanceon Testingfor ReplicationCompetentRetrovirusin
RetroviralVector-Based Gene TherapyProductsand During Follow-upof Patientsin Clinical Tria/sUsing Retrovira/Vectors(Guía para
la Industria: Guía Complementaria de Pruebas para Retrovirus Competentes para la Replicación en Productos de Terapia Géni-
ca Basada en Vectores Retrovirales y Durante el Seguimiento de Pacientes en Estudios Clínicos con Vectores Retrovirales) de la
FDA(octubre de 2000). Lo anterior implica el monitoreo activo durante el primer año y posteriormente archivar las muestras
del paciente si no se detectan RCR.
Los sistemas de bases de datos para cotejar y rastrear los resultados de monitoreo del paciente son esenciales para gestionar
esta información. Los registros nacionales o los datos publicados deben tomarse en cuenta para establecer la seguridad colecti-
va de la terapia génica.
MÉTODOSANALÍTICOS
La complejidad y el alcance de los productos de terapia génica se reflejan en la amplia variedad de procedimientos analíticos
y sus métodos, los cuales se emplean para evaluar la calidad del producto. Los productos de terapia génica aprobados deben
cumplir con las secciones correspondientes del Título 21 del CFR211 y 61 O para garantizar su identidad, dosis, potencia, pure-
za y seguridad. La guía específica para la identificación, el desarrollo y la validación de metodologías analíticas para respaldar la
caracterización de bancos de células y virus, la liberación del producto final y los estudios de estabilidad actualmente se provee
en las pautas de la FDApara fabricación y análisis de productos de terapia génica (ver el Apéndice);en Validaciónde Procedi-
mientos Farmacopeicos (1225); y las pautas Q2(Rl) y Q6B de la ICH. La mayoría de los métodos analíticos específicos para pro-
ductos de terapia génica no han sido estandarizados. Incluso pruebas bien definidas, como las descritas en Pruebasde Esterili-
dad (71 ), pueden no ser aplicables directamente a ciertos productos de terapia génica. Es posible que no se disponga de gran-
des cantidades de material clínico durante el desarrollo clínico inicial de algunos de estos productos. Algunas de las pruebas
requeridas (p.ej. esterilidad) pueden requerir de modificaciones. Se recomienda consultar con las autoridades reglamentarias.
La Tabla5 ofrece una visión general de los parámetros de prueba para productos específicos para los componentes biológi-
cos y métodos o enfoques generales usados para cumplir con los requisitos de las pruebas para productos de terapia génica
celular modificados genéticamente, virales y no virales. El análisis de productos de terapia génica se basa, en gran medida, en
valoraciones biológicas, pero también se recurre a metodologías desarrolladas para productos obtenidos por biotecnología. El
objetivo de esta sección es reseñar los tipos de métodos y sus aplicaciones específicas respecto de las pruebas de caracteriza-
ción, estabilidad y liberación de productos. La validación del proceso puede reducir la necesidad de ciertas pruebas específicas
de liberación de lotes. El desarrollo del producto debe incluir la creación de materiales de referencia adecuados y estándares
para productos de terapia génica celular modificados genéticamente, virales y no virales. Los materiales de referencia deben
estar bien caracterizados con el fin de proporcionar continuidad entre los estándares a lo largo del tiempo. En los productos de
terapia celular y génica modificados genéticamente, el material de referencia puede ser un tejido sustituto o producto simula-
do. Los materiales de referencia se tratan brevemente en la Guidancefor lndustry: PotencyTestsfor Cellularand GeneTherapy
Products(Guía para la Industria: Pruebas de Potencia Para Productos de Terapia Celular y Génica) de la FDA.
Los productos de terapia génica celular modificados genéticamente, virales y no virales pueden requerir de un método de
liberación rápida cuando presentan una vida útil limitada (ver ProductosDerivadosde Célulasy Tejidos(1046)). Este método no
suele aplicarse a productos de terapia génica viral y no viral, porque son suficientemente estables para completar las pruebas
antes de su liberación. Algunos productos de terapia génica no virales también tienen vidas útiles limitadas. En estos casos, se
analizan los componentes individuales antes de la liberación y no se analiza el complejo formulado. La formación y estabilidad
del complejo de terapia génica no viral formulado se establece mediante estudios de validación durante el desarrollo del pro-
ducto.
Según se especifica en el CFR,se deben conservar muestras de productos después de completar las pruebas de liberación de
producto. Si se emplean estrategias de liberación rápida, se deben conservar muestras adicionales para poder reevaluar la cali-
dad del producto con metodologías de prueba alternativas o tradicionales, si fuera necesario.
1:a bla 5 Prue bas Ana I',t 1cas para Pro ductos BI01oq1
I' 1cos de Terapia Genlca y Celular
Producto de Terapia Génica o Celular Genétl- Productos de Terapia Génica
Prueba camente Modificado Viral No viral
-Mapeo por enzimas de
• Determinación del marcador de superficie restricción
• Especies -PCR -Mapeo por enzimas de restricción
Identidad de la • Morfología -lnmunoensayo para gen -PCR
Sustancia • Valoración Biológica expresado -lnmunoensayo para gen expresado
Biolóqica • Marcador Bioquímico -Secuenciación -Secuenciación
Tabla 5. Pruebas Analítlcas para Productos Blo16qlcos de Terapia Génica v Celular (Continuación)
Producto de Terapia Génica o Celular Genétl- Productos de Terapia Génica
Prueba camente Modificado Viral Novlral
-Número de partículas
-Unidades de transduc-
ción (ensayo de híbrida-
ción de ADN) -Peso del ADN plasmídico
• Número de células viables -Proteína total -Valoración por HPLCo electroforesis ca-
• Enumeración de la población celular específica -Ensayo por HPLCusan- pilar para determinar el peso del complejo
•ADN total do estándares de referen- formulado usando estándares de referencia
Dosis • Proteína total cia autentificados autentificados
• Número de células viables (células destinadas a re-
paración estructural)
• Valoraciones biológicas
- Ensayo de formación de colonias
- Función del gen expresado
-Inducción de efecto secundario (p. ej., inducción -Función del gen expresa-
del antígeno de leucocito humano (HLA,por sus sig- do (inducción de efecto -Función del gen expresado (inducción de
las en inglés), secreción de citoquinas y regulación secundario y otras valora- efecto secundario y otras valoraciones bio-
Potencia del marcador de superficie) dones biológicas) lógicas)
-ADN residual de células
anfitrionas
-Contaminantes del pro-
ceso (p. ej., suero y cloru-
ro de cesio)
-Virus colaborador resi-
dual
-Cociente de densidad -Porcentaje de forma física específica (p.
óptica ej., porcentaje de superenrollado)
-Proteínas residuales de -ADN residual de células anfitrionas
células anfitrionas -ARN residual
• Porcentaje de células viables -Perfil de proteínas vira- -Proteínas residuales de células anfitrionas
• Porcentaje de células transducidas les (valoración por HPLC -Disolventes residuales
• Porcentaje de células con marcadores de superficie para partículas defectuo- -Cociente de densidad óptica
específicos sas o inmaduras) -Contaminantes del proceso (p. ej., cloru-
Pureza • Contaminantes del proceso (p. ej., suero) -ARN residual ro de cesio)
• Micoplasma
• Esterilidad -Seguridad general
• Pirógenos y endotoxinas -Esterilidad
• Virus adventicios -Pirógenos y endotoxinas -Micoplasma
• Virus residuales -Virus adventicios -Esterilidad
Seguridad • Vector competente para la replicación -VCR -Piróaenos y endotoxinas
Aspectossobre el Muestreo
El muestreo para las pruebas de liberación de lote se debe basar en la potencial distribución para el parámetro analizado. Ver
Desarrollodel Protocolode Estabilidaden Estabilidad(más adelante) para consideraciones adicionales. Se deben conservar mues-
tras de cada lote ante la posibilidad de que surjan problemas de seguridad o calidad con un lote. Aunque la vida útil del pro-
ducto sea muy breve, se pueden utilizar estas muestras conservadas para detectar impurezas y otras sustancias. Se resalta la
necesidad de un buen diseño del esquema de obtención de muestras en la prueba de seguridad de agentes adventicios o en la
evaluación de VCRpara productos de terapia génica celular o viral modificados genéticamente. En estos casos, la validación
del proceso ayuda a determinar el diseño apropiado de muestreo estadísticamente fundamentado.
Seguridad
Las pruebas de seguridad para productos de terapia génica tienen tres objetivos: (1) detectar contaminación por agentes
adventicios durante el procesamiento del producto, (2) prevenir el uso de líneas celulares empaquetadoras y plásmidos que
podrían permitir la recombinación genética entre vectores y las líneas celulares empaquetadoras o plásmidos-o entre los mis-
mos vectores y (3) analizar el producto final para asegurar un nivel seguro de variantes genéticas y/o estructurales indeseadas
u otros virus usados en el procesamiento.
Las medidas primarias para evaluar la seguridad son la realización de ensayos biológicos para medir agentes adventicios di-
rectamente. También se utilizan valoraciones con técnicas de biología molecular para medir ADN o ARN de agentes adventi-
cios o para detectar variantes genéticas no deseadas. Aunque los vectores vivos modificados genéticamente por ingeniería es-
tán oficialmente fuera de su alcance, se debe consultar la información detallada disponible en la pauta Q5A de la ICH, presen-
tada en el capítulo (1050), puesto que los principios son aplicables.
PRODUCTOSDE TERAPIAGÉNICAVIRAL
Una de las cuestiones primarias de seguridad relacionada con vectores virales usados para terapia génica es la aparición de
variantes genéticas no deseadas, de las cuales, el tipo más crítico y probablemente mejor estudiado, es el VCR. El VCRestá
definido de manera más clara para vectores virales incompetentes para la replicación, pero para virus condicionalmente com-
petentes para la replicación se refiere a variantes genéticas no deseadas que han perdido selectividad hacia las células blanco,
generando así inquietudes sobre la seguridad. Independientemente del virus, estos problemas se fundan en que no siempre es
posible prever la patogenicidad de un virus contaminante para una vía específica de administración, en especial si no es la vía
habitual de infección o si los seres humanos no son el anfitrión natural para el virus. Se conoce la patogenia de la infección por
adenovirus salvaje, pero no siempre es útil para predecir la patogenia por las vías de administración de vectores adenovirales
recombinantes. En la actualidad, para vectores adenovirales incompetentes para la replicación, se considera aceptable un lími-
te de un ACRpor 3 x 10 10 partículas virales (ver el documento Guidancefor FDAReviewersand Sponsors:Content and Reviewof
Chemistry,Manufacturing, and Control (CMC) Jnformationfor Human Gene Therapy/nvestigationalNew Drug Applications(INDs)
(Guía para Revisores y Auspiciadores de la FDA:Contenido y Revisión de Información Química, de Fabricación y Control (CMC)
para Nuevas Aplicaciones Farmacológicas lnvestigativas (IND) de Terapia Génica en Humanos].
Por lo regular, los niveles de ACRse determinan mediante un ensayo basado en células que permite amplificar el ACRal
tiempo que evita la replicación del producto. La línea celular que se usa más a menudo para amplificar y detectar ACRes la
A549. Sin embargo, algunos vectores adenovirales recombinantes expresan genes terapéuticos que interfieren en el análisis
con células A549. En tales casos, se usan líneas bicelulares basadas en valoraciones biológicas. la primera línea de células se
selecciona basándose en la resitencia a los efectos de expresión del transgén y con pasaje subsiguiente de lisado celular o so-
brenadante sobre células A549 para amplificación y detección del ACR. El ACRa menudo se detecta mediante observación
visual del efectos citopático, pero también se puede detectar en el cultivo de células A549 por métodos inmunológicos o basa-
dos en PCR.
La cuantificación del nivel de ACRse basa en la cantidad de muestra analizada y el límite de detección de la valoración. Por
lo general, las valoraciones biológicas de ACRse validan como capaces de detectar 1 unidad formadora de placa o unidad
infecciosa de ACRen la muestra de prueba en una amplia gama de tamaños de muestras de prueba. los tamaños de muestras
de prueba pueden variar, pero por lo regular se basan en el límite de aceptación para ACR de la FDA. Para verificar los límites
de detección, se deben incluir como parte de la prueba controles con cantidades agregadas conocidas, incluso con valoracio-
nes validadas. Para adenovirus recombinantes producidos con células HEK293, la detección de ACR por PCR en los productos
finales o la progenie de un virus amplificada en las células HEK293 puede alterarse por la detección de ADN residual de células
anfitrionas HEK293 (detección de la región El). Sin embargo, las valoraciones por PCR se pueden diseñar para cuantificar espe-
cíficamente la contaminación del ADN de células anfitrionas y hacerlas específicas para formas particulares de ACR de creci-
miento lento. las ensayos cuantitativos por PCR se pueden utilizar junto con un método basado en células para cuantificar los
ACRde manera precisa. Cuando se detecta una muestra de prueba positiva, la identidad del ACR suele confirmarse mediante
un análisis por PCR. lo anterior descarta la posibilidad de que la contaminación del ensayo con adenovirus salvajes exógenos u
otros agentes adventicios sea responsable del resultado positivo.
Para adenovirus condicionalmente competentes para la replicación u otros vectores virales competentes para la replicación,
el análisis de VCRo variantes genéticas indeseadas a menudo es más complicado y específico del vector. Por lo general, una o
dos líneas celulares no permisivas que no son células blanco se infectan con el virus competente para la replicación con la in-
tención de producir la progenie del virus. Para poder generar una cantidad suficiente de población de progenie para su análi-
sis, los analistas someten a la infección a múltiples pasajes y a un tiempo de cultivo prolongado. Se han usado dos líneas celu-
lares de fibroblastos normales fáciles de cultivar, la Wl-38 y la MRC-5, como el modelo de líneas celulares no permisivas para
detectar ACR en productos de adenovirus competentes para la replicación. Incluso después de múltiples pasajes en las líneas
celulares no permisivas, puede ser necesario amplificar la progenie (la cual tiende a presentarse en cantidades diminutas) en
líneas celulares permisivas o empaquetadoras hasta una cantidad suficiente para análisis subsiguiente. La progenie resultante
debe analizarse para determinar cambios en la selectividad biológica y en la composición genética. Por lo regular, la caracteri-
zación genética de la población de progenie incluye el mapeo por enzimas de restricción seguido de transferencia Southern
(blotting), PCR o secuenciación de nucleótidos. Después de identificar los elementos genéticos exclusivos del VCRo las varia-
ciones genéticas indeseadas, se pueden diseñar ensayos cuantitativos por PCR para monitorear el nivel de VCRdespués de la
amplificación en líneas de células no permisivas o, en ocasiones, si la sensibilidad es adecuada, directamente en el producto
final sin amplificación biológica. Se recomienda el uso de un control de cantidades agregadas conocidas en la valoración bioló-
gica para detectar VCR, aunque puede no ser aplicable a todos los casos. En la actualidad no existe un límite aceptable especi-
ficado de ARC para adenovirus condicionalmente competentes para la replicación, aunque se ha informado sobre la seguridad
clínica para una aplicación oncológica con varios miles de ACRpor dosis.
Para vectores retrovirales, es necesario el análisis de RCRpara bancos de células, lotes de producción de vectores virales y
cualquier lote de producto resultante ex vivo (ver Guidancefor Jndustry:SupplementalGuidanceon Testingfor Replication-Com-
petent Retrovirusin Retrovira/Vector-BasedGeneTherapyProductsand During Follow-upof Patientsin Clínica/TrialsUsingRetroviral
Vectors[Guía para la Industria: Guía Complementaria de Pruebas para Retrovirus Competentes para la Replicación en Produc-
tos de Terapia Génica Basada en Vectores Retrovirales y Durante el Seguimiento de Pacientes en Estudios Clínicos con Vectores
Retrovirales] de la FDA). Se han diseñado valoraciones estándar para detectar VLMcompetente para la replicación. Se descono-
ce la patogenia y la potencial toxicidad a largo plazo del VLManfotrópico de bajo nivel en seres humanos. Los métodos habi-
tuales para detectar RCRincluyen una amplificación del título viral aplicando el producto a una línea celular que puede repli-
carse, como Mus dunni. Debido a que la infección se ve limitada por la capacidad de un virus de llegar a las células mediante
movimiento browniano, se pueden usar procedimientos (p. ej., centrifugación y filtración) que físicamente ponen en contacto
al virus con las células a fin de mejorar la detección. Sin embargo, el vector recombinante de título alto puede interferir con la
detección de RCRde bajo nivel, y dichos métodos pueden aumentar esta interferencia. Las células infectadas se someten a
varios pasajes para permitir la replicación viral. El medio de cultivo se cosecha al final del período de cultivo y se detecta RCR
mediante una línea celular indicadora. Si el producto es un VLManfotrópico, se puede hallar RCRcon un ensayo de PG4 S+L-
basado en células felinas, un ensayo MiCI S+L- basado en células de visón o un ensayo de rescate con marcadores. En los ensa-
yos S+L-, el RCRexpresa proteínas que conducen a la transformación y la posterior formación de placas en la monocapa. En
un ensayo de rescate con marcadores, el RCRinfecta una línea celular que expresa un vector retroviral que codifica un gen
marcador, como la f) -galactosidasa, resistencia a fármacos o una proteína fluorescente. El vector es empaquetado por las pro-
teínas que le son suministradas en trans por el RCR.El sobrenadante potencialmente cargado con vectores se transfiere a célu-
las blanco vírgenes que se analizan para determinar la expresión del vector marcador.
El análisis de RCRse lleva a cabo mediante cocultivo de la línea de células o la amplificación del sobrenadante cargado de
vectores con una línea de células que permite la replicación de RCR,generalmente M. dunni, durante varios pasajes. El medio
de cultivo se cosecha al final de este proceso de cocultivo y se aplica a una línea de células indicadoras apropiada, como se ha
descrito anteriormente. Es importante señalar que se pueden generar artefactos durante el ensayo de cocultivo por la expre-
sión de un virus endógeno en la línea de células permisivas o mediante fusión, si la línea de células productoras del vector se
cultiva directamente con una línea de células de rescate con marcadores. Asimismo, el cocultivo puede no ser posible para
productos celulares ex vivo con requisitos de cultivo específicos o vidas de cultivo limitadas.
No se especifican las metodologías para analizar la presencia de RCRen crudo, productos de vectores finales o a granel. La
FDAha presentado a la American Type Culture Collection (Centro Estadounidense de Colecciones de Cultivos o ATCC)un es-
tándar de referencia de un VLMhíbrido anfotrópico. A este depósito viral se le ha asignado un título de marcación, que debe
emplearse en la validación del ensayo. La validación del método debe demostrar la capacidad de detectar, de manera reprodu-
cible, una única partícula de RCRen tipos individuales de productos, porque el producto y sus impurezas pueden interferir en
la detección del RCR.En la actualidad, no hay límites aceptables para la contaminación de productos con RCR.No se pueden
usar en humanos lotes de productos que contengan RCR.No se han desarrollado estándares de referencia para evaluar VCRen
otros vectores virales, como el VLMecotrópico, xenotrópico o seudotipado, adenovirus y lentivirus. El material de referencia de
adenovirus, que consiste en adenovirus humano salvaje tipo 5, se ha usado como control de cantidades agregadas conocidas y
durante la validación de ensayos de ACR, pero ésta podría no aplicar para todos los ensayo de ACR.La amplificación y detec-
ción de VIHcompetente para la replicación, especialmente sus variaciones seudotipificadas, pueden requerir procedimientos
de contención y manipulación especiales.
Los análisis de seguridad adicionales por lo general se centran en métodos similares a los descritos en los capítulos Pruebas
de ReactividadBiológica,In Vivo(88), Pruebasde Esterilidad-ProductosBiológicos(71 ). Para vectores para terapias génicas virales
producidas con una línea celular humana, se recomiendan las valoraciones biológicas con agentes adventicios in vitro utilizan-
do tres líneas celulares. Para vectores adenovirales, también se recomiendan las pruebas específicas para virus asociados con
adenovirus. Para virus asociados con adenovirus, se recomiendan pruebas específicas para adenovirus y virus del herpes. El ma-
terial para análisis se debe derivar de la etapa de fabricación que ofrece la mayor posibilidad de detección, que puede ser en el
producto previo al granel (p. ej., fermentación en etapa tardía), a granel o final.
PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA NO VIRAL
El análisis de seguridad por lo general se centra en métodos similares a los descritos en los capítulos (88) y (71 ). Las pruebas
de seguridad deberían realizarse en material formulado no viral. Si la vida útil del producto no viral formulado es muy corta, los
componentes deben analizarse de manera individual.
Las pruebas de seguridad para variaciones genéticas no deseadas que pueden surgir durante el proceso de fabricación en
productos de terapia génica no viral son similares a las del análisis de VCRpara vectores virales pero con más consideraciones
específicas para los vectores. Por lo general, los métodos basados en biología molecular se aplican al producto final para pro-
bar las variaciones. Cuando la estabilidad genética se establece mediante validación del proceso, los ensayos para monitorear
los niveles de variaciones genéticas no deseadas se pueden limitar al mapeo por enzimas de restricción seguido por la confir-
mación adicional de elementos genéticos críticos (tal como transgenes o elementos reglamentarios) mediante PCR o transfe-
rencia Southern.
Ensayos de Determinación de Dosis
Al ensayo que mide, con precisión, la cantidad de producto se le denomina ensayo de determinación de dosis y se seleccio-
na basándose en su exactitud y precisión. Un ensayo que mide la actividad terapéutica de un producto recibe el nombre de
valoración de potencia y se diseña para medir la función del producto. El diseño del ensayo depende del tipo de producto. En
el caso de medicamentos químicos y proteicos, los ensayos que determinan la cantidad de fármaco (dosis) se llaman valoracio-
nes de contenido. La dosis de producto se puede definir como la concentración o cantidad del medicamento administrado al
paciente y por lo general se mide como la masa de producto.
La concentración de partículas es una medición comúnmente usada para dosis de producto de vectores virales. Se puede
medir con ensayos físicos, biofísicos o celulares in vitro. Por ejemplo, es posible cuantificar las partículas adenovirales purifica-
das empleando la densidad óptica de una solución viral en solución de dodecil sulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés)
al O,1% (p/v), a 260 nm, porque se ha publicado una relación entre la absorción y la concentración de partículas de adenovi-
rus. La concentración de número de partículas es equivalente al producto de la absorbancia a 260 nm en una celda de 1 cm, el
factor de dilución y 1, 1 x 10 12 partículas. Un método que se ha estandarizado para determinar la concentración de partículas
es la integración del área del pico viral de absorbancia a 260 nm y/o 280 nm contra un estándar de referencia autenticado en
un ensayo por cromatografía líquida de alta resolución basada en resina de intercambio aniónico (HPLC). En comparación con
el método de densidad óptica, el método por HPLCpresenta como ventaja la eliminación de la interferencia de ADN libre y/o
proteínas de la cápside en la cuantificación de partículas virales. El material de referencia de adenovirus (ARM,por sus siglas en
inglés) de la ATCCtiene una concentración de partículas determinada por HPLCderivada de una colaboración a gran escala
que implicó a muchos laboratorios. Siempre que sea posible, se debe usar el ARM para calibrar el método de HPLCinterno y el
material de referencia.
La concentración de virus también se puede evaluar midiendo proteínas estructurales seleccionadas con masas moleculares
conocidas y números de copias conocidos dentro del virión. Para este método, el virus debe lisarse y las proteínas estructurales
deben separarse usando un procedimiento cromatográfico apropiado de alta recuperación (p. ej., HPLCde fase reversa). La
separación cromatográfica y la identidad y la pureza de la proteína estructural seleccionada deben verificarse durante la valida-
ción de la valoración con métodos, como electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE),secuenciación de pépti-
dos y espectroscopía de masas. Las proteínas estructurales seleccionadas pueden ser cuantificadas, por ejemplo, integrando los
picos cromatográficos a 214 nm y comparando el área con la de un estándar de referencia autenticado. Luego se puede calcu-
lar la concentración viral sobre la base de la masa molecular, el número de copias y la masa medida de proteína. Cabe señalar
que es posible estimar simultáneamente la concentración viral a partir de múltiples proteínas estructurales, lo que permite utili-
zar esta valoración en preparados de virus relativamente impuros. Este método ha sido aplicado a adenovirus y debería ser
aplicable a otros tipos de vectores virales.
Los métodos biofísicos para determinar el número de partículas incluyen la cuantificación directa del ácido nucleico del vec-
tor mediante hibridación con sonda radiomarcada y la cuantificación indirecta mediante amplificación de un molde de ácido
nucleico (p. ej., PCRy RT-PCR)o mediante amplificación de señal (p. ej., ADN de cadena ramificada usando hibridación con
sonda múltiple).
Cuando no se dispuso de métodos biofísicos, se han usado valoraciones biológicas que miden el título de vector génico.
Estas incluyen infección, transfección o transducción de una línea celular susceptible in vitro, seguida de alguna medición de la
respuesta del producto. Los métodos para cuantificar o estimar el número de episodios de infección, transfección o transduc-
ción incluyen valoraciones de unidades formadoras de placa, valoraciones de dosis infecciosa en cultivo de tejidos basadas en
efectos citopáticos de 50% (TCID50) o detección inmunofluorescente de una proteína expresada del vector o un ensayo cuanti-
tativo de hibridación de ADN. Los ejemplos incluyen: Para productos de terapia génica adenoviral competente para la replica-
ción, el ARMdisponible en ATCCtiene un intervalo definido de título TCID50 determinado mediante un esfuerzo colaborativo.
Siempre que sea aplicable, se debe usar en la validación de un estándar de referencia interno o un control de ensayo para
ensayos de título infeccioso. Sin embargo, debido a la posibilidad de diferencias genéticas entre el ARM, que es adenovirus
humano salvaje tipo 5, y el producto de terapia génica adenoviral competente para la replicación, puede no ser aconsejable
normalizar el título del vector de interés con el del ARM.
Para productos de terapia génica retroviral o lentiviral o VM que portan un marcador seleccionable (p. ej., para resistencia a
la neomicina) o un gen indicador (p.e., p -galactosidasa) además del gen terapéutico, el título infeccioso a menudo se deter-
mina midiendo el número de células transducidas infectadas que expresan estas proteínas no terapéuticas. Por lo general, el
título del vector se expresa como el número de unidades formadoras de colonias (ufc) por mL para células transducidas con
vectores virales que contengan marcadores de resistencia a fármacos y se seleccionan para crecer en un medio que contenga
el fármaco. El título basado en p-galactosidasa se puede expresar en ufc azules por ml, después de teñir y contar las células
que convierten el sustrato X-Gal de la p -galactosidasa en un cromóforo azul. Para vectores sin un gen marcador, la cuantifica-
ción de transducción se ha medido con presición usando PCRcuantitativa o se ha estimado usando métodos de hibridación.
La mayoría de los productos de terapia génica no virales contiene ADN plasmídico y su medida de dosis habitual es la masa
de ADN. Ésta se puede determinar en el estado formulado y, si se incluye proteína recombinante en la formulación, se puede
emplear la masa combinada total de todos los componentes, basada en un cociente específico. La medición por densidad óp-
tica a 260 nm es la manera más simple de calcular concentraciones de ADN superiores a 500 ng/ml. Este método, por lo ge-
neral, no se puede aplicar al ADN en formulación lipídica. Debido a que el ARNy las proteínas también presentan absorbancia
significativa a 260 nm, se deben efectuar otros análisis para demostrar una contaminación mínima con ARN, proteínas o ADN
cromosómico residual de células anfitrionas. Los colorantes que se unen específicamente al ADN de doble cadena permiten
medir con exactitud concentraciones de ADN inferiores a 500 ng/mL, cuando se calculan con respecto a una curva estándar
de ADN autenticada. PicoGreen es uno de los colorantes fluorescentes y se ve mínimamente afectado por ADN de cadena sim-
ple, ARN, proteínas, sales y detergentes. El colorante fluorescente Hoechst 33258 también une tanto el ADN de cadena simple
como el de doble cadena y se puede usar para determinar concentraciones de ADN tan bajas como 0,3 ng/ml. El Hoechst
33258 no se une a la proteína ni al ARNy puede determinar con exactitud las concentraciones de ADN en muestras crudas.
Asimismo, se pueden emplear métodos tales como la electroforesis capilar y la HPLCque usan un material de referencia au-
tentificado para determinar el contenido de productos no virales.
Potencia
La potencia se define como la actividad terapéutica del producto farmacéutico. junto con la dosis, la potencia define la acti-
vidad biológica de cada lote (ver Ensayosde Determinaciónde Dosis).La potencia se puede evaluar con valoraciones biológicas
in vitro o in vivo. No es extraño que estas valoraciones tengan coeficientes de variación entre 30% y 50%, aunque un diseño
de valoración estricto con buena consideración estadística puede ayudar a reducir variaciones en la valoración. Estas valoracio-
nes requieren un material de referencia representativo bien definido que se pueda usar como control positivo para la valora-
ción y/o para calcular la potencia relativa del artículo de prueba. Las consideraciones generales para valoraciones biológicas en
los capítulos vigentes de USPsobre diseño y desarrollo de valoraciones biológicas se deben aplicar al diseño de valoración de
potencia para productos de terapia génica. El control positivo califica el rendimiento de una valoración individual. El desarrollo
de las valoraciones de potencia debe centrarse en la caracterización y control de la variabilidad. Las valoraciones de alta preci-
sión son herramientas más eficaces para controlar la calidad del producto. La información sobre la variabilidad en las valoracio-
nes de potencia se debe incluir en el diseño del estudio de estabilidad y en la metodología estadística propuesta para asignar la
fecha de caducidad (ver Estabilidad).
Las valoraciones biológicas empleadas para medir la potencia de productos de terapia génica viral y no viral por lo general
implican la infección, transfección o transducción de una línea celular susceptible in vitro, seguida por alguna medida funcio-
nal del gen de interés expresado. Por lo general, se deben usar valoraciones funcionales para el gen terapéutico (p. ej., aque-
llos que miden la actividad enzimática y la estimulación o inhibición de crecimiento celular) en lugar de métodos analíticos
tales como enzimoinmunoensayo (ELISA).Cuando la función biológica del transgén expresado presenta una amplia variedad
de actividades o únicamente genera resultados semicuantitativos, el ELISAu otras lecturas inmunológicas o bioquímicas se
pueden usar como valoraciones de potencia sustitutas con un estrecho intervalo de especificación si se cuenta con datos ex-
tensos de caracterización para demostrar que toda proteína expresada es biológicamente activa. Por ejemplo, para los produc-
tos de terapia génica que expresan una citoquina, la expresión de la citoquina por lo regular se cuantifica primero mediante
ELISAy el resultado se usa para ajustar la dilución de muestra para la valoración funcional. La potencia de tales vectores se
puede controlar mejor mediante los resultados de cuantificación del ELISA,pero la actividad biológica de la citoquina expresa-
da se puede usar para verificar que la masa medida es biológicamente activa sin tener que cumplir con un intervalo de especi-
ficación estrecho para la actividad biológica misma.
La HPLCo la citometría de flujo, que proveen información sobre el nivel de expresión pero que solo infieren la función, tam-
bién se han usado en un contexto parecido al descrito para inmunoensayos. Asimismo, para vectores virales, las mediciones de
título infeccioso por sí solas, por lo general, no se consideran como una medida adecuada de potencia del producto. Por ejem-
plo, el título de TCIDS0 o las valoraciones de unidades formadoras de placas para vectores adenovirales en células HEK293
pueden indicar que se conserva la infectividad del adenovirus pero no confirma que el producto adenoviral haya mantenido
sus funciones biológicas completas, especialmente la actividad biológica del transgén. El diseño y la aptitud final de un sistema
de valoraciones para determinar la potencia depende de la relación entre la célula humana blanco in vivo y: (1) la eficiencia de
transducción o transfección de la línea celular utilizada in vitro, (2) los niveles de expresión de proteínas y (3) el tiempo de
expresión necesario para lograr el efecto terapéutico.
Las pruebas in vivo también se pueden usar para medir la potencia del vector en el producto. Las lecturas se pueden basar
en una respuesta por animal (p. ej., los niveles sanguíneos de la proteína terapéutica a las 24 horas del tratamiento) o una tasa
de respuesta grupal (p. ej., el porcentaje de animales que obtuvo una respuesta inmunitaria o sobrevivió al desafío del virus).
La disponibilidad de un sistema de pruebas in vivo apropiado depende del intervalo vector-anfitrión (para vectores virales), la
farmacocinética y la distribución biológica del vector y su producto génico resultante comparado con su e9uivalente humano
y del tiempo necesario para observar el efecto terapéutico o el efecto indirecto. Factores como el costo, las instalaciones, la
validación y la ética determinan si una prueba de potencia in vivo resulta práctica.
Pureza
Los métodos analíticos que separan, aíslan y específicamente cuantifican los componentes del producto activo, determinan
la pureza del producto. Las impurezas son componentes relacionados con el producto o el proceso que se pueden trasladar al
producto final. Se debe optimizar el proceso de fabricación y purificación a fin de eliminar impurezas constantemente y, al
mismo tiempo, conservar la actividad del producto. El requisito de detectar una impureza particular para la liberación de un
lote depende de: (1) la capacidad demostrada del proceso de fabricación y purificación para eliminar o inactivar la impureza
durante la validación de proceso y (2) la toxicidad potencial asociada con la impureza.
Entre los ejemplos de impurezas relacionadas con el proceso asociadas con los productos de terapia génica se incluyen com-
ponentes del medio de producción (p. ej., SFB,suero fetal bovino), antibióticos, citoquinas y ADN cromosómico de E.coli en
un producto plasmídico), productos auxiliares usados en el procesamiento subsiguiente (p. ej., las nucleasas tales como ADNa-
sa 1)y humedad residual para productos de vectores liofilizados. Las impurezas pueden ser bioactivas (p. ej., citoquinas y hor-
monas) o inmunogénicas (p. ej., agregados de productos, productos de degradación, marcadores de selección de plásmidos y
proteínas no humanas) o bien pueden ejercer otros efectos perjudiciales (p. ej., pueden competir con el producto) si se admi-
nistran a una dosis igual a la del producto. Las impurezas relacionadas con el producto son específicas para cada tipo de pro-
ducto. Los ejemplos incluyen formas de plásmidos mellados (nicked) en productos no virales y partículas defectuosas o inma-
duras en productos de vectores retrovirales o adenovirales. Las metodologías analíticas para evaluar la pureza requieren la
cuantificación de las impurezas o su separación física del producto. El sentido común debería determinar si es necesario cuanti-
ficar las impurezas específicas. La validación adecuada del proceso de fabricación puede limitar la necesidad de pruebas de
liberación para lotes específicas para impurezas. Los fabricantes pueden poner énfasis en demostrar la uniformidad del perfil de
impureza del producto.
La prueba para impurezas es a menudo extensa durante la caracterización del producto y la validación del proceso cuando
se está demostrando la uniformidad del proceso de fabricación y purificación. El análisis de impurezas como parte del análisis
de liberación del lote debe reflejar los riesgos de seguridad asociados con la impureza y la capacidad del proceso para eliminar
consistentemente tal impureza.
En vectores virales, las impurezas relacionadas con el producto incluyen agregados y partículas defectuosas e inmaduras que
se pueden generar durante la fabricación o purificación del vector recombinante. Se pueden formar agregados de vector si el
producto es altamente concentrado, se almacena en ciertas condiciones (p. ej., a un pH o temperatura dados) o reconstituido
después de la liofilización. Las valoraciones para detectar agregados incluyen análisis de tamaño de partícula mediante disper-
sión de luz con láser y el uso de PAGEno desnaturalizante y no reductora, seguido por tinción de gel o transferencia y detec-
ción de proteínas virales mediante análisis de transferencia Western. El análisis de velocidad de sedimentación también puede
permitir la separación de agregados de monómeros basados en tamaño. Los análisis de densidad óptica de dispersión de luz
también se usan para evaluar la agregación de vectores.
Las partículas defectuosas son partículas virales sin el genoma recombinante apropiado-es decir, contienen algún otro áci-
do nucleico o no contienen ningún genoma o el vector contiene algún componente estructural defectuoso o alterado de algu-
na otra manera que disminuye su capacidad de transducir una célula. En sistemas de vectores virales con simetría capsomérica,
que requiere la incorporación apropiada de ácido nucleico para la configuración, es posible distinguir con facilidad las partícu-
las vacías de las que portan genomas. Es probable que no se puedan separar tan fácilmente las partículas vacías de aquéllas
con ácido nucleico encapsidado en virus con envoltura.
La HPLCanalítica es útil para separar partículas virales activas de las defectuosas en algunos productos de vectores virales. Se
han empleado resinas de intercambio aniónico para separar el adenovirus activo de partículas virales defectuosas. No obstante,
este método puede no ser útil para un vector adenoviral purificado mediante cromatografía de intercambio aniónico, a menos
que la resina para la valoración sea diferente de la usada en la fabricación. Dependiendo de la naturaleza del vector viral y sus
formas no activas o defectuosas, puede ser necesario que otros métodos de separación, tales como centrifugación de equilibrio
en un gradiente de densidad con cloruro de cesio, precedan la cuantificación de la partícula activa. El método de separación
idealmente permitirá la cuantificación.
Las partículas defectuosas que portan un oncogén no derivado de la célula u otros genes no deseables pueden representar
una preocupación especial. Por ejemplo, en líneas de células murinas que aportan la envoltura al retrovirus, se pueden empa-
quetar pequeños elementos virales, llamados secuencias VL30, en aproximadamente un tercio de las partículas. Se puede re-
querir de valoraciones para cuantificar partículas defectuosas específicas cuando se sepa que están presentes en cantidades su-
ficientes para representar una preocupación de seguridad.
La calidad del virus y la comparabilidad de preparaciones también se puede evaluar midiendo proteínas estructurales selec-
cionadas con masas moleculares conocidas y números de copia conocidos dentro del virión. Para este método, el virus se lisa y
las proteínas estructurales se separan usando HPLCen fase reversa o algún otro procedimiento cromatográfico de alta recupe-
ración. La separación cromatográfica debe validarse y se debe verificar la identidad de las proteínas estructurales seleccionadas
por métodos tales como SDS-PAGE,secuenciación de péptidos o espectroscopía de masas. La identificación genética de la par-
tida se puede llevar a cabo basándose en la cuantificación de las proteínas estructurales seleccionadas y su comparación con
un estándar de referencia. Cuando el método incluye la espectroscopía de masas, también se pueden identificar impurezas,
como las variantes estructurales. Para las preparaciones de adenovirus, algunos precursores y la mayoría de las proteínas virió-
nicas maduras se pueden detectar y distinguir, permitiendo el monitoreo del producto y de las formas viriónicas inmaduras.
Las proteínas derivadas de las células anfitrionas se pueden considerar impurezas para algunos productos de vectores virales
y se pueden separar y cuantificar mediante PAGEo HPLCo detectarse mediante análisis de aminoácidos, transferencia Western
(Western blot) o métodos basados en inmunoensayos. Sin embargo, para virus con envoltura, como los retrovirus, las proteí-
nas de membrana derivadas de células anfitrionas son una parte integral del producto. En esos sistemas de vectores, puede ser
complicado determinar la presencia de proteínas contaminantes exógenas derivadas del anfitrión.
La presencia de impurezas específicas relacionadas con el proceso depende de los procesos de fabricación y purificación de
cada tipo de vector o producto. No obstante, la mayoría de los productos deben ser analizados para detectar endotoxinas resi-
duales (ver Pruebade EndotoxinasBacterianas(85)). Se han establecido límites aceptables de endotoxinas, que se pueden apli-
car directamente a productos de vectores virales. Históricamente, se ha considerado que el ADN genómico proveniente de
sustratos celulares continuos empleados para fabricar productos biológicos era potencialmente tumorígeno, pero estudios re-
cientes sugieren que los riesgos son muy bajos. Sin embargo, durante el desarrollo del proceso, debería intentarse reducir los
niveles de ADN contaminantes. La necesidad de analizar el ADN residual como parte de la liberación de lote de producto se
debe evaluar caso por caso y puede depender de la distribución del tamaño del ADN, su asociación con el producto o sus
componentes de formulación y la vía de administración del producto. Los ensayos cuantitativos por PCR pueden analizar la
cantidad de ADN residual de células anfitrionas usando cebadores diseñados para amplificar secuencias blanco conservadas
evolutivamente y abundantes tales como l 8S para células HEK293.
La cuantificación de componentes séricos residuales tales como albúmina sérica bovina (ASB)se puede lograr usando ELISAy
un estándar de referencia de ASB. Puede ser necesario que los investigadores desarrollen métodos funcionales o inmunológicos
específicos para otros productos auxiliares, incluyendo otros medios de cultivo o componentes del proceso de purificación ta-
les como citoquinas o enzimas (p. ej., desoxirribonucleasa 1 o nucleasa benzon).
PRODUCTOSDE TERAPIAGÉNICANO VIRAL
Un plásmido usado como fármaco se considera como un producto biológico bien caracterizado, mientras que las impurezas
clave del proceso de fabricación son bien conocidas. El análisis por lo general se lleva a cabo en cada componente individual:
el ADN plasmídico, reactivos lipídicos o lipopléxicos y componentes proteicos si se encuentran presentes en la formulación. EL
ADN plasmídico se caracteriza para una variedad de impurezas, incluyendo ADN residual de células anfitrionas, ARN residual y
proteína residual. Las pruebas de proteínas residuales se suelen incluir en las pruebas de liberación de lotes. Con frecuencia, los
cocientes de densidad óptica (usualmente la medición entre 260 nm y 280 nm) se usan en las especificaciones de pureza para
ADN plasmídico.
Asimismo, el ADN plasmídico se debe caracterizar con respecto a su conformación en solución. El ADN plasmídico se pre-
senta en forma monomérica superenrollada, monomérica relajada y lineal. Puesto que todas las formas se pueden generar du-
rante la fermentación a gran escala y los datos sobre su potencia relativa in vivo son escasos, la cantidad relativa de cada forma
se monitorea para verificar la uniformidad entre partidas en las cantidades relativas de cada conformación. La electroforesis en
gel de agarosa puede resolver cada una de estas formas pero no es altamente cuantitativa para cada especie individual. La
HPLCanalítica de intercambio aniónico funciona como análisis cuantitativo para la conformación monomérica superenrollada
y de otras conformaciones, como los concatémeros. Otros métodos analíticos que han sido valiosos para la caracterización de
construcciones plasmídicas durante el desarrollo del proceso y validación tales como electroforesis capilar en gel, dicroísmo de
flujo lineal y microscopía de fuerza atómica, también son viables para evaluar la pureza de una preparación plasmídica deter-
minada. El método más apropiado para la liberación de lote depende de cómo afecta cada plásmido a la potencia del produc-
to. Los detalles específicos para cada uno de estos métodos se resaltan en el capítulo TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-
Generalidades(1125).
Las pruebas deben realizarse para impurezas relacionadas del proceso tales como disolventes orgánicos residuales (fenol, al-
cohol), sales y ciertos antibióticos tales como kanamicina usados durante el proceso de fermentación. Se deben analizar tam-
bién los componentes de formulaciones lipídicas y lipoplex para determinar su pureza química. Las pruebas para impurezas
químicas específicas comúnmente se realizan con cromatografía de gases-espectroscopía de masas (GC-MS), HPLCo croma-
tografía en capa delgada (TLC). Si la proteína forma parte del complejo formulado, también se debe comprobar su pureza. La
HPLCes capaz de detectar cantidades de trazas de antibióticos residuales y pueden, por lo tanto, usarse durante la validación
del proceso o el análisis de liberación de lote para confirmar que hayan sido eficazmente eliminadas. Los aspectos específicos
de estos métodos se detallan en ArtículosObtenidospor Biotecnología-Mapeo de Péptidos(1055) o en ArtículosObtenidospor
Biotecnología-Valoraciónde ProteínasTotales(1057).
Las proteínas, el ADN, el ARN y las endotoxinas bacterianas son los principales tipos de contaminantes del proceso derivados
del anfitrión. Se pueden emplear valoraciones estándar de proteínas (p. ej., Lowry, Bradford o Coomassie), PAGEseguida de
tinción argéntica o Western blot, o ELISAa fin de detectar proteínas residuales del anfitrión con sensibilidad de nanogramos. El
ADN cromosómico del anfitrión se puede detectar por hibridación slot blot (detección en picogramos) o por PCR en tiempo
real (sensibilidad de detección< 1pg) utilizando secuencias altamente conservadas (p. ej., 18S para E. co/J).Los ensayos por
PCR para este propósito deben usar polimerasas recombinantes altamente purificadas para minimizar el ADN bacteriano resi-
dual cuya presencia puede crear señales de fondo. Se puede emplear PAGEo electroforesis en gel de agarosa, seguidas de tin-
ción fluorescente, para detectar ARN residual. Es posible que la cuantificación no sea necesaria, debido a la naturaleza lábil del
ARN y su escasa toxicidad. La prueba de lisado de amebocitos de Limulus(LAL,por sus siglas en inglés) es el método más sensi-
ble y ampliamente usado para la determinación de endotoxinas. Los ensayos colorimétricos ofrecen sensibilidades de 0,005
UE/ml. Los detalles de los métodos descritos en este capítulo se resaltan en los capítulos (1057), ArtículosObtenidospor Biotec-
nología-Electroforesisen Gel de Poliacrilamida(1056), TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Enfoquespara DetectarTrazasde
ÁcidosNucleicos(1130), (1125) y (85).
PRODUCTOSDE VECTORESVIRALES
Y NO VIRALES
LIOFILIZADOS
La humedad residual puede afectar la estabilidad de un producto de vectores liofilizado. La Guíade Determinaciónde Hume-
dad Residualen ProductosBiológicosSecosde la FDArecomienda una humedad residual del 1%, aunque se consideran acepta-
bles los datos que indiquen que no hay efectos adversos sobre la estabilidad del producto a niveles más altos. Los niveles de
humedad residual se pueden determinar con un método estándar (ver Determinaciónde Agua (921)) compatible con el pro-
ducto formulado.
Identidad
El análisis de liberación de lote para productos de terapia génica debe incluir una prueba de identidad. Esta prueba identifica
claramente el producto y confirma que no haya ocurrido la sustitución inadvertida por otro producto. Su complejidad depen-
de de la naturaleza del producto específico y de la gama de productos que se fabriquen. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo
pruebas más exhaustivas y rigurosas para un producto de terapia celular modificado con gen autólogo en una planta donde se
fabrican múltiples productos para pacientes que para un producto de vector viral elaborado en un sitio que fabrica un único
producto.
Para propósitos de caracterización, el mapeo por enzimas de restricción y la secuenciación del ADN de la unidad de trans-
cripción son las metodologías usadas con mayor regularidad. Los métodos basados en PCR, el mapeo por enzimas de restric-
ción y los inmunoensayos basados en la expresión del transgén se usan comúnmente para confirmar la identidad durante el
análisis de liberación de lote.
PRODUCTOSDE TERAPIAGÉNICANO VIRAL
El mapeo por enzimas de restricción es el método de identidad más común para productos derivados de plásmidos. El nú-
mero de enzimas utilizadas para crear el patrón genético del vector varía según la complejidad del ADN y la similitud entre
múltiples productos. Si se emplean lípidos, agentes lipoplex o proteínas para formular el ADN, también se debe analizar y con-
firmar su identidad. Los procedimientos usados para productos farmacéuticos tradicionales, como GC-MS, TLCy similares,
permiten identificar lípidos y componentes lipoplex. Los componentes proteicos de la formulación se pueden identificar me-
diante mapeo de péptidos u otros medios descritos en (1057).
ESTABILIDAD
La vida útil de los productos de terapia génica varía mucho en función de su naturaleza, el uso clínico previsto, sus atributos
específicos y las condiciones recomendadas de almacenamiento, envasado y transporte. Por lo tanto, es difícil redactar pautas
uniformes sobre la duración de estudios de estabilidad y la frecuencia de las pruebas, para todos los productos. El estudio
siempre debe diseñarse basándose en principios y metodologías científicamente sólidos, y un conocimiento cabal del producto
terapéutico final y su uso previsto. Se debe determinar la estabilidad del producto durante los pasos de espera en el proceso,
de los bancos de células y virus, de materias primas fundamentales y de los estándares de referencia. Un programa de estabili-
dad bien diseñado y ejecutado asegurará, en gran medida, que el producto permanezca estable dentro de la vida útil especifi-
cada.
Para productos de terapia génica con vectores virales y no virales y productos de terapia génica celular modificados genéti-
camente no específicos para un solo paciente, la selección de partidas para respaldar la solicitud de licencia y el etiquetado del
producto final deberían llevarse a cabo de acuerdo con los principios de las pruebas de estabilidad, como los descritos en la
guía QSC de la ICH y en el capítulo (1049). Además, se deben reunir datos sobre estabilidad para el material a granel y en
otros puntos dentro del proceso, si el material es almacenado antes del procesamiento y el llenado finales. Los aspectos relacio-
nados con la estabiidad de los productos derivados de células se tratan en el capítulo (1046).
Los vectores plasmídicos de ADN no viral a menudo se formulan con mezclas específicas de lípidos, proteínas o lipoconjuga-
dos para formar liposomas o complejos encapsulados. Según la formulación empleada, se puede lograr una vida útil de horas a
años. Cuando el producto tiene una vida útil corta, puede ser necesario preparar la formulación final en el sitio clínico justo
antes de su administración. La inestabilidad con frecuencia se observa como agregación y precipitación. La formación y la esta-
bilidad del complejo formulado se caracterizan y establecen mediante estudios de validación durante el desarrollo del produc-
to. Asimismo, se deben recolectar datos de estabilidad para los componentes principales del complejo formulado, como lípi-
dos, liposomas y el ADN.
Desarrollodel Protocolode Estabilidad

Los estudios de estabilidad verifican que las condiciones de almacenamiento conserven la pureza y la potencia durante un
periodo definido, de manera que cuando el producto se administre al paciente, siga cumpliendo con las especificaciones de
estabilidad. Estas especificaciones pueden diferir de las estipuladas para la liberación de la fabricación; no obstante, se deben
verificar con datos clínicos. Los estudios formales de estabilidad para respaldar la autorización, así como los planes para reunir
información sobre estabilidad del producto en la fase inicial deben estar detallados en un plan escrito que determine cómo se
obtendrán y analizarán los datos de estabilidad a fin de avalar el período de caducidad del producto. Los protocolos deben
seguir el formato recomendado en las guías vigentes e incluir el alcance, las condiciones de almacenamiento, el número de
lotes que se analizarán, el cronograma de prueba, las valoraciones que se utilizarán, el análisis de los datos y las especificacio-
nes del producto. Todo ensayo empleado en un estudio de estabilidad formal para obtener la autorización debe ser validado
antes de comenzar el estudio. El diseño del estudio específico debe tomar en cuenta los problemas que el producto puede
enfrentar durante la fabricación, el transporte y el procesamiento en el sitio clínico (ver Condicionesde DesafíoAceleradasy Más
Apropiadas,a continuación). El diseño del estudio también debe incluir los conocimientos más recientes en ciencias biológicas
y debe tratar los requisitos reglamentarios existentes. Por ejemplo, si la formulación final del producto se lleva a cabo en el sitio
clínico, los estudios de estabilidad sobre esta formulación final se deben llevar a cabo para establecer el tiempo y las condicio-
nes en las que se puede conservar el producto.
La evaluación de la estabilidad debe incluir una evaluación de funcionalidad de producto (potencia). La valoración de poten-
cia suele tener un alto grado de variabilidad intrínseca. Medir y calcular el deterioro de la actividad del producto empleando
las metodologías estadísticas estándar puede requerir múltiples y frecuentes intervalos de muestreo en un período prolongado
y el análisis de más de tres lotes de producción para compensar la variabilidad de la valoración. Se deben efectuar estudios
iniciales para establecer una fecha de caducidad provisional antes de la administración al primer paciente. Estos estudios tam-
bién son útiles para determinar qué valoraciones son indicadoras de estabilidad, es decir, los indicadores óptimos de degrada-
ción del producto. Como los métodos farmacopeicos vigentes no contemplan las características singulares de los productos de
terapia génica, se recomienda desarrollar ensayos que consideren estas características singulares.
Condicionesde Desafío Aceleradasy Más Apropiadas
El perfil indicador de estabilidad de un producto de terapia génica varía con el tiempo por la influencia de una amplia varie-
dad de condiciones ambientales, incluida la temperatura, los extremos en condiciones fisiológicas de almacenamiento y la luz.
Cuando los investigadores investiguen los efectos de estos parámetros sobre la estabilidad del producto, se deben considerar
las vías de degradación multifactoriales. Los estudios deben incluir condiciones que superen los intervalos de almacenamiento
especificados, es decir, condiciones de desafío como las halladas durante períodos de almacenamiento, transporte o manejo
anormales. Algunos ejemplos son el mal funcionamiento de incubadoras durante un breve periodo, fallas de la incubadora o
del almacenamiento en frío, períodos de fluctuaciones térmicas extremas ocasionadas por el transporte hacia climas calurosos
o fríos, condiciones hipobáricas en el sector de carga de una aerolínea comercial o temperaturas probables en la sala de opera-
ciones. Una corta exposición a una condición ambiental fuera de un límite establecido y una exposición prolongada a una con-
dición ambiental que está justo fuera de un intervalo aceptable establecido puede ser igualmente perjudicial para el perfil ge-
neral de estabilidad. Si se aplican condiciones de almacenamiento diferentes, la velocidad lenta y constante de degradación
del producto a una temperatura específica puede aumentar. Si existe una justificación científica, se debe investigar el efecto de
la luz sobre el perfil indicador de estabilidad. Se debe prestar especial atención a los productos almacenados en líquidos que
contienen componentes sensibles o que reaccionan con la luz, los cuales pueden dar origen a subproductos citotóxicos.
Los estudios análogos a los de envejecimiento acelerado habitualmente usados en programas de monitoreo de estabilidad
farmacéutica también son útiles para determinar la manera en que el producto se degrada y los ensayos que son indicadores
de la estabilidad. Pueden ser los mismos estudios que algunos de los mencionados en el párrafo precedente. Otros estudios
consisten en exponer un producto a 37º ó 18º cuando su temperatura normal de almacenamiento es de 25± 2º o colocar un
producto liofilizado en un ambiente muy húmedo. Este tipo de estudios deben llevarse a cabo antes de los estudios formales
de estabilidad, de manera que estos últimos puedan incorporar ensayos indicadores de estabilidad validados.
ALMACENAMIENTO
V TRANSPORTE
Las condiciones de almacenamiento adecuadas se seleccionan para preservar la pureza y la potencia a fin de que se manten-
gan las especificaciones del producto y de sus ingredientes durante el almacenamiento, transporte y manejo en el sitio clínico.
Antes de la administración, deben realizarse estudios para determinar si las condiciones de almacenamiento, transporte y ma-
nejo son aceptables. No es necesario que las condiciones de almacenamiento y transporte sean las mismas que aquellas previs-
tas para el producto comercial, pero deben garantizar que se mantengan las especificaciones del producto más allá de la fecha
de caducidad inicial. Para productos con vidas útiles cortas, se deben considerar las condiciones de almacenamiento y trans-
porte, incluso dentro de un centro médico, puesto que el transporte constituye la mayor parte del tiempo de almacenamiento
después de la fabricación. Se debe poner especial atención a la capacidad de los gases para penetrar el envase de transporte,
especialmente si el producto de terapia génica se almacena o transporta usando hielo seco. Una vez que se hayan desarrollado
los métodos indicadores de la estabilidad y que se hayan seleccionado la condiciones de almacenamiento y transporte finales,
éstas deben validarse de acuerdo con la sección Estabilidad.
La mayoría de los productos con vidas útiles limitadas se transportan mediante sistemas confiables de correo con entrega al
día siguiente. Algunos productos muy frágiles son transportados a mano en aviones comerciales. Los transportistas comerciales
deben obtener permisos especiales para evitar el control con equipos de rayos X en los aeropuertos. Durante el desarrollo de
sistemas de embalaje, se deben diseñar estudios de transporte de carga para identificar las condiciones adversas que podrían
afectar al producto. Luego se deben seleccionar y validar los materiales de refuerzo y aislamiento para armar un sistema de
embalaje que tolere y proteja al producto de las condiciones extremas de transporte.
La mayoría de los productos de terapia génica se pueden liofilizaro formular mediante técnicas similares a las empleadas
para muchos productos proteicos recombinantes o de terapia celular. Estas formulaciones de almacenamiento típicamente tie-
nen períodos de caducidad superiores a un año y carecen de requisitos de transporte especiales. Los productos de terapia gé-
nica no viral, que pueden ser inestables en su formulación final, pueden tener fechas de caducidad similares si se almacenan en
un equipo de viales múltiples con el ácido nucleico en un vial y un vehículo como los lípidos, en el otro. La formulación final se
elabora en el centro médico justo antes de la administración.
ETIQUETADO
El etiquetado de un producto está reglamentado por la FDAy se requiere que cumpla con la reglamentación vigente. Debi-
do a que los productos de terapia génica son productos biológicos reglamentados, su etiquetado está sujeto a las reglas men-
cionadas. Los productos biológicos y dispositivos deben cumplir con los requisitos de etiquetado específicos para el envase y el
empaque (Título 21 del CFR 61 Oy 801, respectivamente). Tanto la etiqueta del envase como la del empaque deben incluir la
fecha de caducidad. Si el envase está empacado, se deben incluir las condiciones de almacenamiento recomendadas en la eti-
queta del embalaje. Si no está empacado, las condiciones de almacenamiento y todos los demás requisitos de una etiqueta de
embalaje deben aparecer en el envase. El etiquetado debe cumplir además con los requisitos nacionales e internacionales perti-
nentes.
Cuando un producto se va a aplicar a un paciente en una orientación física en particular o en un área específicamente defini-
da, el etiquetado que indique la orientación y/o el área correctas debe ser visible incluso después de abrir el empaque. A me-
nos que el producto haya sido analizado para detectar contaminantes patógenos o microbianos antes de la liberación, se exige
un etiquetado de riesgo biológico apropiado. Para productos con vida útil muy corta, es necesario ajustar y corregir la fecha de
caducidad según los husos horarios para brindar al usuario una estimación exacta de la vida útil. Los procedimientos clínicos se
deben programar próximos a estos marcos temporales cruciales. Las etiquetas de productos específicos para un solo paciente
deben tener el nombre completo del paciente, sus iniciales o una combinación de ambos, además de la designación del lote, a
fin de garantizar que el producto se administre al paciente correcto.
REGLAMENTOS
Y NORMAS
Las tecnologías implicadas en la fabricación de productos de terapia génica han sido ampliamente documentadas en la lite-
ratura y continúan evolucionando. Estos productos se pueden reglamentar como medicamentos o productos biológicos, y en
contadas ocasiones como dispositivos, dependiendo de la manera en que se fabrican y emplean. Los nuevos enfoques que
estas tecnologías permitan pueden dificultar la determinación de qué centros de la FDAestarán a cargo de su reglamentación;
la FDAha recomendado a los fabricantes solicitar aclaraciones en las primeras etapas del desarrollo. En la actualidad, el Center
for Biologics Evaluation and Research (Centro para la Evaluación e Investigación de Productos Biológicos o CBER)rige la mayo-
ría de los productos de terapia génica humana. El CBERse basa tanto en la Public Health Service Act (Ley del Servicio de Salud
Pública) y la Federal Food Drug and Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos). La reglamentación
es la misma que para los productos obtenidos por biotecnología. Los requisitos generales se describen principalmente en el
TTtulo21 del CFR. El gobierno federal ha emitido una gran cantidad de documentos guía como Points to Consider(Puntos a
Considerar) o Guidelines(Pautas) (ver www.fda.gov). Los documentos guía de la ICH para muchas de las áreas relacionadas
con la calidad son importantes en diversas magnitudes para productos de terapia génica que califican (aunque algunos pro-
ductos por lo general quedan nominalmente fuera del alcance de los documentos guía, los principios siguen aplicando; ver
www.ifpma.org o www.ich.org). Algunos de estos documentos se reproducen en los compendios USP-NFcomo capítulos ge-
nerales. Asimismo, la ICH ha celebrado diversas reuniones sobre productos de terapia génica y cuenta con un Grupo de Discu-
sión sobre Terapia Génica (Gene Therapy Discussion Group o GTDG) que trata los aspectos actuales sobre el desarrollo e inves-
tigación de productos de terapia génica y que ha emitido diversas Consideraciones de la ICH que reflejan los principios armo-
nizados. Los National lnstitutes of Health (Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos o NIH) han publicado las Guide-
lines for Researchlnvolving RecombinantDNA Molecules(Guías para la Investigación de Moléculas de ADN Recombinante) que
requieren la revisión de la investigación por parte de NIH, incluyendo investigaciones o ensayos clínicos realizados o patrocina-
dos por instituciones que reciben fondos de NIH. Estas guías se aplican a muchos productos de terapia génica.
Se recomiendan ampliamente los estándares biológicos y bioquímicos para GC de la producción y el análisis de productos
de terapia génica. La diversidad de productos de terapia génica, en particular los vectores virales, ha limitado el desarrollo de
estándares con amplia capacidad de aplicación. Una preparación de RCRde VLM(VR-1450) con un título de infectividad asig-
nado está disponible en ATCC para el análisis de vectores retrovirales murinos para determinar la presencia de RCR.Un están-
dar de referencia de adenovirus salvaje tipo 5 con un número de partículas y un título de infectividad asignados para caracteri-
zación de vectores adenovirales también está disponible en ATCC.Se ha etablecido un grupo de trabajo para supervisar el de-
sarrollo de un estándar de referencia de VAA.No obstante, se han presentado diversos obstáculos para seleccionar, desarrollar,
establecer y poner en circulación estándares adecuados, los cuales incluyen tomar decisiones sobre qué serotipo de virus se
usará de manera más común y exitosa para terapia génica, la disponibilidad de materiales preparados conforme a las BPF,la
seguridad, la estabilidad a largo plazo, el transporte y el inicio y culminación de estudios colaborativos para evaluar los están-
dares candidatos. Asimismo, el desarrollo de estándares para otros vectores virales, incluyendo vectores lentivirales, del virus
del herpes y poxvirales, sigue siendo un desafío.
En la actualidad se encuentran disponibles nuevas metodologías, incluyendo proteómicos, tecnologías basadas en ácidos nu-
cleicos (NAT,por sus siglas en inglés) novedosas, métodos de modificación de proteínas y aislamiento y cultivo de células ma-
dre, y, en muchos casos, se aplican al desarrollo, caracterización y análisis de productos de terapia génica. Además, el uso de
polímeros sintéticos tanto para modificar vectores virales existentes como para el desarrollo de vectores sintéticos químicamen-
te dinámicos ofrece ventajas tales como circulación sistémica mejorada, mejor dirección y liberación y menores niveles de in-
munoestimulación e inflamación. La disponibilidad de poblaciones de células madre definidas y los métodos mejorados de in-
jerto deben llevar a una mayor efectividad de células transducidas ex vivo usadas en protocolos de terapia génica. La introduc-
ción de nuevas metodologías requerirá de revisión continua y supervisión reglamentaria para asegurar la calidad y seguridad
de los productos de terapia génica del futuro.
GLOSARIO
Adenovirus: Virus perteneciente a la familia Adenoviridae de virus de ADN con un virión sin envoltura con 252 capsómeros y
un diámetro entre 70 y 90 nm; una sola molécula lineal de ADN de doble cadena (36 a 38 kb); al menos 1O proteínas estructu-
rales resistentes al éter y estables en ácido; los viriones son liberados mediante destrucción celular.
ADN Complementario (ADNc): El ADN sintetizado a partir de un ARNm y no de un molde de ADN. Se usa para clonación o
como sonda de ADN para localizar genes específicos.
ADN Desnudo: ADN aislado y purificado que carece de proteínas o lípidos.
ADN Recombinante: ADN que se produce mediante la unión de fragmentos de ADN de diversas fuentes a través de mani-
pulaciones in vitro.
Agente Adventicio: Agente extraño que se introduce accidental o inadvertidamente; no es natural ni hereditario (como en la
contaminación microbiana, química o bioquímica de una sustancia purificada).
Anticuerpos Monoclonales: Anticuerpos derivados de un único don celular.
Antígenos de Leucocitos Humanos (HLA, por sus siglas en inglés): Proteínas controladas por el complejo principal de his-
tocompatibilidad. Estas proteínas tienen un papel preponderante en la determinación de la compatibilidad para trasplantes.
Autólogo: Que se obtiene del organismo propio.
Bioensayo: Medición de la efectividad de un compuesto por su efecto en animales o células en comparación con una prepa-
ración estándar. 0fer también Potencia.)
Biotecnología: Toda técnica que utilice organismos vivos (o partes de estos) para producir o modificar productos, mejorar
plantas o animales o desarrollar microorganismos para usos específicos. La definición más nueva se refiere al uso industrial y
farmacéutico del ADN recombinante, fusión celular, nuevas técnicas de bioprocesamiento y terapia génica.
BPFv: Abreviatura para Buenas Prácticas de Fabricación vigentes. La FDA resalta las BPFven el Título 21 del CFRy en Federal
Register(Registro Federal), así como en sus Pointsto Consider(Puntos a Considerar).
Célula Germinal: Célula reproductiva (esperma u óvulo), gameto o célula sexual.
Célula Madre: Célula inmortal capaz de proliferar y diferenciarse en distintos tipos de células especializadas. Se supone que
cada sistema de tejidos importante tiene su propia célula madre.
CFTR: Regulador de la conductancia transmembrana de fibrosis quística.
Citoquina: Todo factor que actúa sobre las células; por lo general, una proteína que favorece el crecimiento.
Citoplasma: Material celular contenido entre la membrana celular y el núcleo.
Citotóxico: Capaz de causar la muerte celular.
Clasificador de Células Activado por Fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés): Equipo que clasifica células basándo-
se en marcadores fluorescentes unidos a las células.
Construcción Génica: Vector de expresión que contiene la secuencia de codificación de una proteína y los elementos nece-
sarios para su expresión.
Cultivo en Suspensión: Células capaces de crecer en suspensión sin necesidad de adherirse a un sustrato (soporte) para ge-
nerar la división celular.
Diferenciación: Proceso de cambios bioquímicos y estructurales mediante el cual las células adquieren forma y función espe-
cializadas.
Electroporación: Método para permitr la transferencia de material a las células que implica el uso breve de un campo eléctri-
co para crear poros temporales en la membrana celular.
ELISA: Enzimoinmunoensayo. lnmunoensayo que utiliza un antígeno o anticuerpo marcado con una enzima para detectar la
unión de una molécula a una matriz sólida.
Endonucleasa de Restricción: Endonucleasa que reconoce una secuencia específica de bases dentro de un ADN de doble
cadena.
Enfermedad del Injerto Contra el Anfitrión (GVDH, por sus siglas en inglés): Rechazo del tejido transplantado por parte
del anfitrión. Es la causa principal de muerte del paciente cuando se utiliza un tejido alogénico mal compatibilizado con el
receptor.
Episomal: Perteneciente a cualquier material genético extracromosómico accesorio.
Ex Vivo: Procedimiento que se lleva a cabo fuera de un organismo vivo.
Exento de suero: Se refiere al medio de crecimiento celular que carece de componentes séricos.
Factores de Crecimiento: Factores responsables de regular la proliferación, función y diferenciación celular.
Fase S: Parte del ciclo celular en la que ocurre la replicación del ADN (Fasede Síntesis).
Formulado: Preparado de acuerdo con condicones o métodos prescritos.
Fusión: Unión de la membrana de dos células, para generar una célula hija que contiene algunas de las propiedades de cada
célula paterna. Se usa en la generación de hibridomas en los que las células que producen anticuerpos se fusionan con células
de mieloma de ratón.
Genoma: Material hereditario total de una célula.
Hematopoyético: Perteneciente o con influencia sobre la formación de células sanguíneas.
Hepatocito: Células predominantes del hígado, que cumplen una función importante en el metabolismo y son productoras
de proteínas séricas. Por lo general, estas células no están en división pero si se dañan, se pueden dividir y regenerar hasta
reponer las células dañadas.
Hibridación Dot Blot (ADN o ARN): Técnica para detectar, analizar e identificar proteínas; similar a la transferencia Western
(Western blot) pero sin separación electroforética de proteínas.
Humoral: Perteneciente a los elementos encontrados en los fluidos corporales (por ejemplo, inmunidad humoral y anticuer-
pos neutralizantes).
lnmunoensayo: Técnica para identificar sustancias basada en el uso de anticuerpos.
In Vivo: Procedimiento que se lleva a cabo dentro de un organismo vivo.
In Vitro: Procedimiento que se lleva a cabo fuera de un organismo vivo. Puede involucrar células o tejidos derivados de los
organismos.
Integración: Asimilación (inserción mediante unión covalente) de material genético (ADN) en el cromosoma de una célula
receptora.
lntracuerpos: Anticuerpos intracelulares que no se secretan y que están diseñados para unir e inactivar moléculas blanco
dentro de las células.
Leucemia: Neoplasia maligna de los tejidos formadores de la sangre.
Línea Celular Empaquetadora: Línea celular que produce proteínas requeridas para empaquetar y producir vectores virales
de manera activa pero que no produce virus competentes para la replicación. Complementa a nivel proteico las carencias ge-
néticas del vector.
Línea Celular Productora: Línea celular establecida que se usa para producir vectores de virus, a menudo a gran escala.
Líneas Celulares: Células que derivan de cultivos primarios de embriones, tejido u órganos. Estas líneas celulares pueden te-
ner una vida finita o pueden inmortalizarse (modificadas para replicarlas indefinidamente).
Lipoplex: Formulación de lípidos y polímeros y/o proteínas.
Liposoma: Bicapa de lípidos esférica que encierra un compartimento acuoso.
Materiales Auxiliares: Componentes usados durante la fabricación que no deben estar presentes en el producto final. Ejem-
plos: factores de crecimiento, citoquinas, anticuerpos monoclonales, dispositivos de separación de células y componentes de
los medios.
Mutagénesis lnsercional: Tipo de mutación ocasionada por la inserción de ácido nucleico en un cromosoma de la célula
anfitriona. Existen múltiples consecuencias negativas posibles por este evento, incluida la muerte de la célula cuando se inacti-
va un gen esencial o predisposición al cáncer si se inactiva un gen supresor de tumores.
Oligonucleótido: Polímero que consiste en un pequeño número de nucleótidos, por lo general de 5 a 30.
Oncogenes: Genes asociados con la proliferación neoplásica (cáncer) después de una mutación o perturbación de su expre-
sión.
Oncogénico: Que ocasiona cáncer.
Par de Base: Dos bases de nucleótido en cadenas diferentes de la molécula de ácido nucleico que se unen.
Parvovirus: Virus de ADN de la familia Parvoviridae. La variedad de anfitriones incluye muchas especies de vertebrados. ADN
pequeño de cadena simple lineal con bucles terminales en forma de horquilla.
Plásmido: Forma pequeña y circular de ADN que porta determinados genes y que es capaz de replicarse de manera inde-
pendiente en una célula anfitriona.
Potencia: Medición cuantitativa de la actividad biológica basada en el atributo del producto vinculado a las propiedades bio-
lógicas relevantes.
Producto Biológico: Cualquier virus, suero terapéutico, toxina, antitoxina o productoanálogoaplicable a la prevención, trata-
miento o cura de enfermedades o lesiones en humanos. (En esta definición derivada de la FDA,el término producto análogo
indica que incluye esencialmente productos obtenidos por biotecnología y procedimientos que incluyen terapia génica, pro-
ductos transgénicos y terapia celular somática.)
Promotor: Secuencia de ADN que se localiza en la parte frontal de un gen y que controla la expresión génica. Es necesario
para unir la ARN polimerasa e iniciar la transcripción.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés): Técnica para amplificar una secuencia específica de
nucleótidos de ADN o ARN mediante ciclos de copiado que utilizan polimerasa, dando como resultado incrementos geométri-
cos en el número de copias.
Retrovirus: Virus que contiene transcriptasa reversa, la cual convierte el ARNviral en ADN que posteriormente se integra a la
célula anfitriona en una forma denominada provirus.
Simulacro de Prueba: Corrida de una prueba en la que deliberadamente se omiten algunos reactivos críticos.
Terapia Celular: Terapia que utiliza células completas para tratar una enfermedad, afección o lesión. Es diferente del trans-
plante de tejidos y órganos.
Lt
Terapia Génica: Terapia que emplea ácidos nucleicos que se expresan de manera subsiguiente como ARN o proteínas para
tratar una enfermedad o condición. La FDAde los EE.UU.define los productos de terapia génica como productos que contie-
nen material genético que se administran para modificar o manipular la expresión de material genético a fin de alterar las pro-
piedades biológicas de células vivas.
Transducción: Transferencia y expresión de material genético en una célula mediante un vector viral o bacteriófago.
Transfección: Transferencia de ADN a las células por medios físicos tales como coprecipitación con fosfato de calcio.
TransferenciaWestern (Western Blot): Método de electrotransferencia de proteínas en el que éstas se transfieren de un gel
a un soporte rígido y delgado (p. ej., membrana de nitrocelulosa), sobre el que posteriormente se detectan mediante la unión
de anticuerpos unidos a enzimas, que permiten el uso de un sustrato cromogénico o quimioluminiscente precipitante, o de
anticuerpos marcados radioactivamente.
Transgén: Se refiere al material genético extraño administrado como parte de una construcción de vectores.
Validación del Proceso: Método para suministrar documentación probatoria de que el proceso de fabricación está controla-
do, es reproducible y capaz de generar uniformemente un producto que cumple con especificaciones predeterminadas.
Vector: Agente (plásmido, virus o complejo liposoma-proteína o complejo ADN-proteína) usado para introducir ADN en una
célula.
Viabilidad: Propiedad de estar vivo y ser funcional.
Virión: Partícula viral elemental que consta de material genético (nucleocápside) y un recubrimiento proteico.
Virus: Agente infeccioso submicroscópico que contiene información genética necesaria para la reproducción. Es un parásito
intracelular obligado.
Virus Anfotrópico: Virus que infecta y se replica en células de múltiples especies.
Virus Asociadocon Adenovirus (VAA): El parvovirus humano contiene un genoma de ADN de cadena simple y depende de
virus colaboradores (adenovirus, virus del herpes o virus vaccinia) para su replicación. Sin la coinfección, los viriones salvajes se
integran en un sitio específico en el cromosoma 19 y permanecen latentes.
Virus Colaborador: Ayuda al desarrollo de un virus defectuoso suministrando o restaurando la actividad de un gen viral o
permitiendo que el virus defectuoso forme una envoltura funcional.
Virus Competente para la Replicación(VCR): Virus que puede completar un ciclo de replicación completo sin requerir un
virus colaborador; virus que se replica de manera autónoma.
Virus con Envoltura: Virus que contienen una bicapa lipoproteica que rodea la cápside y que se adquiere mediante gema-
ción a través de la membrana celular de las células anfitrionas.
Virus del Herpes Simple (VHS): Virus de ADN miembro de la familia Herpesviridae. Puede infectar tanto a vertebrados de
sangre caliente como de sangre fría por contacto con superficies mucosas húmedas.
Virus Ecotrópico: Virus que infecta y se replica en células derivadas únicamente de la especie anfitriona original.
Xenogénico: De una especie diferente.
APÉNDICE
Lista de Referencias Regulamentarias Pertinentes
Los productos de terapia génica son reglamentados por la FDAcomo productos biológicos y, por lo tanto, su fabricación,
análisis, etiquetado y demás factores están sujetos a los requisitos codificados en el CFRy en los documentos guía de la FDA
(www.fda.gov), Las pautas de la ICH ofrecen guías adicionales (www.ich.org). Los fabricantes de productos de terapia génica
que buscan mercados fuera de los Estados Unidos deben referirse a los documentos reglamentarios de los países pertinentes.
De manera complementaria a los capítulos de USP,la siguiente lista incluye documentos reglamentarios, además de las mejo-
res prácticas para el desarrollo, la fabricación, el control de calidad y la garantía de calidad de los productos de terapia génica:
CFR
21 CFR 210
21 CFR 211
21 CFR 600s
21 CFR 61 O Subparte G
21 CFR 801
21 CFR 820
DOCUMENTOSGUÍADE LAFDA
Guideline for the Determination of Residual Moisture in Dried Biological Products (enero 1990)
Guidance for lndustry: Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy (marzo 1998)
Guidance for lndustry: Supplemental Guidance on Testing for Replication-Competent Retrovirus in Retroviral Vector-Based
Gene Therapy Products and During Follow-up of Patients in Clinical Trials Using Retroviral Vectors (octubre 2000)
USP42 Información General/ (1048) Calidad de Productos Biotecnológicos: Análisis 7543
FDAGuidance for lndustry: lnvestigating Out-of-Specification (OOS) Test Results for Pharmaceutical Production (octubre
2006)
Guidance for FDAReviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) lnforma-
tion for Human Gene Therapy lnvestigational New Drug Applications (INDs) (abril 2008)
Draft Guidance for lndustry: Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products (octubre 2008)
DOCUMENTOSREGLAMENTARIOS
NACIONALESE INTERNACIONALES
QSA(Rl ): Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Unes of Human or Animal Origin
ICH QSC: Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products
ICH QSD: Quality of Biotechnological Products: Derivation and Characterization of Cell Substrates Used for Production of
Biotechnological/Biological Products
ICH Q6B Specification: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
ICH Q2 (Rl): Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology
NIH Guidelines for Research lnvolving Recombinant DNA Molecules
(1048) CALIDADDE PRODUCTOSBIOTECNOLÓGICOS: ANÁLISISDE

LACONSTRUCCIÓNEXPRESABLE EN CÉLULASUSADASPARALA
PRODUCCIÓNDE PRODUCTOSPROTEÍNICOSOBTENIDOSCON ADN
RECOMBINANTE,
l. INTRODUCCIÓN
Este documento proporciona una guía para caracterizar construcciones expresables para la producción de productos proteí-
nicos a partir de ADN recombinante (ADN-r) en células eucarióticas y procarióticas. El propósito de este documento es descri-
bir las clases de información importantes para evaluar la estructura de la construcción expresable para producir proteínas obte-
nidas con ADN-r. Este documento no pretende cubrir todos los aspectos relativos a la calidad de los productos medicinales
obtenidos con ADN-r.
La construcción expresable se define como el vector de expresión que contiene la secuencia codificadora de la proteína re-
combinante. Para asegurar la calidad y la uniformidad del producto final, se deben analizar los segmentos de la construcción
expresable utilizando técnicas para ácidos nucleicos junto con otras pruebas realizadas sobre la proteína recombinante purifica-
da. Se debe considerar al análisis de la construcción expresable a nivel del ácido nucleico como una parte de la evaluación
general de calidad, teniendo en cuenta que esta prueba solo evalúa la secuencia codificadora de un gen recombinante y no la
fidelidad de la traducción ni otras características de la proteína recombinante, tal como su estructura secundaria, su estructura
terciaria y las modificaciones posteriores a la traducción.
11.FUNDAMENTOSPARA ELANÁLISISDE LA CONSTRUCCIÓN

EXPRESABLE
El propósito de realizar el análisis de la construcción expresable es establecer que se ha incorporado la secuencia codificado-
ra correcta del producto en la célula anfitriona y que esta secuencia se mantiene sin cambios desde el comienzo del cultivo
hasta el final de la producción. La secuencia genética de las proteínas recombinantes que se producen en células vivas puede
sufrir mutaciones que podrían alterar las propiedades de la proteína con probables consecuencias adversas para los pacientes.
No se puede esperar que un único enfoque experimental detecte todas las modificaciones posibles de una proteína. Se pueden
emplear técnicas de análisis de proteínas para evaluar la secuencia de aminoácidos de una proteína y las características estruc-
1 La presente guía ha sido desarrollada por

el Grupo de Trabajo de Expertos (en Calidad) de la Conferencia Internacional para la Armonización de Requisitos
Técnicos para el Registro de Medicamentos destinados para Uso de Seres Humanos (ICH por sus siglas en inglés) y para su redacción se han consultado a diversos
organismos regulatorios, de conformidad con los procedimientos de la ICH. Este documento ha sido ratificado por el Comité Directivo de la ICH en la Etapa4 del
procedimiento de la ICH, el 29 de noviembre de 1995. Al llegar a la Etapa4 del procedimiento, se recomienda la adopción del borrador final a los organismos
regulatorios de la Unión Europea, Japón y los Estados Unidos. Esta guía ha sido publicada en el Diario Oficial (Federal Register) el 23 de febrero de 1996 (61 FR
7006) y es aplicable a fármacos y productos biológicos. A pesar de que esta guía no crea ni confiere derecho alguno a persona alguna y que no obliga a la
Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés) ni al sector industrial, este documento representa la posición actual de la FDA
respectode la producciónde productosproteínicosobtenidoscon ADN recombinante.Paraobtener copiasadicionalesde esta guía, comunicarsecon: Drug
lnformation Branch, HFD-210, CDER,FDA,5600 Fishers Lane, Rockville, MD 20857 (Teléfono: 301-827-4573) o con Manufacturers Assistance and Communication
Staff (HFM-42), CBER,FDA, 1401 RockvillePike, Rockville, MD 20852-1448. Enviar una etiqueta autoadhesiva con nombre y dirección impresos para facilitar el
trámite de la solicitud.Tambiénse encuentradisponibleuna versiónen formato electrónicode esta guía en Internet usandola Red Mundial 0f'NJW) ( conectarsea
la Página Inicial de CDER(CDERHome Page) en http://www.fda.gov/cder e ir a la sección "Regulatory Guidance").
7544 (1048) Calidad de Productos Biotecnológicos: Análisis / InformaciónGeneral USP42
turales de la proteína expresada debidas a modificaciones posteriores a la traducción, tal como el procesamiento proteolítico,
la glicosilación, la fosforilación y la acetilación. Los datos del análisis del ácido nucleico podrían ser útiles ya que los métodos
de análisis de proteínas pueden no detectar todos los cambios estructurales de la proteína que resultan de mutaciones en la
secuencia codificadora de la proteína recombinante. La importancia relativa del análisis del ácido nucleico y del análisis de la
proteína varían de un producto a otro.
El análisis del ácido nucleico se puede emplear para verificar la secuencia codificadora y el estado físico de la construcción
expresable. El análisis de ácido nucleico se realiza para asegurar que la proteína expresada tendrá la secuencia de aminoácidos
correcta, pero no está concebido para detectar niveles bajos de secuencias variantes. Cuando las células de producción tienen
múltiples copias integradas de la construcción expresable y no todas ellas son activas para la transcripción, un examen del pro-
ducto de transcripción en sí mediante un análisis de ARN mensajero (ARN-m) o ADN codificador (ADN-c) puede ser más ade-
cuado que un análisis del ADN genómico. Los enfoques analíticos que examinan el grueso de una población de ácidos nuclei-
cos, como por ejemplo los que se realizan sobre combinaciones de clones o sobre material amplificado por reacción en cadena
con polimerasa, pueden ser considerados como una alternativa a los enfoques que dependen de la selección de clones de ADN
individuales. Se podrán tener en cuenta otras técnicas que permitan la confirmación rápida y sensible de la secuencia codifica-
dora de la proteína recombinante en la construcción expresable.
En las siguientes secciones se describe la información que se debe suministrar con respecto a la caracterización de la cons-
trucción expresable durante el desarrollo y la validación del sistema de producción. Deben validarse las metodologías analíticas
previstas para la confirmación de la secuencia. La documentación de validación debe incluir, como mínimo, estimaciones de
los límites de detección para las secuencias variantes. Esto debe llevarse a cabo para los métodos de secuenciación de ácidos
nucleicos y de proteínas. Se deben revisar periódicamente la filosofía y las recomendaciones referidas a los análisis que se ex-
presan en este documento, con el fin de aprovechar los adelantos tecnológicos y los avances en la información científica.
111.CARACTERIZACIÓN
DELSISTEMADE EXPRESIÓN
A. ConstrucciónExpresabley Clon Celular Utilizado para Desarrollar el Bancode CélulasMaestro
Elfabricante debe describir el origen de la secuencia de nucleótidos codificadora de la proteína. Debe incluirse la identifica-
ción y la fuente de la célula originaria de la secuencia nucleotídica. También se deben describir los métodos empleados para
preparar el ADN que codifica la proteína.
Se deben describir detalladamente los pasos empleados para ensamblar la construcción expresable. Esta descripción debe
incluir la fuente y la función de las partes que componen la construcción expresable, por ejemplo los orígenes de replicación,
los genes de resistencia a antibióticos, promotores, potenciadores y si la proteína se sintetiza como una proteína de fusión. Se
debe proporcionar un mapa detallado de los componentes y una secuencia completa del plásmido con anotaciones, indicando
las regiones secuenciadas durante la construcción y las secuencias extraídas de la bibliografía. Se deben indicar otras proteínas
expresables codificadas por el plásmido. Se deben determinar la secuencia nucleotídica de la región codificadora del gen de
interés y de las regiones adyacentes asociadas que se insertan en el vector, hasta el empalme de inserción, inclusive, mediante
el secuenciamiento del ADN de la construcción.
Se debe describir del método de transferencia de la construcción expresable a la célula anfitriona. Asimismo, se deben des-
cribir detalladamente los métodos empleados para amplificar la construcción expresable y el criterio utilizado para la selección
de clones celulares para su producción.
B. Sistemade Bancode Células
La producción de proteínas recombinantes debe basarse en un Banco de Células Maestro y en Bancos de Células de Trabajo
bien definidos. Un banco de células es un conjunto de ampollas con una composición uniforme almacenadas en condiciones
definidas; cada ampolla contiene una alícuota de una sola combinación de células. El Banco de Células Maestro por lo general
proviene del don celular seleccionado que contiene la construcción expresable. El Banco de Células de Trabajo se obtiene por
propagación de una o varias ampollas del Banco de Células Maestro. Se deben detallar la historia de la línea celular y la pro-
ducción de los bancos celulares, incluyendo los métodos y los reactivos utilizados durante el cultivo, la edad de las células in
vitro y las condiciones de almacenamiento. Todos los bancos de células deben caracterizarse mediante los marcadores fenotípi-
cos y genotípicos pertinentes, que podrían incluir la expresión de la proteína recombinante o la presencia de la construcción
expresable.
Se debe analizar la construcción expresable en el Banco de Células Maestro según se describe a continuación. Si la prueba
no se puede llevar a cabo en el Banco de Células Maestro, se debe realizar en cada Banco de Células de Trabajo.
Se debe emplear el mapeo con endonucleasas de restricción u otras técnicas adecuadas para analizar la construcción expre-
sable para determinar el número de copias, las inserciones o eliminaciones y el número de sitios de integración. Para los siste-
mas de expresión extracromosómica, se debe determinar el porcentaje de células anfitrionas que retienen la construcción ex-
presable.
Se debe verificar la secuencia codificadora de proteína para el producto de proteína recombinante de la construcción expre-
sable. Para los sistemas de expresión extracromosómica, se debe aislar la construcción expresable y verificar la secuencia nu-
cleotídica codificadora del producto sin clonación adicional. Para las células con copias macrosómicas de la construcción ex-
USP42 InformaciónGeneral/ (1048) Calidad de Productos Biotecnológicos: Análisis 7545
presable, la secuencia nucleotídica codificadora del producto puede verificarse a través de una nueva clonación y secuencia-
miento de las copias cromosómicas. Alternativamente, se puede verificar la secuencia nucleotídica codificadora del producto
empleando diversas técnicas, tales como el secuenciamiento de clones de ADN-c combinados, o amplificando el material por
la reacción en cadena con polimerasa. La secuencia nucleotídica debe ser idéntica a la determinada para la construcción expre-
sable dentro de los límites de detección de la metodología, según se describe en la sección 111.A.,
y debe corresponder a lo
esperado para la secuencia de la proteína.
C. Límite de Edad para las Célulasde ProducciónIn Vitro
El límite de edad para las células de producción in vitro se debe basar en datos obtenidos de células productoras propagadas
a escala de planta piloto o a escala normal de producción hasta la edad propuesta para las células in vitro o más. Por lo gene-
ral, las células productoras se obtienen mediante la propagación del Banco de Células de Trabajo; el Banco de Células Maestro
podría emplearse para preparar células de producción si se justifica debidamente.
La construcción expresable de las células de producción debe analizarse una vez para el Banco de Células Maestro, según se
indica en la sección 111.B.,pero se podría verificar la secuencia codificadora de la proteína de la construcción expresable me-
diante pruebas de ácido nucleico o bien mediante análisis del producto proteínico final. Todo incremento en el límite de edad
definido para las células productoras in vitro debe basarse en datos obtenidos de células propagadas in vitro hasta una edad
igual o mayor que el nuevo límite de edad para las células in vitro.
IV. CONCLUSIÓN
La caracterización de la construcción expresable y de la proteína purificada final son importantes para asegurar la produc-
ción uniforme de un producto obtenido con ADN-r. Según se ha descrito anteriormente, para asegurar la calidad de un pro-
ducto de proteína recombinante se deben evaluar los datos del análisis de ácidos nucleicos y de la evaluación de la proteína
purificada final.
GLOSARIO
Banco de Células de Trabajo (BCT): El Banco de Células de Trabajo se prepara a partir de alícuotas de una suspensión ho-
mogénea de células obtenidas del cultivo de material del Banco de Células Maestro en condiciones de cultivo definidas.
Banco de Células Maestro (BCM): Es una alícuota de una combinación única de células que se ha preparado por lo general
a partir de un don celular seleccionado en condiciones definidas, dispensada en múltiples recipientes y almacenada en condi-
ciones definidas. El Banco de Células Maestro se emplea para proporcionar todos los bancos de células de trabajo. Las pruebas
que se realizan en un Banco de Células Maestro nuevo (a partir de un previo don celular inicial, Banco de Células Maestro o
Banco de Células de Trabajo) deben ser las mismas que las realizadas en el Banco de Células Maestro a menos que se justifique
otra cosa.
Construcción Expresable: Es el vector de expresión que contiene la secuencia codificadora de la proteína recombinante y los
elementos necesarios para su expresión.
Edad de Células In Vitro: Es la medida del tiempo transcurrido desde la descongelación del vial o viales del Banco de Células
Maestro hasta la cosecha del recipiente de producción, medido en tiempo cronológico trascurrido en cultivo, mediante el nú-
mero de duplicaciones de la población o el número de pasajes de las células cuando se subcultivan mediante un procedimien-
to definido para la dilución del cultivo.
Escala de Planta Piloto: La producción de una proteína recombinante mediante un procedimiento que simula y es total-
mente representativo de una escala de fabricación comercial. Los métodos de propagación celular, la cosecha y la purificación
del producto deben ser idénticos, excepto por la escala de producción.
Marcadores Genotípicos y Fenotípicos Relevantes: Son los marcadores que permiten identificar la cepa de la línea celular y
que deben incluir la expresión de la proteína recombinante o la presencia de la construcción expresable.
Regiones de Control Adyacentes: Son secuencias nucleotídicas no codificadoras que están adyacentes a los extremos 5' y 3'
de la secuencia codificadora del producto y que contienen elementos importantes que afectan la transcripción, traducción o
estabilidad de la secuencia codificadora. Estas regiones incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras, potenciadoras y de
empalme y no incluyen los orígenes de la replicación ni los genes de resistencia a los antibióticos.
Sitio de Integración: Es el sitio donde una o varias copias de la construcción expresable se integran al genoma de la célula
anfitriona.
7546 (1049) Calidad de Productos Biotecnológicos: Estabilidad / Información General USP42
(1049) CALIDADDE PRODUCTOSBIOTECNOLÓGICOS: PRUEBASDE

ESTABILIDADDE PRODUCTOSBIOTECNOLÓGICOSO BIOLÓGICOS,
INTRODUCCIÓN
(1)
Las pautas establecidas en la guía armonizada tripartita de la ICH, titulada "Pruebas de Estabilidad de Nuevos Fármacos y
Productos Farmacéuticos" (publicada por la ICH el 27 de octubre de 1993) son aplicables en general a productos biotecnoló-
gicos o biológicos. Sin embargo, los productos biotecnológicos o biológicos tienen características distintivas que deben tenerse
en cuenta en cualquier programa de prueba bien definido, diseñado para confirmar su estabilidad durante el período de alma-
cenamiento deseado. Para tales productos, en los cuales los componentes activos son típicamente proteínas y/o polipéptidos,
el mantenimiento de la conformación molecular y, por lo tanto, de la actividad biológica, depende tanto de fuerzas no cova-
lentes como de fuerzas covalentes. Los productos son particularmente sensibles a factores ambientales tales como cambios de
temperatura, oxidación, luz, contenido iónico y cizalladura. Para asegurar el mantenimiento de la actividad biológica y evitar la
degradación, por lo general son necesarias condiciones rigurosas para su almacenamiento.
Es posible que la evaluación de la estabilidad necesite metodologías analíticas complejas. Las valoraciones de actividad bioló-
gica, cuando correspondan, deben ser parte de los estudios esenciales de estabilidad. Los métodos fisicoquímicos, bioquímicos
e inmunoquímicos adecuados para el análisis de la entidad molecular y para la detección cuantitativa de productos de degra-
dación también deben formar parte del programa de estabilidad toda vez que la pureza y las características moleculares del
producto permitan el uso de estas metodologías.
Con estas inquietudes en mente, el solicitante debe desarrollar los datos adecuados que justifiquen la estabilidad de un pro-
ducto biotecnológico o biológico y tener en cuenta numerosas condiciones externas que puedan afectar la potencia, la pureza
y la calidad del producto. Los datos primarios para avalar un período de almacenamiento solicitado, ya sea para un fármaco o
un producto farmacéutico, deben basarse en estudios de estabilidad a largo plazo, en tiempo real y en condiciones reales. De
este modo, el desarrollo de un programa de estabilidad a largo plazo adecuado resulta fundamental para el desarrollo exitoso
de un producto comercial. El propósito de este documento es dar pautas a los solicitantes respecto del tipo de estudios de
estabilidad que deben proporcionarse para avalar las solicitudes de comercialización. Se entiende que durante el proceso de
revisión y evaluación, pueden ocurrir actualizaciones continuas de los datos de estabilidad iniciales.
ALCANCEDELANEXO(2)
Las pautas que se establecen en este anexo para las "Pruebas de Estabilidad de Nuevos Fármacos y Productos Farmacéuti-
cos" son aplicables a proteínas y polipéptidos bien caracterizados, sus derivados y los productos de los cuales son componen-
tes, y que se aíslan de tejidos, fluidos corporales, cultivos celulares, o se producen usando tecnología de ácido desoxirribonu-
cleico recombinante (ADN-r). Por lo tanto, el documento abarca la generación y presentación de datos de estabilidad para
productos tales como citocinas (interferones, interleuquinas, factores estimulantes de colonias, factores de necrosis tumoral),
eritropoyetinas, activadores de plasminógeno, factores de plasma sanguíneo, hormonas y factores del crecimiento, insulinas,
anticuerpos monoclonales y vacunas constituidas por proteínas o polipéptidos bien caracterizados. Además, las pautas detalla-
das en las siguientes secciones pueden aplicarse a otros tipos de productos, tales como vacunas convencionales, después de
consultar con las autoridades reguladoras correspondientes. El documento no abarca a los antibióticos, extractos alergénicos,
heparinas, vitaminas, sangre entera ni componentes celulares sanguíneos.
TERMINOLOGÍA
(3)
El lector debe consultar el "Glosario" en "Pruebas de Estabilidad de Nuevos Fármacos y Productos Farmacéuticos", para en-
contrar las definiciones de los términos básicos usados en este anexo. No obstante, dado que los fabricantes de productos bio-
tecnológicos o biológicos en ocasiones emplean terminología tradicional, los términos tradicionales figuran especificados entre
1 La presente guía ha sido desarrollada por el Grupo de Trabajo de Expertos (en Calidad) de la Conferencia Internacional sobre Armonización
de Requisitos
Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos destinados para Uso en Seres Humanos (ICH por sus siglas en inglés), y para su redacción ha sido sometida a
consulta por los diversos organismos reguladores, en conformidad con el proceso de la ICH. Este documento ha sido ratificado por el Comité Directivo de la ICH
en la Etapa 4 del proceso de la ICH, el 20 de noviembre de 1995. En la Etapa 4 del proceso, se recomienda la adopción del borrador final a los organismos
reguladores de la Unión Europea, Japón y los Estados Unidos. Esta guía ha sido publicada en el Diario Oficial (Federal Register) el 10 de julio de 1996 (61 FR 36466)
y es aplicable a productos farmacéuticos y biológicos. Pese a que esta guía no crea o confiere derechos a favor de o para persona alguna y que no es vinculante
para la FDA ni para el sector industrial relevante, este documento representa la posición actual de la agencia respecto a las pruebas de estabilidad de productos
biotecnológicos o biológicos. Para obtener copias adicionales de esta guía, comuníquese con: Drug lnformation Branch, HFD-21O, CDER,FDA,5600 Fishers Lane,
Rockville,MD 20857 (Teléfono: 301-827-4573) o con Manufacturers Assistance and Communication Staff (HFM-42), CBER,FDA, 1401 RockvillePike, Rockville,
MD 20852-1448. Envíe una etiqueta autoadhesiva con su nombre y dirección impresos en ella para facilitar el procesamiento de su solicitud. También se encuentra
disponible una versión de esta guía en formato electrónico en Internet usando la World Wide Web (WWW) (conectarse a la Página de Inicio de CDER(CDERHome
Page) en http://www.fda.gov/cder e ir a la sección "Regulatory Guidance").
USP42 InformaciónGeneral/ (1049) Calidad de Productos Biotecnológicos: Estabilidad 7547
paréntesis para ayudar al lector. También se incluye un glosario complementario que explica ciertos términos usados en la ela-
boración de productos biotecnológicos o biológicos.
SELECCIÓN
DE PARTIDAS(4)
Fármaco (Material a Granel) (4.1)
En los casos en los que el material a granel deba almacenarse después de su fabricación, pero antes de la formulación y
fabricación final, se deben proporcionar datos de estabilidad de al menos tres partidas cuya fabricación y almacenamiento sean
representativos de la escala de fabricación. Para los casos en los que se solicitan más de 6 meses de almacenamiento, debe
suministrarse, al momento de la presentación, un mínimo de datos de 6 meses de estabilidad. Para fármacos con períodos de
almacenamiento menores de 6 meses, la cantidad mínima de datos de estabilidad para la presentación inicial se determinará
basándose en cada caso en particular. Los datos de partidas realizadas a escala de planta piloto correspondientes a un fármaco
producido a una escala reducida de fermentación y purificación podrán proporcionarse en el momento en que se presente el
expediente ante las agencias reguladoras, con el compromiso de colocar las primeras tres partidas de escala de fabricación en
el programa de estabilidad a largo plazo después de su aprobación.
La calidad de las partidas de fármaco colocadas en el programa de estabilidad debe ser representativa de la calidad del ma-
terial utilizado en estudios preclínicos y clínicos y de la calidad del material que se producirá a escala de fabricación. Además, el
fármaco (material a granel) producido a escala de planta piloto, debe ser elaborado mediante un proceso y almacenado bajo
condiciones representativas de aquellas usadas para la escala de fabricación. Elfármaco ingresado en el programa de estabili-
dad debe ser almacenado en envases que sean representativos de aquellos usados para contener la sustancia durante la fabri-
cación. Los envases de tamaño reducido serán aceptables para pruebas de estabilidad de fármacos, siempre y cuando estén
fabricados con el mismo material y usen el mismo tipo de sistema de envase/cierre que se pretende utilizar durante la fabrica-
ción.
Productos Intermedios (4.2)
Durante la fabricación de productos biotecnológicos o biológicos, la calidad y el control de ciertos productos intermedios
puede ser fundamental para la producción del producto final. En general, el fabricante debe identificar los productos interme-
dios y generar datos internos y límites de procesos que aseguren su estabilidad, dentro de los parámetros del proceso desarro-
llado. Pese a que se permite el uso de datos a escala de planta piloto, el fabricante debe establecer la conformidad de tales
datos utilizando el proceso a escala de fabricación.
Producto Farmacéutico (Producto del Envase Final) (4.3)
Deberá proporcionarse información sobre la estabilidad de al menos tres partidas del producto del envase final, representati-
vas de aquellas que se usarán a escala de fabricación. Cuando sea posible, las partidas del producto del envase final incluidas
en la prueba de estabilidad deben provenir de distintas partidas del material a granel. Para los casos en los que se solicitan más
de 6 meses de almacenamiento, debe suministrarse, al momento de la presentación, un mínimo de datos de 6 meses de esta-
bilidad. Para productos farmacéuticos con períodos de almacenamiento menores de 6 meses, la cantidad mínima de datos de
estabilidad en la presentación inicial se determinará en cada caso en particular. La fecha de caducidad del producto debe ba-
sarse en los datos reales presentados como aval de la solicitud. Dado que la fecha se basa en los datos de tiempo real/tempera-
tura real presentados para revisión, deben efectuarse actualizaciones continuas de los datos de estabilidad inicial durante los
procesos de revisión y evaluación. La calidad del producto del envase final sometido a los estudios de estabilidad debe ser re-
presentativa de la calidad del material utilizado en los estudios preclínicos y clínicos. Los datos de partidas a escala de planta
piloto del producto farmacéutico podrán proporcionarse en el momento en que se presente el expediente ante las agencias
reguladoras, con el compromiso de incluir las primeras tres partidas a escala de fabricación en el programa de estabilidad a
largo plazo después de su aprobación. Cuando las partidas a escala de planta piloto hayan sido presentadas para establecer el
período de vida útil de un producto y, en caso de que el producto elaborado a escala de fabricación no cumpla con esas espe-
cificaciones de estabilidad a largo plazo durante todo el período de vigencia o que no sea representativo del material usado en
estudios preclínicos y clínicos, el solicitante debe notificar a las autoridades reguladoras correspondientes para determinar un
curso de acción adecuado.
Selección de muestras (4.4)
Cuando un producto es distribuido en partidas que difieran en volumen de llenado (por ejemplo, 1 mililitro (mL), 2 mL o 1O
ml), cantidad de unidades (por ejemplo, 1O unidades, 20 unidades o 50 unidades), o masa (por ejemplo, 1 miligramo (mg), 2
mg o 5 mg), las muestras que se ingresen al programa de estabilidad podrán ser seleccionadas basándose en un sistema de
matriz y/o por "bracketing" (estudio de inferencia por extremos).
7548 (1049) Calidad de Productos Biotecnológicos: Estabilidad/ Información General USP42
El matrizado, es decir, el diseño estadístico de un estudio de estabilidad en el cual se prueban diferentes fracciones de mues-
tras en distintos puntos de muestreo, solo debe aplicarse cuando se proporciona documentación adecuada que confirma que
la estabilidad de las muestras probadas representa la estabilidad de todas las muestras. Las diferencias en las muestras para el
mismo producto farmacéutico deben ser identificadas indicando, por ejemplo, que cubren distintas partidas, distintas concen-
traciones, distintos tamaños del mismo cierre y, posiblemente, en algunos casos, distintos sistemas de envase y cierre. El matri-
zado no debe aplicarse a muestras con diferencias que puedan afectar la estabilidad, tales como distintas concentraciones y
distintos envases y cierres, donde no pueda confirmarse que los productos responden de manera similar a las condiciones de
almacenamiento.
Cuando se utilicen la misma concentración y exactamente el mismo sistema de envase y cierre para tres o más volúmenes
de llenado, el fabricante puede optar por incluir solo los tamaños de envase más pequeño y más grande en el programa de
estabilidad, es decir, puede optar por el "bracketing". El diseño de un protocolo que incorpore "bracketing" supone que la
estabilidad de las muestras de condición intermedia están representadas por aquellas de los extremos. En ciertos casos, se pue-
den necesitar datos para demostrar que todas las muestras están adecuadamente representadas por los datos reunidos para los
extremos.
PERFIL INDICADOR DE ESTABILIDAD (5)
En general, no hay una valoración ni un parámetro único indicador de estabilidad que ofrezca un perfil de las características
de estabilidad de un producto biotecnológico o biológico. Por consiguiente, el fabricante debe proponer un perfil indicador de
estabilidad que garantice que los cambios en la identidad, pureza y potencia del producto serán detectados.
En el momento de la presentación, los solicitantes deben haber validado los métodos que comprenden el perfil indicador de
estabilidad y los datos deben estar disponibles para su revisión. La determinación de las pruebas que deben incluirse será espe-
cífica para cada producto. Los elementos enfatizados en las siguientes subsecciones no pretenden incluir todas las característi-
cas de un producto, sino representar aquellas que típicamente deben documentarse para demostrar en forma adecuada la es-
tabilidad del mismo.
Protocolo (5.1)
El expediente que acompaña la solicitud para autorización de comercialización debe incluir un protocolo detallado de la eva-
luación de la estabilidad tanto del fármaco como del producto farmacéutico, que justifiquen las condiciones de almacenamien-
to y los períodos de vida útil propuestos. El protocolo debe incluir toda la información necesaria que demuestre la estabilidad
del producto biotecnológico o biológico durante el período de vida útil propuesto incluyendo, por ejemplo, especificaciones
bien definidas e intervalos de prueba. Los métodos estadísticos que deben utilizarse se describen en la guía tripartita sobre
estabilidad.
Potencia (5.2)
Cuando el uso previsto de un producto está vinculado a una actividad biológica definible y mensurable, las pruebas de po-
tencia deben formar parte de los estudios de estabilidad. A efectos de las pruebas de estabilidad de los productos descritos en
esta guía, la potencia es la aptitud o capacidad específica de un producto para lograr su efecto previsto. Se basa en la medida
de algún atributo del producto y se determina por medio de un método cuantitativo in vivo o in vitro adecuado. En general,
las potencias de los productos biotecnológicos o biológicos probados por diferentes laboratorios pueden compararse en forma
significativa solo si se expresan en relación con la de un material de referencia adecuado. Para tal propósito, debe incluirse en
la valoración un material de referencia calibrado directa o indirectamente con respecto al material de referencia nacional o in-
ternacional correspondiente.
Los estudios de potencia deben realizarse a intervalos adecuados, según se define en el protocolo de estabilidad y los resulta-
dos deben expresarse en unidades de actividad biológica calibradas, siempre que sea posible, en relación a estándares recono-
cidos nacional o internacionalmente. Cuando no existan estándares de referencia nacionales ni internacionales, los resultados
de las valoraciones podrán ser informados en unidades obtenidas internamente, utilizando un material de referencia caracteri-
zado.
En algunos productos biotecnológicos o biológicos, la potencia depende de la conjugación del ingrediente o ingredientes
activos a una segunda subunidad o de la unión con un adyuvante. La disociación del ingrediente o los ingredientes activos del
transportador utilizado en conjugados o adyuvantes debe ser examinada en estudios en tiempo real/temperatura real (inclu-
yendo condiciones que se encuentran durante el transporte). Es posible que la evaluación de la estabilidad de tales productos
sea dificultosa, ya que, en ciertos casos, las pruebas in vitro de actividad biológica y de caracterización fisicoquímica son poco
prácticas o proporcionan resultados inexactos. Para superar las deficiencias de las pruebas in vitro, habrá que considerar estra-
tegias adecuadas (por ejemplo, probar el producto antes de la conjugación o unión, evaluar la liberación del compuesto activo
de la segunda subunidad, valoraciones in vivo) o el uso de una prueba alternativa adecuada.
USP42 InformaciónGeneral/ (1049) Calidad de Productos Biotecnológicos: Estabilidad 7549
Pureza y Caracterización Molecular (5.3)
A efectos de las pruebas de estabilidad de los productos descritos en esta guía, la pureza es un término relativo. Debido a los
efectos de la glicosilación, desamidación u otras heterogeneidades, la pureza absoluta de un producto biotecnológico o bioló-
gico es sumamente difícil de determinar. Por consiguiente, la pureza de un producto biotecnológico o biológico debe ser eva-
luada típicamente por más de un método y el valor de pureza que se obtenga dependerá del método. A efectos de las pruebas
de estabilidad, las pruebas de pureza deben concentrarse en los métodos para la determinación de los productos de degrada-
ción.
El grado de pureza, al igual que las cantidades individuales y totales de productos de degradación del producto biotecnoló-
gico o biológico ingresado en los estudios de estabilidad, deben ser informados y documentados siempre que sea posible. Los
límites de degradación aceptables deben derivar de los perfiles analíticos de las partidas del fármaco y del producto farmacéu-
tico utilizados en los estudios preclínicos y clínicos.
El uso de metodologías analíticas fisicoquímicas, bioquímicas e inmunoquímicas pertinentes debería permitir una caracteriza-
ción exhaustiva del fármaco y/o del producto farmacéutico (por ejemplo, tamaño molecular, carga, hidrofobicidad) y la detec-
ción exacta de cambios de degradación que puedan ser consecuencia de desamidación, oxidación, sulfoxidación, agregación
o fragmentación durante el almacenamiento. Como ejemplos, entre los métodos que pueden contribuir a este objetivo se in-
cluyen la electroforesis (SDS-PAGE,inmunoelectroforesis, Western blot, isoelectroenfoque), la cromatografía de alta resolución
(por ejemplo, cromatografía en fase reversa, filtración a través de gel, intercambio iónico, cromatografía de afinidad) y el ma-
peo de péptidos.
Siempre que se detecten cambios cualitativos o cuantitativos significativos, que indiquen la formación de un producto de
degradación durante los estudios de estabilidad a largo plazo, acelerados y/o de estrés, habrá que tener en cuenta los riesgos
potenciales y la necesidad de caracterización y cuantificación de los productos de degradación dentro del programa de estabi-
lidad a largo plazo. Deberán proponerse y justificarse límites aceptables, teniendo en cuenta los niveles observados en el mate-
rial utilizado en estudios preclínicos y clínicos.
Para sustancias que no puedan caracterizarse adecuadamente, o productos para los cuales no se pueda determinar un análi-
sis exacto de la pureza por métodos analíticos de rutina, el solicitante debe proponer y justificar procedimientos de prueba
alternativos.
Otras Características del Producto (5.4)
Las siguientes características del producto, pese a no estar específicamente relacionadas con productos biotecnológicos o
biológicos, deben ser monitoreadas e informadas para el producto farmacéutico en su envase final:
El aspecto visual del producto (color y opacidad para soluciones o suspensiones; color, textura y tiempo de disolución para
polvos), las partículas visibles en soluciones o después de la reconstitución de polvos o liofilizados, el pH y el nivel de humedad
de polvos y productos liofilizados.
Las pruebas de esterilidad o pruebas alternativas (por ejemplo, prueba de integridad del envase/cierre) deben realizarse, co-
mo mínimo, al inicio y al final de la vida útil propuesta.
Los aditivos (por ejemplo, estabilizadores, conservantes) o los excipientes se pueden degradar durante el período de vida útil
del producto farmacéutico. Si hay alguna indicación, durante los estudios de estabilidad preliminares, de que la reacción o la
degradación de tales materiales afectan adversamente la calidad del producto farmacéutico, puede que se precise controlar
estos componentes durante el programa de estabilidad.
El envase/cierre tiene el potencial de afectar adversamente al producto y debe ser evaluado cuidadosamente (ver a continua-
ción).
CONDICIONES
DE ALMACENAMIENTO
(6)
Temperatura (6.1)
Como la mayoría de los productos biotecnológicos o biológicos terminados necesitan temperaturas de almacenamiento de-
finidas con precisión, las condiciones de almacenamiento para los estudios de estabilidad en tiempo real/temperatura real pue-
den limitarse a la temperatura de almacenamiento propuesta.
Humedad (6.2)
Los productos biotecnológicos o biológicos generalmente se distribuyen en envases que los protegen contra la humedad.
Por lo tanto, donde pueda demostrarse que los envases propuestos (y las condiciones de almacenamiento) logran una protec-
ción suficiente contra la alta y baja humedad, por lo general, se podrán omitir las pruebas de estabilidad a distintas humedades
relativas. Cuando no se utilicen envases que protejan contra la humedad, deben proporcionarse datos de estabilidad adecua-
dos.
7550 (1049) Calidad de Productos Biotecnológicos: Estabilidad/ InformaciónGeneral USP42
Condiciones Aceleradas y de Estrés (6.3)
Según se observó anteriormente, la fecha de caducidad debe basarse en datos de tiempo real/temperatura real. No obstan-
te, se sugiere enfáticamente que se realicen estudios sobre el fármaco y el producto farmacéutico bajo condiciones aceleradas
y de estrés. Los estudios bajo condiciones aceleradas pueden proporcionar datos útiles para establecer la fecha de caducidad,
proporcionar información sobre la estabilidad del producto o sobre el futuro desarrollo del producto (por ejemplo, la evalua-
ción preliminar de los cambios de fabricación propuestos tales como cambios en la formulación, aumento de escala), ayudar a
la validación de métodos analíticos para el programa de estabilidad, o generar información que pueda ayudar a dilucidar el
perfil de degradación del fármaco o del producto farmacéutico. Los estudios bajo condiciones de estrés pueden ser útiles para
determinar si las exposiciones accidentales a condiciones que no sean las propuestas (por ejemplo, durante el transporte) son
perjudiciales para el producto y también para evaluar qué parámetros específicos de prueba pueden ser los mejores indicado-
res de la estabilidad del producto. Los estudios de la exposición del fármaco o del producto farmacéutico a condiciones extre-
mas pueden ayudar a revelar patrones de degradación; si es así, dichos cambios deben ser monitoreados bajo las condiciones
de almacenamiento propuestas. Pese a que la guía tripartita sobre estabilidad describe las condiciones de los estudios acelera-
dos y de estrés, el solicitante debe tener en cuenta que esas condiciones pueden no ser adecuadas para productos biotecnoló-
gicos o biológicos. Las condiciones deben seleccionarse cuidadosamente, de acuerdo a cada caso en particular.
Luz (6.4)
Los solicitantes deben consultar a las autoridades reguladoras correspondientes, en cada caso, a fin de determinar las pautas
para las pruebas.
Envase/Cierre (6.5)
Pueden ocurrir cambios en la calidad del producto, a causa de las interacciones entre el producto biotecnológico o biológico
formulado y el envase/cierre. Cuando no pueda excluirse la ausencia de interacciones en productos líquidos (que no sean am-
pollas selladas), los estudios de estabilidad deben incluir muestras mantenidas en posición invertida u horizontal (es decir, en
contacto con el cierre), como también en posición vertical, para determinar los efectos del cierre sobre la calidad del producto.
Deben suministrarse datos para todas las combinaciones diferentes de envase/cierre que se vayan a comercializar.
Además de los datos estándar necesarios para un vial monodosis convencional, el solicitante debe demostrar que el cierre
utilizado en un vial multidosis es capaz de tolerar las condiciones de inserciones y extracciones reiteradas, de modo tal que el
producto conserve completamente su potencia, pureza y calidad durante el período máximo especificado en las instrucciones
de uso en los envases, empaques y/o folletos del empaque. Dicho etiquetado debe cumplir con los requisitos nacionales y re-
gionales pertinentes.
Estabilidad después de la Reconstitución de Productos Liofilizados ( 6.6)
Deberá demostrarse la estabilidad de los productos liofilizados, después de su reconstitución, para las condiciones y el perío-
do de almacenamiento máximo especificados en los envases, empaques y/o folletos del empaque. Este etiquetado debe cum-
plir con los requisitos nacionales y regionales pertinentes.
FRECUENCIADE LAS PRUEBAS(7)

La vida útil de los productos biotecnológicos o biológicos puede variar entre días y varios años. Por lo tanto, es difícil elabo-
rar guías uniformes respecto de la duración de los estudios de estabilidad y de la frecuencia de prueba que corresponderían a
todos los tipos de productos biotecnológicos o biológicos. No obstante, solo con unas pocas excepciones, la vida útil para los
productos existentes y los futuros productos potenciales oscila entre 0,5 y 5 años. Por lo tanto, las pautas se basan en la vida
útil esperada dentro de ese intervalo. Esto toma en cuenta el hecho de que la degradación de los productos biotecnológicos o
biológicos puede no estar regida por los mismos factores durante intervalos diferentes de un período de almacenamiento pro-
longado.
Cuando se propone una vida útil de 1 año o menos, los estudios de estabilidad en tiempo real deben realizarse mensual-
mente durante los primeros 3 meses y a intervalos de 3 meses de allí en adelante. Para productos con una vida útil propuesta
de más de 1 año, los estudios deben realizarse cada 3 meses durante el primer año de almacenamiento, cada 6 meses durante
el segundo año y anualmente desde ese momento en adelante.
Mientras que los intervalos de prueba mencionados anteriormente pueden ser adecuados en la etapa previa a la aprobación
o licencia, pruebas de estabilidad reducidas pueden ser adecuadas después de la aprobación o licencia, cuando se dispone de
datos que demuestran una estabilidad adecuada. Cuando existan datos que indiquen que la estabilidad de un producto no se
ve comprometida, se recomienda al solicitante presentar un protocolo que avale la eliminación de intervalos de prueba especí-
ficos (por ejemplo, prueba a los 9 meses) para estudios a largo plazo posteriores a la aprobación o licencia.
USP42 InformaciónGeneral/ (1050) Evaluación de la Seguridad Viral 7551
ESPECIFICACIONES
(8)
Pese a que los productos biotecnológicos o biológicos pueden estar sujetos a pérdidas significativas de actividad, a cambios
fisicoquímicos o a degradación durante el almacenamiento, las regulaciones internacionales y nacionales han proporcionado
pocas pautas en relación a especificaciones claras sobre liberación y fin de la vida útil. No se han desarrollado recomendacio-
nes sobre pérdidas de actividad máximas aceptables, límites para cambios fisicoquímicos o degradación durante la vida útil
propuesta, que se refieran a tipos individuales o grupos de productos biotecnológicos o biológicos, sino que aquellas se consi-
deran en cada caso en particular. Cada producto debe conservar sus especificaciones dentro de los límites establecidos para
seguridad, pureza y potencia durante su vida útil propuesta. Estas especificaciones y límites deben derivar de toda la informa-
ción disponible, usando los métodos estadísticos adecuados. El uso de especificaciones diferentes para liberación y caducidad
debe estar respaldado por datos suficientes que demuestren que la eficacia clínica no se ve afectada, según se establece en la
guía tripartita sobre estabilidad.
ETIQUETADO
(9)
Se recomienda la definición precisa de temperaturas de almacenamiento para la mayoría de los fármacos y productos farma-
céuticos biotecnológicos o biológicos. Deben establecerse recomendaciones específicas, en particular, para fármacos y produc-
tos farmacéuticos que no toleren la congelación. Estas condiciones, y en los casos pertinentes, las recomendaciones sobre pro-
tección contra la luz o la humedad, deben figurar en los envases, empaques y/o folletos de los empaques. Dicho etiquetado
debe cumplir con los requisitos nacionales y regionales pertinentes.
GLOSARIO(10)
Escala de Planta Piloto: La producción del fármaco o del producto farmacéutico por medio de un procedimiento totalmente
representativo y que simula el que se aplicará a escala de fabricación. Los métodos de expansión celular, la cosecha y la purifi-
cación del producto deben ser idénticos, excepto por la escala de producción.
Impureza: Cualquier componente del fármaco (material a granel) o producto farmacéutico (producto del envase final) que
no sea la entidad química definida como el fármaco, un excipiente u otros aditivos del producto farmacéutico.
Producción a Escala de Fabricación: Fabricación a la escala que se encuentra típicamente en una instalación destinada a la
elaboración de productos para su comercialización.
Producto Conjugado: Un producto conjugado está constituido por un ingrediente activo (por ejemplo, un péptido, un car-
bohidrato) unido en forma covalente o no covalente a un transportador (por ejemplo, una proteína, un péptido, un mineral
inorgánico), con el objetivo de mejorar la eficacia o la estabilidad del producto.
Producto de Degradación: Una molécula que resulta de un cambio en el fármaco (material a granel) ocurrido con el tiem-
po. A efectos de las pruebas de estabilidad de los productos descritos en esta guía, dichos cambios podrían ocurrir como resul-
tado de un proceso o del almacenamiento (por ejemplo, por desamidación, oxidación, agregación, proteólisis). En el caso de
productos biotecnológicos o biológicos, algunos productos de degradación pueden ser activos.
Producto Intermedio: Para los productos biotecnológicos o biológicos, un material producido durante un proceso de fabri-
cación que no sea el fármaco o el producto farmacéutico pero cuya fabricación es fundamental para la producción exitosa del
fármaco o del producto farmacéutico. Generalmente, un producto intermedio será cuantificable y se establecerán especifica-
ciones para determinar la finalización exitosa de la etapa de fabricación antes de la continuación del correspondiente proceso
de fabricación. Incluye material que podrá ser sometido a modificaciones moleculares adicionales o conservado durante un
período extenso antes de someterse a procesos adicionales.
(1050) EVALUACIÓNDE LA SEGURIDADVIRALEN PRODUCTOS

BIOTECNOLÓGICOSOBTENIDOSDE LÍNEASCELULARES DE ORIGEN
HUMANO O ANIMAL
l. INTRODUCCIÓN
Este documento trata sobre el análisis y la evaluación de la seguridad viral de productos biotecnológicos derivados de líneas
caracterizadas de células de origen humano o animal (es decir, de mamíferos, aves, insectos) y describe brevemente los datos
que deberán presentarse en el dossier para la solicitud y/o registro de comercialización del producto. A los efectos de este do-
cumento, el término "virus" excluye los agentes transmisibles no convencionales como los asociados con la Encefalopatía Es-
pongiforme Bovina (BSE,por sus siglas en inglés) y el scrapie ovino (o tembladera ovina). Se recomienda a los solicitantes tra-
tar los temas asociados con la BSEcon las autoridades reguladoras.
7552 (1050) Evaluación de la Seguridad Viral / Información General USP42
El documento abarca los productos obtenidos a partir de cultivos celulares iniciados en bancos de células caracterizadas. Cu-
bre los productos derivados del cultivo celular in vitro, como por ejemplo interferones, anticuerpos monoclonales y productos
derivados del ácido desoxirribonucleico recombinante (ADN-r), incluyendo las vacunas de subunidades recombinantes y tam-
bién los productos derivados de hibridomas cultivados in vivo, como la ascitis. En este último caso se aplican consideraciones
especiales y el Apéndice1 contiene información adicional sobre pruebas de células multiplicadas in vivo. Se excluyen de este
documento las vacunas inactivadas, todas las vacunas a virus vivo que contienen agentes autorreplicables y vectores vivos dise-
ñados genéticamente.
El riesgo de contaminación viral es una característica común a todos los productos biotecnológicos obtenidos a partir de
líneas celulares. Tal contaminación podría tener consecuencias clínicas graves y puede surgir de la contaminación de la fuente
misma de las líneas celulares (células sustrato) o de la introducción accidental de un virus durante la producción. Hasta la fe-
cha, sin embargo, los productos biotecnológicos derivados de líneas celulares no han estado involucrados en la transmisión de
virus. De todos modos, se estima que la seguridad de estos productos con respecto a la contaminación viral solo puede garan-
tizarse razonablemente mediante la aplicación de un programa de pruebas de detección viral y la evaluación de los procesos
de eliminación e inactivación viral efectuados durante la fabricación, como se describe a continuación.
Se han desarrollado tres enfoques principales y complementarios para controlar la potencial contaminación viral de los pro-
ductos biotecnológicos:
(1) Selección y prueba de líneas celulares y otras materias primas, incluso de los componentes de los medios, para determi-
nar la ausencia de virus indeseables que pueden ser infecciosos y/o patógenos para los seres humanos;
(2) Evaluación de la capacidad de los procesos de producción para eliminar los virus infecciosos;
(3) Realización de pruebas al producto en fases apropiadas de la producción para verificar la ausencia de virus infecciosos
contaminantes.
Todas las pruebas sufren la limitación inherente a las valoraciones virales cuantitativas, es decir, que la capacidad para detec-
tar concentraciones virales bajas depende, por razones estadísticas, del tamaño de la muestra. Por lo tanto, un solo enfoque no
alcanza para establecer la seguridad de un producto. En muchos casos, la certeza de que el producto final no contiene virus
infecciosos no surge exclusivamente de pruebas directas para determinar su presencia sino también de una demostración de
que el régimen de purificación es capaz de eliminar y/o inactivar los virus.
El tipo y el alcance de las pruebas virales y de los estudios de depuración viral necesarios en diferentes fases de producción
dependerán de diversos factores y deberán considerarse para cada caso en particular y paso por paso. Los factores que se de-
berán tener en cuenta incluyen el alcance de la caracterización y calificación del banco de células, la naturaleza de los virus
detectados, los componentes del medio de cultivo, los métodos de cultivo, el diseño de las instalaciones y los equipos, los re-
sultados de las pruebas virales después del cultivo de las células, la capacidad del proceso para eliminar los virus, el tipo de
producto y el uso clínico para el cual está destinado.
El propósito de este documento es describir un marco de referencia general para las pruebas de detección viral, los experi-
mentos para la evaluación de la depuración viral y el enfoque recomendado para el diseño de pruebas para la detección de
virus y estudios de depuración viral. En los apéndices se incluye información relacionada mientras que en el glosario pueden
encontrarse definiciones de algunos términos seleccionados.
Los fabricantes deberán adaptar las recomendaciones presentadas en este documento a su producto y proceso de produc-
ción específicos. Se deberá explicar y justificar el enfoque empleado por los fabricantes en su estrategia general para garantizar
la seguridad viral. Además del detalle de los datos que se proporcionan, podría ser útil contar con un resumen general de la
evaluación de la seguridad viral a fin de facilitar la revisión por parte de las autoridades regulatorias. Este resumen deberá con-
tener una breve descripción de todos los aspectos de los estudios de seguridad viral y de las estrategias empleadas para impe-
dir la contaminación viral en relación con este documento.
11.FUENTESPOTENCIALES
DE CONTAMINACIÓN
VIRAL
La contaminación viral de los productos biotecnológicos puede surgir de la fuente original de las líneas celulares o de la in-
troducción accidental de virus durante los procesos de producción.
A. Virus que Pueden Encontrarseen el Bancode CélulasMaestro (BCM)
Las células pueden sufrir una infección viral latente o persistente (por ejemplo, virus del herpes) o tener retrovirus endógenos
que pueden transmitirse verticalmente desde una generación de células a la siguiente, ya que el genoma viral persiste dentro
de la célula. Tales virus pueden expresarse constitutivamente o inesperadamente como un virus infeccioso. Los virus pueden
introducirse en el BCM por diferentes vías, como por ejemplo: (1) derivación de líneas celulares de animales infectados; (2)
empleo de virus para establecer la línea celular; (3) empleo de reactivos biológicos contaminados, como por ejemplo, compo-
nentes séricos animales¡ (4) contaminación durante la manipulación de las células.
B. Virus Adventicios Que Pueden Introducirse Durante la Producción
Los virus adventicios pueden introducirse en el producto final por diferentes vías que incluyen, entre otras, las siguientes: (1)
empleo de reactivos biológicos contaminados, como por ejemplo, componentes de suero animal; (2) empleo de un virus para
inducir la expresión de genes específicos que codifican una proteína deseada; (3) empleo de un reactivo contaminado, como
por ejemplo, una columna para cromatografía de afinidad con anticuerpos monoclonales; (4) empleo de un excipiente conta-
minado durante la formulación; y (5) contaminación durante la manipulación de las células y del medio. El control de los pará-
metros de cultivo de células puede ser útil para la detección temprana de la contaminación potencial por virus adventicios.
111.CALIFICACIÓN
DE LÍNEASCELULARES:
PRUEBAPARA LA DETECCIÓN
DE VIRUS
Una parte importante de la calificación de una línea celular para su uso en la producción de un producto biotecnológico es
la realización de pruebas apropiadas para detectar la presencia de virus.
A. Pruebas Virales Sugeridas para BCM, Banco de Células de Trabajo (BCT) y Células en el Límite
de Edad Celular in Vitro Empleadas para Producción
La Tabla 1 muestra ejemplos de pruebas virales que se realizan una sola vez a diversos niveles de células, incluyendo el BCM,
el BCTy las células en el límite de edad celular in vitro usadas para producción.
Tabla 1. Elemplos de Pruebas de Virus a ser Realizadas Una Única Vez a Distintos Niveles Celulares
BCM BCT1 Células en el Límlte 2
Pruebaspara Retrovirusy Otros VirusEndógenos
lnfectividad + - +
Microscopía electrónica 3 +3 - +3
Transcriptasa inversa 4 +4 - +4
Otras pruebas específicas para virus 5 según corres- - según corresponda 5
ponda 5
Pruebaspara VirusNo Endógenoso Adventicios
Valoraciones in vitro _6
+ +
Valoraciones in vivo _6
+ +
Pruebas de producción de anticuerpos 7
+' - -
Otras pruebas específicas para virus 8 +ª - -
1 Ver texto-sección 111.A.2.
2 Células en el Límite: Células en el límite de edad celular in vitro utilizadas para la producción (1/ertexto-sección 111.A.3.).
3 También puede detectar otros agentes.
4 No es necesariosi es positivoen la pruebade infectividadde retrovirus.
5 Según sea adecuado para las líneas celulares que se sabe están infectadas por tales agentes.
6 Para el primer BCT,esta prueba deberá hacerse sobre células en el límite de la edad celular in vitro generadas a partir de ese BCT;para los BCTsubsiguientes al
primerBCT,se puede llevara cabo una únicapruebain vitro e in vivo ya seadirectamentesobreel BCTo sobrecélulasen el límite de la edad celularin vitro.
7 Por ejemplo, MAP,RAP,HAP-norrnalmente aplicables para las líneas celulares
de roedores.
8 Porejemplo,las pruebasparalíneascelularesderivadasde líneascelulareshumanas,de primatesno humanos,u otras,según sea adecuado.
1. BANCO DE CÉLULASMAESTRO
En el BCM se deberá realizar un examen exhaustivo para detectar la contaminación viral, tanto endógena como no endóge-
na. En el caso de las líneas celulares heterohíbridas en las cuales una o varias células asociadas son de origen humano o provie-
nen de primates no humanos, se deberán realizar pruebas para detectar los virus de origen humano o provenientes de prima-
tes no humanos porque la contaminación viral que surge de estas células puede representar un peligro importante.
Las pruebas para detectar virus no endógenos deberán incluir pruebas de inoculación in vitro e in vivo y otras pruebas espe-
cíficas, incluyendo pruebas específicas para la especie que sean apropiadas, como por ejemplo la prueba de producción de
anticuerpos en ratones (MAP,por sus siglas en inglés), según el historial de resiembra de la línea celular, para detectar posibles
virus contaminantes.
2. BANCO DE CÉLULASDE TRABAIO
Cada BCT empleado como sustrato inicial de células para la producción de medicamentos deberá ser examinado para detec-
tar virus adventicios, ya sea realizando pruebas directas o mediante el análisis de células que estén en el límite de edad celular
in vitro, obtenidas inicialmente del BCT.Cuando se hayan realizado pruebas adecuadas para detectar virus no endógenos en el
BCM y se hayan obtenido del BCTcélulas cultivadas hasta el límite de edad celular in vitro, o más allá de ese límite y se las
haya utilizado para detectar la presencia de virus adventicios, no será necesario realizar pruebas similares en el BCT inicial. Por
7554 (1050) Evaluación de la Seguridad Viral / InformaciónGeneral USP 42
lo general, no son necesarias las pruebas de producción de anticuerpos para el BCT.También se consideraría aceptable un en-
foque alternativo en el cual se lleven a cabo pruebas completas sobre el BCT en lugar de hacerlo en el BCM.
3. CÉLULASEN ELLÍMITEDE EDADCELULAR

IN VITROEMPLEADAS
PARAPRODUCCIÓN
El límite de edad celular in vitre usado para la producción deberá estar sustentado en los datos de células de producción
expandidas a escala de planta piloto o condiciones de escala comercial hasta la edad celular in vitro propuesta, o más allá de
ésta. Por lo general, las células de producción se obtienen por expansión del BCT;el BCM también puede utilizarse para prepa-
rar las células de producción. Las células que se encuentran en el límite de la edad celular in vitre deberán evaluarse una vez
para detectar los virus endógenos que pueden no haber sido detectados en el BCM y BCT.La realización de pruebas adecua-
das (por ejemplo, in vitro e in vivo) por lo menos una vez en las células utilizadas para la producción que están en el límite de
edad celular in vitre proporcionaría una seguridad adicional de que el proceso de producción no es propenso a la contamina-
ción por virus adventicios. Si se detecta algún virus adventicio a estos niveles, el proceso se deberá controlar cuidadosamente
para determinar la causa de la contaminación y, si fuera necesario, su diseño deberá modificarse por completo.
B. Pruebas Recomendadas para la Detección e Identificación de Virus
Se pueden emplear numerosas pruebas para la detección de virus endógenos y adventicios. En la Tabla2 se enumeran ejem-
plos de estas pruebas. Estos ejemplos deberán ser considerados como protocolos de valoración recomendados actualmente,
pero la lista no es exhaustiva ni definitiva. Puesto que las técnicas más apropiadas pueden cambiar con los avances científicos,
las propuestas de técnicas alternativas pueden considerarse aceptables, siempre y cuando se acompañen de datos que las ava-
len. Se recomienda a los fabricantes tratar estas alternativas con las autoridades reguladoras. Puede ser necesario realizar otras
pruebas conforme a cada caso particular. Las pruebas deberán incluir controles apropiados para asegurar una adecuada sensi-
bilidad y especificidad. Pueden requerirse pruebas y/o enfoques específicos en aquellos casos en los que se puede predecir con
una probabilidad relativamente alta la presencia de un virus específico proveniente de la especie de origen del sustrato celular.
Si la línea celular usada para la producción es de origen humano o de primate no humano, deberán realizarse pruebas adicio-
nales para detectar virus de humanos, como por ejemplo los que causan enfermedades de inmunodeficiencia y hepatitis, a
menos que se justifiquen otra cosa. La reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) puede ser apropiada
para detectar las secuencias de otros virus humanos, así como otros virus específicos. A continuación, se incluye una breve
descripción del marco de referencia general y de los antecedentes filosóficos conforme a los cuales el fabricante deberá justifi-
car lo realizado.
Tabla 2. Ejem ~los de Uso y Límites de Valoraciones Que Pueden Utlllzarse para Detectar Virus
Prueba Artículo de Prueba Capacidad de Detección Limitaciones de la Detección
Producciónde anticuerpos Usado de célulasy su medio de cul- Antígenosviralesespecíficos Antígenos no infecciosospara el sis-
tivo tema de prueba en animales
Examende virusin vivo Usado de célulasy su medio de cul- Ampliagama de virus patogé- Agentes que no se replican ni pro-
tivo nicos para humanos ducen enfermedades en el sistema
de prueba
Examende virus in vitro para: Ampliagama de virus patogé- Agentes que no se replican ni pro-
nicos para humanos ducen enfermedades en el sistema
de prueba
1. Caracterizacióndel banco de cé- 1 . Usado de célulasy su medio de
lulas cultivo(para cultivosconjuntos, las
célulasintactas deberán estar en el
artículode prueba)
2. Examende producción 2. Recoleccióna granel no procesa-
da o lisado de célulasy su medio
de cultivo celulardel reactor de
producción
TEMsobre: Virusy partículassimilaresa virus Valoracióncualitativacon evalua-
ción de identidad
1. Célulasustrato 1. Célulasviables
2. Sobrenadante de cultivocelular 2. Sobrenadante de cultivo libre de
células
Transcriptasainversa(TI) Sobrenadante de cultivo librede cé- Retrovirusy TI retroviralexpresada Sólo detecta enzimas con actividad
lulas óptima bajo condiciones preferí-
das. La interpretación puede ser
difícildebido a la presencia de en-
zimas celulares;fondo con algunas
muestras concentradas
1 Además,es difícildistinguirel artículode pruebade las célulasindicadoras.
USP42 Información General/ (1050) Evaluación de la Seguridad Viral 7555
Tabla 2. Ejemplos de Uso y Límites de Valoraciones Que Pueden Utlllzane para Detectar Virus (Continuación)
Prueba Artículo de Prueba Capacidad de Detección Limitaciones de la Detección
lnfectividad con retrovirus (RV) Sobrenadantede cultivo libre de cé- Retrovirusinfecciosos RVque no se replican ni forman fo-
lulas cos o placasdiscretos en el sistema
de prueba elegido
Cultivo conjunto Célulasviables Retrovirusinfecciosos RVque no se replican
1. Punto final de infectividad 1. Ver más arriba en
infectividad de RV
2. Punto final de TEM 2. Ver más arriba en TEM1
3. Punto final de TI 3. Ver más arriba en TI
RCP(Reacciónde cadena de poli- Células,líquido de cultivo y otros Secuenciasde virus específicas Lassecuenciasde los
merasa) materiales iniciadores deben estar presentes.
No indica si el virus es infeccioso.
1 Además,esdifícil distinguirel artículode pruebade lascélulasindicadoras.
1. PRUEBASPARADETECTARRETROVIRUS
Para el BCM y para células cultivadas hasta el límite de edad celular in vitro o más allá de éste usadas para la producción, se
deberán realizar pruebas para retrovirus, incluidas las valoraciones de infectividad en cultivos celulares sensibles y estudios de
microscopía electrónica (ME). Si no se detecta infectividad y no se han observado ningún retrovirus o partículas similares a
retrovirus por ME, deberá realizarse la valoración de transcriptasa inversa (TI) u otras valoraciones apropiadas para la detección
de retrovirus que pueden no ser infecciosos. Se ha descubierto que los estudios de inducción no son útiles.
2. VALORACIONES
IN VITRO
Las pruebas in vitro se llevan a cabo mediante la inoculación de un artículo de prueba (ver Tabla2) en diversos cultivos celu-
lares indicadores, sensibles y capaces de detectar una amplia gama de virus humanos y animales pertinentes. La selección de
células usadas en la prueba se rige por la especie de origen del banco de células a evaluar, pero deberá incluir una línea celular
humana y/o de primates no humanos que sea sensible a los virus humanos. La naturaleza de la valoración y de la muestra a
analizar están regidas por el tipo de virus que posiblemente pueda estar presente considerando el origen o manipulación de las
células. Se deberán buscar los virus tanto citopáticos como hemadsorbentes.
3. VALORACIONES
IN VIVO
Se deberá inocular un artículo de prueba (ver Tabla2) en animales, incluyendo ratones adultos y lactantes, y en huevos em-
brionados para descubrir virus que no pueden crecer en cultivos celulares. Se pueden emplear otras especies de animales, se-
gún la naturaleza y el origen de las líneas celulares que se van a analizar. Se deberá vigilar la salud de los animales y deberá
investigarse toda anormalidad para establecer la causa de la enfermedad.
4. PRUEBASDE PRODUCCIÓNDE ANTICUERPOS
Los virus específicos para la especie, presentes en líneas celulares de roedores, pueden detectarse mediante inoculación del
artículo de prueba (ver Tabla2) en animales libres de virus, y mediante el examen, después de un período específico, del nivel
de anticuerpos sérico o la actividad enzimática. Ejemplos de tales pruebas son la prueba de producción de anticuerpos en rato-
nes (MAP), la prueba de producción de anticuerpos en ratas (RAP)y la prueba de producción de anticuerpos en hámsteres
(HAP). Los virus que actualmente se examinan en las valoraciones de producción de anticuerpos se presentan en la Tabla 3.
Tabla 3 Virus Detectados en las Pruebas de Producción de Anticuerpos
MAP HAP RAP
Virus de Ectromelia2,3 Virus de Coriomeningitis Linfocítica Virus Hantaan1,3
{LCM)1,3
Virus Hantaan1,3 Virus de la Pneumoníade Ratón (PVM)2,3 Virus de RataKilham (KRV)2,3
Virus K2 Reoviruslipo 3 (Reo3)1,3 Virus de la Encefalomielitisde Ratón
(Theilers,GDVll)2
Virus de DeshidrogenasaLáctica(LDM)1,3 Virus Sendai1,3 Virus de la Pneumoníade Ratón (PVM)2, 3
Virus de Coriomeningitis Linfocítica SVS Coronavirus de Rata (RCV)2
(LCM)l,3
1 Virus de los que se tiene evidencia de su capacidad de infectar a seres humanos o primates.
2 Virusde los que no se tiene evidenciade su capacidad parainfectara seres humanos.
3
Viruscapacesde replicarsein vitro en célulasde origen humanoo de primates.
Tabla 3. Virus Detectados en las Pruebas de Producción de Anticuerpos (Continuación)

MAP HAP RAP
VirusDiminuto de Ratón2, 3 ReovirusTipo 3 (Reo3)1,3
Adenovirus de Ratón (MAV) 2, 3
VirusSendai1, 3
Citomeqalovirus de Ratón (MCMV)2, 3 Virusde Sialoacrioadenitis(SDAV)
2
Virusde la Encefalomielitisde Ratón VirusToolan (Hl)2,3

(Theilers,GDV11)2
Virusde la Hepatitis de Ratón (MHV)2

Rotavirusde Ratón (EDIM)2, 3
Virusde la Pneumonía de Ratón (PVM)2,3
Virusde Polioma2
ReovirusTipo 3 (Reo3)1, 3
VirusSendai1,3
VirusTímico2
1 Virusde los que se tiene evidenciade su capacidadde infectara seres humanos o primates.
2
Virusde los que no se tiene evidenciade su capacidad para infectara seres humanos.
3 Viruscapaces de replicarsein vitro en célulasde origen humano o de primates.
C. Aceptabilidad de las LíneasCelulares
Se reconoce que algunas líneas celulares usadas para la fabricación de productos contienen retrovirus endógenos, otros virus
o secuencias virales. En tales circunstancias, el plan de acción recomendado para la fabricación es el descrito en la Sección V de
este documento. La aceptabilidad de las líneas celulares que contienen virus distintos de los retrovirus endógenos será conside-
rada en forma individual por las autoridades regulatorias, teniendo en cuenta un análisis de riesgo/beneficio basado en el be-
neficio del producto y el uso clínico al que está destinado, la naturaleza de los virus contaminantes, su potencial para infectar o
causar enfermedades en los seres humanos, el proceso de purificación del producto (por ejemplo, datos de evaluación de de-
puración viral) y el nivel de pruebas virales realizadas en el material a granel purificado.
IV. COMPROBACIÓNDE VIRUSEN ELMATERIALA GRANELSIN PROCESAR

El material a granel sin procesar está constituido por uno o varios grupos de células y medios de cultivo recolectados mezcla-
dos. Cuando las células no son accesibles fácilmente (por ejemplo, fibra hueca o sistemas similares), el granel sin procesar esta-
ría constituido por líquidos extraídos del fermentador. Una muestra representativa del material a granel sin procesar, tomada
del reactor de producción antes del procesamiento adicional, representa uno de los niveles más apropiados en el cual se puede
determinar la posibilidad de contaminación viral adventicia con una alta probabilidad de detección. Se deberán realizar prue-
bas apropiadas para detectar virus al nivel de granel sin procesar, a menos que la prueba para detectar virus se haga más sensi-
ble mediante un procesamiento inicial parcial (por ejemplo, un granel sin procesar podría ser tóxico en cultivos de células de
prueba, mientras que un granel parcialmente procesado podría no serlo).
En ciertos casos, puede ser más apropiado probar una mezcla de células intactas y deshechas y el sobrenadante del cultivo
celular extraído del reactor de producción antes del procesamiento adicional. Como parte de la solicitud y/o registro para la
comercialización de un producto, se deberán presentar datos de, por lo menos, tres lotes de granel sin procesar a escala de
planta piloto o comercial.
Se recomienda a los fabricantes elaborar programas para la evaluación de virus adventicios en lotes de producción. El alcan-
ce, el grado y la frecuencia de pruebas virales en el granel sin procesar deberán determinarse tomando en consideración varios
puntos, incluyendo la naturaleza de las líneas celulares usadas para elaborar los productos deseados, los resultados y el grado
de las pruebas para virus realizadas durante la calificación de las líneas celulares, el método de cultivo, las fuentes de materia
prima y los resultados de los estudios de depuración viral. Las pruebas de examen in vitro, utilizando una o varias líneas celula-
res, generalmente se emplean para probar el material a granel no procesado. Si fuera apropiado, puede utilizarse una prueba
de RCP u otros métodos apropiados.
En general, el material recolectado en el cual se han detectado virus adventicios no deberá utilizarse para elaborar el produc-
to. Si se detectan algunos virus adventicios a este nivel, se deberá controlar el proceso con cuidado para determinar la causa
de la contaminación y tomar las acciones apropiadas al caso.
V. JUSTIFICACIÓN
Y PLAN DE ACCIÓNPARA LOS ESTUDIOSDE DEPURACIÓNVIRALY
PRUEBASVIRALESEN MATERIALA GRANELPURIFICADO
Es importante diseñar el protocolo más adecuado y racional para las pruebas virales a partir del nivel de BCM, a lo largo de
los diversos pasos de la producción del fármaco hasta la obtención del producto final, incluyendo la evaluación y la caracteriza-
ción de la depuración viral del material a granel sin procesar. La evaluación y caracterización de la depuración viral cumple una
función fundamental en este esquema. El objetivo deberá ser obtener la mayor seguridad razonable de que un producto está
libre de contaminación viral.
Al seleccionar los virus que se utilizarán en un estudio de depuración, resulta útil distinguir entre la necesidad de evaluar los
procesos con respecto a su capacidad de eliminar los virus que se sabe están presentes y el deseo de calcular la solidez del
proceso mediante la caracterización de la depuración de los virus de "modelo" no específico (descritos a continuación). En el
glosario se incluyen las definiciones de virus "relevantes" y virus "modelo" específicos y no específicos. La evaluación de proce-
sos requiere un conocimiento de la cantidad de virus que pueden estar presentes en el proceso, como en el material a granel
no procesado, y cuánto puede depurarse a fin de evaluar la seguridad del producto. El conocimiento de la dependencia del
tiempo en los procedimientos de inactivación es útil para asegurar la eficacia del proceso. Cuando se evalúa la depuración de
contaminantes conocidos se deberán proporcionar estudios profundos de inactivación dependientes del tiempo, una demos-
tración de la reproducibilidad de la inactivación/eliminación y una evaluación de los parámetros del proceso. Cuando un pro-
ceso de fabricación está caracterizado por la robustez de depuración utilizando virus "modelo" no específicos, en el diseño del
estudio se deberá prestar atención especial a los virus no encapsulados. El alcance de los estudios de caracterización de depu-
ración viral puede estar influenciado por los resultados de las pruebas en las líneas celulares y el material a granel sin procesar.
Estos estudios deberán realizarse conforme a la descripción de la sección VI que sigue a continuación.
La Tabla4 muestra un ejemplo de un plan de acción en relación con la evaluación del proceso y la caracterización de depu-
ración viral, así como las pruebas virales en material a granel purificado en respuesta a los resultados de las pruebas virales en
células y/o el material a granel sin procesar. Se consideran diversos casos. En todos los casos, se deberá realizar la caracteriza-
ción de la depuración que utiliza virus "modelo" no específicos. Las situaciones más comunes son los Casos A y B. Normalmen-
te no se usan sistemas de producción contaminados con un virus que no sea un retrovirus de roedores. Cuando existen razo-
nes convincentes y bien justificadas para la producción de fármacos usando una línea celular de los Casos C, D o E, éstos debe-
rán ser tratados con las autoridades reguladoras. Con los Casos C, D y E, es importante haber validado los pasos eficaces para
inactivar/eliminar el virus en cuestión del proceso de fabricación.
Tabla 4. Plan de Acción para la Evaluación del Proceso de Depuración Vlral y Pruebas para Virus en Materiales a Granel Purificados
Caso A CasoB CasoC 2 Caso D2 Caso E2
Estado
Presencia de virus 1 - - + + (+)3
Partículas similares a virus 1 - - - - (+)3
Partículas similares a retrovirus 1
- + - - (+)3
Virus identificado no corresponde + + + -
Virus patóqeno para humanos no corresponde _4 _4
+ desconocido
Acción
Caracterización del proceso de depuración viral uti- sí5 sí5 SÍS sí5 sí7
!izando virus "modelo" no específicos
Evaluación de proceso de depuración no sí6 sí6 sí6 sí7
viral utilizando"virusrelevantes"o "modelo" es-
pecfficos
Prueba paravirus en material a qranel purificado no corresponde sí8 sí8 sí8 sí8
1 Resultadosde las pruebasde detecciónde virus para el substratocelulary/o al nivel de granel no procesado.Loscultivoscelularesutilizadospara la produc-
ción que esténcontaminadoscon virusgeneralmenteno seránaceptables.Losvirusendógenos(talescomo retrovirus)o losvirusque forman parte integraldel
BCM pueden ser aceptables si se utilizan procedimientos de evaluación de depuración viral apropiados.
2 El uso de material fuente que está contaminado con virus, ya sea que se sepa o no que son infecciosos y/o patógenos para el ser humano, solamente serán
aceptablesen circunstanciasmuy excepcionales.
3 Se ha observadoun viruspor métodos directoso indirectos.
4 Se piensa que es no patógeno.
5
Se deberá llevar a cabo la caracterización de la depuración utilizando virus "modelo" no específicos.
6 Se deberá llevara cabo la evaluacióndel proceso con virus"relevantes"o virus"modelo"específicos.
7 Ver texto para el Caso E.
8 Deberá confirrnarse la ausencia de virus detectables para el material a granel purificado utilizando métodos apropiados de alta especificidad y sensibilidad para
la detección del virus en cuestión. Para la autorización de su comercialización, se deberán proporcionar los datos de por lo menos 3 lotes de material a granel
purificado y fabricado a escala de planta piloto o comercial. Sin embargo, para líneas celulares tales como células CHO, para las cuales las partículas endógenas
han sidocaracterizadas extensivamentey se ha demostradouna depuraciónadecuada,nonnalmenteno es necesariodetenninarla presenciade partículasno
infecciosas en el material a granel purificado.
Caso A
Cuando se ha demostrado que no hay ningún virus, partículas similares a virus o partículas similares a retrovirus en las célu-
las o en el granel sin procesar, se deberán realizar estudios de inactivación o eliminación viral con virus "modelo" no específi-
cos como se indicó anteriormente.
Caso B
Cuando hay presente solamente un retrovirus de roedor (o una partícula similar a un retrovirus que se piensa que es no
patógena, como las partículas de roedor de tipo A y R), se deberá realizar la evaluación del proceso utilizando un virus "mode-
lo" específico, como un virus de leucemia murina. El material a granel purificado deberá analizarse utilizando métodos apro-
piados que tengan una alta especificidad y sensibilidad para detectar el virus en cuestión. Para la autorización de la comerciali-
zación, se deberán proveer datos de al menos tres lotes de material a granel purificado a escala comercial o escala de planta
piloto. Se han usado con frecuencia líneas celulares tales como las de ovario de hámsteres chinos (CHO), de Cl 27, de riñón de
hámsteres recién nacidos (BHK)y líneas celulares de hibridoma murino como sustratos para la producción de medicamentos
sobre los cuales no se han informado problemas de seguridad relacionados con la contaminación viral de los productos. Para
estas líneas celulares en las cuales las partículas endógenas se han caracterizado ampliamente y se ha demostrado la depura-
ción, generalmente no es necesario hacer pruebas para detectar la presencia de partículas no infecciosas en el material a granel
purificado. Son apropiados los estudios con virus "modelo" no específicos, como en el Caso A.
CasoC
Cuando se sabe que las células o el material a granel no procesado contienen virus, distintos de un retrovirus de roedores,
del que no hay ninguna evidencia de la capacidad de infección en seres humanos [como aquellos identificados en la nota 2 al
pie de la Tabla3, excepto los retrovirus de roedores (Caso B)], los estudios de evaluación de eliminación e inactivación de los
virus deberán usar el virus identificado. Si no es posible usar el virus identificado, se deberán utilizar virus "relevantes" o "mo-
delo" específicos para demostrar una depuración aceptable. Se deberá obtener una inactivación dependiente del tiempo para
los virus identificados (o virus "relevantes" o "modelo" específicos) en los pasos de inactivación fundamentales como parte de
la evaluación del proceso para estos virus. El material a granel purificado deberá analizarse utilizando métodos apropiados que
tengan una alta especificidad y sensibilidad para detectar el virus en cuestión. Para la autorización de la comercialización, se
deberán proveer los datos de al menos tres lotes de granel purificado elaborado a escala de planta piloto o escala comercial.
Caso D
En aquellos casos en que se identifica un agente patógeno humano conocido, como los indicados en la nota 1 al pie de la
Tabla3, el producto puede ser aceptable solo en circunstancias excepcionales. En este caso, se recomienda usar el virus identi-
ficado para los estudios de evaluación de eliminación e inactivación viral y emplear métodos específicos con alta especificidad
y sensibilidad para detectar el virus en cuestión. Si no es posible usar el virus identificado, se deberán utilizar virus "relevantes"
y/o "modelo" específicos (descritos a continuación). Se deberá demostrar que el proceso logra la eliminación e inactivación de
los virus seleccionados durante los procesos de purificación e inactivación. Se deberán obtener datos de inactivación depen-
dientes del tiempo para los pasos de inactivación fundamentales como parte de la evaluación del proceso. Deberán hacerse
pruebas en el granel purificado utilizando métodos apropiados que tengan una alta especificidad y sensibilidad para detectar el
virus en cuestión. Para la autorización de la comercialización, se deberán proveer los datos de al menos tres lotes de granel
purificado elaborado a escala de planta piloto o escala comercial.
Caso E
En aquellos casos en que se detecta un virus que no puede clasificarse según los métodos actualmente disponibles en células
o material a granel no procesado, el producto se considera por lo general inadmisible ya que el virus puede resultar patógeno.
En el caso muy poco frecuente de que haya razones convincentes y bien justificadas para producir el fármaco usando dicha
línea celular, deberá tratarse con las autoridades reguladoras antes de continuar avanzando.
VI. EVALUACIÓN
Y CARACTERIZACIÓN
DE LOSPROCEDIMIENTOS
DE DEPURACIÓNVIRAL
La evaluación y caracterización de los procedimientos de eliminación y/o inactivación viral desempeñan un papel importante
a la hora de establecer la seguridad de un producto biotecnológico. Anteriormente, han ocurrido muchos casos de contamina-
ción con agentes cuya presencia no se detectó ni se sospechó y aunque esto sucedió con productos biológicos obtenidos de
diversas materias primas diferentes de las líneas celulares plenamente caracterizadas, la evaluación de la depuración viral pro-
porcionará una medida de seguridad que indica que puede eliminarse cualquier virus desconocido, no sospechado y nocivo.
Se deberán realizar estudios de una manera bien documentada y controlada.
El objetivo de los estudios de depuración viral es evaluar el paso o los pasos del proceso que pueden considerarse eficaces
para la inactivación o eliminación de los virus y hacer el cálculo cuantitativo del nivel general de reducción viral obtenido por el
proceso. Esto deberá realizarse mediante la introducción deliberada ("adicionado") de cantidades significativas de un virus al
material crudo y/o a diferentes fracciones obtenidas durante los diversos pasos del proceso y la demostración de su eliminación
o inactivación durante los pasos posteriores. No se considera necesario evaluar o caracterizar todos los pasos de un proceso de
fabricación si se demuestra una depuración adecuada mediante el uso de menos pasos. Deberá tenerse presente que otros
pasos del proceso pueden tener un efecto indirecto sobre la inactivación o eliminación viral lograda. Los fabricantes deberán
explicar y justificar el enfoque utilizado en los estudios de evaluación de la depuración viral.
La reducción de la infectividad viral puede lograrse mediante la eliminación de las partículas virales o por inactivación de la
infectividad viral. Para cada etapa de producción evaluada, se deberá describir el posible mecanismo de pérdida de infectividad
viral estableciendo si se debe a inactivación o eliminación. Para los pasos de inactivación, el estudio deberá planificarse de tal
manera que las muestras se tomen en diferentes tiempos y se deberá elaborar una curva de inactivación (ver Sección VI.B.5.).
Los estudios de evaluación de depuración viral se realizan para demostrar la depuración de un virus que se sabe está presen-
te en el BCM y/o para proporcionar cierta seguridad de que se eliminarían los virus adventicios que no pudieron detectarse o
que pudieran llegar a tener acceso al proceso de producción. Los factores de reducción se expresan normalmente en escala
logarítmica, lo cual implica que, aunque la infectividad viral residual nunca se reducirá a cero, puede reducirse considerable-
mente en forma matemática.
Además de los estudios de depuración para los virus que se sabe están presentes, deberán realizarse estudios para caracteri-
zar la capacidad para eliminar y/o inactivar otros virus. El objetivo de los estudios con virus que presentan una variedad de
propiedades bioquímicas y biofísicas que no se sabe si están presentes o que no se estima que lo estén es caracterizar la robus-
tez del procedimiento en lugar de lograr una inactivación o eliminación específica. Es aconsejable que se haga una demostra-
ción de la capacidad del proceso de producción para inactivar o eliminar los virus (ver Sección VI.C.). Tales estudios no se reali-
zan para evaluar un riesgo específico de seguridad. Por consiguiente, no se necesita llegar a un valor específico de depuración.
A. Selección de Virus para la Evaluación y Caracterización de la Depuración Viral
Los virus para la evaluación de la depuración y los estudios de caracterización de los procesos, deberán elegirse de manera
tal que se asemejen a los virus que puedan contaminar el producto y que representen una amplia gama de propiedades físico-
químicas para probar la capacidad del sistema para eliminar los virus en general. El fabricante deberá justificar la elección de
los virus en conformidad con los objetivos de la evaluación y el estudio de caracterización y las pautas proporcionadas en este
documento.
1. VIRUS"RELEVANTES"
Y VIRUS"MODELO"
Un aspecto importante en la realización de un estudio de depuración viral es determinar qué virus deberán utilizarse. Estos
virus se clasifican en tres categorías: virus "relevantes", virus "modelo" específicos y virus "modelo" no específicos.
Los virus "relevantes" son virus utilizados en la evaluación de los procesos de estudios de depuración viral, que son los virus
identificados o virus de la misma especie que los virus que se sabe que contaminan las células sustrato u otros reactivos o ma-
teriales utilizados en el proceso de producción, o que tienen probabilidades de hacerlo. La purificación y/o proceso de inactiva-
ción deberá demostrar la capacidad para eliminar y/o inactivar tales virus. Cuando un virus "relevante" no está disponible o no
se adapta bien a la evaluación del proceso de estudios de depuración viral (por ejemplo, no puede multiplicarse in vitre a nive-
les suficientemente altos), se deberá utilizar un virus "modelo" específico como sustituto. Un virus "modelo" específico apro-
piado puede ser un virus que esté relacionado estrechamente con el virus conocido o presunto (del mismo género o familia),
con propiedades físicas y químicas similares a las del virus observado o presunto.
Generalmente, las líneas celulares derivadas de roedores contienen partículas de retrovirus endógenos o partículas similares a
retrovirus que pueden ser infecciosas (partículas tipo C) o no infecciosas (partículas citoplasmáticas tipo A y R). Deberá deter-
minarse la capacidad del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar los retrovirus de roedores de los productos obteni-
dos de tales células. Esto puede realizarse utilizando un virus de leucemia murina, un virus "modelo" específico en el caso de
células de origen murino. Cuando se han obtenido líneas celulares humanas que secretan anticuerpos monoclonales mediante
la inmortalización de linfocitos B por el Virus Epstein-Barr (EBVpor sus siglas en inglés), se deberá determinar la capacidad del
proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar un virus de herpes. El virus de la pseudo-rabia también puede utilizarse co-
mo un virus "modelo" específico.
Cuando la finalidad es caracterizar la capacidad del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar los virus en general, es
decir, caracterizar la robustez del proceso de depuración, los estudios de caracterización de depuración viral deberán realizarse
con virus "modelo" no específicos con propiedades diferentes. Los datos obtenidos de los estudios con virus "relevantes" y/o
"modelo" específicos también pueden contribuir a esta evaluación. No es necesario probar todos los tipos de virus. Se deberá
dar preferencia a los virus que muestran una resistencia significativa a los tratamientos físicos y/o químicos. Los resultados ob-
tenidos para tales virus proporcionan información útil acerca de la capacidad del proceso de producción para eliminar y/o
inactivar todo tipo de virus. La selección y el número de virus utilizados dependerán de la calidad y caracterización de las líneas
celulares y del proceso de producción.
En el Apéndice2 y en la TablaA-1 se incluyen ejemplos de virus "modelo" útiles con diferentes estructuras físico-químicas y
ejemplos de virus que se han utilizado en los estudios de depuración viral.
2. OTRASCONSIDERACIONES
Deberán considerarse los siguientes puntos adicionales:

(a) Se aconseja usar virus que puedan multiplicarse hasta un título alto, aunque esto no siempre es posible.
(b) Deberá existir una prueba eficaz y confiable para la detección de cada virus utilizado, para cada etapa de fabricación
sometida a prueba.
(c) Se deberán considerar los riesgos planteados por determinados virus para la salud del personal que realiza los estudios de
depuración viral.
B. Diseñoe Implicacionesde la Evaluaciónde la DepuraciónViral y de los Estudiosde

Caracterización
1. INSTALACIONES
Y PERSONAL
Es inapropiado introducir cualquier tipo de virus en las instalaciones de producción debido a las restricciones impuestas por
las buenas prácticas de fabricación (BPF). Por consiguiente, los estudios de depuración viral deberán ser realizados en un labo-
ratorio separado, equipado para el trabajo virológico y por personal con experiencia en virología conjuntamente con el perso-
nal de producción que participa en el diseño y preparación de una versión a menor escala del proceso de purificación.
2. SISTEMADE PRODUCCIÓNA MENOR ESCALA
Se deberá demostrar la validez de la producción a menor escala. El nivel de la purificación de la versión a menor escala debe-
rá ser tan representativo del procedimiento de producción como sea posible. Para el equipo cromatográfico, se deberá demos-
trar que la altura del lecho de la columna, la velocidad lineal de flujo, el cociente entre la velocidad de flujo y el volumen del
lecho de la columna (es decir, el tiempo de contacto), los tipos de gel y soluciones amortiguadoras, el pH, la temperatura y la
concentración de proteínas, sales y el producto son representativos de la fabricación a escala comercial. Deberá obtenerse un
perfil similar de elución. Para otros procedimientos, se aplicarán consideraciones similares. Las desviaciones que no pueden evi-
tarse deberán considerarse con respecto a su influencia en los resultados.
3. ANÁLISISDE LAELIMINACIÓNVIRALESCALONADA
Cuando se están realizando estudios de depuración viral, es aconsejable evaluar la contribución a la eliminación viral de más
de una etapa de producción. Los pasos que tienen probabilidad de eliminar virus deberán evaluarse individualmente con res-
pecto a su capacidad para eliminar e inactivar el virus y la definición exacta de paso individual deberá considerarse meticulosa-
mente. Se deberá tener suficiente virus en el material utilizado en cada paso que se desea probar para obtener una evaluación
adecuada de la eficacia en cada paso. Por lo general, se deberán agregar virus al material en proceso de cada paso que se
desea probar. En algunos casos, simplemente será suficiente agregar un virus de título alto a un material a granel no purificado
y evaluar su concentración entre cada uno de los pasos. Cuando la eliminación viral es el resultado de procedimientos de sepa-
ración, se recomienda investigar, si es apropiado y posible, la distribución de la carga viral en las diferentes fracciones. Cuando
se usan agentes reguladores virucidas en varios pasos dentro del proceso de fabricación, se pueden utilizar estrategias alternati-
vas como por ejemplo la adición en paralelo de cantidades conocidas en soluciones amortiguadoras menos virucidas como
parte de la evaluación general de los procesos. Se deberá determinar el título viral antes y después de cada paso de la prueba.
Las valoraciones cuantitativas de infectividad deberán poseer una sensibilidad y reproducibilidad adecuadas y realizarse con
suficientes repeticiones para asegurar una validez estadística adecuada del resultado. Se podrán utilizar valoraciones cuantitati-
vas no asociadas con infectividad si se justifica. Se deberán incluir controles virales apropiados en todas las valoraciones de in-
fectividad para asegurar la sensibilidad del método. Además, se deberán considerar los datos del muestreo estadístico cuando
el virus tiene baja concentración (Apéndice4).
4. DETERMINACIÓNDE LA ELIMINACIÓNFÍSICAEN FUNCIÓN DE LA INACTIVACIÓN
Se puede reducir la infectividad viral mediante la eliminación o inactivación del virus. Para cada etapa de producción evalua-
da, se deberá describir el posible mecanismo de pérdida de infectividad viral estableciendo si se debe a inactivación o elimina-
ción. Si mediante el proceso de producción se logra una escasa depuración de la infectividad y se considera que la depuración
del virus es el factor más importante para la seguridad del producto, se deberán introducir pasos adicionales o específicos de
inactivación o eliminación. Puede ser necesario distinguir entre la eliminación y la inactivación para un paso en particular, por
ejemplo, cuando existe la posibilidad de que una solución amortiguadora utilizada en más de un paso de depuración pueda
contribuir a la inactivación en todos ellos; es decir, se deberá distinguir entre la contribución de la inactivación por una solu-
ción amortiguadora utilizada en varios pasos cromatográficos y la eliminación lograda en cada uno de estos pasos cromatográ-
ficos.
5. EVALUACIÓN
DE LA INACTIVACIÓN
Para la evaluación de la inactivación viral, se deberá agregar (spike) un virus infeccioso al material en crudo, no procesado o
al material intermedio y deberá calcularse el factor de reducción. Se debe reconocer que esa inactivación viral no es una reac-
ción sencilla de primer orden, sino que generalmente es más compleja, con una "fase 1" rápida y una "fase 2" lenta. Por lo
tanto, se deberá planificar el estudio de tal manera que las muestras se tomen a diferentes tiempos y se deberá elaborar una
curva de inactivación. Se recomienda que los estudios para determinar la inactivación incluyan al menos un punto de tiempo
menor al tiempo de exposición mínima y que sea mayor que cero, además del tiempo de exposición mínimo. Los datos adicio-
nales son particularmente importantes cuando el virus es un virus "relevante" que se sabe que es un agente patógeno humano
y se está diseñando un proceso de inactivación eficaz. Sin embargo, para los estudios de inactivación en los cuales se usan
virus "modelo" no específicos o cuando se usan virus "modelo" específicos como sustitutos de partículas virales, tales como las
partículas intracitoplasmáticas de CHO similares a retrovirus, se deberá demostrar una depuración reproducible en al menos
dos estudios independientes. Siempre que sea posible, se deberá determinar la carga viral inicial a partir del virus que puede
detectarse en el material inicial con virus agregado. Si esto no fuera posible, la carga viral inicial puede calcularse a partir del
título de la preparación viral que se siembra. Cuando la inactivación es demasiado rápida para graficar una curva de inactiva-
ción con las condiciones del proceso, se deberán realizar controles apropiados para demostrar que la infectividad realmente se
pierde mediante la inactivación.
6. FUNCIÓNY REGENERACIÓN
DE COLUMNAS
Con el transcurso del tiempo y después de un uso repetido, la capacidad de las columnas cromatográficas y otros dispositi-
vos utilizados en el sistema de purificación para eliminar los virus puede variar. Algunas estimaciones de la estabilidad de la
depuración viral después de varios usos pueden servir de respaldo para el uso repetido de tales columnas. Se deberá asegurar
que cualquier virus potencialmente retenido por el sistema de producción puede ser adecuadamente destruido o eliminado
antes de la reutilización del sistema, por ejemplo demostrando que los procedimientos de limpieza y de regeneración en reali-
dad inactivan o eliminan el virus.
7. PRECAUCIONES
ESPECÍFICAS
(a) Se deberán tomar las precauciones necesarias al preparar el virus de título alto para evitar la agregación que puede au-
mentar la eliminación física y disminuir la inactivación y, de esta manera, distorsionar la correlación con la producción real.
(b) Se deberá considerar la cantidad mínima de virus que puede analizarse de manera confiable.
(c) El estudio deberá incluir valoraciones de control paralelas para evaluar la pérdida de la infectividad del virus debido a
causas tales como dilución, concentración, filtración o almacenamiento de las muestras antes de la titulación.
(d) El virus "agregado" (spike) se deberá adicionar al producto en un volumen pequeño para no diluir ni cambiar las caracte-
rísticas del mismo. La muestra de prueba de proteína cuando se diluye ya no es idéntica al producto obtenido a escala comer-
cial.
(e) Las diferencias pequeñas, como por ejemplo en las soluciones amortiguadoras, el medio, o los reactivos, pueden afectar
sustancialmente la depuración viral.
(f) La inactivación viral es una función dependiente del tiempo y, por consiguiente, el tiempo durante el cual el producto
con virus agregado permanezca en una solución amortiguadora específica o en una columna cromatográfica específica deberá
reflejar las condiciones del proceso a escala comercial.
(g) Las soluciones amortiguadoras y el producto deberán evaluarse independientemente con respecto a la toxicidad o la in-
terferencia en las valoraciones usadas para determinar la valoración viral, ya que estos componentes pueden afectar negativa-
mente a las células indicadoras. Si las soluciones son tóxicas para las células indicadoras, quizá sea necesaria la dilución, el ajus-
te del pH o la diálisis de la solución amortiguadora que contiene el virus agregado. Si el producto en sí mismo tiene actividad
antiviral, es posible que se deba realizar el estudio de depuración sin el producto en una corrida "simulada", aunque la omisión
del producto o el uso de una proteína similar que no tiene actividad antiviral en su lugar podría afectar el comportamiento del
virus en algunas de las etapas de la producción. Se deberán incluir suficientes controles para demostrar el efecto de los proce-
dimientos utilizados únicamente para preparar la muestra para la valoración (por ejemplo: diálisis, almacenamiento) en la eli-
minación o inactivación del virus agregado en cantidades conocidas.
(h) Muchos esquemas de purificación usan repetitivamente las mismas soluciones amortiguadoras o columnas similares. Se
deberán considerar los efectos de este enfoque cuando se analicen los datos. La eficacia de la eliminación viral mediante un
proceso específico puede variar en las distintas etapas de fabricación en las cuales se usa.
(i) Los factores generales de reducción pueden subestimarse cuando las condiciones de producción o las soluciones amorti-
guadoras son demasiado citotóxicas o virucidas y cada caso deberá tratarse individualmente. También se pueden sobreestimar
los factores generales de reducción debido a las limitaciones inherentes o al diseño inadecuado de los estudios de depuración
viral.
7562 (1050) Evaluación de la Seguridad Viral / InformaciónGeneral USP42
C. Interpretación de los Estudios de Depuración Viral; Aceptabilidad
El objetivo de la evaluación de la inactivación o eliminación viral es evaluar y caracterizar los pasos del proceso que pueden
considerarse eficaces para inactivar o eliminar los virus, y estimar cuantitativamente el nivel general de la reducción viral obte-
nida mediante el proceso de fabricación. En el caso de los contaminantes víricos, como por ejemplo en los Casos B a E, es
importante demostrar que el virus no solamente ha sido eliminado o inactivado, sino que además existe una capacidad en
exceso de depuración viral en el proceso de purificación para garantizar un nivel apropiado de seguridad para el producto fi-
nal. La cantidad de virus eliminado o inactivado por el proceso de producción deberá compararse con la cantidad de virus que
puede estar presente en el material a granel no procesado.
Para realizar esta comparación, es importante calcular la cantidad de virus en el material a granel no procesado. Este cálculo
estimado deberá obtenerse utilizando valoraciones de infectividad u otros métodos como por ejemplo la microscopía electró-
nica de transmisión (TEM, por sus siglas en inglés). Todo el proceso de purificación deberá ser capaz de eliminar sustancial-
mente una cantidad de virus mayor de la que se estima que hay presente en el equivalente de una dosis única de material a
granel no procesado. Ver el Apéndice5 para el cálculo de los factores de reducción viral y el Apéndice6 para el cálculo de partí-
culas estimadas por dosis.
Los fabricantes deben reconocer que los mecanismos de depuración pueden diferir entre las distintas clases de virus. Se de-
berá tomar en consideración una serie de factores cuando se evalúen los datos que avalan la eficacia de los procedimientos de
inactivación o eliminación de virus. Estos incluyen:
(i) La conveniencia de los virus de prueba utilizados;
(ii) El diseño de los estudios de depuración;
(iii) La reducción logarítmica lograda;
(iv) La dependencia del tiempo de inactivación;
(v) Los efectos potenciales de la variación en los parámetros del proceso sobre la inactivación o eliminación viral;
(vi) Los límites de las sensibilidades de la valoración;
(vii) La posible selectividad de los procedimientos de inactivación o eliminación para ciertas clases de virus.
Se puede lograr la depuración eficaz mediante cualquiera de los siguientes procedimientos: varios pasos de inactivación, va-
rios pasos de separación complementarios o combinaciones de pasos de inactivación y separación. Ya que los métodos de se-
paración pueden depender de las propiedades físico-químicas sumamente específicas de un virus, lo cual influye en su interac-
ción con las matrices de gel y las propiedades de precipitación, los virus "modelo" pueden separarse de una manera diferente
a la de un virus objetivo. Los parámetros de fabricación que influyen en la separación deberán definirse y controlarse adecua-
damente. Las diferencias pueden originarse en cambios de la superficie, como por ejemplo en la glicosilación. Sin embargo, a
pesar de estas variables potenciales, se puede obtener la eliminación eficaz mediante la combinación de pasos de separación
complementarios o combinaciones de pasos de inactivación y de separación. Por lo tanto, los pasos de separación bien diseña-
dos, tales como los procedimientos cromatográficos, los pasos de filtración y las extracciones, pueden ser pasos eficaces de
eliminación viral siempre que se realicen bajo condiciones debidamente controladas. Un paso eficaz de eliminación viral debe-
rá producir una reducción reproducible de la carga viral en por lo menos dos estudios independientes.
Un factor de reducción general se expresa normalmente como la suma de los factores individuales. Sin embargo, una reduc-
ción de título viral del orden de 1 log 10 o menos se consideraría inapreciable, y podría descartarse a menos que se justifique.
Si se logra una escasa reducción de la infectividad mediante el proceso de producción, y la eliminación del virus es el factor
más importante para la seguridad del producto, se deberá introducir uno o más pasos específicos adicionales de inactivación o
eliminación. Los fabricantes deberán justificar la aceptabilidad de los factores de reducción obtenidos para todos los virus. Los
resultados deberán evaluarse sobre la base de los factores ya enumerados.
D. Límites de los Estudios de Depuración Viral
Los estudios de depuración viral son útiles para ayudar a garantizar el logro de un nivel de seguridad aceptable en el produc-
to final, pero por sí solos no determinan que el producto es seguro. Sin embargo, existen varios factores en el diseño y la eje-
cución de los estudios de depuración viral que pueden conducir a una estimación incorrecta de la capacidad del proceso para
eliminar la infectividad viral. Estos factores incluyen los siguientes:
1 . Las preparaciones virales utilizadas en los estudios de depuración para un proceso de producción probablemente se pro-
ducen en un cultivo tisular. El comportamiento de un virus de cultivo tisular en una etapa de producción puede ser diferente al
del virus natural, por ejemplo, si los virus naturales y cultivados difieren en la pureza o en el grado de agregación.
2. A menudo la inactivación de la infectividad viral sigue una curva bifásica en la cual una fase inicial rápida está seguida de
una fase más lenta. Es posible que el virus que escapa al primer paso de inactivación sea más resistente a los pasos posteriores.
Por ejemplo, si la fracción resistente toma la forma de agregados virales, la infectividad puede ser resistente a una variedad de
diferentes tratamientos químicos y al calentamiento.
3. La capacidad del proceso general de eliminar la infectividad se expresa como la suma del logaritmo de las reducciones en
cada paso. La sumatoria de los factores de reducción de varios pasos, en particular de los pasos con poca reducción (por ejem-
plo, por debajo de 1 log 10), puede sobreestimar el potencial real de la eliminación viral. Aún más, los valores de reducción
logrados mediante la repetición de procedimientos idénticos o casi idénticos no se deberán incluir a menos que se justifique.
USP42 InformaciónGeneral/(1050) Evaluaciónde la SeguridadViral 7563
4. La expresión de los factores de reducción como reducciones logarítmicas de la valoración implica que, aunque la infectivi-
dad viral residual puede reducirse considerablemente, nunca se reducirá a cero. Por ejemplo, una reducción de la infectividad
de una preparación que contenga 8 log 10 unidades infecciosas por mililitro (mL) por un factor de 8 log 10 da cero log 10 por mL
o una unidad infecciosa por mL, considerando el límite de la detección de la valoración.
5. El procesamiento a escala de planta piloto puede ser diferente del procesamiento a escala comercial a pesar del cuidado
tomado en el diseño del proceso a menor escala.
6. La suma de factores individuales de reducción viral que son resultado de mecanismos similares de inactivación a lo largo
del proceso de fabricación puede sobreestimar la depuración viral general.
E. Estadística
Los estudios de depuración viral deberán incluir el uso del análisis estadístico de los datos para evaluar los resultados. Los
resultados del estudio deberán ser estadísticamente válidos para avalar las conclusiones (ver Apéndice3).
F. Reevaluación de la Depuración Viral

Cuando se hacen cambios significativos en la producción o en el proceso de purificación, se deberá considerar el efecto de
ese cambio en la depuración viral, tanto directo como indirecto y deberá volver a evaluarse el sistema según cada caso. Por
ejemplo, los cambios en los procesos de producción pueden causar cambios significativos en la cantidad de virus producida
por la línea celular; los cambios en los pasos del proceso pueden cambiar el grado de depuración de los virus.
VII. RESUMEN
Este documento sugiere enfoques para la evaluación del riesgo de contaminación viral y para la eliminación del virus del
producto, y de este modo contribuye a la producción de productos biotecnológicos seguros derivados de líneas celulares de
origen animal o humano, y enfatiza el valor de muchas estrategias, que incluyen:
A. La caracterización o examen minucioso del sustrato celular usado como material inicial para identificar los contaminantes
virales presentes, si los hubiera;
B. La evaluación del riesgo mediante la determinación del tropismo en seres humanos de los contaminantes;
C. La creación de un programa apropiado de pruebas para detectar virus adventicios en material a granel no procesado;
D. El diseño cuidadoso de los estudios de depuración viral que utilizan diferentes métodos de inactivación o eliminación viral
en el mismo proceso de producción para lograr la máxima depuración viral; y
E. Estudios de rendimiento que evalúan la inactivación y la eliminación viral.
GLOSARIO
Banco de Célulasde Trabajo (BCT): El BCT está preparado a partir de alícuotas de una suspensión homogénea de células
obtenidas cultivando el BCM bajo condiciones definidas de cultivo.
Banco de CélulasMaestro (BCM): Es una alícuota de una fuente única de células, generalmente preparada a partir de un
don de células seleccionado bajo condiciones definidas, dispensada en envases múltiples y almacenada bajo condiciones defi-
nidas. El Banco de Células Maestro se emplea para proporcionar por derivación todos los bancos de células de trabajo. Las
pruebas que se realicen sobre un nuevo BCM (a partir de un don de células inicial previo, BCM o BCT) deberán ser las mismas
que las realizadas sobre el BCM, a menos que se justifique otra cosa.
Caracterizacióndel Procesode Depuración Viral: Estudios de depuración viral en los cuales se utilizan virus "modelo" no
específicos para evaluar la robustez del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar virus.
Célulasde Producción: Las células sustrato utilizadas para fabricar el producto.
Depuración Viral: La eliminación del virus designado mediante la eliminación de partículas virales o la inactivación de la in-
fectividad viral.
Edad Celular in Vitro: Es la medida del transcurso del tiempo entre el descongelamiento del vial o viales del BCM y la cose-
cha del recipiente de producción, calculado ya sea mediante el tiempo cronológico transcurrido en cultivo, por el nivel de du-
plicación de la población de células o por el nivel de pasaje de las células cuando están subcultivadas por un procedimiento
definido para la dilución del cultivo.
Eliminaciónde Virus: La separación física de partículas de virus del producto previsto.
Estudiosde Evaluacióndel Procesode Depuración Viral: Estudios de depuración viral en los cuales se utilizan virus "rele-
vantes" y/o "modelo" específicos para determinar la capacidad del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar virus.
lnactivación: Reducción de la infectividad del virus causada por una modificación química o física.
Material a Granel sin Procesar: Una o varias extracciones combinadas de células y medios de cultivo. Cuando las células no
son fácilmente accesibles, el material a granel sin procesar sería el líquido extraído del fermentador.
PartículasSimilaresa Virus: Las estructuras visibles por microscopía electrónica que aparentan ser, desde un punto de vista
morfológico, parecidas a virus conocidos.
7564 (1050) Evaluación de la Seguridad Viral/ InformaciónGeneral USP42
Período Mínimo de Exposición: El período más corto durante el cual se mantendrá una fase de tratamiento.
Sustrato Celular: Células utilizadas para la fabricación del producto.
Virus: Agentes infecciosos que se replican intracelularmente y que son potencialmente patógenos, poseen un único tipo de
ácido nucléico [ya sea ácido ribonucléico (ARN)o ADN], no pueden crecer ni dividirse por fisión binaria y se multiplican en la
forma de su material genético.
Virus Adventicio: Un virus contaminante introducido accidentalmente. 0/er también Virus.)
Virus Endógeno: Una entidad viral cuyo genoma es parte de la línea germinal de la especie de origen de la línea celular y
que está integrada de manera covalente dentro del genoma del animal del cual se derivó la línea celular madre. A los efectos
de este documento, están incluidos en esta categoría los virus no integrados introducidos intencionalmente tales como el virus
de la encefalitis bovina (EBV),utilizado para inmortalizar células sustrato o el Virus de Papiloma Bovino. 0fer también Virus.)
Virus Modelo Específico: Un virus estrechamente relacionado con el virus conocido o sospechado (del mismo género o fa-
milia) y que tiene propiedades físicas y químicas similares a aquellas del virus observado o sospechado.
Virus Modelo No Específico: Un virus utilizado para la caracterización del proceso de depuración viral cuando el objetivo es
caracterizar la capacidad del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar los virus en general, por ejemplo, para caracteri-
zar la robutez del proceso de purificación.
Virus No Endógeno: Virus de fuentes externas presentes en el BCM. 0fer también Virus.)
Virus Relevante: Los virus utilizados en estudios de evaluación de procesos, que son o bien el virus identificado o un virus de
la misma especie que el virus conocido, o un contaminante probable del sustrato celular o de cualquier otro reactivo o material
utilizado en el proceso de producción.
APÉNDICES
Apéndice 1: Productos Derivados de Bancos de Células Caracterizadas que Posteriormente Se
Multiplicaron In Vivo
Para productos elaborados a partir de fluidos extraídos de animales inoculados con células de bancos caracterizados, se de-
berá proporcionar información adicional referente a los animales.
Siempre que sea posible, los animales que se utilicen en la fabricación de productos biotecnológicos y/o biológicos se debe-
rán obtener a partir de colonias bien definidas y libres de agentes patógenos específicos. Se deberán realizar pruebas adecua-
das para detectar los virus correspondientes, como por ejemplo los que se enumeran en la Tabla 3. Se deberán describir proce-
dimientos de cuarentena para animales recién llegados y enfermos y se deberán proporcionar medidas que aseguren que to-
dos los métodos de confinamiento, limpieza y descontaminación utilizados dentro de las instalaciones son adecuados para
contener la propagación de agentes adventicios; esto puede lograrse mediante la aplicación de un programa de vigilancia.
También se deberá incluir una lista de agentes para los cuales se realizan pruebas. Los servicios de soporte veterinario deberán
estar disponibles en el sitio o estar en un lugar de fácil acceso. Se deberá describir hasta qué grado el bioterio está aislado de
otras áreas de la planta de fabricación. Las prácticas del personal deberán ser las adecuadas para garantizar la seguridad.
Se deberán describir detalladamente los procedimientos para el mantenimiento de los animales, incluyendo la dieta, los ho-
rarios de limpieza y alimentación, la provisión de un servicio de atención veterinaria periódica, si correspondiera, y detalles de
manipulación especial que los animales puedan requerir una vez inoculados. Se deberá incluir una descripción del régimen de
preparación de los animales, la preparación del inóculo, el sitio y la vía de inoculación.
El primer material recolectado de los animales puede considerarse como una etapa equivalente a la de recolección de mate-
rial a granel sin procesar de un bioreactor. Por lo tanto, se deberán aplicar todas las consideraciones de prueba detalladas pre-
viamente en la sección IVde este documento. Además, el fabricante deberá evaluar la biocarga del material a granel sin proce-
sar, determinar si el material está libre de micoplasma y realizar un análisis específico de la especie, además de una prueba in
vivo en ratones adultos y en ratones lactantes.
Apéndice 2: Selección de Virus para Estudios de Depuración Viral
A. EJEMPLOSDE VIRUS"MODELO" ÚTILES
1 . Virus "modelo" no específicos que representan una amplia gama de estructuras físico-químicas:
• SV40 (Polyomavirus maccacae 1), poliovirus humano 1 (Sabín), parvovirus animal o algún otro virus pequeño no encapsu-
lado;
• virus de parainfluenza o virus de influenza, virus Sindbis o algún otro virus ARN de tamaño mediano a grande encapsula-
do;
• herpesvirus (por ejemplo, HSV-1o virus de la pseudo-rabia) u otros virus ADN de tamaño mediano a grande.
Estos virus se ofrecen solo a modo de ejemplo y su uso no es obligatorio.
2. Para células sustrato de roedores es común que se empleen retrovirus murinos como virus "modelo" específicos.
B. EJEMPLOSDE VIRUSUTILIZADOSEN ESTUDIOSDE DEPURACIÓNVIRAL
En la TablaA-1 se enumeran varios virus que se han empleado en estudios de depuración viral. Sin embargo, ya que éstos
son solamente ejemplos, el uso de cualquiera de los virus de la tabla no se considera obligatorio y se invita a los fabricantes a
que consideren otros virus, especialmente los que puedan ser más apropiados para sus procesos de producción individual. En
general, deberá evaluarse el proceso con respecto a la capacidad de eliminar al menos tres virus diferentes con distintas carac-
terísticas.
Tabla A-1. Elemplos de Virus que se Han Utlllzado en Estudios de Depuración Vlral
Famllla Género Huésped Genoma Med. Tamaño Forma Resistencia 1
Virus Natural Amb. (nm)
Virus de la Estomatitis Ve- Rhabdoviridae Virus vesicu- Equinos, Bo- ARN sí 70 X 150 Cónica Baja
sicular lar vinos
Parainfluenzavirus Paramixoviridae Virus parami- Varios ARN sí 100-200 Pleo/Esfé- Baja
xo rico
MuLV Retroviridae Oncovirus Ti- Ratones ARN sí 80-110 Esférico Baja
poC
Virus de Sindbis Toqaviridae Alfavirus Humanos ARN sí 60-70 Esférico Baja
BVDV Flaviviridae Pestivirus Bovinos ARN sí 50-70 Pleo/Esfé- Baja
rico
Virus de la Pseudorabia Herpesviridae Porcinos ADN SÍ 120-200 Esférico Media
Poliovirus Sabín Picornaviridae Enterovirus Seres huma- ARN no 25-30 lcosahédrico Media
Tipo 1 nos
Virus de la Encefalomio- Picornaviridae Cardiovirus Ratones ARN no 25-30 lcosahédrico Media
carditis (EMC)
Reovirus 3 Reoviridae Ortoreovirus Varios ARN no 60-80 Esférico Media
SV40 Papova Poliomavirus Monos ADN no 40-50 lcosahédrico Muy alta
Parvovirus (canino, porci- Parvoviridae Parvovirus Caninos ADN no 18-24 lcosahédrico Muy alta
no) Porcinos
1 Resistenciaa tratamientosfísico-químicos basadosen estudiosde procesosde producción.La resistencia se refiereal tratamientoespecíficoy se utilizaen el
contexto del entendimiento de la biología del virus y la naturaleza del proceso de fabricación. Los resultados obtenidos varían según el tratamiento. Estosvirus se
ofrecen a modo de ejemplo y su uso no se considera obligatorio.
Apéndice 3: Consideraciones Estadísticas para la Evaluación de Valoraciones Virales
Las valoraciones virales sufren los problemas de variación comunes a todos los sistemas de valoración biológica. Deberá reali-
zarse una evaluación de la exactitud de las valoraciones virales y los factores de reducción derivados de éstas y de la validez de
las valoraciones para determinar la confiabilidad de un estudio. El objetivo de la evaluación estadística es establecer que el es-
tudio se ha llevado a cabo a un nivel aceptable de competencia virológica.
1. Los métodos de valoración pueden ser cuantales o cuantitativos. Los métodos cuantales incluyen valoraciones de infec-
ción en animales o en dosis infectiva en cultivo tisular (TCID), en las cuales el animal o el cultivo de células se califica como
infectado o como no infectado. Los títulos de infectividad son medidos por la proporción de animales o cultivos infectados. En
los métodos cuantitativos, la infectividad medida varía continuamente con la entrada de virus. Los métodos cuantitativos inclu-
yen valoraciones de placa donde cada placa contada corresponde a una sola unidad infecciosa. Tanto las valoraciones cuanta-
les como las cuantitativas son susceptibles de evaluación estadística.
2. Puede haber variación en una valoración como resultado de errores de dilución, efectos estadísticos y diferencias en el
sistema de valoración que son desconocidas o difíciles de controlar. Probablemente estos efectos sean mayores cuando se
comparan diferentes ciclos de valoración (variación entre valoraciones) que cuando se comparan los resultados dentro de un
solo ciclo de valoración (variación intra-valoración).
3. Los límites de confianza del 95 por ciento para los resultados de variación intra-valoración deberán estar normalmente en
el orden de ±0,5 log 10 de la media. La variación intra-valoración puede evaluarse con métodos estadísticos estándar. La varia-
ción entre valoraciones puede controlarse mediante la inclusión de una preparación de referencia, cuya estimación de potencia
deberá estar dentro de aproximadamente 0,5 log 10 de la estimación de la media establecida en el laboratorio para el valor
aceptado de la valoración. Las valoraciones con menor precisión pueden considerarse aceptables con una justificación apropia-
da.
4. Los límites de confianza del 95 por ciento para el factor de reducción observado deberán calcularse, siempre que sea posi-
ble, con estudios de depuración de virus "relevantes" y "modelo" específicos. Si los límites de confianza del 95 por ciento para
las valoraciones virales del material inicial son +s y para las valoraciones virales del material después del paso son +a, los límites
de confianza del 95 por ciento para el factor de reducción son:
±,Js2 +a2
7566 (1050) Evaluación de la Seguridad Viral / InformaciónGeneral USP42
Apéndice 4: Probabilidad de Detección de Virus en ConcentracionesBajas
A concentraciones virales bajas (por ejemplo, dentro del intervalo de 1O a 1000 partículas infecciosas por L) es evidente que
una muestra de unos pocos mililitros puede o no contener partículas infecciosas. La probabilidad, p, de que esta muestra no
contenga virus infecciosos es:
p = (0/-v)N)"
en donde V (L) es el volumen total del material a analizar, v (L) es el volumen de la muestra y n es el número absoluto de
partículas infecciosas estadísticamente distribuidas en V.
Si V>> v, se puede realizar una aproximación a esta ecuación mediante la distribución de Poisson:
p = e-cv
en la cual c es la concentración de partículas infecciosas por L.
o, c = In p/-v
Como ejemplo, si se analiza una prueba con un volumen de 1 mL, las probabilidades p a concentraciones virales que varían
desde 1O hasta 1000 partículas infecciosas por L son:
¡ ,ooo
1: 0,37
Esto indica que para una concentración de 1000 virus por L, en un 37 por ciento de las muestras, 1 mL no contendrá una
partícula viral.
Si solamente se prueba el virus en una porción de una muestra y la prueba es negativa, se deberá calcular la cantidad de
virus que tendría que haber presente en la muestra total para lograr un resultado positivo y este valor debería considerarse al
calcular un factor de reducción. Es aconsejable que los límites de confianza alcancen el 95 por ciento. Sin embargo, en algunos
casos, esto quizás no sea factible debido a las limitaciones de los materiales.
Apéndice 5: Cálculode Factoresde Reducciónen Estudiospara Determinar la Depuración Viral
Elfactor de reducción viral de un paso de purificación o inactivación individual se define como el log 10 del cociente de la
carga viral en el material antes de la purificación y la carga viral en el material una vez purificado cuando está listo para ser
empleado en el próximo paso del proceso. Si se utilizan las siguientes abreviaturas:
Material inicial: volumen v'; concentración 1O•';
carga viral: (v')(l O•),
Material final: volumen v"; título 1O•";
carga viral: (v")(l O•"),
los factores de reducción individual Ri se calculan según:
1oru = (v')(l O•') / (v")(l O•")
Esta fórmula considera las concentraciones y los volúmenes de los materiales antes y después del paso de purificación.
Debido a la imprecisión inherente de algunas valoraciones virales, un factor de reducción individual empleado para el cálcu-
lo de un factor de reducción general deberá ser mayor de 1.
El factor de reducción total para un proceso de producción completo es el logaritmo de la suma de los factores de reducción
de los pasos individuales. Esto representa el logaritmo del cociente entre la carga viral al comienzo del primer paso del proceso
de depuración y al final del último paso del proceso de depuración. Los factores de reducción se expresan normalmente en
una escala logarítmica lo cual implica que, mientras que la contaminación viral residual nunca se reducirá a cero, puede redu-
cirse considerablemente en forma matemática.
Apéndice 6: Cálculo de PartículasEstimadaspor Dosis
Esto se aplica a aquellos virus para los cuales puede hacerse una estimación de una cifra inicial, como por ejemplo los retrovi-
rus endógenos.
Ejemplo:
l. Suposiciones
Concentración estimada o medida de virus en el cultivo celular recolectado: = 106/ml
Factor de depuración viral calculado = > 10 15
Volumen de cultivo recolectado necesario para hacer una dosis del producto = 1 L (103 mL)
11.Cálculo de Partículas/Dosis Estimadas
USP42 Información General/ (1050.1) Procedimientos de Depuración Viral 7567
6 3
(10 unidades
VlrUS
de /ml\x(10
1
ml/dosis)
15
Factor de depuración> 10
10 9 partículas /dosis
15
Factor de depuración> 10
6
=<10~ partículas/dosis
Por lo tanto, se esperaría menos de una partícula por millón de dosis.
(1050.1) DISEÑO,EVALUACIÓN
Y CARACTERIZACIÓN
DE
PROCEDIMIENTOSDE DEPURACIÓNVIRAL
INTRODUCCIÓN
Este capítulo es complementario al capítulo Evaluaciónde la SeguridadViral en ProductosBiotecnológicosObtenidosde Líneas
Celularesde Origen Humano o Animal (1050), el cual fue adaptado, sin cambios fundamentales, de la guía Q5A de la Conferen-
cia Internacional sobre Armonización. Este capítulo provee a los usuarios guías prácticas sobre el diseño, la evaluación y la ca-
racterización de procedimientos de depuración viral. El alcance de este capítulo es el mismo que el descrito en el capítulo
(1050) y abarca productos biotecnológicos para uso humano que se derivan de líneas celulares de origen humano o animal.
Los estudios de depuración viral realizados de acuerdo con los principios descritos en este capítulo proveerán datos significati-
vos sobre la capacidad de los procesos generales de producción y purificación para eliminar o inactivar un amplio espectro de
tipos de virus que pueden afectar la seguridad de los productos obtenidos por biotecnología. [NOTA-El Glosariocontiene defi-
niciones de términos usados en este capítulo que no están definidos en el capítulo (1050).]
Las reglamentaciones para la autorización de productos biotecnológicos establecen que los bancos celulares, las materias
primas de origen biológico y su recolección a granel deben someterse a controles y análisis de seguridad viral; sin embargo,
muchos de los métodos de detección viral que se pueden usar tienen limitaciones inherentes. Además, algunos métodos de
detección pueden ser demasiado específicos para un virus en particular, por lo que pueden fallar en la detección de variantes
virales (p. ej., cepas no citopáticas o cepas tipo salvaje no adaptadas al laboratorio, o variantes mutadas). También podrían no
detectarse algunos virus que han emergido de forma reciente. Por último, los métodos de detección por lo regular se ven limi-
tados por su sensibilidad, y los virus infecciosos con un título bajo pueden pasar inadvertidos. La contaminación viral de los
procesos de fabricación puede provenir de diversas fuentes, incluyendo sustratos celulares y materias primas de origen biológi-
co (tales como suplementos de cultivo celular u otras materias primas para producción), así como de contaminación durante la
producción. Además de los análisis de seguridad viral requeridos para estos materiales, los fabricantes deben evaluar la efectivi-
dad de las etapas de purificación posteriores al procesamiento inicial, que en conjunto deben eliminar o desactivar todos los
virus potencialmente presentes (ver el capítulo (1050)). La USP sugiere a los lectores mantener actualizadas constantemente las
buenas prácticas del área de trabajo mediante la consulta de publicaciones de referencia, de guías reglamentarias y de líderes
de opinión y organizaciones claves.
Según se sugiere en los documentos sobre "Puntos a Considerar'' (Puntosa Considerardurante la Fabricacióny Análisisde
Productosde AnticuerposMonoclonalespara UsoHumanoy VersiónPreliminarde Puntosa Considerardurante la Caracterizaciónde
LíneasCelularesUsadaspara ProducirProductosBiológicos)de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU.
(FDA, por sus siglas en inglés), así como el capítulo (1050), por lo regular se usa un método de múltiple etapas para garantizar
la seguridad viral. Los estudios de depuración por lo general se pueden considerar genéricos o modulares. Según se describe
en el documento Puntosa Considerardurante la Fabricacióny Análisisde Productosde AnticuerposMonoclonalespara UsoHuma-
no de la FDA,un estudio de depuración genérico es aquél en el que se demuestra la eliminación e inactivación de virus duran-
te varias etapas del proceso de purificación de un anticuerpo monoclonal (mAb, por sus siglas en inglés) modelo en el cual los
datos pueden extrapolarse a otros anticuerpos monoclonales que siguen el mismo esquema de purificación y eliminación/inac-
tivación de virus que el mAb modelo. Un estudio de depuración modular demuestra la eliminación o inactivación de virus de
las etapas individuales durante el proceso de purificación (cromatografía en columna, filtración, pasteurización, tratamiento
con disolvente/detergente, tratamiento a pH bajo, entre otros) de modo que cada módulo en el esquema de purificación pue-
da estudiarse de forma independiente de los otros módulos. En caso necesario, como modelo se pueden usar mAbs alternati-
vos para demostrar la depuración viral en diferentes módulos. Si los módulos son idénticos, los resultados del módulo de depu-
ración del mAb modelo son extrapolables a los del módulo de depuración del mAb producto. Este capítulo complementa los
documentos mencionados ya que provee estrategias para realizar y evaluar la depuración viral.
7568 (1050.1) Procedimientos de Depuración Viral / InformaciónGeneral USP42
OBJETIVOS
Y PRINCIPIOSDE LOS ESTUDIOSDE DEPURACIÓNVIRAL
Un estudio de depuración viral debe evaluar la capacidad del proceso general de purificación para eliminar o inactivar un
espectro amplio de tipos de virus, incluyendo virus que se sabe contaminan o tienen el potencial de contaminar las materias
primas, así como aquellos que pueden ser introducidos durante la fabricación. Los estudios de depuración viral por lo regular
implican subestudios realizados en etapas individuales específicas y adecuadas de la fabricación y de los procesos de purifica-
ción. Los estudios deben realizarse de tal manera que generen datos cuantitativos, lo cual permite la identificación de etapas
de depuración eficaces y la estimación de factores de reducción viral (VRF,por sus siglas en inglés, también conocidos como
factores de reducción logarítmica, LRF,por sus siglas en inglés, o valores de reducción logarítmica, LRV,por sus siglas en in-
glés). Elfactor de reducción viral de una etapa individual de depuración representa la relación entre la carga viral en el material
previo al tratamiento (usado para desafiar la etapa de depuración) y la carga viral en el material posterior al tratamiento. Los
factores de reducción viral derivados de etapas específicas se usan para evaluar la capacidad general del proceso completo de
producción para eliminar o inactivar virus específicos o no específicos del proceso.
Uno de los objetivos clave de un proceso de purificación durante la fabricación es lograr una depuración viral máxima sin
comprometer la calidad del producto. Se deben caracterizar los atributos críticos de las etapas estratégicas de depuración viral
en el proceso de fabricación. En el contexto de depuración viral, la robustez tiene dos componentes principales: 1) la capaci-
dad de las etapas de proceso para eliminar y/o inactivar virus en las condiciones más exigentes o en un amplio intervalo opera-
tivo de parámetros (p. ej., temperatura, concentración de proteína, presión, velocidad de flujo, conductividad y pH) y 2) la
capacidad de las etapas del proceso para eliminar o inactivar virus que presentan un amplio espectro de características físicas y
químicas de resistencia (p.ej. a bajo pH, a alta temperatura, a tratamiento con disolvente/ detergente o filtración) consistente-
mente a lo largo del tiempo. Un proceso validado que provee una depuración viral robusta debe establecer un factor de reduc-
ción viral obtenible para un panel de virus "relevantes" o "modelo" (consulte la siguiente sección para definiciones). El proceso
validado también debe demostrar la robustez de las etapas dedicadas a inactivación o depuración, en las cuales los parámetros
operativos que podrían afectar la depuración viral están bien establecidos. Por lo tanto, demostrar la robustez de la depuración
viral provee la confianza de que el proceso de fabricación puede eliminar o inactivar potenciales contaminantes virales.
Los protocolos de estudio de depuración viral comienzan con un plan de acción general y el diseño de experimentos. El
capítulo (1050) (ver la SecciónVy la Tabla4) describe cinco planes de acción principales (CasosA-E) y puede usarse como
guía. Los sustratos celulares categorizados en los CasosC, O y E representan casos especiales, y los fabricantes que emplean
estos sustratos deben discutir el diseño de su estudio con las autoridades reglamentarias correspondientes. Problemas únicos
para cada proceso de producción deben considerarse caso por caso. Estos problemas pueden estar relacionados con los mate-
riales de partida, los procesos de producción, el producto y/o el uso previsto del producto. El plan de acción general dicta la
elección del virus a usar en el estudio de depuración viral, es decir que el estudio debe incluir virus modelo relevantes, específi-
cos y no específicos. Además, el protocolo del estudio de depuración viral puede incluir los siguientes elementos: descripciones
de las instalaciones y del personal responsable de ejecutar el estudio, los modelos de purificación a escala reducida, la justifica-
ción de la aptitud del modelo a escala reducida y el diseño del estudio. El informe del estudio puede incluir estos elementos,
así como un análisis paso a paso de factores de reducción viral calculados y la capacidad de depuración viral general del proce-
so de purificación. Los estudios de depuración viral deben realizarse de forma controlada y bien documentada de manera que
se cumpla con los requisitos reglamentarios vigentes.
CONSIDERACIONES
PARA ELDESEMPEÑODE LOS ESTUDIOSDE DEPURACIÓNVIRAL
Selecciónde Virus
La elección y el número de virus que pueden usarse en un estudio de depuración viral son dictados por la naturaleza y el
origen de la línea celular de producción, así como la naturaleza y el origen de los materiales derivados de animales usados en
la producción y la purificación. En general, al menos dos virus, uno envuelto (por lo regular un retrovirus, p. ej., virus de la
leucemia murina, MuLVpor sus siglas en inglés) y uno sin envoltura (de preferencia un parvovirus, p. ej., virus diminuto de
ratón, MVM por sus siglas en inglés), se usan en las fases clínicas tempranas de desarrollo del producto, pero se pueden usar
tres virus o más para generar datos para estudios con propósitos de registro. Se deben evaluar al menos dos etapas ortogona-
les de eliminación/inactivación (etapas con mecanismos distintos de depuración) para cada virus. La reproducibilidad de una
etapa eficaz debe evaluarse realizando al menos dos experimentos independientes, o la reproducibilidad debe estar sustentada
por el historial (o experiencias) de desarrollo del proceso. Los virus modelo para estudios de evaluación y de caracterización de
procesos deben ser similares a los virus que podrían contaminar el producto; sin embargo, también se deben examinar otros
virus con un amplio intervalo de características físicas y químicas. Esto último es importante para mostrar que el proceso de
purificación es capaz de inactivar o eliminar una amplia variedad de virus, incluyendo virus que han emergido de forma recien-
te (p. ej., vesivirus 2117, circovirus o parvovirus humanos y animales descubiertos recientemente) o contaminantes inespera-
dos (p. ej., virus de la diarrea viral bovina, virus diminuto de ratón, virus de enfermedad hemorrágica epizoótica y virus del
valle de Cache). Elfabricante debe justificar la elección de virus de acuerdo con los objetivos de los estudios de evaluación y de
caracterización del proceso y las guías provistas en este documento, así como las guías reglamentarias pertinentes.
Los virus usados en estudios de depuración pertenecen a tres categorías: virus relevantes, virus modelo específicos y virus
modelo no específicos. Los "virus relevantes" son virus usados en los estudios de evaluación del proceso, los cuales son los
virus contaminantes identificados o de la misma especie que el virus identificado, o que probablemente contaminen el sustrato
celular o cualquier otro reactivo o materiales usados en el proceso de producción. Cuando no se encuentra disponible un virus
relevante o cuando no está bien adaptado para este propósito (p. ej., no se puede hacer crecer in vitro hasta un título suficien-
temente alto o no se puede detectar usando los puntos finales requeridos para evaluar la inactivación en ensayos de titulación
viral basada en células), se puede usar un "virus modelo específico" como sustituto. Un virus modelo específico apropiado
puede ser un virus que esté estrechamente relacionado con el virus conocido o sospechado (mismo género o familia), tenien-
do propiedades físicas y químicas similares. Por ejemplo, las líneas celulares derivadas de roedores por lo general contienen
retrovirus endógenos o partículas virales similares a retrovirus que pueden ser infecciosas o no infecciosas. Se debe determinar
la capacidad del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar retrovirus de roedores presentes en productos obtenidos de
dichas células. En el caso de las células derivadas de roedores, se puede usar un virus de leucemia murina como virus modelo.
Los fabricantes que usan células derivadas de linfocitos B humanos inmortalizadas mediante infección con virus Epstein-Barr
deben demonstrar la capacidad del proceso de fabricación para depurar distintos tipos de virus del herpes. En este caso, los
virus de pseudorabia u otros virus del herpes pueden usarse como virus modelo específico.
Finalmente, cuando el objetivo es caracterizar la capacidad del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar virus en
general (es decir, para caracterizar la robustez de los procesos de depuración), los estudios de depuración viral pueden realizar-
se con un panel de varios "virus modelo no específicos" que tengan una amplia variedad de características físicas y químicas.
Los datos obtenidos a partir de estudios con virus relevantes o virus modelo específicos también pueden contribuir con esta
evaluación. No es necesario analizar todos los tipos de virus; se debe dar preferencia a varios virus con propiedades físicas y
químicas diversas que serían representativos de una amplia variedad de familias virales. Los resultados obtenidos para dichos
virus proveen información útil sobre la capacidad del proceso de producción para eliminar o inactivar virus en general. La
Tabla 1 provee ejemplos de virus modelo que presentan una variedad de propiedades fisicoquímicas para uso en estudios de
depuración viral, incluyendo aquellos ejemplos descritos en el capítulo (1050) (ver la TablaA-1). Los temas adicionales a tener
en cuenta durante la selección de virus son: 1) la capacidad de cultivar el virus de interés hasta un título suficientemente alto,
2) la capacidad para crear suspensiones madre de virus con mínimos agregados, 3) la disponibilidad de un sistema de valora-
ción calificado/validado para la detección de los virus seleccionados, 4) que los virus seleccionados no presenten un riesgo para
la salud del personal que realiza el estudio o para el ambiente y 5) el potencial para enfrentar virus nuevos y emergentes.
4=
1an1a 1. 1:1emp1os ae virus usaaos en 1:Stua1os ae oepurac1on v1ra1 para Proauctos Blotecno1oa1cos Derivados de cu1t1vos Celulares 'l
V,
Virus Familia Género Huésped Natural Genoma Con envoltura Tamaño (nm) Forma Resistencia• 'l
o
Adenovirus 5 Adeno Mastadeno-virus Humano ADN No 70-90 Esférico Alta .....
----
Virus de la diarrea vi- Pleomórfico/ oV,
ral bovina Flavi Pestivirus Bovino ARN Sí 50-70 esférico Baja
~
Virus del valle de Ca- .....
che Bunya Bunyavirus Bovino, ovino ARN Sí 80-120 Esférico Baja "C
Virus de la encefalo- a
n
miocarditis (EMC,
por sus siglas en in-
~
glés)
§'
Picorna Cardiovirus Ratón ARN No 25-30 lcosahedro Media ¡¡¡·
Calicivirus felino Calici :::,
Vesivirus Felino ARN No 35-40 lcosahedro Alta .....
Herpes simple 1 Herpes Virus del herpes alfa Humano ADN Sí 120-200
o
Esférico Media "'
o._
Virus de leucemia mu- (1)
rina Retro Oncovirus tipo C Ratón ARN Sí 80-11 O Esférico Baia o
(1)
Virus de la parain- Pleomórfico/ "'O
fluenza Paramixo Paramixovirus Varios ARN Sí 100-200 esférico Baja
e:
ñl
Parvovirus (virus dimi- n
nuto de ratón, par- o:
:::,
vovirus porcino, par-
vovirus canino, par-
:s:;
Murino, porcino,
vovirus bovino) Parvo Parvovirus canino, bovino ADN No 18-26 lcosahedro Muv alta ª-
Poliovirus sabin tipo 1 Picorna Enterovirus Humano ARN No 25-30 lcosahedro Media ---
s-
Circovirus porcino o'
~
(PCV, por sus siglas ~
Q
en inglés)
Virus de la pseudora-
bia
Circo Circovirus Porcino ADN No 15-20 lcosahedro Alta
a~
:3
Herpes - Porcino ADN Sí 120-200 Esférico Media Cl
n:,
Reovirus 3 Reo Ortorreovirus Varios ARN No 60-80 Esférico Media :3
n:,
Virus de simio 5 Paramixo Rubulavirus Simiano ARN Sí 150-300

Pleomórfico/
esférico Baja ª-
Virus sindbis Toga Alfavirus Humano ARN Sí 60-70 Esférico Baja
SV40 Papova Poliomavirus Simio ADN No 40-50 lcosahedro Muy alta
Virus de la estomatitis
vesicular Rabdo Vesiculovirus Equino, bovino ARN Sí 70 x 150 Bala Baia
Virus del Nilo Occi- Pleomórfico/
dental Flavi Flavivirus Aviar ARN Sí 40-70 esférico Media
ª Resistencia a tratamientos fisicoquímicos basados en estudios de procesos de purificación. La resistencia es relativa al tratamiento específico y se usa en el contexto de entender la biología del virus y la naturaleza del
proceso de fabricación. Los resultados reales varían de acuerdo con el tratamiento. Estos virus son ejemplos únicamente, su uso no es obligatorio y la tabla no es exhaustiva.
e
V,
"C
.¡,.
N
=1~ ~
USP42 InformaciónGeneral/ (1050.1) Procedimientos de Depuración Viral 7571
Capacidad de Depuración del Proceso
La capacidad de depuración viral de un proceso por lo regular se expresa como el valor logarítmico del factor de reducción
del virus calculado para el proceso completo. Aunque no existen requisitos específicos para la capacidad de depuración viral
que un proceso debe lograr, la naturaleza y origen del tipo de célula, las materias primas usadas en la producción, así como
otros factores, pueden influir en la necesidad de niveles de depuración viral mayores o menores. Por ejemplo, para el proceso
de fabricación que emplea células de ovario de hámster chino y NS0, la capacidad de depuración retroviral deseada debería
tener un factor de reducción logarítmica de entre 4-6 de depuración retroviral total teniendo en cuenta el título de partículas
tipo retrovirus en el material del biorreactor de producción y el nivel superior en la dosis terapéutica máxima. La capacidad
mínima de depuración para otro tipo de virus puede incluir un factor de reducción logarítmica >4 tanto para virus con envol-
tura adicionales como para virus sin envoltura. En cada caso se deben establecer y justificar objetivos de depuración específi-
cos. En general, para que se considere efectiva una etapa individual de depuración, se debe demostrar un factor de reducción
logarítmica de 4 o mayor. Por el contrario, una etapa de depuración que demuestre un factor de reducción logarítmica de 1-3
se considera como etapa de apoyo. El título viral en una preparación antes y después de ser procesada por cualquier etapa
individual del proceso debe incluir el valor de intervalo de confianza del 95% (a= 0,05). Una etapa puede ser de apoyo para
algunos virus y ser efectiva para otros. Siempre que sea posible y en la medida que el conocimiento sobre el proceso lo permi-
ta, se deben realizar estudios de depuración viral en las condiciones más desfavorables esperadas para los parámetros definidos
como críticos para dicha etapa (p. ej., pH, temperatura y velocidad de flujo). Se debe identificar y evaluar un número suficiente
de etapas de purificación posteriores al procesamiento inicial, de modo que se pueda alcanzar el objetivo de depuración gene-
ral requerido.
Etapas para la Depuración Viral Posteriores al Procesamiento Inicial del Producto
Las etapas posteriores al procesamiento inicial del producto, deben emplear diferentes mecanismos (ortogonales) de depu-
ración viral debido a que el uso de múltiples etapas con los mismos mecanismos de depuración o similares puede generar una
sobreestimación de la capacidad de reducción viral general. En general, un proceso de purificación debe incluir al menos una
etapa de inactivación viral robusta y/o una etapa de eliminación viral robusta. Para cada etapa de purificación evaluada, el me-
canismo de depuración viral debe describirse como inactivación, eliminación o una combinación de ambos; para éste último
caso, se debe identificar el mecanismo primario de depuración. Para etapas de inactivación, los estudios de depuración deben
planearse de tal manera que se pueda determinar la cinética de inactivación viral. Idealmente, un proceso de fabricación inclu-
ye etapas dedicadas a la depuración viral; es decir, están presentes en el proceso de producción o purificación específicamente
para la eliminación o inactivación de virus. Ejemplos de estas etapas incluyen inactivación por tratamiento con disolvente y
detergente, inactivación a pH bajo y filtración para la eliminación de virus.
Calificación y Reducción de Escala de las Etapas de Purificación

Los estudios de depuración viral que emplean cantidades conocidas agregadas de virus no se realizan a escala de producción
en el sitio de fabricación debido a que esto puede contaminar el sitio con virus. Dichos estudios deben realizarse en una insta-
lación separada, equipada para trabajos virológicos y con personal experimentado en virología y familiarizado con la operación
de un proceso de purificación a escala reducida. Se debe calificar cada etapa a escala reducida del proceso de purificación, es
decir, se debe demostrar que es comparable al proceso de producción a escala completa mediante todos los criterios medibles
pertinentes. La comparabilidad debe demostrarse usando materias primas y productos intermedios representativos de la pro-
ducción, así como el equipo y los parámetros operacionales establecidos de acuerdo a los principios apropiados de reducción
de escala. Los resultados deben medirse con métodos analíticos y análisis estadísticos apropiados.
En muchos casos, los parámetros monitoreados son los mismos que aquellos analizados durante el desempeño de las etapas
reales de fabricación. Para cromatografía, los parámetros deben ser representativos de los de la fabricación a escala clínica o
comercial respectiva: [p. ej., la altura del lecho de la columna, el tiempo de residencia, la velocidad de flujo lineal, la matriz
cromatográfica, la composición de la solución amortiguadora (incluyendo pH, conductividad y temperatura operativa) y las
concentraciones y composición de combinaciones (pool) de producto]. Los sistemas de cromatografía a escala reducida y a
escala de fabricación deben producir similares perfiles de elución y de rendimientos, así como de perfil analítico del producto
final (p. ej., análisis por SEC-HPLCy/o SDS-PAGE).Se aplican consideraciones similares para otros tipos de procedimientos.
Cualquier diferencia inevitable entre los procedimientos a escala reducida y a escala de fabricación debe ser investigada para
determinar su influencia potencial en los resultados de la depuración viral.
Selección de Puntos de Muestreo
Los puntos de muestreo para evaluar la inactivación viral deben incluir los materiales de partida (soluciones de proceso con
cantidades agregadas conocidas de virus y controles apropiados) así como muestras tomadas a diversos tiempos de muestreo
durante el proceso de inactivación. Este método permite monitorear la cinética de la inactivación viral. Los puntos de muestreo
para etapas de eliminación de virus, tales como cromatografía y filtración, deben incluir la solución del flujo de alimentación
7572 (1050.1) Procedimientos de Depuración Viral/ InformaciónGeneral USP42
de proceso que se aplicará a la etapa, así como la combinación de las fracciones obtenidas del proceso esta etapa y que se
procesa en etapas subsiguientes. Las fracciones cromatográficas (p. ej., flujo de paso, lavados, anterior al pico, pico, posterior
al pico, elución total) del flujo principal, así como las muestras previas y posteriores al flujo principal, por lo regular se evalúan
en estudios que sustentan los estudios con propósitos de registro. También puede ser útil el análisis de dichas fracciones adicio-
nales en casos en los que no se entiende el mecanismo de partición. Los puntos de muestreo se discuten en mayor detalle en
la sección Desempeñode Estudioscon CantidadesAgregadasConocidasde Virus.
Selección de Ensayospara CuantificaciónViral

Se pueden usar diversos tipos de ensayos de cuantificación viral. Los ejemplos incluyen ensayos de infectividad tales como
ensayos de dosis infecciosa en cultivo celular y ensayos de cuantificación de placas. Además, los ensayos cuantitativos de la
reacción en cadena de la polimerasa (qPCR, por sus siglas en inglés) detectan y cuantifican los ácidos nucleicos de virus infec-
ciosos y no infecciosos. Estos ensayos se describen en Métodosde PruebasVirológicas(1237), TécnicasBasadasen ÁcidosNuclei-
cos-Extracción, Deteccióny Secuenciación (1126) y en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Amplificación(1127). Al usar técni-
cas basadas en ácidos nucleicos (NAT,por sus siglas en inglés), es importante asegurar que la cantidad agregada conocida de
virus y las muestras con cantidades agregadas conocidas que se van a analizar no contengan cantidades significativas de ácidos
nucleicos virales libres. La cantidad de ácidos nucleicos libres puede reducirse mediante el pretratamiento de las muestras con
nucleasas. Es importante caracterizar el impacto del pretratamiento de nucleasas en las cantidades agregadas conocidas de vi-
rus debido a que puede tener un impacto negativo sobre la cantidad agregada de virus. Los ensayos de infectividad cuantitati-
vos/cuantales deben tener una sensibilidad y reproducibilidad adecuada, y deben realizarse con un número suficiente de deter-
minaciones repetidas para asegurar la validez estadística de los resultados. Todos los ensayos deben incluir controles de aptitud
del sistema apropiados. Se debe demostrar mediante calificación o validación que los ensayos de titulación viral usados para
apoyar los estudios de depuración viral son adecuados para este propósito.
Efectos de la Matrizde la Muestra sobre los Ensayosde CuantificaciónViral

Cuando se depura un virus por métodos de inactivación o eliminación (p. ej., filtración o columna cromatográfica), se deben
realizar análisis preliminares de citotoxicidad e interferencia viral para determinar si los ensayos de cuantificación viral son sen-
sibles a los componentes de la matriz presentes en sus muestras. Estos análisis deben realizarse antes de los estudios con canti-
dades agregadas conocidas de virus para confirmar que los resultados de estos estudios se deben en realidad a la depuración
viral y no a otros factores intrínsecos o extrínsecos que generan resultados falsos negativos. Por ejemplo, algunos intermedia-
rios del proceso pueden ser citotóxicos para las células detectoras (indicadoras) o pueden interferir con la detección de virus
mediante un sistema de ensayo particular. Las soluciones de proceso usadas en estos estudios deben ser representativas de
aquellas de una corrida de fabricación a escala completa con buenas prácticas de fabricación. Se determina la dilución de la
solución muestra de proceso que no ocasiona citotoxicidad o interferencia y la solución del proceso se diluye de manera co-
rrespondiente antes del almacenamiento o del análisis de muestras de la etapa de fabricación en los estudios con cantidades
agregadas de virus.
En una evaluación de citotoxicidad, las células usadas en el ensayo de cuantificación viral se exponen a una serie de dilucio-
nes de la solución de matriz de muestras de dicha etapa del proceso. Posteriormente, se evalúa la viabilidad de las células y los
cambios en su morfología que pudieran interferir con la evaluación de los efectos citopáticos virales o placas en las células indi-
cadoras y 9ue, por consiguiente, podrían tener un impacto sobre el desempeño del ensayo. Se determina la dilución de la
solución muestra de proceso que no ocasiona citotoxicidad y la solución del proceso se diluye de manera correspondiente an-
tes del almacenamiento o del análisis de muestras de la etapa de fabricación en los estudios con cantidades agregadas conoci-
das de virus.
El estudio implica las siguientes etapas:
1. Realizar diluciones en serie (p. ej., 1/1O, 1/5 o 1/2) de la carga de la etapa de filtración o de inactivación del virus usando
medios de cultivo celular apropiados como diluyente
2. Inocular las distintas diluciones de la carga de la etapa de filtración o de inactivación del virus en las células indicadoras
que se usarán para cada titulación viral
3. Incluir soluciones amortiguadoras o medios apropiados y controles celulares
4. Identificar la dilución de la carga de inactivación de virus que no presente toxicidad en células detectoras atribuible a la
matriz de carga
Las soluciones de proceso también pueden interferir con la detección de virus mediante el sistema de ensayo de infectividad
viral in vitro basado en células, ya sea por la inactivación del virus mismo o por la alteración de las células indicadoras de tal
forma que retrase o prevenga la ocurrencia de una infección viral productiva. Para evaluar interferencia viral por parte de una
solución de proceso, se preparan diluciones de la solución de proceso y se les agrega una cantidad conocidas de virus. Cada
dilución se titula subsiguientemente en el ensayo de infectividad viral cuantitativo/cuanta!. Si la diferencia entre el título cono-
cido y el título determinado en el ensayo para la solución con la cantidad agregada conocida (el título de interferencia viral) es
mayor que la variabilidad predeterminada del ensayo (por lo regular ±0,5 log), entonces se sospecha interferencia viral.
Para evaluar la interferencia viral de la carga de la etapa de inactivación, se deben seguir los siguientes pasos:
T
1. Realizar diluciones en serie (p. ej., 1/1O, 1/5 o 1/2) de la suspensión madre de virus usando medios de cultivo celular
apropiados como diluyente. Esto servirá como control positivo para el título del virus
2. Realizar diluciones en serie (p. ej., 1/1O, 1/5 o 1/2) de la suspensión madre de virus usando la carga de inactivación de
virus como diluyente [NOTA-La información del estudio de citotoxicidad determinará el diseño de este paso y del si-
guiente.]
3. Inocular las diluciones en serie en las células indicadoras
4. Incluir controles de aptitud del ensayo (positivo y negativo) en la prueba
5. Identificar la dilución de la carga de inactivación de virus que no genere cambios significativos en el título de la suspen-
sión madre de virus en comparación con el título viral del control positivo
Si se usan ensayos de qPCR para cuantificar los virus, para cada solución de proceso se debe analizar la interferencia y la
recuperación con el método de extracción de ácido nucleico usado, además de analizar la interferencia con la reacción misma
de la qPCR. Cada solución de proceso debe diluirse hasta un nivel que no ocasione interferencia. Aunque la dilución de la solu-
ción de proceso para lograr un desempeño aceptable del ensayo es una estrategia de uso común, esto reduce el factor de
reducción viral máximo demostrable para la etapa de depuración que se está evaluando.
Efectosdel Almacenamientoy la Congelaciónde las Muestras de DepuraciónViral
Si se usan soluciones de proceso dentro de sus tiempos de retención establecidos, se deben realizar estudios de estabilidad
para conocer mejor los efectos de la retención o del almacenamiento de las soluciones sobre la etapa de depuración o sobre el
virus (p. ej., agregación). Por ejemplo, podría presentarse crecimiento bacteriano o precipitación de proteínas en las solucio-
nes, en particular después de almacenamiento prolongado.
Si las muestras del estudio con cantidades agregadas conocidas de virus se almacenan congeladas antes de la cuantificación
del virus, se deben realizar estudios de estabilidad usando el resultado de infectividad como punto final. Idealmente, esto debe
realizarse antes que el estudio con cantidades agregadas conocidas de virus mediante la adición de una cantidad conocida de
virus a cada solución de proceso y posteriormente congelando cada muestra. Después de los tiempos indicados en almacena-
miento por congelación, retirar las muestras y determinar el título de cada dilución muestra. Si la diferencia entre el título co-
nocido y el título determinado a partir de una solución congelada con cantidades agregadas conocidas de virus es mayor que
la variabilidad del ensayo (por lo regular ±0,5 log), esto indica que la infectividad viral se ha visto comprometida por el almace-
namiento por congelación.
Calificaciónde SuspensionesMadre de Virus y Efectossobre las Etapasde Procesamiento
Las suspensiones madre de virus usados en estudios de depuración viral son reactivos críticos. Cada suspensión madre de
virus debe tener una fuente rastreable y certificada con documentación completa de los procedimientos de producción contro-
lados. Las suspensiones madre de virus deben cumplir con los criterios predeterminados de identidad, pureza (p. ej., análisis de
esterilidad, micoplasma y virus adventicios), título infeccioso, estabilidad a temperaturas de congelación y pocos agregados
virales. Se debe minimizar el número de pasajes del banco de virus maestro o de trabajo para reducir la probabilidad de muta-
ción. La pureza de las preparaciones de virus debe tenerse en cuenta para casos en los que las impurezas de las preparaciones
de virus puedan influir sobre el desempeño de alguna operación unitaria específica (p. ej., filtración de virus).
Durante la calificación, se debe obtener el título viral inicial para cada suspensión madre de virus. Idealmente, se deben valo-
rar suspensiones madre de forma independiente en días distintos usando diferentes números de pasajes de las células del culti-
vo indicador que fueron usadas en el ensayo de cuantificación viral. Los títulos resultantes deben coincidir dentro de la variabi-
lidad predeterminada del ensayo (generalmente la expectativa es ±0,5 log) y en tal caso, se pueden promediar los títulos para
determinar el título certificado de la suspensión madre.
Puede ser recomendable realizar un estudio de simulación con cantidades agregadas conocidas de virus antes del estudio
real. Este estudio de simulación con cantidades agregadas conocidas de virus evalúa los efectos de la matriz de la suspensión
madre de virus de la que se agregan cantidades conocidas de virus sobre la etapa del proceso que se está evaluando. Los estu-
dios de simulación con cantidades agregadas conocidas de virus son importantes para todas las etapas que se someterán a
análisis de depuración viral, aunque son particularmente importantes para aquellas etapas en las que se evaluará la depuración
de virus de una suspensión madre que contiene impurezas o aditivos (p. ej., proteína estabilizadora). Los estudios de simula-
ción con cantidades agregadas conocidas de virus se realizan agregando la matriz de suspensión viral (incluyendo todos los
componentes con excepción del virus) a la solución de proceso con una relación entre la matriz y la solución de flujo de ali-
mentación (carga) de no más de 10% (v/v) y ejecutando posteriormente la etapa de procesamiento. Se monitorea el desem-
peño esperado de la etapa de adición simulada de virus y si los resultados son distintos a los esperados, entonces puede ser útil
la reducción de la relación virus agregado:carga. Dicha relación ajustada entre la cantidad agregada conocida de virus y la so-
lución de flujo de alimentación (carga) se utilizaría en la realización del estudio real de depuración para la etapa de procesa-
miento que se está estudiando.
7574 (1050.1) Procedimientos de Depuración Viral/ Información General USP42
Desempeño de Estudios con Cantidades Agregadas Conocidas de Virus
Los estudios de depuración viral por lo general se llevan a cabo en un sitio en el que se llevan a cabo los ensayos con canti-
dades agregadas conocidas de virus y de cuantificación viral (p. ej., un laboratorio de análisis de seguridad biológica) o en dos
sitios distintos: uno en el que se realizan los estudios con virus agregados y otro en el que se cuantifican las muestras. Los
patrocinadores y analistas deben acumular conocimiento y factores de control que puedan influir en cada manipulación que
no sea parte del proceso de fabricación, por ejemplo, congelación y descongelación (ver Efectosdel Almacenamientoy la Con-
gelaciónde las Muestrasde DepuraciónViral) así como condiciones de transporte.
Antes de iniciar un estudio de depuración, se debe preparar un diseño de estudio bien documentado que defina con clari-
dad lo siguiente: las etapas que se analizarán, el plan de muestreo para cada etapa, la identificación de muestras, la manipula-
ción y el almacenamiento de muestras, el transporte de muestra de ser necesario, los parámetros operativos críticos, la escala
de proceso, la justificación para las condiciones más exigentes (si se han establecido) y los controles apropiados para cada eta-
pa. Como mínimo, las muestras analizadas deben incluir aquellas usadas para determinar: 1) el título de virus agregado, 2) el
título de virus agregado después de la congelación-descongelación (si aplica), 3) el título viral en la solución de producción
antes del procesamiento y 4) el título viral después del procesamiento. Podría ser necesario recolectar y valorar muestras adi-
cionales, dependiendo de la etapa en análisis y de la fase del desarrollo del producto.
En un proceso de biofabricación típico, la depuración viral puede lograrse mediante inactivación de virus (p. ej., tratamiento
de pH, tratamiento por calor o tratamiento con disolvente y detergente) o mediante eliminación de virus (p. ej., filtración o
cromatografía en columna). Las Figuras1A y 1B presentan ejemplos de diseños de experimentos para inactivación de virus, la
Figura2 presenta la eliminación de virus mediante filtración y la Figura3 presenta eliminación de virus mediante cromatografía
en columna. Estos ejemplos proveen una referencia general y no representan cada una de las condiciones específicas posibles.
Al desarrollar los diseños de estudios, los patrocinadores deben tener en consideración sus propias condiciones de proceso pa-
ra planear sus propias etapas específicas.
El concepto general de los procedimientos de depuración viral pueden expresarse de la forma siguiente:
Depuración Viral= lnactivación Viral + Eliminación Viral, donde
Eliminación Viral= Eliminación por Filtración + Eliminación por Cromatografía en Columna
DEPURACIÓNVIRALPOR INACTIVACIÓN
DE VIRUS
Consideraciones generales: Se debe reconocer que la inactivación de virus no siempre es una reacción simple de primer
orden. Por lo regular, la inactivación de virus es compleja e implica una fase inicial rápida seguida de una fase más lenta. Por
ende, se debe planear el proceso de inactivación de tal forma que las muestras se tomen a distintos tiempos para construir una
curva de tiempo de inactivación. Las muestras recolectadas para estudios de inactivación deben incluir el tiempo de proceso
planeado y, como mínimo, tiempo cero; un tiempo de muestreo o un número adecuado mayor que cero pero menor que el
tiempo mínimo de exposición al agente de inactivación; un tiempo de muestreo igual al tiempo mínimo de exposición al
agente de inactivación; y, además, un tiempo de muestreo superior al tiempo mínimo de exposición puede ser útil para casos
en los que se presenta una curva de inactivación lenta. Los tiempos de muestreo adicionales pueden ser particularmente im-
portantes cuando no se cuenta con experiencia previa en la cinética de inactivación de virus.
Cuando se presenta la depuración viral por inactivación, por lo general son posibles dos escenarios: 1) el agente de inactiva-
ción no está presente en el material de carga y la inactivación se inicia mediante la adición del agente de inactivación después
de agregar una cantidad conocida de virus (Figura 1A); y 2) el material de carga ya contiene el agente de inactivación antes de
la adición de una cantidad conocida de virus, y la inactivación se inicia mediante la adición de una cantidad conocida de virus
(Figura 18). Un ejemplo de este último caso es el eluato de la columna de Proteína A a un pH bajo. Siempre que sea posible, se
debe determinar la carga inicial de virus a partir del material de carga con cantidad agregada conocida de virus antes de agre-
gar un agente de inactivación. Sin embargo, esto no es posible cuando el agente de inactivación ya está presente en el mate-
rial de carga al inicio del experimento. En estas situaciones, la carga viral inicial se puede calcular usando el valor de título
certificado de la preparación de virus a agregar y la relación virus agregado:carga. Cuando la inactivación viral ocurre demasia-
do rápido y no permite graficar una curva de tiempo de inactivación en condiciones normales de proceso, se deben incluir
controles apropiados para demostrar que la pérdida de dicha actividad es debido a la presencia del agente de inactivación.
USP42 InformaciónGeneral/ (1050.1) Procedimientosde DepuraciónViral 7575
Producto Intermedio del Proceso

Sin lnactivador
!-+------
Carga con Virus
Virus
Agregado
Agregar Agente de lnactivación
Muestra= O
Retención a la Temperatura y
Tiempo del Proceso Muestra= A
Muestra= B
Muestra= Final
Control de Valoraciónpara Determinar1_, -----1 Detención 1
n~_i-----,,►,
~~R~e-te~nc-io-· el Título Viral
Figura lA lnactivación de virus cuando el material de carga no contiene un agente de inactivación; el agente de inactiva-
ción se agrega después de agregar de la cantidad conocida de virus.
Diseño del estudio: El enfoque general para el diseño del estudio para evaluar la depuración viral por inactivación se descri-
be en las Figuras1A y 18. En la Figura 1A, la cantidad conocida de virus se agrega al material de carga (producto intermedio
del proceso) antes de iniciar la inactivación. El material viral y la carga se mezclan de forma adecuada, y se obtiene muestras
de la carga con virus agregado y muestras control de retención, las cuales no fueron sometidas al proceso de inactivación. La
carga con virus agregado debe ser analizada de inmediato para determinar el título viral. Elverdadero título de la carga con
virus agregado (obtenida de forma experimental) se debe comparar con el título teórico de la carga con virus agregado (obte-
nida a partir del título certificado del lote de virus usado y la proporción de virus agregado) para verificar el desempeño del
ensayo de detección de virus y que haya sido agregada la cantidad apropiada de virus al material de carga. Elcontrol de reten-
ción debe tratarse de la misma forma que la carga con virus agregado (es decir, antes de la neutralización del control de reten-
ción, se debe ajustar el pH de la muestra de la misma manera que la carga con virus agregado y, posteriormente, neutralizarla
y agregarle la cantidad conocida del virus). Además, el control de retención debe permanecer a la temperatura del proceso
hasta que se obtenga la muestra final en el experimento. Posteriormente, se evalúa el título viral del control de retención y se
compara con el título verdadero de la carga con virus agregado para determinar si hay la inactivación de virus en presencia del
material de carga con el paso del tiempo y a la temperatura del estudio de inactivación. Esto puede tenerse en cuenta al deter-
minar el factor de reducción viral final.
La inactivación debe iniciarse de tal manera que se replique el proceso de fabricación (p. ej., con mezclado constante) de
modo que el agente de inactivación (p. ej., detergente o ácido usado para reducir el pH) se mezcle de forma homogénea en la
solución a la brevedad posible. Esto minimiza la presencia de altas concentraciones localizadas del agente de inactivación. Si se
usa calor para inactivación, el calor debe aplicarse de tal manera que se replique el proceso de fabricación (p. ej., la velocidad
del incremento de la temperatura, hasta alcanzar la temperatura de inactivación deseada, de ser idéntica) y se deben mantener
controles sin calentar. Sin embargo, la reproducción exacta de la adición (mezclado) de los agentes de inactivación o la repro-
ducción de velocidad de calentamiento puede ser difícil de reproducir en experimentos llevados a cabo a escala reducida. En
dichos casos, se recomienda agregar el virus en cantidad conocida directamente en el material que contienen el agente de
inactivación (o calentado) y seguir la cinética de inactivación según se describe en la Figura 18. Como control del virus agrega-
do, éste se agrega en cantidad conocida en el material del proceso sin agente de inactivación o en el material sin calentar.
Las condiciones de proceso más exigentes (p. ej., pH, tiempo y temperatura) deben aplicarse si ya se han establecido. Se
obtienen los tiempos de muestreo (muestras) y se detiene la reacción inmediatamente (p. ej., mediante neutralización, dilu-
ción o enfriamiento inmediato de la muestra) de modo que no pueda ocurrir una inactivación adicional. Esto permite determi-
nar la cinética de inactivación de virus y después construir una curva de inactivación de virus en función del tiempo. Se puede
aplicar muestreo de gran volumen para maximizar los valores de depuración.
En la Figura 18, el material de carga contiene el agente de inactivación y, por ende, la adición de la cantidad conocida de
virusiniciala inactivación.Enesteescenario,puedeno serposibleneutralizarla soluciónintermediadel procesoantesdel estu-
dio de adición de la cantidad conocida de virus debido a que grandes fluctuaciones en el pH pueden ocasionar que el produc-
to proteico precipite en la solución. Además, las muestras de la carga con virus agregado y de control de retención no pueden
7576 (1050.1) Procedimientos de Depuración Viral / Información General USP 42
ser obtenidas inmediatamente a partir del material de carga con virus agregado, por lo que las muestras de control se obtie-
nen de un control de medio o de solución amortiguadora que no contiene el agente de inactivación.
Controlde Medio o de Amortiguador ProductoIntermediodel Proceso
(Sin Agente de lnactivación) (Con Agente de lnactivación)
!
Agregar Cantidad
Conocida de Virus
!
Muestra= O
Iniciar lnactivación Agregando
Cantidad Conocida de Virus
Muestra= o
Muestra= A
Muestra= B
Muestra= Final
~ Valoraciónpara Determinar
~-~ el Título Viral Detención
Figura 1B. lnactivación de virus cuando el material de carga contiene el agente de inactivación antes de la adición de una
cantidad conocida de virus; la adición de virus inicia la inactivación.
DEPURACIÓNVIRALPORFILTRACIÓN
Se deben realizar análisis preliminares de citotoxicidad e interferencia viral al prepararse para llevar a cabo la depuración viral
por filtración (ver Efectosde la Matriz de la Muestra sobre los Ensayosde Cuantificación Vira{). Las diluciones de la carga de la
etapa de filtración viral y de la muestra de la combinación de las fracciones colectadas, que se usarán en el estudio de depura-
ción, son aquellas diluciones que ha demostrado no ocasionar citotoxicidad o interferencia.
Diseño del estudio: El enfoque general para el diseño del estudio para evaluar la depuración viral por filtración se describe
en la Figura2. Una vez que se agrega una cantidad conocida de virus al producto intermedio del proceso, la muestra de carga
con virus agregado debe valorarse de inmediato para determinar el título viral. La adición de una cantidad conocida de virus
puede asociarse con efectos de agregación. El estado de agregación de un virus contaminante en el producto intermedio res-
pectivo es difícil de predecir y, por ende, se recomienda, como un enfoque de condiciones más exigentes, usar una prepara-
ción de virus monodispersa para la adición de una cantidad conocida de virus. La filtración de virus antes de la adición de
cantidades conocidas (p. ej., 0,45 µm o 0,22 µm) reduce los agregados virales más grandes de las suspensiones madres de
virus congeladas. Una preparación de virus pura de título alto puede ser útil para reducir los efectos inducidos por la cantidad
agregada de virus que influencian el desempeño de la filtración de virus. La muestra de control de retención debe mantenerse
en las condiciones de procesamiento (temperatura y tiempo) y posteriormente valorarse para evaluar el impacto de dichas
condiciones, así como de los componentes del producto intermedio del proceso, sobre el título viral. Se deben aplicar las con-
diciones más exigentes del proceso, si se han establecido. Los títulos virales obtenidos de la carga con virus agregado y del
control de retención deben estar dentro de la variabilidad experimental del ensayo de titulación viral. Si hubiese un impacto
negativo en el título viral debido a las condiciones de procesamiento (temperatura, tiempo y composición del producto inter-
medio del proceso), entonces se debe comenzar una investigación para comprender el proceso. Cuando se requiera, puede
ser necesario ajustar el factor de reducción viral final para tener en cuenta el impacto de las condiciones de retención en las
preparaciones virales. Sin embargo, este enfoque puede subestimar la capacidad de eliminación de la filtración de virus. Como
alternativa, se puede considerar el uso de otro método de detección (p. ej., tecnologías de ácidos nucleicos) u otro virus mo-
delo más estable.
USP42 InformaciónGeneral/ (1050.1) Procedimientos de Depuración Viral 7577
Producto Intermedio del Proceso

¡--------Virus
,-------------1 CargaAc~: :~:tidad

Muestra
Retencióna la Filtro de Eliminación de Virus
Temperatura
Tiempodel
Proceso
y
Muestra
t Muestra
1 Murra 1
l
Control de
PermeadoCombinado
Control de Congelación/
Retención Desean elación de Virus
Valoración para
Determinar
el Título Viral
Figura 2. Depuración de virus mediante métodos de filtración.
Se deben usar controles adecuados previos y posteriores a la filtración para evaluar la eliminación de la cantidad agregada
de virus por la etapa de prefiltración. Las muestras se evalúan usando ensayos de valoración de virus. Las muestras de prueba
pueden requerir neutralización hasta niveles apropiados de pH para los ensayos de valoración basados en cultivo celular. Si se
usa un prefiltro de 0,22 µm o 0,45 µm durante la producción en línea con el filtro de reducción de virus, la adición de canti-
dad conocida se puede llevar a cabo en el producto intermedio antes de la prefiltración. Sin embargo, se debe tomar una
muestra de la etapa posterior a la prefiltración para determinar el factor de reducción viral. Alternativamente, se puede agregar
una cantidad conocida de virus al producto intermedio después de esta prefiltración (usando una cantidad conocida de virus
filtrada de forma similar) para determinar la reducción de virus ocasionada por el filtrado de virus. Para generar un entendi-
miento adicional del proceso de depuración de virus, se pueden tomar muestras en diversos tiempos de muestreo durante la
corrida. En caso de que las muestras se almacenen congeladas antes de la cuantificación de virus, se sugiere un control de
congelación/descongelación de virus para determinar si existe algún impacto del ciclo de congelación/descongelación sobre el
título del virus (ver también Efectosdel Almacenamientoy la Congelaciónde las Muestrasde DepuraciónViral).
DEPURACIÓNVIRALPOR CROMATOGRAFÍA
EN COLUMNA
Consideracionesgenerales: Para estudios con propósitos de registro, se debe investigar la distribución de la carga viral entre
las distintas fracciones de la cromatografía. Por lo general, los analistas agregan el virus al producto intermedio inicial (flujo de
alimentación o carga) para cada etapa analizada, y determinan el título viral de este material de carga con virus agregado y del
material combinado de carga con virus antes y después de cada etapa. Otras fracciones, además de la combinación principal
de fracciones de producto, pueden requerir análisis en las etapas avanzadas del desarrollo del producto (ensayos de fase 3 y
posteriores). Como es común para la depuración viral, estos estudios deben realizarse por duplicado. Con la cromatografía en
columna, la capacidad de las columnas y de otros dispositivos para depurar virus puede aumentar o disminuir después del uso
repetido. La evidencia de depuración viral uniforme después de múltiples usos puede apoyar el uso repetido de dichas colum-
nas. Por lo regular, esta evidencia se obtiene cuando se comparan la depuración en una resina nueva con la resina que ha sido
usada hasta o ligeramente más allá de la duración esperada de la columna, es decir, el número de veces que se usará la colum-
na durante la fabricación comercial. Para estudios con propósitos de registro, también se deben proveer datos para demostrar
que cualquier virus potencialmente retenido por la resina (carry-over) será inactivado o eliminado de forma adecuada por los
procedimientos de limpieza antes de reusar la columna.
Para evaluar la depuración viral en cada etapa del proceso de fabricación, se debe conocer el probable mecanismo de reduc-
ción de infectividad viral y se debe describir como inactivación de virus o eliminación de virus, o ambas. En algunas situacio-
nes, puede ser necesario distinguir entre eliminación e inactivación. Por ejemplo, una etapa de cromatografía en columna que
separa físicamente los virus del producto también puede usar una solución amortiguadora capaz de inactivar virus. En dichas
situaciones, puede ser posible combinar el uso de ensayos de infectividad con ensayos de técnicas de ácidos nucleicos para
medir las contribuciones individuales de los mecanismos de inactivación y eliminación. La disección de cada etapa para deter-
minar la contribución relativa de cada mecanismo de depuración permite un conocimiento cabal de la forma en que se logra
la depuración viral. Este conocimiento puede ayudar a identificar variables críticas en cada etapa de depuración que deben ser
controladas para sustentar la reproducibilidad de la depuración. El análisis de cada variable crítica (cuando se entiende cabal-
mente) en las condiciones más exigentes ayuda a evaluar la robustez de la etapa del proceso.
Para medir la depuración de virus mediante un sistema de cromatografía en columna, se deben realizar análisis preliminares
de citotoxicidad e interferencia viral (ver Efectosde la Matriz de la Muestrasobrelos Ensayosde CuantificaciónViralpara más
detalles). La dilución de la carga de columna que se usará en el estudio de depuración es aquella dilución que demuestre no
4
7578 (1050.1) Procedimientos de Depuración Viral / Información General USP42
ocasionar citotoxicidad ni interferencia. [NOTA-Los estudios de interferencia y citotoxicidad también pueden realizarse en
fracciones recolectadas, cuando se requiera.]
Carga de Columna
--------Virus
i
Muestra
Muestra
Retención a la Cromatografía
Temperatura y Tiempo
del Proceso ¡ Control de
Control de
i
Control de
Fracciones Recolectadas Congelación/
Descongelación
delVirus
Congelación/
Descongelación Retención
Valoracion para
Determinar el
TítuloViral
Figura 3. Depuración de virus mediante un sistema de cromatografía en columna.
Diseño del estudio: La Figura3 muestra el enfoque general para el diseño del estudio para evaluar la depuración viral por
cromatografía. La carga de la columna es el material que se aplica a la columna cromatográfica. ELmaterial de carga en estu-
dios de depuración viral a escala reducida debe ser comparable al material de fabricación comercial o clínica en lo que respecta
a composición y atributos fisicoquímicos. La suspensión madre de virus es un material viral descongelado en el momento de
uso con un título de infectividad predeterminado que se usa para agregar cantidades conocidas de virus en el material de car-
ga de la columna, y también se usa en el estudio de interferencia. Se pueden tomar muestras de la suspensión madre de virus
para determinar el título viral real inmediatamente después de la descongelación. La carga con cantidad agregada conocida de
virus y las muestras adicionales deben ser analizadas de inmediato o ser congeladas inmediatamente. El título de la muestra
congelada y de las demás muestras será determinado al final de la corrida de la etapa cromatográfica. En algunos casos, puede
ser necesaria la filtración de la carga con cantidad agregada conocida de virus con un prefiltro de 0,22 µm o 0,45 µm para
eliminar cualquier agregado viral formado al agregar una cantidad conocida de virus modelo al producto intermedio del pro-
ceso.
El experimento de la etapa cromatográfica de depuración viral debe replicar estrechamente los parámetros de la etapa del
proceso de fabricación real, además de que se debe realizar en las condiciones más exigentes (p. ej., flujo, concentración de
proteína y condiciones de elución) en caso de que estas hayan sido establecidas. Se pueden recolectar múltiples fracciones de
producto o la combinación de las mismas, y se puede determinar el título viral en cada fracción recolectada (tal como flujo de
paso, lavados, anterior al pico, posterior al pico, elución total, entre otros). Los títulos virales en todas las fracciones que com-
ponen la combinación de producto se usan para calcular el factor de depuración de la etapa. Los estudios de interferencia y
citotoxicidad también pueden realizarse en fracciones recolectadas, cuando se requiera. Durante toda la etapa, el control de
retención (la carga más el virus) debe mantenerse a la temperatura a la que se lleva a cabo la cromatografía. Al final de la
corrida cromatográfica, se debe valorar el control de retención junto con las demás muestras/fracciones recolectadas (estas
pueden valorarse de inmediato o, si no es viable, congelarse y analizarse en un momento posterior). Las muestras se evalúan
usando ensayos de valoración de virus. Las muestras de prueba pueden requerir neutralización hasta niveles apropiados de pH
para los ensayos de valoración basados en cultivo celular.
GLOSARIO
(Ver también Evaluaciónde la SeguridadViral en ProductosBiotecnológicosObtenidosde LíneasCelularesde Origen Humano o

Animal (1050), Glosario.)1
Robustezdel Procesode Depuración Viral: Capacidad del proceso posterior al procesamiento inicial o de una operación
unitaria de exhibir el desempeño y la efectividad típicas de la depuración de virus después de cambios menores o moderados
en los parámetros o condiciones operativas estándar.
Solucionesde proceso: Productos intermedios de producción que se obtienen para estudios de depuración viral. Se deben
obtener de una producción a escala completa o de un proceso de escala reducida que ha demostrado ser representativo de la
producción a escala completa.
Procesode producción: Los procesos de fabricación para productos biotecnológicos a menudo son variados y complejos, y
por lo regular se dividen en procesamiento previo y procesamiento posterior al procesamiento inicial del producto. Las activi-
1 Comparar con el glosario del capítulo (1050).

-1
lt
USP42 InformaciónGeneral/ {l 051) Limpieza de Material de Vidrio 7579
dades previas producen la proteína de interés, por lo regular mediante cultivo celular o fermentación, y los aspectos a conside-
rar incluyen la integridad y la calidad de los procesos, bancos de células, sistemas de expresión, cultivo, medios, pureza del
producto/proceso, impurezas y contaminantes. El procesamiento posterior al procesamiento inicial implica la separación y pu-
rificación del producto biológico a granel para volverlo adecuado para el uso final, p. ej., purificación, esterilización y formula-
ción. Las actividades posteriores al procesamiento inicial incluyen filtración, centrifugación, precipitación, numerosas separacio-
nes cromatográficas, esterilización por filtración terminal o liofilización.
Procesode Purificación: Se refiere a separar y aislar el producto de interés, en su forma deseada, del sobrenadante de fer-
mentaci6n o del homogenado celular.
Efectividadde la DepuraciónViral: Se refiere a la eficacia del todo el proceso de purificación o de una etapa individual den-
tro de un proceso de purificación para eliminar los virus, según se determina mediante el factor de reducción viral. En general,
para que una etapa individual de depuración viral se considere efectiva, se debe demostrar una depuración de 4 logs o más
con una confianza del 95% (a= 0,05).
Carga Viral: Se refiere a la cantidad de virus agregada al material de carga de una etapa de purificación y que se somete a un
tratamiento de inactivación/eliminación. La determinación experimental de la carga viral antes y después del tratamiento per-
mite calcular un factor de reducción que es específico del virus y del tratamiento usado.
Factor de ReducciónViral (VRF,por sussiglasen inglés): Elfactor de reducción viral de una etapa individual de depura-
ción representa el log 10 de la relación entre la carga viral en el material previo al tratamiento (usado para desafiar la etapa de
depuración) y la carga viral en el material posterior al tratamiento. Elfactor de reducción viral general se calcula sumando to-
das las etapas individuales con un factor de reducción log 10 >1. El factor de reducción viral log 10 se determina mediante la
siguiente ecuación:
Log10 carga inicial de virus- log10 carga final de virus= Log10 Factorde ReducciónViral
El valor de reducción viral log 10 expresa niveles de contaminación viral reducida en factores de 1 O que podrían convertirse fácil-
mente en reducción porcentual. Por ejemplo, una reducción de 1 log es equivalente a una reducción de 90%, una reducción
de 2 log es una reducción de 99%, una reducción de 3 log es una reducción de 99,9% y una reducción de 4 log es una reduc-
ción de 99,99%.
Validaciónde la Eliminación/lnactivaciónde Virus: Los estudios de validación de la eliminación/inactivación de virus eva-
lúan la capacidad del proceso para eliminar y/o inactivar los virus. Por lo regular, esto implica agregar al producto una canti-
dad conocida de un virus conocido y luego someter el producto a procesos de inactivación/eliminación.
(1051) LIMPIEZADE MATERIALDE VIDRIO
El éxito de muchas valoraciones y pruebas Farmacopeicas depende de la limpieza del material de vidrio utilizado. Siempre
que resulte necesario, se deben usar reactivos inorgánicos o detergentes disponibles comercialmente.
En cualquier caso, es importante verificar que el procedimiento de limpieza sea apropiado para la prueba o valoración parti-
cular que se esté llevando a cabo. Esto se puede lograr de diversas maneras, incluyendo el uso de controles experimentales o
verificación de la limpieza usando análisis de residuos/residuales para asegurar la eliminación de cualquier contaminante po-
tencial. El protocolo de limpieza debe incluir una cláusula en la que se describa la forma en que se evaluará el éxito del proce-
dimiento de limpieza.
Para las mediciones ópticas, se debe prestar especial cuidado a la limpieza de los recipientes, pero no debe usarse ácido cró-
mico ni soluciones altamente alcalinas.
Las siguientes son algunas de las pruebas en las que el uso de material de vidrio limpio es particularmente crítico para el
éxito de las mismas: pruebas para pirógenos y carbono orgánico total, así como valoraciones de heparina sódica y actividad de
vitamina B12 •
El Apéndiceincluye referencias seleccionadas que pueden ser útiles para obtener información adicional sobre la limpieza de
material de vidrio. Dichas referencias no están avaladas por la USP y no representan una lista exhaustiva. Se puede encontrar
información adicional sobre los procedimientos de limpieza de material de vidrio mencionados en este capítulo en la mayoría
de los textos sobre química analítica cuantitativa.
APÉNDICE
Información Adicional
Es posible encontrar información adicional y pautas en las referencias citadas a continuación y en una gran cantidad de tex-
tos sobre química analítica cuantitativa.
1. Parenteral Drug Association. Draft-Points to Considerfor CleaningValidation (Technical Report Number 29). Bethesda,
MD: Parenteral Drug Association; 1998.
7580 (1051) Limpieza de Material de Vidrio/ Información General USP42
2. Anderson NR. Container cleaning and sterilization. En: Olson WP, Groves MJ, eds. AsepticPharmaceuticalManufacturing.
1st ed. Buffalo Grove, IL: lnterpharm Press; 1987:15-22.
3. Green C. Cleaning validation-application in the laboratory; Montalvo M. The cleaning validation policy and the cleaning
validation plan; Verghese G, Kaiser N. Cleaning agents and cleaning chemistry; Verghese G, Lopolito P. Cleaning enginee-
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4. Gordon AJ, Ford RA.Standard glassware cleaning solutions. En: Gordon AJ, Ford RA,eds. The Chemist'sCompanion.Hobo-
ken, NJ: Wiley and Sons; 1973.
(l 052) ARTÍCULOS OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGÍA-ANÁLISIS DE

AMINOÁCIDOS
Este capítulo proporciona guías y procedimientos utilizados para la caracterización de artículos obtenidos por biotecnología
mediante análisis de aminoácidos. Se lo ha armonizado con los capítulos correspondientes en la Farmacopeajaponesay la Far-
macopeaEuropea.Algunas partes de este capítulo que no están armonizadas con las otras dos farmacopeas están marcadas
con el símbolo ♦. La nota al pie de página se encuentra en la USP,pero no así en la FarmacopeaEuropeao FarmacopeaJapone-
sa. También se muestran otras pruebas de caracterización armonizadas en Electroforesis Capilar(1053), ArtículosObtenidospor
Biotecnología-lsoelectroenfoque(1 054), ArtículosObtenidospor Biotecnología-Mapeo de Péptidos(1055), ArtículosObtenidospor
Biotecnología-Electroforesisen Gel de Poliacrilamida(1056) y ArtículosObtenidospor Biotecnología-Valoraciónde ProteínasTota-
les(1057).
INTRODUCCIÓN
El análisis de aminoácidos se refiere a la metodología usada para determinar la composición o el contenido de aminoácidos
de proteínas, péptidos y otras preparaciones farmacéuticas. Las proteínas y los péptidos son macromoléculas formadas por
aminoácidos unidos covalentemente organizados como polímeros lineales. La secuencia de los aminoácidos en una proteína o
un péptido determina las propiedades de la molécula. Las proteínas se consideran moléculas grandes que existen comúnmen-
te como estructuras plegadas con una conformación específica, mientras que los péptidos son más pequeños y pueden estar
formados por pocos aminoácidos. El análisis de aminoácidos se puede usar para cuantificar proteínas y péptidos, para determi-
nar la identidad de proteínas o péptidos basándose en su composición de aminoácidos, para respaldar el análisis estructural de
proteínas y péptidos, para evaluar estrategias de fragmentación para el mapeo de péptidos y para detectar aminoácidos atípi-
cos presentes en una proteína o un péptido. Antes del análisis de aminoácidos, es necesario hidrolizar una proteína o péptido
descomponiéndolo en sus aminoácidos constituyentes. Después de la hidrólisis de la proteína o el péptido, el procedimiento
de análisis de aminoácidos puede ser igual al utilizado para aminoácidos libres en otras preparaciones farmacéuticas. Los ami-
noácidos constituyentes de la muestra de prueba normalmente se derivatizan para su análisis.
APARATOS
Los métodos usados para el análisis de aminoácidos por lo general se basan en una separación cromatográfica de los ami-
noácidos presentes en la muestra de prueba. Las técnicas actuales aprovechan la instrumentación cromatográfica automatiza-
da diseñada para las metodologías analíticas. Un instrumento de análisis de aminoácidos típico es un cromatógrafo de líquidos
de baja presión o de alta presión, capaz de generar gradientes de fase móvil que separan los aminoácidos en una columna
cromatográfica. El instrumento debe tener la capacidad de derivatizar los aminoácidos después de pasar por la columna, a me-
nos que la muestra se analice con derivatización anterior a la columna. El detector generalmente es de luz UV-visibleo de fluo-
rescencia, según el método de derivatización usado. Se usa un dispositivo de registro (p. ej., un integrador) para transformar la
señal analógica del detector y para la cuantificación. Es preferible que los instrumentos utilizados para el análisis de aminoáci-
dos se destinen específicamente a esos fines.
PRECAUCIONES
GENERALES
La contaminación de fondo es siempre una preocupación en el análisis de aminoácidos. Se requieren reactivos de alta pureza
(p. ej., el ácido clorhídrico de baja pureza puede contribuir a la contaminación con glicina). Los reactivos analíticos se cambian
rutinariamente cada pocas semanas y se usan solamente disolventes para cromatografía de líquidos de alta presión (grado
HPLC).La posible contaminación microbiana y los materiales extraños presentes en los disolventes se reducen por filtración
antes de usarlos, cubriendo los recipientes y colocando el instrumental para análisis de aminoácidos alejado de la luz solar di-
recta.
USP42 InformaciónGeneral/ (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología 7581
Las prácticas de laboratorio pueden determinar la calidad del análisis de aminoácidos. Colocar los instrumentos en una zona
de poco tránsito del laboratorio. Mantener limpio el laboratorio. Hay que limpiar y calibrar las pipetas según un plan de man-
tenimiento. Mantener las puntas de las pipetas en una caja cubierta; los analistas no deben manipular las puntas de las pipetas
con las manos. Los analistas pueden usar guantes de látex sin polvo o similares. Limitar la cantidad de veces que se abre y se
cierra un vial de muestra ya que el polvo puede hacer que aparezcan niveles elevados de glicina, serina y alanina.
Se necesitan instrumentos bien mantenidos para que los resultados de los análisis de aminoácidos sean aceptables. Si el ins-
trumento se usa de modo rutinario, se debe revisar diariamente para detectar pérdidas, verificar la estabilidad del detector y la
lámpara y la capacidad de la columna para mantener la resolución de los aminoácidos individuales. Limpiar o reemplazar, de
acuerdo a un plan de rutina, todos los filtros de los instrumentos y demás artículos de mantenimiento.
MATERIALESTÁNDARDE REFERENCIA
Los estándares de aminoácidos aptos para este tipo de análisis están disponibles comercialmente* y consisten generalmente
en una mezcla acuosa de aminoácidos. Cuando se determina la composición de aminoácidos, los estándares de proteínas o
péptidos se analizan junto con el material de prueba como un control para demostrar la integridad de todo el procedimiento.
Para este propósito, se ha usado seroalbúmina bovina altamente purificada como estándar de proteína.
CALIBRACIÓN
DE LOSINSTRUMENTOS
La calibración del instrumental para análisis de aminoácidos por lo general involucra el análisis de estándares de aminoáci-
dos, que son una mezcla de aminoácidos de varias concentraciones, para determinar el factor de respuesta y el intervalo de
análisis de cada aminoácido. Se conoce la concentración de cada aminoácido en el estándar. En el procedimiento de calibra-
ción, el analista diluye el estándar de aminoácidos para obtener distintos niveles de concentración de analito dentro del inter-
valo lineal esperado de la técnica de análisis de aminoácidos. Luego, se analizan repetidamente las diversas concentraciones de
analito. Las áreas de los picos obtenidos para cada aminoácido se grafican en función de la concentración conocida para cada
uno de los aminoácidos en la dilución estándar. Estos resultados permiten al analista determinar el intervalo de concentracio-
nes de aminoácidos donde el área del pico de cada aminoácido es una función aproximadamente lineal de su concentración.
Es importante que el analista prepare las muestras para el análisis de aminoácidos de manera que estén dentro de los límites
analíticos (p. ej., intervalo de trabajo lineal) de la técnica empleada a fin de obtener resultados exactos y repetibles.
Se analizan de cuatro a seis concentraciones del estándar de aminoácidos para determinar un factor de respuesta para cada
aminoácido. Elfactor de respuesta se calcula como el área del pico o la altura del pico promedio por nmol de aminoácido
presente en el estándar. Para calcular la concentración de cada aminoácido presente en la muestra de prueba se prepara y se
usa un registro de calibración con el factor de respuesta de cada aminoácido. En este cálculo se divide el área del pico de un
aminoácido dado por su correspondiente factor de respuesta, y se obtienen así los nmol del aminoácido. Para los análisis de
rutina, basta una calibración de un solo punto; sin embargo, el archivo de calibración se actualiza frecuentemente y se prueba
por análisis de controles analíticos para asegurar su integridad.
REPETIBILIDAD
Los resultados uniformes y de alta calidad de los análisis de aminoácidos de un laboratorio analítico exigen prestar atención
a la repetibilidad de la valoración. Durante el análisis de la separación cromatográfica de los aminoácidos o sus derivados, se
pueden observar numerosos picos en el cromatograma que corresponden a los aminoácidos. El gran número de picos exige
un sistema de análisis de aminoácidos que los pueda identificar repetidamente basándose en el tiempo de retención e integrar
las áreas de los picos para la cuantificación. Una evaluación de repetibilidad típica involucra la preparación de una solución de
aminoácidos estándar y el análisis de varias determinaciones repetidas (es decir, seis análisis o más) de la misma solución están-
dar. Se determina la desviación estándar relativa (RSD, por sus siglas en inglés) para el tiempo de retención y el área del pico
integrada de cada aminoácido. La evaluación de la repetibilidad se amplía incluyendo múltiples valoraciones realizadas durante
varios días por distintos analistas. Las múltiples valoraciones incluyen la preparación de diluciones estándar a partir de materia-
les iniciales para determinar la variación debida a la manipulación de la muestra. A menudo, la composición de aminoácidos
de una proteína estándar (p. ej., seroalbúmina bovina) se analiza como parte de la evaluación de repetibilidad. La evaluación
de la variación de determinaciones repetidas (es decir, la RSD) permite al laboratorio establecer límites analíticos para asegurar
que sus análisis se encuentran bajo control. Es conveniente establecer los límites de variación mínimos practicables para asegu-
rar los mejores resultados. Para disminuir la variabilidad del análisis de aminoácidos, conviene enfocarse en la preparación de la
muestra, la elevada interferencia espectral de fondo debido a la calidad de los reactivos y/o a las prácticas del laboratorio, el
funcionamiento y mantenimiento de los instrumentos, el análisis y la interpretación de los datos y el desempeño y los hábitos
del analista. Todos los parámetros se investigan a fondo como parte del trabajo de validación.
• •se pueden obtener estándares adecuados de NIST (Gaithersburg, MD), Beckman lnstruments (Fullerton, CA), Sigma Chemical (St. Louis, MO), Pierce (Rockford,
ll) o Agilent (Palo Alto, CA).•
7582 (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General USP42
PREPARACIÓN
DE LA MUESTRA
La obtención de resultados exactos del análisis de aminoácidos exige muestras purificadas de proteínas y péptidos. Los com-
ponentes de las soluciones amortiguadoras (p. ej., sales, urea, detergentes) pueden interferir con el análisis de aminoácidos y
se eliminan de la muestra antes del análisis. Los métodos que utilizan derivatización de aminoácidos postcolumna generalmen-
te no se ven tan afectados por los componentes de la solución amortiguadora como se observa en los métodos de derivatiza-
ción precolumna. Es conveniente limitar el número de las manipulaciones de las muestras con el fin de reducir la posible con-
taminación de fondo, para mejorar la recuperación de analitos y para reducir el trabajo. Las técnicas comunes empleadas para
eliminar los componentes de las soluciones amortiguadoras de las muestras de proteínas incluyen: (1) inyectar la muestra de
proteína en un sistema HPLCen fase reversa, extrayendo la proteína con un disolvente volátil que contenga suficiente compo-
nente orgánico y secando la muestra en una centrífuga de vacío; (2) diálisis contra una solución amortiguadora volátil o agua;
(3) ultrafiltración centrífuga para el reemplazo de la solución amortiguadora por una solución amortiguadora volátil o agua;
(4) precipitar la proteína de la solución amortiguadora usando un disolvente orgánico (p. ej.: acetona); y (5) filtración en gel.
ESTÁNDARESINTERNOS
Se recomienda usar un estándar interno para controlar las pérdidas y variaciones físicas y químicas durante el análisis de ami-
noácidos. Antes de la hidrólisis, se puede agregar a la solución de proteína una cantidad de estándar interno conocida con
exactitud. La recuperación del estándar interno indica la recuperación general de los aminoácidos de la solución de proteína.
Sin embargo, los aminoácidos libres no se comportan igual que los aminoácidos unidos a proteínas durante la hidrólisis ya que
sus velocidades de liberación o destrucción son variables. Por lo tanto, el uso de un estándar interno para corregir las pérdidas
durante la hidrólisis puede proporcionar resultados no confiables. Hay que tener en cuenta este punto cuando se interpretan
los resultados. También se pueden agregar estándares internos a la mezcla de aminoácidos después de la hidrólisis para corre-
gir por las diferencias en la aplicación de las muestras y los cambios en la estabilidad del reactivo y las velocidades de flujo.
Idealmente, un estándar interno es un aminoácido primario que no se encuentra naturalmente y que está disponible comer-
cialmente a bajo precio. También debe ser estable durante la hidrólisis, su factor de respuesta debe ser función lineal de su
concentración y debe eluir con un tiempo de retención único, sin superponerse con otros aminoácidos. Los estándares de ami-
noácidos comúnmente empleados incluyen la norleucina, la nitrotirosina y el ácido a-aminobutírico.
HIDRÓLISIS
DE PROTEÍNAS
La hidrólisis de muestras de proteínas y péptidos es necesaria para el análisis de aminoácidos de estas moléculas. El material
de vidrio usado para la hidrólisis debe estar muy limpio para evitar resultados erróneos. Los polvos para guantes y las huellas
dactilares en los tubos de hidrólisis pueden causar contaminación. Para limpiar los tubos de vidrio para hidrólisis, hay que her-
vir los tubos durante 1 hora en ácido clorhídrico 1 N o sumergirlos en ácido nítrico concentrado o en una mezcla de ácido
clorhídrico concentrado y ácido nítrico concentrado (1: 1). Los tubos de hidrólisis limpios se enjuagan con agua de alta pureza,
seguido por un enjuague con metano! de grado HPLC,se secan de un día para el otro en una estufa y se almacenan cubiertos
hasta su uso. Alternativamente, el material de vidrio limpio se puede someter a pirólisis a 500° durante 4 horas para eliminar la
contaminación de los tubos para hidrólisis. También se puede usar material de laboratorio desechable adecuado.
La hidrólisis ácida es el método más común para hidrolizar una muestra de proteína antes del análisis de aminoácidos. La
técnica de hidrólisis ácida puede aumentar la variabilidad del análisis debido a la destrucción completa o parcial de varios ami-
noácidos. El triptófano se destruye; la serina y la treonina se destruyen parcialmente; la metionina puede oxidarse; y la cisteína
típicamente se recupera como cistina (pero la recuperación de la cistina suele ser mala debido a la destrucción o reducción
parcial a cisteína). La aplicación de vacío adecuado (menos de 200 µm de mercurio o 26,7 Pa) o la introducción de un gas
inerte (argón) en la cámara gaseosa superior del recipiente de reacción puede reducir la destrucción oxidativa. En las uniones
peptídicas que involucran isoleucina y valina, las uniones amida de lle-lle, Val-Val,lle-Valy Val-llese escinden parcialmente; y la
asparagina y la glutamina se desamidan, dando como resultado ácido aspártico y ácido glutámico, respectivamente. La pérdi-
da de triptófano, asparagina y glutamina durante una hidrólisis ácida limita la cuantificación a 17 aminoácidos. Algunas de las
técnicas de hidrólisis descritas se usan para tratar estos problemas. Algunas de las técnicas de hidrólisis descritas (es decir, los
Métodos 4-11) pueden modificar otros aminoácidos. Por lo tanto, hay que considerar las ventajas de usar una técnica de hi-
drólisis en comparación con sus problemas; estas ventajas se analizan adecuadamente antes de emplear un método que no sea
la hidrólisis ácida.
A menudo se emplea un estudio en función del tiempo (es decir, un análisis de aminoácidos con tiempos de hidrólisis ácida
de 24, 48 y 72 horas) para analizar la concentración inicial de aminoácidos que se destruyen parcialmente o que se escinden
lentamente. Al graficar la concentración observada de aminoácidos lábiles (es decir, serina y treonina) en función del tiempo
de hidrólisis, se puede extrapolar la línea hasta su origen para determinar la concentración inicial de estos aminoácidos. Los
estudios de hidrólisis en función del tiempo también se usan con aminoácidos que se escinden lentamente (p. ej., isoleucina y
valina). Durante el transcurso del tiempo de hidrólisis, el analista observa una meseta en estos residuos. El nivel de esta meseta
se considera la concentración de residuo. Si el tiempo de hidrólisis es demasiado largo, la concentración del residuo en la
muestra comienza a disminuir, indicando una destrucción por las condiciones de hidrólisis.
lt
Una alternativa aceptable al estudio en función del tiempo es someter un estándar de calibración de un aminoácido a las
mismas condiciones de hidrólisis que la muestra de prueba. El aminoácido libre puede no ser totalmente representativo de la
velocidad de destrucción de los aminoácidos lábiles dentro de un péptido o una proteína durante la hidrólisis. Esto es especial-
mente válido para las uniones peptídicas que se escinden lentamente (p. ej., uniones lle-Val).Sin embargo, esta técnica permi-
te al analista dar cuenta de cierta destrucción de residuos. Se ha empleado la hidrólisis ácida por microondas y ésta es rápida,
pero exige equipo y precauciones especiales. Las condiciones óptimas para la hidrólisis por microondas se deben investigar
para cada muestra de proteína o péptido. La técnica de hidrólisis por microondas típicamente toma solo unos minutos, pero
una desviación de 1 minuto puede proporcionar resultados inadecuados (p. ej., hidrólisis incompleta o destrucción de aminoá-
cidos lábiles). Se ha empleado la proteólisis completa usando una mezcla de proteasas pero puede ser complicada, exige con-
troles adecuados y, por lo general, se puede aplicar más a péptidos que a proteínas. [NOTA-Durante los análisis iniciales de
una proteína desconocida, se realizan experimentos con diferentes tiempos de hidrólisis y condiciones de temperatura para
determinar las condiciones óptimas.]
Método 1
La hidrólisis ácida usando ácido clorhídrico que contenga fenol es el procedimiento más comúnmente usado para la hidróli-
sis de proteínas o péptidos antes del análisis de aminoácidos. La adición de fenol a la reacción evita la halogenación de la tirosi-
na.
Solución de Hidrólisis: ácido clorhídrico 6 N que contenga entre O,1o/oy 1,0% de fenol.
Procedimiento-
Hidrólisisen FaseLíquida-Colocar la muestra de proteína o péptido en un tubo para hidrólisis y secar. [NOTA-La muestra se
seca para que el agua de la muestra no diluya el ácido empleado para la hidrólisis.] Agregar 200 µL de la Soluciónde Hidrólisis
por cada 500 µg de proteína liofilizada. Congelar el tubo de la muestra en un baño de hielo seco y acetona y sellar a la llama
en vacío. Las muestras típicamente se hidrolizan a 11 Oº durante 24 horas al vacío o en una atmósfera inerte para evitar la oxi-
dación. Se investigan tiempos mayores de hidrólisis (p. ej., 48 y 72 horas) si existe la preocupación de que la proteína no esté
totalmente hidrolizada.
Hidrólisisen Fasede Vapor-Éste es uno de los procedimientos de hidrólisis ácida más comunes y se prefiere para el rnicroa-
nálisis cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de muestra. La contaminación de la muestra por el reactivo ácido tam-
bién se minimiza usando la hidrólisis en fase de vapor. Colocar los viales que contengan las muestras secas en un recipiente
con una cantidad adecuada de la Soluciónde Hidrólisis.La Soluciónde Hidrólisisno entra en contacto con la muestra de prueba.
Aplicar una atmósfera inerte o vacío (menos de 200 µrn de mercurio o 26,7 Pa) a la cámara gaseosa del recipiente y calentar
aproximadamente a 11Oº durante un tiempo de hidrólisis de 24 horas. Elvapor ácido hidroliza la muestra seca. Minimizar toda
condensación del ácido en los viales de la muestra. Después de la hidrólisis, secar la muestra al vacío para eliminar el ácido
residual.
Método 2
La oxidación del triptófano durante la hidrólisis disminuye si se usa ácido rnercaptoetanosulfónico (MESA)corno ácido re-
ductor.
Solución de Hidrólisis: solución de MESA2,5 M.
Hidrólisis en Fase de Vapor-Secar aproximadamente de 1 a 100 µg de la proteína o péptido en análisis en un tubo de
hidrólisis. Colocar el tubo de hidrólisis en un tubo más grande con aproximadamente 200 µL de la Soluciónde Hidrólisis.Sellar
al vacío el tubo más grande (aproximadamente a 50 µrn de mercurio o 6,7 Pa) para vaporizar la Soluciónde Hidrólisis.Calentar
el tubo de hidrólisis entre 170º y 185º durante aproximadamente 12,5 minutos. Después de la hidrólisis, secar el tubo de hi-
drólisis al vacío durante 15 minutos para eliminar el ácido residual.
Método 3
La oxidación del triptófano durante la hidrólisis se evita usando ácido tioglicólico (TGA) corno ácido reductor.
Solución de Hidrólisis: una solución que contenga ácido clorhídrico 7 M, 10% de ácido trifluoroacético, 20% de ácido
tioglicólico y 1o/ode fenol.
Hidrólisis en Fase de Vapor-Secar aproximadamente de 1O µg a 50 µg de la proteína o péptido en análisis en un tubo de
muestra. Colocar el tubo de muestra en un tubo más grande con aproximadamente 200 µL de la Soluciónde Hidrólisis.Sellar el
tubo más grande al vacío (aproximadamente a 50 µrn de mercurio o 6,7 Pa) para vaporizar el TGA. Calentar el tubo de mues-
tra a 166º durante aproximadamente 15 a 30 minutos. Después de la hidrólisis, secar el tubo de muestra al vacío durante 5
minutos para eliminar el ácido residual. La recuperación de triptófano por medio de este método puede depender de la canti-
dad de muestra presente.
-¡-
4
7584 (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología/ Información General USP42
Método 4
La oxidación de la cisteína-cistina y de la metionina se realiza con ácido perfórmico antes de la hidrólisis de la proteína.
Soluciónde Oxidación-Preparar ácido perfórmico en el momento de análisis mezclando ácido fórmico y peróxido de hi-
drógeno al 30% (9:1) e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
Procedimiento-Disolver la muestra de proteína o péptido en 20 µL de ácido fórmico y calentar a 50º durante 5 minutos;
agregar luego 100 µL de la Soluciónde Oxidación.En esta reacción, la cisteína se convierte en ácido cisteico y la metionina se
convierte en metionina sulfona. Dejar que la oxidación continúe durante de 1O a 30 minutos. Eliminar el reactivo en exceso de
la muestra en una centrífuga de vacío. Esta técnica puede modificar los residuos de tirosina en presencia de haluros. Luego se
puede realizar una hidrólisis ácida de la proteína oxidada usando el Método 1 o el Método 2.
Método 5
La oxidación de cisteína-cistina se logra durante la hidrólisis en fase líquida con azida de sodio.
Soluciónde Hidrólisis: agregar azida de sodio a ácido clorhídrico 6 N que contenga 0,2% de fenol, para obtener una
concentración final de 0,2% (p/v). Elfenol agregado evita la halogenación de la tirosina.
Hidrólisisen FaseLíquida-Realizar la hidrólisis de la proteína o péptido aproximadamente a 110° durante 24 horas. Du-
rante la hidrólisis, la cisteína-cistina presente en la muestra se convierte en ácido cisteico mediante la azida de sodio presente
en la Soluciónde Hidrólisis.Esta técnica permite una mejor recuperación de tirosina que el Método 4, pero no es cuantitativa
para la metionina. La metionina se convierte en una mezcla de la metionina original y sus dos productos de oxidación, metio-
nina sulfóxido y metionina sulfona.
Método 6
La oxidación de cisteína-cistina se logra con dimetil sulfóxido (DMSO).
Soluciónde Hidrólisis: agregar DMSO a ácido clorhídrico 6 N que contenga de O,1% a 1,0% de fenol, para obtener una
concentración final de 2% (v/v).
Hidrólisisen Fasede Vapor-Realizar la hidrólisis de la proteína o péptido aproximadamente a 110° durante 24 horas.
Durante la hidrólisis, la cisteína-cistina presente en la muestra se convierte en ácido cisteico por el DMSO presente en la Solu-
ción de Hidrólisis.Para reducir la variabilidad y compensar la destrucción parcial, se recomienda evaluar la recuperación de áci-
do cisteico de las hidrólisis oxidativas de proteínas estándar que contengan de 1 a 8 moles de cisteína por mol de proteína. Los
factores de respuesta del hidrolizado de proteínas o péptidos por lo general son aproximadamente 30% menores que los de
los estándares de ácido cisteico no hidrolizado. Como la histidina, la metionina, la tirosina y el triptófano también se modifi-
can, con esta técnica no se obtiene un análisis completo de la composición.
Método 7
La reducción y la alquilación de cisteína-cistina se logra a través de una reacción de piridiletilación en fase de vapor.
Solución Reductora-Transferir 83,3 µL de piridina, 16,7 µL de 4-vinilpiridina, 16,7 µL de tributilfosfina y 83,3 µL de agua
a un recipiente adecuado y mezclar.
Procedimiento-Agregar la proteína o péptido (entre 1 y 100 µg) a un tubo de hidrólisis y colocar en un tubo más grande.
Transferir la SoluciónReductoraal tubo más grande, sellar al vacío (aproximadamente a 50 µm de mercurio o 6,7 Pa), e incubar
aproximadamente a 100° durante 5 minutos. Luego, retirar el tubo de hidrólisis interior y secarlo en un desecador de vacío
durante 15 minutos para eliminar los reactivos residuales. Después, se puede realizar una hidrólisis ácida de la proteína o pépti-
do piridiletilados usando los procedimientos descritos previamente. La reacción de piridiletilación se realiza simultáneamente
con una muestra de un estándar de proteína que contenga de 1 a 8 moles de cisteína por mol de proteína, para mejorar la
exactitud de la recuperación de piridiletil-cisteína. Mayores tiempos de incubación en la reacción de piridiletilación pueden
modificar el grupo a-amino terminal y el grupo E-amino de la lisina en la proteína.
Método8
La reducción de cisteína-cistina y la alquilación se logran a través de una reacción de piridiletilación en fase líquida.
SolucionesMadre-Preparar y filtrar tres soluciones: clorhidrato de Tris 1 M (pH 8,5) que contenga edetato disódico 4 mM
(SoluciónMadre 1), clorhidrato de guanidina 8 M (SoluciónMadre 2) y 2-mercaptoetanol al 10% en agua (SoluciónMadre 3).
Solución Reductora-Preparar una mezcla de la SoluciónMadre 2 y la SoluciónMadre 1 (3:1) para obtener una solución
amortiguada de clorhidrato de guanidina 6 M en clorhidrato de Tris 0,25 M.
Procedimiento-Disolver aproximadamente 1O µg de la muestra de prueba en 50 µL de la SoluciónReductoray agregar
aproximadamente 2,5 µL de la SoluciónMadre 3. Almacenar bajo nitrógeno o argón durante 2 horas a temperatura ambiente
en un lugar oscuro. Para lograr la reacción de piridiletilación, agregar aproximadamente 2 µL de 4-vinilpiridina a la solución de
proteína, e incubar durante 2 horas adicionales a temperatura ambiente en un lugar oscuro. La proteína o péptido se desalini-
za por recolección de la fracción de proteína o péptido luego de una separación por HPLCen fase reversa. La muestra recolec-
tada se puede secar en una centrífuga de vacío antes de la hidrólisis ácida.
Método 9
La reducción de cisteína-cistina y la alquilación se logran a través de una reacción de carboximetilación en fase líquida.
Soluciones Madre-Preparar según se indica en el Método 8.
Solución de Carboximetilación-Preparar una solución que contenga 100 mg de yodoacetamida por mL de alcohol.
Solución Amortiguadora-Usar la SoluciónReductora,preparada según se indica en el Método 8.
Procedimiento-Disolver la muestra de prueba en 50 µL de la SoluciónAmortiguadoray agregar aproximadamente 2,5 µL
de la SoluciónMadre 3. Almacenar bajo nitrógeno o argón durante 2 horas a temperatura ambiente en un lugar oscuro. Agre-
gar la Soluciónde Carboximetilaciónen una relación de 1,5 veces el contenido teórico total de tioles, e incubar durante 30 mi-
nutos adicionales a temperatura ambiente en un lugar oscuro. [NOTA-Si el contenido de tioles de la proteína se desconoce,
agregar 5 µL de yodoacetamida 100 mM por cada 20 nmol de proteína presente.] La reacción se detiene agregando un exce-
so de 2-mercaptoetanol. La proteína o péptido se desaliniza por recolección de la fracción de proteína o péptido luego de una
separación por HPLCen fase reversa. La muestra recolectada se puede secar en una centrífuga de vacío antes de la hidrólisis
ácida. La S-carboxiamidometilcisteína formada se convierte en S-carboximetilcisteína durante la hidrólisis ácida.
Método 10
La cisteína-cistina se hace reaccionar con el ácido ditiodiglicólico o el ácido ditiodipropiónico para producir un disulfuro mix-
to. [NOTA-La elección del ácido ditiodiglicólico o del ácido ditiodipropiónico depende de la resolución requerida por el méto-
do de análisis de aminoácidos.]
Solución Reductora: una solución que contenga 1O mg de ácido ditiodiglicólico (o ácido ditiodipropiónico) por mL de
hidróxido de sodio 0,2 M.
Procedimiento-Transferir aproximadamente 20 µg de la muestra de prueba a un tubo de hidrólisis y agregar 5 µL de la
SoluciónReductora.Agregar 1O µL de alcohol isopropílico y luego eliminar todo el líquido de la muestra mediante centrifuga-
ción al vacío. Luego, hidrolizar la muestra usando el Método 1. La ventaja de este método es que no se derivatizan otros resi-
duos aminoacídicos por reacciones secundarias y no es necesario desalinizar la muestra antes de la hidrólisis.
Método 11
La asparagina y la glutamina se convierten en ácido aspártico y ácido glutámico, respectivamente, durante la hidrólisis ácida.
Los residuos de asparagina y ácido aspártico se suman y se representan con Asx, y los residuos de glutamina y ácido glutámico
se suman y se representan con Glx. Las proteínas o péptidos pueden hacerse reaccionar con bis(l, 1-trifluoroacetoxi)yodoben-
ceno (BTI)para convertir los residuos de asparagina y glutamina en residuos de ácido diaminopropiónico y ácido diaminobutí-
rico, respectivamente, en la hidrólisis ácida. Estas conversiones permiten al analista determinar el contenido de asparagina y
glutamina de una proteína o péptido en presencia de residuos de ácido aspártico y ácido glutámico.
Soluciones Reductoras-Preparar y filtrar tres soluciones: una solución de ácido trifluoroacético 1O mM (Solución1), una
solución de clorhidrato de guanidina 5 M y ácido trifluoroacético 1O mM (Solución2) y una solución recién preparada de dime-
tilformamida que contenga 36 mg de BTIpor mL (Solución3).
Procedimiento-A un tubo de hidrólisis limpio, transferir aproximadamente 200 µg de la muestra de prueba y agregar 2
mL de la Solución1 o la Solución2 y 2 mL de la Solución3. Sellar el tubo de hidrólisis al vacío. Calentar la muestra a 60º duran-
te 4 horas en un lugar oscuro. Luego, dializar la muestra con agua para eliminar el exceso de reactivos. Extraer la muestra
dializada tres veces con volúmenes iguales de acetato de n-butilo y luego liofilizar.Después, se puede realizar la hidrólisis ácida
de la proteína usando los procedimientos descritos previamente. Los residuos de ácido a-,/3-diaminopropiónico y ácido a-, y-
diaminobutírico típicamente no se resuelven de los residuos de lisina en la cromatografía de intercambio iónico basada en el
análisis de aminoácidos. Por lo tanto, cuando se usa el intercambio iónico para separar los aminoácidos, el contenido de aspa-
ragina y glutamina es la diferencia cuantitativa entre el ácido aspártico y ácido glutámico determinados por hidrólisis ácida sin
derivatizar y el contenido que se obtiene por derivatización con BTI.[NOTA-El contenido determinado para treonina, metioni-
na, cisteína, tirosina e histidina puede cambiar por la derivatización con BTI;se debe realizar una hidrólisis sin BTIsi el analista
está interesado en la composición de estos otros residuos de aminoácidos.]
PRINCIPIOSGENERALES
DE LAS METODOLOGÍAS
DE ANÁLISISDE AMINOÁCIDOS
Existen muchas técnicas de análisis de aminoácidos y la elección de una de estas técnicas a menudo depende de la sensibili-
dad que requiera la valoración. En general, aproximadamente la mitad de las técnicas de análisis de aminoácidos empleadas se
basan en la separación de los aminoácidos libres mediante cromatografía de intercambio iónico seguida por derivatización
postcolumna (p. ej., con ninhidrina u o-ftalaldehído). Las técnicas de detección postcolumna se pueden utilizar con muestras
que contienen pequeñas cantidades de los componentes de las soluciones amortiguadoras, tales como sales y urea, y por lo
7586 (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología / InformaciónGeneral USP42
general necesitan entre 5 y 1O µg de muestra de proteína por análisis. Las demás técnicas de aminoácidos generalmente invo-
lucran la derivatización precolumna de los aminoácidos libres (p. ej., isotiocianato de fenilo; carbamato de 6-aminoquinolil-N-
hidroxisuccinimidilo u o-ftalaldehído; cloruro de (dimetilamino)azobencensulfonilo; 9-fluorenil-metilcloroformiato; y 7-fluo-
ro-4-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol) seguida de HPLCen fase reversa. Las técnicas de derivatización precolumna son muy sensi-
bles y por lo general necesitan entre 0,5 y 1,0 µg de la muestra de proteína por análisis, aunque pueden ser influenciadas por
sales amortiguadoras presentes en las muestras. Las técnicas de derivatización precolumna también pueden producir múltiples
derivados de un aminoácido dado, lo cual complica la interpretación de los resultados. Las técnicas de derivatización postco-
lumna generalmente están menos influenciadas por variaciones en el desempeño de la valoración que las técnicas de derivati-
zación precolumna.
Se pueden usar los siguientes Métodospara el análisis cuantitativo de aminoácidos. Los instrumentos y reactivos para estos
procedimientos están disponibles comercialmente. Además, existen muchas modificaciones de estas metodologías con diferen-
tes preparaciones de reactivos, procedimientos de reacción y sistemas cromatográficos. Los parámetros específicos pueden va-
riar según los equipos y procedimientos usados. Muchos laboratorios usan más de una técnica de análisis de aminoácidos para
aprovechar las ventajas de cada una. En cada uno de estos Métodos,la señal analógica se visualiza mediante un sistema de
captación de datos y las áreas de los picos se integran con fines de cuantificación.
Método 1-Principio General de Detección Postcolumna con Ninhidrina
La cromatografía de intercambio iónico con detección postcolumna con ninhidrina es uno de los métodos más comúnmen-
te usados para el análisis cuantitativo de aminoácidos. Por lo general, se emplea un sistema de intercambio catiónico a base de
Li para el análisis de muestras fisiológicas más complejas y un sistema de intercambio catiónico a base de Na, que es más rápi-
do, para mezclas de aminoácidos más simples obtenidas de hidrolizados proteicos (que típicamente contienen 17 aminoáci-
dos). La separación de los aminoácidos en una columna de intercambio iónico se logra a través de una combinación de cam-
bios en el pH y en la fuerza catiónica. A menudo se emplea un gradiente de temperatura para mejorar la separación.
Cuando el aminoácido reacciona con la ninhidrina, el reactante adquiere un color púrpura o amarillo característico. Los ami-
noácidos, a excepción de los iminoácidos, dan un color púrpura y muestran máxima absorción a 570 nm. Los iminoácidos,
como por ejemplo la prolina, dan un color amarillo y muestran una absorción máxima a 440 nm. La reacción postcolumna
entre la ninhidrina y cada aminoácido eluido de la columna se controla a 440 nm y 570 nm, y el cromatograma obtenido se
usa para determinar la composición de aminoácidos.
Se considera que el límite de detección es 1O pmol para la mayoría de los derivados de aminoácidos, pero es 50 pmol para
la prolina. Se obtiene una respuesta lineal entre 20 y 500 pmol con coeficientes de correlación superiores a 0,999. Para obte-
ner buenos datos de composición, es mejor contar con muestras de más de 1 µg antes de la hidrólisis para este análisis de
aminoácidos de proteínas o péptidos.
Método 2-Principio General de Detección Fluorométrica Postcolumna con OPA
El o-ftalaldehído (OPA) reacciona con las aminas primarias en presencia de un tiol para formar productos de isoindol alta-
mente fluorescentes. Esta reacción se utiliza para la derivatización postcolumna en el análisis de aminoácidos por cromatogra-
fía de intercambio iónico. La regla de separación es la misma que la del Método l. Los instrumentos y reactivos para esta forma
de análisis de aminoácidos están disponibles comercialmente. Existen muchas modificaciones de este método.
Si bien el OPA no reacciona con aminas secundarias (iminoácidos, como por ejemplo la prolina) para formar sustancias fluo-
rescentes, la oxidación con hipoclorito de sodio permite que las aminas secundarias reaccionen con OPA. El procedimiento em-
plea una columna de intercambio catiónico fuertemente ácida para la separación de aminoácidos libres seguida de una oxida-
ción postcolumna con hipoclorito de sodio y derivatización postcolumna usando OPAy un compuesto tiol, como por ejemplo
N-acetil-L-cisteínay 2-mercaptoetanol. La derivatización de aminoácidos primarios no se altera perceptiblemente con el aporte
continuo de hipoclorito de sodio.
La separación de los aminoácidos en una columna de intercambio iónico se logra a través de una combinación de cambios
en el pH y en la fuerza catiónica. Después de la derivatización postcolumna con OPA de los aminoácidos eluidos, el reactante
pasa a través de un detector fluorométrico. La intensidad de la fluorescencia de los aminoácidos derivatizados con OPA se con-
trola con una longitud de onda de excitación de 348 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm.
Se considera que el límite de detección es de unas pocas decenas de pmol para la mayoría de los derivados de aminoácidos.
La respuesta es lineal entre unos pocos pmol y unas pocas decenas de nmol. Para obtener buenos datos de composición en
este análisis de aminoácidos de proteínas o péptidos, es mejor contar con muestras de más de 500 ng antes de la hidrólisis.
Método 3-Principio General de Derivatización Precolumna con PITC
El fenilisotiocianato (PITC) reacciona con los aminoácidos para formar derivados de feniltiocarbamilo (PTC) que se pueden
detectar con alta sensibilidad a 254 nm. Por lo tanto, se usa la derivatización precolumna de aminoácidos con PITCseguida
por separación por HPLCen fase reversa con detección UV para analizar la composición de aminoácidos.
Después de eliminar el reactivo al vacío, los aminoácidos derivatizados se pueden almacenar secos y congelados durante va-
rias semanas sin degradación significativa. Si la solución para inyección se mantiene fría, no hay pérdida perceptible en la res-
puesta cromatográfica después de tres días.
La separación de los aminoácidos-PTC por HPLCen fase reversa con una columna ODS se logra a través de una combinación
de cambios en las concentraciones de acetonitrilo y en la fuerza iónica de la solución amortiguadora. Los aminoácidos-PTC
eluidos de la columna se controlan a 254 nm.
Se considera que el límite de detección es 1 pmol para la mayoría de los derivados aminoacídicos. Se obtiene una respuesta
lineal entre 20 y 500 pmol con coeficientes de correlación superiores a 0,999. Para obtener buenos datos de la composición,
en este análisis de aminoácidos de proteínas o péptidos es mejor contar con una muestra de más de 500 ng de proteína o
péptido antes de la hidrólisis.
Método 4-Principio General de Derivatización Precolumna con AQC
Se usa la derivatización precolumna de aminoácidos con 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC) y después

se separan por HPLCen fase reversa con detección fluorométrica.
El AQC reacciona con los aminoácidos para formar derivados de urea estables, fluorescentes y no simétricos (aminoácidos
AQC) que se pueden someter fácilmente al análisis por HPLCen fase reversa. Por lo tanto, se usa la derivatización precolumna
de aminoácidos con AQC seguida de la separación por HPLCen fase reversa para analizar la composición de aminoácidos.
La separación de los aminoácidos-AQC en una columna ODS se logra a través de una combinación de cambios en las con-
centraciones de acetonitrilo y sal. La detección de fluorescencia selectiva de los derivados con una longitud de onda de excita-
ción de 250 nm y una longitud de onda de emisión de 395 nm permite la inyección directa de la mezcla de reacción sin nin-
guna interferencia significativa del único subproducto fluorescente importante del reactivo, la 6-aminoquinolina. El exceso de
reactivo se hidroliza rápidamente (t, 12< 15 segundos) para producir 6-aminoquinolina-N-hidroxisuccinimida y dióxido de car-
bono y después de 1 minuto no se puede producir ninguna otra derivatización.
Las áreas de los picos para los aminoácidos-AQC esencialmente no cambian durante al menos 1 semana a temperatura am-
biente y los derivados tienen más que suficiente estabilidad para permitir el análisis cromatográfico automatizado durante la
noche.
Se considera que el límite de detección está entre aproximadamente 40 fmol y 320 fmol para cada aminoácido, a excepción
de la Cys. El límite de detección para la Cys es aproximadamente 800 fmol. Se obtiene una respuesta lineal entre 2,5 µM y 200
µM con coeficientes de correlación superiores a 0,999. Se pueden obtener buenos datos de composición a partir del análisis de
hidrolizados proteicos derivatizados que contengan tan solo 30 ng de proteína o péptido.
Método 5-Principio General de Derivatización Precolumna con OPA
Se usa la derivatización precolumna de aminoácidos con o-ftalaldehído (OPA)y luego se separan por HPLCen fase reversa
con detección fluorométrica. Esta técnica no detecta los aminoácidos que existen como aminas secundarias (p. ej., prolina).
El OPAjunto con un reactivo tiol reacciona con grupos amino primarios para formar productos isoindólicos altamente fluo-
rescentes. Se puede usar 2-mercaptoetanol y ácido 3-mercaptopropiónico como tiol. El OPA por sí mismo no muestra fluores-
cencia y por lo tanto no produce picos que interfieren. Además, su solubilidad y estabilidad en soluciones acuosas, junto con la
rápida cinética de reacción permiten la derivatización y análisis automatizados usando un muestreador automático para mez-
clar la muestra con el reactivo. Sin embargo, la falta de reactividad con aminoácidos secundarios ha sido una desventaja im-
portante. Este método no detecta los aminoácidos que son aminas secundarias (p. ej., prolina). Para compensar esta desventa-
ja, esta técnica se puede combinar con la técnica descrita en el Método 7 o en el Método 8.
A la derivatización precolumna de aminoácidos con OPA le sigue la separación por HPLCen fase reversa. Debido a la inesta-
bilidad de los derivados aminoácidos-OPA, la separación y el análisis por HPLCse realizan inmediatamente después de la deri-
vatización. El cromatógrafo de líquidos está equipado con un detector fluorométrico para la detección de aminoácidos deriva-
tizados. La intensidad de fluorescencia de los aminoácidos derivatizados con OPAse controla con una longitud de onda de
excitación de 348 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm.
Se ha informado de límites de detección de solo 50 fmol a través de fluorescencia, aunque el límite práctico de análisis se
mantiene en 1 pmol.
Método 6-Principio General de Derivatización Precolumna con DABS-CI
Se usa derivatización precolumna de aminoácidos con cloruro de (dimetilamino)azobencenosulfonilo (DABS-CI)y luego se

separan por HPLCen fase reversa con detección en la región de luz visible.
El DABS-CIes un reactivo cromofórico empleado para marcar aminoácidos. Los aminoácidos marcados con DABS-CI(ami-
noácidos-DABS) son muy estables y muestran la máxima absorción a 436 nm.
Los aminoácidos-DABS, los 19 derivados de aminoácidos naturales, se pueden separar en una columna ODS de HPLCen fase
reversa empleando sistemas de gradientes constituidos por una mezcla de acetonitrilo y una solución amortiguadora acuosa.
Los aminoácidos-DABS separados que eluyen de la columna se detectan a 436 nm en la región visible.
Este método puede analizar los iminoácidos, como por ejemplo la prolina, junto con los aminoácidos, con igual sensibilidad.
El método de derivatización con DABS-CIpermite la cuantificación simultánea de residuos de triptófano mediante hidrólisis
previa de la proteína o péptido con ácidos sulfónicos, como por ejemplo ácido mercaptoetanosulfónico, ácido p-toluensulfóni-
co o ácido metanosulfónico, descritos en el Método 2 en Hidrólisisde Proteínas.Los otros residuos sensibles a los ácidos, aspara-
gina y glutamina, también se pueden analizar mediante la conversión previa en ácido diaminopropiónico y ácido diaminobutí-
rico, respectivamente, tratando la proteína o péptido con BTI,descrito en el Método 11 en Hidrólisisde Proteínas.
El aminoácido no proteinogénjco, norfeucina, no se puede usar como un estándar interno en este método ya que eluye en
una región cromatográfica abundante en picos de aminoácidos primarios. La nitrotirosina se puede usar como estándar inter-
no ya que eluye en una región despejada.
El límite de detección de aminoácidos-DABS es aproximadamente 1 pmol. Se pueden analizar cuantitativamente de 2 a 5
pmol de cada aminoácido-DABS con confiabilidad y solo se necesitan entre 1O ng y 30 ng del hidrolizado proteico tratado con
DABSpara cada análisis.
Método 7-Principio General de Derivatización Precolumna con FMOC-CI
Se usa derivatización precolumna de aminoácidos con cloroformiato de 9-fluorenilmetilo (FMOC-CI)y luego se separan por
HPLCen fase reversa con detección fluorométrica.
El FMOC-CI reacciona con aminoácidos primarios y secundarios para formar productos altamente fluorescentes. La reacción
del FMOC-CIcon aminoácidos se realiza bajo condiciones suaves, en solución acuosa y se completa en 30 segundos. Los deri-
vados son estables y solo se degrada el derivado de histidina. Si bien el FMOC-CI es fluorescente por sí mismo, el exceso de
reactivo y los subproductos fluorescentes se pueden eliminar sin pérdida de aminoácidos-FMOC.
Los aminoácidos FMOC se separan por HPLCen fase reversa usando una columna ODS. La separación se lleva a cabo me-
diante elución por gradiente que varía linealmente de una mezcla de solución amortiguadora de ácido acético, metanol yace-
tonitrilo (50:40:1 O) a una mezcla de acetonitrilo y solución amortiguadora de ácido acético (50:50). En estas condiciones, se
separan 20 derivados de aminoácidos en 20 minutos. Cada derivado que eluye de la columna se controla a través de un detec-
tor fluorométrico ajustado a una longitud de onda de excitación de 260 nm y una longitud de onda de emisión de 313 nm.
El límite de detección se encuentra en el intervalo inferior de fmol. Para la mayoría de los aminoácidos la respuesta es lineal
entre O,1 µM y 50 µM.
Método 8-Principio General de Derivatización Precolumna con NBD-F
Se usa la derivatización precolumna de aminoácidos con 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F)y después se sepa-

ran por HPLCen fase reversa con detección fluorométrica.
El 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F) reacciona con aminoácidos primarios y secundarios para formar productos
altamente fluorescentes. Los aminoácidos se derivatizan con NBD-Fcalentándolos a 60º durante 5 minutos.
Los derivados aminoácidos-NBD se separan en una columna ODS de HPLCen fase reversa empleando un sistema de elución
por gradiente constituido por una mezcla de acetonitrilo y una solución amortiguadora acuosa. En estas condiciones se sepa-
ran 17 derivados de aminoácidos en 35 minutos. Se puede usar el ácido E-aminocaproico como estándar interno ya que eluye
en una región cromatográfica despejada. Cada derivado que eluye de la columna se controla mediante un detectorfluoromé-
trico ajustado a una longitud de onda de excitación de 480 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.
La sensibilidad de este método es casi igual que la del método de derivatización precolumna con OPA(Método 5), excluyen-
do la prolina, que no reacciona con el OPA. Esto puede ser una ventaja del NBD-Fcon respecto al OPA.
El límite de detección para cada aminoácido es aproximadamente 1O fmol. El perfil analítico se logra con aproximadamente
1,5 mg de hidrolizado proteico en la mezcla final de reacción de marcación precolumna para HPLC.
CÁLCULOY ANÁLISISDE DATOS

Cuando se determina el contenido de aminoácidos de un hidrolizado de proteína o péptido, se debe tener en cuenta que el
paso de hidrólisis ácida destruye el triptófano y la cisteína. La serina y la treonina se destruyen parcialmente con la hidrólisis
ácida, mientras que la isoleucina y la valina podrían escindirse solo parcialmente. La metionina puede oxidarse durante la hi-
drólisis ácida y algunos aminoácidos (p. ej., glicina y serina) son contaminantes comunes. La aplicación de un vacío adecuado
(menos de 200 µm de mercurio o 26,7 Pa) o la introducción de un gas inerte (argón) en la cámara gaseosa del recipiente de
reacción durante la hidrólisis en fase de vapor puede reducir la destrucción oxidativa. Por lo tanto, los resultados cuantitativos
obtenidos para cisteína, triptófano, treonina, isoleucina, valina, metionina, glicina y serina de un hidrolizado de proteínas o
péptidos pueden variar y pueden requerir posterior investigación y consideración.
Cálculos
Porcentaje Molar de los Aminoácidos-Es el número de residuos de cada aminoácido por cada 100 residuos en una pro-
teína. Este resultado puede ser útil para evaluar los datos de análisis de aminoácidos cuando se desconoce el peso molecular de
7-
la proteína o péptido a investigar. Esta información se puede usar para corroborar la identidad de una proteína y tiene otras
aplicaciones. Identificar e integrar cuidadosamente los picos obtenidos según se indica para cada Procedimiento.Calcular el
porcentaje molar de cada aminoácido presente en la muestra de prueba, por la fórmula:
100ru/r
en donde ru es la respuesta correspondiente al pico, en nmol, del aminoácido en análisis y res la suma de respuestas corres-
pondientes a los picos, en nmol, de todos los aminoácidos presentes en la muestra de prueba. La comparación entre el por-
centaje molar de aminoácidos en análisis y los datos de proteínas conocidas puede ayudar a establecer o corroborar la identi-
dad de la proteína de muestra.
Muestras de Proteínas Desconocidas-Esta técnica de análisis de datos se puede usar para estimar la concentración pro-
teica de una muestra de proteína desconocida usando los datos de análisis de aminoácidos. Calcular la masa, en µg, de cada
aminoácido recuperado, por la fórmula:
mMw/1000
en donde m es la cantidad recuperada, en nmoles, del aminoácido en análisis; y Mw es el peso molecular para ese aminoácido,
corregido por el peso de la molécula de agua que se eliminó durante la formación de la unión peptídica. La suma de las masas
de los aminoácidos recuperados permite estimar la masa total de la proteína analizada después de corregir adecuadamente
por los aminoácidos destruidos parcial o completamente. Si se dispone del peso molecular de la proteína desconocida (es de-
cir, por análisis SDS-PAGEo espectrometría de masas), se puede predecir la composición de aminoácidos de la proteína desco-
nocida. Calcular el número de residuos de cada aminoácido, por la fórmula:
m/(1 000M/Mwr)
en donde m es la cantidad recuperada, en nmol, del aminoácido en análisis; M es la masa total, en µg, de la proteína; y Mwres
el peso molecular de la proteína desconocida.
Muestras de Proteínas Conocidas-Esta técnica de análisis de datos se puede usar para investigar la composición de ami-
noácidos y la concentración proteica de una muestra de proteína de peso molecular y composición aminoacídica conocidos
usando los datos de análisis de aminoácidos. Cuando se conoce la composición de la proteína que se está analizando, se pue-
de aprovechar el hecho de que algunos aminoácidos se recuperan bien, mientras que la recuperación de otros aminoácidos
puede verse comprometida debido a la destrucción total o parcial (p. ej., triptófano, cisteína, treonina, serina, metionina), la
escisión incompleta de uniones (es decir, para isoleucina y valina) y la contaminación por aminoácidos libres (es decir, por gli-
cina y serina).
Los aminoácidos que se recuperan mejor representan a la proteína y se eligen para cuantificarla. Los aminoácidos que se
recuperan bien son, típicamente, aspartato-asparagina, glutamato-glutamina, alanina, leucina, fenilananina, lisina y arginina.
Esta lista se puede modificar según la experiencia propia con el sistema de análisis utilizado. Dividir la cantidad, en nmol, de
cada uno de los aminoácidos bien recuperados por el número esperado de residuos de ese aminoácido con el fin de obtener el
contenido proteico basado en cada aminoácido bien recuperado. Promediar los resultados de contenido proteico calculados.
Elcontenido proteico determinado para cada uno de los aminoácidos bien recuperados se debe distribuir uniformemente en
torno a la media. Descartar los valores de contenido proteico para esos aminoácidos que se alejan demasiado de la media.
Típicamente, una variación mayor de 5% con respecto a la media se considera inaceptable. Recalcular la media del contenido
proteico de los valores restantes para obtener el contenido proteico de la muestra. Dividir el contenido de cada aminoácido
por el contenido proteico medio calculado para determinar la composición de aminoácidos de la muestra.
Calcular el error relativo de composición, en porcentaje, por la fórmula:
100m/m 5
en donde m es la cantidad determinada experimentalmente, en nmol por residuo aminoacídico, del aminoácido en análisis; y
m5 es el valor conocido para los residuos de ese aminoácido. Elerror relativo composicional promedio es el promedio de los
valores absolutos de los errores relativos composicionales de los aminoácidos individuales, excluyendo típicamente el triptófa-
no y la cisteína de este cálculo. Elerror relativo composicional promedio puede proporcionar información importante acerca
de la estabilidad de los análisis en función del tiempo. La coincidencia en la composición aminoacídica entre la muestra de
proteína y la composición conocida se puede usar para corroborar la identidad y pureza de la proteína en la muestra.
•APÉNDICE
PROCEDIMIENTOS
DE ANÁLISISDE AMINOÁCIDOS
Se presentan los ejemplos de procedimientos específicos para cada Método descrito en Metodologíasde Análisisde Aminoáci-
dos.
4_:
Método 1-Detección Postcolumna con Ninhidrina

A continuación se presenta un método para detección postcolumna con ninhidrina. Existen muchos otros métodos, con ins-
trumental y reactivos disponibles comercialmente.
Preparación de la Fase Móvil-
SoluciónA-Transferir aproximadamente 1,7 g de citrato de sodio anhidro y 1,5 mL de ácido clorhídrico a un matraz volu-
métrico de 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar. Ajustar, si fuera necesario, con ácido clorhídrico hasta un
pH de 3,0.
Solución8-Transferir aproximadamente 1,7 g de citrato de sodio anhidro y 0,7 mL de ácido clorhídrico a un matraz volu-
métrico de 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar. Ajustar con ácido clorhídrico, si fuera necesario, hasta un
pH de 4,3.
Solucióne-Preparar una solución que contenga 5% de cloruro de sodio, 1,9% de citrato de sodio anhidro y O,1% de fenol
en agua y ajustar hasta un pH de 6.
SoluciónRegeneradorade la Columna-Preparar una solución que contenga 0,8% de hidróxido de sodio en agua y ajustar
hasta un pH de 1 3.
FaseMóvif--.JJsarmezclas variables de SoluciónA, SoluciónBy SoluciónC según se indica en SistemaCromatográfico.
Reactivo Postcolumna-Transferir aproximadamente 18 g de ninhidrina y 0,7 g de hidrindantina a 900 mL de una solución
que contenga 76,7% de dimetil sulfóxido, 0,7% de acetato de litio dihidrato y O,1% de ácido acético y mezclar durante un
mínimo de 3 horas bajo un gas inerte, como por ejemplo nitrógeno. [NOTA-Este reactivo es estable durante 30 días si se man-
tiene a una temperatura entre 2º y 8° bajo un gas inerte.]
Solución Amortiguadora-Preparar una solución que contenga 2% de citrato de sodio anhidro, 1% de ácido clorhídrico,
0,5% de tiodiglicol y O,1% de ácido benzoico en agua y ajustar hasta un pH de 2.
Sistema Cromatográfico-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector con filtros de interferencia apropiados a
440; 570 ó 690 nm y una columna de 4,0 mm x 120 mm rellena con copolímero sulfonado de estireno-divinilbenceno de 7,5
µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 14 mL por hora. Programar el sistema del siguiente modo. Inicialmente,
equilibrar la columna con SoluciónA; a los 25 minutos, cambiar la composición de la FaseMóvil a 100% de SoluciónB; y a los
37 minutos, cambiar la composición al 100% de SoluciónC. A los 75 minutos de la corrida, eluye el último aminoácido de la
columna y se regenera la columna con la SoluciónRegeneradorade la Columnadurante 1 minuto. Equilibrar luego la columna
con SoluciónA durante 11 minutos antes de la siguiente inyección. Programar la temperatura de la columna del siguiente mo-
do. La temperatura inicial es 48º; después de 11,5 minutos, aumentar la temperatura a 65º a una velocidad de 3º por minuto;
aproximadamente a los 35 minutos, aumentar la temperatura a 77º a una velocidad de 3º por minuto; y finalmente aproxima-
damente a los 52 minutos, disminuir la temperatura a 48º a una velocidad de 3° por minuto.
Procedimiento y Reacción Postcolumna-Reconstituir el hidrolizado proteico o peptídico liofilizado en la SoluciónAmorti-
guadora, inyectar una cantidad adecuada en el cromatógrafo y proceder según se indica en SistemaCromatográfico.Cuando
los aminoácidos eluyen de la columna, se mezclan con el ReactivoPostcolumna,que se suministra a una velocidad de flujo de 7
mL por hora, a través de una llave T. Después de mezclar, el efluente de la columna y el ReactivoPostcolumnapasan a través de
un reactor tubular a una temperatura de 1 35º, donde se forma un color púrpura o amarillo característico. Desde el reactor, el
líquido pasa a través de un colorímetro con una cubeta de flujo de 12 mm. La luz que emerge de la cubeta se divide en tres
haces que son analizados por el detector con filtros de interferencia a 440; 570 ó 690 nm. La señal de 690 nm se puede restar
electrónicamente de las otras señales para obtener mejores relaciones señal-ruido. Las señales de 440 nm (iminoácidos) y de
570 nm (aminoácidos) se pueden sumar para simplificar el manejo de datos.
Método 2-Detección Fluorométrica Postcolumna con OPA

A continuación se presenta un método de detección fluorométrica postcolumna con OPA.
SoluciónA-Preparar una solución de hidróxido de sodio, ácido cítrico y alcohol en agua de grado HPLCcon una concentra-
ción de sodio 0,2 N y que contenga 7% de alcohol (p/v), ajustada hasta un pH de 3,2.
Solución8-Preparar una solución de hidróxido de sodio y ácido cítrico en agua de grado HPLCcon una concentración de
sodio 0,6 N, ajustada a un pH de 10,0.
SoluciónC: hidróxido de sodio 0,2 N.
FaseMóvil-Usar mezclas variables de SoluciónA, Solución8 y SoluciónC según se indica en SistemaCromatográfico.
Preparación del Reactivo Postcolumna-
So/uciónAmortiguadoraAlcalina-Preparar una solución que contenga carbonato de sodio 384 mM, ácido bórico 216 mM y
sulfato de potasio 108 mM y ajustar hasta un pH de 10,0.
Reactivode Hipoclorito-Agregar 0,4 mL de una solución de hipoclorito de sodio (10% de cloro) a 1 L de la SoluciónAmorti-
guadora Alcalina. [NOTA-la solución de hipoclorito es estable durante 2 semanas.]
ReactivoOPA-Transferir 2 g de N-acetil-L-cisteínay 1,6 g de OPA a un matraz volumétrico de 15 mL, disolver con alcohol,
diluir a volumen con alcohol y mezclar. Transferir esta solución y 4 mL de una solución acuosa al 10% de éter laurílico de polio-
xietileno (23) a un matraz volumétrico de 1 L, diluir con 980 mL de SoluciónAmortiguadoraAlcalinay mezclar.
USP42 Información General/ (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología 7591
Sistema Cromatográfico-Equipar el cromatógrafo de líquidos con un detector fluorométrico ajustado a una longitud de
onda de excitación de 348 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm y con una columna de 4,0 mm x 150 mm
rellena con material L17 de 7,5 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 0,3 ml por minuto y la temperatura de la
columna se ajusta a 50º. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con SoluciónA; durante los siguientes
20 minutos, cambiar linealmente la composición de la FaseMóvil a 85% de SoluciónA y 15% de SoluciónB; luego cambiar
abruptamente a 40% de SoluciónA y 60% de SoluciónB; durante los siguientes 18 minutos, cambiar linealmente la composi-
ción a 100% de Solución8 y mantenerla durante 7 minutos; luego cambiar abruptamente a 100% de SoluciónC y mantenerla
durante 6 minutos; luego cambiar abruptamente a la SoluciónA, mantener esta composición durante los siguientes 8 minutos.
Procedimiento y Reacción Postcolumna-lnyectar en el cromatógrafo aproximadamente 1,0 nmol de cada aminoácido
en análisis y proceder según se indica en el SistemaCromatográfico.Cuando el efluente deja la columna, se mezcla con el
Reactivode Hipoclorito.La mezcla pasa a través del primer reactor postcolumna que es un tubo de acero inoxidable de 0,5 mm
x 2 m. Inmediatamente a continuación del primer reactor postcolumna se coloca un segundo reactor postcolumna de diseño
similar que se usa para la reacción postcolumna con OPA. La velocidad de flujo tanto para el Reactivode Hipocloritocomo para
el ReactivoOPAes 0,2 mL por minuto, dando como resultado una velocidad de flujo total (es decir, Reactivode Hipoclorito,
ReactivoOPAy el efluente de la columna) de 0,7 mL por minuto que sale de los reactores posteriores al paso por la columna.
Las reacciones postcolumna se realizan a 55º. Esto produce un tiempo de permanencia de aproximadamente 33 segundos en
el reactor postcolumna con OPA. Después de la derivatización postcolumna, el efluente pasa a través del detector fluorométri-
co.
Método 3-Derivatización Precolumna con PITC
A continuación se presenta un método de derivatización precolumna con PITC.

SoluciónA: acetato de amonio 0,05 M, ajustado con ácido fosfórico a un pH de 6,8.
Solución8--Preparar acetato de amonio O,1 M, ajustar con ácido fosfórico a un pH de 6,8 y luego preparar una mezcla de
esta solución y acetonitrilo (1 :1).
SoluciónC: una mezcla de acetonitrilo y agua (70:30).
FaseMóvil-Usar mezclas variables de SoluciónA, Solución8 y SoluciónC según se indica en SistemaCromatográfico.
Preparación del Reactivo de Derivatización-
SoluciónAmortiguadorade Acoplamiento: una mezcla de acetonitrilo, piridina, trietilamina y agua (10:5:2:3).
Disolventede la Muestra: una mezcla de agua y acetonitrilo (7:2).
Procedimiento de Derivatización de la Muestra-Disolver la muestra de prueba liofilizada en 100 µL de SoluciónAmorti-
guadora de Acoplamientoy luego secar en una centrífuga de vacío para eliminar todo el clorhidrato si se realizó un paso de
hidrólisis de proteína. Disolver la muestra de prueba en 100 µL de SoluciónAmortiguadorade Acoplamiento,agregar 5 µL de
PITCe incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. La muestra de prueba se seca nuevamente en una centrífuga de
vacío y se disuelve en 250 µL de Disolventede la Muestra.
Sistema Cromatográfico-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 254 nm y una columna de 4,6 mm x
250 mm rellena con material L1 de 5 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1 ml por minuto y la temperatura de
la columna se mantiene a 52º. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con la SoluciónA; durante los
siguientes 15 minutos, cambiar linealmente la composición de la FaseMóvil a 85% de SoluciónA y 15% de SoluciónB; durante
los siguientes 15 minutos, cambiar linealmente la composición a 50% de SoluciónA y 50% de SoluciónB; luego cambiar abrup-
tamente a 100% de SoluciónC y mantenerla durante 1O minutos; luego cambiar abruptamente a 100% de SoluciónA y dejar
que la columna se equilibre antes de la siguiente inyección.
Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente 1,0 nmol de cada aminoácido-PITC en análisis (1 O µL de la
muestra en el Disolventede la Muestra)y proceder según se indica en SistemaCromatográfico.
Método 4-Derivatización de Precolumna con AQC
A continuación se presenta un método de derivatización precolumna con AQC.

SoluciónA-Preparar una solución de acetato de sodio 140 mM y trietilamina 17 mM y ajustar con ácido fosfórico hasta un
pH de 5,02.
Solución8: una mezcla de acetonitrilo y agua (60:40).
FaseMóvil-Usar mezclas variables de SoluciónA y Solución8 según se indica en SistemaCromatográfico.
Procedimiento de Derivatización de la Muestra-Disolver aproximadamente 2 µg de la muestra de prueba en 20 µL de
ácido clorhídrico 15 mM y diluir con una solución amortiguadora de borato 0,2 M (pH 8,8) a 80 µL. Iniciar la derivatización
agregando 20 µL de AQC 1O mM en acetonitrilo y dejar que prosiga durante 1O minutos a temperatura ambiente.
onda de excitación de 250 nm, una longitud de onda de emisión de 395 nm y con una columna de 3,9 mm x 150 mm rellena
con material L1 de 4 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1 ml por minuto y la temperatura de la columna se
mantiene a 37º. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con la SoluciónA; durante los siguientes 0,5
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7592 (1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General USP 42
minutos, cambiar linealmente la composición de la FaseMóvil a 98% de SoluciónA y 2% de SoluciónB; luego durante los si-
guientes 14,5 minutos a 93% de SoluciónA y 7% de SoluciónB; durante los siguientes 4 minutos a 87% de SoluciónA y 1 3%
de SoluciónB; durante los siguientes 14 minutos a 68% de SoluciónA y 32% de SoluciónB; luego cambiar abruptamente a
100% de SoluciónB para un lavado de 5 minutos; durante los siguientes 1O minutos, cambiar abruptamente a 100% de Solu-
ción A y dejar que la columna se equilibre antes de la siguiente inyección.
Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente 0,05 nmol de cada aminoácido-AQC en análisis y proceder
según se indica en el SistemaCromatográfico.
Método 5-Derivatización Precolumna con OPA
A continuación se presenta un método de derivatización precolumna con OPA.

SoluciónA: una mezcla de acetato de sodio 100 mM (pH 7,2), metanol y tetrahidrofurano (900:95:5).
SoluciónB: metanol.
FaseMóvil-Usar mezclas variables de SoluciónA y SoluciónB según se indica en SistemaCromatográfico.
Reactivo de Derivatización-Disolver 50 mg de OPA en 1,25 mL de metanol (apto para secuenciación de proteína). Agre-
gar 50 µL de 2-mercaptoetanol y 11,2 mL de borato de sodio 0,4 M (pH 9,5) y mezclar. [NOTA-El reactivo es estable durante
1 semana.]
Procedimiento de Derivatización de la Muestra-Transferir aproximadamente 5 µL de la muestra de prueba a un reci-
piente adecuado, agregar 5 µL del Reactivode Derivatizacióny mezclar. Después de 1 minuto, agregar no menos de 20 µL de
acetato de sodio O,1 M (pH 7,0). Usar 20 µL de esta solución para el análisis. [NOTA-Se recomienda usar un estándar interno
(p. ej., norleucina) para el análisis cuantitativo debido a variaciones potenciales en el volumen del reactivo en la derivatización
de la muestra. La derivatización de la muestra se realiza de manera automatizada en línea. Debido a la inestabilidad de los
derivados aminoácido-OPA, la separación y análisis por HPLCse realizan inmediatamente después de la derivatización.]
onda de excitación de 348 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm y con una columna de 4,6 mm x 75 mm rellena
con material L3 de 3 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,7 mL por minuto y la temperatura de la columna se
mantiene a 37º. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con 92% de SoluciónA y 8% de SoluciónB;
durante los siguientes 2 minutos, cambiar la composición de la FaseMóvil a 83% de SoluciónA y 17% de SoluciónBy mantener
durante 3 minutos más; después durante los siguientes 5 minutos cambiar a 54% de SoluciónA y 46% de SoluciónBy mante-
ner durante 2 minutos más; después durante los siguientes 2 minutos cambiar a 34% de SoluciónA y 66% de SoluciónBy
mantener durante 1 minuto; después durante los siguientes O,3 minutos cambiar a 20% de SoluciónA y 80% de SoluciónBy
mantener durante 2,6 minutos más; y finalmente durante 0,6 minutos cambiar a 92% de SoluciónA y 8% de SoluciónBy man-
tener durante 0,6 minutos más.
Procedimiento-Inyectar aproximadamente 0,02 nmol de cada derivado aminoácido-OPA en análisis en el cromatógrafo y
proceder según se indica en el SistemaCromatográfico.
Método 6-Derivatización Precolumna con DABS-CI

A continuación se presenta un método de derivatización precolumna con DABS-CI.
SoluciónA: acetato de sodio 25 mM (pH 6,5) que contenga 4% de dimetilformamida.
SoluciónB: acetonitrilo.
FaseMóvil-Usar mezclas variables de SoluciónA y SoluciónB según se indica en SistemaCromatográfico.
So/uciónAmortiguadorade Muestra: bicarbonato de sodio 50 mM ajustado hasta un pH de 8, 1.
Reactivode Derivatización-Disolver 1,3 mg de DABS-CIen 1 mL de acetonitrilo. [NOTA-Este reactivo se prepara poco antes
del paso de derivatización.]
SoluciónAmortiguadorade Dilución de la Muestra-Preparar una mezcla de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0) y alcohol (1 :1).
Procedimiento de Derivatización de la Muestra-Disolver la muestra de prueba en 20 µL de SoluciónAmortiguadorade
Muestra, agregar 40 µL de Reactivode Derivatizacióny mezclar. Sellar el recipiente de la muestra con un tapón de goma de
silicona y calentar a 70° durante 1O minutos. Mientras se calienta la muestra, la mezcla se disuelve completamente. Después
de la derivatización, diluir la muestra de prueba con una cantidad adecuada de SoluciónAmortiguadorade Dilución de la Mues-
tra.
Sistema Cromatográfico-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 436 nm y una columna de 4,6 mm x
250 mm rellena con material L1 . La velocidad de flujo es de aproximadamente 1 ml por minuto y la temperatura de la colum-
na se mantiene a 40°. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con 85% de SoluciónA y 15% de Solu-
ción B; durante los siguientes 20 minutos, cambiar la composición de la FaseMóvil a 60% de SoluciónA y 40% de SoluciónB;
durante los siguientes 12 minutos, cambiar la composición a 30% de SoluciónA y 70% de SoluciónBy mantener durante 2
minutos más.
Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente 0,05 nmol de los aminoácidos-DABS y proceder según se

indica en Sistema Cromatográfico.
Método 7-Derivatización Precolumna con FMOC-CI
A continuación se presenta un método de derivatización precolumna con FMOC-CI.

SoluciónAmortiguadorade ÁcidoAcético-Transferir 3 ml de ácido acético glacial y 1 ml de trietilamina a un matraz volumé-
trico de 1 L y diluir a volumen con agua de grado HPLC.Ajustar con hidróxido de sodio hasta un pH de 4,20.
SoluciónA: una mezcla de SoluciónAmortiguadorade ÁcidoAcético,metanol y acetonitrilo (50:40:l O).
SoluciónB: una mezcla de acetonitrilo y SoluciónAmortiguadorade ÁcidoAcético(50:50).
FaseMóvil-Usar mezclas variables de SoluciónA y SoluciónB según se indica en Sistema Cromatográfico.
So/uciónAmortiguadorade Borato-Preparar una solución de ácido bórico 1 M y ajustar con hidróxido de sodio hasta un pH
de 6,2.
ReactivoFMOC-C/--Disolver155 mg de cloroformiato de 9-fluorenilmetilo en 40 mL de acetona y mezclar.
Procedimiento de Derivatización de la Muestra-Agregar O,1 mL de SoluciónAmortiguadorade Boratoy 0,5 mL de Reacti-
vo FMOC-CI a 0,4 mL de la muestra de prueba. Después de aproximadamente 40 segundos, extraer la mezcla con 2 mL de
pentano y luego extraer una vez más con una nueva porción de pentano. La solución acuosa con los derivados de aminoácidos
queda lista para la inyección.
onda de excitación de 260 nm y una longitud de onda de emisión de 313 nm y con una columna de 4,6 mm x 125 mm
rellena con material L1 de 3 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1, 3 mL por minuto. Programar el sistema del
siguiente modo. Equilibrar la columna con SoluciónA y mantener esta composición durante 3 minutos; durante los siguientes 9
minutos, cambiar a 100% de SoluciónB;durante los siguientes 0,5 minutos, aumentar la velocidad de flujo a 2 mL por minuto
y mantenerla hasta que el último aminoácido-FMOC eluya de la columna. El tiempo total de la corrida es de aproximadamente
20 minutos.
Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo no menos de 0,01 nmol de cada aminoácido-FMOC en análisis y proceder
según se indica en el Sistema Cromatográfico.El derivado histidina-FMOC por lo general dará una respuesta menor que los
demás derivados.
Método 8-Derivatización Precolumna con NBD-F
A continuación se presenta un método de derivatización precolumna con NBD-F.

SoluciónA: una solución de citrato de sodio 1 O mM y perclorato de sodio 75 mM, ajustada con ácido clorhídrico hasta un
pH de 6,2.
SoluciónB: una mezcla de acetonitrilo y agua (50:50).
SoluciónAmortiguadorade Muestra: una solución de ácido bórico O,1 M ajustada con hidróxido de sodio a un pH de 9,2.
Reactivode Derivatización--Disolver 5 mg de NBD-Fen 1,0 mL de alcohol y mezclar.
Procedimiento de Derivatización de la Muestra-Disolver la muestra de prueba en 20 µL de SoluciónAmortiguadorade
Muestra,agregar 1O µL de Reactivode Derivatizacióny mezclar. Calentar el recipiente de la muestra a 60º durante 5 minutos.
Después de la derivatización, diluir la muestra de prueba con 300 µL de la SoluciónA.
onda de excitación de 480 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm y una columna de 4,6 mm x 150 mm rellena
con sílice ODS con un tamaño de partícula de 5 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,0 mL por minuto y la
temperatura de la columna se mantiene a 40º. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con 94% de
SoluciónA y 6% de SoluciónB;durante los siguientes 16 minutos, cambiar linealmente la composición a 63% de SoluciónA y
37% de SoluciónB;durante los siguientes 5 minutos, cambiar linealmente la composición a 62% de SoluciónA y 38% de Solu-
ción B;durante los siguientes 9 minutos, cambiar linealmente la composición a 100% de SoluciónBy mantener durante otros 5
minutos; finalmente durante 2 minutos, cambiar linealmente la composición a 94% de SoluciónA y 6% de SoluciónBy luego
dejar equilibrar la columna antes de la siguiente inyección.
Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente 15 pmol de cada aminoácido-NBD en análisis y proceder
según se indica en el Sistema Cromatográfico .•
4
7594 (1053) Electroforesis Capilar/ InformaciónGeneral USP42
(1053) ELECTROFORESIS
CAPILAR
mediante electroforesis capilar. Se lo ha armonizado con los capítulos correspondientes en la FarmacopeaJaponesa(JP)y la
FarmacopeaEuropea(EP).También se muestran otras pruebas de caracterización armonizadas en ArtículosObtenidospor Biotec-
nología-Análisis de Aminoácidos(1052), ArtículosObtenidospor Biotecnología-lsoelectroenfoque(1054), ArtículosObtenidospor
Biotecnología-Mapeo de Péptidos(1055), ArtículosObtenidospor Biotecnología-Electroforesisen Gel de Poliacrilamida(1056) y
ArtículosObtenidospor Biotecnología-Valoraciónde ProteínasTotales(1057).
INTRODUCCIÓN
La electroforesis capilar es un método físico de análisis basado en la migración, dentro de un capilar, de analitos cargados
disueltos en una solución de electrolitos, bajo la influencia de un campo eléctrico de corriente continua. En esta sección se
describen cuatro métodos de electroforesis capilar: ElectroforesisCapilarde Zona, ElectroforesisCapilaren Gel, lsoelectroenfoque
Capilary CromatografíaElectrocinéticaMice/ar.
PRINCIPIOSGENERALES
La velocidad de migración del analito en un campo eléctrico de intensidad E está determinada por la movilidad electroforéti-
ca del analito y la movilidad electroosmótica de la solución amortiguadora dentro del capilar. La movilidad electroforética de
un soluto (µ.p) depende de las características del soluto (carga eléctrica, tamaño molecular y forma) y de las características de
la solución amortiguadora en donde ocurre la migración (tipo y fuerza iónica del electrolito, pH, viscosidad y aditivos). La velo-
cidad electroforética (vep)de un soluto, suponiendo una forma esférica, es la siguiente:
v ep-µ•P
- E-[-q
)('!_)
- 6JzTJí L
en donde q es la carga efectiva del soluto; ll es la viscosidad de la solución electrolítica; r es el radio de Stoke del soluto; V es el
voltaje aplicado; y L es la longitud total del capilar.
Cuando se aplica un campo eléctrico a través del capilar lleno con solución amortiguadora, se genera un flujo de disolvente
dentro del capilar que se denomina flujo electroosmótico. Su velocidad depende de la movilidad electroosmótica (µeo)que a su
vez depende de la densidad de la carga en la pared interna del capilar y de las características de la solución amortiguadora. La
velocidad electroosmótica (veo)está dada por la ecuación:
en donde e es la constante dieléctrica de la solución amortiguadora; e;es el potencial zeta de la superficie del capilar; y los
otros términos son los definidos anteriormente.
La velocidad del soluto (v) está dada por la ecuación:
V= Vep+ Veo
La movilidad electroforética del analito y la movilidad electroosmótica pueden actuar en la misma dirección o en direcciones
opuestas, dependiendo de la carga del soluto. En electroforesis capilar normal, los aniones migrarán en la dirección opuesta al
flujo electroosmótico y sus velocidades serán menores que la velocidad electroosmótica. Los cationes migrarán en la misma
dirección del flujo electroosmótico y sus velocidades serán mayores que la velocidad electroosmótica. Bajo condiciones en las
cuales hay una velocidad electroosmótica rápida con respecto a la velocidad electroforética de los solutos, tanto los cationes
como los aniones se pueden separar en la misma corrida. El tiempo (t) que tarda el soluto en migrar la distancia (1)desde el
extremo de inyección del capilar al punto de detección (longitud efectiva del capilar) es el siguiente:
l(L)
en donde los otros términos son los definidos anteriormente.

En general, los capilares de sílice fundida sin recubrimiento con un pH por encima de 3 tienen carga negativa debido a los
grupos silanol ionizados en la pared interna. Por consiguiente, el flujo electroosmótico va del ánodo al cátodo. Elflujo electro-
osmótico debe mantenerse constante de corrida a corrida para obtener una buena reproducibilidad en la velocidad de migra-
ción de los solutos. Para algunas aplicaciones, puede ser necesario reducir o suprimir el flujo electroosmótico modificando la
pared interna del capilar o cambiando la concentración, la composición y/o el pH de la solución amortiguadora.
USP42 Información General/ (1053) Electroforesis Capilar 7595
Después de la introducción de la muestra dentro del capilar, cada ión del analito de la muestra migra dentro del electrolito
de fondo como una zona independiente de acuerdo con su movilidad electroforética. La dispersión de la zona, o sea el exten-
dido de cada banda de soluto es el resultado de fenómenos diferentes. En condiciones ideales, el ensanchamiento de la zona
del soluto se debe solamente a la difusión molecular del soluto a lo largo del capilar (difusión longitudinal). En este caso ideal,
la eficiencia de la zona, expresada como el número de platos teóricos (N), está dada por:
N (µep +µeo )(VI)

2DL
en donde D es el coeficiente de difusión molecular del soluto en la solución amortiguadora.
En la práctica, otros fenómenos, como por ejemplo la disipación de calor, la adsorción de la muestra en la pared del capilar,
las diferencias de conductividad entre la muestra y la solución amortiguadora, la longitud de la zona de inyección, el tamaño
de celda del detector y los recipientes de solución amortiguadora no nivelados, pueden contribuir significativamente a la dis-
persión de banda. La separación entre dos bandas (expresada por la resolución, R5) se puede obtener modificando la movilidad
electroforética de los analitos, la movilidad electroosmótica inducida por el capilar y aumentando la eficiencia para la banda de
cada analito del siguiente modo:
en donde µepay µepbson las movilidades electroforéticas de los dos analitos a separar; µep es la movilidad electroforética prome-
dio de los dos analitos calculada como:
f.1ep= '/, (µepb+ µep,)
APARATO
Un aparato de electroforesis capilar se compone de una fuente de alimentación de corriente continua (directa) regulable, de
alto voltaje; dos recipientes para las soluciones amortiguadoras que se mantienen en el mismo nivel y que contienen las solu-
ciones anódica y catódica especificadas; dos conjuntos de electrodos (cátodo y ánodo) sumergidos en los recipientes de las
soluciones amortiguadoras y conectados a la fuente de alimentación; un capilar de separación, generalmente de sílice fundida,
a veces con una ventana de visualización óptica alineada con el detector, dependiendo del tipo de detector, con los extremos
del capilar ubicados en los recipientes de las soluciones amortiguadoras y el capilar lleno con una solución que se especifica en
la monografía correspondiente; un sistema de inyección adecuado; un detector capaz de monitorear la cantidad de sustancia
de interés que pasa a través de un segmento del capilar de separación en un tiempo dado, generalmente basado en la espec-
trofotometría de absorción (UVy visible), fluorometría, o detección conductimétrica, amperométrica o espectrométrica de ma-
sas, dependiendo de las aplicaciones específicas, o incluso en la detección indirecta para detectar compuestos no fluorescentes
y que no absorben luz UV;un sistema termostático capaz de mantener una temperatura constante dentro del capilar, reco-
mendada para obtener una buena reproducibilidad de separación; un registrador y un integrador apropiado o una computa-
dora.
La definición del proceso de inyección y su automatización son críticos para realizar análisis cuantitativos precisos. Los mo-
dos de inyección incluyen la inyección por gravedad, presión o vacío o la inyección electrocinética. La cantidad de cada com-
ponente de muestra introducida electrocinéticamente depende de su movilidad electroforética, lo cual lleva a una posible dis-
criminación al usar este modo de inyección.
Se espera que el capilar, las soluciones amortiguadoras, el método de preacondicionamiento, la solución muestra y las con-
diciones de migración estén especificadas en la monografía correspondiente. La solución electrolítica empleada se filtra para
eliminar partículas y desgasificar para evitar la formación de burbujas que pueden interferir con el sistema de detección o inte-
rrumpir el contacto eléctrico en el capilar durante la corrida de separación. Para lograr un tiempo de migración reproducible
de los solutos, es necesario desarrollar, para cada método analítico, una rutina de enjuague riguroso después de cada inyec-
ción.
ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA
Principio
En la electroforesis capilar de zona, los analitos se separan en un capilar que contiene únicamente una solución amortigua-
dora sin ningún medio anticonvectivo. En esta técnica, la separación ocurre debido a que los distintos componentes de la
muestra migran como bandas discretas con velocidades diferentes. La velocidad de cada banda depende de la movilidad elec-
troforética del soluto y del flujo electroosmótico en el capilar (ver PrincipiosGenerales).Se pueden usar capilares recubiertos
para aumentar la capacidad de separación de las sustancias que se adsorben en las superficies de sílice fundida.
7596 (1053) Electroforesis Capilar/ Información General USP42
Este método de electroforesis capilar es apropiado para el análisis de moléculas pequeñas (PM < 2000) y grandes (2000 <
PM < 1 00 000). Debido a la alta eficiencia lograda en la electroforesis capilar de zona se puede efectuar la separación de molé-
culas que presenten diferencias mínimas en su relación carga-masa. Este modo de separación también permite la separación
de compuestos quirales por adición de selectores quirales a la solución amortiguadora de separación.
Optimización
La optimización de la separación es un proceso complejo en el que diversos parámetros de separación pueden desempeñar
un papel importante. Los principales parámetros que se deben considerar en el desarrollo de las separaciones son los paráme-
tros instrumentales y de la solución electrolítica.
Parámetros Instrumentales
VOLTAJE
Un gráfico de calentamiento de Joule es útil para optimizar el voltaje aplicado y la temperatura de la columna. El tiempo de
separación es inversamente proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, un aumento en el voltaje empleado puede producir
calor excesivo, dando lugar a un aumento de temperatura y, como resultado, a gradientes de viscosidad en la solución amorti-
guadora dentro del capilar, lo cual ensancha las bandas y disminuye la resolución.
POLARIDAD
La polaridad del electrodo puede ser normal (el ánodo en la entrada y el cátodo en la salida) y el flujo electroosmótico se
moverá hacia el cátodo. Si la polaridad del electrodo se invierte, el flujo electroosmótico queda lejos de la salida y solo los
analitos cargados con movilidades electroosmóticas mayores que el flujo electroosmótico pasarán hacia la salida.
TEMPERATURA
El principal efecto de la temperatura se observa en la viscosidad y conductividad eléctrica de la solución amortiguadora afec-
tándose, por lo tanto, la velocidad de migración. En algunos casos, un aumento en la temperatura del capilar puede alterar la
conformación de algunas proteínas, modificando su tiempo de migración y eficiencia de separación.
CAPILAR
La longitud y diámetro interno del capilar afectan el tiempo de análisis, la eficiencia de las separaciones y la capacidad de
carga. El aumento de la longitud efectiva y de la longitud total permiten disminuir los campos eléctricos, a un voltaje constan-
te, lo cual aumenta el tiempo de migración. Para una solución amortiguadora y un campo eléctrico dados, la disipación de
calor (por lo tanto, el ensanchamiento de banda de la muestra) depende del diámetro interno del capilar. Este último también
afecta el límite de detección, dependiendo del volumen de muestra inyectado en el capilar y del sistema de detección usado.
La adsorción de los componentes de la muestra en la pared del capilar limita la eficiencia; por lo tanto, hay que considerar
métodos para evitar estas interacciones cuando se desarrolla un método de separación. En el caso específico de las proteínas,
se han diseñado varias estrategias para evitar la adsorción en la pared capilar. Algunas de estas estrategias (uso de pH extremo
y adsorción de aditivos amortiguadores cargados positivamente) solo necesitan la modificación de la composición del amorti-
guador del pH para evitar la adsorción de las proteínas. Otras estrategias incluyen el recubrimiento de la pared interna del
capilar con un polímero unido covalentemente a la sílice lo cual evita la interacción entre las proteínas y la superficie de la sílice
negativamente cargada. Para este propósito, se consiguen en el mercado capilares listos para el uso con recubrimiento de polí-
meros hidrófilos neutros, catiónicos y aniónicos.
Parámetros de la Solución Electrolítica
TIPO DE SOLUCIÓNAMORTIGUADORA
Y CONCENTRACIONES
Las soluciones amortiguadoras apropiadas para la electroforesis capilar tienen una capacidad amortiguadora adecuada en el
intervalo de pH de elección y baja movilidad para minimizar la generación de corriente.
Para minimizar la distorsión de la banda es importante hacer coincidir la movilidad de los iones en la solución amortiguadora
con la movilidad del soluto siempre que sea posible. Es importante el tipo de disolvente de la muestra empleado para lograr el
enfoque de la muestra en la columna, lo que aumenta la eficiencia de separación y mejora la detección. Además, el aumento
en la concentración de las soluciones amortiguadoras a un pH dado disminuye el flujo electroosmótico y la velocidad del solu-
to.
USP42 Información General/ (1053) Electroforesis Capilar 7597
PH DE LASOLUCIÓNAMORTIGUADORA
El pH de la solución amortiguadora puede afectar la separación al modificar la carga del analito o aditivos y al cambiar el
flujo electroosmótico. Para la separación de proteínas y péptidos, un cambio en el pH de la solución amortiguadora desde un
valor superior al punto isoeléctrico a un valor inferior al punto isoeléctrico cambia la carga neta del soluto de negativa a positi-
va. Un aumento en el pH de la solución amortiguadora generalmente aumenta el flujo electroosmótico.
DISOLVENTES
ORGÁNICOS
Los modificadores orgánicos, como por ejemplo el metano!, el acetonitrilo y otros, se pueden agregar a la solución amorti-
guadora acuosa para aumentar la solubilidad del soluto o de otros aditivos o para afectar el grado de ionización de los compo-
nentes de la muestra. Estos modificadores orgánicos agregados a la solución amortiguadora suelen disminuir el flujo electroos-
mótico.
ADITIVOSPARASEPARACIONES
QUIRALES
Para separar isómeros ópticos, se agrega un selector quiral a la solución amortiguadora de separación. Los selectores quirales
más comúnmente usados son las ciclodextrinas, aunque en algunos casos se pueden usar éteres corona, algunos polisacáridos
o incluso proteínas. Como el reconocimiento quiral depende de las distintas interacciones entre el selector quiral y cada uno
de los enantiómeros, la resolución lograda para los compuestos quirales depende en gran medida del tipo de selector quiral
usado. Mientras se desarrolla una separación dada, puede ser útil analizar las ciclodextrinas que tengan distintos tamaños de
cavidad (a, f3 o y-ciclodextrina) o ciclodextrinas modificadas con grupos neutros (metilo, etilo, hidroxialquilo, etc.) o grupos
ionizables (aminometilo, carboximetilo, sulfobutiléter, etc.). Al usar ciclodextrinas modificadas se deben tener en cuenta las va-
riaciones de una partida a otra en el grado de sustitución de las ciclodextrinas, puesto que eso influirá en la selectividad. La
resolución en la separación de compuestos quirales también está controlada por la concentración del selector quiral, la compo-
sición y el pH de la solución amortiguadora y la temperatura de separación. Los aditivos orgánicos, como por ejemplo el meta-
no! o la urea, también pueden afectar la resolución de la separación.
ELECTROFORESISCAPILAR EN GEL
En la electroforesis capilar en gel, la separación ocurre dentro de un capilar lleno con un gel que actúa como un tamiz mole-
cular. Las moléculas con relaciones carga a masa similares se separan de acuerdo con el tamaño molecular dado que las molé-
culas más pequeñas se mueven más libremente a través de la red del gel y, por lo tanto, migran más rápido que las moléculas
más grandes. De esa forma, las diferentes macromoléculas biológicas (por ejemplo, las proteínas y los fragmentos de ADN),
que a menudo tienen relaciones carga a masa similares se pueden separar por electroforesis capilar en gel de acuerdo con su
masa molecular.
Características de los Geles
En electroforesis capilar se usan dos tipos de geles: los geles recubiertos permanentemente y los geles recubiertos dinámica-
mente. Los geles recubiertos permanentemente se preparan dentro del capilar por polimerización de monómeros. Un ejemplo
de dicho gel es una poliacrilamida entrecruzada. Este tipo de gel generalmente está unido a la pared de sílice fundida y no se
puede eliminar sin destruir el capilar. Para el análisis de proteínas bajo condiciones reductoras, la solución amortiguadora de
separación, por lo general, contiene dodecilsulfato de sodio, y la muestra se desnaturaliza por calor en una mezcla de dodecil-
sulfato de sodio y 2-mercaptoetanol o ditiotreitol antes de la inyección. Cuando se emplean condiciones no reductoras (por
ejemplo, durante el análisis de un anticuerpo intacto), no se utilizan 2-mercaptoetanol y ditiotreitol. La optimización de la se-
paración en un gel entrecruzado se obtiene modificando la solución amortiguadora de separación (ver ElectroforesisCapilar de
Zona) y controlando la porosidad del gel durante la preparación del mismo. Para geles de poliacrilamida entrecruzada, la poro-
sidad se puede modificar cambiando la concentración de acrilamida y/o la relación del agente de entrecruzamiento. Como
regla general, al disminuir la porosidad del gel se reduce la movilidad de los solutos. Debido a la rigidez de este tipo de gel,
solo se puede usar la inyección electrocinética.
Los geles recubiertos dinámicamente son polímeros hidrófilos (es decir, poliacrilamida lineal, derivados de celulosa, dextra-
no, etc.) que se pueden disolver en soluciones amortiguadoras acuosas de separación, dando lugar a un medio de separación
que también actúa como tamiz molecular. Estos medios de separación poliméricos son más fáciles de preparar que los políme-
ros entrecruzados. Se pueden preparar en un vial y llenar por presión en un capilar de pared recubierta sin flujo electroosmóti-
co. Si se reemplaza el gel antes de cada inyección generalmente mejora la reproducibilidad de la separación. La porosidad de
los geles recubiertos dinámicamente se puede aumentar usando polímeros de una masa molecular mayor (a una concentra-
ción de polímero dada) o disminuyendo la concentración de polímero (para una masa molecular de polímero dada.) Al dismi-
nuir la porosidad del gel se reduce la movilidad del soluto para la misma solución amortiguadora. Se pueden usar técnicas de
inyección hidrodinámica y electrocinética ya que la disolución de estos polímeros en la solución amortiguadora produce solu-
ciones de baja viscosidad.
ISOELECTROENFOQUE
CAPILAR
Principio
En isoelectroenfoque las moléculas migran bajo la influencia del campo eléctrico, siempre y cuando estén cargadas, en un
gradiente de pH generado por anfolitos que tienen un intervalo amplio de valores de pi (ácidos poliaminocarboxílicos) disuel-
tos en la solución amortiguadora de separación.
Los tres pasos básicos en el isoelectroenfoque capilar son la carga de la muestra, el enfoque y la movilización.
CARGA
Se pueden emplear dos métodos.

Carga en un Solo Paso-La muestra se mezcla con anfolitos y se introduce en el capilar por presión o vacío.
Carga Secuencial-Se introducen en el capilar una solución amortiguadora inicial, luego los anfolitos, luego la muestra
mezclada con anfolitos, otra vez los anfolitos solos y finalmente la solución amortiguadora final. Elvolumen de la muestra debe
ser suficientemente pequeño como para no modificar el gradiente de pH.
ENFOQUE
Cuando se aplica voltaje, los anfolitos migran hacia el cátodo o el ánodo según su carga neta, creando un gradiente de pH
desde el ánodo (menor pH) al cátodo (mayor pH). Durante este paso los componentes a separar migran hasta que alcanzan el
pH correspondiente a su punto isoeléctrico y la corriente cae a valores muy bajos.
MOVILIZACIÓN
Si se requiere movilización para la detección, usar uno de los siguientes métodos. Se cuenta con tres métodos.
Método 1-La movilización se consigue durante el Enfoque,bajo la influencia del flujo electroosmótico cuando este flujo es
suficientemente pequeño para permitir el enfoque de los componentes.
Método 2-La movilización se consigue por aplicación de presión positiva después del Enfoque.
Método 3-La movilización se consigue después del Enfoque,agregando sales al recipiente del cátodo o del ánodo, depen-
diendo del sentido elegido para la movilización, a fin de alterar el pH en el capilar cuando se aplica voltaje. Al cambiar el pH,
las proteínas y anfolitos se movilizan hacia el recipiente que contiene las sales agregadas y pasan por el detector.
La separación lograda se expresa como ~pi y depende del gradiente de pH (dpH/dx), el número de anfolitos que tienen
valores de pi diferentes, el coeficiente de difusión molecular (D), la intensidad del campo eléctrico (E) y la variación de la movi-
lidad electroforética del analito en función del pH (-dµ/dpH):
l= D(dpH/dx)
6 3
p E(-dµ!dpH)
Optimización
Los principales parámetros que se deben considerar en el desarrollo de las separaciones son los siguientes:
VOLTAJE
Emplear campos altos desde 300 V/cm a 1000 V/cm durante el Enfoque..
CAPILAR
Según la estrategia de Movilizaciónseleccionada (ver más arriba), el flujo electroosmótico se debe reducir o eliminar. Los ca-
pilares recubiertos tienden a reducir el flujo electroosmótico.
USP42 InformaciónGeneral/ (1053) Electroforesis Capilar 7599
SOLUCIONES
El recipiente con el amortiguador correspondiente al ánodo se llena con una solución de pH más bajo que el pi del anfolito
más ácido y el recipiente del cátodo se llena con una solución que tiene un pH más alto que el pi del anfolito más básico.
Frecuentemente se usa ácido fosfórico para el ánodo e hidróxido de sodio para el cátodo.
La adición de un polímero, como la metilcelulosa, a la solución del anfolito tiende a suprimir las fuerzas convectivas (si las
hubiese) y el flujo electroosmótico por aumento de la viscosidad. Se dispone comercialmente de anfolitos que abarcan muchos
intervalos de pH, que se pueden mezclar para obtener un intervalo de pH ampliado. Los intervalos de pH más amplios se usan
para estimar el punto isoeléctrico (pi) mientras que los más estrechos se emplean para mejorar la exactitud. La calibración se
puede llevar a cabo relacionando el tiempo de migración con el punto isoeléctrico de una serie de marcadores estándar de
proteínas. Durante el Enfoque,se puede evitar la precipitación de proteínas en su punto isoeléctrico, si fuera necesario, usando
aditivos de amortiguadores como por ejemplo glicerol, agentes tensoactivos, urea o amortiguadores zwiteriónicos. Sin embar-
go, según las concentraciones, la urea puede desnaturalizar las proteínas.
CROMATOGRAFÍA
ELECTROCINÉTICA
MICELAR(CECM)
Principio
La separación se efectúa en una solución electrolítica que contiene un agente tensoactivo en una concentración por encima
de la concentración micelar crítica (eme). Las moléculas de soluto se distribuyen entre la solución amortiguadora acuosa y la
fase pseudo-estacionaria compuesta por las micelas según el coeficiente de partición del soluto. Esta técnica se puede conside-
rar un híbrido de electroforesis y cromatografía. Es una técnica que se puede usar para la separación de solutos neutros o car-
gados manteniendo la eficiencia, la velocidad y la aptitud del instrumento de electroforesis capilar. Uno de los agentes ten-
soactivos más ampliamente usados en CECM es el tensoactivo aniónico dodecilsulfato de sodio, aunque se han usado otros
agentes tensoactivos, como por ejemplo las sales de cetiltrimetilamonio tensoactivos catiónicos.
El mecanismo de separación es el siguiente. A pH neutro y alcalino, se genera un flujo electroosmótico fuerte que mueve los
iones de la solución amortiguadora de separación hacia el cátodo. Si se usa dodecilsulfato de sodio como agente tensoactivo,
la migración electroforética de la micela aniónica se produce en el sentido opuesto, hacia el ánodo. Como resultado, la veloci-
dad general de migración de las micelas disminuye en comparación con el flujo en masa de la solución electrolítica. En el caso
de solutos neutros, como el analito se puede repartir entre la micela y la solución amortiguadora acuosa y no tiene movilidad
electroforética, la velocidad de migración del analito dependerá únicamente del coeficiente de partición entre la micela y la
solución amortiguadora acuosa. En el electroferograma, los picos correspondientes a cada soluto sin carga están siempre entre
el del marcador del flujo electroosmótico y el de la micela; y el tiempo transcurrido entre estos dos picos se denomina ventana
de separación. Para los solutos con carga eléctrica, la velocidad de migración depende del coeficiente de partición del soluto
entre la micela y la solución amortiguadora acuosa y de la movilidad electroforética del soluto en ausencia de micelas.
Dado que el mecanismo de solutos neutros o débilmente ionizados en CECM es esencialmente cromatográfico y la migra-
ción del soluto y la resolución se pueden racionalizar en términos del factor de retención del soluto (k'), también conocido
como cociente de distribución másica (Dm),que es el cociente entre el número de moles de soluto en la micela y los moles en
la fase móvil. Para un compuesto neutro, k' es del siguiente modo:
k'
en donde t, es el tiempo de migración del soluto; t,, es el tiempo de análisis del soluto no retenido obtenido al inyectar un
marcador de flujo electroosmótico que no entra a la micela (p. ej., metano!); ~e es el tiempo de migración de la micela medi-
do al inyectar un marcador de micela, como por ejemplo Sudán 111,que migra continuamente asociado con la micela; K es el
coeficiente de partición del soluto; V5 es el volumen de la fase micelar; y VMes el volumen de la fase móvil.
La resolución entre dos solutos que migran cerca (R5) es la siguiente:
Rs= ✓Nxa-\~x tJ 1
-(
4 k,'+1
a 1+ka'{:~J
en donde N es el número de platos teóricos para uno de los solutos; a es la selectividad; k.'y kb' son los factores de retención
para ambos solutos, respectivamente (~' > k,').
Ecuaciones similares, aunque no idénticas, dan valores de k' y Rspara solutos con carga eléctrica.
7600 (1053) Electroforesis Capilar/ Información General USP42
Optimización
Los principales parámetros a considerar en el desarrollo de separaciones por CECM son los parámetros instrumentales y de la
solución electrolítica.
PARÁMETROS
INSTRUMENTALES
Voltaje-El tiempo de separación es inversamente proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, un aumento en el voltaje
podría generar calor excesivo, aumentando los gradientes de temperatura y de viscosidad de la solución amortiguadora en la
sección transversal del capilar. Este efecto puede ser significativo con amortiguadores de alta conductividad, como por ejemplo
aquellos que contienen micelas. La disipación insuficiente del calor ensancha las bandas y disminuye la resolución.
Temperatura-Las variaciones en la temperatura del capilar afectan el coeficiente de partición del soluto entre la solución
amortiguadora y las micelas, la concentración micelar crítica y la viscosidad de la solución amortiguadora. Estos parámetros
contribuyen al tiempo de migración de los solutos. El uso de un buen sistema de enfriamiento mejora la reproducibilidad del
tiempo de migración para los solutos.
Capilar-Al igual que en la Electroforesis Capilarde Zona, la longitud y el diámetro interno de los capilares influyen sobre el
tiempo de análisis y la eficiencia de las separaciones. El aumento de la longitud efectiva y de la longitud total puede disminuir
los campos eléctricos, trabajando a un voltaje constante, aumenta el tiempo de migración y mejora la eficiencia de la separa-
ción. El diámetro interno controla la disipación de calor, para un amortiguador y campo eléctrico dados, y por consiguiente
ensancha las bandas de la muestra.
PARÁMETROS
DE LASOLUCIÓNELECTROLÍTICA
Tipo de Agente Tensoactivo y Concentración-El tipo de agente tensoactivo, al igual que la fase estacionaria en cromato-
grafía, afecta la resolución ya que modifica la selectividad de la separación. El log k' de un compuesto neutro aumenta lineal-
mente con la concentración de agente tensoactivo en la fase móvil. Cuando k' se acerca al valor de
AA
la resolución de la CECM alcanza su máximo. La modificación de la concentración del agente tensoactivo en la fase móvil cam-
bia la resolución.
pH de la Solución Amortiguadora-El pH no modifica el coeficiente de partición de los solutos no ionizados, pero puede
modificar el flujo electroosmótico en capilares sin recubrimiento. Una disminución en el pH de la solución amortiguadora dis-
minuye el flujo electroosmótico y por lo tanto aumenta la resolución de los solutos neutros en CECM, llevando a un aumento
del tiempo de análisis.
Disolventes Orgánicos-Se pueden agregar modificadores orgánicos (metano!, propano!, acetonitrilo, etc.) a la solución
electrolítica para mejorar la separación por CECM de compuestos hidrófobos. La adición de estos modificadores generalmente
disminuye el tiempo de migración y la selectividad de la separación. Dado que la adición de modificadores orgánicos afecta la
concentración micelar crítica, solo se puede usar una concentración dada de un agente tensoactivo con un cierto porcentaje
de un modificador orgánico para evitar inhibir o alterar adversamente la micelación, que daría como resultado la ausencia de
micelas y, por lo tanto, la ausencia de partición. La disociación de micelas en presencia de un alto contenido de disolvente
orgánico no siempre significa que la separación ya no será posible, dado que en ciertos casos, la interacción hidrófoba entre el
monómero tensoactivo iónico y los solutos neutros forman complejos solvófobos que se pueden separar electroforéticamente.
Aditivos para Separaciones Quirales-Para la separación de enantiómeros usando CECM, se incluye un selector quiral en
el sistema micelar, unido covalentemente al agente tensoactivo o agregado al electrolito de separación micelar. Las micelas
que tienen un grupo con propiedades de discriminación quiral incluyen sales, N-dodecanoil-L-aminoácidos, sales biliares, etc.
La resolución quiral también se puede lograr usando discriminadores quirales, como por ejemplo ciclodextrinas, agregados a
las soluciones electrolíticas que contienen agentes tensoactivos aquirales micelizados.
Otros Aditivos-La selectividad se puede modificar agregando productos químicos a la solución amortiguadora. También
se emplea la adición de varios tipos de ciclodextrinas al amortiguador para reducir la interacción de solutos hidrófobos con la
micela, aumentando la selectividad para este tipo de compuesto. La adición de sustancias modificadoras de las interacciones
soluto-micela por adsorción en las micelas se ha usado para mejorar la selectividad de las separaciones en CECM. Estos aditivos
pueden ser un segundo agente tensoactivo (iónico o no iónico) que da lugar a la formación de micelas mixtas, o cationes me-
tálicos que se disuelven en la micela y forman complejos de coordinación con los solutos.
Cuantificación
Las áreas de los picos se dividen por el tiempo de migración correspondiente para obtener el área corregida a fin de com-
pensar el cambio en el tiempo de migración de corrida a corrida, reduciendo la variación de la respuesta. Al dividir las áreas de
los picos por el tiempo de migración también se compensan las distintas respuestas de los constituyentes de la muestra que
USP42 InformaciónGeneral/ (1053) Electroforesis Capilar 7601
tienen diferentes tiempos de migración. Cuando se usa un estándar interno, hay que verificarque no enmascare ninguno de
los picos de la sustancia a examinar.
CÁLCULOS
A partir de los valores obtenidos, calcular el contenido del componente o componentes que se están determinando. Cuando
se indique, se calcula el porcentaje de uno o más componentes de la muestra a examinar determinando las áreas corregidas
del pico o picos como porcentaje de las áreas totales corregidas de todos los picos, excluyendo aquellos debidos a disolventes
o reactivos agregados (procedimiento de normalización). Se recomienda usar un sistema de integración automático (sistema
integrador o de adquisición y procesamiento de datos).
APTITUDDELSISTEMA
Con el fin de verificarel comportamiento del sistema de electroforesiscapilar, se usan parámetros de aptitud del sistema. La
elección de estos parámetros depende del tipo de electroforesiscapilar utilizado. Los parámetros incluyen los siguientes: factor
de retención k' usado únicamente para la CromatografíaElectrocinéticaMicelar, el número aparente de platos teóricos (N), el
factor de simetría (As)y la resolución (Rs). Es de destacar que las expresiones teóricas para N y Rsse han descrito en las seccio-
nes anteriores, pero las ecuaciones más prácticas que permiten la determinación de estos parámetros de aptitud usando los
electroferogramas se describen a continuación.
Número Aparente de PlatosTeóricos
El número aparente de platos teóricos (N) se puede calcular a partir de la fórmula:

N = 5,54 (~/wh)2
en donde ~ es el tiempo de migración o distancia a lo largo de la línea base entre el punto de inyección y la perpendicular
trazada desde el máximo del pico correspondiente al componente; y wh es el ancho del pico a la mitad de su altura.
Resolución
La resolución (R5) entre los picos de alturas similaresde dos componentes se puede calcular a partir de la fórmula:
Rs= 1, 18(1:iu- ~ 1)/(wh 1 + Wh2)
tR2 > ~1
en donde tR1 y t;u son los tiempos de migración o distancias a lo largo de la línea base, entre el punto de inyección y las per-
pendiculares trazadas desde el máximo de los dos picos adyacentes; y wh1y wh2 son los anchos de los picos a la mitad de su
altura.
Cuando sea apropiado, la resolución (Rs)también se puede calcular midiendo la altura del valle (H.) entre dos picos parcial-
mente resueltos en una preparación estándar, la altura del pico más pequeño (Hp), y calculando la relación pico a valle:
p/v = H/Hv
Factor de Simetría
Elfactor de simetría de un pico (As)se puede calcular usando la fórmula:

A, = W 0,05/2d
en donde w 0,05 es el ancho del pico a una vigésima parte de su altura; y d es la distancia entre la perpendicular trazada desde
el máximo del pico y el borde frontal del pico a una vigésima parte de su altura.
Otros parámetros de aptitud incluyen pruebas para la repetibilidad del área (desviación estándar de las áreas o del área/
tiempo de migración) y pruebas para la repetibilidad del tiempo de migración (desviación estándar del tiempo de migración).
La repetibilidad del tiempo de migración proporciona una prueba de la aptitud de los procedimientos del lavado del capilar.
Para evitar la falta de repetibilidad del tiempo de migración, una práctica alternativa consiste en usar un tiempo de migración
relativo al estándar interno.
RelaciónSeñal-Ruido
Una prueba para verificar la relación señal-ruido de una preparación estándar o para determinar el límite de cuantificación
puede ser útil para la determinación de sustancias relacionadas. El límite de detección y el límite de cuantificación correspon-
den a una relación señal-ruido de 3 y 1O, respectivamente. La relación señal-ruido (S/N) se calcula del siguiente modo:
S/N = 2H/h
en donde H es la altura del pico correspondiente al componente pertinente en el electroferograma obtenido con la solución de
referencia especificada, medido desde el máximo del pico hasta la línea base extrapolada de la señal observada sobre una dis-
tancia igual a veinte veces el ancho del pico a la mitad de su altura; y h es el intervalo de ruido de fondo en un electroferogra-
ma obtenido después de la inyección de un blanco, observado sobre una distancia igual a veinte veces el ancho del pico a la
mitad de su altura en el electroferograma obtenido con la solución de referencia prescrita y, de ser posible, situado igualmente
alrededor del lugar donde se encontraría este pico.
(1054) ARTÍCULOSOBTENIDOSPORBIOTECNOLOGÍA-
ISOELECTROENFOQUE
mediante isoelectroenfoque. Se lo ha armonizado con los capítulos correspondientes en la FarmacopeaJaponesa(JP)y la Far-
macopeaEuropea(EP).También se muestran otras pruebas de caracterización armonizadas en ArtículosObtenidospor Biotecno-
logía-Análisis de Aminoácidos(1052), ElectroforesisCapilar(1053), ArtículosObtenidospor Biotecnología-Mapeo de Péptidos
(1055), ArtículosObtenidospor Biotecnología-Electroforesisen Gel de Poliacrilamida(1056) y ArtículosObtenidospor Biotecnolo-
gía-Va/oración de ProteínasTotales(1057).
PRINCIPIOSGENERALES
El isoelectroenfoque (IEF,por su sigla en inglés) es un método de electroforesis que separa proteínas según sus puntos isoe-
léctricos. La separación se lleva a cabo en una placa de gel (slab) de poliacrilamida o agarosa que contiene una mezcla de
electrólitos anfotéricos (anfolitos). Cuando se aplica un campo eléctrico, los anfolitos migran en el gel, creando un gradiente
de pH. En algunos casos, se usan geles que contienen un gradiente de pH inmovilizado, preparado por incorporación de áci-
dos y bases débiles en regiones específicas de la red de gel durante su preparación. Cuando las proteínas aplicadas alcanzan la
zona del gel que tiene un pH igual a su punto isoeléctrico (pi), su carga se neutraliza y la migración cesa. Los gradientes se
pueden formar en diversos intervalos de pH, según la mezcla de anfolitos elegida.
ASPECTOSTEÓRICOS
Cuando una proteína está en la posición de su punto isoeléctrico, no tiene carga neta y el campo eléctrico no la puede mo-
ver en una matriz de gel. Sin embargo, se puede mover de dicha posición por difusión. El gradiente de pH obliga a la proteína
a mantenerse en la posición de su punto isoeléctrico, concentrándola; este efecto de concentración se denomina "enfoque". Al
aumentar el voltaje aplicado o reducir la carga de la muestra, hay una mejor separación de las bandas. El voltaje aplicado está
limitado por el calor generado, que necesita ser disipado. El uso de geles delgados y una placa de enfriamiento eficiente que
esté controlada por un circulador termostático evita que el gel se queme y permite un enfoque nítido. La separación se estima
determinando la diferencia de pi mínima (Llpl), que es necesaria para separar dos bandas vecinas, del siguiente modo:
Llpl= D( dpH/dx)
3
E(-dµ/dpH)
en donde D es el coeficiente de difusión de la proteína; dpH/dx es el gradiente de pH; E es la intensidad del campo eléctrico,
en voltios por centímetro y -dµ/dpH es la variación de la movilidad del soluto en función del pH en la región cercana al pi.
Como no se pueden alterar D y -dµ/dpH para una proteína dada, la separación se puede mejorar usando un intervalo de pH
más estrecho y aumentando la intensidad del campo eléctrico.
La resolución entre las bandas de proteínas en un gel de IEFpreparado con anfolitos transportadores puede ser muy buena.
Se puede lograr una mejor resolución usando gradientes de pH inmovilizados donde las sustancias amortiguadoras, que son
análogas a los anfolitos transportadores, se copolimerizan dentro de la matriz de gel. Las proteínas que muestran valores pi
que difieren tan solo en 0,02 unidades de pH se pueden resolver usando un gel preparado con anfolitos transportadores,
mientras que los gradientes de pH inmovilizados pueden resolver proteínas que difieran en aproximadamente 0,001 unidades
de pH.
ASPECTOSPRÁCTICOS
Desde un punto de vista operativo, se debe prestar especial atención a las características de la muestra o a su preparación.
La sal en una muestra puede ser un problema, y en lo posible es mejor preparar la muestra en agua desionizada o anfolitos al
2% usando diálisis o filtración con gel si fuera necesario. El tiempo necesario para completar el enfoque en capas delgadas de
gel de poliacrilamida se determina colocando una proteína coloreada (p. ej., hemoglobina) en distintas posiciones en la super-
ficie del gel y aplicando el campo eléctrico: el estado estacionario se alcanza cuando todas las aplicaciones dan un patrón de
banda idéntico. En algunos procedimientos, se determina que el enfoque está completo según el tiempo transcurrido después
de la aplicación de la muestra.
El gel de IEFse puede usar como prueba de identidad cuando el patrón de migración en el gel se compara con una prepara-
ción estándar adecuada y proteínas de calibración de IEF;el gel de IEFse puede usar como prueba de límite cuando la densi-
dad de una banda en IEFse compara subjetivamente con la densidad de las bandas que aparecen en una preparación están-
dar, o se puede usar como prueba cuantitativa cuando la densidad se mide usando un densitómetro o instrumento similar para
determinar la concentración relativa de proteína en las bandas, siempre que se valide.
APARATO
Un aparato para isoelectroenfoque consiste en un generador regulable capaz de proporcionar una corriente constante en
tensión, intensidad y potencia. Se utilizan en general potenciales de 2500 V, los cuales se consideran óptimos en ciertas condi-
ciones operativas. Se recomienda un suministro de hasta 30 W de potencia constante. El aparato incluye además una cámara
plástica rígida de isoelectroenfoque que contiene una placa enfriada de un material adecuado para sostener el gel; y una cu-
bierta plástica con electrodos de platino que se conectan al gel por medio de papel absorbente de largo, ancho y grosor ade-
cuados, impregnado con soluciones de electrólitos anódicos y catódicos.
ISOELECTROENFOQUE
EN GELESDE POLIACRILAMIDA:
PROCEDIMIENTO
DETALLADO
El siguiente método es una descripción detallada de un procedimiento de IEFen placas gruesas de gel de poliacrilamida, que
se utiliza a menos que la monografía indique algo diferente.
Preparaciónde los Geles
MOLDE
El molde está compuesto por una placa de vidrio (A) sobre la cual se coloca la película de poliéster (B) para facilitar la mani-
pulación del gel, uno o más espaciadores (C), una segunda placa de vidrio (D) y pinzas para mantener unida la estructura (ver
Figura 1).
Figura 1. Molde
GEL DE POLIACRILAMIDA
AL 7,5%
Disolver 29, 1 g de acrilamida y 0,9 g de metilenbisacrilamida en 100 mL de agua. Agregar la mezcla de anfolitos especifica-
da en la monografía individual a 2,5 volúmenes de esta solución y diluir hasta 1O volúmenes con agua. Mezclar cuidadosa-
mente y desgasificar la solución.
PREPARACIÓN
DELMOLDE
Colocar la película de poliéster sobre la placa de vidrio inferior, aplicar el espaciador, colocar la segunda placa de vidrio y las
pinzas. Antes de usar, colocar la mezcla en un agitador magnético y agregar 0,25 volúmenes de una solución de persulfato de
amonio de 100 g/L y 0,25 volúmenes de tetrametilendiamina. Llenar inmediatamente el espacio entre las placas de vidrio del
molde con la solución.
SOLUCIÓN FIJADORAPARAGEL DE POLIACRILAMIDA

DE ISOELECTROENFOQUE
Mezclar 35 g de ácido sulfosalicílico y 100 g de ácido tricloroacético en 1000 mL de agua.
SOLUCIÓN DE TINCIÓN COOMASSIEY SOLUCIÓN DE DECOLORACIÓN
Usar las mismas soluciones indicadas en el capítulo de información general ArtículosObtenidospor Biotecnología-Electrofore-
sis en Gel de Poliacrilamida(1056).
Procedimiento
Desarmar el Molde,y usando la película de poliéster, transferir el gel al soporte enfriado humedecido con unos pocos mL de
un líquido adecuado, procurando evitar que se formen burbujas de aire. Preparar las soluciones de prueba y las soluciones de
referencia según se especifica en la monografía individual. Colocar sobre el gel las tiras de papel para la aplicación de las mues-
tras, de aproximadamente 1 O mm x 5 mm, e impregnar cada una con las cantidades prescritas de las soluciones de prueba y
de referencia. Aplicar también la cantidad descrita de una solución de proteínas con puntos isoeléctricos conocidos como mar-
cadores de pH para calibrar el gel. En algunos procedimientos, el gel tiene ranuras moldeadas previamente donde se aplica la
solución de la muestra, en lugar de usar tiras de papel impregnadas. Cortar dos tiras de papel de la longitud del gel e impreg-
narlas con las soluciones de los electrólitos: ácida para el ánodo y alcalina para el cátodo. Las composiciones de las soluciones
del ánodo y el cátodo se proporcionan en cada monografía. Aplicar estos papeles absorbentes a cada lado del gel a varios mm
del borde. Colocar la cubierta de modo que los electrodos estén en contacto con los papeles absorbentes (con respecto a los
polos anódico y catódico). Proceder con el isoelectroenfoque aplicando los parámetros descritos en la monografía individual.
Desconectar la corriente cuando la migración de la mezcla de las proteínas estándar se haya estabilizado. Usando pinzas, reti-
rar las tiras de aplicación de las muestras y los dos papeles absorbentes de los electrodos. Sumergir el gel en la SoluciónFijadora
para Gel de Poliacri/amidade lsoelectroenfoque. Incubar con agitación suave a temperatura ambiente durante 30 minutos. Escu-
rrir la solución y agregar 200 mL de la Soluciónde Decoloración.Incubar con agitación durante 1 hora. Escurrir el gel y agregar
la Soluciónde TinciónCoomassie.Incubar durante 30 minutos. Decolorar el gel por difusión pasiva con la Soluciónde Decolora-
ción hasta que las bandas se visualicen bien contra un fondo transparente. Ubicar la posición e intensidad de las bandas en el
electroferograma, como se prescribe en cada monografía.
Variaciones en el Procedimiento Detallado (Sujetas a Validación)
Cuando se hace referencia al método general de isoelectroenfoque, se pueden hacer variaciones en la metodología o en el
procedimiento siempre que se validen. Estas variaciones incluyen el uso de geles previamente moldeados disponibles comer-
cialmente y de kits comerciales de tinción y decoloración; el uso de gradientes de pH inmovilizados; el uso de tubos de gel
(rod gels); y el uso de geles en placas de distintas dimensiones, incluyendo geles ultra delgados (0,2 mm); las variaciones en el
procedimiento de aplicación de la muestra, incluyendo distintos volúmenes de muestra o el uso de máscaras de aplicación de
la muestra o mechas absorbentes que no sean de papel; el uso de distintas condiciones de corrida, incluyendo variaciones en
el campo eléctrico dependiendo de las dimensiones del gel y el equipo y el uso de tiempos de migración fijos en lugar de la
interpretación subjetiva de la estabilidad de la banda; la inclusión de una etapa de pre-enfoque; el uso de instrumentación
automatizada; y el uso de geles de agarosa.
VALIDACIÓNDE LOSPROCEDIMIENTOS
DE ISOELECTROENFOQUE
Cuando se emplean métodos alternativos al procedimiento detallado es necesario validarlos. Se pueden usar los siguientes
criterios para validar la separación: la formación de un gradiente de pH estable de las características deseadas, evaluado, por
ejemplo, usando marcadores de pH coloreados con puntos isoeléctricos conocidos; la comparación con el electroferograma
suministrado con la sustancia química de referencia para la preparación a examinar; y cualquier otro criterio de validación pres-
crito en la monografía individual.
VARIACIONESESPECIFICADAS
DELMÉTODOGENERAL
Las variaciones del método general necesarias para el análisis de sustancias específicas pueden estar especificadas en detalle
en cada monografía. Las variaciones pueden incluir el agregado de urea en el gel (una concentración 3 M a menudo es satis-
factoria para mantener la proteína en solución pero se puede usar hasta 8 M). Algunas proteínas precipitan en su punto isoe-
léctrico. En este caso, se incluye la urea en la formulación del gel para mantener la proteína en solución. Si se usa urea, pueden
usarse solamente soluciones recién preparadas para evitar la carbamilación de la proteína. Otras variaciones incluyen el uso de
otros métodos de tinción y el uso de aditivos de geles tales como detergentes no iónicos (por ejemplo: octilglucósido) o deter-
gentes zwitteriónicos (por ejemplo: CHAPSo CHAPSO)y la adición de anfolitos a la muestra para evitar la aglomeración o
precipitación de las proteínas.
PUNTOSA CONSIDERAR
1. Las muestras se pueden aplicar a cualquier zona del gel, pero para proteger las proteínas de medios de pH extremo, las
muestras no se deben aplicar cerca de ninguno de los electrodos. Durante el desarrollo del método, el analista puede in-
tentar aplicar la proteína en tres posiciones del gel (p. ej., en el medio y en ambos extremos); el patrón de una proteína
aplicada en los extremos opuestos del gel puede no ser idéntico.
2. Si un gel se enfoca por mucho tiempo, puede ocurrir un fenómeno conocido como deriva catódica, donde el gradiente
de pH disminuye con el tiempo. Aunque no se entiende bien, la electroendosmosis y la absorción de dióxido de carbono
son factores que pueden favorecer la deriva catódica. La deriva catódica se observa cuando la proteína enfocada migra
hacia el extremo catódico del gel. Se pueden usar gradientes de pH inmovilizados para resolver este problema.
3. Es importante un enfriamiento eficiente (aproximadamente 4º) del lecho donde se encuentra el gel durante el enfoque.
Las intensidades de campo elevadas usadas durante el isoelectroenfoque pueden producir recalentamiento y afectar la ca-
lidad del gel enfocado.
(1055) ARTÍCULOSOBTENIDOSPORBIOTECNOLOGÍA-MAPEODE
PÉPTIDOS
mediante mapeo de péptidos. Se lo ha armonizado con los capítulos correspondientes en la FarmacopeaJaponesa(JP)y la
FarmacopeaEuropea(EP).Las partes del capítulo que no están armonizadas con las otras dos farmacopeas se indican con el
símbolo ♦• También se muestran otras pruebas de caracterización armonizadas en ArtículosObtenidospor Biotecnología-Análisis
de Aminoácidos(1052), ElectroforesisCapilar(1053), ArtículosObtenidospor Biotecnología-Jsoe/ectroenfoque (1054), ArtículosOb-
tenidospor Biotecnología-Electroforesisen Gelde Poliacrilamida(1056) y ArtículosObtenidospor Biotecnología-Valoración de Pro-
teínas Totales(1057).
INTRODUCCIÓN
El mapeo de péptidos es una prueba de identidad para proteínas, especialmente para aquellas obtenidas por tecnología de
ADN-r. Implica el tratamiento químico o enzimático de una proteína, con la formación de fragmentos peptídicos y seguido de
la separación e identificación de los fragmentos en una manera reproducible. Es una prueba de gran alcance capaz de identifi-
car cambios en aminoácidos individuales como resultado de acontecimientos tales como errores en la lectura de las secuencias
de ADN complementario (ADNc) o mutaciones puntuales. El mapeo de péptidos es un procedimiento comparativo ya que la
información obtenida, comparada con un Estándar de Referencia o Material de Referencia tratado de manera similar, confirma
la estructura primaria de la proteína, es capaz de detectar si ha habido alguna alteración en la estructura y demuestra la unifor-
midad del proceso y la estabilidad genética. Cada proteína presenta características exclusivas que se deben entender bien para
que el enfoque científico y analítico permita el desarrollo validado de un mapa peptídico que suministre suficiente especifici-
dad.
Este capítulo proporciona una ayuda detallada para la aplicación del mapeo de péptidos y su validación para caracterizar el
producto proteico deseado, con el fin de evaluar la estabilidad de la construcción de expresión de las células usadas para pro-
ductos de ADN recombinante; para evaluar la uniformidad del proceso global; y para evaluar la estabilidad del producto, ade-
más de asegurar la identidad del producto proteico o de detectar la presencia de una variante de la proteína. • El esquema de
la validación presentado establece diferencias entre la calificación del método en una etapa temprana del proceso reglamenta-
rio, al nivel de Nuevo Fármaco en Investigación (IND, por sus siglas en inglés) y la validación completa para apoyar una Solici-
tud de Nuevo Fármaco (NDA, por sus siglas en inglés), Solicitud de Licencia de Producto (PLA,por sus siglas en inglés), o Soli-
citud de Autorización para Comercialización (MM, por sus siglas en inglés). Los conceptos de validación descritos concuerdan
con el capítulo de información general Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos(1225) y con el documento de la Conferen-
cia Internacional sobre Armonización (ICH) sobre Validaciónde MétodosAnalíticos.•
ELMAPAPEPTÍDICO
El mapeo de péptidos no es un método general, pero implica el desarrollo de mapas específicos para cada proteína única. Si
bien la tecnología evoluciona rápidamente, existen ciertos métodos que están generalmente aceptados. Las variaciones de es-
tos métodos se indican, cuando corresponda, en las monograñas específicas.
Un mapa peptídico se puede considerar como la huella digital de una proteína y es el producto final de varios procesos quí-
micos que permiten una amplia comprensión de la proteína analizada. Se necesitan cuatro pasos principales para el desarrollo
del procedimiento: aislamiento y purificación de la proteína, si la proteína es parte de una formulación; escisión selectiva de los
enlaces peptídicos; separación cromatográfica de los péptidos; y análisis e identificación de los péptidos. Una muestra de prue-
ba se digiere y valora en paralelo con un Estándar de Referencia o Material de Referencia. La escisión completa de uniones
peptídicas es más factible con enzimas tales como endoproteasas (por ejemplo: tripsina) en lugar de reactivos de escisión quí-
mica. Un mapa debe contener suficientes péptidos para ser significativo. Por otro lado, si hay demasiados fragmentos, el mapa
puede perder su especificidad ya que de este modo es posible que muchas proteínas tengan los mismos perfiles.
Aislamientoy Purificación
El aislamiento y la purificación son necesarios para el análisis de fármacos a granel o en formas farmacéuticas que contienen
excipientes y proteínas transportadoras que interfieren y, cuando es necesario, se especifica en la monografía. Se debe validar
la recuperación cuantitativa de proteínas de la forma farmacéutica.
EscisiónSelectivade Uniones Peptídicas
La selección del enfoque usado para la escisión de uniones peptídicas depende de la proteína que se está analizando. Este
proceso de selección involucra la determinación del tipo de escisión a emplear-enzimática o química-y el tipo de agente de
escisión dentro de la categoría elegida. En la Tabla1 se muestran varios agentes de escisión y su especificidad. Esta no es una
lista completa y se ampliará a medida que se identifiquen otros agentes de escisión.
Tabla 1. Ejemplos de Agentes de Escisión
Tipo Agente Especificidad
Enzimático Tripsina, EC 3.4.21.4 Extremo C-terminal de Arg y Lys
Quimotripsina, EC 3.4.21.1 Extremo C-terminal de residuos hidrófobos (por ej., Leu, Met, Ala, aromáticos)
Pepsina, EC 3.4.23.1 y EC 3.4.23.2 Digestión no específica
Lisil endopeptidasa (endopeptidasa Lys-C), EC Extremo e-terminal de Lys
3.4.21.50
Glutamil endopeptidasa; (de la cepa 5. aureus Extremo e-terminal de Glu y Asp
V8), EC 3.4.21.19
Peptidil-Asp metaloendopeptidasa (endoprotei- Extremo N-terminal de Asp
nasa Asp-N), EC 3.4.24.33
Clostripaína, EC 3.4.22.8 Extremo C-terminal de Arg
Químico Bromuro de cianógeno Extremo e-terminal de Met
Ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico Extremo N-terminal de Cys
Ácido O-yodosobenzoico Extremo e-terminal de Trp y Tyr
Ácido diluido Asp y Pro
BNPS-Escatol Tr
TRATAMIENTOPREVIODE LA MUESTRA
Según el tamaño o la configuración de la proteína, se pueden usar distintos enfoques en el tratamiento previo de las mues-
tras. Para los anticuerpos monoclonales, es necesario separar las cadenas pesadas y livianas antes del mapeo. Si se usa tripsina
como agente de escisión para las proteínas que tengan una masa molecular mayor que 100 000 Da, se deben proteger los
residuos lisina por citraconilación o maleilación; de lo contrario, se generan demasiados péptidos.
TRATAMIENTOPREVIODELAGENTEDE ESCISIÓN
Podría ser necesario el tratamiento previo de purificación de los agentes de escisión, especialmente los agentes enzimáticos,
con el fin de asegurar la reproducibilidad del mapa. Por ejemplo, la tripsina usada como agente de escisión debe tratarse con
tosil-L-fenilalaninaclorometilcetona para inactivar la quimotripsina. Otros métodos, tales como la purificación de la tripsina por
HPLCo la inmovilización de enzimas en un soporte de gel, han resultado eficaces cuando se dispone solo de una pequeña
cantidad de proteína.
TRATAMIENTOPREVIODE LA PROTEÍNA
Bajo ciertas condiciones, puede ser necesario concentrar la muestra o separar la proteína de sustancias y estabilizadores usa-
dos en la formulación del producto, si éstos interfieren con el procedimiento de mapeo. Los procedimientos físicos usados para
el tratamiento previo pueden incluir la ultrafiltración, la cromatografía en columna y la liofilización.
Otros tratamientos previos tales como el agregado de agentes caotrópicos (por ejemplo, urea) se pueden usar para desple-
gar la proteína antes del mapeo. Para permitir que la enzima tenga acceso total a los sitios de escisión y que la proteína sufra
algún grado de desplegamiento, a menudo es necesario reducir y alquilar las uniones disulfuro antes de la digestión.
La digestión con tripsina puede introducir ambigüedades en el mapa tríptico debido a reacciones secundarias durante la di-
gestión, tales como escisión no específica, desamidación, isomerización de disulfuros, oxidación de residuos de metionina, o
formación de grupos piroglutámicos creados por desamidación de glutamina en el extremo N-terminal de un péptido. Ade-
más, se pueden producir picos por autohidrólisis de la tripsina. Sus intensidades dependen de la relación de la tripsina con
respecto a la proteína. Para evitar la autohidrólisis, se pueden preparar soluciones de proteasas a un pH que no sea óptimo
(por ejemplo, pH 5 para la tripsina), lo cual significa que la enzima solo se activa cuando se diluye con la solución amortigua-
dora de digestión.
ESTABLECIMIENTO
DE LASCONDICIONES ÓPTIMAS DE DIGESTIÓN
Los factores que afectan la integridad y eficacia de la digestión de las proteínas son aquellos que podrían afectar a cualquier
reacción química o enzimática.
pH-EI pH de la mezcla de digestión se determina empíricamente para asegurar el desempeño óptimo de un agente de
escisión dado. Por ejemplo, cuando se usa bromuro de cianógeno como agente de escisión, es necesario un ambiente alta-
mente ácido (por ejemplo: pH 2, ácido fórmico); sin embargo, al usar tripsina como agente de escisión, un ambiente levemen-
te alcalino (pH 8) es óptimo. Como regla general, el pH del entorno de la reacción no debe alterar la integridad química de la
proteína durante la digestión y no debe cambiar durante el transcurso de la reacción de fragmentación.
Temperatura-Una temperatura entre 25º y 37º es adecuada para la mayoría de las digestiones. La temperatura empleada
está prevista para minimizar las reacciones químicas secundarias. El tipo de proteína en análisis determinará la temperatura del
medio de reacción ya que algunas proteínas son más susceptibles a la desnaturalización a medida que aumenta la temperatura
de la reacción. Por ejemplo, la digestión de somatropina bovina recombinante se realiza a 4º ya que a temperaturas más altas
ésta precipita durante la digestión.
Tiempo-Si se dispone de suficiente muestra, se puede realizar un estudio en función del tiempo a fin de determinar el
tiempo óptimo para obtener un mapa reproducible y evitar una digestión incompleta. El tiempo de digestión varía de 2 a 30
horas. La reacción se detiene al agregar un ácido que no interfiera en el mapa tríptico, o por congelación.
Cantidad de Agente de Escisión-Si bien se usan cantidades de agente de escisión en exceso para lograr tiempos de di-
gestión razonablemente rápidos (es decir, 6 a 20 horas), la cantidad se minimiza para evitar su contribución al perfil del mapa
cromatográfico. Generalmente se usa una relación proteína-proteasa entre 20:1 y 200:1. Se recomienda agregar el agente de
escisión en dos o más etapas para optimizar la escisión. Sin embargo, el volumen final de la reacción se mantiene lo suficiente-
mente pequeño para facilitar el siguiente paso en el mapeo de péptidos-el paso de separación. Para determinar los artefactos
de digestión que podrían interferir con los análisis siguientes, se realiza una determinación con un blanco usando un control
de digestión con todos los reactivos excepto la proteína en análisis.
Separación Cromatográfica
Se usan muchas técnicas para separar péptidos para mapeos. La elección de la técnica depende de la proteína estudiada. Las
técnicas eficaces para la separación de péptidos se muestran en la Tabla2.
Tabla 2. Técnicas Usadas para la Separación de Péptldos
Cromatografía líquida de Alta Resoluciónen Fase Reversa{RP-HPLC)
Cromatografíade Intercambio lónico (IEC)
Cromatografía de Interacción Hidrófoba(HIC)
Electroforesisen Gel de Poliacrilamida(PAGE),sin desnaturalización
Electroforesisen Gel de Poliacrilamidacon Dodecilsulfatode Sodio (SDS-PAGE)
Tabla 2. Técnicas Usadas para la Separación de Péptldos (Continuación)

ElectroforesisCapilar (CE)
Cromatografía de Alto Voltaje en Papel (PCH\f, por sus siglas en inglés)
Electroforesisde Alto Voltaje en Papel (HVPE)
En esta sección, se describe un método de HPLCen fase reversa (RP-HPLC)ampliamente usado en la separación cromatográ-
fica.
La pureza de los disolventes y de las fases móviles es un factor crítico en la separación por HPLC.Se recomienda usar agua y
disolventes de grado HPLC,disponibles comercialmente, para la RP-HPLC.Los gases disueltos presentan un problema en los
sistemas de gradientes donde la solubilidad del gas en un disolvente puede ser menor en una mezcla que en un disolvente
solo. La desgasificación al vacío y la agitación por ultrasonido suelen ser útiles para la desgasificación. Cuando las partículas
sólidas presentes en los disolventes se introducen en el sistema HPLC,pueden dañar los sellos de las válvulas de las bombas u
obstruir la parte superior de la columna cromatográfica. Se recomienda filtrar antes y después del bombeo.
Columna Cromatográfica-La selección de una columna cromatográfica se determina empíricamente para cada proteína.
Las columnas con tamaño de poro de 100 Ao 300 Ay soporte de sílice pueden proporcionar una separación óptima. Para
péptidos más pequeños, los rellenos de columna de octilsilano unido químicamente a partículas de sílice totalmente porosas,
de 3 a 1O µm de diámetro (L7), y de octadecilsilano unido químicamente a micropartículas porosas de sílice o cerámica, de 3 a
1O µm de diámetro (L1), son más eficientes que el relleno de silano de butilo unido químicamente a partículas de sílice total-
mente porosas, de 5 a 1O µm de diámetro (L26)
Disolvente-El disolvente más comúnmente usado es agua con acetonitrilo como modificador orgánico al cual se le agrega
menos de O,1% de ácido trifluoroacético. Si fuera necesario, agregar alcohol isopropílico o alcohol n-propílico para solubilizar
los componentes de digestión, siempre que el agregado no aumente excesivamente la viscosidad de los componentes.
Fase Móvil-Se usan fases amortiguadas que contienen fosfato para flexibilizar la selección de las condiciones de pH ya que
los cambios en el pH en el intervalo de 3,0 a 5,0 mejoran la separación de los péptidos que contienen residuos ácidos (por
ejemplo, ácido glutámico y ácido aspártico). También se han usado fosfatos de sodio o potasio, acetato de amonio, ácido fos-
fórico y un pH entre 2 y 7 (o superior para soportes a base de polímeros), con gradientes de acetonitrilo. También se usa a
menudo ácido trifluoroacético que contiene acetonitrilo.
Selección del Gradiente-Los gradientes pueden ser lineales, no lineales o incluir funciones escalonadas. Se recomienda un
gradiente gradual a fin de separar mezclas complejas. Los gradientes se optimizan para resolver claramente uno o dos picos
que serán los picos "marcadores" de la prueba.
Selección !socrática-Los sistemas isocráticos de HPLCque usan una única fase móvil se emplean por su conveniencia de
uso y las respuestas mejoradas del detector. A menudo es difícil de establecer la composición óptima de una fase móvil para
obtener una resolución clara de cada pico. En sistemas isocráticos de HPLCno deben usarse fases móviles donde un cambio
leve en la relación de sus componentes o en el pH tenga un efecto importante en los tiempos de retención de los picos del
mapa peptídico.
Otros Parámetros-Generalmente es necesario controlar la temperatura de la columna para lograr una buena reproducibi-
lidad. Las velocidades de flujo para las fases móviles varían de O,1 a 2,0 mL por minuto y la detección de péptidos se realiza
con un detector UVentre 200 nm y 230 nm. Se han usado otros métodos de detección (por ejemplo: derivatización postco-
lumna), pero no son tan robustos ni tan versátiles como la detección UV.
Aptitud del Sistema-El apartado Aptitud del Sistemaen Cromatografía(621) suministra un medio experimental para medir
el desempeño global del método de prueba. El criterio de aceptación para la aptitud del sistema depende de la identificación
de los parámetros críticos de prueba que afectan la interpretación y aceptación de los datos. Estos parámetros críticos también
son criterios que controlan la digestión y el análisis de péptidos. Un indicador de que se alcanzó el punto final de digestión
deseado es la comparación con un Estándar de Referencia o un Material de Referencia, el cual se trata exactamente como el
artículo en análisis. El uso de un Estándar de Referencia USP paralelamente con la proteína en análisis es crítico en el desarrollo
y establecimiento de los límites de aptitud del sistema. Además, se debe incluir el cromatograma de una muestra con el Están-
dar de Referencia USP o Material de Referencia a los efectos de comparación adicionales. Otros indicadores pueden incluir la
inspección visual de la solubilidad de la proteína o el péptido, la ausencia de proteína intacta, o la medición de respuestas de
un péptido dependiente de la digestión. Los parámetros críticos de aptitud del sistema para el análisis de péptidos dependerá
de cada modo de separación y detección de péptidos y de los requisitos de análisis de datos.
Cuando se usa el mapeo de péptidos como prueba de identificación, los requisitos de aptitud del sistema para los péptidos
identificados incluyen la selectividad y la precisión. En este caso, al igual que cuando se realiza la identificación de variantes de
proteínas, la identificación de la estructura primaria de los fragmentos peptídicos en el mapa peptídico suministra una verifica-
ción de la estructura primaria conocida y la identificación de las variantes de las proteínas por comparación con el mapa peptí-
dico del Estándar de Referencia USP o Material de Referencia para la proteína especificada. El método de elección para la deter-
minación de la resolución de péptidos es el uso de un Estándar de Referencia USP o Material de Referencia digerido para una
proteína dada. Para el análisis de una variante de una proteína, se puede usar una mezcla caracterizada de una variante y un
estándar de referencia, especialmente si la variante del péptido se encuentra en una región menos resuelta del mapa. El índice
de uniformidad del patrón puede ser simplemente el número de péptidos principales detectados. La uniformidad del patrón
de péptidos se puede definir mejor por la resolución de los picos de los péptidos. Los parámetros cromatográficos-tales como
la resolución pico a pico, el ancho máximo de los picos, el área de los picos, los factores de asimetría de los picos y la eficiencia
USP42 Información General/ (1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología 7 609
de la columna-se pueden usar para definir la resolución peptídica. Dependiendo de la proteína en análisis y el método de
separación que se use, pueden ser necesarios requisitos de resolución de un solo péptido o de múltiples péptidos.
El análisis repetido del digerido del Estándar de Referencia USP o Material de Referencia para la proteína en análisis produce
medidas de precisión y recuperación cuantitativa. La recuperación de los péptidos identificados generalmente se puede deter-
minar por el uso de estándares peptídicos internos o externos. La precisión se expresa como la desviación estándar relativa
(RSD). Es de esperar diferencias en la recuperación y precisión de los péptidos identificados; por lo tanto, hay que establecer
los límites de aptitud del sistema tanto para la recuperación como para la precisión de los péptidos identificados. Estos límites
son exclusivos para cada proteína y se especificarán en las monografías individuales.
La comparación visual de los tiempos de retención relativos, las respuestas de los picos (el área del pico o la altura del pico),
el número de picos y el patrón de elución global se completa inicialmente. Luego se complementa y respalda con el análisis
matemático de los cocientes de respuesta de los picos y el perfil cromatográfico de una mezcla 1 :1 (v/v) de la muestra y el
digerido del Estándar de Referencia USP o Material de Referencia. Si todos los picos en el digerido de la muestra y en el digeri-
do del Estándar de Referencia USP o Material de Referencia tienen los mismos tiempos de retención relativos y cocientes de
respuesta de los picos, se confirma la identidad de la muestra en análisis.
Si los picos que inicialmente eluyeron con tiempos de retención relativos significativamente diferentes luego se observan co-
mo picos únicos en la mezcla 1 :1, la diferencia inicial sería una indicación de la variabilidad del sistema. Sin embargo, si se
observan picos separados en la mezcla 1 :1, esto indicaría la no equivalencia de los péptidos en cada pico. Si un pico en la
mezcla 1 :1 es significativamente más ancho que el pico correspondiente en la muestra y el digerido del Estándar de Referencia
USP o Material de Referencia, podría indicar la presencia de péptidos diferentes. Se ha propuesto y aplicado un software de
reconocimiento de patrones para el análisis de los datos del mapeo de péptidos, pero los problemas relacionados con la valida-
ción del software impiden que pueda usarse en una prueba farmacopeica en el futuro cercano. Se han usado otros enfoques
automatizados que emplean fórmulas matemáticas, modelos y reconocimiento de patrones. Se han propuesto enfoques tales
como, por ejemplo, la identificación automatizada de compuestos por espectroscopia IRy la aplicación de análisis espectral UV
con arreglo de diodos para la identificación de péptidos. Estos métodos tienen limitaciones debido a resoluciones inadecuadas,
elución conjunta de fragmentos o diferencias absolutas en las respuestas de los picos entre el Estándar de Referencia USP o
Material de Referencia y los fragmentos de la muestra.
La comparación numérica de los tiempos de retención y áreas o alturas de los picos se puede realizar para un grupo seleccio-
nado de picos relevantes correctamente identificados en los mapas peptídicos. Las áreas de los picos se pueden calcular usan-
do un pico como referencia interna con relativamente poca variación, teniendo en cuenta que la integración del área del pico
es sensible a la variación de la línea base y posiblemente introduzca un error en el análisis. De modo alternativo, se puede
calcular la altura porcentual del pico de cada péptido con respecto a la suma de todas las alturas de los picos para la muestra
de prueba. El porcentaje se compara luego con el del pico correspondiente del Estándar de Referencia USP o Material de Refe-
rencia. La posibilidad de autohidrólisis de la tripsina se controla mediante la producción de un mapa peptídico blanco que es el
mapa obtenido cuando la solución blanco se trata con tripsina.
El requisito mínimo para la calificación de un mapeo de péptidos es un procedimiento de prueba aprobado que incluya la
aptitud del sistema como control de prueba. En general, en una etapa temprana del proceso reglamentario, basta con la califi-
cación del mapeo de péptidos para una proteína. A medida que avanza el proceso de aprobación reglamentario de la proteí-
na, calificaciones adicionales de la prueba pueden incluir una validación parcial del procedimiento analítico con el fin de asegu-
rar que el método funciona en la forma planeada en el desarrollo del mapa peptídico para la proteína especificada.
Análisis e Identificación de Péptidos
Esta sección es una guía para el uso del mapeo de péptidos durante la investigación que respalda las solicitudes reglamenta-
rias.
El uso de un mapa peptídico como herramienta cualitativa no exige la caracterización completa de los picos de péptidos
individuales. Sin embargo, la validación del mapeo de péptidos en respaldo de las solicitudes reglamentarias exige la caracteri-
zación rigurosa de cada pico en el mapa peptídico. Los métodos para caracterizar picos varían desde .la secuenciación N-termi-
nal de cada pico seguida por un análisis de aminoácidos hasta el uso de espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés).
A los efectos de la caracterización, cuando se usan la secuenciación N-terminal y el análisis de aminoácidos, la separación
analítica se realiza a mayor escala. Ya que el aumento en escala puede afectar la resolución de los picos de péptidos, es necesa-
rio asegurar con datos empíricos que no haya pérdida de resolución debida al aumento en escala. Se recogen los eluatos co-
rrespondientes a picos de péptidos específicos, se concentran al vacío y se cromatografían nuevamente, según sea necesario. El
análisis de aminoácidos de los fragmentos puede estar limitado por el tamaño del péptido. Si el N-terrninal está bloqueado,
puede ser necesario desbloquearlo antes de la secuenciación. También se puede usar la secuenciación (-terminal de las proteí-
nas de manera conjunta con la digestión por carboxipeptidasa y espectrometría de masas por tiempo de vuelo con ionización
por desorción láser asistida por matrices (MALDI-TOFMS, por sus siglas en inglés) para su caracterización.
El uso de MS para la caracterización de fragmentos peptídicos se hace por infusión directa de péptidos aislados o por el uso
en línea de cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS, por sus siglas en inglés) para el análisis estructural. En
general, incluye el electrospray y analizadores MALDI-TOFasí como también el bombardeo atómico rápido (FAB,por sus siglas
en inglés). También se ha usado la MS en serie para secuenciar una proteína modificada y para determinar la modificación
761 O (1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología/ InformaciónGeneral USP42
aminoacídica producida. La comparación de los espectros de masas de los digeridos antes y después de la reducción propor-
ciona un método para asignar las uniones disulfuro a los diferentes péptidos que contienen sulfhidrilos.
Si hay regiones de la estructura primaria que no se demuestran claramente en el mapa peptídico, podría ser necesario reali-
zar un mapa peptídico secundario. El objetivo de un método validado de caracterización de una proteína a través del mapeo
de péptidos es conciliar y explicar al menos el 95% de la composición teórica de la estructura de la proteína.
• ELUSO DELMAPEODE PÉPTIDOSPARALA EVALUACIÓNDE ESTABILIDAD

GENÉTICA
Se puede usar un mapa peptídico validado para evaluar la integridad de la secuencia primaria prevista de un producto pro-
teíco (es decir, su estabilidad genética). También se puede usar para determinar la uniformidad lote a lote del proceso de pro-
ductos biotecnológicos. Además, el desempeño de la expresión de la proteína en el sistema de producción se evalúa mejor a
través del mapeo de péptidos de la proteína expresada. Los mapas peptídicos de proteínas producidos en diversas etapas de la
expresión de la proteína, incluyendo un punto más allá del tiempo normal de expresión de la proteína, comparados con los de
un Estándar de Referencia USP o Material de Referencia, sirven para evaluar la estabilidad genética del sistema de expresión en
función del tiempo.
Pueden surgir variantes de las secuencias de las proteínas a partir de una variación genética en el ADN (mutación puntual) o
como un error en la traducción. El mejor enfoque es un mapa peptídico validado para la detección de variantes de proteínas.
Sin embargo, se deben considerar las limitaciones inherentes del mapeo de péptidos. La detección de una variante estructura-
da es posible únicamente si la variante peptídica correspondiente es fácil de aislar y caracterizar. Para establecer estabilidad
genética es necesario usar una batería de métodos bioquímicos, siempre que las variantes tengan propiedades distintas de las
de la proteína "normal" .•
•VALIDACIÓN
FactoresCríticos
La validación del mapeo de péptidos exige el diseño de un protocolo que describa detalladamente el experimento a realizar
y los criterios para la aceptación del mapa. Los criterios para la aceptación del mapeo incluyen límites de detección, especifici-
dad, linealidad, intervalo, exactitud, precisión y estabilidad de los reactivos. La reproducibilidad del mapa peptídico es un ele-
mento crítico en su utilización como prueba de identidad y para confirmar la estabilidad genética. Se analizarán aquellos as-
pectos técnicos del mapeo de péptidos que influencian la reproducibilidad del mapa.
El ajuste de los límites, con respecto a la cuantificación (área o altura del pico) e identificación (tiempos de retención) para el
grupo seleccionado de picos relevantes se basa en observaciones empíricas. Estos límites detectan diferencias significativas en-
tre la muestra y el Estándar de Referencia USP o Material de Referencia dentro de una serie de análisis.
Otro problema crítico es la recuperación de péptidos y su efecto sobre la determinación y reproducibilidad de las áreas de
los picos y en el establecimiento de criterios de aceptación. Los criterios de recuperación tratan todos los aspectos de metodo-
logía de la prueba, desde la digestión hasta las condiciones cromatográficas. La determinación de la recuperación de péptidos
incluye el análisis cuantitativo de aminoácidos, el agregado de cantidades conocidas (spike addition), el marcado radioactivo y
la sumatoria UV.Una recuperación general de aproximadamente el 80% se considera satisfactoria. La recuperación de pépti-
dos individuales es más problemática y se maneja caso por caso. Los factores críticos de la validación de un mapa peptídico
son los siguientes.
Procedimientos de Prueba Documentados por Escrito-Estos procedimientos incluyen una descripción detallada del mé-
todo analítico en donde se definen los reactivos, equipos, preparación de la muestra, método de análisis y análisis de los datos.
Protocolo de Validación-Se prepara un protocolo que incluye un procedimiento para la validación de la prueba.
Criterio de Aceptación-El criterio puede ser mínimo en las primeras etapas, pero debe definirse mejor a medida que pro-
gresan los estudios de validación.
Informe de los Resultados-En los resultados del estudio de validación se documentan los parámetros analíticos indicados
en el protocolo de validación.
Revalidación del Procedimiento de la Prueba-Si el método empleado requiere alteraciones que podrían afectar los pará-
metros analíticos previamente evaluados en la validación, es necesario volver a validar el procedimiento de la prueba. Si hay
cambios significativos en el procesamiento del artículo, en los laboratorios que realizan el análisis, en la formulación de los pro-
ductos a granel o terminados y en cualquier otro parámetro importante, se requerirá la revalidación de los métodos.
Requisitos
PRECISIÓN
Precisión lntra Prueba-Es una medida de la reproducibilidad del mapeo de péptidos. Los dos pasos críticos en el mapeo
de péptidos son la fragmentación (es decir, digestión) y la separación de péptidos. La precisión es aceptable cuando los tiem-
pos de retención absolutos y las áreas de los picos relativos son constantes de corrida a corrida y la variación promedio en el
tiempo de retención es pequeña en relación con la del pico de referencia interno seleccionado. La reproducibilidad del mapa
se puede mejorar si se usa un horno con columna con control de temperatura, si se equilibra exhaustivamente el sistema antes
de comenzar la prueba, si primero se realiza una determinación con un blanco (mezcla de digerido control sin proteína) para
minimizar los "efectos de la primera corrida" y si se intercala periódicamente un digerido del Material de Referencia o del Es-
tándar de Referencia USP con las muestras de prueba para evaluar la variación sistemática de la cromatografía.
Los criterios para validar el paso de fragmentación son similares a los descritos a continuación para la separación de pépti-
dos, pero se cumplen para pruebas consecutivas de una serie de digeridos preparados por separado de la proteína en análisis.
Los criterios para la validación del paso de separación de péptidos incluyen lo siguiente:
1. La desviación estándar promedio de los tiempos de retención absolutos de todos los picos principales para un conjunto
de pruebas consecutivas del mismo digerido no excede un criterio de aceptación especificado.
2. La desviación estándar promedio del área de pico absoluta para todos los picos principales totalmente resueltos no exce-
de un porcentaje especificado.
Precisión lnter Pruebas-Esta es una medida de la reproducibilidad del mapeo de péptidos cuando la prueba se realiza en
distintos días, por distintos analistas, en distintos laboratorios, con reactivos o enzimas de distintos proveedores o con distintos
lotes del mismo proveedor, con instrumental diferente, en columnas de fabricación distinta o columnas de igual fabricación
pero de lotes distintos y en columnas individuales de la misma fabricación y el mismo lote. Si bien sería preferible, desde una
perspectiva científica, validar el efecto de todas estas variables sobre la precisión, un enfoque práctico es validar la prueba
usando aquellas variables que sean más probables de encontrar en condiciones operativas. Se pueden incluir variables adicio-
nales cuando sea necesario.
El diseño experimental permite al analista realizar comparaciones usando tiempos de retención de picos y áreas de picos que
se expresan con relación a un pico de referencia interno altamente reproducible dentro del mismo cromatograma. El área de
pico relativa se expresa como el cociente entre el área del pico y el área del pico de referencia interna. El tiempo de retención
relativo se puede expresar como la diferencia entre el tiempo de retención absoluto y el tiempo de retención del pico de refe-
rencia. El uso de valores relativos elimina la necesidad de realizar correcciones separadas por diferencias de volumen de un
inyector a otro, por unidades de medición de las áreas de los picos, por dimensiones de la columna y por volúmenes de espa-
cio muerto de los instrumentos. Se espera que la variabilidad en los tiempos de retención y en las áreas de los picos para los
experimentos de Precisiónlnter Pruebassea ligeramente mayor que la variabilidad observada para la Precisiónlntra Prueba.
ROBUSTEZ
La composición de la FaseMóvil, la calidad de la proteasa o la pureza de los reactivos químicos, la variación y edad de la
columna y la estabilidad del digerido son todos factores que podrían afectar el desempeño general de la prueba y su reprodu-
cibilidad. Se evalúan las tolerancias para cada parámetro clave y se establecen los límites de la línea de base en caso de que la
prueba se use para la liberación rutinaria de lotes.
Fase Móvil-La composición de la FaseMóvil se optimizará para obtener la máxima resolución de péptidos en todo el perfil
de elución. Se prefiere un equilibrio entre la resolución óptima y la reproducibilidad general. Un pH más bajo podría mejorar la
separación entre los picos pero podría acortar la vida de la columna, dando como resultado una falta de reproducibilidad. Los
mapas peptídicos a un pH por encima o por debajo del pH del procedimiento se comparan con el mapa peptídico obtenido al
pH del procedimiento y se observa si hay diferencias significativas; también se revisan con respecto a los criterios de aceptación
establecidos en el protocolo de validación.
Calidad de la Proteasa o Pureza de los Reactivos Químicos-Se prepara y digiere una muestra del Estándar de Referencia
USP o Material de Referencia para la proteína en análisis con distintos lotes del agente de escisión. En los cromatogramas para
cada digerido se comparan las áreas de los picos, su forma y el número de picos. Se puede aplicar el mismo procedimiento a
otras sustancias químicas o tratamientos previos usados durante la preparación de la muestra, como por ejemplo los reactivos
reductores y de carboximetilación.
Consideraciones de la Columna-La variabilidad entre una columna y otra, incluso dentro de un mismo lote, puede afec-
tar el desempeño de la columna en el desarrollo de mapas peptídicos. El tamaño de la columna también puede producir dife-
rencias significativas. Se digiere un Estándar de Referencia USP o Material de Referencia de la proteína de prueba y el digerido
se cromatografía en distintos lotes de columna de un mismo fabricante. Luego se evalúa el perfil de elución general, los tiem-
pos de retención, la resolución de selectividad y la recuperación de los mapas. Para evaluar la robustez de la columna durante
toda su vida útil, se debe realizar una prueba de mapeo de péptidos en distintas columnas y variar significativamente el núme-
ro de inyecciones (por ejemplo, de 1O inyecciones a 250 inyecciones). Los mapas resultantes se comparan buscando diferen-
cias significativas en el ensanchamiento de los picos, área de los picos y resolución general. A medida que la columna envejece,
podría observarse un aumento en la contrapresión que podría afectar los mapas peptídicos.
Una precaución razonable en el uso de columnas de mapeo de péptidos es seleccionar columnas alternativas, en caso de
que las columnas originales no estén disponibles o dejen de fabricarse. Realizar una prueba de mapeo de péptidos usando co-
lumnas equivalentes de distintos fabricantes y examinar los mapas. Las diferencias en la forma y el tamaño de las partículas, el
tamaño y volumen de los poros, la carga de carbono y el recubrimiento exhaustivo (end-capping) pueden dar lugar a diferen-
cias significativas en los tiempos de retención, la selectividad del perfil de elución, la resolución y la recuperación. Podría ser
necesario hacer ligeras modificaciones en el perfil del gradiente para lograr mapas equivalentes cuando se usen columnas de
distintos fabricantes. [NOTA-Debe considerarse la equivalencia entre la instrumentación usada para la validación de la prueba
7612 (1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología / InformaciónGeneral USP42
y para la prueba de control de calidad de rutina. Podría ser preferible usar el mismo sistema HPLCpara todas las aplicaciones.
De lo contrario, se determina la equivalencia de los sistemas, lo cual puede exigir algunos cambios en las condiciones de la
prueba cromatográfica.]
Estabilidad del Digerido-Se evalúa el tiempo de almacenamiento de un digerido y las condiciones de almacenamiento
antes de la cromatografía. Se almacenan varias alícuotas de un mismo digerido en distintas condiciones de almacenamiento y
se cromatografían. Estos mapas luego se evalúan para buscar diferencias significativas.
REPRODUCIBILIDAD
Se repite la determinación de varios de los parámetros indicados anteriormente usando el mismo Estándar de Referencia USP
o Material de Referencia y la misma muestra de prueba en al menos dos laboratorios distintos y por dos analistas, equipados
con sistemas HPLCsimilares. Luego se evalúan los mapas peptídicos generados para ver si existen diferencias significativas.•
ELECTROFORESISEN GELDE POLIACRILAMIDA
Cambio en la redacdón:
e8 ERR(Ol.feb-2018)
INTRODUCCIÓN
Alcance
La electroforesis en gel de poliacrilamida se utiliza para la caracterización cualitativa de proteínas en preparaciones biológi-
cas, para controles de pureza y para determinaciones cuantitativas.
Propósito
La electroforesis analítica en gel es un método apropiado con el que se identifica y evalúa la homogeneidad de las proteínas
en las preparaciones farmacéuticas. El método generalmente se utiliza para la estimación de masas moleculares de subunida-
des de proteínas y para la determinación de composiciones de subunidades de proteínas purificadas. Los geles y reactivos listos
para usar se encuentran disponibles comercialmente y se pueden usar en lugar de los descritos en este capítulo, siempre y
cuando ofrezcan resultados equivalentes y cumplan con los requisitos de validez que se citan en Validaciónde la Prueba.
CARACTERÍSTICADE
S LOSGELESDE POLIACRILAMIDA
Las propiedades de tamizado de los geles de poliacrilamida se establecen mediante la red tridimensional de fibras y poros
que se forma cuando la bisacrilamida bifuncional se entrecruza en forma adyacente a las cadenas de poliacrilamida. La polime-
rización por lo regular se cataliza con un sistema generador de radicales-libres compuesto de persulfato de amonio y
N,N,N ;N ~tetrametiletilendiamina (TEMED).
A medida que aumenta la concentración de acrilamida de un gel, disminuye el tamaño efectivo de sus poros. El tamaño
efectivo del poro de un gel se define operacionalmente por sus propiedades de tamizado, es decir, por la resistencia que im-
parte a la migración de macromoléculas. Existen límites con respecto a las concentraciones de acrilamida que se pueden usar.
En concentraciones altas de acrilamida, los geles se rompen con mucha más facilidad y son difíciles de manipular. A medida
que disminuye el tamaño del poro de un gel, disminuye la velocidad de migración de una proteína a través del gel. Al ajustar
el tamaño de poro de un gel, mediante la modificación de la concentración de acrilamida, se puede optimizar la resolución del
método para un producto proteico dado. Por lo tanto, un gel se caracteriza físicamente por su composición de acrilamida y
bisacrilamida.
Además de la composición del gel, el estado de la proteína es un factor importante de la movilidad electroforética. En el
caso de las proteínas, la movilidad electroforética depende del valor pK de los grupos cargados y del tamaño de la molécula.
Está influenciada por el tipo, la concentración y el pH de la solución amortiguadora; por la temperatura y la intensidad del
campo; y por la naturaleza del material de soporte.
ELECTROFORESIS
DESNATURALIZANTE
EN GELDE POLIACRILAMIDA
El método citado a manera de ejemplo se limita al análisis de polipéptidos monoméricos con un intervalo de masa de
14 000 a -100 000 Da. Es posible ampliar este intervalo de masa mediante diversas técnicas (por ejemplo, sistemas de geles de
gradiente o de soluciones amortiguadoras particulares). Por ejemplo, los geles de tricina-dodecilsulfato de sodio (SOS, por sus
siglas en inglés) emplean tricina en lugar de glicina (en el método descrito en este capítulo) como el ión trasero en la solución
amortiguadora de corrida para electroforesis, pueden separar proteínas muy pequeñas y péptidos por debajo de 1O000-
15 000 Da.
La electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida usando glicina SOS (SDS-PAGE)es el modo más común de electro-
foresis para evaluar la calidad farmacéutica de productos proteicos y es el objeto de estudio del método de ejemplo. Típica-
mente, la electroforesis analítica de proteínas se realiza en geles de poliacrilamida bajo condiciones que aseguran la disociación
de las proteínas en sus subunidades polipeptídicas individuales y que minimizan la aglomeración de estas subunidades. El de-
tergente SOS fuertemente aniónico se usa más comúnmente en combinación con calor para disociar las proteínas antes de
que se coloquen en el gel. Los polipéptidos desnaturalizados se unen al SOS, adquieren carga negativa y exhiben una relación
carga-masa estable, sin importar el tipo de proteína. Como la cantidad de SOS unido casi siempre es proporcional a la masa
molecular del polipéptido y es independiente de su secuencia, los complejos SDS-polipéptido migran a través de los geles de
poliacrilamida cuyas movilidades dependen del tamaño del polipéptido.
Las movilidades electroforéticas de todos los complejos de detergente-polipéptido resultantes adoptan la misma relación
funcional con sus masas moleculares. Los complejos SOS migran de modo previsible hacia el ánodo, observándose que los
complejos de baja masa molecular migran más rápido que los complejos más grandes. La masa molecular de una proteína se
puede estimar por su movilidad relativa en SDS-PAGEcalibrada y la intensidad de una banda única con respecto a otras ban-
das no deseadas en un gel de este tipo puede ser una medición de la pureza.
Sin embargo, las modificaciones de la cadena polipeptídica, tales como la N-glicosilación o la 0-glicosilación, pueden cam-
biar la masa molecular aparente de una proteína, debido a que el SOS no se une a un grupo glicosídico de la misma manera
que a un polipéptido; por lo tanto, no se mantiene una relación entre masa y carga uniforme.
Dependiendo del grado de glicosilación y de otras modificaciones postraduccionales, la masa molecular aparente de proteí-
nas puede no reflejar con exactitud la masa de la cadena polipeptídica.
Condiciones Reductoras
Las subunidades de polipéptidos y la estructura tridimensional por lo general se mantienen en las proteínas mediante unio-
nes disulfuro. Uno de los objetivos del análisis SDS-PAGEen condiciones reductoras es romper esta estructura por reducción de
las uniones disulfuro. La desnaturalización y disociación completa de proteínas por tratamiento con 2-mercaptoetanol (2-ME) o
ditiotreitol (DTT) despliega el esqueleto polipeptídico, formándose luego un complejo con SOS. Con estas condiciones, la ma-
sa molecular de las subunidades de polipéptidos puede ser calculada de manera razonable por regresión lineal (o, de manera
más cercana mediante regresión no lineal) en presencia de estándares adecuados de masa molecular.
Condiciones No Reductoras
Para algunos análisis, no es conveniente la disociación completa de la proteína en subunidades peptídicas. En ausencia de
tratamiento con agentes reductores tales como 2-ME o DTT,los enlaces disulfuro covalentes permanecen intactos, preservan-
do la forma oligomérica de la proteína. Los complejos de SOS-proteína oligomérica migran más lentamente que sus subunida-
des SDS-polipéptido. Además, las proteínas no reducidas no se pueden saturar por completo con SOS y, por lo tanto, no pue-
den unirse al detergente en una relación de masa constante. Asimismo, las uniones disulfuro dentro de la cadena limitan la
forma molecular generalmente de una manera que reduce el radio de Stokes de la molécula, reduciendo así la masa molecular
aparente, M,. Esto hace que las determinaciones de masa molecular de estas moléculas mediante SDS-PAGEsean menos senci-
llas que los análisis de polipéptidos completamente desnaturalizados, porque es necesario que las proteínas estándar y las pro-
teínas desconocidas estén presentes en configuraciones similares para que las comparaciones sean válidas.
CARACTERÍSTICAS
DE UNA ELECTROFORESIS
EN GELCON SISTEMAAMORTIGUADOR
DISCONTINUO
El método electroforético más popular para la caracterización de mezclas complejas de proteínas usa un sistema amortigua-
dor de pH discontinuo que incluye dos geles contiguos pero diferenciados: un gel de resolución o separador (inferior) y un gel
concentrador (superior). Los dos geles están conformados con diferentes porosidades, pH y fuerzas iónicas. Además, se usan
distintos iones móviles en el gel y en los amortiguadores de pH de los electrodos. La discontinuidad del amortiguador actúa
para concentrar muestras de gran volumen en el gel concentrador, mejorando así la resolución. Cuando se aplica electricidad,
se produce una caída de voltaje a través de la solución de muestra que conduce a las proteínas hacia el gel concentrador. Los
iones de glicinato del amortiguador de pH de los electrodos siguen a las proteínas hacia el gel concentrador. Se forma rápida-
mente un frente móvil con los iones de cloruro de alta movilidad adelante y los iones relativamente lentos de glicinato atrás. Se
forma un gradiente de alto voltaje localizado entre los frentes de iones delanteros y traseros, haciendo que los complejos SOS-
proteína se acumulen en una zona delgada (concentrado) y migren entre las fases de cloruro y glicinato. Dentro de un amplio
límite, sin importar la altura de la muestra aplicada, todos los complejos SOS-proteína se condensan en una región muy estre-
cha e ingresan al gel separador como una zona delgada, bien definida, de alta densidad proteica. El gel concentrador, de gran-
des poros, no retrasa la migración de la mayoría de las proteínas y sirve principalmente como un medio anticonvectivo. En la
interfase de los geles concentrador y separador, las proteínas experimentan un marcado incremento en el retardo debido al
tamaño restrictivo del poro del gel separador y a la discontinuidad de la solución amortiguadora, lo cual también contribuye al
enfoque de las proteínas. Una vez en el gel separador, las proteínas continúan siendo ralentizadas por el tamizado de la matriz.
Los iones de glicinato sobrepasan a las proteínas, que se mueven entonces en un espacio de pH uniforme formado por tris(hi-
droximetil)aminometano (Tris)y glicina. El tamizado molecular hace que los complejos SDS-polipéptido se separen según sus
masas moleculares.
PREPARACIÓN
DE GELESVERTICALES
DE SDS-POLIACRILAMIDA
CON SISTEMA
AMORTIGUADORDISCONTINUO
Esta sección describe la preparación de geles usando instrumentos particulares. Esto no se aplica a los geles preformados. En
el caso de los geles preformados u otros equipos disponibles comercialmente, se deben usar las instrucciones del fabricante
como guía.
Se recomienda el uso de reactivos comerciales que se hayan purificado en solución. Cuando este no sea el caso, y cuando la
pureza de los reactivos no sea suficiente, se aplica un pretratamiento. Por ejemplo, cualquier solución suficientemente impura
como para requerir filtración debería también desionizarse con una resina de lecho mixto (intercambio aniónico-catiónico) pa-
ra eliminar el ácido acn1ico y otros productos de degradación cargados. Cuando se almacenan de acuerdo con las recomenda-
ciones, las soluciones de acrilamida/bisacrilamida y persulfato sólido se mantienen estables durante periodos prolongados.
Soluciones Madre de Gel
SOLUCIÓN DE ACRILAMIDA-BISACRILAMIDA
AL 30%
Preparar una solución que contenga 290 g de acrilamida y 1Og de metilen-bisacrilamida por litro de agua. Filtrar.
SOLUCIÓNDE PERSULFATO
DE AMONIO
Preparar una pequeña cantidad de solución, con una concentración de 100 g/L de persulfato de amonio. [NOTA-El persulfa-
to de amonio proporciona los radicales libres que impulsan la polimerización de la acrilamida y la bisacrilamida. Debido a que
el persulfato de amonio se descompone rápidamente, se deben preparar nuevas soluciones a diario.]
TEMED
Usar un reactivo de grado electroforético.
SOLUCIÓNDE SOS
Se trata de una solución de 100 g/L de sds de grado electroforético.
SOLUCIÓNAMORTIGUADORA
1,5 M
Disolver 90,8 g de Tris en 400 mL de agua. Ajustar el pH a 8,8 con ácido clorhídrico y diluir hasta 500,0 mL con agua.
1M
Disolver 60,6 g de Tris en 400 mL de agua. Ajustar el pH a 6,8 con ácido clorhídrico y diluir hasta 500,0 mL con agua.
Ensamblado del Casete para Moldeo del Gel
Limpiar las dos placas de vidrio (con un tamaño de, p. ej., 1O cm x 8 cm), el peine de politetrafluoroetileno, los dos espacia-
dores y la tubería de caucho de silicona (p. ej., 0,6 mm de diámetro x 35 cm largo) con detergente suave; enjuagar minuciosa-
mente con agua, seguida de alcohol deshidratado y dejar que las placas se sequen a temperatura ambiente. Lubricar los espa-
ciadores y la tubería con grasa no siliconada. Colocar los espaciadores a lo largo de los dos lados cortos de la placa de vidrio, a
2 mm de los bordes y a 2 mm del lado largo correspondiente a la parte inferior del gel. Comenzar a colocar las tuberías sobre
la placa de vidrio, utilizando un espaciador como guía. Cuidadosamente doblar la tubería por debajo del espaciador y seguir el
lado largo de la placa de vidrio. Mientras se sostiene la tubería con un dedo por el lado largo, doblar nuevamente la tubería y
colocarla sobre el segundo lado corto de la placa de vidrio, usando el espaciador como guía. Colocar la segunda placa de vi-
drio perfectamente alineada y mantener unido el molde haciendo presión con la mano.
Colocar dos pinzas en cada uno de los dos lados cortos del molde. Colocar cuidadosamente cuatro pinzas sobre el lado lar-
go del molde para el gel, formando así su parte inferior. Verificarque la tubería corra a lo largo del borde de las placas de
vidrio y que no se haya salido al momento de colocar las pinzas. El molde del gel está ahora listo para el vertido del gel.
Preparación del Gel
En un sistema de gel de SDS-poliacrilamida con sistema amortiguador discontinuo, se recomienda verter el gel separador,
dejar que solidifique, y luego verter el gel concentrador, debido a que los geles tienen diferente composición de acrilamida-
bisacrilamida, solución amortiguadora y pH.
PREPARACIÓN
DELGELSEPARADOR
En un matraz Erlenmeyer, preparar el volumen adecuado de solución que contenga la concentración deseada de acrilamida
para el gel separador usando los valores proporcionados según se indica en la Tabla 1. Mezclar los componentes en el orden
que se muestra. Cuando corresponda, antes de agregar la Soluciónde Persulfatode Amonio y el TEMED,filtrar la solución si
fuera necesario al vacío a través de un filtro de membrana de acetato de celulosa (con un diámetro de poro de 0,45 µm).
Mantener la solución al vacío mientras se agita la unidad de filtración por rotación suave hasta que no se formen más burbujas
en la solución. Agregar cantidades adecuadas de Soluciónde Persulfatode Amonio y de TEMED,según se indica en la Tabla 1;
agitar por rotación suave y verter inmediatamente en el espacio entre las dos placas de vidrio del molde. Dejar espacio sufi-
ciente para el gel concentrador (el largo de los dientes del peine más 1 cm). Con una pipeta de vidrio cónico, cubrir cuidado-
samente la solución con isobutanol saturado con agua. Dejar el gel en posición vertical, a temperatura ambiente, para permitir
la polimerización.
Tabla 1. Preparación del Gel Separador
Volumen (ml) de Componentes por Volumen del Molde del Gel Indicado DebaJo
Componentes de la solución 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml
Acrilamida al 6%
Aqua 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 15,9 21,2 26,5
Soluciónde Acrilamida-Bisacrilamida
al 30% 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 10,0
SoluciónAmortiquadora 1,5 M 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
Soluciónde SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
Soluciónde Persulfatode Amonio 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04
Acrilamida al 8%
Agua 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2
Soluciónde Acrilamida-Bisacri/amida
al 30% 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3
SoluciónAmortiquadora 1,5 M 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
Soluciónde SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03
Acrilamida al 10%
Agua 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8
al 30% 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7
SoluciónAmortiguadora 1,5 M 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
Soluciónde SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
Acrilamida al 12%
Tabla 1. Preparación del Gel Separador (Continuación)

Volumen (ml) de Componentes por Volumen del Molde del Gel Indicado Debafo
Componentes de la solución 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml
Aqua 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5
al30% 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0
Soluciónde SOS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
Acrilamida al 14%
Agua 1,4 2,7 3,9 5,3 6,6 8,0 10,6 13,8
al30% 2,3 4,6 7,0 9,3 11,6 13,9 18,6 23,2
Soluciónde SOS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
Acrilamida al 15%
Agua 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5
al 30% 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0 25,0
SoluciónAmortiauadora 7,5 M 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
Soluciónde SOS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
PREPARACIÓN
DELGELCONCENTRADOR
Una vez finalizada la polimerización (aproximadamente 30 minutos), retirar el isobutanol y lavar la superficie del gel varias
veces con agua para quitar la capa de isobutanol y toda la acrilamida no polimerizada. Drenar tanto líquido como sea posible
de la parte superior del gel y luego quitar el agua remanente usando el borde de una toalla de papel.
En un matraz Erlenmeyer, preparar el volumen adecuado de solución con la concentración deseada de acrilamida, usando
los valores proporcionados en la Tabla2. Mezclar los componentes en el orden que se muestra. Cuando corresponda, antes de
agregar la Soluciónde Persulfatode Amonioy el TEMED,filtrar la solución si fuera necesario al vacío a través de un filtro de
membrana de acetato de celulosa (con un diámetro de poro de 0,45 µm). Mantener la solución al vacío mientras se agita la
unidad de filtración por rotación suave hasta que no se formen más burbujas en la solución. Agregar cantidades adecuadas de
Soluciónde Persulfatode Amonioy de TEMED,según se indica en la Tabla2. Agitar por rotación suave y verter inmediatamente
en el espacio entre las dos placas de vidrio del molde, directamente sobre la superficie del gel separador polimerizado. Introdu-
cir inmediatamente un peine de politetrafluoroetileno limpio en la solución de gel concentrador, con cuidado para no atrapar
burbujas de aire. Agregar más solución de gel concentrador para llenar completamente los espacios del peine. Colocar el gel
en posición vertical y dejar polimerizar a temperatura ambiente.
Tabla 2. Preparación del Gel Concentrador
Volumen (ml) de Componentes por Volumen del Molde del Gel Indicado De-
bajo
Componentes de la solución 1 ml 2ml 3ml 4ml 5ml 6ml 8ml 10ml
Agua 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8
al 30% 0,17 0,33 0,5 0,67 0,83 1,0 1,3 1,7
SoluciónAmortiauadora 7,OM 0,13 0,25 0,38 0,5 0,63 0,75 1,0 1,25
Soluciónde SOS 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1
TEMED 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,008 0,01
Preparación de la Muestra
A menos que se especifique de otro modo en la monografía específica, las muestras pueden prepararse de la siguiente ma-
nera:
DE MUESTRAPARASDS-PAGE(CONCENTRADA)
Disolver 1,89 g de Tris, 5,0 g de lauril sulfato de sodio y 50 mg de azul de bromofenol en agua. Agregar 25,0 mL de glicerol
y diluir hasta 100 mL con agua. Ajustar el pH a 6,8 con ácido clorhídrico y diluir hasta 125 mL con agua.
DE MUESTRAPARASDS-PAGEEN GELESEN CONDICIONESREDUCTORAS(CONCENTRADA)
Disolver 3,78 g de Tris, 10,0 g de SOS y 100 mg de azul de bromofenol en agua. Agregar 50,0 mL de glicerol y diluir hasta
200 mL con agua. Agregar 25,0 mL de 2-ME. Ajustar a un pH de 6,8 con ácido clorhídrico y diluir hasta 250,0 mL con agua.
Alternativamente, se puede usar DTT como agente reductor en lugar de 2-ME. En este caso, preparar la solución amortiguado-
ra de muestra según se indica a continuación: Disolver 3,78 g de Tris, 10,0 g de SDS y 100 mg de azul de bromofenol en
agua. Agregar 50,0 mL de glicerol y diluir hasta 200 mL con agua. Ajustar a un pH de 6,8 con ácido clorhídrico y diluir hasta
250,0 mL con agua. Inmediatamente antes de usar, agregar DTT hasta una concentración final 100 mM.
DE CORRIDAPARASDS-PAGE
Disolver 151,4 g de Tris, 721,0 g de glicina y 50,0 g de lauril sulfato de sodio en agua, y diluir hasta 5000 mL con el mismo
disolvente. Inmediatamente antes de usar, diluir 1O veces su volumen con agua y mezclar. Medir el pH de la solución diluida.
El pH es entre 8, 1 y 8,8.
SOLUCIÓN MUESTRA(CONDICIONES NO REDUCTORAS)
Mezclar volúmenes iguales de: una mezcla de agua más la preparación o las soluciones de referencia y la SoluciónAmortigua-
dora de Muestrapara SDS-PAGE (Concentrada).
SOLUCIÓNMUESTRA(CONDICIONES REDUCTORAS)
Mezclar volúmenes iguales de: una mezcla de agua más la preparación o las soluciones de referencia y la SoluciónAmortigua-
dora de Muestra para SDS-PAGE para CondicionesReductoras(Concentrada)que contenga 2-ME (o DTT) como agente reductor.
La concentración prescrita en la monografía puede variar dependiendo de la proteína y del método de tinción.
Tratamiento de la muestra: Mantener durante 5 minutos en un baño de agua en ebullición o en un bloque de calentamiento
ajustado a 100º y luego enfriar. (Tener en cuenta que la temperatura y el tiempo pueden variar en la monografía debido a que
se puede presentar la escisión de proteína durante el tratamiento con calor.)
Montaje del Gel en el Aparato de Electroforesis y Separación Electroforética
Una vez completada la polimerización (aproximadamente 30 minutos), retirar cuidadosamente el peine de politetrafluoroeti-
leno. Enjuagar inmediatamente los pocillos con agua o con la SoluciónAmortiguadorade Corridapara SDS-PAGE para eliminar
toda la acrilamida no polimerizada. Si fuera necesario, enderezar los dientes del gel concentrador con una aguja hipodérmica
roma conectada a una jeringa. Quitar las pinzas de uno de los lados cortos, retirar cuidadosamente la tubería y volver a colocar
las pinzas. Proceder de manera similar con el otro lado corto. Quitar la tubería de la parte inferior del gel. Montar el gel en el
aparato de electroforesis. Agregar las soluciones amortiguadoras de electroforesis a los recipientes superior e inferior. Quitar
cualquier burbuja que haya quedado atrapada en el fondo del gel, entre las placas de vidrio. Esta eliminación se realiza mejor
con una aguja hipodérmica roma conectada a una jeringa. Nunca se debe correr previamente el gel antes de cargar las mues-
tras porque esto destruiría la discontinuidad de los sistemas amortiguadores de pH. Antes de cargar la muestra, enjuagar cui-
dadosamente cada pocillo con SoluciónAmortiguadorade Corridapara SDS-PAGE. Preparar las soluciones de prueba y de refe-
rencia en la solución amortiguadora de muestra recomendada y tratar según se indica en la monografía individual. Aplicar el
volumen adecuado de cada solución a los pocillos de gel concentrador.
Comenzar la electroforesis usando las condiciones recomendadas por el fabricante del equipo. Los fabricantes de equipos
para SDS-PAGEpueden proveer geles de diferentes áreas y espesores, y el tiempo de corrida y la corriente o el voltaje de la
electroforesis puede variar para lograr la separación óptima. Verificar que el frente de tinción se mueva hacia el gel separador.
Detener la electroforesis cuando la tinción esté cerca del fondo del gel. Retirar el montaje de gel del aparato y separar cuidado-
samente las placas de vidrio. Quitar los espaciadores, cortar y desechar el gel concentrador y proceder de inmediato con la
tinción.
4
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Los geles de gradiente (geles separadores) se preparan con una concentración creciente de acrilamida desde la parte supe-
rior hacia la parte inferior. La preparación de los geles en gradiente requiere de un aparato de formación de gradiente. Se en-
cuentran disponibles comercialmente geles en gradiente listos para usar con protocolos recomendados específicos.
Los geles en gradiente ofrecen algunas ventajas sobre los geles de concentración fija. Algunas proteínas que co-migran en
los geles de concentración fija pueden resolverse dentro de los geles en gradiente. Durante la electroforesis las proteínas mi-
gran hasta que el tamaño de poro detiene su avance y, por ende, se presenta un efecto concentrador, lo que resulta en bandas
más pronunciadas. De acuerdo con la Tabla3, los geles en gradiente también permiten la separación de un rango más amplio
de masas moleculares de proteína que los geles de concentración fija.
La Tabla3 provee composiciones sugeridas del gradiente lineal, relacionando el rango de concentraciones de acrilamida con
los rangos moleculares de proteína apropiados. Se debe tener en cuenta que se pueden preparar otras formas de gradiente (p.
ej., cóncava) para aplicaciones específicas.
Tabla 3. Porcentajes de Gradiente de Acrllamlda Recomendados para los
PesosMo le cu Iares d e Protemas
' Esperad os
Acrllamlda Rango de Proteínas
(%) (kDa)
5-15 20-250
5-20 10-200
10-20 10-150
8-20 8-150
Los geles en gradiente también se usan para la determinación de masas moleculares y la determinación de pureza de las pro-
teínas.
DETECCIÓN
DE PROTEÍNASEN GELES
La tinción con Coomassie y plata son los métodos de tinción más comunes y se describen en mayor detalle a continuación.
Se encuentran disponibles otros colorantes, métodos de detección y kits comerciales. Por ejemplo, las tinciones fluorescentes
se visualizan usando un generador de imágenes fluorescente y a menudo proveen una respuesta lineal a lo largo de un amplio
rango de concentraciones de proteína-por lo regular con diversos órdenes de magnitud, dependiendo de la proteína.
La tinción de Coomassie tiene un nivel de detección de proteína de aproximadamente 1-1 O µg de proteína por banda. La
tinción con plata es el método más sensible para teñir proteínas en geles y es posible detectar una banda que contenga 10-
100 ng. Dichas cifras se consideran robustas en el contexto de estos geles. La sensibilidad mejorada en uno o dos órdenes de
magnitud ha sido referida en la bibliografía relacionada.
La tinción de Coomassie responde de manera más lineal que la tinción con plata, aunque la respuesta y el intervalo depen-
den de la proteína y del tiempo de desarrollo. Tanto la tinción con Coomassie como con plata pueden ser menos reproduci-
bles si la tinción se detiene de manera subjetiva, es decir, cuando el analista considera que la tinción es satisfactoria. Es impor-
tante usar rangos dinámicos amplios de proteínas de referencia debido a que ayudan a evaluar la sensibilidad y la linealidad
intra-experimental. Todas las etapas de la tinción del gel se llevan a cabo usando guantes, a temperatura ambiente, con agita-
ción suave (p. ej., en la plataforma de un agitador orbital) y usando cualquier recipiente apropiado.
Reactivosde Tinción
SOLUCIÓNDE DECOLORACIÓN
Preparar una mezcla de 1 volumen de ácido acético glacial, 4 volúmenes de metano! y 5 volúmenes de agua.
SOLUCIÓNDE TINCIÓN DE COOMASSIE
Preparar una solución de 1,25 g/L de azul ácido 83 en Soluciónde decoloración.Filtrar.
SOLUCIÓNFIJADORA
Agregar 0,27 mL de formaldehído a 250 mL de metanol y diluir con agua hasta 500,0 ml.
REACTIVODE NITRATODE PLATA
Agregar, gota a gota y mezclando, 8 mL de una solución de 200 g/L de nitrato de plata a una mezcla de 3 mL de amoníaco
concentrado y 40 mL de hidróxido de sodio 1 M. Diluir hasta 200 mL con agua.
SOLUCIÓNDE DESARROLLO
Diluir 2,5 ml de una solución de 20 g/L de ácido cítrico y 0,27 ml de formaldehído hasta 500,0 mL con agua.
SOLUCIÓNDE DETENCIÓN
Una solución de ácido acético al 10% (v/v).
Tinción de Coomassie
Sumergir el gel en un gran exceso de Soluciónde Tinciónde Coomassiey dejar en reposo durante al menos 1 hora. Retirar la
solución de tinción.
Decolorar el gel con un gran exceso de Soluciónde Decoloración.Cambiar la Soluciónde Decoloraciónvarias veces, hasta que
las bandas de proteína teñidas se distingan claramente sobre un fondo transparente. Cuanto más completamente se decolore
el gel, menor será la cantidad de proteína detectable por el método. Se puede lograr una decoloración más rápida incluyendo
unos pocos gramos de resina de intercambio aniónico o una esponja pequeña en la Soluciónde Decoloración.[NOTA-Las solu-
ciones de alcohol-ácido usadas en este procedimiento no fijan completamente las proteínas en el gel. Esto puede conducir a
pérdidas de algunas proteínas de baja masa molecular durante la tinción y decoloración de geles delgados. La fijación perma-
nente se puede lograr dejando el gel en reposo en una mezcla de 1 volumen de ácido tricloroacético, 4 volúmenes de metanol
y 5 volúmenes de agua durante 1 hora antes de sumergirla en la Soluciónde Tinciónde Coomassie.]
Tinción con Plata
Sumergir el gel en un gran exceso de SoluciónFijadoray dejar en reposo durante 1 hora. Desechar la SoluciónFijadora,agre-
gar SoluciónFijadorarecién preparada, e incubar durante al menos 1 hora, o durante toda la noche si fuera conveniente. Dese-
char la SoluciónFijadoray lavar el gel en un gran exceso de agua durante 1 hora. Embeber el gel durante 15 minutos en una
solución de glutaraldehído al 1o/o(v/v). Lavar el gel dos veces durante 15 minutos en un gran exceso de agua. Embeber el gel
en Reactivode Nitrato de Plata recién preparado durante 15 minutos en la oscuridad. Lavar el gel tres veces durante 5 minutos
en un gran exceso de agua. Sumergir el gel durante aproximadamente 1 minuto en Soluciónde Desarrollohasta obtener una
tinción satisfactoria. Detener el desarrollo mediante incubación en la Soluciónde detencióndurante 15 minutos. Enjuagar el gel
con agua.
REGISTRODE RESULTADOS
Los geles deben fotografiarse o barrerse mientras aún estén húmedos o después de un proceso de secado apropiado. En la
actualidad, se encuentran disponibles comercialmente sistemas de barrido de geles con un software de análisis de datos para
fotografiar y analizar el gel húmedo inmediatamente.
Dependiendo del método de tinción empleado, los geles se tratan de manera ligeramente distinta. Para la tinción de Coo-
massie, después del paso de decoloración, dejar el gel en reposo en una solución de glicerol de 100 g/L durante al menos 2
horas (es posible incubar durante toda la noche). Para la tinción con plata, agregar al enjuague final un paso de 5 minutos de
inmersión en una solución de glicerol de 20 g/L.
Uno de los métodos para obtener una documentación permanente consiste en secar los geles de poliacrilamida teñidos con
SOS. Este método con frecuencia resulta en la ruptura del gel durante el secado entre películas de celulosa.
Sumergir dos láminas de película de celulosa porosa en agua, e incubar durante 5-1 O minutos.
Colocar una de las láminas en un marco de secado. Levantar el gel cuidadosamente y colocarlo sobre la lámina de película
de celulosa. Eliminar todas las burbujas de aire atrapadas y verter algunos mL de agua alrededor de los bordes del gel. Colocar
la segunda lámina por encima y eliminar todas las burbujas de aire atrapadas. Completar el montaje del marco de secado.
Colocar en una estufa o dejar a temperatura ambiente hasta que esté seco.
DETERMINACIÓN
DE LA MASA MOLECULAR
Las masas moleculares de las proteínas se determinan por comparación de sus movilidades con las de varias proteínas mar-
cadoras de peso molecular conocido. Para la calibración de geles, se encuentran disponibles mezclas de proteínas previamente
teñidas y sin teñir con masas moleculares conocidas con precisión, combinadas para una tinción uniforme. Están disponibles
7620 (1056) Artículos Obtenidos por Biotecnología/ Información General USP 42
en diversos rangos de masas moleculares. Las soluciones madre concentradas de proteínas de masa molecular conocida se di-
luyen en el amortiguador del pH de muestra apropiado y se cargan en el mismo gel que la muestra de proteína a estudiar.
Inmediatamente después de correr el gel, marcar la posición del colorante de rastreo de azul de bromofenol para identificar
el borde frontal de iones electroforéticos. Esto se puede realizar cortando muescas en los bordes del gel, o insertando en el gel,
en el frente de tinción una aguja empapada en tinta China. Después de la tinción, medir las distancias de migración de cada
banda de proteína (marcadoras y desconocidas) desde la parte superior del gel separador. Dividir la distancia de migración de
cada proteína por la distancia recorrida por el colorante de rastreo. Las distancias de migración normalizadas se denominan
movilidades relativas de las proteínas (con respecto al frente de tinción) o R,. Construir una gráfica del logaritmo de las masas
moleculares relativas (M,) de los estándares de proteínas en función de los valores RF.Las masas moleculares desconocidas se
pueden estimar mediante análisis de regresión lineal (con mayor exactitud, mediante análisis de regresión no lineal) o por in-
terpolación a partir de las curvas de logaritmo M, en función de RFsiempre que los valores obtenidos para las muestras desco-
nocidas se coloquen a lo largo de la parte lineal de la gráfica.
VALIDACIÓNDE LA PRUEBA
La prueba no es válida a menos que el rango de resolución esperado del gel haya sido demostrado mediante la distribución
de los marcadores de masa molecular apropiados, p. ej., a lo largo del 80% de la longitud del gel. La separación obtenida para
las bandas de proteína esperadas debe presentar una relación lineal entre el logaritmo de la masa molecular y el valor RF.Si la
gráfica tiene una forma sigmoidea, entonces, en los cálculos, solamente se pueden usar los datos de la región lineal de la cur-
va. Se pueden especificar requisitos de validación adicionales con respecto a la muestra de prueba en las monografías indivi-
duales.
Asimismo, se debe validar la sensibilidad. Un control de proteína de referencia correspondiente al límite de concentración
deseado que se corre en paralelo con las muestras de prueba puede servir como verificación de la aptitud del sistema del expe-
rimento.
CUANTIFICACIÓN
DE IMPUREZAS
La SDS-PAGEa menudo se usa como una prueba de límite para impurezas. Cuando las impurezas se cuantifican por normali-
zación con respecto a la banda principal usando un densitómetro de integración o análisis de imágenes, se debe validar la
linealidad de las respuestas. Se debe tener en cuenta que, dependiendo del método de detección y de la proteína, según se
describió en la introducción de la sección Detecciónde Proteínasen Geles,el rango lineal puede variar pero puede ser evaluado
dentro de cada corrida usando una o más muestras de control que contengan un rango apropiado de concentraciones de pro-
teínas.
Cuando se especifica el límite de impurezas en la monografía individual, los analistas deben preparar una solución de refe-
rencia correspondiente a ese nivel de impureza, mediante la dilución de la solución de prueba. Por ejemplo, cuando el límite es
5%, la solución de referencia sería una dilución 1:20 de la solución de prueba. Ninguna impureza (cualquier banda que no sea
la banda principal) en el electroferograma obtenido con la solución de prueba puede ser más intensa que la banda principal
obtenida con la solución de referencia.
En condiciones validadas, las impurezas se pueden cuantificar por normalización con respecto a la banda principal, usando
un densitómetro de integración, o mediante análisis de imagen.
VALORACIÓNDE PROTEÍNAS
TOTALES
Este capítulo proporciona guías y procedimientos utilizados para la caracterización de artículos obtenidos por biotecnología.
Se lo ha armonizado con los capítulos correspondientes en la Farmacopea Japonesa(JP)y la FarmacopeaEuropea(EP).También
se muestran otras pruebas de caracterización armonizadas en ArtículosObtenidospor Biotecnología-Análisis de Aminoácidos
(1052), ElectroforesisCapilar(1053), ArtículosObtenidospor Biotecnología-/soelectroenfoque (1054), Artículosobtenidospor Bio-
tecnología-Mapeode Péptidos(1055) y ArtículosObtenidospor Biotecnología-Electroforesis en Gelde Poliacri/amida(1056).
INTRODUCCIÓN
Los siguientes procedimientos se proporcionan para ilustrar la determinación del contenido de proteínas totales en las pre-
paraciones farmacopeicas. Otras técnicas, tales como HPLC,también son aceptables si se demuestra la recuperación total de
proteínas. Muchos de los métodos de valoración de proteínas totales descritos a continuación se pueden realizar satisfactoria-
mente con equipos comerciales. [NOTA-Siempre que se necesite agua, usar agua destilada.]
Método 1
La proteína en solución absorbe la luz UV a una longitud de onda de 280 nm debido a la presencia de aminoácidos aromáti-
cos, principalmente tirosina y triptófano. Esta propiedad es el fundamento del Método 7. La determinación de proteínas a 280
nm es principalmente una función del contenido de tirosina y triptófano de la proteína. Si la solución amortiguadora usada
para disolver la proteína tiene una absorbancia elevada en relación a la del agua, hay una sustancia interferente que se puede
compensar cuando el espectrofotómetro se ajusta a cero con la solución amortiguadora. Si la interferencia da como resultado
una absorbancia muy alta, los resultados podrían afectarse. Además, en concentraciones bajas, la proteína puede ser absorbida
en la cubeta, reduciendo así el contenido en solución. Esto puede evitarse preparando muestras más concentradas, o usando
un detergente no iónico en la preparación. [NOTA-Mantener la Soluciónde Prueba,la SoluciónEstándary la solución amorti-
guadora a la misma temperatura durante la prueba.]
SOLUCIÓNDE PRUEBA
Disolver una cantidad adecuada de la proteína en análisis en la solución amortiguadora apropiada para obtener una solución
con una concentración de 0,2 a 2 mg por ml.
SOLUCIÓNESTÁNDAR
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, preparar una solución del Estándar de Referencia USP
o material de referencia para la proteína en análisis en la misma solución amortiguadora y a la misma concentración que la
Soluciónde Prueba.
PROCEDIMIENTO
Determinar concomitantemente las absorbancias de la SoluciónEstándary de la Soluciónde Pruebaen celdas de cuarzo a una
longitud de onda de 280 nm con un espectrofotómetro adecuado (ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857)), usando la solu-
ción amortiguadora como blanco. Para obtener resultados exactos, la respuesta debe ser lineal para el intervalo de concentra-
ciones de proteína a ser valoradas.
DISPERSIÓNDE LUZ
La exactitud de la determinación espectroscópica UV de la proteína puede disminuir si la muestra dispersa la luz. Si las pro-
teínas en la solución existen como partículas de tamaño comparable con la longitud de onda de la luz de medición (250 a 300
nm), la dispersión del haz de luz produce un aumento aparente en la absorbancia de la muestra. Para calcular la absorbancia a
280 nm causada por la dispersión de luz, hay que determinar las absorbancias de la Soluciónde Pruebaa longitudes de onda
de 320; 325; 330; 335; 340; 345 y 350 nm. Usando el método de regresión lineal, trazar la gráfica del logaritmo de la absor-
bancia observada en función del logaritmo de la longitud de onda y determinar la curva estándar que mejor se ajuste a los
puntos graficados. A partir de la gráfica así obtenida, extrapolar el valor de absorbancia causada por la dispersión de luz a 280
nm. Restar la absorbancia por dispersión de luz debido a la absorbancia total a 280 nm para obtener el valor de absorbancia
de la proteína en la solución. Para reducir el efecto de la dispersión de luz, en especial si la solución está muy turbia, se puede
pasar la solución por un filtro con un tamaño de poro de 0,2 µm o se puede clarificar por centrifugación.
CÁLCULOS
Calcular la concentración, Cu, de la proteína en la muestra de la prueba, por la fórmula:
en donde C5 es la concentración de la SoluciónEstándar;y Auy As son las absorbancias corregidas de la Soluciónde Pruebay la
SoluciónEstándar,respectivamente (ver (857)).
Método 2
Este método, comúnmente conocido como la valoración de Lowry, se basa en la propiedad que tienen las proteínas de redu-
cir la mezcla cromogénica de los ácidos fosfomolíbdico y túngstico en el reactivo Folin-Ciocalteu para fenoles, que produce
una absorbancia máxima a 750 nm. El reactivo Folin-Ciocalteu para fenoles reacciona principalmente con residuos tirosina en
la proteína, lo cual puede conducir a una variación en la respuesta cuando se valoran diferentes proteínas. Como el método es
sensible a sustancias de interferencia, se puede usar un procedimiento para precipitar la proteína de la muestra. Cuando sea
necesaria la separación de las sustancias de interferencia de la proteína en la muestra de la prueba, proceder según se indica a
continuación para Sustanciasde Interferenciaantes de la preparación de la Soluciónde Prueba.El efecto de las sustancias de
interferencia se puede minimizar por dilución, siempre que la concentración de la proteína en análisis continúe siendo suficien-
te para una medición exacta.
SOLUCIONESESTÁNDAR
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, disolver el Estándar de Referencia USP o el material
de referencia para la proteína en análisis, en la solución amortiguadora usada para. preparar la Soluciónde Prueba.Diluir porcio-
nes de esta solución con la misma solución amortiguadora para obtener no menos de cinco SolucionesEstándarcon concentra-
ciones uniformemente espaciadas entre 5 y 100 µg de proteína por ml.
SOLUCIÓN DE PRUEBA
Disolver una cantidad adecuada de la proteína en análisis, en la solución amortiguadora apropiada para obtener una solu-
ción con una concentración comprendida dentro del intervalo de concentraciones de las SolucionesEstándar.Una solución
amortiguadora apropiada producirá un pH entre 10,0 y 10,5.
BLANCO
Usar la solución amortiguadora utilizada para la Soluciónde Pruebay las SolucionesEstándar.
REACTIVOS
Y SOLUCIONES
Reactivo de Sulfato de Cobre-Disolver 100 mg de sulfato cúprico y 200 mg de tartrato de sodio en agua, diluir con agua
a 50 ml y mezclar. Disolver 1Og de carbonato de sodio en agua a un volumen final de 50 ml y mezclar. Verter lentamente la
solución de carbonato de sodio en la solución de sulfato de cobre, mezclando. Preparar esta solución a diario.
Solución de SOS-Disolver 5 g de dodecilsulfato de sodio en agua y diluir con agua a 100 ml.
Solución de Hidróxido de Sodio-Disolver 3,2 g de hidróxido de sodio en agua, diluir con agua a 100 mL y mezclar.
Reactivo de Cobre Alcalino-Preparar una mezcla de Reactivode Sulfatode Cobre,Soluciónde SOSy Soluciónde Hidróxido
de Sodio(1 :2: 1). Este reactivo se puede almacenar a temperatura ambiente hasta 2 semanas.
Reactivo Folin-Ciocalteu para Fenoles Diluido-Mezclar 1O mL de Folin-Ciocalteu para Fenoles SR con 50 mL de agua.
Almacenar en un frasco ámbar, a temperatura ambiente.
PROCEDIMIENTO
Agregar 1 mL de Reactivode CobreAlcalino a 1 mL de cada SoluciónEstándar,a 1 mL de la Soluciónde Pruebay a 1 mL del

Blancoy mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 1 O minutos. Agregar 0,5 mL del ReactivoFolin-Ciocalteu
para FenolesDiluido a cada solución, mezclar inmediatamente cada tubo y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30
minutos. Determinar las absorbancias de las soluciones obtenidas de las SolucionesEstándary la Soluciónde Pruebaa la longi-
tud de onda de absorbancia máxima a 750 nm con un espectrofotómetro adecuado (ver (857)), usando la solución del Blanco
para ajustar el instrumento a cero.
CÁLCULOS
[NOTA-La absorbancia no es función lineal de concentración proteica; sin embargo, si el intervalo de concentración de la
curva estándar es lo suficientemente pequeño, se aproxima a la linealidad.] Usando el método de regresión lineal, graficar las
absorbancias de las soluciones obtenidas de las SolucionesEstándaren función de las concentraciones de proteína y determinar
la curva estándar que mejor se ajuste a los puntos graficados. A partir de la curva estándar así obtenida y de la absorbancia de
la Soluciónde Prueba,determinar la concentración proteica de la Soluciónde Prueba.
SUSTANCIASDE INTERFERENCIA
En el siguiente procedimiento, se agrega desoxicolato-ácido tricloroacético a una muestra de prueba, para eliminar las sus-
tancias de interferencia por precipitación de las proteínas antes de hacer la prueba. Esta técnica también puede usarse para
concentrar proteínas de una solución diluida.
Reactivo de Desoxicolato de Sodio-Preparar una solución de desoxicolato de sodio en agua, con una concentración de
150 mg en 100 ml.
Reactivo de Ácido Tricloroacético-Preparar una solución de ácido tricloroacético en agua, con una concentración de
72 g en 100 ml.
Procedimiento-Agregar O,1 ml de Reactivode Desoxicolatode Sodioa 1 mL de una solución de la proteína en análisis.
Mezclar en un mezclador por vórtice y dejar reposar a temperatura ambiente durante 1O minutos. Agregar O,1 mL de Reactivo
de Ácido Tricloroacético
y mezclar en un mezclador por vórtice. Centrifugar a 3000 x g durante 30 minutos, decantar el líquido
y eliminar todo líquido residual con una pipeta. Volver a disolver el pellet de proteína en 1 mL de Reactivode CobreAlcalino.
Proceder según se indica para la Soluciónde Prueba.
[NOTA-El desarrollo del color alcanza un máximo entre los 20 y 30 minutos del comienzo de la incubación a temperatura
ambiente, y después hay una pérdida gradual de color. La mayoría de las sustancias de interferencia reducen la intensidad del
color; sin embargo, algunos detergentes causan un leve aumento del color. Una concentración alta de sal puede provocar la
formación de un precipitado. Como las distintas especies de proteína pueden dar respuestas de color de distinta intensidad, la
proteína estándar y la proteína de prueba deben ser la misma.]
Método 3
Este método, comúnmente denominado ensayo de Bradford, se basa en el cambio de absorción de 470 nm a 595 nm que
se observa cuando el colorante azul brillante G se une a la proteína. El colorante azul brillante G presenta más afinidad por los
residuos arginilo y lisilo en la proteína lo que conduce a la variación en la respuesta de la valoración para diferentes proteínas.
SOLUCIONESESTÁNDAR
de referencia para la proteína en análisis en la solución amortiguadora usada para preparar la Soluciónde Prueba.Diluir porcio-
nes de esta solución con la misma solución amortiguadora para obtener no menos de cinco SolucionesEstándarque tengan
concentraciones uniformemente espaciadas entre 100 µg y 1 mg de proteína por ml.
SOLUCIÓNDE PRUEBA
con una concentración comprendida dentro del intervalo de concentraciones de las SolucionesEstándar.
BLANCO
Usar la solución amortiguadora utilizada para preparar la Soluciónde Pruebay las SolucionesEstándar.
REACTIVODE COOMASSIE
Disolver 100 mg de azul brillante G* en 50 mL de alcohol. [NOTA-No todos los colorantes tienen el mismo contenido de
azul brillante G y distintos productos pueden dar resultados diferentes.] Agregar 100 mL de ácido fosfórico, diluir con agua a 1
L y mezclar. Pasar la solución a través de papel de filtro (Whatman Nº 1 o equivalente) y almacenar el reactivo filtrado en un
frasco ámbar a temperatura ambiente. [NOTA-El colorante precipita lentamente durante el almacenamiento del reactivo. Fil-
trar el reactivo antes de usarlo.]
PROCEDIMIENTO
Agregar 5 ml del ReactivoCoomassiea 100 µL de cada SoluciónEstándar,a 100 µL de la Soluciónde Pruebay a 100 µL del
Blancoy mezclar por inversión. Evitar la formación de espuma ya que altera la reproducibilidad. Determinar las absorbancias de
las soluciones de las SolucionesEstándary la Soluciónde Pruebaa 595 nm con un espectrofotómetro adecuado (ver (857)),
usando el Blancopara ajustar el instrumento a cero. [NOTA-No emplear celdas de cuarzo (sílice) en el espectrofotómetro dado
que el colorante se une a este material. Como las distintas especies de proteína pueden dar respuestas de color de diferente
intensidad, la proteína estándar y la proteína de prueba deben ser la misma.]
Hay relativamente pocas sustancias de interferencia, pero se deben evitar los detergentes y los anfolitos en la muestra de
prueba. Las muestras muy alcalinas pueden interferir con el reactivo ácido.
CÁLCULOS
[NOTA-La absorbancia no es función lineal de la concentración proteica; sin embargo, si el intervalo de concentración de la
• La pureza del colorante es importante en la preparación del reactivo. Serva BlueG (Crescent ChemicalCompany, Hauppage, NY)es un grado aceptable.
4
Método4
Este método, comúnmente denominado valoración con ácido bicinconínico o BCA,se basa en la propiedad que tienen las
proteínas de reducir el ión cúprico (Cu2+) a ión cuproso (Cu1+). El reactivo de ácido bicinconínico se usa para detectar el ión
cuproso. El método tiene pocas sustancias de interferencia. Cuando hay sustancias de interferencia presentes, se puede mini-
mizar su efecto mediante dilución, siempre que la concentración de la proteína en análisis sea suficiente para una medición
exacta.
SOLUCIONESESTÁNDAR
de referencia para la proteína en análisis, en la solución amortiguadora usada para preparar la Soluciónde Prueba.Diluir porcio-
ciones uniformemente espaciadas entre 1O µg y 1200 µg de proteína por ml.
SOLUCIÓNDE PRUEBA
BLANCO
REACTIVOS
ReactivoBCA-Disolver aproximadamente 1Og de ácido bicinconínico, 20 g de carbonato de sodio monohidrato, 1,6 g de

tartrato de sodio, 4 g de hidróxido de sodio y 9,5 g de bicarbonato de sodio en agua. Ajustar, si es necesario, hasta un pH de
11,25 con hidróxido de sodio o con bicarbonato de sodio. Diluir con agua a 1 L y mezclar.
Reactivode Sulfato de Cobre-Disolver aproximadamente 2 g de sulfato cúprico en agua a un volumen final de 50 ml.
ReactivoCobre-BCA-Mezclar 1 mL de Reactivode Sulfatode Cobrey 50 mL de ReactivoBCA.
PROCEDIMIENTO
Agregar 2 mL de Reactivode Cobre-BCAa O,1 mL de cada SoluciónEstándar,O,1 mL de la Soluciónde Pruebay O,1 mL del
Blanco,y mezclar. Incubar las soluciones a 37° durante 30 minutos, anotar el tiempo y dejar que lleguen a temperatura am-
biente. Dentro de los 60 minutos siguientes a la incubación, determinar las absorbancias de las soluciones de las Soluciones
Estándary la Soluciónde Pruebaen celdas de cuarzo a 562 nm, con un espectrofotómetro adecuado (ver (857)), usando la
solución Blancopara ajustar el instrumento a cero. Después de enfriar las soluciones a temperatura ambiente, la intensidad del
color continúa aumentando gradualmente. Si hay sustancias presentes que causen interferencias en la prueba, proceder según
se indica en Sustanciasde Interferenciaen el Método 2. Como las distintas especies de proteína pueden dar respuestas de color
de distinta intensidad, la proteína estándar y la proteína de prueba deben ser la misma.
CÁLCULOS
[NOTA-La absorbancia no es función lineal de la concentración proteica; sin embargo, si el intervalo de concentración de la
Método 5
Este método, comúnmente denominado valoración de Biuret, se basa en la interacción del ión cúprico (Cu2+) con la proteína
en una solución alcalina y el desarrollo de absorbancia a 545 nm.
SOLUCIONESESTÁNDAR
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, preparar una solución de Albúmina Humana, para la
cual se haya determinado previamente el contenido proteico por análisis de nitrógeno (usando el factor de conversión nitróge-
no-proteína de 6,25) o del Estándar de Referencia USP o material de referencia para la proteína en análisis en solución de clo-
ruro de sodio (9 en 1000). Diluir porciones de esta solución con solución de cloruro de sodio (9 en 1000) para obtener no
menos de tres SolucionesEstándarcon concentraciones uniformemente espaciadas entre 0,5 y 1O mg por ml. [NOTA-Pueden
observarse respuestas bajas si la muestra en análisis tiene un nivel de prolina significativamente diferente al de la Albúmina
Humana. En dichos casos se puede emplear una proteína estándar diferente.]
SOLUCIÓNDE PRUEBA
Preparar una solución de la proteína de prueba en solución de cloruro de sodio (9 en 1000), con una concentración com-
prendida dentro del intervalo de las concentraciones de las SolucionesEstándar.
BLANCO
Usar solución de cloruro de sodio (9 en 1000).
REACTIVODE BIURET
Disolver aproximadamente 3,46 g de sulfato cúprico en 1O mL de agua caliente y dejar enfriar (Solución1). Disolver aproxi-
madamente 34,6 g de citrato de sodio dihidrato y 20,0 g de carbonato de sodio en 80 mL de agua caliente y dejar enfriar
(Solución2). Mezclar la Solución1 y la Solución2 y diluir con agua a 200 ml. Este Reactivode Biuretes estable a temperatura
ambiente durante 6 meses. No usar el reactivo si aparece turbidez o contiene algún precipitado.
PROCEDIMIENTO
A un volumen de una solución de la Soluciónde prueba, agregar un volumen igual de solución de hidróxido de sodio (6 en
100) y mezclar. Agregar inmediatamente un volumen de Reactivode Biuretequivalente a 0,4 volúmenes de la Soluciónde Prue-
ba y mezclar. Dejar en reposo a una temperatura ambiente entre 15º y 25º, durante no menos de 15 minutos. Dentro de los
90 minutos siguientes a la adición del Reactivode Biuret,determinar las absorbancias de las SolucionesEstándary de la solución
obtenida de la Soluciónde Pruebaa la longitud de onda de absorbancia máxima a 545 nm con un espectrofotómetro adecua-
do (ver (857)), usando el Blancopara ajustar el instrumento a cero. [NOTA-Toda solución que desarrolle turbidez, o un precipi-
tado, no es aceptable para el cálculo de la concentración proteica.]
CÁLCULOS
Usando el método de regresión lineal de cuadrados mínimos, graficar las absorbancias de las SolucionesEstándaren función
de las concentraciones de proteína, determinando la curva estándar que mejor se ajuste a los puntos graficados y calcular el
coeficiente de correlación para la misma. [NOTA-Dentro del intervalo dado de los estándares, la relación entre la absorbancia
y la concentración proteica es aproximadamente lineal.] Un sistema adecuado es aquel que produce una línea con un coefi-
ciente de correlación de no menos de 0,99. A partir de la curva estándar y de la absorbancia de la Soluciónde Prueba,determi-
nar la concentración proteica de la muestra de prueba, haciendo las correcciones necesarias.
SUSTANCIASDE INTERFERENCIA
A fin de minimizar el efecto de las sustancias de interferencia, se puede precipitar la proteína en la muestra de prueba inicial,
como se indica a continuación. Agregar O,1 volúmenes de ácido tricloroacético al 50% a 1 volumen de una solución de la
muestra de prueba, retirar la capa sobrenadante y disolver el precipitado en un volumen pequeño de hidróxido de sodio 0,5
N. Usar la solución así obtenida para preparar la Soluciónde Prueba.
COMENTARIOS
Esta prueba muestra una diferencia mínima entre muestras de lgG y de albúmina equivalentes. La adición de hidróxido de
sodio y del Reactivode Biuretcomo reactivo combinado, la mezcla insuficiente después de la adición del hidróxido de sodio o
un tiempo prolongado entre la adición de la solución de hidróxido de sodio y la adición del Reactivode Biuretproduce para las
muestras de lgG una respuesta más alta que para las muestras de albúmina. El método de ácido tricloroacético usado para
minimizar los efectos de sustancias de interferencia también se puede usar para determinar el contenido proteico en muestras
de prueba con concentraciones por debajo de 500 µg por ml.
Método 6
Este método fluorométrico se basa en la derivatización de la proteína con o-ftalaldehído (OPA), que reacciona con las aminas
primarias de la proteína (es decir, el aminoácido NH2-terminal y el grupo E-amino de los residuos lisina). La sensibilidad de la
prueba puede aumentarse hidrolizando la proteína antes de realizar la prueba. Mediante hidrólisis los grupos a-amino de los
aminoácidos constituyentes de la proteína quedan disponibles para reaccionar con el reactivo o-ftalaldehído. El método requie-
re cantidades muy pequeñas de la proteína.
Las aminas primarias, tales como el tris(hidroximetil)aminometano y las soluciones amortiguadoras de aminoácidos, reaccio-
nan con el o-ftalaldehído y deben evitarse o eliminarse. El amoníaco en concentraciones altas reacciona también con el o-ftalal-
dehído. La fluorescencia obtenida cuando la amina reacciona con el o-ftalaldehído puede ser inestable. El uso de procedimien-
tos automatizados para estandarizar este procedimiento puede mejorar la exactitud y la precisión de la prueba.
SOLUCIONESESTÁNDAR
de referencia para la proteína en análisis, en la solución amortiguadora usada para preparar la Soluciónde Prueba.Diluir porcio-
ciones uniformemente espaciadas entre 1O y 200 µg de proteína por ml.
SOLUCIÓN DE PRUEBA
Disolver una cantidad adecuada de la proteína en análisis en la solución amortiguadora adecuada para obtener una solución
BLANCO
REACTIVOS
Solución Amortiguadora de Borato-Disolver aproximadamente 61,83 g de ácido bórico en agua y ajustar con hidróxido
de potasio, hasta un pH de 10,4. Diluir con agua a 1 L y mezclar.
Reactivo OPA Madre-Disolver aproximadamente 120 mg de o-ftalaldehído en 1,5 mL de metano!, agregar 100 mL de
SoluciónAmortiguadorade Boratoy mezclar. Agregar 0,6 mL de éter polioxietilén (23) laun1ico y mezclar. Esta solución es esta-
ble a temperatura ambiente durante al menos 3 semanas.
Reactivo OPA-A 5 mL de ReactivoOPAMadre,agregar 15 µL de 2-mercaptoetanol. Preparar al menos 30 minutos antes de
usar. Este reactivo es estable durante un día.
PROCEDIMIENTO
Ajustar cada una de las SolucionesEstándary la Soluciónde Pruebaa un pH entre 8 y 10,5. Mezclar 1O µL de la Soluciónde
Pruebay 1O µL de cada una de las SolucionesEstándarcon 100 µL de ReactivoOPAy dejar reposar a temperatura ambiente
durante 15 minutos. Agregar 3 mL de hidróxido de sodio 0,5 N y mezclar. Usando un fluorómetro adecuado (ver Espectrosco-
pía de Fluorescencia
(853)), determinar las intensidades de fluorescencia de las soluciones obtenidas de las SolucionesEstándary
de la Soluciónde Pruebaa una longitud de onda de excitación de 340 nm y a una longitud de onda de emisión entre 440 y
455 nm. [NOTA-La fluorescencia de una muestra individual se lee solo una vez, porque la irradiación disminuye la intensidad
de la fluorescencia.]
CÁLCULOS
La fluorescencia es función lineal de la concentración proteica. Usando el método de regresión lineal, graficar las intensida-
des de fluorescencia de las soluciones obtenidas de las SolucionesEstándaren función de las concentraciones de proteína y
determinar la curva estándar que mejor se ajuste a los puntos graficados. A partir de la curva estándar así obtenida y de la
intensidad de fluorescencia de la Soluciónde Prueba,determinar la concentración proteica de la muestra.
Método 7
Este método se basa en el análisis de nitrógeno como un medio de determinación de proteína. La interferencia causada por
la presencia de otras sustancias nitrogenadas en la muestra pueden afectar la determinación de proteína por este método. Las
USP42 Información General/ (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos 7627
técnicas de análisis de nitrógeno destruyen la proteína en análisis, pero no se limitan a la determinación de proteínas en un
medio acuoso.
PROCEDIMIENTO1
Determinar el contenido de nitrógeno de la proteína en análisis según se indica en Determinaciónde Nitrógeno(461 ). Hay
instrumental disponible comercialmente para la valoración de nitrógeno por el método de Kjeldahl.
PROCEDIMIENTO2
Hay instrumental disponible comercialmente para análisis de nitrógeno. La mayoría de los instrumentos para análisis de ni-
trógeno emplean pirólisis (es decir, la combustión de la muestra en oxígeno a temperaturas cercanas a los 1000°), producién-
dose óxido nítrico (NO) y óxidos de nitrógeno similares (NOx) a partir del nitrógeno presente en la proteína de prueba. Algu-
nos instrumentos convierten los óxidos nítricos en gas nitrógeno, que se cuantifica con un detector de conductividad térmica.
Otros instrumentos mezclan el óxido nítrico (NO) con ozono (0 3) formándose dióxido de nitrógeno excitado (N0 2), que emi-
te luz cuando se desintegra y se puede cuantificar con un detector de quimioluminiscencia. Se usa un material de referencia de
proteína o un estándar de referencia que sea relativamente puro y similar en composición a las proteínas de la prueba para
optimizar los parámetros de inyección y pirólisis y para evaluar la uniformidad en el análisis.
CÁLCULOS
La concentración proteica se calcula dividiendo el contenido de nitrógeno de la muestra por el contenido conocido de nitró-
geno de la proteína. El contenido conocido de nitrógeno de la proteína se puede determinar a partir de la composición quími-
ca de la proteína, o por comparación con el contenido de nitrógeno del Estándar de Referencia USP o del material de referen-
cia.
(1058) CALIFICACIÓNDE INSTRUMENTOSANALÍTICOS
INTRODUCCIÓN
Para adquirir datos que ayudarán a asegurar que los productos cumplen con las especificaciones, la industria farmacéutica se
emplea una gran variedad de instrumentos analíticos que van desde un aparato simple hasta sistemas computarizados comple-
jos. Muchos de estos instrumentos combinan una función metrológica con un software de control. Existen muchas formas de
demostrar que un instrumento está calificado y bajo control, dentro de las cuales se pueden incluir calificación, calibración,
validación y mantenimiento. Para asegurar la "aptitud para el propósito", se recomienda un enfoque integrado, basado en una
evaluación de riesgos. Para los propósitos de este capítulo, el término "instrumento" incluye cualquier aparato, equipo, instru-
mento o sistema de instrumentos usado en los análisis farmacopeicos.
Este capítulo informativo provee guías generales para un enfoque científico basado en riesgos para llevar a cabo una califica-
ción de instrumentos analíticos (AIQ por sus siglas en inglés). Los parámetros operativos del instrumento que se va a calificar
se encuentran detallados en los capítulos generales respectivos para cada tipo en particular. Queda a discreción de cada labo-
ratorio justificar y documentar sus enfoques específicos. Los propietarios/usuarios de instrumentos y su equipo gerencial son
responsables de asegurar la calificación adecuada de sus instrumentos.
Este capítulo usa varios términos, acrónimos y actividades que son comunes a los diversos laboratorios analíticos y disciplinas
de validación. El uso de estos términos y actividades puede no ser idéntico en todos los laboratorios. Se invita al lector a ser
flexible en la interpretación de la aplicación de estos términos y actividades dentro del contexto y propósito de este capítulo.
La evaluación de riesgos para una AIQ permite clasificar el instrumento para determinar el grado de calificación y las accio-
nes requeridas para demostrar la aptitud para el propósito buscado. Por lo general, mientras más complejo sea el instrumento
o cuanto más crítica sea la medición, mayor será el trabajo requerido para asegurar que los datos que se generen sean de
calidad. Además, se debe prestar atención para asegurar que se mantiene la integridad y la seguridad de los datos.
Los instrumentos por lo general pueden clasificarse como perteneciente a los Grupos A, B o C. Se debe tener en cuenta que
el mismo tipo de instrumento puede ajustarse a una o a más categorías, dependiendo del uso que se le pretende dar.
El Grupo A incluye los instrumentos comunes más sencillos que no se usan para propósitos de medición que no requieren
calibración por parte del usuario, tales como un agitador magnético o mezclador de vórtice. Se asegura que funcionan de for-
ma apropiada mediante observación, y no se requieren actividades adicionales de calificación para este grupo.
El Grupo B incluye instrumentos que se pueden usar para proveer una medición o alguna condición experimental que pu-
diera afectar una medición. Los ejemplos incluyen un medidor de pH o un horno. Elfuncionamiento apropiado de los instru-
mentos en este grupo puede requerir únicamente calibración, mantenimiento o verificaciones de desempeño de rutina. El gra-
7628 (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos/ InformaciónGeneral USP42
do de las actividades a realizar puede depender de cuán crítica sea la aplicación. Por lo general, estos instrumentos no suelen
tener un software, sino un firmware que es actualizado por el usuario.
El Grupo C comprende instrumentos analíticos con un grado importante de computarización y complejidad, tales como cro-
matógrafos de líquidos de alta presión y espectrómetros de masas. Se deben considerar todos los elementos de la calificación,
incluida la validación de software, para asegurar el funcionamiento apropiado de los instrumentos en este grupo.
COMPONENTES
DE LA CALIDADDE LOSDATOS
Existen cuatro componentes críticos involucrados en la generación de datos confiables y repetibles (datos de calidad). La
Figura 7 muestra estos componentes como actividades en capas dentro de un triángulo de calidad. Cada capa influye en la
calidad general. La AIQ constituye la base para generar datos de calidad. Los otros componentes esenciales para generar datos
de calidad son la validación del método analítico, las pruebas de aptitud del sistema y las muestras para control de calidad.
Estos componentes de la calidad se describen a continuación.
Validacióndel Método Analítico
Calificaciónde InstrumentosAnalíticos
Figura 1. Componentes de la calidad de los datos.
Calificación de Instrumentos Analíticos
La AIQ es la colección de pruebas documentadas de que un instrumento se desempeña adecuadamente para su uso previs-
to. El uso de un instrumento calificado en los análisis contribuye a la confianza en la validez de los datos generados.
Validación del Método Analítico
La validación del método analítico es la colección de pruebas documentadas de que un procedimiento analítico es apto para
su uso previsto. El uso de un procedimiento validado con instrumentos analíticos calificados ofrece la confianza de que el pro-
cedimiento generará datos de prueba de calidad aceptable. En Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos (1225), se puede
encontrar una guía adicional sobre la validación de los procedimientos farmacopeicos.
Pruebas de Aptitud del Sistema
Las pruebas de aptitud del sistema verifican que el sistema se desempeñe de acuerdo con los criterios fijados en el procedi-
miento. Estas pruebas se efectúan junto con los análisis de la muestra para garantizar que el desempeño del sistema es acepta-
ble en el momento de la prueba. En Cromatografía(621) se presenta una discusión más detallada de las pruebas de aptitud del
sistema en lo que se refiere a sistemas cromatográficos.
Muestras para Control de Calidad
Muchos analistas efectúan sus pruebas en instrumentos que han sido estandarizados mediante el uso de materiales de refe-
rencia y/o estándares de calibración. Algunos análisis requieren también la inclusión de muestras para control de calidad que
brinden una garantía, continua o durante el proceso, del desempeño adecuado de la prueba. De esta manera, la AIQ y la vali-
dación del método analítico contribuyen a la calidad del análisis antes de que los analistas lleven a cabo las pruebas. Las prue-
bas de aptitud del sistema y los análisis de muestras para control de calidad ayudan a garantizar la calidad de los resultados
analíticos inmediatamente antes o durante el análisis de la muestra.
PROCESODE CALIFICACIÓN
DE INSTRUMENTOS
ANALÍTICOS
Las siguientes secciones se refieren en detalle al proceso de AIQ. Los otros tres componentes que incorporan calidad dentro
de los datos analíticos-la validación del método analítico, las pruebas de aptitud del sistema y las muestras para control de
calidad-están fuera del alcance de este capítulo.
Fasesde la Calificación
La AIQ no es un proceso único y continuo, sino que resulta de actividades interrelacionadas durante el ciclo de vida del ins-
trumento. La primera actividad es la generación de una Especificación de Requisitos del Usuario (URS, por sus siglas en inglés),
la cual define las necesidades particulares del laboratorio y los requisitos técnicos y operativos que se deben cumplir. Las activi-
dades de calificación subsiguientes, necesarias para establecer la aptitud para el propósito deseado, se pueden agrupar en cua-
tro fases: calificación del diseño (DQ, por sus siglas en inglés), calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés), califi-
cación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). La PQ en ocasiones
se denomina Prueba de Aceptación del Usuario (UAT,por sus siglas en inglés). Este marco puede extenderse en el caso de
sistemas complejos para incluir especificaciones funcionales (FS, por sus siglas en inglés) y Prueba de Aceptación en Fábrica
(FAT,por sus siglas en inglés), cuando corresponda. Algunas actividades normalmente realizadas durante la IQ, la OQ o la PQ
pueden satisfacerse durante la instalación y la puesta en servicio del instrumento. Esto en ocasiones se denomina Prueba de
Aceptación en Sitio (SAT,por sus siglas en inglés). Más importante que la asignación exacta de una actividad en el marco de
IQ/OQ/PQ, es que todas las actividades requeridas se lleven a cabo en un orden lógico y sobre bases científicas firmes. Las
actividades también pueden realizarse dentro de un marco integrado.
Algunas actividades de AIQ cubren más de una fase de calificación y los analistas podrían potencialmente efectuarlas durante
más de una de estas fases. Sin embargo, existe la necesidad de un orden lógico y específico para las actividades de AIQ; por
ejemplo, las actividades de IQ, tales como la configuración del equipo se deben realizar antes de iniciar la OQ. Sin embargo,
cuando corresponda, algunas actividades de calificación y su documentación asociada podrían combinarse (p. ej., IQ y OQ).
Todas las actividades de AIQ se deben definir previamente y se deben documentar al momento de realizarlas.
Las pruebas de OQ están diseñadas específicamente para verificar que el instrumento funciona y opera correctamente en el
entorno del usuario, de acuerdo con las especificaciones documentadas en la URS. No es necesario repetir todos los análisis a
intervalos regulares. No obstante, después del mantenimiento preventivo, se deben confirmar los parámetros operativos críti-
cos. Las pruebas analíticas de rutina no constituyen pruebas de OQ.
Cuando el instrumento se somete a reparaciones o modificaciones importantes, este debe evaluarse usando un control de
cambios. Se deben repetir las pruebas de IQ, OQ o PQ que sean relevantes para verificar que el instrumento sigue funcionando
satisfactoriamente. Si un instrumento se traslada a otro sitio, se debe evaluar si es necesario repetir alguna etapa de califica-
ción.
CALIFICACIÓN
DELDISEÑO
La DQ es la colección documentada de actividades que definen las especificaciones funcionales y operativas, así como el uso
previsto del instrumento. La DQ indica lo que el laboratorio desea del instrumento y muestra que el instrumento seleccionado
es adecuado para esos propósitos. La DQ puede ser realizada por el fabricante del instrumento o por el usuario. Se espera que
los requisitos de DQ sean mínimos para los instrumentos comerciales de uso general. Puede ser suficiente la verificación de que
las especificaciones del instrumento cumplen con los requisitos de funcionalidades deseados.
Por lo general, el proveedor es responsable del diseño adecuado y del mantenimiento de la documentación que describe la
forma en que se fabrica y prueba el instrumento analítico y cualquier software de control asociado (p. ej., especificaciones de
diseño, requisitos funcionales, etc.), lo cual en ocasiones se denomina como prueba de aceptación en fábrica. No obstante, el
usuario debe asegurar que los instrumentos son adecuados para el uso previsto y puede evaluar si el proveedor ha adoptado
un sistema de calidad que garantiza un instrumento, un software y una conectividad en red confiables. Los usuarios también
deben determinar la capacidad del proveedor para proporcionar apoyo durante la instalación, servicio y capacitación. Esta de-
cisión podría facilitarse por la interacción previa del usuario con el proveedor.
Cuando el uso de un instrumento cambia o se somete a una mejora importante, puede ser necesario revisar y/o actualizar la
documentación de DQ del usuario.
CALIFICACIÓN
DE LA INSTALACIÓN
IQ es la colección documentada de actividades necesarias para establecer que un instrumento se entrega como fue diseñado
y especificado, está debidamente instalado en el entorno seleccionado, y que este entorno es adecuado para el instrumento.
La IQ se aplica a un instrumento nuevo o de segunda mano. Para cualquier instrumento que ya esté en el sitio pero que no
haya sido previamente calificado, o que aún no ha sido calificado con las normas industriales vigentes, se debe cotejar la docu-
mentación existente y se debe realizar una evaluación de riesgos para determinar el mejor curso de acción.
4
7630 (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos / InformaciónGeneral USP42
Partes relevantes de la IQ se aplican también a un instrumento calificado que haya sido transportado a otro sitio o esté sien-
do reinstalado por otras razones, tal como un almacenamiento prolongado.
Las actividades y la documentación asociadas típicamente con la IQ son las siguientes.
Entrega del instrumento: Asegurar que el instrumento, el software, los manuales, los suministros y cualquier otro acceso-
rio del instrumento lleguen según lo especificado por el usuario y que no hayan sufrido daños. En el caso de un instrumento
de segunda mano o ya existente, se deben obtener los manuales y la documentación.
Descripción: Documentar la información sobre el instrumento y todos los componentes, incluyendo proveedores, mode-
los, números de serie, versiones de software y ubicaciones.
Servicios/Instalaciones/Entorno: Verificarque el lugar de instalación cumpla satisfactoriamente con los requisitos am-
bientales especificados por el proveedor.
Ensamblado e instalación: Ensamblar e instalar el instrumento y efectuar cualquier diagnóstico o análisis preliminar. El
ensamblado y la instalación pueden ser realizados por el proveedor, los representantes de servicio, los ingenieros especializados
o el personal interno calificado. Las pruebas de instalación establecidas por el proveedor proporcionan una valiosa referencia
para determinar la aceptación del instrumento. Cualquier hecho anormal observado durante el ensamblado y la instalación
merece documentarse. Se deben revisar los paquetes de documentación de IQ comprados a un proveedor para asegurar que
son aceptables para el usuario antes y después de la ejecución.
Instalación de software, red y almacenamiento de datos: Algunos sistemas analíticos requieren la instalación de softwa-
re en una computadora calificada, así como la conexión a una red de comunicaciones y almacenamiento de datos en el sitio
de instalación. A menudo se requiere la participación del personal de informática para la instalación de los sistemas de labora-
torio computarizado.
Verificación de la instalación: Efectuar los diagnósticos y pruebas iniciales del instrumento después de la instalación.
Cuando sea necesario, conectar el instrumento a la red y verificar su funcionalidad.
CALIFICACIÓN
OPERATIVA
OQ es la colección documentada de las actividades necesarias para demostrar que un instrumento funcionará de acuerdo
con su prueba de especificación operativa en el entorno seleccionado. OQ demuestra la aptitud para el uso seleccionado y
debe reflejar los requisitos para el usuario (URS, por sus siglas en inglés). Las pruebas en la fase de OQ pueden constar de los
siguientes parámetros.
Parámetros fijos: Estas pruebas miden los parámetros invariables del instrumento, tales como longitud, altura, peso, en-
tradas de voltaje, presiones aceptables y cargas. Si las especificaciones proporcionadas por el fabricante para estos parámetros
satisfacen al usuario, los requisitos de la prueba se pueden obviar. Sin embargo, si el usuario desea confirmar los parámetros, se
pueden efectuar las pruebas en el sitio del usuario. Los parámetros fijos no cambian durante la vida del instrumento y, por lo
tanto, no es necesario volver a analizarlos. [NOTA-Estas pruebas podrían efectuarse también durante la fase de IQ de ser así,
no es necesario volver a analizar los parámetros fijos como parte de las pruebas de OQ.]
Funciones del software: Cuando resulte aplicable, la prueba de OQ debe incluir elementos críticos del software de la
aplicación configurado para demostrar que el sistema entero trabaja según lo esperado. Las funciones a analizar serían aquellas
aplicables a la adquisición captura de datos, al análisis de datos y al informe de resultados en las condiciones reales de uso, así
como a la seguridad, el control de acceso y el registro de auditoría. El usuario puede aplicar metodologías de evaluación de
riesgos y puede aprovechar el análisis del software del proveedor para enfocarlo en las pruebas de OQ.
Almacenamiento de datos, copia de seguridad (backup) y archivado seguros: Cuando corresponda, probar el manejo
seguro de datos, tal como almacenamiento, copia de seguridad, registros de auditoría y archivado en el sitio del usuario, de
acuerdo con los procedimientos escritos.
Pruebas de las funciones del instrumento: Las funciones del instrumento requeridas por el usuario se deben probar para
verificar que el instrumento funcione según lo previsto por el fabricante. La información proporcionada por el proveedor es útil
para identificar las especificaciones de estos parámetros y para diseñar las pruebas para verificar que el instrumento cumple
con las especificaciones del proveedor o del usuario en el entorno del usuario.
El nivel de prueba de OQ al que se somete un instrumento depende de sus aplicaciones deseadas, por lo tanto, este capítulo
no ofrece pruebas específicas de OQ para ningún instrumento o aplicación. Los parámetros a calificar se describen en los capí-
tulos generales relacionados con una técnica analítica específica.
Las pruebas de OQ pueden ser modulares o integrales. Los análisis modulares de los componentes individuales de un siste-
ma pueden facilitar el intercambio de dichos componentes sin recalificación, pero se requiere una evaluación de riesgos para
justificar este hecho. Las pruebas integrales, que involucran a todo el sistema, demuestran que el sistema entero cumple con
los URS.
Para los paquetes de prueba de OQ adquiridos a un proveedor de servicios o proveedor de materiales, el usuario debe revi-
sar el material para asegurar que las pruebas tengan una base científica y cumplan con las reglamentaciones aplicables. El
usuario debe revisar los documentos antes de la ejecución y debe aprobar las pruebas después de la ejecución para asegurar la
integridad y exactitud del documento completado y de los datos de la prueba generados.
Configuración y/o personalización del software: Todas las configuraciones y/o personalizaciones del software del instru-
mento se deben realizar antes de la OQ y deben documentarse. A menos que se requieran cambios para pruebas de compo-
nentes específicos, la OQ debe realizarse usando la configuración de software que será usada para el análisis de rutina.
CALIFICACIÓN
DE DESEMPEÑO
PQ es la colección documentada de las actividades necesarias para demostrar que un instrumento se desempeña de manera
uniforme de acuerdo con las especificaciones definidas por el usuario y es apropiado para el uso previsto. PQ verifica la aptitud
para el propósito del instrumento en las condiciones reales de uso. Después de haber efectuado las pruebas de IQ y OQ, la PQ
demuestra la aptitud continua del instrumento para el uso previsto.
El usuario debe definir los planes de PQ, incluidos los procedimientos de prueba, los criterios de aceptación y la frecuencia.
Los planes de mantenimiento preventivo y la documentación sobre reparaciones y otros cambios también son una parte nece-
saria de la calificación general del instrumento.
La fase de PQ puede incluir las siguientes actividades.
Verificaciones de desempeño: Una prueba o serie de pruebas para verificar el desempeño aceptable del instrumento pa-
ra el uso previsto. Las pruebas de PQ se basan por lo general en las aplicaciones típicas del instrumento en el sitio de uso y
pueden consistir en el análisis de estándares o componentes conocidos. Las pruebas se deben basar en métodos científicos
adecuados y reflejar el uso general previsto para el instrumento. Algunas pruebas de aptitud del sistema o análisis de control
de calidad que se efectúan simultáneamente con las muestras de prueba se pueden usar para demostrar que el instrumento se
desempeña de manera adecuada. Las pruebas de PQ pueden semejarse a las efectuadas durante la OQ, pero las especificacio-
nes para los resultados de PQ se pueden fijar de manera diferente de ser necesario. Sin embargo, las especificaciones del usua-
rio para las pruebas de PQ deben demostrar que el instrumento funciona sin problemas para las aplicaciones previstas. Como
en el caso con las pruebas de OQ, las pruebas de PQ pueden ser modulares o integrales.
La frecuencia de análisis depende de la robustez del instrumento y la criticidad del método analítico. Las pruebas pueden
llevarse a cabo sin programación, por ejemplo, cada vez que se usa el instrumento. También se pueden programar a intervalos
regulares. La experiencia con el instrumento puede influir en esta decisión, lo cual debe documentarse. Podría ser útil repetir
las mismas pruebas de PQ cada vez que se usa el instrumento, para poder compilar la historia del desempeño del instrumento.
Como alternativa, el instrumento se puede incluir en un sistema de soporte integrado para garantizar que permanezca califica-
do continuamente. Las pruebas de aptitud del sistema que se efectúan al momento de analizar las preparaciones de prueba
también pueden asegurar que el instrumento se desempeña de manera adecuada.
Mantenimiento preventivo y reparaciones: Se requieren actividades de mantenimiento preventivo periódico para mu-
chos instrumentos. Esto puede incluir la calibración. Documentar los planes de mantenimiento preventivo, incluyendo procedi-
mientos y frecuencia como parte del paquete de AIQ. Cuando un instrumento falla en cumplir con los criterios de PQ o pre-
senta otro tipo de funcionamiento incorrecto, se debe investigar y documentar la causa de la falla. El instrumento puede re-
querir mantenimiento o reparación. Las pruebas de OQ o PQ relevantes se deben repetir después del mantenimiento o repara-
ción necesaria para garantizar que el instrumento sigue estando calificado.
Prácticas para PQ, control de cambios y revisión periódica: Cada actividad de PQ, mantenimiento y calibración debe
ser documentada. Se debe establecer un control de cambios para la configuración del instrumento, incluido el firmware y el
software. Los instrumentos críticos se deben revisar periódicamente para asegurar que el sistema aún está bajo control. Las
áreas típicas de revisión pueden incluir el estado de calificación/validación, la vigencia de los procedimientos del usuario, los
registros de control de cambios, la veracidad y la integridad de los registros producidos por el sistema, la copia de seguridad y
la recuperación de los registros electrónicos, y la revisión y la aprobación de los resultados de la prueba.
El propietario/usuario del instrumento y su equipo gerencial son responsables de este trabajo, aunque algunas partes del
mismo pueden ser llevadas a cabo en su nombre por personal interno, proveedores externos, o prestadores de servicios.
ROLESY RESPONSABILIDADES
Usuarios
Los usuarios son en definitiva los responsables de especificar sus necesidades y de asegurar que el instrumento seleccionado
cumple con estas, y de que se mantiene la calidad e integridad de los datos. El grupo de usuarios abarca los analistas, sus
supervisores, los especialistas del instrumento y la gerencia de la organización. Los usuarios deben estar capacitados adecuada-
mente en el uso del instrumento y su historial de capacitación se debe mantener como lo exijan las reglamentaciones.
Los usuarios también deben ser responsables de calificar sus instrumentos porque su capacitación y pericia en el uso de
aquellos los convierte en el grupo mejor calificado para diseñar las pruebas y especificaciones del instrumento necesarias para
una exitosa AIQ. Los consultores, los fabricantes o los proveedores de instrumentos, los especialistas en validación y el personal
de garantía de calidad pueden asesorar y asistir según sea necesario, pero la responsabilidad final de calificar los instrumentos y
validar los sistemas recae en los usuarios, quienes deben asegurar que el instrumento se mantiene en un estado calificado efec-
tuando rutinariamente la PQ.
7632 (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos/ InformaciónGeneral USP42
Unidad de Calidad
El papel de la unidad de calidad en la AIQ sigue siendo el mismo que para cualquier otra actividad reglamentada. El personal
de calidad es responsable de garantizar que el proceso de AIQ reúna los requisitos de cumplimento, que los procesos se sigan
y que el uso previsto del instrumento esté respaldado por datos completos, válidos y documentados.
Fabricantes,Proveedores,Representantesde ServicioTécnicoy Consultores
Los fabricantes son responsables del diseño y la fabricación del instrumento, y de asegurar la calidad de los procesos relevan-
tes usados en la fabricación y en el montaje del instrumento. Los fabricantes deben probar los instrumentos montados antes
de enviarlos a los usuarios. Para ayudar al usuario, los proveedores son responsables de desarrollar especificaciones significati-
vas para que los usuarios puedan compararlas con sus necesidades y ayudar en la selección.
Cuando se use, el software debe ser desarrollado y probado usando un ciclo de vida definido y se debe contar con evidencia
del trabajo realizado para respaldar revisiones mayores y menores. Cada versión de software liberado debe estar acompañado
por notas de liberación.
Por último, es deseable que los proveedores notifiquen a todos los usuarios conocidos de los defectos del hardware o softwa-
re descubiertos después de la liberación de un producto; ofrezcan al usuario capacitación, servicio, reparación y apoyo para la
instalación; y lo inviten a hacer auditorías, según sea necesario.
Debe existir un acuerdo de calidad o técnico entre la organización usuaria y los fabricantes, los proveedores, los representan-
tes de servicio técnico o los consultores quienes proveen servicios de calibración, mantenimiento, calificación o validación; el
acuerdo debe definir el alcance del trabajo y las responsabilidades de las dos partes.
VALIDACIÓNDE SOFTWARE
Existe una creciente integración de las partes de hardware y software de los instrumentos analíticos modernos lo que dificul-
ta su separación. En muchos casos, el software es necesario para calificar el instrumento, y la operación del instrumento es
esencial al validar el software. Por lo tanto, para evitar superposiciones o duplicación potencial, la validación del software y la
calificación del instrumento pueden integrarse en una sola actividad.
El software usado en instrumentos analíticos se puede clasificar en cuatro grupos: firmware, software para control del instru-
mento, software de adquisición de datos y software de procesamiento. Aunque la validación del software no es el objetivo
principal de este capítulo, las siguientes secciones describen en qué casos esta actividad está dentro del alcance de la califica-
ción de instrumentos y sistemas analíticos.
Una fuente para la validación del software es la guía GAMP:A Risk-Based Approach to Compliant GxP ComputerizedSystems.
(Buenas Prácticas de Fabricación Automática: Un Enfoque Basado en Riesgos para Sistemas Computarizados que Cumplen con
Buenas Prácticas).
Firmware
Los instrumentos analíticos computadorizados contienen chips integrados con software de bajo nivel (firmware). Dichos ins-
trumentos no funcionarán sin un firmware que opere adecuadamente y en la mayoría de los casos los usuarios por lo general
no pueden alterar la función del firmware. Por lo tanto, el firmware se considera un componente del instrumento mismo. De
hecho, la calificación del hardware no es posible sin ponerlo en funcionamiento a través de su firmware.
Por lo tanto, cuando se califica el hardware (o sea, el instrumento analítico) en el sitio del usuario, también se está califican-
do esencialmente el firmware . No es necesario calificar el firmware por separado en el sitio. Siempre que sea posible, se debe
registrar la versión de firmware como parte de las actividades de IQ. Cualquier cambio que se haga a las versiones de firmware
se debe rastrear a través del control de cambios del instrumento (ver Control de Cambiosa continuación).
En algunos instrumentos, el firmware también puede ser capaz de realizar cálculos fijos sobre los datos adquiridos. Estos cál-
culos deben ser verificados por el usuario. Algunos instrumentos cuentan con firmware que permite a los usuarios definir pro-
gramas para la operación del instrumento; de forma similar, estos programas definidos por el usuario deben ser definidos y
verificados para demostrar que son aptos para el fin previsto. Cualquier programa definido por el usuario debe colocarse bajo
control de cambios y, de ser posible, se debe restringir el acceso solo a personal autorizado.
Software para Control del Instrumento, Adquisiciónde Datos y Procesamiento
En muchos de los instrumentos computarizados actuales, el software para control del instrumento, adquisición de datos y
procesamiento se carga en una computadora conectada al instrumento. La operación del instrumento se controla entonces a
través del software, lo cual deja pocos controles operativos en el instrumento. Además, el software se necesita para la adquisi-
ción de datos y para los cálculos posteriores. Por ello, tanto el hardware como el software, con sus funciones inextricablemente
entrelazadas, son críticos para proporcionar los resultados analíticos.
El software en este grupo puede clasificarse en tres tipos: 1) software no configurable que no puede ser modificado para
cambiar el proceso operativo; 2) software configurable que incluye herramientas del proveedor para modificar el proceso ope-
rativo; y 3) software configurable con adiciones personalizadas (es decir, software o macros personalizados para automatizar el
proceso operativo).
El proveedor del sistema debe desarrollar y probar el software de acuerdo con un ciclo de vida definido y proveer a los usua-
rios con un resumen de las pruebas que se llevaron a cabo. Idealmente, este desarrollo de software debe llevarse a cabo bajo
un sistema de gestión de calidad.
tn el sitio del usuario, la calificación integral del instrumento, en conjunto con la validación del software, implica al sistema
completo. Esto es más eficiente que separar la calificación del instrumento de la validación del software.
CONTROLDE CAMBIOS
Los cambios a los instrumentos calificados, incluido el software, se vuelven inevitables a medida que los proveedores agre-
gan nuevas características y corrigen defectos conocidos. Sin embargo, la implementación de todos esos cambios no siempre
beneficia a los usuarios. Por lo tanto, los usuarios deben adoptar los cambios que consideren útiles o necesarios. Los cambios
también ocurren debido a reparaciones, mantenimiento o reubicación del instrumento. Se debe contar con un proceso de
control de cambios para guiar la evaluación, ejecución, documentación y aprobación de cualquier cambio en los instrumentos.
El control de cambios se aplica a todos los elementos de la calificación y puede seguir el proceso de calificación general. Los
usuarios deben evaluar los efectos de los cambios para determinar si se requiere alguna actividad de recalificación. Si la imple-
mentación del cambio es necesaria, introducir los cambios al sistema. Considerar si el cambio afectará la capacidad del instru-
mento de cumplir con los requisitos del usuario o si los requisitos del usuario han cambiado. Evaluar cuál de las pruebas de OQ
y PQ existentes necesita revisión, eliminación o adición como resultado del cambio instalado.
Después de la implementación, realizar todos los análisis requeridos para evaluar los efectos del cambio. Documentar todos
los detalles del cambio. Incluir una descripción del cambio y una justificación, y listar la identificación apropiada de los nuevos
componentes (p. ej., números de parte y serie) y del software o firmware (p. ej. número de versión).
PROCESODE CALIFICACIÓN
DE INSTRUMENTOSANALÍTICOS
Los documentos obtenidos durante las actividades de calificación se deben conservar de manera accesible. Cuando existan
múltiples instrumentos de un tipo, los documentos comunes de todos los instrumentos y los documentos específicos de un
instrumento se pueden almacenar por separado. Durante el control de cambios, documentos adicionales pueden complemen-
tar aquellos obtenidos durante el proceso de calificación y ambos grupos de documentos se deben conservar y mantener en
una forma adecuada que permita la protección y el acceso apropiados.
GLOSARIO
[NOTA-Las definiciones de estos términos pueden ser distintas a las provistas en otros capítulos generales USP.]
Calibración: Una operación que, en condiciones específicas, en una primera etapa, establece una relación entre los valores
de cantidad, con incertidumbres de medición provistas por estándares de medición, y las indicaciones correspondientes con
incertidumbres de medición asociadas y, en una segunda etapa, emplea esta información para establecer una relación para
obtener un resultado de medición de una indicación. Tener en cuenta lo siguiente:
1 . Una calibración puede expresarse mediante una declaración, una función de calibración, un diagrama de calibración, una
curva de calibración o una tabla de calibración. En algunos casos, puede constar de una corrección aditiva o multiplicativa
de la indicación con incertidumbre de medición asociada.
2. La calibración no debe confundirse con el ajuste de un sistema de medición, que a menudo se denomina erróneamente
"auto-calibración" (self-calibration), ni con la verificación de calibración.
3. A menudo, solo el primer paso de la definición anterior se percibe como la calibración.
Mantenimiento: Acciones realizadas para mantener un instrumento analítico en un estado de funcionamiento apropiado de
modo que continúe operando dentro de los límites establecidos durante la calificación o la validación.
Calificación: Acción de comprobar que un instrumento funciona de manera correcta y produce los resultados esperados; de-
mostración de la aptitud para el propósito deseado.
Configuración del software: Adaptación de las funciones del software a un proceso operativo usando herramientas provistas
dentro de la aplicación por el proveedor del software.
Personalización del software: Cambiar la forma en que el software automatiza un proceso operativo mediante la adición de
módulos de software codificados externamente de forma personalizada usando un lenguaje de programación reconocido o el
desarrollo de macros dentro del software de la aplicación.
Validación de software: Confirmación mediante inspección y presentación de pruebas objetivas de que el software cumple
con las necesidades del usuario y los usos pretendidos, y de que los requisitos particulares implementados mediante el softwa-
re pueden cumplirse de manera constante.
7634 (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos/ Información General USP42
Proveedor: Este término se usa de modo genérico y puede referirse al fabricante, proveedor, representante de servicio técni-
co o consultor, dependiendo de las circunstancias.
(1059) DESEMPEÑODE EXCIPIENTES
INTRODUCCIÓN
Los excipientes se usan prácticamente en todos los medicamentos y son esenciales para la fabricación y el desempeño del
producto. Por tanto, la fabricación exitosa de un producto robusto requiere del uso de excipientes y procesos de fabricación
bien definidos que entreguen constantemente un producto de calidad. Los excipientes usados en los medicamentos general-
mente se fabrican y proveen en cumplimiento con normas farmacopeicas. No obstante, los efectos de las propiedades de los
excipientes sobre los atributos de calidad críticos (CQA, por sus siglas en inglés) de un medicamento son particulares para ca-
da formulación y proceso, y pueden depender de propiedades de los excipientes no evaluadas en las monografías USPo NF.
Los efectos de las variaciones en las propiedades materiales del excipiente dependen de la función de un excipiente en una
formulación y de los atributos de calidad críticos del producto terminado. Este capítulo general provee un marco para la apli-
cación de principios de Calidad por Diseño (QBD, por sus siglas en inglés) a la calidad y desempeño de los excipientes.
Un excipiente puede ser usado de distintas formas o para distintos propósitos en una formulación y puede, por tanto, reque-
rir de diversas propiedades materiales para lograr el desempeño deseado. Las categorías funcionales del excipiente son térmi-
nos amplios, cualitativos y descriptivos del propósito de un excipiente en una formulación. La sección de DocumentosPrelimi-
nares, Excipientes,del NF incluye una lista de excipientes agrupados por categoría funcional que resume los propósitos más
comunes de estos excipientes en los medicamentos. También es importante que se identifiquen y controlen las propiedades
materiales de los ingredientes, para asegurar que el excipiente desempeñe la función deseada en un medicamento. Un atribu-
to material crítico (CMA, por sus siglas en inglés) es una propiedad física, química, biológica o microbiológica de un material
que debe estar dentro de un límite, intervalo o distribución apropiados para asegurar que los atributos de calidad críticos de
los medicamentos se mantengan durante todo el ciclo de vida del producto. La mayoría de los atributos críticos de los materia-
les, pero no todos, se convierten en pruebas en una monografía oficial. En algunas aplicaciones, los proveedores y usuarios de
excipientes necesitarán identificar y controlar las propiedades materiales además de las especificaciones de la monografía. La
identificación de atributos críticos de los materiales requiere de una comprensión profunda de los atributos de calidad críticos
del medicamento, de los procesos de fabricación, así como de las propiedades físicas, químicas, biológicas o microbiológicas
de cada ingrediente. Los fabricantes deben prever la variabilidad entre lotes y entre proveedores en las propiedades del exci-
piente y deben contar con medidas de control apropiadas para asegurar que los atributos materiales críticos se mantengan
dentro de los límites requeridos. Se pueden utilizar conocimientos previos, diseños experimentales y herramientas de evalua-
ción de riesgos para priorizar e identificar los atributos críticos de los materiales de los excipientes, así como los parámetros
críticos del proceso. Un atributo crítico para un excipiente puede no estar relacionado con el componente principal del exci-
piente ya que, por ejemplo, la presencia de componentes menores (p. ej., peróxidos, impurezas elementales o contenido mi-
crobiológico) puede afectar la estabilidad o calidad del producto. Las buenas prácticas de desarrollo de productos, que en oca-
siones se denominan principios de calidad por diseño, requieren un entendimiento de los atributos materiales críticos del exci-
piente que contribuyen al desempeño uniforme y que son la base de una estrategia de control que compense la variabilidad
del excipiente, logrando que los atributos de calidad del producto final se mantengan constantes.
Este capítulo de información general proporciona una visión general de las categorías funcionales claves de los excipientes,
además de pruebas o procedimientos que pueden usarse para monitorear y controlar los atributos materiales críticos.1
En este capítulo, las categorías funcionales han sido organizadas por sus usos más representativos en formas farmacéuticas
comunes. Sin embargo, las categorías funcionales pueden aplicarse a múltiples formas farmacéuticas. La asociación de una ca-
tegoría funcional con una forma farmacéutica en particular no limita el uso de un excipiente a un solo tipo de forma farmacéu-
tica o sistema de liberación. Cada categoría funcional incluye una descripción general; los mecanismos mediante los cuales los
excipientes logran su actividad; las propiedades físicas comunes de estos excipientes; las propiedades químicas; y una lista de
capítulos generales de la USPque pueden ser útiles en el desarrollo de pruebas específicas, procedimientos y criterios de acep-
tación para asegurar que los atributos materiales críticos se monitorean y controlan adecuadamente. Debido a la complejidad
de la naturaleza e interacción de los ingredientes de las formulaciones, del procesamiento y de los requisitos de desempeño de
las formas farmacéuticas, la información provista en este capítulo no debe considerarse restrictiva ni completamente exhausti-
va.
1 Este capítulo de
informacióngeneral provee informaciónno obligatoriaque no deriva en requisitosfarmacopeicosoficiales.Para informaciónadicionalsobre
capítulos generales no obligatorios,así como métodos y procedimientosalternativos,ver las AdvertenciasGenerales,6.30 Métodosy Procedimientos
Alternativosy
Armonizados.
USP42 InformaciónGeneral/ (1059) Desempeño de Excipientes 7635
TABLETASY CÁPSULAS
Categoría Funcional: Diluyente
DESCRIPCIÓN
Los diluyentes son componentes que se incorporan en las tabletas o cápsulas para incrementar el volumen o peso de la for-
ma farmacéutica. Los diluyentes a menudo constituyen una gran proporción de la forma farmacéutica, y la cantidad y tipo de
diluyente seleccionado por lo regular depende de sus propiedades físicas y químicas. Por ende, la fabricación exitosa y robusta
y el desempeño de la forma farmacéutica dependen de la medición y el control de los atributos materiales críticos.
MECANISMOFUNCIONAL
Entre los papeles funcionales más importantes que desempeñan los diluyentes se encuentra su capacidad de impartir propie-
dades deseables de fabricación (p. ej., fluidez de polvos, fuerza de compactación de tabletas, formación de granulados húme-
dos o secos, u homogeneidad) y desempeño (p. ej., uniformidad de contenido, desintegración, disolución, integridad de la
tableta, friabilidad, o estabilidad física y química). En ocasiones se hace referencia a algunos diluyentes (p. ej., celulosa micro-
cristalina) como aglutinantes secos debido al alto grado de fortaleza mecánica que imparten a la tableta comprimida final.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Las propiedades físicas primarias pertinentes a los diluyentes para tabletas/cápsulas son aquellas que pueden tener un efecto
directo en el desempeño del diluyente y la formulación. Estas incluyen: (1) tamaño y distribución del tamaño de partícula, (2)
forma de la partícula, (3) densidad aparente/por asentamiento/verdadera, (4) área superficial específica, (5) cristalinidad, (6)
contenido de humedad, (7) fluidez de polvos, (8) solubilidad, (9) forma cristalina y (1 O) propiedades de compactación para
tabletas.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los diluyentes de tabletas comprenden un amplio y diverso grupo de materiales que incluyen materiales inorgánicos (p. ej.,
fosfato dibásico de calcio o carbonato de calcio), materiales orgánicos de un solo componente (p. ej., lactosa monohidrato o
manito!) y materiales orgánicos de componentes múltiples (p.ej. celulosa microcristalina silicificada o esferas de azúcares) o
complejos (p. ej., celulosa microcristalina o almidón). Estos pueden ser solubles o insolubles en agua y pueden ser de naturale-
za neutra, ácida o alcalina. Tales propiedades químicas pueden tener un efecto positivo o negativo sobre la estabilidad física o
química del fármaco y sobre el desempeño. La selección apropiada de excipientes con propiedades físicas y químicas deseables
puede mejorar la estabilidad física y química, así como el desempeño del fármaco y de la forma farmacéutica. La composición
detallada de un excipiente puede ser importante debido a que la presencia de componentes concominantes menores, que son
esenciales para el desempeño adecuado, puede influir sobre la función del excipiente. Es posible que los científicos farmacéuti-
cos encuentren necesario controlar la presencia de componentes no deseados (p. ej., impurezas elementales o peróxidos) para
asegurar la estabilidad y el desempeño adecuados de la forma farmacéutica.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los diluyentes: Medición
del Tamañode Partículapor Difracción de Luz (429), DensidadAparentey Densidadpor Asentamientode los Polvos(616), Cristalini-
dad (695), Caracterizaciónde SólidosCristalinospor Microcalorimetríay Calorimetríade Disolución(696), Densidadde Sólidos
(699), Pérdidapor Secado(731 ), MicroscopíaÓptica (776), Estimaciónde la Distribución del Tamañode Partículapor Tamizado
Analítico (786), Finurade Polvos(811 ), Área SuperficialEspecífica(846), Determinaciónde Agua (921) y Fluidezde Polvos(1174}.
Categoría Funcional: Aglutinante Vía Húmeda
DESCRIPCIÓN
Los aglutinantes de tabletas y cápsulas se incorporan a las formulaciones para facilitar la aglomeración del polvo en gránulos
durante el mezclado con un líquido de granulación, como por ejemplo agua, mezclas hidroalcohólicas u otros disolventes. El
aglutinante puede disolverse o dispersarse en el líquido de granulación o mezclarse en estado seco; además de que es posible
agregar por separado otros componentes y el líquido de granulación durante la agitación. Después de evaporarse el líquido de
granulación, los aglutinantes generalmente producen gránulos secos que adquieren las propiedades deseadas tales como ta-
maño de gránulo, distribución del tamaño, forma, contenido, masa y contenido activo. La granulación húmeda facilita el pro-
cesamiento adicional de los gránulos mejorando una o más de las propiedades del granulado tales como fluidez, manipula-
7636 (1059) Desempeño de Excipientes/ InformaciónGeneral USP42
ción, fortaleza mecánica, resistencia a la segregación, pulverulencia, apariencia, solubilidad, compactación o liberación del fár-
maco.
MECANISMOFUNCIONAL
Los aglutinantes son solubles o parcialmente solubles en el disolvente de granulación o, como en el caso de almidones nati-
vos, se pueden hacer solubles. Las soluciones concentradas de aglutinante también tienen propiedades adhesivas. Cuando se
agregan líquidos, los aglutinantes generalmente facilitan la producción de granulados húmedos (aglomerados) alterando la
adhesión entre partículas. También pueden modificar las propiedades interfaciales, viscosidad, u otras propiedades. Durante el
secado pueden producir puentes sólidos que generan una fortaleza mecánica residual mejorada del granulado seco.
PROPIEDADES
FÍSICAS
La dispersión o disolución de un aglutinante en el líquido de granulación depende de sus propiedades físicas: entre las pro-
piedades más importantes, dependiendo de la aplicación, se encuentran la tensión superficial, el tamaño de partícula, la distri-
bución de tamaño, la solubilidad y la viscosidad. La incorporación homogénea de un aglutinante a una mezcla seca depende
también de sus propiedades físicas, tales como tamaño de partícula, forma y distribución de tamaño. La viscosidad a menudo
es una propiedad importante que se debe considerar para los aglutinantes y, en el caso de los polímeros, se ve influenciada por
la naturaleza de la estructura polimérica, por el peso molecular y por la distribución del peso molecular. Los aglutinantes poli-
méricos pueden formar geles.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los aglutinantes para tabletas y cápsulas se pueden categorizar como (1) polímeros naturales, (2) polímeros sintéticos o (3)
azúcares. La naturaleza química de los polímeros, incluyendo la estructura polimérica, las propiedades y secuencia monoméri-
ca, los grupos funcionales, el grado de sustitución y el entrecruzamiento, influyen en las interacciones complejas que pueden
presentarse durante la granulación. Los polímeros naturales, particularmente, pueden presentar una variación mayor en sus
propiedades debido a variaciones en sus orígenes y, por tanto, en su composición.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los aglutinantes. Densi-
dad Aparentey Densidadpor Asentamientode los Polvos(616), Cromatografía(621 ), Cristalinidad(695), Densidadde Sólidos
(699), Pérdidapor Secado(731 ), Estimaciónde la Distribucióndel Tamañode Partículapor TamizadoAnalítico(786), Área Superfi-
cial Específica(846), Viscosidad-Métodos Capilares(911) y Fluidezde Polvos(1174).
Categoría Funcional: Desintegrante
DESCRIPCIÓN
Los desintegrantes son componentes funcionales que se agregan a las formulaciones para promover la desintegración rápida
en unidades más pequeñas y para permitir que el fármaco se disuelva con mayor rapidez. Los desintegrantes son sustancias
poliméricas naturales, sintéticas o naturales químicamente modificadas. Cuando los desintegrantes entran en contacto con
agua o fluido intestinal o estomacal, funcionan absorbiendo el líquido y comienzan a hincharse, a disolverse o a formar geles.
Esto ocasiona que la estructura de la tableta se rompa y se desintegre, produciendo mayores superficies para una mejor disolu-
ción del fármaco.
MECANISMO(S)FUNCIONAL(ES)
La capacidad de interactuar fuertemente con el agua es esencial para la función del desintegrante. Existen tres mecanismos
principales que describen la función de los diversos desintegrantes: aumento de volumen por hinchamiento, deformación y
acción capilar (capilaridad). En formulaciones de tabletas, la función de los desintegrantes se describe mejor como una combi-
nación de dos o más de estos efectos. El comienzo y grado de las acciones logradas localmente dependen de diversos paráme-
tros de un desintegrante, tales como su naturaleza química y su distribución de tamaño de partícula y forma de partícula, así
como de algunos parámetros importantes de las tabletas tales como dureza y porosidad.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Las propiedades físicas primarias pertinentes a un desintegrante son aquellas que describen la estructura de las partículas del
producto como un polvo seco o su estructura cuando entra en contacto con el agua. Estas propiedades pueden incluir (1)
t
USP42 Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 7637
distribución de tamaño de partícula, (2) velocidad de absorción de agua, (3) velocidad de hinchamiento o índice de hincha-
miento y (4) la caracterización del producto resultante independientemente de si se mantiene en partículas o si se forma un
gel.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los polímeros que se utilizan como desintegrantes son no iónicos o aniónicos con contraiones tales como sodio, calcio o
potasio. Los polímeros no iónicos son polisacáridos naturales o modificados físicamente tales como almidones, celulosas, pulu-
lano o polivinilpirrolidona entrecruzada. Los polímeros aniónicos son en su mayoría almidones modificados, productos de celu-
losa o poliacrilatos de bajo grado de entrecruzamiento. Estas propiedades químicas deben tomarse en cuenta para el caso de
los polímeros iónicos. El desempeño de desintegración se ve afectado por cambios en el pH del tracto gastrointestinal o por la
formación de complejos con fármacos iónicos.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los desintegrantes: Medi-
ción del Tamañode Partículapor Difracciónde Luz (429), MicroscopíaÓptica (776), Estimaciónde la Distribucióndel Tamañode
Partículapor TamizadoAnalítico (786) y Fluidezde Polvos(1174).
Categoría Funcional:Lubricante
DESCRIPCIÓN
Los lubricantes por lo general se usan para reducir las fuerzas de fricción entre partículas y entre partículas y superficies de
contacto metálicas del equipo de fabricación, tales como punzones y matrices para tabletas usados en la fabricación de formas
farmacéuticas sólidas. Los lubricantes líquidos se pueden absorber en la matriz del granulado antes de la compactación. Los
lubricantes líquidos también se pueden usar para reducir la fricción metal-metal en el equipo de fabricación.
MECANISMOFUNCIONAL
Los lubricantes de capa límite funcionan adhiriéndose a superficies sólidas (gránulos y partes metálicas) y reduciendo la fric-
ción partícula-partícula o la fricción partícula-metal. La orientación de las partículas del lubricante adherente se ve influenciada
por las propiedades de la superficie del sustrato. Para un desempeño óptimo, las partículas del lubricante de capa límite deben
estar compuestas de pequeños cristales en forma de placa o pilas de cristales en forma de placa. Los lubricantes de película
fluida se funden bajo presión creando así una película fluida delgada alrededor de las partículas y en la superficie de los punzo-
nes y matrices de las tableteadoras, lo que ayuda a reducir la fricción. Los lubricantes de película fluida se resolidifican después
de retirar la presión. Los lubricantes líquidos se liberan de los gránulos bajo presión y crean una película fluida. Estos no se
resolidifican cuando se retira la presión pero se reabsorben o redistribuyen a través de la matriz de la tableta con el transcurrir
del tiempo.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Las propiedades físicas que son importantes para la función de los lubricantes de capa límite incluyen tamaño de partícula,
área superficial, estado de hidratación y forma polimórfica. También pueden ser importantes la pureza (p. ej., relación esteara-
to:palmitato) y el contenido de humedad. Las propiedades físicas de posible importancia para los lubricantes de película fluida
son el tamaño de partícula y el comportamiento en estado sólido/térmico. La pureza también puede ser importante.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los lubricantes se pueden clasificar en lubricantes de capa límite, lubricantes de película fluida, o lubricantes líquidos. Los
lubricantes de capa límite son sales de ácidos grasos de cadena larga (p. ej., estearato de magnesio) o ésteres de ácidos grasos
(p. ej., fumarato sódico de estearilo) con una cabeza polar y una cola de ácido graso. Los lubricantes de película fluida son
grasas sólidas (p. ej., aceite vegetal hidrogenado, tipo 1), glicéridos (behenato y diestearato de glicerilo) o ácidos grasos (p. ej.,
ácido esteárico) que funden al someterlos a la presión. Los lubricantes líquidos son materiales líquidos que se liberan de los
gránulos bajo presión.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los lubricantes: Medición
del Tamañode Partículapor Difracciónde Luz (429), Cristalinidad(69S), Caracterizaciónde SólidosCristalinospor Microcalorimetría
7638 (1059) Desempeño de Excipientes/ Información General USP42
y Calorimetríade Disolución(696), Pérdidapor Secado(731 ), MicroscopíaÓptica (776), Estimaciónde la Distribucióndel Tamaño

de Partículapor TamizadoAnalítico (786), Área SuperficialEspecífica(846), Análiis Térmico(891 ), Determinaciónde Agua (921) y
Caracterizaciónde SólidosCristalinosy ParcialmenteCristalinospor Difracciónde RayosX SobrePolvo(DRXP)(941 ).
INFORMACIÓNADICIONAL
Algunos lubricantes, particularmente aquellos usados en formas farmacéuticas efervescentes, no caen en las categorías quí-
micas definidas anteriormente. Estos materiales se usan en situaciones especiales y no son adecuados para su aplicación univer-
sal. El talco es un material inorgánico que puede tener algunas propiedades lubricantes. Por lo general se usa en combinación
con lubricantes de película fluida para reducir la adhesión a los punzones y matrices.
Categoría Funcional: Deslizante y/o Agente Antiaglutinante
DESCRIPCIÓN
Los deslizantes y agentes antiaglutinantes se usan para promover la fluidez de polvos y para reducir el aglutinamiento o la
formación de grumos que puede presentarse cuando los polvos se almacenan a granel. Además, los deslizantes y agentes anti-
aglutinantes reducen la incidencia de puenteado durante el vaciado de tolvas para polvos y durante el procesamiento del pol-
vo.
MECANISMOFUNCIONAL
Se piensa que los deslizantes trabajan mediante una combinación de adsorción en la superficie de partículas más grandes y
la reducción de las fuerzas adhesivas y cohesivas entre partículas, permitiendo así que las partículas se muevan con mayor faci-
lidad en relación con las otras. Además, los deslizantes se pueden dispersar entre partículas más grandes y reducir de esta ma-
nera la fricción entre estas partículas. Los agentes antiaglutinantes pueden absorber humedad libre que de otro modo permiti-
ría el desarrollo de puentes entre partículas implicados en los fenómenos de aglutinamiento.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Las propiedades físicas primarias de potencial importancia para deslizantes y agentes antiaglutinantes son el tamaño de par-
tícula, distribución del tamaño de partícula y área superficial. Estos pueden ser ligeramente higroscópicos.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los deslizantes y agentes antiaglutinantes por lo general son materiales inorgánicos finamente divididos. Por lo general, son
insolubles en agua. Algunos de estos materiales son complejos.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los deslizantes o agentes
antiaglutinantes: Medicióndel Tamañode Partículapor Difracciónde Luz(429), Pérdidapor Secado(731 ), Estimaciónde la Distri-
bución del Tamañode Partículapor TamizadoAnalítico(786), Área SuperficialEspecífica(846) y Determinaciónde Agua (921 ).
Categoría Funcional: Agente Colorante
DESCRIPCIÓN
Los agentes colorantes se incorporan a las formas farmacéuticas a fin de producir una apariencia distintiva que se puede usar
para diferenciar un producto en particular de otros con apariencia física similar o, en algunos casos, para proteger componen-
tes fotolábiles de la forma farmacéutica. Estas substancias se subdividen en colorantes (sustancias solubles en agua), lacas (for-
mas insolubles de un colorante que resultan de su adsorción irreversible en un óxido metálico hidratado), pigmentos inorgáni-
cos (sustancias tales como dióxido de titanio u óxidos de hierro) y colorantes naturales (compuestos colorantes que no se con-
sideran colorantes per se, tales como riboflavina). Los agentes colorantes están sujetos a las reglamentaciones federales y, en
consecuencia, se debe determinar el estado reglamentario vigente de una sustancia dada antes de usarla.
La Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (Federal Food, Drug, and Cosmetic Act) define tres categorías de
agentes colorantes:
• Colorantes FD&C: colorantes certificables para su uso en la coloración de alimentos, medicamentos y cosméticos.
• Colorantes D&C: colorantes y pigmentos considerados seguros en medicamentos y cosméticos cuando entran en contac-
to con membranas mucosas o cuando se ingieren.
• Colorantes D&C de uso externo: colorantes que, debido a su toxicidad oral, no son certificables para su uso en productos
ingeribles pero que se consideran seguros para productos que se aplican externamente.
Cada organismo reglamentario puede tener diferentes requisitos para agentes colorantes y cantidades aceptables. Asimismo,
se debe considerar el consumo diario y acumulativo de los colorantes.
MECANISMOFUNCIONAL
Los colorantes solubles en agua por lo general se disuelven para su uso en un líquido de granulación, aunque también se
pueden adsorber en portadores tales como almidón, lactosa o azúcar a partir de soluciones acuosas o alcohólicas. Estos últimos
productos a menudo se secan y utilizan como ingredientes de formulación. Debido a su carácter insoluble, las lacas casi siem-
pre se mezclan con otros excipientes secos durante la formulación. Por esta razón, las tabletas de compresión directa a menu-
do se colorean con lacas.
PROPIEDADES
FÍSICAS
El tamaño y la distribución del tamaño de partícula de colorantes y lacas puede tener influencia sobre los tiempos de proce-
samiento del producto (mezclado y disolución), intensidad de color y uniformidad de apariencia. Un agente colorante no debe
reaccionar físicamente con otros excipientes ni con los fármacos.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Las propiedades más importantes de un agente colorante son su intensidad de color y resistencia a desteñirse con el tiempo.
Las sustancias se pueden clasificar por su eficiencia para reflejar los colores deseados del espectro de luz visible, así como por
sus absortividades molares a longitudes de onda características. Un agente colorante no debe reaccionar químicamente con
otros excipientes ni con los fármacos. La calidad de un agente colorante comúnmente se mide mediante una determinación
de su concentración, desempeño o valoración. El perfil de impurezas se establece mediante mediciones de materia insoluble,
contenido de sales inorgánicas, contenido metálico e impurezas orgánicas.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los agen-
tes colorantes: Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429) y Color-Medición Instrumental (1061 ). Se deben
usar métodos instrumentales para determinar el color absoluto de un agente colorante.
Los agentes colorantes están sujetos a las reglamentaciones federales y, en consecuencia, se debe determinar el estado regla-
mentario vigente de una sustancia dada antes de usarla.
Categoría Funcional: Cubierta de Cápsula
DESCRIPCIÓN
La palabra cápsula se deriva del latín 'capsula' que significa envase pequeño. Las cápsulas, entre otros beneficios, permiten
formular polvos y líquidos farmacéuticos con exactitud de dosificación y facilidad de transportación. El material de las cápsulas
debe ser compatible con todos los demás ingredientes en el medicamento. Las cápsulas duras por lo regular consisten en dos
partes: ambas son cilíndricas y una parte, denominada cuerpo, es ligeramente más larga que la otra. La tapa se ajusta estrecha-
mente al cuerpo para cerrar la cápsula. Por el contrario, la cápsula blanda es una unidad de una sola pieza que puede estar
sellada a lo largo de un eje o puede presentarse sin costura. El material de la cápsula se puede obtener por hidrólisis de coláge-
no de fuentes porcinas, bovinas o de peces, o puede ser de origen no animal, p. ej., entidades químicas celulósicas o de polisa-
cáridos. La cubierta de la cápsula también contiene otros aditivos tales como plastificadores, colorantes y conservantes. En al-
gunos casos, las cubiertas de las cápsulas se esterilizan para prevenir el crecimiento microbiano. La cubierta de la cápsula es
una parte integral de la formulación y por ende la fabricación robusta y el desempeño de la formulación dependen de la medi-
ción y del control de atributos críticos de los materiales. Las Cápsulas se pueden usar para administrar medicamentos por vía
oral, rectal, vaginal o inhalación.
MECANISMOFUNCIONAL
Las cápsulas pueden encerrar formulaciones sólidas, semisólidas y líquidas. Entre la variedad de beneficios que ofrecen las
cápsulas se incluye lo siguiente: enmascaran sabores desagradables, facilitan el cegado en estudios clínicos, facilitan el tragado
7640 (1059) Desempeño de Excipientes/ InformaciónGeneral USP42
y presentan una apariencia única. Las cubiertas de cápsulas convencionales se deben disolver rápidamente a 37º; en fluidos
biológicos tales como medios gástricos e intestinales. No obstante, las propiedades de solubilidad de la cubierta se pueden
modificar (p. ej., con polímeros entéricos o de liberación controlada) para controlar la liberación del contenido de las cápsulas.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Las propiedades físicas primarias pertinentes a las cubiertas de las cápsulas son aquellas que pueden tener un efecto directo
en el desempeño del producto (1) contenido de humedad, (2) permeabilidad a los gases, (3) estabilidad durante el almacena-
miento, (4) desintegración, (5) consistencia y (6) fragilidad. Elcontenido de humedad varía con el tipo de cápsula. Las cápsu-
las de gelatina dura por lo general contienen 13%-16% de agua en comparación con las cápsulas de hipromelosa (hidroxipro-
pil metilcelulosa o HPMC) que por lo regular presentan un 4%-7% de contenido de agua. Elcontenido de humedad tiene un
impacto importante en la tendencia a la fractura de las cápsulas. Las cápsulas de gelatina blanda contienen 5%-15% de agua.
El contenido de agua en equilibrio también puede ser crucial para la estabilidad de la forma farmacéutica debido a que se
puede producir migración de agua entre la cubierta y el contenido de las cápsulas. La permeabilidad a los gases puede ser
importante y por lo general es mayor en cápsulas de HPMC que en las cápsulas de gelatina debido a la presencia de estructu-
ras abiertas en las primeras. A diferencia de las cápsulas de HPMC, que no se entrecruzan, las cápsulas de gelatina pueden
sufrir entrecruzamiento, debido a la exposición ambiental y química. Las cápsulas de gelatina pueden experimentar entrecru-
zamiento durante el almacenamiento a una temperatura y humedad elevadas (p.ej. 40°/75% HR).Asimismo, se sabe también
que el material de las cubiertas de gelatina se entrecruza debido a la exposición a aldehídos, cetonas y algunos colorantes en
las formulaciones de las cubiertas. Por ende, se debe tomar en cuenta la presencia de estos materiales en los excipientes para
productos encapsulados en gelatina. El entrecruzamiento reduce la velocidad de disolución in vitro y a menudo requiere la
introducción de enzimas en el medio de prueba. Las cápsulas de gelatina deben desintegrarse dentro de los 15 minutos al
exponerlas a ácido clorhídrico al 0,5% a 36°-38º pero a una temperatura no menor de 30º. Las cápsulas de HPMC se pueden
desintegrar a una temperatura por debajo de 30º.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
La gelatina es una proteína comercial derivada de colágeno nativo. El producto se obtiene mediante hidrólisis parcial de co-
lágeno derivado de piel, tejido conectivo blanco y huesos de animales. La gelatina tipo A se obtiene mediante tratamiento
ácido, mientras que la gelatina tipo B se obtiene por tratamiento con bases. Las fuentes comunes de gelatina comercial son la
piel de cerdo, el cuero de ganado bovino, los huesos de ganado bovino, la piel de bacalao y la piel de tilapia. La cápsula de
gelatina también contiene, por lo general, agentes colorantes, plastificantes tales como alcoholes polihídricos, gomas y azúca-
res naturales y conservantes tales como metabisulfito de sodio y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Hoy en día, las cápsulas
sin gelatina mayormente usadas se fabrican con HPMC. Los diversos tipos de cápsulas contienen distintos niveles de humedad
y pueden, por tanto, influir sobre la estabilidad del medicamento. La composición detallada de un excipiente puede ser impor-
tante debido a que la función de la cubierta se puede ver influenciada por pequeñas cantidades de impurezas en los excipien-
tes (p. ej., peróxidos en aceites o aldehídos en lactosa y almidones) que pueden provocar entrecruzamiento en la cápsula Se
debe evaluar la presencia de materiales indeseables en las cubiertas de las cápsulas, tales como metales, sustancias odorantes,
sustancias insolubles en agua y dióxido de azufre, a fin de asegurar la estabilidad y el desempeño.
CAPÍTULOS
GENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de las cubier-
tas de las cápsulas: ExamenMicrobiológicode ProductosNo Estériles:Pruebasde RecuentoMicrobiano (61 ), ExamenMicrobiológico
de ProductosNo Estériles:Pruebasde MicroorganismosEspecíficos (62), Arsénico(211 ), ImpurezasElementales-Límites(232) e
ImpurezasElementales-Procedimientos(233), Residuode Incineración(281 ), Desintegración(701 ), Disolución(711 ), Determina-
ción de Agua (921) y Color-Método Instrumental(1061 ).
Además de los capítulos generales citados anteriormente, se puede encontrar información útil para asegurar la uniformidad
de las funciones de la cubierta de la cápsula seleccionada en la monografía de Gelatina,Consistenciadel Gel (Valor Bloom).
Categoría Funcional: Agente de Recubrimiento
DESCRIPCIÓN
Las tabletas orales pueden recubrirse usando recubrimiento por compresión, grageado o recubrimiento con película. El recu-
brimiento por compresión (en efecto comprimir una tableta dentro de una tableta) por lo general emplea los mismos ingre-
dientes que una tableta convencional y, por tanto, está fuera del alcance de esta sección. El término grageado se refiere a un
proceso y no requiere el uso de sacarosa como parte de la formulación. Las cápsulas orales pueden recubrirse usando procedi-
mientos de recubrimiento con película. Las razones para recubrir las formas farmacéuticas incluyen: enmascarar olores y sabo-
res desagradables, mejorar la ingestión y apariencia, proteger del ambiente a los ingredientes activos y modificar la liberación
del ingrediente activo (p. ej., velocidades de liberación controladas o liberación gastrointestinal). Los materiales usados como
agentes de recubrimiento difieren dependiendo del proceso de recubrimiento usado. El grageado es el proceso original de re-
cubrimiento. Sin embargo, debido a razones técnicas y económicas, hoy en día el grageado ha sido ampliamente reemplazado
por el recubrimiento con película. El grageado es un proceso complejo que generalmente implica la aplicación de diversas ca-
pas que incluyen una capa de sellado, una capa de pre-recubrimiento, una capa de engrosamiento, una capa de alisado, una
capa de color y una capa de pulido. Las soluciones o suspensiones de recubrimiento se vierten lentamente o se aplican de otro
modo en alícuotas sobre un lecho de tabletas en una paila (o bombo) que gira lentamente. El proceso de recubrimiento gene-
ralmente toma un largo periodo (que puede llevar varios días) y genera un incremento significativo en el peso de las tabletas.
Por el contrario, el recubrimiento con película es un proceso más simple en el que la solución o suspensión de recubrimiento
se rocía sobre las tabletas en una paila rotatoria o en un aparato de lecho fluido y genera únicamente un aumento modesto en
el peso de la cápsula o tableta. Los materiales usados en el grageado y el recubrimiento con película incluyen materiales natu-
rales, semisintéticos y sintéticos. Éstos pueden ser soluciones, suspensiones o dispersiones coloidales (látex o pseudolátex) que
se pueden aplicar como sistemas acuosos o no acuosos. Además, se pueden aplicar ceras y lípidos en estado fundido como
recubrimiento sin utilizar disolventes. Las ceras y los lípidos también se pueden aplicar en estado sólido como una capa de
pulido sobre el grageado o el recubrimiento con película.
MECANISMOFUNCIONAL-GRAGEADO
El recubrimiento de sellado se usa para sellar la superficie de los núcleos de tabletas para prevenir que el agua de las solucio-
nes o suspensiones de recubrimiento provoque la desintegración de los núcleos de las tabletas durante la etapa de recubri-
miento. El recubrimiento de sellado por lo general es un polímero (p. ej., goma laca) que es insoluble en agua y que se aplica
como una capa delgada a partir de una solución en un disolvente no acuoso. El componente clave de la mayoría de las solu-
ciones o suspensiones de grageado es un soluto, generalmente sacarosa, que es muy soluble en agua y que a muy alta con-
centración genera una solución pegajosa y viscosa (un jarabe). Se pueden disolver o suspender otros materiales en la solución
dependiendo de la etapa del proceso de recubrimiento. A medida que el recubrimiento se seca, el material de recubrimiento
disuelto se adhiere a la superficie de las tabletas. La solución o suspensión de recubrimiento por lo general se aplica en etapas
sucesivas, seguidas de secado, hasta que se haya obtenido el recubrimiento requerido. El recubrimiento de engrosamiento se
compone de otra capa delgada diseñada para adherirse a los núcleos que han sido sellados para proveer una base de pre-
recubrimiento de manera que la capa de engrosamiento se pueda adherir a la superficie de la tableta. El pre-recubrimiento por
lo general contiene una alta concentración de sólidos suspendidos y está diseñado para incrementar el peso de las tabletas de
manera comparativamente rápida. El recubrimiento de alisado (o glaseado) está diseñado para proveer una superficie lisa,
mientras que el recubrimiento de color provee el color final requerido. Finalmente, las tabletas pueden transferirse a una paila
de pulido y pulirse usando una mezcla de ceras para proveer un acabado de alto brillo.
MECANISMOFUNCIONAL-RECUBRIMIENTO
CON PELÍCULA
Los agentes de recubrimiento con película están compuestos de materiales formadores de película (ver CategoríaFuncional:
Agente Formadorde Película)que proporcionan propiedades farmacéuticas deseables, tales como apariencia, aceptación por
parte del paciente (p.ej. enmascaramiento de sabores y facilidad al tragar). Los agentes de recubrimiento con película también
pueden usarse para otros propósitos funcionales tales como proveer una barrera contra reacciones químicas indeseables o la
liberación inoportuna del fármaco. Después de su ingestión, el recubrimiento con película se puede disolver mediante proce-
sos como hidratación, solubilización o desintegración, dependiendo de la naturaleza del material usado. Los recubrimientos
entéricos son insolubles en medios ácidos (pH bajo) pero se disuelven con facilidad en condiciones de pH neutro. No obstante,
los polímeros de recubrimiento con película más comunes no tienen una solubilidad específica de pH. El espesor de la película
puede variar por la aplicación y la naturaleza de los agentes de recubrimiento. En el proceso de recubrimiento, las cadenas de
polímero se dispersan sobre la superficie del núcleo y coalecen en una película continua a medida que se evapora el disolvente.
Las soluciones o dispersiones de polímero con baja viscosidad y alta capacidad de unión de pigmentos reducen el tiempo de
aplicación del recubrimiento y permiten lograr una fabricación relativamente simple y económica. Los polímeros plásticos, ce-
ras y recubrimientos basados en lípidos se pueden aplicar sin disolventes mediante fundición y atomización. Cuando las gotitas
de fluido fundido impactan contra la superficie de las partículas de fármaco fluidizado, se dispersan y resolidifican para formar
capas de película. Por tanto, los materiales de recubrimiento con película generalmente tienen la capacidad de formar una pe-
lícula completa y estable alrededor del sustrato. El recubrimiento con película por lo regular se aplica de manera uniforme y se
seca cuidadosamente para asegurar la producción de un producto de calidad constante. Puede ser necesario el uso de plastifi-
cantes adecuados para disminuir la temperatura mínima de formación de la película del polímero, y los formuladores deben
considerar su efecto potencial sobre la liberación del fármaco.
PROPIEDADES
FÍSICAS
El grageado es un proceso largo y complejo. Las propiedades físicas del polímero de recubrimiento de sellado y de la solu-
ción son importantes, al igual que las propiedades físicas del componente del jarabe en las capas subsiguientes y de cualquier
sólido disuelto o suspendido, y los agentes de recubrimiento deben ser lo suficientemente estables durante su uso.
El recubrimiento con película es un proceso complejo y las características de un polímero formador de película son impor-
tantes. El tamaño de partícula de las dispersiones coloidales varía según su composición y fabricación (látex, pseudolátex o
polvo redispersado) y puede tener un efecto sobre la formación de la película. La tensión superficial de las preparaciones de
recubrimiento puede influir sobre el patrón de rociado en el proceso de fabricación. La película debe tener una elasticidad y
fortaleza mecánica suficientes para soportar las tensiones durante las operaciones de recubrimiento y envasado. Para los recu-
brimientos que se aplican en estado fundido sin disolventes (polímeros plásticos, ceras y recubrimientos basados en lípidos), el
intervalo de fusión y la viscosidad de fusión son las propiedades que requieren de mayor consideración por parte de los formu-
ladores.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los componentes del recubrimiento pueden ser de origen natural, semisintético o sintético y también pueden estar disponi-
bles en diferentes grados químicos. Comprenden una variedad de materiales químicos distintos. Los formuladores deben con-
siderar la naturaleza del material y su uso previsto al identificar y cuantificar los atributos críticos de los materiales para garanti-
zar el desempeño constante.
CAPÍTULOSGENERALES
tes de recubrimiento: Grasasy AceitesFijos(401), Medicióndel Tamañode Partículapor Difracción de Luz(429), Disolución(711),
Resistenciaa la Tensión(881), AnálisisTérmico(891), Viscosidad-MétodosCapilares(911), Viscosidad-MétodosRotatorios(912)
y Viscosidad-Métodode BolaRodante(913). Asimismo, los capítulos generales citados en CategoríaFuncional: Agente Formador
de Película(a continuación) también pueden ser adecuados para la evaluación de polímeros para recubrimiento con película.
La formulación del recubrimiento incluye a menudo el uso de aditivos. Los diluyentes sólidos (p. ej., alcoholes de azúcares,
celulosa microcristalina, carbonato de calcio y caolín) se pueden agregar para incrementar el contenido de sólidos del agente
de recubrimiento sin incrementar la viscosidad. Se puede usar ácido esteárico para mejorar la función protectora/barrera con-
tra la humedad de un recubrimiento. Es posible agregar agentes colorantes (p. ej., dióxido de titanio y óxido de hierro) para
modificar la apariencia.
Categoría Funcional: Plastificante
DESCRIPCIÓN
Un plastificante es una sustancia de bajo peso molecular que, cuando se la agrega a otro material-por lo regular un políme-
ro-lo vuelve flexible, elástico y más fácil de manejar. Los plastificantes son componentes clave que determinan las propieda-
des físicas de los sistemas farmacéuticos poliméricos tales como los recubrimientos de las tabletas y las cubiertas de las cápsu-
las.
MECANISMOFUNCIONAL
Los plastificantes funcionan incrementando la movilidad intramolecular e intermolecular de las macromoléculas que compo-
nen los materiales poliméricos. Lo anterior se logra interfiriendo con los mecanismos normales de unión intermoleculares e in-
tramoleculares en dichos sistemas. Los plastificantes más efectivos ejercen su efecto a bajas concentraciones, por lo regular me-
nos de 5% p/p. Los plastificantes comúnmente se agregan a los recubrimientos de película (sistemas acuosos y no acuosos) y a
las cubiertas de las cápsulas (duras y blandas) para mejorar la capacidad de trabajo y resistencia mecánica. Sin la adición de
plastificantes, dichos materiales pueden agrietarse o fracturarse prematuramente. Los plastificantes también se agregan a pre-
paraciones farmacéuticas semisólidas tales como cremas y ungüentos para mejorar sus propiedades reológicas.
PROPIEDADESFÍSICAS
Los plastificantes más comunes son sólidos o líquidos de bajo peso molecular(< 500 Da). Generalmente tienen puntos bajos
de fusión(< 100°) y pueden ser volátiles (es decir, ejercer una presión de vapor importante) a temperatura ambiente. Los plas-
tificantes pueden reducir la temperatura de transición vítrea (T9) del sistema al que se agregan.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Muchos plastificantes modernos son ésteres sintéticos tales como citratos y ftalatos. Los plastificantes farmacéuticos tradicio-
nales incluyen aceites, azúcares y sus derivados.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los exci-
pientes: DisolventesResiduales(467), Intervalo o Temperaturade Fusión(741 ), Índicede Refracción(831 ), PesoEspecífico(841 ),
AnálisisTérmico(891) y Determinaciónde Agua (921 ).
La selección de un plastificante apropiado a menudo está determinada por su parámetro de solubilidad, que se relaciona
con su densidad de energía cohesiva. Los valores de los parámetros de solubilidad para una gran cantidad de materiales comu-
nes se tabulan en textos de referencia. Para asegurar la máxima eficacia, el parámetro de solubilidad del plastificante y del sis-
tema polimérico que se está plastificando deben coincidir en la mayor medida posible.
Categoría Funcional: Agente Formador de Película
DESCRIPCIÓN
Los agentes formadores de película por lo general son polímeros que se pueden usar para preparar películas de polímero
para recubrir tabletas o cápsulas para administración oral, para modificar la apariencia, para modificar la liberación de fárma-
cos o para otros propósitos tales como formulaciones que se funden en la boca. Los materiales poliméricos usados como agen-
tes formadores de película se pueden derivar de fuentes naturales, semisintéticas o sintéticas, y se pueden proveer como pol-
vos, gránulos, soluciones previamente preparadas o dispersiones coloidales. Las dispersiones coloidales pueden contener otros
componentes tales como plastificantes, agentes tensoactivos, conservantes o estabilizantes. Los agentes formadores de película
pueden aplicarse como dispersiones coloidales (látex o pseudolátex) o como soluciones poliméricas acuosas, hidroalcohólicas o
no acuosas.
MECANISMOFUNCIONAL
Los agentes formadores de película por lo general están compuestos por materiales poliméricos que poseen la capacidad de
formar películas después de la evaporación del disolvente de una solución del polímero o de la fase continua de una dispersión
coloidal. Por ende, el polímero mismo debe ser un sólido a temperatura y humedad ambientes. Algunos polímeros pueden
formar películas sin incluir componentes agregados, pero otros polímeros pueden requerir el uso de componentes adicionales
tales como plastificantes.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Muchos agentes formadores de película poliméricos están disponibles en una variedad de grados físicos que por lo general
se basan en la viscosidad nominal del grado pertinente. Las propiedades físicas del polímero son las correspondientes a los
sólidos y muchos polímeros están disponibles como polvos o gránulos. Además de las propiedades normales de los polvos y
gránulos a granel, otras propiedades físicas importantes de un agente formador de película polimérico son la distribución de
peso molecular, que se vincula con la viscosidad nominal del grado y la temperatura de transición vítrea (Tg). Si el agente for-
mador de película se provee en forma de solución o dispersión previamente preparada, la viscosidad de la solución o disper-
sión puede afectar el desempeño, por lo que deberá monitorearse.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los agentes formadores de película comprenden un grupo diverso de materiales que incluyen materiales naturales, semisin-
téticos y sintetices, tal como se discutió anteriormente. Pueden tener grupos funcionales ionizables que imparten propiedades
que dependen del pH y también pueden estar disponibles en diversos grados químicos (p. ej., con diversos grados de sustitu-
ción química). Las monografías oficiales a menudo describen clases de materiales poliméricos que permiten un intervalo consi-
derable de composición. Los formuladores deben considerar estos factores al momento de identificar atributos críticos de los
materiales y de establecer especificaciones para asegurar un desempeño uniforme.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas del agente
formador de película: Grasasy AceitesFijos(401 ), Medición del Tamañode Partículapor Difracciónde Luz (429), DensidadAparen-
te y Densidadpor Asentamientode Polvos(616), Cromatografía(621 ), Densidadde Sólidos(699), Disolución(711 ), Microscopía
Óptica (776), pH (791 ), Resistenciaa la Tensión(881 ), AnálisisTérmico(891 ), Viscosidad-Métodos Capilares(911 ), Viscosidad-
Métodos Rotatorios(912), Viscosidad-Método de Bola Rodante(913), Procedimientospara el Muestreode Polvosa Granel(1097),
Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano(1119), Espectroscopía Raman(1120), FormasFarmacéuticas(1151 ), Fluidezde Polvos
(1174) y MicroscopíaElectrónicade Barrido(1181 ).
Categoría Funcional: Saborizantes y Fragancia

DESCRIPCIÓN
Un saborizante es una entidad química individual o una mezcla de productos químicos de origen sintético o natural que
tiene la capacidad de producir una respuesta de sabor o aroma (es decir, fragancia) cuando se consume por vía oral o se huele.
El propósito principal del saborizante que se agrega a una preparación farmacéutica es proveer todo o parte del sabor y aroma
del producto que se lleva a la boca. Los saborizantes a menudo se usan en tabletas farmacéuticas de desintegración oral, solu-
ciones orales y suspensiones orales para enmascarar el sabor desagradable del fármaco y para hacer que la formulación sea
más agradable al paladar, con lo que se promueve el cumplimiento por parte del paciente con la ingesta requerida.
MECANISMOFUNCIONAL
Los químicos disueltos en la saliva excitan a los quimioreceptores en las papilas gustativas que residen principalmente en la
lengua y que generan la percepción de sabor. La disolución también libera productos químicos volátiles que alcanzan a los
receptores olfativos generando así la percepción de aromas. La combinación de las respuestas de gusto y olor constituyen el
sabor. Los humanos pueden distinguir entre cinco componentes de sabor: ácido, salado, dulce, amargo, no dulce, así como un
amplio rango de olores específicos. Los mejoradores y modificadores de sabor se pueden usar para modificar el perfil de dulzu-
ra de un agente endulzante o para enmascarar sabores. Por ejemplo, se sabe que los ácidos orgánicos tales como el ácido
aspártico y glutámico reducen el amargor.
PROPIEDADES
FÍSICAS
La percepción de sabor depende de factores fisicoquímicos, fisiológicos y psicológicos. Todas las propiedades físicas tales co-
mo tamaño de partícula, solubilidad, humectación, textura y color influyen sobre los sentidos. Además del sabor, los atributos
sensoriales de la vista (p. ej., color llamativo), sonido (p. ej., el crujido de una tableta masticable) y la sensación en la boca (p.
ej., viscoso, pegajoso, calcáreo, empalagoso o acuoso) también contribuyen con la experiencia sensorial general.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los productos químicos que proveen uno de los cinco sabores básicos poseen una amplia variedad de estructuras, grupos
funcionales y pesos moleculares. Los productos químicos usados para impartir sabor a las preparaciones farmacéuticas median-
te olor y sabor tienden a presentar pesos moleculares bajos(< 250 Da) y grupos funcionales polares tales como ésteres, ceto-
nas, aldehídos, aminas o alcoholes. Para incrementar la estabilidad de los sabores en una forma farmacéutica sólida y para mi-
nimizar las interacciones entre sabor y fármaco, los formuladores pueden agregar saborizantes encapsulados o secados por as-
persión.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los saborizantes: Medi-
ción del Tamañode Partículapor Difracciónde Luz (429), Cromatografía(621 ), Temperaturade Solidificación(651 ), Pérdidapor
Secado(731 ), Intervalo o Temperaturade Fusión(741 ), RotaciónÓptica (781 ), Estimaciónde la Distribucióndel Tamañode Partícu-
la por TamizadoAnalítico (786), Índicede Refracción(831) y PesoEspecífico (841 ).
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Categoría Funcional: Agente Modificador de Liberación
Los agentes de modificación de la liberación se usan para controlar la liberación de fármacos en las formulaciones de libera-
ción prolongada (también referidas como formulaciones de liberación controlada). Los agentes de liberación sostenida y recu-
brimiento entérico se incluyen en CategoríaFuncional: Agentede Recubrimiento.
DESCRIPCIÓN
Los agentes modificadores de liberación cambian el patrón de liberación de fármacos de un medicamento para lograr el per-
fil plasmático deseado en un tiempo determinado. La mayoría de los agentes modificadores de liberación son polímeros que
difieren en términos de solubilidad, facilidad de erosión, velocidad de dilatación o sensibilidad al ambiente biológico en el que
se colocan. Estos polímeros se han empleado para fabricar sistemas de administración de fármacos basados en matrices o
membranas para las vías de administración oral, parenteral, transdérmica, entre otras. Los sistemas de liberación de fármacos
controlados por matrices se pueden clasificar como matrices hidrófilas erosionables, matrices hidrófilas no erosionables o ma-
trices hidrofóbicas. En los sistemas de liberación de fármacos controlados por membrana el reservorio del fármaco se recubre
con una membrana polimérica que controla la velocidad, la cual puede consistir en una mezcla de polímeros para controlar la
liberación. Dichos dispositivos pueden tomar la forma de tabletas, cápsulas, microesferas, vesículas, fibras, parches, entre otros.
Además de los polímeros, algunos excipientes basados en lípidos también pueden usarse como agentes modificadores de libe-
ración en dispositivos de matriz hidrofóbica y en otros tipos de sistemas de liberación modificada. Por lo regular, estos materia-
les basados en lípidos son grasas y ceras o materiales relacionados con intervalos de fusión por encima de 45º.
MECANISMOFUNCIONAL
Al entrar en contacto con un fluido biológico, los polímeros que controlan la liberación pueden experimentar una variedad
de cambios físicos tales como hinchamiento, gelificación, disolución o erosión, cada uno de los cuales se puede disparar por
una simple exposición acuosa, o se puede modular por el pH, la tensión osmótica o las interacciones con la bilis u otros conte-
nidos intestinales. Además de los cambios físicos, los polímeros pueden experimentar degradación química por ácidos, bases,
enzimas, agua, calor, por mencionar algunos. Cualquiera de estos mecanismos o todos ellos pueden actuar de manera coordi-
nada para controlar la velocidad a la que se libera el fármaco del sistema de liberación.
Para matrices hidrófilas en las que la difusión del fármaco domina la velocidad de liberación, la velocidad de liberación de
fármacos depende de las propiedades del gel polimérico, y la naturaleza de la fase continua en los intersticios del gel influencia
las velocidades de disolución y difusión del fármaco. En el caso de las matrices erosionables, el gel se erosiona debido a la ac-
ción mecánica del tracto gastrointestinal a medida que la captación de agua se incrementa, y el gel se vuelve más diluido,
reduciendo así la distancia de difusión o liberando partículas de fármaco que se disuelven posteriormente. Los materiales hi-
drofóbicos que forman matrices son insolubles. La liberación de fármacos de dichos sistemas está regulada por la difusión del
fármaco a través de los poros tortuosos que se van produciendo a medida que los componentes solubles se disuelven.
Los sistemas de liberación de fármacos basados en membrana incluyen tabletas, cápsulas y microesferas con recubrimientos
poliméricos. Los mecanismos de liberación de fármacos de dichos sistemas son complejos y dependen de las características
fisicoquímicas del fármaco y de los polímeros o lípidos usados, así como de factores biológicos en el caso de sistemas biocom-
patibles y biodegradables. Con mayor frecuencia, la liberación de fármacos de dichos sistemas está regulada por la difusión del
fármaco a través de la membrana hidratada que controla la velocidad.
Otros sistemas de liberación modificada para uso parenteral incluyen nanopartículas de lípidos sólidos y liposomas. Los me-
canismos de liberación para estos sistemas a menudo implican una interacción complicada con los procesos biológicos tales
como una depuración potencial a través del sistema reticuloendotelial, liberación dirigida y captación celular.
Los dispositivos de bomba osmótica representan un caso especial de los sistemas de administración por membrana. El polí-
mero que controla la velocidad es insoluble y semipermeable-es decir, permitirá la difusión de agua-no así de moléculas de
fármaco-a través de la membrana. La liberación se controla mediante la presión osmótica de los componentes en el centro y
de la viscosidad de la solución o suspensión resultante. La salida de la solución o suspensión del fármaco, se fuerza a través de
un orificio en la membrana, que típicamente se perfora con un láser durante la fabricación del producto.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Las propiedades físicas del excipiente que controla la liberación dependen del tipo químico: polímero hidrófilo, polímero hi-
drofóbico, mezclas de polímeros semipermeables o lípidos, ceras o polímeros biodegradables (que pueden ser hidrófilos o hi-
drofóbicos).
Los polímeros hidrófilos forman un gel al entrar en contacto con agua o medios acuosos. Típicamente estos polímeros son
de grados de peso molecular elevado debido a que deben proveer resistencia a la acción mecánica del tracto gastrointestinal
durante el pasaje. A las concentraciones generalmente usadas durante la liberación in vivo, estos polímeros de pesos molecula-
res altos a menudo no presentan propiedades newtonianas, excepto en solución muy diluida (si son solubles). Los formulado-
res deben monitorear las propiedades cinéticas y viscoelásticas de los geles formados en el medio de liberación.
Los polímeros hidrofóbicos son insolubles en agua y sus propiedades en solución se determinan en soluciones no acuosas.
Los polímeros usados en la preparación de membranas semipermeables en dispositivos de bomba osmótica también son inso-
lubles en agua y, de manera similar, sus propiedades en solución se determinan en soluciones no acuosas. De forma parecida,
los materiales hidrofóbicos basados en lípidos son insolubles en agua.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los agentes que controlan la velocidad pueden ser de muchos orígenes y tipos diferentes y se encuentran disponibles en
una variedad de grados que reflejan la considerable variación química en sus estructuras y propiedades químicas. Los formula-
dores deben considerar estas variables durante cualquier investigación química y cuando consideren los efectos de la estructu-
ra química sobre el desempeño del excipiente. Las propiedades de interés pueden incluir composición química de copolímeros
y derivados celulósicos, grado de ionización, peso molecular, grado de entrecruzamiento o, para lípidos, composición de áci-
dos grasos. Las impurezas residuales del proceso de fabricación tales como monómeros, iniciadores, agentes de extinción, pe-
róxidos y aldehídos pueden afectar la estabilidad del fármaco y se deben monitorear.
CAPÍTULOSGENERALES
tes modificadores de liberación: Grasasy AceitesFijos(401 ), Medicióndel Tamañode Partículapor Difracciónde Luz(429), Crista-
linidad (695), Caracterizaciónde SólidosCristalinospor Microcalorimetríay Calorimetríade Disolución(696), Disolución(711 ), Pér-
didapor Secado(731 ), Intervalo o Temperaturade Fusión(741 ), Espectroscopía de ResonanciaMagnét~caNuclear(761 ), Microsco-
pía Optica (776), Estimaciónde la Distribucióndel Tamañode Partículapor TamizadoAnalítico (786), Area SuperficialEspecífica
(846), Espectroscopía en el Infrarrojo Medio (854) y Espectroscopía
Ultravioleta-Visible(857), Resistenciaa la Tensión(881 ), Análisis
Térmico(891 ), Viscosidad-Métodos Capilares(911 ), Viscosidad-Métodos Rotatorios(912), Viscosidad-Método de Bola Rodante
(91 3), Determinaciónde Agua (921 ), Caracterizaciónde SólidosCristalinosy ParcialmenteCristalinospor Difracciónde RayosX So-
bre Polvo(DRXP)(941 ), Fluidezde Polvos(1174) y MicroscopíaElectrónicade Barrido(1181 ).
Algunos agentes modificadores de liberación pueden incluir aditivos tales como agentes antioxidantes o antiaglutinantes.
LÍQUIDOSORALES
Categoría Funcional: Modificador de pH (Agente Acidificante/ Agente Alcalinizante/ Agente

Amortiguador)
DESCRIPCIÓN
La concentración de ión de hidrógeno, [H•], en una solución acuosa se expresa como pH = - log(H•). El pH del agua pura es
7 a 25º. Una solución acuosa es ácida a un pH < 7 y alcalina a un pH > 7. Se puede agregar un ácido para acidificar una solu-
ción. De manera similar, se puede usar una base para alcalinizar una solución. Un amortiguador es un ácido (o base) débil y su
sal. Cuando un amortiguador está presente en una solución, la adición de pequeñas cantidades de ácido o base fuerte produce
solo un pequeño cambio en el pH de la solución. La capacidad amortiguadora se ve influenciada por la relación sal/ácido (o
base/sal) y la concentración total de ácido (o base) y sal. El pH de las soluciones farmacéuticas por lo regular se controla usan-
do agentes acidificantes/alcalinizantes y amortiguadores para (1) mantener un pH cercano al del fluido corporal pertinente pa-
ra evitar la irritación; (2) mejorar la estabilidad de un fármaco cuando se determine que ésta depende del pH; (3) controlar la
solubilidad en equilibrio de ácidos o bases débiles; y (4) mantener un estado de ionización uniforme de las moléculas durante
el análisis químico, p. ej., cromatografía líquida de alta resolución.
MECANISMOFUNCIONAL
Los equilibrios de ionización de bases débiles, ácidos débiles y agua son la clave de las funciones de los agentes acidificantes,
alcalinizantes y amortiguadores. La reacción autoprotolítica del agua se puede expresar como
H2 0 + H20 +-> H,0• + OH-
La constante de autoprotólisis (o producto iónico) del agua es Kw= 1 x 10-14 a 25º y varía significativamente con la temperatu-
ra. Debido a que las concentraciones de iones de hidrógeno e hidroxilos en el agua pura son iguales, cada una tiene el valor de
aproximadamente 1 x 10-7 moles/L, lo que conlleva a un pH neutro de 7 a 25º. Cuando se agrega un ácido, base o sal de un
ácido (o base) débil, el equilibrio de ionización del agua se modifica de manera que [H+][OH-Jse mantiene constante, lo que
resulta en un pH de la solución que es diferente de 7.
PROPIEDADESFÍSICAS
Los modificadores del pH generalmente se disuelven en formas farmacéuticas líquidas. Las propiedades físicas pueden ser
importantes y deben considerarse debido a que pueden influenciar los requisitos de procesamiento (p. ej., el tamaño de partí-
cula puede influenciar el tiempo de mezclado requerido para disolver un modificador del pH).
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los amortiguadores y modificadores del pH influyen sobre el pH, la capacidad amortiguadora, la osmolalidad, la osmolari-
dad y la conductividad del agua de la solución. Cuando se usan en un análisis químico, los amortiguadores deben ser química-
mente compatibles con los reactivos y la sustancia de prueba. Los amortiguadores usados en sistemas fisiológicos no deben
interferir con la actividad farmacológica del medicamento ni con la función normal del organismo.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas del modifica-
dor del pH o agente amortiguador: Conductividaddel Agua (645), Osmolalidady Osmolaridad(785) y pH (791 ).
Categoría Funcional: Agente Humectante y/o Solubilizante
DESCRIPCIÓN
Los solubilizantes se pueden usar para disolver moléculas que de otro modo serían insolubles. Funcionan facilitando la trans-
ferencia espontánea de fase para producir una solución termodinámicamente estable. Una variedad de solubilizantes se en-
cuentra disponible comercialmente. Los solubilizantes aceptables para aplicaciones farmacéuticas han sido totalmente evalua-
dos en animales para comprobar su seguridad y toxicología. Los agentes humectantes incrementan las propiedades de disper-
sión y penetración de un líquido mediante la reducción de su tensión superficial.
MECANISMOFUNCIONAL
Los agentes humectantes y solubilizantes comprenden una variedad de estructuras o clases químicas distintas. Algunos solu-
bilizantes tienen estructuras químicas únicas. Por ejemplo, una entidad hidrófila se puede amarrar a una entidad hidrofóbica
para producir formas y morfologías definidas de micelas en agua, lo que facilita la solubilización. El mecanismo de solubiliza-
ción a menudo se asocia con una interacción favorable del agente insoluble y el núcleo interior del ensamble solubilizante
(p.ej. micelas). En otros casos, se presentan sitios hidrofóbicos únicos capaces de formar complejos de inclusión. Otros tipos de
solubilizantes emplean una gama de cadenas poliméricas que interactúan con moléculas hidrofóbicas para incrementar la solu-
bilidad disolviendo el agente insoluble en las cadenas poliméricas.
PROPIEDADESFÍSICAS
Los agentes humectantes y solubilizantes son generalmente materiales sólidos, líquidos o cerosos. Sus propiedades físicas de-
penden de sus estructuras químicas. Sin embargo, las propiedades físicas y el desempeño de los agentes humectantes y solubi-
lizantes dependen de las propiedades tensoactivas de los solubilizantes y del balance hidrófilo-lipofílico (HLB,por sus siglas en
inglés). Los materiales con con valores HLBmás bajos se comportan como emulsificantes, mientras que aquéllos con valores
HLBmás altos se comportan generalmente como solubilizantes. Por ejemplo, el lauril sulfato de sodio (HLB40), un agente
humectante y solubilizante comúnmente usado, es hidrófilo y altamente soluble en agua y, cuando se dispersa en agua, redu-
ce espontáneamente la tensión superficial y forma micelas que sirven para solubilizar materiales lipofílicos.
Las propiedades únicas de hidrofilia e hidrofobia de los solubilizantes se pueden caracterizar por sus estructuras químicas,
números de agregación o concentraciones micelares críticas (CMC). El valor de CMC es único para cada solubilizante indivi-
dual con cadenas hidrófilas, lipofílicas y/o hidrofóbicas. La CMC es una medida de la concentración a la que las moléculas ten-
soactivas forman agregados, los cuales pueden solubilizar el soluto incorporando una parte en el interior hidrofóbico. Tales in-
teracciones con la molécula insoluble estabilizan adicionalmente las moléculas en los ensambles completos, sin precipitación.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Las propiedades químicas y tensoactivas dependen de las estructuras de los solubilizantes. Debido a la naturaleza compleja
de las interacciones soluto-disolvente-solubilizante, los científicos farmacéuticos deben considerar, identificar y controlar cui-
dadosamente los atributos críticos de los solubilizantes.
CAPÍTULOSGENERALES
solubilizante: Grasasy AceitesFijos(401 ), Medición del Tamañode Partículapor Difracciónde Luz (429), pH (791 ), PesoEspecífico
(841 ), Área SuperficialEspecífica(846), Espectroscopíaen el Infrarrojo Medio (854) y Espectroscopía
Ultravioleta-Visible(857), Análi-
sis Térmico(891 ), Viscosidad-Métodos Capilares(911 ), Viscosidad-Métodos Rotatorios(912), Viscosidad-Método de Bola Ro-
dante (913) y MicroscopíaElectrónicade Barrido(1181 ).
Categoría Funcional: Conservante Antimicrobiano
DESCRIPCIÓN
Los conservantes antimicrobianos se usan para matar o prevenir el crecimiento de bacterias, hongos filamentosos y levadu-
ras en la forma farmacéutica.
MECANISMOFUNCIONAL
Los conservantes actúan mediante una variedad de mecanismos para controlar microbios. La mayoría actúan en la membra-
na celular, ocasionando daños en la membrana y alteración de la permeabilidad celular. Otros modos de acción incluyen inhi-
bición del transporte, precipitación de proteínas y desacoplamiento del gradiente de protones. Algunos conservantes son bac-
tericidas (matan bacterias u hongos filamentosos y levaduras); algunos son bacteriostáticos (inhiben el crecimiento de microor-
ganismos); mientras que otros son esporicidas (matan esporas). Algunos de los conservantes pueden actuar sinergísticamente
(p. ej., combinaciones de parabenos).
PROPIEDADES
FÍSICAS
Los antimicrobianos por lo general son solubles en agua en los intervalos de concentración en los que resultan efectivos. La
presión de vapor de estos agentes es importante, en especial si la forma farmacéutica está destinada para liofilización o secado
por aspersión. Algunos de estos agentes son inflamables. Comprender el coeficiente de partición de un excipiente es importan-
te debido a que la partición de un conservante en una fase oleosa puede disminuir la concentración del mismo en la fase acuo-
sa, lo que a su vez reducirá su valor como conservante.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los conservantes fenólicos pueden experimentar oxidación y formación de color. Se deben tomar en cuenta las incompatibi-
lidades de los conservantes (mezclas catiónicas y aniónicas, adsorción en tubos o filtros, o unión con surfactantes y proteínas)
durante el desarrollo del producto.
CAPÍTULOSGENERALES
tes antimicrobianos: MedicamentosInyectablesy en Implantes(1 ), Pruebasde EficaciaAntimicrobiana(51 ), ExamenMicrobiológico
de ProductosNo Estériles:Pruebasde RecuentoMicrobiano (61 ), ExamenMicrobiológicode ProductosNo Estériles:Pruebasde Micro-
organismosEspecíficos (62) y AgentesAntimicrobianos-Contenido (341 ).
Se deben considerar los requisitos de seguridad y etiquetado con respecto al uso de conservantes antimicrobianos.
Categoría Funcional: Agente Quelante y/o Complejante
DESCRIPCIÓN
Los agentes quelantes forman moléculas complejas solubles con ciertos iones metálicos (p. ej., cobre, hierro, manganeso,
plomo y calcio) y, en esencia, eliminan los iones de la solución para minimizar o eliminar su capacidad de reaccionar con otros
elementos y/o para precipitar. Estos agentes se usan en preparaciones farmacéuticas (formulaciones orales, parenterales y tópi-
cas), cosméticos y alimentos para secuestrar iones de la solución y formar complejos estables. Los agentes quelantes también
son conocidos como quelantes, queladores o agentes secuestrantes.
Los agentes complejantes forman moléculas complejas solubles (p. ej., complejos de inclusión) con otros solutos (p. ej., fár-
macos) y pueden influenciar propiedades físicas y químicas tales como solubilidad y estabilidad.
MECANISMOFUNCIONAL
Los agentes quelantes se usan para secuestrar iones metálicos indeseables de la solución. Su estructura química les permite
actuar como una "pinza" para asociarse con el átomo metálico formando una estructura de anillo heterocíclico. Los agentes
complejantes funcionan de manera similar pero mecanísticamente y no requieren (por definición) de una estructura de pinza
de dos dedos ya que se pueden asociar mediante uno o más sitios de unión. Todos los agentes quelantes son agentes comple-
jantes, pero no todos los agentes complejantes son agentes quelantes. Los agentes quelantes se usan como sinergistas antioxi-
dantes, sinergistas antimicrobianos y ablandadores de agua. Los agentes quelantes reducen la propensión a reacciones oxidan-
tes secuestrando los iones metálicos de la solución. Los agentes quelantes tienen además la capacidad de mejorar la eficacia
antimicrobiana generando un ambiente deficiente en iones metálicos que de otro modo alentaría el crecimiento microbiano.
Los agentes complejantes por lo general forman moléculas complejas solubles con solutos (p. ej., moléculas de fármacos)
que pueden influenciar las propiedades físicas, químicas y de liberación del fármaco. Los agentes complejantes que forman
complejos de inclusión por lo general contienen una cavidad hidrofóbica en la que se puede introducir un fármaco, además de
una región externa más hidrófila.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Los agentes quelantes y complejantes por lo general son solubles en agua y generalmente se disuelven en formas farmacéu-
ticas líquidas. Las propiedades físicas pueden ser importantes y deben considerarse debido a que pueden influenciar los requisi-
tos de procesamiento (p. ej., el tamaño de partícula puede influenciar el tiempo de mezclado requerido para disolver). Los
agentes quelantes y complejantes presentan diferentes grados de higroscopicidad. Debido a que los agentes quelantes se usan
en niveles muy bajos, su distribución del tamaño de partícula puede ser importante para permitir una uniformidad de conteni-
do aceptable en las formas farmacéuticas.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los agentes quelantes forman complejos con iones metálicos mediante cualquier combinación de enlaces iónicos y covalen-
tes. Las soluciones acuosas diluidas pueden ser neutras, ácidas o alcalinas. El ácido edético y sus sales son incompatibles con
oxidantes fuertes, bases fuertes y iones metálicos polivalentes (p. ej., cobre y níquel). Los agentes específicos para una formula-
ción se seleccionan basándose en su solubilidad, su afinidad por el ión metálico diana y su estabilidad. Las sales de edetato son
más solubles que el ácido libre. A diferencia de otras sales de edetato y del ácido libre, el edetato cálcico disódico no secuestra
calcio y por lo tanto se prefiere para prevenir la hipocalcemia. También se prefiere para quelar metales con la liberación de
iones de calcio. De manera alternativa, se puede usar edetato disódico para tratar la hipercalcemia. El ácido edético producirá
descarboxilato si se calienta a una temperatura por encima de 150º.
Los agentes complejantes por lo general forman complejos moleculares con fármacos que son dependientes de las propie-
dades físicas y químicas del agente complejante. La capacidad de un soluto para formar un complejo de inclusión depende del
peso molecular del agente complejante, de su estructura química y de las dimensiones de la cavidad hidrofóbica.
CAPÍTULOSGENERALES
tes quelantes y complejantes: Pruebasde EficaciaAntimicrobiana(51 ), ExamenMicrobiológicode ProductosNo Estériles:Pruebas
de RecuentoMicrobiano (61 ), ImpurezasElementales-Límites(232) e ImpurezasElementales-Procedimientos(233), Hierro (241 ),
Plomo(251 ), AgentesAntimicrobianos-Contenido (341 ), Medición del Tamañode Partículapor Difracciónde Luz (429), Pérdida
por Secado(731 ), pH (791 ), Determinaciónde Agua (921) y ProductosDerivadosde Célulasy Tejidos(1046).
Categoría Funcional: Antioxidante
DESCRIPCIÓN
Esta categoría aplica a los antioxidantes usados como estabilizadores in vitro de preparaciones farmacéuticas para mitigar los
procesos de oxidación. Los antioxidantes usados para su actividad biológica in vivo se pueden considerar como ingredientes
activos con efectos terapéuticos por lo que no se analizan en este capítulo. Los antioxidantes retrasan la aparición y/o reducen
significativamente la velocidad de las reacciones oxidativas complejas que de otro modo podrían tener un efecto perjudicial en
el fármaco. Los antioxidantes también se pueden considerar para proteger componentes inactivos tales como aceites insatura-
dos, lípidos pegilados, saborizantes y aceites esenciales. De esta forma, los antioxidantes conservan la integridad general de la
forma farmacéutica contra el estrés oxidativo. Los antioxidantes son más efectivos cuando se incorporan en la fórmula para
prevenir o retardar las reacciones en cadena y para inhibir a los radicales libres e hidroperóxidos de tomar parte en los proce-
sos en cascada descritos anteriormente. La aplicación efectiva de antioxidantes y la evaluación de su eficacia requieren com-
prender los mecanismos oxidativos y la naturaleza de los subproductos que generan. La autooxidación se inicia cuando el oxí-
geno reacciona con un sustrato para formar especies altamente reactivas conocidas como radicales libres (RH ➔ R. ). Después
de la "iniciación", los radicales libres en presencia de oxígeno pueden desatar reacciones en cadena (R • + 0 2 ➔ ROO. y ROO.
+ RH➔ R • + ROOH) para formar radicales peroxi, hidroperóxidos y nuevos radicales alquílicos que pueden iniciar y luego pro-
pagar sus propias reacciones en cadena. Las reacciones en cascada durante la fase de propagación se pueden acelerar median-
te calor, luz y catalizadores metálicos. Ante la presencia de trazas de catalizadores metálicos (Cu•, Cu2•, Fe2•y Fe3•), los hidro-
peróxidos (ROOH) se descomponen fácilmente en RO • y ROO• y, de manera subsiguiente, pueden desencadenar reacciones
con el APIy/o los excipientes (p. ej., hidrocarburos) para formar ácidos hidroxílicos, ceto ácidos y aldehídos que pudieran tener
efectos indeseables adicionales. Se debe tener en cuenta que los hidroperóxidos no son solo productos de reacción de los me-
canismos oxidativos dentro de una formulación. También se pueden encontrar cantidades residuales de hidroperóxidos en ex-
cipientes usados comúnmente como polietilenglicoles, polivinilpirrolidona y polisorbatos. La fase de iniciación por lo general es
lenta y tiene un efecto limitado sobre la calidad del producto terminado. Por el contrario, la fase de propagación implica la
degradación rápida e irreversible de especies químicas.
MECANISMOFUNCIONAL
Los antioxidantes se pueden agrupar por su modo de acción. A los antioxidantes fenólicos que bloquean las reacciones en
cadena de los radicales libres también se les conoce como antioxidantes verdaderos o primarios. Este grupo consiste en com-
puestos monohidroxi o polihidroxi fenólicos con sustituciones en el anillo. Presentan una energía de activación muy baja para
donar átomos de hidrógeno a cambio de los electrones de radicales que son rápidamente deslocalizados por radicales libres. Al
aceptar los electrones de radicales estabilizan a los radicales libres. La reacción produce radicales libres de antioxidantes que
también pueden reaccionar con radicales libres de lípidos para formar otros compuestos estables. De esta forma pueden blo-
quear las reacciones oxidativas en cadena tanto en la etapa de iniciación como de propagación. Debido a su solubilidad, los
antioxidantes fenólicos son más efectivos para proteger aceites y sustancias activas solubles en aceite contra el estrés oxidativo.
Los agentes reductores son por lo general antioxidantes solubles en agua (p. ej., ácido L-ascórbico) con un potencial redox
menor que el del fármaco o excipiente que protegen. Estos retrasan el inicio y la velocidad de las reacciones oxidantes reaccio-
nando con el oxígeno y otras especies reactivas. El potencial de remoción de oxígeno de los agentes reductores puede ser
sensible al pH y puede además verse negativamente afectado por la presencia de trazas de elementos. Los agentes quelantes
se unen con los metales libres (Cu•, Cu2•, Fe2• y Fe3•) que pudieran estar presentes en trazas en la formulación. Los complejos
iónicos formados nuevos no son reactivos. Por consiguiente, los agentes quelantes eliminan la capacidad de los catalizadores
metálicos de participar en reacciones oxidativas que ocurren durante la etapa de propagación.
La utilidad de los antioxidantes se puede maximizar mediante el uso sinergístico de uno o dos antioxidantes primarios en
conjunto con agentes reductores y quelantes. El efecto combinado a menudo es mayor que la suma de los efectos individuales
de cada antioxidante (efecto sinergístico).
PROPIEDADES
FÍSICAS
La solubilidad del antioxidante debe ser máxima en la fase de la formulación (oleosa, acuosa o interfase de la emulsión) en la
9ue el fármaco es más soluble. La temperatura a la 9ue el antioxidante se descompone es crítica para preparaciones sometidas
a un autoclave en las que puede ocurrir una pérdida de actividad antioxidante. También debe considerarse la estabilidad del
antioxidante, pudiendo ser una función del pH y las condiciones de procesamiento. Los iones metálicos pueden reaccionar con
galato de propilo para formar complejos de colores. A un pH alcalino, algunas proteínas y sales de sodio pueden ocasionar la
decoloración de la terc-butilhidroquinona.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
La energía de activación, el potencial de oxidoreducción, así como la estabilidad en formulaciones diferentes (p. ej., pH) y
las condiciones de procesamiento (p. ej., calor) constituyen propiedades químicas importantes. Si la vida útil esperada de la
forma farmacéutica depende de la función del antioxidante, la concentración debe ser tomada en cuenta y evaluarse periódi-
camente a fin de asegurar que se conserva una cantidad suficiente de antioxidante durante toda la vida útil del producto.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para evaluar las funciones de los excipientes antioxidantes seleccionados:
Hierro(241 ), Cromatografía(621 ), Cristalinidad(695), Intervalo o Temperaturade Fusión(741 ), Área SuperficialEspecífica(846) y
Determinaciónde Agua (921 ).
Categoría Funcional: Agente Edulcorante
DESCRIPCIÓN
Los agentes edulcorantes se usan para edulcorar formas farmacéuticas orales y para enmascarar sabores desagradables. Ver
CategoríaFuncional:Saborizantesy Fraganciapara más detalles.
MECANISMOFUNCIONAL
Los agentes edulcorantes se unen a los receptores de la lengua responsables de la sensación de dulzura. Entre más tiempo
permanezca la molécula edulcorante unida al receptor, más dulce se percibirá la sustancia. La sacarosa es el estándar para dul-
zura.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Las propiedades físicas primarias pertinentes a los edulcorantes se relacionan con su compatibilidad con los demás ingre-
dientes de la formulación (p. ej., ingredientes ácidos), las condiciones de procesamiento (p. ej., calentamiento), la distribución
y el tamaño de partícula, el contenido de humedad, el isomerismo, la dulzura y la capacidad para enmascarar el sabor. Estas
propiedades pueden depender de la formulación.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los edulcorantes se pueden dividir en tres grupos principales: azúcares (que presentan una estructura de anillo), alcoholes
de azúcares (azúcares sin estructura de anillo) y edulcorantes artificiales. Todos los edulcorantes son hidrosolubles. La estabili-
dad de muchos edulcorantes se ve afectada por el pH y por los demás ingredientes en la formulación. Algunos edulcorantes
pueden catalizar la degradación de algunos ingredientes activos, especialmente en líquidos y en los casos en que los procesos
de fabricación incluyen calentamiento.
CAPÍTULOSGENERALES
tes edulcorantes: Medición del Tamañode Partículapor Difracciónde Luz (429), Pérdidapor Secado(731 ), Intervalo o Temperatura
de Fusión(741 ), RotaciónÓptica (781) y Determinaciónde Agua (921 ).
Los productos que contienen aspartamo deben incluir una advertencia en la etiqueta que indique que el producto contiene
fenilananina. Los alcoholes de azúcares tienen un índice glicémico muy por debajo del presentado por la glucosa. No obstante,
el sorbitol se metaboliza lentamente a fructosa y a glucosa, lo cual eleva los niveles de azúcar en la sangre. Los alcoholes de
azúcares en cantidades generalmente mayores a 20 g/día actúan como laxante osmótico, especialmente cuando están conte-
nidos en una formulación líquida. Los sistemas de conservantes deben ser cuidadosamente seleccionados para evitar su incom-
patibilidad con el edulcorante, mientras que algunos edulcorantes son incompatibles con ciertos conservantes.
SEMISÓLIDOS,
PRODUCTOSTÓPICOSY SUPOSITORIOS
Categoría Funcional: Base para Supositorios
DESCRIPCIÓN
Las bases para supositorios se usan en la fabricación de supositorios (para administración rectal) y supositorios vaginales (pa-
ra administración vaginal). Las bases pueden ser hidrofóbicas o hidrófilas.
MECANISMOFUNCIONAL
Los supositorios deben fundirse justo por debajo de la temperatura corporal (37°), permitiendo así la liberación del fármaco
por erosión y partición en caso de que el fármaco esté disuelto en la base o por erosión y disolución si el fármaco se suspende
en la base. Las bases para supositorios de grasa sólida funden aproximadamente a la temperatura corporal. Las bases para su-
positorios hidrófilas también funden a la temperatura corporal y por lo regular también se disuelven o dispersan en medios
acuosos. De esta manera, la liberación ocurre mediante una combinación de erosión y disolución.
7652 (1059) Desempeño de Excipientes / InformaciónGeneral USP42
PROPIEDADES
FÍSICAS
El intervalo de fusión constituye la característica física importante de las bases para supositorios. Por lo general, las bases
para supositorios funden a una temperatura entre 27° y 45º. No obstante, las bases individuales por lo regular tienen un inter-
valo de fusión mucho más estrecho dentro de estos límites de temperatura, generalmente 2º-3º. La selección de un intervalo
de temperatura en particular está determinada por la influencia que tienen los otros componentes de la formulación sobre el
intervalo de fusión del producto final.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Las bases para supositorios de grasa sólida son mezclas de ésteres de triglicéridos semisintéticos de ácidos grasos de cadena
más larga. Pueden contener proporciones variadas de mono y diglicéridos y también pueden contener ácidos grasos etoxila-
dos. Se encuentran disponibles en una gran cantidad de grados distintos que se diferencian en intervalo de fusión, índice de
hidroxilo, índice de acidez, índice de yodo, intervalo de solidificación e índice de saponificación.
Las bases para supositorios hidrófilos son mezclas de materiales semisólidos hidrófilos que combinadas son sólidas a tempe-
ratura ambiente y que además liberan el fármaco mediante fusión, erosión y disolución cuando se administran al paciente. Las
bases para supositorios hidrófilas tienen niveles mucho más altos de grupos hidroxilo u otros grupos hidrófilos que las bases
para supositorios de grasa sólida. Los polietilenglicoles que presentan un comportamiento de fusión apropiado son ejemplos
de bases para supositorios hidrófilas.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de las bases
para supositorios: Grasasy AceitesFijos(401), Temperaturade Solidificación(651), Intervalo o Temperaturade Fusión(741) y For-
mas Farmacéuticas(1151 ).
Algunos materiales incluidos en los supositorios de grasas sólidas tienen intervalos de fusión mucho más altos. Estos materia-
les por lo general son ceras microcristalinas que ayudan a estabilizar las formulaciones de suspensiones fundidas. Los suposito-
rios también se pueden fabricar a partir de gelatina glicerinada.
Categoría Funcional: Agente de Suspensión y/o Viscosante
DESCRIPCIÓN
Los agentes de suspensión y viscosantes se usan en las formulaciones farmacéuticas para estabilizar sistemas dispersos (p. ej.,
suspensiones o emulsiones), para reducir la velocidad de transporte de solutos o partículas, o para disminuir la fluidez de for-
mulaciones líquidas.
MECANISMO(s) FUNCIONAL(Es)
Existe una variedad de mecanismos que contribuyen a la estabilización de la dispersión o al efecto viscosante de estos agen-
tes. El más común es el incremento en la viscosidad-debido a que el disolvente queda atrapado por cadenas macromolecula-
res o plaquitas de arcilla-y la interrupción del flujo laminar. Otros mecanismos incluyen la formación de gel mediante una red
tridimensional de moléculas o partículas de excipiente a través de un continuo con el disolvente, y la estabilización estérica,
donde el componente macromolecular o mineral en el medio de dispersión se adsorbe a las superficies de las partículas o goti-
tas de la fase dispersa. Estos últimos dos mecanismos incrementan la estabilidad de la formulación al inmovilizar la fase disper-
sa.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Cada uno de los mecanismos-viscosidad aumentada, formación de gel o estabilización estérica-es una manifestación del
carácter reológico del excipiente. Debido a los pesos y tamaños moleculares de estos excipientes, los perfiles reológicos de sus
dispersiones no son Newtonianos. Las dispersiones de estos excipientes presentan propiedades viscoelásticas. La distribución
del peso molecular y la polidispersión de los excipientes macromoleculares en esta categoría son criterios importantes para su
caracterización.
USP42 Información General/ (1059) Desempeño de Excipientes 7 65 3
PROPIEDADES
QUÍMICAS
La mayoría de los agentes de suspensión y viscosantes son (1) macromoléculas hidrófilas de carbohidratos (goma arábiga,
agar, ácido algínico, carboximetilcelulosa, carragenanos, dextrina, goma gellan, goma guar, hidroxietilcelulosa, hidroxipropil-
celulosa, hipromelosa, maltodextrina, metilcelulosa, pectina, alginato de propilenglicol, alginato de sodio, almidón, tragacanto
y goma de xantana) y (2) macromoéculas hidrófilas sin carbohidratos, incluyendo gelatina, carbómeros de povidona, óxido de
polietileno y alcohol polivinílico. Los minerales (p. ej., atapulgita, bentonita, silicato de magnesio y aluminio, y dióxido de sili-
cio) comprenden el segundo grupo más grande de agentes de suspensión y viscosantes. El monoestearato de aluminio es el
único excipiente no mineral y no macromolecular en esta categoría funcional. Consiste principalmente en proporciones varia-
bles de monoestearato de aluminio y monopalmitato de aluminio.
CAPÍTULOSGENERALES
tes viscosantes: Viscosidad-MétodosCapilares(911 ), Viscosidad-MétodosRotatorios(912) y Viscosidad-Métodode BolaRodan-
te (913).
Categoría Funcional: Base para Ungüentos
DESCRIPCIÓN
Un ungüento es una preparación semisólida viscosa que se usa por vía tópica sobre una variedad de superficies corporales.
La base de ungüento es el componente principal de un ungüento y controla sus propiedades físicas.
MECANISMOFUNCIONAL
Las bases para ungüentos funcionan como vehículos para la aplicación tópica de sustancias medicinales y como emolientes y
agentes protectores para la piel.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Las bases para ungüentos son líquidos con una viscosidad relativamente alta de modo que los sólidos se puedan suspender
como una mezcla estable.
Las bases para ungüentos se clasifican como (1) bases para ungüentos oleosas que son anhidras, no absorben agua fácil-
mente, son insolubles en agua y no se pueden eliminar con agua (p. ej., petrolato); (2) bases para ungüentos de absorción que
son anhidras y absorben algo de agua pero son insolubles en agua y no se pueden eliminar con agua (p. ej., lanolina); (3)
bases para ungüentos para emulsión que son emulsiones de agua en aceite o de aceite en agua y que están hidratadas, absor-
ben agua y son insolubles en agua (p. ej., cremas acuosas, aceites, ceras o parafinas); y (4) bases para ungüentos solubles en
agua que son anhidras, que absorben agua, que son solubles en agua y que se pueden eliminar con agua (p. ej., polietilengli-
col).
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Las bases para ungüentos se seleccionan para que sean inertes y químicamente estables.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de las bases
para ungüentos: Temperaturade Solidificación (651 ), Viscosidad-MétodosCapilares(911 ), Viscosidad-MétodosRotatorios(912)
y Viscosidad-Métodode BolaRodante(91 3).
Categoría Funcional: Agente Espesante
DESCRIPCIÓN
Un agente espesante es un agente o una mezcla de agentes que incrementa la viscosidad o firmeza de una preparación,
especialmente en ungüentos y cremas.
MECANISMOFUNCIONAL
En general, los agentes espesantes son sólidos con alto punto de fusión que incrementan el punto de fusión de ungüentos o
incrementan la consistencia o cuerpo de las cremas. Los agentes espesantes pueden ser hidrofóbicos (p. ej., grasa sólida o pa-
rafina) o hidrófilos (p. ej., polietilenglicol de alto peso molecular).
PROPIEDADES
FÍSICAS
La propiedad física primaria pertinente a los agentes espesantes es su alto punto de fusión o intervalo de fusión. Los interva-
los de fusión típicos para los agentes espesantes oscilan de 43º a 47° (cera de ésteres cetílicos), 53º a 57º (diestearato de glice-
rilo), 69º a 74º (behenato de glicerilo) y 85º a 88º (aceite de ricino hidrogenado).
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los agentes espesantes comprenden un grupo diverso de materiales que incluyen glicéridos de ácidos grasos saturados, al-
coholes alifáticos sólidos, ésteres de alcoholes grasos saturados y ácidos grasos saturados, hidrocarburos saturados, mezclas de
alcoholes grasos y un derivado polioxietilenado de un éster de ácido graso de sorbitán, y polímeros de etilenglicol de pesos
moleculares más altos.
CAPÍTULOSGENERALES
espesante: Temperaturade Solidificación (651 ), Intervaloo Temperaturade Fusión(741 ), Viscosidad-MétodosCapilares(911 ),
Viscosidad-MétodosRotatorios(912) y Viscosidad-Métodode BolaRodante(913).
Algunos de los materiales incluidos como agentes espesantes incrementan la capacidad de los ungüentos para retener agua
(p. ej., petrolato) o funcionan como coemulsificantes en cremas. Los ejemplos incluyen alcohol estean1ico y alcohol cetílico.
Categoría Funcional:Emoliente
DESCRIPCIÓN
Los emolientes son excipientes usados en preparaciones tópicas para impartir lubricación, facilidad para untar, textura y sua-
vización de la piel, así como para contrarrestar el potencial efecto resecante/irritante de los surfactantes en la piel.
MECANISMOFUNCIONAL
Los emolientes ayudan a formar una capa protectora y a mantener la función de barrera de la epidermis. Su eficacia se pue-
de describir mediante tres mecanismos de acción: protección contra los efectos deslipidizantes y resecantes de los surfactantes,
humectación debida a la oclusión (al proveer una capa de aceite sobre la superficie de la piel, los emolientes reducen la veloci-
dad de pérdida de agua e incrementan de esta manera la capacidad de retención de humedad del estrato córneo) y lubrici-
dad, agregando capacidad de deslizamiento a la preparación.
PROPIEDADES
FÍSICAS
los emolientes imparten uno o más de los siguientes atributos a una preparación farmacéutica: capacidad para untar, sensa-
ción agradable al tacto, suavidad de la piel y humectación indirecta de la piel previniendo la pérdida de agua.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
los emolientes son aceites o derivados de componentes de aceites como ésteres de ácidos grasos. Dependiendo de la natu-
raleza de su éster de ácido graso, un emoliente puede ser líquido, semisólido o sólido a temperatura ambiente. Por lo general,
cuanto más grande sea el peso molecular del ácido graso (longitud de la cadena de carbono) más intenso será la sensación y la
suavidad al tacto. la fluidez por lo regular se imparte mediante una longitud de cadena menor y un mayor grado de insatura-
ción en el ácido graso. El grado de ramificación de los enlaces del éster también influye en las propiedades del emoliente.
CAPÍTULOGENERAL
El siguiente capítulo general puede ser útil para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los emolientes:
Grasasy AceitesFijos(401 ).
PARENTERALES
Categoría Funcional: Agua Farmacéutica
DESCRIPCIÓN
El agua se usa como disolvente, vehículo o diluyente para muchos medicamentos, especialmente para aquellos que se pro-
veen en forma líquida, los cuales incluyen medicamentos inyectables, medicamentos oftálmicos, soluciones inhalables, entre
otros. El agua es además un vehículo para amortiguadores y agentes antimicrobianos y es un elemento que permite expandir
el volumen de soluciones de infusión.
La USPincluye monografías para ocho grados de aguas para uso farmacéutico. El Agua para Inyección está destinada para su
uso en la preparación de soluciones parenterales. Cuando se usa en la preparación de soluciones parenterales que se someten
a esterilización final, usar medios adecuados para minimizar el crecimiento microbiano, o producir primero Agua Estéril para
Inyección y, en lo sucesivo, protegerla de la contaminación microbiana. Para soluciones parenterales que se preparan en condi-
ciones asépticas y que no se esterilizan mediante filtración adecuada o en el envase final, producir primero Agua Estéril para
Inyección y, en lo sucesivo, protegerla de la contaminación microbiana. No usar Agua Purificada en las preparaciones destina-
das para administración parenteral. Cuando se usa para formas farmacéuticas estériles con un uso distinto a la administración
parenteral, procesar el artículo para que cumpla con los requisitos en Pruebasde Esterilidad(71 ), o producir primero Agua Esté-
ril Purificada y, en lo sucesivo, protegerla de la contaminación microbiana. La USPtambién contiene referencias a otros tipos de
agua, tales como agua destilada, agua desionizada y demás, de acuerdo con el uso específico según se resume en el capítulo
de información general Agua para Uso Farmacéutico(1231 ).
MECANISMOFUNCIONAL
Un disolvente es capaz de disolver materiales debido a su capacidad de interferir con las fuerzas de atracción intermolecula-
res y para permitir que las moléculas individuales se dispersen en todo el disolvente a granel. El agua es un disolvente y vehícu-
lo aceptado en la mayoría de las aplicaciones debido a su facilidad de manejo, seguridad y bajo costo.
PROPIEDADES
FÍSICAS
El agua es un líquido a temperatura y presión normales. Se convierte en hielo a temperaturas de congelación de 0° o meno-
res y se evapora a una temperatura normal de ebullición de 100º, dependiendo de la presión atmosférica. El agua en forma de
vapor se usa para propósitos de esterilización debido a que el calor latente de vaporización es significativamente mayor que el
del agua hirviendo.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
El agua en su forma pura tiene pH neutro y una conductividad y carbono orgánico total (TOC, por sus siglas en inglés) muy
bajos. Sin embargo, el pH, la conductividad y el TOC se ven afectados por las condiciones de almacenamiento y la exposición
a los gases en el aire. La exposición del agua al dióxido de carbono atmosférico reduce su pH. El almacenamiento en envases
de plástico puede incrementar el contenido de TOC del agua con el paso del tiempo. El agua almacenada en envases de vidrio
puede experimentar un incremento en el pH y la conductividad con el paso del tiempo.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas del agua far-
macéutica: MedicamentosInyectablesy en Implantes(1), Pruebade EndotoxinasBacterianas(85), Carbón Orgánico Total(643),
Conductividaddel Agua (645), Agua para Usoen Hemodiálisis(1230) y Agua para UsoFarmacéutico(1231 ).
Categoría Funcional: Agente de Volumen
DESCRIPCIÓN
Los agentes de volumen usados en liofilizados farmacéuticos, también referidos como productos liofilizados, incluyen diver-
sos sacáridos, alcoholes de azúcares, aminoácidos y polímeros. La función primaria de los agentes de volumen es proporcionar
una torta (cake) liofilizadafarmacéuticamente elegante con una integridad estructural que no se colapse y que se reconstituya
rápidamente antes de la administración. Además, los agentes de volumen se seleccionan para prevenir la pérdida de producto
ocasionada por arrastre de vapor (blow-out), para facilitar el secado eficaz y para proporcionar una matriz de formulación física
y químicamente estable. Con frecuencia, se usan combinaciones complementarias de agentes de volumen, p. ej., manito! y un
polímero, para mejorar el desempeño.
MECANISMOSFUNCIONALES
Un agente de volumen que se cristaliza fácilmente durante la liofilización ayuda a mantener la estructura integral de la torta
formada durante el secado primario, evitando así el colapso macroscópico y manteniendo la elegancia farmacéutica. Aunque
aún queda la posibilidad de que ocurra un colapso microscópico de los componentes amorfos en la formulación (con algunos
resultados potencialmente indeseables), no resulta en colapso macroscópico o sublimaciónincompleta(meltback) si las propie-
dades y la concentración del agente de volumen son adecuadas. Además, el agente de volumen debe tener una temperatura
de fusión eutéctica con el hielo elevada para permitir temperaturas primarias de secado relativamente elevadas con un secado
proporcional rápido y eficiente y con una reconstitución rápida subsiguiente al momento de su uso. Los excipientes que for-
man tortas tales como manito! se usan con frecuencia debido a que tienden a cristalizarse durante el congelamiento, lo que
permite un secado eficaz y la formación de una torta estructuralmente robusta y estable. Los aminoácidos y codisolventes tam-
bién han sido utilizados para lograr dicho efecto. La mayoría de los ingredientes activos biopoliméricos se mantienen amorfos
al liofilizarsey los agentes de volumen tales como los disacáridos pueden funcionar como lioprotectores ayudando a mantener
una fase amorfa estable durante el congelamiento y el secado para evitar la desnaturalización. En ocasiones se logra mejorar la
solubilidad de un ingrediente activo cristalino insoluble mediante el uso de un biopolímero que mejora la solubilidad o previe-
ne la cristalización durante la liofilización o la reconstitución subsiguiente. Los agentes de volumen también se seleccionan ba-
sándose en la biocompatibilidad, capacidad de amortiguación y propiedades de modificación de tonicidad.
Las propiedades lioprotectoras de los agentes de volumen (es decir, aquéllas que protegen al fármaco durante la liofilización)
por lo general se logran mediante la formación de una fase vítrea altamente viscosa que incluye el fármaco biopolimérico en
combinación con sacáridos amorfos de bajo peso molecular tales como sacarosa, trehalosa o algunos aminoácidos. Un método
típico para la formulación farmacéutica de proteínas es combinar un alcohol de azúcar que se cristaliza fácilmente y un dilu-
yente amorfo; esta mezcla actúa como lioprotector.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Los agentes de volumen se disuelven en solución acuosa antes de la liofilización. Por lo tanto, la pureza química y la ausencia
de biocarga y materiales pirógenos son propiedades esenciales del excipiente. Sin embargo, la forma física y las propiedades
de partícula del excipiente por lo general no son relevantes para las propiedades finales de la formulación liofilizada. Resulta
posible facilitar los procesos de solubilización y secado usando codisolventes volátiles tales como etanol o alcohol butílico ter-
ciario.
Las propiedades físicas que son esenciales para el desempeño del producto durante y después de la liofilización incluyen la
temperatura de transición vítrea (T9) del concentrado congelado amorfo antes del secado, la temperatura de transición vítrea
de la torta seca de la formulación final y la temperatura de fusión eutéctica del agente de volumen cristalino con hielo. La
temperatura de transición vítrea (T9) de la formulación depende de las temperaturas de transición vítrea de los componentes
individuales, sus concentraciones e interacciones. Aunque se pueden realizar aproximaciones basándose en las temperaturas de
transición informadas para componentes individuales, las prácticas actuales incluyen la medición de las temperaturas de transi-
ción vítrea de la formulación mediante análisis térmico o microscopia de liofilización.
Los estados físicos del agente de volumen durante y después de la liofilización representan propiedades físicas importantes.
Tanto la composición de la formulación como los parámetros de procesamiento desempeñan un papel al determinar si el
agente de volumen es amorfo o si adquiere una forma cristalina específica. La velocidad de congelación, las temperaturas de
secado y el calentamiento y enfriado controlado de la solución para promover la cristalización (annealing) se encuentran entre
los parámetros importantes de proceso usados para controlar el estado físico de la formulación y sus componentes. La reten-
ción y adsorción de humedad después de la liofilización también pueden contribuir a la falta de estabilidad y la reconstitución
deficiente de la formulación.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
La reactividad del agente de volumen con los demás componentes de la formulación, especialmente el ingrediente activo,
puede ser crítica. Es bien sabido que los azúcares reductores reaccionan con aminas aromáticas y alifáticas. Los glicoles pueden
contener trazas de peróxidos que pueden iniciar una degradación oxidativa. La capacidad de los sacáridos y alcoholes polihí-
dricos para formar enlaces de hidrógeno con los biopolímeros pueden influir sobre sus efectos lioprotectores.
~¡___
1T
CAPÍTULOSGENERALES
tes de volumen: MedicamentosInyectablesy en Implantes(1 ), Cristalinidad(695), Caracterizaciónde SólidosCristalinospor Micro-
calorimetríay Calorimetríade Disolución(696), AnálisisTérmico(891 ), FormasFarmacéuticas(1151) e InteraccionesAgua-Sólido en
SistemasFarmacéuticos(1241 ).
Categoría Funcional: Agente de Tonicidad
DESCRIPCIÓN
Para reducir la crenación o la hemólisis de eritrocitos cuando las soluciones se inyectan y para mitigar el dolor y la incomodi-
dad cuando se aplican en los ojos o en la nariz, resulta necesario isotonizar las soluciones. Para esto, la presión osmótica efecti-
va de las soluciones para inyección debe ser aproximadamente igual que la de la sangre. Cuando los medicamentos se prepa-
ran para su administración en membranas tales como las oculares o los tejidos nasales o vaginales, las soluciones se deben
isotonizar con respecto a estos tejidos.
MECANISMOFUNCIONAL
La tonicidad es igual a la suma de las concentraciones de los solutos que tienen la capacidad de ejercer una fuerza osmótica
a través de una membrana, con lo cual se refleja la osmolalidad general. La tonicidad aplica a los solutos impermeantes dentro
de un disolvente-en contraste con la osmolaridad, la cual toma en cuenta los solutos permeantes e impermeantes. Por ejem-
plo, la urea es un soluto permeante, lo que significa que puede pasar a través de la membrana celular libremente y no se toma
en cuenta al determinar la tonicidad de una solución. Por el contrario, el cloruro de sodio es impermeante y no puede pasar a
través de una membrana sin la ayuda de un gradiente de concentración y, por lo tanto, contribuye con la tonicidad de la solu-
ción.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Las soluciones de cloruro de sodio, dextrosa y de Ringer Lactato son ejemplos comunes de preparaciones farmacéuticas que
contienen agentes de tonicidad. No todos los solutos contribuyen con la tonicidad, la cual en general depende únicamente del
número de partículas de soluto presentes en una solución, y no de los tipos de partículas del soluto. Por ejemplo, mol por mol,
las soluciones de cloruro de sodio presentan una presión osmótica mayor que las soluciones de glucosa de la misma concen-
tración molar. Esto se debe a que cuando la glucosa se disuelve se mantiene como una sola partícula, pero cuando el cloruro
de sodio se disuelve, se convierte en dos partículas: Na+y CI-. Se encuentran disponibles varios métodos para calcular la tonici-
dad.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los agentes de tonicidad pueden presentarse como tipos iónicos o no iónicos. Entre los ejemplos de los agentes de tonici-
dad iónicos se incluyen los haluros de metales alcalinos o alcalinotérreos tales como cloruro de calcio (CaCl2), bromuro de po-
tasio (KBr),cloruro de potasio (KCI),cloruro de litio (LiCI),yoduro de sodio (Nal), bromuro de sodio (NaBr) o cloruro de sodio
(NaCI), sulfato de sodio (Na2 S0 4 ) o ácido bórico. Los agentes de tonicidad no iónicos incluyen glicerol, sorbitol, manitol, pro-
pilenglicol o dextrosa. El cloruro de sodio o potasio y la dextrosa comúnmente se agregan para ajustar la tonicidad.
CAPÍTULOSGENERALES
tonicidad: MedicamentosInyectablesy en Implantes(1 ), Osmolalidady Osmolaridad(785) y Cálculosen la PrácticaFarmacéutica
(1160).
AEROSOLES
Categoría Funcional: Propelente
DESCRIPCIÓN
Los propelentes son compuestos que se encuentran en estado gaseoso en condiciones ambientales. Se usan en medicamen-
tos (atomizadores nasales y formulaciones respiratorias y tópicas), cosméticos y alimentos para proporcionar fuerza para expul-
sar el contenido de un envase.
MECANISMOFUNCIONAL
Las sustancias propelentes son líquidos con bajo punto de ebullición o gases comprimidos que son relativamente inertes pa-
ra los ingredientes activos y excipientes. Se pueden caracterizar mediante tres propiedades: si forman una fase líquida a tempe-
ratura ambiente y presiones útiles, su solubilidad y/o miscibilidad en el resto de la formulación y su inflamabilidad. Su desem-
peño se juzga por su capacidad para proveer una presión adecuada y predecible a lo largo de la vida útil del producto.
Los propelentes que tienen tanto una fase líquida como una gaseosa en el producto proporcionan presiones uniformes siem-
pre que haya fase líquida presente-la presión en la cámara gaseosa se mantiene mediante el equilibrio de las dos fases. Por el
contrario, la presión provista por los propelentes que no tienen fase líquida puede cambiar relativamente rápido a medida que
se expulsa el contenido del envase. A medida que aumenta el tamaño de la cámara gaseosa, la presión dentro del envase cae
proporcionalmente. Los propelentes que no tienen fase líquida pero que tienen una solubilidad significativa dependiente de la
presión en el resto de la formulación tienen características de desempeño compartidas de los otros dos sistemas. En dichos
casos, a medida que la cámara gaseosa se incrementa, el propelente sale de la solución para ayudar a mantener la presión del
sistema.
En inhaladores de dosis fija, el propelente tiene una fase líquida que es parte integral del medicamento dispensado. Al acti-
var la válvula dosificadora se dispensa un volumen definido del contenido líquido. El propelente hierve espontáneamente y
proporciona fuerza de atomización y de propulsión. Se presenta un cambio predecible en la concentración activa desde el ini-
cio hasta el final del ciclo de vida del envase a medida que la fase líquida del propelente vaporiza para restablecer la presión de
equilibrio del sistema conforme aumenta la cámara gaseosa.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Los propelentes tienen puntos de ebullición muy por debajo de las temperaturas ambientales. Al seleccionar el propelente,
es importante tomar en cuenta su densidad para sistemas dispersos y sus propiedades de solubilidad. El apaflurano y el norflu-
rano tienen densidades de fase líquida mayores a las del agua. Los propelentes hidrocarburos (butano, isobutano y propano) y
el éter dimetílico tienen densidades de fase líquida menores a las del agua.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Por lo general, los propelentes son materiales estables. Los propelentes hidrocarburos (butano, isobutano y propano) y el
éter dimetílico son todos materiales inflamables. El apaflurano, dióxido de carbono, nitrógeno y norflurano no son inflamables.
El óxido nitroso no es inflamable pero sustenta la combustión. Los propelentes clorofluorocarbonados son considerados sus-
tancias que consumen el ozono. Su uso en alimentos, medicamentos, dispositivos o cosméticos está reglamentado por el Títu-
lo 21 del CFR 2.125. Los inhaladores de dosis fija de albuterol formulados con propelentes clorofluorocarbonados no han esta-
do disponibles en los Estados Unidos de América desde el 1ro de enero de 2009.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los prope-
lentes: MedicamentosNasalesy para Inhalación: Pruebasde Calidadde Desempeñode Aerosoles,Atomizadoresy Polvos(601 ),
Cromatografía(621) y Determinaciónde Agua (921 ).
INHALADORES DE POLVO SECO
Los inhaladores de polvo seco por lo regular contienen pocos excipientes funcionales. Por ejemplo, los inhaladores de polvo
seco pueden contener un transportador y pueden usar una cubierta de cápsula. Otros excipientes útiles incluyen deslizantes
para mejorar el flujo durante la fabricación de la mezcla transportadora activa. Las secciones sobre tabletas o cápsulas anterio-
res incluyen mayor información sobre el uso de un lubricante además de las propiedades del transportador analizadas más
adelante.
Categoría Funcional: Transportador
DESCRIPCIÓN
Los transportadores se usan para ayudar a depositar el ingrediente activo en el pulmón y pueden desempeñar un papel se-
cundario en la dilución del activo para asegurar que las dosis puedan medirse adecuadamente.
MECANISMOFUNCIONAL
Los transportadores se usan para promover la descarga del fármaco en los pulmones para una mejor penetración o absor-
ción en la región adecuada de los pulmones. Asimismo, el transportador se usa para reducir la concentración del activo de
modo que este último se dosifique adecuadamente y de manera uniforme.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Las propiedades físicas de los transportadores incluyen morfología adecuada, estado de hidratación, fluidez, energía superfi-
cial y distribución del tamaño de partícula.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los transportadores deben tener una pureza adecuada, incluyendo un contenido microbiano bajo y sin proteínas o impure-
zas extrañas para evitar interacciones con el sistema inmune del paciente.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los trans-
portadores: ExamenMicrobiológicode ProductosNo Estériles:Pruebasde RecuentoMicrobiano (61), ExamenMicrobiológicode Pro-
ductosNo Estériles:Pruebasde MicroorgnismosEspecíficos (62), ImpurezasElementales-Límites(232) e ImpurezasElementales-
Procedimientos(233), Medicióndel Tamañode Partículapor Difracciónde Luz (429), Determinaciónde Nitrógeno (461 ), Medica-
mentos Nasalesy para Inhalación: Pruebasde Calidadde Desempeñode Aerosoles,Atomizadoresy Polvos(601 ), DensidadAparente
y Densidadpor Asentamientode los Polvos(616), Cristalinidad(695), Caracterizaciónde SólidosCristalinospor Microcalorimetríay
Calorimetríade Disolución(696), Densidadde Sólidos(699), Pérdidapor Secado(731), MicroscopíaÓptica (776), Estimaciónde la
Distribucióndel Tamañode Partículapor TamizadoAnalítico (786), Finurade Polvos(811 ), Espectroscopía en el Infrarrojo Medio
(854) y Espectroscopía Ultravioleta-Visible(857), Determinaciónde Agua (921 ), Caracterizaciónde SólidosCristalinosy Parcialmente
Cristalinospor Difracciónde RayosX sobre Polvos(DRXP)(941) y Fluidezde Polvos(1174).
Categoría Funcional: Cubiertas de Cápsulas para Inhaladores de Polvo Seco
DESCRIPCIÓN
Las cubiertas de cápsulas en ocasiones se usan en los inhaladores de polvo seco. La cubierta de cápsula se usa para contener
la cantidad de dosificación y para resguardar el polvo inhalable en un inhalador de polvo seco.
MECANISMOFUNCIONAL
El uso de cubiertas de cápsulas puede acelerar el desarrollo farmacéutico puesto que no requiere de un dispositivo complejo
y puede usar un fármaco o formulación previamente medidos. Una cubierta de cápsula no debe fragmentarse en porciones
inhalables y debe permanecer intacta después de que se abre para exponer el polvo para inhalación.
PROPIEDADES
FÍSICAS
La composición de las cubiertas de cápsulas por lo general está regulada por el contenido de humedad, la fragilidad y las
interacciones electrostáticas del fármaco con el polvo inhalable.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de las cubier-
tas de las cápsulas para inhaladores de dosis fija: ExamenMicrobiológicode ProductosNo Estériles:Pruebasde RecuentoMicrobia-
no (61 ), ExamenMicrobiológicode ProductosNo Estériles:Pruebasde MicroorgnismosEspecíficos (62), Arsénico(211 ), Impurezas
Elementales-Límites(232) e ImpurezasElementales-Procedimientos(233), Residuode Incineración(281 ), MedicamentosNasales

y para Inhalación: Pruebasde Calidadde Desempeñode Aerosoles,Atomizadoresy Polvos(601 ), Desintegración(701 ), Disolución
(711), Pérdidapor Secado(731), MicroscopíaÓptica (776), Estimaciónde la Distribucióndel Tamañode Partículapor Tamizado
Analítico(786), Uniformidadde Unidadesde Dosificación(905), Determinaciónde Agua (921 ), Color-Medición Instrumental
(1061) e InteraccionesAgua-Sólidoen SistemasFarmacéuticos(1241 ).
INFORMACIÓN
ADICIONAL
Además de los capítulos generales citados anteriormente, se puede encontrar información útil para asegurar la uniformidad
de las funciones de la cubierta de la cápsula seleccionada en la monografía de Gelatina,Consistenciadel Gel (Valor Bloom).
PREPARACIONES
OFTÁLMICAS
Categoría Funcional:ConservanteAntimicrobiano
DESCRIPCIÓN
El sistema conservante actúa como resguardo para matar o inhibir el crecimiento de microorganismos que pudieran introdu-
cirse inadvertidamente en el producto después del proceso de fabricación durante el almacenamiento o el uso.
MECANISMOFUNCIONAL
Los conservantes antimicrobianos actúan mediante una variedad de mecanismos. Los compuestos de amonio cuaternario
afectan a las membranas celulares microbianas mediante interacciones de carga con fosfólípidos, lo que genera la alteración de
la membrana celular. Los parabenos también alteran la integridad de la membrana celular. Los alcoholes tales como clorobuta-
nol y alcohol bencílico actúan mediante la solvatación de lípidos (membrana) y la desnaturalización de proteínas. La N-[3-(di-
metilamino)propil]tetradecanamida tiene mayor efectividad antimicrobiana contra hongos y protozoarios que los compuestos
de amonio cuaternario. Al igual que los compuestos de amonio cuaternario, ésta altera la integridad del plasma de la membra-
na. El ácido sórbico actúa mediante la reducción de grupos sulfihidrilo de las proteínas. El hipoclorito es un agente de oxidante
fuerte. Las reacciones de cloraminas con los grupos amino de las proteínas puede ocasionar cambios en la conformación y, por
consiguiente, pérdida de la actividad protéica. El cloro liberado por estas reacciones puede reaccionar con los componentes de
las células tales como proteínas y lípidos. La poliaminopropil biguanida se acumula en la membrana celular bloqueando el in-
greso de nutrientes.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Para funcionar como conservante antimicrobiano oftálmico, un compuesto debe ser al menos moderadamente soluble en
agua, con lo que se provee un intervalo apreciable de concentraciones utilizables.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Un conservante debe ser compatible con los ingredientes activos e inactivos del producto terminado. Por ejemplo, los com-
puestos de amonio cuaternario son incompatibles con algunos surfactantes aniónicos. El alcohol bencílico es incompatible con
agentes oxidantes. El clorobutanol es incompatible con algunos surfactantes no iónicos. La compatibilidad entre compuestos
varía con el pH de la fórmula. El conservante debe ser estable en solución al pH de la formulación, que por lo general es de 5 a
8. El pH de la formulación puede afectar la actividad del conservante al influir sobre la forma en que el conservante se reparte
entre la formulación y los microbios, y en la forma en que el conservante interactúa con los sitios diana de la célula microbia-
na. Por ejemplo, los conservantes que deben pasar a través de las membranas celulares antes de ejercer su actividad, deben
formularse a un pH en el que el conservante se encuentre principalmente en su estado no ionizado.
CAPÍTULOS
GENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los conservantes antimi-
crobianos: Pruebasde EficaciaAntimicrobiana(51 ), Pruebasde Esterilidad(71 ), DensidadAparentey Densidadpor Asentamientode
los Polvos(616), Cromatografía(621 ), Densidadde Sólidos(699), Pérdidapor Secado(731 ), FormasFarmacéuticas(1151 ), Fluidez
de Polvos(1174), Garantía de Esterilidad(1211) y Validaciónde la RecuperaciónMicrobiana de ArtículosFarmacopéicos (1227).
Categoría Funcional: Polímero para Uso Oftálmico
DESCRIPCIÓN
Los polímeros se usan en preparaciones oftálmicas para mejorar la retención de ingredientes activos mediante la reducción
de la cantidad de producto que se pierde en el ojo cuando el paciente pestañea. Asimismo, los polímeros pueden ser compo-
nentes de las lágrimas artificiales. La mayoría de los polímeros solubles en agua comúnmente usados como agentes formado-
res de película en preparaciones oftálmicas se pueden categorizar según se indica a continuación: (1) sustancias basadas en
celulosa, (2) gomas producidas por medios biológicos y (3) sustancias producidas por medios sintéticos.
MECANISMOFUNCIONAL
Los agentes formadores de película para preparaciones oftálmicas pueden mejorar la retención de los ingredientes activos en
el ojo mediante diversos mecanismos. Se pueden usar como simples agentes modificadores de la viscosidad para reducir el
flujo del producto, con lo que se reduce la velocidad de pérdida del producto después de la administración. Asimismo, se pue-
den usar para formar películas en la superficie del ojo de modo que el fármaco permanezca depositado en el ojo después de
que la porción líquida del producto haya sido expulsada o se haya evaporado. Estos agentes pueden formularse para producir
una película o gel cuando el producto se entibia a la temperatura corporal (después de entrar en contacto con la superficie del
ojo), mezclándose con la película de lágrimas y/o evaporándose. Algunos polímeros presentan propiedades bioadherentes en
la córnea y pueden incrementar la retención del fármaco.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Para funcionar como un agente formador de película oftálmica, un polímero generalmente debe, por lo menos, ser ligera-
mente soluble en agua, con lo que se provee un intervalo apreciable de concentraciones de uso. Dichos polímeros a menudo
incrementan la viscosidad o presentan propiedades de formación de película o gel cuando se entibian a la temperatura corpo-
ral, cuando se los expone al pH o a la composición de soluto y fuerza iónica de la película de lágrimas, o cuando el producto
se evapora.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
El intervalo de viscosidad del producto terminado que se puede obtener con un agente formador de película se relaciona
con su estructura química y peso molecular. Los grupos funcionales tales como los grupos piruvato y acetato de goma de xan-
tana pueden afectar la relación entre la viscosidad y el pH y la fuerza iónica de la solución, además de que pueden determinar
las propiedades formadoras de película y de gel. La carga del polímero puede influenciar las interacciones con la capa mucosa
del ojo. La conformación molecular, la movilidad de la cadena y el grado de entrecruzamiento también pueden afectar el gra-
do de hinchamiento y, por ende, el desempeño.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones de los polímeros para uso
oftálmico: DensidadAparentey Densidadpor Asentamientode los Polvos(616), Cromatografía(621) (ver en particular Cromato-
grafía de Exclusiónpor Tamaño),Densidadde Sólidos(699), Pérdidapor Secado(731 ), Partículasen SolucionesOftálmicas(789),
Viscosidad-MétodosCapilares(911 ), Viscosidad-MétodosRotatorios(912), Viscosidad-Método de BolaRodante(91 3), Formas
Farmacéuticas(1151) y Fluidezde Polvos(1174). Asimismo, los capítulos generales citados en CategoríaFuncional:AgentesFor-
madoresde Películatambién pueden ser adecuados para la evaluación de polímeros para uso oftálmico.
PRODUCTOSTRANSDÉRMICOS
Y PARCHES
Categoría Funcional: Adhesivo
DESCRIPCIÓN
Los sistemas de liberación tópica de fármacos (p. ej., productos transdérmicos o parches para la piel) requieren el uso de
adhesivos para mantener el contacto entre el sistema de liberación de fármacos aplicado y la piel. Los adhesivos pueden inter-
calarse como una capa separada entre la matriz de la formulación y la superficie de la piel, incorporarse como parte de la ma-
triz misma de la formulación o aplicarse a la periferia del sistema de administración tópica.
MECANISMOFUNCIONAL
La adhesión es la tendencia que presentan superficies diferentes a adherirse entre sí como resultado de uno o más tipos de
interacciones. Para sistemas de liberación tópica de fármacos, estas interacciones adhesivas por lo general son de caracter quí-
mico (principalmente electrostáticas) o dispersivo (unión van der Waals y/o puentes de hidrógeno), aunque existe la posibili-
dad de interacción mecánica mediante el interbloqueo de asperezas microscópicas.
PROPIEDADES
FÍSICAS
En general, los adhesivos usados en productos transdérmicos o parches para la piel son materiales sensibles a la presión cuyo
desempeño se caracteriza mejor a través de métodos de pruebas físicas para adherencia y viscoelasticidad del adhesivo mismo
y la viscosidad de una solución del adhesivo.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
En los productos transdérmicos, los adhesivos sensibles a la presión de mayor uso son los polímeros acrílicos, de caucho y de
silicona. Los adhesivos de polímeros acrílicos incluyen diversos ésteres de ácido acrílico o metacn1ico, acrilamida, metacrilami-
da, N-alcoxialquil o N-alquil-acrilamidas. Los poliisobutilenos y polisiloxanos se encuentran entre los adhesivos basados en cau-
cho y silicona más comunes, respectivamente. El peso molecular y la distribución de componentes de los polímeros son críticos
para la replicación de la eficacia del adhesivo entre partidas.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para evaluar la aptitud de los adhesivos usados en los productos trans-
dérmicos: Resistenciaa la Tensión(881) y Viscosidad-MétodosCapilares(911 ).
Categoría Funcional: Agente Formador de Película
DESCRIPCIÓN
Los agentes formadores de película usados como matriz de la formulación de los sistemas tópicos de liberación de fármacos
(p. ej., productos transdérmicos o parches para la piel) o en conjunto con dichos sistemas comprenden una película no pega-
josa pero adherente, que se aplica a la superficie de la piel, completa o parcialmente.
MECANISMOFUNCIONAL
La formación de la película resulta de la pérdida progresiva de disolvente (o medio de dispersión) a partir de una solución (o
dispersión) de un agente formador de película, ya sea en forma de partículas o moléculas dispersas. La pérdida de disolvente
(o medio de dispersión) lleva a una aglomeración molecular o de partículas más cercana y a una mayor interacción entre las
moléculas o partículas del agente formador de película. Por último, se forma una película continua como resultado de un au-
mento en el entrelazamiento molecular o de la sinterización de las partículas.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Las propiedades críticas para la formación exitosa de película incluyen la temperatura de transición vítrea del agente forma-
dor de película (T9), la viscosidad de la solución o dispersión y las características de la superficie del sustrato. Las propiedades
viscoelásticas tales como módulo elástico, módulo viscoso y la viscosidad intrínseca o compleja describen las características
funcionales tales como la adhesión para un componente adhesivo sensible a la presión. Las pruebas de adhesión a un sustrato,
de adherencia y de cizallamiento se pueden usar para la liberación de partidas.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los agentes formadores de película comunes son polímeros o copolímeros termoplásticos o termoestables de alto peso mo-
lecular, a menudo en forma de dispersiones acuosas o composiciones de látex. Los polímeros de celulosa, los polímeros viníli-
cos y los copolímeros, así como los polímeros y copolímeros de ácido acrílico y metacrílico con frecuencia se usan en los siste-
mas de administración tópica como agentes formadores de película.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para evaluar la aptitud de los agentes formadores de película usados en
productos transdérmicos y parches: AnálisisTérmico(891 ), Viscosidad-MétodosCapilares(911 ), Viscosidad-MétodosRotatorios
(912) y Viscosidad-Métodode BolaRodante(91 3).
PREPARADOSRADIOFARMACÉUTICOS
Los preparados radiofarmacéuticos regularmente contienen categorías de excipientes que también se usan en los medica-
mentos convencionales. Por ejemplo, las cápsulas de preparados radiofarmacéuticos pueden contener diluyentes y necesaria-
mente emplean una cubierta de cápsula, mientras que los preparados radiofarmacéuticos parenterales pueden contener agua
farmacéutica, diluyentes, agentes de tonicidad, modificadores de pH, conservantes antimicrobianos, agentes quelantes y/o
complejantes y antioxidantes. No obstante, muchos preparados radiofarmacéuticos difieren de los medicamentos convencio-
nales, debido a que su preparación (reconstitución) implica una o más reacciones químicas que requieren de excipientes poco
comunes. Ademas, la autoabsorción de la radiación emitida puede resultar en la descomposición radiolítica de muchos prepa-
rados radiofarmacéuticos. Por consiguiente, son varios los excipientes que se usan predominantemete en las formulaciones ra-
diofarmacéuticas, aunque se pueden usar de vez en cuando en otros medicamentos.
Categoría Funcional: Agente Reductor
DESCRIPCIÓN
Los agentes reductores por lo general son necesarios para los preparados radiofarmacéuticos de tecnecio Te 99m. El tecnecio
Te 99m, en la forma química de pertecnetato de sodio (estado de oxidación+ 7), se debe reducir a un estado de oxidación
menor de modo que pueda ser quelado o complejado de alguna otra manera con el ligando deseado para formar el prepara-
do radiofarmacéutico final Te 99m. El agente reductor, por lo general una sal estannosa, a menudo se formula en un kit de
preparación del preparado radiofarmacéutico de tecnecio Te 99m.
MECANISMOFUNCIONAL
El agente reductor (p. ej., ión estannoso) debe estar presente en una cantidad suficiente para reducir todos los átomos de
tecnecio al estado de oxidación deseado, pero no debe generar productos de reducción indeseables ni otras impurezas (p. ej.,
precipitados de hidróxido de estaño).
PROPIEDADES
FÍSICAS
Los agentes reductores (p. ej., sales estannosas) deben ser fácilmente solubles en agua.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los agentes reductores (p. ej., sales estannosas) son sensibles a la oxidación por el oxígeno atmosférico y a las especies oxi-
dantes en solución. Por consiguiente, el contenido liofilizado de los viales del kit se debe llenar con un gas no oxidante tal
como nitrógeno o argón. El agente reductor también debe ser estable al pH esperado para el producto formulado.
CAPÍTULOSGENERALES
reductor: Cromatografía (621) y Radioactividad
(821 ).
Categoría Funcional: Ligando de Transferencia
DESCRIPCIÓN
En la preparación de algunos preparados radiofarmacéuticos, el radiometal (p.ej. tecnecio Te 99m reducido con estaño) pri-
mero se quela mediante un ligando quelante relativamente débil y luego se transfiere al ligando quelante principal o subuni-
dad complejante. Ejemplos de dichos ligandos de transferencia incluyen citrato, gluconato y tartrato.
MECANISMOFUNCIONAL
Los ligandos de transferencia por lo general experimentan reacciones rápidas con tecnecio reducido para formar quelatos
débiles, con lo que se mantiene el tecnecio reducido en una forma soluble hasta que se transfiere al ligando principal. Este
procedimiento es especialmente útil cuando la cinética de formación de complejo con el ligando principal es lenta o cuando se
requiere un paso de calentamiento para exponer los grupos quelantes del ligando principal.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Los ligandos de transferencia deben ser fácilmente solubles en agua.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los ligandos de transferencia deben tener cinéticas rápidas de formación de complejos y deben formar quelatos relativamen-
te débiles en comparación con la formación del complejo con el ligando principal.
CAPÍTULOSGENERALES
Los siguientes capítulos generales pueden ser útiles para asegurar la regularidad en las funciones seleccionadas de los ligan-
dos de transferencia: Cromatografía(621) y Radioactividad(821).
Categoría Funcional: Agente Estabilizante de Coloides
DESCRIPCIÓN
Los coloides liofóbicos tienden a aglomerarse y formar grandes agregados para minimizar su relación área superficial-volu-
men. Los agentes estabilizantes de coloides son moléculas lioft1icasrelativamente grandes que recubren la superficie de cada
partícula coloidal individual y previenen o inhiben la aglomeración. Entre los ejemplos de agentes estabilizantes de coloides se
incluyen la gelatina y el dextrano.
MECANISMOFUNCIONAL
El agente estabilizante de coloides recubre las partículas coloidales liofóbicas y les da propiedades liofílicas.Además, se pue-
de agregar una carga al agente estabilizante de coloides, lo cual provoca que las partículas coloidales recubiertas se repelan
entre sí.
PROPIEDADES
FÍSICAS
Los agentes estabilizantes de coloides deben ser fácilmente solubles en agua.
PROPIEDADES
QUÍMICAS
Los agentes estabilizantes de coloides deben ser capaces de recubrir las partículas coloidales liofóbicas, p. ej., mediante la
atracción electrostática de una carga opuesta.
CAPÍTULOSGENERALES
estabilizante de coloides: Cromatografía(621) y Radioactividad(821 ).
Categoría Funcional: Secuestrador de Radicales Libres
DESCRIPCIÓN
Las interacciones de la radiación con el agua y otras moléculas con frecuencia producen radicales libres. Los secuestradores
de radicales libres interactúan preferencialmente con radicales libres oxidantes o reductores que de otro modo provocarían la
desintegración de los componentes de la formulación. En el caso de los preparados radiofarmacéuticos, los secuestradores de
radicales libres se pueden usar para mejorar la pureza radioquímica. Entre los ejemplos de secuestradores de radicales libres se
incluyen el azul de metileno y el ácido aminobenzoico.
USP42 Información General/ (1061) Color-Medición Instrumental 7665
MECANISMOFUNCIONAL
Los secuestradores de radicales libres interactúan preferencialmente con los radicales libres producidos por la vía radiolítica
antes de que dichos radicales puedan interactuar con el preparado radiofarmacéutico y produzcan impurezas radioquímicas.
PROPIEDADESFÍSICAS
Los secuestradores de radicales libres deben ser fácilmente solubles en agua.
PROPIEDADESQUÍMICAS
Los secuestradores de radicales libres deben ser capaces de interactuar preferencialmente con radicales libres sin ocasionar
otros efectos.
(1061) COLOR-MEDICIÓN INSTRUMENTAL
El color observado (ver (631) Colory Acromatismo)de un objeto depende de la energía espectral de la iluminación, las carac-
terísticas de absorción del objeto y la sensibilidad visual del observador en el intervalo de luz visible. De manera similar, es
esencial que todo método instrumental de amplia aplicación tenga en cuenta estos mismos factores.
Los métodos instrumentales para medir el color proporcionan datos más objetivos que la determinación visual de color sub-
jetiva realizada por un pequeño número de personas. Con un buen mantenimiento y calibración, los métodos instrumentales
pueden proporcionar mediciones exactas y precisas de color y de diferencias de color que no varían con el tiempo. Toda medi-
ción instrumental de color se basa en el hecho de que el ojo humano detecta el color a través de tres "receptores". Por lo
tanto, todos los colores se pueden descomponer en una mezcla de tres estímulos de radiación seleccionados adecuadamente
para excitar los tres receptores del ojo. Aunque no exista un solo conjunto de fuentes de luz reales que se pueda emplear para
comparar todos los colores (es decir, para tres luces cualesquiera que se elijan existen algunos colores que requieren una canti-
dad negativa de una o más luces), se han definido tres estímulos arbitrarios con los que se pueden definir todos los colores
reales. Mediante extensos experimentos de comparación de color realizados con personas con una visión de colores normal, se
han medido los coeficientes de distribución para cada longitud de onda visible (400 nm a 700 nm) que proporcionan la canti-
dad relativa de estimulación de cada receptor causada por la luz a esa longitud de onda. Estos coeficientes de distribución x,y,
z, se muestran a continuación. De manera similar, para cualquier color la cantidad de estimulación de cada receptor en el ojo
se define mediante un conjunto de Valorestricromáticos(X, Y y Z) para ese color.
En las siguientes ecuaciones se proporcionan las relaciones entre el coeficiente de distribución (ver la figura adjunta) y los
valores tricromáticos
X= r f)"i,P;d,UY',
Y= Jo
Í~f.y.P.d,UY'
l. J. A
Z = fo\_2:;_P,dl/Y'
en donde
es la potencia espectral de la fuente luminosa y f).es la reflectancia espectral (pJ o la transmitancia espectral ('tJ del material.
4
7666 (1061) Color-Medición Instrumental/ Información General USP42
200,------------------,
150
e
·O
·¡:;
:,
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·;::
iií x
'o 100
Q)
'Cl
<Jl
2e
Q)
·¡:;
~
o
ü
50
Longitudde onda,nm
Coeficientes de Distribución de 400 a 700 nm
Una vez que se han calculado los valores tricromáticos de un color, se pueden emplear para determinar la coordenadas del
color en un espacio de color tridimensional idealizado al que se denomina espaciode colorvisualmenteuniforme.En un intento
por definir dicho espacio se han desarrollado muchos conjuntos de ecuaciones de color. Las ecuaciones proporcionadas en este
capítulo representan una solución intermedia entre la sencillez del cálculo y la adecuación a lo ideal.
Las coordenadas de un color en un espacio de color visualmente uniforme pueden emplearse para calcular la desviación de
un color con respecto a un punto de referencia seleccionado. Cuando se utiliza el método instrumental para determinar el
resultado de una prueba que requiere comparar el color de una preparación de prueba con el color de un estándar o un líqui-
do de comparación, el parámetro a comparar es la diferencia, en espacio de color visualmente uniforme, entre el color del
blanco y el color de la muestra de prueba o estándar.
PROCEDIMIENTO
Las consideraciones que se tratan en Espectroscopía Ultravioleta-Visible
(857) también se aplican a la medición instrumental
del color. En el método espectrofotométrico, los valores de reflectancia o de transmitancia se obtienen a longitudes de onda
discretas en todo el espectro visible, a un ancho de banda de 1O nm o menor. Luego, estos valores se emplean para calcular
los valores tricromáticos mediante el uso de factores de ponderación.' En el método colorimétrico, la ponderación se realiza
mediante el uso de filtros.
En la medición de la reflectancia espectral de sólidos opacos, el ángulo de visión está separado del ángulo de iluminación de
manera tal que solo entran en el receptor los rayos que se reflejan difusamente de la muestra de prueba. Se excluyen el reflejo
especular y la luz dispersada.
Para la medición de la transmitancia espectral de líquidos transparentes, la muestra se irradia desde un ángulo que no se
diferencia en más de 5 grados con respecto a la normal a su superficie, y la energía transmitida medida está dentro de los
5 grados de la normal. El color de las soluciones cambia con el espesor de la capa medida. A menos que existan consideracio-
nes especiales que indiquen algo diferente, se debe emplear una capa de 1 cm de espesor.
Los métodos descritos en este documento no son aplicables a líquidos turbios o sólidos translúcidos.
Calibración
A los fines de la calibración, se puede utilizar alguno de los siguientes materiales de referencia, según lo requiera la geome-
tría del instrumento. Para mediciones de transmitancia, se puede utilizar agua purificada como un estándar del color blanco y
1 la norma ASTM258.7.1-1951 proporciona valores típicos de ponderación, tal como se informa en el Joumal of the Optical Society of America, Vol. 41, 1951,
páginas 431-439.
USP42 InformaciónGeneral/ (1061) Color-Medición Instrumental 7667
asignarle una transmitancia de 1,000 a todas las longitudes de onda. Luego, los valores tricromáticos X, Y y Z para la fuente C
de la Comisión Internacional del Color (CIE, por sus siglas en francés) son 98,0; 100,0 y 118, 1, respectivamente. Para medicio-
nes de reflectancia, se pueden usar placas de porcelana opaca, cuya base de calibración es el reflector difuso perfecto y cuyas
características de reflectancia han sido determinadas para la geometría instrumental apropiada.2 Si la geometría de la muestra
presentada excluye el uso de tales placas, se puede emplear sulfato de bario comprimido, de grado estándar de reflectancia
del color blanco. 3
Después de llevar a cabo la calibración con los materiales mencionados, es deseable, siempre que sea posible, medir un ma-
terial de referencia que tenga un color lo más semejante posible al de la muestra. Si no es adecuado emplear una muestra del
material sometido a prueba como estándar a largo plazo, hay disponibles tablas de color' que abarcan todo el espacio de color
uniforme visualmente, en pequeños incrementos de color. Se recomienda el uso de un estándar de referencia de este tipo co-
mo un método para supervisar el desempeño de un instrumento incluso para determinaciones de color absoluto.
Método Espectrofotométrico
Determinar la reflectancia o transmitancia entre 380 y 770 nm a intervalos de 1O nm. Expresar el resultado como un porcen-
taje, siendo 100,0 el máximo. Calcular los valores tricromáticos X, Y y Z de la siguiente manera.
MATERIALES
REFLECTANTES
Para los materiales reflectantes, los valores X, Y y Z son
X= I::~P;_X;PAL'1tc/Y',
y= L.,
"no PAY,. -_p,,1'11c/Y'
380
en donde
es la reflectancia espectral del material, x,.Plly,.P,.y z,.P,.son valores conocidos asociados con cada Fuente Estándar, 1,2y M se
expresa en nm.
MATERIALES
DE TRANSMISIÓN
Para materiales de transmisión, las cantidades X, Y y Z se calculan según se indicó anteriormente, sustituyendo p.,_por,,.
(transmitancia espectral).
Método Colorimétrico
Operar un colorímetro 5 adecuado para obtener valores equivalentes a los valores tricromáticos, X, Y y Z. La exactitud con la
que los resultados, obtenidos a partir del colorímetro de filtro, coinciden con los valores tricromáticos puede indicarse determi-
nando los valores tricromáticos de placas de colores fuertemente saturados y comparando tales valores con los calculados a
partir de mediciones espectrales en un espectrofotómetro.
INTERPRETACIÓN
Coordenadas de Color
Las Coordenadas de Color, L*, a* y b* se definen mediante
2 Los elementos adecuados se pueden conseguir

en BYK-GardnerUSA,2431 Linden Lane, Silver Spring, MD 2091 O o en Hunter Associates Laboratory, lnc., 11491
Sunset Hills Road, Restan, VA22090.
3 El material adecuado se puede conseguir
en Eastman Kodak Company, Rochester, NY 14650, como "White Reflectance Standard" (Estándar de Reflectancia del
ColorBlanco).
4
Se pueden obtener Cartas de Colores Centroides de proveedores de instrumentos para la medición del color.
5 Un coloñmetro tricromático adecuado se puede obtener en BYK-GardnerUSA,2431 Linden Lane, Silver Spring, MD 20910, o en Hunter Associates Laboratory,
lnc., 11491 Sunset Hills Road, Restan, VA22090.
7668 (1061) Color-Medición Instrumental/ Información General USP42
L* = ll 6(Y/Y0)'" - 16
a*= 500[(X/X0)'h- (Y/Yo)'"]
Y
b* = 200[(Y/Y0)'h - (Z/Z 0)'i•]
en donde X0 , YO y Z0 son los valores tricromáticos del estándar blanco nominal o incoloro e Y/YO > 0,01 . Normalmente son
iguales a los valores tricromáticos de la fuente de iluminación estándar, donde el conjunto de Y0 es igual a 100,0. En este caso
X0 =98,0 y Z0 = 118, 1.
Diferencia de Color
La Diferencia de Color total t.E* es
t.E* = [(t.L *) 2 + (t.a*)2 + (t.b*)2J'i•

en donde t.L *, t.a* y t.b* son las diferencias en las coordenadas de color de las muestras comparadas.
Las variables instrumentales pueden influir en los resultados. Aunque pueden hacerse comparaciones confiables entre colores
similares medidos al mismo tiempo, los resultados obtenidos por distintos instrumentos o en diferentes condiciones de funcio-
namiento deben compararse con cuidado. Si fuera necesario comparar datos obtenidos con distintos instrumentos o tomados
en diferentes momentos etc., es muy útil tener datos concomitantes obtenidos con un material de referencia estándar, como
por ejemplo tablas de color para materiales opacos. La comparación de las lecturas del material de referencia ayuda a identifi-
car variaciones debidas al funcionamiento del instrumento.
(1062) CARACTERIZACIÓN
DE LACOMPRESIÓNDETABLETAS
1. ANTECEDENTES
2. FASESDE LA COMPRESIÓN
3. EQUIPO PARALA CARACTERIZACIÓN DE LA COMPRESIÓN DE TABLETAS
3.1 Prensa Hidráulica
3.2 Prensa para Tabletas Instrumentada para Investigación
3.3 Simulador de Prensa para Tabletas
3.4 Simulador de Compactación
3.5 Prensa para Tabletas Instrumentada para Producción
4. PUNZONERÍA
5. PERFILESDE DESPLAZAMIENTO DE LOS PUNZONES EN FUNCIÓN DEL TIEMPO
6. RESISTENCIAMECÁNICA DE LAS TABLETAS
7. POROSIDAD Y FRACCIÓN SÓLIDA DE LAS TABLETAS
8. PERFILDE FABRICABILIDAD
9. PERFILDE TABLETEABIUDAD
1O. PERFILDE COMPRESIBILIDAD
11. PERFILDE COMPACTABILIDAD
12. PERFILDE COMPRESIÓN DE TABLETAS
13. SENSIBILIDAD DE LA VELOCIDAD DEL EQUIPO
14. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
GLOSARIO
REFERENCIAS
1. ANTECEDENTES
En la actualidad, la tableta es la forma farmacéutica de uso más amplio para la administración oral de fármacos (ver Formas
Farmacéuticas(1151 )). Las ventajas de la tableta incluyen la economía de fabricación y la conveniencia cumplimiento por parte
del paciente. Las tabletas también pueden ofrecer ventajas adicionales sobre otras formas farmacéuticas, tal como mejor esta-
bilidad física o química.
La compresión del polvo es un proceso crítico en la fabricación de tabletas. Aunque este proceso se ha usado de manera
rutinaria por más de un siglo, aún persisten problemas relacionados con la compresión del polvo en el desarrollo farmacéutico
y la fabricación. Entre los problemas comunes se incluyen defectos en las tabletas, tales como decapado y laminación (7-3),
alta friabilidad, adhesión de los polvos a las superficies de los punzones o a la pared de la matriz, así como insuficiente resisten-
cia mecánica para tolerar exigencias durante el procesamiento posterior. Algunas formulaciones pueden presentar característi-
USP42 InformaciónGeneral/ (1062) Caracterización de la Compresión de Tabletas 7669
cas de compresión aceptables durante el desarrollo temprano cuando los volúmenes de producción son generalmente bajos,
pero se vuelven problemáticas durante el aumento de escala.
Las propiedades de las tabletas comprimidas son sensibles a las características del material y a los parámetros del proceso.
Las características del equipo usado y las condiciones ambientales de temperatura y humedad también son factores clave que
influyen en la compresión de la tableta. Las propiedades físicas tales como el tamaño de partícula (4), la forma de la partícula
(5,6), la textura de la superficie (7), la cristalinidad y el contenido de humedad (8) influyen sobre el desempeño del polvo para
el tableteado al afectar la fuerza de unión y/o el área de unión (9, 7O). Las propiedades mecánicas del material en polvo, tales
comola durezade laspartículas,laspropiedadeselásticas,laspropiedadesviscoelásticas,
la plasticidady lafragilidadde las
partículas, también afectan la resistencia de las tabletas (7 7-7 3). El grado de lubricación también es otro factor importante que
afecta la compresión del polvo. Por lo general, se agrega un lubricante a la formulación de la mezcla del medicamento como
paso final anterior a la compresión para reducir las fuerzas de fricción durante la compresión y la eyección de la tableta. Sin
embargo, este lubricante agregado puede afectar de manera adversa la resistencia mecánica de la tableta y la velocidad de
liberación durante la disolución.
En este capítulo se describe el conocimiento actual de esta área especializada y se presentan las metodologías experimenta-
les para la caracterización de la compresión de tabletas a fin de proveer pautas para el uso de terminología y procedimientos
de prueba de compresión estandarizados. Aunque los conceptos fundamentales descritos en este capítulo también son aplica-
bles a otros procesos, tales como formación de compactos durante la encapsulación y la compactación con rodillos, este artí-
culo se enfoca en el tableteado. [NOTA-En el Glosariose definen términos con el Sistema Internacional de Unidades (SI), usa-
dos comúnmente en la compresión farmacéutica de tabletas.]
2. FASESDE LA COMPRESIÓN
El comportamiento de la compresión de polvos está regido por las propiedades físicas y mecánicas del material, así como
por los aspectos del proceso de compresión tal como la presión (es decir, tensión o esfuerzo), el grado de deformación (defor-
mación) y la velocidad de deformación. Por lo tanto, es importante conocer la tensión, la deformación y la velocidad de defor-
mación para entender el comportamiento del polvo durante el proceso de compresión. La mayoría de las tabletas farmacéuti-
cas se fabrican mediante "compresión uniaxial de polvos". Es decir, cada tableta se forma mediante la densificación de una
muestra de polvo empacada ligeramente y confinada dentro de una matriz rígida usando dos punzones rígidos que se aproxi-
man desde arriba y abajo (en un plano vertical). Este proceso de formación de tabletas a menudo se describe como un proceso
de cuatro etapas, según se muestra en la Figura1:
1. Reordenamiento de partículas
2. Compresión
3. Descompresión
4. Eyección
,,.~oo r-·;r··~J}
Tiempo
Figura 1. Etapas de compresión de polvos (presión del punzón inferior)
En la primera etapa, Reordenamientode partículas,las partículas por lo general cambian de posición mediante movimientos
de deslizamiento, rotación o traslación, con lo que se reducen o se eliminan los poros en el polvo sin una deformación irrever-
sible significativa. Al final de la primera etapa, cuando las partículas han alcanzado su mayor grado de reordenamiento, el pol-
vo a menudo es significativamente más denso que el polvo inicial debido a la reducción del volumen de poro. Cualquier re-
ducción adicional en el volumen del compacto requeriría la deformación de las partículas.
Durante la segunda etapa, Compresión,las partículas se deforman en los puntos de contacto con otras partículas, la pared de
la matriz o las superficies del punzón. Durante esta etapa, la presión de compresión a menudo aumenta rápidamente, ocasio-
nando una reducción de volumen a medida que aumenta la densidad del polvo. Sometidas a presión, las partículas inicialmen-
7670 (1062) Caracterización de la Compresión de Tabletas/ Información General USP42
te experimentan deformación elástica. Dependiendo de las propiedades mecánicas y la tensión en los puntos de contacto, las
partículas pueden posteriormente experimentar distintos grados de fragmentación y/o deformación plástica. Si la fragmenta-
ción ocurre al inicio de la segunda etapa, algunos de los fragmentos pueden experimentar un reordenamiento adicional. Sin
embargo, el movimiento relativo de partículas es limitado cuando el polvo está altamente consolidado. Para la mayoría de los
materiales farmacéuticos, la deformación plástica es una parte importante del proceso de compresión que implica un incre-
mento en el área de contacto entre las partículas, lo que contribuye a una mayor resistencia del compacto. Las nuevas superfi-
cies de las partículas generadas por la fragmentación también contribuyen a una mayor resistencia del compacto. La velocidad
de compresión (velocidad del punzón) y el período de tiempo en el que el polvo es mantenido bajo presión a un volumen
constante (tiempo de residencia) también influyen sobre el comportamiento de deformación y las propiedades mecánicas de
las tabletas resultantes de la compactación de muchos polvos farmacéuticos. La densidad de la tableta y la resistencia de ten-
sión de los polvos sensibles a la velocidad (tales como el almidón) dependen de la velocidad de tableteado, donde las velocida-
des más altas (es decir, los tiempos de residencia más cortos) por lo general producen tabletas menos densas con una menor
fortaleza. Elfinal de la segunda etapa es a menudo el momento de mayor presión de compresión.
Durante la tercera etapa, Descompresión, los punzones se retraen, lo que resulta en una disminución de la presión axial de los
punzones. A medida que la presión axial se reduce a cero durante la descompresión, la presión residual de la pared de la ma-
triz por lo general se presenta en dirección radial. Durante esta fase, las partículas experimentan principalmente una recupera-
ción elástica, dependiendo de la presión y de las propiedades mecánicas de las partículas. La recuperación elástica puede pro-
veer información sobre la deformación elástica experimentada por el polvo durante la compresión. La recuperación elástica
excesiva puede reducir la unión entre partículas y puede resultar en una reducción significativa de la resistencia mecánica de la
tableta. Estas mismas tres etapas se aplican a una etapa de pre-compresión en la fabricación de tabletas, la que a menudo se
realiza a una menor presión de compresión y puede agregarse precediendo al paso principal de compresión.
Durante la cuarta etapa, Eyección,la tableta a menudo es empujada fuera de la matriz por el punzón inferior. A medida que
la tableta emerge de la matriz, la porción eyectada de la tableta es libre de expandirse de forma radial debido a la recupera-
ción elástica (es decir, se libera de la presión residual de la pared de la matriz). Puede desarrollarse una tensión de corte signifi-
cativa dentro de la tableta y en los bordes de la interfase de la tableta con la matriz debido a que la porción inferior de la
tableta permanece restringida por la pared de la matriz. En caso serios, esta tensión de corte puede resultar en el laminado o
decapado de la tableta. La formación de un compacto denso y sin defectos depende de la capacidad de las partículas para
formar uniones entre ellas durante la compresión, y la capacidad de estas uniones para tolerar la expansión elástica durante la
descompresión y las fases de eyección. La forma y tamaño de la punzonería también pueden afectar las propiedades de la ta-
bleta comprimida debido a que afectan la densidad y la distribución de la tensión durante la compresión. La termodinámica
del proceso de compresión, p. ej., calorimetría de compresión ( 14,15), es otro aspecto importante de la compresión del polvo
y se puede estudiar usando prensas instrumentadas (ver 3. Equipopara la Caracterización de la Compresiónde Tabletas).
3. EQUIPOPARALA CARACTERIZACIÓN
DE LA COMPRESIÓNDE TABLETAS
Se han usado diversos métodos de compresión para caracterizar las propiedades de compresión de los polvos farmacéuticos.
Cada método tiene ventajas y limitaciones. Para caracterizar las propiedades de compresión de los polvos, se aplica una pre-
sión de compresión (tensión o esfuerzo) a un polvo para producir un espécimen coherente y compacto o tableta. El sistema de
carga usado para aplicar presión de compresión puede tener diversos diseños. Los instrumentos típicos de compresión usados
en la industria farmacéutica incluyen prensas hidráulicas, prensas para tabletas instrumentadas para investigación, simuladores
de prensa para tabletas, simuladores de compactación y prensas para tabletas instrumentadas para producción.
3.1 Prensa Hidráulica

Cuando se usa una prensa hidráulica, por lo regular solo se puede obtener fácilmente al valor pico de la presión hidráulica.
Por lo general, las velocidades de compresión y descompresión no están controladas con precisión, y estos procesos ocurren
durante un periodo de segundos o más. Posteriormente, se puede analizar la resistencia y la densidad de las tabletas produci-
das en dichos dispositivos, así como otras propiedades de desempeño tales como friabilidad, desintegración o disolución. Di-
chos dispositivos proveen datos de compresión para comparar materiales y formulaciones, pero no necesariamente predicen el
desempeño del tableteado durante el tableteado a alta velocidad.
3.2 Prensa para Tabletas Instrumentadapara Investigación

Las prensas para tabletas para investigación tienen dos diseños básicos: prensas excéntricas monopunzón y prensas rotativas
multipunzón. Las prensas excéntricas monopunzón por lo regular son de funcionamiento mecánico y comprimen la tableta
usando el punzón superior con un perfil de posición sinusoidal; el punzón inferior por lo regular está fijo durante el ciclo de
compresión. Las prensas rotativas multipunzón para investigación son versiones a escala reducida de las prensas de escala de
producción, y comprimen las tabletas mediante el movimiento del punzón superior e inferior a medida que pasan bajo un par
de rodillos de compresión. La geometría de la cabeza del punzón (es decir, la curvatura y el área plana) también influye en la
forma del perfil de posición del punzón en una prensa rotativa para tabletas.
USP42 Información General/ (1062) Caracterización de la Compresión de Tabletas 7671
3.3 Simulador de Prensa para Tabletas
Los simuladores de prensa para tabletas (fablet Press Emulator) son similares a las prensas rotativas para tabletas en que
usan rodillos de compresión para mover los punzones al mismo tiempo para formar la tableta y, por lo tanto, los perfiles de
desplazamiento en función del tiempo (ver 5. Perfilesde Desplazamientode los Punzonesen Funcióndel Tiempo)representan con
fidelidad los de las máquinas rotativas. Sin embargo, el tiempo del ciclo de compresión de las tabletas es más prolongado que
el de las prensas rotativas debido a que la vía de compresión es lineal.
3.4 Simulador de Compactación
Los simuladores de compactación son prensas monopunzón que utilizan potencia mecánica o hidráulica para mover los
punzones y están diseñados para igualar el perfil de desplazamiento de una prensa de alta velocidad dada mediante una com-
putadora. Los simuladores de compactación también pueden programarse para simular cualquier perfil de posición de punzo-
nes, lo cual es útil para la caracterización básica de materiales.
3.5 Prensa para Tabletas Instrumentada para Producción
Las prensas para tabletas instrumentada para producción también usan un diseño de rodillos para formar una tableta. Un
gran número de estaciones de compresión permite un mayor rendimiento de producción y/o capacidad de producir tabletas
de capas multiples o de tabletas dentro de tabletas (tablet-in-tablet).
4. PUNZONERÍA
Las tabletas pueden fabricarse con una punzonería de tamaños y formas variadas. Lasformas de punzonería comúnmente
usadas para la caracterización básica de materiales son de cara plana, cara plana con borde biselado y cóncava redonda común
que produce tabletas con forma convexa. Se puede usar una gran variedad de formas de punzonería en la producción de pro-
ductos farmacéuticos, basándose en consideraciones comerciales y técnicas (7 6). La punzonería puede presentar repujado (es
decir, marcas elevadas sobre la superficie del punzón), con lo que se introducen marcas en bajo relieve en las tabletas compri-
midas. Dependiendo de las propiedades de compresión del polvo y de los parámetros del proceso de fabricación, el diseño de
la punzonería para tabletas puede afectar la integridad mecánica.
5. PERFILES
DE DESPLAZAMIENTO
DE LOSPUNZONESEN FUNCIÓNDELTIEMPO
El equipo de compresión de tabletas puede usarse para producir una variedad de perfiles de desplazamiento de los punzo-
nes en función del tiempo. La Figura2 es una ilustración de tres de los perfiles más simples usados para la caracterización bási-
ca de materiales.
Las propiedades de un polvo comprimido dependen de diversos factores, incluida la presión de compresión, la velocidad de
compresión y el perfil de compresión. Los experimentos de compresión pueden realizarse con un punzón en movimiento y
uno estacionario; un punzón superior en movimiento y una base fija (es decir, sin punzón inferior); o dos punzones, superior e
inferior, en movimiento independiente (compresión por ambos lados). Debido a que la configuración y los parámetros de
compresión pueden afectar las propiedades de compactación medidas, es importante especificar los detalles experimentales al
informar los resultados. Los perfiles típicos de compresión incluyen:
• Fases de compresión y descompresión lineal que generan perfiles de desplazamiento de los punzones en función del tiem-
po en forma de diente de sierra (Figura2A)
• Perfiles de desplazamiento de los punzones en función del tiempo en forma cuadrada (Figura28)
• Perfiles de desplazamiento de los punzones en función del tiempo en forma sinusoidal modificada, habituales para una
prensa rotativa para tabletas (Figura2C)
Uno de los punzones (compresión unilateral) o ambos punzones (compresión por ambos lados) pueden seguir estos perfiles.
Las mediciones exactas de los perfiles de desplazamiento en función del tiempo, así como las fuerzas resultantes aplicadas, re-
quieren instrumental de alta exactitud y, en algunos casos, corrección por la deformación del sistema (es decir, deformación
elástica de los punzones u otros componentes del equipo). Los perfiles de desplazamiento de los punzones en función del
tiempo para la mayoría de las máquinas de tableteado a escala de producción son una combinación de perfiles sinusoidales y
cuadrados, en los que las fases de compresión y descompresión siguen el perfil sinusoidal y entre ellas existe una porción plana
que representa el tiempo de residencia.
A
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o.
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E
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"'
a,
o Tiempo
Figura 2. Perfiles de desplazamiento de los punzones en función del tiempo: A) perfil en forma de diente de sierra, B) perfil
cuadrado y C) perfil sinusoidal modificado. Se representa únicamente una curva de desplazamiento del punzón en función del
tiempo (p. ej., movimiento del punzón superior).
6. RESISTENCIA
MECÁNICADE LASTABLETAS
La resistencia de la tableta se ve influenciada principalmente por la fuerza de unión entre partículas y las áreas reales de con-
tacto (p. ej., área superficial sobre la cual la fuerza de atracción entre las partículas es significativa) ( 71). Cuando las superficies
de las partículas se aproximan entre sí, las interacciones interpartículas (p. ej., las fuerzas van der Waals) se maximizan y por lo
regular generan una fuerte unión entre las partículas. La resistencia mecánica de la tableta puede cuantificarse midiendo la
tensión máxima, ya sea de compresión o tensión, que una tableta puede tolerar antes de fracturarse (ruptura). Una prueba
comúnmente usada es colocar las tabletas entre dos platinas y medir la fuerza necesaria para fracturar las tabletas; esta prueba
se describe en Fuerzade Rupturade las Tabletas(1217). Para tabletas redondas convencionales con una sección transversal cir-
cular, la carga se ejerce a través del diámetro de la tableta y en ocasiones se le denomina "carga diametral". Otros métodos,
tales como las pruebas de flexión de tres puntos o de cuatro puntos, también están disponibles, aunque se usan con menos
frecuencia en los entornos de producción debido a que pueden requerir equipo y análisis más complejos. La resistencia de las
tabletas, según se determina mediante estas pruebas, a menudo se denomina en la industria farmacéutica como "dureza", aun-
que un término exacto es "fuerza de ruptura". En la ciencia de los materiales, la dureza se refiere a la resistencia de una superfi-
cie a la penetración o endentación (p. ej., dureza Mohs, dureza por indentación o presión de deformación permanente). El
valor de la fuerza de ruptura de las tabletas sirve como criterio mediante el cual se puede guiar el desarrollo de un producto y
como especificación de control de calidad.
La resistencia de las tabletas puede verse afectada por diversos factores tales como:
• Tamaño y forma de la tableta: Debido a que la fuerza de ruptura se ve afectada por el tamaño y la forma de la tableta, un
parámetro más confiable para cuantificar la resistencia mecánica de una tableta es la resistencia a la tensión. Para tabletas
cilíndricas o convexas con formas simples, la resistencia a la tensión se puede calcular a partir de la prueba diametral, des-
crita en el capítulo (1217).
• Densidad relativa: La resistencia de las tabletas se incrementa a medida que los polvos se compactan a una densidad rela-
tiva mayor.
USP 42 Información General/ (1062) Caracterización de la Compresión de Tabletas 7673
• nempo y condiciones de almacenamiento: Las tabletas pueden sufrir relajación o verse influenciadas por las condiciones
ambientales (p. ej., humedad relativa), por lo que las condiciones de almacenamiento y el tiempo de almacenamiento de
las tabletas antes del análisis deben especificarse para determinaciones de fuerzas reproducibles.
• Composición de la formulación y proceso de fabricación: Cada componente tiene propiedades mecánicas únicas y en al-
gunos casos estas propiedades pueden afectar las propiedades mecánicas de otros componentes. Por ejemplo, la incorpo-
ración de un lubricante, que tiene como objetivo reducir la adherencia al equipo de fabricación, puede reducir las uniones
entre partículas. Los problemas en los procesos de fabricación, tales como el sobremezclado o la sobregranulación, pue-
den también influir sobre la resistencia de las tabletas.
Los atributos de desempeño de las tabletas, tales como desintegración, disolución y friabilidad, pueden verse afectados por
la compresión de las tabletas y también pueden verse reflejados en la resistencia mecánica de las tabletas. Por lo regular, una
tableta con una resistencia menor presentará una desintegración y disolución más rápidas, así como una mayor friabilidad (ver
Friabilidadde las Tabletas(1216)).
7. POROSIDADY FRACCIÓNSÓLIDADE LASTABLETAS

Prácticamente todos los compactos farmacéuticos contienen regiones porosas (poros). La porosidad de las tabletas es una
medición del volumen de la tableta que consta de poros o "espacio vacío". Es de crítica importancia considerar la porosidad
de las tabletas al caracterizar cuantitativamente las propiedades del tableteado, debido a que éste tiene un efecto sustancial
sobre las propiedades de los compactos medidos. La fracción sólida de las tabletas, también referida como densidad relativa,
es una medición del volumen de material sólido en un compacto y puede calcularse usando la Ecuación1. La fracción sólida de
las tabletas y la porosidad están relacionadas, tal como se muestra en la Ecuación2.
La densidad verdadera de un material es la masa promedio/unidad de volumen (p. ej., g/cm 3) sin incluir todos los espacios
vacíos (ver Densidadde Sólidos(699)). Las densidades verdaderas típicas de polvos orgánicos de interés farmacéutico están en
el intervalo de 1,0-1,7 g/cm 3, mientras que para ingredientes inorgánicos pueden estar en el intervalo de 2,0-3,0 g/cm 3
(18, 19).
(masa de la tableta)
(densidad de la tableta)
Fracción Sólida = ------------ (volumen de la tableta) (1)
(densidad verdadera del material) (densidad verdadera del material)
Porosidad= 1 - Fracciónsólida (2)

A menudo se usan geometrías simples de tabletas (p. ej., redonda de cara plana) para propósitos de investigación, a fin de
simplificar la determinación del volumen de la tableta usando la medición de las dimensiones de la tableta. Para formas de
tabletas más complejas, se pueden usar métodos alternativos para determinar el volumen de las tabletas, tales como el uso de
instrumentos que cuantifican el volumen de la envoltura. Las tabletas farmacéuticas típicas tienen porosidades de entre O,1 y
0,4, dependiendo de las propiedades de los materiales y las condiciones usadas para producir la tableta (20). Una porosidad
de O correspondería a una masa teórica de tableta en la que todos los poros han sido eliminados, lo que resulta en un compac-
to que consta en su totalidad de material sólido (es decir, fracción sólida= 1). Con una presión de compresión creciente, los
poros se eliminan a través del reordenamiento y deformación de las partículas, mientras que la porosidad de la tableta dismi-
nuye a menos que una recuperación elástica extensa de la tableta después de la descompresión ocasione grietas u otros defec-
tos.
8. PERFILDE FABRICABILIDAD
La fuerza de ruptura de las tabletas a menudo se mide como una función de la fuerza de compresión. Una gráfica de la
fuerza de ruptura en función de la fuerza de compresión es útil para monitorear cambios en el comportamiento de tableteado
de un polvo con un tamaño, forma y peso de tableta fijos producidas en condiciones similares de compresión (es decir, veloci-
dad y fuerza de producción), tales como las obtenidas usando una prensa rotativa para tabletas específica. En este caso, la
relación entre la fuerza de ruptura de las tabletas y la fuerza de compresión puede denominarse "fabricabilidad" (factibilidad
de fabricación, manufacturability en inglés), debido a que a menudo se trata del criterio usado en un entorno de producción
para monitorear la compresión de las tabletas. Ver la Figura3 para un ejemplo de un perfil de fabricabilidad.
4
600
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o 5 10 15
Fuerza de Compresión (kN)
Figura 3. Ejemplo de un perfil de fabricabilidad.
9. PERFILDE TABLETEABILIDAD
A pesar de su valor en el entorno de fabricación, la fuerza de ruptura de las tabletas debería reemplazarse por la resistencia a
la tensión de las tabletas para cuantificar la resistencia mecánica (ver el capítulo (1217)), y la fuerza de compresión debería
reemplazarse por la presión de compresión (fuerza de compresión por unidad de área de la sección transversal de la punta del
punzón). Estos cambios minimizarán el impacto del tamaño de la tableta, espesor y peso de la tableta sobre el análisis de los
datos de compresión. La relación entre la resistencia a la tensión de la tableta y la presión de compresión se denomina "table-
teabilidad". La resistencia a la tensión se incrementa por lo regular al inicio con el incremento de la presión de compresión.
Dependiendo de la composición de la tableta, la resistencia a la tensión puede continuar creciendo o nivelarse gradualmente a
presiones mayores. También es posible que la resistencia a la tensión pueda disminuir con la presión creciente, fenómeno al
cual se le conoce como sobrecompresión. Esta reducción en la resistencia de la tableta con la presión creciente es mayormente
el resultado de los defectos de la tableta generados por algunos materiales y que ocurren a presiones de compresión más altas.
Debido a la diversidad de los comportamientos de tableteabilidad del polvo, es beneficioso determinar la resistencia a la ten-
sión de las tabletas preparadas empleando una rango de presiones de compresión, en lugar de una sola presión, de ser posi-
ble. Esto ayudará a obtener una caracterización exacta de la tableteabilidad. Cuando los recursos o materiales disponibles sean
limitados, la presión de compresión requerida para fabricar un compacto a una resistencia a la tensión específica (p. ej., 1 MPa)
puede usarse para comparar las propiedades de compresión de distintos polvos. La tableteabilidad de los materiales farmacéu-
ticos a menudo pude describirse mediante la Ecuación3 para un rango típico de presiones de compresión, en la cual K y B son
constantes empíricas:
log(resistenciaa la tensión)= K log(presiónde compresión)+ B (3)

Ver la Figura4 para un ejemplo de un perfil de tableteabilidad.
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10 100 1000
Presión de Compresión (MPa)
Figura 4. Ejemplo de un perfil de tableteabilidad.
10. PERFIL DE COMPRESIBILIDAD
La compresibilidad es la dependencia de la fracción sólida de la tableta (o porosidad) con respecto a la presión de compre-
sión. La curva de compresibilidad puede obtenerse graficando una fracción sólida de la tableta en función de la presión de
compresión. Ver la Figura5 para un ejemplo de un perfil de compresibilidad.
Para muchos materiales farmacéuticos, se puede usar la Ecuación 4 para describir la compresibilidad en un intervalo típico de
fracciones sólidas de las tabletas, donde a y b son constantes empíricas:
log(presiónde compresión)=ax (fracciónsólida)+ b (4)
La presión de compresión necesaria para formar un compacto con una fracción sólida específica (p. ej., 0,85) puede usarse
para comparar materiales farmacéuticos diversos. El uso de 0,85 como fracción sólida de referencia es conveniente debido a
que muchos, aunque no todos, los polvos farmacéuticos pueden compactarse en esta fracción sólida, y una fracción sólida de
referencia permite evaluaciones comparativas de las mediciones de las propiedades de las tabletas. Se pueden usar valores al-
ternativos para la fracción sólida de referencia según se requiera.
0,95-,-------~--,---------,
0,90
0.85
:s'l0,80
'o
~ 0,75
•O
-~ 0,70
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0,65
0,60
0,55
0,50 +--~-~~~~---~-~~~~ .....

10 100 1000
Presión de Compresión(MPa)
Figura 5. Ejemplo de un perfil de compresibilidad.
La compresibilidad también se ha descrito usando la ecuación de Heckel (Ecuación5), que predice una dependencia lineal del
logaritmo de porosidad de la tableta en función de la presión de compresión. En la Ecuación5, Ky B son constantes empíricas.
-ln(porosidad) = K x (presiónde compresión)+ B (5)
4
Sin embargo, la ecuación de Heckel es sumamente simplista en el sentido de que no describe adecuadamente la compresibi-
lidad del polvo en la región de baja presión, donde ln(porosidad)en función de los datos de presión no es lineal. Modelos más
sofisticados, como la ecuación de Heckel modificada (27) y el Modelo Drucker-Prager Cap (22), han demostrado ser más con-
fiables al describir la compresibilidad de polvos al tener en cuenta la transición entre el estado de un polvo y el estado de una
tableta.
11. PERFILDE COMPACTABILIDAD

La relación entre la resistencia a la tensión y la fracción sólida (o porosidad) se denomina "compactabilidad". Por lo general,
la resistencia a la tensión de las tabletas se incrementa exponencialmente con el incremento de la fracción sólida, y la compac-
tabilidad del polvo a menudo se describe de manera adecuada mediante la ecuación Ryshkewitch-Duckworth (Ecuación6)
donde k y A son constante empíricas (2 3):
log(resistenciaa la tensión)= k x (fracciónsólida)+ A (6)
Esta relación es cualitativamente razonable, dado que la presencia de más poros o poros más grandes en un compacto lo debi-
lita. Además, esta relación enfatiza la importancia de determinar la porosidad de la tableta para entender de mejor manera el
desempeño del tableteado de los polvos. Por ejemplo, cuando una baja resistencia a la tensión de la tableta se asocia con una
porosidad alta (baja fracción sólida), una estrategia efectiva para superar el problema de tableteado es agregar un excipiente
altamente deformable, lo cual incrementa la plasticidad del polvo y reduce la porosidad de la tableta. Ver la Figura6 para un
ejemplo de perfil de compactabilidad.
100 ~------------------~
10+-'--'--L...l..~..L...l.,..Y-L..L...1...J..+..l....l....J..J4-J..-'--'--'--+-1-'-L...l..~..L...l....l..J
0,6 0,7 0,8 0,9
Fracción Sólida
Figura 6. Ejemplo de perfil de compactabilidad.
12. PERFILDE COMPRESIÓN

DETABLETAS
La Figura7 ilustra las relaciones entre resistencia a la tensión, presión de compresión y fracción sólida (o porosidad) y otros
parámetros de tableteado relacionados. Las relaciones entre resistencia a la tensión, presión de compresión y fracción sólida (o
porosidad) pueden representarse en tres dimensiones, según se muestra en la Figura8, donde las tres caras de la gráfica tridi-
mensional representan la tableteabilidad, la compresibilidad y la compactabilidad (24).
Resistencia a la◄ _ Considerar/as dimensionesde las tabletas _ Fuerza de

Tensión Ruptura
Fracción Presión de
Sólida ,_ __ C_o_m_p-,e-si-bi-lid_a_d
__ _.Compresión • _ _ __ __ _ __ _ _ Fuerza de
Considerartas dimensiones Compresión
de las tabletas
Figura 7. Relaciones entre los parámetros de tableteado para análisis de datos de compresión.
Figura 8. Perfil de compresión tridimensional.
13. SENSIBILIDAD
DE LAVELOCIDADDELEQUIPO
El efecto de la velocidad de compresión puede evaluarse comparando las propiedades de los compactos que se prepararon a
diferentes velocidades de compresión. Se puede obtener un intervalo de velocidades de compresión usando una prensa hi-
dráulica, una prensa rotativa para tabletas o un simulador de compactación. Para realizar evaluaciones básicas de materiales,
las propiedades de las tabletas tales como resistencia a la tensión, dureza y porosidad pueden usarse para cuantificar la sensibi-
lidad de la velocidad de deformación (SRS, por sus siglas en inglés) de un polvo usando la Ecuación7.
SRS I propíedad(sR21-propiedad(sR1¡ 1
(7)
propíedad(sR1¡
SR1 = velocidades de deformación bajas (p. ej., velocidad de compresión baja)

SR2 = velocidades de deformación altas (p. ej., velocidad de compresión alta)
14. CONCLUSIONES
Y RECOMENDACIONES
La compresión de tabletas es un proceso complejo que depende de la composición del medicamento, las propiedades de los
materiales, los parámetros del proceso de fabricación, las condiciones ambientales, el equipo y el diseño de la punzonería. Para
entender en profundidad el comportamiento de compresión de un polvo, es beneficioso conocer el tamaño y la forma de par-
tícula, la forma sólida y el contenido de agua del polvo. Sin el control ni las descripciones apropiadas de estos factores, los
datos obtenidos no son significativos para caracterizar con exactitud las propiedades de compresión de un polvo. Por lo tanto,
estaspropiedadessiempredebenconsiderarse duranteel análisisde los resultadosde compresiónde tabletas.Enla Tabla1 se
presentan ejemplos de parámetros que se usan comúnmente en la caracterización de las propiedades de compresión de sóli-
dos farmacéuticos.
7678 (1062) Caracterización de la Compresión de Tabletas / InformaciónGeneral USP42
Tabla 1. Parámetros Importantes a Especificar Durante la Caracterización de las Propiedades de Compresión de Polvos
Valor(es) de(l/los) Pa-
Parámetro Experimental rámetro(s) Usado(s) Elemplo de Parámetros de Uso Común•
Tipo de Punzonería Especificar Redonda de cara plana; redonda de cara cóncava común
Tamaño de la punzonería Especificar 8 mm, 10 mm, 13 mm
Velocidad de compresión Especificar Tabletas/minuto, 0,03 mm/s, 300 mm/s
Perfil de desplazamiento de
los punzones en función del
tiempo Especificar Diente de sierra, cuadrado, sinusoidal; unilateral, ambos lados
Intervalo de presiones de
compresión Especificar 25-300 MPa
Intervalo de fracciones sólidas Especificar 0,6-0,95
Propiedades de la tableta (pe-
so, dimensiones) Especificar Espesor de la tableta, diámetro de la tableta
Equilibrio del polvo Especificar 20', 40% de humedad relativa (HR)
Lubricación Especificar Tipo; matriz externa; interna, %
Almacenamiento de la tableta
(tiempo, temperatura y hu-
medad relativa) Especificar Ninquna; 24 horas a 20', 40% de HR
Configuración de la prensa
para tabletas Especificar Con o sin precompresión
Análisis de Datos
Presión de compresión {ac) en la fracción sólida especificada (SF, por sus siglas en in-
Compresibilidad glés)
Compactibilidad Especificar Resistencia a la tensión (ax) en la SF especificada
[NOTA-Si fuera posible,
Tableteabilidad ax en el ac especificada, o ar en el ax especificada
se prefiere la curva com-
Fuerza de eyección pleta.J Fuerza de eyección en el ac especificada
SRS = (P2 - Pl )/P2, P2 = presión de fluencia (yield pressure) media a 300 mm/s; Pl =
presión de fluencia media a 0,033 mm/s, perfil de desplazamiento de los punzones en
SRS Especificar función del tiempo en forma de diente de sierra.
ª Estosejemplos no son requerimientosy pueden no ser adecuados paratodos los materiales.No deben considerarsevaloresprescritosparacaracterizarpolvos.
GLOSARIO
Fuerza de ruptura: Fuerza [en newtons (N)] requerida para ocasionar la fractura mecánica de la tableta. A menudo referido
como dureza de las tabletas (ver el capítulo (1217)).
Fragilidad: Propiedad que lleva a la ruptura de las partículas o del compacto, por lo general de manera muy rápida.
Decapado: División laminar a lo largo del eje de la corona o banda de una tableta comprimida.
Compactabilidad: Capacidad de un polvo de formar un compacto intacto con resistencia medible.
Perfil de compactabilidad: Cambio en la resistencia a la tensión de un cuerpo comprimido con la fracción sólida (o porosi-
dad).
Compactación: Transformación de un polvo en un compacto intacto con resistencia medible y forma definida mediante la
aplicación de presión de compresión. Por lo regular se usa como sinónimo de consolidación.
Simulador de compactación: Dispositivo que se aproxima físicamente a las configuraciones de las prensas para tabletas en
el que se pueden aplicar los parámetros de compresión; los parámetros pueden incluir las dimensiones del rodillo de precom-
presión y compresión, la velocidad de tableteado, el ángulo de eyección y el diseño del punzón.
Simulador de prensa: Dispositivo que permite la compresión de polvos, que por lo regular usa una fuente hidráulica para
controlar el desplazamiento de los punzones, que puede estar diseñado para igualar el perfil de desplazamiento y fuerza de
una prensa de alta velocidad mediante una computadora.
Compresibilidad: Capacidad de un polvo para ser comprimido (reducir su volumen) mediante la aplicación de tensión.
Perfil de compresibilidad: Cambio en la fracción sólida (o porosidad) de un cuerpo comprimido con presión aplicada.
Compresión: Reducción en volumen de un lecho de polvo debido a la aplicación de tensión, p. ej., carga.
Fuerza de compresión: Fuerza aplicada para comprimir un lecho de polvo. La unidad kN por lo regular se usa en el table-
teado.
Presión de compresión: Presión (fuerza/área, en MPa) aplicada al material de muestra; en ocasiones se usa de manera inter-
cambiable con los términos "presión de compactación" o "tensión de compresión". Ver Compactación y Compresión.
Perfil de compresión: Relación entre la Presiónde compresión,Fracción sólida(o porosidad) y resistencia a la tensión.
Tiempo de residencia: Tiempo (en ms) en el que el rodillo de compresión entra en contacto con la porción plana de la
cabeza del punzón. A menudo se usa para describir los procesos de compresión rotativa con un perfil de desplazamiento de
los punzones en función del tiempo en forma sinusoidal modificada.
USP42 InformaciónGeneral/ (1062) Caracterización de la Compresión de Tabletas 7679
Deformación elástica: Cambio en la forma de un cuerpo tensionado que se recupera completamente cuando se libera la
tensión. Esta es una deformación recuperable independiente del tiempo.
Límite elástico: Cantidad de tensión en la que un material se desvíe del comportamiento elástico lineal, es decir, la tensión
más pequeña que deja una deformación permanente detectable cuando se descarga.
Falla: Colapso, ruptura o deformación permanente del material.
Fuerza: Empuje o tracción (en N) que resulta de las interacciones entre dos objetos.
Dureza: Ver Fuerzade ruptura.
Prensa hidráulica: Dispositivo que emplea presión de líquidos para permitir la aplicación de fuerza a una muestra.
Dureza por indentación: Resistencia de una superficie a la deformación permanente (endentación) al someterla a presión
con un objeto duro.
Laminación: Condición en la que una tableta se parte o se separa en capas.
Perfil de fabricabilidad (manufacturability en inglés): Cambio en la resistencia a la ruptura de un cuerpo comprimido
cuando se aplica una fuerza.
Propiedades mecánicas: Características de un material al momento de la aplicación de una tensión. Los ejemplos incluyen
resistencia a la tensión, tensión de fluencia, plasticidad, fragilidad, dureza, módulo elástico y flexibilidad.
Deformación plástica: Cambio permanente en la forma de un cuerpo sólido, sin fractura, que resulta de la aplicación soste-
nida de una tensión más allá del límite elástico. La deformación ocurre sin un cambio en el volumen de las partículas.
Plasticidad: Ver Deformaciónplástica.
Presión: Fuerza aplicada a una unidad de área (en MPa), en este capítulo se usa de manera intercambiable con tensión.
Porosidad o fracción vacía: Medición de los espacios vacíos en un material. Se trata de la fracción de espacios vacíos dividi-
da por el volumen total. Intervalos de porosidad entre O y 1, o como porcentaje entre 0% y 100%.
Tensión de corte: Fuerza por unidad de área (en MPa) que actúa a lo largo de un plano a través de un cuerpo.
Fracción sólida: Densidad aparente dividida por la densidad absoluta del sólido, en ocasiones referida como densidad relati-
va. Fración sólida = (1 - porosidad).
Adherencia: Adherencia del material a las caras de los punzones o matrices de la prensa para tabletas después de la compre-
sión.
Tensión: Tensión normal. Se usa en este capítulo de manera intercambiable con presión. Ver Presión.
Perfil de tableteabilidad: Cambio en la resistencia a la tensión de un cuerpo comprimido cuando se aplica una presión.
Prensa para tabletas: Dispositivo mecánico que comprime el polvo en tabletas con un tamaño y peso deseados.
-
Densidad verdadera: La masa promedio por volumen unitario, sin incluir todos los espacios vacíos que no son una parte
fundamental del orden de la estructura molecular cristalina.
Deformación viscoelástica: Deformación parcialmente recuperable, dependiente del tiempo.
Tensión de la fluencia: Tensión requerida para producir una cantidad especificada de deformación plástica (por lo regular
un cambio de longitud del 0,2%).
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(1063) METODOLOGÍADE CELDADE CORTEPARAPRUEBAS

DE
FLUIDEZDE POLVOS
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Alcance
2. TEORÍAY PRINCIPIOS
3. DESCRIPCIÓNDE COMPONENTESY DISEÑOSDE LACELDADE CORTE
4. MEDICIONESDE LACELDADE CORTE
4.1 Preparación de la Muestra
4.2 Preparación del Instrumento
5. SELECCIONDE LASCONDICIONES DE PRUEBA
6. PROCEDIMIENTODE PRUEBA
7. ANÁLISISDE DATOSY CÁLCULOS
8. MATERIALES DE REFERENCIA Y REPRODUCIBILIDAD
1. INTRODUCCIÓN
Existe un gran número de procesos farmacéuticos que implican la transferencia y carga de polvo, además de que la capaci-
dad de los polvos para fluir de manera controlada durante estas operaciones es crítica para la calidad del producto. Por ejem-
plo, los atributos de los medicamentos, tales como el peso y la uniformidad de contenido dependen de las características de
fluidez de polvos. Los métodos de celdas de corte se encuentran entre los más importantes para medir las propiedades de
fluidez de polvos, y los datos derivados del análisis de celda de corte pueden ser usados para predecir una amplia variedad de
comportamientos de fluidez de polvos durante la fabricación farmacéutica. Los métodos de celdas de corte tienen muchas
ventajas sobre los métodos más simples de medición de fluidez de polvos (ver Fluidezde Polvos(1174)), pero su operación es
más compleja y los procedimientos para su uso deben controlarse de forma cuidadosa para producir datos exactos y reprodu-
cibles. Este capítulo describe las mejores prácticas para obtener datos confiables y exactos de fluidez de polvos mediante una
celda de corte.
1.1 Alcance
Este capítulo se enfoca en tres de los tipos de celdas de corte más comunes usados para medir las propiedades de fluidez de
polvos:
1. Traslacional (tipo Jenike)
2. Anular (tipo Schulze)
USP42 InformaciónGeneral/ (1063) Metodología de Celda de Corte 7681
3. Rotacional (tipo Peschl)

Estos tres tipos de celdas de corte se categorizan como pruebas de corte directo en las que una región del polvo se corta a
tensiones normales controladas en serie. A partir de estos datos, se puede obtener una amplia variedad de parámetros, inclui-
do el punto de fluencia, que representa la relación entre la tensión de corte y la tensión normal en el flujo incipiente, el ángulo
de fricción interna, la tensión de fluencia no confinada, la cohesión del polvo y una variedad de parámetros relacionados, tales
como la función de flujo. Además, estas tres celdas de corte pueden configurarse con suplementos de pared (ver Apéndice)
para medir la fricción del polvo con la pared. Al combinar los datos de la celda de corte, se pueden usar para la evaluación y el
diseño de la bandeja y de la tolva. Otros enfoques de análisis, tales como equipos para ensayo triaxial y analizadores indirectos
o híbridos (p. ej., lndizador lohanson ), están fuera del alcance de este capítulo.
2. TEORÍAY PRINCIPIOS
El comportamiento de la fluidez de un polvo es fundamentalmente distinto al de la fluidez de un líquido. En primer lugar, las
propiedades de flujo de polvos y los comportamientos de corte son altamente dependientes de las tensiones de consolidación
aplicadas al polvo y mínimamente dependientes de la velocidad de deformación o de flujo (asumiendo condiciones casi estáti-
cas, tales como el flujo en un tambor). Por el contrario, el flujo de los fluidos depende en gran medida de la velocidad de
deformación (donde la viscosidad describe la relación entre las tensiones de corte y las velocidades de deformación) y depende
en menor medida de la presión absoluta. En segundo lugar, cuando las tensiones de corte se aplican a los polvos, estos po-
drían no fallar inmediatamente (es decir, pueden evitar fluir bajo una tensión de corte sostenida), mientras que los fluidos new-
tonianos y viscoelásticos no se comportan de dicha manera y siempre fluyen bajo una tensión de corte aplicada. Por ende, los
polvos tienen tendencia al arqueo y canalización, dependiendo del patrón de fluidez (ver el Apéndice).
Sin embargo, los polvos pueden tolerar la tensión de corte sin fluir solo hasta cierto punto. El punto de fluencia para un
polvo dado es una función de muchas variables, incluida su composición, tamaño y forma de partícula, contenido de hume-
dad, temperatura, tiempo de almacenamiento en reposo y el estado de consolidación. Una vez que el polvo se somete a ten-
siones (ya sea por gravedad o mecánicamente) que alcanzan o excedan el punto de fluencia, el polvo fluye. Por ende, determi-
nar el punto de fluencia para un polvo dado en condiciones que representan el proceso de fabricación es un paso esencial para
la evaluación de los comportamientos de la fluidez para dicho proceso. En algunas circunstancias, esto puede implicar llevar a
cabo el análisis en condiciones ambientales controladas, así como mantener el polvo en estado de carga durante un periodo
extenso antes del corte (una "prueba de tiempo").
Debido a que las propiedades de los polvos dependen en gran medida del grado de consolidación, la preparación de un
lecho de polvo uniforme (densidad aparente uniforme en todo el lecho de polvo) es el primer paso crítico del análisis de celda
de corte. La próxima etapa de análisis es la aplicación de una tensión normal (u) y de tensión de corte(,) al lecho de polvo
para lograr un corte en estado estacionario, lo que resulta en un estado conocido de consolidación. Posteriormente, se detiene
la tensión de corte y se aplica una tensión normal reducida. Luego, se aplica una tensión de corte que se incrementa progresi-
vamente hasta que el lecho de polvo cede y comienza a fluir. Este procedimiento se repite en varias condiciones de tensión
normales distintas para crear una gráfica de "punto de fluencia". Para finalizar un análisis completo de la función de flujo, el
operador debe determinar diversos puntos de fluencias, lo cual requiere determinar la tensión de fluencia no confinada a diver-
sos niveles de consolidación.
Aunque este capítulo se enfoca en las propiedades de los polvos (partícula-partícula), también son importantes las propieda-
des de la fricción con la pared (partícula-pared) y la densidad aparente. Dichas propiedades se usan para el diseño de contene-
dores y también son esenciales al comparar diferentes materiales de las paredes (p. ej., los diferentes grados y acabados de
acero inoxidable, o el efecto de los recubrimientos plásticos sobre los comportamientos de la fluidez de polvos). La propiedad
más fundamental de un material de pared en este sentido es t!I, el ángulo de fricción entre el polvo a granel y el material de la
pared, o, en consecuencia, el coeficiente de fricción con la pared (µw):
µ,, = tan( t!I) = ,wf
(Tw
'w = tensiónde corte con la pared

CTw = tensiónnormal con la pared
Se debe tener en cuenta que t!I, y por endeµ.,, a menudo son una función de la tensión normal aplicada (uw).
3. DESCRIPCIÓNDE COMPONENTESY DISEÑOSDE LA CELDADE CORTE

Las Figuras 1, 2 y 3 proveen esquemas de los distintos tipos de celdas de corte consideradas en este capítulo general. Todas
las celdas tienen el mismo principio de operación general que se basa en su capacidad de medir la fuerza requerida para cortar
un lecho de polvo al que se ha aplicado una carga normal. La carga aplicada o fuerza medida se pueden expresar en forma de
tensión al dividirlas por el área de la sección transversal del plano de corte que se está considerando.
La celda de corte traslacional (Figura 1) tiene una base fija con un anillo móvil por encima de esta, y ambas sostienen el
polvo a granel. Se usa una cubierta que se ajusta dentro del anillo para contener el polvo y para proveer una aplicación unifor-
me de la carga normal (N). El anillo y la cubierta se presionan como una unidad mientras que una celda de carga registra las
7682 (1063) Metodología de Celda de Corte/ Información General USP42
fuerzas de corte (F) que se generan. El plano de corte se forma entre el polvo que está contenido en la base y el polvo conteni-
do en el anillo.
CUBIERTA
N
BRAZO SÓLIDO
TRANSVERSAL A GRANEL
rANILLO
BASE
Figura 1. Esquema descriptivo de la celda de corte traslacional.

La celda de corte anular (Figura2) consta de una celda o base de corte que sostiene el polvo. Se usa una cubierta que se
ajusta dentro de la celda para contener el polvo y para proveer una aplicación uniforme de la carga normal (N). La cubierta
puede moverse libremente hacia arriba y hacia abajo, aunque es mantenida en su lugar por una celda de carga que mide las
fuerzas de corte (F) que se generan. La celda de corte se hace rotar a una velocidad angular constante (w) para crear un plano
de corte que se forma en el lecho de polvo en algún lugar entre la parte inferior de la celda y la cubierta. La cubierta y la celda
de corte por lo general tienen deflectores u otros elementos en la superficie que evitan que el polvo se deslice o se corte en la
interfase entre el polvo y la cubierta o la base de la celda de corte.
BARRA
TRANSVERSAL
CUBIERTADE
LA CELDA
CELDADE
CORTE
SÓLIDOA GRANEL
Figura 2. Esquema descriptivo de la celda de corte anular.
La celda de corte rotatoria (Figura3) tiene una base y un anillo que retienen el polvo. Se usa una tapa de carga que se ajusta
dentro del anillo para contener el material y para proveer una aplicación uniforme de la carga normal (N). La tapa de carga
puede moverse libremente hacia arriba y hacia abajo, aunque se mantiene en su lugar, y está conectada a una celda de carga
que mide las fuerzas de corte (F)que se generan. Se hace girar la base de la celda de corte a una velocidad angular constante
(w) para crear un plano de corte que se forma en el lecho de polvo en algún lugar entre el anillo y la base. Como alternativa, la
base puede fijarse y la tapa puede rotarse para crear el plano de corte en la muestra de polvo. El anillo y la base por lo general
cuentan con elementos en la superficie que evitan que el polvo se deslice en la interfase de polvo-superficie.
USP42 InformaciónGeneral/ (1063) Metodología de Celda de Corte 7683
TAPADE
CARGA
ANILLO
BASE
SÓLIDO
A GRANEL
Figura 3. Esquema descriptivo de la celda de corte rotatoria.
La elección de un tipo de celda de corte particular con respecto a otra depende de factores, tales como la disponibilidad del
equipo y la facilidad de uso para un técnico particular. Debido al recorrido infinito permitido por la geometría de la celda de
corte anular y rotatoria, estos tipos de celdas son más adecuados para polvos que requieren tensiones más grandes para alcan-
zar el estado estacionario. Otra ventaja del recorrido infinito de los analizadores giratorios es que no siempre es necesario un
paso de preconsolidación.
Se pueden llevar a cabo pruebas de fricción con la pared usando las celdas de corte referidas en este capítulo con algunas
modificaciones menores, principalmente creando un plano de corte en el que el polvo se deslice sobre un suplemento de pa-
red adecuado en lugar de tener un plano de corte dentro del lecho de polvo. Esto por lo general se logra reemplazando la
base de la celda de corte con un suplemento del material de pared y ajustando la cantidad de polvo usada para crear un plano
de corte en la interfase de polvo-cupón.
4. MEDICIONES
DE LA CELDADE CORTE
4.1 Preparación de la Muestra
La aplicabilidad de los datos de la celda de corte depende en gran medida del uso de una muestra representativa de polvo.
Se puede encontrar información detallada sobre los procedimientos de muestreo apropiados en Procedimientos de Muestreode
Polvosa Granel(1097).
Eltamaño de la celda (volumen y diámetro) por lo general se selecciona basándose en el tamaño de partícula máximo de la
muestra de polvo y en la proporción de partículas grandes en la muestra. Por lo general, el proveedor del equipo de análisis
disponible comercialmente provee información sobre el límite de tamaño de partícula. Para una celda traslacional, el tamaño
de partícula máximo es aproximadamente 5% del diámetro de la celda, y para una celda anular, el tamaño de partícula máxi-
mo es aproximadamente 10% del ancho del anillo (es decir, la diferencia entre el radio exterior e interior del paso de la celda
de corte). De ser posible, es recomendable usar una nueva carga de polvo para cada prueba, por lo que puede ser preferible
usar una celda más pequeña en vez de reusar el polvo. En algunas circunstancias, puede requerirse una celda más pequeña
para lograr tensiones de consolidación más altas. Los tamaños de celda más pequeños pueden tener una precisión menor y un
mayor sesgo, dependiendo del analizador específico y del tamaño de la celda que se está considerando, debido a una mayor
contribución de aspectos no ideales ocasionados por los efectos de la pared.
La fuerza de corte de algunos polvos (p. ej., sólidos fibrosos o escamosos) a menudo se debe al interbloqueo de las partícu-
las; por lo tanto, dichos materiales pueden ser inadecuados para su análisis con una celda de corte convencional. De forma
similar, los polvos con alto poder de recuperación (propiedades similares al caucho o altamente elásticas) en ocasiones pueden
caer fuera de los límites prácticos de un analizador de corte. Una reproducibilidad deficiente y resultados inesperados pueden
indicar un problema en el análisis de estos tipos de polvos.
Las muestras de polvo deben manipularse y analizarse en condiciones que sean relevantes desde un punto de vista práctico.
Por ejemplo, muchos polvos farmacéuticos sorberán/desorberán humedad de sus entornos de acuerdo a la humedad relativa y
la temperatura ambiental. Esta humedad sorbida puede afectar significativamente las propiedades medidas de fluidez de pol-
vos. Controlar las condiciones ambientales durante la manipulación y el análisis de modo que la muestra sea representativa de
las condiciones de procesamiento de interés es esencial para la mayoría de los polvos.
7684 (1063) Metodología de Celda de Corte / Información General USP42
Algunos polvos farmacéuticos "envejecen" rápidamente después de su producción y puede ser necesario analizarlos inme-
diatamente después de su fabricación. El análisis de algunos polvos puede resultar en la aglutinación o abrasión de partículas
que generan un polvo inadecuado para el reanálisis. En dichas circunstancias, se deben usar nuevas muestras de polvo para
cada prueba.
4.2 Preparación del Instrumento
La celda de corte debe situarse en un área exenta de vibraciones. Las vibraciones pueden afectar las lecturas del instrumento
y también pueden densificar o dilatar el polvo durante el análisis.
Debido a que los analizadores de corte miden fuerzas, sus celdas de carga deben calibrarse con respecto a las fuerzas que se
están midiendo. Algunos analizadores también miden el desplazamiento (lineal o angular) de la celda (lo cual indica el recorri-
do) y/o el desplazamiento vertical de la cubierta o tapa (usada para calcular el volumen de la celda y, por ende, una densidad
aparente promedio). En estos casos, los transductores de desplazamiento también deben calibrarse. Como parte de esta cali-
bración, será necesario confirmar la velocidad de cualquier cambio en la fuerza y el desplazamiento. Además, la celda de corte
se opera bajo la suposición de que todas las partes están alineadas con precisión y que existe un grado mínimo de vibración
cuando la celda gira. Por ejemplo, si la cubierta y el paso de la celda de corte no están en paralelo durante el análisis, será
difícil obtener resultados reproducibles. Por ende, la alineación y operación mecánica de la celda de corte deben ser evaluadas
a intervalos regulares. No se realiza ningún otro ajuste con respecto a la calibración, aunque el desempeño correcto del apara-
to puede confirmarse midiendo el punto de fluencia de un polvo de referencia en condiciones de prueba estandarizadas.
Los suplementos de pared usados para el análisis deben representar las superficies en las que se deslizará el polvo. Las super-
ficies direccionales pueden orientarse en la dirección del flujo en la aplicación (p. ej., rugosidad (o aspereza) orientada hacia
abajo a lo largo de la tolva), orientado en la condición más exigente (a menudo, rugosidad (o aspereza) orientada de forma
perpendicular a la dirección del flujo en la tolva) o evaluado en ambas direcciones.
Todos los componentes de la celda de corte (incluyendo los suplementos de pared) deben limpiarse cuidadosamente con un
método que no erosione o deje algún residuo químico antes de usarlos. Además, el método de limpieza debe ser capaz de
eliminar todos los componentes de la muestra de prueba, incluyendo lubricantes y otros aditivos.
5. SELECCIÓN
DE LASCONDICIONES
DE PRUEBA
Por lo general, las tensiones normales previas al corte se seleccionan basándose en los valores de densidad del polvo. Los
estándares, tales como el Estándar ASTM6128, proveen tablas de tensiones normales previas al corte específicas como una
función de la densidad aparente de la muestra. 1 Las tensiones normales previas al corte subsiguientes se proveen en múltiplos
del valor previo al corte inicial (p. ej., 2; 4 y 8 veces el nivel inicial). El número de niveles de tensión normal previas al corte
debe ser al menos 4. A menudo, resulta valioso equiparar las tensiones previas al corte en la prueba con las tensiones espera-
das en la situación de procesamiento de interés. Los tiempos de espera para las pruebas por tiempo se seleccionan basándose
en la correspondencia con el tiempo de espera en la aplicación práctica. Si los tiempos de espera largos no son realistas, los
operadores pueden considerar diversos puntos de muestreo intermedios y la extrapolación de los datos.
Se seleccionan niveles de tensión normal para corte a fin de proveer un intervalo de puntos de datos sobre el punto de
fluencia. Por lo general, es válido un intervalo entre 25% y 80% de la tensión normal previa al corte, aunque los polvos con
una alta fricción interna o alta tensión de fluencia no confinada pueden requerir un intervalo más estrecho. El intervalo de ni-
veles de tensión de corte normal debe ser suficiente para permitir un ajuste significativo y una extrapolación de los datos para
determinar la tensión de flujo ilimitada y otros parámetros relacionados.
6. PROCEDIMIENTO
DE PRUEBA
El análisis de celda de corte implica una secuencia de pasos que consolida el polvo a un grado conocido y luego lo corta en
condiciones cuidadosamente controladas mientras registra las tensiones normales aplicadas y mide las tensiones de corte. En la
mayoría de los casos, los pasos esenciales son los siguientes:
1. Llenar la celda de prueba con una muestra apropiada y representativa del polvo de manera que provea una densidad apa-
rente y composición uniformes. Esta muestra en la celda de prueba se denomina "espécimen". Los procedimientos deta-
llados pueden variar de acuerdo con el tipo de analizador usado, pero en todos los casos es esencial distribuir el polvo de
forma uniforme y evitar bolsas de aire que puedan ser difíciles de eliminar posteriormente.
2. Para celdas de corte traslacionales, realizar un paso de preconsolidación para crear la densidad deseada en la celda. Esto
se logra girando la cubierta mientras se encuentra bajo una carga normal de compresión. Este paso reduce el recorrido
requerido para lograr un valor previo al corte en estado estacionario y puede limitar el desplazamiento vertical total de la
cubierta durante la prueba. Se puede llevar a cabo un paso de preconsolidación en otros tipos de celdas, pero esto a me-
nudo no se lleva a cabo debido a que la rotación ilimitada de las celdas anulares y rotatorias por lo general puede proveer
un estado de consolidación suficiente. El nivel apropiado de preconsolidación es crítico y se debe tener cuidado de no
sobreconsolidar o subconsolidar la muestra.
1 ASTM. D6128-06. Standard test method for shear testing

of bulk solids using the Jenike shear cell. West Conshohocken, PA:ASTM; 2006.
lt
USP42 Información General/ (1063) Metodología de Celda de Corte 7685
3. Consolidar la muestra aplicando una tensión normal conocida a la muestra de polvo mediante la cubierta/tapa de la cel-
da.
4. Precortar la muestra hasta alcanzar un valor de corte en estado estacionario. Se debe tener cuidado para evitar la sobre-
consolidación de la muestra. Posteriormente, la tensión de corte aplicada se reduce a cero.
5. Se lleva a cabo una prueba de corte instantáneo cortando la muestra a una tensión normal reducida (con respecto a la
tensión previa al corte aplicada) hasta que la tensión de corte pasa a través de un valor máximo y luego comienza a des-
cender.
Los pasos 1-5 se repiten en una serie de distintas condiciones de tensión normales reducidas para crear un conjunto de da-
tos completo (punto de fluencia) y, posteriormente, en una serie de distintas condiciones de tensión normales previas al corte
para crear una "función de flujo". De preferencia, la celda de prueba está vacía y se vuelve a llenar antes de generar cada pun-
to de fluencia. Para tipos de celda de corte anulares o rotatorias, es común repetir los pasos 3-5 varias veces para la misma
muestra sin vaciar y rellenar la celda. Si se usa la misma muestra para múltiples puntos de prueba, debe asegurarse que la
muestra no haya cambiado entre pruebas.
Se lleva a cabo una prueba de fricción con la pared de forma análoga deslizando la muestra sobre un suplemento de mate-
rial de pared y midiendo la tensión de corte como una función de la tensión normal aplicada. En una prueba por tiempo, se
aplica una tensión normal a la muestra durante un periodo predeterminado antes del corte. Se pueden llevar a cabo pruebas
de fricción con la pared y de consolidación con el tiempo con los tres tipos de celdas de corte descritos en este capítulo, siem-
pre que se tenga en cuenta la direccionalidad (si la hubiere) de la superficie de la pared con respecto al movimiento de la
celda.
7. ANÁLISISDE DATOS Y CÁLCULOS
Los resultados ilustrativos del procedimiento de prueba con la celda de corte se presentan en la Figura4. Para el análisis, la
tensión normal previa al corte aplicada ( ap)y todos los puntos de tensión normal aplicada válidos ( a',;)para / = 1, 2, 3, ... , n y
sus puntos de tensión de corte medidos correspondientes 2 ( rP' r, 1, r,2, ... , rsn)se grafican en las coordinadas ( o; r). Estos datos
se usan para generar una línea continua a través de todos los puntos de corte válidos para obtener el punto de fluencia. Por lo
general, el punto de fluencia pasa por encima o a través del punto previo al corte. Si no es así, los resultados de prueba deben
analizarse en mayor detalle. En algunas circunstancias, se puede hacer pasar el punto de fluencia a través del punto previo al
corte y que se ajuste a todos los puntos de corte.
La "tensión de fluencia no confinada" del polvo se obtiene trazando un círculo Mohr a través del origen y de manera tan-
gencial al punto de fluencia. El punto más alto de la intersección de este círculo Mohr y el eje a es la tensión de fluencia no
confinada f,. La "tensión de consolidación principal", c,1, se encuentra trazando un segundo círculo Mohr a través del punto
previo al corte y tangencial al punto de fluencia. El punto más alto de la intersección de este círculo Mohr (punto de consolida-
ción) y el eje a es la tensión de consolidación principal.
flu¡o 1nc1p1ente I l punto de fluencia
\ ------: --- ----Tp- ----- \----__¿_--,'-._

------
/
flujo en
estado
\ ------j--
I
-----------T,,---------- :
¡
flujo en estado
estacionario
1 :
1 :
º~---~~-----!'---~~-º~--~--~~'-------~
º 1~ 11>------------.;I
precorte
1~ º f, ªP a-~
corte I crp u 52 <cr 81
(crPaplicada) (CTs1<Up
aplicada) 1 tiempo
~estra nueva
Figura 4. Prueba en celda de corte y análisis de datos: datos sin procesar tal como se obtienen de la celda de corte (izquier-
da) y punto de fluencia calculado a partir de los datos sin procesar (derecha).
El "ángulo de fricción interna", </J,se define como la pendiente del punto de fluencia, tal como se muestra en la Figura5.
Una línea trazada a través del origen y tangencial al círculo Mohr en estado estacionario tiene un ángulo, J, que se define co-
mo el "ángulo efectivo de fricción". La "cohesión," C, es la intersección del punto de fluencia y del eje r.
2
Para una dada tensión normal aplicada, los valores de tensión de corte en estado estacionario medidos deben ser uniformes entre las pruebas. Para tener en
cuenta las variaciones experimentales normales, se puede prorratear de manera apropiada un valor dado de tensión de corte medido, con respecto al valor en
estado estacionario asociado con dicho punto.
4
7686 (1063) Metodología de Celda de Corte / Información General USP42
punto de fluencia
''
<t> ,,,.,,.-;/ '' \
-r- /
==r:/<i_
~.,,,....'...,
/ punto de fluencia efectivo
\
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\
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e / ,,,,,,,,,,,,,
I
º ~\ ,,/' 1 \
1
1
1
o ¡ / 1
1
a
o
Figura 5. Representación gráfica del ángulo de fricción interna ( <1>),
del ángulo efectivo de fricción (ó) y de la cohesión (C).
A partir de una familia de puntos de fluencia generados en diferentes tensiones normales previas al corte, es posible graficar
la resistencia al flujo ilimitada, f" como una función de la tensión de consolidación principal, o-1, según se muestra en la Figura
6. La curva que mejor se ajusta a estos puntos se denomina "función de flujo" y se puede usar para calcular el potencial de
arqueo y canalización en contenedores de almacenamiento.
Tres Gráficasde Punto de Fluencia Tres Puntos en Una Curva de Función de Flujo
Ten~iónde Resistenciade
CortP,T Fluencia
No Confinada(f,) Funciónde Flujo
(f,)s -·········
1-
(f,l,
(f,), -
1
oO '
(rr,),
Tensión de Consolidación Principa!,cr 1
Figura 6. Cálculo de la función de flujo a partir de múltiples gráficas de punto de fluencia.
El "punto de fluencia cinemática de la pared" se desarrolla de forma similar al cálculo del punto de fluencia. Esto se repre-
senta en la Figura l. El "ángulo de fricción con la pared", tfl, se define como la inclinación de una línea a partir del origen
hasta un punto de fluencia de la pared. En general, es conveniente que los ángulos de fricción con la pared sean bajos.
'--punto de fluencia de la pared
específica
tiempo
Figura 7. Cálculo de puntos de fluencia con la pared.
Las condiciones de prueba deben documentarse con cuidado paracada análisis con celda de corte a fin de permitir la inter-
pretación exacta de los datos y las comparaciones de datos significativas. Cuando los analistas comparan múltiples polvos, usar
el mismo tipo de analizador, modelo de analizador específico, tamaño de celda de prueba, preparación de la muestra, procedi-
mientos de prueba, tensiones normales aplicadas y condiciones ambientales provee mayor confianza que cualquier diferencia
en los resultados se atribuye al polvo y no a la prueba. Los cambios en el origen o fabricación del material pueden requerir la
repetición de los estudios iniciales.
Las pruebas de celda de corte permiten al analista caracterizar polvos consolidados en condiciones casi estáticas. Las pruebas
no son capaces de medir directamente las propiedades de fluidez de polvos en condiciones de tensión muy baja o a velocida-
des de corte muy altas, lo cual puede ocurrir en algunas situaciones de manipulación de polvo. Por ende, ningún parámetro
individual puede describir la fluidez de polvos. Por el contrario, los parámetros descritos en este capítulo deben interpretarse
en conjunto y en el contexto de las condiciones en las que el polvo será almacenado y manipulado (p. ej., dimensiones de
equipo, condiciones ambientales, entre otros).
El cociente entre la tensión de consolidación principal, a 7, y la tensión de fluencia no confinada, f" en un valor particular de
la tensión de consolidación principal provee una forma general y simplificada de evaluar la capacidad de flujo del polvo. Como
caso general, el flujo de materiales en polvo se clasifica en la Tabla1.
Tabla 1. Claslflcaclón General de los Tipos de Flujoª
<Y¡/f, Tipos de Flujo
<2 Muy cohesivo,sin fluidez
2-4 Cohesivo
4-10 FácilFluidez
>10 Libre Fluidez
' Jenike A. Storage and flow of solids: bulletin no. 123 of the Utah Engineering Experiment Station. Salt Lake City, UT: University of Utah; 1964.
Este enfoque puede ser útil para clasificar los tipos de flujo de los polvos farmacéuticos como parte de las actividades de
formulación y de desarrollo del proceso. Sin embargo, se debe tener en cuenta que esta visión simplificada puede llevar a erro-
res significativos en la interpretación, debido a que este enfoque no tiene en cuenta el patrón de flujo o el tamaño o la geome-
tría del equipo de fabricación usado.
8. MATERIALES DE REFERENCIA Y REPRODUCIBILIDAD
Para un analizador que se instala y opera correctamente, el desempeño del instrumento y del operador puede evaluarse me-
diante el análisis de un material estándar. En la actualidad, no existe un material de referencia farmacéutico específico para la
verificación del método de prueba de celda de corte. El polvo de cal ha sido usado como material de referencia certificado. 3
Las Figuras8, 9, 1O, 11, 12 y 13 muestran puntos de fluencia representativos y gráficas de función de flujo para diversos
polvos de excipientes farmacéuticos comunes determinados en un intervalo de condiciones. Las gráficas se proveen para ilus-
trar el tipo de datos que pueden generarse para los polvos farmacéuticos usando una celda de corte y la reproducibilidad típi-
ca de los datos. Los datos en las Figuras8, 9, 1Oy 11 se recolectaron usando un procedimiento que se corresponde con el
descrito para la Figura4. Estas gráficas no están destinadas para uso como datos de referencia y no se debe asumir que son
representativos de todas las condiciones de prueba y los tipos de materiales.
5-
4.
o~~~~-~-~-~--~-~-~--~-~--~~
o 10 11
Tensiónnormal,ff [kPa]
Figura 8. Puntos de fluencia representativos para celulosa microcristalina NF (Formulario Nacional, por sus siglas en inglés)
(Avicel PH-101) en tensiones previas al corte de 730 Pa (líneassólidas),1,9 kPa (líneaspunteadas)y 4,6 kPa (líneasquebradas).
3 El material de referencia certificado de polvo de cal (BCR-116) está disponible en el lnstitute for Reference Materials and Measurements (Instituto para Materiales
de Referencia y Mediciones) de la Comisión Europea y con proveedores de instrumentos.
4
7688 (1063) Metodología de Celda de Corte/ Información General USP42
15----~-------------~--------~
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6
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8
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1
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·····.•.•..•
10 15 20 25 30
Tensión normal,cr [kPa]
Figura 9. Puntos de fluencia representativos para sorbitol en tensiones previas al corte de 3 kPa (líneasdiscontinuasgrises),
6 kPa (líneaspunteadas), 9 kPa (líneasdiscontinuasnegras)y 15 kPa (líneassólidas).
10-----~--~-------~-----,---,------;--~
2 10 12 14 16 18 20
Tensiónnormal,u [kPa]
Figura 1O. Puntos de fluencia representativos para manito! (líneaspunteadas), sorbitol (líneasdiscontinuasnegras),lactosa ta-
mizada (líneasdiscontinuasgrises)y lactosa secada por aspersión (líneassólidas)a una tensión previa al corte de 9 kPa.
0,8
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O 0,2 0,4 0,6 0,8 1,2 1,4 1,6 1,8 2
Tensión normal,cr [kPa]
Figura 11. Los puntos de fluencia representativos para varios grados distintos de celulosa microcristalina NF. Avicel PH-101
(líneassólidas),Avicel PH-102 (líneaspunteadas) y Avicel PH-105 (líneasdiscontinuas)a una tensión previa al corte de 730 Pa.
6-
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5-
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4-
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·~
...
2-
1-
0-+----,-~,--,-~,-~,--,---,--,-- ,------<
o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tensión normal [kPa]
Figura 12. Puntos de fluencia representativos para celulosa microcristalina (Avicel PHl 02) a partir de determinaciones inde-
pendientes realizadas a una tensión previa al corte de 9 kPa. [Figura adaptada de Sun CC. Setting the bar for powder flow
properties in successful high speed tableting. PowderTechnol.2010;201 (1):106-108.]
2,0
-0- Operador 1 Operador 2
'iii' 1,5
ll.
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e [,s
'º
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e
<li
f-
0,0
o 5 10 15 20
Tensión principal mayor [kPa]
Figura 1 3. Gráficas de función de flujo representativas para celulosa microcristalina (Avicel PH102) de dos operadores inde-
pendientes. [Figura adaptada de Shi L, Chattoraj S, Sun CC. Reproducibility of flow properties of microcrystalline cellulose -
Avicel PHl 02. PowderTechnol.2011 ;212(1 ):253-257.]
APÉNDICE
Notación
Símbolo
y Unidades del
Término SI Definición Comentarlos
Ángulo de fricción
interna </1,grados la inclinación del punto de fluencia (Figura5).
m, grados por se- la velocidad angular a la que gira la base de la cel-
Velocidad anqular qundo da de corte, Por lo oeneral se mantiene constante.
Celda de corte anu- Una celda de corte basada en un diseño anular gi- ElAnalizador anular de Corte de Schulze es una
lar No aplica ratorio (Figura2). celda de corte anular común.
4
7690 (1063) Metodología de Celda de Corte / InformaciónGeneral USP42
Notación (Continuación)
Símbolo
y Unidades del
Formación de un puente de polvo a lo largo de
una abertura ocasionada, por ejemplo, por inte-
Arqueado No aplica racciones de atracción entre partículas. Tambiénconocidocomo "puenteado".
La masa de la cantidad de un polvo dividida por su Varía con la tensión normal aplicada y el historial
Densidad aparente p, kg/m 3 volumen total. de la muestra.
La falla de tensión de corte a una tensión normal
cero, que normalmente se obtiene por extrapola- Una indicación de la resistencia intrínseca de un
Cohesión C, Pa ción del punto de fluencia (Figura5). polvo no confinado.
El proceso de incrementar la densidad de un polvo,
que por lo general resulta en un incremento de su
tensión de fluencia no confinada.
Se logra en una celda de corte aplicando una car-
ga normal previa al corte y una carga de corte a
Consolidación No aplica la muestra.
Superficie plana que está en contacto con la mues- La superficie del acabado del suplemento de pared
Suplemento de pa- tra de polvo durante la prueba de fricción con la debe ser representativa de la superficie de la pa-
red No aplica pared. red de interés.
Ángulo efectivo de La inclinación del punto de fluencia efectivo (Figura En ocasiones se usa como una medición de la flui-
fricción li, grados 5). dez relativa.
La línea recta que pasa a través del origen de la
gráfica u- ,y es tangencial al círculo Mohr en es-
tado estacionario, que corresponde a las condicio-
Punto de fluencia nes de flujo en estado estacionario de un
efectivo No aplica polvo con una densidad aparente dada (Figura5).
Una estimación cualitativa de las propiedades de A menudo se basa en valores medidos de la fun-
Fluidez No aplica flujo relativas de un polvo. ción de flujo o en el ángulo efectivo de fricción.
La gráfica de tensión de fluencia no confinada en
función de la tensión de consolidación
principal para un polvo específico (Figura6).
Cuantificado como el cociente entre la tensión de
consolidación principal y la tensión de fluencia no
confinada a un valor particular de tensión de con-
Función de flujo No aplica solidación principal.
Un patrón de flujo en el que se forma un canal de
Flujo en embudo No aplica flujo activo a través de un material estancado.
La posición de la tapa puede medirse para determi-
Cubierta de la celda que contiene la muestra den- nar el desplazamiento, la densidad aparente y la
Tapa No aplica tro de una celda de corte. dilatación del polvo.
La tensión principal mayor dada por el círculo
Mohr en estado estacionario. Este círculo es tan-
gencial al punto de fluencia y al punto de fluencia
Tensión de consoli- efectiva y pasa a través del punto previo al corte
dación principal u 1, Pa (Figura4).
Un patrón de flujo en una tolva convergente en la
que todo el material está en movimiento, inclu-
yendo material que se desliza a lo largo de las pa-
Flujo de masa No aplica redes de la tolva.
Una representación gráfica de un estado de ten-
sión en coordenadas de tensiones normales y de
Círculo Mohr No aplica corte (Figura4).
La tensión que actúa normalmente (de forma per- o-Pes la tensión normal previa al corte; o:5¡ para i =
Tensión normal u, Pa pendicular) al plano considerado. 1, 2, 3, ... las tensiones normales de prueba.
Tensión normal aplicada para consolidar un polvo
antes de analizarlo en algunas celdas de corte (Fi-
Preconsolidación No aplica gura 4).
Aplicación de tensión normal mientras se corta pa-
ra lograr condiciones de corte en estado estacio-
Previo al corte No aplica nario (Figura4).
Tendencia de un polvo a fluir solo en la región so-
Canalización (Rat- bre una abertura, con lo que se forma un canal o
holing) No aplica túnel estrecho en el polvo. También conocido como "flujo central".
USP42 InformaciónGeneral/ (1064) Artículos Botánicos 7691
Notación (Continuación)
Símbolo
y Unidades del
Una celda de corte que opera en condiciones de
Celda de corte rota- corte rotatorio (es decir, corte rotatorio perpendi- Las celdas de corte Peschl y Freeman son celdas de
toria No aplica cular a la tensión normal aplicada) (Fiaura 3). corte rotatorias comunes.
La tensión requerida para cortar el polvo en una di-
Tensión de corte r, Pa rección perpendicular a la tensión normal.
La tensión de fluencia no confinada de un polvo
Resistencia consoli- después de mantenerlo en condiciones fijas de
dada por tiempo f,.,,Pa consolidación durante cierto tiempo.
El punto de fluencia de un polvo que ha permane-
Punto de fluencia cido en reposo bajo una tensión normal dada du-
por tiempo No aplica rante cierto tiempo.
Una celda de corte que opera en condiciones de
Celda de corte tras- corte traslacional (es decir, corte lineal perpendi- La celda de corte ¡enike es una celda de corte tras-
lacional No aplica cular a la tensión normal aplicada) (Figura 1). lacional común.
La tensión principal mayor del círculo de tensión
Mohr que es tangencial al punto de fluencia
Tensión de fluencia cuando la tensión principal menor es cero (Figura
no confinada f,., Pa 4).
Ángulo de fricción El arcotangente del coeficiente de la fricción con la
con la pared <ti, grados pared (Figura 7).
Coeficiente de la El cociente entre la tensión de corte de la pared y
fricción con la pala tensión normal de la pared en una condición
red /Jw de tensión normal dada.
Una gráfica de la tensión de corte de la pared en
función de la tensión normal con la pared.
Se usa para determinar el ángulo de fricción con
Punto de fluencia de la pared para una combinación de polvo-pared
la pared No aplica (Figura 7).
Una gráfica de tensión de corte en función de la
tensión normal al momento de la falla.
El punto de fluencia en ocasiones se denomina Un polvo presenta una serie de puntos de fluencia
punto de fluencia instantánea para diferenciarlo para cada nivel diferente de consolidación (densi-
Punto de fluencia No aplica del punto de fluencia por tiempo (Fiaura 4). dad).
(1064) IDENTIFICACIÓNDEARTÍCULOSDE ORIGENBOTÁNICOPOR

CROMATOGRAFÍA EN CAPADELGADADE ALTARESOLUCIÓN
INTRODUCCIÓN
La identificación de artículos botánicos puede lograrse mediante la aplicación de múltiples técnicas, incluyendo descripcio-
nes macroscópicas y microscópicas, análisis de ADN y medios químicos. El capítulo Identificaciónde Artículosde Origen Botánico
(563) provee un análisis detallado de estos enfoques. La identificación química por lo regular emplea procedimientos cromato-
gráficos o espectroscópicos para lograr la identificación mediante comparación de la huella dactilar contra la de un Estándar de
Referencia, descripción de monografía o un cromatograma de referencia. La cromatografía en capa delgada (TLC)es una de
las técnicas cromatográficas usadas de esta manera en las monografías USPpara artículos botánicos. La cromatografía en capa
delgada de alta resolución (HPTLC)es la versión más avanzada de la TLC (ver Cromatografía(621 )), y un procedimiento analíti-
co general para la aplicación de HPTLCa la identificación de productos botánicos se describe en el capítulo Procedimientode
Cromatografíaen Capa Delgadade Alta Resoluciónpara Identificaciónde Artículosde Origen Botánico(203). En la HPTLC,la fase
estacionaria consta de una capa uniforme, generalmente de 200 µm de espesor, de partículas irregulares porosas (tamaño de
poro de 60 Á) de gel de sílice con un tamaño entre 2 y 1O µm y un tamaño promedio de partícula de 5 µm, además de un
aglutinante polimérico y un indicador fluorescente (F254 ) recubriendo un soporte que por lo general es una placa de vidrio o
lámina de aluminio. Otras fases estacionarias tales como fases unidas químicamente (C8, Cl 8, CN, NH2; DIOL)o celulosa mi-
crocristalina, también están disponibles con y sin indicador fluorescente. Debido a la mayor eficiencia de separación de las par-
tículas finas en la HPTLC,el sistema cromatográfico se miniaturiza, usando cámaras de desarrollo más pequeñas y distancias de
desarrollo más cortas de 6-8 cm, en comparación con la TLC clásica, en el que se requieren 12-15 cm para una mejor separa-
ción. En consecuencia, se requiere menos fase móvil y menos tiempo para el desarrollo del cromatograma. Otro efecto de la
7692 (1064) Artículos Botánicos/ Información General USP42
miniaturización es el uso de volúmenes de muestra más pequeños, lo que resulta en la posibilidad de analizar más muestras
por placa que con la TLC clásica.
Asimismo, la mejor calidad de la capa debida a un tamaño de partícula más pequeño mejora la relación señal-ruido y, por
ende, tiene efectos sobre la capacidad de detección de los componentes de la muestra separados. Se usa una prueba de apti-
tud del sistema para calificar los resultados. Esta característica es de gran importancia para la identificación de ingredientes
botánicos, los cuales tienen una variabilidad natural intrínseca en su composición química. Las imágenes electrónicas de cro-
matogramas de HPTLCpermiten una comparación visual conveniente de los resultados obtenidos para múltiples muestras
contra imágenes de cromatogramas generados con materiales de referencia. Para propósitos de identificación, la complejidad
de los ingredientes botánicos se representa mejor mediante huellas dactilares obtenidas con múltiples modos de detección a
partir del mismo cromatograma, p. ej., luz UV254 nm y UV 366 nm sin derivatización, y luz blanca y UV 366 nm después de
la derivatización. Debido a que los métodos farmacopeicos se usan para determinar el cumplimiento, se debe evitar la variabili-
dad de los resultados ocasionada por el método analítico seleccionado. Dado que la HPTLCpuede controlar las variables den-
tro de intervalos estrechos usando una metodología rigurosamente estandarizada y equipo apropiado, la HPTLCes capaz de
incrementar de manera significativa la reproducibilidad de los resultados cromatográficos entre placas, en comparación con la
TLCtradicional. A continuación se presenta un análisis de las variables que se deben controlar para obtener resultados repro-
ducibles en la identificación de artículos de origen botánico usando HPTLC.
VARIABLESDE LA HPTLC
La placa es un sistema abierto afectado por factores ambientales, los cuales deben controlarse cuidadosamente. A diferencia
de la cromatografía en columna que es un sistema cerrado en el que las muestras se analizan de manera secuencial, en la
HPTLCse pueden analizar múltiples muestras en paralelo en la misma placa. Todas las etapas del proceso cromatográfico pla-
nar son independientes en cuanto a tiempo y espacio (proceso fuera de línea). Para cada una de las etapas-aplicación de la
muestra, desarrollo del cromatograma, visualización, detección, documentación y evaluación-se pueden seleccionar libre-
mente numerosos parámetros. Esta característica única agrega una inmensa flexibilidad al método y hace del enfoque croma-
tográfico planar un complemento de las técnicas basadas en columna.
Durante el desarrollo del método, la gran cantidad de opciones disponibles para los diversos parámetros puede resultar
abrumadora, y, dependiendo de la combinación seleccionada, pueden resultar múltiples opciones que cumplan con el objetivo
analítico respectivo, aunque sean bastante distintas. Por este motivo, a menudo se dice que un determinado ajuste de paráme-
tros es "mejor" o "peor" que otro de acuerdo con las preferencias personales. En un ambiente de cumplimiento con las Bue-
nas Prácticas de Fabricación vigentes, la reproducibilidad y la integridad de los resultados son de gran importancia. Esta es la
razón por la que los parámetros individuales de la técnica de HPTLCdeben ser seleccionados y combinados concienzudamente
en una metodología estandarizada de modo que se optimice el resultado final y se pueda comparar con los resultados obteni-
dos por distintos analistas. Puede ser importante evitar etapas engorrosas y que consuman mucho tiempo, así como evitar el
uso de sustancias químicas peligrosas o tóxicas. La simplicidad y la claridad son aspectos deseables de los métodos prácticos.
Manipulación de las Placas

Las placas para HPTLCson delicadas y deben manipularse con cuidado para evitar que se dañe la capa. Cuando se deba
trasladar la placa, solo debe tocarse la parte superior por encima de la región donde se realiza la cromatografía. Las notaciones
sobre las placas se deben realizar con un lápiz suave en la esquina superior derecha (o izquierda). La distancia de desarrollo
prefijada puede marcarse en el borde derecho (o izquierdo) con un lápiz haciendo una pequeña muesca hasta el soporte de
vidrio. Se debe evitar marcar la distancia de desarrollo a lo largo de toda la placa debido a que es difíciljuzgar el momento
cuando el frente difuso de la fase móvil alcanza dicha línea. Es más fácil alinear el frente con una muesca en el borde lateral.
Las placas deben almacenarse en un lugar que esté libre de vapores y polvo con las capas orientadas hacia abajo en una pila
de placas. El envoltorio plástico del empaque no debe estar en contacto con la placa a fin de evitar la contaminación con ma-
teriales volátiles de la lámina. Por lo general, las placas para HPTLCestán listas para usar sin necesidad de pretratamiento. Las
placas más viejas o almacenadas inadecuadamente pueden haber acumulado impurezas y, por ende, requerir de limpieza pre-
via. Tal es el caso cuando, después del desarrollo, se observa el frente de la fase móvil (o frentes secundarios adicionales) bajo
UV254 nm como una banda oscura amplia e intensa a lo largo de la placa. La limpieza previa puede realizarse desarrollando la
placa en metanol hasta el borde superior. Posteriormente, la placa se seca en una estufa limpia a 120º durante 20 minutos.
Para enfriar a temperatura ambiente y para su almacenamiento previo a uso adicional, las placas se pueden mantener en un
desecador vacío o envueltas en papel aluminio. La limpieza previa puede cambiar ligeramente la selectividad de una placa. Por
lo tanto, es importante definir en un método si se va a permitir o no el uso de placas previamente limpiadas. La limpieza previa
con la fase móvil por lo general no es una opción adecuada debido a que puede ser difícil eliminar completamente todos los
componentes durante la etapa de secado.
USP42 Información General/ (1064) Artículos Botánicos 7693
Organización de la Placa y Aplicación de la Muestra
El formato estándar de la placa para HPTLCes 20 cm de ancho xx 1O cm de altura. Se podrían usar también otros tamaños
(p. ej., 1O x 1O cm), pero se debe tener en cuenta que para obtener resultados reproducibles, cada tamaño de placa requiere
una cámara diferente para mantener los mismos aspectos geométricos como los tendría, por ejemplo, una cámara de cubetas
gemelas para la placa estándar (ver Desarrollo del Cromatograma). La distancia óptima de desarrollo en la HPTLCes 6 cm. Cor-
tar las placas a una altura menor de 1O cm no provee ventajas adicionales.
El posicionamiento exacto es esencial para la identificación apropiada de zonas separadas. Se deben considerar los siguientes
parámetros para la aplicación de muestras con respecto a la organización de la placa (Figura 1).
,( )
Figura 1. Organización de la placa.
Para la identificación apropiada (distancia de migración/valores RF),todas las muestras deben aplicarse en una línea (virtual)
paralela al borde inferior de la placa. La distancia entre la línea de aplicación y el borde inferior (y) debe ser lo suficientemente
grande para evitar que la muestra se sumerja en la fase móvil. Durante el desarrollo, la velocidad de la fase móvil se reduce a
medida que aumenta la distancia de desarrollo. Por consiguiente, el resultado final depende de la posición de aplicación con
respecto al nivel de fase móvil (Figura 2).
º·'
Figura 2. Parte superior: Efecto de la posición de aplicación con respecto al nivel de fase móvil (5 mm). La distancia desde el
borde inferior va de 8-50 mm en incrementos de 3 mm. Parte inferior: Valores RFcalculados para las diferentes distancias de
desarrollo efectivas. Muestra: partes aéreas de Houttuynia; fase móvil: una mezcla de acetato de etilo, ácido fórmico y agua
(15:1 :1, v/v/v); derivatización: reactivo para productos naturales; detección: UV 366 nm.
Para obtener resultados reproducibles, se debe mantener constante la distancia desde el borde inferior (y) y también se debe
fijar la cantidad de fase móvil que se coloca en la cámara. Para minimizar el consumo de fase móvil, se usan cámaras de cube-
tas gemelas. Por lo general, el nivel de fase móvil en dichas cámaras es de 5 mm. Se forma un menisco sobre la placa en la
línea de inmersión. Una muestra aplicada a y= 8 mm estará adecuadamente por encima de este menisco.
La distancia de la posición de aplicación con respecto a los bordes izquierdo y derecho de la placa (x) debe ser suficiente
para evitar el denominado "efecto de borde" (Figura 3). Durante la producción, la mayoría de las placas pre-recubiertas desa-
rrollan una pequeña elevación en los bordes donde la capa es ligeramente más gruesa. Esto ocasiona que la fase móvil avance
más rápido, y las muestras que se aplican directamente en o muy cerca del borde elevado migrarán de manera irregular.
Figura 3. El "efecto de borde".

La posición x, a menudo se denomina "posición de aplicación". Para evitar el efecto de borde, se debe tomar en cuenta la
longitud de la banda aplicada ({) al definir x2 como la distancia a partir del borde de la placa. Se requiere un mínimo de 15 mm
para x2• La distancia entre dos muestras (d 1) también considera la longitud de la banda({). Para d , se recomienda un mínimo
2
de 3 mm de modo que las muestras no interfieran entre sí cuando se apliquen volúmenes mayores. Se debe fijar la longitud de
la banda ({) para cada método, debido a que ésta afecta la concentración de muestras por banda si se aplica un volumen defi-
nido de solución muestra. La cantidad aplicada (a lo largo de una longitud de banda definida) tiene un efecto sobre la intensi-
dad de las zonas separadas y puede afectar la capacidad de visualizar una zona particular de una huella dactilar. Un motivo
para seleccionar bandas más cortas sería la capacidad para aplicar más muestras sobre la placa. Sin embargo, debido a que la
evaluación del cromatograma se realiza principalmente de manera visual, se debe tener en cuenta que una banda se ve más
"definida" (más como una banda y menos oblonga) cuando tiene una longitud >5 mm (Figura 4). Una longitud de banda de 8
mm es un buen compromiso teniendo en cuenta también que el capítulo (621) especifica bandas de 5-1 O mm para placas
para HPTLC.
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
Figura 4. Efecto de la longitud de banda sobre la impresión visual de separación. De izquierda a derecha, 3 µL/3 mm, 5 µL/5
mm, 8 µL/8 mm, 11 µL/11 mm y 15 µL/15 mm. Muestra: Flores de TIio; fase móvil: mezcla de acetato de etilo, ácido fórmico,
agua y metil etil cetona (50:l 0:10:30, v/v/v/v); derivatización: reactivo para productos naturales /polietilenglicol; detección:
UV 366 nm.
Con los parámetros descritos, la organización estándar de la placa presentará 15 bandas de 8 mm de longitud. Si se va a
analizar un número menor de muestras, se recomienda aplicar determinaciones repetidas o dejar algunos carriles en blanco
sobre la placa.
Durante la aplicación, las muestras se depositan con precisión sobre las placas para HPTLCen las posiciones y cantidades
definidas. Las soluciones muestra se pueden aplicar mediante contacto usando un capilar o una jeringa, o rociando la solución
muestra sin tocar la placa (técnica de rociado superficial). Durante la aplicación por contacto, el disolvente de la muestra pue-
de producir una cromatografía circular (Figura5). Por lo tanto, solo se deben aplicar volúmenes pequeños en un solo desplaza-
miento y, de ser posible, solo se deben usar disolventes no polares. Durante la aplicación por rociado superficial, el disolvente
de la muestra se nebuliza y evapora, creando zonas bien definidas independientemente de la polaridad del disolvente.
Si se realiza una aplicación manual, se puede usar una guía de aplicación para posicionar adecuadamente las muestras. No
se recomienda marcar la posición de aplicación con un lápiz debido a que la capa puede dañarse fácilmente.
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
\'.t•,,;,;;:rr
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 5. Parte inferior: Aplicación de la muestra como punto (carriles 1-4) y en banda (carriles 5-8) mediante aplicación por
contacto (carriles 1; 2; 5; 6) o técnica de rociado superficial (carriles 3; 4; 7; 8); volúmenes de aplicación: 2 µL (carriles 1; 3;
5;7) ó 5 µL (carriles 2; 4; 6; 8); mezcla de prueba de colorantes en metano!. Parte superior: Cromatografía con tolueno como
fase móvil.
Desarrollo del Cromatograma
Los procesos en una cámara cromatográfica son altamente complejos y difíciles de describir. A diferencia de la cromatografía
en columna, en la cual se asume que tiene lugar en sistemas cromatográficos equilibrados, la cromatografía planar siempre
comienza en un estado sin equilibrar, y nunca se alcanza el equilibrio. La muestra ha sido aplicada sobre la placa, la cual se
convierte en la fase estacionaria solo cuando entra en contacto con un líquido en la cámara cromatográfica. La fase móvil que
avanza debe ser capaz de disolver la muestra para que comience la cromatografía. Impulsada por la acción capilar, la velocidad
de la fase móvil disminuye a medida que se incrementa la distancia de migración debido a que también se incrementa la resis-
tencia de la fase estacionaria contra el flujo.
Se puede demostrar experimentalmente que la distancia de migración óptima para fases móviles en placas de HPTLCes
aproximadamente 6 cm. Dependiendo de la viscosidad de la fase móvil, el desarrollo toma entre 1O y 20 minutos. Extender el
desplazamiento del frente de la fase móvil por tan solo 1O mm aumentará el tiempo de desarrollo entre 5-15 minutos, mien-
tras que un desplazamiento adicional de 20 mm aumentará el tiempo de desarrollo entre 15-40 minutos. A menudo, resulta
injustificable la contribución de dicha distancia extra de desarrollo para lograr una mejor separación, debido a que general-
mente, toda ganancia en separación debida a la mayor distancia recorrida se compensa por la difusión que se produce a causa
de la reducción en la velocidad de la fase móvil.
En una cámara cromatográfica ocurren cuatro procesos distintos, los cuales siempre suceden simultáneamente e interaccio-
nan entre sí (Figura6).
USP42 InformaciónGeneral/ (1064) Artículos Botánicos 7697
Figura 6. Procesos que ocurren en la cámara cromatográfica (cámara de cubetas gemelas): (1) saturación de la cámara; (2)
preacondicionamiento de la placa; (3) evaporación; (4) formación de frentes secundarios.
La saturación de la cámara (Figura6, proceso 1) por lo regular se realiza antes de colocar la placa en el interior de la cámara.
La fase móvil, que tiene una composición conocida, se coloca en el interior de ambas cubetas de la cámara y la hoja de papel
de filtro en la cubeta posterior se humedece por completo. La saturación de la cámara ocurre una vez que el líquido en la
cámara está en equilibrio con su propio vapor, lo cual es una función de tiempo. Después de 20 minutos, la cámara por lo
general logrará un grado reproducible de saturación.
La placa debe colocarse dentro de la cámara de tal manera que el soporte descanse en posición vertical apoyado sobre la
pared delantera mientras que la capa debe estar orientada hacia la pared trasera. La parte seca de la capa absorbe el vapor de
la fase móvil desde la fase gaseosa (proceso 2) para lograr la saturación adsortiva, la cual ocurre cuando la superficie queda
recubierta por una capa de moléculas de la fase móvil. Por lo general, este proceso puede disminuir los valores RFy afectar
también la selectividad de la separación. En la porción inferior de la placa, el líquido que asciende desde la cubeta forma la fase
móvil. Dependiendo del grado de saturación, podría evaporarse parte de la fase móvil de la placa (proceso 3). La fase estacio-
naria podría ocasionar la separación de los múltiples componentes de las fases móviles debido a las diferentes interacciones de
dichos componentes con la fase estacionaria. Este proceso se ve afectado por el grado de preacondicionamiento.
En una cámara no saturada, la situación es bastante diferente. La cubeta posterior no contiene líquido ni papel de filtro. La
placa se introduce inmediatamente después de la fase móvil, lo cual no permite suficiente tiempo para lograr el equilibrio de
saturación gas-líquido. El preacondicionamiento tiene menos preponderancia, mientras que la evaporación y la posible forma-
ción de frentes secundarios (proceso 4) dominan el proceso cromatográfico. Ambos procesos por lo regular ocasionan altera-
ciones en los cromatogramas, por lo que la separación se ve afectada.
En conclusión, cada cámara provee un resultado algo distinto, dependiendo de la geometría de la cámara, la presencia o
ausencia de líquido y papel de filtro en una de las cubetas, y el tiempo de espera antes de la introducción de la placa. Los
cromatogramas presentados en la Figura7 se obtuvieron con una cámara de desarrollo automático con control de humedad.
En este ejemplo, una cámara saturada (A) provee una mejor separación que una cámara no saturada (C). Los cromatogramas
son reproducibles siempre que todas las condiciones sean iguales (A) y (B). Si el papel de filtro para saturación no se cambia,
sino que se reúsa sin secarlo, se obtiene un resultado completamente distinto (D).
7-
e D
Figura 7. Efectos de las distintas configuraciones de cámara a una humedad relativa de 33%: (A) y (B) saturadas, (C) no satu-
rada, y (D) saturada con papel de filtro reutilizado. Muestra: Lapsanacommunis,estándares de referencia: ácido clorogénico (RF
0,38, carril 1, Panel A), quercitrina (R,0,58, carril 2, Panel A), fase móvil: agua, metano!, ácido acético glacial y cloruro de
metileno (2:3:8:15, v/v/v/v); derivatización: Reactivo de productos naturales/polietilenglicol; detección: UV 366 nm.
Para obtener resultados reproducibles, es necesario estandarizar cuidadosamente el desarrollo. La saturación de la cámara es
fácil de conseguir, al igual que la apropiada reproducibilidad de los tiempos. Las cámaras no saturadas son extremadamente
sensibles a los pequeños cambios y, por ende, desde un punto de vista práctico, deben evitarse, aunque fuesen capaces de
lograr una "mejor" separación. Una buena práctica es seguir mantener las distancias de desarrollo constantes (en las condicio-
nes óptimas) para todos los métodos, puesto que otros parámetros tales como la selectividad y el acondicionamiento de la fase
gaseosa afectan la separación en un grado mucho mayor.
Secado
Después de que la fase móvil haya recorrido la distancia deseada, la placa debe retirarse de la cámara y secarse de manera
reproducible. La mejor manera de conseguir esto es exponiendo la placa en posición vertical a una corriente de aire frío. Las
temperaturas elevadas durante el secado pueden ocasionar difusión de los componentes volátiles de la muestra o que se eva-
poren de la placa. Durante la evaporación de la fase móvil, los componentes de la muestra migran desde áreas más profundas
de la capa hacia la superficie. El secado no uniforme a lo largo de la placa puede generar intensidades diferentes para zonas
con las mismas cantidades de sustancias.
Efectosde la Humedad
El gel de sílice tiene una afinidad extremadamente alta para el agua y es un agente desecante efectivo. Una placa para
HPTLCsiempre está en equilibrio con el vapor de agua en la atmósfera del laboratorio (humedad relativa o HR). Los resultados
cromatográficos se ven afectados por la variación en la cantidad de agua adsorbida en la superficie del gel de sílice. A mayor
humedad relativa, se absorberá mayor cantidad de agua. En primera instancia, esto reduce la "actividad" de la fase estaciona-
ria y ocasiona valores RFmás altos. Además, debido a que el agua adsorbida puede convertirse en parte de la fase estacionaria,
la selectividad del sistema cromatográfico a menudo cambia como respuesta a una variación en la humedad relativa.
Desafortunadamente, es casi imposible predecir el efecto que tendrá un cambio en la humedad relativa sobre una separa-
ción dada (Figura 8). Algunas separaciones se ven más afectadas que otras y, en ocasiones, únicamente cambiarán algunas par-
tes del cromatograma. Además, no existe una actividad ideal de la placa que pueda resolver todos los problemas de separa-
ción, y es difícil usar cambios de actividad definidos de la fase estacionaria para influir sobre la separación de la manera desea-
da. La mejor opción es mantener la humedad relativa constante a un nivel moderado (p. ej., 33%) y, posteriormente, intentar
ajustar la selectividad de la fase móvil. Una excepción práctica es el "secado exhaustivo" de la placa efectuado con tamiz mole-
cular. Es posible activar la placa con calor (120º durante 20 minutos), debido a que en estas condiciones, el agua adsorbida en
el gel de sílice se elimina de manera efectiva, pero la placa se reequilibra a la humedad relativa ambiental al enfriarla y almace-
narla, o durante la aplicación de la muestra.
j-
1,0 1,0
0,9 0,9
0,8 0,8
OJ 0,7
0,6 0,6
0,5 0,5
0,4 0,4
0.3 0,3
0,2 0,2
0,1
0,1
o.o o.o
2% 33% 47% 54"l'o• 75%
A B
2% 47% 50%. HR
e
Figura 8. Efectos de la humedad relativa sobre la separación de diferentes muestras. (A) Hoodiagordonii,fase móvil: clorofor-
mo, metano! y agua (70:30:3, v/v/v); derivatización: reactivo de anisaldehído, detección: luz blanca. (8) Raíz de regaliz, fase
móvil: acetato de etilo, ácido fórmico, ácido acético y agua (15:1 :1 :2, v/v/v/v); derivatización: reactivo de ácido sulfúrico; de-
tección: luz blanca. (C) Acteína/rizoma de cimicífuga racemosa, fase móvil: tolueno, formiato de etilo y ácido fórmico (5:3:2,
v/v/v); derivatización: reactivo de ácido sulfúrico; detección: luz UV 366 nm. Humedad: *ambiental; 2%: tamiz molecular;
33%: solución saturada de cloruro de magnesio (MgCl2); 47%: solución saturada de tiocianato de potasio (KSCN); 75%: solu-
ción saturada de cloruro de sodio (NaCI).
Para obtener resultados reproducibles independientemente de los cambios estacionarios o regionales en la humedad relativa
de los distintos laboratorios, es importante exponer la placa, con las muestras ya aplicadas, a una humedad relativa definida
antes del desarrollo. Esto mantendrá constante la actividad y la selectividad de la fase estacionaria. Se puede crear una hume-
dad relativa definida en contenedores cerrados tales como un desecador sobre soluciones salinas saturadas. Entre 20º y 25º, las
soluciones saturadas de cloruro de magnesio generan una humedad relativa del 33%; las de tiocianato de potasio (KSCN), una
humedad relativa del 47%; y las de cloruro de sodio (NaCI), una humedad relativa del 75%.
Derivatización, Detección y Evaluación
Una ventaja sobresaliente de la cromatografía planar es la posibilidad de lograr una derivatización química conveniente de
sustancias ya separadas en una placa. Se pueden aplicar soluciones de reactivos de derivatización sobre la placa, ya sea me-
diante rociado o inmersión. Para obtener resultados reproducibles, la cantidad aplicada de un reactivo de una concentración
dada, debe definirse por volumen (rociado) o por volumen y tiempo de inmersión. La mayoría de las reacciones de derivatiza-
ción requieren llevar a cabo una etapa de calentamiento en un calentador de placas o en un horno de secado. La placa debería
ser secada al aire antes del calentamiento para evitar cualquier alteración en la capa generada por la evaporación del disolven-
te residual. Antes de calentar la placa, el dispositivo de calentamiento debe alcanzar la temperatura requerida. Para obtener
resultados reproducibles, es importante que todo el proceso de derivatización se cronometre de manera estricta. Esto incluye
todos los tiempos de espera (p. ej., de enfriamiento) antes de la etapa de detección.
La detección se lleva a cabo bajo luz blanca, por lo regular usando una fuente de luz sobre la placa (reflectancia) en combi-
nación con luz proveniente de debajo de la placa (transmisión). Se puede obtener información adicional (por lo regular antes
de cualquier derivatización química) bajo luz UV254 nm. El indicador F254 de la placa para HPTLCemitirá una luz verde (azul
para F254 ,). Cualquier sustancia que absorba luz UV 254 nm será visible como una zona "de extinción" oscura donde el grado
de extinción corresponde a la cantidad de dicha sustancia (y a su coeficiente de extinción). Algunas sustancias fluorescentes se
pueden excitar usando luz UV 366 nm, particularmente después de la derivatización química. Dichas sustancias se observan
como zonas de colores específicos sobre un fondo oscuro.
La HPTLCse beneficia de las imágenes digitales tomadas de la placa en distintos modos de detección/iluminación. En oca-
siones, dichas imágenes pueden parecer diferentes de lo que percibe el analista mediante inspección visual. Esto se debe a
algunas limitaciones físicas, pero es posible estandarizar el proceso de generación de imágenes de modo que se generen datos
"fidedignos". Estos parámetros siempre deberían ser los mismos para una placa dada independientemente del lugar o la perso-
na que tome la imagen. No es permisible el uso de software de edición de imágenes para cambiar ciertos aspectos de las imá-
genes.
En la etapa de evaluación, los datos analíticos obtenidos para una muestra se comparan contra las especificaciones del méto-
do. La HPTLCpara identificación de ingredientes botánicos por lo regular produce huellas dactilares, es decir, secuencias de
zonas que tienen posiciones, colores e intensidades específicos. Dichas huellas dactilares se comparan contra los datos obteni-
dos con materiales de referencia. Idealmente, dicha comparación se basa en imágenes más que en descripciones. Debido a la
variabilidad natural de los materiales botánicos, el criterio de aceptación siempre tendrá un intervalo asociado para que una
huella dactilar pase la prueba de identidad. Las huellas dactilares de diversas especies (adulterantes) deberían tener característi-
cas distintivas que no estén presentes en muestras que pasen la evaluación (Figura 9). Al definir los criterios de aceptación para
la identificación, es necesario incluir una variedad de materiales botánicos de referencia que abarque diversas entradas. El uso
de múltiples modos de detección es útil a la hora de tomar decisiones.
2 3 4 5
Figura 9. Similitudes y diferencias entre múltiples muestras de especies relacionadas: (1) Cimicifugaracemosa;(2) Cimicifuga
foetida; (3) Cimicifugaheracleifolia/dahurica;(4) Cimicifugapachypoda;(5) Cimicifugaamericana.
Aptitud del Sistema

Antes de evaluar y/o comparar los datos que se originan de diferentes placas para HPTLC,se debe calificar cada una de las
placas desarrolladas. Esto es posible mediante una prueba de aptitud del sistema, la cual es parte del método analítico. En cada
placa, se seleccionan dos o más sustancias de referencia que tengan valores RFsimilares pero apenas separables en las condicio-
nes cromatográficas que se van a usar; [por ejemplo, ácido clorogénico (azul) e hiperósido (anaranjado amarillento) en siste-
mas cromatográficos usados para flavonoides]. Las sustancias designadas para verificar la aptitud del sistema en lo que respec-
ta a resolución, posición y colores de las bandas pueden estar incluidas en extractos estándares de referencia o en otra matriz.
La descripción de la resolución, posición y colores para las bandas clave de la identificación del material de referencia deben
corresponderse con la descripción de la referencia dentro del intervalo de tolerancia especificado. Los resultados obtenidos con
las muestras en la misma placa se podrán evaluar adicionalmente para determinar el cumplimiento, únicamente cuando se
hayan satisfecho los requisitos de aptitud del sistema. Para referencias sobre un procedimiento estandarizado de identificación
de artículos de origen botánico que controle las variables descritas en este capítulo, ver el capítulo (203).
CONCLUSIONES
Debido al amplio y creciente uso a nivel global de la HPTLCen la identificación botánica para monitorear la calidad de los
artículos de origen botánico, parece importante estandarizar concienzudamente los procedimientos analíticos implicados. To-
dos los parámetros discutidos anteriormente deben especificarse siempre para cada uno de los análisis por HPTLC.En la actua-
lidad, los laboratorios en diversos países pueden generalizar esta selección dentro del marco de los capítulos generales USP;no
obstante, no se cuenta con pautas acerca de cómo obtener resultados específicos de HPTLCde manera reproducible. Un pro-
cedimiento estandarizado tal como el propuesto en el capítulo (203) puede llenar dicha brecha y servir como fundamento pa-
ra la armonización de los resultados obtenidos en diferentes laboratorios.
USP42 InformaciónGeneral/ (1065) Cromatografía lónica 7701
(1065) CROMATOGRAFÍA
IÓNICA
INTRODUCCIÓN
La cromatografía iónica (IC, por sus siglas en inglés) es una técnica instrumental de cromatografía de líquidos de alta resolu-
ción (HPLC, por sus siglas en inglés) usada en los procedimientos de prueba de USP tales como pruebas de identificación, valo-
raciones y determinación de impurezas, incluyendo pruebas de límite y pruebas cuantitativas. La IC se usa para medir aniones
y cationes derivados de moléculas orgánicas o inorgánicas, desde moléculas pequeñas hasta macromoléculas biológicas. Esto
puede incluir, entre otros, ácidos orgánicos, carbohidratos, alcoholes de azúcares, aminoácidos, aminas, fosfonatos, péptidos,
aminoglicósidos, oligosacáridos, proteínas y glicoproteínas.
La IC se ha aplicado a todos los aspectos de la fabricación y la disposición de productos farmacéuticos, entre los que se in-
cluye la caracterización de ingredientes activos, excipientes, productos de degradación e impurezas y flujo de procesos. Se
pueden analizar mediante IC materias primas, productos intermedios (incluidos medios y caldos de cultivo), ingredientes acti-
vos a granel, diluyentes, productos formulados, soluciones de limpieza de equipos de producción, agua de proceso y efluentes
de desecho.
La mayoría de los métodos de IC emplean cromatografía de intercambio aniónico o catiónico acoplada con detección de
conductividad con supresión. La IC es particularmente valiosa para analitos iónicos o ionizables (en la fase móvil) que tienen
una absorbancia UV nativa reducida o nula. Además de la detección de conductividad con supresión, la separación por inter-
cambio iónico se puede acoplar con otras estrategias de detección, incluida la detección amperométrica por pulsos (PAD, por
sus siglas en inglés), la detección de absorbancia UVNis, la detección por espectrometría de masas de plasma inductivamente
acoplado (ICP-MS, por sus siglas en inglés) y la detección por espectrometría de masas, lo cual provee un amplio intervalo de
sensibilidad y especificidad de analitos. Las separaciones por exclusión iónica expanden el intervalo de aplicaciones de la IC a
algunos analitos no iónicos (p. ej., alcoholes) y proveen una selectividad distinta para algunos analitos que también pueden
separarse por intercambio iónico. El amplio rango dinámico de la mayoría de los métodos de detección de IC hace posible que
se pueda aplicar la técnica tanto a la cuantificación de trazas contaminantes así como a la determinación de los componentes
principales de un producto en la misma corrida. Por lo regular, la IC emplea soluciones diluidas de ácidos, álcalis, amortigua-
dores o sales como fase móvil, lo cual reduce el costo de los disolventes y simplifica la logística de eliminación. En la mayoría
de los casos, el efluente puede ser eliminado después de ser neutralizado apropiadamente y, cuando sea necesario, después de
diluirlo con agua.
Por lo general, la IC se realiza a temperatura ambiente o a una temperatura cercana. Al igual que con otras formas de HPLC,
las separaciones por IC se basan en la variación de los factores de capacidad y, por lo general, siguen la ecuación de Knox. La
IC es una técnica que a menudo complementa otras usadas en el análisis farmacéutico: la HPLCen fase reversa y en fase nor-
mal, así como las técnicas de absorción atómica y de plasma inductivamente acoplado.
APARATOS
Los instrumentos para IC pueden ser instrumentos convencionales para HPLCo instrumentos especialmente diseñados solo
para realizar IC. El tipo de instrumento seleccionado depende de la aplicación. Los componentes típicos de un instrumento
para IC pueden incluir un muestreador automático, una bomba de alta presión, un bucle de muestra de tamaño adecuado, un
guarda columna, una columna analítica, en caso de usarse un detector de conductividad puede incorporarse un supresor op-
cional, un detector con celda de flujo y un sistema de datos (Figura1).
GeneradordeElucnte
(opcional)
Detector (CD,
t PAD,UV•Vis,MS)
t
6
Bombf de/\lla Supresoru RecolLión
P1·e~1ón Otro Dispositivo de
Muestra
Post-columna (opcional) Datos
Figura 1. Ilustración esquemática de los componentes de un sistema típico de IC; CD = detector de conductividad, PAD=
detector amperométrico por pulsos y MS = detector por espectrometría de masas. [NOTA-La fase móvil es agua cuando se usa
el Generadorde Eluyenteopcional.]
Debido a que, por lo general, las fases móviles consisten en soluciones diluidas de ácidos, álcalis o sales, los componentes
que están en contacto con la fase móvil y la muestra suelen fabricarse a partir de materiales inertes, como por ejemplo poliete-
retercetona (PEEK,por sus siglas en inglés). También puede utilizarse un sistema HPLCconvencional siempre que sus compo-
nentes sean compatibles con la fase móvil y las soluciones de muestras inyectadas, aunque para el análisis de trazas de metales
7702 (1065) Cromatografía lónica / InformaciónGeneral USP42
se debe usar un sistema exento de metales. Después de una preparación adecuada de muestra, si fuera necesaria, la muestra
se introduce a través de la válvula de inyección. Dado que la IC utiliza una fase móvil predominantemente iónica, cuando se
requiere alta sensibilidad suele utilizarse un supresor antes de la detección por conductividad, aunque la detección de conduc-
tividad sin supresión se ha utilizado con éxito en el análisis farmacéutico.
FasesMóviles
Casi todas las separaciones por IC requieren ácidos o bases diluidas en agua de alta pureza, por lo general con una resistivi-
dad mayor de 18 megaohmios-cm para preparar las fases móviles. Como en todos los métodos cromatográficos, la sensibili-
dad determina el método de detección, mientras que la selectividad esta dictada por la fase móvil y la selección de la columna.
Para la detección por conductividad con supresión, las bases y ácidos usados se convierten en agua o especies débilmente
disociadas. Si los analitos son aniones, las bases usadas como contraiones de fase móvil para la detección por conductividad
con supresión son hidróxido de sodio o de potasio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio y, con menor frecuencia, tetra-
borato de sodio. Si los analitos son cationes, los ácidos usados como contraiones de fase móvil para la detección por conducti-
vidad con supresión son ácido metanosulfónico, ácido sulfúrico y, con menor frecuencia, ácido clorhídrico. Al determinar con-
centraciones iónicas bajas, se debe usar una tecnología de atrapamiento adecuada para purificar la fase móvil.
Cuando la detección se basa en absorbancia UVo visible, entonces se puede usar una variedad de soluciones salinas para
preparar la fase móvil, incluyendo ácido ftálico y ácido p-hidroxibenzoico para la determinación de aniones, así como ácido
metanosuffónico para la determinación de cationes.
La detección amperométrica emplea una solución de ácido o base fuerte como fase móvil, aunque algunos métodos pueden
usar una solución salina con un pH casi neutro o una solución de ácido o base que contenga una sal. Cuando se usan fases
móviles alcalinas, la contaminación por dióxido de carbono/carbonato puede minimizarse usando reactivos de alta pureza y
almacenando bajo una atmósfera de nitrógeno o helio. La mayoría de los métodos de IC-MS usan las mismas fases móviles
usadas para la conductividad con supresión, aunque también se han usado soluciones de aminas volátiles y de sales volátiles.
Los métodos de IC que usan una columna de exclusión iónica emplean soluciones de ácidos fuertes tales como ácido sulfúrico
como fase móvil. En ocasiones se utilizan solventes orgánicos para HPLCpara preparar la fase móvil, por lo regular a una con-
centración de no más de 20%. Esta adición por lo regular se lleva a cabo para modificar la selectividad o para mejorar la solu-
bilidad de componentes de muestra que de otro modo podrían contaminar la fase estacionaria.
Asimismo, las moléculas de proteína pueden presentar una distribución de carga de superficie distinta de acuerdo con su
estructura y el pH de la fase móvil. En dichos casos, el pH, el gradiente de pH, la concentración iónica, o una combinación de
estos parámetros demostraron ser útiles para la separación.
FasesEstacionarias
Las separaciones por IC se basan en el intercambio iónico y, por lo tanto, las fases estacionarias para IC son intercambiadores
aniónicos o catiónicos, o menos comúnmente, las fases contienen ambas funcionalidades. Las fases estacionarias tienen grupos
funcionales iónicos sobre una base de sílice o de materiales poliméricos,. Sin embargo, debido a la solubilidad del gel de sílice
en agua, en particular a pH alcalinos, el uso de soportes de base sílice está limitado cuando la fase móvil es alcalina. En dichos
casos, un soporte polimérico para IC es útil en un intervalo de pH más extenso. La mayoría de las fases usadas en la actualidad
se construyen con polímeros altamente entrecruzados, lo que aumenta su compatibilidad con los disolventes orgánicos que en
ocasiones se requieren para preparar la fase móvil. Las fases poliméricas de intercambio aniónico para IC por lo regular se cons-
truyen a partir de soportes de poliestireno/divinilbenceno, etilvinilbenceno/divinilbenceno o sustrato polimérico de alcohol po-
livinílicoy polimetacrilato con tamaños de partícula que van de 4 a 15 µm de diámetro, no porosas o con un tamaño de poro
de hasta 2000 A.Para proveer funcionalidad al intercambiador aniónico, los grupos de intercambio aniónico se unen al sustra-
to generalmente mediante una de dos maneras, electrostáticamente o covalentemente por polimerización por condensación
(también conocida como polimerización por crecimiento en etapas). Las fases de intercambio catiónico para IC emplean los
mismos sustratos poliméricos que las fases de intercambio aniónico, pero debido a que las fases móviles para IC de cationes
son ácidas, también se puede usar sílice. La cromatografía de exclusión iónica usa una fase estacionaria porosa de intercambio
catiónico fuerte, mientras que la cromatografía de pares iónicos emplea una fase estacionaria polimérica de fase reversa.
Detección
La detección por conductividad es el modo de detección de uso más común en la IC, en especial para la detección por con-
ductividad con supresión.
En la detección por conductividad con supresión, la conductancia de fondo de la fase móvil iónica se reduce significativa-
mente a medida que fluye a través del dispositivo de supresión (supresor). Por ejemplo, cuando el hidróxido de sodio diluido
(10-50 mM) usado como fase móvil en la IC de aniones fluye a través del supresor, éste se convierte en agua (HP), que tiene
muy baja conductividad. Se producen reacciones análogas al usar un supresor para cationes, en el que la fase móvil ácida se
convierte en agua y los cationes del analito se convierten en formas de hidróxido altamente conductoras (debido a la mayor
conductancia equivalente de los iones de hidróxido en comparación con otros aniones).
USP42 InformaciónGeneral/ (1065) Cromatografía Jónica 7703
La reducción en la conductancia de fondo y la mejoría en la señal debido a las especies iónicas dan como resultado una
relación señal-ruido significativamente mejorada para la detección conductimétrica de iones en IC con supresión. Esto resulta
en una reducción del ruido de la línea base mientras se incrementa la sensibilidad y la reproducibilidad del análisis. Los supre-
sores de uso común se pueden clasificar en dos categorías. En la primera, las reacciones se producen a través de una membra-
na de intercambio iónico y los iones regeneradores son proporcionados por un producto químico o bien como productos de la
electrólisis del agua. En la segunda, las reacciones de supresión se producen en un lecho relleno de material de resina de alta
capacidad de intercambio o material monolítico, y la regeneración se logra mediante un producto químico o por electrólisis
del agua.
DETECCIÓNAMPEROMÉTRICA
POR PULSOS/INTEGRADA
(PAD/IPAD, POR SUS SIGLASEN INGLÉS)
La detección amperométrica por pulsos y la detección amperométrica integrada son modos de detección amperométrica
que aplican más de un potencial al electrodo de trabajo. Estos modos de detección se usan comúnmente para la detección de
especies electroactivas, p. ej., compuestos orgánicos como carbohidratos, alcoholes de azúcares, aminoácidos, aminas y espe-
cies de azufre orgánico que se pueden oxidar fácilmente. Los analitos se detectan mediante un proceso de desorción oxidativa
en la superficie de un electrodo ubicado en el flujo de efluente de la columna. La detección amperométrica por pulsos emplea
un potencial para detección, mientras que la detección amperométrica integrada usa múltiples potenciales. La corriente gene-
rada durante los periodos fijos en que se aplican dichos potenciales de detección se integra para generar carga. Después de la
detección, se aplica una serie de potenciales durante períodos fijos para limpiar la superficie del electrodo. A diferencia de la
amperometría convencional con corriente directa en la que la superficie del electrodo se ensucia, esta secuencia de potenciales
de rápida repetición para detección y limpieza del electrodo, denominada ondulación, permite la detección y la eliminación de
los productos de las reacciones redox de la superficie del electrodo de trabajo.
DETECCIÓNUV
La detección UVdirecta se utiliza para iones inorgánicos y orgánicos que absorben luz UV,por lo regular a longitudes de
onda bajas. Éstos incluyen ácidos orgánicos, bromuro, yoduro, nitrato, nitrito, tiosulfato y complejos cianometálicos. La detec-
ción UV indirecta usa eluyentes que absorben fuertemente en la región espectral visible o ultravioleta. Se selecciona una longi-
tud de onda donde el eluyente absorbe pero los iones de muestra no lo hacen, y posteriormente se detectan los picos negati-
vos proporcionales a la concentración de analito. En la detección espectral después de reacción post-columna, se detectan al-
gunos analitos después de que el efluente de la columna se combina con un reactivo que resulta en la formación de un com-
puesto que absorbe luz a una longitud de onda UVo visible. En la detección espectral luego de una reacción post-columna,
algunos analitos son detectados luego de que el efluente se combina con un reactivo, resultando en la formación de un com-
puesto que absorbe la luz UVo visible. Un ejemplo clásico es la determinación de iones metálicos en la que los iones metálicos
en el efluente de la columna se quelan con 4-(2-piridilazo)resorcinol para ser detectados a 51 O y 530 nm.
ESPECTROMETRÍA
DE MASAS(MS, POR SUS SIGLASEN INGLÉS)
Por lo regular, los analitos se detectan después de que han pasado primero a través de un supresor para hacer que el efluen-
te resultante sea compatible con el espectrómetro de masas. La ionización por electrospray en modo negativo se usa para
aniones, mientras que el modo positivo se usa para cationes. En ocasiones se agrega un disolvente orgánico al efluente del
supresor para mejorar la ionización y aumentar la sensibilidad. Algunos iones metálicos pueden determinarse mediante una
separación por intercambio iónico seguida de ICPMS.
PREPARACIÓN
DE LA MUESTRA
La preparación de la Muestra puede ir desde una simple disolución o dilución de la muestra a la concentración apropiada, a
menudo seguida de filtración, hasta otros casos más complejos que requieren extracción en fase sólida (SPE, por sus siglas en
inglés). Si la solución es turbia y/o contiene partículas, entonces se requiere filtración a través de un filtro con un tamaño de
poro de 0,45 µm adecuado para IC. Las muestras que contienen una alta concentración de iones de la misma carga que el
analito pueden requerir un pretratamiento de la muestra para eliminar selectivamente el ion de alta concentración.
PROCEDIMIENTO
La elección de la fase móvil esta dictada por la selección de la columna, a su vez basada en la selectividad para los analitos
de interés, en relación a la de otros iones de igual carga que pudieran estar presentes. En casos en los que se presente una alta
concentración de otros iones, se selecciona una columna con una capacidad mayor para evitar la sobrecarga de la columna.
Esto es especialmente importante para muchas pruebas de límite, en las que se tiene una concentración baja del analito ante la
presencia de una concentración alta de otro ion con el mismo estado de carga. Esto es especialmente importante para muchas
7704 (1065) Cromatografía Jónica / Información General USP42
pruebas límite, donde coexiste una baja concentración de analito de interés con grandes concentraciones de otros iones de
igual carga. Para la IC de aniones, algunas fases móviles se pueden preparar a partir de sólidos o de soluciones o concentrados
comerciales listos para usar, p. ej., bicarbonato/carbonato de sodio. Algunas fases móviles, p. ej., soluciones de hidróxido de
sodio, se deben preparar y manipular con cuidado, minimizando la exposición al aire, y prepararlas a partir de soluciones de
hidróxido de sodio al 50%. Los pellets de hidróxido de sodio y las soluciones diluidas comerciales contienen grandes cantida-
des de carbonato, lo que altera la composición deseada de la fase móvil. Las soluciones ácidas para IC de cationes se preparan
diluyendo ácidos concentrados de alta pureza, Como alternativa, las fases móviles de carbonato/bicarbonato, de hidróxido y
de ácido metanosulfónico pueden producirse mediante un generador de eluyente. La mayoría de los análisis requerirán la in-
yección de 5-50 µL de solución muestra, aunque pueden requerirse volúmenes más grandes para el análisis de analitos de baja
concentración. Como en el caso de otras técnicas de LC, la cuantificación se realiza mediante procedimientos de estandariza-
ción internos o externos, en los que la concentración se calcula mediante la interpolación de la respuesta de la muestra en una
curva de calibración. Como en otras técnicas de LC, la cuantificación se realiza mediante calibraciones por el método de están-
dar interno o estándar externo, y la concentración se calcula por interpolación de la respuesta de la solución muestra en la
curva de calibración. Los métodos de IC se validan de acuerdo con las recomendaciones descritas en el capítulo Validaciónde
ProcedimientosFarmacopeicos (1225).
(1066) AMBIENTESFÍSICOSQUE FAVORECEN

ELUSO SEGURODE LOS
MEDICAMENTOS
INTRODUCCIÓN
El ambiente físico de trabajo en los entornos de cuidados de la salud es uno de los mayores contribuyentes potenciales a los
errores de medicación. Los datos sobre errores de medicación informados al Programa de Informe de Errores de Medicación
de la Farmacopea de los Estados Unidos (2008) demuestran que diversos atributos físicos del lugar de trabajo afectan el de-
sempeño humano al realizar este trabajo. Estos atributos pueden ayudar o entorpecer a los profesionales de la salud en sus
esfuerzos de proveer cuidados seguros y de alta calidad a todos los pacientes. Conforme a lo indicado por el Instituto de Medi-
cina (IOM) en su emblemático informe de 2001, Quality Chasm(ElAbismo de la Calidad), "Hoy en día, el cuidado de la salud
ocasiona daños con demasiada frecuencia y, en muchas ocasiones, es incapaz de proveer su potencial benéfico."
Este capítulo general describe normas basadas en evidencia para crear y mantener un ambiente físico que sustente y favorez-
ca el uso exacto y seguro de los medicamentos. El proceso para el uso seguro de los medicamentos implica múltiples aspectos
o etapas: adquisición, prescripción, transcripción, ingreso de órdenes, preparación, dispensación y administración, así como el
seguimiento de los efectos del medicamento sobre el paciente. Una mejor comprensión de estos procesos puede formar una
base sólida para el mejoramiento, lo que permitiría a los profesionales de la salud alcanzar un desempeño óptimo dentro del
sistema de uso de los medicamentos en diversos entornos de práctica. Este capítulo general se concentra en las características
del ambiente físico que pueden favorecer el uso apropiado de los medicamentos. Las normas se proveen cuando están justifi-
cadas por evidencias y opiniones de expertos; asimismo, se provee un glosario de términos usados en este capítulo.
RESPALDODE LA ORGANIZACIÓN
Los líderes de una organización de cuidados de la salud son quienes por lo general determinan las operaciones, las políticas
y los procedimientos que influyen sobre la seguridad. También establecen el diseño del ambiente de trabajo y la cultura, y
tienen una fuerte influencia sobre la adopción de una cultura de seguridad en lugar de una imposición cultural. Por ejemplo, el
personal jerárquico de la organización puede ayudar a mejorar la seguridad favoreciendo el libre flujo de información y refor-
zando los comportamientos de seguridad, o puede desalentar y restar importancia a las iniciativas de seguridad. Se encuentran
disponibles dos informes que documentan aspectos relacionados con las acciones organizacionales y la cultura y la forma en
que afectan la seguridad y el cuidado de los pacientes: El informe de la IOM de 1999, ToErr is Human (Errar es Humano), y el
informe de la IOM de 2006, PreventingMedication Errors(Prevención de Errores de Medicación).
Los organismos de acreditación tales como The Joint Commission (La Comisión Conjunta o TJC), la National lntegrated Ac-
creditation for Healthcare Organizations (Acreditación Integrada Nacional para Organizaciones de Cuidados de la Salud o NIA-
HO) y la lnternational Organization for Standardization (Organización Internacional para la Estandarización o ISO) enfatizan los
roles de la organización y de sus directivos en la determinación de las normas de seguridad. La TJC define la función crítica de
los directivos y responsabiliza a los líderes por los sistemas y procesos, mientras que la NIAHOy la ISO requieren la revisión
gerencial de la calidad y la seguridad por parte del organismo rector, con el propósito de favorecer cuidados de la salud segu-
ros y de alta calidad.
De acuerdo con James Reason (Human Error[Error Humano], 1990) se puede decir que la influencia de la organización cae
en algún punto intermedio entre los controles normativos, representados por reglas y procedimientos, y los controles discre-
cionales, que pueden basarse únicamente en la experiencia del individuo. Los controles de la organización que favorecen am-
USP42 Información General/ (1066) Ambientes Físicos 7705
bientes seguros deben incluir, como mínimo, los planes de informe, análisis e intervención necesarios para fundamentar las
defensas contra eventos adversos de medicación. Los sistemas para el análisis de errores deben incluir las influencias organiza-
cionales que finalmente afectan a los trabajadores a nivel de unidad.
Una cultura directiva que apoya y empodera a todos los niveles de la organización, debería resultar en ambientes físicos de
trabajo óptimos que ayudan a prevenir errores de medicación y que favorecen el uso exacto de los medicamentos. Este enfo-
que puede mejorar el desempeño de todos los individuos implicados en el proceso de uso de los medicamentos. Una organi-
zación que alinea los objetivos y recursos de los directivos centrándose en la seguridad estratégica basada en evidencia genera
sistemas más seguros para la administración de medicamentos. Aunque los hospitales han sido "diseñados" para el cuidado de
pacientes, existe un organismo de investigación rector que apunta al diseño basado en evidencia para una provisión segura de
los cuidados. Otras industrias de alto riesgo con énfasis en la seguridad estratégica comparten características comunes que in-
cluyen el uso de procesos robustos para el mejoramiento de organizaciones; esto puede llevar a intervenciones basadas en da-
tos y evidencia científica.
ZONAS DE SEGURIDADPARAMEDICACIÓN
En el sistema de uso de medicamentos, el grado de exactitud y seguridad lograda es el resultado final de muchas interaccio-
nes entre humanos, sus ambientes físicos de trabajo y los equipos y la tecnología utilizados. Es importante concentrarse en
áreas de ambiente laboral en las que (1) se prescriben los medicamentos; (2) se ingresan las órdenes en una computadora o se
transcriben en papel; y (3) se realizan preparaciones magistrales de medicamentos que se dispensan y se administran. Estas
áreas de trabajo comúnmente se conocen como zonas de seguridad para medicación. Entre los ejemplos se incluyen las áreas
de trabajo alrededor de un carro de medicamentos en una unidad de enfermería; cualquier lugar donde se toman las decisio-
nes con respecto a las prescripciones; el espacio de trabajo de un dispositivo automatizado de dispensación de medicamentos;
una farmacia donde se preparan, inspeccionan y dispensan las prescripciones; y áreas en los hogares de los pacientes donde se
preparan, administran o consumen los medicamentos. La zona aledaña a la cama del paciente en una instalación de cuidados
de la salud o su hogar es otra zona de seguridad para medicación importante que presenta retos únicos.
El ambiente físico de cualquier sala de operaciones requiere atención especial debido a los altos niveles de ruido, a la ilumi-
nación variable y otras distracciones. En este entorno desafiante, los profesionales de la salud toman decisiones críticas de me-
dicación que pueden influir en la vida o muerte de un paciente. Asimismo, las zonas de seguridad para medicación deben
incluir áreas con un espacio destinado a un equipo seguro para el desecho de material punzante (agujas y jeringas). En gene-
ral, en todas las zonas de seguridad para medicación, es importante asegurar que se mantengan cantidades apropiadas de
suministros, verificar de manera rutinaria las fechas de caducidad de los productos, y las condiciones de almacenamiento co-
rrectas para el mantenimiento de los productos sensibles a la temperatura.
Principios derivados de la Investigación de Factores Humanos
La literatura investigativa describe diversos principios que pueden ser útiles para el planeamiento del ambiente físico de una
zona de seguridad para medicación.
PRINCIPIODE IMPORTANCIA
Dentro de la zona de seguridad para medicación, los componentes importantes se deben colocar en lugares convenientes.
Por ejemplo, los sistemas de información deben ser accesibles dentro o cerca de la zona de seguridad para medicación de mo-
do que la información del medicamento y los datos del paciente (p. ej., resultados de laboratorio y signos vitales) estén dispo-
nibles de inmediato. Las instrucciones de funcionamiento y resolución de problemas de los equipos se deben colocar cerca o
sobre los equipos para ofrecer respuestas rápidas a cualquier pregunta que surja.
PRINCIPIODE FRECUENCIA
DE USO
Los suministros y equipos que se usen de manera frecuente deben ser fáciles de encontrar y accesibles. Esto reduce la proba-
bilidad de que el personal deba improvisar soluciones, en las que se utilicen equipos/suministros menos adecuados en lugar de
los artículos recomendados.
PRINCIPIODE FUNCIÓN
Los exhibidores, controles o suministros relacionados con una función específica deben mantenerse juntos. Por ejemplo, las
jeringas, las agujas y los hisopos con alcohol pueden almacenarse juntos en un cajón; y los tubos y conectores IVque se usan
en la preparación de infusiones pueden colocarse en el mismo estante.
7706 (1 066) Ambientes Físicos / Información General USP42
PRINCIPIODE SECUENCIADE USO
Los artículos deben colocarse en un orden que refleje la secuencia de los pasos necesarios para realizar correctamente la ta-
rea. Por ejemplo, los guantes estériles se deben encontrar dentro o con los kits de vendas estériles, y los artículos se deben
acomodar de manera secuencial. Esto permite al personal completar las tareas de manera rápida y correcta.
Estaciones de TrabajoAledañas a la Cama

Existen métodos disponibles para realizar el análisis del espacio de trabajo. Un aspecto importante son las áreas de adminis-
tración de medicamentos aledañas a la cama del paciente (en instalaciones de cuidados de la salud o en el hogar del pacien-
te), que deben seguir el mismo diseño que la zona de seguridad para medicación centralizada. Las distracciones representan
un reto mayor cuando se trabaja en las zonas aledañas a la cama del paciente, por lo que se deben tomar medidas para mini-
mizarlas siempre que sea posible. La información y los suministros deben mantenerse accesibles (de acuerdo con los principios
de factor humano tratados con anterioridad) y colocarse en un área ordenada con iluminación adecuada. Los recipientes para
desechar objetos punzantes se deben colocar en áreas donde se puedan alcanzar fácilmente, pero fuera de las áreas de tránsito
constante. Cada área aledaña a la cama debe presentar un diseño estandarizado, de manera que no se necesite reubicar la
información y los suministros al trasladar un paciente de una cama a otra.
Producción Optimizada
El mantenimiento de un lugar de trabajo eficiente y efectivo reduce la probabilidad de errores. Una manera eficiente para
diseñar el lugar de trabajo emplea técnicas de producción optimizada para mejorar las actividades deseables y con valor agre-
gado, al tiempo que se eliminan actividades indeseables que producen pérdidas durante los procesos de trabajo.
A continuación se presentan tres técnicas de producción optimizada: (1) ControlesVisuales,es decir, mantener los procesos
de trabajo e indicadores a la vista de modo que el personal pueda ver el estado de la tarea a simple vista; (2) Diseñoracionali-
zado, es decir, optimizar la secuencia de los procesos de trabajo a través del diseño de las instalaciones; y (3) Almacenamiento
en el Lugar de Uso,es decir, almacenar suministros en el lugar donde se usarán siempre que sea posible, de modo que el perso-
nal pueda realizar las tareas de manera más eficiente. 1
Simplificacióny Estandarización
La aplicación de cambios que simplifiquen y estandaricen el ambiente de cuidados del paciente disminuye la carga cogniti-
va, reduciendo la probabilidad de olvidos y errores durante tareas de rutina al minimizar el tiempo de decisión y manipulación.
La estandarización se puede usar en el diseño de instalaciones y habitaciones, equipo médico y funciones relacionadas con la
medicación (p. ej., entrega de medicamentos y almacenamiento de medicamentos específicos del paciente). Asegurar el acce-
so inmediato a la información clínica que es específica para el paciente (o de los medicamentos), es esencial para todas las
áreas en las que el personal desarrolla las etapas del proceso de uso de medicamentos.
Soluciones Innovadoras
Otra manera de optimizar el diseño de la zona de seguridad para medicación consiste en involucrar al personal que realiza
las tareas de manera rutinaria. Los trabajadores pueden sugerir soluciones innovadoras para los problemas en la estación de
trabajo. Para favorecer la innovación, es recomendable incorporar flexibilidad en el diseño de la zona de seguridad para medi-
cación.
Funciones de Restricción
Las restricciones y las funciones de restricción son medios efectivos para prevenir errores, en particular para medicamentos y
situaciones de alto riesgo. Las funciones de restricción no siempre se refieren al diseño del dispositivo. De éstas, las más simples
no requieren de tecnología. Una de las primeras funciones de restricción identificada en los cuidados de la salud fue la elimina-
ción de potasio concentrado de las unidades hospitalarias para eliminar el riesgo de preparación involuntaria de soluciones in-
travenosas con potasio concentrado, un error que, con el paso de los años, ha ocasionado un número de muertes bajo pero
constante.
Otros ejemplos incluirían la incorporación de bloqueadores neuromusculares en un kit de entubado sellado lo cual reduce la
posibilidad de que se administre un agente paralizante a un paciente sin tener acceso a ventilación asistida. Además, el envasa-
do de un producto enteral de modo que no se pueda conectar físicamente a un conector con cierre Luer para tubuladuras
intravenosas evitaría un error de ruta de administración, incluso si el personal de enfermería se encontrase trabajando bajo
condiciones de poca luz y, en un principio, hubiera cometido un error al identificar la ruta destinada para el tubo. La disponibi-
1 Sanders MS, McCormick EJ.Human Factorsin Engineeringand Design.

New York: McGraw-Hill; 1993.
USP42 InformaciónGeneral/ (1066) Ambientes Físicos 7707
lidad de tecnología de seguridad para medicación nunca debe reemplazar a las prácticas seguras de medicación dentro de una
zona de seguridad para medicación. Diversos informes han advertido acerca de errores derivados de ignorar o pasar por alto
(override) controles de seguridad, tales como bibliotecas de fármacos en bombas de infusión inteligentes y alarmas.
Elementos del Sistema de Trabajo
CARACTERÍSTICAS
DELPERSONAL
Las características del individuo que realiza el trabajo incluyen su nivel de experiencia, edad, agudeza visual y auditiva, ten-
dencia a las distracciones y nivel de atención. Los seres humanos difieren en sus respuestas al ambiente físico. En un escenario
ideal, el ambiente físico podría modificarse para cada individuo. De esta forma, el ambiente se podría adaptar para ajustarlo a
las necesidades del usuario de turno a fin de optimizar la exactitud de su desempeño. Alternativamente, el ambiente debe ser
lo más favorable posible para la más amplia gama de capacidades posible.
SONIDOY RUIDO
La Agencia de Protección Ambiental de EE.UU.(Environmental Protection Agency o EPA)recomienda niveles pico de sonido
de 45 dB durante el día y 35 dB durante la noche en hospitales. Las guías de la Organización Mundial de la Salud (OMS) esta-
blecen que los niveles de sonido de fondo en las habitaciones de los pacientes no deben exceder de 35 dB. El lnternational
Noise Council recomienda máximos de 45 dB durante el día y de 20 dB en la noche para áreas de cuidados agudos. Es necesa-
rio usar protección para los oídos cuando los trabajadores estén expuestos a niveles de sonido que promedien 90 dB.
La norma para niveles de sonido en zonas de seguridad para medicación se establece en 45 dBA. Con esto se pretende ase-
gurar que la información verbal crítica se pueda escuchar con exactitud. Los profesionales de la salud deben ser conscientes de
sus propias necesidades de silencio, dependiendo de la tarea realizada, y deben contar con un área silenciosa para favorecer el
desempeño apropiado. La eliminación total de ruido en instalaciones de cuidados del paciente no es factible ni deseable. Las
áreas de asesoramiento de pacientes en las farmacias deben incluir métodos de reducción de sonido para mejorar la audición y
el aprendizaje, por ejemplo, el uso de una sala cerrada.
El ruido se considera como un riesgo serio para la salud de los pacientes hospitalarios, además de ser una fuente de interfe-
rencia para el desempeño efectivo en el trabajo. La mayoría de los estudios sobre los efectos del ruido en el ambiente de traba-
jo han sido realizados en entornos no relacionados con el cuidado de la salud. No obstante, se documenta cada vez con mayor
frecuencia que los niveles de ruido son un factor que contribuye al estrés del personal de enfermería. En los centros de cuida-
dos de la salud, las fuentes de ruido pueden incluir desde sistemas de radiolocalización de personas, alarmas de equipos, siste-
mas de calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC),cañerías, televisores y radios hasta máquinas de hielo. Se ha cita-
do al ruido como un obstáculo para el desempeño adecuado del personal de enfermería. Un estudio exhaustivo desarrolló un
mapa de ruido de un hospital en el que se encontraron niveles de sonido de 55 dB, lo que representa 10-20 dB por encima de
las recomendaciones de la EPAdependiendo de la hora del día. Los niveles de sonido promedio en otros hospitales han presen-
tado mediciones entre 45 y 68 dB, con picos entre 85 y 90 dB. Un estudio de niveles de sonido durante cambios de turno
presentó mediciones de 11 3 dB.
A continuación, se presentan condiciones relacionadas con el sonido que pueden afectar la exactitud al dispensar los medi-
camentos: previsibilidad del sonido; capacidad de control del sonido; tipo de tarea (simple vs compleja); realización simultánea
de tareas múltiples; distracciones debidas al ruido (que puede confundir las señales ambientales y la voz interna del trabajador,
usadas para practicar y recordar tareas importantes). De 58 estudios, 7 mostraron que el ruido mejoraba el desempeño, al con-
trario de 29 que mostraron que el ruido lo perjudicaba. Un estudio mostró que los sonidos y ruidos impredecibles pero contro-
lables mejoran la exactitud de la preparación de prescripciones, contrario a lo mostrado por investigaciones anteriores. Lo an-
terior puede ser indicativo de que es necesario cierto estímulo ambiental para mantener a los trabajadores en un estado de
alerta y atención adecuados. Los investigadores intentan identificar niveles óptimos de reacción debida al sonido y al ruido
para las personas que realizan diferentes tipos de tareas (p.ej. la ley de Yerkes-Dodson).
Es posible reducir el ruido y demás interferencias sensoriales mediante actividades, herramientas y principios desarrollados
por expertos en factores humanos e ingeniería, muchos de los cuales ya se usan en algunas organizaciones dedicadas al cuida-
do de la salud. Como parte de un proyecto de investigación (http://www.healthdesign.org/pebble) auspiciado por The Center
for Health Design (Centro de Diseño para la Salud), una organización de investigación y promoción sin fines de lucro, se están
estudiando los efectos que tienen estos y otras mejoras en el diseño de los espacios de trabajo de enfermería, sobre el estado
final de los pacientes y el desempeño del centro de atención. El proyecto ha encontrado disminuciones en errores médicos, así
como en transferencias de pacientes, infecciones intrahospitalarias, caídas de pacientes y uso de medicamentos. Cuando lo
permitan las guías de control de infecciones, se puede lograr la reducción del ruido a un costo moderado mediante la instala-
ción de materiales que puedan absorber el sonido (p.ej. materiales de cielos rasos y paredes, y alfombras). Los ingenieros acús-
ticos pueden proveer métodos adicionales para la reducción de ruido. Los trabajadores que no necesitan responder a señales
audibles tales como llamadas telefónicas o alarmas pueden usar auriculares con cancelación de ruido y escuchar música, siem-
pre que su desempeño no se vea afectado de manera adversa.
7708 (1066) Ambientes Físicos / Información General USP42
ACTIVIDADESY TAREASREALIZADAS
Al diseñar un ambiente físico óptimo que favorezca el uso exacto de los medicamentos, se deben considerar las actividades y
tareas que se requieren llevar a cabo. Un ambiente con un diseño deficiente u otras condiciones adversas en el área de trabajo
puede llevar a una adaptación insegura de los procedimientos. Por ejemplo, los profesionales que tienen que escuchar cons-
tantemente alarmas de los equipos fuera de los parámetros adecuados (y que por lo tanto producen demasiadas falsas alar-
mas) pueden silenciar las alarmas para disminuir el ruido. No obstante, esto limita la capacidad del profesional para monitorear
la seguridad del sistema. Una situación similar es la de las alarmas visuales y los mensajes de computadora que a menudo se
ignoran o pasan por alto. En general, las actividades y las tareas deben estructurarse de modo que puedan llevarse a cabo con
la menor dificultad posible. Si se detectan soluciones improvisadas, estas deben investigarse como una indicación de que el
procedimiento o flujo de trabajo no es adecuado para la tarea.
Atención Dividida en Tareas Múltiples
El término "Atención Dividida en Tareas Múltiples" se originó en la industria de la ingeniería informática y se refiere a la capa-
cidad de una persona para llevar a cabo más de una tarea en simultáneo. El cerebro humano funciona de manera distinta en
cada persona; por lo tanto, no todos son capaces de realizar múltiples tareas en simultáneo de manera exitosa. La necesidad
de realizar múltiples tareas en simultáneo es común en todas las áreas del ambiente de los cuidados de la salud, ya sea en una
unidad de enfermería, en una farmacia, en una sala de operaciones o en un área de procedimientos especiales. Algunas perso-
nas pueden concentrarse sin problemas al realizar más de una tarea a la vez, mientras que a otras no les resulta posible. En el
cerebro humano, la atención dividida en tareas múltiples implica ir y volver de forma lineal de una actividad a otra mientras en
realidad se completa una tarea a la vez.
Esto puede generar problemas en los establecimientos de cuidados de la salud, en particular si sucede algo inesperado con
respecto a una tarea mientras el individuo está enfocado en otra. Estas interrupciones y distracciones pueden llevar a errores de
medicación y otras formas de daños a los pacientes. Otro tipo de error por atención dividida en tareas múltiples se relaciona
con la "sobrecarga mental", es decir, cuando diversos asuntos se están considerando al mismo tiempo. Un exceso en la carga
de trabajo cognitiva puede tener consecuencias indeseables, por lo que es importante tener en cuenta que no todos los profe-
sionales son capaces de manejar sistemas y procesos establecidos en un ambiente físico particular.
Los farmacéuticos y enfermeras son profesionales que con regularidad realizan múltiples tareas en simultáneo. Aunque la
mayoría de las prescripciones se preparan o administran de a una por vez, esto no significa que no pueda ocurrir la atención
dividida en tareas múltiples. El área de trabajo debe estar diseñada para mantener las prescripciones individuales separadas y
para permitir la atención dividida en tareas múltiples. Los individuos tienen capacidades diferentes para llevar a cabo tareas
secuenciales en lugar de dividir su atención en tareas múltiples. En la actualidad, no hay evidencia suficiente para evaluar la
aptitud de un individuo para dividir su atención en tareas múltiples en ambientes de cuidados de la salud, pero la investigación
de factores humanos en los entornos de laboratorio controlados sugiere que, en el futuro, pueda ser posible evaluar y aumen-
tar esta capacidad en los profesionales de la salud.
HERRAMIENTAS
Y TECNOLOGÍAS
EN ELAMBIENTEFÍSICO
En el entorno de cuidados de la salud, las herramientas y tecnologías que se usan para realizar las tareas también pueden
interactuar con el ambiente físico para afectar la probabilidad de errores de medicación. Por tanto, el diseño del ambiente de-
be tener en cuenta las herramientas y tecnologías específicas que serán usadas por los individuos para completar su trabajo.
Por ejemplo, el diseño físico de una sala de operaciones debe tener el tamaño, la maniobrabilidad y los espacios requeridos
entre los muchos dispositivos que se usan durante una cirugía. Las herramientas y tecnologías también deben cumplir con las
normas de diseño ergonómico.
Otro ejemplo consiste en que las etiquetas de los medicamentos en ocasiones son demasiado pequeñas para mostrar ins-
trucciones de preparación, dispensación o administración; cuando esto ocurre, se deben considerar alternativas. Una alternati-
va es incluir códigos QR de Respuesta Rápida en las etiquetas, los cuales permiten al personal de cuidados de la salud acceder a
la información de prescripción y manipular el producto correctamente con un dispositivo conectado a la Internet (tales como
iPad, iPhone o Android). Los códigos QR de Respuesta Rápida son códigos de barras bidimensionales que, al ser leídos por el
dispositivo de lectura de imagen, llevan al usuario directamente al sitio Web que contiene la información requerida.
Los factores adicionales que deben tenerse en cuenta incluyen las fallas, el tiempo de inactividad y la vibración de los equi-
pos.
Falla de los Equipos:El supervisor debe ser inmediatamente informado acerca de cualquier equipo que presente fallas, da-
ños, o que se haya extraviado. En el caso de las fallas, se debe tomar la decisión de reparar el artículo o reemplazarlo a la
brevedad posible. En muchos casos, el artículo puede reemplazarse rápidamente, pero algunas partes del equipo pueden to-
mar más tiempo para desarmarlas y reinstalarlas. El personal debe confirmar que el equipo se encuentra en buen estado de
operación antes y después de cada uso. Se debe contar con un programa de rutina de confirmación del funcionamiento del
equipo.
Inactividad de los Equipos:El término "inactividad" se refiere a los periodos en los que no se encuentra disponible un siste-
ma o parte de un equipo. Los cortes, o duración de la inactividad, se refieren al tiempo durante el cual el equipo no puede
cumplir con su función primaria. El concepto de inactividad por lo regular se aplica a redes y servidores informáticos, aunque
también puede usarse al tratar las fallas de los equipos. Dichas fallas pueden deberse a varias razones, incluidos daños; defectos
de diseño; error en el procedimiento, es decir, uso inadecuado por parte del personal; problemas de ingeniería, es decir, la
forma en que se usa e implementa el equipo; sobrecarga por someter los recursos del sistema a un estrés mayor a su capaci-
dad; problemas ambientales con sistemas de soporte tales como calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC)y electri-
cidad; e inactividad programada por mantenimiento, actualizaciones o expansión. Los contratos de servicios son una práctica
habitual para minimizar la inactividad y los cortes. Se debe contar con procedimientos para tratar la inactividad.
Vibraciónde los equipos:La vibración es un fenómeno mecánico en el cual ocurren oscilaciones alrededor de un punto de
equilibrio. Aunque en ocasiones la vibración puede ser conveniente, por lo general no lo es, desperdicia energía y crea ruido
indeseado. Por ejemplo, los movimientos vibratorios de los motores, motores eléctricos o de cualquier dispositivo mecánico
son generalmente indeseados y pueden deberse a falta de equilibrio en las partes giratorias, fricción poco uniforme, encastre
imperfecto de los dientes del engranaje, entre otros factores. A menudo, el diseño cuidadoso y la instalación apropiada pueden
minimizar las vibraciones indeseadas.
DISTRACCIONES
E ÍNDICEDE CAPACIDADDE DISTRACCIÓN
El ambiente de trabajo de los cuidados de la salud está repleto de distracciones e interrupciones que pueden afectar de ma-
nera negativa el desempeño y llevar a errores de medicación. Los arquitectos, ingenieros y demás profesionales que desempe-
ñan un papel en el diseño del lugar de trabajo tienen la responsabilidad de estar al tanto y conocer profundamente este pro-
blema de modo que puedan diseñar espacios de trabajo seguros y ergonómicamente idóneos. Este enfoque debe tener un
importante impacto benéfico al contrarrestar los efectos negativos de las interrupciones y distracciones durante el cuidado de
pacientes. En general, las zonas de seguridad para medicación se deben ubicar en áreas donde se minimice el potencial de
distracciones e interrupciones. Con frecuencia, el personal de enfermería cita las distracciones e interrupciones como factores
que contribuyen a la incidencia de los errores de medicación. La distracción derivada de tareas paralelas puede afectar el de-
sempeño de muchas maneras, como por ejemplo, la interferencia sensorial/perceptiva (p. ej., el personal de enfermería no es-
cucha la alarma debido a que un compañero de trabajo interrumpe con una pregunta), el costo cognitivo de cambiar de una
tarea a otra (el personal de enfermería responde a una alarma con mayor lentitud debido a que toma tiempo recobrar la orien-
tación hacia la tarea de la alarma después de la pregunta del compañero de trabajo) o la posible pérdida de memoria (el per-
sonal de enfermería omite llevar a cabo una etapa pues olvidó en qué parte se quedó al retomar la tarea después de la inte-
rrupción).
Además, las interrupciones y distracciones han sido asociadas con tasas más altas de errores de dispensación de prescripcio-
nes en una farmacia ambulatoria. De acuerdo con el 2008 USP MEDMARXData Report, las distracciones continúan teniendo
un papel principal en los errores de medicación al identificarlas como un factor que contribuye con el 45% de todos los errores
de medicación en hospitales y sistemas de salud. Sin embargo, la prevención o reducción de interrupciones y distracciones se
puede lograr otorgando al personal la capacidad de controlar y manejar su exposición a dichos factores. Se puede permitir que
el personal ajuste las características de la zona de seguridad para medicación con el objeto de maximizar su concentración, los
niveles de atención y optimizar su desempeño. Las características ajustables incluyen proporcionar una estación de trabajo pro-
tegida de interrupciones y distracciones, tales como una sala de medicación separada o un carro con espacio de trabajo para
aquellos que no se ven afectados de manera adversa por las distracciones. Cada individuo tiene un nivel distinto de capacidad
de distracción y deben ser conscientes de sus propias necesidades de mantener un área de trabajo libre de distracciones. Elevar
la consciencia del trabajador sobre el impacto adverso de las interrupciones y distracciones puede ayudar a minimizar proble-
mas. Además, se puede capacitar a los trabajadores sobre cómo evitar interrumpir a sus compañeros de trabajo por razones no
urgentes, en particular cuando estos últimos se encuentran realizando tareas relacionadas con la medicación. De acuerdo con
un estudio en farmacia, las solicitudes de ayuda por parte de compañeros de trabajo representan la fuente más frecuente de
interrupciones.
Las técnicas que pueden ser efectivas para disminuir interrupciones y distracciones incluyen estímulos visuales (tales como
vestir chalecos de seguridad de color anaranjado) y barreras físicas tales como preparar dosis en una sala de medicación. Asi-
mismo, el personal puede usar listas de verificación para enfocar o reenfocar su atención en las tareas. La investigación científi-
ca sobre distracciones e interrupciones en el ambiente físico es limitada; por lo tanto, se requieren estudios adicionales para
identificar acciones correctivas basadas en evidencia que promuevan el uso seguro de los medicamentos.
ELEMENTOS
DELAMBIENTEFÍSICO
Diversos factores del ambiente físico tales como la iluminación, el ruido, la temperatura, la distribución y el diseño de la esta-
ción de trabajo, interactúan con los factores humanos y relacionados con las tareas para influir sobre la exactitud del uso de los
medicamentos. Las partes siguientes de este capítulo general se enfocan en proveer guías sobre el ambiente óptimo para me-
jorar el desempeño de los individuos implicados en el proceso de uso de los medicamentos.
771 O (1066) Ambientes Físicos / Información General USP42
DISEtilODELSISTEMADE TRABAJO
De acuerdo con el modelo de la Systems Engineering lnitiative for Patient Safety (Iniciativa de ingeniería de Sistemas para la
Seguridad del Paciente o SEIPS),existe una interacción entre cinco elementos del sistema de trabajo-humanos, tareas, tecno-
logía y herramientas, organización y ambiente-que afectan los resultados del empleado, de la organización y del paciente.
Debido a que estos cinco sistemas de trabajo están estrechamente interrelacionados, los diseñadores deben tenerlos en cuenta
en todo momento. Siempre que uno de estos elementos cambie, habrá implicaciones para los otros elementos. El sistema de
trabajo completo requiere de un diseño adecuado para optimizar el desempeño y asegurar resultados positivos. Aunque este
capítulo general describe todos los sistemas de trabajo, su enfoque se centra en recomendaciones para el ambiente físico.
DiseñoBasadoen Evidencias
El diseño basado en evidencias (EBD,por sus siglas en inglés) es un campo de estudio que hace uso de los datos de investi-
gación más confiables para la planificación del diseño del ambiente y equipo del lugar de trabajo. El diseño basado en eviden-
cias está estrechamente relacionado con la jerarquía sistemática de la práctica basada en evidencias y emplea un proceso siste-
mático de evaluación de investigaciones científicas como fundamento para tomar decisiones de diseño que mejoren el desem-
peño humano y que reduzcan la tensión en el ambiente complejo de los cuidados de la salud. El diseño basado en evidencias
cruza y combina los dominios de la ergonomía, los factores humanos, la capacidad de uso y la psicología cognitiva para conse-
guir el mejor ambiente de trabajo posible.
Los principios del diseño basado en evidencias están disponibles para proveer información sobre las opciones de diseño am-
biental. En 2008, Ulrich y sus asociados publicaron una revisión de la literatura de investigación sobre el diseño de cuidados de
la salud basado en evidencias, en la que concluyeron que "La evidencia indica que los entornos físicos bien diseñados desem-
peñan un papel importante para que los hospitales sean más seguros y proporcionen una mejor atención a los pacientes, así
como mejores lugares para que el personal realice su trabajo." Por ejemplo, los principales avances tales como una reducción
en las tasas de infección se han asociado con el diseño y la ubicación de los lavamanos, ventilación apropiada y materiales
adecuados para superficies.
La aplicación de los principios de diseño basado en evidencias al diseño del equipo es igual de esencial que su aplicación al
ambiente de trabajo. En años recientes, se ha descrito el uso del diseño basado en evidencias para bombas intravenosas, tubos
de alimentación y dispositivos de liberación de analgésicos controlados por el paciente. La investigación continúa apoyando el
uso de tipos de letra y etiquetas estandarizados para la identificación de fármacos, así como el diseño basado en evidencias
para áreas de almacenamiento de medicamentos. Las partes interesadas deben recurrir a la evidencia de la investigación más
relevante disponible al momento de tomar decisiones sobre el complejo ambiente de trabajo de los cuidados de la salud, y
usarla como uno de los principales factores guía. La selección de objetos tales como muebles, estantes y dispositivos debe rea-
lizarse después de tener en cuenta de manera cuidadosa los objetivos del diseño basado en evidencia y la investigación realiza-
da. Por ejemplo, sería ideal configurar los muebles para crear una sensación de privacidad y minimizar las distracciones visuales
y auditivas durante la transcripción, preparación, dispensación y administración de medicamentos. Los muebles deben ajustar-
se para satisfacer las necesidades ergonómicas de un trabajador. Además, la contaminación de superficies puede reducirse se-
leccionando materiales no porosos y sin juntas ni uniones, permitiendo una fácil limpieza.
DESAFÍOSEN ELAMBIENTEFÍSICO
Preparaciónde Órdenesy Transcripciones

Los errores al ordenar medicamentos o al transcribir órdenes de medicamentos están bien documentados en la literatura de
investigación. Debido a que los errores cometidos al realizar estas tareas pueden poner directamente en peligro la seguridad
del paciente, la preparación de órdenes y transcripciones deben tratarse como actividades de alto riesgo en el ambiente de los
cuidados de la salud. Los métodos manuales para preparar órdenes y transcribirlas dependen del desempeño humano. Los
errores pueden cometerse cuando el lector malinterpreta imperfecciones en la escritura manuscrita, abreviaturas o decimales,
o cuando simplemente se lee erróneamente la escritura manuscrita. Las órdenes enviadas por fax implican fuentes de error
adicionales debido a que la legibilidad puede ser deficiente después de la transmisión e impresión.
Los sistemas computarizados para preparación de órdenes, conocidos como ingreso de orden médica computarizado
(CPOE, por sus siglas en inglés), y la transcripción de órdenes por medios electrónicos no está totalmente protegida de la posi-
bilidad de errores. Por ejemplo, se han citado fallas en el uso y en la visualización de los registros electrónicos de cuidados de la
salud, además de que pueden carecer de la personalización necesaria para preparar órdenes para poblaciones específicas tales
como pacientes pediátricos. Aunque la transmisión electrónica de datos se considera más segura con respecto a los errores de
interpretación, aún no se ha establecido con base en evidencia que la adición de decisiones asistidas en el ingreso de orden
médica computarizado constituya una intervención que garantice la seguridad. En todo momento, la aplicación de tecnología
deberá someterse a cierto grado de escrutinio al igual que los otros métodos para prevenir errores de medicación.
Preparación de Prescripciones y Preparación Magistral de Medicamentos
El área de trabajo para la preparación de prescripciones/preparación magistral de medicamentos debe diseñarse, ordenarse y
mantenerse a fin de facilitar la preparación magistral de alta calidad que cumpla con las normas de los capítulos Preparación
Magistral-PreparacionesNo Estériles (795) y PreparaciónMagistral-PreparacionesEstériles (797). El área de preparación de me-
dicamentos estériles debe estar separada del área de preparación de medicamentos no estériles (ver los capítulos (795) y
(797)). Eltránsito en el área de preparación de prescripciones/preparación magistral de medicamentos debe mantenerse al mí-
nimo permitiendo el acceso únicamente a personal autorizado. La iluminación, la temperatura y la ventilación deben ser ópti-
mas para prevenir la descomposición de ingredientes activos farmacéuticos (API,por sus siglas en inglés), excipientes y medi-
camentos. Estas medidas también pueden asegurar un lugar de trabajo en el que la incomodidad física no sea un motivo de
distracción.
La humedad debe monitorearse y controlarse, debido a que los medicamentos tienden a degradarse en presencia de hume-
dad. Debido a su efecto sobre la estabilidad y la integridad del medicamento, la humedad en las áreas de preparación magis-
tral y de almacenamiento es el segundo aspecto más importante tras la temperatura (ver los capítulo (795) y (797)). Se debe
colocar un higrómetro en una pared interna, pero alejado del retorno de aire del acondicionador, placa de calentamiento o
puerta de entrada/salida, de modo que provea una lectura representativa de la humedad relativa en el área de preparación
magistral o instalación de almacenamiento.
Los materiales usados para el piso, paredes, estantería, gabinetes y cielos rasos no deben retener polvo, olores ni residuos de
las actividades de preparación magistral. Además, el área debe estar libre de relieves que acumulen polvo (p. ej., tubos en el
cielo raso, sistemas de luces colgantes y cornisas). El área de trabajo real debe estar nivelada, lisa, impermeable (libre de grietas
y fisuras) y no deben liberar partículas, mientras que los estantes y gabinetes deben ser fáciles de limpiar.
Los medicamentos peligrosos deben ser preparados, almacenados y manipulados por personal adecuadamente capacitado
en condiciones que protejan a los trabajadores de cuidados de la salud y a los demás individuos que puedan entrar en contac-
to con estos medicamentos. La eliminación de desechos de medicamentos peligrosos debe cumplir con los reglamentos fede-
rales y estatales aplicables. Los trabajadores que lleven a cabo el mantenimiento de rutina de las actividades de eliminación de
desechos y de limpieza en las áreas de almacenamiento y preparación de medicamentos peligrosos deben estar capacitados
para realizar los procedimientos adecuados para protegerse a sí mismos y para prevenir la contaminación del ambiente físico.
Esta capacitación debe incluir los procedimientos que deben seguirse en caso de derrames.
Para la preparación magistral estéril, la unidad de control de ingeniería primario (CIP) debe colocarse en un lugar donde
minimizará el ruido y evitará condiciones que podrían afectar de manera adversa su operación. Por ejemplo, las corrientes de
aire fuertes de las puertas abiertas, el tránsito de personal o las corrientes de aire de los sistemas de HVACpueden afectar el
flujo de aire unidireccional de las mesas de trabajo abiertas. El control de ingeniería primario debe colocarse fuera del flujo del
tránsito en una posición que evitará interrupciones en el sistema de HVACy corrientes de aire cruzadas en la habitación. En
general, la selección e instalación de todo el equipo debe realizarse con el objetivo de crear condiciones óptimas de trabajo,
con ruido mínimo y suficiente iluminación, de modo que el personal pueda realizar un trabajo exacto y de alta calidad (ver el
capítulo (797)).
Dispensación
Existen muchas distracciones potenciales en las áreas de dispensación de farmacias y otras áreas en las que se dispensan los
medicamentos. Estas distracciones pueden incluir el sonido de los teléfonos e interrupciones de pacientes, personal, visitantes,
entre otros. Las distracciones deben ser minimizadas o eliminadas en la mayor medida posible. Aunque las funciones de dis-
pensación a menudo requieren la atención dividida en tareas múltiples, lo óptimo es preparar, procesar y verificar una sola
prescripción u orden de medicación a la vez. La verificación final debe ser realizada por un farmacéutico o profesional autoriza-
do y con licencia en un área libre de distracciones. Algunos puntos adicionales incluyen:
• Se debe contar con iluminación necesaria debido a que las etiquetas de algunos envases tienen impresiones muy peque-
ñas o con colores muy tenues.
• Los niveles de ruido deben mantenerse al mínimo (ver la Tabla2), lo cual puede requerir el traslado de un equipo ruidoso
a una habitación diferente, o por lo menos el uso de un tabique para separarlo.
• Los olores en el entorno de farmacia deben controlarse usando sistemas de ventilación apropiados, los cuales deben man-
tenerse apropiadamente y monitorearse de manera periódica. Las farmacias contienen una combinación de olores que
resultan del almacenamiento, de la preparación y la dispensación de los medicamentos mismos; los olores también ema-
nan de otros artículos tales como agentes desinfectantes.
• La temperatura debe mantenerse a niveles apropiados para la comodidad del personal de farmacia y para la estabilidad de
los productos farmacéuticos.
• El espacio de trabajo de la farmacia debe estar diseñado para mejorar la eficiencia del flujo de trabajo y para mantener la
seguridad a lo largo de todo el proceso de dispensación.
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Administración
Algunas zonas de seguridad para medicación de importancia crítica para el personal de enfermería incluyen las áreas de pre-
paración y administración de medicamentos. La información debe estar disponible al momento en un formato fácil de usar
que ayude al profesional en el proceso de sintetizar los hechos y datos. El acceso a la información relacionada con los medica-
mentos debe ser eficiente, con materiales y registros disponibles en los sitios adecuados. Por ejemplo, el personal de enferme-
ría puede requerir información de los medicamentos y datos específicos del paciente para tomar decisiones sobre la adminis-
tración del medicamento¡ por lo tanto estos dos tipos de información deben estar cerca uno del otro para facilitar el descubri-
miento de los hechos y/o la toma de decisiones. Las diversas fuentes de información dentro de un espacio se deben ordenar
de acuerdo con principios específicos para disminuir las distracciones al momento de buscar información y de tomar decisio-
nes. El personal de enfermería también debe ser consciente de factores adicionales al administrar medicamentos, p. ej., ilumi-
nación, desorden, olor, niveles de ruido y temperatura.
ElAmbiente Hogareño
El ambiente de cuidados de la salud en el hogar del paciente difiere al ambiente hospitalario u otros ambientes instituciona-
les en varios aspectos. Por ejemplo, los médicos reconocen que el entorno de cuidado de la salud en el hogar es el dominio
privado del paciente. Por ende, el cuidado que proveen a cada paciente debe ser único e individualizado, basado en gran me-
dida en dicho entorno hogareño. Existen variables relacionadas con situaciones en el hogar del paciente que presentan riesgos
para el paciente y que son difíciles o imposibles de eliminar para los médicos. Por ejemplo, los hospitales cuentan con departa-
mentos de seguridad ambiental para monitorear la calidad del aire, así como diseñadores/ingenieros para asegurar que la altu-
ra de los escalones de las escaleras sean seguras¡ sin embargo, los profesionales de la salud a domicilio pueden no tener la
capacitación o recursos necesarios para evaluar y mejorar dichos riesgos en el hogar del paciente.
No obstante, el paciente y las personas que cuidan de él pueden promover un ambiente seguro en la vivienda estableciendo
un almacenamiento, una organización y accesibilidad apropiados para los medicamentos, así como una iluminación adecuada
en las áreas en las que se administran medicamentos. También se deben evaluar otros diversos elementos físicos para facilitar la
manipulación y la administración seguras de medicamentos. La vivienda debe contar con un servicio telefónico confiable, con
un área adecuada para preparar y administrar medicamentos (p. ej., infusiones parenterales) y tomacorrientes en buen estado
y seguros para cualquier equipo requerido. Todos los medicamentos deben almacenarse de modo tal que se facilite el cumpli-
miento y la seguridad de estos. Los sitios de almacenamiento deben estar secos y frescos. Los medicamentos que requieren
refrigeración deben almacenarse en áreas en las que no se congelen. Todos los medicamentos, ya sea de venta bajo receta o
de venta libre, deben mantenerse fuera del alcance de los niños, mascotas, o adultos con trastornos o discapacidades menta-
les.
FACTORES
DELAMBIENTEFÍSICO
La interferencia sensorial que resulta de temperaturas extremas, ruido, poca iluminación, superficies encandilantes, interrup-
ciones y desorden pueden interferir con la memoria de trabajo y con el desempeño de los profesionales del cuidado de la sa-
lud. Las guías descritas en este capítulo para el ambiente físico deben aplicarse a zonas de seguridad para la medicación.
Iluminación
Los niveles adecuados de iluminación pueden mejorar tanto la exactitud como la eficiencia del desempeño. Un incremento
en los niveles de iluminación de 450 a 1460 lux (45-146 fe) en una farmacia para pacientes ambulatorios con elevada carga
de trabajo mejoró significativamente la exactitud en la preparación de prescripciones, de 96,2% a 97,4%. A través de un estu-
dio se demostró que los farmacéuticos que calificaban los niveles de iluminación como "mínimo suficiente" detectaron 38%
más errores durante la preparación de prescripciones. Además, a medida que aumenta la fatiga visual durante un turno de
trabajo, se requiere una mejor iluminación. Los farmacéuticos que usaron luces para tareas específicas para aumentar la ilumi-
nación registraron una reducción del 10,7% de error en la verificación de productos. Un estudio de iluminación en viviendas,
oficinas y espacios públicos encontró niveles menores a los recomendados para la lectura, y también relacionó el desempeño
con la edad. Se debe poner énfasis en la prevención de errores de medicación ocasionados directa o indirectamente por la baja
iluminación. Por ejemplo, el informe de un incidente indicó que la poca iluminación había contribuido a la inadecuada cone-
xión de un dispositivo de administración de analgésico controlado por el paciente (PCA, por sus siglas en inglés), lo que oca-
sionó que el medicamento se derramara sobre el piso e impidió que el paciente pudiera controlar el dolor. La baja iluminación
hacía difícil observar que el tubo no estaba conectado adecuadamente. Un estudio de iluminación en una farmacia minorista
reveló un error relacionado con el contenido y la forma farmacéutica: se usaron cápsulas de diciclomina de 1O mg para prepa-
rar una prescripción de tabletas de 20 mg. El nivel de iluminación del estante en el que se encontraban los medicamentos era
de 220 lux (22 pe).
Las recomendaciones descritas en este capítulo tienen en cuenta la necesidad de trabajar rápidamente y con exactitud du-
rante la manipulación de medicamentos, el nivel de visibilidad requerido por la tarea y la comodidad del trabajador. Tanto
USP42 Información General/ (1066) Ambientes Físicos 771 3
arquitectos como ingenieros de iluminación pueden consultar la referencia "Lighting for Hospitals and Healthcare Facilities"
(Iluminación para Hospitales e Instalaciones de Cuidado de la Salud) de la llluminating Engineering Society of North America
(IESNA)para detalles sobre la iluminación de las áreas de medicación. Es importante tomar en cuenta que los niveles de ilumi-
nancia recomendados en la referencia de la IESNAestán por debajo de los citados en esta guía, que son mayores debido a las
evidencias sobre la relación inversa entre los niveles de iluminación y los errores de medicación. Se recomiendan lámparas fluo-
rescentes de luz blanca fría de lujo o lámparas fluorescentes compactas por su índice de reproducción cromática de 80 o más y
porque tienen una alta eficiencia en comparación con las lámparas incandescentes. Proveer el índice de reproducción cromáti-
ca recomendado puede ayudar a evitar la identificación errónea de medicamentos.
Cuando los niveles de iluminancia del ambiente están por debajo de los recomendados es necesario usar luces localizadas
para tareas específicas (iluminación funcional) en las áreas donde se realizan tareas visuales críticas. Si no se cuenta con ilumi-
nación funcional, los trabajadores pueden proyectar sombras sobre el espacio de trabajo, lo cual reducirá aún más los niveles
de iluminación. Las tareas críticas incluyen la lectura de prescripciones escritas a mano y de letra pequeña en etiquetas, así
como la inspección de formas farmacéuticas de medicamentos. Debido a que las personas perciben de manera distinta los ni-
veles de iluminación, se recomiendan luces funcionales ajustables de 50 watts de alta intensidad para situaciones en las que el
personal se enfrente con prescripciones y etiquetas de productos difíciles de leer, tales como etiquetas de envases de dosis úni-
ca. Los niveles de iluminación son importantes para los profesionales de la salud implicados en el ingreso de órdenes al compu-
tador (p. ej., médicos o farmacéuticos), preparación de prescripciones, inspección y asesoría al paciente. Los niveles de ilumi-
nación para las áreas de ingreso de órdenes al computador deben ser de al menos 750 lux (75 pe). Se recomiendan niveles
más altos [l 000 lux (100 fe)] para leer órdenes escritas a mano.
La iluminación se debe colocar de manera que no se produzca reflejo en el monitor del computador que dificulte leer la
pantalla con exactitud. Las áreas de preparación de prescripciones, las estaciones de inspección de medicamentos (para doble
verificación) y de asesoría deben presentar niveles de iluminación entre 900 y 1500 lux (90-150 fe). Todas estas normas están
por encima del mínimo de 200 lux (20 pe) para una lectura exacta de las etiquetas de los medicamentos, establecidas por la
American Society for Testing and Materials lnternational (ASTMlntemational). Una norma de ASTM lnternational incluye una
prueba de legibilidad en la que se requiere que el nombre y la cantidad del fármaco en la etiqueta sea legible a 20 pe de luz a
una distancia de aproximadamente 20 pulgadas (500 mm) por una persona con una visión no asistida o corregida de 20/20.
Los niveles de iluminación se deben incrementar cuando téngalos trabajadores tengan una edad promedio superior a 45 años
para optimizar la legibilidad (recomendación general para el tratamiento de presbicia). Se recomienda que los profesionales de
la salud cuenten con una lupa que les ayude a leer con cuidado etiquetas con inscripciones de letras muy pequeñas y en situa-
ciones en las que no sea posible evitar bajos niveles de iluminación. El uso de una lupa en conjunto con iluminación funcional
redujo en 22% los errores de verificación de productos por parte de los farmacéuticos, en comparación con un grupo de con-
trol.
Para el personal de enfermería, las tareas clave relacionadas con la medicación que requieren de buena iluminación incluyen
la revisión de órdenes de medicamentos y la selección, preparación y administración de los medicamentos. Es posible que es-
tas tareas se lleven a cabo en uno o más lugares en la unidad de enfermería, como por ejemplo en la estación de enfermería
donde se almacenan los historiales de los pacientes, la sala de medicación o la habitación del paciente. Se recomienda la ilumi-
nación transicional para las áreas de medicación en las estaciones de enfermería y otras unidades de cuidado del paciente para
evitar sitios oscuros y sitios de luz intensa próximos a áreas de baja iluminación. La iluminación debe permitir una buena repro-
ducción cromática (un índice de reproducción cromática de 80 o más) para ayudar a la revisión apropiada de medicamentos.
La iluminación funcional puede ayudar a conseguir niveles apropiados de iluminación y se debe incluir en los carros de medi-
camentos (incluyendo aquellos que usan sistemas de verificación de código de barras de medicamentos). Se debe controlar el
reflejo asegurando que no haya reflejos de luz que pudieran incidir en la pantalla dificultando la lectura de los monitores de los
computadores.
Los niveles de iluminación para las salas de medicación en las unidades de enfermería deben ser de al menos 1000 lux (100
pe) basándose en la complejidad de la tarea (p. ej., en la lectura de letra pequeña en los envases de medicamentos) y la necesi-
dad de exactitud y velocidad. Se debe usar un intervalo mayor de nivel de iluminación cuando la tarea requiere la lectura de
letra pequeña. Las recomendaciones para niveles de iluminación se resumen en la Tabla 1. Con el paso del tiempo, los niveles
de iluminación pueden sufrir una reducción (p. ej., del 25% durante un periodo de 2 años) por lo que es importante dar man-
tenimiento a las lámparas de manera rutinaria para mantener los niveles de iluminación recomendados. Los niveles de ilumina-
ción deben medirse cada tres meses. Las bombillas quemadas o parpadeantes deben reemplazarse de inmediato.
Tabla 1. Recomendaciones para Niveles de llumlnaclón en Entornos de Cuidado de la Salud
Nlvel de llumlnaclón
Ple-Candela
Área de Trabajo Lux (pe)
Ingreso de órdenes al computador 1000 100
Procesamientode órdenes escritas a mano 1000 100
Preparacióny verificaciónde medicamentos (farmacia) 900-1500 90-150
Asesoríaal paciente (farmacia) 900-1500 90-150
Preparaciónmagistral estérily preparación de medicamentos 1000-1500 100-150
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Tabla 1. Recomendaciones para Niveles de Iluminación en Entomos de Cuidado de la Salud (Continuación)

Nivel de Iluminación
Ple-Candela
Área de Trabalo Lux (pe)
Área de almacenamiento de medicamentos de la farmacia 500 50
Área de preparación de medicamentos (p. ej., estación de enfermería) 1000 100
Área de trabajo de administración de medicamentos (p. ej., superficie del carro, habita-
ción del paciente) 1000 100
La iluminación apropiada también es esencial en el sitio donde se proporcionan los cuidados. Intentar que la iluminación sea
cómoda para pacientes y familiares puede resultar contrario a las condiciones de iluminación necesarias para la administración
segura de medicamentos. La administración de medicamentos por la noche con baja iluminación para evitar molestar al pa-
ciente o a los familiares es una práctica insegura. Se debe contar con iluminación funcional o localizada, de manera que los
profesionales puedan confirmar visualmente que tratan al paciente correcto (leyendo el brazalete o mediante otra tecnología
de identificación), y de modo que no se comprometa el medicamento y el sitio de administración. Las lámparas fluorescentes
compactas requieren cierto tiempo para alcanzar el nivel de iluminación correcto. Por lo tanto, no se deben realizar tareas críti-
cas sino hasta que la luz alcance el nivel requerido.
Recomendaciones para Sonido y Ruido

En el caso de hospitales, la Environmental Protection Agency (Agencia de Protección Ambiental de EE.UU.o EPA)recomien-
da niveles pico de sonido de 45 dB durante el día y 35 dB durante la noche en hospitales. Las guías de la Organización Mun-
dial de la Salud (OMS) establecen que los niveles de sonido de fondo en las habitaciones de los pacientes no deben exceder de
35 dB. El lnternational Noise Council (Consejo Internacional sobre Ruido) recomienda límites de 45 dB durante el día y de 20
dB durante la noche para áreas de cuidados agudos. Es necesario usar protección para los oídos cuando los trabajadores estén
expuestos a niveles de sonido que promedien 90 dB. Las recomendaciones para niveles de sonido se indican en la Tabla2.
Tabla 2. Recomendaciones de Niveles Pico de Sonido
Área de Trabalo Fuenteª Niveles de Sonido (dB)
Hospitales (día) EPA 45
Hospitales (noche) EPA 35
Habitación del paciente OMS 35
Áreas de cuidados agudos (día) INC 45
Áreas de cuidados aqudos (noche) INC 20
Protección auditiva requerida INC 90 (promedio)
Zonas de sequridad para medicación - 50
ª EPA,Environmental Protection Agency (Agencia de Protección Ambienta0; OMS, Organización Mundial de la Salud; INC, lntemational Noise Council (Consejo
Internacional de Ruido).
La norma para niveles de sonido en las zonas de seguridad para medicación se establece en 45 dB, con la intención de ase-
gurar que la información verbal crítica se pueda escuchar con exactitud. Sin embargo, muchas de las áreas de preparación
magistral y de dispensación de farmacias rebasarán dicha norma. Los profesionales de la salud deben ser conscientes de sus
propias necesidades de silencio, dependiendo de la tarea realizada, y deben contar con un área silenciosa para favorecer el
desempeño apropiado. La eliminación total de ruido en instalaciones de cuidados del paciente no es factible ni deseable. Las
áreas de asesoramiento de pacientes en las farmacias deben incluir métodos de reducción de sonido (p. ej., el uso de una sala
cerrada) para mejorar la audición, el aprendizaje y la privacidad.
El ruido en exceso se considera como un riesgo serio para la salud de los pacientes. Se debe tener en cuenta su efecto sobre
los pacientes hospitalizados y su potencial interferencia con el desempeño efectivo del trabajo de los médicos. La mayoría de
los estudios sobre los efectos del ruido en el ambiente de trabajo han sido realizados en entornos no relacionados con el cuida-
do de la salud. No obstante, se documenta cada vez con más frecuencia que los niveles de ruido son un factor que contribuye
al estrés del personal de enfermería. En los centros de cuidados de la salud, las fuentes de ruido pueden incluir desde sistemas
de radiolocalización de personas, alarmas de equipos, sistemas de calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC),cañe-
rías, televisores y radios hasta máquinas de hielo. Se ha citado al ruido como un obstáculo para el desempeño adecuado del
personal de enfermería. Un estudio exhaustivo desarrolló un mapa de ruido de un hospital en el que se encontraron niveles de
sonido de 55 dB, lo que representa 10-20 dB por encima de las recomendaciones de la EPAdependiendo de la hora del día.
Los niveles de sonido promedio en otros hospitales han presentado mediciones entre 45 y 68 dB, con picos entre 85 y 90 dB.
Un estudio de niveles de sonido durante cambios de turno presentó mediciones de 11 3 dB.
La exactitud al dispensar un medicamento puede verse afectada por características específicas del sonido/ruido, p. ej., si es
predecible y si puede ser controlado. Estos factores pueden confundir las señales ambientales y la voz interna del trabajador,
usadas para practicar y recordar tareas importantes. De 58 estudios, 7 mostraron que el ruido mejoraba el desempeño, al con-
trario de 29 que mostraron que el ruido lo perjudicaba. Un estudio mostró que los sonidos y ruidos impredecibles pero contro-
lables mejoran la exactitud de la preparación de prescripciones, contrario a lo mostrado por investigaciones anteriores. Lo an-
terior puede ser indicativo de que es necesario cierto estímulo ambiental para mantener a los trabajadores en un estado de
alerta y atención adecuados. Los investigadores intentan identificar niveles óptimos de reacción debida al sonido y al ruido
para las personas que realizan diferentes tipos de tareas (p.ej. la ley de Yerkes-Dodson).
Los efectos adversos de ruido y demás interferencias sensoriales pueden reducirse usando actividades, herramientas y princi-
pios desarrollados por expertos en factores humanos e ingeniería. Muchos de estos principios y herramientas ya se usan en
algunas organizaciones dedicadas al cuidado de la salud. Los investigadores se encuentran estudiando y evaluando los efectos
que tienen estos y otras características del diseño de los espacios de trabajo de enfermería sobre el estado final de los pacientes
y el desempeño del centro de atención; uno de estos estudios es el auspiciado por The Center for Health Design, una organiza-
ción de investigación y promoción sin fines de lucro, y una red de 11 proveedores de servicios de la salud (http://www.health-
design.org/pebble). Los datos han mostrado reducciones en errores médicos, transferencias de pacientes, infecciones intrahos-
pitalarias, caídas de pacientes y uso de medicamentos. Cuando lo permitan las guías de control de infecciones, se puede lograr
la reducción del ruido a un costo moderado mediante la instalación de materiales que puedan absorber el sonido (p.ej. mate-
riales de cielos rasos y paredes, y alfombras). Los ingenieros acústicos pueden proveer métodos adicionales para la reducción
de ruido. Además, los trabajadores que no necesitan responder a señales audibles tales como llamadas telefónicas o alarmas
pueden usar auriculares con cancelación de ruido y escuchar música, siempre que su desempeño no se vea afectado de mane-
ra adversa.
Olor
Las áreas en los que se almacenan o manipulan los productos farmacéuticos tienden a presentar un olor que es característico
de los fármacos correspondientes. Dichos olores a menudo pueden minimizarse usando sistemas de acondicionamiento/
extracción de aire. La calidad del ambiente en interiores (IEQ, por sus siglas en inglés) puede estar asociada a los productos
químicos y otras fuentes. Los olores detectados en casi todos los ambientes de trabajo pueden derivarse de materiales de cala-
fateo, selladores, recubrimientos, adhesivos, pinturas, barnices, manchas, papel tapiz, agentes de limpieza, combustibles y pro-
ductos de combustión, alfombras, pisos de vinilo, materiales de telas, desodorantes ambientales y otros productos perfuma-
dos, así como productos personales de los empleados (p. ej., perfumes, champús, entre otros). Si no se controlan estos olores,
pueden surgir problemas con la calidad del ambiente en interiores, en particular si el sistema de ventilación del edifico no
cuenta con un diseño apropiado o recibe un mantenimiento deficiente. La calidad del ambiente en interiores puede mejorarse
-
instalando sistemas de extracción apropiados para eliminar los olores que emanan de los medicamentos. Esto puede incluir
instalaciones de "extracción por tubo de aireación" cercanas al lugar donde se manipulan los medicamentos, así como campa-
nas de extracción tipo gabinete. Otras medidas que pueden ser útiles incluyen establecer zonas libres de perfumes, prohibir
fumar y no permitir el almacenamiento o consumo de alimentos en las inmediaciones. La práctica de introducir olores agrada-
bles en el lugar de trabajo puede o no ser beneficiosa, pero regular la respuesta a los olores y factores irritantes es crítico para
mantener la salud y el bienestar de los trabajadores.
Controlesde Temperatura y Humedad
El control de temperatura es importante para la estabilidad del medicamento y para la comodidad del personal. En una ha-
bitación que contiene algún equipo (p.ej. campanas de flujo de aire laminar), tiende a generarse calor y, por lo tanto, se deben
diseñar e implementar medidas de control de temperatura apropiadas.
En algunas situaciones tales como en la elaboración de preparaciones magistrales, es importante controlar la humedad y mi-
nimizar así la estática en los polvos, envasado y otras formas farmacéuticas (ver (795) y (797)). El control de humedad también
es importante para aparatos tecnológicos relacionados, tales como computadoras, tabletas electrónicas y máquinas de dispen-
sación automatizadas. La temperatura del núcleo de la unidad central de procesamiento de las computadoras debe ser entre
1Oº y 32º C, y el índice de humedad ideal es entre 30% y 50%.
Evaluacióndel Diseño Físicoy de la Organización del Espaciode Trabajo
El diseño del ambiente del espacio de trabajo influye sobre la capacidad de los profesionales para utilizar información de
manera efectiva y realizar tareas con exactitud. La altura del mostrador, de los estantes para el almacenamiento de suministros
y los cambios de iluminación en los cajones y gabinetes inferiores que reducen la visibilidad de productos pueden contribuir a
errores si no se ajustan adecuadamente. La integración eficaz de accesorios de iluminación y altura de mostradores ajustables,
junto con el uso de carros móviles, puede mejorar la eficiencia y la seguridad. El desorden en los mostradores de trabajo y la
falta de espacio suficiente para realizar tareas clave es comúnmente un indicador de desorganización y planificación deficiente.
Un estudio demostró que ocurrían más errores de dispensación cuando los envases de almacenamiento de medicamentos se
colocaban amontonados en los estantes (a menos del pulgada entre medicamentos diferentes). Al seleccionar el mobiliario
apropiado, se pueden usar listas de verificación de diseño basado en evidencia para mobiliario a fin de tomar decisiones infor-
madas de inversión y mejorar los resultados de los cuidados de la salud (ver la Tabla3 para una lista de verificación completa).
7716 (1066) Ambientes Físicos / Información General USP42
Tabla 3. Lista de Verificación de Dlselio Basado en Evidencias

Hallazgos Objetivos y Características del Dlselio Basado en Evidenciasª
1. Reducir contaminación superficial vinculada a infecciones asociadas con los cuidados de la salud
a. Las superficies pueden limpiarse fácilmente, la superficie no tiene juntas ni uniones.
b. Los materiales de tapicería son impermeables (sin poros).
c. Las superficies son lisas y sin poros.
2. Reducir las caídas de pacientes y lesiones asociadas
a. La altura de la silla puede ajustarse.
b. La silla tiene descansabrazos.
c. El espacio debajo de la silla admite cambios de posición de los pies.
d. El ángulo de inclinación posterior del asiento y el reclinado del respaldo de la silla facilitan la salida del paciente.
e. Las sillas son firmes, estables y no pueden voltearse fácilmente.
f. El mobiliario con rueditas incluye rueditas con sistema de bloqueo.
g. Las sillas no tienen bordes puntiagudos o rígidos que pudieran lastimar a los pacientes que caen o que tropiezan.
3. Reducción de errores de medicación
a. Las lámparas deben proveer una iluminación de 90-150 pies-candela y una lámpara funcional de alta intensidad ajustable
de 50 vatios para mobiliario con luz integrada que se usa en una zona de seguridad de medicación.
b. El mobiliario se puede configurar para crear una sensación de privacidad a fin de minimizar las distracciones visuales e
interrupciones por sonido y ruido durante las actividades de transcripción, preparación, dispensación y administración de
medicamentos.
4. Mejorar la comunicación y el apoyo social para pacientes y familiares
a. El mobiliario puede configurarse en grupos pequeños y flexibles que se pueden ajustar fácilmente para acomodar un nú-
mero variable de individuos en diversos entornos de cuidados de la salud.
b. Se recomienda que el mobiliario sea variado en ancho y edad.
c. Se recomienda que el mobiliario sea compatible con la privacidad acústica y visual del paciente.
5. Reducir el estrés y la fatiga de pacientes, familiares y personal
a. Materiales que sugieren un vínculo con la naturaleza.
b. Apariencia atractiva y sin carácter institucional.
c. Se prueba la seguridad y el uso confortable del mobiliario para todas las personas, incluyendo personas que padezcan de
obesidad mórbida.
6. Mejorar la efectividad, la eficiencia y la comunicación del personal
a. El mobiliario puede ajustarse fácilmente a las necesidades ergonómicas de cada trabajador.
b. El diseño permite la coordinación y el intercambio cuidadosos de información.
c. Los materiales absorben el sonido.
7. Mejorar la seguridad ambiental
a. Los materiales no contienen compuestos orgánicos volátiles, tales como formaldehído y benceno.
8. Representar la mejor inversión
a. Reflejar y reforzar la misión, los objetivos estratégicos y la marca de la organización.
b. Integrar el mobiliario y objetos nuevos con los existentes en los proyectos de renovación de las instalaciones.
c. Las partes pueden reconfigurarse con flexibilidad y moverse para sustentar misiones de cambio y aquéllas emergentes.
d. Colocar rueditas o dispositivos de deslizamiento para reducir daños en el piso.
e. Verificar que no haya protuberancias que pudieran dañar las paredes; verificar las alturas de los rieles para sillas.
f. Elfabricante provee resultados sobre las pruebas de seguridad y durabilidad.
g. Elfabricante describe la evidencia específica que se ha usado para diseñar el producto.
h. Elfabricante incluye una garantía apropiada para el uso, por ejemplo, para mobiliario que se usa todo el día, todos los
días.
i. Se encuentran disponibles partes de reemplazo.
j. Las reparaciones pueden realizarse en la instalación de cuidados de la salud.
k. El fabricante o distribuidor local puede ayudar con la reparación y renovación de mobiliario.
l. El personal de servicios ambientales/limpieza puede realizar fácilmente el mantenimiento del mobiliario.
m. Se puede usar una Organización para Compras Grupales al adquirir mobiliario.
Escala de hallazgos:
Presente(+), Ausente(-), Se requiere más información(?), No aplica (N/A).
ª Malone EB,Dellinger BA FumitureDesignFeaturesand Hea/thcareOutcomes.The Center for Health Design; 2011 (ver https://www.healthdesign.org/chd/
research/fumiture-design-features-and-healthcare-outcomes).
MÉTODOSDE EVALUACIÓN
DELAMBIENTEFÍSICO
Iluminación
Un medidor de iluminación, también llamado medidor de nivel de luz o fotómetro, es un instrumento que consiste en un
fotodetector (con una pantalla digital o análoga) que mide la iluminancia en lux o pie-candela (pe). Los niveles de iluminación
se deben evaluar en las zonas de seguridad para la medicación usando mediciones de iluminancia en puntos específicos. Para
esto, el fotodetector se debe colocar en el área donde se realiza la tarea crítica de medicación (p. ej., inspección de medica-
mentos en el mostrador de trabajo), con el trabajador en una posición normal de trabajo al momento de tomar la medición.
Las mediciones en áreas de almacenamiento de medicamentos deben incluir niveles de luz en los estantes superiores, medios e
inferiores, debido a que los niveles de luz dependen de la distancia a la fuente de iluminación. Los fotómetros están disponi-
bles comercialmente o se pueden obtener de los ingenieros de gestión, y deben recalibrarse cada año.
Los niveles de iluminación también pueden medirse usando una aplicación de "Medición de Luz" para teléfono celular inteli-
gente. Estas aplicaciones son baratas y fáciles de usar, y se descargan de manera simple a un teléfono celular inteligente, en el
cual, al iniciar la aplicación, se debe apuntar la cámara del teléfono a un área/superficie iluminada y se presiona el botón en-
cendido/apagado de la aplicación. El dispositivo realiza mediciones y provee una descripción de las actividades apropiadas pa-
ra los niveles de luz marcados. Las aplicaciones pueden calibrarse y se puede ajustar su sensibilidad, ofreciendo lecturas en lux
o pie-candela.
Niveles de Sonido
Para medir los niveles de sonido se deben usar medidores de nivel de sonido capaces de leer de 30 a 130 decibeles (dBA) en
la escala A. La escala A se usa comúnmente para medir decibeles debido a que es la representación más cercana del oído hu-
mano en términos de intensidad sonora. Los medidores se deben calibrar antes de cada uso. Las mediciones se toman en la
posición de trabajo, usando las instrucciones provistas en el manual del medidor de sonido específico. Los medidores Tipo 1 o
Tipo 2 presentan niveles aceptables de exactitud. Los niveles de sonido también pueden medirse de manera fácil y barata
usando una aplicación para teléfono inteligente, la cual se descarga al teléfono inteligente y se seleccionan las opciones de
lectura. Posteriormente, se activa el modo de medición y éste continúa proveyendo una lectura completa de la frecuencia (eje
x) y de los niveles de presión de sonido en decibeles (eje y) en tiempo real.
Detección de Olores
Los olores pueden ser detectados por personas, pero este método es muy subjetivo. Algunos olores indican la presencia de
una entidad o unidad química específica. Sin embargo, pueden no estar disponibles dispositivos de medición apropiados para
su uso en el ambiente de trabajo o estos pueden no ser prácticos. Por consiguiente, puede ser necesario seleccionar un panel
de individuos para categorizar lo que es y no es aceptable en términos de olores en el ambiente de trabajo. Los sistemas de
HVACapropiados pueden desempeñar un papel en la reducción de olores.
Medición de la Temperatura y la Humedad

La temperatura por lo general se mide con termómetros digitales, mientras que la humedad se mide con higrómetros. En
ambos casos, un instrumento de registro (p. ej., termómetro de registro) ofrece la ventaja de la documentación.
RESUMEN
Desde el siglo XIX,Florence Nightingale identificó la importancia de los ambientes físicos para la sanación del paciente, pero
no fue sino hasta tiempos recientes en que se estableció que el ambiente físico puede favorecer el desempeño de las tareas
críticas realizadas por el personal de cuidados de la salud para proteger al paciente de daños iatrogénicos. En la actualidad, los
errores de medicación se reconocen como complejos, multifactoriales y dependientes de sistemas, y ha sido complicado lograr
un entendimiento científico cabal sobre la prevención de errores. Sin embargo, el consejo de Nightingale que dice "pero espe-
cialmente, no causa daño", nos compromete a usar la evidencia más actualizada para prácticas seguras en los cuidados de la
salud a fin de prevenir errores y proteger al paciente. Los aspectos y consideraciones del ambiente físico de trabajo tratados en
este capítulo general no son exhaustivos, pero pueden servir como estímulo para la evaluación de los espacios de trabajo exis-
tentes y para tener en cuenta la evidencia más reciente sobre la ciencia de los factores humanos en el diseño de nuevas instala-
ciones. El componente remanente que no se trata en este capítulo general es el profesional de la salud que trabaja en condi-
ciones arduas quien, con la mejor intención, podría contribuir a daños para el paciente a través de acciones inadvertidas cuan-
do las condiciones de trabajo están por debajo de las normas. El ambiente físico de trabajo debe estructurarse a fin de susten-
tar y promover la provisión segura de cuidados y para prevenir daños a los pacientes, al tiempo que se apuntala la práctica de
los cuidados de la salud por parte de los médicos.
GLOSARIO
Administración:Preparación, inmediatamente antes del uso, de un agente farmacológico u otro agente terapéutico para
ingestión, inyección, inserción o aplicación.
Índice de ReproducciónCromática (IRC): Es una expresión de la forma en que una fuente de luz afecta la apariencia del
color de los objetos o de los humanos en comparación a cómo deberían verse bajo una fuente de luz de referencia.
PreparaciónMagistral: Preparación, mezclado, ensamblado, alteración, envasado y etiquetado de un medicamento, dis-
positivo de liberación de medicamento o dispositivo de acuerdo con la prescripción, orden de medicación o iniciativa de
un profesional autorizado basada en la relación médico/paciente/farmacéutico/preparador magistral durante el curso de
la práctica profesional.
Restricción:Es una regla que indica en qué condiciones se permite o prohíbe realizar una acción. Las restricciones se usan
en el diseño de procedimientos o herramientas para prevenir prácticas inseguras.
4
7718 (1066) Ambientes Físicos/ InformaciónGeneral USP42
Congestionamiento: Condición que ocurre cuando múltiples trabajadores usan el mismo espacio de trabajo, afectando
de manera adversa la cantidad de espacio disponible para cada individuo, y además incrementando los factores negativos
de distracciones, interrupciones y ruido.
Decibel: Unidad usada para medir la intensidad de un sonido comparándolo con un nivel estándar en una escala logarít-
mica, indicando así el grado de intensidad sonora. Comúnmente se usa la escala A para medir decibeles debido a que es
la representación más cercana de la percepción del oído humano en términos de intensidad sonora.
Dispensación: Acción de proveer una medicación o una prescripción; preparar una prescripción.
Distracción: Estímulo externo que se presenta cuando una persona está enfocada en una tarea o actividad el cual ocasio-
na una perturbación cognitiva o emocional, pero que no resulta en la interrupción de la actividad, por ejemplo, el timbre
de un teléfono o una pregunta de un compañero de trabajo.
Diseño ergonómico: Se refiere a un espacio de trabajo que se acomoda a las capacidades y limitaciones de cada indivi-
duo, permitiendo un trabajo de manera segura y eficiente. Esto incluye un ambiente óptimo y mobiliario ajustable.
Función de restricción: Es un aspecto del diseño que impide que se realice una acción determinada o que permite que se
realice solamente si otra acción se realiza primero.
Factores Humanos: Disciplina científica relacionada con las interacciones entre humanos y demás elementos de un siste-
ma, así como la profesión que aplica teorías, principios, datos y métodos para diseñar sistemas que optimicen el bienestar
humano y el desempeño general del sistema.
Nivel de iluminación: La cantidad de energía luminosa que alcanza un área que se mide (en lux o pie-candela) mediante
un fotómetro con un sensor de iluminancia e indica la luminosidad. Un lux es una unidad de iluminancia, medida en lú-
menes por metro cuadrado. Un pie-candela (pe) es lúmenes/pie cuadrado, y también se mide comúnmente en metros de
luz. El término candela reemplazó a pie-candela como medida del Sistema Internacional para intensidad luminosa y repre-
senta 1 lumen/estereorradián (lm/sr).
Interrupción: El cese de una actividad productiva antes de completar una tarea, ocasionado por estímulos impuestos de
forma externa.
Producción optimizada: Los resultados de trabajo de alta calidad, a la vez que se elimina el desperdicio y se reducen
recursos, tiempo y errores.
Zona de Seguridad para Medicación: Área crítica donde se prescriben los medicamentos, se ingresan las órdenes en el
computador o se transcriben a documentos en papel, o donde se preparan las prescripciones/preparan o administran los
medicamentos. Las características de un ambiente físico óptimo para el uso apropiado de medicamentos se deben aplicar
a las zonas de seguridad para medicación.
Atención Dividida en Tareas Múltiples: Capacidad de los seres humanos para realizar múltiples tareas en simultáneo.
Ruido y sonido: El ruido se define como un estímulo auditivo que no guarda relación informativa con la tarea realizada. El
sonido es un cambio en el volumen que guarda alguna relación informativa con la tarea que se realiza. Un ambiente de
trabajo silencioso se define como un área ausente de ruido y donde el trabajador se encuentra libre de perturbaciones.
Pasar por alto (override): Neutralizar o contrarrestar la acción de un control automático.
Fotómetro: Instrumento para medir cantidades fotométricas tales como iluminancia.
Ambiente físico: El entorno que puede afectar a uno o más de los sentidos humanos.
Solución improvisada, o solución alternativa (workaround): Plan o método usado para sortear un problema (como en
un software informático) sin eliminarlo.
Condiciones de Trabajo: Conjunto de factores que incluyen el ambiente físico, personal que constituye la fuerza de tra-
bajo, diseño del flujo de trabajo, factores personales/sociales y características organizacionales.
(1072) DESINFECTANTES
Y ANTISÉPTICOS
INTRODUCCIÓN
Se requiere un programa eficaz de limpieza y sanitización de ambientes controlados en los que se fabrican artículos farmaco-
peicos para prevenir la contaminación microbiana de los mismos. Los productos farmacéuticos estériles pueden contaminarse
a través de sus ingredientes farmacéuticos, el agua usada durante el proceso de fabricación, los componentes del empaque, el
entorno de fabricación, los equipos de procesamiento y los operadores que trabajen en la fabricación de estos productos. Las
Buenas Prácticas de Fabricación vigentes (cGMPs, por sus siglas en inglés) hacen hincapié en el tamaño, diseño, construcción y
ubicación de los edificios y en los materiales empleados en la construcción, así como también en el flujo adecuado de materia-
les para facilitar la limpieza, el mantenimiento y las operaciones apropiadas para la fabricación de productos farmacéuticos.
Cuando se emplean desinfectantes en el entorno de fabricación, se debe tener cuidado para evitar la contaminación del pro-
ducto farmacéutico con desinfectantes químicos dada la toxicidad inherente de los mismos. Los requisitos para el procesa-
miento aséptico incluyen: pisos, paredes y techos fáciles de limpiar, con superficies lisas y no porosas; control de temperatura,
humedad y partículas; y procedimientos de limpieza y desinfección que provean y mantengan las condiciones asépticas. El
programa de limpieza y sanitización debería alcanzar estándares de limpieza específicos, controlar la contaminación microbia-
USP42 Información General/ (1072) Desinfectantes y Antisépticos 7719
na de productos y estar diseñado de tal modo que prevenga la contaminación química de ingredientes farmacéuticos, equipos
y superficies que entran en contacto con el producto, materiales de empaque y, esencialmente, los productos farmacéuticos.
Estos principios también aplican a las formas farmacéuticas no estériles cuya contaminación microbiana se controla mediante
la selección de ingredientes farmacéuticos, servicios y entornos de fabricación adecuados; procedimientos efectivos de limpieza
de equipos; productos especialmente formulados para controlar la actividad de agua; la inclusión de conservantes adecuados;
y el diseño del empaque del producto.
Además de desinfectantes, se usan antisépticos para descontaminar la piel humana y tejidos corporales expuestos, que el
personal puede usar antes de entrar al área de fabricación. Se pueden usar esterilizantes químicos para descontaminar superfi-
cies en las áreas de fabricación y en las de pruebas de esterilidad. Además, los esterilizantes pueden emplearse en la esteriliza-
ción de artículos farmacopeicos y la irradiación UVpuede usarse como sanitizante de superficies.
Este capítulo de información general trata de la selección de antisépticos y desinfectantes químicos adecuados; la demostra-
ción de su eficacia bactericida, fungicida y esporicida; la aplicación de desinfectantes en el área de fabricación de productos
farmacéuticos estériles; y consideraciones respecto a reglamentaciones y medidas de seguridad. La formación de biopelícula
(biofilm) y su relación con los desinfectantes se encuentran fuera del alcance de este capítulo. Cualquier información adicional
que no se encuentre en este capítulo, se la puede obtener de textos de referencia sobre desinfectantes y antisépticos. 1
DEFINICIONES
Agente de Limpieza-Agente que elimina de la superficie de las instalaciones y equipos residuos de productos que pueden
inactivar a los agentes sanitizantes o albergar microorganismos.
Agente Esporicida-Agente que destruye esporas fúngicas y bacterianas cuando se usa en una concentración suficiente du-
rante un tiempo de contacto específico. Se espera que mate todo microorganismo vegetativo.
Agente Sanitizante-Agente que reduce, en superficies inanimadas, la cantidad de toda forma de vida microbiana, inclu-
yendo hongos, virus y bacterias.
Antiséptico-Agente que inhibe o destruye microorganismos sobre un tejido vivo, incluyendo la piel, cavidades orales y he-
ridas abiertas.
Descontaminación-Eliminación de microorganismos mediante desinfección o esterilización.
Desinfectante-Agente físico o químico que al aplicarse sobre una superficie destruye o elimina formas vegetativas de mi-
croorganismos nocivos.
Desinfectante Químico-Agente químico que se emplea en superficies y objetos inanimados para destruir virus, bacterias y
hongos infecciosos, aunque no necesariamente sus esporas. Los agentes antivirales y esporicidas pueden considerarse como
una clase especial de desinfectantes. Grupos relacionados con la medicina con frecuencia caracterizan a los desinfectantes de
alto, mediano o bajo nivel según su eficacia frente a varios microorganismos.
Esterilizante-Agente que destruye toda forma de vida microbiana, incluyendo hongos, virus y todas las formas de bacte-
rias y sus esporas. Los esterilizantes son agentes líquidos o de fase vapor.
Los microorganismos difieren mucho en su resistencia a los agentes desinfectantes. En orden descendente de resistencia a
los desinfectantes químicos se listan en la Tabla 1 los microorganismos clínicamente importantes.
Tabla 1. Resistencia de Algunos Microorganismos Clínicamente Importantes a los Desinfectantes Químicos (Se Listan en Orden
Descendente de Resistencia)
TIPo de Mlcroorqanlsmos Elemplos
Esporas bacterianas Bacil/ussubtilis y C/ostridiumsporoqenes
Micobacterias Mycobacterium tuberculosis
Virus con envoltura no lipídica Poliovirus y rinovirus
Esporas fúnqicas y honqos filamentosos y levaduras veqetativas Trichophyton, Cryptococcusy Candida spp.
Bacterias vegetativas Pseudomonasaeruqinosa,Staphylococcusaureusy Salmonellaspp.
Virus con envoltura lipídica Virus herpes simple, virus de hepatitis B y virus de inmunoeficiencia humana
CLASIFICACIÓN
DE DESINFECTANTES
Los desinfectantes químicos se clasifican según su composición química. Esto incluye aldehídos, alcoholes, halógenos, peró-
xidos, compuestos de amonio cuaternario y compuestos fenólicos (ver Tabla2).
1
Ascenzi, J.M., Ed. Handbookof Disinfeetantsand Antiseptics,5 th ed.; Marcel Dekker: New York, 1995; Block, S.S., Ed. Disinfection,Sterilization,and Preservation, 5 th
ed.; lippincott Williams & Wilkins Publishers: Philadelphia, 2000. Russell, A.D.; Hugo, W.B.; Ayliffe,G.A.J., Eds. Principiesand Practicesof Disinfection,Preservation
and Sterilization,3«l ed.; Blackwell Science lnc.: London, 1999.
7720 (1072) Desinfectantes y Antisépticos / Información General USP 42
Tabla 2. Claslflcaclón General de Antisépticos, Desinfectantes y Agentes Esporlcldas

Entidad Química Clasificación Elemplo
Aldehídos Agente esporicida Glutaraldehídoal 2%
Alcoholes Desinfectante de uso general, antiséptico y Alcoholisopropílicoal 70%, alcohol al 70%
aqente antiviral
Cloro e hipoclorito de sodio Agente esporicida Hipocloritode sodio al 0,5%
Fenólicos Desinfectante de uso general 500 µg por g de Clorocresol,500 µg por g de cloroxile-
nol
Ozono Agente esporicida 8% de Gas en peso
Peróxidode hidrógeno Esterilizantede fase vapor, agente esporicida 4 µg por g de H20 2 vapor, solución del 10% al 25%, so-
ITquido,antiséptico lución al 3%
Biquanidassustituidas Aqente antiséptico Gluconato de clorhexidinaal 0,5%
Ácido peracético Esterilizantelíquido, esterilizantede fase vapor Ácido peracético al 0,2%, 1 µg por q de ácido peracético
Óxido de etileno Esterilizantede fase vapor 600 µg por g de Óxido de etileno
Compuestos de amonio cuaternario Desinfectantede uso general y antiséptico Concentración dependente de la aplicación, Cloruro de
benzalconio
p -Propiolactona Agente esporicida 100 µq por q de p -Propiolactona
La eficacia de un desinfectante depende de su actividad biocida intrínseca, la concentración del desinfectante, el tiempo de
contacto, la naturaleza de la superficie desinfectada, la dureza del agua usada para diluir el desinfectante, la cantidad de mate-
rial orgánico presente en la superficie, y el tipo y la cantidad de microorganismos presentes. Conforme a la Ley Federal de
Insecticidas, Fungicidas y Rodenticidas (Federal lnsecticide, Fungicide, and Rodenticide Acto FIFRA,por sus siglas en inglés), la
Agencia de Protección Ambiental de los EE.UU.(EPA)registra los desinfectantes químicos que se comercializan en los Estados
Unidos y exige que los fabricantes suministren información del producto en cuanto a la dilución de uso, el tipo de microorga-
nismos que eliminan y el tiempo de contacto necesario. Ciertos esterilizantes químicos líquidos que se destinan al uso en dis-
positivos médicos críticos o semicríticos se encuentran definidos y regulados por la Administración de Alimentos y Medicamen-
tos de los EE.UU.(FDA).
SELECCIÓN
DE UN ANTISÉPTICOPARA DESINFECCIÓN
DE MANOSY SITIOSDE
INTERVENCIÓN QUIRÚRGICA
En el ámbito de los hospitales se desinfectan las manos y los sitios de intervención quirúrgica para reducir la flora residente y
eliminar la flora transitoria (p. ej., Streptococcuspyogenes)y los S. aureusy P.aeruginosaresistentes a la meticilina, que se han
visto implicados en infecciones hospitalarias. Se ha demostrado que el uso de antisépticos para la desinfección de manos es
más efectivo que el uso de agua y jabón para la reducción del recuento de bacterias en la piel; el uso repetido de antisépticos
reduce aún más el recuento. En la industria farmacéutica, estos principios pueden aplicarse a los operadores de cuartos lim-
pios.
Los antisépticos comunes incluyen clorhexidina al 4%, povidona yodada al 10%, hexaclorofeno al 3%, alcohol isopropílico
al 70% y clorhexidina al 0,5% en alcohol al 95%.
SELECCIÓN
DE UN DESINFECTANTE
PARA USAREN ELENTORNODE FABRICACIÓN
DE
PRODUCTOSFARMACÉUTICOS
Al seleccionar un desinfectante para usar en el entorno de fabricación de productos farmacéuticos, se deben considerar los
siguientes aspectos: el número y tipos de microorganismos a controlar; el espectro de actividad de los desinfectantes disponi-
bles en el mercado; la declaración de la etiqueta como esterilizante; registros del desinfectante o sanitizante respaldados por la
EPA;la concentración, método de aplicación y tiempo de contacto del desinfectante; la naturaleza del material de la superficie
a desinfectar y su compatibilidad con el desinfectante; la cantidad de compuestos orgánicos en la superficie que pudieran inac-
tivar al desinfectante; la posibilidad de mantener la actividad bactericida residual del desinfectante en la superficie; la corrosión
de los equipos a causa de la aplicación repetitiva del desinfectante; las consideraciones de seguridad para los operadores que
aplican el desinfectante; la compatibilidad del desinfectante con agentes de limpieza y otros desinfectantes; la rotación progra-
mada del desinfectante; y los pasos necesarios para evitar la contaminación de productos farmacéuticos por el desinfectante. 2
ANÁLISISTEÓRICODE LA ACTIVIDADDE LOSDESINFECTANTES

Las gráficas del logaritmo del número de microorganismos por mL que sobreviven en una solución de desinfectante indican
que se puede aplicar una cinética de primer orden como una aproximación bruta a la reducción del recuento microbiano en
2 Denny,V.F.;Marsik,F.J.CurrentPracticesin the Useof Disinfectantswithinthe Pharmaceuticallndustry.PDAJ.of PharmaceuticalSci.and Tech.,1997, 51, (6),

227-228.
USP42 InformaciónGeneral/ (1072) Desinfectantes y Antisépticos 7721
relación al tiempo. En la práctica, las gráficas muestran una curva más sigmoidea con una reducción inicial de los números más
lenta, incrementándose luego la velocidad en relación al tiempo.
La constante de velocidad, K, para el proceso de desinfección se puede calcular mediante la fórmula:
(1/t)(log N0/N)
en donde t es el tiempo, en minutos, necesario para reducir el recuento microbiano de N0 a N; N0 es el número inicial de
organismos, en ufc por mL; y N es el número final, en ufc por mL, de organismos.
Tal como ocurre con una reacción química de primer orden, la misma concentración de desinfectante reduce el número de
organismos en forma más rápida a temperaturas elevadas. El impacto de la temperatura, T, puede expresarse a través del 0 10,
coeficiente por cada 10° de aumento en la temperatura, calculado por la fórmula:
Tiempo para descontaminación a Tº/Tiempo para descontaminación a T
en donde Tes Tº - 1O.
Otro indicio de que la reacción de primer orden es una descripción inadecuada de la desinfección es que los valores 0 10 para
las reacciones enzimáticas y químicas son de 2 a 3, mientras que los desinfectantes comunes fenol y alcohol tienen valores 0 10
de 4 y 45, respectivamente.
Para emplear los desinfectantes de forma satisfactoria, es crucial entender el efecto de la concentración en la reducción mi-
crobiana. Un gráfico del logaritmo del tiempo para reducir a cero la población microbiana de un inóculo estándar en función
del logaritmo de la concentración del desinfectante es una línea recta cuya pendiente se denomina exponente de la concentra-
ción, n. La relación se puede expresar del siguiente modo:
n = (log del tiempo de muerte a la concentración C2 ) - (log del tiempo de muerte a la concentración C1)/(log C1 - log C2)
en donde C1 y C2 son las concentraciones más alta y más baja del desinfectante, respectivamente.
Las amplias diferencias en los exponentes de concentración, n, tienen consecuencias prácticas en la selección de la dilución
de uso de los distintos desinfectantes y en el uso de la dilución para neutralizar un desinfectante en la prueba de eficacia de
desinfectantes y el control microbiano de rutina del entorno de fabricación. Por ejemplo, el cloruro mercúrico tiene un expo-
nente de concentración de 1, por lo que una dilución al tercio reducirá la actividad del desinfectante por 31 (o un tercio),
mientras que el fenol con un exponente de concentración de 6 presentará una reducción de la actividad del desinfectante de
36 ( o una reducción de 729 veces). Los desinfectantes con exponentes de concentración o coeficientes de dilución mayores
pierden rápidamente actividad al diluirlos. En la Tabla3 se listan los exponentes de concentración de algunos desinfectantes.
Tabla 3. Exponentes de Concentración de Antisépticos, Desinfectantes y Esterlllzantes Comunes
Desinfectante Exponentes de Concentración
Peróxido de hidrógeno 0,5
Hipoclorito de sodio 0,5
Cloruro mercúrico 1
Clorhexidina 2
Formaldehído 1
Alcohol 9
Fenol 6
Compuestos de amonio cuaternario de 0,8 a 2,5
Alcoholes alifáticos de 6,0 a 12,7
Compuestos fenólicos de 4 a 9,9
Otro aspecto importante que se debe considerar es el pH del desinfectante. Muchos desinfectantes son más activos en su
forma ionizada, mientras que otros lo son en su forma no ionizada. El grado de ionización dependerá del pK. del agente y del
pH del entorno de desinfección. Por ejemplo, el fenol, con un pK. de 1O será más eficaz a un pH menor que 7, en el cual no
está ionizado.
MECANISMODE LA ACTIVIDADDELDESINFECTANTE
La Tabla4 lista los sitios y modos de acción de algunos desinfectantes representativos.
Tabla 4. Mecanismo de la Actividad de los Desinfectantes Contra Células Microbianas
Objetivo Desinfectante
Pared celular Formaldehído, hipoclorito y qlutaraldehído
Membrana citoplasmática, acción sobre el potencial de membrana Anilidas y hexaclorofeno
Enzimas de membrana, acción sobre la cadena de transporte de electro- Hexaclorofeno
nes
Acción sobre el ATP Clorhexidina y óxido de etileno
4
7722 (1072) Desinfectantes y Antisépticos / Información General USP 42
Tabla 4 Mecanismo de la Actividad de los Desinfectantes Contra Células Microbianas (Continuación)

Objetivo Desinfectante
Acción sobre enzimas con grupos -SH Óxido de etileno, glutaraldehído, peróxido de hidrógeno, hipoclorito y
yodo
Acción sobre la permeabilidad general de membrana Alcoholes, clorhexidina y compuestos de amonio cuaternario
Contenido de las células, coaqulación general Clorhexidina, aldehídos y compuestos de amonio cuaternario
Ribosomas Peróxido de hidrógeno
Ácidos nucleicos Hipocloritos
Grupos tiol Óxido de etileno, glutaraldehído, peróxido de hidrógeno e hipoclorito
Grupos amino Óxido de etileno, qlutaraldehído e hipoclorito
Oxidación qeneral Hipoclorito
RESISTENCIA
MICROBIANA
A LOSDESINFECTANTES
El desarrollo de resistencia microbiana a los antibióticos es un fenómeno ampliamente descrito. El desarrollo de resistencia
microbiana a los desinfectantes es menos probable que ocurra a niveles significativos, ya que los desinfectantes son agentes
biocidas más poderosos que los antibióticos. Además, se aplican normalmente en mayores concentraciones contra poblaciones
de microorganismos más bajas que, por lo general, no están en crecimiento activo; es por ello que la presión selectiva para el
desarrollo de resistencia es menos profunda. Sin embargo, los microorganismos aislados con mayor frecuencia de un progra-
ma de control ambiental pueden someterse periódicamente a pruebas de dilución de uso con agentes empleados en el pro-
grama de desinfección para comprobar su susceptibilidad ya que hay diferencias reales entre las especies distintas con respecto
a su resistencia a los efectos letales de sanitizantes diferentes.
PRUEBADE DESAFÍODE DESINFECTANTES

Conforme a la FIFRA,la EPAexige que las empresas que registran productos plaguicidas antimicrobianos para la salud públi-
ca, incluyendo desinfectantes, agentes sanitizantes, agentes esporicidas y esterilizantes, garanticen la seguridad y eficacia de
los productos antes de su venta o distribución. Las empresas que registran estos productos deben declarar la composición quí-
mica del producto, incluir datos toxicológicos para documentar que el producto es seguro si se emplea según las instrucciones
de la etiqueta, incluir datos de eficacia para documentar la efectividad declarada contra organismos específicos y para respal-
dar las instrucciones de uso del etiquetado, y deben además presentar un etiquetado que refleje los elementos que se requie-
ren para el uso efectivo y seguro del producto. Si bien estas instrucciones proveen información valiosa, es probable que no
sean de utilidad en relación con el uso de estos productos como desinfectantes en un entorno de fabricación.
En los Estados Unidos, la AOAC lnternational3 publica los métodos oficiales de prueba de desinfectantes, que incluyen la
Prueba de Coeficiente de Fenal, la Prueba del Método de Dilución de Uso, el Método de Portador en Superficie Dura y la Prue-
ba de Portador de Esporicida. El estudio científico que se someta a revisión de la EPApara obtener el registro del desinfectante
debe conducirse en las instalaciones de un laboratorio que cumpla con las normas de Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP,
por sus siglas en inglés, descritas en 21 CFR58). Para demostrar la eficacia de un desinfectante en un entorno de fabricación
de productos farmacéuticos puede considerarse necesaria la realización de las siguientes pruebas: (1) pruebas de dilución de
uso (analizar la eficacia de los desinfectantes a varias concentraciones y tiempos de contacto contra una amplia variedad de
organismos estándares de prueba y aislamientos ambientales); (2) pruebas de desafío de superficie (usando microorganismos
estándares de prueba y microorganismos que son aislamientos ambientales típicos, aplicando desinfectantes sobre las superfi-
cies a la concentración de uso seleccionada y durante un tiempo de contacto especificado y determinando la reducción del
logaritmo de los microorganismos de desafío); y (3) una comparación estadística de la frecuencia de aislamiento y números de
microorganismos aislados antes y después de la implementación de un nuevo desinfectante. Esto se considera necesario ya
que, según lo establecido por las normas de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP, por sus siglas en inglés), los pasos críticos
de un proceso, como la desinfección de áreas de procesamiento aséptico, requieren validación, y porque los requisitos de re-
gistro de la EPAno incluyen instrucciones sobre cómo usar los desinfectantes en las industrias farmacéutica, biotecnológica y
de dispositivos médicos. Para las pruebas de desafío de superficie, los organismos de prueba se enumeran por medio de méto-
dos de hisopado, enjuague de superficie o placa de contacto. Los neutralizantes que inactivan desinfectantes deberían incluirse
ya sea en el diluyente o los medios microbianos usados en el recuento microbiano o en ambos. La información acerca de neu-
tralización de desinfectantes puede encontrarse en Validación de RecuperaciónMicrobiana en ArtículosFarmacopeicos (1227).
La prueba de eficacia de desinfectantes debe tener un criterio de aceptación realista. En la práctica, es necesario inocular una
cantidad suficiente de organismos en un cuadrado de 2 pulgadas x 2 pulgadas de la superficie que está siendo descontamina-
da, es decir, un cupón (coupon), para demostrar una reducción de al menos 2 log (para esporas bacterianas) a 3 log (para
bacterias vegetativas) durante un tiempo de contacto predeterminado (es decir, 1O minutos por encima de la recuperación
observada con la aplicación de un desinfectante de control). La eficacia de los neutralizadores y su capacidad para recuperar
del material los microorganismos inoculados debería demostrarse durante los estudios de dilución de uso o de desafío de su-
3 AOAClntemationa/ Officia/ Methods of Analysis, ediciones 15, 16 y 17'". Arlington, VA.

USP42 Información General/ (1072) Desinfectantes y Antisépticos 7723
perficie. Es importante recordar que los desinfectantes son menos efectivos contra los números más altos de microorganismos
usados en las pruebas de desafío de laboratorio que contra los números encontrados en cuartos limpios (ver Control Microbioló-
gico y Monitoreo de Ambientespara ProcesamientoAséptico(1116)); que los inóculos de la fase de crecimiento logarítmico, co-
múnmente empleados en los laboratorios, son más resistentes, salvo las esporas que se forman durante la fase estacionaria,
que aquellos de un cultivo estacionario o en extinción o que los organismos bajo estrés en el ambiente; y que los microorga-
nismos pueden eliminarse físicamente durante la aplicación del desinfectante en el área de fabricación.
Aunque no es extensiva, la Tabla5 lista los organismos de desafío típicos que pueden emplearse.
Tabla 5. Organismos de Desafío Típicos
Organismos de Desafío AOAC Aislamientos Ambientales Típicos
Bactericida: Escherichia
cofi,ATCC 11229; S. aureus,ATCC 6538; P.aeruginosa, Bactericida: Micrococcus
luteus,S. epidermdis,Coynebacterium
jei-
ATCC 15442 keium,P.vesiclaris
Fungicida: C. albicans,ATCC 10231 ó 2091; Penicillium
chrysogenum,ATCC Fungicida: P.chrysogenum,
A. brasiliensis
11 709; A. brasiliensis,
ATCC 16404
Esporicida: 8. subtilis,ATCC 19659 Esporicida: 8. sphaericus,8. thurinqiensis
Dada la variedad de materiales usados en la construcción de cuartos limpios y otras áreas controladas, se debe analizar cada
material por separado para validar la eficacia de un desinfectante determinado. La Tabla 6 contiene un listado de materiales
comúnmente usados en la construcción de cuartos limpios.
Tabla 6. Superficies Típicas a DeKontamlnar con Desinfectantes en el Área de Fabricación de Productos Farmacéuticos
Material Aplicación
Acero inoxidable de grados 304L y 3l 6L Superficies de trabajo, equipo de llenado y tanques
Vidrio Ventanas y recipientes
Plástico, vinilo Cortinas
Plástico, policarbonato Revestimiento aislante
Lexan® (plexiglas) Pantallas protectoras
Yeso recubierto con epoxilo Paredes y techos
Plástico reforzado con fibra de vidrio Paneles de las paredes
Tyvek® Envoltorio de equipos
Baldosas de terrazo Pisos
DESINFECTANTES
DE UN PROGRAMADE LIMPIEZAY SANITIZACIÓN
La selección de desinfectantes adecuados y la verificación de su eficacia en pruebas de desafío de superficie son cruciales en
el desarrollo de un programa de limpieza y sanitización.
Los aspectos relacionados con la implementación satisfactoria de dichos programas se refieren a lo siguiente: desarrollo de
procedimientos escritos, capacitación del personal, decisiones acerca de la rotación de los desinfectantes, establecimiento de
los métodos de aplicación y tiempos de contacto, control ambiental para demostrar la eficacia, y seguridad del personal.
La sección 21 CFR211.67 de las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes (cGMP, por sus siglas en inglés), Limpiezay Mante-
nimiento de Equipos,especifica los requisitos de los procedimientos escritos en cuanto a la limpieza, mantenimiento y sanitiza-
ción de los equipos de fabricación de productos farmacéuticos. Estos procedimientos deben especificar la asignación de res-
ponsabilidades, establecimiento de horarios, detalles de las operaciones de limpieza, protección de equipos limpios antes de
usar, inspección de limpieza inmediatamente antes del uso y mantenimiento de registros de limpieza y sanitización.
El personal involucrado en la desinfección requiere capacitación en microbiología, prácticas industriales de limpieza y saniti-
zación, manejo seguro de desinfectantes concentrados, preparación y eliminación de desinfectantes, y métodos de aplicación
adecuados. Se debería recalcar que la preparación de diluciones correctas es un punto crítico ya que las fallas de muchos de-
sinfectantes pueden atribuirses al empleo de soluciones desinfectantes muy diluidas. Los desinfectantes que por lo general se
usan en áreas de procesamiento y llenado asépticos se diluyen con Agua Purificada Estéril y se preparan asépticamente. Como
alternativa, se puede diluir el desinfectante con Agua Purificada y luego esterilizar por filtración para eliminar microorganismos
que probablemente puedan persistir en el desinfectante. Los desinfectantes diluidos deben tener una fecha de expiración asig-
nada basada en estudios de efectividad.
Se recomineda la rotación de un desinfectante eficaz con una esporicida. Es prudente reforzar el empleo diario de desinfec-
tantes bactericidas con el uso semanal (o mensual) de un agente esporicida. La aplicación diaria de agentes esporicidas no es
generalmente recomendada dada su tendencia a corroer equipos y debido a potenciales problemas de seguridad ante la expo-
sición crónica del operador. Otros esquemas de rotación del desinfectante pueden justificarse en la revisión de los datos históri-
cos de control ambiental. Los desinfectantes que se aplican sobre superficies de contacto potencial con productos generalmen-
te se remueven con paños empapados con alcohol al 70%. Se debería controlar la efectividad de la eliminación de desinfec-
tantes residuales como precaución contra la posibilidad de contaminación del producto.
Los mayores problemas de seguridad se encuentran en el manejo de desinfectantes concentrados y en la mezcla de desin-
fectantes no compatibles. Por ejemplo, las soluciones concentradas de hipoclorito de sodio (a una concentración de más de
7724 (1072) Desinfectantes y Antisépticos / Información General USP42
5%) son oxidantes fuertes que se descomponen al calentarlas, al entrar en contacto con ácidos y bajo la influencia de la luz,
despidiendo gases tóxicos y corrosivos, incluyendo cloro. Por lo contrario, las soluciones diluidas (a una concentración de me-
nos de 0,5%) no se consideran peligrosas. No se deben mezclar, bajo ninguna circunstancia, desinfectantes con concentracio-
nes diferentes. Las Hojas de Datos de Seguridad del Material de todo desinfectante usado en el área de fabricación deberían
estar a disposición del personal que maneja estos agentes. Se deben suministrar equipos de seguridad adecuados tales como
máscaras, lentes de seguridad, guantes y uniformes al personal que prepara los desinfectantes, el cual también debe entrenar-
se en. el uso adecuado de dichos equipos. Las duchas de seguridad y las estaciones para el lavado de ojos deben ubicarse en el
área de trabajo donde se preparan las soluciones desinfectantes.
(1074) GUÍASPARALA EVALUACIÓNDE LASEGURIDADBIOLÓGICA

DE LOSEXCIPIENTES
INTRODUCCIÓN
Este capítulo es de carácter informativo y presenta un enfoque científico para la evaluación de la seguridad de nuevos exci-
pientes farmacéuticos (es decir, los excipientes que no han sido previamente utilizados o autorizados para su uso en una pre-
paración farrnacéutica). Las guías aquí presentadas suministran un protocolo para el desarrollo de una base de datos adecuada
que permita establecer las condiciones para el uso seguro de un nuevo excipiente en productos administrados por diferentes
vías. [NOTA-La última sección de este capítulo, Definiciónde Términos,contiene algunos de los térrninos a los que aquí se hace
referencia.]
Un excipiente puede cumplir diferentes funciones en un producto farmacéutico pero, a diferencia de las sustancias farrnaco-
lógicamente activas, el excipiente no muestra ninguna actividad farmacológica o posee una actividad muy limitada y específi-
ca. Debido a estas diferencias entre excipientes y fárrnacos activos en términos de relación riesgo-beneficio y actividades bioló-
gicas esperadas, los procedimientos para la evaluación de seguridad de los excipientes y de los fármacos activos varían. Por lo
tanto, es importante tener en cuenta que las guías presentadas en este capítulo informativo solo son válidas para la evaluación
de la seguridad de los excipientes, y no para la evaluación de la seguridad de los fármacos activos.
Estas guías de evaluación son de carácter inforrnativo y deben ser utilizadas por profesionales con conocimientos de toxico-
logía y otras ciencias afines. En la propuesta para la comercialización de un producto, también deberán cumplirse los requisitos
pertinentes del método de prueba de seguridad establecidos por la autoridad reglamentadora receptora. Por ejemplo, si se
presenta una propuesta a la Administración de Alimentos y Fármacos (Food and Drug Administration) de los EE.UU.,deberán
cumplirse con los requisitos de las pruebas de seguridad establecidos por dicho organismo. Estas guías no proporcionan deta-
lles específicos relativos a la metodología de prueba e interpretación de datos. Se deberán utilizar los procedimientos de prue-
ba reconocidos de manera general por expertos y organismos reglamentadores. Se alienta el uso de métodos que no utilicen
animales vivos siempre y cuando estos procedimientos hayan sido validados para el propósito en cuestión y pueda confirmarse
que dichos procedimientos alternativos proporcionarán suficientes datos para fundamentar un juicio sobre la seguridad de un
producto. En la realización de todos los procedimientos de prueba, se recomienda ajustarse a los PrincipiosOrientativossobre el
Usode Animalesen Toxicologíade la Sociedad de Toxicología (1996) y, en otros países, respetar los códigos legales y profesio-
nales correspondientes. Todos los estudios deben cumplir los requisitos de las guías sobre buenas prácticas de laboratorio na-
cionales, vigentes en el país en que se realizan los estudios.
En los casos en que se cuente con una amplia experiencia en humanos basada en el consumo de alimentos, podría existir
suficiente información para cumplir con los requisitos de las guías para excipientes de administración oral únicamente. Asimis-
mo, podrían utilizarse datos basados en estudios con animales, originalmente desarrollados con otros propósitos, para cumplir
con los requisitos de las guías de evaluación. Si se han cumplido con los requisitos de datos a través de la experiencia previa de
uso por humanos y se han recopilado datos pertinentes en humanos con un criterio científico, no es necesario proporcionar
datos de animales para aquellos resultados evaluados según experiencia clínica previa.
Algunas vías de administración presentan desafíos toxicológicos únicos y las guías incluyen disposiciones relativas a dichas
vías de administración (por ejemplo, inhalación). Además, se proporciona una explicación detallada sobre la cantidad de espe-
cies y otra información básica (por ejemplo, dos especies, una roedora y una no roedora).
La cantidad de información requerida para definir un grupo de datos de referencia iniciales, que conforrnen una base de
datos toxicológica y química, depende del uso previsto, de la duración y dosificación del material de excipiente propuesto. Es
fundamental realizar un análisis profundo de la información de referencia antes de iniciar un régimen de pruebas. Además de
consultar las bases de datos de literatura relacionada, debe obtenerse información sobre las propiedades físicas y químicas del
compuesto, su proceso (o procesos) de fabricación y las especificaciones del producto, incluyendo límites de impurezas, po-
tencial de actividad farmacológica, condiciones de exposición (es decir, dosis, duración, frecuencia de uso, forrnulación y vía
de administración) y población potencial de usuarios. Además, es fundamental contar con información sobre la toxicidad bási-
ca de los productos. Debería prestarse especial atención a los estudios de absorción/distribución/metabolismo/excreción/
USP42 InformaciónGeneral/ (1074) Seguridad Biológica de Excipientes 7725
farmacocinética (ADME/PK,por sus siglas en inglés) ya que gran parte del proceso de decisión posterior dependerá de dichos
datos.
Estas guías proporcionan un mecanismo para obtener conjuntos de datos iniciales para todos los materiales propuestos co-
mo excipientes. La información de referencia y de toxicidad inicial por sí mismas pueden avalar el uso del excipiente propues-
to, ya sea en un producto de vida media corta que no se administre con una frecuencia tal que produzca una acumulación
residual del excipiente en tejido corporal o en un producto utilizado solo una vez o dos en la vida, como ser, un agente de
diagnóstico. Se necesitan pruebas adicionales, enumeradas en el Paso4 de las Guíasde Evaluaciónde Seguridad,para el exci-
piente propuesto cuyo uso resulte en una exposición repetida a corto o mediano plazo en humanos -es decir, un producto
farmacéutico que se administre durante menos de 1O días o de 30 a 90 días consecutivos, respectivamente. En el caso de un
excipiente propuesto que ha de utilizarse en un producto farmacéutico de administración intermitente o crónica durante un
período prolongado, como por ejemplo para el tratamiento de la psoriasis o una preparación de insulina, se requieren pruebas
adicionales. Estas pruebas se enumeran en el Paso7 de las guías y en la sección correspondiente en Requisitos Adicionalespara
Víasde ExposiciónEspecíficas. Si bien las pruebas requeridas ofrecen orientación sobre la seguridad del producto para el consu-
midor, algunas de ellas están diseñadas para proporcionar información que permita evaluar su seguridad en el ámbito laboral
(por ejemplo, irritación de la piel y de los ojos).
Las guías se resumen en la Tabla 1. Las pruebas requeridas (R) en las guías difieren de las pruebas que se recomiendan en
forma condicional (C). La realización de pruebas condicionales depende de las condiciones de uso y de los datos biológicos
disponibles. También deben tenerse en cuenta los requisitos de las autoridades reglamentadoras al tomar la decisión de realizar
una prueba.
Tabla 1. Resumen d e Guias para Exc1p
11 entes
Vías de Exposición para los Humanos
Dérmica/
A través Tópica/
delas Trans- lnhalatorla/
Pruebas Oral Mucosas dérmica Inyectable• lntranasal Ocular
Datos de ToxicidadIniciales
Toxicidad Oral Aguda R R R R R R
Toxicidad Dérmica Aquda R R R R R R
Toxicidad lnhalatoria Aguda c c c c R c
Irritación Ocular R R R R R R
Irritación Cutánea R R R R R R
SensibilizaciónCutánea R R R R R R
Toxicidad Inyectable Aguda - - - R - -
Evaluacióndel Sitio de Aplicación - - R R - -
SensibilizaciónPulmonar - - - - c -
Fototoxicidad/Fotoalerqia R - R R R -
Ensayosde Genotoxicidad R R R R R R
ADME/PK-VíaPrevista R R R R R R
Toxicidad de 28 Días (2 Especies)-VíaPrevista R R R R R R
Datos Adicionales:UsoRef2_etido
a Corto o Mediano Plazo
Toxicidad a 90 Días(Especiesmás Adecuadas) R R R R R R
Toxicoloqía Embrio-Fetal R R R R R R
EnsayosAdicionales c c e e e e
Ensayosde Genotoxicidad R R R R R R
Ensayosde lnmunosupresión R c c R c c
Datos Adicionales:Usoa larao Plazo Intermitente o Crónico

Toxicidad Crónica (Roedor, No Roedor) c c c c c c
Toxicidad Reproductiva R R R R R R
Fotocarcinogenicidad c - c c c -
Carcinogenicidad c c c c c c
R= Requerida
C = Condicional
* Intravenosa,intramuscular,subcutánea,intratecal,etc.
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GUÍASPARA LA EVALUACIÓN
DE LA SEGURIDAD
Información de Referencia
Antes de proseguir con los pasos de la sección Requisitosy Puntosde Controlde Datos,deben analizarse y definirse los si-
guientes puntos:
• Consultar la literatura pertinente utilizando las bases de datos adecuadas
• Definir las propiedades químicas y físicas
• Definir el proceso de fabricación
• Definir las especificaciones del producto, incluyendo impurezas y disolventes residuales (ver guías ICH aplicables)
• Estimar las condiciones de exposición (dosis, duración, frecuencia, vía)
• Definir la población de usuarios
• Evaluar el potencial de actividad farmacológica.
En este punto, evaluar lo que se conoce y desarrollar el método inicial de prueba.
Requisitos y Puntos de Control de Datos
PASO 1
Datos de Toxicidad (ver Datos de ToxicidadIniciales)

Los datos de toxicidad deben tener en cuenta la siguiente información:
• Efectos de la exposición aguda por vía oral y las vías previstas
• Efectos de exposiciones repetidas por las vías previstas
• Efectos de los ensayos de genotoxicidad in vitro
• ADME/PKpor vía oral o por las vías adecuadas; dosis únicas o múltiples.
PASO 2
Según los resultados anteriores, evaluar los efectos de una dosis única en humanos.
PASO 3
Punto de control: Evaluar los resultados de las condiciones de exposición anteriores y las condiciones propuestas y la pobla-
ción expuesta. Los datos anteriores podrían permitir el uso en un producto único con una vida media corta (por ejemplo, un
agente diagnóstico).
PASO 4
Reunir los siguientes datos adicionales:

• Efectos de exposición subcrónica en especies y vías adecuadas
• Estudios de desarrollo embrio-fetal a través de la vía de exposición adecuada
• Pruebas de genotoxicidad in vitro e in vivo adicionales.
PASO 5
Según los resultados anteriores, deberían considerarse las pruebas en humanos como parte de los ensayos clínicos de un
ingrediente activo o como un procedimiento independiente.
PASO 6
Punto de control: Evaluar toda la información anterior. Los datos podrían permitir el uso en diferentes productos destinados
a una ingesta repetida a corto plazo (por ejemplo, antibióticos). Si los estudios ADME/PKpara un excipiente no inyectable no
muestran absorción, los datos pueden permitir el uso de un producto por 30 a 90 días consecutivos.
PASO 7
Deben obtenerse datos adicionales para productos que se toman en forma crónica, ya sea a diario o intermitentemente, du-
rante un período prolongado, teniendo en cuenta lo siguiente:
• Resultados de estudios subcrónicos y toxicidad a largo plazo en mamíferos no roedores adecuados
USP42 InformaciónGeneral/ (1074) Seguridad Biológica de Excipientes 7727
• Estudios de toxicidad reproductiva

• Resultados de otras pruebas y datos de exposición humana y toxicidad a largo plazo o carcinogenicidad en roedores.
Datos de ToxicidadIniciales
Deberían tenerse en cuenta los siguientes datos:
TOXICIDADAGUDA ADECUADAPOR LASVÍASDE ADMINISTRACIÓNPREVISTAS
sensibilización cutánea, método de dosis letal aproximada, prueba de límite, etc.
OTROS ESTUDIOSDE TOXICIDADAGUDAADECUADOS
toxicidad oral por prueba de límite o método de dosis letal aproximada, irritación cutánea, etc.
ADME/PK
dosis únicas o múltiples.
GENOTOXICIDAD
por ejemplo, la Prueba Ames, prueba de aberración cromosómica in vitro, ensayo de mutación celular en mamíferos.
ESTUDIOSDE 28 DÍAS DE DOSIFICACIÓNREPETIDAEN DOS ESPECIESPOR LASVÍASADECUADAS(UN ROEDOR, UN

MAMÍFERONO ROEDOR)
podrían requerirse una evaluación del sitio de la inyección o consideraciones similares según la vía de administración.
[N0TAS-
1. En aquellos casos en que las restricciones de la vía prevista (por ejemplo, volumen, concentración) impiden una evaluación
adecuada de la toxicidad del excipiente, podría requerirse el desarrollo de un perfil de toxicidad mediante otras vías pertinen-
tes.
2. La comparación de los datos de toxicidad y ADME/PK entre las vías oral y la prevista es fundamental en este punto ya que
podría indicar hacia dónde deberían apuntar las pruebas de toxicidad futuras (por ejemplo, pruebas de toxicidad reproductiva
realizadas por vía oral en lugar de la vía prevista). Asimismo, la realización de estudios pertinentes utilizando la vía prevista y la
duración de exposición anticipada podrían hacer innecesaria la realización de estudios adicionales.]
RequisitosAdicionalespara Vías de ExposiciónEspecíficas
PARAEXPOSICIÓNORAL
No hay requisitos adicionales aparte de los presentados para los Datos de ToxicidadIniciales.
PARAEXPOSICIÓNA TRAVÉSDE LAS MUCOSAS
No hay requisitos adicionales aparte de los presentados para los Datos de ToxicidadIniciales.
PARAEXPOSICIÓNDÉRMICA,TÓPICA O TRANSDÉRMICA
Datos de Toxicidad Iniciales-

• Efectosde ExposiciónAgudapor Vía de AdministraciónTransdérmica:estudio de sensibilización dérmica para aplicaciones re-
petidas
• Efectosde Exposiciones Repetidaspor Vía Transdérmica
1. Estudio de fotoalergia/fototoxicidad
2. Estudios en dos especies (un roedor, un mamífero no roedor) por vía transdérmica.
• Efectosde ExposiciónSubcrónica,Efectosde ToxicidadReproductiva-Los estudios de toxicidad iniciales pueden realizarse por
vía intravenosa para determinar en forma adecuada el perfil de toxicidad del excipiente. De esta manera, si no se puede
suministrar una cantidad adecuada del compuesto a través de una forma farmacéutica transdermal, se puede evaluar qué
órganos resultarán afectados. Esto depende de los resultados de los estudios ADME/PK.
7728 (1074) Seguridad Biológica de Excipientes/ Información General USP42
Los estudios reproductivos también pueden realizarse por vía oral o vía intravenosa con demostración de absorción (oral) y
comparaciones farmacocinéticas de la vía elegida en función de la transdérmica.
Pueden requerirse estudios de fotocarcinogenicidad, y deben tenerse en cuenta, si los datos y el uso propuesto indican que
los materiales se han de colocar en la piel durante períodos prolongados y que la exposición a la luz UV es un factor importan-
te (por ejemplo, protector solar). Esto también es válido para productos orales, parenterales y de inhalación en los casos en
que las concentraciones del fármaco en la piel superan las concentraciones plasmáticas del fármaco durante un período consi-
derable o en los casos en que el material propuesto parecería tener potencial de fotoactividad o ha demostrado tenerlo.
PARAFORMASFARMACÉUTICAS
INYECTABLES
Información de Referencia-
l. Definir la compatibilidad de la forma farmacéutica con la sangre, si corresponde, según la vía de exposición.
2. Definir el pH y la tonicidad de la forma farmacéutica inyectable, si corresponde, según la vía de exposición.
• Efectosde la ExposiciónAgudapor las Víasde AdministraciónInyectablesPrevistas
1. Incluir la evaluación de irritación en el lugar de inyección en conejos o perros
2. Incluir una evaluación de la velocidad de administración.
PARAEXPOSICIÓNPOR INHALACIÓNO INTRANASAL

1

• Toxicidadpor InhalaciónAguda-Una prueba de límite que, por ejemplo, utilice la concentración más alta obtenible en una
exposición de 4 horas a vapor, aerosol o partículas sólidas. La sensibilización pulmonar puede realizarse junto con otros
estudios adecuados. Si la exposición será a un aerosol o partícula sólida, deben generarse partículas de un diámetro me-
dio en masa adecuado.
• ADME/PKde DosisÚnicay Repetidaspor Inhalacióno Víaslntranasal y Oral
• Estudiode 28 Díasde Inhalaciónpor DosisRepetidasen Dos Especies de MamíferosUtilizando Vaporo Partículasde un Diáme-
tro Medio de Masa Adecuado:comparar con datos de toxicidad oral similar.
PARAEXPOSICIÓNOFTÁLMICA
Información de Referencia: definir pH y osmolaridad de la forma farmacéutica ocular tópica.

• Efectosde ExposiciónAgudapor VíasOftálmicas:pruebas de citotoxicidad (p. ej. recubrimiento con agar)
• Efectosde Exposiciones Repetidaspor VíasOftálmicas
1. Estudios en dos especies (un roedor, un mamífero no roedor)
2. Examen de segmentos anterior y posterior del ojo
3. Estudios sobre potencial de alergenicidad.
Otros datos-La comparación de los parámetros farmacocinéticos de la vía elegida para estudios reproductivos y la exposi-
ción oftálmica son esenciales para la extrapolación de la toxicidad potencial a través de la vía oftálmica.
GLOSARIO
Aguda: exposición a un agente de prueba dentro de un período único de 24 horas. Las dosis pueden ser únicas, múltiples o
continuas durante un período de 24 horas.
Crónica: dosis repetidas de un agente de prueba durante más del 10% de la expectativa de vida de la especie de prueba
(más de 90 días en roedores). Las dosis diarias pueden ser únicas, múltiples o continuas durante un período de 24 horas.
Subaguda: administración repetida de un agente de prueba hasta 29 días. Las dosis diarias pueden ser únicas, múltiples o
continuas durante un período de 24 horas.
Subcrónica: administración repetida de un agente de prueba por 30 días y hasta el 10% de la expectativa de vida de la espe-
cie de prueba (90 días en roedores). Las dosis diarias pueden ser únicas, múltiples o continuas durante un período de 24 horas.
1 Aldiseñar estudios para evaluar el uso en productos indicados para inhalación o administraciónpor vía intranasal,debe tenerse en cuenta el régimen de dosifica-
ción que seráutilizadoen humanos.El protocolode estudioadecuadopara un productodestinadoa una terapiade inhalaciónque causaráexposiciones
prolonga-
das (por ejemplo, variashoras al día) podrá diferirdel utilizadopara evaluar un producto que resulte en la exposicióna varias dosis medidas por día.
USP 42 InformaciónGeneral/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 7729
(1078) BUENASPRÁCTICAS
DE FABRICACIÓNPARAEXCIPIENTES
FARMACÉUTICOSA GRANEL
ANTECEDENTES
Este capítulo de información general proporciona guías para métodos, instalaciones y controles de fabricación que se deben
usar en la producción de excipientes farmacéuticos para asegurar que los excipientes posean la calidad, pureza, seguridad y
aptitud para el uso supuestos. Los principios y la información de este capítulo se pueden aplicar a la fabricación de todos los
excipientes farmacéuticos (mencionados en este documento como excipientes)destinados a ser utilizados en los medicamentos
para uso humano, los medicamentos para uso veterinario y los productos biológicos. El capítulo abarca el sistema de gestión
de calidad y el alcance necesario de buenas prácticas de fabricación (GMP, por sus siglas en inglés) a lo largo de toda la pro-
ducción, tanto para procesos por partidas (lotes) como procesos continuos. El capítulo tiene como propósito ayudar a fabri-
cantes y a auditores a establecer si las instalaciones y controles utilizados en la fabricación de excipientes son adecuados, si los
excipientes poseen la calidad y pureza supuestas y si son aptos para el uso propuesto. La fabricación de ciertos excipientes para
aplicaciones especiales implica desafíos adicionales que exceden el alcance de este capítulo. Los ejemplos incluyen excipientes
para uso parenteral, ocular, inhalatorio y en heridas abiertas, además de excipientes estériles y/o exentos de pirógenos. Éste
capítulo no provee información sobre todos los requisitos legales nacionales ni detalla las características particulares de todos
los excipientes. La norma del sistema de calidad que se utiliza como marco de este capítulo es la ISO 9001, que corresponde a
la fabricación. Dada la diversidad de excipientes, algunos de los principios incluidos en este capítulo informativo pueden no ser
aplicables a determinados productos y procesos.
Este capítulo combina conceptos sobre principios existentes de GMP extraídos de las siguientes fuentes:
• Guías de la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre GMP de Excipientes,
• Guía de Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel 2001 del lnternational Pharmaceutical
ExcipientsCouncil(IPEC/ Consejo Internacional de Excipientes Farmacéuticos),
• Norma PS 9100:2002 para Excipientes Farmacéuticos del PharmaceuticalQuality Group (PQG / Grupo de Calidad Farma-
céutica) del lnstitute of Quality Assurance(IQA / Instituto de Garantía de Calidad),
• Requisitos internacionales para sistemas de gestión de calidad desarrollados por la lnternational Organization for Standardi-
zation (ISO / Organización Internacional de Normalización).
Ante la creciente globalización de la industria farmacéutica y la armonización de los requisitos de registro farmacéutico, re-
sulta necesario contemplar todos los esquemas. Por lo tanto, a lo largo de este capítulo se emplean partes relevantes de los
conceptos de fabricación detallados en tales esquemas.
La sección Guía Generalofrece una perspectiva general de los criterios apropiados para las prácticas de fabricación de exci-
pientes, así como los puntos de aplicación de las buenas prácticas de fabricación de excipientes y de los sistemas de calidad.
Esta sección también recomienda medidas para limitar la contaminación de excipientes. Finalmente, se analiza la relación entre
excipientes y formas farmacéuticas terminadas. No se ha intentado incluir detalles específicos para excipientes particulares.
La información contenida en el Apéndice:ConsideracionessobreAuditoría estipula los criterios fundamentales con el objeto de
ayudar en la auditoría de una planta de fabricación de excipientes.
Para obtener una lista de los términos que se utilizan en este capítulo, así como sus definiciones, ver el Glosario.
INTRODUCCIÓN
Propósito y Alcance
Este capítulo define el alcance y punto de aplicación de los principios de GMP apropiados para la fabricación de excipientes
y es aplicable a la fabricación de excipientes destinados al uso en productos farmacéuticos. Este capítulo abarca el sistema de
control de calidad y el alcance necesario de las GMP a lo largo de la fabricación, tanto para procesos por partidas como proce-
sos continuos. El capítulo tiene como propósito ayudar a los fabricantes y a los auditores a establecer si las instalaciones y con-
troles utilizados en la fabricación de excipientes son adecuados, si los excipientes poseen la calidad, pureza y seguridad supues-
tas y si son adecuados para el uso al que están destinado.
La fabricación de ciertos excipientes para aplicaciones especiales implica desafíos adicionales que exceden el alcance de este
capítulo. Los ejemplos incluyen excipientes
• para uso parenteral, ocular, inhalatorio y en heridas abiertas; y
• excipientes estériles y/o exentos de pirógenos.
Para estos casos, la información detallada sobre el uso previsto de un excipiente, según lo indicado por usuario final, puede
ser útil para determinar las GMP apropiadas. Este capítulo no aborda GMP específicas de las buenas prácticas de comercializa-
ción y distribución (GTDP,por sus siglas en inglés).
7730 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General USP42
PrincipiosAdoptados
ELCAPÍTULOY SU USO
Los excipientes farmacéuticos son diversos y en muchas ocasiones tienen usos distintos a las aplicaciones farmacéuticas. Ca-
da fabricante debería considerar la forma en que el capítulo podría aplicarse a sus productos y procesos (por ejemplo, procesos
por partidas frente a procesos continuos). Dada la gran diversidad de excipientes, algunos de los principios de este capítulo
pueden no ser aplicables a determinados productos y procesos de fabricación.
APLICACIÓN
Este capítulo proporciona la información necesaria para la fabricación de excipientes, aunque no abarca todos los detalles.
No es posible especificar en este capítulo los requisitos legales a nivel nacional ni abarcar las características particulares de to-
dos los excipientes.
NORMA DELSISTEMADE CALIDAD
La norma del sistema de gestión de calidad que se utiliza como marco en este capítulo es la ISO 9001, que corresponde a
instalaciones de fabricación. Un fabricante puede aplicar la norma ISO con o sin certificación; no obstante, esta posibilidad,
como decisión empresarial, no se discute en este capítulo. Sin embargo, la certificación ISO tiene la ventaja de ofrecer a los
clientes la garantía de que el sistema de gestión de calidad del fabricante de excipientes ha sido verificado de manera indepen-
diente.
Los encabezados de este capítulo han sido alineados con las cláusulas de ISO 9001, en virtud de que muchos fabricantes de
excipientes ya utilizan tal norma como base de sus sistemas de gestión de calidad. El capítulo incluye encabezados adicionales
para introducir guías de GMP que no estén cubiertas por las cláusulas ISO 9001 vigentes.
ESTRUCTURA
DELCAPÍTULO
Este capítulo combina conceptos sobre principios existentes de GMP extraídos de las siguientes fuentes:
• Guías de la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre GMP de Excipientes,
• Guía de Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Farmacéuticos a Granel 2001 del lnternational Pharmaceutical
ExcipientsCouncil(IPEC / Consejo Internacional de Excipientes Farmacéuticos),
• Norma PS 9100:2002 para Excipientes Farmacéuticos del PharmaceuticalQuality Group (PQG / Grupo de Calidad Farma-
céutica) del lnstitute of Quality Assurance(IQA / Instituto de Garantía de Calidad), Requisitos internacionales para sistemas
de gestión de calidad desarrollados por la lnternational Organizationfor Standardization(ISO / Organización Internacional
de Normalización).
Debido a la creciente globalización de la industria farmacéutica y la armonización de los requisitos de registro farmacéutico,
se emplean a lo largo de este capítulo las partes relevantes de los conceptos de fabricación detallados en tales esquemas.
La sección Guía Generalofrece una perspectiva general de los criterios de GMP apropiados para la fabricación de excipientes,
así como los puntos de aplicación de las GMP de excipientes.
Las demás secciones ofrecen una guía sobre los principios de GMP y la implementación de un sistema de gestión de calidad
adecuado para la fabricación de excipientes. Por ejemplo, estas secciones recomiendan medidas para limitar la contaminación
del excipiente. No se ha intentado incluir detalles específicos para excipientes particulares, y cada fabricante debería considerar
tales detalles según apliquen a sus propios productos y procesos.
Los Apéndices ofrecen guías de soporte para las GMP de excipientes. El Apéndice1. Consideraciones sobreAuditoríaestipula
los criterios fundamentales que se deben considerar en la auditoría de una instalación de fabricación de excipientes. El Apéndi-
ce 2. Glosarioofrece las definiciones de los términos que se utilizan en este capítulo.
GUÍAGENERAL
ExcipientesFarmacéuticos
Los excipientes farmacéuticos son sustancias distintas al ingrediente farmacéutico activo (API, por sus siglas en inglés) que
han sido evaluadas de manera apropiada respecto a su seguridad y que se incluyen intencionalmente en un sistema de libera-
ción de fármacos. Por ejemplo, los excipientes pueden desempeñar las siguientes funciones:
• facilitar el procesamiento del sistema de liberación de fármacos durante su fabricación,
• proteger, mantener o mejorar la estabilidad, biodisponibilidad o aceptación por parte del paciente,
• contribuir a la identificación del producto, y
• mejorar cualquier otro atributo general relativo a la seguridad, eficacia o liberación del fármaco durante el almacenamien-
to o el uso.
USP42 Información General/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 7731
La sección ExcipientesUSPy NF,Agrupadospor Categoríaen USP-NFofrece una clasificación más completa de excipientes de
acuerdo con sus funciones.
Implementación de GMP de Excipientes
La aplicación de las GMP es importante cuando se determina que un producto químico está destinado a ser usado como
componente de un producto farmacéutico. La fabricación de excipientes debería realizarse conforme a los conceptos de GMP
en consonancia con este capítulo. El objetivo de las GMP de excipientes es garantizar que la fabricación de un excipiente pro-
duzca un material acorde con las características de calidad deseadas. El énfasis de las GMP de excipientes está en asegurar la
integridad del producto, evitar su contaminación y asegurar el mantenimiento de registros.
A medida que avanza el proceso de fabricación de un excipiente, debería aumentarse el grado de garantía en relación con la
calidad del producto. Se deberían controlar y documentar los procesos de fabricación. No obstante, en alguna etapa lógica de
proceso, según lo determine el fabricante, deberían aplicarse y mantenerse las GMP según se describen en este capítulo.
Se requiere de un criterio basado en el análisis de riesgos, así como de un amplio conocimiento del proceso para determinar
la etapa del proceso a partir de la cual deberían implementarse las GMP. Esta es habitualmente una etapa bien previa a la ope-
ración final de terminación y que, por ejemplo, puede identificarse usando métodos como el análisis de riesgos y puntos críti-
cos de control (HACCP,por sus siglas en inglés), el análisis de modos y efectos de fallas (AMEFo FEMA,por sus siglas en in-
glés), o un diagrama de flujo detallado del proceso. Asimismo, se deberían tomar en cuentra otros factores como los procesos
por partidas frente a los procesos continuos, el equipo dedicado frente al equipo multipropósito y los procesos abiertos frente
a los procesos cerrados.
SISTEMADE GESTIÓNDE CALIDAD:SISTEMASDE CALIDADDE EXCIPIENTES
Recomendaciones Generales
Los principios descritos en este capítulo ofrecen una base integral para el sistema de gestión de calidad usado en la fabrica-
ción de excipientes farmacéuticos. Los fabricantes de excipientes deberían identificar los procesos de gestión de calidad reque-
ridos para asegurar la calidad del excipiente. Cuando se contrate a terceros para fabricar, analizar o llevar a cabo otras opera-
ciones que pudieran afectar la calidad del excipiente, la responsabilidad sobre la calidad seguirá recayendo sobre el fabricante
del excipiente, debiéndose definir medidas de control (ver también la subsección Informaciónde Comprasen la sección Realiza-
ción del Producto).
Recomendaciones sobre Documentación
RECOMENDACIÓNGENERAL
Elfabricante de excipientes debería tener a su disposición un sistema para controlar los documentos y datos relacionados
con los requisitos del sistema de gestión de calidad.
MANUALDE CALIDAD
El fabricante de excipientes debería elaborar un manual de calidad en el que se describa el sistema de gestión de calidad, la
política de calidad y el compromiso del fabricante de excipientes para aplicar las GMP y normas de gestión de calidad apropia-
das contenidas en este capítulo. Dicho manual debería incluir el alcance del sistema de gestión de calidad, referencias a los
procedimientos de respaldo y una descripción de la interacción entre los procesos de gestión de calidad.
CONTROLDE DOCUMENTOS
Elfabricante de excipientes debería establecer y mantener procedimientos para la identificación, recopilación, indexación,
archivo, almacenamiento, mantenimiento y eliminación de documentos controlados, incluso documentos que procedan de
fuentes externas que formen parte del sistema de gestión de calidad.
Se deberían documentar, implementar y mantener los procedimientos usados en la fabricación de excipientes. Asimismo,
deberían existir controles formales relacionados con la aprobación, revisión y distribución del procedimiento. Estos controles
deberían garantizar que se está utilizando la versión actual de un procedimiento en todas las áreas operativas y que se han
retirado las revisiones anteriores del documento.
La documentación y los cambios posteriores realizados a la misma deberían ser revisados y aprobados por personal calificado
designado antes de su entrega a las áreas correspondientes, según se identifican en la documentación. La documentación que
afecte la calidad del producto debería ser revisada y aprobada por el departamento de calidad (ver también Responsabilidady
Autoridad en la sección Responsibilidad,Autoridad y Comunicaciónen ResponsabilidadGerencia/).
11
La documentación controlada puede incluir un identificador exclusivo, la fecha de emisión y un número de revisión para
facilitar la identificación de la documentación más reciente. Es recomendable identificar al departamento responsable de la
emisión de documentación. Cuando resulte práctico, deberían documentarse los cambios y las razones de los cambios.
La documentación en formato electrónico debería cumplir con los requisitos del sistema de control de documentos especifi-
cado anteriormente. Si se utilizan firmas electrónicas en los documentos, se deberían aplicar controles sobre éstas para ofrecer
seguridad equivalente a la que ofrece la firma manuscrita. Es posible que la documentación y firmas en formato electrónico
tengan que cumplir también con requisitos reglamentarios locales.
CONTROLDE REGISTROS
Elfabricante de excipientes debería establecer y mantener procedimientos para la identificación, recopilación, indexación,
archivo, almacenamiento, mantenimiento y eliminación de registros.
Deberían conservarse registros para demostrar que se logró la calidad requerida y el funcionamiento eficaz del sistema de
gestión de calidad. Los registros deberían ser legibles e identificables con el producto en cuestión. Estos registros deberían in-
cluir los datos de calidad pertinentes de los subcontratistas.
Las entradas en los registros deberían ser claras, indelebles y asentadas inmediatamente después de llevar a cabo la actividad
(en el orden de realización), además de estar firmadas y fechadas por la persona que las ingresa. Las correcciones a las entra-
das deberían estar firmadas y fechadas, dejando la entrada original aún legible.
Los registros deberían conservarse durante un período definido. Este período debería ser congruente con el excipiente y con
su fecha de caducidad o intervalo de reevaluación. Los registros deberían almacenarse y conservarse de manera tal que se pue-
dan recuperar fácilmente y en lugares que ofrezcan un ambiente apto para minimizar deterioros o daños.
CONTROLDE CAMBIOS
Elfabricante de excipientes debería establecer y mantener procedimientos para evaluar y aprobar cambios que puedan afec-
tar la calidad del excipiente. Por ejemplo, esto puede incluir cambios en los siguientes puntos:
• materias primas o envases y sus orígenes,
• especificaciones del material,
• métodos de prueba,
• equipos de fabricación y analíticos,
• procesos de producción,
• sitios de fabricación o envasado.
Un departamento con una función independiente de la producción (por ejemplo, el departamento de asuntos reglamenta-
rios o de garantía de calidad) debería tener la responsabilidad y autoridad para la aprobación final de los cambios.
Se debería notificar a los clientes y, cuando corresponda, se debería enmendar la documentación que integra las presenta-
ciones reglamentarias para excipientes (tales como los Archivos Maestros de Fármacos [DMF, por sus siglas en inglés] o los Cer-
tificados de Aptitud de la FarmacopeaEuropea[CEP,por sus siglas en inglés]) de modo que reflejen los cambios significativos de
los procedimientos de control de producción y proceso que puedan afectar la calidad del excipiente (ver también Comunica-
cióncon los Clientesen la sección ProcesosRelacionadoscon los Clientesen Realizacióndel Producto).
RESPONSABILIDAGERENCIAL
D
Compromiso Gerencial
La alta gerencia debería demostrar a la organización la importancia que le otorga a la satisfacción de los clientes y al cumpli-
miento con las reglamentaciones y normas apropiadas. Lo anterior debería lograrse a través del desarrollo de una política de
calidad y del establecimiento de objetivos de calidad. El progreso hacia los objetivos documentados de calidad debería revisar-
se a intervalos planeados.
Necesidades de los Clientes
Es responsabilidad de la alta gerencia garantizar que se determinen y cumplan los requisitos de los clientes. Elfabricante de
excipientes debería permitir que el cliente o su representante lleve a cabo auditorías a su sistema de gestión de calidad, a los
procesos de fabricación y a los edificios e instalaciones.
Política de Calidad
La alta gerencia debería demostrar su compromiso con la política de calidad de la empresa y garantizar que se implemente
dentro del departamento operativo. La política de calidad debería respaldar el mejoramiento continuo del sistema de gestión
USP 42 Información General/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 7733
de calidad. La gerencia debería participar en el desarrollo de la política de calidad de la empresa y proporcionar los recursos
necesarios para su desarrollo, mantenimiento y despliegue.
Planeación
OBJETIVOSDE CALIDAD
La alta gerencia debería establecer objetivos de adhesión a las GMP para asegurar que el fabricante de excipientes matenga
y mejore su desempeño. Los objetivos deberían desplegarse en toda la organización y deberían ser medibles y estar de acuer-
do con la política de calidad.
PLANEACIÓNDELSISTEMADE GESTIÓNDE CALIDAD
La alta gerencia debería proveer los recursos adecuados para asegurar el cumplimiento con las disposiciones de este capítu-
lo. Debería existir un proceso para identificar los recursos necesarios para apegarse a las GMP. Se puede generar un análisis de
carencias (gap analysis)basado en auditorías realizadas por personal interno, clientes, agencias reguladoras o contratistas ex-
ternos, o basado en el uso de este capítulo, para identificar la necesidad de recursos. La alta gerencia debería asegurar la con-
servación de la integridad del sistema de gestión de calidad al momento de planear e implementar cambios.
Responsabilidad, Autoridad y Comunicación

RESPONSABILIDAD
Y AUTORIDAD
La alta gerencia debería definir claramente las responsabilidades y autoridades y comunicarlas dentro de la organización. Un
departamento independiente de la producción, tal como el departamento de calidad, debería tener la responsabilidad de lle-
var a cabo lo siguiente:
• asegurar que las actividades críticas para la calidad se realicen según se definen,
• aprobar proveedores de materiales y servicios críticos para la calidad,
• aprobar o rechazar materias primas, componentes del envase, productos intermedios y excipientes terminados,
• asegurar que se revisen los registros de producción para confirmar que no ha ocurrido ningún error, o si hubiese ocurrido
algún error, que se haya investigado de forma exhaustiva,
• participar en la revisión y autorizar cambios a procesos, especificaciones, procedimientos y métodos de prueba que afec-
ten potencialmente la calidad (ver también el apartado anterior Controlde Cambiosen la sección Recomendaciones sobre
Documentaciónen Sistemade Gestiónde Calidad:Sistemasde Calidadde Excipientes),así como participar en la investigación
de fallas y quejas,
• retener la responsabilidad de aprobar o rechazar excipientes producidos, procesados, envasados o conservados bajo con-
trato por otra empresa,
• desarrollar e implementar un programa de autoinspección del sistema de gestión de calidad.
Elfabricante de excipientes puede delegar algunas de las actividades del departamento de calidad (por ejemplo, auditorías
periódicas, capacitación y documentación) a otra parte del personal si es que se cuenta con los controles apropiados.
Los vínculos entre los departamentos, así como las relaciones con la alta gerencia de la empresa, deberían quedar reflejadas
a través de un organigrama. Se debería contar con descripciones detalladas de tareas del personal cuyos puestos afecten la
calidad del excipiente.
REPRESENTANTE
DE LAGERENCIA
Elfabricante de excipientes debería designar a un representante de la gerencia con la autoridad suficiente para garantizar la
implementación apropiada de las disposiciones de este capítulo. El representante debería informar periódicamente a la alta ge-
rencia acerca del cumplimiento con el sistema de gestión de calidad, incluyendo cualquier cambio en los requisitos del cliente
o reglamentarios.
COMUNICACIÓNINTERNA
El fabricante de excipientes debería garantizar el establecimiento de sistemas apropiados para comunicar a toda la organiza-
ción los requisitos de GMP y reglamentarios, políticas de calidad, objetivos de calidad y procedimientos. Asimismo, los comu-
nicados deberían ofrecer información sobre la eficacia del sistema de gestión de calidad. Se debería notificar oportunamente a
la alta gerencia acerca de situaciones críticas para la calidad, tales como la recuperación de un producto de su circulación, de
conformidad con un procedimiento documentado.
RevisiónGerencial
RECOMENDACIONES
GENERALES
La alta gerencia de la empresa debería llevar a cabo revisiones periódicas del sistema de gestión de calidad para confirmar el
cumplimiento continuo de la organización con este capítulo. La revisión debería quedar registrada e incluir la evaluación de
oportunidades de mejoramiento y la necesidad de cambios en el sistema de gestión de calidad.
COMENTARIOSSOBRELAREVISIÓN
Los comentarios sobre la revisión gerencial deberían incluir, por ejemplo, lo siguiente:
• resultados de auditorías internas y externas,
• retroalimentación de clientes sobre el desempeño de la empresa,
• cumplimiento de los productos y desempeño de los procesos,
• puntos de acción extraídos de la revisión gerencial anterior,
• quejas de los clientes,
• estado de acciones correctivas o preventivas,
• cambios que pudieran afectar al sistema de gestión de calidad.
RESULTADOS
DE LAREVISIÓN
La revisión gerencial debería identificar los recursos necesarios y las oportunidades para mejorar el sistema de gestión de
calidad y mejorar el cumplimiento del producto con los requisitos del cliente y reglamentarios. Debería crearse un registro de
las acciones recomendadas y tomadas.
GESTIÓNDE RECURSOS
Provisiónde Recursos
Se debería contar con suficiente personal calificado y recursos (por ejemplo, equipos, materiales, edificios e instalaciones)
para implementar, mantener y mejorar el sistema de gestión de calidad, así como para producir, envasar, analizar, almacenar y
liberar cada excipiente de manera acorde a este capítulo.
RecursosHumanos
RECOMENDACIONES
GENERALES
El personal cuyas labores afecten la calidad de los excipientes debería tener la combinación apropiada de formación acadé-
mica, capacitación y experiencia para sus tareas asignadas. Los consultores que brinden asesoría respecto del diseño, produc-
ción, envasado, análisis o almacenamiento de excipientes deberían tener formación académica, capacitación y experiencia sufi-
cientes o alguna combinación de las mismas, para asesorar en el tema para el que se los contrata. Se deberían mantener regis-
tros que indiquen el nombre, dirección y calificaciones de todos los consultores y el tipo de servicio que proveen.
COMPETENCIA,CONOCIMIENTOY CAPACITACIÓN
Elfabricante de excipientes debería establecer y mantener procedimientos para identificar necesidades de capacitación y
proporcionar la capacitación requerida al personal que realiza actividades que afecten la calidad del excipiente. Se deberían
mantener registros apropiados de capacitación. La capacitación debería vincularse a operaciones particulares que el empleado
realice, así como a las GMP relacionadas con sus funciones. La capacitación sobre GMP debería ser impartida por personas
calificadas, con suficiente frecuencia, para garantizar que los empleados permanezcan familiarizados con los principios de GMP
aplicables. La gerencia debería establecer y mantener capacitación continua y adecuada sobre higiene personal para el perso-
nal que manipule materiales, de modo que comprendan las precauciones necesarias para evitar la contaminación de los exci-
pientes. El programa de capacitación debería asegurar que el personal entienda que las desviaciones respecto de los procedi-
mientos pueden afectar la calidad de los productos de los clientes.
HIGIENEPERSONAL
Con el fin de proteger a los exipientes de la contaminación, se debería usar equipo de protección, tal como protectores para
la cabeza, cara, manos y brazos cuando sea necesario para las tareas realizadas. Cualquier tipo de joyas u otros artículos suel-
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tos, incluyendo los que se encuentren en los bolsillos, deberían retirarse o cubrirse. Únicamente el personal autorizado debería
entrar a las áreas de los edificios e instalaciones designadas como áreas de acceso restringido.
El personal debería mantener buenos hábitos de asepsia e higiene. Cualquier persona que parezca tener una enfermedad o
lesiones abiertas, detectadas por examen médico u observación del personal de supervisión, que puedan afectar de manera
adversa la seguridad o calidad del excipiente, debería ser excluida del contacto directo con materias primas, componentes del
envase, productos intermedios y excipientes terminados hasta que esta condición se resuelva o hasta que el personal compe-
tente determine que no es un riesgo para la seguridad o la calidad del excipiente. Se debería instruir al personal para que infor-
me a sus supervisores de cualquier afección de salud que pueda tener un efecto adverso sobre los excipientes. El almacena-
miento y consumo de alimentos, bebidas, medicamentos personales, productos de tabaco o artículos similares, deberían res-
tringirse a lugares designados, separados de las áreas de fabricación.
INFRAESTRUCTURA
La infraestructura debería administrarse, operarse, limpiarse y conservarse de conformidad con los principios de GMP para
asegurar la calidad del excipiente y evitar la contaminación (incluyendo la infraestructura crítica para la calidad del excipiente,
el control de partículas, el control microbiológico y el control de calidad del agua).
EDIFICIOSE INSTALACIONES
La prevención de contaminación debería considerarse en el diseño de los procesos e instalaciones de fabricación, en particu-
lar cuando el excipiente está expuesto. Los edificios e instalaciones usados en la producción, procesamiento, envasado, análisis
o almacenamiento de un excipiente deberían mantenerse en buen estado y deberían contar con un tamaño, construción y
ubicación adecuados para facilitar la limpieza, mantenimiento y operación apropiados para el tipo de procesamiento.
Los procesos de fabricación asociados con la producción de productos de alta sensibilidad o toxicidad (por ejemplo, herbici-
das y pesticidas) deberían ubicarse en instalaciones especiales (dedicadas) o deberían utilizar equipos diferentes de los emplea-
dos para la fabricación de excipientes. Si esto no fuera posible, se deberían implementar medidas apropiadas (tales como lim-
pieza o desactivación) para evitar la contaminación cruzada. Se debería demostrar la efectividad de estas medidas. Se debería
contar con instalaciones adecuadas para el análisis de materias primas, componentes del envase, productos intermedios y exci-
pientes terminados.
EQUIPOS
Los equipos usados en la producción, procesamiento, envasado, análisis o almacenamiento de un excipiente deberían man-
tenerse en buen estado y deberían contar con un tamaño, diseño y ubicación apropiados para facilitar su limpieza, manteni-
miento y operación correcta, dependiendo del tipo de procesamiento (por ejemplo, procesamiento por partidas frente a pro-
cesamiento continuo). Los equipos deberían ponerse en servicio antes de su uso para garantizar que funcionan como se espe-
ra. Cuando un equipo se encuentra fuera de las instalaciones, deberían existir controles aptos para minimizar los riesgos para la
calidad del excipiente derivados del entorno (por ejemplo, procesamiento dentro de un sistema cerrado).
ESTRUCTURA
DE EQUIPOS
Los equipos de procesamiento se deberían construir de modo que sus superficies de contacto no sean reactivas, aditivas ni
absorbentes como para alterar la calidad del excipiente. Se debería evitar que las sustancias necesarias para las operaciones,
por ejemplo lubricantes o refrigerantes, entren en contacto con las materias primas, materiales del envase, productos interme-
dios o excipientes terminados. Cuando exista posibilidad de contacto, deberían emplearse sustancias adecuadas para el uso en
aplicaciones de alimentos.
Los equipos se deberían diseñar de modo que se minimice la posibilidad de contaminación ocasionada por contacto directo
del operador en actividades tales como descarga de bolsas para centrifugación, uso de mangueras de transferencia (en particu-
lar las que se emplean para transferir polvos) y la operación de equipos y bombas de secado. Se debería evaluar el diseño sani-
tario de los equipos de transferencia y procesamiento. Aquellos equipos que posean partes móviles se deberían evaluar con
respecto a la integridad de sellos y materiales de empaque para evitar el riesgo de contaminación.
MANTENIMIENTODE EQUIPOS
Se deberían establecer y cumplir procedimientos documentados para el mantenimiento de equipos críticos utilizados en la
producción, procesamiento, envasado, análisis o conservación del excipiente. Se deberían mantener registros del uso y mante-
nimiento de equipo crítico para la calidad. Estos registros pueden estar en forma de libro de registro, base de datos de compu-
tadora u otro tipo de documentación apropiada.
SISTEMASCOMPUTARIZADOS
Los sistemas computarizados que puedan afectar la calidad del excipiente deberían contar con suficientes controles de ope-
ración y mantenimiento y de prevención de acceso no autorizado o cambios en el software, hardware o datos computarizados.
Tales controles incluyen lo siguiente:
• sistemas y procedimientos que muestren que el equipo y el software trabajan como se espera,
• procedimientos para controlar el equipo a intervalos apropiados,
• conservación de sistemas de respaldo o archivo adecuados tales como copias del programa y archivos,
• garantía de que los cambios sean verificados y documentados y que solo sean efectuados por personal autorizado.
SERVICIOS
Los servicios (tales como nitrógeno, aire comprimido y vapor) utilizados en la producción, almacenamiento o transferencia
de materiales, que pudieran afectar la calidad del excipiente, deberían evaluarse y someterse a acciones apropiadas para con-
trolar el riesgo de contaminación y contaminación cruzada.
AGUA
Se debería demostrar que el agua utilizada en la fabricación de excipientes tiene la calidad apropiada en lo que respecta a
requisitos de pureza y al uso para el que está destinado el excipiente. A menos que se justifique de otro modo, el agua de
procesamiento debería, como mínimo, cumplir con los requisitos reglamentarios para agua potable. Si el agua potable no es
suficiente para asegurar la calidad, o si se requieren especificaciones más estrictas de calidad química o microbiológica del
agua, se deberían establecer controles y especificaciones apropiadas: por ejemplo, atributos físico-químicos, recuentos totales
microbianos y límites para microorganismos inaceptables y/o endotoxinas.
Cuando el fabricante trate el agua usada en el proceso para lograr una calidad definida, el proceso de tratamiento debería
especificarse y monitorearse mediante límites de acción apropiados. El agua que entre en contacto con el excipiente debería
suministrarse bajo presión positiva continua (u otros medios que prevengan el flujo inverso) en un sistema libre de defectos
para controlar el riesgo de contaminación del excipiente.
AMBIENTEDE TRABAJO
Cuando la fabricación requiera que el excipiente quede expuesto, la exposición debería realizarse en un ambiente apropiado
para minimizar la contaminación. Elfabricante debería aplicar controles adecuados para mantener tal ambiente.
MANEJODE AIRE
Cuando se instale un sistema de manejo de aire para ofrecer protección al excipiente, el fabricante de excipientes debería
demostrar su efectividad. Los sistemas de manejo de aire en unidades de producción de excipientes deberían diseñarse para
prevenir la contaminación cruzada. En las áreas especiales (dedicadas) que procesan el mismo excipiente, se permite reciclar
una parte del aire extraído retomándolo a la misma área. La aptitud de tal sistema para áreas multiusos, especialmente si se
procesan diversos productos al mismo tiempo, debería evaluarse con respecto a la contaminación cruzada.
AMBIENTECONTROLADO
Puede ser necesario un ambiente controlado para evitar la contaminación o la degradación provocada por la exposición al
calor, al aire o a la luz. El grado de protección necesario puede variar según la etapa del proceso. Las condiciones ambientales
especiales que requieren algunos procesos se deberían monitorear en todo momento para garantizar la calidad del producto
(por ejemplo, atmósfera inerte o protección de la luz). Cuando se requiere una atmósfera inerte, el gas se debe tratar como
una materia prima. Si se producen interrupciones en un ambiente especial, se deben documentar con pruebas suficientes y
fundamentos apropiados que demuestren que dichas interrupciones no comprometieron la calidad del excipiente. Estos asun-
tos ambientales adquieren mayor importancia después de la purificación del excipiente.
LIMPIEZAY CONDICIONESHIGIÉNICAS
La limpieza adecuada es un punto importante a considerar en el diseño de las instalaciones de fabricación de excipientes.
Todo edificio que se use para producción, procesamiento, envasado o conservación de un excipiente debería mantenerse lim-
pio y en condiciones higiénicas apropiadas de acuerdo con el tipo de proceso que se lleve a cabo (por ejemplo, sistemas abier-
tos/cerrados). Cuando mantener condiciones de limpieza y sanitarias resulta crítico para la calidad del excipiente, deberían
existir procedimientos escritos que asignen responsabilidades para el mantenimiento de la limpieza e higiene y que describan
con suficiente detalle la frecuencia de limpieza, métodos, equipos y materiales a utilizar en la limpieza de edificios e instalado-
USP42 InformaciónGeneral/ (1078) Buenas Prácticas de Fabricación 7737
nes. Estos procedimientos deberían cumplirse y la limpieza debería quedar documentada. Los residuos deberían segregarse y
desecharse puntualmente y de manera apropiada. Si los residuos no se desechan de inmediato, estos deberían identificarse
adecuadamente.
CONTROLDE PLAGAS
Todos los edificios deberían estar libres de roedores, aves, insectos y otras alimañas. Algunas materias primas, en particular
las de origen botánico, pueden presentar contaminación inevitable, como por ejemplo infestaciones o suciedad provocada por
roedores u otros animales. El fabricante de excipientes debería tener suficientes métodos de control para evitar el aumento de
dicha contaminación o infestación en áreas de conservación, así como su propagación a otras áreas de la planta.
ILUMINACIÓN
Se debería proveer una iluminación adecuada para facilitar la limpieza, mantenimiento y operaciones apropiadas.
DRENAJE
En las áreas en las que el excipiente se encuentre expuesto al ambiente, los drenajes deberían tener un tamaño adecuado y,
en aquellos casos en que estén directamente conectados a una cloaca, deberían tener un freno de aire u otro dispositivo mecá-
nico que implida el reflujo.
LAVATORIOS
Y BAÑOS
Deberían proporcionarse lavatorios adecuados que incluyan agua fría y caliente, jabón o detergente, secadores de aire o toa-
llas desechables, así como baños limpios de fácil acceso desde las áreas de trabajo. Cuando corresponda, deberían proporcio-
narse instalaciones adecuadas para duchas y/o vestidores.
REALIZACIÓN DEL PRODUCTO
Planeaciónde la Realizacióndel Producto
Elfabricante de excipientes debería planear y desarrollar los procesos y controles necesarios para la fabricación de un pro-
ducto. Tales planes y controles deberían ser apropiados para el proceso de producción, especificaciones del excipiente, equipos
e instalaciones usadas en la fabricación del producto. Los aspectos fundamentales para la planeación de un proceso adecuado
y sus controles deberían incluir lo siguiente, según corresponda:
• programas de pruebas documentados, para materiales críticos para la calidad incluyendo excipientes, que contengan es-
pecificaciones, planes de muestreo y procedimientos de prueba y liberación apropiados,
• generación y mantenimiento de registros (ver también el apartado anterior Controlde Registrosen la sección Recomenda-
cionessobreDocumentaciónen Sistemade Gestiónde Calidad:Sistemasde Calidadde Excipientes)que ofrezcan evidencia de
que los planes se han llevado a cabo según lo previsto y que permiten demostrar la rastreabilidad (ver también más ade-
lante en esta sección, Rastreabilidaden Identificacióny Rastreabi/idad),
• suministro de recursos para implementar dichos planes,
• programas de control ambiental y de higiene para minimizar la contaminación.
ProcesosRelacionadoscon los Clientes
DETERMINACIÓNDE REQUISITOSRELACIONADOS
CON EL PRODUCTO
Elfabricante de excipientes debería determinar los requisitos del cliente en relación con la calidad, etiquetado y entrega del
excipiente. Ambas partes deberían establecer acuerdos en relación con requisitos adicionales, ya sean específicos del cliente,
legales o reglamentarios (por ejemplo, material farmacopeico y monografías generales). Cuando se conozcan, deberían consi-
derarse los requisitos no especificados por el cliente pero que son necesarios para el uso específico o previsto.
REVISIÓNDE REQUISITOSRELACIONADOS
CON EL PRODUCTO
El fabricante de excipientes y el cliente deberían establecer un acuerdo mutuo sobre los requisitos identificados en la sección
anterior, Determinaciónde RequisitosRelacionadoscon el Producto,antes de iniciar el abastecimiento. Elfabricante debería con-
tar con las instalaciones y la capacidad de procesamiento que le permitan cumplir el acuerdo según las especificaciones acor-
dadas. Cuando se modifiquen los requisitos determinados en la sección Determinaciónde RequisitosRelacionadoscon el Produc-
to, esta revisión debería repetirse antes de reiniciar el abastecimiento.
COMUNICACIÓNCON EL CLIENTE
Se debería estipular la provisión de comunicados precisos y pertinentes al cliente. Las copias maestras de documentos tales
como especificaciones e informes técnicos deberían ser documentos controlados. Se debería estipular cómo responder las pre-
guntas del cliente, contratos y requisitos para el manejo de órdenes. La retroalimentación y quejas del cliente deberían quedar
documentadas. Se debería notificar a los clientes acerca de cambios significativos (ver también el apartado anterior, Controlde
Cambios,en la sección Recomendaciones sobreDocumentación en Sistemade Gestiónde Calidad:Sistemasde Calidadde Excipien-
tes).
DISEÑOY DESARROLLO
La norma ISO 9001 incluye requisitos para asegurar el control sobre las actividades de diseño y desarrollo. Es recomendable
que las empresas implicadas en tales actividades cumplan con los requisitos de la norma ISO 9001. No siempre es posible apli-
car la totalidad de las GMP durante el diseño y desarrollo de nuevos excipientes y/o procesos de fabricación. Sin embargo, las
partidas de desarrollo de excipientes destinadas para su uso en productos farmacéuticos deberían fabricarse de conformidad
con las disposiciones aplicables de este capítulo.
Compras
PROCESODE COMPRAS
Elfabricante de excipientes debería contar con un sistema de selección y aprobación de proveedores de materiales y servi-
cios críticos para la calidad (por ejemplo, fabricantes o laboratorios subcontratistas). La aprobación del proveedor por parte del
departamento de calidad debería requerir una evaluación del sistema de gestión de calidad del proveedor, que incluya la evi-
dencia adecuada de que puede cumplir sistemáticamente con las especificaciones acordadas y mantener la rastreabilidad. Esto
puede requerir auditorías periódicas a las intalaciones de fabricación del proveedor. Se deberían mantener registros sobre estas
actividades. Los materiales deberían adquirirse según la especificación acordada de proveedores aprobados.
INFORMACIÓNDE COMPRAS
Los contratos de compras deberían describir el material o servicio ordenado, incluyendo, cuando sean críticos para la calidad
del excipiente, lo siguiente:
• el nombre, tipo, clase, estilo, grado, número de código del artículo u otra información de identificación precisa que per-
mita el rastreo a las especificaciones de la materia prima y el envase,
• diseños, requisitos de procesamiento, instrucciones de inspección y demás datos técnicos pertinentes, incluyendo los re-
quisitos para la aprobación o calificación del producto, procedimientos, equipos de procesamiento y personal,
• adhesión a las secciones correspondientes de este capítulo de fabricantes o laboratorios pertinentes contratados, y
• una declaración para notificar al fabricante de excipientes sobre cambios significativos en materias primas críticas para la
calidad.
Vl:RIFICACIÓN
DEPRODUCTOS
COMPRADOS
Deberían existir procedimientos para la aprobación y liberación de material crítico para la calidad. Cuando se reciben, los
materiales críticos para la calidad deberían permanecer en cuarentena y no deberían usarse antes de su aprobación. Se puede
establecer un sistema de cuarentena eficaz mediante etiquetas o signos de identificación adecuados y/u otros sistemas manua-
les de documentación. Cuando el sistema de cuarentena y el control de las existencias se gestionan mediante sistemas compu-
tarizados en vez de un control físico de las existencias, los sistemas de control deberían prevenir el uso de material no liberado.
El sistema de cuarentena puede no ser factible para materiales suministrados a través de duetos. Para estos casos, el fabricante
de excipientes debería establecer un acuerdo con el proveedor de tal manera que se notifique al fabricante sobre el material
que no cumpla con la especificación. Las actividades de muestreo deberían realizarse bajo condiciones definidas, de conformi-
dad con un método de muestreo predeterminado y utilizando procedimientos diseñados para prevenir la contaminación y la
contaminación cruzada.
Los materiales críticos para la calidad usados en la fabricación de un excipiente deberían analizarse o verificarse de otro mo-
do antes de su uso. La verificación debería incluir la disponibilidad y una verificación del certificado de análisis del proveedor y,
si fuera factible, al menos una prueba de identificación. El plan de análisis debería organizarse de tal forma que se diferencien
las pruebas de rutina de aquellas que se realizan con poca frecuencia o únicamente para nuevos proveedores. La entrega de
productos a granel debería someterse a controles adicionales para asegurar la pureza y ausencia de contaminación en el mate-
rial (por ejemplo, uso de camiones cisterna especiales (dedicados), sellos que evidencian su alteración intencional, certificados
de limpieza, pruebas analíticas o auditorías del proveedor). Estos procedimientos, actividades y resultados deberían quedar do-
cumentados.
USP42 Información General/ (1078) BuenasPrácticasde Fabricación 7739
Produccióny Prestaciónde Servicios
CONTROL DE PRODUCCIÓNY PRESTACIÓNDE SERVICIOS
Las actividades de producción deberían realizarse bajo condiciones controladas (ver también el apartado anterior, Planeación
de la Realizacióndel Productoen Realizacióndel Producto).Las siguientes secciones presentan ejemplos específicos de controles
importantes, algunos de los cuales pueden no aplicar para todos los fabricantes de excipientes.
INSTRUCCIONESY REGISTROSDE PRODUCCIÓN
Las instrucciones y registros de producción son necesarios, aunque pueden variar dependiendo del tipo de operación: por
ejemplo, procesos por partidas frente a procesos continuos. Debería existir un documento controlado en el que se describa la
forma como se produce el excipiente (por ejemplo, instrucciones maestras de producción, registros maestros de producción y
control o definiciones de procesos). Para procesos por partidas, debería porporcionarse al área de producción una reproduc-
ción exacta de las instrucciones maestras de producción pertinentes. Para procesos continuos, debería contarse con un libro de
registro de procesamiento. Deberían existir registros disponibles para cada partida de excipiente producida, que deberían in-
cluir información completa relacionada con la producción y control de cada partida. Para procesos continuos, la partida y sus
registros deberían estar definidos (por ejemplo, basados en el tiempo o una cantidad definida). Los registros pueden mante-
nerse en diferentes lugares pero de un modo que permita recuperarlos rápidamente. Cuando los registros, tanto para procesos
por partidas como para continuos, sean críticos para la calidad del excipiente, deberían incluir lo siguiente:
• fecha y hora en que se completó cada etapa o registro de fecha y hora de parámetros fundamentales,
• identificación de personas que realizan y supervisan o verifican directamente cada etapa, operación o parámetro de con-
trol importante,
• identificación de los principales equipos y líneas utilizados,
• datos sobre materiales para permitir la rastreabilidad: por ejemplo, número de partida y cantidades de materias primas/
productos intermedios y la hora en que se agregaron,
• resultados de controles de proceso y de laboratorio,
• la cantidad producida para la partida definida y una declaración del porcentaje de rendimiento teórico, a menos que no
sea cuantificable (por ejemplo, como sucede en algunos procesos continuos),
• inspección del área de envasado y etiquetado antes y después de su uso,
• registros de control de etiquetado,
• descripción de envases y cierres del excipiente,
• descripción del muestreo realizado,
• fallas, desviaciones y sus investigaciones,
• resultados de la inspección del producto final.
LIMPIEZADE EQUIPOS
El fabricante de excipientes debería diseñar y justificar procedimientos de limpieza y sanitización y ofrecer pruebas de su
efectividad. En plantas multipropósito, se puede emplear el enfoque de producto modelo(grupos de producto de tipo similar)
para justificar un procedimiento adecuado. Los procedimientos de limpieza y sanitización deberían quedar documentados y
estar lo suficientemente detallados para permitir a los operadores limpiar cada tipo de equipo de manera reproducible y eficaz.
Debería generarse un registro que confirme que se ha cumplido con estos procedimientos. El equipo y los utensilios se deben
limpiar y sanitizar cuando sean críticos para la calidad del excipiente, a intervalos adecuados para evitar la contaminación y la
contaminación cruzada del excipiente. El estado de limpieza del equipo debería quedar adecuadamente documentado.
Cuando se usa un equipo multipropósito, es importante poder determinar todo uso previo al momento de investigar una
contaminación cruzada o la posibilidad de que se produzca dicha contaminación (ver también más adelante en esta sección,
Registrosde Usodel Equipo).El arrastre fortuito de remanentes de material ocurre con frecuencia durante una campaña de pro-
ducción, y por lo general es aceptable porque normalmente no se requiere la limpieza entre partidas sucesivas del mismo exci-
piente para mantener los niveles de calidad. Los productos que dejen residuos que no puedan eliminarse de manera efectiva
deberían producirse en equipos especiales (dedicados). Para procesamiento continuo, el fabricante debería determinar y justifi-
car la frecuencia en la limpieza del equipo.
RECUPERACIÓN
DE DISOLVENTES,LICORESMADREY CRISTALIZACIONES
DE SEGUNDASCOSECHAS
Cuando los disolventes se recuperan y reutilizan en el mismo proceso o en procesos diferentes, aquellos deberían cumplir
con las normas apropiadas antes de reutilizarlos o mezclarlos con otro material aprobado. Resulta frecuente la reutilización de
licores madre o filtrados que contienen cantidades recuperables de excipientes, reactantes o productos intermedios. Tales pro-
cesos deberían quedar documentados en los registros o libros de producción para permitir su rastreabilidad.
~z 1
n-
7740 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación/ Información General USP42
MEZCLADURANTEELPROCESO
La mezcla durante el proceso para garantizar la uniformidad de la partida o para facilitar su procesamiento debería contro-
larse y documentarse. Si el objetivo de la operación es garantizar la uniformidad de la partida, aquella debería realizarse de tal
forma que se asegure la mezcla homogénea de los materiales hasta el grado que sea factible y debería poder reproducirse en
cada partida.
CONTROLDE PROCESO
Se deberían realizar inspecciones y pruebas durante el proceso basándose en el monitoreo del proceso o en el análisis de una
muestra en lugares y tiempos definidos. Los métodos de muestreo deberían estar documentados para garantizar que la mues-
tra es representativa y está claramente etiquetada. Las muestras del proceso no deberían ser devueltas a producción para su
incorporación en la partida final.
Los resultados de las pruebas del proceso deberían quedar registrados y deberían cumplir con los parámetros del proceso
establecidos o con tolerancias aceptables. Las instrucciones de trabajo deberían definir el procedimiento a seguir e indicar có-
mo utilizar los datos de inspección y prueba para controlar el proceso. Deberían definirse acciones a realizar cuando los resulta-
dos queden fuera de los límites especificados. Cuando la aprobación para continuar con el proceso se emite dentro del depar-
tamento de producción, las pruebas especificadas deberían ser realizadas por personal capacitado y los resultados registrados.
ENVASADOY ETIQUETADO
Se deberían emplear procedimientos para proteger la calidad y pureza del excipiente en el momento del envasado y para
garantizar que se aplique la etiqueta correcta a todos los envases. Las operaciones de envasado y etiquetado deberían estar
diseñadas para evitar mezclas. Deberían implementarse procedimientos para garantizar la impresión y emisión de las etiquetas
correspondientes y que las etiquetas contengan la información correcta. El procedimiento también debería especificar la inme-
diata destrucción o devolución al almacenamiento controlado de las etiquetas excedentes. Las etiquetas excedentes que lleven
números de partida deberían ser destruidas. Las instalaciones de envasado y etiquetado deberían inspeccionarse inmediata-
mente antes de su uso para garantizar que se hayan retirado los materiales no requeridos para la próxima operación de enva-
sado. Para los casos en que los excipientes se etiquetan en la línea de envasado, se envasan en bolsas preimpresas, o se envían
a granel en camiones cisterna, debería existir documentación del sistema utilizado para cumplir con el propósito de los proce-
dimientos indicados anteriormente.
REGISTROSDE USO DELEQUIPO
Se deberían mantener registros de uso del equípo crítico para la calidad, los cuales deberían contribuir a determinar la se-
cuencia de las actividades de limpieza, mantenimiento y producción.
VALIDACIÓNDE PROCESOSPARAPRODUCCIÓNY PRESTACIÓNDE SERVICIOS
Un factor importante para garantizar la calidad del producto radica en el diseño y control adecuados de los procesos de
fabricación, debido a que el análisis del producto por sí solo no es suficiente para revelar variaciones que pudieran haber ocu-
rrido. Cada etapa de proceso de fabricación debería controlarse en la medida necesaria para garantizar que el excipiente cum-
ple con las especificaciones establecidas. El concepto de validación del proceso es un elemento básico para garantizar el cum-
plimiento de estas metas de garantía de calidad. Las reacciones del proceso, los parámetros operativos, las etapas de purifica-
ción, las impurezas y las pruebas fundamentales necesarias para el control del proceso deberían quedar documentados, con lo
que se proporcionaría la base para la validación.
Elfabricante de excipientes no siempre puede llevar a cabo el programa de validación completo que generalmente se em-
plea en la industria farmacéutica; sin embargo, el fabricante de excipientes debería demostrar la operación sistemática de cada
proceso de fabricación: por ejemplo, a través de informes de estudios de capacidad de proceso, de desarrollo y de cambio de
escala.
Identificacióny Rastreabilidad
RASTREABILIDAD
Todos los artículos críticos para la calidad (por ejemplo, materias primas, materiales del envase, productos intermedios y ex-
cipientes terminados) deberían estar claramente identificados y deberían ser rastreables por medio de registros. Estos registros
deberían permitir la rastreabilidad del excipiente durante las etapas anteriores y posteriores del proceso. La identificación de las
materias primas utilizadas en los procesos de producción por partidas debería ser rastreable mediante el uso de un sistema de
numeración de partidas u otro sistema apropiado. La identificación de materias primas usadas en excipientes producidos me-
USP42 InformaciónGeneral/ (1078) BuenasPrácticasde Fabricación7741
diante procesamiento continuo debería indicar el período durante el cual una partida (lote) particular de materia prima fue
procesado en la planta. Los fabricantes de excipientes también deberían tener conocimiento adecuado acerca del origen de
cualquier materia prima derivada de plantas o animales.
En ocasiones, las materias primas, incluidos disolventes, se almacenan en tanques para productos a granel u otros contene-
dores de gran tamaño, lo que dificulta la separación precisa de partidas. No obstante, el uso de tales materiales y contenedores
debería quedar documentado en los registros de producción.
ESTADODE INSPECCIÓNY PRUEBAS
Debería contarse con un sistema para identificar el estado de la inspección de todos los artículos críticos para la calidad,
incluidas las materias primas, materiales del envase, productos intermedios y excipientes terminados. Aunque se prefiere alma-
cenar los materiales en lugares debidamente definidos, cualquier medio que identifique claramente el estado de la prueba es
satisfactorio. La alimentación continua de materiales puede requerir de consideraciones especiales para cumplir con estos re-
quisitos.
ETIQUETADO
El etiquetado para envases de excipientes está sujeto a requisitos reglamentarios nacionales e internacionales, que pueden
incluir medidas de transporte y seguridad. Las etiquetas deben incluir, como mínimo, lo siguiente:
• el nombre del excipiente y el grado, si corresponde,
• el nombre del fabricante del excipiente y/o del distribuidor,
• el número de partida a partir del cual se puedan determinar los antecedentes completos de la partida,
• condiciones especiales de almacenamiento, si corresponde.
PROPIEDADDELCLIENTE
El fabricante de excipientes debería establecer y mantener procedimientos para verificar, almacenar y mantener los materia-
les provistos por el cliente destinados a incorporarse en el excipiente del cliente. La verificación por parte del fabricante no
exime al cliente de la responsabilidad de suministrar material aceptable. Se debería registrar e informar al cliente de cualquier
material perdido, dañado o inadecuado para su uso. En este caso, deberían existir procedimientos para el desecho y el reem-
plazo aceptables del material. Elfabricante debería establecer disposiciones para proteger toda otra propiedad real e intelec-
tual suministrada por el cliente (por ejemplo, equipos de prueba, métodos de prueba y especificaciones).
Conservación del Producto
MANIPULACIÓN,ALMACENAMIENTO
Y CONSERVACIÓN
Todos los excipientes, productos intermedios y materias primas deberían manipularse y almacenarse bajo condiciones apro-
piadas de temperatura, humedad y luz, de modo tal que no se vean afectadas su identidad, calidad y pureza. Se acepta el
almacenamiento exterior de materias primas (por ejemplo, ácidos, otras sustancias corrosivas y materiales explosivos) o exci-
pientes, siempre que los recipientes ofrezcan protección adecuada contra el deterioro o la contaminación de sus contenidos,
que sus etiquetas de identificación se mantengan legibles y que los recipientes se limpien adecuadamente antes de abrirlos y
usarlos. Se deberían mantener registros de las condiciones de almacenamiento si aquellas fueran críticas para el cumplimiento
continuo del material con las especificaciones.
SISTEMASDE ENVASE
Un sistema de envase de excipientes debería incluir las siguientes características:

• especificaciones escritas y métodos de examinación y de prueba,
• procedimientos de limpieza, cuando se reusen los envases,
• sellos que evidencian su alteración intencional,
• envases que ofrezcan protección adecuada contra el deterioro o la contaminación del excipiente durante el transporte y
almacenamiento recomendado,
• envases que no contaminen o interactúen con el excipiente,
• procedimientos de almacenamiento y manipulación que protejan a los envases y cierres, que minimicen el riesgo de con-
taminación, daños o deterioro y que eviten confusiones (por ejemplo, entre envases con especificaciones diferentes pero
que presentan apariencia similar).
Si se reutilizan envases retomables de excipientes, el etiquetado anterior debería eliminarse o borrarse. Si los envases se reu-
tilizan únicamente para el mismo excipiente, se deberían eliminar o borrar por completo los números anteriores de partida o la
etiqueta en su totalidad.
77 42 (1078) Buenas Prácticas de Fabricación / Información General USP42
ENTREGAY DISTRIBUCIÓN
La identificación y rastreabilidad de aspectos criticas para la calidad constituyen requisitos para los fabricantes de excipien-
tes. Se deberían mantener registros de distribución de envíos de excipientes, los cuales deberían identificar, por partida de ex-
cipiente, a dónde y a quién se le envió el excipente, la cantidad enviada y la fecha del envío, de tal manera que se facilite la
recuperación en caso necesario. Cuando los excipientes son manipulados por una serie de distribuidores diferentes, debería ser
posible rastrearlos hasta el fabricante original, y no únicamente hasta el proveedor anterior. El fabricante debería mantener la
integridad y la calidad del producto después de la inspección y prueba finales. Cuando se especifique mediante un contrato,
esta protección debería ampliarse para incluir la entrega al destino final. Los excipientes deberían suministrarse únicamente
dentro de su período de caducidad y/o reanálisis.
CONTROL DE DISPOSITIVOSDE MEDICIÓNY MONITOREO
El equipo de medición y prueba, incluidos los sistemas computarizados, identificados como críticos para la calidad, deberían
ser calibrados y sometidos a mantenimiento. Esto incluye instrumentos usados durante el proceso y equipos de prueba usados
en el laboratorio. El programa de control debería incluir la estandarización o calibración de instrumentos y equipos a intervalos
adecuados de acuerdo con un programa establecido y por escrito. Este programa debería contener instrucciones específicas,
cronogramas, límites de exactitud y precisión y disposiciones para acciones correctivas en caso de que no se cumpla con los
límites de exactitud o precisión. Los estándares de calibración deberían ser rastreables a estándares nacionales reconocidos o
estándares farmacopeicos, según corresponda.
No deberían utilizarse instrumentos y equipos que no cumplan con las especificaciones establecidas, y se debería investigar
la validez de los resultados previos desde la última calibración exitosa. Los usuarios deberían poder conocer y verificar el estado
actual de calibración de los equipos críticos para la calidad.
MEDICIONES,ANÁLISISY MEJORAMIENTO
La organización debería planear e implementar actividades de monitoreo, medición y mejoramiento requeridas para demos-
trar el cumplimiento del excipiente con los requisitos del cliente y para garantizar el cumplimiento del sistema de gestión de
calidad con este capítulo. La organización debería evaluar oportunidades de mejoramiento a través de la medición y análisis de
tendencias de productos y procesos.
Monitoreo y Medición
SATISFACCIÓNDELCLIENTE
Elfabricante de excipientes debería establecer actividades de medición para evaluar la satisfacción del cliente. Dichas medi-
ciones pueden incluir quejas del cliente, devolución de excipientes y retroalimentación del cliente. Esta información debería
impulsar actividades que fomenten el mejoramiento continuo de la satisfacción del cliente.
AUDITORÍAINTERNA
El fabricante de excipientes debería llevar a la práctica un sistema integral de auditorías internas de calidad planificadas y
documentadas para determinar si las actividades vinculadas a la calidad cumplen las disposiciones planificadas y para determi-
nar la eficacia del sistema de gestión de calidad. Las auditorías se deberían programar basándose en el estado y la importancia
de la actividad. Las auditorías y las acciones de seguimiento se deberían llevar a cabo conforme a procedimientos documenta-
dos. Los resultados de las auditorías se deberían documentar y discutir con el personal de la gerencia responsable del área au-
ditada. El personal de la gerencia responsable del área auditada debería tomar medidas correctivas respecto a las deficiencias
encontradas. El Apéndice7. Consideraciones sobreAuditoríaresultará de ayuda para establecer un programa de auditorías inter-
nas.
MONITOREOY MEDICIÓNDE PROCESOS
Elfabricante de excipientes debería identificar las pruebas y mediciones necesarias para controlar de forma adecuada los
procesos de fabricación y del sistema de gestión de calidad. Cuando sea crítico para la calidad del excipiente, se deberían esta-
blecer técnicas para verificar que los procesos se encuentran bajo control. Cuando ocurran desviaciones de los resultados pla-
neados, se deberían tomar acciones correctivas para garantizar que el excipiente cumple con los requisitos. Se deberían realizar
revisiones periódicas de indicadores fundamentales tales como atributos de calidad del proceso y fallas en el mismo a fin de
evaluar la necesidad de mejoras.
MONITOREOY MEDICIÓNDE PRODUCTOS
Elfabricante de excipientes debería establecer métodos y procedimientos de prueba para garantizar que el producto cumple
de manera constante con las especificaciones. Deberían adaptarse métodos analíticos para tales propósitos. Los métodos analí-
ticos pueden ser aquellos incluidos en la edición vigente de la farmacopea correspondiente u otra norma aceptada. Pueden
usarse también métodos no farmacopeicos. Si el fabricante de excipientes indica que su producto cumple con una farmacopea
o un compendio oficial, en ese caso
• se debería demostrar que las pruebas analíticas no farmacopeicas son equivalentes a las de los compendios;
• el producto debería cumplir con los capítulos y advertencias generales aplicables de la USP.
CONTROLESDE LABORATORIO
Los controles de laboratorio deberían incluir datos completos a partir de las pruebas requeridas para garantizar el cumpli-
miento con las especificaciones y normas, incluyendo lo siguiente:
• una descripción de la muestra recibida para el análisis, junto con el nombre del material, un número de lote u otro código
distintivo y la fecha en que se tomó,
• una declaración con referencia a cada método de prueba empleado,
• un registro de los datos crudos obtenidos en cada prueba, incluyendo gráficas, cromatogramas, diagramas y espectros de
los instrumentos de laboratorio, identificados para mostrar el material y partida específicos analizados,
• un registro de los cálculos realizados relacionados con la prueba,
• resultados de las pruebas y la manera en que se comparan con las especificaciones establecidas,
• un registro de la persona que realizó cada prueba y la(s) fecha(s) de realización de las pruebas.
Debería existir un procedimiento documentado para la preparación de reactivos y soluciones de laboratorio. Los reactivos y
soluciones adquiridas de una fuente externa deberían etiquetarse con el nombre, concentración y fecha de caducidad adecua-
dos. Deberían conservarse registros de la preparación de soluciones que incluyan el nombre de la solución, la fecha de prepa-
ración y las cantidades de material empleado. Las soluciones volumétricas deberían normalizarse de acuerdo con un método
interno o utilizando un estándar reconocido. Deberían conservarse registros de la normalización.
Siempre que se utilicen, los reactivos y estándares de referencia primarios deberían almacenarse adecuadamente y no sería
necesario analizarlos al momento de recibirlos, siempre que se cuente con un certificado de análisis del proveedor. Los están-
dares de referencia secundarios deberían ser preparados, identificados, analizados, aprobados y almacenados de manera ade-
cuada. Debería existir un procedimiento documentado para la calificación de estándares de referencia secundarios frente a es-
tándares de referencia primarios. Se debería definir un período de reevaluación para los estándares de referencia secundarios y
cada partida debería ser recalificada periódicamente de acuerdo con un protocolo o procedimiento documentado.
ANÁLISISY LIBERACIÓN
DE EXCIPIENTES
TERMINADOS
El análisis de excipientes terminados debería realizarse a cada partida para garantizar que el excipiente cumple con las espe-
cificaciones documentadas. Debería existir un procedimiento para garantizar que la documentación de fabricación apropiada,
además de los resultados de prueba, sea evaluada antes de liberar el excipiente terminado. La responsabilidad relacionada con
la liberación del excipiente terminado debería recaer sobre el departamento de calidad. Para excipientes producidos mediante
procesos continuos, es posible garantizar que el excipiente cumple con las especificaciones documentadas a través de los resul-
tados de pruebas de proceso u otros registros de control de proceso.
RESULTADOS
DE PRUEBAFUERADE ESPECIFICACIONES
Los resultados de pruebas fuera de especificaciones (OOS, por sus siglas en inglés) deberían ser investigados y documenta-
dos de acuerdo con un procedimiento documentado. Los resultados de las muestras reanalizadas pueden usarse para reempla-
zar a los resultados de prueba originales únicamente si se demuestra con fundamentos basados en una investigación docu-
mentada que el resultado original es erróneo. Cuando se utilizan análisis estadísticos, deben incluirse tanto los datos originales
como los del reanálisis. El procedimiento para OOS debería definir las técnicas estadísticas a utilizar y sus circunstancias de uso.
Los mismos principios se aplican cuando se sospecha que la muestra no es representativa del material del que se tomó.
MUESTRASRETENIDAS
Cuando resulte posible, se debería retener una muestra representativa de cada partida de excipiente. El período de retención
debería ser adecuado a la fecha de caducidad o de reevaluación. Las muestras retenidas deberían almacenarse y conservarse de
tal forma que se puedan recuperar fácilmente en instalaciones que ofrezcan un ambiente adecuado. El tamaño de la muestra
debería ser de al menos dos veces la cantidad requerida para llevar a cabo un análisis completo de las especificaciones.
CERTIFICADOS
DE ANÁLISIS
La organización debería proveer certificados de análisis de las especificaciones requeridas para cada partida de excipiente.
IMPUREZAS
Cuando sea posible, los fabricantes de excipientes deberían identificar y establecer límites apropiados para impurezas. Los
límites se deberían basar en datos de seguridad adecuados, límites descritos en compendios oficiales o en otros requisitos, así
como en consideraciones estrictas de GMP. Los procesos de fabricación se deberían controlar adecuadamente de tal manera
que las impurezas no excedan de tales límites establecidos. Muchos excipientes se extraen o se purifican usando disolventes
orgánicos. Estos disolventes generalmente se eliminan mediante secado. Es importante que las especificaciones del excipiente
incluyan pruebas y límites para disolventes residuales.
ESTABILIDAD
Aunque muchos excipientes son estables y pueden no requerir de pruebas exhaustivas para garantizar su estabilidad, la esta-
bilidad de los excipientes es un factor importante que contribuye a la calidad general del producto farmacéutico. Para exci-
pientes que hayan estado en el mercado durante mucho tiempo, se pueden usar los datos históricos para indicar la estabilidad.
Cuando no existan datos históricos, se debería realizar un análisis y/o un programa de evaluación documentados, diseñados
para evaluar las características de estabilidad del excipiente. Los resultados de dicho análisis y/o evaluación de estabilidad se
deberían usar para determinar las condiciones de almacenamiento y las fechas de reanálisis o caducidad adecuadas. El progra-
ma de análisis debería incluir lo siguiente:
• el número de partidas, tamaños de las muestras e intervalos de pruebas,
• condiciones de almacenamiento de muestras retenidas para análisis,
• métodos de prueba adecuados que sean indicativos de estabilidad,
• almacenamiento del excipiente en envases que simulen el envase comercial, cuando sea posible.
La estabilidad de los excipientes puede verse afectada por cambios no detectados en materias primas o cambos sutiles en los
procesos de fabricación o condiciones de almacenamiento. Es posible que el transporte de los excipientes se realice en distin-
tos tipos de envases que puedan afectar su estabilidad (por ejemplo, frascos de plástico o vidrio, tambores de metal o plástico,
bolsas, camiones cisterna u otros envases de productos a granel).
Algunos excipientes pueden estar disponibles en diferentes grados (por ejemplo, diversos pesos moleculares de un polímero
o diferentes proporciones de monómeros, diferentes tamaños de partícula o densidades aparentes) o pueden ser mezclas de
otros excipientes. Estos excipientes pueden ser muy similares a otros dentro de un grupo de productos. Pequeñas diferencias
cuantitativas de algunos de los componentes pueden ser la única variación significativa entre un producto y otro. Para estos
tipos de excipientes, puede ser apropiado un enfoque de producto modelo para evaluar la estabilidad de excipientes similares.
Los estudios de estabilidad de este tipo deberían comprender la selección de varios productos modelo que se esperaría simulen
la estabilidad del grupo de producto en evaluación. Esta selección se debería fundamentar en criterios científicos sólidos y que-
dar documentada. Se pueden usar los datos de estudios de estabilidad de estos productos modelo para determinar la estabili-
dad teórica de productos similares.
PERÍODOSDE CADUCIDAD/REANÁLISIS
Se debería asignar un período de caducidad o reanálisis a cada excipiente y comunicárselo al cliente. Una práctica común
consiste en emplear un período de reanálisis en vez de un período de caducidad.
CONTROLDE UN PRODUCTOQUE NO CUMPLECON LOS REQUISITOS
Toda materia prima, producto intermedio o excipiente terminado que no cumpla con las especificaciones debería ser clara-
mente identificado y controlado para evitar su uso inadvertido o su liberación para venta. Se debería mantener un registro de
productos que no cumplen con los requisitos. Toda incidencia de falta de cumplimiento con los requisitos se debería investigar
para identificar la causa. Esta investigación debería quedar documentada y deberían tomarse acciones para evitar la repetición
del problema. Se debería contar con un procedimiento documentado en el que se defina la forma en que debe realizarse y
registrarse la recuperación de un excipiente de la cadena de distribución. Se debería contar con procedimientos para la evalua-
ción y eliminación subsiguiente de productos que no cumplen con los requisitos. Los productos que no cumplen con los requi-
sitos deberían ser revisados de acuerdo con los procedimientos documentados para determinar si es posible
• reprocesarlo o reelaborarlo para que cumpla con los requisitos especificados,
• que sea aceptado por el cliente, con su consentimiento,
• cambiarle su grado y emplearlo en otras aplicaciones,
• destruirlo.
REPROCESAMIENTO
La repetición de una actividad que es parte normal del proceso de fabricación (reprocesamiento) debería ocurrir únicamente
cuando ya se haya documentado que el excipiente se puede fabricar de tal manera. En cualquier otro caso, se debería cumplir
con la guía de reelaboración.
REELABORACIÓN
Cualquier actividad que no sea parte normal del proceso de fabricación (reelaboración) se debería realizar únicamente si-
guiendo una revisión documentada de los riesgos para la calidad del excipiente y con la aprobación del departamento de cali-
dad. Al evaluar los riesgos, se debería considerar lo siguiente, según corresponda:
• nuevas impurezas que pudieran haberse introducido como resultado de la reelaboración,
• análisis adicionales para controlar la reelaboración,
• registros y rastreabilidad hasta las partidas originales,
• criterios de aceptación adecuados para el excipiente reelaborado,
• impacto sobre la estabilidad o la validez del intervalo de reevaluación,
• desempeño del excipiente.
Cuando se determina que es necesario reelaborar un excipiente, se requiere investigar y evaluar las causas. La equivalencia
de la calidad del material reelaborado con el material original también debería ser evaluada y documentada para garantizar
que la partida cumplirá con las especificaciones y características establecidas. Las partidas de excipientes que no cumplan con
las especificaciones de manera individual no deben mezclarse con otras partidas que cumplan con los requisitos en un intento
de ocultar material adulterado o que no cumple totalmente con la norma.
EXCIPIENTES
DEVUELTOS
Los excipientes devueltos se deberían identificar y colocar en cuarentena hasta que el departamento de calidad haya com-
pletado una evaluación de su calidad. Se debería contar con procedimientos para la retención, análisis, reprocesamiento y ree-
laboración del excipiente devuelto. Se deberían mantener registros para productos devueltos, que deberían incluir el nombre y
el número de partida del excipiente, el motivo de la devolución, la cantidad devuelta y la disposición final del excipiente de-
vuelto.
ANÁLISISDE DATOS
Elfabricante de excipientes debería desarrollar métodos para evaluar la efectividad de su sistema de gestión de calidad y
emplear tales datos para identificar oportunidades de mejoramiento. Estos datos se pueden derivar de quejas de clientes, revi-
siones de productos, estudios de capacidad de procesamiento, auditorías internas y auditorías del cliente. El análisis de tales
datos se puede utilizar como parte de la revisión gerencial (ver también el apartado anterior, RevisiónGerencialen la sección
ResponsabilidadGerencial).Se puede llevar a cabo una revisión periódica de indicadores fundamentales tales como atributos de
calidad de productos, quejas de los clientes y falta de cumplimiento de los productos con las especificaciones para evaluar la
necesidad de mejoramiento.
Mejoramiento
MEJORAMIENTO
CONTINUO
Elfabricante de excipientes debería tomar medidas en favor del mejoramiento continuo de los procesos de fabricación y del
sistema de gestión de calidad. Con el fin de identificar oportunidades de mejoramiento continuo, se puede considerar el análi-
sis de los siguientes indicadores de rendimiento:
• causas de la falta de cumplimiento del producto con sus especificaciones,
• resultados de auditorías internas y externas,
• devoluciones y quejas de los clientes,
• fallas operativas y del proceso.
Acciones Correctivas-El fabricante de excipientes debería establecer, documentar y mantener procedimientos para:
• determinar las causas primarias que ocasionan la falta de cumplimiento con las especificaciones,
• garantizar la implementación y efectividad de las acciones correctivas,
• implementar y registrar cambios en los procedimientos que resulten de las acciones correctivas.
Acciones Preventivas-El fabricante de excipientes debería establecer, documentar y mantener procedimientos para:
• emprender acciones preventivas para afrontar problemas al nivel correspondiente a los riesgos,
• implementar y registrar cambios en los procedimientos que resulten de las acciones preventivas.
GLOSARIO
Los siguientes términos se definen según se utilizan en este capítulo. Siempre que fue posible, se emplearon las definiciones
utilizadas por la Conferencia Internacional sobre Armonización como base para este apéndice de definiciones.
Alta Gerencia: persona o grupo de personas que dirigen y controlan una organización al nivel más alto. El nivel más alto
puede ser tanto a nivel del sitio o a nivel corporativo y dependerá de la manera en que esté organizado el sistema de gestión
de calidad.
Archivo Maestro de un Fármaco (Drug Master File o DMF): información detallada acerca de la fabricación de un exci-
piente presentada a la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (U.S. Food and Drug Administra-
tion o FDA).
Calibración: demostración de que un instrumento o dispositivo de medición particular genera resultados dentro de los
límites especificados al compararlos con los resultados producidos por un estándar rastreable o de referencia sobre un intervalo
apropiado de mediciones.
CEP (Certificado de Aptitud de la FarmacopeaEuropea): certificación otorgada a fabricantes individuales por la Direc-
ción Europea para la Calidad de los Medicamentos (European Directorate for the Quality of Medicines o EDQM) cuando se
determina que un excipiente o ingrediente activo específico cumple con una monografía de la FarmacopeaEuropea.
Certificado de Análisis: documento que cita los métodos de prueba, especificaciones y resultados del análisis de una
muestra representativa de la partida a que se va a liberar.
Cliente: organización que recibe el excipiente una vez que éste ha quedado fuera del control del fabricante del excipien-
te; incluye intermediarios, agentes y usuarios.
Contaminación: introducción indeseada de impurezas de origen químico o microbiológico o de materia extraña en una
materia prima, producto intermedio o excipiente durante la producción, muestreo, envasado o reenvasado, almacenamiento o
transportación.
Contaminación Cruzada: contaminación de un material o producto con otro material o producto.
Control de Calidad: verificaciones o pruebas de que se cumple con las especificaciones.
Controles/Pruebas de Proceso: controles efectuados durante la producción para monitorear y, si fuera apropiado, ajustar
el proceso y/o asegurar que el producto intermedio o el excipiente cumpla con su especificación.
Criterios de Aceptación: límites numéricos, intervalos u otras medidas de aceptación adecuadas para los resultados de
pruebas.
Crítico: etapa de proceso, condición de proceso, requsito de prueba u otro parámetro o punto relevante que se debe
controlar dentro los criterios predeterminados para asegurar que el excipiente cumpla con su especificación.
Crítico para la Calidad: describe un material, etapa de proceso o condición de proceso, requisito de prueba u otro pará-
metro relevante que influye directamente sobre los atributos de calidad del excipiente y que se debe controlar dentro de los
criterios predeterminados.
Cuarentena: estado de los materiales aislados físicamente o mediante cualquier otro método efectivo mientras se espera
una decisión sobre su aprobación o rechazo subsiguiente.
Desviación: apartamiento de una instrucción aprobada o norma establecida.
Especificaciones: lista de pruebas, referencias a procedimientos analíticos y criterios de aceptación apropiados que repre-
sentan límites numéricos, intervalos u otros criterios para las pruebas descritas para un material.
Estabilidad: cumplimiento constante del excipiente con sus especificaciones.
Excipiente: toda sustancia distinta del API que ha sido evaluada de manera apropiada respecto a su seguridad y que se
incluye intencionalmente en un sistema de liberación de fármacos.
Fecha de Caducidad (Expiración): fecha que designa el tiempo durante el cual se espera que el excipiente permanezca
dentro de las especificaciones y después de la cual no debería utilizarse.
Fecha de Reevaluación (Fecha de Reanálisis): fecha en la que debería reexaminarse el material para asegurar que aún
cumple con la especificación.
Garantía de Calidad: suma total de planes organizados con el objetivo de garantizar que todos los excipientes tengan la
calidad requerida para el uso al que están destinados y que se mantengan los sistemas de calidad.
Impureza: componente de un excipiente cuya presencia es indeseada pero que surge como consecuencia del proceso de
fabricación.
Ingrediente Farmacéutico Activo (API, por sus siglas en inglés): cualquier sustancia o mezcla de sustancias que esté
destinada a ser usada en la fabricación de un producto farmacéutico y que, cuando se utiliza en la producción de un medica-
mento, se convierte en un ingrediente activo del mismo. Tales sustancias están destinadas a proporcionar actividad farmacoló-
gica u otro efecto directo en el diagnóstico, cura, alivio, tratamiento o prevención de una enfermedad, o a afectar la estructura
o cualquier función del cuerpo humano o de los animales.
Instrucción Maestra de Producción (Registro Maestro de Producción y Control): documentación que describe la fabri-
cación del excipiente desde de la materia prima hasta la terminación.
Licor Madre: líquido residual que queda después de los procesos de critalización o aislamiento.
Lote: Ver Partida.
Materia Prima: término general usado para indicar materiales iniciales, reactivos y disolventes destinados al uso en la pro-
ducción de productos intermedios o excipientes.
Material: término general utilizado para indicar materias primas (materiales iniciales, reactivos y disolventes), adyuvantes
del proceso, productos intermedios, excipientes, materiales del envase y etiquetado.
Material Adulterado: material contaminado con una sustancia extraña o que no ha sido fabricado aplicando GMP. Esta
definición no corresponde a materiales que simplemente no cumplen con las especificaciones físicas o químicas.
Material de Envase (de Empaque): material destinado a proteger a un producto intermedio o excipiente durante su al-
macenamiento y transporte.
Mezcla: mixtura de diferentes grados en un lote homogéneo.
Número de Partida (Número de Lote): combinación única de números, letras y/o símbolos que identifica a una partida
y a partir de la cual se puede determinar toda la historia de producción y distribución.
Partida (Lote): cantidad específica de material producido en un proceso o serie de procesos de manera tal que se espera
que sea homogénea. En un proceso continuo, una partida puede corresponder a una porción definida de la producción. El
tamaño de la partida se puede definir mediante una cantidad fija o mediante la cantidad producida en un intervalo fijo de
tiempo.
Proceso Continuo: proceso que produce continuamente un material a partir del suministro continuo de materias primas.
Proceso del Fabricante/de Fabricación: todas las operaciones de recepción de materiales, producción, envasado, reenva-
sado, etiquetado, reetiquetado, control de calidad, liberación y almacenamiento de excipentes y controles relacionados.
Proceso por Partidas (por Lotes): proceso que produce el excipiente a partir de un suministro discreto de materias pri-
mas que están presentes antes de completar la reacción.
Producción: operaciones involucradas en la preparación de un excipiente, desde la recepción de materiales hasta el pro-
cesamiento y envasado del excipiente.
Producto Farmacéutico (Medicinal): forma farmacéutica en su envase inmediato final destinada a la comercialización.
Producto Intermedio: material que debe someterse a etapas adicionales de fabricación antes de transformarse en un ex-
cipiente.
Producto Modelo: producto representativo de un grupo de productos similares con respecto a su composición, funciona-
lidad o especificación.
Puesta en Servicio: introducción de un equipo para su uso de manera controlada.
Rastreabilidad: capacidad de determinar la historia, aplicación o ubicación que se esté considerando: por ejemplo, el ori-
gen de materiales y partes, historia del proceso o distribución del producto después de su liberación.
Recuperación: proceso de retiro de un excipiente de la cadena de distribución.
Reelaboración: sometimiento de material procesado previamente que no cumplió con las normas o especificaciones a
etapas de proceso que son diferentes del proceso normal.
Registro: documentación que indica los resultados logrados y/o que proporciona pruebas de las actividades realizadas. Se
puede presentar en papel, disco magnético, formato electrónico u óptico, fotográfico o cualquier otro formato o una combi-
nación de los mismos.
Registro de Partida o Lote (Batch Record): documentación que proporciona la historia de la fabricación de una partida de
excipiente.
Reprocesamiento: repetición de una actividad que es parte normal del proceso de fabricación y ha sido previamente do-
cumentada.
Validación: programa documentado que proporciona un alto nivel de garantía de que un proceso, método o sistema es-
pecífico producirá constantemente un resultado que cumplirá con los criterios de aceptación predeterminados.
APÉNDICE
Consideraciones sobre Auditoría
INTRODUCCIÓN
Muchos excipientes se emplean en productos alimenticios, cosméticos e industriales, al igual que en productos farmacéuti-
cos. De este modo, las condiciones ambientales, los equipos y las técnicas operativas empleadas en la fabricación de excipien-
tes son a menudo las que se emplean en la industria química más que en la industria farmacéutica. Los procesos químicos
pueden producir impurezas derivadas de reacciones secundarias. Por consiguiente, un cuidadoso control de proceso resulta
esencial para minimizar los niveles de impurezas y contaminación.
Los excipientes habitualmente se fabrican a gran escala, empleando procesamiento continuo y controles de proceso auto-
matizados. Los equipos de producción y los procesos varían dependiendo del tipo de excipiente a producir, la escala de pro-
ducción y el tipo de operación (por ejemplo, procesos por partidas frente a procesos continuos).
Este apéndice tiene el propósito de ayudar en la preparación de una auditoría de un fabricante de excipientes. Tanto audito-
res internos como externos (ver también Auditoría Interna en Monitoreo y Medición en la sección Medición,Análisisy Mejora-
miento) encontrarán este apéndice útil para identificar asuntos importantes de GMP y calidad que requieren evaluación. Esta
sección ayudará a los fabricantes de excipientes a identificar resultados tangibles fundamentales al adoptar las normas de GMP
citadas en las otras secciones de este capítulo; en lo que respecta a la planeación de una auditoría, este apéndice también ayu-
dará a verificar la calidad del proceso de fabricación del excipiente y del sistema de gestión de calidad del fabricante.
Y=
PRINCIPIOSDE GMP
Control de Impurezas y Contaminación: El cliente que usa un excipiente para su producto farmacéutico por lo general
no somete al excipiente a etapas adicionales de reacción química o de purificación; el excipiente se utiliza tal como se compra.
Por consiguiente, es probable que las impurezas presentes en el excipiente estén presentes en el producto farmacéutico. Si
bien los fabricantes de formas farmacéuticas tienen cierto control sobre la calidad del excipiente a través de especificaciones,
los fabricantes de excipientes tienen mayor control sobre las características físicas, la calidad y la presencia de impurezas en los
excipientes que producen.
La contaminación externa del excipiente puede surgir del ambiente de fabricación; sin embargo, los procesos químicos em-
pleados en la fabricación de excipientes habitualmente se llevan a cabo en sistemas cerrados que protegen de dicha contami-
nación, incluso cuando los recipientes de reacción no están dentro de los edificios. El ambiente externo puede requerir de con-
troles adecuados para evitar la contaminación potencial cuando el excipiente o el material en proceso quedan expuestos.
Propiedades y Funcionalidad del Excipiente: Los excipientes se utilizan con frecuencia en aquellos tipos de productos
farmacéuticos para los que las características físicas, tales como el tamaño de partícula, pueden ser importantes. Aunque el
fabricante de la forma farmacéutica terminada es directamente responsable de identificar las características físicas particular-
mente requeridas, también es responsabilidad del fabricante de excipientes controlar los procesos de fabricación de excipien-
tes para garantizar el cumplimiento constante con las especificaciones del excipiente. Siempre que sea posible, se debería te-
ner en cuenta el uso final del excipiente. Esto es particularmente importante si el excipiente es un componente directo de un
producto farmacéutico estéril o si declara ser libre de pirógenos.
Correspondencia entre Fabricación y Control de Cambios: El cabal entendimiento del proceso de fabricación y el con-
trol efectivo de cambios son la mejor forma de asegurar la constancia de la calidad del excipiente de una partida a la otra. La
implementación de cambios también puede tener consecuencias en los procesos de registro ante agencias reguladoras.
Los cambios en los procesos de fabricación de excipientes pueden resultar en cambios de las propiedades físicas o químicas
del excipiente que se vuelven evidentes únicamente durante procesamientos subsiguientes o en la forma farmacéutica termi-
nada. Esto es particularmente importante en el contexto del proceso de aprobación del producto farmacéutico cuando se ha-
cen comparaciones de bioequivalencia entre partidas piloto, para estudios clínicos (bio batch) y las partidas de escala comer-
cial. Los cambios realizados al excipiente suministrado para el producto comercial con respecto al excipiente suministrado para
el bio batch no deberían afectar la calidad y desempeño del producto farmacéutico comercial. El aumento en escala (sca/e-up)
de las partidas de excipientes hasta la partida de producción comercial puede implicar diversas etapas, pudiéndose requerir de
datos para demostrar la correspondencia entre las partidas a lo largo de dicho proceso de aumento de escala.
Rastreabilidad: La rastreabilidad de los registros relacionados con las partidas para facilitar investigaciones y recuperacio-
nes de productos, también es un requisito básico de las GMP.
APLICACIÓNDE LOS PRINCIPIOSDE GMP
Es responsabilidad del fabricante de excipientes designar y documentar los fundamentos para el punto del proceso de fabri-
cación en que resulta adecuado aplicar las GMP.A partir de este punto, se deberían aplicar las GMP apropiadas. Elfabricante
debería aplicar un nivel de GMP a cada etapa de fabricación directamente relacionado con la importancia que guarda cada
etapa en lo que respecta a garantizar la integridad del producto. Esto se puede demostrar utilizando un procedimiento de eva-
luación de riesgos (por ejemplo, HACCP,FMEA).
La rigurosidad de las GMP en la producción de excipientes se debería incrementar a medida 9ue avanza el proceso, desde
las etapas iniciales hasta las etapas finales de fabricación, purificación y envasado. El procesamiento físico (por ejemplo, granu-
lado, recubrimiento o manipulaciones físicas del tamaño de partícula, tales como trituración o micronización), así como el pro-
cesamiento químico de excipientes, se deberían realizar por lo menos en cumplimiento con las normas sugeridas en este capí-
tulo.
Se debería reconocer que no todos los productos intermedios pueden requerir de análisis. No obstante, un fabricante de
excipientes debería ser capaz de identificar puntos críticos o fundamentales en el proceso de fabricación en los que se requiere
de muestreos y análisis selectivos de productos intermedios para monitorear el desempeño del proceso.
CONSIDERACIONES
GENERALES
SOBREAUDITORÍA
Las auditorías realizadas a una operación de excipientes se verán influenciadas por el propósito de la auditoría y el uso al que
está destinado el excipiente. Las etapas fundamentales de un proceso de producción se deberían examinar para determinar si
el fabricante controla estas etapas, de tal forma que el proceso se desarrolle en forma constante. En general, una auditoría
debería evaluar la capacidad del fabricante de excipientes para entregar un producto que cumpla constantemente con las es-
pecificaciones establecidas.
El equipo de auditoría puede estar formado por ingenieros, analistas de laboratorio, agentes de compras, expertos en infor-
mática, personal de mantenimiento y demás personal que sea apropiado para el alcance y propósito de la auditoría. Los audi-
tores externos deben respetar la confidencialidad del los procesos y otras divulgaciones del fabricante.
Una auditoría debería centrarse en las etapas de proceso críticas para la calidad que son necesarias para producir un exci-
piente que cumpla con los criterios físicos y químicos establecidos. El fabricante de excipientes debería identificar y controlar
estas etapas. Las etapas de proceso críticas para la calidad pueden implicar cierto número de operaciones o procesos unitarios.
Las etapas críticas para la calidad pueden incluir, aunque no limitarse, a las siguientes:
• cambios de fases que involucran a la molécula deseada, disolvente, transportador inerte o vehículo (por ejemplo, disolu-
ción, cristalización, evaporación, secado, sublimación, destilación o absorción),
• separación de fases (por ejemplo, filtración o centrifugación),
• cambios químicos que involucran a la molécula deseada (por ejemplo, eliminación o adición de agua de hidratación, ace-
tilación o formación de una sal),
• ajustes de la solución que contiene la molécula (por ejemplo, ajuste del pH),
• mediciones precisas de componentes del excipiente, soluciones del proceso y materiales reciclados agregados (por ejem-
plo, pesada o determinaciones volumétricas),
• mezcla de diversos componentes,
• cambios que ocurren en el área superficial, tamaño de partícula o uniformidad de la partida (por ejemplo, molienda, aglo-
meración o mezclado).
PUNTOS DE INSPECCIÓNDE UNA AUDITORÍA
Un método adecuado para la auditoría de una planta de excipientes consiste en una revisión de las siguientes áreas:
• falta de cumplimiento/conformidad-tales como el rechazo de una partida que no cumplió con las especificaciones, que-
jas de clientes, devolución de un producto por parte del cliente o recuperación de un producto de la cadena de distribu-
ción. Elfabricante debería haber determinado la causa de la falta de cumplimiento, preparado un informe de la investiga-
ción y haber iniciado y documentado la acción correctiva subsiguiente. Se deberían examinar los registros y la documen-
tación para garantizar que la falta de cumplimiento no haya resultado de un proceso deficientemente desarrollado o in-
constante;
• archivos de quejas de clientes-como informes de que algún aspecto del producto hace que no resulte totalmente ade-
cuado para su uso; estos problemas pueden deberse a impurezas o incongruencias en el proceso de fabricación del exci-
piente;
• libros de registro de control de cambios-para determinar si la empresa evalúa los cambios significativos con el objeto de
decidir si es necesario notificar al cliente y/o a la autoridad reguladora;
• documentos de las reuniones sobre productos que no cumplen con los requisitos o de la Junta de Revisión de Materiales
(Material ReviewBoard)y/o registros equivalentes que demuestren que la disposición de los productos que no cumplen los
requisitos se maneja en forma apropiada por el personal responsable;
• registros de fórmulas maestras y de producción, para observar revisiones frecuentes que pudieran manifestar problemas
en el proceso de producción de excipientes;
• evidencia de la presencia de productos intermedios que no hayan reaccionado y de residuos de disolventes en el excipien-
te terminado;
• sistemas de gestión de materiales, para garantizar el control adecuado sobre materiales que no cumplen con los requisitos
de tal forma que no se puedan vender a clientes ni utilizarse en la fabricación sin autorización;
• revisión del diagrama de flujo del proceso, para ayudar a entender las diversas etapas de procesamiento. Las etapas críti-
cas y los puntos de muestreo se deberían identificar como parte de la revisión de los registros de procesamiento;
• revisión de las medidas de control de contaminación.
Al evaluar la aptitud de las medidas tomadas para prevenir la contaminación y la contaminación cruzada de materiales du-
rante el proceso, resulta adecuado considerar los siguientes factores de riesgo:
• el tipo de sistema (por ejemplo, abierto o cerrado). A menudo, los sistemas cerrados en plantas químicas no están cerra-
dos cuando se cargan y/o cuando se descarga el producto final. Además, en ocasiones se usan los mismos recipientes de
reacción para diferentes reacciones;
• la forma del material (por ejemplo, húmedo o seco);
• la etapa de proceso y uso de los equipos y/o área (por ejemplo, multipropósito o dedicados);
• producción continua frente a producción por partidas.
REVISIÓNDE DOCUMENTACIÓNY REGISTROS
La documentación requerida para las etapas tempranas del proceso no requiere ser tan exhaustiva como en las etapas finales
del mismo. Es importante que exista una cadena de documentos y que dicha cadena esté completa en los siguientes casos:
• el excipiente se puede identificar y cuantificar en los procesos en que la molécula se produce durante el transcurso del
proceso. Para la producción por partidas, también se puede establecer un balance teórico de masa con límites apropia-
dos, puesto que las desviaciones de las tolerancias resultan un buen indicio de una pérdida de control;
• se identifica una impureza u otra sustancia que pueda afectar de manera adversa el perfil de impurezas o la forma de la
molécula y se realizan intentos posteriores para eliminarla.
A medida que el procesamiento químico avanza, se debería establecer una cadena de documentos que incluya lo siguiente:
• un proceso documentado,
• la identificación de etapas críticas de procesamiento,
• registros de producción apropiados,

• registros de números de partidas iniciales y subsiguientes,
• registros de materias primas utilizadas,
• comparación de resultados de prueba frente a estándares relevantes.
Si se registran desviaciones importantes con respecto al proceso de fabricación normal, debería existir evidencia de investi-
gaciones adecuadas, además de una revisión de la calidad del excipiente. Se debería continuar generando documentación
completa durante la parte restante del proceso para etapas de proceso críticas para la calidad hasta que el excipiente haya sido
envasado y entregado al usuario final. La partida debería ser homogénea dentro de las especificaciones del fabricante. Esto no
requiere de la mezcla final del material proveniente de un proceso continuo si los controles de proceso pueden demostrar el
cumplimeinto con las especificaciones en toda la partida.
Se deberían establecer los siguientes requisitos básicos a fin de promover la uniformidad en las inspecciones de GMP de ex-
cipientes:
• asignación al excipiente de un número exclusivo de partida que permita rastrearlo a lo largo de la fabricación hasta su
liberación y certificación,
• controles adecuados para la preparación de un registro de partida destinado a un procesamiento por partidas y/o de un
registro de producción, hoja de registro u otra documentación adecuada para un procesamiento continuo,
• comprobación de que la partida se ha preparado empleando las guías de GMP desde el punto del procesamiento en el
que se determinó que se debían aplicar las GMP de excipientes,
• confirmación de que la partida no se combinó con material de otras partidas con el propósito de ocultar o diluir una parti-
da adulterada,
• registros que evidencien que se extrajeron muestras de la partida de conformidad con un plan de muestreo que garantice
una muestra representativa de la partida,
• registros que muestren que la partida ha sido analizada empleando métodos de prueba establecidos científicamente, dise-
ñados para garantizar que el producto cumple con las normas, especificaciones y características establecidas,
• datos de estabilidad adecuados que respalden el período de uso indicado del excipiente; estos datos se pueden obtener
de datos históricos, estudios reales sobre el excipiente específico o estudios pertinentes de productos modelo que puedan
simular razonablemente el desempeño del excipiente específico.
(1079) BUENASPRÁCTICASDE ALMACENAMIENTOY DISTRIBUCIÓN

PARAMEDICAMENTOS
INTRODUCCIÓN
Este capítulo de información general describe buenas prácticas de almacenamiento y distribución para asegurar que los pro-
ductos farmacéuticos (medicamentos) lleguen al usuario final (profesionales de la salud, pacientes y consumidores) con la cali-
dad intacta.
Las siguientes definiciones se aplican en el contexto de este capítulo.
ALCANCE
Las buenas prácticas de almacenamiento y distribución se aplican a todas las organizaciones e individuos implicados en cual-
quier aspecto del almacenamiento y la distribución de todos los medicamentos, incluyendo, entre otros, los siguiente:
• Fabricantes de medicamentos para uso humano y veterinario cuya fabricación puede implicar operaciones en las instala-
ciones del titular de la solicitud (es decir, instalaciones que pertenecen al titular de una Solicitud de Medicamento Nuevo
aprobada o Solicitud Abreviada de Medicamento Nuevo) o en las de un contratista a nombre del titular de la solicitud
• Operaciones de almacenamiento por parte del fabricante o de un contratista designado por el titular de la solicitud
• Operaciones de reenvasado en las que el medicamento puede ser propiedad de una organización distinta al fabricante
principal
• Operaciones de laboratorio realizadas en las instalaciones del fabricante o contratista
• Consultorios médicos y veterinarios
• Farmacias incluyendo, entre otras, farmacias de venta al por menor, de preparación magistral, de especialidad, de orden
por correo, de hospitales y de residencias para ancianos
• Importadores y exportadores de Registro
• Distribuidores de venta al por mayor; compañías de distribución implicadas en servicios automotrices, ferroviarios, maríti-
mos y aéreos
• Proveedores externos de servicios logísticos, fletes tercerizados y consolidadores
• Profesionales de la salud que dispensan o administran el medicamento al usuario final
USP42 Información General/ (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento 7751
• Distribuidores por correo, incluyendo el Servicio Postal de EE.UU.(U.S. Postal Service o USPS)y demás servicios de trans-
porte, incluyendo los servicios de transporte expedito
Se pretende que la información aquí provista se aplique a todos los medicamentos independientemente de los requisitos
ambientales de almacenamiento o distribución.
Se reconoce la posibilidad de que existan casos especiales, así como una gran cantidad de medios alternativos para cumplir
con el propósito de este capítulo, por lo que dichos medios se deben justificar con bases científicas. Aunque este capítulo no
pretende tratar el almacenamiento y la distribución de ingredientes farmacéuticos activos (API),excipientes, productos ra-
dioactivos, reactivos, disolventes, dispositivos médicos, gases medicinales o materiales paraensayos clínicos cuyos requisitos de
almacenamiento pudieran no haberse definido todavía (p. ej., medicamentos para ensayos clínicos de Fase 1), los principios
generales descritos en este capítulo pueden ser útiles si se aplican de manera selectiva o íntegra.
Este capítulo de información general no sustituye o reemplaza ningún requisito nacional, federal y/o estatal sobre almacena-
miento y distribución, ni a las monografías USP.El Capítulo General (659) Requisitos de Envasadoy Almacenamiento contiene
definiciones sobre las condiciones de almacenamiento. Este capítulo no abarca temas tales como falsificaciones, medicinas fal-
sificadas, pedigrí de los medicamentos ni otros aspectos de seguridad de la cadena de suministro tales como temas relativos a
la cadena de custodia.
ANTECEDENTES
los procesos de almacenamiento y distribución pueden implicar un complejo desplazamiento de productos alrededor del
mundo así como diferencias en los requisitos de documentación y manejo, y en la comunicación entre diversas entidades en la
cadena de suministro. La transformación de las buenas prácticas en un buen almacenamiento y distribución ayuda a solventar
dichos desafíos y establece un estado de control.
Las buenas prácticas de almacenamiento y distribución descritas en este capítulo deben facilitar el desplazamiento de medi-
camentos a través de una cadena de suministro que se controla, mide y analiza para lograr el mejoramiento continuo, y que
debe mantener la integridad del medicamento en su sistema de envase durante el almacenamiento y la distribución.
RESPONSABILIDADES
Eltitular de la solicitud del medicamento, el fabricante del medicamento (en el caso de muchos medicamentos de venta
libre, cuando no existe una solicitud) y el reenvasador comparten responsabilidades y deberes primarios que incluyen, entre
otros, los siguientes:
• Las decisiones de presentar propuestas reglamentarias sobre el contenido de este capítulo para el almacenamiento y la
distribución de productos farmacéuticos, cuando corresponda. Si se violara alguno de los Sistemas de Gestión de Calidad
y no pudiera justificarse o documentarse mediante evidencia científica, la entidad apropiada deberá considerar interven-
ciones con respecto al producto para asegurar la seguridad pública.
• Determinar las prácticas adecuadas de almacenamiento y manejo
• Comunicar las prácticas de almacenamiento y distribución a través de la cadena de suministro
• Perfiles de estabilidad del medicamento o información relacionada con la estabilidad procedente del propietario, que in-
cluyan condiciones de distribución y desviaciones permisibles. Dichos perfiles de estabilidad incluyen las condiciones de
almacenamiento aprobadas para la vida útil del medicamento y, cuando corresponda, datos que avalen las condiciones
de distribución, si éstas difieran de las condiciones de almacenamiento.
• Cuando sea necesario sustentar desviaciones generales o desviaciones de temperatura, las partes apropiadas, tales como
el solicitante titular, deben transmitir los requisitos ambientales pertinentes (p. ej., cuando corresponda, datos de estabili-
dad del ciclo de vida específicos del producto). Cuando no sea posible revisar o compartir los datos de estabilidad, puede
ser necesario realizar una evaluación a fin de considerar revisiones reglamentarias u otras acciones apropiadas (p. ej., des-
trucción del producto o análisis adicionales de estabilidad).
• Retirar y recuperar el medicamento del mercado si se determina su adulteración en cualquier parte de la cadena de sumi-
nistro
No obstante, todas las organizaciones que forman parte de la cadena de suministro tienen la responsabilidad de asegurarse
de que el manejo de los medicamentos se efectúe dentro de los parámetros adecuados de almacenamiento y distribución y
que no afecte la identidad, contenido, calidad, pureza o seguridad del medicamento.
Cada actor de la cadena de suministro tiene la responsabilidad y obligación de aceptar y transferir el medicamento de una
entidad a otra.
CONSIDERACIONES
DE ETIQUETADO
PARA MEDICAMENTOS
Los requisitos ambientales para las condiciones de almacenamiento del medicamento deben indicarse en el sistema de enva-
se-cierre primario del medicamento. Si el espacio en el envase inmediato es demasiado pequeño (p. ej., una ampolla) o si re-
sulta poco práctico para el sistema de envase-cierre (p. ej., un envase de blíster), dicha información se puede colocar en el
envase más inmediato de tamaño apropiado (p. ej., en la caja). Las condiciones ambientales de almacenamiento y/o las adver-
7752 (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento/ InformaciónGeneral USP42
tencias ambientales deben ser evidentes, indelebles y estar bien fijadas en el envase más externo (por lo regular, el envase para
transporte).
Aquellos productos clasificados como materiales de riesgo biológico y/o mercancías peligrosas por el U.S. Department of
Transportation (Departamento de Transporte de los EE.UU.)u otras autoridades o entidades pertinentes deben etiquetarse, al-
macenarse y manejarse de conformidad con los reglamentos federales/estatales/locales aplicables. Los medicamentos clasifica-
dos como sustancias controladas por la U.S. Drug Enforcement Administration (Administración de Control de Narcóticos de los
EE.UU.)o por los requisitos estatales individuales, deben etiquetarse y manejarse de acuerdo con los reglamentos aplicables.
Las buenas prácticas y controles de etiquetado deben proveer al receptor instrucciones para el manejo correcto del producto
farmacéutico al momento de la recepción. Cuando las condiciones de almacenamiento de un medicamento no se encuentren
fácilmente disponibles, se deben utilizar las condiciones de almacenamiento descritas en Requisitosde Envasadoy Almacena-
miento(659}.
Las etiquetas de los productos que presentan información que se extiende más allá de la temperatura individual de almace-
namiento a largo plazo facilitan el transporte y el uso a los transportistas, distribuidores, profesionales de la salud y pacientes.
Las etiquetas de los productos deben definir con claridad el intervalo de temperatura de almacenamiento, además de interva-
los más amplios de temperaturas de distribución o uso cuando así se permitan. Los productos etiquetados con la leyenda
"Mantener en un lugar frío" o "No congelar'' están sujetos a interpretación, por lo que no se aconseja su uso si no se acompa-
ña de intervalos de temperatura. Las definiciones de almacenamiento y los intervalos de temperatura de la USP se definen en
las Advertenciasy RequisitosGenerales.
Durante el transporte internacional, se deben usar los idiomas adecuados para asegurarse de que los encargados del manejo
entiendan los requisitos establecidos en el etiquetado del medicamento. Se recomienda el uso de símbolos reconocidos por
organizaciones internacionales.
Los medicamentos se podrán transportar a temperaturas que estén fuera de las temperaturas de almacenamiento declaradas
siempre que se demuestre que se ha mantenido la calidad del producto mediante datos de estabilidad y justificación científica
pertinente. La duración de los estudios de estabilidad y de las condiciones de almacenamiento para un medicamento deben
ser suficientes para abarcar el transporte, la distribución y el uso subsiguiente del medicamento. Los datos recolectados a partir
de las normativas de ICH, Ql A R2, de análisis acelerados o de análisis en una condición ICH intermedia se pueden usar para
evaluar el efecto de las desviaciones a corto plazo fuera de las condiciones de almacenamiento declaradas que pudieran ocurrir
durante el almacenamiento y/o la distribución.
SISTEMASDE GESTIÓNDE CALIDAD

Las buenas prácticas de almacenamiento y distribución requieren que las entidades implicadas en el almacenamiento y/o la
distribución de productos farmacéuticos mantengan un Sistema de Gestión de Calidad (SGC) que se base en conceptos nor-
mativos de calidad, que incluya buenas prácticas de fabricación de acuerdo con las agencias reglamentarias pertinentes, y que
complemente a las guías de la ICH sobre calidad, incluyendo ICH Q 7OPharmaceutical QualitySystem(Ql O Sistema de Calidad
Farmacéutica) y Q9 QualityRiskManagement(Q9 Gestión de Riesgos para la Calidad). En el contexto de este capítulo, el SGC
incluye los siguientes programas de sistema de gestión: (1) Sistemade Gestiónde Almacenamiento,(2) Sistemade Gestiónde
Distribución,(3) Sistemade GestiónAmbienta/y (4) Sistemade Gestiónde Riesgos.
El SGC de almacenamiento y distribución debe, como mínimo, abarcar los siguientes elementos: acciones correctivas y pre-
ventivas, gestión de cambios, gestión de desviaciones/investigaciones y el proceso de revisión de gestiones.
Se debe contar con contratos escritos (p. ej., Contrato de Calidad, Contrato Técnico, Contratos de Nivel de Servicio) suscri-
tos entre las organizaciones involucradas correspondientes en la cadena de suministro del medicamento. Esto significa que el
fabricante original podría no estar obligado a mantener un Contrato Escrito con todas las partes de la cadena de suministro. El
uso de contratos escritos garantiza claridad y transparencia, además de que define las responsabilidades de cada organización
en la cadena de suministro.
Buenas Prácticas de Documentación
El SGC debe incluir buenas prácticas de documentación. Dicha documentación incluye procedimientos operativos estándar,
así como políticas y normas corporativas, además de protocolos y otros documentos escritos que establecen los elementos del
SGC. Los programas de SGC deben describir hechos y acciones que se deben documentar mediante el uso de un lenguaje
adecuado, el número de copias requeridas y cualquier otra cuestión que asegure el procesamiento adecuado del medicamento
y la prevención de retrasos. El proceso de documentación debe emplear un documento normativo tal como un manual de
calidad u otra práctica, y debe incluir evaluaciones de rutina para efectuar revisiones y actualizaciones necesarias.
Los procedimientos escritos deben asegurar que los medicamentos se conserven de acuerdo con las instrucciones de sus eti-
quetados y con los requisitos reglamentarios correspondientes. Los procedimientos deben proveer por escrito las etapas nece-
sarias para completar el proceso y asegurar resultados uniformes y estandarizados. Se deben incluir los siguientes elementos:
(1) cómo y cuándo se debe trasladar un producto de un envase/vehículo de transporte a otro, (2) cómo manejar los productos
cuando se presentan fallas en el equipo o ante retrasos en la distribución debido a retenciones aduaneras y (3) cómo comuni-
carse con las partes necesarias.
USP42 InformaciónGeneral/ (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento 7753
El SGC debe requerir el monitoreo de procesos para demostrar que se mantiene un estado de control, en el que el conjunto
de controles provee una garantía constante del desempeño continuo del proceso y de la calidad del producto (ICH Ql O).
Si se presentan desviaciones, se debe documentar el incumplimiento y llevar a cabo y documentar la investigación corres-
pondiente. El proceso de investigación debe determinar el origen de la desviación. Por ejemplo, se debe determinar lo siguien-
te: si el medicamento experimentó estrés, daños, retrasos o lapsos ambientales, o si se produjeron errores en la documenta-
ción. El personal de gestión de calidad de suministro asociado tendrá la responsabilidad final de aprobar o rechazar la investi-
gación. El proceso de investigación debe vincularse con el programa de gestión de riesgos para asegurar que se lleva a cabo
una mitigación apropiada y que se ponen en práctica medidas preventivas.
Por ejemplo, se debe llevar a cabo una investigación por escrito si los procesos de recepción y/o transferencia resultan en la
exposición de un medicamento a condiciones inaceptables de temperatura o contaminación (p. ej., plagas, microorganismos
o humedad). Cualquier violación de los procedimientos operativos estándar debe documentarse con su respectiva justificación
de riesgos, según se requiera. Esta información se debe remitir a la organización apropiada responsable del medicamento. El
medicamento debe colocarse en cuarentena y la eliminación final debe tener una buena base científica con evidencias adecua-
das para justificar las decisiones.
Los fabricantes deben desarrollar procedimientos escritos para registrar los procesos de seguridad que confirmen la integri-
dad del envase-cierre para medicamentos que requieren manejo especial, tales como sellos de seguridad para sustancias con-
troladas. Los registros de mercancías devueltas y recuperadas deben contemplar la forma en que se evaluó el medicamento
mediante un procedimiento escrito. Asimismo, la capacitación sobre dichos procedimientos debe formar parte del SGC.
Se deben conservar registros de compra y venta de medicamentos que muestren la fecha de la compra o suministro; el
nombre y cantidad del medicamento; el nombre y dirección del proveedor o consignatario; y los números de lote asociados.
Estos registros permiten rastrear un medicamento en la cadena de abastecimiento.
Todos los registros y documentos deben mantenerse de acuerdo con un programa rastreable de retención de registros y se
deben poner a disposición de las autoridades reglamentarias, cuando así lo requieran. El departamento responsable del SGC
debe aprobar, firmar y fechar dichos documentos.
Sistema de Gestión de Almacenamiento
SITIOSY PROCESOSDE ALMACENAMIENTO
Es importante que cada entidad defina sus sitios de almacenamiento apropiados para asegurar la disponibilidad de controles
adecuados. Estos sitios incluyen edificios e instalaciones para almacenamiento de medicamentos (p. ej., depósitos, áreas de
almacenamiento o retención, depósitos del fabricante original, depósitos de contratistas, depósitos de distribución de venta al
por mayor, áreas de almacenamiento de farmacias de ventas al por mayor u órdenes por correo, áreas de almacenamiento de
farmacias de hospitales o residencias para ancianos; y áreas de almacenamiento de aduanas fronterizas).
En dichos sitios, se pueden presentar dos procesos básicos. Primero, la recepción para almacenamiento consiste en traer un
medicamento a una instalación, mientras que transferir se refiere a trasladar un medicamento internamente dentro de una ins-
talación o hacia dentro o fuera de un vehículo. Segundo, almacenar y retener se refieren a mantener la posesión temporal de
un medicamento en el proceso de la cadena de suministro durante la cual, el producto no experimentará ningún movimiento.
ALMACENAMIENTO
EN EDIFICIOSE INSTALACIONES
Las áreas de almacenamiento del medicamento deben mantener la temperatura del producto entre los límites definidos en
la etiqueta del mismo. Los edificios e instalaciones usados para conservar, almacenar y/o retener medicamentos deben ser de
tamaño adecuado para su uso previsto. Asimismo, dichas instalaciones deben ser adecuadas para prevenir la sobresaturación.
Los edificios e instalaciones deben contar con un diseño que permita controlar las condiciones ambientales cuando sea necesa-
rio y deben estar construidos con materiales fáciles o rápidos de limpiar. Se deben redactar procedimientos de higienización y
control de plagas que indiquen la frecuencia de la limpieza y los materiales y métodos que se deben usar. El programa de con-
trol de plagas debe asegurar la prevención de contaminación, así como el uso seguro de plaguicidas. Además, se deben man-
tener registros de todas las actividades de limpieza y control de plagas.
El almacenamiento debe mantenerse ordenado y debe permitir la segregación de medicamentos aprobados, en cuarentena,
rechazados, devueltos, o retirados del mercado. Si se emplean sistemas computarizados para controlar las condiciones de al-
macenamiento, el softwaredebe estar adecuadamente calificado para sus usos previstos. Las instalaciones deben contar con
controles para mitigar riesgos tales como incendios, inundaciones o explosiones. Aquellos medicamentos que pudieran ocasio-
nar dichos riesgos deben almacenarse de manera acorde a las circunstancias. Cuando las áreas de almacenamiento no estén
computarizadas, deben estar marcadas de manera visible y apropiada.
En sí, salvo que estén termostáticamente controladas, las instalaciones de almacenamiento no pueden ser validadas; no obs-
tante, se pueden calificar mediante un proceso de mapeo. Además, se debe calificar el suministro de energía por generador de
energía alternativo.
7754 (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento/ InformaciónGeneral USP42
RECEPCIÓNY TRANSFERENCIA
DE MEDICAMENTOS
El almacenamiento de un medicamento incluye no solo el periodo durante el cual el medicamento se retiene en las áreas de
almacenamiento del fabricante, sino también el tiempo que pasa en la plataforma de descarga del lugar de recepción. Cuando
los medicamentos llegan a los puertos de carga de los depósitos y a otras áreas de llegada, se deben transferir lo más pronto
posible a un depósito designado o dentro de un periodo que sea congruente con el riesgo y la exposición del producto en el
área receptora a un ambiente de almacenamiento designado para asegurar la menor cantidad de tiempo posible fuera de las
condiciones de almacenamiento especificadas según se indica en un procedimiento escrito.
Con respecto a la recepción del medicamento, se reconoce que el proceso de reacción del producto a las condiciones am-
bientales comienza de inmediato y puede ocurrir a gran velocidad (p. ej., alcanzar el equilibrio de temperatura dentro de po-
cos minutos o en unas cuantas horas, dependiendo de ciertos detalles como la masa del producto, el volumen y la densidad
de envasado tomando en cuenta el envase secundario y terciario) 1• El tiempo que el producto pasa en el vehículo de transpor-
te se considera parte del proceso de distribución y no es un sitio de almacenamiento.
Los puertos de recepción deben proteger las entregas de medicamentos del clima inclemente durante la descarga. Todas las
áreas de almacenamiento, incluyendo los puertos de carga y descarga para recepción y distribución de medicamentos, deben
estar limpios, ser lavables y exentos de plagas. El área de recepción de materiales entrantes debe limitar el acceso a personas
autorizadas. Cuando sea apropiado, se debe examinar el vehículo/contenedor de entrega antes de descargarlo para asegurarse
de que se haya mantenido una protección adecuada contra la contaminación durante el tránsito. Las entregas deben exami-
narse al momento de su recepción para verificar que los envases no estén dañados y que el envío corresponda con lo ordena-
do. Los resultados de dicho examen deben quedar documentados.
Se deben designar áreas que ofrezcan un espacio adecuado en el que los envases de medicamentos puedan ser limpiados y
abiertos para muestreo. Si el muestreo se lleva a cabo en el área receptora, se debe realizar de tal manera que prevenga la
contaminación y la contaminación cruzada, y que prevenga cualquier violación de los requisitos ambientales del medicamen-
to.
Se deben tomar precauciones adecuadas para prevenir robos y desvíos de medicamentos. Los medicamentos que hayan si-
do identificados como falsificados deberán colocarse en cuarentena para evitar su distribución posterior y se deberá establecer
contacto con las agencias reglamentarias correspondientes de acuerdo con los procedimientos establecidos.
Los registros de entrega adecuados (p. ej., según corresponda, documentos del desplazamiento de vehículos de transporte,
registros de recepción/entrega, registros de ingreso de datos, aparatos de registro de temperaturas y dispositivos similares, co-
nocimiento de embarque terrestre o marítimo, conocimiento de embarque aéreo hijo, conocimiento de embarque aéreo ma-
dre, etc.) deben ser revisados por cada entidad receptora de la cadena de abastecimiento para determinar si el producto ha
estado sujeto a cualquier retraso en su transporte o a otros eventos que pudieran haberlo expuesto a condiciones indeseadas.
Cada entidad debe asegurarse de que sus respectivos Contratos de Nivel de Servicios y documentos de sustento tales como
POE abarquen las responsabilidades de entrega y recepción de las partes implicadas en las transacciones.
No debe permitirse fumar, comer o beber en las áreas de almacenamiento/retención.
REFRIGERADORES
Y CONGELADORES
Los refrigeradores y congeladores usados para almacenar medicamentos deben mantener la temperatura del producto entre
los límites definidos en la etiqueta del mismo. Por lo regular, se establecería una especificación de 5° para una unidad de refri-
geración con un intervalo permisible de ±3º para almacenar productos cuya eti9ueta indicara una temperatura de 2º-8º, Las
temperaturas de congelación pueden variar y a menudo van de -25º a -1 O°. No obstante, algunos productos farmacéuticos
congelados requieren temperaturas menores, p. ej., temperaturas de hielo seco o de nitrógeno líquido.
Se debe contar con procedimientos operativos y protocolos de mantenimiento regulares a la par de convenios contractuales
escritos para todos los procedimientos de mantenimiento y evaluación, incluyendo los siguientes:
1. Los artículos deben almacenarse en las unidades de manera tal que permita un flujo adecuado de aire para mantener las
condiciones especificadas.
2. Las unidades deben colocarse en la instalación de modo que no estén sujetas a circunstancias ambientales extremas que
pudieran afectar su desempeño. Cuando esto no pueda prevenirse, el protocolo de mapeo debe incluir una disposición
que contemple la realización de análisis durante las circunstancias ambientales extremas anticipadas.
3. Las unidades comerciales grandes, tales como cámaras frigoríficas, se califican mediante un estudio de mapeo de tempe-
raturas u otro tipo de proceso de calificación para determinar la aptitud de la unidad para el almacenamiento de medica-
mentos. Se debe utilizar un número adecuado de dispositivos de registro de temperatura para registrar las temperaturas y
para proveer mapas de las temperaturas del área. Posteriormente, las unidades deben monitorearse de acuerdo con lo
establecido por los resultados del estudio de mapeo. Puede referirse a la sección de Monitoreode Temperatura en Sistema
de GestiónAmbiental.
4. Las unidades deben emplear sistemas de registro para registrar y rastrear las temperaturas. Los sistemas de alarma deben
ser una parte integral del sistema de monitoreo de refrigeradores y congeladores. Aunque los sistemas automatizados mo-
1 JP Emond, Study for TemperatureSensitiveProduct:PreliminaryTesting,Octubre 2009, University of Florida.

USP42 InformaciónGeneral/ (1079} Buenas Prácticas de Almacenamiento 7755
nitorean las unidades continuamente, se deben llevar a cabo verificaciones manuales acordes al programa de validación.
Cuando no se cuente con sistemas automatizados, se podrán emplear sistemas manuales.
Sistema de Gestión de Distribución
La distribución de medicamentos ocurre dentro de instalaciones o sitios correspondientes a fabricantes, mayoristas, áreas de
dispensación de farmacias, sitios de venta minorista, farmacias de clínicas/hospitales/residencias para ancianos y en la práctica
médica. La distribución de medicamentos se presenta como un desplazamiento de punto a punto dentro de la cadena de su-
ministro entre las instalaciones de distribución mediante camiones semiremolque, furgonetas, vehículos de servicios de emer-
gencias médicas, automóviles de representantes de la industria, trenes, aviones, barcos y vehículos de entrega de correos.
La comunicación dentro de la cadena de suministro debe coordinarse a fin de determinar el tiempo adecuado para transpor-
te y recepción de medicamentos, tomando en cuenta días feriados, fines de semana y demás formas de interrupción. Cuando
se requiere de distribución internacional, se deben emitir alertas por anticipado y utilizar el idioma adecuado para asegurar la
plena comprensión de los requisitos establecidos en el etiquetado del medicamento.
EMBALAJE
PARADISTRIBUCIÓN
Y TRANSPORTE
Los fabricantes farmacéuticos deben considerar el envase primario, secundario y terciario que mejor proteja el medicamento
durante su almacenamiento y distribución. Elfabricante debe documentar el análisis de desempeño del envase como parte de
su Sistema de Gestión de Calidad. Se encuentran disponibles diversos procedimientos de prueba estándar para evaluar el de-
sempeño del envase ante factores tales como impacto, vibración, presión, compresión y demás eventos del tránsito. Las orga-
nizaciones con métodos de prueba estándar incluyen las siguientes: la StandardPracticefor PerformanceTestingof ShippingCon-
tainersand Systems(Práctica Estándar para el Análisis de Desempeño de Envases y Sistemas de Transporte) de la American So-
ciety for Testing and Materials (Sociedad Estadounidense de Análisisy Materiales o ASTM)y las especificaciones de la lnterna-
tional Safe Transit Association (Asociación Internacional de Tránsito Seguro o ISTA)para diversos tipos de modos de tránsito,
tales como carga menor a la capacidad de un camión, paquetes pequeños, vagón y flete aéreo.
Es importante tener en cuenta que el retiro o modificación del empaque original puede someter al producto a condiciones
inaceptables.
El embalaje (terciario o subsiguientes) para la distribución del medicamento debe seleccionarse y comprobarse de modo que
se asegure el mantenimiento de la calidad del producto y para proteger el contenido de los rigores de la distribución, incluyen-
do daños ambientales o físicos.
Todos los medicamentos tienen requisitos de almacenamiento que pueden incluir controles específicos. El envase usado para
transportar el medicamento se debe calificar basándose en las condiciones declaradas, así como en las condiciones ambienta-
les anticipadas. Asimismo, se deben tomar en cuenta las diferencias de temperatura estacionales, el transporte entre hemisfe-
rios y las vías y modos de transporte.
El tipo, tamaño, ubicación y cantidad de los estabilizadores de temperatura requeridos para proteger el producto deben ba-
sarse en estudios documentados de los ambientes de distribución específicos, incluyendo rutas nacionales e internacionales,
modos de transporte, duración, temperatura y demás exposiciones o sensibilidades ambientales potenciales que pudieran te-
ner un impacto en la calidad del producto. Los materiales de los envases de transporte, tales como paquetes y materiales cáli-
dos/fríos usados para controlar las condiciones de temperatura se deben acondicionar adecuadamente antes de su uso. La pro-
tección mediante barreras puede ser importante para ayudar a determinar la posición de materiales tales como paquetes de
gel, a fin de evitar el contacto directo con el medicamento. Se debe determinar si deben llevarse a cabo estudios para asegurar
que el hielo seco y sus vapores no afectan de manera adversa al medicamento, incluyendo su etiquetado.
VALIDACIÓNY CALIFICACIÓN
DELDESEMPEÑOTÉRMICOPARASISTEMASDE TRANSPORTE
Los sistemas de transporte de medicamentos se deben monitorear continuamente mediante sistemas de monitoreo calibra-
dos, (verificación continua), o se deben calificar los sistemas de transporte y basarlos en datos históricos relativos al proceso.
No obstante, puede resultar aceptable el uso de datos de estabilidad de producto, así como una evaluación de riesgos de la
cadena de suministro para justificar el transporte sin monitorear o calificar continuamente el sistema de transporte.
Los estudios de transporte operativos y de desempeño deben constituir una parte genérica del protocolo formal de califica-
ción que pueda usar análisis en ambientes controlados o de campo de prueba real, dependiendo del canal de transporte pro-
yectado. Estos estudios deben reflejar configuraciones de carga, condiciones y extremos ambientales esperados reales. El análi-
sis se debe llevar a cabo en sistemas de envasado térmico activos y pasivos.
Sistema de Gestión Ambiental
Aunque los intervalos de temperatura de almacenamiento y distribución para medicamentos se declaran en el empaque, los
efectos de la humedad relativa ocurren en un marco de tiempo mucho más extenso. El envase primario se diseña y analiza
7756 (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento/ Información General USP42
para proteger el producto de la humedad; por lo tanto, se debe considerar el monitoreo de la humedad cuando se vaya a
almacenar un producto en una instalación no controlada.
MONITOREODE TEMPERATURA
Las condiciones ambientales representan parámetros importantes a considerar para el almacenamiento y la distribución de
todos los medicamentos y, dependiendo de los requisitos, pueden requerir de monitoreo. Cuando se requieren condiciones
específicas de almacenamiento y no se ha llevado a cabo la calificación del transporte, y ante la ausencia de envases activos o
pasivos, se deben usar aparatos o dispositivos de registro ambiental para confirmar que se ha mantenido un intervalo acepta-
ble durante cada etapa en la cadena de suministros.
La temperatura es una de las condiciones más importantes que se debe controlar y los requisitos para cada medicamento
deben basarse en datos de estabilidad. Las temperaturas deben rastrearse usando un sistema de monitoreo, mientras que los
dispositivos de monitoreo usados deben incluirse en el programa de calibración y/o mantenimiento preventivo. Los dispositi-
vos de monitoreo ambiental deben calibrarse al intervalo de operación. Los dispositivos de monitoreo usados deben proveer
un mecanismo de alerta cuando se presente alguna violación de los intervalos establecidos. Las siguientes prácticas y controles
son ejemplos de medidas apropiadas que deben ponerse en práctica para asegurar el control ambiental (ver también el capítu-
lo Dispositivosde Monitoreo-Tiempo, Temperaturay Humedad(1118)):
• Se debe utilizar un equipo de monitoreo de temperatura, un dispositivo de monitoreo, un equipo de registro de tempera-
tura u otro dispositivo adecuado para dicho propósito.
• Un número adecuado de monitores de temperatura u otra forma de registro o prueba de control de temperatura. Se de-
ben usar monitores de temperatura con cada proceso de distribución, a menos que se haya puesto en marcha otro proce-
so para asegurar los intervalos de temperatura especificados.
• Los monitores de temperatura electrónicos deben calibrarse al National lnstitute of Standards and Technology (Instituto
Nacional de Estándares y Tecnología o NIST) u otro estándar adecuado.
• Se pueden usar indicadores de temperatura química, según sea apropiado.
• Se deben establecer intervalos predeterminados de temperatura para todas las áreas aplicables, así como un plan de ac-
ción en el caso de una desviación inaceptable.
MAPEODE TEMPERATURA
Elfundamento de cualquier programa de temperatura en un espacio con temperatura controlada (p. ej., instalación, vehícu-
lo, envase para transporte, refrigerador, congelador) es la identificación y documentación de una justificación sólida usada para
un procedimiento de mapeo dado. Se deben definir la variabilidad de temperatura asociada con los sitios mapeados y el nivel
de riesgos térmicos para el producto, a menos que se haya puesto en marcha otro proceso para asegurar el control ambiental.
Se debe diseñar un estudio de mapeo de temperatura para evaluar la uniformidad de la temperatura y su estabilidad con el
paso del tiempo y a través de un espacio tridimensional. Para completar un perfil de temperaturas tridimensional se deben
medir puntos en no menos de tres planos dimensionales en cada dirección/eje-de arriba hacia abajo, de derecha a izquierda,
de adelante hacia atrás, en el lugar donde estará presente el producto.
Cuando resulta necesario realizar un mapeo de la temperatura, se debe comenzar con una inspección de la instalación, del
equipo y/o del vehículo, y se deben realizar reevaluaciones correspondientes. El mapeo ambiental también debe realizarse des-
pués de cual9uier modificación significativa del sistema de distribución 9ue pudiera afectar la temperatura del medicamento.
Mapeo de temperatura de la instalación: Los siguientes factores, que pueden contribuir a la variabilidad de la temperatura,
deben tomarse en cuenta durante el proceso de mapeo de temperatura de los sitios de almacenamiento: (1) tamaño del espa-
cio; (2) ubicación del equipo de calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC),calentadores y acondicionadores de aire;
(3) paredes que reciben la luz del sol; (4) techos o cielos rasos bajos; (5) ubicación geográfica del área que se está mapeando;
(6) flujo de aire dentro del sitio de almacenamiento; (7) variabilidad de la temperatura fuera del sitio de almacenamiento; (8)
variación del flujo de trabajo y desplazamiento del equipo (día de la semana vs. fin de semana); (9) patrones de carga o alma-
cenamiento de productos; (1O) capacidades del e9uipo (p. ej., modo de descongelación, modo de ciclos); y (11) procedimien-
tos operativos estándar.
El registro de temperaturas durante el mapeo térmico de un depósito o cuarto frío debe contar con un marco de tiempo
suficiente para capturar la variación del flujo de trabajo que puede impactar el flujo de aire y la fluctuación de la temperatura
resultante (es decir, se recomienda un periodo de una semana para la recolección de datos que capturen los ciclos de flujo de
trabajo).
Mapeo de temperatura del equipo (envases/remolque): Para minimizar el riesgo de exposición del producto a temperatu-
ras perjudiciales para el producto durante el transporte, se deben mapear el espacio dedicado a la carga de envases/vehículos.
Cuando el mapeo de la flotilla completa (es decir, vehículos del mayorista o distribuidor) es inadecuado o poco realista, se
debe mapear al menos un envase/vehículo de la flotilla. En consecuencia, se deben considerar las siguientes opciones: (1) pro-
cedimientos operativos estándar, incluyendo procedimientos de carga y descarga; (2) operación específica de la ruta del e9ui-
po de control de temperatura; (3) efectos estacionales hallados en las rutas esperadas; (4) patrones de carga; y (5) duración de
los transportes.
Cuando se emplean envases/vehículos de transporte y equipo no dedicados (es decir, transportadores de correos), su diseño
debe minimizar el riesgo de contaminación del producto que se esté manejando. Si no se lleva a cabo el mapeo ambiental de
dichos vehículos, se deben poner en práctica otros medios de control para asegurar que el producto farmacéutico esté protegi-
do adecuadamente. El mapeo por parte del consignador puede no ser necesario si éste último utiliza un envase de transporte
adecuadamente aislado y previamente calificado para la duración del proceso de distribución por el fabricante del mismo me-
diante un estudio de mapeo o si los medicamentos se monitorean continuamente a través de sistemas de monitoreo calibra-
dos (verificación continua).
Elvehículo en el que se transportan los medicamentos se debe mapear para determinar la colocación apropiada de dispositi-
vos que registren la temperatura y para confirmar que la configuración de carga no restringe el flujo de aire. Las siguientes
prácticas y controles se recomiendan para vehículos que reciben y transfieren medicamentos:
1 . Los envases/vehículos y equipos de transporte usados para almacenar y transportar medicamentos deben ser adecuados
para su función prevista.
2. Se deben establecer procedimientos que describan la forma en que se deben operar, limpiar y mantener los envases/vehí-
culos de transporte y equipos usados en el almacenamiento y distribución de medicamentos.
3. El diseño de los envases/vehículos de transporte debe prevenir daños al medicamento, por lo que los fabricantes farma-
céuticos deben actuar en colaboración con el encargado del transporte para establecer planes de respuesta a contingen-
cias sobre la forma en que deben manejarse los medicamentos en caso de fallas del equipo.
4. Cuando el medicamento deba ser trasladado de un envase/vehículo de transporte a otro, habrá de seguirse la configura-
ción de carga apropiada.
5. Es necesario comprender la forma en que se establecerá la comunicación con las entidades necesarias cuando ocurra di-
cha transferencia.
6. Los vehículos de subcontratistas deben estar considerados en los convenios contractuales y auditorías, y se debe mantener
documentación relacionada con su uso.
El mapeo de temperatura debe tomar en cuenta las cargas máximas y mínimas para capturar la variabilidad de temperatura
que resulta de variaciones en la masa de temperatura de la carga útil. Se debe tomar en cuenta el desempeño del equipo ante
escenarios extremos, incluyendo fallas de equipo a puerta abierta, a puerta cerrada y simuladas.
El mapeo térmico de vehículos debe ser representativo de la flotilla a fin de capturar la variabilidad en toda la variedad de
vehículos (tipo de vehículos, incluyendo equipo no refrigerado, de uso, sistema de calefacción y/o enfriamiento). Se debe do-
cumentar un programa de recalificación periódica.
El mapeo de las instalaciones y de los envases/vehículos de transporte se debe llevar a cabo de tal manera que se confirme
su aptitud para la operación durante periodos de climas extremos esperados (p.ej. verano e invierno). Las instalaciones se de-
ben mapear en condiciones operativas variadas-idealmente durante periodos de mayor variabilidad, tomando en cuenta y
capturando el resultado de cualquier fluctuación estacional de desplazamiento del inventario, desplazamiento del equipo o va-
riación del flujo de trabajo.
El protocolo de mapeo de temperatura y el número asociado de dispositivos de registro de datos de temperatura usados
para mapear un espacio tridimensional deben cumplir con el propósito de demostrar una uniformidad tridimensional, además
de cumplir con los requisitos del producto. Para el mapeo de temperatura de instalaciones y de remolques/envases, se deben
registrar las condiciones ambientales y se deben identificar las correlaciones entre condiciones ambientales y riesgos térmicos
potenciales dentro del espacio controlado. Los medicamentos no deben almacenarse en áreas en las que se haya identificado
un riesgo térmico como resultado del mapeo de la temperatura. Las áreas definidas como inadecuadas para almacenamiento
deben marcarse claramente como tales para asegurarse de que no sean utilizadas.
Se deben usar dispositivos de registro de datos de temperatura para el mapeo de temperatura y para análisis de PQ en insta-
laciones, equipo y envases de transporte que se usan para almacenar o transportar los productos medicinales sensibles a la
temperatura. Asimismo, se deben validar apropiadamente dichos dispositivos, junto con cualquier aplicación de software rela-
cionada. Los dispositivos de monitoreo deben contar con certificados individuales de calibración rastreables al NISTu otro es-
tándar internacional.
EXCURSIONES
El proceso de mapeo ayudará a determinar cuándo podrían ocurrir las excursiones y son útiles cuando los fabricantes farma-
céuticos desarrollan un plan para tratarlas. Se deben usar alarmas para revelar excursiones ambientales durante las operacio-
nes. Las excursiones de temperatura para periodos breves fuera de las condiciones respectivas de almacenamiento declaradas
pueden ser aceptables siempre que existan datos de estabilidad y una justificación científica/técnica que demuestren que la
calidad del producto no fue afectada (ver la GUI 0069 de Health Canada titulada, Guidelinesfor TemperatureControl of Drug
ProductsOuring Storageand Transportation,2011 ).
CÁLCULODE u\ TEMPERATURA
CINÉTICAMEDIA
La temperatura cinética media (TCM) es la temperatura única calculada en la que la cantidad total de degradación durante
un periodo particular es igual a la suma de las degradaciones individuales que ocurrirían a diversas temperaturas. La TCM se
7758 (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento/ Información General USP42
puede considerar como una temperatura de almacenamiento isotérmica que simula los efectos no isotérmicos de la variación
de la temperatura de almacenamiento. La TCM no es una simple media aritmética.
Las temperaturas usadas para calcular la TCM se pueden recopilar de manera conveniente usando dispositivos electrónicos
que midan temperaturas a intervalos frecuentes (p. ej., cada 15 minutos). La TCM se puede calcular directamente o los datos
pueden descargarse a una computadora para su procesamiento. Se encuentra disponible comercialmente softwarepara calcu-
lar la TCM.
Para sitios de dispensación, tales como farmacias y hospitales, en los que el uso de dichos instrumentos puede no ser facti-
ble, se pueden emplear dispositivos tales como termómetros de máxima y termómetros de mínima capaces de indicar la tem-
peratura máxima y mínima semanal. Luego se utiliza el promedio entre la máxima y mínima semanal para calcular la TCM. La
TCM se calcula mediante la siguiente ecuación (derivada de la ecuación de Arrhenius):
T. !lHIR
k -In(
e-•H1Rr, j
+e··•H1:,+ ...+e-;H1Rr,
donde Tkes la temperatura cinética media; !lH es el calor de activación, 83,144 k] • mol-1 (a menos que se cuente con informa-
ción más exacta de estudios experimentales); Res la constante universal de los gases, 8,3144 x 10-3 kJ • mol-1 • grado-1; T1 es el
valor para la temperatura registrada durante el primer periodo, p.ej, la primera semana; T2 es el valor para la temperatura re-
gistrada durante el segundo periodo, p. ej., segunda semana; y Tnes el valor para la temperatura registrada durante el periodo
n, p. ej., la n semana, siendo n el número total de temperaturas de almacenamiento registradas durante el periodo de observa-
ción. [NOTA-Todas las temperaturas, T, son temperaturas absolutas en grados Kelvin (K).]
TCM DURANTEELALMACENAMIENTO
Y LA DISTRIBUCIÓN
Como parte de las prácticas de almacenamiento y distribución el medicamento puede permanecer en depósito. Los medica-
mentos en la cadena de distribución del suministro se pueden mantener a temperaturas fuera de sus requisitos de almacena-
miento declarados de conformidad con un estudio de estabilidad apropiado. Los medicamentos almacenados en condiciones
de depósitos o en modos de transporte pueden experimentar excursiones de sus intervalos de temperatura aceptables. Cada
una de las excursiones de los productos deben evaluarse para determinar el efecto sobre el producto final. El medio de evalua-
ción debe ser científicamente sólido y constituir una justificación técnica documentada de que la integridad del medicamento
no fue afectada. Un método de análisis de medicamentos almacenados fuera de sus condiciones correspondientes de almace-
namiento declaradas es el uso de un cálculo de la TCM.
Debido a que la TCM expresa el estrés térmico acumulativo experimentado por un medicamento, se considera una práctica
aceptable para el almacenamiento, por lo que debe considerarse para excursiones durante el tránsito en el proceso de distribu-
ción. Se debe justificar el cálculo para su uso con excursiones durante la distribución confirmando que la característica limitan-
te de la estabilidad del producto siga la cinética de primer orden durante el intervalo de temperatura encontrado. Las guías de
análisis de la estabilidad de la ICH definen la TCM como una temperatura derivada "única", la cual, si se mantiene durante un
periodo definido, podría ofrecer el mismo desafío térmico a un medicamento que el que habría experimentado durante un
intervalo de temperaturas altas y bajas durante un periodo definido equivalente.
El análisis de la TCM debe tener una base científica adecuada y debe tomar en cuenta la integridad del producto. La TCM
calculada no es sensible al impacto de las excursiones que podrían ocurrir si la línea base es un periodo largo, tal como un
segmento del almacenamiento o la vida entera del producto farmacéutico. Para periodos de línea base más cortos, tales como
segmentos de transporte, una excursión puede tener un impacto significativo en la TCM resultante para dicho segmento; sin
embargo, dicha condición no tendría necesariamente un impacto significativo sobre la calidad del producto.
El análisis de la TCM se puede usar para condiciones de almacenamiento que hayan excedido los parámetros aceptables pa-
ra un medicamento, durante un periodo corto y no pretende ser una medición para el almacenamiento a largo plazo.
Conocer la TCM para una excursión es útil para evaluar el impacto potencial sobre la calidad del producto. No obstante,
resulta esencial conocer los límites de temperatura superior e inferior de cualquier excursión. Si estas temperaturas extremas
estuvieran fuera de los datos de estabilidad disponibles, podría ser imposible predecir de manera confiable el impacto que ten-
dría la excursión sobre la calidad independientemente de la TCM. Aunque a las altas temperaturas se les da un peso mayor en
el cálculo, el cálculo de la TCM para un producto no congelado que se congela durante un periodo puede resultar en una
temperatura no aceptable aunque el producto podría no haberse adulterado. A temperaturas más altas, la cinética de degrada-
ción puede cambiar o se pueden presentar nuevas reacciones de degradación; a temperaturas más bajas (cercanas a la conge-
lación) se puede presentar un cambio de fase que se sabe que tiene un impacto negativo sobre la calidad de algunos medica-
mentos (p. ej., algunas proteínas y vacunas). Para un ejemplo de cálculo, ver el capítulo Cálculosen la PrácticaFarmacéutica
(1160).
Transporte en Vehículosde Serviciosde Emergencias,Automóvilesy Furgonetas
Los vehículos automotores usados para transportar medicamentos (p. ej., ambulancias y otros vehículos de respuesta a
emergencias, furgonetas o automóviles, incluyendo aquéllos usados por los representantes de ventas para transportar muestras
para médicos) deben ser adecuados para su propósito. Se deben colocar dispositivos de monitoreo en diversas áreas del male-
tero o cabina en la que se colocará el medicamento durante extremos estacionales (p. ej., verano e invierno). El monitor se
debe asegurar de modo que se mantenga inmóvil y no debe existir ambigüedad sobre su posición exacta dentro de la carga
útil, de modo que éste siempre se coloque en la misma posición. Asimismo, se pueden usar dispositivos de monitoreo sobre o
dentro de empaques o en envases. Se deben tomar medidas adecuadas para mantener el medicamento dentro de los límites
permisibles de los requisitos de almacenamiento declarados. El almacenamiento de muestras de medicamentos para médicos
por parte de representantes de ventas está regulado por el Título 21 del CFRParte 203.34(b)(4).
Distribución Mediante Farmacia por Correo
El remitente es responsable del proceso de envío por correo apropiado. Los distribuidores de correo, incluyendo el Servicio
Postal de los EE.UU.(USPS)y demás servicios de transporte, incluyendo servicios de transporte expedito, son responsables de
proveer el servicio contratado.
En caso de que el paquete no pueda ser entregado según lo programado, éste debe devolverse a la farmacia remitente.
Sistema de Gestión de Riesgos
Las estrategias del Sistema de Gestión de Riesgos deben asegurar que los mejores intereses de cada organización se cumplan
mediante el apego a las prácticas, controles y procedimientos apropiados, incluyendo, entre otros, los siguientes: la naturaleza
de los medicamentos; requisitos de distribución indicados en el etiquetado legible del envase; exposición a condiciones am-
bientales adversas; número de etapas/recepciones en la cadena de suministro; instrucciones escritas del fabricante; contratis-
tas; medicamentos que se afectan con la congelación (vacunas, insulina y productos biológicos) o temperaturas elevadas (su-
positorios de bases grasas, vacunas, insulina y productos biológicos).
Entre los ejemplos de riesgos se incluyen los siguientes: (1) vibración que puede ocasionar agregación de algunos medica-
mentos tales como proteínas y fármacos basados en péptidos; (2) excursiones de temperatura que pueden llevar a cambios de
fase (fusión o congelación); (3) pérdida de la integridad del envase-cierre que puede ocasionar rupturas del vidrio o pérdida
de la esterilidad en envases de medicamentos estériles; e (4) ingreso de agua u oxígeno que puede generar un incremento en
los productos de degradación. Se recomienda que las partes apropiadas tales como los solicitantes titulares transmitan los re-
quisitos ambientales pertinentes cuando se requieran para justificar excursiones. Pueden existir maneras alternativas de deter-
minar las condiciones ambientales aceptables, las cuales deben documentarse y justificarse.
Los fabricantes farmacéuticos deben asegurarse de que los proveedores de transporte de medicamentos estén sujetos a mo-
nitoreo. Se deben llevar a cabo auditorías rutinarias a las empresas transportistas para asegurar el manejo adecuado de produc-
tos. Elsistema de control de cambios del fabricante debe capturar y evaluar los cambios en factores logísticos tales como de-
pósitos o áreas de recepción y cambios en los vehículos.
CONCLUSIÓN
Las prácticas y procesos establecidos en este capítulo de información general se aplican al almacenamiento y distribución
como parte de la gestión del ciclo de vida de los medicamentos. Todas las partes implicadas deben garantizar el producto has-
ta el momento de su uso, mediante la creación de una red de abastecimiento contigua basada en la colaboración y que enfati-
ce las medidas preventivas para proteger la calidad del medicamento. El incremento en los procesos globales asociados con los
productos que requieren controles ambientales especiales enfatiza la necesidad de un programa de Gestión de Calidad sólido.
La Gestión de Calidad debe proveer los cimientos para mantener las prácticas de almacenamiento y distribución en un progra-
ma de mejora continua y como parte de una revisión general del sistema de gestión por parte de cada entidad, según corres-
ponda, en la cadena de suministro.
Resulta igualmente importante mantenerse actualizado y estar preparado para ajustarse a la aparición de nuevas soluciones.
Estas nuevas tecnologías deben tomarse en cuenta durante el desarrollo de estrategias para buenas prácticas de distribución,
controles y procedimientos.
GLOSARIO
Acciones preventivas: Medidas que se adoptan para eliminar la causa de un incumplimiento potencial u otra situación
potencial indeseable.
Adulteración: Ley de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (FDAFDC Act), Sección. 501 (351 ), Un medicamento o dis-
positivo se considerará adulterado si (2)(A) Ha sido preparado, envasado o conservado en malas condiciones higiénicas por las
que pudiera haberse contaminado con suciedad, o por las que pudiera haber resultado perjudicial para la salud; o (B) el méto-
do usado o las instalaciones o controles usados para su fabricación, procesamiento, envasado o conservación no cumplen o no
se operan o administran de conformidad con las buenas prácticas de fabricación vigentes para asegurar 9ue dicho fármaco
cumple con los requisitos de esta Ley en lo relativo a su seguridad, posee la identidad y el contenido, y cumple con las caracte-
rísticas de calidad y pureza que pretende o declara poseer.
7760 (1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento/ InformaciónGeneral USP 42
Cadena de suministro: Se refiere a la secuencia continua de entidades que abarcan el ciclo de vida de almacenamiento y
distribución de un producto hasta el usuario final.
Calidad: Atributos físicos, químicos, microbiológicos, biológicos, de biodisponibilidad y estabilidad que un producto far-
macéutico debe mantener a fin de considerarse adecuado para uso terapéutico o de diagnóstico. En este capítulo, el término
también abarca las propiedades de seguridad, identidad, contenido, calidad y pureza.
Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH) Guía para la Industria, /CH Q 1O, Sistemade CalidadFarmacéutica;
/CH Q9, Gestiónde Riesgosde Calidad;e /CH Q1A R2, Pruebasde Estabilidadde NuevosFármacosy ProductosFarmacéuticos
(documentación disponible en inglés únicamente): Documentos internacionales armonizados de ayuda para la industria
farmacéutica.
Contrato o Convenio Escrito (comúnmente referido como Contrato de Calidad, Contrato Técnico, Contrato de Nivel
de Servicio, entre otros): Contrato negociado y documentado entre el propietario del medicamento y el proveedor del ser-
vicio que define el acuerdo común sobre materiales o servicio, especificaciones de calidad, responsabilidades, garantías y me-
canismos de comunicación. Puede ser un contrato legalmente vinculante o meramente informativo. Además, un Contrato de
Nivel de Servicio puede especificar el nivel mínimo esperado de desempeño, operación u otros atributos del servicio.
Distribución: Se refiere a elementos tales como actividades de envío y transporte relacionadas con el desplazamiento y
suministro de medicamentos.
Documentación: Toda información registrada.
Estabilizador de temperatura: Material o combinación de materiales que almacena y libera energía térmica usada para
mantener un intervalo de temperatura específico dentro de un envase o sistema de envase activo o pasivo (p. ej., material de
cambio de estado basado en agua, aceite o sustancias químicas, tales como dióxido de carbono sólido o hielo seco y nitrógeno
líquido).
Materiales de riesgo biológico y/o mercancías peligrosas:: Cualquier artículo o material químico cuyo transporte o des-
plazamiento representa un riesgo para la seguridad pública o el ambiente y que se reglamenta como tal en cualquiera de los
siguientes: Reglamentaciones para Materiales de Riesgo Biológico (Título 49 del CFR 100-180); lnternational Maritime Dange-
rous Goods Code; Dangerous Goods Regulations of the lnternational Air Transport Association; Technical lnstructions of the
lnternational CivilAviation Organization; or the U.S. Air Force Joint Manual, PreparingHazardousMaterials for Military Air Ship-
ments (Códigolnternational Marítimo de MercancíasPeligrosas;Reglamentaciones sobreMercancíasPeligrosasde la Asociaciónde
TransporteAéreoInternacional;InstruccionesTécnicasde la Organizaciónde Aviación Civil Internacional;o el Manual Conjunto de la
FuerzaAéreade los EE.UU.,Preparaciónde MaterialesPeligrosospara EnvíosAéreosMilitares).
Medicamentos: Medicinas, incluidas las formas farmacéuticas con receta médica comercializadas para uso humano o ve-
terinario, materiales a granel, intermedios o en proceso, muestras de medicamentos, materiales para ensayos clínicos y produc-
tos de venta libre.
Mejora continua: Actividad recurrente para aumentar la capacidad de cumplir con los requisitos [ver Quality Management
Systems-Fundamentalsand Vocabulary.ISO Standard 9000:2005 (Sistemas de Gestión de la Calidad-Fundamentos y Vocabu-
lario)].
Sistema de gestión ambiental: Sistema de gestión que permite identificar aspectos ambientales críticos para la calidad
del medicamento (tales como temperatura, humedad y/o factores ambientales adicionales) y que asegura el uso de procesos
adecuados para mantener dicho ambiente.
Sistema de gestión de almacenamiento: Programa que se emplea para controlar el almacenamiento de medicamentos.
Sistema de gestión de calidad (SGC): En el contexto de este capítulo, se refiere como mínimo a un conjunto de políti-
cas, procesos y procedimientos que permiten la identificación, medición, control y mejoramiento de la distribución y almace-
namiento de medicamentos. Se trata del sistema de gestión usado para dirigir y controlar una compañía con respecto a la
calidad (ver el modelo ICH Ql0 y Quality ManagementSystem-Fundamentalsand Vocabulary,ISOStandard 9000:2005).
Sistema de gestión de la distribución: Programa que abarca el desplazamiento de medicamentos, incluyendo almacena-
miento y transporte.
Sistema de gestión de riesgo: Proceso sistemático usado para evaluar, controlar, comunicar y revisar los riesgos para la
calidad de un medicamento a lo largo del ciclo de vida del producto. Como parte integral de un sistema de calidad farmacéu-
tica efectivo, se trata de un enfoque sistemático y activo para identificar, evaluar científicamente y controlar riesgos potenciales
para la calidad según se describe en ICH Ql O. Asimismo, facilita el mejoramiento continuo del desempeño del proceso y de la
calidad del producto durante todo su ciclo de vida. El modelo ICH Q9 Quality RiskManagement (Gestión de Riesgos para la
Calidad) proporciona principios y ejemplos de herramientas que se pueden aplicar a diferentes aspectos de la calidad farma-
céutica.
Temperatura cinética media (TCM): Se define como la temperatura única calculada en la que la cantidad total de degra-
dación durante un periodo particular es igual a la suma de las degradaciones individuales que ocurrirían a diversas temperatu-
ras.
Usuario flnalSe refiere al paciente, así como al proveedor de cuidados de la salud que administra el producto farmacéutico
al paciente.
Vehículos de transporte: Vehículos usados en la cadena de suministro que incluyen camiones semirremolque, furgonetas,
trenes, aviones, barcos y vehículos de entrega de correos. Otros vehículos, cuando se usan para transportar medicamentos,
también se incluyen en esta definición, por ejemplo, vehículos de servicios médicos de emergencia y automóviles de represen-
tantes de la industria.
USP42 Información General/ (1079.1) Almacenamiento y Transporte de Medicamentos 7761
(1079.1) ALMACENAMIENTOY TRANSPORTEDE MEDICAMENTOSEN

INVESTIGACIÓN
INTRODUCCIÓN
Los ensayos clínicos son estudios farmacológicos que se realizan para determinar si un medicamento en investigación cum-
ple con los criterios de efectividad y seguridad señalados en el protocolo del ensayo clínico. Los productos farmacéuticos en
investigación (PFls) son productos no disponibles comercialmente para la indicación o dosificación analizada; pueden existir
casos en los que un producto disponible comercialmente sea utilizado en un ensayo clínico como control positivo (compara-
dor), para una nueva indicación o como medicación de rescate. En todo este documento se utilizará la sigla PFI. En todos los
casos donde se utilice PFI, es posible que para algunos resulte más familiar el término medicamento en investigación (IMP, por
sus siglas en inglés) de la Unión Europea. La definición de un medicamento en investigación se encuentra en el Artículo 2 (d)
de la Directiva 2001 /20/CE de la Comisión Europea: "forma farmacéutica de una sustancia activa o placebo que se prueba o se
utiliza como referencia en un ensayo clínico, incluidos los productos con autorización de comercialización cuando se utilicen o
combinen (en la formulación o en el envase) de forma diferente a la autorizada, o cuando se utilicen para una indicación no
autorizada, o para obtener más información sobre la forma farmacéutica autorizada". Para fines de este capítulo, considerare-
mos que ambos términos son equivalentes. La naturaleza precomercial de los PFI implica que los ingredientes de fabricación,
incluidos ingredientes farmacéuticos activos (IFA)y excipientes, la dosificación para el ensayo clínico y cualquier componente
del envase y la estabilidad asociada pueden no estar tan definidos como los del producto terminado final aprobado. Las regla-
mentaciones sobre las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Esta-
dos Unidos (FDA)para productos farmacéuticos terminados se aplican por igual a los productos comerciales y a los PFI.
La distribución de PFI difiere de la distribución comercial en que las cantidades para los primeros son, con frecuencia, peque-
ñas (p. ej. tan solo uno o dos frascos o envases de dosis única) y en que son muchos los destinos finales, tales como clínicas y
clínicas en lugares remotos. Otra diferencia con un medicamento comercial es el conocimiento sobre la estabilidad del PFI, que
con frecuencia es una nueva entidad química/molecular en las primeras fases de los ensayos clínicos y no ha sido sometido al
programa de estabilidad robusto de los productos comerciales. El PFItambién plantea un desafío único al ser comparado con
un producto comercial, que es asegurar la distribución adecuada de todos los sistemas de envase, puesto que una desviación
de temperatura puede comprometer el resultado del ensayo clínico en su totalidad.
ALCANCE
Debido a problemas de seguridad a nivel mundial, las reglamentaciones para la distribución de medicamentos y para PFI
pueden variar y/o cambiar. Los patrocinadores, el personal del centro del ensayo clínico o sus personas designadas son respon-
sables del control del PFIy deben estar al tanto de los requisitos de distribución vigentes en el país. En este capítulo se aborda-
rán los aspectos del almacenamiento y distribución que son exclusivos para PFI(p. ej., desenmascaramiento, comparadores y
estudios académicos); entre otros capítulos de interés se pueden incluir Dispositivosde Monitoreo-Tiempo, Temperaturay Hu-
medad (1118), BuenasPrácticasde Almacenamientoy Distribuciónpara Medicamentos(1079) y BuenasPrácticasde Distribución
para ExcipientesFarmacéuticosa Granel(1197). Este capítulo orientativo es aplicable a todos los PFI, incluyendo las combinacio-
nes de un medicamento con un dispositivo, así como a los PFI clínicos no comerciales, pero no es aplicable a los dispositivos
médicos. El ensayo clínico no comercial puede tener una rentabilidad limitada y, con frecuencia, puede ser realizado en un
entorno académico o por una farmacia de preparaciones magistrales con participación limitada de la industria (ver la Figura1).
EnvíoDirecto al Centro
Patrocinador,
Fabricante,o Depósito Centro de
EnsayosClínicos PACIENTE
Envasador Local/Central
Contratado
Envío Directo al Paciente
Cadenade Distribución para EnsayosClínicos No Comerciales
FarmaciaMagistral,
Instituto de Investigación PACIENTE
o Universidad
!=igura1. Esquema de la cadena de distribución de P!=Ipara ensayos clínicos comerciales y no comerciales.

7762 (1079.1) Almacenamiento y Transporte de Medicamentos/ Información General USP42
FACTORESCLAVEPARA LA DISTRIBUCIÓN
DE PFI
Número de Centros de EnsayosClínicos
Cuanto mayor sea el número de centros de ensayos clínicos, mayor será el riesgo, ya que supone más desafíos relacionados
con países, envíos y aduanas. La empresa patrocinadora y el distribuidor de PFI deben conocer los requisitos aduaneros en to-
dos los países donde será distribuido el PFI. Los PFIpueden ser transportados desde un centro de ensayo clínico a otro, y la
distribución de estos PFIdebe cumplir con los mismos requisitos de distribución que cualquier otro medicamento que esté
siendo transportado.
Auditorías
CENTROS DE ENSAYOSCLÍNICOS
Los centros de ensayos clínicos deben almacenar los PFI en un área que sea segura y tenga acceso limitado, y deben asegu-
rar que los productos se mantengan bajo las condiciones de almacenamiento declaradas. Las auditorías de calificación de los
centros permiten asegurar que estos cuenten con espacio y separación adecuados para PFls que no hayan sido dispensados a
pacientes, así como para PFls que serán devueltos al patrocinador o contratista para reconciliación y disposición finales. Depen-
diendo de los requisitos reglamentarios de los países donde se están realizando los estudios, se deben utilizar termómetros cali-
brados o un sistema de alarma y registro de temperatura automatizado para documentar el cumplimiento en el centro.
DEPÓSITOSY SUBCONTRATISTAS
Estos sitios y personas deben cumplir tanto con los requisitos del patrocinador como con los reglamentos del país asociado
en el que se está realizando el estudio.
Cantidades Disponiblesde Productos
En la etapa inicial del desarrollo (es decir, Fase 1 e inicio de la Fase 2), en general se dispone de menos IFAe PFI. Las rupturas
de la cadena de distribución tendrán mayor efecto y consecuencias sobre la finalización a tiempo de los ensayos clínicos, y los
retrasos en la distribución (en especial para productos biológicos) pueden afectar la inscripción y realización del estudio.
Fechasde Caducidad/Reanálisis
A medida que se establece el perfil de estabilidad durante las etapas iniciales del desarrollo, se deben prever ampliaciones de
la fecha de caducidad o reanálisis. Las fechas de caducidad o reanálisis del PFI deben cumplir con los requisitos reglamentarios
locales durante todo el estudio. Las fechas de caducidad o reanálisis se pueden seguir mediante un sistema electrónico valida-
do, aunque es posible que las fechas de caducidad o reanálisis del PFI en los centros o depósitos internacionales necesiten ac-
tualización de forma manual.
Calificaciónde Envasespara PFI y Seguimiento y Ubicación
No existe diferencia entre las calificaciones de envases para PFls y para medicamentos disponibles comercialmente.
Resulta de particular importancia determinar durante las etapas iniciales de un protocolo de investigación clínica cuáles serán
las condiciones ambientales exigidas para los envíos del PFI, pues es el mejor momento para definir un perfil de estabilidad
robusto del medicamento en estudio. Entre los factores de riesgo importantes relacionados con la distribución se incluyen dis-
tancia, tiempo, temperatura y número y tipo de traspasos que puedan presentarse. Para proteger el contenido, se deben utili-
zar envases que sean apropiados para la fase clínica. Cuando esto no sea posible, el objetivo es utilizar componentes calificados
(es decir, componentes que hayan demostrado, mediante análisis pertinentes, resultados positivos en cuanto al mantenimiento
de temperaturas para una gran variedad de productos en una amplia variedad de condiciones ambientales) para asegurar que
los PFls dentro de los contenedores para transporte estén controlados y permanezcan a la temperatura correcta durante el tra-
yecto desde el sitio de almacenamiento (o depósito) hacia el centro del ensayo clínico. Sin embargo, existen tecnologías sofis-
ticadas para el seguimiento y ubicación que permiten al patrocinador del ensayo clínico, envasador contratado, organización
de la investigación clínica y centro del ensayo clínico monitorear (seguir) los PFls en toda la cadena de distribución.
La calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés) de los sistemas de envase para enviar PFls debe realizarse de
acuerdo con la configuración de carga real, duración del viaje y condiciones ambientales previstas. No debe haber diferencia
entre el fundamento para la PQ de productos farmacéuticos comerciales y en investigación debido a que los riesgos asociados
con el almacenamiento y transporte no están relacionados con la autorización de comercialización. Los detalles sobre la PQ
como estrategia para mitigar los riesgos se proporcionan en el capítulo (1079).
USP42 Información General J (1079.1) Almacenamiento y Transporte de Medicamentos 7763
Desafíosen la Cadena de Distribución de PFI
Uno de los mayores desafíos en la cadena de distribución de PFI es el número de envíos de suministros para ensayos clínicos
que se realizan para que se lleven a cabo los ensayos clínicos. En los círculos de distribución de PFI, a estos envíos se les deno-
mina envíos "de salida". Cuanto más rápida sea la inscripción de pacientes en el ensayo clínico, mayor será el número de en-
víos. Con cada envío aumenta el riesgo de daño y de variaciones de temperatura. Cada uno de estos supondría el envío de
PFls adicionales como apoyo para el ensayo clínico y un costo adicional para .la empresa patrocinadora.
Entre otros desafíos relacionados con la cadena de distribución de PFI se encuentran la frecuencia y el tamaño de los envíos.
Estos se ven influenciados por factores tales como el número de pacientes, frecuencia de administración del PFIa los pacientes,
número y tamaño de kits para pacientes en cada envío y los gastos asociados a cada envío.
Programación
Los ensayos clínicos que tienen una duración mayor a la del plan original pueden suponer más envíos de PFIy la necesidad
de asegurar que estas extensiones sigan cumpliendo con las buenas prácticas de distribución vigentes. En algunos casos, el
inventario de PFIpermanece en el centro de investigación cuando se completa la inscripción, inclusive cuando los pacientes
inscriptos continúan con su tratamiento remanente. En otros casos, los PFI puede permanecer en la institución mientras se es-
peran las instrucciones de devolución/destrucción por parte del patrocinador. Las guías de este capítulo son aplicables a ambos
casos.
DesafíosGlobales Clave para PFI
Entre los desafíos globales se incluyen seguridad, idioma, cultura, códigos arancelarios/impuestos, contratación, entrena-
miento, aduanas, días festivos, requisitos de importación y exportación específicos del país, diferencias horarias, horarios de las
compañías aéreas y documentación. Se pueden encontrar consejos para abordar estos desafíos en los documentos de orienta-
ción reglamentarios [p. ej., Ley de Seguridad de la Cadena de Suministro de Fármacos de la FDA(DSCSA,por sus siglas en
inglés) o serie Q del Consejo Internacional de Armonización (ICH, por sus siglas en inglés)].
CONDICIONES
AMBIENTALES
PARAPFI
Los controles ambientales para la distribución de PFls pueden proporcionarse en el etiquetado del envase, certificado de aná-
lisis del producto, hoja de datos de seguridad o en otros registros disponibles para el envío; sin embargo, no siempre se cono-
cen estas condiciones ambientales al momento del transporte hacia los centros del ensayo clínico tales como clínicas o el do-
micilio de los pacientes (para administración en el hogar). Debe haber confirmación de que se están realizando los pasos ade-
cuados para asegurar la integridad de la cadena de distribución de PFIdurante todo el proceso de distribución. Cuando se
dispensa el PFIal participante de la investigación (sujeto o paciente) y el mismo está bajo su custodia, debe explicársele la
manipulación y almacenamiento adecuados del PFI(de forma escrita u oral) en el centro clínico, hospital o domicilio del parti-
cipante. Los PFls que han sido dispensados a un paciente o sujeto no pueden ser devueltos al inventario de investigación origi-
nal del centro investigador para volver a ser dispensados. En el caso donde se facilita el PFIa un miembro del equipo de inves-
tigación para que lo dispense al participante, pero este no llega a ser dispensado al sujeto o paciente y se puede verificar que la
cadena de custodia ha permanecido dentro del equipo del estudio, el PFI puede volver a recibirse en el servicio de medica-
mentos en investigación para que vuelva a ser dispensado solo si se cuenta con procedimientos operativos estándar (POE) y
documentación para asegurar el control del PFI. Nótese que esta guía de redispensación puede ser anulada si el protocolo es-
pecífico, POE o instrucciones del patrocinador prohíben la redispensación en algún caso.
Desenmascaramiento
El enmascaramiento de los PFls se realiza para reducir o eliminar prejuicios en los ensayos clínicos y lograr la aleatorización
en las poblaciones de pacientes. En algunos casos, para mantener la seguridad de los participantes de la investigación, es nece-
sario hacer un desenmascaramiento de emergencia. Esto puede hacerse para una dosis individual o para una partida/lote. En
cualquier caso, el PFI no enmascarado se debe separar del inventario de PFIque está listo para ser dispensado. Dependiendo
del motivo del desenmascaramiento, el patrocinador proveerá instrucciones sobre la devolución o destrucción del PFI. El resul-
tado del desenmascaramiento de un producto puede generar la necesidad de distribuir un nuevo PFI,ya sea desde el fabrican-
te, el depósito o desde otro centro del ensayo clínico. Los participantes de la cadena de distribución deben contar con un pro-
cedimiento escrito que establezca las responsabilidades, procedimientos, precauciones, registros y destino final respecto del
desenmascaramiento de los PFls para asegurar la manipulación adecuada de este material y evitar su redistribución con un có-
digo de aleatorización inservible.
7764 (1079.1) Almacenamiento y Transporte de Medicamentos/ Información General USP42
Comparadores
La mayoría de los PFI en Fase 2 tardía y en toda la Fase 3 de los ensayos clínicos serán comparados con el tratamiento médi-
co estándar vigente (es decir, producto disponible comercialmente). Este proceso se realiza, en general, utilizando un producto
comparador que puede o no encontrarse actualmente en el mercado de los países donde se está realizando el ensayo clínico.
El proceso de distribución para el comparador debe cumplir con los requisitos de envío declarados en el etiquetado del PFI
para ese producto o por el fabricante del producto. El proveedor del PFIque utiliza comparadores debe conocer y cumplir con
los requisitos de distribución de este control para asegurar que el producto sea seguro y eficaz para el paciente del ensayo
clínico.
PFls Devueltos
Se debe dar la misma importancia al monitoreo ambiental e integridad de la cadena de distribución para los PFls devueltos,
puesto que algunos patrocinadores pueden decidir redistribuir a otros centros de ensayos clínicos los PFls devueltos que no
hayan sido abiertos ni dispensados. Los PFI devueltos que estén destinados a ser redistribuidos deben cumplir con todos los
requisitos (es decir, criterios de liberación inicial) del producto y reglamentos locales asociados. La decisión de reutilizar PFls
devueltos debe ser respaldada por una evaluación basada en los riesgos.
EVALUACIÓN
DELRIESGOAL INICIODELPROCESODE DISTRIBUCIÓN
Cuando se envíen PFls a depósitos y centros de ensayos clínicos, utilizando vías de envío comunes (rutas entre el punto de
origen y el punto de destino) y en áreas con temperaturas adecuadas, una evaluación del riesgo puede identificar la probabili-
dad de errores y su efecto en la cadena de suministro. En la guía ICH Q9 se presentan algunas herramientas para la evaluación
del riesgo que pueden utilizarse para ayudar a que las organizaciones identifiquen los riesgos y la forma de abordarlos. Para la
evaluación del riesgo se deben considerar factores como la categoría del producto (p. ej. estupefacientes, productos biológi-
cos, radiofármacos), especificación de las condiciones de almacenamiento (p. ej. temperatura, luz, humedad, vibración), con-
diciones ambientales a las que los productos se verán sometidos según la ruta de transporte (p. ej. origen, destino y vías), du-
ración del viaje, contenedor de envío (p. ej. si es de temperatura controlada, si es activo o pasivo) y tipo de vehículo. Las orga-
nizaciones deben evaluar también si retrasos durante el transporte o debidos a retenciones en aduanas pueden incrementar las
probabilidades de riesgos y deben proponer estrategias para mitigar estos riesgos.
GLOSARIO
Enmascaramiento: Proceso mediante el cual uno o más integrantes de un ensayo clínico desconocen las asignaciones de
tratamiento. Los estudios ciegos (enmascarados) se realizan para evitar prejuicios involuntarios que puedan afectar los datos
del sujeto cuando se conocen las asignaciones de tratamiento.
Comparador: Producto de investigación o comercializado (es decir, control activo) o placebo utilizado como referencia en
un ensayo clínico.
Distribución: Se refiere a actividades de envío y transporte asociadas al traslado y suministro de medicamentos.
Producto farmacéutico en investigación (PFI): Todo producto farmacéutico (producto nuevo o producto de referencia) o
placebo que está siendo investigado o utilizado como referencia en un ensayo clínico.
Protocolo: Plan de estudio en el que se basa un ensayo clínico.
Medicación de rescate: Medicamentos identificados en el protocolo como aquellos que pueden ser administrados a los pa-
cientes cuando la eficacia del PFI no sea satisfactoria, el efecto del PFIsea demasiado elevado y es posible que ocasione daños
al paciente o para tratar un caso de emergencia.
Procedimiento operativo estándar (POE): Instrucciones detalladas por escrito para lograr uniformidad del desempeño de
una función específica. Se exige ICH/ISO 9001 para la aplicación repetida de procesos que necesiten estandarización. Todos los
POEs deben tener la aprobación de garantía de calidad.
Centro del ensayo clínico: Lugar donde se realizan las actividades relacionadas con el ensayo clínico.
T
USP42 Información General/ (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel 7765
(1080) EXCIPIENTES
FARMACÉUTICOS
A GRANEL-CERTIFICADODE
ANÁLISIS
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Propósito
1.2 Alcance
1. 3 Principios Adoptados
2. GUÍA GENERAL
3. DISEÑO Y ELEMENTOS REQUERIDOSDE UN CERTIFICADO DE ANÁLISIS
4. CONTENIDO DEL CERTIFICADO DE ANÁLISIS
4.1 Información de Identificación
4.2 Cuerpo
4.3 Declaraciones de Cumplimiento y Certificación
4.4 Autorización
5. REQUISITOSPARALA DENOMINACIÓN FARMACOPEICA
6. ESTABLECIMIENTODE FECHASEN UN CERTIFICADO DE ANÁLISIS
6.1 Guía General
6.2 Fecha de Fabricación
6.3 Fecha de Caducidad y Fecha Recomendada de Reevaluación
6.4 Fecha de Reanálisis
6.5 Fechas Adicionales
7. INFORME DE DATOS
7.1 Guía General
7.2 Datos versus Cumplimiento
7.3 Alternativas al Análisis de Excipientes
8. USO DE CERTIFICADOSDE ANÁLISIS GENERADOS ELECTRÓNICAMENTE
9. INFORMACIÓN DEL DISTRIBUIDOR
GLOSARIO
APÉNDICES
Apéndice 1: Modelo de Certificado de Análisis
Apéndice 2: Alternativas al Análisis de Excipientes-Ejemplos
REFERENCIAS
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Propósito
Este capítulo de información general deriva de la Certificate of AnalysisGuide for Bulk PharmaceuticalExcipients(Guía para el
Certificado de Análisis de Excipientes Farmacéuticos a Granel), preparada por el Consejo Internacional sobre Excipientes Far-
macéuticos de las Américas (IPEC-Américas, por sus siglas en inglés), y tiene el propósito de servir como guía para la prepara-
ción y el uso apropiados de un Certificado de Análisis (COA, por sus siglas en inglés) para excipientes farmacéuticos. Los objeti-
vos son estandarizar el contenido y sugerir un formato de Certificados de Análisis para excipientes, así como definir claramente
los roles y responsabilidades para el fabricante y el distribuidor de excipientes. Las definiciones y temas detallados intentan es-
tablecer un enfoque uniforme. Al proporcionar estas bases para el entendimiento común, el Certificado de Análisis servirá co-
mo un elemento importante de los controles generales de la cadena de suministro necesarios para proveer al usuario la garan-
tía del cumplimiento del excipiente con la especificación y su aptitud de uso en productos farmacéuticos.
El capítulo está dividido en varias partes. La primera proporciona una discusión de la información básica necesaria para el
diseño y los elementos requeridos de un Certificado de Análisis. En la sección 4. Contenido del Certificado de Análisisse presenta
un modelo con el fin de mostrar el formato y la localización de la información en el Certificado de Análisis. Posteriormente, se
ofrece una discusión detallada para garantizar la comprensión del propósito y significado de la información específica conteni-
da en el Certificado de Análisis. En el Glosariose provee una lista de términos usados en este capítulo de información y sus
definiciones.
1.2 Alcance
Este capítulo es aplicable a excipientes usados en la fabricación de productos farmacéuticos.

7766 (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel/ Información General USP42
1.3 Principios Adoptados

En su carácter de guía internacional, en este capítulo informativo no es posible especificar todos los requisitos legales nacio-
nales ni abarcar en detalle las características particulares de todos los excipientes. Cuando se considere el uso de este capítulo,
cada fabricante, distribuidor y usuario debe tener en cuenta cómo podría aplicarse a los productos de esa organización especí-
fica. La diversidad de excipientes implica que algunos de los principios de este capítulo podrían no ser aplicables a determina-
dos productos y procesos. El uso del verbo "debe" y de la frase verbal "se recomienda" no necesariamente significa una obli-
gación en la aplicación de este capítulo.
2. GUÍAGENERAL
El Certificado de Análisis es un documento legal que certifica la calidad del excipiente y demuestra que la partida cumple
con las especificaciones definidas, que se ha fabricado usando principios reconocidos de buenas prácticas de fabricación
(GMPs, por sus siglas en inglés) y es adecuado para su uso en productos farmacéuticos. No debe usarse en lugar de la califica-
ción apropiada del proveedor ( 7).
La empresa responsable del material debe preparar y expedir el Certificado de Análisis para excipientes siguiendo las guías
generales descritas a continuación. Se espera que el usuario reciba un Certificado de Análisis completo y exacto para cada par-
tida y/o entrega de excipiente. Cuando un distribuidor lleva a cabo el análisis, el distribuidor debe expedir un Certificado de
Análisis para el usuario con respecto a cualquier análisis que haya realizado el distribuidor mismo o por un tercero en su nom-
bre o que se haya realizado en su representación. En dichos casos, la mejor práctica de la industria es que el distribuidor pro-
vea al usuario el Certificado de Análisisdel fabricante original y el Certificado de Análisis del distribuidor.
El análisis de identificación por parte del fabricante de excipientes no es un requisito reglamentario. Elfabricante de exci-
pientes no está obligado a realizar pruebas de identidad si cuenta con controles del proceso que junto con el análisis aseguren
la identidad del excipiente.
3. DISEÑOY ELEMENTOS
REQUERIDOS
DE UN CERTIFICADO
DE ANÁLISIS
Los elementos de un Certificado de Análisis citados más adelante se incluyen en 4. Contenidodel Certificadode Análisis.El
proveedor de excipientes puede organizar a su discreción los elementos del Certificado de Análisis;sin embargo, las secciones
de este capítulo han sido diseñadas para presentar la información requerida y opcional en una forma lógica.
Elfabricante original y el lugar de fabricación deben identificarse si son diferentes del proveedor y de la ubicación del pro-
veedor, con la intención de permitir al usuario asegurarse de que no haya ocurrido un cambio en el sitio de fabricación sin su
conocimiento. Es esencial que el usuario sepa quién es el fabricante. Para proteger la confidencialidad en la cadena de suminis-
tro, es aceptable el uso de códigos para fabricantes y sitios de fabricación en el Certificado de Análisissiempre que el usuario
pueda vincular el código al fabricante y al sitio de fabricación. Se debe establecer inequívocamente la identidad del excipiente,
indicando el nombre farmacopeico y el nombre comercial (si lo hubiere), el grado del material y las denominaciones farmaco-
peicas aplicables en el Certificado de Análisis.
Un número de partida u otro medio para identificar exclusivamente la cantidad de material cubierto por el Certificado de
Análisisy la información relacionada específicamente al mismo se incluyen, por lo general, en una sección denominada cuerpo
(ver 4.2 Cuerpo).La identificación única del excipiente vincula el Certificado de Análisiscon la especificación pertinente y es
rastreable a una partida específica. La fecha de fabricación y, si aplica, la fecha de caducidad, la fecha de reevaluación reco-
mendada o cualquier otra declaración pertinente relacionada con la estabilidad del excipiente, por lo general se incluye en esta
sección (la sección 6. Establecimientode Fechasen un Certificadode Análisisincluye información detallada sobre las fechas en el
Certificado de Análisis). En esta sección también podría incluirse la información requerida por el usuario.
Los resultados reales de las pruebas que sean aplicables a la cantidad del material cubierto por el Certificado de Análisis se
incluyen en la sección Apéndice1: Modelo de Certificadode Análisis.De preferencia, se incluyen los criterios de aceptación y los
resultados de pruebas para cada característica listada. La designación del método de prueba y los criterios de aceptación pue-
den comunicarse al usuario haciendo referencia a otros documentos controlados, p. ej., especificaciones sobre ventas. Se reco-
mienda informar los datos y observaciones reales en lugar de las declaraciones inespecíficas "pasa" o "cumple", a menos que
la prueba sea cualitativa o que sea el criterio de aceptación listado en una farmacopea u otra especificación.
Si los resultados informados no se derivan del muestreo de la partida de excipiente terminado, se debe hacer mención en la
sección de análisis del Certificado de Análisis (ver 7.2 Datos versusCumplimientopara información detallada de dichos aspec-
tos). En dichos casos, las opciones alternativas para el origen de los resultados de pruebas distintas al análisis de laboratorio del
control de calidad incluyen, por ejemplo (2):
• Análisis durante el proceso
• Monitoreo continuo de un atributo o variable y aplicación de métodos de control estadístico de proceso (SPC, por sus
siglas en inglés) apropiados
Puede ser aceptable no llevar a cabo una prueba cuando el atributo de prueba no pueda estar presente o cuando no se
puedan incumplir los criterios de aceptación, p. ej., asegurar que una impureza no entra o no se forma en el proceso por con-
troles de procesos previos que impliquen su medición y limitación. El no llevar a cabo una prueba especificada debe sustentar-
se mediante una justificación documentada adecuada, basándose en una evaluación de riesgo documentada.
USP42 InformaciónGeneral/ (1080) ExcipientesFarmacéuticosa Granel 7767
La sección 4.3 Declaracionesde Cumplimientoy Certificaciónse usa para listar diversas declaraciones que pueden requerirse,
dependiendo del excipiente y de acuerdo con los requisitos del usuario. En esta sección se incluye, por lo general, cualquier
declaración del proveedor que se refiera al cumplimiento de requisitos farmacopeicos y/o reglamentarios.
Elfundamento de la aprobación del Certificado de Análisis debe aparecer en el Certificado de Análisis (ver 8. Usode Certifica-
dos de AnálisisGeneradosElectrónicamente).
4. CONTENIDODELCERTIFICADO
DE ANÁLISIS
La siguiente información debe aparecer en el Certificado de Análisis o mediante referencia. Es importante que todas las pági-
nas del Certificado de Análisis estén numeradas e incluyan el número de páginas totales para el control de documentos, a fin
de asegurar al cliente que todas las páginas del Certificado de Análisis estén presentes. Ver el Apéndice1: Modelo de Certificado
de Análisispara un ejemplo.
4.1 Información de Identificación
• Título "Certificado de Análisis"

• Identidad y dirección del sitio de fabricación original: nombre u otro identificador adecuado que sea exclusivo del fabri-
cante y el sitio (p. ej., código)
• Organización responsable que emite el Certificado de Análisis, dirección e información de contacto (si es distinta del fabri-
cante original)
• Nombre (farmacopeico o químico) y denominación farmacopeica, según corresponda
• Grado
• Nombre comercial
• Número de partida
4.2 Cuerpo
• Fecha de fabricación
• Identificador único para la especificación del excipiente
• Fecha de caducidad o reevaluación (según corresponda) o declaración de estabilidad
• Especificación
• Nombre de la prueba
• Referencia al método de prueba
• Criterios de aceptación
• Análisis
• Resultados de la prueba basados en la muestra de excipiente terminado, o
• Resultados de la prueba alternativa, según corresponda (ver 7.3 Alternativasal Análisisde Excipientes)
• Fecha de Reanálisis (según corresponda)
4.3 Declaraciones de Cumplimiento y Certificación

• Norma de Buenas Prácticas de Fabricación aplicada (p. ej., IPEC-PQGExcipiente, ICH Q7, NSF/IPEC/ANSI363, EXCi-
PACT™)
• Declaraciones de cumplimiento adicionales y referencias aplicables a estándares
• Potencial para cumplir normas farmacopeicas adicionales
• Listado de contenido y grado de los ingredientes (si fuera una mezcla)
• Información especificada por el cliente
4.4 Autorización
• Identidad de la persona autorizada para la aprobación o declaración de firma electrónica

• Fecha de aprobación o alternativa adecuada
• Número de página (es decir, página 1 de X)
5. REQUISITOSPARA LA DENOMINACIÓNFARMACOPEICA
Para que un proveedor pueda declarar el grado farmacopeico de un excipiente en el Certificado de Análisis, se deben cum-
plir dos requisitos.Elprimerrequisitoesque el excipienteseafabricadode acuerdocon los principiosreconocidosde Buenas
Prácticas de Fabricación (ver Advertenciasy RequisitosGenerales,3.1OAplicabilidadde las Normas). El segundo requisito es que
el excipiente cumpla con todos los criterios de aceptación contenidos en la monografía oficial correspondiente, a menos que
7768 (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel/ Información General USP42
su diferencia se declare en la etiqueta, según se define en Advertenciasy RequisitosGenerales,3.20 Indicaciónde Cumplimiento.

Estas expectativas se mantienen vigentes hasta su fecha de caducidad o fecha de reevaluación recomendada, cuando se alma-
cena de acuerdo con las recomendaciones del fabricante en el envase original sin abrir del fabricante.
Todo artículo farmacopeico debe estar constituido de forma tal que cuando se examine de acuerdo con estos procedimien-
tos de prueba y valoración cumpla con todos los requisitos en la monografía que lo define, así como con las disposiciones en
AdvertenciasGenerales,capítulos generales, o reglamentos, según corresponda. Sin embargo, no debe inferirse que la aplica-
ción de todos los procedimientos analíticos de la monografía a muestras de cada una de las partidas de producción sea un
prerrequisito necesario para asegurar el cumplimiento con las normas farmacopeicas antes de liberar las partidas para su distri-
bución. Se pueden usar los datos derivados del análisis durante el proceso o del monitoreo continuo de un atributo mediante
control de proceso estadístico. Con la justificación científica apropiada, los métodos analíticos que son equivalentes o mejores
(es decir, más exactos, más precisos, etc.) que los que aparecen en la monografía pueden ser usados por el proveedor al juzgar
el cumplimiento de la partida con las normas farmacopeicas (ver 7. Informe de Datos).
6. ESTABLECIMIENTO
DE FECHASEN UN CERTIFICADO
DE ANÁLISIS
6.1 Guía General
Al informar fechas en Certificados de Análisis para excipientes, es importante usar un formato claro y sin ambigüedades con
el fin de evitar una posible malinterpretación. Para ello, se recomienda usar el nombre del mes para designar el mes (puede ser
abreviado), en vez de una representación numérica. Se recomienda también incluir los cuatro dígitos para el año (p. ej., Ene.
1, 201 O; o 1 de Ene. del 201 O, etc.).
6.2 Fechade Fabricación
Elfabricante original debe definir claramente la fecha de fabricación y aplicarla de manera uniforme al excipiente y al proce-
so específicos basándose en políticas y procedimientos establecidos.
Cabe destacar que aunque las operaciones de reenvasado deben cumplir con los requisitos de Buenas Prácticas de Fabrica-
ción, el reenvasado por sí solo no se considera un paso del procesamiento que pueda utilizarse para determinar la fecha de
fabricación. Con el fin de permitir la rastreabilidad de una partida específica de un excipiente, pueden requerirse otras fechas
además de la de fabricación que reflejen pasos adicionales como el reenvasado.
6.3 Fechade Caducidady FechaRecomendadade Reevaluación
La estabilidad de los excipientes puede ser un factor importante en la estabilidad de las formas farmacéuticas terminadas
que los contienen. Por lo tanto, es importante que el Certificado de Análisis indique la estabilidad del excipiente ya sea infor-
mando la fecha de caducidad y/o la fecha de reevaluación recomendada. Esto provee a los usuarios información clave relacio-
nada con la viabilidad de uso del excipiente en el periodo entre la fecha de fabricación y el uso del excipiente por parte del
usuario.
Las fechas apropiadas de caducidad y/o fechas recomendadas de reevaluación para los excipientes se deben establecer a
partir de los resultados de un programa documentado de pruebas de estabilidad o a partir de datos históricos documentados.
La fecha de caducidad y la fecha recomendada de reevaluación no deben ser informadas por un proveedor sin suficientes da-
tos de estabilidad o de historia del producto para respaldar las fechas asignadas. Cuando el excipiente se reenvasa, debe eva-
luarse el efecto de esta operación y de los nuevos materiales de envasado para determinar si debe modificarse la fecha de ca-
ducidad o la fecha de reevaluación.
La fecha de caducidad de un excipiente no puede extenderse. La fecha de reevaluación para un excipiente es la fecha indica-
da por el proveedor después de la cual se debe reevaluar el excipiente para asegurar el cumplimiento continuo con las especifi-
caciones adecuadas. Se puede extender una fecha de reevaluación del excipiente basándose en un análisis apropiado. La ree-
valuación del excipiente puede incluir la inspección física y/o el análisis químico, físico o microbiológico apropiado.
Es aceptable informar tanto la fecha de caducidad como la fecha recomendada de reevaluación en el Certificado de Análisis
de excipientes, si corresponde.
Si los datos de estabilidad (3) de un excipiente no están disponibles, se debe incluir en o con el Certificado de Análisisuna
declaración apropiada para indicar lo que se conoce acerca de la estabilidad del material y/o si se están llevando a cabo los
estudios de estabilidad.
6.4 Fechade Reanálisis
Si el proveedor de un excipiente efectúa una reevaluación (según se indica en 6.3 Fechade Caducidady FechaRecomendada
de Reevaluación)y los resultados son usados por el proveedor para extender el tiempo de uso del material, entonces la fecha de
reanálisis se debe informar también, de preferencia en el Certificado de Análisis, aunque son aceptables medios de comunica-
ción alternativos. Las pruebas específicas que se utilizaron en el reanálisis se deben identificar claramente e informar los resulta-
USP42 InformaciónGeneral/ (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel 7769
dos obtenidos después de éste. Después del reanálisis, también se debe informar en el Certificado de Análisis una nueva fecha
recomendada de reevaluación.
6.5 FechasAdicionales
En un Certificado de Análisis pueden aparecer otras fechas, si así lo desea el proveedor del excipiente o lo solicita el usuario.
Algunos ejemplos incluyen la fecha de liberación, la fecha de envío, la fecha de análisis y la fecha en que se imprimió o aprobó
el Certificado de Análisis. Cualquier fecha adicional que aparezca en un Certificado de Análisis para excipientes debe incluir
una indicación clara de lo que representa.
7. INFORMEDE DATOS
7.1 Guía General
Para los excipientes listados en los compendios USP-NF,el proveedor fija las especificaciones del producto de manera que
incluyan todos los atributos enumerados en la monografía. No se requiere realizar el análisis de todos los atributos de las espe-
cificaciones en cada lote. Sin embargo, se debe contar con suficientes análisis y pruebas de la estabilidad del proceso para ga-
rantizar que la partida cumpla con todas las especificaciones antes de su liberación (ver 7.3 Alternativasal Análisisde Excipien-
tes). El análisis periódico de todos los atributos se debe llevar a cabo para confirmar el cumplimiento continuo. Todos los atri-
butos deben ser verificados con una frecuencia apropiada.
las AdvertenciasGenerales,6.30. Métodosy Procedimientos Alternativosy Armonizadospermiten el uso de métodos y/o proce-
dimientos alternativos siempre que provean ventajas en términos de exactitud, sensibilidad, precisión, selectividad y en algu-
nos otros aspectos del desempeño y manejo del procedimiento, y que provean resultados equivalentes o mejores.
En el caso de excipientes que no estén incluidos en los compendios USP-NF,el proveedor debe fijar las especificaciones para
garantizar que la calidad del material se mantiene de manera continua y refleja las propiedades inherentes del excipiente y del
proceso de fabricación. Se debe demostrar que los métodos para las especificaciones proveen resultados exactos, reproduci-
bles y repetibles para las características que se están analizando.
7.2 Datos versusCumplimiento
las pruebas para excipientes terminados a menudo se realizan sobre el excipiente a granel después de completar todos los
procesos de fabricación pero antes del envasado. "Cuando un resultado de prueba durante el proceso o excipiente a granel es
rastreable al material del excipiente terminado, dicho resultado de prueba puede informarse en el Certificado de Análisis" (2).
Cuando una prueba farmacopeica o para especificación no se lleva a cabo sobre la partida del excipiente, durante el proceso,
el granel o en el envase, esto debe indicarse en el Certificado de Análisis. En lugar de los datos, las declaraciones o información
típica pueden incluir lo siguiente:
• "Cumple"
• "Si se analiza, cumplirá con los requisitos farmacopeicos"
• Una nota al pie de página para indicar la última medición u otra práctica adecuada
Las mediciones informadas en un Certificado de Análisis pueden derivarse del:
1 . Análisis de una muestra representativa a partir de la partida de excipiente terminado
2. Análisis durante el proceso de una muestra representativa en la que el atributo se mantiene sin cambios durante el proce-
samiento de rutina posterior
3. Monitoreo continuo de un atributo en combinación con los controles de proceso estadísticos
Cuando sean aplicables los números 2 ó 3, se debe describir la técnica usada para obtener el resultado de la prueba.
Algunos atributos [p. ej., encefalopatía espongiforme bovina (BSE,por sus siglas en inglés)/encefalopatía espongiforme
transmisible (TSE,por sus siglas en inglés)], DisolventesResiduales(467), ImpurezasElementales-Límites(232), y/o declaracio-
nes sobre organismos modificados genéticamente (GMO, por sus siglas en inglés) pueden no informarse en el Certificado de
Análisisy pueden proveerse por separado.
7.3 Alternativas al Análisisde Excipientes
Para excipientes usados en medicamentos vendidos en los Estados Unidos, si un atributo del excipiente "tiene criterios re-
queridos, debe existir alguna medición o prueba del material en cada lote para asegurar que se cumplan los criterios. Esta pue-
de ser una medición de una prueba sustituta, de datos de control durante el proceso, o del análisis o medición del material
terminado en cada lote. Por el contrario, los representantes de la FDAconsideran que un enfoque que permita el análisis por
lote salteado basándose únicamente en la historia satisfactoria de calidad del producto no es aceptable desde el punto de vista
de Buenas Prácticas de Fabricación debido a que dicho enfoque no verifica adecuadamente que cada lote cumpla con todas
sus especificaciones" (2).
Se tiene en cuenta que la ICH Q6A permite el análisis de lote salteado periódico/ del medicamento y del fármaco (4).
7770 (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel / Información General USP42
Los resultados del análisis durante el proceso también pueden usarse para reemplazar el análisis en el excipiente terminado.
"Para asegurar que un lote de material de excipiente cumpla con sus propiedades requeridas, es aceptable basarse en pruebas
o mediciones realizadas sobre muestras de material tomadas en una etapa durante el proceso de producción, siempre que el
material del proceso no se vea afectado por el procesamiento o retención subsiguientes con respecto a los atributos que se
están verificando. Debe existir una justificación de que los resultados o las mediciones de prueba, o las características de de-
sempeño del producto, no cambien desde esa etapa durante el proceso hasta el producto terminado" (2).
7.3.1 DOCUMENTACIÓN
El proveedor de un excipiente debe desarrollar y mantener la documentación que esboce los sistemas de control de proce-
sos y los datos de validación para justificar el uso de alternativas al análisis del excipiente terminado. Esta documentación debe
incluir también los procedimientos para manejar el impacto de cambios significativos en el programa de análisis (ver Guíaso-
bre CambiosSignificativosen ExcipientesFarmacéuticos a Granel(1195)).
7.3.2 EJEMPLOS
Ver el Apéndice2: Alternativasal Análisisde Excipientes-Ejemplos.
8. USO DE CERTIFICADOS
DE ANÁLISISGENERADOSELECTRÓNICAMENTE
Los Certificados de Análisis emitidos mediante sistemas informáticos sin una firma manuscrita son comunes y aceptables,
siempre que se cuente con controles apropiados. Se deben cumplir las siguientes consideraciones:
• Acceder al sistema informático para la gestión de Certificados de Análisis;el ingreso y edición de datos debe estar limitado
al personal autorizado
• Se debe requerir autentificación mediante nombre de usuario y contraseña, así como el cambio de contraseñas con una
frecuencia apropiada
• Se debe completar la confirmación de la integridad y la exactitud de la información almacenada en el sistema y transferi-
da al registro impreso durante la implementación, y después debe verificarse periódicamente
• Los datos ingresados en un sistema informático del cual se extrae información para un Certificado de Análisisy los cam-
bios realizados posteriormente deben ir acompañados por registros de auditoría sellados con fecha y hora.
Una vez cumplidos estos criterios, es aceptable la emisión de Certificados de Análisisgenerados electrónicamente, siempre
que el Certificado de Análisis incluya información de contacto.
9. INFORMACIÓN
DELDISTRIBUIDOR
Los distribuidores proveen excipientes y servicios relacionados, tales como:
• Proveer el excipiente en el envase original del fabricante sin abrir (intermediario)
• Reenvasado de excipientes desde cantidades a granel
• Compra de excipientes para reenvasado con una etiqueta distinta
Un distribuidor no debe cambiar el título y datos originales del Certificado de Análisis u otros documentos de calidad. Siem-
pre que sea posible, se debe usar la documentación original del fabricante, o se debe verificar la transcripción de los datos.
Seespera que el distribuidor tenga establecido el nivel apropiado de Buenas Prácticas de Fabricación (ver BuenasPrácticasde
Fabricación para ExcipientesFarmacéuticos a Granel(1078)).
GLOSARIO
Criterios de aceptación: Límites numéricos, intervalos u otras medidas adecuadas de aceptación para los resultados de la
prueba.
Partida (lote): Cantidad definida de material producido en un proceso o series de procesos de modo que se pueda esperar
que la partida tenga un carácter y calidad uniformes dentro de los límites especificados. En el caso de procesos continuos, una
partida puede corresponder a una fracción definida de la producción. El tamaño de la partida puede definirse mediante una
cantidad fija o mediante la cantidad producida en un intervalo de tiempo fijo.
Número de partida (lote): Combinación única de números, letras y/o símbolos que identifica una partida y a partir de la
cual se puede determinar toda su historia de producción y distribución.
Proceso de partida: Proceso de fabricación o etapa de procesamiento que produce el excipiente a partir de un suministro
discreto de materias primas que está presente antes de completarse la reacción.
Certificado de Análisis (COA, por sus siglas en inglés): Documento que indica los métodos de prueba, especificaciones y
resultados del análisis de una muestra representativa de la partida que va a ser entregada.
Propiedad química: Atributo de calidad que se mide mediante métodos de prueba químicos o fisicoquímicos.
USP42 Información General/ (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel 7771
Proceso o procesamiento continuo: Proceso que produce continuamente el excipiente a partir de un suministro continuo
de materia prima.
Instalaciones contratadas: Instalación interna o externa que proporciona servicios al fabricante o distribuidor de un exci-
piente. Pueden incluir, entre otras, las siguientes: instalaciones de fabricación, laboratorios, instalaciones de reenvasado (inclui-
do etiquetado) y almacenes.
Fecha de fabricación: Fecha que indica la terminación del proceso final de fabricación (según lo definido por el proveedor
para un excipiente y proceso en particular).
Fecha de reanálisis (date retested): Fecha en la cual el proveedor de un excipiente efectuó la reevaluación para extender el
tiempo en que se puede usar el material.
Distribuidor: Todas las partes en la cadena de distribución/suministro comenzando desde el punto en que el excipiente es
transferido fuera del control del sistema de gestión del material del fabricante original, incluyendo las partes implicadas en la
comercialización y la distribución, (re)procesadores, (re)envasadores, empresas de transporte y almacenamiento, agentes de
transferencia, intermediarios, comerciantes y proveedores distintos al fabricante original.
Excipiente: Sustancias distintas al fármaco que han sido evaluadas de manera apropiada con respecto a su seguridad y que
se incluyen intencionadamente en un sistema de liberación de fármacos.
Fecha de caducidad (expiración): Fecha que designa el periodo durante el cual se espera que el excipiente se mantenga
dentro de las especificaciones y después de la cual no debería usarse.
Impureza: Cualquier componente de un excipiente que no es la entidad química deseada, pero está presente como conse-
cuencia de las materias primas usadas, del proceso de fabricación del excipiente o de la degradación del mismo.
Fabricante original o fabricante: Persona o empresa que fabrica un material hasta la etapa en la que este se designe como
material farmacéutico de partida.
Envase: El recipiente y sus componentes que contienen el excipiente para almacenamiento y transporte al usuario.
Propiedad física: Atributo de calidad que se puede medir únicamente por medios físicos.
Proceso: Combinación de etapas operativas (incluida la síntesis, aislamiento, purificación, envasado, etc.) que produce el ex-
cipiente terminado.
Índice de capacidad del proceso (Cp, por sus siglas en inglés): Medición estadística que se puede emplear para evaluar si
el proceso es adecuado para cumplir con las especificaciones. Puede decirse que existe un estado de control estadístico si la
variación aleatoria en los resultados de prueba para un atributo del proceso es tal que la capacidad calculada del proceso es
>1,33 (ver definición más detallada en el Apéndice2: Alternativasal Análisisde Excipientes-Ejemplos).
Etapa del proceso: Instrucción documentada al personal de fabricación del excipiente farmacéutico en la cual se ordena que
se efectúe una operación.
Procesamiento: Operaciones para cambiar las características del producto principalmente mediante tratamiento físico, p. ej.,
molienda, tamizado, destilación, filtración o mezclado.
Reenvasado: Acción de cambiar el envase del material.
Fecha de reevaluación (retest date): Fecha en que una partida específica de material debe ser reevaluada para asegurar que
continúa siendo adecuada para uso.
Programa de análisis por lote salteado (periódico): Realización de pruebas especificadas durante la liberación en partidas
preseleccionadas y/o en intervalos predeterminados, en lugar de en cada partida, entendiendo que aquellas partidas que no
fueron analizadas también deben cumplir con todos los criterios de aceptación establecidos para dicho producto. Esto repre-
senta un programa de análisis que no es completo y, por lo tanto, debe justificarse, presentarse ante y ser aprobado por la
autoridad reglamentaria antes de su implementación. Durante el análisis, cualquier incumplimiento del material de partida con
los criterios de aceptación establecidos para el análisis por lote salteado (periódico) debe manejarse mediante notificación
apropiada a la autoridad o autoridades reglamentarias o competentes. Si estos datos demuestran una necesidad de reestable-
cer el análisis de rutina, entonces se deberá reinstaurar el análisis de liberación para cada partida.
Cambio significativo: Cualquier cambio que tenga el potencial de alterar una propiedad física, química o microbiológica del
excipiente a partir de lo normal y/o que pudiera alterar el desempeño del excipiente en la forma farmacéutica.
Sitio: Ubicación definida del equipamiento en el que se fabrica el excipiente. Puede estar dentro de una instalación más
grande. Un cambio en el sitio puede referirse a una parte diferente de la instalación existente, pero en un área operativa distin-
ta, o en una instalación remota, incluida la de un fabricante contratista.
Especificación: Lista de pruebas, referencias a procedimientos analíticos y límites numéricos, intervalos u otros criterios
preestablecidos para las pruebas descritas para un material, con los que el material está obligado a cumplir.
Proceso estable: Un proceso se considera estable cuando el producto del mismo, independientemente de la naturaleza del
procesamiento (por partida o continuo), puede demostrar por medios apropiados un nivel de variabilidad que cumple regular-
mente con todos los aspectos de la especificación declarada (tanto de la USP como del cliente) y por lo tanto es aceptable para
su uso previsto.
Estabilidad: Cumplimiento continúo del excipiente con sus especificaciones.
Proveedor: Persona o empresa que suministra materiales farmacéuticos de partida según la demanda. Los proveedores pue-
den ser distribuidores, fabricantes, comerciantes, entre otros.
Cadena de suministro: Todos los pasos en la cadena de distribución entera que comienzan desde el punto en que un exci-
piente es transferido fuera del control del material del fabricante original, a un sistema de gestión posterior, hasta el usuario
final del excipiente.
4
7772 (1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel / Información General USP42
Usuario: Persona u organización que usa el excipiente en la fabricación de un medicamento u otro excipiente.
APÉNDICES
Apéndice 1: Modelo de Certificado de Análisis
El siguiente ejemplo de Certificado de Análisis se provee para ilustrar los principios tratados en esta guía y no pretende ser
obligatorio.
Certificado de Análisis
(los análisis de muestras, límites y declaraciones son para propósitos de demostración)
Nombre de la Empresa Proveedora
Dirección de la Empresa Proveedora
Lugar de Fabricación
Nombre del Fabricante (si es distinto al Proveedor) Teléfono: xxx-xxx-xxxx
Dirección del Sitio de Fabricación Fax: xxx-xxx-xxxx
Producto: Nombre Comercial y Descripción,o Nombre Común
Grado: Designación de Grado Código del Cliente: xxxxxx(si aplica)
Número de Partida: xxxxxx Fecha de Fabricación: dd/mmm/aaaa
Fecha de Reevaluación Recomendada: <tiempodesdela fechade fabricación>
Nombre Farmacopeicoy Designación: USP-NF,Ph.Eur.,JPo )PE
(Listar los múltiples nombres o designaciones si la nomenclatura es distinta en cada compendio)
Resultados de la Prueba (análisis de la muestra y límites para propósitos de demostración)
Prueba Método de Prueba Especificación Resultados
Apariencia Examen visual Polvo granular blanco Cumple
Materia extraña Examen visual Exento de contaminación visible Cumple
ldentificación-J PE Pruebas A-C Pasa Cumple
Transparencia y color )PE Transparente e incoloro Cumple
pH (solución al x%) USP 5,0-7,0 #,#
Residuo de incineración /PE No más de 1,0% (450º-550ºC) #,#%
Viscosidad (solución al x%) Ph.Eur. 4,0-7,0 mPa-s (@20ºC) #,# mPa-s
Sustancias insolubles en agua USP No más de O,1% #,#%
Pérdida por secado (11 O ºC) USP No más de 5,0% #,#%
Pérdida por secado (105 ºC) )PE No más de 6,0% #,#%
Tamaño de partícula Método del proveedor # 99,5% <150 µm ####
Información Adicional (análisis de muestra y límites para propósitos de demostración)
Metales pesados )PE No más de 10 ppm (como Pb) No más de 1 O ppmª
Arsénico )PE No más de 2 ppm No más de 2 ppmb
ª Esta prueba se lleva a cabo durante el proceso en cada partida y el material ha demostrado no presentar cambios en la muestra de excipiente terminado.
b Esta prueba se realiza trimestralmente basándose en la validación del proceso.
El siguiente ejemplo de Certificado de Análisis se provee para ilustrar los principios tratados en esta guía y no pretende ser
obligatorio.
Nombre de la Empresa Proveedora

Dirección de la Empresa Proveedora
Producto: Nombre Comercial y Descripcióno Nombre Común
Grado: Designación de Grado
Número de Partida: xxxxxx
Declaracionesde Cumplimiento y Certificación
Cumplimiento con las Buenas Prácticasde Fabricación:Esta partida de <NombreComercial>ha sido fabricada usando Buenas Prácticas de Fabrica-
ción para excipientes.
Normas farmacopeicas: Esta partida de <NombreComercial>cumple con todos los requisitos vigentes listados en la Farmacopeade los EstadosUnidos
(USP),la FarmacopeaEuropea(Ph.Eur.)v los ExcipientesFarmacéuticos
JaponesesUPE).
Otras declaracionesde certificación: En esta sección se debe listar cualquier otro tipo de certificación, p. ej., Disolventes Residuales, derivado de
organismos modificados genéticamente, o información específica del cliente. Las certificaciones pueden variar dependiendo de los requisitos regla-
mentarios regionales, asuntos específicos sobre Buenas Prácticas de Fabricación e información deseada por el cliente, basándose en su uso del exci-
piente.
identidad de la persona autorizada para la aprobación: xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
USP42 InformaciónGeneral/ (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos 7773
Cargo
Fecha de aprobación: dd/mmm/aaaa
EsteCertificadode Análisisfue generadomedianteun sistemade gestiónde documentoselectrónicocontrolado.
Apéndice 2: Alternativas al Análisis de Excipientes-Ejemplos
A continuación se presentan ejemplos de situaciones en los que podrían justificarse alternativas al análisis de excipientes ter-
minados. Estas no son las únicas situaciones en las que se puede demostrar un fundamento técnico sólido, ni tampoco son
ejemplos de situaciones en las que las alternativas al análisis de excipientes terminados serían siempre apropiadas.
• Una impureza, subproducto o materia prima sin reaccionar podría no estar presente en el producto debido a que las ma-
terias primas o las reacciones químicas usadas podrían no contener o producir dichas sustancias por encima de los límites
especificados.
• El índice de capacidad del proceso (Cp) para el atributo relevante es alto y, por ende, indica un proceso estable. Los análi-
sis estadísticos de los datos de frecuencia reducida deben mostrar que la propiedad permanece estable y dentro de las
especificaciones. Un proceso se considera estable cuando el producto del mismo, independientemente de la naturaleza
del procesamiento (por partida o continuo), puede demostrar por los medios apropiados un nivel de variabilidad que
cumple regularmente con todos los aspectos de la especificación declarada (tanto de la farmacopea como del cliente) y
por lo tanto es aceptable para su uso previsto. En el caso de procesos continuos, también es importante demostrar que el
material se ha producido en condiciones en las cuales el proceso ha alcanzado un "estado estacionario", es decir, en el
cual hay mínima intervención del operario y en donde los atributos durante el proceso se han estabilizado.
• Para el caso de un proceso continuo, los análisis durante el proceso muestran que la propiedad determinada a una fre-
cuencia reducida es estable y está dentro de las especificaciones. La repetición de la prueba en cada partida sería redun-
dante.
• Un análisis de un atributo que se determina en cada partida durante el proceso ha mostrado proveer garantías de que
puede cumplirse el requisito de la prueba final. Dichos datos pueden usarse para sustentar el análisis del excipiente termi-
nado a una frecuencia reducida.
REFERENCIAS
1. lntemational Pharmaceutical Excipients Council. IPECqualification of excipients for use in pharmaceuticals. Arlington, VA:
lnternational Pharmaceutical Excipients Council of the Americas; 2008. http://ipecamericas.org/sites/default/files/Exci-
pientQualificationGuide.pdf. Consultado el 18 de julio de 2016.
2. Carlin B, Carter D, Griffiths G, Lamer G, Moore K, Rothman B, et al. Joint position paper on pharmaceutical excipient tes-
ting and control strategies. Pharm Technol.2007;31(9):1-19.
3. lnternational Pharmaceutical Excipients Council. IPECexcipient stability program guide. Arlington, VA:lntemational Phar-
maceutical Excipients Council of the Americas; 201 O. http://ipec-europe.org/UPLOADS/100311 _IPECStabilityGuide-Fi-
nal.pdf. Consultado el 18 de julio de 2016.
4. lnternational Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use.
ICH harmonised tripartite guideline. Specifications: test procedures and acceptance criteria for new drug substances and
new drug products: chemical substances. Q6A. Geneva, Switzerland: lnternational Conference on Harmonisation of Tech-
nical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use; 6 October 1999.
(1084) ANÁLISISDE GLICOPROTEÍNAS

Y GLICANOS-
CONSIDERACIONESGENERALES
INTRODUCCIÓN
GENERAL
Se han desarrollado diversos fármacos glicoproteicos como resultado de los avances en la biotecnología; asimismo, muchas
proteínas derivadas de manera natural poseen estructuras complejas de glicanos. La glicosilación, una modificación postraduc-
cional de estas proteínas, puede desempeñar un papel importante en la determinación de la función farmacocinética, farmaco-
dinámica, estabilidad e inmunogenicidad de estos agentes. Los dos tipos principales de glicosilación proteica son la N-glicosila-
ción y la O-glicosilación. A diferencia de la transcripción y la traducción, la glicosilación es un proceso que no se realiza a partir
de un molde; por lo tanto, se pueden presentar variaciones en el patrón de glicosilación de una proteína ocasionadas por di-
versas fuentes o diferentes procesos de fabricación. Se sabe que las diferencias en este patrón afectan la actividad biológica.
Por consiguiente, los patrones de glicosilación pueden ser un conjunto importante de atributos que surgen al caracterizar una
glicoproteína candidata al uso terapéutico y al asegurar su estabilidad y calidad.
7774 (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos / InformaciónGeneral USP42
La primera parte de este capítulo proporciona una breve introducción a la glicobiología y describe la complejidad de las es-
tructuras de los glicanos. Las partes subsiguientes proporcionan diagramas de flujo y una serie de estrategias analíticas genera-
les que se pueden usar para caracterizar los glicanos de las glicoproteínas mediante los métodos siguientes:
1. Análisis directo de glicoproteínas; y
2. Análisis de glicanos liberados no derivatizados o derivatizados usando diversos métodos de separación cromatográfica y
electroforética y espectrometría de masas (MS).
Al final del capítulo se describen los diferentes métodos para analizar monosacáridos.
En lo que respecta a métodos analíticos selectos, este capítulo proporciona referencias cruzadas a otros capítulos de la USP,
en particular a aquellos relacionados con artículos derivados por biotecnología (ver los capítulos Electroforesis
Capilar(1053),
ArtículosObtenidospor Biotecnología-lsoelectroenfoque (1054), ArtículosObtenidospor Biotecnología-Mapeode Péptidos(1055)
y ArtículosObtenidospor Biotecnología-Electroforesis en Gelde Poliacrilamida
(1056)).
GLICOSILACIÓN
DE PROTEÍNAS
La mayoría de las proteínas en las células eucarióticas se glicosilan o se modifican postraduccionalmente antes de ser dirigi-
das hacia los lisosomas, y de convertirse en parte de la membrana en la superficie celular o de secretarse. La glicosilación pre-
senta variaciones significativas en cada célula, tejido y especie, debido a la expresión variante de cientos de glicosiltransferasas
y glicosidasas localizadas por todo el aparato de Golgi y el retículo endoplásmico (ER, por sus siglas en inglés). En las proteínas
se encuentran cuatro tipos principales de glicosilación enzimática:
1. La N-glicosilación, que implica la transferencia inicial de oligosacáridos al nitrógeno en el grupo amida terminal de la as-
paragina y su procesamiento y modificación subsiguientes en una serie de cadenas de glicanos;
2. La O-glicosilación, que en general implica la transferencia inicial de monosacáridos a los grupos hidroxilo de serina y treo-
nina, así como la elongación y ramificación subsiguientes de la cadena de sacáridos mediante la adición de monosacári-
dos;
3. El anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI), que es un glicolípido unido al (-terminal de una proteína; y
4. La C-glicosilación, que implica la formación de un enlace carbono-carbono entre el carbono C2 del anillo indol de triptó-
fano y el carbono Cl de un residuo de a-manopiranosilo.
Cualquier proteína dada puede contener múltiples glicosilaciones N, O ó C, pero no más de un anclaje GPI. Una adición no
enzimática de sacáridos, llamada glicación, puede presentarse cuando las proteínas se mezclan con azúcares reductores me-
diante una serie de reacciones complejas. Los dos tipos de glicosilación proteica que por lo general son motivo de preocupa-
ción y que se analizan en los fármacos glicoproteicos son la N- y la O-glicosilación. A continuación se analiza cada una de éstas.
N-Glicosilación
La biosíntesis de N-glicanos en glicoproteínas se puede describir como un proceso en cuatro etapas:
1. Iniciación y elongación de la cadena de glicanos unida por lípidos;
2. Transferencia de oligosacáridos a la proteína o cadena de polipéptidos naciente;
3. Procesamiento de la cadena de N-glicanos mediante la eliminación de residuos específicos de glucosa y manosa; y
4. Modificación de la cadena de N-glicanos mediante la adición de residuos a los extremos no reductores de la cadena de
glicanos.
Hay consenso en que la secuencia de aminoácidos para la N-glicosilación es Asn-Xaa-Thr/Ser (donde Xaa es cualquier ami-
noácido diferente de prolina). En general, solo aproximadamente dos tercios de todas las secuencias potenciales, denominadas
secuones, se glicosilan y, en la actualidad, no existe un método para predecir qué secuón será glicosilado. La N-glicosilación de
proteínas está relacionada, generalmente, con el tráfico y secreción de proteínas.
Los N-glicanos pueden categorizarse como ricos en manosa, híbridos o complejos, dependiendo del grado de procesamien-
to (Figura1). Las estructuras ricas en man osa (Apéndice1) carecen de residuos de galactosa o de N-acetilglucosamina
(GlcNAc), en las ramificaciones que funcionan como antenas en el extremo más distante de la cadena. En las estructuras híbri-
das, las antenas presentan residuos de GlcNAc sustituídos y residuos de manosa terminal, mientras que en las estructuras com-
plejas, los residuos de al ,6- y al ,3-manosa se sustituyen con grupos de GlcNAc. Los glicanos híbridos y complejos se pueden
presentar con dos o más ramificaciones, frecuentemente denominadas antenas; por lo tanto, a tales glicanos a menudo se les
denomina, por ejemplo, biantenarios, triantenarios o tetraantenarios. Asimismo, se sabe que existen los N-glicanos monoante-
narios y pentaantenarios. En los glicanos complejos, las antenas con frecuencia portan residuos de ácido siálico terminal (ácido
neuramínico). Se ha demostrado que la sialilación tiene un gran efecto sobre la farmacocinética y la farmacodinámica de mu-
chas glicoproteínas terapéuticas.
Tipos comunes de glicanos (N-glicanos)con enlacesde asparagina(Asn)

Fue,fucosa;Gal,galactosa;GlcNAc,N-acetilglucosamina:
Man, manosa;NeuSAc,ácidoN-acetilneuraminico
Tipo Rico en Manosa
(Man al.2) 0..,
Tipo Híbrido
¡Manal,6
Mancü,3
1
Mano:L6,
Manal,3
)'v1an¡31,4 GicNAc¡31,4G\cNAc¡31-Asr.
Mano.1.6,
(fvian o.1,2) ;¡,2 J,1ar.al,6,
{
W.an al.3 ;v:an¡31.4GlcNAc¡31.4
GicNAc¡31-Asn
:: Neu5Aca2,3/6 Gal¡31,4GfcNAc¡31,2Man al,3
Tipos Complejos
Biantenario
,:G!cNAc¡31,4 ::¡:ucal,6
Galpl,4 GkNAci31,2 Man al,6, i !
:: (Neu5Afü2,3/6) 0 .2 ,,Ma:1¡31,4 GlcNAcpl,4 GicNAq31-Asn
{
Gaipl,.4 GicNAc(31,2 Man o.1,3
Triantenaria
Ga!pl,4 GicNAcpl,4, :!:Fue al,6
,.,Manal,6, !
;::(Neu5Aca2,3/6) ¡¡. , Ga!pl,4 G!cNAcpl,2 rMan¡31,4 G!cNAc~l,4 G!cNAcpl-Asn
{
Ga!pl,4 GlcNAc¡31.2 Man o.1,3
Tetraantenario { Gat!31,4GícNAc¡31,4
~Manal,6 ::Jucal,6
Ga,i31.4G'cNAc!31,2 \ ,
rv•ar.¡31,4G'cNAcpl,.1 GícNAcpl-Asn
:: (Neu5Aca2,3Í6)~.o Gaípl,4 GicNAci31,4, /
/./ai1c.t1¡3
Ga ~1,4GicNAc~l,2
Figura 1. Tipos comunes de N-glicanos. Para abreviaturas, ver el Apéndice1.
O-Glicosilación
Las cadenas de 0-glicanos se construyen secuencialmente mediante un residuo de GalNAc inicial unido a serina, treonina y
tirosina, así como a los aminoácidos menos comunes, hidroxiprolina e hidroxilisina. Se conocen múltiples estructuras centrales
de glicanos. La secuencia y el enlace isomérico de monosacáridos presentan una mayor variedad que los de los N-glicanos y se
han identificado por lo menos ocho tipos distintos (Figura2). Aunque no hay consenso en una secuencia de aminoácidos de-
terminada para la 0-glicosilación, por lo general, esta se favorece con la presencia de prolina, un residuo antes o tres residuos
después del sitio de glicosilación, así como de la ausencia de residuos de aminoácidos cargados próximos a serina o treonina.
La unidad de disacárido N-acetil-lactosamina, Galp 1,4GlcNAc, es la extensión más común de la cadena. También son frecuen-
tes las modificaciones adicionales, incluyendo protección de la galactosa terminal con ácido siálico (terminal capping) y fucosi-
lación a lo largo de la cadena.
La 0-glicosilación puede ocurrir en grupos, por ejemplo, el tipo mucina, que por lo general forma parte de la matriz extrace-
lular de la superficie celular o de glicoproteínas secretadas. Otra 0-glicosilación, como por ejemplo 0-GlcNAc, se presenta en
muchas proteínas nucleocitoplásmicas; asimismo, la glicosilación con enlaces O-Man se presenta en algunas glicoproteínas
musculares y neurales y en la levadura. Los tipos de glicosilación con enlaces O-Fue- y 0-Glc se presentan en un gran número
de proteínas epidérmicas parecidas al factor de crecimiento que se asocian con la vía de señalización Notch.
4
7776 (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos / Información General USP42
Gali31,4 GlcNAci3l,6 \
Núcleo 1 Gal$1,3 GlcNAc~l,3 GalBl.3 GalNAc al • Ser( Thr)
1
Gal$1,3 GlcNAclsl,3
GalPl,4 (GlcNAci31,3Gal~l,4) n GlcNAcBl.6,

Núcleo 2 GalNAcal • Ser(Thr)
Gal!H,3 1 __ _
Gali31,4 GlcNAci3l,6,
Núcleo 3 'Gali31,4 GlcNAcBl,3GalNAcal -Ser(Thr)
Gal$1,4 GlcNAci31,3/
Gali31,4 GlcNAcBl,6 \
Núcleo4 GalNAca1 • Ser( Thr)
Gali31,4 GlcNAcBl 3 1
Núcleo 5 GlcNAcBl,6 GalNAc al• Ser( Thr)
Núcleo 6 GalNAcBl.3 GalNAc al- Ser( Thr)
Núcleo 7 GalNAc al.6 GalNAcal• Ser( Thr)
Núcleo 8
Gal gl 3 GalNAc al- Ser( Th r)
Figura 2. Estructuras nucleares comunes de O-glicanos (resaltadas y subrayadas). Abreviaturas para azúcares conforme al
Apéndice1.
Heterogeneidad de los Glicanos
El tipo de glicosilación (con enlaces N- u 0-), la ocupación del sitio y el sitio de glicosilación no son los únicos aspectos que
pueden variar de glicoproteína a glicoproteína, sino que también las estructuras reales de los oligosacáridos (ramificaciones y
uniones) pueden variar, incluso en el mismo sitio. La variación estructural sucede debido a que la glicosilación no se realiza a
partir de un molde. El patrón de glicosilación en un sitio dado depende de muchos factores, incluyendo la disponibilidad de
glicosiltransferasas y exoglicosidasas específicas de la célula y dependientes de su crecimiento encontradas en los aparatos de
Golgi y el RE.La heterogeneidad conduce a diversas propiedades físicas y bioquímicas, y por consiguiente, también a la diversi-
dad funcional.
Sistemasde Expresiónde CélulasHuéspedy Glicosilación
BACTERIAS
Aunque se ha demostrado que la O- y la N-glicosilación ocurren en una variedad de procariotes, la Escherichiacoli, que es la
bacteria elegida para muchos productos terapéuticos, no produce proteínas glicosiladas.
LEVADURA
Las levaduras producen proteínas N-glicosiladas y O-glicosiladas. La hipermanosilación en las levaduras puede producir cade-
nas de N-glicanos con más de 100 residuos de manosa, pero la sialilación no ocurre a menos que el organismo sea genética-
mente modificado. El desarrollo de cepas recombinantes de Pichiapastorisque contienen genes heterólogos insertados para
varias enzimas de glicosilación ha permitido la N-glicosilación en esta levadura de manera similar a la que se produce en huma-
nos. La O-glicosilación en las levaduras también varía significativamente de la que se presenta en células de mamíferos. A dife-
rencia de las células de mamíferos, la O-glicosilación de la serina o treonina se produce mediante la unión de moléculas de
manosa y a menudo consiste en cadenas lineales de hasta seis residuos de manosa.
USP42 Información General/ (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos 7777
CÉLULASDE INSECTOS
Las cadenas de N-glicanos de células de insectos por lo general son del tipo rico en rnanosa, trirnanosa o paucirnanosa y
complejo truncado (ver el Apéndice1 para definiciones). Las células de insectos también producen glicoproteínas con el resi-
duo Fuca 1, 3 unido al residuo de GlcNAc proximal en el núcleo de quitobiosa. Este residuo del núcleo de fucosa es un potente
inrnunógeno y alérgeno. La O-glicosilación en células de insectos no ha sido bien estudiada y aunque se han encontrado resi-
duos de GalNAc-Ser(Thr) con enlaces O-glicosídicos, son muy pocos los que se procesan más allá de la secuencia Galp 1,3Gal-
NAc-Ser(Thr). No se han encontrado residuos de ácido siálico en proteínas producidas en células de insectos.
VEGETALES
Y CÉLULASVEGETALES
Los N-glicanos de vegetales contienen principalmente oligosacáridos del tipo oligornanosa, pero también están presentes los
tipos híbridos y complejos truncados de estructuras, con o sin Xil/J1,2 acopladas al residuo de rnanosa con enlace p del nú-
cleo trirnanosílico y Fucal,3 acoplado al residuo de GlcNAc proximal del núcleo de quitobiosa. Los residuos Fue y Xil son in-
rnunogénicos y se ha demostrado que forman parte de los glico-epitopes de varios alérgenos vegetales. La O-glicosilación en
vegetales no ha sido bien estudiada pero se sabe que consiste predominantemente en la adición de cadenas de arabinogalac-
tanos acopladas a residuos de hidroxiprolina, treonina y serina que se localizan en la pared celular del vegetal o en la superficie
externa de la membrana plasmática celular. Estos glicanos son inmunogénicos.
CÉLULASANIMALES
La mayoría de las proteínas glicosiladas terapéuticas se producen en líneas continuas de células de animales. Se han emplea-
do las células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), de riñón de cría de hámster (BHK, por sus siglas en
inglés), de riñón embrionario humano (HEK,por sus siglas en inglés) y de rnieloma de ratón (SP2/0 o NS0). Estas células ani-
males por lo general producen proteínas con glicosilación similar a la que se observa en humanos. Aunque existen varias dife-
rencias entre la glicosilación en células de roedores y humanos, tales como la presencia de ácido N-glicolilneuramínico que no
se encuentra en humanos, las células de CHO se han convertido en una herramienta ampliamente utilizada por la industria
biotecnológica.
ANÁLISISDE GLICANOSPARA FÁRMACOSBIOLÓGICOSGLICOSILADOS
La glicosilación de proteínas puede afectar la actividad biológica, ya sea directa o indirectamente, y la variabilidad en la gli-
cosilación no solo surge de la diversidad celular, sino también del proceso de fabricación. Por consiguiente, el patrón de glico-
silación puede ser importante como parte de los estudios de caracterización al asegurar la uniformidad del proceso, y puede
ser importante también al asegurar la calidad uniforme de un medicamento biológico después de su ingreso al mercado. Se
requieren materiales de referencia adecuadamente caracterizados para respaldar el análisis biológico y fisicoquírnico de las par-
tidas de producción para asegurar la uniformidad entre partidas. El análisis de la glicosilación puede ser adecuado para los si-
guientes procesos:
1 . Caracterización de la estructura y estabilidad de productos novedosos y su estabilidad en las etapas de procesamiento y
almacenamiento;
2. Pruebas de liberación de partida y pruebas de control durante el proceso; y
3. Evaluación de la cornparabilidad entre productos (p. ej., cuando se han realizado uno o más cambios en el proceso).
La comprensión de la relación entre la estructura de glicanos y la función biológica permite tomar decisiones con respecto a
la información requerida en cada etapa de desarrollo. Para fármacos biológicos/biotecnológicos, los criterios de caracterización
y las especificaciones para la liberación de partidas por lo general se establecen en las pautas ICH Q68, TestProceduresand
AcceptanceCriteriafor Biotechno/ogical/Biologica/ Products(Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación para Productos
Biotecnológicos/Biológicos); 1 y ICH QSE, Comparabilityof Biotechnological/Biological ProductsSubjectto Changesin TheirManu-
facturing Process(Cornparabilidad de Productos Biotecnológicos/Biológicos Sujetos a Cambios en Su Proceso de Fabricación). 2
El mapeo de glicanos se lleva a cabo aplicando numerosos enfoques y metodologías. Esta variedad es una consecuencia de la
diversidad y complejidad de las estructuras de los glicanos, así corno de la tecnología y los sistemas de detección disponibles.
Debido a la diversidad y complejidad de las estructuras de los glicanos y al aumento en la disponibilidad y las mejoras en
varios sistemas de detección y tecnologías, los métodos analíticos cubren una amplia gama. Los diferentes métodos que respal-
dan a los procedimientos paso a paso varían con las glicoproteínas, la disponibilidad de equipo, la experiencia de cada científi-
co y los grupos de científicos, y la información requerida. Los dos tipos de glicosilación de proteínas más estudiados que afec-
tan a la bioactividad son la N- y la O-glicosilación.
Los análisis de glicanos pueden emplearse en diversas aplicaciones; las más importantes son: caracterización general del pro-
ducto, validación del proceso, evaluación de la cornparabilidad, pruebas de estabilidad, control de uniformidad del proceso de
fabricación y pruebas de liberación. La selección de las técnicas analíticas y sus aplicaciones en el desarrollo del producto y la
1
http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html; ingresada el 15/12/2011.
2
http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html; ingresada el 15/12/2011.
fabricación de rutina dependen de muchos factores, como por ejemplo la complejidad de la glicoproteína, el conocimiento de
las relaciones entre glicosilación y seguridad y eficacia, y el diseño general de la estrategia para controlar el proceso de fabrica-
ción. Por ejemplo, incluso cuando la importancia biológica de la glicosilación es incierta, el control de la glicosilación se puede
considerar como una medida de uniformidad de fabricación.
El diagrama de flujo de la Figura 3A es de gran ayuda en la selección de las aplicaciones del análisis de glicanos, mientras que
la Figura38 ofrece una perspectiva general de las técnicas analíticas disponibles y del equipo empleado.
/ ¿Laestructura del glicano modula

la bioactividad de la molécula?
Los análisis de glicanos deben conside-
rarse únicamente para observar la uni-
formidad del receso
Sí O incierto
¿La molécula se adapta al
Seleccionarlos métodos de Proteína pequeña, glicosilación
mapeo de glicanos
análisissin escición de
limitada y estructuras simples
glicanos?
No
Molécula grande,glicanoscon ramificaciones

complejas y/o múltiples sitios de glicosilación
¿Se requiere conocimiento Surge de la definición

sobre glicosilación sitio-específica' o biología del fármaco
No
• Determinación del intervalo de carga Decidir métodos de análisis
negativa No ¿Serequiere del análi~ (p.ej., digestión de proteasa y análisis
• Identificación y cuantificación de ácido
',~etallado de glicanos? de glicopéptidos)
siálico y/o monosacáridos
1
!
Seguir en B (Información general sobre análisis de glicanos): diseñar
IDET;NERI métodos para el análisis de g!icanos escindidos (p.ej., perfilantenario
de las ramificaciones, identificación de estructuras individuales)
Figura 3A. Diagrama de flujo de ayuda para la selección de opciones del análisis de glicanos.
Información General sobre los Métodos de Análisis de Glicanos

Espectrometría de masas MALDIy ESI
i
Análisis al nivel de lsoelectroenfoque para la heterogeneidad de la sialilación
glicoproteínas Electroforesis capilar para la heterogeneidad de la sia!ilación
intactas Cromatografía de intercambio iónico ~ara la heterogeneidad de la siali!adón
Métodos por arreglos (arrays) con Lect1na
Métodos ELlSAcon lectina
i5
Borohidruro alcalino ____., ~ ___r-CromatografíaHPAEC-PAD
t
cad.enas con enlaces O·) ~ ~ Cromatogra.fia en poligrafito
J
- Esp.ectrometría de masas-MALDI
Análisis al nivel E
Glicoproteínas de glkanos H1drazlna (cadenas - i [Cromatografía HPAEC-PAD
Terapéuticas escindidos conenlacesO·y N-) -~
;; X ~Separac,oneslect;nkas
Métodos enzimáticos § Marcacio.·n con Espectromet.ríade.masas {MS}
(cadenas con enlaces N0 5
~
fluoróforo Electroforesiscapilar
Cromatografíade intercambio aniónico
w Tratamiento de .(l..
exo-glicosidasas HPLCen fase normal=> MALDI-MS
HPLC·ESl·MS-MS acopladas
CE-ESI-MS-MS acopladas
Electroforesisen gel
HPLC---- Espectrometría
de masas-MALDI
Análisis al nivel HPLC-ESI-Espectrometríade masas acopladas
de Espectrometría de masas-MALO!
glicopéptidos Electroforesis capilar para la heterogeneidad de ta sialilación
Electroforesis capilar-ESI-Espectrometría de masas acopladas
Cromatografia HPAEC-PAD
Análisis a 1 nivel de
monosacáridos -f ., ,
Marcac1on con fluoroforo -
nnción química
HPLCen fase reversa
Figura 3B. Perspectiva general de las técnicas de análisis de glicanos y del equipo empleado.
SELECCIÓN
DE ANÁLISISDE GLICANOSPARA CARACTERIZACIÓN
Y ESPECIFICACIÓN
DE
FÁRMACOSBIOLÓGICOSGLICOSILADOS
Análisis de Glicoproteínas Intactas
La forma más directa de análisis es el estudio de las moléculas intactas. Este método permite obtener información sobre el
perfil de glicosilación de las glicoproteínas. Sin embargo, este procedimiento ofrece información limitada cuando se analiza
una molécula grande con múltiples sitios de glicosilación. Uno de los factores de glicosilación más importantes que define la
actividad biológica y determina la vida media de las glicoproteinas en circulación es el grado de sialilación. Esto hace que la
electroforesis basada en carga iónica y la cromatografía de intercambio iónico sean las técnicas de elección. Se han usado casi
todos los tipos de electroforesis en gel para estudiar la glicosilación de proteínas, incluyendo la electroforesis en gel de poliacri-
lamida (PAGE),(ver ArtículosObtenidospor Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida(1056)) y el isoelectroenfoque
(IEF),(ver ArtículosObtenidospor Biotecnología-lsoelectroenfoque (1054)). De manera similar, se ha demostrado que la electro-
foresis capilar (CE), (ver Electroforesis
Capilar(1053)) también es adecuada. La cromatografía de intercambio aniónico fuerte se
ha usado con el mismo propósito, pero la resolución es a menudo inferior a la del IEFy la CE. La espectrometría de masas
directa (MS) es otra opción para el análisis de la modificación postraduccional. A medida que se mejora la resolución de la MS,
se hace posible, por medio de este método, la caracterización directa de glicoproteínas cada vez más complejas.
Análisis de Glicopéptidos
El análisis de glicopéptidos ofrece información sobre los sitios de glicosilación, el grado de ocupación y las estructuras de los
oligosacáridos. Los sitios de glicosilación se pueden ver afectados por las condiciones de cultivo celular. Por lo tanto, si un sitio
de glicosilación conocido es crítico, los fabricantes deben monitorear las estructuras sitio-específicas de los glicanos. El método
típico consiste en generar primero glicopéptidos mediante la digestión con proteasa y luego separarlos, por ejemplo, por HPLC
en fase reversa (RP-HPLC}(ver ArtículosObtenidospor Biotecnología-Mapeo de Péptidos(1055)). Posteriormente, los glicopépti-
dos separados se pueden caracterizar individualmente, p. ej., mediante análisis directo usando MS, o por desglicosilación y
posterior identificación de los glicanos, según se describe más adelante en la sección Perfilde 0/igosacáridosEscindidos.
La identificación directa mediante MS de la mezcla de glicopéptidos y péptidos sin glicosilar, está limitada por el efecto del
enmascaramiento (supresión de iones) de los péptidos sobre las señales de los glicopéptidos. Se puede evitar este efecto sepa-
rando los péptidos de los glicopéptidos antes del análisis por MS, por ejemplo, combinando el análisis MS fuera de línea (ioni-
zación por desorción con láser asistida por matrices [MALDI,por sus siglas en inglés]) o por acoplamiento en línea (ionización
por electrospray [ESI,por sus siglas en inglés]). El análisis por MS de glicopéptidos es importante en la caracterización de O-
glicanos debido a que estos glicanos no siempre se liberan cuantitativamente y además, debido a su menor tamaño, se adap-
tan mejor a la caracterización por MS como glicopéptidos.
También puede ser apropiado usar CE de alta resolución para la separación, en especial para el análisis de sialilación.
Perfil de Oligosacáridos Escindidos
La generación de un perfil de glicanos totales escindidos de glicoproteínas es el método más común para caracterizar glico-
proteínas. Este método ofrece información sobre las diversas poblaciones de glicanos presentes en las proteínas. El grado de
sialilación también se puede analizar en este proceso. Dependiendo del método seleccionado, pueden ser necesario derivatizar
o marcar previamente a los glicanos para permitir su detección. Se encuentran disponibles muchos protocolos y la mayoría de
los pasos en el análisis están bien establecidos. La posible desventaja con tal flexibilidad es la falta de acuerdo con respecto a la
elección del método bajo ciertas circunstancias; debido a la variedad de técnicas analíticas, no siempre es posible comparar los
resultados obtenidos usando diferentes plataformas. Hasta ahora, la mayoría del trabajo se ha enfocado en la N-glicosilación,
debido a los siguientes factores:
1 . Por lo general, los N-glicanos son clínicamente más relevantes que los O-glicanos en los productos biológicos; o
2. La liberación de N-glicanos, ya sea por medios químicos (hidrazina) o por enzimas (endoglicosidasas y N-glicosidasa pep-
tídica F [PNGasa F]), es más sencilla que la liberación de glicanos con enlace 0-.
DESGLICOSILACIÓN
El método usado para la liberación de glicanos depende de la glicoproteína en análisis. El agente de escisión se selecciona de
acuerdo con el tipo de escisión y el nivel de información requeridos. Se puede usar escisión enzimática o química. La Tabla 1
proporciona una lista de algunos agentes de escisión enzimática y su especificidad. La eficiencia de la digestión por lo general
depende de la accesibilidad de los glicanos en la proteína y, por consiguiente, la proteína debe desnaturalizarse para maximi-
zar la exposición del sitio de glicosilación, a menos que los analistas deseen distinguir entre glicanos en la superficie y en el
interior de la proteína. También pueden usarse agentes de escisión química, por ejemplo, hidrazina o borohidruro alcalino para
/J-eliminación de glicanos con enlace 0-.
Tabla 1. Ejemplos de Agentes de Escisión Enzimática

Agente Especificidad
Liberación de gllcanos con enlace N-
Péptido-N'-(N-acetil-/J -glucosaminil) asparagina amidasa (EC 3.5.1.52) Hidrólisis del residuo del péptido-N'-(N-acetil-/J -glucosaminil) asparagina
en la que el residuo de glucosamina puede estar aún más glicosilado que
resulta en una N-acetil-/J -D-glucosaminilamina (sustituida) y un péptido
que contiene un residuo de aspartato.
Péptido-N-Glicosidasa F (PNGasa F) Liberación de las cadenas de N-glicano que no contienen núcleo de fucosa
con enlace (al,3).
Péptido-N-Glicosidasa A (PNGasa A) Liberación de las cadenas de N-glicano que contienen un núcleo de fucosa
con enlace (al ,3).
Manosil-glicoproteína endo-/J -N-acetilglucosaminidasa (EC 3.2.1.96) Endohidrólisis de la unidad N,N'-diacetilquitobiosilo en glicopéptidos/
glicoproteínas ricos en manosa que contienen la estructura -
[Man(GlcNAc),]Asn
Endo-/J -N-acetilglucosaminidasa F (endo F) Liberación de oligosacáridos ricos en manosa, híbridos y complejos
Endo-/J -N-acetilglucosaminidasa H (endo H) Liberación de oligosacáridos ricos en manosa e híbridos
Liberaciónde glicanos con enlace O-
Glicopéptido-a-N-Acetilgalactosaminidasa (EC 3.2.1.97)* Hidrólisis de residuos D-galactosil-N-acetil-a-o-galactosaminídicos termina-
les
* Esta enzima tiene un uso limitado debido a su alta especificidad de sustrato.
Liberación Química o Enzimática de N-Glicanos-La PNGasa F (Flavobacteriummeningosepticum)es la enzima de prefe-

rencia para la liberación de N-glicanos para la mayoría de las glicoproteínas, excepto para algunas glicoproteínas de células
vegetales y de insectos que pueden contener un residuo Fuca.1,3 unido al núcleo de quitobiosilo. Las cadenas de N-glicanos
que tienen esta estructura pueden ser separadas del glicopéptido únicamente por la enzima de almendra, PNGasa A. La libera-
ción química por hidrazina anhidra es mucho menos común, principalmente debido a la disponibilidad limitada del reactivo, el
cual se considera como un químico peligroso. Asimismo, la hidrazinólisis produce N-glicanos des-N-acetilados.
Liberación Química o Enzimática de 0-Glicanos-En la actualidad, solamente una enzima, la O-glicanasa de Diplococcus
pneumoniae,está disponible para la liberación de O-glicanos y esta enzima tiene un uso limitado debido a su alta especificidad
de sustrato: únicamente separa residuos de Galp l ,3GalNAcal-Ser{íhr. Además, no se dispone de un procedimiento químico
ideal; no obstante, los O-glicanos unidos a Ser y Thr se pueden liberar generalmente mediante la reacción por p -eliminación
reductora catalizada con álcali (reacción con borohidruro alcalino), en la que los glicanos liberados se reducen tan pronto co-
mo se escinden a fin de evitar la formación de productos de degradación debido al "peeling". Sin embargo, esta reacción no
es específica y se sabe que, por lo general, durante la reacción también se liberan aproximadamente 10%-20% de N-glicanos.
Los glicanos liberados carecen de un grupo reductor usado para el acoplamiento de marcadores fluorescentes mediante ami-
nación reductiva. Afortunadamente, gracias a los avances en la sensibilidad de la MS, es posible la identificación directa de
glicanos reducidos. Se pueden obtener O-glicanos reductores de una calidad relativamente buena mediante p -eliminación ca-
talizada con álcali usando aminas primarias tales como la etilamina y la hidrazina. No obstante, ambos reactivos tienen el po-
tencial de producir productos de degradación debido al "peeling". Además, la liberación de O-glicanos con etilamina no es
cuantitativa. Aunque la hidrazina puede ser mejor que la etilamina, requiere del estricto control de las condiciones de reacción
y manipulación, además de que no cuenta con una fuente comercial en Europa.
Separación de Glicanos Escindidos Sin Marcado Fluorescente-Los N-glicanos también se pueden resolver mediante cro-
matografía de intercambio aniónico HPAECde pH alto con detección amperométrica por pulsos (PAD,por sus siglas en inglés;
ver Cromatografía(621 )), la cual presenta alta sensibilidad, puede separar algunos isómeros y alcanzar una capacidad para de-
tectar directamente glicanos nativos sin marcar. No obstante, la LC/MS para este método de separación es complicada debido
a que este sistema HPAECusa fases móviles con pH elevado y alta concentración de sales que interfieren con la ionización de
los glicanos. Además, la cuantificación absoluta del glicano solo es posible si se conocen los factores de respuesta PADindivi-
duales para las diversas estructuras de los glicanos, p. ej., si se encuentra disponible una biblioteca de referencia de oligosacári-
do apropiada. La cromatografía en grafito poroso (PGC, por sus siglas en inglés) también puede usarse para separar glicanos y
ofrece selectividad ortogonal adicional en comparación con otras columnas. Es posible aplicar un método de PGC-MS por ioni-
zación con electrospray y para el análisis directo de glicanos.
La MALDI/ESI-MSes un método potente para el análisis de mezclas de glicanos tanto en la forma nativa como en la forma
derivatizada. La permetilación de glicanos liberados es un método común para el análisis directo usando MALDI/ESI-MS,espe-
cialmente para glicanos sialilados.
MARCADODE GLICANOSPARAINCREMENTAR
LASENSIBILIDAD
DE DETECCIÓNY/O PARAMODIFICARSUS PROPIEDADES
FISICOQUÍMICAS
La derivatización química es el método más común que se emplea para marcar glicanos en su extremo reductor mediante
ami nación reductiva. Se puede acoplar un marcador fluorescente a cada mono y oligosacárido, facilitando así la determinación
de cantidades molares. La Tabla2 presenta los ejemplos más comunes de marcadores fluorescentes y sus usos más comunes.
a a
T.bl2Ej empos d e M arca dores FIuorescentes
Acrónimo en in- Técnica
o;
Nombre qlés Estructura Analítica
Ácido 2-aminobenzoico 2-AA HPLC
o-
#
o;H,
o
2-Aminobenzamida 2-AB NH 2 HPLC
MS
o
2-Aminopiridina 2-AP HPLC
Sal trisódica de 8-aminopireno-1,3,6-

trisulfónico
APTS
°'""'
NaO 3 S
1
~#~
1 #1 #'
~
NH 2 CE
1~
NaO 3 S
# SO3 Na
PERFILDE N-GLICANOS
El análisis o la determinación del perfil de los glicanos liberados se puede realizar mediante procedimientos cromatográficos,
electroforéticos o de MS y, en general, mediante una combinación de los mismos. Los métodos se pueden elegir y agrupar de
acuerdo con la naturaleza de los glicanos y el nivel de información requerida. El análisis de glicanos ofrece información sobre
las diversas poblaciones de glicanos presentes en la proteína (ricos en manosa, híbridos, complejos).
Perfil de Glicanos mediante HPLCy/o Electroforesis y MS-La generación de perfiles de glicanos marcados con etiquetas
fluorescentes mediante HPLCse ha convertido en el método más común. Se puede acoplar una etiqueta a cada mono y oligo-
sacárido individual mediante aminación reductiva en su extremo reductor, facilitando la determinación de cantidades molares.
Con un marcador apropiado, se puede generar un perfil de glicanos con alta sensibilidad usando HPLCen fase reversa, en fase
normal y de intercambio aniónico (ver Cromatografía(621 )). Rutiariamente, los analistas usan una combinación de estos méto-
dos a fin de incrementar la resolución de la separación y para diferenciar mejor las estructuras de los glicanos. La exactitud de
la identificación de los glicanos se puede validar mediante estándares de glicanos y/o acoplando el sistema HPLCcon MS. Por
consiguiente, la HPLCde intercambio aniónico, en fase normal y en fase reversa-ESI-MS-MS forman combinaciones podero-
sas; asimismo y de ser posible, el análisis en línea puede ofrecer perfiles cuantitativos relativos e información sobre la estructura
de los glicanos en una sola corrida. La identificación de los picos a través del tiempo de retención es aceptable siempre que sus
identidades hayan sido previamente validadas por métodos complementarios y que sea posible garantizar la homogeneidad
de los picos.
El grado de sialilación de las cadenas de los glicanos puede ser un factor crucial para la eficacia clínica, debido a que la siali-
lación a menudo define la vida media de la molécula in vivo. La HPLCde intercambio aniónico es el método más simple para
su determinación y las estructuras de los glicanos separados basandose en la carga pueden ser identificadas posteriormente
mediante MS. Cuando la interfase de ionización está diseñada únicamente para flujos de bajo contenido salino, es necesaria la
desalinización de cada fracción antes de la MS.
Cuando se utilizan sistemas de separación de alta resolución tales como la CE, se pueden identificar las estructuras de los
glicanos usando estándares bien caracterizados para comparación, sin necesidad de usar la MS. El desarrollo de un sistema CE-
MS en línea ha incrementado aún más el poder del análisis de glicanos usando este método.
Identificación Estructural por Secuenciación Microenzimática y Espectrometría de Masas-Cuando se requiere infor-
mación detallada sobre la estructura, el análisis generalmente se lleva a cabo usando secuenciación microenzimática. Este pro-
cedimiento depende en gran medida de la especificidad y calidad de las enzimas usadas. En los últimos tiempos, la MS en
tándem se ha usado con mayor regularidad para confirmar, determinar y secuenciar estructuras de glicanos conocidas y nue-
vas; este método es factible especialmente cuando los glicanos se liberan de glicoproteínas bien conocidas y de fuentes de
producción también bien conocidas.
Análisisde Monosacáridos
Diversos ensayos cuantitativos de monosacáridos se llevan a cabo para una variedad de propósitos. En el campo de las glico-
proteínas, estos proporcionan información sobre las cantidades relativas de sacáridos en una glicoproteína y sobre el grado de
sialilación de una glicoproteína; asimismo, a través de la medición de la composición de monosacáridos, ofrecen cierta infor-
mación sobre la estructura de las cadenas de glicanos presentes.
Los ensayos usados más simples son las pruebas calorimétricas para demostrar que el producto sea glicosilado y para cuanti-
ficar la cantidad total de sacárido presente en el producto. Dichas pruebas tienen una pobre especificidad entre diferentes ti-
pos de residuos de azúcares.
Los ensayos de la composición de monosacáridos son por lo general más simples de realizar que el perfil de oligosacáridos,
aunque proveen menos información. El ensayo de mayor uso es la cuantificación de contenido de ácido siálico, debido a que
la pérdida de sialilación y exposición de residuos Gal terminales pueden llevar a una eliminación más rápida de la glicoproteína
de la circulación.
Estos ensayos se pueden dividir en dos tipos: (1) aquellos que proporcionan información composicional sobre la muestra
intacta sin degradación previa; y (2) otros, principalmente cromatográficos, que requieren la hidrólisis de las cadenas de sacári-
dos antes del análisis y que generan información cuantitativa sobre diversas especies de monosacáridos de manera simultánea.
En general, los primeros son calorimétricos y los últimos son cromatográficos. La etapa de hidrólisis es una fuente importante
de variabilidad del ensayo y puede requerir de optimización cuidadosa para muestras específicas.
La presencia de ciertos monosacáridos señala la presencia de estructuras de glicanos específicas. Por ejemplo, la GalNAc ge-
neralmente indica la presencia de cadenas de O-glicanos, mientras que la fucosa denota la presencia de tipos específicos de
cadenas. Como consecuencia de la diversidad limitada de residuos de monosacáridos presentes en los glicanos de las glicopro-
teínas, se requiere la cuantificación exacta de los residuos Man, Gal o GlcNAc a fin de distinguir entre grandes cantidades de
glicanos estructuralmente diversos. El monosacárido ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc, por sus siglas en inglés) no se pro-
duce en humanos y por lo general se considera un componente indeseable y potencialmente inmunogénico de los productos
biofarmacéuticos.
PREPARACIÓN
DE LAMUESTRA
Las muestras de glicoproteínas para el análisis de monosacáridos deben estar libres de sales, excipientes y demás materiales
portadores (a menudo se usan azúcares de bajo peso molecular como excipientes para productos biofarmacéuticos). Lo ante-
rior se puede lograr a través de una variedad de métodos, incluyendo los siguientes:
1. Diálisiscontra agua o contra un amortiguador volátil, usando una membrana adecuada y liofilización;
2. HPLCen una columna para permeación en gel apropiada, elu ida con agua o con un amortiguador volátil, monitoreada
por absorbancia UV o índice de refracción y seguida por la liofilización de la muestra; o
3. Captura de la muestra en un cartucho RP-SPE(extracción en fase sólida de fase reversa) como por ejemplo un sistema
para SPE (extracción en fase sólida) C18 o C8, seguido por lavado para eliminar las sales y excipientes y elución de la
muestra requerida.
CUANTIFICACIÓN
El método común para la cuantificación de azúcares neutros en las glicoproteínas depende del color generado al calentar
glicanos o glicoproteínas en presencia de fenol acuoso en ácido sulfúrico concentrado. En muchos casos, el calor requerido
para esta reacción se genera agregando ácido sulfúrico concentrado a la mezcla de glicoproteínas-fenol en agua. El mezclado
rápido y eficaz de las soluciones es crítico para obtener resultados uniformes. Los resultados cuantitativos se obtienen mediante
el análisis simultáneo de estándares para generar una curva estándar de absorbancia en función de la cantidad de sacáridos y/o
en función de una muestra de referencia del producto en análisis.
PROCEDIMIENTOSDE HIDRÓLISISPARACADENASDE POLISACÁRIDOS

Y GLICANOSDE GLICOPROTEÍNAS
Los métodos cromatográficos para la identificación y cuantificación de componentes de monosacáridos requieren la hidróli-
sis de la muestra antes del análisis. Es necesaria la preparación adecuada de la muestra debido a que los excipientes o las impu-
rezas relacionadas con el proceso pueden ser sacáridos, y las sales residuales pueden interferir con la hidrólisis o con la separa-
ción cromatográfica subsiguiente o con la marcación con fluoróforo. Los residuos de ácido siálico pueden ser liberados me-
diante hidrólisis ácida moderada o por tratamiento enzimático, lo cual deja otros residuos de azúcares unidos a la cadena pep-
tídica. La cuantificación de la cantidad de sacárido presente se basa en la adición de un estándar interno antes o después de la
hidrólisis. El estándar más comúnmente usado para el análisis de ácido siálico mediante HPAECes el ácido 3-desoxi-D-glicero-D-
galacto-2-nonulosónico (KDN), mientras que la 2-desoxiglucosa se usa ampliamente para azúcares neutros. Ambos azúcares
USP42 Información General/ (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos 7783
son acidolábiles y se deben agregar después de la etapa de hidrólisis. La cuantificación exacta depende de la hidrólisis este-
quiométrica y de que no se degraden los productos monosacáridos durante la hidrólisis.
DETERMINACIÓN
DE ÁCIDOSSIÁLICOSTOTALES
Los ácidos siálicos se presentan en polisacáridos y glicoproteínas bacterianas generalmente como derivados N-acetilo y N-
glicolilo del ácido neuramínico (Neu5Ac y Neu5Gc). Los ácidos siálicos pueden determinarse junto con otros monosacáridos a
través de un proceso que incluye hidrólisis ácida para liberar monosacáridos constitutivos, seguida de HPLCusando una mezc-
la estándar apropiada. Otra alternativa para determinar el contenido total de ácido siálico son los procedimientos colorimétri-
cos sin necesidad de hidrólisis. El método comúnmente referido como método Warren se basa en la reacción del ácido tiobar-
bitúrico con el producto de oxidación con peryodato del ácido neuramínico liberado in situ a partir de la glicoproteína. Tam-
bién el color se puede generar, mediante la reacción de resorcinol con ácido neuramínico. Para alcanzar una cuantificación
exacta, se incluye una muestra de estándar de referencia en cada medición.
Liberación Selectiva de Ácidos Siálicos-La hidrólisis ácida o la digestión enzimática moderadas se pueden usar para libe-
rar de manera selectiva ácido siálico a partir de las cadenas de glicanos de glicoproteínas para cuantificación por métodos cro-
matográficos y para cuantificación de formas indeseables tales como el Neu5Gc. Resultan necesarias condiciones ácidas más
agresivas a fin de liberar azúcares neutros y amino azúcares antes del análisis cromatográfico. El protocolo debe ser optimizado
con respecto al rendimiento y la degradación de sacáridos para cada proteína a analizar.
Digestión de Neuraminidasa para la Liberación de Ácido Siálico a partir de Glicoproteínas Intactas-Diversos tipos de
neuraminidasas han sido aisladas y estudiadas; la enzima derivada de Clostridiumperfringenses la que se usa de manera más
común para la liberación enzimática de ácidos siálicos a partir de las glicoproteínas. La enzima recombinante está disponible a
través de proveedores comerciales. Se encuentran disponibles otras enzimas con diferentes especificidades que pueden ser uti-
lizadas para distinguir diferentes tipos de enlaces. Las condiciones de hidrólisis deben optimizarse para cada producto, debido
a que los parámetros cinéticos para diferentes enlaces, así como para Neu5Ac y Neu5Gc pueden variar. La eliminación selectiva
de Neu5Ac con enlaces a2➔,3 y Neu5Ac con enlaces a2➔,6 a partir de glicanos escindidos es un medio conveniente para
definir enlaces. Para análisis cuantitativos, se agrega una cantidad conocida de un estándar interno adecuado, a menudo 2-
desoxiglucosa, después de la hidrólisis y eliminación del ácido.
SEPARACIÓN
Y CUANTIFICACIÓN
DE MONOSACÁRIDOSNO MARCADOS
El único método usado para la identificación y cuantificación simultáneas de monosacáridos no marcados en hidrolizados es
esencialmente HPAEC-PAD.Los métodos HPAEC-PAD también son aplicables a separaciones de oligosacáridos, por lo que se
puede usar un único método instrumental para ambas aplicaciones.
Para mayor información sobre los principios y componentes generales de cromatografía, ver Cromatografía(621 ). El HPAEC-
PADfacilita el análisis de monosacáridos y todas las clases de oligosacáridos sin derivatización. Debido a que son compuestos
polihídricos, los carbohidratos son ácidos débiles con valores pKa de 12-14 y, a valores elevados de pH, incluso los carbohidra-
tos neutros se ionizan y pueden ser separados como oxianiones mediante cromatografía de intercambio iónico. Aunque las
separaciones pueden llevarse a cabo en intercambiadores aniónicos con poliestireno-divinilbenceno porosos estables en álcali,
los carbohidratos tienden a presentar picos amplios como resultado de problemas de transferencia de masas. En las microesfe-
ras peliculares de relleno de la columna de intercambio aniónico, las microesferas de látex funcionalizadas (diámetro <0, 1µm)
se acoplan a microesferas no porosas uniformes de mayor tamaño (diámetro <1 Oµm). El analito de carbohidrato interactúa
con los grupos funcionales en la superficie de las microesferas de látex, eliminando la difusión hacia dentro y hacia afuera de
los poros y el ensanchamiento del pico asociado.
La PADes el método preferido para la detección de carbohidratos en HPAECdebido a que se basa en las soluciones con pH
alto provistas por HPAECde manera predeterminada. La detección amperométrica mide la corriente o la carga que resulta de
la oxidación o reducción de moléculas de analito en la superficie de un electrodo de trabajo. Los electrones se transfieren del
analito electroactivo al electrodo durante las reacciones de oxidación y en la dirección opuesta durante las reacciones de re-
ducción. Este proceso permite la detección sensible y altamente selectiva de analitos que se pueden oxidar o reducir, pero las
especies interferentes que no son electroactivas siguen sin ser detectadas. Los carbohidratos se oxidan fácilmente en electrodos
de oro y platino a un pH elevado y la corriente generada es proporcional a la concentración de carbohidratos.
Un sistema típico de detección amperométrica contiene un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia. Los electrodos
de oro son los más comunes para el análisis de carbohidratos, pero los productos de oxidación dañan la superficie del electro-
do e inhiben la oxidación adicional. Una superficie estable y activa en el electrodo se logra mediante pulsaciones cíclicas entre
potenciales positivos y negativos altos. A esta serie de potenciales diferentes a intervalos regulares se la conoce como forma de
onda y la aplicación repetida de una forma de onda es la base de una amperometría por pulsos. Se usan diferentes formas de
onda para diferentes aplicaciones HPAEC-PAD y para diferentes electrodos de trabajo: los electrodos de oro desechables requie-
ren el uso de formas de onda cuádruples y rápidas, pero otros electrodos de oro permiten el uso de un rango más amplio de
formas de onda sin dañar la superficie del electrodo. Los electrodos desechables y las formas de onda rápidas se introdujeron
para minimizar la influencia del electrodo de receso sobre la sensibilidad y precisión de aplicaciones cuantitativas de monosa-
cáridos.
7784 (1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos / InformaciónGeneral USP42
MARCACIÓNDE MONOSACÁRIDOSCON FLUORÓFOROANTESDE LASEPARACIÓNY LACUANTIFICACIÓN
Un método alternativo a la identificación y cuantificación de monosacáridos presentes en un hidrolizado consiste en modifi-

car los monosacáridos mediante ami nación reductiva con un marcador fluoróforo fácilmente detectable que permita la detec-
ción de alta sensibilidad y mejore la separación cromatográfica de monosacáridos. Se puede usar un equipo de HPLCesencial-
mente estándar y, debido a que se pueden aplicar los mismos métodos de marcación a los oligosacáridos separados, es posible
aplicar un método analítico congruente. La marcación con fluoróforo se ha usado en mucha menor medida que HPAEC-PAD
para la identificación y cuantificación de monosacáridos. La marcación de derivados de ácido siálico por lo general se lleva a
cabo con 1,2-fenilendiamina (o DMB, 4,5-metilendioxi-derivados) y los productos resultantes se separan en una columna C-18
usando detección por fluorescencia.
CONCLUSIÓN
Por lo general, debido a la complejidad de las estructuras de los glicanos de las glicoproteínas y su variación inherente du-
rante los procesos de producción, se requiere que los fabricantes desarrollen, mediante estudios de caracterización, criterios
para controlar el patrón de glicosilación de un fármaco biológico cuando ocurra la glicosilación y que desarrollen el nivel de
información requerido en cada etapa de la producción y en la liberación de partidas. Posteriormente, se pueden derivar proce-
dimientos analíticos de tal manera que proporcionen información pertinente para cumplir con los requisitos de calidad. En ge-
neral, resulta necesaria una combinación de métodos y técnicas, además de que se requiere un análisis estructural de glicanos
más detallado en etapas tempranas del desarrollo de fármacos. Las consideraciones sobre la validación son importantes a me-
dida que progresa el desarrollo de métodos y el conocimiento de los productos.
APÉNDICE1
Abreviaturas
Fue L-Fucosa
Gal o-Galactosa
GalNAc N-Acetil-D-galactosamina
Glc D-Glucosa
GlcNAc N-Acetil-D-glucosamina
Man D-Manosa
Neu5Ac Ácido N-acetilneuramínico
Neu5Gc Ácido N-glicolilneuramínico
Xil D-Xilosa
Definiciones Adicionales
Ricasen manosa-Cadenas de glicanos que contienen dos residuos de núdeo de GlcNAc y entre cinco y nueve residuos de
Man y que carecen de residuos de Gal, GlcNAc o Neu5Ac en las antenas. Dichas cadenas por lo regular se encuentran en glica-
nos de mamíferos.
Hipermanosilación-(i) Adición de residuos de Man a cadenas ricas en manosa que crea cadenas con grandes cantidades
de residuos de Man y ii) cadenas de glicanos con enlaces O-Man con múltiples residuos de Man sintetizados por levadura.
Paucimanosa-Cadenas de glicanos que contienen dos residuos de núcleo de GlcNAc entre dos y cuatro residuos de Man.
Pueden estar presentes residuos unidos al núcleo de Fucal ,3 y/o Fucal ,6.
Oligomanosa-Se usa en este capítulo como un término genérico que incluye rico en manosa, paucimanosa y cadenas hi-
per-manosiladas con enlaces N.
(1086) IMPUREZASEN FÁRMACOSY PRODUCTOSFARMACÉUTICOS
INTRODUCCIÓN
Este capítulo de información general tiene como propósito proporcionar la terminología común para impurezas y productos
de degradación que pueden estar presentes en fármacos y productos farmacéuticos farmacopeicos. Las impurezas o productos
de degradación en fármacos pueden surgir durante el proceso de fabricación o durante el almacenamiento del fármaco. Los
productos de degradación en productos farmacéuticos pueden surgir a partir de fármacos o productos de reacción del fárma-
co con el ambiente, con un excipiente o un sistema de envase-cierre primario. Este capítulo no cubre productos biológicos y
USP42 Información General/ (1086) Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos 7785
biotecnológicos, productos de fermentación y productos semisintéticos derivados de los mismos, y preparaciones radiofarma-
céuticas.
La inclusión en esta Farmacopea de definiciones de términos y los contextos en que se usan dichos términos, permite mejo-
rar las comunicaciones acerca de impurezas y productos de degradación en artículos farmacopeicos. (>lerDefinicionesmás ade-
lante.) En los últimos años ha habido mucha actividad y discusión sobre definiciones de términos. Ciertas inquietudes de la
industria acerca de la terminología y el contexto merecen una publicación de amplia difusión y fácil acceso, y por ello se inclu-
yen en esta Farmacopea. Ver la sección 5.60, Impurezas y Sustancias Extrañasen la sección 5, Componentes delasMonografías
en Advertenciasy RequisitosGenerales,5.60 Impurezasy SustanciasExtrañas,y el capítulo general ImpurezasComunes(466).
Con el transcurso de los años se han agregado otros capítulos generales que incluyen tópicos de pureza o impurezas a medida
que cobraron relevancia o se dispuso de la metodología analítica. En el capítulo Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos
(1225) se amplían los aspectos analíticos.
Las mediciones de pureza o impurezas en productos farmacéuticos suponen un desafío para el establecimiento de las nor-
mas Farmacopeicas. Cuando se trata de la degradación de un producto farmacéutico con el transcurso del tiempo, los mismos
métodos analíticos indicadores de estabilidad son también indicadores de pureza. La separación de los ingredientes activos de
los excipientes necesarios para la preparación presenta el mismo problema cualitativo. Por esto, muchas monografías de pre-
paraciones Farmacopeicas se caracterizan por tener valoraciones cromatográficas. Cuando se conocen las impurezas de mayor
significancia, algunas monografías establecen pruebas de límite específicas. Sin embargo, en general, en esta Farmacopea no
se repiten pruebas de impurezas en las monografías de preparaciones subsiguientes cuando dichas pruebas se especifican para
las monografías del fármaco y siempre que se espere que tales impurezas no aumenten. Se asume que se retienen muestras
adecuadas de la partida exacta de un fármaco usado en un lote específico de un producto farmacéutico. Siempre que el análi-
sis de un artículo oficial genere dudas sobre los atributos oficiales de cualquiera de los fármacos usados, se debe realizar un
análisis de las muestras de retención.
FÁRMACO
Clasificación de Impurezas
Las impurezas se pueden clasificar en las siguientes categorías:

1. Impurezas orgánicas (de proceso y del fármaco)
2. Impurezas inorgánicas
3. Disolventes residuales
Las impurezas orgánicas pueden surgir durante el proceso de fabricación y/o almacenamiento del fármaco. Pueden ser iden-
tificadas o no identificadas, volátiles o no volátiles, e incluyen lo siguiente:
1. Materiales iniciales
2. Subproductos
3. Productos intermedios
4. Productos de degradación
5. Reactivos, ligandos y catalizadores
6. Isómeros geométricos y estereoisómeros
Las impurezas inorgánicas pueden resultar del proceso de fabricación. Por lo regular se conocen e idientifican, e incluyen lo
siguiente:
1. Reactivos, ligandos y catalizadores
2. Metales pesados u otros metales residuales
3. Sales inorgánicas
4. Otros materiales (p.ej. adyuvantes de filtración, carbón)
Los disolventes residuales son líquidos orgánicos que se usan como vehículos para la preparación de soluciones o suspensio-
nes en la síntesis de un fármaco. Debido a que generalmente presentan una toxicidad conocida, la selección de los controles
apropiados se logra fácilmente (ver DisolventesResiduales(467)).
Los conceptos para establecer los límites de impurezas o productos de degradación en fármacos se basan en inquietudes de
índole química y física. Como tales, los límites para impurezas orgánicas e inorgánicas y disolventes residuales se deben esta-
blecer para los fármacos. El principio básico para establecer límites consiste en que los niveles de impurezas o de productos de
degradación en un fármaco se deben controlar durante su desarrollo para asegurar su seguridad y calidad de uso en un pro-
ducto farmacéutico.
Se debe establecer evidencia documentada de que el procedimiento analítico usado para evaluar impurezas o productos de
degradación está validado y es adecuado para la detección y cuantificación de impurezas o productos de degradación.
PRODUCTOFARMACÉUTICO
La especificación para un producto farmacéutico incluye una lista de productos de degradación que se espera estén presen-
tes durante la fabricación del producto comercial y en las condiciones de almacenamiento recomendadas. Se deben usar estu-
dios de estabilidad, conocimiento de rutas de degradación, estudios de desarrollo de producto y estudios de laboratorio para
7786 (1086) Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos / Información General USP42
caracterizar el perfíl de degradación. La selección de productos de degradación en la especificación del producto farmacéutico
debe basarse en los productos de degradación encontrados en las partidas fabricadas mediante el proceso comercial propues-
to.
Este fundamento debe incluir una discusión sobre los perfiles de degradación observados en las partidas usadas para los es-
tudios de seguridad y desarrollo clínico y en estudios de estabilidad, en conjunto con una consideración del perfil de degrada-
ción de partidas fabricadas mediante el proceso comercial propuesto. Para los productos de degradación que se reconocen
e.orno inusualmente potentes o que producen efectos farmacológicos tóxicos o inesperados, el límite de cuantificación/detec-
ción de los procedimientos analíticos debe ser proporcional al nivel al que se deben controlar los productos de degradación.
Para productos farmacéuticos, el concepto para establecer límites de productos de degradación se basa en aplicar un juicio
científico bien establecido a los datos disponibles sobre la seguridad y estabilidad del producto farmacéutico, datos que pue-
dan incluir rutas de degradación del fármaco, el proceso de fabricación, interacciones conocidas del excipiente, cualquier estu-
dio de evaluación de seguridad, estudios de estabilidad realizados en las condiciones de almacenamiento recomendadas y es-
tudios auxiliares que pudieran proporcionar información adicional sobre el perfil de estabilidad del producto farmacéutico. Las
impurezas que no son productos de degradación (p. ej., impurezas de proceso derivadas del fármaco) a menudo no se contro-
la en el producto farmacéutico, pues por lo general se controlan en el fármaco y no se espera que estas impurezas aumenten
con el paso del tiempo. Se pueden encontrar pautas adicionales para establecer límites en diversos documentos del ICH y la
FDA,así como en las pautas de presentación de monografías USP.
Se debe establecer evidencia documentada de que el procedimiento analítico usado para evaluar impurezas o productos de
degradación está validado y es adecuado para la detección y cuantificación de impurezas o productos de degradación.
Los productos farmacéuticos deben contener niveles de disolventes residuales que no sean mayores a los que pueden respal-
darse mediante los datos de seguridad (ver DisolventesResiduales(467'>).
GLOSARIO
Componentes concomitantes: Los componentes concomitantes son característicos de muchos fármacos y no se conside-
ran impurezas en el sentido Farmacopeico. En esta Farmacopea se establecen límites de contenido o intervalos específicos, o se
definen mezclas de los componentes concomitantes. Son ejemplos de componentes concomitantes los isómeros geométricos
y ópticos (o racematos) y los antibióticos que son mezclas. Cualquier componente que pueda considerarse una impureza tóxi-
ca debido a su efecto biológico indeseable significativo no se considera un componente concomitante.
Contaminantes del proceso: Los contaminantes del proceso son sustancias identificadas o no identificadas (excluidas las
sustancias relacionadas y el agua), incluyendo los reactivos, catalizadores, otras impurezas inorgánicas (p. ej., metales pesados,
cloruro o sulfato); y también pueden incluir sustancias extrañas (contaminantes extraños). Estos contaminantes pueden intro-
ducirse durante los procedimientos de fabricación o de manejo.
Disolventes residuales: Líquido orgánico que se usa como vehículo para la preparación de soluciones o suspensiones en
la síntesis de un fármaco (ver DisolventesResiduales(467)).
Impureza-Cualquier componente de un fármaco que no es la entidad química definida como el fármaco y además, para
un producto farmacéutico, cualquier componente que no sea un ingrediente de formulación
Impureza estereomérica: Compuesto con la misma estructura química bidimensional que el fármaco pero que difiere en
la orientación tridimensional de los sustituyentes en los centros quirales dentro de dicha estructura. Para aquellos casos en los
que todos los centros quirales se encuentran orientados de manera opuesta, la impureza es un enantiómero (impureza enan-
tiomérica). Las determinaciones de impurezas en esta categoría a menudo requieren métodos cromatogáficos quirales especia-
les. Las impurezas diastereoméricas o epiméricas se presentan cuando solamente algunos de los centros quirales están orienta-
dos de manera opuesta.
Impurezas comunes: Algunas monografías hacen referencia a las impurezas comunes. Para mayor información, ver Impu-
rezas Comunes(466).
Impurezas especificadas y productos de degradación especificados: Anteriormente denominadas Impurezas Indicado-
ras, las impurezas especificadas o productos de degradación especificados son impurezas o productos de degradación que se
listan individualmente y se limitan con criterios de aceptación específicos en las monografías individuales, según corresponda.
Las impurezas especificadas o productos de degradación especificados pueden ser identificados o no identificados.
Impurezas identificadas y productos de degradación identificados: Impurezas o productos de degradación para los
que se ha logrado su caracterización estructural.
Impurezas inorgánicas: Las impurezas inorgánicas pueden resultar del proceso de fabricación (p. ej., metales residuales,
sales inorgánicas, coadyuvantes de filtración, etc.). Normalmente, las impurezas inorgánicas se controlan mediante pruebas
como Residuode Incineración(281). También puede resultar útil la información suministrada en Espectroquímicade Plasma
(730) y CromatografíaJónica(1065).
Impurezas no identificadas y productos de degradación no identificados: Impurezas o productos de degradación para
los que no se han logrado caracterizaciones estructurales y se identifican únicamente mediante propiedades analíticas cualitati-
vas (p. ej., tiempos de retención cromatográficos).
Impurezas no especificadas y productos de degradación no especificados: Impurezas o productos de degradación que
se limitan mediante criterios de aceptación generales pero que no se listan individualmente con sus propios criterios de acepta-
ción específicos en las monografías individuales.
USP42 InformaciónGeneral/ (1087) Disolución Intrínseca Aparente 7787
Impurezas tóxicas: Las impurezas tóxicas poseen una actividad biológica indeseable significativa, aún como componen-
tes minoritarios, y requieren de su identificación y cuantificación individual mediante pruebas específicas. Estas impurezas pue-
den surgir de la síntesis, preparación o degradación de artículos farmacopeicos. Se seleccionan pruebas y especificaciones indi-
vidualizadas basándose en los datos de validación. Estas pruebas se realizan mediante la comparación de impurezas con un
Estándar de Referencia, si estuviera disponible. Corresponde al fabricante proporcionar datos que respalden la clasificación de
dichas impurezas como impurezas tóxicas.
Material inicial: Material que se usa en la síntesis de un fármaco y que se incorpora como un elemento en la estructura de
un producto intermedio y/o del fármaco. Los materiales iniciales a menudo se encuentran disponibles comercialmente y tienen
propiedades físicas y químicas y una estructura bien definidas.
Otras impurezas: Ver la sección 5. Componentesde las Monografíasen Advertenciasy RequisitosGenerales.
Producto de degradación: Impureza que resulta de un cambio químico en el fármaco ocurrido durante la fabricación y/o
el almacenamiento del producto farmacéutico por el efecto de, por ejemplo, la luz, temperatura, pH, agua, o por reacción con
un excipiente y/o sistema de envase-cierre primario.
Producto intermedio: Material que se produce durante las etapas de síntesis de un fármaco y que experimenta una trans-
formación química adicional antes de convertirse en un fármaco. El producto intermedio a menudo se aísla durante el proceso.
Polimorfos: Diferentes formas cristalinas del mismo fármaco, que pueden incluir productos de solvatación o hidratación
(también conocidos como seudopolimorfos) y formas amorfas. Aunque los polimorfos no son impurezas por definición, resulta
crítico para la caracterización general del fármaco comprender las formas cristalinas, los estados de hidratación o solvatación o
la naturaleza amorfa.
Reactivo: Sustancia diferente al material inicial, producto intermedio o disolvente que se usa en la fabricación de un fár-
maco.
Sustancias extrañas (contaminantes extraños): Impurezas que surgen de una fuente extraña al proceso de fabricación y
que son introducidas por contaminación o adulteración. Estas impurezas no pueden preverse al seleccionar las pruebas y valo-
raciones de las monografías. La presencia de sustancias extrañas inaceptables no reveladas por las pruebas o valoraciones de
las monografías constituye una desviación respecto de la norma oficial. Como ejemplos de sustancias extrañas se pueden citar
la efedrina en Ipecacuana o un plaguicida en un analgésico oral líquido. Esta Farmacopea considera la posibilidad de detectar
sustancias extrañas mediante métodos no oficiales. (Ver Advertenciasy RequisitosGenerales,5. 6 OImpurezasy SustanciasExtra-
ñas.)
Sustancias relacionadas: Las sustancias relacionadas están vinculadas estructuralmente con un fármaco. Estas sustancias
pueden ser (a) impurezas identificadas o no identificadas que surgen del proceso de síntesis como los materiales iniciales, pro-
ductos intermedios o subproductos y no aumentan en el almacenamiento o (b) productos de degradación identificados o no
identificados que resultan de los procesos de fabricación del fármaco o del producto farmacéutico, o que surgen durante el
almacenamiento del material.
(1087) DISOLUCIÓN INTRÍNSECAAPARENTE-PROCEDIMIENTOSDE

PRUEBASDE DISOLUCIÓN PARADISCO ROTATORIOY DISCO
ESTACIONARIO
Este capítulo de información general DisoluciónIntrínsecaAparente-Procedimientosde Pruebasde Disoluciónpara DiscoRota-

torio y DiscoEstacionario(1 087) trata sobre la determinación de las velocidades de disolución de compactos de material no
desintegrable que exponen un área superficial fija a un medio disolvente determinado. El compacto, según se usa en este capí-
tulo, es una masa no desintegrable que resulta de la compresión del material en análisis usando condiciones de presión apro-
piadas. Una única superficie con dimensiones físicas especificadas se expone a disolución. La determinación de la velocidad de
disolución puede ser importante durante el desarrollo de nuevas entidades químicas puesto que en ocasiones permite predecir
problemas potenciales de biodisponibilidad y puede ser útil también para caracterizar artículos farmacopeicos tales como exci-
pientes o fármacos. Los estudios de disolución intrínseca son estudios de caracterización y no están referidos en las monogra-
fías individuales. La información suministrada en este capítulo de información general está destinada a ser adaptada a través de
un protocolo específico apropiado al material determinado.
La velocidad de disolución por lo general se expresa como la masa de soluto que aparece en el medio de disolución por
unidad de tiempo (p. ej., masa seg- 1), pero el flujo de disolución se expresa como la velocidad por unidad de área (p. ej., masa
cm-2 seg- 1). Se prefiere informar el flujo de disolución dado que está normalizado por el área superficial y por lo general se lo
denomina velocidad de disolución intrínseca en el caso de un fármaco puro. La velocidad de disolución está influenciada por
las propiedades intrínsecas del estado sólido, tal como el estado cristalino, incluyendo polimorfos y solvatos, así como por el
grado de no cristalinidad. Se cuenta con numerosos enfoques investigativos para modificar las propiedades fisicoquímicas de
las entidades químicas, de forma que mejoren su solubilidad y sus propiedades de disolución. Entre estos métodos se encuen-
tran el uso de los coprecipitados y el uso de dispersiones sólidas amorfas. El efecto de las impurezas asociadas con un material
7788 (1087) Disolución Intrínseca Aparente/ Información General USP42
puede también alterar significativamente sus propiedades de disolución. Las propiedades de disolución también se ven influen-
ciadas por factores extrínsecos como el área superficial, la hidrodinámica y las propiedades del medio de disolución, incluyen-
do el disolvente (por lo general, agua), la presencia de surfactantes, la temperatura, la viscosidad del líquido, el pH y el tipo y
concentración de la solución amortiguadora.
Los procedimientos de disolución de disco rotatorio y disco estacionario son suficientemente versátiles como para permitir el
estudio de las características de los compuestos de interés farmacéutico bajo una gran variedad de condiciones de prueba. Las
características comunes a ambos aparatos incluyen las siguientes:
(1) Son adaptables al uso con aparatos de disolución estándar y ambos usan una matriz de tableta para contener el compacto
no desintegrable durante la prueba de disolución.
(2) Dependen de la compresión del compuesto de prueba en un compacto que no se descame ni desprenda durante la prue-
ba de disolución.
(3) Una superficie única de geometría y dimensiones físicas conocidas se expone a disolución.
(4) La matriz está localizada en una posición fija en el vaso, lo cual disminuye la variación de las condiciones hidrodinámicas.
Una diferencia entre los dos procedimientos es la fuente del flujo del líquido sobre la superficie en disolución. En el caso del
procedimiento del disco rotatorio, el flujo del líquido se genera por rotación de la matriz en un líquido quiescente, mientras
que en el procedimiento del disco estacionario el flujo del líquido se produce con una paleta u otro dispositivo mezclador.
PROCEDIMIENTO
EXPERIMENTAL
El procedimiento para llevar a cabo estudios de disolución con los dos tipos de aparatos consiste en preparar un compacto
de material que no se desintegre usando un dispositivo de compactación adecuado, colocar el compacto y el montaje de la
matriz circundante en un medio de disolución adecuado, someter el compacto a las condiciones hidrodinámicas deseadas cer-
ca de su superficie y medir la cantidad de soluto disuelto en función del tiempo.
Los compactos se preparan por lo general usando un aparato que consta de una matriz, un punzón superior y una placa de
superficie inferior fabricada de acero endurecido u otro material que permita la compresión del material en análisis en un com-
pacto que no se desintegre. Un aparato alternativo de compactación consta de una matriz y dos punzones. También se pue-
den usar otras configuraciones que produzcan un compacto que no se desintegre y tenga un área superficial constante. El
compacto no desintegrable tiene por lo general un diámetro de 0,2-1,5 cm.
Preparación del Compacto
Conectar la placa de superficie inferior lisa a la cara inferior de la matriz o, como alternativa, insertar el punzón inferior usan-
do un sistema de sujeción apropiado. Pesar con exactitud la cantidad de material necesario para producir un compacto acep-
table y transferirlo a la cavidad de la matriz. Colocar el punzón superior dentro de la cavidad de la matriz y comprimir el polvo
en una prensa hidráulica a la presión de compresión requerida para formar un compacto que no se desintegre y que perma-
nezca en el montaje de la matriz a lo largo de la prueba. Para muchos de los compuestos cristalinos orgánicos, por lo general
es suficiente aplicar compresión durante 1 minuto a 15 MPa, pero se deberían evaluar otras condiciones alternativas de com-
presión que eviten la formación de capilares. Para una sustancia dada, una vez optimizada la preparación del compacto, ésta
se estandariza para facilitar la comparación de las diferentes muestras de la sustancia.
Durante la compresión pueden ocurrir cambios en la forma cristalina; por lo tanto, se debe confirmar la forma del estado
sólido por medio de difracción de rayos X para polvo u otras técnicas. Retirar la placa de superficie o el punzón inferior. Elimi-
nar el polvo suelto de la superficie del compacto y la matriz con una corriente de aire o nitrógeno.
Medio de Disolución
La elección del medio de disolución es una consideración importante. Siempre que sea posible, se deben efectuar las prue-
bas bajo condiciones de exceso de solubilidad (sink conditions) para evitar que se retarde artificialmente la velocidad de disolu-
ción debido al acercamiento del medio al punto de saturación del soluto. Las mediciones de disolución se hacen típicamente
en medios acuosos. Para semejar las condiciones in vivo, las mediciones se pueden realizar en el intervalo fisiológico de pH a
37°. Siempre que sea posible, el procedimiento se lleva a cabo bajo las mismas condiciones que se usan para determinar la
solubilidad intrínseca de la forma del estado sólido en análisis. Los medios de disolución se deben desgasificar inmediatamente
antes del uso para evitar la formación de burbujas de aire sobre la superficie del compacto o de la matriz. 1
Se deben controlar la temperatura del medio y el pH, especialmente cuando se usan sales y compuestos ionizables, donde la
velocidad de disolución puede depender en gran medida del pH, del tipo de solución amortiguadora y de la concentración de
la misma. Para efectos de simplicidad, al hacer pruebas de disolución en un área de superficie constante se supone que el pH
en la superficie del compacto en disolución es igual al pH del medio de disolución a granel. En caso de compuestos no ioniza-
bles esto es relativamente simple porque no se espera una dependencia significativa de la velocidad de disolución con el pH.
1
Un método de desgasificaciónes el siguiente:Calentarel medio aproximadamentea 41º mezclandosuavemente,inmediatamentefiltraral vacíoutilizandoun
filtro con un tamaño de poro de 0,45 µm o menor, mezclandovigorosamente,y continuarmezclandoal vacíoduranteaproximadamente5 minutos.Tambiénse
pueden emplearotras técnicasde desgasificaciónparaeliminarlos gases disueltos.
USP42 Información General/ (1087) Disolución Intrínseca Aparente 7789
En el caso de ácidos y bases, el soluto puede alterar el pH en la superficie del compacto y en las cercanías de la misma durante
la disolución. Bajo estas condiciones, el pH en la superficie del compacto puede ser bastante diferente del pH del medio a gra-
nel debido a la capacidad autoamortiguadora del soluto. Con el fin de evaluar la solubilidad intrínseca, se deben escoger con-
diciones experimentales para eliminar el efecto de la amortiguación del soluto, la alteración del pH de la solución y la precipi-
tación de otras formas del estado sólido en la superficie del compacto. En el caso de ácidos débiles, el pH del medio de disolu-
ción debe estar de 1-2 unidades por debajo del pKa de la sustancia que se disuelve. En el caso de bases débiles, el pH del
medio de disolución debe estar de 1-2 unidades por encima del pKa de la sustancia que se disuelve.
Aparatos
DISCO ROTATORIO
Un aparato típico (Figura 1) consiste en un punzón y una matriz fabricados de acero endurecido. La base de la matriz tiene
tres orificios roscados para conectar una placa de superficie de acero pulido, que proporciona una base pulida a espejo para el
pellet compactado. La matriz posee una cavidad en la que se coloca una cantidad medida del material cuya velocidad de diso-
lución intrínseca se va a determinar. Luego se inserta el punzón en la cavidad de la matriz y se comprime el material de prueba
mediante una prensa hidráulica. [NOTA-Un orificio en la cabeza del punzón permite la inserción de una varilla metálica que
ayuda a sacarlo de la matriz después de la prueba.] En la cavidad se forma un pellet compactado del material con una sola cara
de área definida expuesta en el fondo de la matriz.
Cara inferior de la matriz
Montaje de soporte
&eje
Placa de superficie
Punzón ,_,
'Ql
Nota-Aceroendurecidoy pulido.
'Q--1
\_, ,_,
,-0'1
Junta de Neopreno
~: Matriz
~ Nota-Acero inoxidable tipo #316.
Placa de superficie
Nota-Aceroendurecidoy pulido.
Figura 1
El montaje de la matriz se conecta entonces a un eje fabricado de un material apropiado (por lo general, acero). El eje que
sostiene el montaje de la matriz se coloca de forma tal que, al descender la matriz dentro del medio de disolución (Figura 2), la
superficie expuesta del compacto esté a no menos de 1,0 cm del fondo del vaso y nominalmente en posición horizontal. El
montaje de la matriz debe alinearse para reducir al mínimo las oscilaciones y no se debe permitir la formación de burbujas de
aire sobre la superficie del compacto o de la matriz.
4
7790 (1087) Disolución Intrínseca Aparente / InformaciónGeneral USP42
_ Vasode
disolución
.,.____Montaje de
matriz y eje
Figura 2
Se recomienda una velocidad de 300 rpm para el disco rotatorio. Las velocidades típicas de rotación pueden estar entre 60-
500 rpm. La velocidad de disolución depende de la velocidad de rotación utilizada. Este parámetro se debe seleccionar con el
fin de admitir al menos cinco puntos de muestreo durante la prueba, pero si las velocidades de mezclado son excesivas se
pueden crear patrones de cizallamiento en la superficie del material en disolución que podrían ocasionar resultados aberrantes
(es decir, no linealidad). Por lo general, la concentración de la muestra de prueba se mide en función del tiempo y después se
calcula la cantidad disuelta. El intervalo de muestreo se determinará de acuerdo con la velocidad del proceso de disolución. Si
se toman muestras del medio de disolución, la cantidad acumulativa disuelta en cada tiempo de muestreo se debe corregir por
las pérdidas debidas al muestreo.
DISCO ESTACIONARIO
El aparato (Figura3) consta de un punzón de acero, una matriz y una placa de base. La base de la matriz tiene tres agujeros
para conexión a la placa de base. Los tres tornillos fijos sobre la placa de base se insertan a través de los agujeros de la matriz y
luego se aseguran con tres tuercas y arandelas. El material de prueba se coloca dentro de la cavidad de la matriz. Luego se
inserta el punzón en la cavidad y se comprime con la ayuda de una prensa de banco. La placa de base se desconecta entonces
de la matriz para exponer una superficie lisa del pellet compacto. Alrededor del hombro roscado de la matriz se coloca una
junta y luego se enrosca una tapa de polipropileno en el hombro roscado de la matriz.
El montaje de la matriz se coloca entonces en el fondo plano de un vaso de disolución especialmente diseñado (Figura4). La
unidad de mezclado (p. ej., la paleta) se coloca a una distancia apropiada (por lo general 2,54 cm) de la superficie del com-
pacto. El montaje de la matriz y la unidad de mezclado se deben alinear para garantizar una hidrodinámica uniforme y no
deben haber burbujas de aire presentes en la superficie del compacto durante la prueba. Se pueden utilizar otras configuracio-
nes si es posible establecer la caracterización y control adecuados de la hidrodinámica.
USP42 Información General/ (1087) Disolución Intrínseca Aparente 7791
Junta ~l!.<1Z//Z//ITI==::Jil/Z1/ZZZZZl2i
"""'~"'"
\_ Compacto de
fármaco
Placa de superficie
Figura 3
Vaso de Eje de paleta

disolución \ rotatoria
Compacto
de fármaco
I
Figura 4
La velocidad de disolución depende de la velocidad de rotación y de la hidrodinámica precisa que exista. Por lo general, la
concentración de la muestra de prueba se mide en función del tiempo y después se calcula la cantidad disuelta. El intervalo de
muestreo se determinará de acuerdo con la velocidad del proceso de disolución (ver DiscoRotatorio).Si se toman muestras del
medio de disolución, la cantidad acumulativa disuelta en cada tiempo de muestreo se debe corregir por pérdidas debidas al
muestreo.
ANÁLISISE INTERPRETACIÓN
DE LOSDATOS
La velocidad de disolución se determina graficando la cantidad acumulativa de soluto disuelta en función del tiempo. El aná-
lisis de regresión lineal se efectúa sobre los datos de la región lineal inicial de la curva de disolución. La pendiente corresponde
a la velocidad de disolución (masa seg- 1). (Se pueden obtener cálculos más precisos de la pendiente usando un modelo lineal
7792 (1087) Disolución Intrínseca Aparente/ InformaciónGeneral USP42
generalizado que tenga en cuenta las correlaciones entre las mediciones de las cantidades acumulativas disueltas en los diver-
sos tiempos de muestreo).
Los perfiles de cantidad en función del tiempo pueden mostrar una curvatura. Cuando esto ocurre, solo se usa la porción
lineal inicial del perfil para determinar la velocidad de disolución. La curvatura ascendente (segunda derivada positiva) de con-
centración contra tiempo por lo general indica un problema experimental sistemático. Los problemas posibles incluyen degra-
dación física del compacto por resquebrajamiento, deslaminación o desintegración. La curvatura descendente (segunda deri-
vada negativa) del perfil de disolución, a menudo indica una transformación de la forma sólida del compacto en la superficie o
que se está llegando inadvertidamente al punto de saturación del medio de disolución. Esto ocurre con frecuencia cuando una
forma cristalina termodinámicamente menos estable se convierte en una forma más estable. Ejemplos de esto incluyen la con-
versión de una forma amorfa en una forma cristalina, la conversión de una forma anhidra a una forma hidratada, la formación
de una sal o la conversión de una sal en el correspondiente ácido o base libre. Si se observa tal curvatura, se puede evaluar la
forma cristalina del compacto retirándola del medio y examinándola por difracción de rayos X para polvos u otra técnica simi-
lar, para determinar si el área de superficie expuesta está cambiando.
La velocidad de disolución del área de superficie constante se expresa en unidades de masa seg-1, y el flujo de disolución se
informa en unidades de masa cm-2 seg- 1 • El flujo de disolución se calcula dividiendo la velocidad de disolución por el área de
superficie del compacto. Con los análisis se deben informar también las condiciones de la prueba, por lo general, una descrip-
ción del aparato, la velocidad de rotación, la temperatura, el tipo y concentración de la solución amortiguadora, el pH y la
fuerza iónica.
(1088) EVALUACIÓNIN VIVO E IN VITRO DE FORMAS

FARMACÉUTICAS
PROPÓSITO
Este capítulo proporciona una visión general de la metodología para caracterizar las propiedades fisicoquímicas de un fárma-
co y de su producto farmacéutico asociado, y analiza la relación entre estos métodos y propiedades con las propiedades farma-
cocinéticas y farmacodinámicas del producto farmacéutico. Los resultados de los métodos in vitro se vinculan con información
de las evaluaciones in vivo a través de una correlación in vitro-in vivo (CIVIV)
ALCANCE
El objetivo principal de estos estudios de caracterización es comprender la relación que guardan las propiedades fisicoquími-
cas y farmacológicas del fármaco con las propiedades farmacocinéticas y el desempeño in vitro del producto farmacéutico.
Este capítulo describe el análisis in vitro e in vivo que se lleva a cabo durante el desarrollo del conjunto de datos que proporcio-
na información para la toma de decisiones relacionadas con la formulación, fabricación y actividades reglamentarias asociadas
para el desarrollo, aprobación reglamentaria y comercialización de cualquier producto farmacéutico. Este capítulo complemen-
ta la información de los capítulos generales, • Evaluacióndel Desempeñoe Jntercambiabilidadde MedicamentosSólidosOrales-
• (AFOl-may-io, 9¡Biodisponibi/idad,
Bioequivalenciay Disolución(1090) y Procedimientode Disolución:Desarrolloy Validación(1092)
detallando los datos in vitro e in vivo esenciales que son fundamentales para comprender la bioequivalencia y la biodisponibili-
dad. El texto del capítulo reconoce la disponibilidad de guías reglamentarias y de una cantidad importante de literatura sobre
el contenido provisto y no tiene como propósito presentar una discusión exhaustiva sobre los temas tratados, sino ofrecer una
guía y un listado de los temas de interés.
ANTECEDENTES
Durante mucho tiempo se ha buscado establecer una relación significativa entre el comportamiento en lo que respecta a la
disolución y el desempeño del producto farmacéutico in vivo (es decir, una CIVIV)desde la perspectiva de la biodisponibilidad
(BD) y bioequivalencia (BE)y del control de calidad. La política de la USP para establecer criterios de aceptación de disolución
para una monografía de un producto se ha basado en dar una importancia predominante a los estudios válidos de BD o BE,
cuando estos se encuentran disponibles.
La primera característica in vitro que se consideró que podría predecir el comportamiento in vivo fue la desintegración de
cápsulas y tabletas. La prueba de desintegración se adoptó en la USPXIV (1950). En aquel momento, no se realizaron estudios
cuantitativos para intentar demostrar dicha relación, especialmente con respecto al desempeño del producto in vivo. Sin em-
bargo, los avances en los métodos instrumentales y en la precisión analítica finalmente sentaron las bases para esta tarea. El
Panel de Expertos en Disponibilidad Fisiológica (Joint Panel on Physiologic Availability)de USP-NF reconoció que la prueba de
USP42 InformaciónGeneral/ (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro 7793
desintegración no era lo suficientemente sensible y, en 1968, ordenó la identificación de artículos experimentales para las pri-
meras 12 pruebas de disolución oficiales que utilizaron el Aparato 1.
La USPrequiere analizar la liberación de fármacos mediante la prueba de desempeño de la USP en la mayoría de las mono-
grafías de formas farmacéuticas orales, sublinguales y transdérmicas que no sean soluciones. El estado actual de la ciencia hace
necesario llevar a cabo pruebas in vivo durante el desarrollo y la evaluación de formas farmacéuticas de liberación inmediata y
de liberación modificada. En algunos casos, dependiendo de la clasificación del fármaco en el Sistema de Clasificación de Bio-
farmacéuticos (Biopharmaceutics Classification System o BCS)y, dependiendo de la política reglamentaria, el análisis en vivo
podría no ser necesario. Además, se reconoce ampliamente la especial sensibilidad de la prueba de disolución a los cambios en
la composición o en el método de fabricación que no resultan en cambios significativos en el desempeño in vivo. La compren-
sión de toda la información provista mediante la evaluación in vitro e in vivo del fármaco y del producto es el punto de partida
para el desarrollo de una prueba de desempeño in vitro significativa.
EVALUACIÓN
IN VITRO
Propiedades Fisicoquímicas-Fármaco
La información fisicoquímica generalmente incluye polimorfismo, estabilidad, distribución del tamaño de partícula, solubili-
dad, velocidad de disolución, lipofilicidad, permeabilidad y otras variables que controlan la liberación del fármaco en condicio-
nes que puedan imitar las condiciones extremas del ambiente fisiológico a las que se someta la forma farmacéutica.
Propiedades Fisicoquímicas-Producto Farmacéutico

Las variables analizadas para caracterizar las propiedades fisicoquímicas del producto farmacéutico deben ser las mismas que
se analizaron para caracterizar el fármaco. Los perfiles de disolución en un intervalo de pH pertinente, usualmente de pH 1-
6,8, se deben obtener prestando particular atención a los efectos de la formulación. Para caracterizar formulaciones insolubles
en sistemas acuosos puede ser necesario agregar lauril sulfato de sodio u otro agente tensoactivo. Se debe determinar la clasifi-
cación en el BCS para el fármaco, en especial para formas farmacéuticas de liberación inmediata.
Prueba de Disolución
La prueba de disolución se requiere para todas las formas farmacéuticas orales de la Farmacopea, incluyendo sublinguales,
que no sean soluciones, en las que sea necesaria la absorción del medicamento para que el producto ejerza el efecto terapéuti-
co deseado. Las excepciones incluyen tabletas que cumplen con un requisito de totalidad de la disolución, productos que con-
tienen fármacos radiomarcados o productos que contienen un fármaco soluble y que demuestran una desintegración rápida
(10-15 minutos). La prueba de disolución se debe llevar a cabo en un equipo que cumpla con los requisitos de Disolución
(711) y al cual se le haya realizado una prueba de verificación del desempeño cuando exista una disponible. En su sitio Web, la
USP ofrece guías para optimizar el desempeño del instrumento de disolución mediante calibración mecánica y pruebas de veri-
ficación del desempeño ( https://www.usp.org/sites/default/files/usp/document/our-work/chemical-medicines/disso1ution-
too1kit-version2.pdf).
La prueba de disolución in vitro por lo general intenta reproducir la disolución in vivo, aunque no es posible seleccionar a
priori dichas condiciones in vitro de manera confiable. Se deben evaluar una variedad de condiciones de prueba de disolución
in vitro (p. ej., medios de disolución a diferentes valores de pH, agentes tensoactivos y velocidades de rotación del aparato). El
conocimiento de las propiedades del fármaco, de la formulación del producto, la fisiología gastrointestinal, la disolución in vi-
tro y la farmacocinética in vivo ayudará durante la selección de las condiciones y especificaciones de la prueba de disolución in
vitro.
Para productos que contienen más de un solo ingrediente activo, la disolución generalmente debe determinarse para cada
ingrediente activo. Cuando se agrega una prueba de disolución a una monografía existente, la prueba de desintegración se
elimina, pero en el caso de preparaciones sublinguales y de tabletas de desintegración oral, la desintegración, aunada a la diso-
lución, puede ser un atributo crítico de calidad. En tales casos, se puede incluir una o ambas pruebas en la monografía.
Cuando no es posible establecer un solo conjunto de especificaciones para productos de orígenes múltiples en las monogra-
fías, se permiten múltiples pruebas de disolución, y el etiquetado debe indicar la prueba de disolución apropiada para el pro-
ducto específico.
El capítulo Procedimientode Disolución:Desarrolloy Validación(1 092) proporciona información detallada sobre el desarrollo y
validación del método.
FORMAS FARMACÉUTICASDE LIBERACIÓNINMEDIATA
Para formas farmacéuticas de liberación inmediata, el proceso de disolución in vitro generalmente no toma más de 60 minu-
tos y, en la mayoría de los casos, una sola especificación de tiempo de muestreo es adecuada para los propósitos Farmacopei-
7794 (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro / Información General USP42
cos. Para asegurar los tiempos de desintegración típicos, los tiempos de prueba menores a 30 minutos se deben basar en una
necesidad demostrada.
FORMASFARMACÉUTICAS
DE LIBERACIÓN
PROLONGADA
Para los productos de liberación prolongada, la velocidad de disolución in vivo por lo general es la limitante que resulta en
una absorción prolongada del fármaco y, por ende, facilita la identificación de condiciones in vitro que pudieran predecir la
disolución in vivo. Por lo tanto, se requieren múltiples tiempos de muestreo para definir un perfil de disolución para una forma
farmacéutica de liberación modificada.
La elección del aparato se debe basar en el conocimiento de la formulación y el desempeño real de la forma farmacéutica en
el sistema de prueba in vitre. ElAparato 1 (canastilla) o el Aparato 2 (paleta) pueden ser más útiles a velocidades de rotación
más altas (p. ej., la paleta a 100 rpm). ElAparato 3 (cilindro oscilante) ha demostrado ser especialmente útil para formas farma-
céuticas de liberación modificada tipo perlas. ElAparato 4 (celda de flujo) puede ofrecer ventajas para las formas farmacéuticas
de liberación modificada que contienen ingredientes activos con una solubilidad limitada. ElAparato 7 (disco oscilante) se pue-
de aplicar para formas farmacéuticas orales de liberación modificada que no se desintegran, al igual que para formas farma-
céuticas transdérmicas. El Aparato 5 (paleta sobre disco) y el Aparato 6 (cilindro) también son útiles para evaluar y analizar for-
mas farmacéuticas transdérmicas.
Para los propósitos Farmacopéicos, se seleccionan por lo menos tres tiempos de muestreo para caracterizar el perfil de libe-
ración de fármaco in vitre de una forma farmacéutica de liberación prolongada. Pueden ser necesarios tiempos de muestreo
adicionales para la aprobación del fármaco. Se selecciona un tiempo de muestreo inicial, habitualmente 1-2 horas, para de-
mostrar que no se produce una liberación masiva, un tiempo de muestreo intermedio para definir el perfil de liberación in vitro
de la forma farmacéutica y un tiempo final para demostrar la liberación completa del fármaco.
EVALUACIÓN
IN VIVO DE FORMASFARMACÉUTICAS
Al evaluar el desempeño de un producto farmacéutico, los analistas deben preguntarse fundamentalmente qué tipo de estu-
dio deben llevar a cabo para proveer una garantía razonable de la BEde un producto comercializado con respecto al producto
del ensayo clínico de seguridad y eficacia demostradas. Aunque los estudios de disolución in vitre proveen información impor-
tante con respecto a las características de liberación del fármaco a partir de la forma farmacéutica, en la actualidad se usan
principalmente para establecer o sustentar las especificaciones para productos farmacéuticos (p. ej., vida útil) y controles de
proceso de fabricación (p. ej., aumento de escala o cambios posteriores a la aprobación). Normalmente, la mejor manera de
demostrar la BEes mediante la evaluación in vivo, aunque en ocasiones se puede reemplazar con estudios in vitro. 1 La mejor
forma de evaluar la BEde formas farmacéuticas de liberación modificada es observando los comportamientos farmacocinético
y/o farmacodinámico del fármaco in vivo mediante estudios clínicos bien diseñados. Las agencias reglamentarias proporcionan
múltiples guías para la realización de dichos estudios. Además, cuando existe una relación predecible y bien definida entre las
concentraciones plasmáticas del fármaco o sus metabolitos activos y la respuesta clínica (terapéutica y adversa), se pueden usar
únicamente los datos de la concentración plasmática del fármaco como fundamento para la aprobación de una forma farma-
céutica de liberación modificada diseñada para sustituir una forma farmacéutica de liberación inmediata.
Aunque a menudo se emplean estudios farmacocinéticos en humanos para evaluar la BEde formas farmacéuticas orales sóli-
das de liberación inmediata, en ocasiones, se pueden usar estudios in vitro para realizar dicha evaluación. La ventaja principal
de los estudios in vitro es que reducen los costos de desarrollo. Por ejemplo, se prefiere una prueba in vitro cuando se analizan
fármacos Clase I del BCS con disolución rápida. Algunas agencias reglamentarias permiten este tipo de análisis en lugar de la
prueba in vivo.
Las siguientes discusiones sirven de guía para la evaluación de un fármaco y el diseño, ejecución y evaluación de estudios
que comprendan formas farmacéuticas. Aunque estas pautas se concentran en sistemas de liberación de fármacos de adminis-
tración oral, los mismos principios pueden aplicarse a otras vías de administración de fármacos (p. ej., transdérmica, subcutá-
nea, intramuscular, etc.).
CARACTERIZACIÓN
DE UN FÁRMACO
Sistemade Clasificaciónde Biofarmacéuticos
La FDAemitió una guía titulada "Waiver of In Vivo Bioavailabilityand Bioequivalence Studies for lmmediate-release Salid
Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System" (www.fda.gov/down1oads/Drugs/GuidanceComplian-
ceRegulatorylnformation/Guidances/UCM070246.pdf) (Exención de Estudios de Biodisponibilidad y Bioequivalencia In Vivo
para Formas Farmacéuticas Orales Sólidas de Liberación Inmediata Basada en un Sistema de Clasificación de Biofarmacéuticos,
disponible solo en inglés). Una suposición clave en el enfoque es que la liberación y disolución del fármaco son lo suficiente-
mente rápidas, por lo que no es posible ni útil determinar una correlación in vitro-in vivo. Cuando corresponde, el Sistema de
1 Título 21 del CFR 320.22 Criteria for waiver

of evidence of in vivo bioavailability or bioequivalence. (Criterios para exención de evidencias de biodisponibilidad o
bioequivalenciain vivo).
USP42 InformaciónGeneral/ (1088) EvaluaciónIn Vivo e In Vitro 7795
Bioclasificación de Biofarmacéuticos permite obtener datos de la velocidad de disolución en lugar de los estudios de BD o BE
para la aprobación del producto.
Propiedades Farmacocinéticas
Se recomienda caracterizar cuidadosamente el perfil de absorción del fármaco activo a partir de una formulación que tiene
una 8D rápida (solución intravenosa, solución oral o producto farmacéutico de liberación inmediata bien caracterizado). A su
vez, esta información sirve como referencia para evaluar el perfil de absorción de la forma farmacéutica de liberación modifica-
da. Dicha información, junto con la farmacocinética del fármaco activo, puede caracterizar la absorción del fármaco y predecir
cambios en la 8D del fármaco cuando se modifica la entrada, como en las formas farmacéuticas de liberación modificada. Por
ejemplo, si el fármaco activo presenta metabolización hepática de primer paso saturable, podría producirse una reducción en
la disponibilidad sistémica después de la administración oral si disminuye la velocidad de entrada.
Al diseñar una forma farmacéutica de liberación modificada, puede resultar útil para los analistas determinar la absorción del
fármaco activo en diversos segmentos del tracto gastrointestinal (particularmente en la parte inferior del tracto gastrointestinal
(colon) para formas farmacéuticas que pueden liberar el fármaco en esa zona). Los efectos de los alimentos también pueden
ser importantes y deben investigarse.
Eliminación del Fármaco
La información necesaria para caracterizar la eliminación del fármaco puede incluir lo siguiente.
1. Parámetros de eliminación-depuración, área bajo la curva (ABC)de concentración plasmática-tiempo, concentración
plasmática máxima (Cmá.),tiempo hasta la concentración plasmática máxima (Tmá,),volumen de distribución, vida media,
tiempo de residencia medio o parámetros dependientes del modelo.
2. Linealidad o caracterización de falta de linealidad en el intervalo de concentración o de dosis que se podrían encontrar.
3. Acumulación de fármaco/metabolito
4. Perfil metabólico y ruta de excresión, prestando especial atención a los metabolitos activos y enantiómeros activos de
mezclas racémicas.
S. Circulación enterohepática.
6. Parámetros de unión proteica y efectos de diálisis.
7. Los efectos de la edad, sexo, raza y condiciones patológicas relevantes.
8. Plasma: relaciones sanguíneas.
9. Un índice terapéutico estrecho o una respuesta clínica que varía significativamente en función de la hora del día (cronofar-
macocinética).
Propiedades Farmacodinámicas
Antes de desarrollar una forma farmacéutica, se debe obtener las relaciones de concentración-respuesta en un intervalo de
dosis lo suficientemente amplio que abarque las respuestas terapéuticas y adversas importantes. Además, se deben evaluar las
características del tiempo de equilibrio2 entre las concentraciones plasmáticas y el efecto. Para productos de liberación modifi-
cada que por lo regular tienen dosis de fármaco mayores, estas relaciones de concentración-respuesta deben estar suficiente-
mente caracterizadas a fin de poder predecir razonablemente el margen de seguridad si se produjera la liberación masiva de la
dosis. Si existe una relación bien definida entre la concentración plasmática del fármaco activo o los metabolitos activos y la
respuesta clínica (terapéutica y adversa), la eficacia clínica de una nueva forma farmacéutica de liberación modificada se podría
caracterizar mediante los datos de concentración plasmática-tiempo. Si no se dispone de dichos datos, se deben llevar a cabo
ensayos clínicos de la forma farmacéutica de liberación modificada conjuntamente con determinaciones farmacocinéticas y far-
macodinámicas.
CARACTERIZACIÓN
DE LA FORMAFARMACÉUTICA
Propiedades Farmacocinéticas: Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata
Los tipos de estudios farmacocinéticos que se deben llevar a cabo dependen del conocimiento que se tenga del fármaco
activo, sus propiedades farmacocinéticas y su Clase en el BCS. Por ejemplo, una nueva entidad química requiere de una mayor
2
El tiempo de equilibrio es una medida de la discontinuidad dependiente del tiempo entre las concentraciones plasmáticas medidas y los efectos medidos. La
discontinuidadse caracterizamásfrecuentementepor el gradode histéresisobservadocuandola gráficade concentración-efecto
para concentracionescrecientes
se comparacon la de concentraciones decrecientes.Cuandoel tiempo de equilibrioes muy corto (esdecir, equilibriorápidosinque se generenmetabolitosacti-
vos), habrá poca o ningunahistéresis.Estosignificaque, se observaráel mismoefectopara una concentracióndeterminadaindependientedel intervaloentre el
momento de la dosificacióny el momento en el que se realizanlas mediciones.
caracterización farmacocinética que la necesaria para una formulación ya aprobada por la FDApara la que se presenta una
solicitud de cambios posteriores a la aprobación (SUPAC)por motivo de un aumento de escala.
Dicha evaluación se presenta cuando un producto farmacéutico aprobado por la FDAexperimenta cambios en su fabrica-
ción después de que ha sido aprobado. Dichos cambios son comunes y se pueden deber a la expansión del tamaño de los
lotes fabricados, a nuevos sitios de fabricación o a la introducción de nuevas tecnologías. Las pruebas de disolución in vitro y/o
pruebas de BEin vivo necesarias se encuentran descritas en el documento de la FDA"Guidance for lndustry: lmmediate-release
Solid Oral Dosage Forms: Scale-up and Postapproval Changes: Chemistry, Manufacturing, and Controls, In Vitro Dissolution
Testing, and In Vivo Bioequivalence Documentation" (Guía para la Industria: Formas Farmacéuticas Sólidas Orales de Libera-
ción Inmediata: Aumento de Escala y Cambios Posteriores a la Aprobación: Documentación de Procesos Químicos, Fabricación
y Controles, Pruebas de Disolución In Vitro y Bioequivalencia In Vivo) (www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceCompliance-
Regulatorylnformation/Guidances/UCM070636.pdf).
Se aplican requisitos similares a un equivalente genérico de una forma farmacéutica de liberación inmediata aprobada que
debe ser bioequivalente al fármaco innovador, conocido como el fármaco listado de referencia. Los dos métodos de uso más
frecuente para cumplir con los requisitos de bioequivalencia son los estudios farmacocinéticos in vivo y los estudios in vitro
basados en el BCS.
Propiedades Farmacocinéticas: Formas Farmacéuticas de Liberación Modificada
Al igual que los enfoques para formas farmacéuticas de liberación inmediata, los tipos de estudios farmacocinéticos que se
deben llevar a cabo para formas farmacéuticas de liberación modificada dependen del conocimiento que se tenga del fármaco
activo, sus propiedades farmacocinéticas y si los estudios farmacocinéticos pretenden ser el único fundamento para la aproba-
ción del producto. Se requieren como mínimo dos estudios para caracterizar el producto cuando no existe un produco farma-
céutico de liberación modificada de referencia: (1) un estudio cruzado monodosis para cada concentración de una forma far-
macéutica de liberación modificada; y (2) un estudio de estado estacionario, multidosis que utilice la concentración más alta
de una forma farmacéutica de liberación modificada. Asimismo, se requiere un estudio de los efectos de los alimentos para
evaluar el potencial de liberación masiva de las formas farmacéticas de liberación prolongada como estudio separado o inclui-
do como extensión de un estudio cruzado. Para demostrar la intercambiabilidad, será suficiente un estudio cruzado monodosis
en condiciones de ayuno contra el producto de referencia. En algunos casos, se requiere un estudio de los efectos de los ali-
mentos cuando se ha demostrado algún efecto de los alimentos sobre la BD en el producto de referencia. A continuación se
describen algunos estudios cruzados monodosis y de estado estacionario multidosis.
Resultan posibles productos de referencia para formas farmacéuticas de liberación modificada, soluciones intravenosas, solu-
ciones orales o productos farmacéuticos de liberación inmediata bien caracterizados, a fin de evaluar una formulación de libe-
ración modificada. Por ejemplo, si el fármaco activo presenta metabolización hepática de primer paso saturable del intestino
delgado, podría producirse una reducción en la disponibilidad sistémica después de la administración oral si disminuye la velo-
cidad de entrada. Se podría observar un incremento de la disponibilidad sistémica si un fármaco es absorbido desde el colon a
partir de una forma farmacéutica de liberación retardada que apunta al colon, evitando así un efecto de primer paso.
En algunas formas farmacéuticas de liberación modificada en cápsulas, la diferencia entre las concentraciones depende sola-
mente de la cantidad de material idéntico en forma de gránulos en cada cápsula. En este caso, son suficientes estudios de
estado estacionario monodosis y multidosis con la concentración de la dosificación más alta. Se pueden caracterizar otras con-
centraciones a partir de datos comparativos obtenidos de la disolución in vitro.
Los estudios farmacocinéticos descritos a continuación serán necesarios para la mayoría de las formas farmacéuticas de libe-
ración modificada. Estos estudios pueden ser la base de la caracterización de la forma farmacéutica. Si se busca la aprobación
reglamentaria sin realizar ensayos clínicos, los fabricantes deben consultar con las autoridades reglamentarias para garantizar
que exista una base de datos adecuada para la aprobación. Los tipos de estudios farmacocinéticos que se llevan a cabo, por lo
general, se pueden categorizar según se indica a continuación:
CASO A
El Caso A corresponde a una forma farmacéutica oral de liberación modificada original de un fármaco ya comercializado co-
mo forma farmacéutica de liberación inmediata y para el cual existen amplios datos farmacocinéticos y farmacodinámicos.
Estudio cruzado monodosis: Un estudio cruzado monodosis debe comprender los siguientes tratamientos: la forma farma-
céutica de liberación modificada administrada en ayunas; una forma farmacéutica rápidamente disponible administrada en
ayunas; y la forma farmacéutica de liberación modificada administrada inmediatamente después de una comida con alto con-
tenido graso. El estudio de los efectos de los alimentos debe controlar la ingestión de fluidos a temperatura ambiente (p. ej.,
6-8 oz.) al momento de la administración del fármaco. La forma farmacéutica se debe administrar dentro de los 5 minutos
posteriores al término de la ingestión de la comida. Idealmente, todos los sujetos deben consumir la comida en aproximada-
mente 15 minutos. Si no se encuentran diferencias significativas en la velocidad o grado de biodisponibilidad (ABC, Cmáxy Tmáx)
en función del alimento ingerido, entonces no serán necesarios estudios adicionales de los efectos de los alimentos. Si se en-
cuentran diferencias significativas en la biodisponibilidad, los investigadores deberán definir cómo los alimentos afectan la for-
ma farmacéutica de liberación modificada, 3 y el efecto de los alimentos sobre el fármaco en función del tiempo.
Usar las siguientes guías para evaluar los efectos de los alimentos.
1. Si ningún estudio bien controlado ha definido previamente los efectos de una comida con alto contenido graso sobre una
forma farmacéutica de liberación inmediata, se deben llevar a cabo estudios para determinar si el efecto de los alimentos
podría ocasionar problemas con la forma farmacéutica. Se debe cuestionar si la liberación de la forma farmacéutica pre-
senta cambios relacionados con los alimentos o si hay influencias de los alimentos no relacionados con la forma farmacéu-
tica, p. ej., cambios en la absorción del fármaco en el tracto gastrointestinal o cambios en la eliminación del fármaco que
son independientes de la absorción. La causa del efecto del alimento se debe determinar mediante un estudio cruzado
monodosis que compare la solución (o forma farmacéutica de liberación inmediata) en condiciones de ayuno y de ali-
mentación. Si el alimento no produce ningún efecto, se concluye que existen problemas con la forma farmacéutica. Si el
alimento produce un efecto, se concluye que dicho efecto no está vinculado a la forma farmacéutica.
2. La influencia que tiene el tiempo sobre el efecto del alimento se deben analizar mediante un estudio cruzado de cuatro
vías en el que la forma farmacéutica de liberación modificada se administra según las siguientes condiciones de tratamien-
to: en ayunas, con una comida con alto contenido graso, 1 hora antes de una comida con alto contenido graso y 2 horas
después de una comida con alto contenido graso.
3. Si se determina que el efecto del alimento sobre una forma farmacéutica de liberación inmediata se debe a cambios en la
absorción del fármaco disuelto en el tubo digestivo o a cambios en la eliminación del fármaco, los estudios deben definir
la relación apropiada entre la dosificación del fármaco y las comidas.
4. Se pueden llevar a cabo estudios alternativos adecuados si el solicitante declara en la etiqueta del fármaco que se debe
administrar con una comida sin grasas. En este caso, se debe considerar un cambio en la composición de las comidas.
5. Los analistas deben monitorear todo el perfil de absorción de una monodosis de liberación modificada. Cuando corres-
ponda (p. ej., en un estudio multidosis), en el caso de fármacos y sistemas de liberación de fármacos específicos, el segun-
do día se deben extraer muestras de sangre, después del desayuno y antes de administrar la segunda dosis. Este progama
de muestreo es particularmente importante para productos que se administran una vez al día.
6. En el caso de formas farmacéuticas de liberación retardada (con recubrimiento entérico), los analistas deben realizar estu-
dios de biodisponibilidad para caracterizar los efectos de los alimentos y sustentar la dosificación indicada en el etiqueta-
do.
Estos estudios tienen un doble propósito: primero, determinar si es necesario incluir en el etiquetado instrucciones que des-
criban condiciones especiales de administración con respecto a las comidas y, segundo, proporcionar información respecto del
patrón de absorción de la forma farmacéutica de liberación modificada comparándolo con el de la forma farmacéutica de libe-
ración inmediata. Se debe definir la función de entrada del fármaco para formas farmacéuticas de liberación modificada. Esto
servirá de ayuda para desarrollar una prueba de disolución in vitro apropiada. En el caso de formas farmacéuticas que presen-
ten gran variabilidad, se recomienda un diseño de estudios repetidos.
Estudios multidosis de estado estacionario
Estudio/-Cuando hay datos que demuestren una farmacocinética lineal para una forma farmacéutica de liberación inmediata,
se debe llevar a cabo un estudio de estado estacionario con la forma farmacéutica de liberación modificada a una dosificación
determinada (preferentemente en el extremo superior del régimen de dosificación habitual) utilizando como control una dosis
total diaria comparable de una forma farmacéutica de liberación inmediata. Se deben realizar al menos tres determinaciones
de la concentración plasmática mínima del fármaco (Cm;n)a la misma hora del día para demostrar que se lograron las condicio-
nes de estado estacionario. En cada fase del estudio cruzado se deben efectuar determinaciones de concentración plasmática
del fármaco, en al menos un intervalo de dosificación de la forma farmacéutica de liberación modificada. Puede ser preferible
(como en el caso de variación rítmica de absorción o eliminación del fármaco) determinar concentraciones durante un día en-
tero en cada fase. Se debe verificar la presencia o ausencia de variación circadiana. La forma farmacéutica de liberación modifi-
cada debe producir un ABC que sea equivalente al de la forma farmacéutica de liberación inmediata si el grado de absorción
de la forma farmacéutica de liberación modificada es comparable a la dosis de liberación inmediata. El grado de fluctuación
del producto de liberación modificada debe ser el mismo, o menor, que el de la forma farmacéutica de liberación inmediata
dada por el régimen aprobado. Las mediciones apropiadas de la concentración deben incluir los metabolitos principales y el
fármaco intacto. En el caso de fármacos racémicos, los analistas deben considerar la determinación de los enantimeros activos.
Estudio//-Cuando no hay comparaciones de las propiedades farmacocinéticas de una forma farmacéutica de liberación inme-
diata en dosis diferentes, o cuando los datos demuestran una falta de linealidad, se deben llevar a cabo estudios cruzados de
estado estacionario que comparen los efectos de la forma farmacéutica de liberación modificada con los de la forma farmacéu-
tica de liberación inmediata a dos dosificaciones diferentes: una en el extremo inferior del intervalo de dosificación recomenda-
do y la segunda en el extremo superior del intervalo de dosificación. En cada caso, la forma farmacéutica de liberación modifi-
cada debe cumplir los criterios descritos en el Estudio/ con respecto al ABCy a las fluctuaciones en las concentraciones plasmá-
ticas de fármaco. Si existieran diferencias importantes entre la forma farmacéutica de liberación modificada y la forma farma-
céutica de liberación inmediata tanto en el intervalo de dosificación bajo como alto, estos datos por sí solos no son adecuados
para caracterizar al producto. Los datos pueden ser engañosos, si se obtienen de sujetos con características fisiológicas o de
eliminación de fármaco atípicas, con relación a la población diana. Por lo tanto, la selección de sujetos debe efectuarse a partir
3
Wagner-Nelson, Loo-Riegelman y otros métodos de deconvolución están disponibles en la literatura sobre productos biofarmacéuticos.
7798 (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro / InformaciónGeneral USP42
de una población blanco adecuada con una designación aleatoria de la forma farmacéutica. Si la forma farmacéutica de libera-
ción modificada se va a usar en una subpoblacion específica (p. ej., en niños), se debe analizar en esa población. Independien-
temente de si un fármaco presenta farmacocinética lineal o no lineal, la base para la caracterización es la equivalencia del ABC
y del grado relativo de fluctuación de las concentraciones de las formas farmacéuticas de liberación modificada y de liberación
inmediata.
Además pueden ser necesarios estudios de estado estacionario en poblaciones de pacientes seleccionados o estudios sobre
interacción de fármacos, dependiendo del uso terapéutico del fármaco y de los tipos de individuos a los que se recomendará el
uso de la forma farmacéutica de liberación modificada. En el caso de fármacos que presentan índices terapéuticos limitados,
puede ser necesario llevar a cabo mediciones más amplias de la concentración plasmática para determinar la posibilidad de
patrones anómalos de liberación del fármaco en ciertas subpoblaciones. En tales estudios, los investigadores deben realizar
más de una medición del ABC por paciente para evaluar la variabilidad tanto de las formas farmacéuticas de liberación modifi-
cada como de las de liberación inmediata.
CASO B
El Caso B corresponde a una forma farmacéutica de liberación modificada, no oral, de un fármaco activo ya comercializado
del que existen amplios datos farmacodinámicos y farmacocinéticos.
Losestudiosdel CasoA (omitiendo los estudios del efecto de los alimentos) son adecuados para evaluar una forma farmacéu-
tica de liberación modificada diseñada para administrar por vía no oral si el patrón de biotransformación a metabolitos activos
es idéntico para las dos vías. Si los patrones de biotransformación son diferentes, entonces deben llevarse a cabo estudios de
eficacia clínica con la forma farmacéutica de liberación modificada. Además, pueden ser necesarios estudios especiales para
evaluar factores de riesgo específicos relacionados con la forma farmacéutica (p. ej., irritación o sensibilización de la zona de
aplicación de un sistema de administración transdérmica de fármaco).
CASO C
El Caso C se aplica a un equivalente genérico de una forma farmacéutica de liberación modificada aprobada, que debe ser
biológicamente equivalente al fármaco de referencia en lo que respecta a su velocidad y grado de exposición (es decir, ABC,
Cmá"'Cm;"'y grado de fluctuación) en estudios cruzados monodosis. En el caso de una forma farmacéutica oral de liberación
modificada, también se deben llevar a cabo los estudios con alimentos descritos en el CasoA.
CASO D
El Caso D se aplica a un producto aprobado por la FDAque se ha sometido a una evaluación de aumento en escala y de
cambios posteriores a la aprobación (SUPAC).La guía de la FDA, SUPAC-MR: ModifiedReleaseSo/idOralDosageForms;Sca/e-Up
and PostapprovalChanges:Chemistry,Manufacturing,and Controls,In VitroDissolutionTesting,and In VivoBioequivalence
Docu-
mentation (www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM070640.pdf) describe
las pruebas de disolución in vitro y/o pruebas de bioequivalencia in vivo necesarias.
AnálisisEstadísticode BioequivalenciaIn Vivo
Se debe seleccionar un método estadístico apropiado. 0/er •Evaluacióndel Desempeñoe lntercambiabilidad

de Medicamentos
SólidosOrales-• (AFOl-may-zoi 9¡Biodisponibilidad,
Bioequivalencia
y Disolución(1090)).
CORRELACIONES
IN VIVO-INVITRO
El término correlación in vivo-in vitro (CIVIV)apareció por primera vez en la literatura farmacéutica al conocerse la impor-
tancia de los conceptos de biodisponibilidad y las determinaciones de la velocidad de disolución in vitro. El término CIVIVse
refiere al establecimiento de una relación racional entre una propiedad biológica, o un parámetro derivado de concentraciones
plasmáticas del fármaco producidas por una forma farmacéutica y una característica o propiedad fisicoquímica de la misma
forma farmacéutica. Las propiedades biológicas que se usan más frecuentemente son uno o más parámetros farmacocinéticos,
tal como Cmáxo ABC, obtenidos después de administrar la forma farmacéutica. La propiedad fisicoquímica que se usa con ma-
yor frecuencia es el comportamiento de la forma farmacéutica durante la disolución in vitro (p. ej., porcentaje de fármaco libe-
rado bajo un conjunto determinado de condiciones). La relación cuantitativa entre las dos propiedades, biológica y fisicoquí-
mica, es una CIVIV.El uso más importante de un CIVIVes en relación con la predictibilidad. En muchos casos, la concentración
plasmática de fármaco real se puede predecir a partir de datos de disolución in vitro.
Históricamente, el análisis de la CIVIVha tenido mayor éxito para formas farmacéuticas de liberación prolongada que para
las de liberación inmediata. Esta diferencia problablemente refleja la aplicación de técnicas e interpretaciones de análisis de
datos específicos que requieren una velocidad de disolución-absorción de fármaco limitada. Sin embargo, algunas correlacio-
USP42 Información General/ (1088) Evaluación In Vivo e In Vitro 7799
nes con formas farmacéuticas de liberación inmediata han sido demostradas usando métodos que se basan en la presente y
amplísima disponibilidad de computadoras y de softwarede regresión no lineal, junto con nuevos métodos de correlación.
ConsideracionesGenerales
Con la proliferación de formas farmacéuticas de liberación modificada, se ha vuelto necesario examinar con mayor detalle el
CIVIV.A diferencia de las formas farmacéuticas de liberación inmediata, las formas farmacéuticas de liberación modificada, par-
ticularmente las formas farmacéuticas de liberación prolongada, no se pueden caracterizar mediante una prueba de disolución
con un solo tiempo de muestreo. Estas formas farmacéuticas están diseñadas para liberar fármaco de tal modo que el paciente
presente un perfil de nivel plasmático específico durante un período prolongado, por lo regular 12-24 horas. Los analistas re-
quieren de métodos in vitro para garantizar que cada partida del producto se comportará de manera idéntica in vivo. Un CIVIV
satisface este requisito. Inicialmente se pensó que desarrollar una correlación significativa para las formas farmacéuticas de libe-
ración inmediata sería una tarea más fácil que para los productos de liberación prolongada. Sin embargo, debido a la naturale-
za de los principios sobre los que se basa cada tipo, los analistas actualmente consideran que se puede conseguir un CIVIVcon
mayor facilidad para las formas farmacéuticas de liberación modificada.
Se espera que todos las formas farmacéuticas de liberación prolongada tengan una velocidad de disolución limitada. Para
estos productos, la formulación contribuye de manera significativa a la prolongación de la liberación del fármaco a partir de la
forma farmacéutica. Debido al impacto de la formulación sobre la BD de una forma farmacéutica de liberación prolongada, se
han hecho numerosos intentos de correlacionar uno o más parámetros farmacocinéticos determinados a partir de estudios in
vivo con la cantidad liberada en un tiempo determinado durante una prueba de disolución in vitro. Las correlaciones pueden
indicar que aumentar o disminuir la velocidad de disolución in vitro de la forma farmacéutica de liberación modificada genera-
ría un cambio de dirección correspondiente en el comportamiento del producto. Sin embargo, tales correlaciones puntuales
revelan muy poco sobre la curva general de nivel plasmático, la cual representa un factor primordial para el comportamiento
del fármaco en el paciente. En su lugar, se prefieren los métodos de correlación que utilizan todos los datos de concentración
plasmática del fármaco y todos los dados de disolución in vitro. Se encuentran disponibles tres procedimientos de correlación
que usan todos los datos de disolución y plasmáticos, junto con análisis de momento estadístico. Cada procedimiento presenta
diferencias importantes en la calidad de la correlación. Estos métodos se analizan según las ventajas de cada uno, junto con su
posible utilidad como herramienta de predicción para el científico farmacéutico.
Niveles de Correlación
Se han definido y categorizado tres niveles de correlación, en orden descendente de calidad. El concepto de nivel de correla-
ción se basa en la capacidad de la correlación de reflejar la totalidad de la curva de concentración plasmática de fármaco-
tiempo que resulta de la administración de una forma farmacéutica dada. La relación entre la curva de disolución in vitro total
y el perfil concentración plasmática-tiempo total define la fuerza de la correlación y, por lo tanto, la predictibilidad.
NIVELA
Este nivel representa la categoría más alta de correlación. Representa una relación punto a punto entre la disolución in vitro
y la velocidad de entrada in vivo (velocidad de absorción del fármaco a partir de la forma farmacéutica). Para una correlación
de Nivel A, se compara la curva de disolución in vitro de un producto con la curva de entrada in vivo, es decir, la curva produ-
cida por deconvolución del perfil plasmático. La deconvolución se puede lograr mediante técnicas de balance de masas de-
pendientes del modelo, como el procedimiento de Wagner-Nelson o el método de Loo-Riegelman, o por deconvolución ma-
temática independiente del modelo. En una correlación ideal, las curvas de disolución in vitro y de velocidad de absorción in
vivo son directamente superponibles o se pueden superponer mediante el uso de un valor constante para ajustar la escala de
tiempo. Las ecuaciones que describen cada curva son las mismas. Este procedimiento a menudo se encuentra con sistemas de
dosificación de liberación modificada que demuestran una velocidad de liberación in vitro esencialmente independiente de los
medios de disolución y de las velocidades de mezclado usados en un aparato de disolución. La superposición no es un requisi-
to absoluto para una correlación de Nivel A. Si las curvas de disolución y absorción son diferentes y se puede desarrollar una
relación matemática para relacionarlas a ambas, el perfil de nivel plasmático aún se puede predecir a partir de los datos de
disolución in vitro. Esta relación no solo es fidedigna para una sola velocidad de entrada, sino también para todo el intervalo
de disolución de control de calidad para el producto. Asimismo, cuando la velocidad de disolución depende de la velocidad de
mezclado, las dos curvas se pueden se pueden volver superponibles al aumentar o reducir la velocidad de mezclado in vitro u
otra alteración del método de disolucion.
Las ventajas de una correlación de Nivel A son las siguientes.
1 . Desarrolla una correlación de punto a punto. Esto no se consigue con ningún otro nivel de correlación. Se desarrolla utili-
zando todos los puntos de nivel plasmático y del perfil de disolución recabados en distintos intervalos, por lo que refleja
toda la curva de nivel plasmático. Así, en el caso de una correlación de Nivel A, una curva de disolución in vitro puede
servir como sustituto del comportamiento in vivo. Un cambio en el sitio de fabricación, método de elaboración, suminis-
tro de materias primas, modificación menor en la formulación e incluso en la concentración del producto con la misma
formulación, se pueden justificar sin necesidad de realizar otros estudios de BD-BA.4,5
2. Se define para la forma farmacéutica un procedimiento verdaderamente valioso de control de calidad que indica el de-
sempeño en vivo y que permite predecir el desempeño de una forma farmacéutica,
3. Los extremos de los estándares de control de calidad in vitre se pueden justificar mediante convolusión (simulando el per-
fil de nivel plasmático a partir de la curva de disolución) o mediante desconvolusión (usando los límites superior e inferior
del intervalo de confianza),
NIVELB
Esta correlación utiliza los principios del análisis de momento estadístico, La media del tiempo de disolución in vitre se com-
para con la media del tiempo de residencia o con la media del tiempo de disolución in vivo. Al igual que con la correlación de
Nivel A, el Nivel B emplea todos los datos in vitro e in vivo, pero no se considera una correlación de punto a punto. No se
correlacionan los perfiles plasmáticos reales in vivo sino un parámetro que resulta del análisis del momento estadístico de un
componente del perfil plasmático tal corno el tiempo de residencia medio, Debido a que un número de perfiles plasmáticos
diferentes pueden producir valores de tiempo de residencia medio similares, no es posible basarse únicamente en una correla-
ción de Nivel B para predecir un perfil plasmático a partir de datos de disolución in vitro. Además, no se pueden usar datos in
vitro de dicha correlación para justificar los valores en los límites de las normas de control de calidad.
NIVELC
Esta categoría relaciona un punto de muestreo de la disolución (t50%, t90 %, etc) con un parámetro farrnacocinético tal corno
ABC, Cmáx, o Tmálc Representa una correlación de un solo punto y no refleja la forma completa del perfil plasmático, que es el
factor que mejor define el desempeño de productos de liberación modificada. Debido a que este tipo de correlación no puede
predecir el comportamiento real del producto in vivo, generalmente se usa solo corno una guía para el desarrollo de formula-
ciones o corno procedimiento de control de calidad de la producción. En razón de sus limitaciones evidentes, una correlación
de Nivel C tiene una utilidad limitada para predecir el desempeño de fármacos in vivo y se deben tornar las mismas precaucio-
nes que en una correlación de Nivel Ben cuanto a su capacidad para respaldar modificaciones en el producto y en el sitio de
fabricación, al igual que justificar los valores en los límites de las normas de control de calidad, La Guía de la FDA"Extended-
Release Solid Oral Dosage Forms-Developrnent, Evaluation, and Application of In Vitre/In Vivo Correlations"
(www,fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceCornplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM070239.pdf) establece que los
fabricantes pueden obtener bioexenciones (biowaivers) basadas en múltiples correlaciones de Nivel C. La guía presenta la for-
ma en que los fabricantes pueden lograr esta correlación. Asimismo, la FDAindica que cuando es posible lograr tal correlación,
también es factible el desarrollo de una correlación de Nivel A.
DESARROLLO
DE UNA CORRELACIÓN
Este capítulo no define los únicos procedimientos posibles para desarrollar una CIVIV,y cualquier enfoque bien diseñado y
científicamente válido es aceptable. Para ayudar al científico farmacéutico, a continuación se describe un procedimiento posi-
ble para desarrollar una correlación de Nivel A:
1. Para llevar a cabo de manera adecuada una deconvolución, los analistas deben estar familiarizados con la farrnacocinética
del fármaco en sí e incorporado en una forma farmacéutica de liberación modificada. Por ejemplo, si se sabe que un fár-
maco se absorbe por completo pero demuestra cinéticas de primer paso saturables, es mejor asumir una biodisponibili-
dad del 100% para propósitos del cálculo de la velocidad de absorción, Esto se basa en el hecho de que el fármaco se
absorbe completamente, pero debido al metabolismo hepático, se observa una cantidad menor que si el fármaco se hu-
biese administrado como bolo de liberación inmediata, Si se utiliza el grado de absorción relativo a una forma farmacéuti-
ca de liberación inmediata o en solución, el perfil de entrada no se sobrepondrá con el que se calculó asumiendo una
absorción del 100%. No obstante, será muy posible establecer las correlaciones de punto a punto.
2. Los diferentes perfiles de disolución de una formulación se deben obtener tal como se ilustra en la Figura1, La formula-
ción se debe modificar solo lo suficiente para producir perfiles distintos de disolución de modo que la formulación tenga
los mismos excipientes en todos los lotes que se van a analizar. Las modificaciones a la formulación usadas en estas parti-
das se deben basar en factores que se esperaría que tuvieran alguna influencia sobre la velocidad de liberación modificada
del producto y que podrían ocurrir durante la fabricación normal de este, La liberación del fármaco in vitre se lleva a cabo
en partidas que se usarán en el estudio de biodisponibilidad y se investiga el efecto de las condiciones variables de disolu-
4 FDAGuidance SUPAC-MR: ModifiedReleaseSolidOral Dosage Forms-Scale-Up and PostapprovalChanges: Chemistry,Manufacturing,and Controls;In Vitro
DissolutionTesting,and In VivoBioequivalenceDocumentation (1997).
5 FDAGuidance Extended-ReleaseSolidOral Dosage Form-Development, Evaluation,and Applicationof In Vitro/lnVivoCorrelations,"Si se desarrollauna CIVIV
con la concentraciónmás alta,se pueden otrogarexenciones por cambiosrealizadosen la concentraciónmás altay en cualquierade las concentracionesmás bajas
siempre que tales concentracionestengan una composición proporcionalo sean cualitativamenteiguales, los perfilesde disoluciónin vitro de todas las concentra-
ciones sean similares,y todos los contenidos tengan el mismo mecanismo de liberación(traducción para fines informativosdel texto oficialdisponible únicamente
en inglés)."
USP42 InformaciónGeneral/ (1088) EvaluaciónIn Vivo e In Vitro 7801
ción. Algunas de las variables que se deben estudiar son el aparato (es preferible usar un equipo de disolución oficial), la
intensidad de mezclado y el medio de disolución (es decir, valor de pH, enzimas, agentes tensoactivos, presión osmótica,
fuerza iónica, etc.). No es necesario estudiar el comportamiento de la disolución de la forma farmacéutica en todas las
condiciones indicadas. El número de condiciones investigadas depende en gran medida de si se puede desarrollar una
correlación con los resultados in vitro obtenidos bajo las condiciones investigadas con mayor frecuencia, como aparato,
intensidad de agitación o medio de disolución y valor de pH. Cada formulación y cada fármaco representan un desafío
individual. Los perfiles de disolución que resultan del uso de diferentes medios de disolución se ilustran en las Figuras1 y
2, en las cuales se analizaron las mismas formulaciones en agua y en solución amortiguadora ácida.
g
j so
g
~ $0
/
t----,'-f--:1~----===----------
~
~ 4C +----i--'-,'--------l
"
10t--+I---------------------
10 12 20 22 2.1
Tiempo. h
Figura 1. Perfiles de disolución media de tres modificaciones de una nueva formulación de liberación modificada (Aparato
2 de la USP,50 rpm, 0,9 L de agua, 37°).
i¡: 68 +-----+------------------------
o
~
~
G -iO +---,..~-~-----;
<
-,J.
10t--_,.,.. ___________________ _
10 18 20 22 24
Tiempo. h
Figura 2. Perfiles de disolución media de una nueva formulación de liberación modificada (Aparato 2 de la USP,50 rpm,
0,9 L de solución amortiguadora de pH 4,5, 37°).
3. Los datos de nivel plasmático o de excresión urinaria obtenidos en el estudio definitivo de biodisponibilidad de la forma
farmacéutica de liberación modificada se tratan mediante un procedimiento de deconvolución. Los datos obtenidos pue-
den representar la velocidad de entrada del medicamento desde la forma farmacéutica. También representan la disolución
in vivo cuando la velocidad de disolución de la forma farmacéutica constituye el paso limitante que controla la velocidad
(es decir, se considera que la absorción del fármaco después de la disolución es instantánea). Cualquier procedimiento de
deconvolución (p. ej., balance de masas o deconvolución matemática) arrojará resultados aceptables. La Figura 3 ilustra
los resultados de deconvolución numérica de los perfiles plasmáticos obtenidos para las partidas de las Figuras1 y 2.
80
-•-Lenta 1
*"Med_ia j
f--i.--F-------,"--------,-¼-Ráp1da,1----------
2D
10 t-r---------------------
1'
24 30
Tiempo, h
Figura 3. Perfiles de absorción media a partir de la deconvolución numérica de gráficas

de concentración plasmática-tiempo.
4. La curva de disolución in vitro se compara entonces con la curva de velocidad de absorción del medicamento. Esto se
puede realizar por diversos métodos. Simplemente colocar una curva sobre la otra puede indicar a menudo la existencia
de una correlación. Esto se puede cuantificar luego definiendo una ecuación para cada curva y comparando las constan-
tes correspondientes. La manera más simple de demostrar una correlación es graficar la fracción absorbida in vivo en fun-
ción de la fracción liberada in vitro, según se ilustra en las Figuras4 y 5. Con una correlación de Nivel A, esta relación a
menudo es lineal, con una pendiente cercana a 1. Conforme se ilustra en las Figuras4 y 5, una correlación puede ser cur-
vilineal. La intersección puede ser cero o un valor distinto, dependiendo de si hay un lapso de tiempo antes de que el
sistema comience a liberar el medicamento in vivo, o la absorción no es instantánea dando como resultado la presencia
de cierta cantidad limitada de medicamento disuelto pero sin absorber. En cualquiera de los casos, se trata de una correla-
ción de punto a punto o una correlación de Nivel A cuando el ajuste de cuadrados mínimos de la línea se acerca a un
coeficiente de determinación, R2, de 1. Para las correlaciones ilustradas en las Figuras4 y 5, la CIVIVusando los perfiles de
disolución con solución amortiguadora ácida fue superior a la obtenida usando agua.
%!---------------------
.., Rápida
• Lenta
.... Líneade
60 +-------; ___ TeJldencia 1----------+--
i
j 50 !---------------------
~
50 60
%Disuelto
Figura 4. Intento de CIVIV:agua (usando formulaciones lentas y rápidas).

40 5!;
%Disuelto
Figura 5. Intento de CIVIVC:solución amortiguadora de pH 4,5.

5. Si a partir de los estudios indicados anteriormente en la evaluación de disolución in vitro, la forma farmacéutica de libera-
ción modificada presenta un comportamiento de disolución que es independiente de las variables estudiadas, y se de-
muestra una correlación de Nivel A cuando la curva de disolución in vitro se compara con la curva de velocidad de entra-
da del fármaco, es probable que la correlación sea general y se pueda extrapolar dentro de un intervalo razonable para
esa formulación del fármaco activo. Si la forma farmacéutica presenta un comportamiento de disolución que varía con las
condiciones in vitro, los analistas deben determinar el conjunto de condiciones de disolución que se correlaciona mejor
con el desempeño in vivo. Se puede establecer entonces si la correlación es real o es un artefacto. Esto se logra mediante
la preparación de al menos dos formulaciones que tengan un comportamiento in vitro significativamente diferente. Una
debe demostrar una liberación más rápida y la otra una liberación más lenta que la del lote de biodisponibilidad clínica
(biolote). Se debe llevar a cabo un estudio piloto de BD-BEcon estas formulaciones y demostrar para ambas la correlación
establecida previamente. Las modificaciones en la formulación de estas partidas se deben basar en factores de formula-
ción que podrían influir sobre el mecanismo de liberación modificada del producto, y se espera que la modificación de
estos factores de formulación influya sobre la velocidad de liberación de la forma farmacéutica.
6. Como alternativa, el desempeño in vivo de la formulación de biolote se puede simular basándose en la correlación desa-
rrollada con estas formulaciones que se usaron en el estudio de BD-BE.Posteriormente, los analistas pueden comparar los
valores predichos y determinados experimentalmente, es decir, el error de predicción. El ejercicio ilustrado en las Figuras6
y 7 sirve como validación interna de la correlación de Nivel A. Una validación externa implicaría la simulación de datos
para una partida de formulación que no fue incluida en los cálculos de la correlación de Nivel A. Dicha validación se llevó
a cabo usando los datos in vivo del lote de medio de la formulación, y los resultados se ilustran en la Figura8.
t
e20 ----------------------
¡
~
!
!
..
31) .tC
Tiempo h
Figura 6. Perfiles plasmáticos medios observados y predichos: formulación lenta.

Figura 7. Perfiles plasmáticos medios observados y predichos: formulación rápida.
Figura 8. Perfiles plasmáticos medios observados y predichos: formulación media.

7. Una vez establecida una correlación de Nivel A, se puede usar en análisis in vitro para establecer especificaciones de diso-
lución, bioexenciones para facilitar la SUPACy cambios en el contenido de la forma farmacéutica para la misma formula-
ción. Es cuestionable si se puede realizar tal extrapolación con las correlaciones de Nivel By C.
Establecimientode Intervalos de Especificaciones

de Disolución
Es relativamente fácil establecer una especificación de disolución de múltiples puntos para una forma farmacéutica de libera-
ción modificada. El comportamiento de disolución de biolote se puede usar para definir la cantidad que se va a liberar en cada
tiempo de muestreo. La dificultad surge en la variación que se va a admitir en cada punto de muestreo. En el caso de una
correlación de Nivel A, esto se puede hacer de dos maneras, las cuales emplean la CIVIV:convolución y deconvolución.
CONVOLUCIÓN
Se seleccionan valores superiores e inferiores razonables para cada tiempo establecido usando el biolote. Históricamente, las
especificaciones de disolución se han seleccionado empleando la disolución promedio de las partidas de desarrollo, con un
intervalo de ±2,5-3 desviaciones estándar. Se espera que los valores de disolución promedio sean aproximadamente iguales a
los del biolote. Se realiza la convolución de las curvas de disolución definidas por los extremos superior e inferior para proyec-
tar las curvas de nivel plasmático previstas que resultarían de la administración de esas formulaciones a los mismos pacientes a
quienes se le administró la biopartida. Si los datos de niveles plasmáticos se ubican dentro del intervalo de confianza del 95%
obtenido en el estudio de BD-BEdefinitivo, estos intervalos se pueden considerar aceptables. Un enfoque alternativo de apro-
bación que se puede usar después de haber definido el intervalo terapéutico de un medicamento es establecer si los límites
superior e inferior de los resultados de la convolución caen dentro del intervalo terapéutico, incluso si no están comprendidos
dentro del intervalo de confianza. Si no están comprendidos dentro del intervalo, se debe establecer un intervalo más limitado.
Este procedimiento se debe continuar hasta que los valores pronosticados se ubiquen dentro de los intervalos deseados.
DECONVOLUCIÓN
Se establece un conjunto aceptable de datos de niveles plasmáticos tanto para una partida de sustancia que demuestra una
liberación más rápida como para una que demuestra una liberación más lenta que la de la partida de muestra del producto. Se
pueden seleccionar usando los extremos del intervalo de confianza del 95% o una desviación estándar de ±1 con respecto al
nivel plasmático medio. Se realiza la deconvolución de estas curvas y la curva de velocidad de entrada resultante se usa para
establecer las especificaciones de disolución superior e inferior en cada punto temporal. En el caso de las correlaciones de Nivel
By C, las partidas del producto se deben elaborar en los límites superior e inferior propuestos del intervalo de disolución y se
debe demostrar que estas partidas son aceptables mediante un estudio de BD-BE.
USP42 Información General/ (1090) Evaluación del Desempeño 7805
FormasFarmacéuticasde LiberaciónInmediata
CONSIDERACIONES
GENERALES
Debido a que los mecanismos de liberación de fármacos de formas farmacéuticas de liberación modificada son más comple-
jos y variables que aquellos asociados a las formas farmacéuticas de liberación inmediata, se esperaría que la CIVIVfuera más
fácil de desarrollar con las últimas formulaciones. Lamentablemente, la mayoría de los intentos de correlación realizados hasta
la fecha con formas farmacéuticas de liberación inmediata se han basado en el método de correlación de Nivel C, aunque tam-
bién se han hecho intentos mediante la teoría de análisisestadístico de momento (Nivel B). Aunque es razonable suponer que
el mismo método de correlación de Nivel A se podrá utilizarcon formas farmacéuticas de liberación inmediata, hasta que se
reúnan datos para corroborarlo, el Nivel By el Nivel C son los mejores métodos que se pueden recomendar para usarlos con
estas formas farmacéuticas.
1Cambloen la redacdón:
(1090) EVALUACIÓNDELDESEMPEÑO•E INTERCAMBIABILIDAD.usP4l

DE
MEDICAMENTOS•SÓLIDOSORALES.uSP4
-BIODISPONIBILIDAD, 2
BIOEQUIVALENCIA
Y DISOLUCIÓN
1Cambloen la redacdón:
ANTECEDENTES
BIODISPONIBILIDAD, BIOEQUIVALENCIA Y DISOLUCIÓN
BIOEQUIVALENCIA
Medicamentos de LiberaciónInmediata
Medicamentos de LiberaciónModificada
Medicamentos AdministradosPor Vía Oral, No Destinados A Un Efecto Sistémico
Estudiosde Bioequivalencia
AnálisisEstadístico
DISOLUCIÓN Y DESEMPEÑO DELPRODUCTOIN VITRO
Disolucióny BiodisponibilidadIn Vitre
Disolucióny EquivalenciaIn Vitre
Comparaciones del Perfilde Disolución
•INTERCAMBIABILIDAD DEMEDICAMENTOS
FORMASÓLIDAYTAMAÑODE PARTÍCULA
DIFERENCIAS ENTREEXCIPIENTES
PROCESODEFABRICACIÓN AUSP42
BIOEXENCIÓN
BioexenciónBasada en la Proporcionalidad de la Forma Farmacéutica
BioexenciónBasada en el Sistema de ClasificaciónBiofarmacéutica
APÉNDICE
ANTECEDENTES
Este capítulo ofrece recomendaciones para la evaluación del desempeño de medicamentos •sólidos orales•usP42in vivo e in
vitre. Elcapítulo pretende ser una guía para los científicosy los médicos clínicos que buscan evaluar el desempeño del medica-
mento por medio de procedimientos sucedáneos que anteceden y/o se correlacionan con estudios clínicos en seres humanos.
Loscompendios U5P-NFproporcionan normas de calidad para fármacos, excipientes y preparaciones terminadas. Una mono-
grafía U5P-NFpara una sustancia o una preparación oficialincluye la definición del artículo, el envasado, el almacenamiento y
otros requisitos, así como la especificación. La especificaciónconsiste en una serie de pruebas universales (descripción, identifi-
cación, impurezas y valoración) y pruebas específicas,uno o más procedimientos analíticos para cada prueba, y criterios de
aceptación. Lasnormas de calidad son atributos importantes que deben ser parte constitutiva del medicamento. El cumpli-
miento con las normas U5P-NFse acepta mundialmente como garantía de alta calidad y forma parte de los requisitos necesa-
rios para la aprobación de un medicamento• •usp42 bioequivalente e • •usp42 intercambiable. Los medicamentos • •usp42 deben
7806 (1090) Evaluación del Desempeño / Información General USP42
cumplir con determinados estándares de desempeño in vivo y/o in vitro para ser considerados terapéuticamente equivalentes
(TE) e intercambiables. 4 4 usp42 El desempeño de un medicamento puede definirse como la liberación del •fármaco .t.usp42 de la
forma farmacéutica del producto, •normalmente 4 usP4 2 derivando en la •exposición 4 usp42 sistémica •o, con menor frecuencia,
en la actividad loca14 usP42del 4 fármaco 4 usP4
2 necesaria para alcanzar la respuesta terapéutica deseada.
4 La biodisponibilidad
(BD) es una medida de exposición sistémica. 4 usP42En este capítulo se abordan los enfoques in vivo e in vitro para determinar el
desempeño del medicamento. El capítulo se centra principalmente en el desempeño de los medicamentos sólidos orales.
•Este4 usm capítulo hace referencia a •dos guías de la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos
(FDA, por sus siglas en inglés): Guidancefor lndustry:Bioavailabilityand Bioequivalence StudiesSubmittedin NDAsor INDs-Gene-
ral Considerations (guía preliminar de marzo de 2014) y Guidancefor lndustry:Bioequiva/ence Studieswith Pharmacokinetic End-
points for DrugsSubmittedUnderan ANDA(guía preliminar de didembre de 2013) (buscar por el título del documento; http:/ /
www.fda.gov/); una guía de la European Medicines Agency (EMA):Guidelineon the lnvestigationof Bioequivalence (201 O) (bus-
car por el título del documento; http://www.ema.europa.eu/ema/), 4 usP4iy a un documento de la Organización Mundial de la
Salud (OMS o WHO, por sus siglas en inglés), Annex7: Multisource(Generic)PharmaceuticalProducts:Guidelineson Registration
Requirements to Establishlnterchangeability,•WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Products: Informe
cuadragésimo. World Health Organization: Ginebra, 2006: Annex 7 (WHO Technical Report Series, No. 937). TRS992 (2015)
4 usp42 (buscar por el título del documento; http://who.int/en/). Las guías de la FDAse usan en los Estados Unidos, mientras que
otras autoridades reguladoras nacionales/regionales ,.t.fuerade los Estados Unidos 4 usP42pueden usar las guías de la OMS, de la
FDA,de la •Agencia Europea de. Medicamentos 4 usm (EMA,por sus siglas en inglés), así como también guías nacionales/regio-
nales. Después de la aprobación de un medicamento, se puede realizar su control de la calidad, en parte, usando la especifica-
ción privada y/o pública, que puede incluir una prueba de desempeño. La USP proporciona los capítulos generales Desintegra-
ción (701 ), Disolución(711 ), Liberaciónde Fármacos(724), EvaluaciónIn Vivoe In Vitrode FormasFarmacéuticas (1088), y 4 .t.usp42
Procedimiento de Disolución:Desarrolloy Validación(1092) y Cápsulas-Pruebasde Disolucióny Atributosde CalidadRelacionados
(1094), donde se describen estas pruebas y procedimientos.
Este capítulo proporciona información general sobre la realización de estudios de bioequivalencia (BE)como una forma al-
ternativa de medir el desempeño de un medicamento in vivo, y de comparaciones del perfil de disolución para medir el de-
sempeño del medicamento in vitro, •tal como se indica en las guías citadas en este capítulo ..t.usm El capítulo también analiza
las condiciones bajo las cuales ciertos medicamentos pueden quedar exentos del requisito de BEin vivo (bioexención o biowai-
ver) y muestra cómo se puede usar el Sistema de Clasificación Biofarmacéutica para predecir el desempeño de un medicamen-
to. En el Apéndicede este capítulo se define la terminología científica clave y se proporciona una comparación de las evaluacio-
nes de desempeño de medicamentos entre la FDA,la 4 EMA4 usP42y la OMS. •Pueden existir otras guías de BEaparte de las
proporcionadas en este capítulo. 4 usm
BIODISPONIBILIDAD,
BIOEQUIVALENCIA
Y DISOLUCIÓN
Los estudios de biodisponibilidad (BD) se enfocan en determinar el proceso y el periodo durante el cual se libera el 4 fárma-
co 4usP42desde una forma farmacéutica oral y luego se desplaza al sitio de acción [ver la •Guidancefor lndustry:Bioavai/ability
and Bioequivalence StudiesSubmittedin NDAsor INDs-General Considerations (guía preliminar de la FDA, de marzo de 2014) y
Guidancefor Jndustry:Bioequivalence Studieswith Pharmacokinetic Endpointsfor DrugsSubmittedUnderan ANDA(guía preliminar
de la FDA,de diciembre de 2013) (buscar por el título del documento; http://www.fda.gov/1. 4 usP4 2 La BD es una medida indi-
recta o alternativa de la velocidad y el grado con los que el •fármaco 4 usP42o su parte activa se absorben desde un medicamen-
to y se vuelve disponible en sus sitios de acción diana. Los datos de BD proporcionan una estimación de la exposición sistémica
del fármaco, incluida la fracción del fármaco absorbida. ,4 La determinación de la disponibilidad de fármacos que no están des-
tinados a ser absorbidos en el torrente sanguíneo a partir de los medicamentos se encuentra fuera del alcance de este capítu-
lo .• u5p42 Los medicamentos se consideran bioequivalentes si un medicamento de prueba •(T) 4 usp4,ino muestra una diferencia
significativa en la velocidad y el grado de absorción en comparación con un 4 medicamento(R) 4 usp42 designado como referen-
cia cuando se administran a la misma ••usp 42 dosis 4 4 usp42 bajo condiciones experimentales similares, bien sea en dosis únicas o
en dosis múltiples.
La BD y la BEse pueden obtener generalmente por mediciones seriales de las concentraciones del •fármaco 4 u5p42 y/o del
metabolito en la circulación sistémica durante un período prescrito. Los estudios de BEpueden usar otros enfoques cuando no
se pueden medir las concentraciones sistémicas del fármaco o estas no son apropiadas. En estos casos, los métodos más indi-
rectos para determinar la BEincluyen criterios de valoración (endpoints) farmacodinámica aguda, criterios de valoración clínica
y estudios in vitro que típicamente involucran comparaciones de los perfiles de disolución de los productos farmacéuticos 4 (7)
4 usp42 y (R). Los estudios de desempeño in vitro no se usan en lugar de los estudios de BD sin una correlación in vitro-in vivo
4
:(IVIVC)o sin consideraciones basadas en el Sistema de Clasificación Biofarmacéutica (BCS).4 usp42

La información sobre BD y BEes importante para cumplir con las presentaciones reglamentarias. La información de BD abar-
ca, en general, la absorción, distribución, metabolismo y excreción del •fármaco. 4 usm En el caso de un producto innovador,
los estudios de BE establecen el desempeño del producto destinado a la comercialización tal como fue desarrollado para ser
aprobado comercialmente, por comparación de su BD con la del material usado en los ensayos clínicos, es decir, con el medi-
camento usado en los ensayos de seguridad y eficacia. Para el desarrollo y aprobación reglamentaria de un medicamento ge-
USP42 InformaciónGeneral/ (1090) Evaluación del Desempeño 7807
nérico, el producto "7 .. usp42debe ser "bioequivalente.,.usp42 al producto "R.,.usm (por lo general, es el medicamento de marca o
innovador designado por la autoridad reguladora correspondiente).
El documento de guía de la ICH titulado Specifications:TestProceduresand AcceptanceCriteriafor New Drug Substancesand
New Drug Products:ChemicalSubstancesQ6A (2000) (buscar por el título del documento; http://www.fda.gov/) proporciona el
enfoque para establecer los criterios de aceptación para el desempeño del medicamento. Estos enfoques se basan en la disolu-
ción o en la desintegración de partidas clínicamente aceptables, como lo hace el enfoque de la FDA. Los estudios de BEse
centran en el desempeño del medicamento y, por lo general, involucran comparaciones de dos productos farmacéuticos: "7 y
R... usP<zLos estudios requeridos y la determinación de BEson competencia de las agencias reguladoras. En los Estados Unidos,
a R se le denomina "medicamento de referencia listado" (reference listed drug o RLD,por sus siglas en inglés) y así se anota en
la lista de ApprovedDrug Productswith TherapeuticEquivalenceEvaluations,"37th Edition.,.usp 42 [Orange Book("2017 .. usm)
(http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/ob/)] preparado por la FDA. Para orientar a los países y regiones en donde no
siempre se puede identificar fácilmente el producto R, la OMS ha preparado un documento titulado Annex 11: Guidanceon the
Selectionof ComparatorPharmaceuticalProductsfor EquivalenceAssessmentof lnterchangeableMultisource(Generic)Products
(2002) (buscar por el título del documento; http://www.who.int/en/). En el documento de la OMS, a R se le denomina "pro-
ducto farmacéutico comparador'' (CPP, por sus siglas en inglés). Cuando un país o región tiene un conjunto de CPP claramen-
te definido, se requiere que un fabricante demuestre, a satisfacción de su autoridad reguladora, que su " .. usm producto es
farmacéuticamente equivalente (FE)y "bioequivalente.,.usP<zal CPP correspondiente.
Cambio en la redacción:
BIOEQUIVALENCIA
Un producto "farmacéutico •usm intercambiable debe ser FE. Los documentos de la •EMAy .,.u5p42de la OMS permiten que
las alternativas farmacéuticas se consideren terapéuticamente equivalentes •(TE>..usP<z e intercambiables si son "bioequivalen-
:tes..,.usmAdemás, para que los productos genéricos se consideren •TE.,.usmal producto •R..usm debe demostrarse que son
bioequivalentes. Para que el producto sea considerado un equivalente farmacéutico, debe tener el mismo •fármaco,.usm, igual
contenido, la misma forma farmacéutica y vía de administración, así como el mismo etiquetado del producto "R.,.usm·Se
cuenta con diversos métodos para evaluar y documentar la BE.Estos incluyen lo siguiente:
1. Estudiosfarmacocinéticoscomparativosen sereshumanos. En estos estudios, el ..:fármaco.,.usmy/o sus metabolitos se miden
en función del tiempo en fluidos biológicos accesibles como sangre, plasma, suero u orina para obtener mediciones far-
macocinéticas como el área bajo la curva de la concentración del fármaco en plasma en función del tiempo (ABC)y la
concentración máxima (Cmá,),que son un reflejo de la exposición sistémica. •Otros parámetros farmacocinéticos, tales co-
mo el tiempo para alcanzar la concentración máxima (Tm,¡,) pueden ser informativos para la evaluación de la seguridad y
la eficacia,.,.usm Los estudios de BEse diseñaron para comparar el desempeño in vivo de" 1).,.usm un producto genérico
con un producto R •o 2) una nueva formulación de un producto R con el producto aprobado originalmente ... usm Por lo
general, el diseño del "estudio .. usp42es cruzado, aleatorizado, con dos períodos, dos secuencias, una dosis única. La canti-
dad de sujetos se debe justificar estadísticamente y no ser menor de 12. ·•El poder estadístico necesario del estudio deter-
minará el número de sujetos> 12. •usP<Z Durante el estudio, se recolectan muestras de sangre con intervalos suficientes pa-
ra evaluar la Cmá"' ABCy otros parámetros. Las muestras de sangre se analizan por medio de metodología bioanalítica
apropiadamente validada con medidas farmacocinéticas estándares y enfoques estadísticos. El método estadístico para
evaluar la BEfarmacocinética se basa en la determinación del intervalo de confianza del 90% alrededor del cociente de la
media geométrica de las medias poblacionales transformadas en logaritmos(" 7•usp42/R) para ABCy Cmáx, efectuando dos
pruebas unilaterales con un nivel de significancia del 5%.
2. Otras opciones.Además, se pueden utilizar estudios farmacodinámicos comparativos en seres humanos y ensayos clínicos
comparativos para documentar o suplementar la evaluación de la BE. • .. usP<z La documentación de la equivalencia in vivo
es especialmente importante para: fármacos con intervalo terapéutico estrecho; evidencia documentada de problemas de
BE;medicamentos de liberación modificada diseñados para actuar por absorción sistémica; y productos combinados de
dosis fijas con acción sistémica cuando al menos uno de los ·"fármacos.,.usP<Z requiere un estudio in vivo.
Medicamentosde LiberaciónInmediata
Los estudios cruzados de BEde dosis única se efectúan con la dosis más alta para comparar los productos T y R en ayunas.
Para fármacos que tienen una vida media de eliminación (t,1,) muy larga se puede utilizar un diseño de estudio paralelo. Las
agencias reguladoras pueden permitir un muestreo truncado a las 72 horas. Las formas farmacéuticas con contenidos más ba-
jos pueden recibir una bioexención basándose en la •farmacocinética lineal,,.usP 42en la proporcionalidad de la forma farmacéu-
tica y en la similitud del perfil de disolución. Se requieren estudios sobre el efecto de los alimentos •según lo.descrito en la
guía para los aumentos de escala y cambios posteriores a la aprobación de los productos de liberación inmediata (SUPAC-IR).
Se requieren estudios sobre el efecto de los alimentos para todos los productos oral.es 7 de liberación inmediata, excepto cuan-
do: 1) los productos 7 y R se disuelven rápidamente con perfiles de disolución similares y contienen fármacos altamente solu-
bles y altamente permeables; o 2) cuando el etiquetado del producto R indique que debe tomarse en ayunas; o 3) cuando el
etiquetado del producto R no incluya una declaración acerca del efecto de los alimentos en la absorción o la administración
7808 (1 090) Evaluación del Desempeño / Información General USP42
[ver FDAGuidancefor lndustry:Food-Effect

Bioavailabilityand FedBioequivalence
Studies(2002); (buscar por el título del docu-
mento; http://www.fda.gov/)] ..,.usP42
Medicamentos de Liberación Modificada
Para comparar los productos Ty R los estudios de BEpara formas farmacéuticas de liberación "modificada.,.usp4z se efectúan
de forma cruzada, con una dosis única, a la dosis más alta, en condiciones de ayuno y con alimentos. Un estudio de dosis
única es más sensible que los estudios de dosis múltiples en estado estacionario para evaluar el desempeño del medicamento
in vivo, especialmente en lo que respecta al fenómeno de liberación masiva de la dosis, es decir, la liberación prematura rápida
e imprevista del "fármaco.,.usp 42 en el "tracto gastrointestinal.,.usr42 a partir de un producto de liberación prolongada. Las for-
mas farmacéuticas de liberación prolongada con contenidos más bajos pueden no requerir un estudio in vivo, siempre que se
use el mismo mecanismo de liberación del fármaco, y basándose en la proporcionalidad de la forma farmacéutica y la similitud
del perfil de disolución. El documento "Guidancefor lndustry:SUPAC-MR: ModifiedRelease So/idOral DosageFormsScale-Upand
PostapprovalChanges:Chemistry,Manufacturing,and Controls;In VitroDissolutionTestingand In V-woBioequivalence Documenta-
tion (buscar por el título del documento; http:l/www.fda.gov/) de la FDA,proporciona una guía acerca de la necesidad de
estudios de BEcuando se han hecho cambios a la formulación. Para todos los productos genéricos de liberación modificada
administrados por vía oral se requieren estudios de BEen presencia de alimentos [ver FDAGuidancefor lndustry:Food-Effect
Bioavailabilityand FedBioequivalence Studies(2002)) ...usP4z
Medicamentos Administrados Por Vía Oral, No Destinados A Un Efecto Sistémico
Algunos medicamentos orales están destinados a una actividad local. Por ejemplo, la mesalamina y la colestiramina son fár-
macos destinados a ejercer una actividad local. Para estetipo de medicamentos, la absorción sistémica desde el tracto gas-
trointestinal es mínima, requiriéndose, por lo tanto, de un ensayo clínico comparativo, aunque también se puede requerir un
perfil de exposición sistémica al fármaco. En algunos casos, los estudios in vitro pueden ser apropiados; tales como estudios
que incluyan la comparación de la unión de la colestiramina a las sales biliares.
Estudios de Bioequivalencia
Objetivo: El objetivo de un estudio de BE es medir y comparar el desempeño de la formulación entre dos o más .,.Ausr42
medicamentos. La disponibilidad del fármaco a partir de los productos Ty R no debe ser estadísticamente diferente cuando el
medicamento se administra a pacientes o sujetos en la misma dosis molar y bajo condiciones experimentales similares.
Diseño: El diseño de un estudio de BEdepende de sus objetivos, de la capacidad de analizar el "fármaco (y/o .. usp 42 los meta-
bolitos "cuando corresponda).,.usr4z en fluidos biológicos, de la farmacodinamia del fármaco, de la vía de administración del
medicamento y de la naturaleza del fármaco y del medicamento. Para determinar la BD del fármaco a partir de un medica-
mento pueden utilizarse los parámetros farmacocinéticos, los parámetros farmacodinámicos, las observaciones clínicas y/o los
estudios in vitro.
Algunos posibles diseños de estudios de BEincluyen:
1. Estudio cruzado de dos vías y dosis única en ayunas.
2. Estudio cruzado de dos vías y dosis única, en condición de ayuno y con alimentos
3. Estudio paralelo de dosis única en ayunas.
4. Diseño replicado, de dosis única
5. Diseño parcialmente replicado, de dosis única
6. Estudio cruzado de dos vías y dosis múltiples en ayunas
7. Estudio con criterio de valoración farmacodinámica o clínica
8. Comparaciones del perfil de disolución in vitro
El estudio de BEestándar tiene un diseño cruzado (p. ej., diseño cruzado en cuadrado latino) en el cual cada sujeto recibe
los productos farmacéuticos .,.T.,.usr 42 y "RusP42en ocasiones separadas. Los estudios, por lo general, se evalúan por un diseño
cruzado, aleatorizado, de dosis única, con dos períodos, dos tratamientos, dos secuencias, abierto, que compara dosis iguales
de los productos .,.TAUSP42 y "R.,.usr
42 en sujetos sanos adultos en condición de ayuno y con alimentos. Algunos medicamentos
de liberación prolongada pueden requerir un estudio de dosis múltiples. Entre los dos períodos se programa un período
de " ..usr4, eliminación para permitir que los sujetos eliminen completamente el fármaco absorbido en la primera dosis antes de
la administración de la segunda dosis "del medicamento,.,.usr•z Si la concentración antes de la dosis es :;;5% del valor Cmáx en
ese sujeto, se pueden incluir los datos de ese sujeto sin ningún ajuste en todas las mediciones y cálculos farmacocinéticos. Las
muestras de un fluido biológico accesible, como la sangre, se usan para caracterizar el perfil de la concentración del fármaco
en función del tiempo. Durante el estudio en ayunas los sujetos ayunan al menos 1O horas. Se toma una muestra de sangre
antes de la dosis (tiempo O). El medicamento se administra con 240 mL de agua (8 onzas). No se permite ningún alimento por
lo menos 4 horas después de la dosis. "Los productos farmacéuticos Ty Rse administran a la misma hora del día para evitar
efectos diumos •.i.usmLa recolección de muestras de sangre se efectúa periódicamente después de la .,.AUSP4Z administra-
ción "del producto farmacéutico Ausp 421de acuerdo con el protocolo. Un estudio con intervención de alimentos o de efecto del
alimento se efectúa en condiciones de alimentación estándar que se prevé que proporcionen los mayores efectos sobre la fisio-
logía gastrointestinal, de manera que la disponibilidad sistémica del fármaco se vea afectada al máximo. Además, el alto conte-
nido lipídico de la alimentación puede afectar la velocidad de liberación del fármaco a partir del producto, in situ. Como comi-
da de prueba para los estudios de BD bajo el efecto de los alimentos (food-effect BD) y de BEcon alimentos (fed BE)se reco-
mienda una comida rica en grasas (aproximadamente 50% del contenido calórico total de la comida) y en calorías (aproxima-
damente 800-1000 calorías). Esta comida de prueba debe aportar aproximadamente 150 calorías a partir de proteínas, 250 a
partir de hidratos de carbono y 500 a 600 a partir de grasas. El producto farmacéutico se administra con 240 mL de agua (8
onzas) después de la ingestión de la comida estándar. Idealmente, los sujetos deberán consumir comidas idénticas "dentro del
mismo intervalo antes de la administración de los productos 1 o R....usm
Análisis de las Muestras: Las muestras, por lo general de plasma, se analizan para medir las concentraciones del "fárma-
co .i..us,
42y, en ocasiones, las concentraciones del metabolito activo, por medio de métodos bioanalíticos validados.
Parámetros Fannacocinéticos: Los parámetros farmacocinéticos se obtienen de las curvas resultantes de la concentración en
función del tiempo. Para evaluar la velocidad y el grado de absorción sistémica del fármaco se usan dos parámetros farmacoci-
néticos importantes. La ABC refleja la extensión de absorción del fármaco, mientras que la ,...Cm6"...usp42 refleja su nivel de absor-
ción. Otros parámetros farmacocinéticos pueden incluir • Tm6".-usm,la constante de velocidad de eliminación (k), la vida media
de eliminación (t,1,), el tiempo de latencia o demora (T1a
9
), y otros.
Análisis Estadístico
Los parámetros farmacocinéticos se analizan estadísticamente para determinar si los productos T y R arrojan valores compa-
rables. Dado que los estudios de BE pueden utilizar tamaños pequeños de muestras, la transformación logarítmica de los datos
permite que la distribución de frecuencias de los datos sea más normalizada de manera que se puedan efectuar análisis estadís-
ticos paramétricos (ver FDA, Guidancefor lndustry: StatisticalApproachesto EstablishingBioequivalence(2001 ); buscar por el títu-
lo del documento; http://www.fda.gov/).
Para el análisis de datos farmacocinéticos derivados de estudios de BEin vivo, se recomiendan procedimientos que siguen el
modelo lineal general paramétrico (teoría normal). Se debería realizar un análisis de varianza (ANOVA)con los parámetros far-
macocinéticos ABCy Cmáxt empleando modelos y programas estadísticos adecuados. Por ejemplo, para un diseño de estudio
cruzado convencional de dos tratamientos, dos períodos, dos secuencias (2 x 2), aleatorizado, el modelo estadístico a menudo
incluye factores que toman en cuenta las siguientes fuentes de variación:
• Secuencia (a veces dominada Grupo u Orden)
• Sujetos, agrupados en secuencias
• Periodo (o Fase)
• Tratamiento (a veces denominado Medicamento o Formulación)
Debería probarse el efecto de la secuencia usando el cuadrado medio [sujeto (secuencia)] obtenido del ANOVAcomo una
evaluación del error. Los demás efectos principales deberían analizarse contra el error residual (error cuadrático medio) obteni-
do del ANOVA.Se debería usar el método de las medias por mínimos cuadrados (LSMEANS)para calcular las medias por míni-
mos cuadrados de los tratamientos. Se deberían estimar las diferencias ajustadas entre las medias de los tratamientos y el error
estándar asociado a estas diferencias.
Las suposiciones estadísticas derivadas del ANOVAson las siguientes:
• Aleatorización de las muestras
• Homogeneidad de las varianzas
• Aditividad (linealidad) del modelo estadístico
• Independencia y normalidad de los residuos
En los estudios de BE,estas suposiciones se pueden interpretar de la siguiente manera:
• Los sujetos elegidos para este estudio deberían asignarse aleatoriamente a las secuencias del estudio.
• Las varianzas asociadas con los dos tratamientos, así como entre los grupos de secuencias, deberían ser iguales o por lo
menos comparables.
• Los efectos principales del modelo estadístico, como por ejemplo el sujeto, la secuencia, el período y el efecto del trata-
miento para un estudio cruzado estándar 2 x 2, deberían ser aditivos. No debería existir interacción entre estos efectos.
• Los residuos del modelo deberían estar distribuidos de forma normal e independiente.
Si no se cumplen estos supuestos, deberían tomarse medidas adicionales antes de realizar el ANOVA,incluyendo la transfor-
mación de datos para mejorar el ajuste de los supuestos o el uso de una prueba estadística no paramétrica en lugar del ANO-
VA Sin embargo, se sabe que las suposiciones de normalidad y varianza constante en el modelo de ANOVAson relativamente
robustas (es decir, una desviación pequeña o moderada de una de estas suposiciones, o de ambas, no tendrá un efecto signifi-
cativo sobre el resultado final). La justificación de la transformación logarítmica se encuentra en la Guidancefar lndustry: Statis-
tical Approachesto EstablishingBioequivalence(2001) [buscar por el título del documento; ver FDAhttp://www.fda.gov/] ".i..usm
de la FDA.
Procedimiento de dos pruebas unilaterales (two one-sided tests): Para determinar la comparabilidad de los valores de la
media geométrica de los parámetros farmacocinéticos medidos después de la administración de los productos • T•usP4 2
781 O (1090) Evaluación del Desempeño/ InformaciónGeneral USP42
y •R,.usp42 se usa lo que se conoce como el procedimiento de dos pruebas unilaterales. El procedimiento de dos pruebas unila-
1
terales determina si T no es significativamente menor que R y si R no es significativamente menor que T. •Se pueden usar otros
enfoques estadísticos para determinar una diferencia clínicamente significatíva.,.u5p42 Por lo general, una diferencia de 20% se
define como •clínicamente significativa.,.usp42 El procedimiento estadístico implica el cálculo de un intervalo de confianza para
el cociente (o diferencia) entre los promedios de las variables farmacocinéticas del producto de prueba T y del de referencia R.
Los límites del intervalo de confianza observado deben estar comprendidos en un intervalo predeterminado para el cociente (o
diferencia) entre los promedios. La estimación puntual de los cocientes de las medias (T/R) derivados de los datos de ABCy
Cmáx transformados logarítmicamente debe estar entre el 80% y el 125%. Dado que los datos se transforman logarítmicamen-
te, T/R= 80/100 =80% y R/T= 100/80 =125%. Además, los intervalos al 90% de confianza para los cocientes de las medias
geométricas (T/R) para ABCy Cmáx deben estar entre •el 80,00%,.usP4zy •el 125,00%.,.u 5p42 Los requisitos reglamentarios para
los intervalos de confianza del 90% para Cmáx-""son,.usm diferentes fuera de los Estados Unidos.
Bioinequivalencia: El fracaso en la demostración de la BEpuede deberse a una falla en el desempeño del producto To a un
diseño inadecuado del estudio. Elfracaso en la demostración de la BEdebido a un diseño inadecuado del estudio puede de-
berse a un muestreo inadecuado en el cual: 1) el tiempo de muestreo para Cmáx no se obtuvo apropiadamente, o 2) el número
de muestras tomadas no describió adecuadamente el perfil de concentración plasmática del fármaco en función del tiempo.
En el caso de fármacos altamente variables (p. ej., coeficiente de variación% [CV]•de Cmáxo ABC>30%~, en los que fracasó la
demostración de la BE,se observó con frecuencia que el estudio no tenía el poder estadístico adecuado debido a un número
insuficiente de sujetos usados ... usP42
Presentación de los datos: Debería proporcionarse la concentración del fármaco en el fluido biológico en cada tiempo de
muestreo, sin transformar, para todos los sujetos que hayan participado en el estudio. Los parámetros farmacocinéticos deriva-
dos también deberían proporcionarse sin transformar. En el informe final se debería calcular y tabular la media, la desviación
estándar y el O/ para cada variable.
Para facilitar las comparaciones de BE,deberían presentarse los parámetros farmacocinéticos para cada individuo de forma
paralela para las formulaciones probadas. Específicamente, para ABCy Cm 6., la diferencia (T - R), el cociente (T/R) y el logarit-
mo del cociente (log T/R o In T/R)entre los valores de Ty R se deberían tabular de forma paralela para todos los sujetos. Las
tablas que resumen los resultados deberían indicar la secuencia de la administración del producto para cada sujeto (T luego R,
o R luego T). Es útil presentar histogramas que muestren la distribución de frecuencias de la diferencia y el cociente logarítmico
(In o log) para los principales parámetros farmacocinéticos (ABCy Cm6.). •No más del 20% del ABCtotal (cero a infinito) debe-
ría obtenerse al extrapolar la eliminación terminal. .. usm
Además de las medias aritméticas para los productos Ty R, deberían calcularse las medias geométricas (antilogaritmo de las
medias de los logaritmos), las medias de los logaritmos y las desviaciones estándar de los logaritmos para ABCy Cmáx- En el
informe deben incluirse todas las medias: la media aritmética, la media geométrica y las medias de los logaritmos, así como las
desviaciones estándar y los coeficientes de variación.
DISOLUCIÓNY DESEMPEAODELPRODUCTOIN VITRO

Conforme a lo descrito para las preparaciones oficiales, las monografías de la USPproporcionan una especificación pública
que incluye una lista de pruebas, referencias a los procedimientos analíticos y criterios de aceptación. La mayoría de las formas
farmacéuticas sólidas orales, incluidas las suspensiones orales, requieren una prueba de disolución o prueba de liberación de
fármacos. Las pruebas de disolución y de liberación de fármacos se describen en los capítulos generales (711) y (724). Estas
especificaciones públicas se usan para pruebas de control de calidad y para la aprobación comercial. La prueba de disolución
en la monografía de la USPestá relacionada con la BD y la BEsolamente cuando está vinculada estrechamente con una sólida
determinación reglamentaria. Sin esta relación, se debe considerar la prueba de disolución de la USPúnicamente como una
prueba de control de calidad para la liberación de la partida. Las guías de la FDAson: 1) Guidancefor lndustry: DissolutionTes-
ting of lmmediate ReleaseSo/idOral DosageForms••(l 997),.usp42 (http://www.fda.gov/¡ buscar por el título del documen-
to)¡ "'•vsP4z2) Guidancefor lndustry: ExtendedReleaseOral DosageForms:Development,Evaluation,and Applicationof In Vitro/ln
VivoCorrelation•(1997); y 3) Guidancefor lndustry. DissolutionTestingand SpecificationCriteriofor lmmediate-Release So/idOral
DosageForrnsContainingBiopharrnaceutics ClassificationSystemClass1 and 3 Drugs(guía preliminar de julio de 2015) •usp42
(buscar por el título del documento¡ http://www.fda.gov/).
Disolucióny Biodisponibilidad
In Vitro
Las pruebas de disolución y liberación de fármacos son muy útiles durante el desarrollo del medicamento para identificar los
atributos críticos de fabricación, como son el impacto de las propiedades del ingrediente y del proceso de fabricación sobre el
desempeño del producto. Durante el desarrollo del producto, es necesario conseguir las condiciones óptimas de disolución
con el fin de discriminar entre las formulaciones del medicamento y los cambios en los procesos de fabricación. Una vez que la
1 Schuirmann DJ.A comparison ot the two one-sided tests procedure and the power approach for assessingthe equivalenceof average bioavailability./ Pharmaco-
kinet Biopharm.1987;15(6):657-680.
forma farmacéutica final se aprueba para su comercialización, las pruebas de disolución y liberación de fármacos .i.pueden
ser .i.us,
42 útiles para predecir los posibles cambios en el desempeño debidos al •aumento de escala y a los cambios posteriores
a su aprobación ..i.usmVer las siguientes guías de la FDA:
Guidancefor lndustry: lmmediate ReleaseSo/idOral DosageForms,Sca/e-Upand PostapprovalChanges:Chemistry,Manufac-
turing, and Controls;In Vitro DissolutionTestingand In Vivo BioequivalenceDocumentation(1995) (buscar por el título del
documento; http://www.fda.gov/) y
Guidancefor lndustry: SUPAC-MR: Modified ReleaseSo/idOral DosageForms,Sca/e-Upand PostapprovalChanges:Chemistry,
Manufacturing, and Controls;In Vitro DissolutionTestingand In VivoBioequivalenceDocumentation(i.1997).i.usm(buscar por
el título del documento; http://www.fda.gov/).
Para algunos medicamentos orales, la disolución del fármaco in vitro se puede relacionar con el desempeño in vivo, tal como
la .i.Bo.i.usp42 y/o la exposición sistémica al fármaco. El capítulo (1088) describe diferentes enfoques de IVIVC.
Disolucióny EquivalenciaIn Vitro

Una prueba de disolución .i.apropiada.i.usm es una poderosa prueba fisicoquímica in vitro que mide la calidad y el desempe-
ño del medicamento para una gran variedad de formas farmacéuticas, como las formas farmacéuticas sólidas orales, formas
farmacéuticas transdérmicas, suspensiones y ciertas formas farmacéuticas semisólidas. las pruebas de la USPpara las formas
farmacéuticas terminadas se pueden dividir en dos tipos: 1) pruebas de calidad del medicamento y 2) pruebas de desempeño
del medicamento. Las pruebas de calidad del producto están previstas para evaluar atributos tales como valoración y uniformi-
dad de contenido; las pruebas de desempeño están diseñadas para evaluar el desempeño del producto y, en muchos casos, se
relacionan con la disolución. Para detalles concernientes a la realización de una prueba de disolución .../liberación de fárma-
cos.i.usP42,ver (711 ), (724), (1088), .i..i.usp
42 (1092), .i.yMedicamentosSemisólidos-Pruebasde Desempeño(1724) ..i.usP4z
La prueba de disolución in vitro se desarrolló inicialmente como una herramienta de control de calidad para garantizar la
calidad del medicamento y la uniformidad entre las partidas. Los procedimientos de las pruebas de disolución.i./liberación de
fármacos.i.usmse describen en (711) y (724) de la USP. El desarrollo del sistema de clasificación biofarmacéutica (BCS) ofrece
una nueva interpretación y poder a la prueba de disolución. El BCS clasifica un fármaco de acuerdo con su solubilidad .i.acuo-
.i.asícomo también su.i.usP42
sa.i.usp421 permeabilidad .i..i.usma través de una biomembrana como la de las células mucosas intes-
tinales. La velocidad de disolución del .i.fármacO.i.usP4z a partir de la forma farmacéutica es importante para sustentar las bioe-
xenciones basadas en el BCS.
Comparacionesdel Perfil de Disolución

Las pruebas de disolución y de liberación de fármacos in vitro pueden relacionarse con el desempeño del fármaco in vivo, tal
como la BD. las comparaciones de los perfiles de disolución tienen cada vez más importancia como un medio de documentar
los estudios comparativos de BD, es decir, de BE.Una bioexención es el reemplazo o exención .i..i.usNzde los estudios de BEin
vivo por una prueba in vitro.
Para comparar los perfiles de disolución de dos productos se usa un modelo de enfoque matemático independiente: 1) para
comparar el perfil de disolución entre el producto P .i.usp
4z y el producto R....i.usmen las consideraciones de la bioexención; 2)
para comparar el perfil de disolución entre dos productos de un fabricante dado que tienen contenidos distintos; y 3) para
SUPACdespués de la aprobación del producto. Para comparar el perfil de disolución, se debe calcular el factor de similitud f2
usando la ecuación:
donde R,y T,son el porcentaje acumulativo del fármaco disuelto en cada uno de los n tiempos seleccionados, de los produc-
tos ...R.usP4Z y .i.1•usm, respectivamente. Un valor de f2 de 50 o más (50-100) garantiza la similitud del perfil de disolu-
ción ...•usp42 y la .i.equivalencia•usm del desempeño de los dos productos . .i.la guía de la FDArecomienda que, como•usNz
mínimo, se deben usar tres puntos para la comparación del perfil de similitud, no más de 1 debe exceder del 85% •de la
cantidad disuelta declarada. •usp42 Para productos que se disuelven muy rápidamente (~85% de disolución en 15 min) no es
necesario el perfil de comparación. ,...Distintas guías tienen consideraciones un poco disímiles acerca de la aplicación de las
comparaciones del perfil de disolución dadas en la TablaA-1..i.us, 42
Agregar lo siguiente:
•INTERCAMBIABILIDAD
DE MEDICAMENTOS
AUSP42
•La intercambiabilidad de los me.dicamentos es una preocupación importante entre médicos, farmacéuticos y otras personas
que los prescriben, dispensan, o compran. La intercambiabilidad de medicamentos es una dedsion reglamentaria que requiere
la determinación de la equivalencia terapéutica. La FDAdetermina la equivalencia terapéutica de productos en los Estados Uni-
7812 (1090) Evaluación del Desempeño/ Información General USP42
dos. Deb.idoa que la formulacióny el método de fabricacióndel medicamento pueden afectar su BDy estabilidad,el fabrican-
te debe demostrar que el medicamento T es bioequivalentey TEal producto R. Losfactores que pueden afectar el desempeño
del producto y, por ende, la intercambiabilidaddel producto final incluyen:
• Forma sóliday tamaño de partículadel fármaco
• Diferenciasentre los excipientesen la formulación
• Diferenciasen el proceso de fabricación..usp42
..FORMASÓLIDAY TAMAÑODE PARTÍCULA

..usm
..Como resultado de la vía de síntesisy del método de purificación,el fármaco puede tener tamaños de partículao formas
sólidasdistintas. Lasdistintasformas sólidas,cristalinaso amorfas, pueden disolversea distintasvelocidadesy, por lo tanto, el
grado de absorcióny BDde estas sustanciasa partir de la mismaforma farmacéutica, p. ej. tableta oral, pueden ser diferentes.
Por ejemplo, las estructurascristalinasson más estables termodinámicamente en comparación con las formas amorfasy, en
consecuencia,puede que se disuelvande manera más lenta. Distintospolimorfos,hidratos o sales del fármaco pueden tener
también distintas propiedades fisicoquímicas.Estasdistintasformas del fármaco pueden tener distintassolubiHdadesacuosas a
pueden disolversea distintasvelocidades.Eltamaño de partículao la distribucióndel tamaño de partículadel fármaco también
pueden afectar la velocidadde disolución.Un fármaco que tenga una .distribucióndel tamaño de partícula con un número
grande de partículasmuy finas puede disolversemás rápido y llevara una absorciónsistémicaque sea más rápida que aquella
para una distribucióndel tamaño de partículas.con partículasmás grandes...usp42
•DIFERENCIAS
ENTREEXCIPIENTES
..USP42
..Unaforma farmacéuticaestá formada típicamente de excipientesy fármaco(s).Un excipientees cualquiercomponente,
distinto del fármaco, agregado intencionalmentea la formulaciónde una forma farmacéutica. Losexcipientes,que pueden no
tener actividadfarmacodinámica,cumplen un rol críticoen la fabricación,estabilidady desempeño. Losexcipientesse fabrican
para cumplir con las normas farmacopeicasde calidad. Sin embargo, las propiedades físicasy químicasde los excipientesafec-
tan el desempeño de una forma farmacéuticaterminada al menos tanto como las propiedades físicasy químicasdel fárma-
co...usP<2
..PROCESODE FABRICACIÓN
..USP42
..Lasvariacionesen el proceso de fabricaciónpueden tener un efecto drástico en el desempeño del medicamento. Elmezcla-
do, tamizado, fuerza de compresión, precompresión o granulacióny recubrimientoson operacionesde fabricaciónque pue-
den afectar el desempeño del producto. Laintercambiabilidadpuede verse afectada debido a la operación de fabricación,que
es una consideracióntan importante como el control de la forma del fármaco y las propiedades de los excipientesusados en la
formulación.•us, 42
BIOEXENCIÓN
Eltérmino "bioexención"se aplica a un proceso de aprobación reglamentariacuando la solicitud(expediente) se aprueba
basándose en una evidenciade equivalenciadiferente a la prueba de BEin vivo. Para formas farmacéuticassólidasorales, la
evidenciade equivalenciase determina basándose en una comparación del perfilde disoluciónin vitro entre los produc-
tos .. T• usP<lY ..R..usP<2·
.. .. USP42
Bioexención Basada en la Proporcionalidad de la Forma Farmacéutica
Cuando se efectúa un estudio de BEde dosis única en ayunas para el contenido designado del medicamento (por lo general
el más alto), se puede eximirdel requisitode efectuar estudios de BEin vivo adicionalespara los contenidos más bajos del
mismo producto, siempre y cuando el contenido más bajo: 1) se presente en la mismaforma farmacéutica;2) sea proporcio-
nalmente similaren sus ingredientesactivos e inactivos;3) tenga el mismo mecanismode liberacióndel fármaco (para produc-
tos de liberaciónprolongada); 4) cumpla con un criterioapropiado de comparación del perfilde disoluciónin vitro
(..p.e¡.,..usP42f1 ~50); y 5) tanto los contenidos más bajos como los más altos estén dentro del intervalofarmacocinéticolineal.
USP42 InformaciónGeneral/(1090) Evaluacióndel Desempeño7813
BioexenciónBasadaen el Sistemade ClasificaciónBiofarmacéutica
"El BCSproporciona una plataforma reglamentaria para reemplazar ciertos estudios de BEcon pruebas de disolución in vi-
tro ... usP42
El BCS " .. usm tiene en cuenta tres factores importantes que rigen la velocidad y el grado de absorción del fármaco a
partir de formas farmacéuticas de liberación inmediata. "Estos incluyen la solubilidad acuosa y la permeabilidad intestinal del
fármaco en conjunto con la disolución de la forma farmacéutica. Para el propósito de la clasificación, estas propiedades se eva-
lúan y categorizan en niveles bajos o altos ... usP42 De acuerdo con la solubilidad y la permeabilidad de la forma farmacéutica, el
fármaco se ,.i.categoriza en distintas,.u 5, 42 clases:
• Clase 1: alta solubilidad, alta permeabilidad
• Clase 2: baja solubilidad, alta permeabilidad
• Clase 3: alta solubilidad, baja permeabilidad
• Clase 4: baja solubilidad, baja permeabilidad
"La clasificación de la solubilidad de un fármaco, como alta o baja, depende de la dosis del medicamento. La FDAdefine un
fármaco como altamente soluble "cuando el contenido de la dosis más alta se disuelve en 250 mL o menos de un medio acuo-
so en el intervalo de pH 1,0-6,8" 0fer FDAGuidancefor lndustry: Waiverof In VwoBioavailabilityand Bioequivalence Studiesfor
lmmediate-Release So/idOral DosageFormsBasedon a Biopharmaceutics ClassificationSystem(Diciembre 2017) (buscar por el
título del documento; http: / /www.fda.gov/). Sin embargo, la EMAusa la dosis unitaria más alta administrada y la OMS usa
la dosis terapéutica más alta aprobada por una autoridad competente, típicamente definida por el etiquetado del producto
innovador.
La clasificación de permeabilidad del fármaco como alta o baja difiere entra la FDA,la OMS y la EMA.La FDAindica que un
fármaco es altamente permeable cuando el grado de absorción es 90% o más de una dosis administrada en ausencia de evi-
dencia de inestabilidad en el tracto gastrointestinal. La OMS considera que un fármaco (IFA)es altamente permeable cuando el
grado de absorción es 85% o más de una dosis administrada. Según la EMA,la absorción completa se establece cuando el
:grado de absorción es :?:85%y también indica que, por lo general, la absorción completa se relaciona con una permeabilidad
alta. La FDA,OMS y EMAutilizan el balance de masa o la comparación contra una dosis intravenosa de referencia (EMA:BD
absoluta) para que ayude a sustentar la declaración del grado de absorción.
Los requisitos de la FDApara bioexención basada en BCS se aplican a medicamentos de liberación inmediata cuando el fár-
maco es de Clase 1 del BCSy los productos R y T se disuelven rápidamente (no menos de 85% en no más de 30 min) o de
Clase 3 del BCS, donde R y T se disuelven muy rápidamente (no menos de 85% en no más de 15 min) y contienen los mismos
excipientes. Los productos T y R deben ser equivalentes farmacéuticos y presentar perfiles de disolución similares. La bioexen-
ción de la FDAexcluye productos de liberación inmediata con índice terapéutico estrecho o que están diseñados para absor-
berse en la cavidad oral. Los requisitos de la EMApara bioexención basada en el BCS se aplican a medicamentos orales sólidos
de liberación inmediata que se considere que no tienen índice terapéutico estrecho. Se pueden considerar compuestos de Cla-
se 1 y 3 del BCS. Los productos Ty R deben contener un fármaco idéntico, pero se aceptan distintas sales siempre y cuando
estén dentro de la Clase 1 del BCS. Para fármacos de Clase 1 del BCS, la disolución in vitro es muy rápida (es decir, >85% en
15 min) o similarmente rápida (es decir, 85% en <30 min y con perfiles de disolución similares). Para fármacos de Clase 3 del'
BCS, la bioexención requeriría disolución in vitro muy rápida para ambos productos Ty R. Los exdpientes que podrían afectar
la BD son los mismos y otros excipientes son cualitativamente similares y están presentes en cantidades similares.
Los requisitos de la OMS para la bioexención basada en BCSse aplican a los fármacos de Clase 1 y Clase 3 del BCS. Para
fármacos de Clase 1 del BCS, los productos 7 y R deben disolverse rápidamente y demostrar perfiles similares de disolución.
Para fármacos de Clase 3, la disolución in vitro debe ser muy rápida. Se requiere la misma composición de excipientes para los
productos farmacéuticos 7 y R... usm
El uso del BCS se ha convertido en un medio para documentar la BEsin efectuar un estudio in vivo; ver la guía de la FDA
titulada Guidancefor lndustry: Waiverof In VivoBioavailabilityand Bioequivalence Studiesfor lmmediate-Release So/idOral Dosage
FormsBasedon a Biopharmaceutics ClassificationSystem"(Diciembre 2017),.usP42(buscar por el título del documento; http://
www.fda.gov/).
Los estudios de disolución in vitro se llevan a cabo por lo general por el método de la canastilla a 100 rpm o por el método
de la paleta a 50 rpm [ver la guía de la FDAcitada anteriormente "Y la guía de la EMA, Guide/ineon the lnvestigationof Bioequi-
va/ence(201 0)J,.u5, 42 o 75 rpm "[la guía de la OMS, Annex 7: Multisource(Generic)PharmaceuticafProducts:Guidelineson Regis-
tration Requirements to Estabfishlnterchangeabifity,WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Products: In-
forme cuadragésimo. OMS: Ginebra, 2006: Annex 7 WHO Technical Report Series, No. 937). TRS 992J,.u5, 42 (buscar por el títu-
lo del documento; http://www.who.int/en/) en 900 mL de medio a pH 1,2; 4,5 y 6,8. Sobre la base de la velocidad de disolu-
ción, las formas farmacéuticas de dosificación se clasifican como: 1) de disolución muy rápida "(FDA, EMAy OMS), ,.u5, 42 si el
85% o más del "contenido declarado en la etiqueta,.u 5, 42 se disuelve en 15 min o menos, o 2) de disolución rápida, si el 85%
o más del ,,.contenido declarado en la etiqueta•usp42 se disuelve en 30 min. ,,.•usp42
Para la bioexención, las pruebas de disolución se deben efectuar para ambos productos "7 .. usp42 y "'R,.u5, 42 bajo las mismas
condiciones de análisis. Para que el producto genérico califique para la bioexención, el producto •"'R,.usP<l debe pertenecer a la
misma clase de BCSy cumplir con los criterios de comparación del perfil de la disolución. Basándose en la clasificación del BCS
y en la comparación del perfil de disolución, las autoridades reguladoras pueden considerar la bioexención siempre y cuan-
do" ,.u5p42 se cumplan los criterios de similitud del perfil de disolución "'(TabfaA-1).,.usm
7814 (1090) Evaluación del Desempeño / InformaciónGeneral USP42
DISOLUCIÓN COMO UNA PRUEBADE CONTROL DE CALIDADY •COMO UNA PRUEBADE EQUIVALENCIAIN VITRO.•usp42
Existe una clara diferencia entre la disolución como una prueba de control de calidad y como una prueba de • •usp42 equiva-
lencia in vitro. Para las formas farmacéuticas de liberación inmediata, la prueba de control de calidad involucra una prueba de
disolución de un solo punto en un solo medio (por lo general, una prueba farmacopeica). Por otra parte, la prueba de equiva-
lencia in vitro • •usp42 involucra la comparación del perfil de disolución a pH 1,2; 4,5 y 6,8 entre el producto T y el producto R.
APÉNDICE
Comparaciones entre FDA, EMA y OMS
Tabla A-1. Comparación de los Enfoques de Bloexenclón Basada en BCS

FOA EMA OMS
Se debe considerarcomo máximo 1
tiempo de muestreo después de
haber alcanzado el 85% de disolu-
ción de la referencia(producto
comparador). En casos en los que
Un mínimode 3 tiempos de mues- no se pueda alcanzarel 85% de
Solo se debe consideraruna medi- .treo (excluyendoO)y no más de 1 disolución,la disoluciónse realiza-
ción después de la disolucióndel valor medio de >85% disueltopa- rá hasta llegar a una asíntota (me-
Condicionespara el cálculof, 85% de ambos productos. ra cualquierade las formulaciones. seta).
Requisitos t,?. 50 sos f,s 100 50Sf 2 S 100
No menos de 85% de la cantidad
No menos de 85% en 15 min >85% de la cantidad declarada se declarada se disuelveen 15 min
:(usandoel método de acuerdo disuelveen 15 min (usando el mé- (usando el método de acuerdo
De muy rápida disolución con la guía) todo de acuerdo con la guía) con la guía)
?.85% de la cantidad declarada se No menos de 85% de la cantidad
?.85% de la cantidad declarada se disuelvedentro de 30 min (de for- declarada se disuelveen 30 min
disuelveen 30 min (usando el mé- ma similarmenterápida) (usando (usando el método de acuerdo
De rápida disolución todo de acuerdo con la guía) el método de acuerdo con la guía) .conla guía)
Productosfarmacéuticosde Clase 1
del BCSy de muy rápida disolu-
ción o similarmenterápidos. Los
Elproducto farmacéutico(Ty R)de ·excipientesque podrían afectar la
Clase 1 del BCSse disuelverápida- BDson cualitativay cuantitativa-
mente, y T no contiene excipien- mente iguales.Productosfarma-
tes que afectaríanla velocidady el céuticosde Clase 3 del BCSy de
grado de absorcióndel fármaco. El muy rápida disolucióny los exci-
producto farmacéutico(Ty R)de pientes que podrían afectar la BD Clase 1 BCS:Ty Rson de muy rápi-
Clase3 del BCSse disuelvemuy son cualitativay cuantitativamente da disolucióno de disoluciónsimi-
.rápidamente,y T es cualitativa- iguales,y otros excipientesson larmente rápida,
mente muy similaren composi- cualitativamenteigualesy cuanti- Clase 3 de BCS:Ty Rson de muy
Bioexención .ción a R. .tativamente muy similares. rápida disolución•
Aparato 1 de la USP Canastilla Canastilla
Aparato Aparato 2 de la USP Paleta Paleta
ÁcidoclorhídñcoO,1 N o fluido
gástrico simulado(FGS)(sin enzi-
mas) pH 1,2 (ácido clorhídricoO,1 N o Soluciónamortiguadora de pH 1,2
Soluciónamortiguadorade pH 4,5, FGS) Soluciónamortiguadora de pH 4,5
Soluciónamortiguadorade pH 6,8 Soluciónamortiguadora de pH 4,5 :(soluciónamortiguadorade aceta-
o fluidointestinalsimulado(FIS) Soluciónamortiguadora de pH 6,8 to)
(sin enzimas) o FIS Soluciónamortiguadora de pH 6,8
Para cápsulasy tabletas con recubñ~
miento de gelatinase pueden usar No se permite la adiciónde agentes Esprefeñble el uso de soluciones
fluidosgástricose intestinalessi- tensoaétivos.Se permite el uso de amortiguadorasde la farmacopea
Mediosde disolución muladas (con enzimas)USP. enzimaspara cápsulasde gelatina. internacional
Volumen 500 ml o menos 900 ml o menos ,900 mLo menos
Temperatura '37 ± 0,5° 37± 1° '37º
USP42 InformaciónGeneral/ (1090) Evaluacióndel Desempeño 7815
Tabla A-1. Comparación de los Enfoques de Bloexenclón Basada en BCS(Continuación}

.FDA EMA OMS
Aparato 1 : 100 rpm
Aparato 2: 50 rpm (o 75 rpm
cuando se justifique apropiada- Canastilla: 100 rpm Canastilla: 100 rpm
Agitación mente) Paleta: 50 rpm Paleta: 75 rpm
Número muestra 12 12 12
Número suficiente de intervalos, p.
Tiempo de muestreo ej., 10; 15; 20 y 30 min 10; 15; 20; 30; 45 min 10; 15; 20; 30; 45; 60 min
.j.LJSP42
•Tabla A-2•• u,p4 , Comparación de las Definiciones de la FDA, la "EMA '"P•' y la OMS
Término FDA OMS
Los medicamentos se consideran
equivalentes farmacéuticos si con-
tienen los mismos ingredientes ac-
tivos, se presentan en la misma Los productos son equivalentes far-
forma farmacéutica, tienen la mis- macéuticos si contienen la misma
ma vía de administración y son cantidad molar del mismo o los
idénticos en contenido o concen- mismos ingredientes farmacéuti-
tración. Los medicamentos farmacos activos "'(IFA),.usp42 en la mis-
céuticamente equivalentes están • Los productos medicinales son ma forma farmacéutica "';...uSP4l si
formulados para contener la mis- equivalentes farmacéuticos si con- cumplen con estándares compara-
ma cantidad del ingrediente activo .tienen la misma cantidad de la bles·"' •usp42 y si están destinados
en la misma forma farmacéutica y misma o de las mismas sustancias a ser administrados por la misma
para cumplir con las mismas nor- activas en las mismas formas far- vía. La equivalencia farmacéutica
mas farmacopeicas u otras normas macéuticas que cumplen con es- no necesariamente implica equiva-
pertinentes (contenido, calidad, tándares comparables o iguales. La lencia terapéutica (TE), •puesto
pureza e identidad), pero pueden equivalencia farmacéutica no ne- que,. usp42 las diferencias de
diferir en características como for- cesariamente implica bioequiva- las •propiedades del estado sólido
ma, configuración de las ranuras, lencia porque las diferencias en los del IFA,los.• usp42 excipientes y/o
mecanismos de liberación, envasa- excipientes y/o en el proceso de los procesos de fabricación
do, excipientes, fecha de caduci- fabricación pueden llevar a una di- y "'•USP<l otras variables pueden
dad y, dentro de ciertos límites, solución y/o absorción más rápida llevar a diferencias en el desempe-
Equivalentes Farmacéuticos etiquetado. o más lenta.,. usp42 ño del producto.
Los productos son alternativas far-
macéuticas si contienen la mis-
ma • •usP4l entidad farmacéutica
activa, pero difieren en la forma de
dosificación (p. ej., tabletas en vez
de cápsulas)•, contenido,.u 5p42
y/o forma química (p. ej., diferen-
Los medicamentos se consideran al- tes sales o ésteres). Las alternativas
ternativasfarmacéuticassi contie- "'Productos medicinales que contie- farmacéuticas liberan la misma en-
nen la misma entidad o parte tera- nen distintas sales, ésteres, éteres, tidad o parte activa por la misma
péutica, pero presentan diferentes isómeros, mezclas de isómeros, vía de administración,pero no son
sales, ésteres o complejos de esta complejos o derivados de la parte equivalentes farmacéuticos. Pue-
entidad o son formas farmacéuti- activa, o que difieren en la forma den ser o no bioequivalentes o TE
Alternativas Farmacéuticas cas o contenidos diferentes. farmacéutica o contenido. ,''°•2 al producto comparador.
7816 (1090) Evaluación del Desempeño/ Información General USP42
42 y la OMS (Continuación)
.. Tabla A-2.,.u,p4 , Comparación de las Definiciones de la FDA, la .lEMA,.usp
Término FDA .lEMA,.u,p42 OMS
.. Un producto medicinales un
.equivalenteterapéutico de otro
producto si contiene la misma sus-
tancia activa o entidad terapéutica
'f clínicamentepresenta la misma
.eficaciay seguridad que la de di-
cho producto, cuya eficaciay se-
guridad han sido establecidas.En
la práctica, la demostración de la
BEconstituye el método más apro~
piado, en general, para sustentar
la equivalenciaterapeutica entre
productos medicinalesque sean
equivalentesfarmacéuticoso alter-
nativasfarmacéuticassiempre que
contengan excipientesque se co-
nozca que, en general, no afectan Dos medicamentos se consideran
la seguridady eficaciay cumplen equivalentesterapéuticos si son
con los requisitosdel etiquetado equivalentesfarmacéuticoso alter-
con respecto a otros excipientes. nativasfarmacéuticasy después de
Sin embargo, en algunos casos la administraciónde la misma do-
donde se observa un grado de ab- sis molar, sus efectos, con respecto
sorciónsimilar,pero distintasvelo- a la eficaciay seguridad, son esen-
Losmedicamentos se consideran cidades de absorción, los produc- cialmente iguales cuando se admi-
equivalentesterapéuticos solo si tos pueden juzgarse como equiva- nistran a los pacientes por la mis-
son equivalentesfarmacéuticosy si lentes terapéuticos si las diferen- ma vía en las condicionesespecifi-
se puede esperar que tengan el cias no son terapéuticamente rele- cadas en el etiquetado. .lEsto se
mismo efecto clínicoy el mismo vantes. Puede ser necesarioun es- puede demostrar mediante estu-
perfilde seguridad cuando se ad- tudio clínicopara probar que las dios de equivalenciaapropiados,
ministrana pacientes bajo las con- distintasvelocidadesde absorción tales como estudiosfarmacocinéti-
diciones especificadasen el etique- no son terapéuticamente relevan- cos, farmacodinámicos,clínicoso
EquivalentesTerapéuticos tado. tes . .&.USP42 in vitro.Ji.usp4:,
Lavelocidady el grado a los cua-
les .. "usp42 la parte activa se ab-
sorbe a partir de una forma farma-
céutica y se encuentra disponi-
ble .len el sitio de acción. Usual-
mente no es posible obtener me-
didas confiablesde las concentra-
ciones de los ingredientesfarma-
céuticos activos en el sitio de ac-
ción. Sin embargo, se considera
que el fármaco en la circulación
.. Lavelocidady el grado a los cua- sistémicaestá en equilibriocon el
les un fármaco o su parte activa se fármaco en el sitio de acción. So-
libera a partir de una forma farma- bre la base de las consideraciones
céuticay se encuentran disponi- farmacocinéticasy clínicas,por lo
Estetérmino se refierea la veloci- bles en la circulacióngeneral (te- general se acepta que, en el mis-
dad y el grado a los cuales el in- niendo en cuenta que el fármaco mo sujeto, el curso temporal de la
grediente o parte activa es absor- en la circulacióngeneral está en concentración plasmática resultará
bido a partir de un medicamento y intercambio (equilibriodinámico) fundamentalmente similaral curso
queda disponibleen el sitio de ac- con el fármaco en el sitio de ac- temporal de la concentración en e(
BD(biodisponibilidad) ción. ción). '"P41 sitio de acción.,."SP4'
Dos medicamentos son bioequiva-
lentes si son equivalentesfarma-
céuticos o son alternativas farma-
,.. Dos productos medicinalesson céuticas y su BD,en términos
bioequivalentessi son equivalentes de "nivel Cm6,y tm6,•y grado de
Estetérmino describe medicamen- farmacéuticoso alternativasfarma" absorción (área bajo la curva
tos equivalentesfarmacéuticoso céuticasy si sus biodisponibilida- [ABCJ)1.usP 42 después de la admi-
alternativasfarmacéuticasque de- des después de la administracióna nistraciónde la misma dosis molar
muestran una biodisponibilidad la misma dosis molar son similares bajo las mismas condicionesson
comparable cuando se estudian en tal grado que sus efectos, con similaresen tal grado que se pue-
bajo condicionesexperimentales respecto a la eficaciay seguridad, de esperar que sus efectos sean
MedicamentosBioequivalentes similares. son esencialmente iguales. u,p 42 esencialmente iguales.
USP42 Información General/ (1091) Etiquetado de Ingredientes Inactivos 7817
•11a blaA2- . r1rp,p eomparacon

I' ., )
de las Definiciones de Ia FDA, 1a •EMA '•U'""y 1a OMS (Confmuac1on
Término FDA ,.lEMA. IISP42 OMS
El• producto farmacéutico.i. usp41
comparador (CPP)es un producto
farmacéutico con el cual el pro-
dueto de múltiplesfuentes preten-
de ser intercambiableen la prácti-
Un RLD[21 CFR314.94(a)(3)]es ca clínica.Elproducto comparador
un medicamento listado identifica- normalmente será el producto in-
do por la FDAcomo el producto •un producto medicinalde refe- novador para el cual se han esta-
farmacéutico en el cual se sustenta renda es un producto medicinal blecido la eficacia,la seguridad y
el solicitanteal buscar la a proba- autorizado bajo el Artículo6, de la calidad. Laautoridad reguladora
ción de su solicitudde registro conformidad con las disposiciones generalmente hace la seleccióndel
(ANDA,AbbreviatedNew Drug del Artículo8 {DirectivaCE producto comparador a nivelna-
• Producto farmacéutico R . "'°" Application). 2001/83/CE) '"º" cional.
·• Un producto medicinal_genérico
que tiene la misma composición
cualitativay cuantitativade sustan~
cias activasy tiene la misma forma
farmacéuticaque el producto me-
dicinalde referenciay cuya BEcon
.elproducto medicinalde referen-
cia ha sido demostrada mediante
estudios de BDapropiados. Las
distintas sales,ésteres, éteres, isó-
meros, mezclasde isómeros,com-
piejos o derivados de una sustan-
cia activa se consideran como la
misma sustanciaactiva, a menos
que sus propiedades difieransigni-
ficativamentecon respecto a la se-
guridad y/o eficacia.En tales ca-
sos, el solicitantedebe proporcio-
nar informaciónadicionalque
pruebe la seguridad y/o eficaciadi!
las sales, ésteres o derivados de
una sustancia activa autorizada.
Un producto genérico es aquel que las distintasformas farmacéuticas
es terapéuticamente equivalente al orales de liberacióninmediata se
RLDy pretende ser intercambiable consideran como una y la misma •ver Medicamentos de Múltiples
• Producto farmacéutico T,. s,4 , con el producto innovador. forma farmacéutica. '""<' Fuenteso Multífuentes... u,.4 ,
Productosfarmacéuticamente equi-
valentes o productos farmacéutica-
mente alternativosque pueden ser
o no equivalentesterapéuticos.
Losmedicamentos de múltiples
Medicamentosde MúltiplesFuentes fuentes que son equivalentestera-
o Multifuentes péuticos son intercambiables.
Un medicamento intercambiable
es •aque1.i.usp42 que es terapéuti-
camente equivalente a un produc-
to comparador y puede intercam-
biarse con este en la práctica clíni-
Medicamento Intercambiable ca.
(1091) ETIQUETADODE INGREDIENTESINACTIVOS
Este capítulo informativo proporciona guías para el etiquetado de ingredientes inactivos presentes en formas farmacéuticas.
En los últimos años, varias asociaciones comerciales que representan a fabricantes de productos farmacéuticos han adoptado
guías voluntarias para dar a conocer los ingredientes inactivos y cómo declararlos en la etiqueta. Esta práctica resulta útil para
los individuos sensibles a sustancias particulares y que desean confirmar la presencia o la ausencia de esas sustancias en pro-
ductos farmacéuticos. Debido a la actividad de estas asociaciones, en la actualidad se considera una buena práctica farmacéuti-
ca a la declaración de los ingredientes terapéuticamente inactivos en las etiquetas.
7818 (1091) Etiquetado de Ingredientes Inactivos/ Información General USP42
Aunque los fabricantes representados por estas asociaciones producen la mayoría de los productos vendidos en los Estados
Unidos, no todos los fabricantes o compañías que se dedican al reenvasado o al etiquetado, dentro o fuera de los Estados Uni-
dos, son miembros de estas asociaciones. Además, existen algunas diferencias entre las guías de las diferentes asociaciones. Las
guías presentadas aquí están diseñadas para ayudar a promover la uniformidad en el etiquetado.
En conformidad con las buenas prácticas farmacéuticas [NOTA-para los requisitos referentes a preparaciones parenterales y
tópicas, ver Advertenciasy RequisitosGenerales,5.20.20 SustanciasAgregadas(Excipientese Ingredientes)en ProductosOficiales]
todas las formas farmacéuticas deben declarar en la etiqueta la identidad de toda sustancia agregada presente (ingredientes
terapéuticamente inactivos), entre las cuales se incluyen los colorantes, pero no saborizantes y fragancias que pueden listarse
bajo el término general "saborizantes" o "fragancias". Dicha lista debe estar en orden alfabético y debe ser distinta a la decla-
ración de identificación del ingrediente activo.
El nombre de un ingrediente activo debe tomarse de la edición vigente de una de las siguientes obras de referencia (en el
siguiente orden de precedencia): (1) la Farmacopeade los EstadosUnidoso el FormularioNacional; (2) USANy el DiccionarioUSP
de Nombresde Fármacos;(3) el CTFADiccionariode IngredientesCosméticos;(4) Códigode Químicosy Alimentos.Si un ingredien-
te no figura en ninguna de las obras de referencia mencionadas se le debe identificar por su nombre común o usual (el nom-
bre generalmente reconocido por los consumidores o profesionales del área de la salud) o, si ningún nombre común o usual
estuviera disponible, por su nombre químico u otro nombre técnico.
Un ingrediente que puede estar presente en un producto, aunque no siempre, debe ser calificado por palabras como por
ejemplo "o" o "también puede contener''.
El nombre de un ingrediente cuya identidad sea un secreto comercial puede omitirse de la lista si ésta declara: "y otros in-
gredientes". A los efectos de esta norma, se considera que un ingrediente es un secreto comercial solo si la presencia del ingre-
diente confiere a su fabricante una ventaja competitiva y significativa, y si su identidad no puede ser determinada mediante el
empleo de tecnología analítica moderna.
No es necesario enumerar un ingrediente presente en trazas en forma incidental, si no ejerce un efecto funcional o técnico
sobre el producto, a menos que se haya demostrado que causa reacciones de sensibilidad o respuestas alérgicas.
Los ingredientes inactivos deben enumerarse en la etiqueta del envase de un producto destinado para la venta sin receta,
excepto si su envase es demasiado pequeño, en cuyo caso tal información puede aparecer en otra etiqueta o dentro del empa-
que.
(1092) PROCEDIMIENTODE DISOLUCIÓN: DESARROLLO

Y
VALIDACIÓN
INTRODUCCIÓN
Propósito
El capítulo Procedimientode Disolución:Desarrolloy Validación(1092) provee un enfoque integral que abarca puntos a tener
en cuenta para el desarrollo y la validación de los procedimientos de disolución y los procedimientos analíticos que lo acompa-
ñan. El capítulo trata el uso de la automatización a través de la prueba y provee guías y criterios de validación. Asimismo, el
capítulo se enfoca en el tratamiento de los datos generados y en la interpretación de los criterios de aceptación para formas
farmacéuticas orales sólidas de liberación inmediata y modificada.
Alcance
El capítulo (1 092) trata el desarrollo y la validación de los procedimientos de disolución, con un enfoque en las formas far-
macéuticas orales sólidas. Sin embargo, muchos de los conceptos presentados pueden aplicarse a otras formas farmacéuticas y
vías de administración. Se proveen recomendaciones generales entendiendo que deben justificarse todas las modificaciones
aplicadas al aparato y a los procedimientos provistos en los capítulos generales de la USP.
La organización del capítulo (1092) sigue la secuencia de las acciones que a menudo se realizan en el desarrollo y la valida-
ción de una prueba de disolución. Las secciones se presentan en la secuencia siguiente.
1. EVALUACIÓN PREELIMINAR (PARALASETAPAS TEMPRANASDELDESARROLLO DELPRODUCTO/DESARROLLO DELMÉ-
TODO DE DISOLUCIÓN)
1.1 Compatibilidad del Filtro
1.2 Determinación de la Solubilidad y la Estabilidad del Fármaco en Diversos Medios
1.3 Selección de Medios y Volúmenes.
1 .4 Selección de Aparatos
2. DESARROLLO DELMÉTODO
2 .1 Desgasificación
14=
USP42 InformaciónGeneral/ (1092) Procedimiento de Disolución 7819
2.2 Dispositivos de Sumersión

2.3 Agitación
2.4 Diseño del Estudio
2.4.1 nempos de Muestreo
2.4.2 Observaciones
2.4.3 Muestreo
2.4.4 Limpieza
2.5 Procesamiento de Datos
2.6 Evaluación del Procedimiento de Disolución
3. COMPLEMENTACIÓNANALÍTICA
3.1 Procesamiento de Muestras
3.2 Filtros
3. 3 Centrifugación
3.4 Procedimiento Analítico
3.5 Análisis Espectrofotométrico
3.6 HPLC
4. AUTOMATIZACIÓN
4.1 Preparación del Medio
4.2 Introducción de la Muestra y nempo
4.3 Muestreo y Filtración
4.4 Limpieza
4.5 Software Operativo y Cómputo de Resultados
4.6 Desviaciones Comunes de los Procedimientos Farmacopeicos que Podrían Requerir Validación
5. VALIDACIÓN
5.1 Especificidad/Interferencia del Placebo
5.2 Linealidad e Intervalo
5. 3 Exactitud/Recuperación
5.4 Precisión
5.4.1 Repetibilidad del Análisis
5.4.2 Precisión Intermedia/Tolerancia o Fortaleza
5.4.3 Reproducibilidad
5.5 Robustez
5.6 Estabilidad de la Solución Muestra y la Solución Estándar
5.7 Consideraciones para la Automatización
6. CRITERIOSDE ACEPTACION
6.1 Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata
6.2 Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada
6. 3 Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada
6.4 Pruebas de Disolución Múltiples
6.5 Interpretación de los Resultados de la Disolución
6.5.1 Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata
6.5.2 Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada
6.5.3 Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada
7. REFERENCIAS
1. EVALUACIÓN
PRELIMINAR
(PARA LAS ETAPJ\STEMPRANASDELQESARROLLO
DEL
PRODUCTO/DESARROLLO DELMETODODE DISOLUCION)
Antes de poder comenzar con el desarrollo del método, es importante caracterizar la molécula de modo que el filtro, el me-
dio, el volumen del medio y el aparato puedan seleccionarse de manera apropiada para evaluar el desempeño de la forma
farmacéutica.
1.1 Compatibilidad del Filtro
La filtración es una etapa clave en la preparación de muestras para obtener resultados de prueba exactos. El propósito de la
filtración es eliminar fármacos y excipientes no disueltos de la solución retirada. Si no se eliminan de la solución muestra, las
partículas del fármaco continuarán disolviéndose y pueden sesgar los resultados. Por lo tanto, generalmente es necesario filtrar
las muestras de disolución y se debe hacer inmediatamente si el filtro no está colocado en la cánula.
La filtración también elimina excipientes insolubles que de otro modo podrían interferir con la conclusión analítica. La selec-
ción del material apropiado del filtro es importante y se debe realizar, y justificar a través de experimentos, en las etapas tem-
pranas del desarrollo del procedimiento de disolución. Las características importantes a tener en cuenta al seleccionar el mate-
-,
7820 (1092) Procedimiento de Disolución / Información General USP42
rial del filtro son el tipo, el tamaño del filtro y el tamaño de poro. Puede ser necesario reconsiderar en tiempo posterior la selec-
ción del filtro basada en la evaluación durante las etapas tempranas del desarrollo del procedimiento de disolución. Además, se
debe tener en cuenta la recalificación después de aplicar un cambio en la composición del medicamento o cambios en la cali-
dad de los ingredientes (p. ej., tamaño de partícula de la celulosa microcristalina).
Los ejemplos de filtros usados en el análisis de disolución pueden incluir filtros de cánula, discos de filtro o material sinteriza-
do, puntas de filtro o filtros para jeringas. El material del filtro tiene que ser compatible con los medios y el fármaco. Los tama-
ños de poro comunes van de 0,20 a 70 µm; sin embargo, se pueden usar filtros con otros tamaños de poro según se requiera.
Si el tamaño de partícula del fármaco es muy pequeño (p. ej., micronizado o nanopartículas), puede ser complicado encontrar
un filtro con un tamaño de poro que excluya estas partículas pequeñas.
Es posible que ocurra la adsorción de fármacos en el filtro, por lo que ésta debe ser evaluada. Los materiales del filtro interac-
tuarán con los medios de disolución para influir en la recuperación de los solutos individuales y deben tenerse en cuenta para
cada caso. Los diferentes materiales de filtro presentan distintas propiedades de unión al fármaco. El porcentaje de pérdida de
fármaco a partir del filtrado debido a la unión puede depender de la concentración del fármaco. Por lo tanto, se debe evaluar
la interferencia de la adsorción en soluciones muestra a diferentes concentraciones cubriendo los extremos del intervalo de
concentración esperado. Cuando la adsorción de fármaco es saturable, desechar un volumen inicial de filtrado puede permitir
la recolección de una solución subsiguiente que se acerque a la concentración original de la solución. Por lo regular, se pueden
encontrar materiales alternativos de filtros que minimizan la interferencia de la adsorción. Puede ser necesario humedecer pre-
viamente el filtro con el medio. Además, es importante que los lixiviables del filtro no interfieran con el procedimiento analíti-
co. Esto puede evaluarse analizando el medio de disolución filtrado y comparándolo con el medio sin filtrar.
El tamaño del filtro debe basarse en el volumen que se va a retirar y la cantidad de partículas que se van a separar. El uso de
las dimensiones de filtro correctas mejorará el rendimiento y la recuperación, y reducirá las obstrucciones. El uso de un filtro
grande para una filtración de pequeño volumen puede generar la pérdida de muestra a través del volumen muerto, mientras
que la filtración a través de filtros de tamaños pequeños requiere mayores presiones y tiempos más largos, y los filtros pueden
obstruirse rápidamente.
Los filtros usados para el Aparato 4 de la USP requieren especial atención debido a que están integrados en el proceso de
flujo. Las partículas no disueltas pueden depositarse en los filtros, creando resistencia al flujo.
En el caso de los sistemas automatizados, la selección del filtro con respecto al material y al tamaño de poro puede realizarse
de manera similar a la filtración manual. La velocidad de flujo a través del filtro y las obstrucciones pueden ser críticas en el
caso de filtros usados en sistemas automatizados. La verificación experimental de que un filtro es apropiado puede lograrse
comparando las respuestas para soluciones estándar y soluciones muestra filtradas y sin filtrar. Esto se lleva a cabo primero pre-
parando una solución estándar adecuada y una solución muestra. Por ejemplo, preparar una muestra de disolución típica en
un vaso de precipitados y mezclar vigorosamente con un mezclador magnético hasta disolver completamente la carga de fár-
maco. Para soluciones estándar, comparar los resultados de las soluciones filtradas (después de desechar el volumen apropia-
do) con los resultados de soluciones sin filtrar. Para soluciones muestra, comparar los resultados de las soluciones filtradas (des-
pués de desechar el volumen apropiado) con los resultados de soluciones sin filtrar y centrifugadas.
1.2 Determinación de la Solubilidad y la Estabilidad del Fármaco en Diversos Medios

Las características físicas y químicas del fármaco deben determinarse como parte del proceso de selección del medio de diso-
lución apropiado. Al decidir la composición del medio para el análisis de disolución, es importante evaluar la influencia de las
soluciones amortiguadoras, el pH y, de ser necesario, los diferentes surfactantes respecto a la solubilidad y la estabilidad del
fármaco. La solubilidad del fármaco por lo regular se evalúa determinando la concentración de saturación del fármaco en dife-
rentes medios a 37° usando el método de solubilidad por agitación del matraz (solubilidad en equilibrio). Para nivelar los efec-
tos iónicos potenciales entre el fármaco y las soluciones amortiguadoras usadas en los medios, se usan mezclas de ácido clorhí-
drico e hidróxido de sodio para realizar las investigaciones de solubilidad; esto es adicional a las soluciones amortiguadoras
típicas. En algunos casos, puede ser necesario evaluar la solubilidad del fármaco a temperaturas distintas a 37º (es decir, 25º).
El pH del sobrenadante transparente debe verificarse para determinar los cambios de pH durante la prueba de solubilidad.
También se pueden usar enfoques alternativos para la determinación de la solubilidad.
Los medios típicos para disolución pueden incluir los siguientes elementos (no se mencionan en orden de preferencia): ácido
clorhídrico diluido, soluciones amortiguadoras (fosfato o acetato) en el rango de pH fisiológico de 1,2-7,5, fluido gástrico o
intestinal simulados (con o sin enzimas) y agua. Para algunos fármacos, la incompatibilidad del fármaco con algunas soluciones
amortiguadoras o sales puede influir en la selección de la solución amortiguadora. La molaridad de las soluciones amortigua-
doras y de los ácidos usados puede influir sobre el efecto de solubilización y este factor puede ser evaluado.
Las soluciones acuosas (soluciones ácidas o amortiguadoras) pueden contener un porcentaje de un surfactante [p.ej. dode-
cilsulfato de sodio, polisorbato u óxido de lauril dimetilamina] para aumentar la solubilidad del fármaco. Los surfactantes selec-
cionados para las investigaciones de solubilidad deben abarcar todos los tipos de surfactantes comunes, es decir, aniónicos, no
aniónicos y catiónicos. Cuando se ha identificado un surfactante adecuado, se deben investigar diferentes concentraciones de
dicho surfactante para identificar la concentración más baja requerida para lograr las condiciones de exceso de medio. Por lo
regular, la concentración de surfactante está por encima de su concentración micelar crítica (CMC). La Tabla 1 presenta una
lista de algunos de los surfactantes usados en los medios de disolución. Los valores de CMC aproximados se proveen con refe-
rencias, cuando están disponibles. Las listas no son exhaustivas y no pretenden excluir los surfactantes no listados. Otras sus-
tandas, tales como hidroxipropil p -ciclodextrina, se han usado como aditivos de medios de disolución para mejorar la disolu-
ción de compuestos con solubilidad baja. La Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU.(FDA,por sus siglas
en inglés) mantiene una base de datos de métodos de disolución, la cual incluye información sobre los medios de disolución
que han sido usados (1). Por lo regular, la cantidad de surfactante agregado es suficiente para lograr las condiciones de exceso
de medio en el volumen deseado del medio de disolución.
Es importante controlar el grado y la pureza de los surfactantes debido a que usar grados diferentes podría afectar la solubili-
dad del fármaco. Por ejemplo, el dodecilsulfato de sodio está disponible en un grado técnico y en un grado de alta pureza.
Obtener polisorbato 80 de distintas fuentes puede afectar su aptitud al realizar el análisis por cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC,por sus siglas en inglés).
Pueden presentarse efectos de contra-iones o pH sobre la solubilidad o la estabilidad de la solución de las soluciones con
surfactantes. Por ejemplo, se forma un precipitado cuando la sal potásica para la solución amortiguadora de fosfato se usa en
una concentración de 0,5 M en combinación con dodecilsulfato de sodio. Esto puede evitarse usando la sal de fosfato de sodio
al preparar medios con dodecilsulfato de sodio.
Tabla 1. Surfactantes de Uso Común con Concentraciones Mlcelares Críticas
CMC
Surfactante (% peso/volumen) Referencia
Dodecilsulfato de sodio, lauril sulfato de sodio 0,18%-0,23% (2-4)
Taurocolato de sodio 0,2% (3)
Colato de sodio 0,16% (3)
Aniónico Desoxicolato de sodio 0,12% (3)
Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB, 0,033%-0,036%
bromuro de hexadeciltrimetilamonio) (0,92-1,0 mM) (5,6)
Catiónico Cloruro de bencetonio (Hiamina 1622) 0,18% (4 mM) (2)
Polisorbato 20 (Monolaurato de sorbitán
Polioxietileno (20), Tween 20) 0,07%-0,09% (3,7)
Polisorbato 80 (Monooleato de sorbitán
polioxietileno (20), Tween 80) 0,02%-0,08% (3,7)
Polioxil-8 glicéridos de caprilocaproilo (Labrasol) 0,01% (4)
Aceite de ricino polioxilado 35 (Cremophor El) 0,02% (8)
Éter laurílico de polioxietileno 23 (Brii 35) 0,013% (9)
No iónico Octoxinol (Triton X-100) 0,01%-0,03% (3,10)
Zwitteriónicos N-óxido de laurildimetilamina (LDAO) 0,023% (11)
Por lo regular, el medio de disolución está amortiguado; sin embargo, el uso de agua purificada como medio de disolución
es adecuado para productos con un comportamiento de disolución independiente del pH del medio. Existen diversas razones
por las podría no preferirse el agua purificada. La calidad del agua puede variar dependiendo de su fuente y el pH del agua no
está tan estrictamente controlado como el pH de las soluciones amortiguadoras. Además, el pH puede variar día a día y tam-
bién puede cambiar durante una corrida, dependiendo del fármaco y de los excipientes. No se recomienda emplear una mezc-
la de un disolvente orgánico y uno acuoso como medio de disolución; sin embargo, puede ser aceptable si existe una justifica-
ción apropiada para este tipo de medio.
Cuando se necesiten, deben llevarse a cabo investigaciones de la estabilidad del fármaco en el medio de disolución seleccio-
nado con los excipientes presentes a 37º. Esta temperatura elevada tiene el potencial de reducir la estabilidad de la solución
(degradación). La estabilidad debe permitir un tiempo suficiente para completar o repetir el procedimiento analítico. La estabi-
lidad física puede ser un motivo de preocupación cuando ocurre una precipitación debido a una reducción de la solubilidad a
temperatura ambiente o refrigerada.
1.3 Selección de Medios y Volúmenes

Cuando se desarrolla un procedimiento de disolución, una meta es tener condiciones de exceso de medio, definido como el
volumen de medio igual a por lo menos tres veces el requerido para formar una solución saturada del fármaco. Cuando la
condición de exceso de medio está presente, existirán mayores probabilidades de que los resultados de disolución reflejen las
propiedades de la forma farmacéutica. Un medio que no cumple con la condición de exceso de medio puede ser aceptable si
se justifica adecuadamente. La composición y el volumen del medio de disolución se guían por las investigaciones de solubili-
dad. Por ejemplo, es necesario justificar la selección y la concentración de un surfactante a partir de los datos de solubilidad y
de los perfiles de disolución.
El uso de enzimas en el medio de disolución está permitido según lo establece el capítulo Disolución (711) cuando la disolu-
ción no cumpla con los requisitos debido al entrecruzamiento en cápsulas de gelatina o productos con cubiertas de gelatina. El
capítulo Cápsulas-Pruebas de Disolucióny Atributosde CalidadRelacionados (1094) trata el fenómeno del entrecruzamiento y el
desarrollo del método usando enzimas. La validación debe realizarse con el método que emplea enzimas de acuerdo con la
sección 5. Validación.
7822 (1092) Procedimiento de Disolución / Información General USP 42
Otra opción es usar medios cuya composición es más cercana a la de los fluidos estomacales y del tracto intestinal. Estos
medios pueden contener ingredientes surfactantes fisiológicos, tales como taurocolatos. Los medios también pueden contener
emulsificantes (lecitina) y componentes tales como solución salina que incrementan la osmolalidad. Además, se puede mani-
pular la concentración iónica o molaridad de las soluciones amortiguadoras. Los medios están diseñados para representar el
estado alimentado y de ayuno del estómago y del intestino delgado. Estos medios pueden ser muy útiles al crear un modelo
del comportamiento de la disolución in vivo de las formas farmacéuticas de liberación inmediata, en particular aquéllas que
contienen fármacos lipofílicos, y pueden ayudar a entender la cinética de disolución del producto relacionada con la compen-
sación fisiológica de los fluidos digestivos. Se han publicado resultados para crear un modelo exitoso de la cinética de disolu-
ción, principalmente para productos de liberación inmediata. En el caso de las formas farmacéuticas de liberación prolongada
con un efecto reducido del fármaco sobre el comportamiento de la disolución, el uso de dichos medios debe evaluarse de
manera diferente. Las pruebas de desempeño in vitro no necesariamente requieren medios que generen modelos de los esta-
dos de ayuno y postprandial (12, 13).
Una etapa ácida es parte del análisis de productos de liberación retardada mediante el MétodoA o el MétodoB del capítulo
(711 ). En el caso de fármacos con una solubilidad en ácido menor al 10% de la cantidad declarada en la etiqueta o de fárma-
cos que se degradan en ácido, se compromete la utilidad de la etapa ácida en la detección de fallas en el recubrimiento, lo
cual requiere ser tratado para cada caso particular. Las soluciones posibles incluyen agregar surfactante a la etapa ácida o ajus-
tar las especificaciones.
Durante la selección del medio de disolución, se debe tener cuidado de asegurar que el fármaco es adecuadamente estable
durante todo el análisis. En algunos casos, se pueden usar antioxidantes tales como ácido ascórbico en el medio de disolución
para estabilizar al fármaco. Hay ocasiones en las que dichas acciones no son suficientes. Para compuestos que se degradan con
rapidez para formar un producto de degradación estable, monitorear el producto de degradación solo o en combinación con
un fármaco puede ser más adecuado que analizar solo el fármaco. Las técnicas espectroscópicas in situ tienden a verse menos
afectadas por la degradación en comparación con los análisis por HPLC(incluyendo UHPLCy otros enfoques de cromatografía
de líquidos).
Para el Aparato 1 (canastilla) y el Aparato 2 (paleta) farmacopeicos, el volumen del medio de disolución puede variar de 500
a 1000 ml. Por lo regular, se puede determinar el volumen requerido para la prueba de disolución para mantener las condicio-
nes de exceso de medio. En algunos casos, se puede aumentar el volumen entre 2 y 4 L, usando recipientes más grandes y
dependiendo de la concentración y de la condición de exceso de medio del fármaco; el uso de este enfoque debe justificarse.
En la práctica, el volumen del medio de disolución por lo regular se mantiene dentro del intervalo farmacopeico provisto ante-
riormente. Como alternativa, puede ser preferible cambiar a otro aparato farmacopeico, tal como un cilindro oscilante (Apara-
to 3), soporte oscilante (Aparato 7) o celda de flujo (Aparato 4). Algunas aplicaciones pueden requerir volúmenes bajos de
medios de disolución (p. ej., 100-200 mL) cuando se prefiere el uso de una paleta o canastilla. En estos casos, se puede usar
un aparato alternativo no farmacopeico (p. ej., aparato de pequeño volumen).
1.4 Selecciónde Aparatos

La elección del aparato se basa en el conocimiento que se tenga sobre el diseño de la formulación y los aspectos prácticos
del desempeño de la forma farmacéutica en el sistema de la prueba in vitro. En general, se debe seleccionar un aparato farma-
copeico.
El Aparato 1 y el Aparato 2 son los aparatos que se utilizan con mayor frecuencia para las formas farmacéuticas orales sóli-
das. Si el Aparato 1 o el aparato 2 no fuesen apropiados, se puede utilizar otro aparato oficial. El Aparato 3 (cilindro oscilante)
ha demostrado ser especialmente útil para tabletas masticables, cápsulas de gelatina blanda, formas farmacéuticas de libera-
ción retardada y productos que no se desintegran, tales como perlas recubiertas. El Aparato 4 (celda de flujo) puede ofrecer
ventajas para las formas farmacéuticas de liberación modificada y las formas farmacéuticas de liberación inmediata que contie-
nen ingredientes activos con solubilidad limitada. Además, el Aparato 4 puede resultar útil para múltiples tipos de formas far-
macéuticas tales como cápsulas de gelatina blanda, productos en forma de perlas, supositorios o formas farmacéuticas de de-
pósito, así como formas farmacéuticas de liberación prolongada tipo suspensión. ElAparato 5 (paleta sobre disco) y el Aparato
6 (cilindro rotatorio) son útiles para evaluar y analizar las formas farmacéuticas transdérmicas. El Aparato 7 (soporte oscilante)
se puede aplicar a formas farmacéuticas orales de liberación modificada que no se desintegran, stents e implantes, y a formas
farmacéuticas transdérmicas. Para formas farmacéuticas semisólidas, el aparato generalmente usado incluye la celda de difu-
sión vertical, la celda de inmersión y el aparato de celda de flujo con el inserto para formas farmacéuticas tópicas (ver el capítu-
lo Medicamentos Semisó/idos-Pruebas de Desempeño (1724)).
Se pueden realizar cambios en los aparatos farmacopeicos; por ejemplo, se puede usar una canastilla con un tamaño de ma-
lla diferente a la típica canastilla de malla 40 (p. ej., de malla 1O; 20 u 80) cuando se documenta eficientemente la necesidad
del cambio y se cuenta con datos de apoyo. Se debe tener cuidado de emplear canastillas que sean uniformes y cumplan con
los requisitos de tamaño especificados en el capítulo (711 ).
Un aparato no farmacopeico puede tener alguna utilidad si cuenta con la debida justificación, calificación y documentación
que demuestra su superioridad sobre el equipo estándar. Por ejemplo, un aparato de pequeño volumen con minipaletas y ca-
nastillas puede considerarse para productos de baja dosificación. Un frasco rotatorio o tubos para diálisis pueden ser útiles para
microesferas e implantes, vasos con cono en el fondo y celdas de flujo modificadas para formas farmacéuticas especiales, in-
cluidos los polvos y los stents.
2. DESARROLLO
DELMÉTODO
Una prueba diseñada adecuadamente debe arrojar datos que no sean demasiado variables y deben estar exentos de proble-
mas significativos de estabilidad. La gran variabilidad de los resultados puede dificultar la identificación de tendencias o efectos
referentes a los cambios de formulación. El tamaño de la muestra puede afectar la variabilidad observada. Los resultados de
disolución se definen en una guía como demasiado variable si la desviación estándar relativa (RSD, por sus siglas en inglés) es
más de 20% a los tiempos de muestreo de 1O minutos o menos y más de 10% a los tiempos de muestreo posteriores para un
tamaño de muestra de 12 (14). Sin embargo, durante el desarrollo del método, se pueden usar muestras más pequeñas, por lo
que se deberán hacer juicios apropiados. No obstante, la mayoría de los resultados de disolución presentan una variabilidad
menor. En el desarrollo de un procedimiento de disolución, se debe investigar la fuente de variabilidad y se debe intentar redu-
cirla siempre que sea posible. Las dos causas más probables de variabilidad se vinculan con la formulación en sí (p.ej, fármacos,
excipientes o proceso de fabricación) o con artefactos asociados al procedimiento de prueba (p. ej., formación de conos, table-
tas que se adhieren a la pared del vaso o a la malla de la canastilla). Con frecuencia, la observación visual ayuda a comprender
la fuente de variabilidad y si la misma prueba de disolución contribuye a dicha variabilidad. Cuando el contenido de la forma
farmacéutica no se dispersa fácilmente por todo el vaso de manera uniforme, pueden originarse resultados aberrantes. Depen-
diendo de cada caso, los problemas usualmente se resuelven cambiando los siguientes factores: el tipo de aparato, la velocidad
de agitación, el nivel de desgasificación; el tipo de dispositivo de sumersión; o la composición del medio.
Muchas causas de variabilidad pueden encontrarse en la formulación y en el proceso de fabricación. Existen ejemplos que
pueden ser fuentes de variabilidad e interferencias, tales como falta de uniformidad de contenido, inconsistencias en el proce-
so, interacciones o interferencias con el excipiente, el recubrimiento, el envejecimiento de la cubierta de la cápsula y el endure-
cimiento o ablandamiento de la forma farmacéutica en función de su estabilidad.
2.1 Desgasificación
Se debe determinar la importancia de la desgasificación del medio de disolución debido a que las burbujas de aire pueden
actuar como una barrera para el proceso de disolución si están presentes en la unidad de dosificación o en la malla de la canas-
tilla, y pueden afectar de manera adversa la confiabilidad de los resultados de prueba. Además, las burbujas pueden causar que
las partículas se adhieran a las paredes del vaso y del aparato. Las burbujas en la unidad de dosificación pueden aumentar la
flotabilidad, lo que ocasiona el aumento de la velocidad de disolución o la disminución de la superficie específica disponible
produciendo una disminución en la velocidad de la disolución. Los fármacos poco solubles son más sensibles a la interferencia
de las burbujas de aire; por lo tanto, puede ser necesaria la desgasificación al analizar estos tipos de productos. La sección
Procedimientodel capítulo (711) describe en una nota al pie de página un método de desgasificación. Los pasos típicos inclu-
yen calentamiento del medio, filtración y vacío durante un periodo corto. Otros métodos de desgasificación están disponibles
y la industria los utiliza en forma rutinaria. Una vez que se ha identificado el proceso de desgasificación adecuado, éste debe
documentarse como parte del proceso de disolución. El grado de desgasificación puede evaluarse midiendo la presión total del
gas disuelto o midiendo la concentración de oxígeno disuelto en agua. Por ejemplo, se ha determinado que una concentra-
ción de oxígeno por debajo de 6 mg/L es efectiva como marcador para la desgasificación adecuada del agua para la Prueba de
Verificación de Desempeño con el ERTabletas de Prednisona USP.
Los medios que contiene surfactantes por lo regular no se desgasifican debido a que el proceso genera espuma en exceso y,
por lo regular, el efecto del aire disuelto en el proceso de disolución se mitiga mediante la reducción de la tensión superficial
del medio. En ocasiones, puede ser efectivo desgasificar el medio antes de agregar surfactantes.
Para determinar si es necesario desgasificar un medio, se deben comparar los resultados de las muestras de disolución corri-
das con un medio no desgasificado y con otro medio desgasificado usando una técnica farmacopeica, tal como se describió
anteriormente. Si no se detecta efecto alguno por la desgasificación, este experimento puede usarse como justificación de que
la desgasificación no será necesaria en el futuro. Sin embargo, si se detecta algún efecto, entonces será necesario controlar
cuidadosamente este parámetro, por lo que será prudente caracterizar la robustez del proceso de desgasificación. El contenido
de gas disuelto de los medios desgasificados bajo presión atmosférica es inestable y presentará una tendencia a la saturación.
Las manipulaciones del medio desgasificado tales como mezclado o vertido pueden incrementar la velocidad a la que se redi-
suelven los gases atmosféricos.
2.2 Dispositivosde Sumersión
Los dispositivos de sumersión a menudo se usan para ajustar la flotabilidad de las formas farmacéuticas que, de otro modo,
flotarían durante la prueba con el Aparato 2. Cuando se usen dispositivos de sumersión, se debe proveer una descripción deta-
llada del dispositivo en el procedimiento escrito. Puede ser útil evaluar diferentes dispositivos de sumersión, reconociendo que
los dispositivos de sumersión pueden influir significativamente en el perfil de disolución de la unidad de dosificación. Al trans-
ferir el procedimiento, se deben usar los mismos dispositivos de sumersión o, si se usa un diseño distinto, se debe demostrar
que produce resultados equivalentes. Existen en el mercado varios tipos de dispositivos de sumersión. El capítulo (711) provee
una descripción de un dispositivo de sumersión armonizado en la Figurala.
Tabla 2. Dispositivos de Sumersión de Alambre con Tamaños de Cubierta de CáJsula Comunes
Tamaño de Cubierta de Cáp- Longitud del Alambre Diámetro
sula (cm) (cm) Número de Sacabocados
#0, oblonqa 12 0,8 4
#1 y#2 10 0,7 3
#3 y#4 8 0,55 2
Se puede fabricar un dispositivo de sumersión estándar usando un alambre de longitud apropiada y enrollándolo alrededor
de un cilindro. Los materiales deben ser un alambre de acero inoxidable 316, normalmente de 0,032 pulgadas/calibre 20, u
otro material inerte; y enrollar el alambre alrededor de cilindros que tengan un diámetro adecuado (p. ej., sacabocados para
tapones) un número de vueltas apropiado que se ajuste al tipo de cubierta de la cápsula. Los tamaños se presentan en la Tabla
2. Los extremos del alambre pueden curvarse para retener la cápsula dentro del dispositivo de sumersión al sumergirlos. Debi-
do a que los extremos del alambre pueden ser ásperos, puede ser necesario limarlos. Si el dispositivo de sumersión está hecho
a mano, debe documentarse el material utilizado y las instrucciones del procedimiento de construcción (p.ej. dimensiones, di-
seño, número de vueltas); si se usa un dispositivo de sumersión comercial, se debe informar el número de catálogo del provee-
dor, cuando se conozca.
Aunque los dispositivos de sumersión por lo regular se usan para mantener la forma farmacéutica en el fondo del vaso, tam-
bién se pueden usar para evitar que las formas farmacéuticas se adhieran al vaso (p. ej., tabletas recubiertas). El dispositivo de
sumersión debe ser apropiado para la forma farmacéutica; por lo tanto, un tamaño de dispositivo de sumersión podría no ser
adecuado para todos los tamaños de formas farmacéuticas. El dispositivo de sumersión no debe apretarse demasiado alrededor
de la forma farmacéutica, debido a que esto puede restringir su interacción con el medio. Por el contrario, si se enrolla dema-
siado suelto, la forma farmacéutica podría soltarse inmediatamente después de iniciar la prueba. El dispositivo de sumersión
debe ser lo suficientemente pequeño para que la cápsula no cambie su orientación dentro del dispositivo de sumersión. Se
debe tener cuidado al analizar cápsulas que presenten algo de entrecruzamiento, a fin de evitar que la cubierta pegajosa se
adhiera al fondo del vaso. En este caso, el diseño del dispositivo de sumersión armonizado provisto en la Figura la del capítulo
(711 ) ofrecerá ventajas.
2.3 Agitación
Para cápsulas o tabletas de liberación inmediata, los aparatos de uso más común son el Aparato 1 (canastillas) a 50-100 rpm
o el Aparato 2 (paletas) a 50 ó 75 rpm. Con una justificación apropiada, se aceptan otras velocidades de agitación. Por lo ge-
neral, las velocidades fuera del intervalo de 25-150 rpm para la paleta y la canastilla no son apropiadas debido a las faltas de
uniformidad del mezclado ocasionadas por un mezclado demasiado rápido o demasiado lento. Las velocidades de agitación
entre 25 y 50 rpm son generalmente aceptables para las suspensiones.
Para formas farmacéuticas que presentan la formación de conos (montículos) debajo de la paleta a 50 rpm, el cono puede
reducirse al aumentar la velocidad de la paleta a 75 rpm, reduciendo el artefacto para, de este modo, mejorar los datos. Si se
justificara, se puede emplear una velocidad de 100 rpm con el Aparato 2, especialmente para productos de liberación prolon-
gada. El aumentar o disminuir la velocidad de rotación del aparato puede justificarse si para lograr una mejor correlación in
vitro-in vivo (IVIVC,por sus siglas en inglés) los perfiles resultantes reflejan mejor el desempeño in vivo,o si los resultados del
método demuestran una mejor discriminación sin afectar adversamente la variabilidad del método.
El Aparato 3 (cilindro oscilante) puede usarse a velocidades de inmersión que van de 5 a 30 sumersiones/minuto. La hidrodi-
námica se ve influenciada por el movimiento oscilante del cilindro y el movimiento resultante de la muestra en el medio. El
movimiento oscilante del cilindro y de la malla puede ocasionar la formación de espuma si el medio contiene surfactantes. La
adición de un agente antiespumante tal como simeticona o n-octanol puede ser útil para evitar la formación de espuma por
surfactantes.
El Aparato 4 (celda de flujo) se describe en el capítulo (711) con velocidades de flujo estándar de 4; 8 y 16 mL/min. Se pue-
den usar otras velocidades de flujo para el Aparato 4 siempre que se justifique y dentro de la capacidad de la bomba para
cumplir con los requisitos del capítulo (711 ). La agitación en el Aparato 4 no solo se relaciona con la velocidad de la bomba,
sino también puede verse afectada por el diámetro de la celda. A una velocidad de flujo determinada, según se mide por el
volumen, la celda de 12 mm desarrollará una velocidad de fluido lineal mayor que la conseguida en la celda de 22,6 mm. El
Aparato 4 puede configurarse con la adición de perlas de vidrio en el cono de entrada de la celda de flujo (columna rellena) o
sin perlas de vidrio (columna abierta).
Las características del flujo de la celda de flujo se tratan en la literatura científica ( 75). La colocación de la muestra en la celda
de flujo influirá los patrones de flujo que se presenten, lo cual debe tenerse en cuenta al intentar reducir la variabilidad de los
resultados.
USP 42 InformaciónGeneral/ (1092) Procedimiento de Disolución 7825
2.4 Diseño del Estudio
La selección de la velocidad de agitación y de otros elementos del diseño del estudio para la forma farmacéutica, ya sea de
liberación inmediata o modificada, deben cumplir con los requisitos y especificaciones (es decir, aparato, procedimientos e in-
terpretación) del capítulo (711 ).
2.4.1 TIEMPOSDE MUESTREO
Para las formas farmacéuticas de liberación inmediata, la duración del procedimiento de disolución es usualmente entre 30-
60 minutos¡ en la mayoría de los casos, la especificación de un solo tiempo de muestreo es adecuada para fines farmacopeicos.
Sin embargo, para el desarrollo del método, se deben seleccionar suficientes tiempos de muestreo para una adecuada caracte-
rización de la fase ascendente y de la meseta de la curva de disolución. Los conceptos industriales y reglamentarios referentes a
la comparabilidad y desempeño del producto pueden exigir tiempos adicionales y esto también puede ser requisito para el
registro o aprobación del producto. De acuerdo con el Sistema de Clasificación Biofarmacéutica al cual se refiere en varias ins-
tancias las Guías de la FDA, los fármacos muy solubles y de alta permeabilidad formulados como productos que se disuelven
rápidamente no requieren estar sujetos a un perfil de comparación si demuestran una liberación de 85% o más del fármaco
dentro de los 15 minutos. Para este tipo de productos, será suficiente una prueba de un solo punto o una prueba de desinte-
gración. Sin embargo, la mayoría de los productos no pertenecen a esta categoría. Los perfiles de disolución de productos de
liberación inmediata por lo general presentan un incremento gradual que alcanza entre 85%-100% en un período de aproxi-
madamente 30-45 minutos. De este modo, se eligen tiempos de muestreo de disolución suficientes para caracterizar el de-
sempeño en la mayoría de los productos de liberación inmediata. Para algunos productos, incluyendo suspensiones, se puede
obtener información útil a partir de puntos anteriores, p. ej., 5-1 O minutos. Para productos de disolución más lenta, pueden
ser útiles los tiempos de muestreo superiores a 60 minutos. Los tiempos de la prueba de disolución para las pruebas farmaco-
peicas generalmente se basan en una evaluación de los datos del perfil de disolución.
Elfactor de similitud f2 puede no ser útil cuando se disuelve más del 85% a los 15 minutos. Si se va a usar el factor de simili-
tud f2, se requieren múltiples tiempos de muestreo para la prueba de disolución, con al menos dos tiempos de muestreo con
un porcentaje promedio disuelto (por lo regular para n = 12) inferior al 85% disuelto y solo un punto por encima del 85% para
ambos productos (16). Por lo tanto, puede ser útil la adición de tiempos de muestreo tempranos.
Para analizar una forma farmacéutica de liberación prolongada, se seleccionan al menos tres tiempos de muestreo para pro-
tegerse de una liberación rápida de la dosis, para definir el perfil de liberación in vitro y para demostrar que se logra la libera-
ción prácticamente completa (>80%) del fármaco. Pueden ser útiles tiempos de muestreo adicionales. Algunos criterios para la
correlación in vivo-in vitro, tales como la correlación de nivel B (de acuerdo con el capítulo EvaluaciónIn Vitro e In Vivode For-
mas Farmacéuticas(1088)), requieren la determinación experimental del tiempo para disolver el 100% de la cantidad declara-
da en la etiqueta. La selección de los tiempos de muestreo finales refleja los datos obtenidos del perfil de liberación del fárma-
co que se generan durante el desarrollo. En el caso de productos que contengan más de un ingrediente activo, se debe deter-
minar la liberación del fármaco para cada ingrediente activo.
Las formas farmacéuticas de liberación retardada por lo regular requieren especificaciones para al menos dos tiempos de
muestreo; por lo tanto, durante el desarrollo del fármaco, es importante evaluar todo el perfil de disolución. En el caso de las
formas farmacéuticas con recubrimiento entérico, la funcionalidad del recubrimiento por lo general se demuestra mediante
desafío en un medio ácido, seguido por la demostración de la disolución en un medio con un pH mayor. El capítulo (711)
provee un medio de solución amortiguadora estándar para dicha etapa del análisis, aunque se pueden usar otros medios si se
justifica. El tiempo de la etapa ácida es por lo regular 2 horas y la liberación en la solución amortiguadora es similar a las for-
mas de liberación inmediata. Para formas farmacéuticas de liberación retardada que no son con recubrimiento entérico, el es-
tablecimiento de especificaciones es diferente. A diferencia de la liberación retardada, el inicio de la liberación no está determi-
nado por el diseño experimental, que es el cambio de pH; por lo tanto, pueden requerirse especificaciones multivariadas para
definir intervalos de tiempo y sus intervalos porcentuales correspondientes.
Los puntos llamados infinitos pueden ser útiles durante los estudios de desarrollo. Para obtener un punto infinito, se aumen-
ta la velocidad de la paleta o de la canastilla al final de la corrida (después del último tiempo de muestreo) durante un periodo
sostenido (normalmente 15-60 minutos); después de transcurrido ese tiempo, se toma una muestra adicional. Aunque no se
tenga en el perfil un requisito para el 100% de disolución, el punto infinito puede compararse con los datos de la uniformidad
de contenido y puede proveer información útil acerca de las características de la formulación durante el desarrollo inicial o
acerca de las desviaciones del método.
2.4.2 OBSERVACIONES
La observación visual y los registros del comportamiento de disolución y desintegración del producto son de utilidad ya que
los patrones de disolución y desintegración pueden ser indicativos de variaciones en la formulación o en el proceso de fabrica-
ción. Una adecuada iluminación del contenido de los vasos (con debida consideración de la fotodegradación) y una buena
visibilidad en el baño son esenciales para la observación visual. La documentación de las observaciones a través de dibujos,
fotografías o vídeos puede ser instructiva y útil para quienes no pueden observar la prueba de disolución en tiempo real. Las
observaciones son especialmente útiles durante el desarrollo del método y la optimización de la formulación. Es importante
registrar las observaciones de los seis vasos para determinar si la observación se presenta en los seis vasos, o solo en algunos. Si
la prueba se lleva a cabo para ayudar con el desarrollo de la formulación, se debe proveer al formulador cualquier observación
que se considere única. Ejemplos de observaciones típicas incluyen, pero no se limitan, a lo siguiente:
1. Distribución irregular de partículas por todo el vaso. Esto puede ocurrir cuando las partículas se adhieren a las paredes del
vaso, cuando las mismas forman un cono o montículo directamente debajo del aparato (p. ej., por debajo de la canastilla
o paleta), cuando las partículas flotan en la superficie del medio, cuando las tabletas recubiertas con película se pegan al
vaso y/o cuando se forman montículos fuera del centro.
2. Burbujas de aire dentro del vaso, en el aparato o en la unidad de dosificación. Un brillo en el aparato es también una señal
de la presencia de burbujas de aire. Esta observación se haría típicamente al evaluar la necesidad de desgasificar el medio.
3. Movimiento errático o en giros de la unidad de dosificación o bien ésta es golpeada por la paleta.
4. Adherencia de las partículas a la paleta o al interior de la canastilla, lo que se puede observar al remover el dispositivo de
agitación al final de la prueba.
5. Películas o formaciones análogas, tales como sacos transparentes o gomosos, masas hinchadas rodeando el contenido de
la cápsula.
6. Presencia de partículas flotantes grandes o trozos de la unidad de dosificación, en especial en la superficie de los medios.
7. Observación de la velocidad de desintegración (p. ej., la reducción del porcentaje en tamaño de la unidad de dosificación
dentro de un cierto tiempo).
8. Desintegración compleja del recubrimiento de productos con cubierta entérica o modificada [p. ej., una apertura parcial y
separación de las partes (como sería separar la concha de una almeja) o una apertura incompleta de la cubierta] acompa-
ñada de la liberación de burbujas de aire y excipientes.
9. Si la forma farmacéutica se posa en el centro del vaso o en un costado, y, si está en un costado, si queda adherida en
dicha posición.
1O. El tiempo requerido para la disolución completa de la cubierta de la cápsula o para la desintegración de la tableta.
Las observaciones también ayudan a documentar que se ha seguido el procedimiento apropiado o, de mayor importancia,
que ha ocurrido una desviación. Los ejemplos incluyen confirmar la presencia de una forma farmacéutica en el vaso durante la
prueba o que, inadvertidamente, se encuentre más de una forma farmacéutica en el mismo vaso, o que haya caído un filtro
del muestreador automático en el vaso.
2.4.3 MUESTREO
Manual: Para el muestreo manual, usar dispositivos químicamente inertes (p. ej., jeringas poliméricas o de vidrio, y cánu-
las poliméricas o de acero inoxidable), un filtro y/o un soporte para filtro. El sitio de muestreo debe cumplir con las especifica-
ciones del capítulo (711 ). Cuando las condiciones de agitación son muy lentas, p. ej., una canastilla a 50 rpm, se debe tener
cuidado de muestrear de manera uniforme en el mismo lugar del vaso debido a que puede existir un gradiente de concentra-
ción; se debe evitar realizar un muestreo demasiado cerca del eje o de la pared del vaso. Durante el desarrollo del método, se
debe tomar una decisión con respecto a si se debe reemplazar los medios después de cada tiempo de muestreo. No se reco-
mienda reemplazar los medios debido a que la unidad de dosificación puede verse afectada durante la liberación de los me-
dios. Sin embargo, el reemplazo puede ser necesario cuando mantener las condiciones de exceso de medio represente un de-
safío. Con el reemplazo, el volumen usado en los cálculos se mantiene igual en todos los tiempos de muestreo, aunque se
extrae algo de fármaco con cada muestra, lo cual debe tenerse en cuenta para los cálculos.
Las superficies de metal pueden interactuar con la muestra. Por ejemplo, puede ocurrir adsorción en las superficies metáli-
cas, o las superficies metálicas pueden liberar iones metálicos en medios acuosos. Posteriormente, los iones podrían catalizar
las reacciones de degradación, generando artefactos durante los procedimientos analíticos. Las superficies de los elementos de
mezclado y de los seguros metálicos de jeringas pueden ser fuentes de interferencia para el muestreo exacto.
Muestreo automático: El muestreo automático se trata en la sección 4. Automatización.
2.4.4 LIMPIEZA
La evaluación del proceso de limpieza entre pruebas es importante. Los cambios de medio de disolución y/o de producto
generan la necesidad de limpieza. Los residuos de los vasos pueden afectar los resultados (p. ej., los residuos adsorbidos pue-
den disolverse y alterar las propiedades subsiguientes del medio o interferir con el análisis de muestras), por lo que la limpieza
efectiva los devolverá a un estado adecuado. Los sistemas automatizados se tratan en la sección 4.4 Limpieza.
2.5 Procesamiento de Datos

Las velocidades de disolución se calculan a partir del cambio en la concentración del fármaco en el medio de disolución.
Para procedimientos en los que se trabaja con un volumen de medio fijo, como en el caso del análisis con el Aparato 1 y el
Aparato 2 de formas farmacéuticas de liberación inmediata con un solo tiempo de muestreo, la concentración de la muestra se
multiplica por el volumen de medio para llegar a la masa de fármaco disuelto que por lo general se expresa como porcentaje
de la cantidad declarada en la etiqueta. Cuando se toman múltiples tiempos de muestreo, la cantidad total de fármaco retirada
en los tiempos de muestreo tempranos debe evaluarse y puede ser parte del cálculo de la cantidad disuelta, si se considera
importante. De manera similar, si el volumen de medio no es fijo, por ejemplo, cuando el volumen de la muestra no se reem-
plaza en el caso de productos de liberación prolongada, el cambio en el volumen de medio debe ser parte del cálculo para
tiempos de muestreo sucesivos. Las pruebas de disolución realizadas con el Aparato 4 en la configuración de circuito cerrado
con una detección in situ proveen control conveniente del volumen de medio. Para el análisis con el Aparato 4 en la configura-
ción abierta, el tiempo de prueba y la velocidad de flujo determinarán el volumen de medio usado en los cálculos de la disolu-
ción.
Los resultados de la disolución pueden evaluarse como velocidades acumulativas o velocidades fraccionales. Las velocidades
acumulativas representan la suma de toda la disolución de fármaco ocurrida durante un intervalo (Figura 1). Las velocidades
fraccionales se evalúan en un tiempo de muestreo específico o durante una parte del tiempo de prueba total (Figura 2). Por lo
regular, la velocidad de liberación se expresará como masa o porcentaje de la cantidad declarada en la etiqueta por unidad de
tiempo. Para la mayoría de las pruebas farmacopeicas de disolución, la velocidad de disolución se expresa como porcentaje de
la cantidad declarada disuelta en el tiempo de prueba indicado.
Figura 1. Ejemplo de una gráfica de disolución como proceso acumulativo. La concentración, C, es la cantidad de fármaco
liberado por volumen de medio y t representa el tiempo. Este tipo de gráfica se observa fácilmente en los sistemas de disolu-
ción de volumen constante, tales como el Aparato 1 o el Aparato 2, o el Aparato 4 en la configuración de circuito cerrado.
Figura 2. Ejemplo de una gráfica de la concentración observada de la muestra tomada durante un intervalo que es inaprecia-
blemente pequeño con respecto al tiempo del proceso general de disolución. La concentración es proporcional a la velocidad
de disolución instantánea o fracciona! (dc/dt). Este tipo de gráfica se observa fácilmente en los sistemas de disolución de flujo
constante, tal como el Aparato 4 en la configuración de circuito abierto.
Los perfiles de disolución acumulativa representan la cantidad total de fármaco disuelto a partir de la formulación con el
paso del tiempo. Cuando la disolución acumulativa se mide en un sistema de volumen constante, no es necesario aplicar nin-
guna corrección por la cantidad perdida en el muestreo. Si la muestra se retira del sistema, la cantidad consumida en el análisis
debe tenerse en cuenta en el cálculo. El muestreo recirculado con el Aparato 1 o el Aparato 2, o con el Aparato 4 en la confi-
guración de circuito cerrado (Figura 3), son ejemplos de sistemas que producirán velocidades de disolución acumulativa. Con
el Aparato 4 en la configuración abierta (Figura4), las velocidades acumulativas tienen en cuenta la cantidad total de fármaco
disuelto a lo largo del intervalo de análisis que se obtienen recolectando y analizando todo el flujo saliente de cada celda de
flujo individual. Con el Aparato 3 (Figura5), se muestrea el medio de cada tubo al final del intervalo programado y la concen-
tración analizada representa la velocidad de disolución acumulativa durante dicho intervalo.
Figura 3. Aparato 4 en la configuración de circuito cerrado.
SistemaAbierto
r+
LflJCeldade
f-v-11
flujo
~
~y'
())
V
Ll
Figura 4. Aparato 4 en la configuración de circuito abierto. La muestra puede recolectarse en fracciones, tal como se muestra
en la parte superior. El medio puede cambiarse usando reservorios sucesivos.
Formas
farmacéuticas
_, __
,
Tiempo
Figura 5. Progresión posible para un cilindro oscilante del Aparato 3. El cilindro oscilante puede moverse de vaso en vaso.
Esta característica facilita el cambio del medio de disolución y el análisis de diferentes intervalos en tubos sucesivos.
Las velocidades de disolución fracciona! a menudo se miden para un intervalo discreto. Una serie de dichas velocidades pro-
ducirá una función escalonada como el perfil de disolución. En cualquier momento, la velocidad de disolución acumulativa de
este tipo de perfil es la suma de los intervalos precedentes. Este tipo de perfil está representado por el Aparato 3 usando múlti-
ples tubos o por el Aparato 4 en la configuración de circuito abierto en la que todo el flujo de salida se recolecta y analiza
durante intervalos sucesivos.
Existen diversos métodos algebraicos y numéricos para transformar resultados de disolución acumulativos y fraccionales. Se
puede calcular la diferencia en la cantidad liberada durante tiempos de muestreo sucesivos y la velocidad de liberación prome-
dio se determina mediante la fórmula:
Resultado= (M 2 - M7)/(t 2 - t 7)
M = masa o porcentaje de la cantidad declarada en la etiqueta

t= tiempo
A medida que se reduce la diferencia de t2 a partir de t,, se puede considerar que la velocidad promedio se acerca a la veloci-
dad instantánea. Las consideraciones del muestro y las restricciones físicas para la medición de la transferencia de masa en la
interfaz de medio de la forma farmacéutica hacen que la medición de la disolución instantánea verdadera sea poco práctica
para la determinación de rutina en el laboratorio. La disolución fracciona! se mide para intervalos en los que la diferencia ente
t2 y t, es pequeña, con respecto al tiempo total de prueba. El diseño del Aparato 4 en la configuración abierta permite una
medición directa de la disolución fracciona! durante intervalos de tiempo pequeños. Por ejemplo, si se muestrea una fracción
de 4 mL del flujo de salida para el Aparato 4 que corre 16 mL/min, ya sea mediante detección in situ o fuera de línea, la canti-
dad de fármaco detectado representa la disolución que ocurre en un intervalo de 15 segundos.
La disolución combinada se ha usado en diversas monografías. El procedimiento de disolución combinada produce una ve-
locidad de liberación promedio para las unidades analizadas combinando volúmenes iguales de cada vaso o celda y analizando
únicamente una solución resultante. Debido a que este enfoque solo usa la velocidad de liberación promedio para la compara-
ción con la tabla de aceptación, se considera que el procedimiento de disolución combinada reduce la cantidad de datos dis-
ponibles de la prueba de disolución y, por consiguiente, su propio valor. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la combina-
ción de volúmenes de muestra iguales es equivalente, desde el punto de vista de los cálculos, a determinar la media aritmética
de los resultados de muestra individuales.
El uso del factor de similitud f2 en la comparación de los perfiles de disolución se trata en el capítulo • Evaluacióndel Desem-
peño e lntercambíabílidad de MedicamentosSólidosOrales-• <AFoi-may-io,gjBiodisponibilidad, Bioequivalencia y Disolución(1090).
Para la correlación con datos in vivo, se obtienen parámetros de modelos matemáticos ajustándolos a los datos de disolución
para establecer una relación funcional continua denominada correlación in vivo- in vitro (ver el capítulo (1088)).
2.6 Evaluación del Procedimiento de Disolución
El procedimiento de disolución requiere un aparato, un medio de disolución y condiciones de prueba que provean un méto-
do sensible a los cambios en los atributos críticos de calidad, pero lo suficientemente resistente y reproducible para las opera-
ciones diarias y que se pueda transferir entre laboratorios.
El procedimiento de disolución ideal no contribuirá a un grado inaceptable de variabilidad y proveerá un perfil con puntos
adecuados por debajo de una disolución del 85%. Si ocurre una disolución del 85% antes de 15 minutos, entonces podrían no
ser apropiadas las comparaciones f2 •
Existe una gran cantidad de formas de desafiar la sensibilidad del método. Una opción consiste en comparar los perfiles de
disolución de formulaciones que se fabrican intencionalmente con variaciones significativas para la variable de fabricación críti-
ca más relevante, por ejemplo, un cambio de± 10%-20% en los intervalos de estas variables. De manera similar, se pueden
usar muestras que hayan presentado estrés para demostrar la sensibilidad a los cambios en la estabilidad. Este concepto puede
usarse para establecer los factores que tienen una influencia más significativa sobre la velocidad de disolución. Dichos estudios
pueden enfocarse en los parámetros de disolución (p. ej., concentración de medio, velocidad de agitación y desgasificación) o
en los atributos del producto (p. ej., relaciones de excipientes, tamaño de partícula, compresión). El objetivo final es entender
los mecanismos de liberación y determinar si el procedimiento de disolución puede presentar cambios en los atributos de cali-
dad críticos de un medicamento.
3. COMPLEMENTACIÓN
ANALÍTICA
La etapa de disolución se ha descrito como una preparación intrincada de la muestra. La manipulación de la muestra y el
procedimiento analítico que se usan para determinar la cantidad de fármaco disuelto durante el procedimiento de disolución
se denominan "complementación analítica." Aunque las determinaciones espectrofotométricas y la HPLCson las técnicas de
uso más común y se tratan en este capítulo, se puede usar cualquier tecnología analítica adecuada. La Sección 5. Validación
describe los criterios para los métodos.
3.1 Procesamiento de Muestras
Después de que las muestras se retiran del medio de disolución, éstas pueden requerir procesamiento adicional para ade-
cuarlas a la metodología analítica que se utiliza para determinar la cantidad liberada. Por ejemplo, se puede usar filtración para
retirar partículas no disueltas o las muestras podrían requerir protección de la exposición a la luz, o requerir almacenamiento
refrigerado. Además, es posible que las muestras deban diluirse a un nivel que esté dentro del intervalo lineal del método. En el
caso de los análisis mediante HPLC,puede ser necesaria la dilución de la muestra con la fase móvil para reducir el efecto sobre
la separación al inyectar el medio de disolución. Pueden ser necesarios otros tipos de tratamientos dependiendo de la formula-
ción del producto, tal como la inactivación o eliminación de la interferencia ocasionada por los componentes de la formulación
por la adición de los reactivos apropiados. Sin embargo, la separación puede no ser posible o requerirse para todos los casos.
En algunos casos, pueden ser útiles las mediciones in situ obtenidas con métodos tales como fibra óptica o determinación elec-
troquímica.
3.2 Filtros
El tema de la filtración se trata en la sección 7.7 Compatibilidaddel Filtro.
3.3 Centrifugación
La centrifugación de muestras no es recomendable por diversas razones: la disolución puede continuar ocurriendo hasta que
los sólidos son retirados, se puede formar un gradiente de concentración en el sobrenadante, y la energía impartida puede
generar un aumento en la disolución de las partículas del fármaco. Algunas excepciones en los que podría recomendarse la
centrifugación incluyen su uso con compuestos que se adsorben en todos los filtros comunes, o casos en los que los lixiviables
y sustancias extraíbles potenciales del filtro pudieran interferir con la etapa cuantitativa de la prueba de disolución (p. ej., cuan-
do se usan procedimientos de fluorescencia en la cuantificación). La centrifugación puede demostrar su utilidad durante el de-
sarrollo del método para evaluar la aptitud del material del filtro.
3.4 Procedimiento Analítico
La valoración común para una muestra de disolución emplea un procedimiento espectrofotométrico o un procedimiento de
cromatografía de líquidos. La determinación espectrofotométrica puede ser directa o puede proveer la detección para la HPLC.
La determinación espectrofotométrica se usa a menudo debido a que los resultados pueden obtenerse con mayor rapidez, el
análisis es más simple, es más fácil de automatizar y se requieren menos disolventes. El uso de la determinación espectrofoto-
métrica directa por lo regular requiere confirmar la especificidad. La HPLCes la técnica preferida por diversas razones, por
ejemplo, provee un amplio intervalo dinámico que reduce la necesidad de diluir algunas muestras al mismo tiempo que pro-
vee sensibilidad en el análisis de muestras diluidas, además de una mayor selectividad cuando los excipientes o múltiples fár-
macos en la formulación presentan una interferencia significativa. Los sistemas modernos de HPLCemplean muestreadores au-
tomáticos que proveen ventajas de velocidad y simplicidad comparables al análisis espectrofotométrico.
3.5 Análisis Espectrofotométrico
Los análisis espectrofotométricos pueden realizarse en muestras que se introducen manualmente en las celdas. Como alter-
nativa, las muestras se pueden introducir en el espectrofotómetro en forma automática utilizando succionadores automáticos y
celdas de flujo. Los controles rutinarios de desempeño, la limpieza y el mantenimiento descritos en los correspondientes proce-
dimientos operacionales estándares o en la documentación de metrología ayudan a asegurar la operación confiable de estos
dispositivos. Generalmente se utilizan celdas cuya longitud de paso varía entre 0,02 y 1 cm, y se pueden usar cubetas con una
longitud de paso mayor para incrementar el intervalo de cuantificación de muestras diluidas. La alineación de las celdas y las
burbujas de aire pueden ser fuentes de error. La longitud de paso más pequeña de las celdas se usa para evitar la dilución de la
muestra; sin embargo, se requiere demostrar una linealidad aceptable y el error estándar.
La selección de la longitud de onda para la determinación debe basarse en el espectro del fármaco en solución. En algunos
casos, cuando el fármaco puede degradarse en el medio de disolución (p. ej., formas farmacéuticas que contienen aspirina), es
útil llevar a cabo las mediciones del punto isosbéstico. Los excipientes también pueden tener efectos, pero realizar el análisis a
diferentes longitudes de onda puede minimizarlos. La contribución de la absorbancia a partir de un excipiente a la longitud de
onda analítica se puede determinar en ocasiones mediante el cociente de su absorbancia a una longitud de onda en la que la
absorbancia del fármaco es mínima.
Mediante una complementación analítica validada, las soluciones estándar por lo general se preparan en medio de disolu-
ción y se analizan solo a una concentración, igual a 100% o al valor Q seleccionado de la concentración de la dosificación
debido a que se ha establecido la linealidad del complemento analítico. Antes de la validación, el análisis del perfil de disolu-
ción o el análisis de productos de varias concentraciones requiere usar múltiples soluciones estándar que abarquen el intervalo
de concentración esperado. Un blanco del medio típico, estándar y muestra pueden analizarse en una secuencia que compren-
da la muestra con los estándares y los blancos, especialmente al comienzo y al final del análisis. Las soluciones del estándar y
de las muestras se deben preparar en el medio de disolución en el intervalo de concentración lineal y medirse a la misma lon-
gitud de onda. Sin embargo, se pueden usar cantidades pequeñas de un disolvente orgánico en la preparación del estándar,
siempre que se puedan cumplir los criterios de exactitud durante la validación.
La absortividad se calcula dividiendo la absorbancia estándar media entre la concentración, en mg/mL, dividida por la longi-
tud de paso de la celda en cm. Un reacomodo de la expresión Beer-Lambert provee la absortividad, a, como:
a= A/be
A= absorbancia
b = longitud de paso (cm)
USP42 Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 7831
e= concentración (mg/mL)
Las unidades típicas para absortividad que se usan en el análisis de disolución están en términos de AU • mL/mg, donde AU es
la unidad de absorbancia. Los datos históricos pueden usarse para proveer un intervalo aceptable de absortividad para el anali-
to (empleando la celda con una longitud de paso apropiada). Este valor puede ser útil para corregir datos aberrantes.
El uso de fibra óptica como método de muestreo y de determinación, con validación apropiada, es una opción.
3.6HPLC
En el caso del análisis por HPLC,es necesario enumerar el efecto sobre los picos en el cromatograma que resulta de la inyec-
ción del medio de disolución. Una perturbación grande del disolvente puede afectar la exactitud y la precisión de la respuesta
cuando ésta se resuelva de manera deficiente del pico de interés, lo cual adquiere mayor importancia cuando se requieren in-
yectores de mayor volumen (> 100 µL). Las pruebas de aptitud del sistema pueden evaluar la forma del pico, la separación del
pico principal de la perturbación del disolvente y de los picos que eluyen de manera cercana, y la precisión de la inyección.
Como mínimo, la precisión se considera un aspecto crítico.
Idealmente, las soluciones estándar deben diluirse con los medios de disolución a una concentración dentro del intervalo
lineal del método, p. ej., 100%, o el valor Q seleccionado de la concentración de la dosificación. Sin embargo, se puede usar
un disolvente orgánico en la preparación del estándar, siempre que se puedan cumplir los criterios de exactitud durante la
validación. En algunos casos, la muestra pude diluirse con fase móvil para mejorar la forma del pico. Las soluciones del están-
dar y de las muestras se deben preparar en el intervalo de concentración lineal y medirse a la misma longitud de onda.
4. AUTOMATIZACIÓN
Los sistemas de disolución automatizados pueden configurarse en diversas maneras y grados. Los elementos de la prepara-
ción, inicio, muestreo y tiempo, de la prueba, además de la limpieza, pueden automatizarse. Se encuentran disponibles siste-
mas completamente automatizados, al igual que sistemas en los que las etapas individuales, tales como la preparación de me-
dios o el muestreo, están automatizadas. Esta sección tratará las etapas operativas que se pueden automatizar. El nivel de com-
plejidad de la automatización depende de si la configuración del instrumento es de circuito abierto o cerrado y también de si
el dispositivo analítico se acopla en línea o fuera de línea. El análisis en línea devuelve la alícuota de muestra al sistema de
prueba, como en el caso de la espectrofotometría con cubetas de flujo. El análisis fuera de línea elimina la alícuota de la mues-
tra del medio de disolución para el análisis subsiguiente, por lo regular mediante HPLC,en el que el análisis consume la mues-
tra. La decisión con respecto a la configuración por lo regular depende del número de muestras que se van a procesar y del
tiempo requerido para su análisis.
La automatización puede requerir desviaciones de las especificaciones farrnacopeicas de los instrumentos, tales como incor-
porar una salida integrada en la parte inferior del vaso para limpiar y reemplazar el medio.
Las etapas adicionales que no sean parte del procedimiento farmacopeico deben ser validadas. Las desviaciones del procedi-
miento estándar descritas en el capítulo (711 ), tales como usar sondas de muestreo o sondas de fibra óptica deben validarse
contra el procedimiento estándar.
4.1 Preparación del Medio
La preparación automatizada de medios por lo general se logra mediante la dilución de concentrados. Los sistemas automa-
tizados de preparación de medios por lo regular dispensan el volumen de medio en el vaso monitoreando el peso o el volu-
men. La estabilidad física o química de los concentrados, así como la homogeneidad de las diluciones durante el periodo de
uso previsto son aspectos importantes que deben ser entendidos. Los concentrados de las soluciones amortiguadoras y los sur-
factantes pueden tener problemas de estabilidad, tales como degradación química y cambio de pH. Se debe prevenir la inesta-
bilidad física, la cual puede presentarse como precipitación, recristalización o separación de fases.
Si se requiere la desgasificación del medio, se debe especificar el nivel de desgasificación.
La concentración del oxígeno disuelto puede usarse para evaluar la eficacia de los procedimientos de desgasificación trata-
dos en la sección 2. 1 Desgasificación.
4.2 Introducción de la Muestra y Tiempo
Las muestras deben insertarse en el vaso de una manera que sea reproducible. La introducción de muestras y el retiro de
alícuotas automatizados proveen una ventaja sobre el muestreo manual debido a que las técnicas automatizadas pueden redu-
cir la variabilidad del tiempo entre vasos de los intervalos de prueba. Sin embargo, la manipulación automatizada de muestras
puede imponer limitaciones de tiempo que deben tenerse en consideración. La tolerancia farmacopeica de ±2% del tiempo de
prueba de disolución especificado puede ser difícil de cumplir para los tiempos de muestreo tempranos.
4.3 Muestreo y Filtración

El muestreo automático es una alternativa útil al muestreo manual, especialmente si la prueba incluye varios tiempos. La
transferencia y la filtración de soluciones muestra a partir del instrumento de disolución a la unidad analítica puede realizarse
mediante conexiones de tubos o mediante dispositivos robóticos operados en un procedimiento por etapas. Es posible retirar
volúmenes de muestra del medio de disolución sin devolverlos (muestreo sin reposición) o se puede devolver el volumen de la
muestra al medio de disolución (muestreo por recirculación).
Existen muchas marcas comerciales de muestreadores automáticos, entre los que se incluyen sistemas semiautomatizados y
totalmente automatizados. Los controles rutinarios de desempeño, la limpieza y el mantenimiento descritos en los procedi-
mientos operativos estándar pertinentes o en la documentación de metrología ayudan a asegurar la operación confiable de
estos dispositivos.
Las sondas de muestreo pueden o no permanecer en el vaso durante toda la corrida. Las sondas de muestreo o las sondas de
fibra óptica pueden perturbar la hidrodinámica del vaso; por lo tanto, se debe realizar una validación adecuada para garantizar
que las sondas no causan un cambio significativo en la velocidad de disolución. Si se usan filtros diferentes a los que se usan
para el muestreo manual, dichos filtros también deben ser evaluados por separado. La posición de la zona de muestreo farma-
copeica para el Aparato 1 y el Aparato 2 es a la mitad entre la parte superior del elemento de mezclado y la superficie del
medio, y depende del volumen del medio. Las sondas de muestreo deben sacar la muestra de la zona de muestreo. Los instru-
mentos en los cuales se lleva a cabo el muestreo a través del eje hueco deben ser diseñados con un medio para ajustar la pro-
fundidad de la apertura de ingreso para permitir el cumplimiento de este requisito. El volumen de muestreo programado de-
pende del volumen muerto del sistema de tubos, cubetas y otros dispositivos y debe ser ajustado de manera correspondiente.
Se puede operar una alineación de muestreo recirculado descargando el contenido del sistema de tubos en el vaso después
de cada muestreo o permitiendo que el sistema de tubos se mantenga lleno de solución en los intervalos entre los puntos de
muestreo. En el último caso, el volumen muerto y los efectos de arrastre son aspectos importantes a considerar.
Asimismo, se debe tener en cuenta la necesidad de reemplazar el volumen de muestra. En un muestreo sin reposición con
múltiples tiempos de muestreo, el volumen retirado puede reemplazarse con un volumen igual de medio preparado reciente-
mente. El volumen de muestreo puede ser crítico si excede en total 1% del volumen declarado de medio de disolución reque-
rido por el procedimiento. Si se puede demostrar que el reemplazo del medio no es necesario, el cambio de volumen debe ser
parte del cálculo de los resultados. Ver la sección 2.5 Procesamientode Datos.
El arrastre puede ocurrir cuando muestras subsiguientes se ven afectadas por los residuos o condiciones de las muestras pre-
vias; el efecto de la primera muestra o condición "arrastra" a la segunda. En la manipulación de líquidos, los residuos de los
líquidos previamente presentes en la solución muestra pueden contaminar las soluciones muestra subsiguientes. Los medios de
disolución que contienen surfactantes o lípidos pueden presentar problemas. El arrastre puede ocurrir en muestras sucesivas
tomadas durante una prueba con múltiples tiempos de muestreo, así como al inicio de una nueva prueba debido a la solución
de limpieza. Este tema se trata en la sección 4.4 Limpieza.
La interacción del fármaco disuelto con los dispositivos de muestreo y de transferencia es un aspecto importante a conside-
rar. Cuando se presenta la adsorción del fármaco disuelto, a menudo implica las superficies del aparato de disolución o los
filtros de muestreo y el sistema de tubos. La adsorción puede depender del pH en el caso de fármacos disueltos cargados. La
adsorción del fármaco disuelto en las partes del dispositivo de muestreo debe evaluarse usando una solución muestra típica
(muestra de disolución a partir del producto o fármaco con una matriz de formulación) con una concentración conocida. El
diseño típico es una validación cruzada con alícuotas de la misma solución muestra que pasan y que rodean el dispositivo de
muestreo (incluyendo la sonda de muestreo, el filtro, el sistema de tubos, las válvulas y la bomba). No existe una recomenda-
ción general en la que se prefiera algún tipo de material o construcción del equipo (p. ej., vidrio o polímeros específicos). Ver
la sección 5.7 Consideraciones para la Automatizaciónpara más información.
Además de la información provista en la sección 2.4.3 Muestreo,las conexiones de bombas y sistemas de tubos pueden ser
fuentes de contaminación en sistemas automatizados. Las interferencias con los procedimientos analíticos espectroscópicos,
que por lo regular se usan en el análisis de disolución, generan menos preocupaciones. No obstante, las interferencias deben
evaluarse si el producto que se está investigando contiene sales de metales en bajas dosis, como en el caso de algunos suple-
mentos dietéticos.
La transferencia de líquidos por lo general se realiza mediante sistemas de tubos poliméricos. En ocasiones, no es posible
usar materiales inertes tales como politetrafluoroetileno (PTFE)debido a sus propiedades mecánicas. Cuando se requieren tu-
bos flexibles, como en el caso de bombas peristálticas o para bobinado en un radio pequeño, los materiales preferidos pueden
ser el polipropileno (PP)o el polietileno de alta densidad (HOPE, por sus siglas en inglés). Dependiendo del tipo de polímero y
su cristalinidad y densidad, puede presentarse la lixiviación de componentes, especialmente de plastificantes. Los lixiviables
pueden interferir con el procedimiento analítico. La concentración lixiviada a la solución muestra por lo regular depende de la
superficie, la temperatura, el tiempo de exposición, las condiciones hidrodinámicas y la composición de los medios.
4.4 Limpieza
Además de la información provista en la sección 2.4.4 Limpieza,los sistemas automatizados presentan cuestiones de limpieza
específicas. Por ejemplo, se recomienda evaluar la efectividad del purgado y enjuagado entre tiempos de muestreo, así como
la condición del sistema de tubos dentro de la corrida. Asimismo, es importante evaluar el proceso de limpieza entre pruebas.
4.5 Software Operativo y Cómputo de Resultados
Los sistemas de software para la evaluación de datos y la operación de instrumentos deben validarse de conformidad con el
Título 21 del CFR11 (17).
4.6 DesviacionesComunesde los ProcedimientosFarmacopeicosque Podrían RequerirValidación
Algunas áreas comunes en las que se presentan desviaciones de los procedimientos farmacopeicos incluyen lo siguiente:
• Introducción de la muestra con respecto al inicio de la rotación del vástago
• nempo de residencia y colocación de las sondas de muestreo
• Muestreo por recirculación contra muestreo sin reposición
• Reemplazo del volumen de muestra en el muestreo sin reposición.
5. VALIDACIÓN
Los temas típicos referentes a la validación se describen en esta sección, aunque tal descripción no es exhaustiva, y se pue-
den observar en el contexto del capítulo Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos (1225), así como en el documento de la
lnternational Conference on Harmonization (Conferencia Internacional sobre Armonización o ICH), Validaciónde Procedimien-
tos Analíticos(18) (disponible solo en inglés). Esta sección trata la validación de ambas partes del procedimiento de disolución,
el complemento analítico y la etapa de disolución. La etapa de disolución es la liberación del fármaco en el medio de disolu-
ción y el muestreo. El complemento analítico se define en la sección 3. ComplementoAnalítico.La validación del complemento
analítico evaluará los atributos, la linealidad y el intervalo, la precisión, la especificidad, la exactitud/recuperación, la robustez y
la estabilidad de las soluciones muestra y estándar. La validación de la etapa de disolución incluirá la evaluación de la precisión
y la robustez de la preparación de la muestra de disolución. La validación del complemento analítico se lleva a cabo usando
una solución estándar o un placebo con cantidades agregadas conocidas, o a través del método de adición estándar (cantida-
des agregadas conocidas del medicamento según lo descrito en la sección Exactituddel capítulo (1225)), según se especifica
en las secciones siguientes. La validación de la etapa de disolución requiere el uso de una forma farmacéutica bien caracteriza-
da (p. ej., que tenga una estrecha uniformidad de contenido y un desempeño uniforme. Dependiendo del parámetro de inte-
rés, la validación de la manipulación de la muestra y del procedimiento analítico puede llevarse a cabo in situ, p. ej., dentro del
vaso de disolución. Los parámetros de validación tratados y el grado de la validación pueden variar, dependiendo de la fase de
desarrollo o del uso pretendido de los datos.
Los criterios de aceptación se presentan solo como guías y pueden diferir para algunos productos. Los fabricantes deben
documentar los criterios de aceptación apropiados para sus productos en los Procedimientos Operativos Estándar pertinentes o
en los protocolos de validación. Otras consideraciones pueden ser importantes para formas farmacéuticas especiales. Los estu-
dios de validación deben realizarse en todo el intervalo de los tiempos de muestreo del perfil. En el caso de productos que
contengan más de un ingrediente activo, se debe validar el procedimiento de disolución para cada ingrediente activo. Se espe-
ra que las investigaciones sobre la aptitud del filtro y el potencial de adsorción del vidrio hayan sido realizadas con anterioridad
(ver 1.1 Compatibilidaddel Filtro).La validación de dichas evaluaciones puede realizarse durante los experimentos de recupera-
ción de cantidades agregadas conocidas.
5.1 Especificidad/Interferenciadel Placebo

Es necesario para demostrar que los resultados no están indebidamente afectados por los ingredientes del placebo, otros
fármacos activos o productos de degradación. El placebo está constituido por todos los excipientes y recubrimientos, incluyen-
do tintas y cubiertas de cápsulas cuando corresponda, sin el ingrediente activo. La interferencia del placebo puede evaluarse
usando un placebo con cantidades agregadas conocidas que se prepara pesando las muestras de la mezcla del placebo y disol-
viéndolas o dispersándolas en el medio de disolución a las concentraciones que se pueden encontrar durante la prueba, y
agregando una cantidad conocida del fármaco en solución. Puede ser preferible realizar este experimento a 37°, comparando
la solución con una solución estándar a la concentración que se espera encontrar durante el análisis, usando la fórmula:
Resultado= (A,/A5) x C5 x (VIL) x 100
A, = absorbancia del placebo
A5 = absorbancia del estándar
C5 = concentración del estándar (mg/mL)
V= volumen de medio (mL)
L = cantidad declarada en la etiqueta (mg)
La interferencia no debe exceder 2%. Se debe tomar en cuenta que para productos de liberación prolongada, puede ser
más apropiado usar una versión del placebo de la forma farmacéutica terminada que las mezclas, ya que la formulación del
placebo liberará varios excipientes de cierta manera que representará mejor al producto que una simple mezcla de excipientes.
7834 (1092) Procedimiento de Disolución/ Información General USP42
En este caso, puede ser apropiado evaluar la interferencia potencial en puntos múltiples de muestreo en el perfil de liberación,
donde la peor interferencia se espera en los puntos de muestreo más avanzados.
El blanco es el medio de disolución sin la muestra disuelta y se trata de la misma manera que la muestra. Se debe evaluar el
efecto de la absorbancia del blanco a la longitud de onda analítica. En la mayoría de los casos, la absorbancia del medio de
disolución usado como blanco puede no exceder de 1% de la solución estándar a la concentración usada para el análisis. Los
valores >1% deben evaluarse caso por caso.
Si la interferencia del placebo excede de 2%, puede ser necesario modificar el método. Las posibles modificaciones incluyen
seleccionar otra longitud de onda, restar la línea base usando una longitud de onda mayor, transformar los valores de absor-
bancia (p. ej., primera derivada) y usar una técnica analítica alternativa tal corno HPLC.Podrían aceptarse otros medios para
minimizar la interferencia del placebo si se justifican apropiadamente. Cuando están presentes otros fármacos activos o hay
niveles significativos de degradación, es necesario demostrar que estos no afectan demasiado los resultados. Un procedimiento
para lograrlo es medir la matriz en presencia y ausencia del otro fármaco activo o producto de degradación: ninguna interfe-
rencia debe exceder de 2%. Se pueden usar enfoques similares cuando se usan otras técnicas para el terminado analítico.
5.2 Linealidad e Intervalo

La linealidad se establece habitualmente preparando soluciones del fármaco, que abarcan desde una concentración inferior a
la más baja concentración esperada hasta una concentración mayor de la concentración más alta durante la liberación. Las
soluciones pueden prepararse usando una solución estándar o una solución con cantidades agregadas conocidas, o por el mé-
todo de adición de estándar. Normalmente se usa un mínimo de cinco concentraciones (ver el capítulo (1225)). En lo posible,
las soluciones normalmente se preparan a partir de una solución madre común. El intervalo de concentración no puede exce-
der los límites de linealidad del método, incluyendo el instrumento. Para mejorar la solubilidad del fármaco se pueden emplear
disolventes orgánicos en la preparación de las soluciones estándar de linealidad; sin embargo, a menos que se valide, no se
debe usar más de 5% (v/v) del disolvente orgánico en la solución final. La linealidad habitualmente se calcula utilizando un
programa de regresión de cuadrados mínimos adecuado. Típicamente, el cuadrado del coeficiente de correlación (r2 2'.O,98)
demuestra linealidad. Además, la ordenada al origen y no debe ser significativamente diferente de cero.
El intervalo del procedimiento es el intervalo entre las concentraciones superior e inferior del fármaco (incluyendo estos nive-
les) que ha demostrado tener un nivel de precisión, exactitud y linealidad adecuado usando el procedimiento tal como se des-
cribe.
5.3 Exactitud/Recuperación
La exactitud y la recuperación por lo general se establecen al preparar muestras múltiples que contengan el fármaco y cual-
quier otro ingrediente presente en la forma farmacéutica (p. ej., excipientes, materiales de recubrimiento, cubiertas de cápsu-
las) con concentraciones que varían de concentraciones menores que el rango más bajo esperado hasta concentraciones ma-
yores que las más altas concentraciones durante la liberación del fármaco. La exactitud y la recuperación se pueden lograr con-
juntamente con la determinación de la linealidad. También se puede usar el método de adición de estándar. Antes de esta
actividad, se espera que ya se haya llevado a cabo la evaluación del filtro y que también se haya investigado y descartado la
adsorción del fármaco en el vidrio.
Las soluciones individuales pueden prepararse directamente en el medio de disolución. Alternativamente, para mejorar la so-
lubilidad del medicamento, puede ser apropiado preparar una solución madre disolviendo el fármaco en una pequeña canti-
dad de disolvente orgánico (generalmente que no exceda de 5%) y diluyendo a la concentración final con el medio de disolu-
ción. Se puede usar una cantidad de solución madre equivalente a la cantidad declarada, específicamente elegida, en lugar del
fármaco en polvo. De la misma manera, en el caso de concentraciones muy bajas, puede ser más apropiado preparar una solu-
ción madre que intentar pesar cantidades muy pequeñas.
La medida de recuperación se encuentra normalmente entre 95%-1 05% de la cantidad agregada. Cuando existen múltiples
concentraciones puede ser útil emplear matrices o selección de extremos (bracketing). Un caso especial para la validación es el
procedimiento de la EtapaÁcida descrito en el capítulo (711 ), FormasFarmacéuticasde LiberaciónRetardada.Se debe validar el
límite de no más de 10%. Los experimentos de recuperación para los fármacos que tienen baja solubilidad en medios ácidos
pueden presentar desafíos o ser imposibles de realizar, y puede ser necesario tratarlos caso por caso. Si el compuesto se degra-
da en ácido, el experimento de validación debe tener en cuenta este factor.
5.4 Precisión
5.4.1 REPETIBILIDAD
DELANÁLISIS
En el caso del terminado analítico, la repetibilidad se evalúa obteniendo mediciones repetidas de las soluciones estándar y/o
de las soluciones placebo con cantidades agregadas conocidas/de adición de estándar. Se puede medir mediante el cálculo de
la desviación estándar relativa de múltiples inyecciones o lecturas espectrofotométricas para cada solución estándar o usando
la exactitud o los datos de linealidad. La guía de la ICH, Validationof Analytical Procedures:Methodology(Validación de Procedí-
mientes Analíticos: Metodología), recomienda evaluar la repetibilidad usando un mínimo de nueve determinaciones que abar-
quen el intervalo especificado para el procedimiento (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada
concentración) o usando un mínimo de seis determinaciones al 100% de la concentración de prueba. Un criterio de acepta-
ción típico es una desviación estándar relativa de <2%. La demostración de la repetibilidad para la etapa de disolución se lleva
a cabo realizando la etapa de disolución en unidades separadas de una forma farmacéutica bien caracterizada o de un com-
puesto equivalente.
5.4.2 PRECISIÓNINTERMEDIA/TOLERANCIA
O FORTALEZA
Si se asume que el factor que más contribuye a la varianza proviene de la etapa de disolución, se puede evaluar la precisión
intermedia para determinar los efectos de los eventos aleatorios sobre la precisión del procedimiento de disolución. Normal-
mente, esta evaluación se realiza en una etapa avanzada del desarrollo de la forma farmacéutica y es necesaria para la valida-
ción completa del método. Para muchos procedimientos analíticos, la precisión intermedia por lo regular se evalúa determi-
nando las contribuciones a la varianza y, posiblemente, mediante una comparación de medias. Para la evaluación de la preci-
sión intermedia, se recomienda el uso de un diseño experimental de matriz debido a que pueden observarse efectos de la inte-
racción con mayor claridad en comparación con un experimento con una sola variable. En el análisis de disolución, a menudo
se adopta un enfoque de tolerancia o fortaleza que compara por sí mismo las medias para investigar los factores que contribu-
yen a la precisión intermedia. La tolerancia o fortaleza puede evaluarse en el intervalo completo de las concentraciones del
producto. Las variaciones típicas a considerar en un estudio incluyen días, analistas y equipos diferentes. De ser posible, se pue-
de evaluar la tolerancia o fortaleza usando un lote de producto cuando se haya caracterizado adecuadamente, por ejemplo,
cuando se cuenta con una estrecha uniformidad de contenido y un desempeño uniforme; sin embargo, cuando este tipo de
lote no esté disponible, se puede usar un placebo previamente medido con ingredientes activos para investigar la precisión
intermedia. El uso de dicho placebo con cantidades agregadas conocidas sustentaría adicionalmente la evaluación de la contri-
bución del complemento analítico con la variabilidad observada de los resultados.
El procedimiento de disolución en el mismo lote de la forma farmacéutica bien caracterizada puede ser llevado a cabo por al
menos dos analistas diferentes del mismo laboratorio, en donde cada analista prepara las soluciones estándar y el medio, y
sigue el procedimiento definido de extracción/cuantificación. Por lo general, los analistas utilizan diferentes baños de disolu-
ción, equipos de espectrofotometría o HPLC(incluyendo columnas) y muestreadores automáticos así como realizan el análisis
en diferentes días. Cuando resulta pertinente para el producto, se deben evaluar los perfiles completos. Es posible que este
procedimiento no sea necesario para cada concentración; puede ser aceptable la selección de extremos solo con las concentra-
ciones alta y baja.
Se deben determinar previamente los criterios de aceptación para la precisión intermedia o para la tolerancia o fortaleza. Un
criterio de aceptación típico para la tolerancia o fortaleza es que la diferencia en el valor medio entre los resultados de disolu-
ción en cualquiera de las dos condiciones que empleen la misma concentración no exceda un 10% absoluto en tiempos de
muestreo con <85% disuelto y no excede de 5% para los tiempos de muestreo >85%. Los criterios de aceptación pueden refe-
rirse a un producto específico y pueden emplearse otros límites y pruebas estadísticas.
5.4.3 REPRODUCIBILIDAD
La reproducibilidad sigue los conceptos generales de la precisión intermedia, pero es llevada a cabo por dos analistas dife-
rentes en distintos laboratorios.
5.5 Robustez
La evaluación de la robustez, es decir el estudio del efecto de cambios pequeños y deliberados en las condiciones de disolu-
ción, por lo general se hace en las etapas avanzadas del desarrollo del medicamento y es un requisito para la validación com-
pleta del método. La evaluación de robustez se lleva a cabo empleando un lote bien caracterizado de un medicamento con
estrecha uniformidad de contenido y desempeño uniforme. El número de determinaciones repetidas (por lo regular 3 ó 6) de-
pende de la precisión intermedia. Se deben evaluar todos los puntos del perfil.
La selección de los parámetros sujetos a variaciones depende del procedimiento de disolución y del tipo de análisis, y pue-
den incluir composición del medio (p. ej., concentración del surfactante o solución amortiguadora, pH, desgasificación) volu-
men, velocidad de agitación, tiempo de muestreo y temperatura. El análisis estadístico de los datos generados ayudará a deter-
minar el grado al que deben controlarse los parámetros en el método. La evaluación de robustez está bien adaptada a las me-
todologías de Diseño de Experimentos para investigar de manera eficiente el impacto de los parámetros individuales y/o su
interacción.
El capítulo (1225) hace referencia a la robustez del complemento analítico. Los parámetros de los análisis de HPLC pueden
incluir la composición de la fase móvil (porcentaje de componente orgánico, concentración de la solución amortiguadora, pH),
velocidad de flujo, longitud de onda, temperatura de la columna y múltiples columnas (del mismo tipo). La longitud de onda
puede variar para los análisis espectrofotométricos.
7836 (1092) Procedimiento de Disolución/ Información General USP42
5.6 Estabilidad de la Solución Muestra y la Solución Estándar
La solución estándar se almacena en condiciones que aseguren la estabilidad. La estabilidad de la solución estándar se anali-
za durante un periodo específico (que es al menos la duración de todo el procedimiento de disolución), usando una solución
estándar recientemente preparada en cada intervalo para realizar la comparación. El intervalo aceptable para la estabilidad de
la solución estándar se ve influenciado por la concentración y por lo general se encuentra entre 98% y 102% a la concentra-
ción final esperada.
La solución muestra usualmente se almacena a temperatura ambiente. La muestra se analiza durante un periodo específico
usando la respuesta de la solución de muestra original para realizar la comparación. El intervalo típico aceptable para la estabi-
lidad de la solución muestra puede encontrarse entre 98% y 102% comparado con el análisis inicial de las soluciones de mues-
tra. Si la solución no es estable, los aspectos a considerar incluyen la temperatura (puede requerirse refrigeración), protección
de la luz y material de los envases (plástico o vidrio).
El procedimiento puede indicar que los estándares y las muestras requieren ser analizados dentro de un periodo durante el
cual se demuestre la estabilidad aceptable de la solución muestra y de la solución estándar.
5.7 Consideraciones para la Automatización
Los métodos automatizados ofrecen oportunidades para incrementar la precisión y la reproducibilidad; no obstante, hay po-
sibilidad de introducción de sesgo. La sonda de muestreo y las líneas de la muestra requieren atención particular pues son lu-
gares en los que pueden presentarse imprecisiones. Las desviaciones del procedimiento descritas en el capítulo (711), tales co-
mo usar sondas de muestreo que se mantienen en el vaso durante el ensayo, o muestrear a través del elemento de agitación
del eje (muestreo en el eje hueco), o sondas de fibra óptica, deben validarse. Otros aspectos de la validación de la automatiza-
ción pueden incluir el arrastre de residuos del fármaco, los efectos de mantener la sonda en el vaso durante el ensayo, adsor-
ción del fármaco y los ciclos de limpieza y/o enjuague. La validación se realiza usando el sistema de disolución automatizado e
incluye los materiales. Por lo tanto, cualquier cambio en los materiales requerirá demostrar la aptitud basándose en los atribu-
tos de validación que sufren algún impacto por el cambio.
Se deben comparar los procedimientos manuales con los automatizados para evaluar la intercambiabilidad de los procedi-
mientos. Esto se lleva a cabo realizando dos corridas automatizadas en cada concentración de dosificación, usando todos los
puntos de muestreo, y comparándolas con corridas muestreadas manualmente de las mismas muestras. No es posible determi-
nar el efecto de la sonda que se mantiene en el vaso durante el análisis mediante el muestreo manual ni automatizado del
mismo vaso. Los resultados deben ser coherentes con los requisitos para la precisión intermedia si se considera que los procedi-
mientos son intercambiables. La diferencia en el valor medio entre los resultados de disolución en cualquiera de las dos condi-
ciones que empleen la misma concentración no debe exceder un 10% absoluto en tiempos de muestreo con <85% disuelto,
ni exceder de 5% para los tiempos de muestreo >85%. Los criterios de aceptación pueden referirse a un producto específico y
pueden emplearse otros límites y pruebas estadísticas.
La revalidación puede ser necesaria cuando el sistema automatizado se usa con diferentes formulaciones debido a la interac-
ción con excipientes. Los medios de disolución que contienen surfactantes o lípidos pueden requerir validaciones adicionales.
6. CRITERIOSDE ACEPTACIÓN
Los criterios de aceptación deben ser congruentes con los datos históricos de liberación o estabilidad. Existe la expectativa
de que las partidas aceptables darán resultados que caerán dentro de los criterios de aceptación y de que todas las partidas
fabricadas deberán presentar un comportamiento de disolución similar, enfatizando así la importancia de contar con un méto-
do que no presente una alta variabilidad. Por lo tanto, los criterios de aceptación y los puntos de muestreo deben discriminar
entre partidas aceptables e inaceptables. Asimismo, los resultados de la prueba de disolución se consideran un vínculo con las
partidas clave para ensayos clínicos. Cuando se ha demostrado que los cambios en la velocidad de disolución afectan la biodis-
ponibilidad de manera significativa, la prueba de disolución y el criterio de aceptación deben distinguir entre partidas con una
biodisponibilidad inaceptable (7 9). Asimismo, cuando los cambios en la formulación y en el proceso de fabricación afectan
significativamente la disolución y estos no se controlen mediante otro aspecto de la especificación, la prueba y los criterios de
disolución deben distinguir dichos cambios.
6.1 Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata
Aunque los datos de liberación y de estabilidad se recopilan durante el desarrollo de la forma farmacéutica, es común regis-
trar todo el perfil de disolución o la cantidad de fármaco disuelta en intervalos específicos, tales como 1O; 20; 30; 40; 50 y 60
minutos o 15; 30; 45 y 60 minutos. En el registro, la disolución para una tableta de liberación inmediata por lo regular se
convierte en una prueba de un solo punto. El criterio de aceptación y el tiempo de la prueba se establecen evaluando los datos
del perfil de disolución. El criterio de aceptación para una prueba de disolución es una función Q, que se expresa como la
cantidad disuelta de fármaco, como porcentaje de la cantidad declarada, en un tiempo especificado. Los valores Q típicos es-
USP42 Información General/ (1092) Procedimiento de Disolución 7837
tán en el intervalo de 75%-80% disuelto. Por lo general, no se usan valores Q que superan el 80% puesto que se tienen que
adaptar a las necesidades de los intervalos de valoración y la uniformidad del contenido.
6.2 Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada
La discusión sobre la disolución de formas farmacéuticas de liberación retardada del capítulo (711) se enfoca en las formas
farmacéuticas con recubrimiento entérico, que son la forma farmacéutica de liberación retardada más común. Una prueba de
disolución para una tableta o cápsula de liberación retardada es una prueba de dos partes, cada una de las cuales tiene crite-
rios de aceptación. Primero, las formas farmacéuticas se exponen a un medio ácido, seguido de la exposición a un medio
amortiguado. Para asegurar que el recubrimiento entérico tiene un desempeño apropiado, se indica un criterio de aceptación
de "no más de" en el capítulo (711) para la etapa ácida. El medio usado para una etapa ácida por lo regular es HCI O,1 N y la
duración de esta etapa es por lo general 2 horas. Posteriormente, las formas farmacéuticas se exponen a un medio amortigua-
do, por lo general solución amortiguadora de fosfato 0,05 M a un pH 6,8, aunque se pueden usar otras soluciones amortigua-
doras y pH esperados siempre que se justifique. La duración de la etapa amortiguada es por lo regular 45 minutos para prue-
bas farmacopeicas, aunque dicha duración puede variar dependiendo del medicamento. Al igual que con las formas farmacéu-
ticas de liberación inmediata, se determina un valor Q y un tiempo de muestreo evaluando todo el perfil de disolución.
6.3 Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada
Una prueba de disolución para una forma farmacéutica de liberación prolongada por lo general es similar a la usada para los
medicamentos de liberación inmediata o retardada, excepto que la duración de la prueba es mayor y que se especifican al
menos tres tiempos de muestreo para propósitos farmacopeicos (20). Pueden necesitarse tiempos de muestreo adicionales pa-
ra la aprobación del fármaco. Se elige un tiempo de muestreo inicial, habitualmente de 1-2 horas, para demostrar que impro-
bable que se produzca la liberación masiva. Se elige un tiempo de muestreo intermedio para definir el perfil de liberación in
vitro de la forma farmacéutica y se elige un tiempo final para mostrar básicamente la liberación completa del fármaco (20). Los
tiempos de muestreo para la prueba deben determinarse evaluando el perfil de disolución a lo largo del tiempo de la prueba
deseado. A menudo, se obtienen tiempos de muestreo adicionales durante el desarrollo de la forma farmacéutica para ayudar
a seleccionar los tiempos de muestreo apropiados para la especificación o monografía.
Al igual que con los medicamentos de liberación inmediata o retardada, los criterios de aceptación y los tiempos de mues-
treo para un medicamento de liberación prolongada deben discriminar entre partidas aceptables e inaceptables. Los criterios
de aceptación para la primera etapa de análisis (L1) deben establecerse con respecto a los datos de la partida disponibles
(7 9,20). Si se cuenta con datos sobre biodisponibilidad en humanos para formulaciones que presentan diferentes velocidades
de liberación, entonces se puede usar una relación in vitro/in vivo para establecer los criterios de aceptación (19,20). Los crite-
rios de aceptación para la segunda (L2) y tercera (L3) etapas se derivan de los criterios de L1 usando la Tablade Aceptación2 del
capítulo (711 ).
6.4 Múltiples Pruebas de Disolución
Por lo regular, las monografías para formas farmacéuticas de liberación prolongada contienen múltiples pruebas de disolu-
ción que representan productos específicos. De acuerdo con las Advertenciasy RequisitosGenerales,4.10.1 OAplicabilidadde los
Procedimientosde Prueba,la prueba apropiada, cuando se usa una diferente a la Prueba 1, se indica en el etiquetado del pro-
ducto. Por ejemplo, la monografía USPde Clorhidratode Oxicodona,Tabletasde LiberaciónProlongada(21) cita dos pruebas de
disolución, cada una de las cuales tiene tres o cuatro tiempos de muestreo. Si las Tabletas se analizan usando la Prueba2 y los
resultados de la disolución cumplen con los criterios provistos en la monografía, el etiquetado de las Tabletas puede indicar
que las Tabletas cumplen con la Pruebade Disolución2 de la USP.También se pueden encontrar múltiples pruebas de disolu-
ción en las monografías para formas farmacéuticas de liberación inmediata y retardada. Por ejemplo, las monografías USPde
LevotiroxinaSódica,Tabletasy PantoprazolSódico,Tabletasde LiberaciónRetardadaproveen cuatro pruebas de disolución
(22,23).
6.5 Interpretación de los Resultados de la Disolución
La sección Interpretacióndel capítulo (711) trata las formas farmacéuticas de liberación inmediata, retardada y prolongada.
En este capítulo se amplía la discusión sobre cada uno de estos patrones de liberación con ejemplos para ayudar en la aplica-
ción de los criterios durante varias etapas del análisis. Entender la forma en que se aplican estos criterios ayudará a establecer
criterios de aceptación apropiados.
6.5.1 FORMASFARMACÉUTICAS
DE LIBERACIÓN
INMEDIATA
Una vez que se ha establecido el valor Q, la prueba de disolución es una prueba por etapas de tres niveles. En el primer nivel
del análisis denominado S1, se analizan seis formas farmacéuticas. Cada forma farmacéutica debe presentar una cantidad Q
+ 5% (puntos porcentuales absolutos) disuelta en un tiempo especificado. Por ejemplo, el tiempo y las tolerancias en una mo-
nografía serían:
Tiempo: 30 min
Tolerancias:No menos de 80% (Q) de la cantidad declarada del "fármaco"
Si el valor Q para una tableta de liberación inmediata con una cantidad declarada (LC, por sus siglas en inglés) de 200 mg se
especifica en 80% y el tiempo de muestreo es 30 minutos, entonces se debe disolver no menos de 85% de la cantidad decla-
rada (1 70 mg) del fármaco en cada tableta a los 30 minutos.
Si no se cumple este criterio, entonces deben analizarse 6 tabletas adicionales en el nivel 2 (S2). Para pasar el criterio de
aceptación S2, el promedio de las 12 tabletas debe ser igual o mayor que el valor Q (80% de la cantidad declarada; 160 mg en
el ejemplo anterior), y ninguna tableta debe tener un valor menor que Q - 15% (65% de la cantidad declarada; 130 mg en el
ejemplo anterior).
Si no se cumplen estos criterios, entonces se debe llevar a cabo un análisis en el nivel 3 o S3 analizando 12 tabletas adiciona-
les. Para pasar S3, el promedio de las 24 tabletas debe ser igual o mayor que el valor Q (80% de la cantidad declarada; 160 mg
en el ejemplo anterior). Además, se deben cumplir dos criterios adicionales: 1) no más de 2 tabletas tienen un valor menor que
Q - 15% (65% de la cantidad declarada; 130 mg en el ejemplo anterior) y 2) ninguna tableta tiene un valor menor que Q -
25% disuelto (55% de la cantidad declarada; 110 mg en el ejemplo anterior.)
DE LIBERACIÓN
RETARDADA
Al final de la etapa ácida, se analiza una alícuota del medio ácido a partir de cada vaso. Para la etapa ácida, los criterios de
aceptación tienen tres niveles. El análisis de nivel 1 (A1) se aprueba cuando ningún valor individual excede del 10% de disolu-
ción. Si no se cumplen los criterios A1, entonces la prueba de disolución se lleva a cabo en 6 formas farmacéuticas adicionales
para el análisis del nivel 2 (A2). Los criterios del nivel A2 se aprueban si el promedio de las 12 formas farmacéuticas en la etapa
ácida es no más de 10% disuelto y si ninguna forma farmacéutica individual es más de 25% disuelto. Si no se cumplen los
criterios A2, se lleva a cabo el análisis de nivel 3. Los criterios A3 se aprueban si el promedio de las 24 formas farmacéuticas en la
etapa ácida es no más de 10% disuelto y si ninguna tableta individual es más de 25% disuelto. Para el caso especial en el que
la solubilidad del fármaco en un medio ácido debido a la conversión al ácido libre es demasiado baja para sustentar un criterio
de aceptación de no más de 10%, se debe exponer el medicamento a la etapa ácida durante el tiempo definido y luego expo-
nerlo al medio amortiguado. Se pueden justificar criterios de aceptación alternativos para la etapa ácida basándose en la solu-
bilidad del fármaco.
Para formas farmacéuticas de liberación retardada, el porcentaje total disuelto se determina sumando las cantidades medidas
en las fases ácida y amortiguada para cada forma farmacéutica individual. Estos valores calculados se comparan posteriormente
con los criterios de aceptación de la etapa correspondiente (B1, B2 y B3) que se basan en un valor Q. Los criterios B1, B2 y B3 son
idénticos a aquellos para los criterios de liberación inmediata S1, S2 y S,.
DE LIBERACIÓN
PROLONGADA
En el siguiente ejemplo hipotético, que se usa para describir los criterios para una forma farmacéutica de liberación prolon-
gada, los tiempos de muestreo son 1; 4 y 8 horas. El intervalo de aceptación para cada tiempo de muestreo es el siguiente:
• Entre 24% y 44% disuelto de la cantidad declarada de fármaco en 1 hora
• Entre 56% y 76% disuelto de la cantidad declarada de fármaco en 4 horas
• No menos de 85% disuelto de la cantidad declarada de fármaco en 8 horas.
Los intervalos de aceptación a menudo se expresan en forma de tabla en los compendios USP-NF(ver la Tabla 3):
Tabla 3. Criterios L1
Tiempo
(h) Cantidad Disuelta
1 24%-44%
4 56%-76%
8 No menos de 85%
Se analizan seis tabletas en el Nivel 1 (L1); los criterios de aceptación se cumplen si ningún valor individual está fuera de cada
uno de los intervalos declarados, y ningún valor individual es menor que el porcentaje especificado para el tiempo final de
muestro. Si no se cumplen los criterios L1, entonces se analizan 6 tabletas adicionales en el nivel 2 (L2). Los criterios L2 se cum-
plen cuando se satisfacen las siguientes tres condiciones:
1. Elvalor promedio de las 12 tabletas está dentro de cada uno de los intervalos declarados y es no menor que el intervalo
establecido del tiempo final de muestreo.
2. Ninguna de las 12 tabletas está fuera por> 10% del contenido declarado en cada uno de los intervalos establecidos.
3. Ninguna de las 12 tabletas está fuera por> 10% por debajo del contenido declarado de la cantidad establecida en el tiem-
po final de la prueba.
Para el ejemplo anterior, los criterios de aceptación L2 para las 12 tabletas (ver la Tabla 4) son los siguientes:
T:a bla 4 Crlterlos L.,

1h 4h 8h
Promedio 24%-44% 56%-76% No menos de 85%
Tabletas individuales 14%-54% 46%-86% No menos de 75%
Si no se cumplen los criterios L2, entonces se analizan 12 tabletas adicionales en el nivel 3 (L3). Los criterios L3 se cumplen
cuando se satisfacen las siguientes cinco condiciones:
1 . Elvalor promedio de las 24 tabletas está dentro de cada uno de los intervalos establecidos y es no menor que el intervalo
establecido en el tiempo final de muestreo.
2. No más de 2 de las 24 tabletas están fuera por> 10% del contenido declarado en cada uno de los intervalos establecidos.
3. No más de 2 de las 24 tabletas están fuera por> 10% por debajo del contenido declarado de la cantidad establecida en el
tiempo final de muestreo.
4. Ninguna de las 24 tabletas está fuera por >20% del contenido declarado en cada uno de los intervalos establecidos.
5. Ninguna de las 24 tabletas está fuera por >20% por debajo del contenido declarado de la cantidad establecida en el tiem-
po final de la prueba.
Los criterios de aceptación L, para las 24 tabletas en el ejemplo anterior se resumen en la Tabla5:
Tabla 5. Criterios L3
1h 4h 8h
Promedio 24%-44% 56%-76% No menos de 85%
No más de 2 tabletas están fuera No más de 2 tabletas están fuera
del intervalo de 14%-54%, y nin- del intervalo de 46%-86%, y nin- No más de 2 tabletas libera <75% y
guna tableta individual está fuera guna tableta individual está fuera ninguna tableta individual libera
Tabletas individuales del intervalo de 4%-64% del intervalo de 36%-96% <65%
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(1094) CÁPSULAS-PRUEBAS
DE DISOLUCIÓNY ATRIBUTOSDE
CALIDADRELACIONADOS
1. INTRODUCCIÓN
Este capítulo de información general provee enfoques para el desarrollo de procedimientos de pruebas de disolución para
cápsulas, los cuales no están incluidos en los capítulos Disolución(711 ), Liberaciónde Fármacos(724), Procedimientode Disolu-
ción: Desarrolloy Validación(1 092) y Desintegracióny Disoluciónde SuplementosDietéticos(2040). Este capítulo también trata de
los atributos de calidad relacionados con las cápsulas que pueden afectar el resultado de la prueba de disolución.
1.1 Tipos de Cápsulas
Las cápsulas se pueden clasificar en dos tipos principales, basándose en las características físicas de la cubierta: cápsulas blan-
das y cápsulas duras. Para los propósitos de este capítulo, se hace referencia a las cápsulas de cubierta blanda y a las cápsulas
de cubierta dura como "de gelatina blanda" y "de gelatina dura", respectivamente. Las cápsulas de gelatina blanda tienen una
cubierta más gruesa y por lo regular presentan un mayor grado de elasticidad debido a la adición de plastificante, además de
que tienen un tiempo de ruptura ligeramente más prolongado en comparación con las de gelatina dura. Por comparación, las
cápsulas de gelatina dura tienen una cubierta más delgada y más rígida que las de gelatina blanda. Ambos tipos de cápsulas
están compuestas por un polímero, p. ej., gelatina, almidón o un derivado de celulosa tal como hipromelosa (HPMC, por sus
siglas en inglés) u otros polímeros, un plastificante y agua. En el caso de las cápsulas de gelatina dura, el agua actúa como
plastificante, mientras que las de gelatina blanda contienen polioles de alto punto de ebullición tales como glicerol o sorbitol
como plastificantes, además de que también contienen agua. A pesar del gran número de parámetros que afectan las propie-
dades físicas y químicas de la cubierta, es la relación entre polímero y plastificante la que principalmente determina la rigidez,
la fragilidad y el desempeño de disolución de la cubierta.
Asimismo, las cápsulas se pueden caracterizar por las propiedades químicas del material de relleno (materiales de relleno hi-
drófobos versus materiales de relleno hidrófilos) o por las propiedades físicas del material de relleno (soluciones versus disper-
siones versus sólidos). Las soluciones hidrófobas incluyen aceites sin diluir, combinaciones de aceites miscibles o ingredientes
activos disueltos en vehículos oleosos. Las dispersiones hidrófobas incluyen ingredientes activos dispersos o suspendidos en
aceite o en mezclas de cera y aceite. Éstas últimas, por lo regular, se denominan semisólidas. Las soluciones hidrófilas pueden
ser líquidos sin diluir, combinaciones de líquidos miscibles en agua o ingredientes activos disueltos en vehículos miscibles en
agua. Las dispersiones o suspensiones hidrófilas incluyen ingredientes activos dispersos o suspendidos en vehículos hidrófilos
tales como polietilenglicol. Los materiales de relleno sólidos contienen mezclas de excipientes e ingredientes activos cuyas pro-
piedades como hidrofilia/hidrofobia, polimorfismo, tamaño de partícula, entre otras, dirigen el comportamiento de la disolu-
ción.
1.2 Cuestionesde Fabricacióny Envasadoque PuedenAfectar las Pruebasde Disolución
Algunas cuestiones que afectan el desarrollo de un procedimiento de disolución y del comportamiento de disolución de las
cápsulas incluyen:
• Las propiedades del material de la cubierta de las cápsulas
• Las propiedades del material de relleno
• La interacción entre el material de la cubierta de las cápsulas y el material de relleno
La gelatina es un material higroscópico y su contenido de humedad afecta las propiedades de las cápsulas de gelatina dura y
blanda. Debido a que algunos excipientes son agentes higroscópicos conocidos, resulta particularmente importante monito-
rear las propiedades mecánicas de las cápsulas de gelatina almacenadas en diversas condiciones de temperatura y humedad
relativa. Los factores que pueden afectar las propiedades de las cápsulas incluyen: el intercambio de humedad entre la cubierta
y el material de relleno, el cual potencialmente podría generar fragilidad en la cubierta de gelatina; y las interacciones químicas
entre el material de relleno y la gelatina, las cuales pueden resultar en entrecruzamientos de la gelatina.
USP42 InformaciónGeneral/ (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución 7841
Durante el desarrollo del producto, se deben investigar el potencial de impurezas aldehídicas y la formación de productos de
degradación así como la degradación de ingredientes activos o excipientes en la formulación, usando estudios de estabilidad
(los aldehídos contribuyen al entrecruzamiento; ver la sección 2. Entrecruzamientoen Cápsulasde Gelatina). Elentendimiento
de las posibles rutas de la formación de aldehídos o cetonas, así como las posibles fuentes de aldehídos, ayuda a predecir el
comportamiento de las cápsulas. La velocidad de enfriamiento y secado pueden modificar las características de liberación de
los ingredientes activos de la matriz. Se debe investigar la posibilidad de que el ingrediente activo migre dentro de la cubierta
de la cápsula principalmente cuando la cubierta de la cápsula blanda es de gelatina, debido al impacto sobre la prueba de
disolución.
Las cubiertas de las cápsulas pueden volverse reactivas dependiendo de las condiciones de almacenamiento. La selección del
envasado y de las condiciones de almacenamiento del producto deben prevenir los efectos adversos sobre la calidad de las
cápsulas. El ingreso de humedad y/u oxígeno en el empaque y a través de la cubierta de las cápsulas, así como la velocidad de
ingreso, pueden afectar la vida útil final del producto. En algunos casos, un incremento en el contenido de agua de la cubierta
de las cápsulas puede producir una reducción medible en el tiempo de disolución puesto que un producto humedecido puede
facilitar la hidratación del polímero.
Debido al contenido de agua de la cubierta de gelatina (por lo general entre 13% y 16%), este tipo de cápsula se comporta
como un depósito de humedad que puede afectar la estabilidad de los ingredientes activos sensibles a la humedad.
Cuando una cápsula se sumerge en un medio acuoso, el agua permea las paredes, el polímero se hidrata y la cápsula se
hincha. Cuando está completamente hidratada, la cubierta comienza a disolverse. Eltiempo que tarda el agua en penetrar la
cubierta de las cápsulas varía, dependiendo de la naturaleza de las cubiertas de las cápsulas y de otros factores. Se ha informa-
do que dicho tiempo es de aproximadamente 40 segundos para cápsulas de gelatina y aproximadamente 3 minutos para cáp-
sulas de HPMC. Este retraso puede ser significativo solo para la prueba de disolución de formas farmacéuticas de liberación
inmediata, y debería tener poco o ningún impacto sobre la prueba de disolución de formulaciones de liberación modificada.
2. ENTRECRUZAMIENTO
EN CÁPSULASDE GELATINA
El entrecruzamiento implica la formación de enlaces químicos más fuertes que la simple unión por medio de puentes de
hidrógeno y uniones iónicas entre las cadenas de gelatina, y afecta la reversibilidad térmica de la transición de solución a gel
de la gelatina en la cubierta. El entrecruzamiento puede ser ocasionado por agentes presentes en el relleno de las cápsulas que
reaccionan con las moléculas de la gelatina, lo cual resulta en la formación de una película en la superficie interna de la cubier-
ta. Con menor frecuencia, se puede formar una película en la superficie externa de la cubierta, la cual surge de los agentes
reactivos presentes o que se derivan de los productos intermedios de los componentes del envase final.
Una película es una membrana transparente, delgada e insoluble en agua, de proteínas entrecruzadas en la superficie inter-
na o externa de la cápsula que impide la liberación del relleno de la cápsula. El entrecruzamiento se evidencia por la presencia
de una membrana delgada o de una masa gelatinosa durante la prueba de disolución, puesto que la película misma puede ser
difícil de observar.
El entrecruzamiento también puede ser ocasionado por agentes o impurezas presentes en la cubierta, lo que provoca que
toda la matriz de la cubierta sea insoluble en condiciones que normalmente disolverían la cubierta de la gelatina. Uno de los
tipos más comunes y fuertes de entrecruzamiento implica la unión covalente entre el grupo amino de una cadena lateral de
lisina de una molécula de gelatina y un grupo amino similar de otra molécula. Esta reacción, por lo general, es ocasionada por
trazas de aldehídos reactivos. Elformaldehído, el glutaraldehído, el glioxal y los azúcares reductores son los agentes de entre-
cruzamiento más comunes. La unión covalente producida por este tipo de entrecruzamiento es, a fines prácticos, irreversible, y
la disolución de la cubierta debe incluir la ruptura de otros enlaces tales como la ruptura mediada por enzimas de los enlaces
peptídicos en las cadenas de proteínas.
La gelatina modificada por medios químicos, p. ej., mediante la adición de grupos de ácido succínico a las cadenas laterales
de lisina, puede prevenir o al menos aminorar el entrecruzamiento mediado por aldehídos. Un tipo más débil de entrecruza-
miento implica la formación de complejos de grupos de ácidos carboxílicos libres de dos moléculas diferentes de gelatina con
iones metálicos trivalentes tales como Fe3• y Al'•. Estos cationes se pueden encontrar en algunas tinturas usadas como coloran-
tes o como contaminantes de excipientes en bajo nivel. Para gelatina con una mayor consistencia Bloom (ver la sección 6.1.1
Gelatina), que por lo general se considera de mayor calidad, el entrecruzamiento se presenta con mayor facilidad puesto que
se necesita una menor cantidad de enlaces para unir cadenas de gelatina de longitudes mayores.
Es extremadamente importante conocer y entender la formulación del producto para identificar las posibles fuentes de
agentes de entrecruzamiento y tomar medidas para eliminar o minimizar su papel en la promoción de entrecruzamientos. Di-
cho conocimiento puede ayudar en lo que respecta a los cambios en la formulación y/o en el material de envase posteriores a
la aprobación.
Las causas comunes de entrecruzamiento incluyen lo siguiente:
• Aldehídos presentes en ingredientes activos, excipientes o materiales de envase (p. ej., en disolventes residuales); o que se
pueden formar in situ durante el almacenamiento.
• Alta humedad (que lleva a una mayor permeabilidad del oxígeno).
• Sustancias que facilitan una reacción de entrecruzamiento.
• Sustancias que promueven la descomposición del estabilizador en el almidón de maíz (hexametilentetramina), la cual re-
sulta en la formación de amoníaco y formaldehído, lo que ocasiona la reacción de entrecruzamiento.
7842 (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución / InformaciónGeneral USP42
• Torundas de rayón que contienen un grupo funcional de aldehído (furfural).

• Polietilenglicol, el cual puede contener peróxidos y aldehídos.
• Luz UV,en especial con alto calor y humedad.
• Formación de aldehído promovida por temperaturas elevadas.
La prueba de disolución de cápsulas entrecruzadas puede impedir o generar una liberación más lenta del fármaco. En raras
ocasiones, si existen defectos en la costura de las cápsulas rellenas de líquido, la cápsula puede romperse por la costura, incluso
en presencia de entrecruzamiento en la gelatina, lo que resulta en una liberación temprana del relleno de la cápsula en el me-
dio de disolución. El grado de entrecruzamiento no es uniforme dentro de una cápsula ni entre diversas cápsulas. En conse-
cuencia, existe una mayor variabilidad en los resultados de disolución si las cápsulas de gelatina presentan entrecruzamiento.
Se pueden agregar enzimas al medio de disolución para superar este problema (ver Disolución(711 )). No se deben usar enzi-
mas si no se presenta dicha evidencia.
3. DESARROLLO
DELPROCEDIMIENTO
DE DISOLUCIÓN
El diseño de un procedimiento de prueba de disolución de cápsulas depende de la formulación del producto. La composi-
ción del relleno, la solubilidad de los ingredientes activos en el relleno y la dispersión del relleno en el medio de disolución
influyen sobre el comportamiento de una formulación con un relleno determinado. Por ejemplo, una formulación que conten-
ga un ingrediente activo soluble en lípidos con excipientes hidrófobos y un punto de fusión que exceda de 37º probablemente
no liberará el ingrediente activo en forma de solución en medios acuosos en un lapso que responda a las expectativas para las
formas farmacéuticas de liberación inmediata. Por el contrario, un ingrediente activo fácilmente miscible en agua disuelto o
dispersado en una fórmula de relleno soluble o dispersable en agua a temperatura ambiente se liberará en forma de solución
rápidamente después de la ruptura de la cubierta y de que la forma farmacéutica libere el material de relleno en el medio.
Al desarrollar un método de disolución para un producto dado, se debe conocer el diseño específico de la formulación y el
perfil de liberación esperado. La flotabilidad tiene un gran impacto sobre la liberación del relleno de las cápsulas para las for-
mulaciones basadas en lípidos que a menudo son menos densas que los medios acuosos. Si la formulación ha sido diseñada
para que sea autoemulsionable o automicroemulsionable, ésta se dispersará de manera eficiente en la mayoría de los medios
acuosos. Las formulaciones como las que están compuestas simplemente por un triglicérido sin codisolvente o emulsificante
adicional flotarán rápidamente hacia la superficie del medio de disolución en el vaso. En esta situación, los resultados cuantita-
tivos de una prueba de disolución proveen la velocidad de la partición del fármaco desde esta capa flotante. La selección del
aparato es quizás el paso más crítico para estos tipos de cápsulas debido a que la eficiencia con la que el contenido de las
cápsulas se mezcla con los medios de disolución se ve altamente influenciada por la hidrodinámica de la agitación. Una vez
que el aparato ha sido seleccionado, las otras variables que se deben tomar en cuenta para el desarrollo de una prueba de
disolución son la velocidad de rotación, la velocidad de inmersión o la velocidad de flujo, el tipo y la concentración de agente
tensoactivo/mejorador de solubilidad, y el volumen y pH del medio (ver los capítulos (711 ), (1092) y (2040)).
Con el objetivo de guiar de mejor manera el diseño de la forma farmacéutica, puede ser útil considerar otras características
del producto tales como la solubilidad de los ingredientes activos en diversos medios, la disolución intrínseca de los ingredien-
tes activos (ver DisoluciónIntrínsecaAparente-Procedimientos de Pruebasde Disoluciónpara Disco Rotatorioy DiscoEstacionario
(1087)), la capacidad de dispersión, el tamaño de los glóbulos para emulsiones, la formación de micelas, la digestión, la preci-
pitación durante la dilución en el medio, los estudios de comportamiento de fase y las pruebas de estallido para detectar el
entrecruzamiento de la gelatina.
La prueba de ruptura puede ser una herramienta útil en las etapas tempranas del desarrollo y la evaluación de la formula-
ción, en especial si el ingrediente activo pertenece a la Clase 1 del Sistema de Clasificación de Biofarmacéuticos (Biopharma-
ceutics Classification System Class 1) (ver FDAGuidancefor lndustry-Waiver of In vivo Bioavailabilityand BioequivalenceStudies
for lmmediate-ReleaseSo/idOral DosageFormsBasedon a BiopharmaceuticsClassificationSystem[Guía para la industria de la
FDA-Exenciónde Estudios de Biodisponibilidad y Bioequivalencia In Vivo para Formas Farmacéuticas Sólidas Orales de Libera-
ción Inmediata Basándose en el Sistema de Clasificación de Biofarmacéuticos]) y está formulado en un relleno miscible en
agua. Para dicho propósito, se considera que la ruptura ocurre cuando la cubierta de la cápsula se fisura, exponiendo el conte-
nido del relleno. Si la ruptura de la cubierta de la cápsula se puede correlacionar con los datos de disolución, entonces se pue-
de explorar como una posible alternativa a la prueba de disolución.
3.1 Aparato
Al igual que con otras formas farmacéuticas sólidas orales, el Aparato 1 de la USP (canastilla), el Aparato 2 de la USP (pale-
tas), el Aparato 3 de la USP (cilindro oscilante) y el Aparato 4 de la USP (celda de flujo) son los aparatos que se seleccionan con
mayor regularidad para la disolución de cápsulas (ver los capítulos (711) y (2040)). No obstante, al seleccionar y usar los apara-
tos de disolución para las cápsulas se deben considerar los diversos beneficios y desventajas específicos:
• Las cápsulas pueden rellenarse con un material que tenga un peso específico menor que el del agua. Por ende, las cápsu-
las pueden flotar en un medio de disolución acuoso;
• En lugar de disolverse por completo durante la prueba de disolución, la cubierta de la cápsula puede ablandarse y desinte-
grarse formando una masa cerosa o pegajosa que se puede adherir a cualquier punto en el vaso de disolución y en áreas
diferentes en vasos diferentes, generando una alta variabilidad en los resultados.
USP42 InformaciónGeneralJ (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución 7843
• El material de relleno de las cápsulas puede formar una película en la superficie del medio de disolución durante el trans-
curso de la prueba.
El proceso de disolución de las cápsulas incluye tres etapas: (1) ruptura de la cubierta de las cápsulas, (2) liberación y disper-
sión del material de relleno de las cápsulas y (3) disolución de los ingredientes activos en el medio. Cada aparato de disolución
previamente referido puede lograr estas tres etapas, pero pueden ocasionar un efecto hidrodinámico diferente sobre las cápsu-
las al igual que en cualquier otra forma farmacéutica.
3.1.1 APARATO1 DE LA USP (CANASTILLA)
Este aparato tiene la ventaja de encerrar las cápsulas, evitando que floten libremente en el medio. No obstante, las canasti-
llas pueden no ser adecuadas para ciertas cápsulas. A medida que la cápsula se rompe, el material de la cubierta de la cápsula
puede obstruir la malla de la canastilla, mientras que para materiales de relleno hidrófobos, la fase oleosa liberada de la cápsula
puede no dispersarse en la canastilla en forma de gotitas lo suficientemente finas para pasar de manera eficiente a través de la
malla. Puede ser necesaria una malla de mayor tamaño para superar estas limitaciones.
3.1.2 APARATO2 DE LA USP (PALETAS)
Este aparato no tiene una malla que se pueda obstruir, pero no evita que las cápsulas floten. Para estos casos, se pueden
enrollar espirales de alambre alrededor de las cápsulas o se pueden usar dispositivos de sumersión disponibles comercialmente
para encerrar las cápsulas y mantenerlas en el fondo del vaso, permitiendo una mayor exposición del relleno al medio (ver
Aparato/Agitación, Dispositivosde Sumersiónen el capítulo (1092)). Los dispositivos de sumersión también se pueden usar para
evitar que la cápsula se pegue a las paredes del vaso y para proveer un mejor contacto con el medio de disolución, incluso si la
cápsula no flota y se mantiene en el fondo del vaso. La forma y el tamaño del dispositivo de sumersión pueden desempeñar un
papel importante en el perfil de disolución y se deben seleccionar cuidadosamente. Resulta necesario tomar en cuenta el hin-
chamiento que la cápsula experimenta cuando entra en contacto con el medio de disolución al momento de definir el tamaño
del dispositivo de sumersión que se va a usar.
3.1.3 APARATO3 DE LA USP (CILINDROOSCILANTE)
Este aparato, al igual que el Aparato 1, encierra las cápsulas. No obstante, la malla en el fondo del cilindro puede obstruirse
con las cubiertas no disueltas. Se puede solucionar este problema cambiando el tamaño de la malla. El mecanismo de agita-
ción diferente del Aparato 3 provee una hidrodinámica muy distinta en comparación con los Aparatos 1 y 2. Esta característica
puede ayudar a dispersar las gotitas hidrófobas, evitando la formación de capas y algunos problemas ocasionados por la flota-
ción de la cápsula. En el caso del Aparato 3, resulta posible cambiar diferentes medios durante el transcurso de la prueba de
disolución. Esto permite determinar los perfiles de disolución a diversos valores de pH, lo cual resulta útil para formas farma-
céuticas de acción localizada o de liberación modificada. Este aparato puede no ser una opción adecuada para casos en los
que el ingrediente activo se ha dispersado pero no se ha disuelto, debido a una pérdida significativa de muestra al transferir el
cilindro de un tubo al otro. Asimismo, el Aparato 3 de la USP tiene la tendencia de generar espuma cuando se agregan agentes
tensoactivos a los medios. Ante esta situación, se puede agregar al medio un agente antiespumante apropiado.
Una alternativa al Aparato 3 es el aparato de desintegración descrito en el capítulo Desintegración(701 ). Se debe evitar el uso
de discos debido a las obstrucciones. Si no se usan los discos, la cápsula flotará y podría no humedecerse uniformemente. Este
aparato ofrece condiciones de mayor turbulencia que pueden ser útiles para la dispersión del relleno hidrófobo, evitando la
formación de capas y contrarrestando la flotabilidad de la cápsula.
3.1.4 APARATO4 DE LAUSP (CELDADE FLUJO)
Este aparato también encierra las cápsulas y tiene un filtro. Se encuentran disponibles diversos tipos de celdas, dependiendo
de la aplicación. El uso de la celda de flujo diseñada para cápsulas blandas rellenas de lípidos puede ser útil para ciertos tipos
de formulaciones (ver la Figura2 en el capítulo (2040)). El uso del Aparato 4 también posibilita cambiar diferentes medios y
alterar el flujo durante el transcurso de la prueba de disolución. Asimismo, este equipo se puede configurar para volúmenes
bajos o altos de medio, los cuales se pueden usar para productos de baja concentración y para ingredientes activos con baja
solubilidad, respectivamente.
Se puede considerar el uso de otros aparatos, siempre que se justifique adecuadamente, evaluando las variaciones en la
composición de los medios, el volumen de los medios, la velocidad de agitación o flujo y otros parámetros de prueba de cada
aparato candidato para determinar el efecto que tiene cada uno sobre el desempeño de la disolución del producto.
3.2 Medio
Se pueden consultar las recomendaciones generales para la selección de medios de disolución apropiados en los capítulos
(1092) y (2040), en la FDAGuidancefor lndustry-Dissolution Testingof lmmediate-ReleaseSo/idOral DosageForms(Guía de la
7844 (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución/ Información General USP 42
FDA para la Industria-Prueba de Disolución de Formas Farmacéuticas Sólidas Orales de Liberación Inmediata) y en la FDAGui-
dancefor lndustry-Extended ReleaseOral DosageForms:Development,Evaluation,and Application of In vitro/ln vivo Correlations
(Guía de la FDApara la Industria-Formas Farmacéuticas Orales de Liberación Prolongada: Desarrollo, Evaluación y Aplicación
de Correlaciones In vitro/ln vivo).
Las características del medio de disolución que pueden afectar la apertura o ruptura de la cubierta de la cápsula, la liberación
y la dispersión del material de relleno de la cápsula, así como la disolución de los ingredientes activos se tratan en las secciones
siguientes.
3.2.1 LOGRO DE LASCONDICIONESDE EXCESODE MEDIO
Al igual que en el desarrollo de cualquier procedimiento de disolución efectivo, el medio, de preferencia, aunque no necesa-
riamente, debe proveer condiciones de exceso de medio para el ingrediente activo en un ambiente que asegure la estabilidad
y que, de preferencia, sea pertinente desde el punto de vista fisiológico para el producto (ver el capítulo (1092)).
Si el relleno es soluble en agua o, por lo menos, fácilmente dispersable en un medio acuoso, y si el ingrediente activo mismo
también es soluble, se pueden lograr condiciones de exceso de medio en una manera comparable a la usada para cualquier
otra forma farmacéutica sólida oral. No obstante, las cápsulas rellenas de líquido pueden contener una matriz o ingrediente
activo (o ambos) que sean hidrófobos o insolubles en agua. En este caso, puede ser necesario usar un medio con agentes ten-
soactivos (ver más adelante). No se recomienda el uso de codisolventes orgánicos para mejorar las condiciones de exceso de
medio y, en caso necesario, su uso deberá justificarse de forma apropiada y únicamente como último recurso y en cantidades
mínimas. En la práctica, la presencia de disolventes orgánicos en el medio puede inhibir la disolución de la cubierta.
Además de dispersar/disolver la matriz y los ingredientes activos, el medio no debe interferir con la actividad de las enzimas
usadas ni interactuar negativamente con la cubierta de la cápsula o la formulación. Por lo tanto, el desarrollo de un medio
adecuado para sistemas hidrófobos puede requerir de una serie considerable de experimentos. Por ejemplo, el uso de la prue-
ba del capítulo (711) requiere la adición de enzimas cuando la cápsula de gelatina no pasa la prueba debido a la formación de
película. Cuando se usan ciertos agentes tensoactivos (p. ej., lauril sulfato de sodio), la enzima puede quedar desactivada, de-
pendiendo del tipo y la concentración del agente tensoactivo usado. En este caso, se puede considerar un periodo de pretrata-
miento con la enzima proteolítica seguido por la adición posterior del agente tensoactivo al medio. El tiempo de este pretrata-
miento debe ser lo más corto posible. En la mayoría de los casos no excede de 15 minutos. El periodo de pretratamiento se
incluye en el tiempo total de la prueba de disolución.
Para establecer un medio adecuado, se deben evaluar varios medios diferentes para identificar al que logre las condiciones
de exceso de medio apropiadas con la cantidad más baja de agente solubilizante/dispersante. También, se deben evaluar el
efecto del pH, de la concentración iónica, del contraión amortiguador y/o del codisolvente sobre la solubilidad del ingrediente
activo y la actividad enzimática, en particular para ingredientes activos hidrófobos, además de la partición relativa del ingre-
diente activo entre la matriz y el medio.
3.2.2 USO DE AGENTESTENSOACTIVOS/AGENTES

DE DISPERSIÓN/MEJORADORES
DE LA SOLUBILIDAD
Se pueden usar en el medio de disolución agentes tensoactivos, agentes de dispersión o mejoradores de la solubilidad cuan-
do el relleno de la cápsula, el ingrediente activo, o ambos, sean hidrófobos o insolubles en agua. Asimismo, se pueden usar
cuando los medios descritos en el capítulo (1 092) y en las guías de la FDAno sean efectivos para dispersar el relleno de las
cápsulas o para lograr condiciones de exceso de medio adecuadas para el ingrediente activo.
Los agentes tensoactivos, agentes de dispersión y mejoradores de la solubilidad incluyen:
• Aniónicos:
- Dodecil sulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés; o lauril sulfato de sodio, SLS, por sus siglas en inglés)
- Sales biliares (desoxicolato de sodio, colato de sodio)
• Catiónicos:
- Bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB,por sus siglas en inglés)
- Bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB,por sus siglas en inglés)
- Cloruro de metilbencetonio (Hyamine™)
• No iónicos:
- Polisorbatos (Tween™)
- Ésteres de sorbitán de polioxietileno
- Octoxinol (Triton Xl 00™)
- N-Óxido de N,N-dimetildodecilamida
-Brij 721
- Aceite de ricino polioxilado (Cremophor™)
- Nonilfenol etoxilado (Tergitol™)
- Ciclodextrinas
- Éter polioxil 1O laun1ico
• Zwitterión
-Óxido de lauril dimetil amina (óxido de dodecildimetilamina, DDAO, por sus siglas en inglés)
- Lecitina
Aunque resultan útiles como agentes solubilizantes, los agentes tensoactivos deben usarse con cuidado debido a que pue-
den interactuar con la gelatina en la cubierta de la cápsula y pueden dificultar la desintegración o la disolución. Asimismo,
pueden inhibir enzimas que se pueden usar para hidrolizar la cubierta de la gelatina y/o el relleno.
Uno de los agentes tensoactivos aniónicos más comunes usado para la prueba de disolución de tabletas, el lauril sulfato de
sodio, presenta ambos efectos adversos mencionados, particularmente en presencia de pH bajos (p. ej., en fluido gástrico si-
mulado). Asimismo, el lauril sulfato de sodio forma precipitados insolubles en presencia de iones de potasio. El lauril sulfato de
sodio es uno de los agentes tensoactivos menos compatibles con enzimas, por lo que únicamente se debe usar lauril sulfato de
sodio con un grado de calidad muy alto en los medios de disolución debido a la interferencia potencial de sus impurezas en la
etapa de cuantificación de la prueba de disolución. Por consiguiente, el uso de lauril sulfato de sodio se debe considerar única-
mente ante la falta de alternativas.
Existen otros agentes tensoactivos aniónicos o catiónicos que han mostrado afectar la solubilidad de la gelatina, por lo que
el grado de estas interacciones debe tomarse en cuenta al momento de seleccionar el medio de disolución. Se debe evitar el
uso de agentes tensoactivos catiónicos en formulaciones que contengan ácidos grasos puesto que dicha combinación puede
formar precipitados insolubles.
3.2.3 USO DE ENZIMAS
Las enzimas proteolíticas tales como la pepsina (a un pH bajo) o la pancreatina (a un pH de 2>:6,8)se pueden usar cuando las
cubiertas de gelatina de las cápsulas no se disuelvan en medios acuosos ordinarios debido al entrecruzamiento, conforme a lo
descrito previamente. La pancreatina tiene la ventaja de poseer también actividad de lipasa, lo que la vuelve útil cuando el
material de relleno de las cápsulas es un triglicérido.
Se deben llevar a cabo pruebas para asegurar que las enzimas usadas en la prueba de disolución no interaccionan de manera
adversa con la formulación. Asimismo, se debe optimizar el medio de disolución (p. ej., ajustando el pH, la fuerza iónica, entre
otros) de modo que conserve la actividad enzimática mientras mantiene las condiciones de exceso de medio para el ingredien-
te activo. Cuando también se usen agentes tensoactivos, se deben evaluar sus efectos adversos potenciales sobre la actividad
enzimática.
3.2.4 PH
Además de establecer un perfil de pH-solubilidad durante el desarrollo de la disolución, también se debe evaluar lo siguien-
te:
• El efecto del pH de los medios sobre el hinchamiento o la disolución de la cápsula basándose en el tipo de gelatina usada
en el producto: ya sea de Tipo A (para cuyo medio, el pH es generalmente 7-9) o Tipo B (para cuyo medio, el pH es
generalmente 4,7-5,4)
• La necesidad de enzimas puede influir sobre la selección de un intervalo de pH específico para ajustarse apropiadamente a
la solubilidad y estabilidad del ingrediente activo y para minimizar los efectos sobre la actividad enzimática.
3.3 Entrecruzamiento en Cápsulas de Gelatina
Conforme a lo tratado previamente, el entrecruzamiento resulta en la formación de películas en la superficie interna o exter-
na de la cubierta. Dependiendo del grado de entrecruzamiento y de la integridad estructural de la cubierta, esta película pue-
de retardar o evitar la liberación del relleno y la disolución de los ingredientes activos durante la prueba.
Las películas a menudo son difíciles de disolver y por lo regular requieren el uso de enzimas proteolíticas en el medio para
lograr la disolución.
La gelatina forma también entrecruzamientos iónicos (puentes salinos), por lo regular entre los residuos con carboxilatos
(aniónicos) y los residuos con grupos amonio (catiónicos) de los aminoácidos que componen la cadena polipeptídica. Aunque
pueden inhibir la disolución de la gelatina, los entrecruzamientos iónicos son mucho más débiles que los entrecruzamientos
covalentes y se pueden alterar cambiando la fuerza iónica o el pH del medio o usando una enzima.
3.3.1 ENTRECRUZAMIENTO
FORZADO
Durante el desarrollo del producto y del método de disolución, la formación forzada de entrecruzamientos en la cápsula de
gelatina puede ser útil para establecer el tipo y la cantidad de enzima que se usará en la prueba, así como para entender de
mejor manera el comportamiento de la formulación en el medio de disolución. Esto se puede lograr agregando cantidades
conocidas de excipientes con cantidades conocidas de formaldehído u otros agentes de entrecruzamiento, o exponiendo las
cápsulas a humedad elevada.
7846 (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución / InformaciónGeneral USP42
3.4 Muestreo
El establecimiento de la técnica y ubicación adecuadas para el muestreo de las cápsulas sigue los procedimientos descritos
en los capítulos (711) y (1092). En el caso de cápsulas rellenas de líquidos hidrófobos, el material de relleno por lo regular
forma una película en la superficie del medio de disolución durante el transcurso de la prueba, por lo que el muestreo debe
realizarse de tal manera que la sonda penetre la capa aceitosa sin obstruirse. Además de los estudios de validación y compatibi-
lidad estándares, se debe tener cuidado al utilizar un filtro para asegurar que éste no se obstruya con aceite o material de la
cubierta de la cápsula no disuelto al momento de tomar la muestra. Se aplican consideraciones similares al equipo de mues-
treo automatizado debido a que los filtros y las líneas de transferencia pueden obstruirse durante el muestreo. Para tratar este
problema, puede ser necesario el uso de agentes tensoactivos y/o enzimas en los medios de disolución para solubilizar de me-
jor manera la cubierta y el relleno de la cápsula. Otro punto a considerar en el caso del equipo de muestreo automatizado es la
sonda. Si se mantiene dentro del medio durante la prueba, puede perturbar la capa aceitosa y posiblemente influir sobre la
hidrodinámica y cambiando el perfil de disolución. Un método alternativo es la eliminación de la sonda y su introducción justo
al momento del muestreo. Se debe validar el método de muestreo para cada producto.
3.5 Cuantificación
Al igual que las muestras de disolución de otras formas farmacéuticas sólidas orales, las muestras de disolución de cápsulas
pueden cuantificarse usando técnicas cromatográficas, espectrofotométricas, de cromatografía-espectrometría de masas en
tándem y demás, después del desarrollo y validación adecuados del método (ver el capítulo (1092), y cuando se presenten las
consideraciones especiales conforme a lo descrito a continuación en la sección 4. Validacióndel Método).
4. VALIDACIÓNDELMÉTODO
Además de los parámetros generales de validación del método tratados en el capítulo (1092), se pueden evaluar las siguien-
tes características de desempeño:
• El efecto del pH y de la fuerza iónica sobre la solubilidad del fármaco y sobre la actividad enzimática, si se usan enzimas
• Para ingredientes activos hidrófobos, la partición relativa de los ingredientes activos entre la matriz y el medio, así como
los efectos adversos potenciales al liberarlos en el medio acuoso
• Para procedimientos cromatográficos, el efecto adverso potencial del agente tensoactivo, si se usa, sobre la separación
cromatográfica; como parte del estudio de robustez, la evaluación de las diferentes concentraciones de agente tensoacti-
vo, los diferentes tipos de agentes tensoactivos, la interacción con sales amortiguadoras, entre otros
• Para procedimientos espectrofotométricos, se debe evaluar la absorbancia a partir de la contribución potencial de la cu-
bierta de la cápsula
• Los efectos adversos potenciales del agente tensoactivo o la enzima, si estuvieran presentes, sobre la vida de la columna
cromatográfica
• La calificación del procedimiento de muestreo para prevenir la obstrucción de la sonda, del sistema de tubos de transfe-
rencia o de los filtros
• Validación de la prueba de disolución en dos etapas (con el uso de enzimas)
- tiempo de remojo previo
- compatibilidad de cualquier agente tensoactivo presente con las enzimas
- verificación de que las condiciones de la prueba de la segunda etapa no afectan el perfil de disolución cuando se
comparan con la prueba de la primera etapa
5. SUGERENCIAS
PARA PUNTOSDE INICIO
Basándose en las consideraciones tratadas anteriormente, los posibles puntos de inicio para establecer una prueba de disolu-
ción para cápsulas con base en las características de solubilidad del relleno y de los ingredientes activos son los siguientes:
Formulaciones posibles:
1. Relleno hidrófilo/ingrediente activo soluble en medios acuosos
2. Relleno hidrófobo/ingrediente activo poco soluble en medios acuosos
3. Relleno hidrófilo/ingrediente activo poco soluble en medios acuosos
4. Relleno hidrófobo/ingrediente activo es soluble en medios acuosos
5.1 Medio
Evaluar la solubilidad del ingrediente activo en medios acuosos dentro de un intervalo de pH de 1,0 a 7,2-7,5.
lf=
5.2 Aditivos para el Medio
Enzimas, tales como la pepsina (a un pH <4,0) o la pancreatina (a un pH ~6,8) se pueden usar cuando el producto presente
evidencia de entrecruzamiento en la cápsula de gelatina. Si el producto es una formulación tal como las formulaciones 2 ó 3
anteriores, evaluar el uso de agentes tensoactivos y la posible interacción con enzimas.
5.3 Aparato
Aparatos 1 ó 2 de la USP.Si la cápsula está rellena de líquido con un peso específico bajo y presenta tendencia a flotar, se
deben usar dispositivos de sumersión. Si el producto es una formulación tal como las formulaciones 2 ó 4 anteriores, conside-
rar como opción el Aparato 3.
5.4 Velocidad de Agitación
La velocidad de agitación por lo regular es de 50-100 rpm para canastillas y de 50-75 rpm para paletas. El uso de velocida-
des mayores deberá justificarse.
5.5 Tiempos de Muestreo
Se debe establecer un perfil de disolución durante la fase de desarrollo para identificar el momento en que la velocidad de
liberación del ingrediente activo se haya estabilizado.
6. ATRIBUTOSCRÍTICOSDE CALIDAD
6.1 Composición de la Cubierta
El conocimiento de la composición de la cubierta (polímero, plastificante, contenido de agua, etc.), según lo tratado al inicio
de este capítulo, es un aspecto importante y ayuda a determinar los atributos críticos de calidad. Otros aspectos importantes
con respecto al entendimiento de los atributos críticos de calidad son la composición y las propiedades de la masa de gel y de
la cubierta terminada. En su forma más simple, la cubierta de una cápsula se prepara a partir de una masa fundida de gel, el
cual, en el caso de las gelatinas duras, consta de gelatina u otros polímeros y agua, y, en el caso de gelatinas blandas, la cubier-
ta consta de gelatina y un plastificante disuelto en un vehículo acuoso. La relación entre polímero y plastificante varía depen-
diendo de las características de desempeño deseadas de la cubierta, del tamaño de la misma y de la composición del material
de relleno. Otros componentes menores agregados a la masa de gel pueden incluir colorantes, saborizantes, estabilizadores,
amortiguadores y agentes opacificantes. Las características físicas y la calidad de estos componentes menores son una parte
central para el diseño de formulaciones robustas y de alta calidad. La composición de gelatinas duras, por lo regular, no varía
con el tamaño de la cápsula.
6.1.1 GELATINA
Proceso de fabricación de cápsulas de gelatina: Para gelatinas duras, existen dos etapas distintas de fabricación: (1) la fa-
bricación de cubiertas vacías y (2) el proceso de llenado. Las cubiertas de las cápsulas se producen, envasan y transportan a los
fabricantes de la forma farmacéutica. Posteriormente, las cápsulas se llenan y se sellan. La mayor parte de la maquinaria mo-
derna para relleno de cápsulas está diseñada para permitir el relleno exacto con polvos, gránulos, pellets, tabletas y combina-
ciones de los mismos, y en muchos casos se pueden modificar para poder llenar gelatinas duras con líquidos calientes o fríos.
Una parte esencial de una operación de llenado con líquidos es la capacidad de sellar de manera efectiva la cápsula. Este pro-
ceso de sellado es un parámetro crítico del proceso, y es importante el conocimiento detalladao de todos los aspectos de este
proceso.
Para gelatinas blandas, la formación de la cápsula, el proceso de llenado (proceso de encapsulación) y el sellado de las cáp-
sulas se producen de manera simultánea. Durante el proceso de encapsulación, es importante monitorear el espesor de la cu-
bierta, la calidad de la costura, el peso de la cápsula y el peso del relleno usando controles estadísticos para el proceso.
Composición química de la gelatina: El conocimiento de la naturaleza química de la gelatina es otro componente impor-
tante de los atributos críticos de la formulación. La gelatina se clasifica principalmente por la consistencia del gel. Dependiendo
del proceso y de la fuente del tejido, surgen diferencias notorias entre proveedores e incluso entre lotes del mismo proveedor.
Por consiguiente, el control de la consistencia de la gelatina entre partidas, medida en grados Bloom, es clave para obtener un
producto con un desempeño uniforme. La graduación Bloom es una forma de medir la consistencia del gel preparado a una
concentración establecida de gelatina en agua en condiciones controladas y es una función del peso molecular de la gelatina,
de la concentración de la gelatina en el gel y del pH del gel. Es una medición de la resistencia resultante del gel a la compre-
sión y se informa en grados Bloom o gramos. La consistencia en grados Bloom aumenta cuando se incrementa la concentra-
ción de gelatina en el gel, cuando aumenta el peso molecular promedio de la gelatina y cuando el pH del gel se aproxima a la
7848 (1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución/ Información General USP42
neutralidad (desde cualquier dirección). Asimismo, a medida que aumenta la consistencia en grados Bloom, también aumenta
el costo de la gelatina y se reduce la velocidad de disolución del gel. La consistencia en grados Bloom también tiene un efecto
sobre la transparencia y el color de las cápsulas rellenas de líquido. Para gelatina con una mayor consistencia en grados Bloom,
se requiere menos gelatina para producir una cubierta adecuada, lo que resulta en una cubierta más transparente y en una
menor necesidad de colorantes y tintes para producir el tono deseado. Aunque la gelatina puede comprarse con grados Bloom
que van de 50 a 300, la mayoría de las gelatinas usadas en la fabricación de cápsulas rellenas de líquido tienen una consisten-
cia en grados Bloom de aproximadamente 150-200 para gelatinas blandas y 220-280 para gelatinas duras. Los fabricantes de
gelatinas, por lo regular, mezclan diversos sublotes de gelatina para cumplir con los requisitos de consistencia en grados
Bloom. Estas importantes características de la gelatina deben tomarse en cuenta al caracterizar el producto en desarrollo.
6.1.2 QUÍMICADE OTROS POLÍMEROS
Se debe prestar atención adecuada a los otros polímeros usados para fabricar las cubiertas de las cápsulas. Los carragenanos
iota y kappa, los almidones de maíz, papa y guisante modificados, así como las celulosas modificadas, junto con los plastifican-
tes, también se usan para la preparación de las cubiertas de las cápsulas. Los carragenanos son polisacáridos que se extraen de
las algas marinas. Poseen las características de gelificación requeridas similares a las de la gelatina. No obstante, el carragenano
kappa produce un gel quebradizo, mientras que el carragenano iota produce un gel blando y elástico. Por lo regular, los carra-
genanos se combinan con almidones modificados y plastificantes para formar la cubierta de la cápsula. Las celulosas modifica-
das tales como hipromelosa (HPMC, por sus siglas en inglés), también se usan en la fabricación de gelatinas duras. En compa-
ración con la cubierta de gelatina, la cubierta que se prepara usando los polímeros mencionados anteriormente presentará al-
gunas ventajas, tales como ausencia de entrecruzamiento, capacidad de tolerar intervalos más amplios de pH y tolerancia a
una temperatura de llenado elevada.
6.1.3 COADYUVANTES
DELPROCESAMIENTO
Los coadyuvantes del procesamiento incluyen lubricantes de cinta de gelatina en el proceso de fabricación de la gelatina
blanda. Los lubricantes de cinta de uso común incluyen aceite mineral y triglicéridos de cadena media. Puesto que los lubri-
cantes de cinta se aplican a las superficies internas y externas de la cubierta de la cápsula, la evaluación de sus efectos adversos
potenciales se enfoca en la cápsula misma y, principalmente, en el entrecruzamiento de la gelatina.
6.2 Estabilidady Condicionesde Almacenamiento
El conocimiento de la estabilidad y la reactividad de la gelatina o de otros polímeros es esencial para anticipar su influencia
sobre la calidad del producto final. A temperatura ambiente, las cubiertas de las cápsulas tal como se proveen son relativamen-
te efectivas para proteger el relleno del oxígeno y sus efectos, y cuando se agrega un agente opacificante tal como dióxido de
titanio a la cubierta, puede prevenir la fotodegradación del relleno. Asimismo, la baja actividad de agua de la cubierta no pro-
mueve el crecimiento microbiano. Para que las bacterias, hongos filamentosos y levaduras crezcan, se requiere de una mayor
actividad de agua de al menos 80 unidades de actividad de agua; la actividad del agua en las cubiertas de las cápsulas es por
lo regular menor de 0,40 unidades de actividad de agua.
Las condiciones de almacenamiento del producto final van desde temperatura de refrigeración hasta temperatura ambiente
estándar. Los productos deben almacenarse de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta. Se deben evaluar las desviaciones
breves fuera de dichas condiciones para determinar su influencia en la calidad del producto final. Asimismo, se deben conside-
rar las condiciones y la duración del almacenamiento para las cubiertas de las cápsulas vacías.
6.3 Desarrollode la Formulacióny Fabricaciónde las CápsulasRellenasde Líquido
Resulta importante entender las propiedades de los ingredientes activos durante el desarrollo de la formulación.
Se pueden aplicar las formulaciones que se desarrollan usando tecnología para rellenos líquidos cuando los ingredientes acti-
vos (1) presentan una baja solubilidad en sistemas acuosos, (2) tienen una vida media corta que requiere dosificación frecuen-
te, (3) tienen un punto de fusión bajo, (4) se caracterizan por una dosis baja/potencia alta cuando es importante mantener la
proporción dosis baja/potencia alta, (5) tienen un requisito de enmascaramiento del sabor u olor y (6) requieren una estabili-
dad química o física crítica como en el caso de ingredientes activos altamente higroscópicos. Otros factores que se deben con-
siderar durante el desarrollo de la formulación incluyen:
• La compatibilidad y estabilidad de excipientes e ingredientes activos con el paso del tiempo
• La solubilidad dependiente de la temperatura del ingrediente activo en el lípido
• Las características de envejecimiento/polimórficas del lípido
• La caracterización adecuada del estado de saturación/supersaturación de los ingredientes activos en la formulación del lí-
pido para evitar la precipitación de los ingredientes activos. Idealmente, el estado de saturación debe determinarse cuan-
do la formulación se encuentra en equilibrio con la cubierta.
• La estabilidad en solución en condiciones de estrés
USP42 Información General/ (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel 7849
• La formación de aldehídos y degradación de los ingredientes activos

• La influencia, si la hubiere, que tiene la velocidad de enfriamiento sobre la estructura de ciertos excipientes, lo cual puede
modificar las características de liberación de los ingredientes activos
Entre los factores importantes a considerar durante una operación de relleno con líquidos son la temperatura y la viscosidad
del material de relleno y, en el caso de una dispersión o suspensión, el tamaño de partícula de los ingredientes activos dispersa-
dos. En principio, se puede usar cualquier excipiente que se determine compatible con la cubierta, aunque en un ambiente de
fabricación, la viscosidad del material de relleno es importante. Los excipientes que son sólidos a temperatura ambiente pero
que funden a temperaturas de hasta 70° pueden ser adecuados (dependiendo del polímero de la cubierta) para formular in-
gredientes activos, siempre que dichos excipientes produzcan el desempeño in vivo deseado.
Resulta necesario controlar los niveles de entrecruzamiento de los agentes conocidos, tales como formaldehído y azúcares
reductores, en los excipientes de la cubierta y del relleno.
Las imperfecciones en la cubierta y/o en la costura pueden afectar la disolución, además de que pueden generar fugas del
contenido de las cápsulas.
Se debe contar con controles durante el proceso apropiados para monitorear y reducir la variabilidad entre lotes.
(1097) PROCEDIMIENTOSPARAELMUESTREODE POLVOSA GRANEL
INTRODUCCIÓN
Este capítulo tiene como objetivos proporcionar pautas relacionadas con los procedimientos de muestreo de polvos a granel,
identificar conceptos importantes del muestreo de polvos a granel y recopilar información básica sobre prácticas y considera-
ciones útiles que puedan llevar al muestreo físico ideal de materiales en polvo a granel. La terminología usada en este capítulo
está bien establecida en el campo del muestreo de materiales (por ejemplo, ver la referencia 7 en el Apéndice3). El muestreo se
lleva a cabo como parte de un proceso de estimación. El parámetro de interés primario es el nivel medio de algún analito en la
totalidad del polvo a granel.
El propósito de un plan de muestreo es obtener una muestra representativa de una población de tal manera que se puedan
sacar conclusiones válidas sobre la población muestreada con cierto nivel o grado de confianza. La obtención de una muestra
representativa de un lote es una tarea crítica debido a que sin una muestra representativa todos los análisis e interpretaciones
de datos adicionales sobre el lote resultan dudosos. Un proceso de muestreo ideal se define como un proceso en el que todas
las partículas o al menos todas las porciones de igual tamaño de la población tienen la misma probabilidad de ser selecciona-
das en la muestra. Además, los procedimientos de muestreo deben ser reproducibles, es decir que si se repitiese el protocolo
de muestreo, debería existir una alta probabilidad de obtener resultados similares. Asimismo, la integridad de la muestra debe
conservarse durante y después del muestreo. Los detalles sobre la forma de realizar el muestreo dependen de una variedad de
factores. Por ejemplo, los criterios de muestreo para evaluar la segregación de partículas pueden diferir de los criterios para
evaluar el contenido de humedad o la identificación.
Debido a la tendencia de un polvo a la segregación, los sistemas heterogéneos pueden dificultar la obtención de una mues-
tra ideal. Por consiguiente, para extraer muestras representativas se requiere del desarrollo cuidadoso de un plan de muestreo
que tome en cuenta y mitigue la tendencia a la segregación. El desarrollo de pautas generales para el muestreo de polvos a
granel supone diversos desafíos debido a que cada situación es diferente y, por lo tanto, se deben usar diversos enfoques para
hacer frente a cada situación. En consecuencia, el objetivo de este capítulo de información general es delinear los pasos reco-
mendados para desarrollar un esquema o plan de muestreo que sea consistente con las buenas prácticas.
La dificultad primaria para obtener una muestra representativa es que el tamaño de la muestra para la medición, típicamente
de unos pocos miligramos a gramos, se debe retirar de una gran población que está en el orden de cientos a miles de kilogra-
mos. Los pocos miligramos analizados en un laboratorio se deben tomar de una gran población de partículas de un depósito
de tal manera que la muestra para medición sea representativa de todas las partículas del lote. Cualquier sesgo o error en el
proceso de muestreo ocasionará que todas las conclusiones futuras sean erróneas. Con el paso de los años, se han desarrollado
y perfeccionado métodos con la intención de asegurar que la muestra para medición sea representativa de toda la población
general. La Figura 1 presenta una estrategia típica, la cual consiste en muestrear por etapas, comenzando con la muestra inicial
bruta o primaria retirada directamente de los envases recibidos. Eltamaño de la muestra bruta debe ser reducida en el labora-
torio hasta que tenga un tamaño apropiado para la medición. Esto debe realizarse de tal manera que se minimice la introduc-
ción de errores de muestreo. La clave para reducir el error de muestreo radica en asegurar que cada partícula de la población
tenga la misma probabilidad de ser incluida en la muestra. Sin embargo, debido a la segregación o a la naturaleza no aleatoria
de los polvos, son muchos los obstáculos que pueden generar sesgos y contribuir a la aparición de errores de muestreo. Seguir
el diagrama de flujo de la Figura 1 y los pasos delineados en los debates subsiguientes ayudará a minimizar los errores de
muestreo.
7850 (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel / Información General USP42
•••
2 N
Lote inicial: Escala de 100tos de kg
t
Muestra bruta: Escala de kg
Muestra de laboratorio: Escala de g
¡
Muestra para medición: Escala de mg
Figura 1 . Estrategia de muestreo general para reducir el tamaño de la muestra de la escala de cientos de kg a la escala de
mg.
Para adquirir una muestra representativa se debe desarrollar e implementar un plan de muestreo adecuado. Un buen plan
de muestreo incluye: (1) la determinación de la población y la selección del tamaño de la muestra, (2) un procedimiento de
recolección de muestras y un método de reducción del tamaño de la muestra y (3) resumen de precálculos que demuestren
que el plan de muestreo generará muestras que caractericen de manera exacta a la población dentro de un nivel declarado de
aceptación. Asimismo, se requiere una infraestructura para mantener la integridad de las muestras y de los materiales mues-
treados.
Este capítulo comienza con una breve introducción a la teoría y terminología del muestreo. El contenido técnico del capítulo
requiere de una compresión científica básica de las características físicas (p. ej., masa, densidad, forma y tamaño) y estatísticas
(p. ej, muestreo de aceptación y distribución binomial) de las partículas.
DELMUESTREO
TEORÍAY TERMINOLOGÍA
Tamaño Fundamental de la Muestra (Masa de la Muestra)
El tamaño de la muestra se considera desde dos perspectivas: (1) la masa de la muestra con la que se pretende representar a
toda la población, en ocasiones denominada muestra compuesta y (2) el número de muestras tomadas con una masa suficien-
te para evaluar, comparar o proporcionar confianza de manera independiente a fin de asegurar la reproducibilidad de la mues-
tra compuesta o la uniformidad de la población. La clave para obtener una muestra ideal consiste en comprender y tomar en
cuenta el grado de heterogeneidad de la característica que se evalúa en el sistema en estudio. Por ejemplo, la heterogeneidad
de un sistema de partículas se produce a partir de dos fuentes: la heterogeneidad intrínseca, constitutiva o de composición y la
heterogeneidad de la distribución espacial. La heterogeneidad intrínseca del sistema de polvos refleja las diferencias fundamen-
tales en las partículas individuales. Se espera que la heterogeneidad estadística (diferencias entre individuos), o varianza, man-
tenga las propiedades asumidas. Para una población normal, la expresión general para un tamaño de muestra estadístico su-
giere que el número de muestras independientes sea proporcional al cuadrado de la función cuantil normal al nivel de confian-
za deseado (Z) y a la varianza de la población (cr2}, y sea inversamente proporcional al cuadrado de la diferencia mínima detec-
table requerida (o}, según se muestra en la ecuación 1:
Resulta necesario tomar en cuenta las características del material a fin de aplicar la ecuación teórica normal del tamaño de la
muestra a la masa de la muestra con un número discreto de partículas. Para un material a granel heterogéneo, tal como un
polvo a granel, la masa de la muestra requerida para asegurar la representación adecuada de la heterogeneidad o variación
intrínseca o fundamental de la población se determina por el tamaño, la forma y la densidad de las partículas. El error total de
muestreo (ETM) mide la diferencia entre la concentración del analito estimada en la muestra (amuestra) y la concentración media
del analito en el lote (a10,.) en relación con la concentración media del analito en el lote (a10,.), según se muestra en la ecuación
2:
ETM 8 muestra- 8 101e (2)

alote
Cuando se emplea un muestreo ideal, el ETM se reduce a un error de muestreo fundamental, limitado únicamente por la
heterogeneidad intrínseca del material. La varianza relativa del error de muestreo fundamental (Sem/}ha sido estimada empíri-
USP42 InformaciónGeneral/ (1097) Procedimientospara el Muestreo de Polvosa Granel 7851
camente en aplicaciones de tamaño de partícula mediante la caracterización de la masa crítica de partículas, la heterogenei-
dad, el tamaño (diámetro), la forma, la densidad y los pesos del material. Los estimados empíricos requieren de un conoci-
miento cabal y completo del material y del proceso. Los métodos y la caracterización del material establecidos son aspectos
críticos para evitar estimaciones inaceptables. Según se muestra en la ecuación 3:
donde f1orma es una medida del factor de cubicidad o forma de las partículas del analito; gfc;,el factor granulométrico, es un
factor empírico de corrección de diferencias en el tamaño de partículas; cmáxes la heterogeneidad máxima de composición y se
calcula como si el material consistiera en las partículas de analito y en todo lo demás; 1,el factor de liberación, es un factor
empírico que representa la proporción de partículas de contenido crítico separadas de las partículas del lote que no contienen
analito; dmáxes el diámetro de partícula [por ejemplo, el diámetro máximo o el diámetro (cm) del tamaño de la abertura de un
tamiz que retiene S% en peso del lote que se va a muestrear]; mmuestra es la masa de la muestra; y m10,. es la masa del lote que
se está muestreando. [NOTA-Cuando el analito no aparece como partículas separadas se requiere un factor de liberación. Un
valor de liberación alto (1,0) sugiere la heterogeneidad de las partículas. Un valor de liberación bajo (0,05) sugiere partículas
muy homogéneas. El Apéndice1 proporciona ejemplos de aplicaciones potenciales de la ecuación 3 en la estimación de la ma-
sa fundamental de la muestra requerida para dar cuenta de la heterogeneidad constitutiva de la mezcla de polvos.] El uso de la
ecuación 3 requiere la estimación previa de f1ormv gFc, Cmáx,
1y dmáx•
Error de Segregación
La heterogeneidad de la distribución es la diferencia espacial o temporal entre muestras o grupos de partículas. Por ejemplo,
las partículas pequeñas se localizan preferentemente en la porción inferior de un lecho de polvo. Este tipo de situación puede
surgir como resultado de la segregación del lecho y es común en algunos sistemas con amplia distribución del tamaño de par-
tícula. En otras palabras, es posible que las partículas más pequeñas no estén distribuidas de manera aleatoria en todo el lote.
La heterogeneidad espacial introduce una variación en la muestra y es una fuente de variación que contribuye a la variación
total. En conjunto, el error fundamental y de segregación originan un error de muestreo, el cual establece cuan variables serán
las muestras, cuan grandes deberían ser el tamaño y el número de muestras (p. ej., 1O envases de los que se obtienen mues-
tras de la parte superior y del fondo, con tamaños de muestra de 50 g cada una) y qué tan difícil será obtener una muestra
representativa.
Minimizar los efectos del error de segregación durante la caracterización del material del lote, sin dejar de asegurar una ma-
sa de muestra representativa, requiere la recolección de muchas muestras pequeñas que promedien la variación del error de
segregación. Con esto se asume que se está interesado en estimar el promedio general y no en caracterizar la heterogeneidad
del lote. El error de segregación es difícil de controlar debido a que la segregación puede ser el resultado de cambios en el
tamaño, la forma y la densidad de las partículas, así como en la entrada de datos en la determinación de la masa de la mues-
tra. Minimizar los efectos del error de segregación al momento de reducir el tamaño de la muestra primaria requiere del mez-
clado físico adecuado o de la distribución al azar de las muestras primarias antes del análisis, proporcionando así una probabili-
dad de selección similar.
Error Total del Método de Muestreo
La heterogeneidad intrínseca o de composición es una función del sistema de polvos y representa las verdaderas característi-
cas del material (p. ej., la ecuación 3). Por consiguiente, la heterogeneidad intrínseca es a menudo la varianza mínima que
puede tener un sistema. La diferencia entre el estado verdadero del sistema y lo qué en realidad se mide al emplear un mues-
treo ideal se denomina error fundamental (ecuación 2). La varianza relativa del ETM (el S2To1ai) se representa en la ecuación 4
como la suma de las varianzas relativas de todos los componentes del error:
s 2
Total
= s fundamenta!
2
+ s 2
..
segregac1on
+ s 2
..
extraccion
+ s 2
. .
dellm1tac1ón
+ s 2
.
preparación
+ s 2
.. +
tendencias,cambios
s 2
c1c!os
+ s 2
.
metodo analítico
(4)
El S2r0 ,. 1 se puede reducir empleando un muestreo ideal. El muestreo ideal limitará o se ajustará a los efectos del error aporta-
do por la segregación de partículas, del error de extracción creado por el dispositivo de muestreo, del error de delimitación
creado al no considerar la naturaleza del material a granel de tres dimensiones y de los errores de manipulación de la muestra
tales como la degradación del producto. La variación total es la suma de estas fuentes de error, ilustradas en la ecuación 4
como componentes sumandos independientes. A fin de reducir estos errores, un objetivo importante en la caracterización del
material por muestreo es la determinación de los errores pertinentes dentro de la muestra a granel. Conocer la fuente del error
ayuda a determinar la mejor manera de minimizar estos errores.
El error fundamental surge de la heterogeneidad intrínseca de las partículas dentro de una muestra de la población del ma-
terial. El error fundamental se reduce cambiando las características intrínsecas del material tales como reducir el tamaño de
partícula mediante molienda o trituración. El error de segregación es la diferencia en la distribución espacial de las partículas
7852 (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel / InformaciónGeneral USP42
en toda la población. Este tipo de error se puede minimizar mezclando o distribuyendo al azar las partículas que se están selec-
cionando. El error de segregación se ve afectado por las características del error fundamental. Asimismo, para la determinación
tanto del error fundamental como del error de segregación, se asume que el muestreo mecánico se lleva a cabo de manera
correcta y que no es invasivo, es decir, que el muestreo mecánico no altera las características que se están midiendo y propor-
ciona una representación verdadera. En los casos en los que el muestreo del material a granel proporciona una representación
sesgada o es tan invasivo que altera las características del material, es posible que los operadores, a fin de obtener una repre-
sentación sin sesgo y no invasiva, puedan cambiar el muestreo de una forma a granel a una forma de muestreo continuo du-
rante el proceso, ya sea antes o despúes (más cerca o más lejos) en el proceso (ver el Apéndice2). Es posible que el muestreo
mecánico requiera mezclar la muestra lo suficiente como para facilitar el muestreo aleatorio con una probabilidad de selección
similar a fin de obtener una representatividad adecuada del lote a granel completo. El proceso también puede requerir del
mezclado o muestreo desde un punto en el proceso que proporcione una muestra aleatoria del material que sea susceptible a
la segregación.
Los errores de extracción, delimitación y manipulación resultan del muestreo mecánico y de la manipulación de la muestra
antes del análisis, los cuales también se ven afectados por el error fundamental. Las tendencias, los cambios y los ciclos son
fuentes temporales de errores que afectan al error total. El error analítico del método de análisis contribuye al error general del
resultado obtenido. Además de obtener submuestras representativas a partir del material a granel, el método también debe
obtener una submuestra representativa a partir de la muestra particulada del laboratorio antes del análisis.
Estrategia de Muestreo
Una estrategia típica de muestreo se compone de dos etapas básicas: (1) la muestra primaria o bruta, seguida de (2) la
muestra secundaria, la cual reduce la muestra primaria a un tamaño adecuado para medición en el laboratorio. En resumen, el
objetivo es seleccionar del lote una cantidad de material adecuado para la medición, sin cambios significativos del atributo por
el que se realiza el muestreo. En paralelo a la reducción del tamaño de la muestra, los cálculos del tamaño de la muestra se
deben llevar a cabo de tal manera que la estrategia de muestreo tenga un poder estadístico suficiente para determinar si los
atributos relevantes se encuentran dentro de los parámetros especificados con un grado de certeza razonable. Cada etapa de-
be realizarse de manera correcta o la estrategia de muestreo en su conjunto no proporcionará una muestra que sea representa-
tiva de la población original.
Para retirar con éxito una muestra de un envase a granel que sea representativa de la población, es necesario tener una idea
de la heterogeneidad de la población, es decir, qué tan segregado o estratificado es el sistema. El conocimiento de los factores
que puedan acentuar la segregación y los probables modelos de segregación ayudará a determinar la causa de la segregación
en un lecho de polvo y a tomar mejores muestras. Son muchos los factores que pueden afectar el grado de segregación del
lecho de polvo. Para que ocurra la segregación, es necesario aplicar suficiente energía al lecho de polvo para inducir el movi-
miento entre las partículas. Cuando se suministra una cantidad suficiente de energía, la segregación puede ocurrir en tres mo-
dos: percolación (en el lecho de polvo), rodado (en las superficies libres del lecho de polvo) y flujo libre (cuando el lecho de
polvo se fluidifica). Estos modos se ilustran en la Figura2.
Vibración del Lecho
Perco!ación Rodado Flujo Libre
Figura 2. Ilustración de los tres modos de segregación de partículas: percolación, rodado y flujo libre.
Dentro del lecho de polvo, la segregación puede ocurrir por percolación, también denominada segregación por tamizado,
así como por el movimiento de partículas gruesas hacia la parte superior mediante vibración. Durante la segregación por tami-
zado, las partículas más pequeñas que actúan por la influencia de la gravedad pueden migrar más fácilmente hacia abajo ocu-
pando los espacios vacíos entre las partículas de mayor tamaño cuando se perturba el lecho de partículas. El efecto neto de
estos movimientos radica en que las partículas más pequeñas se filtran hacia abajo en el lecho del polvo, lo que resulta en una
mayor proporción de las partículas de mayor tamaño en la parte superior del lecho. Un ejemplo común de segregación por
tamizado son los granos de maíz sin inflar que se encuentran en la parte inferior de una bolsa de maíz inflado.
Para las superficies libres, la segregación por rodado puede ocurrir en cualquier momento en que las partículas puedan rodar
hacia abajo en una superficie libre. En otras palabras, la segregación puede ocurrir en cualquier superficie desnivelada que per-
mita el movimiento relativo de partículas. Cuando las partículas ruedan en estas superficies libres, las partículas de mayor ta-
maño tienden a caer aún más abajo en la superficie que las partículas más pequeñas (ver la Figura3). Por ejemplo, si se forma
un montón o pila cónica en medio de una tolva durante la carga, las partículas de mayor tamaño son más propensas a rodar
más hacia abajo en el montón, hacia el borde exterior de la tolva. Lo anterior genera una situación en la que las partículas más
pequeñas tienden a estar en el centro de la tolva y las partículas de mayor tamaño se acumulan hacia la pared externa de la
tolva. La formación de estas superficies libres puede representar un factor importante en la segregación.
Regióndel techode polvo

accesibleal muestreocon
cuchara
Mayorconcentracíónde
partículasde mayor tamaño
Mayorconcentraciónde
partículasmás pequeñas
Figura 3. Ejemplo de segregación extensa en el polvo dentro de un tambor.
Cuando el lecho de polvo se fluidifica, se incorpora una gran cantidad de aire y cuando este aire está en movimiento, su
velocidad puede exceder la velocidad terminal de las partículas más pequeñas. Cuando esto sucede, las partículas finas se sus-
penden en la corriente de aire, mientras que las partículas gruesas sedimentan. Eventualmente, las partículas finas sedimentan
en la parte superior del lecho de polvo, formando una capa superior con una concentración mayor de partículas finas. Este
tipo de segregación, en ocasiones denominada segregación por elutriación, puede ocurrir cuando se descarga un polvo de
una tolva o cuando se vierte en la parte superior de una tolva y se desplaza un gran volumen de aire.
En resumen, para un sistema con un alto nivel de segregación, el lecho de polvo podría tener una distribución de partículas
similar a la mostrada en la Figura3, en la que, como resultado de la segregación por elutriación, una capa de partículas finas
en la parte superior reviste a las partículas de mayor tamaño depositadas por la segregación por percolación, y se presenta una
distribución radial de las partículas de mayor tamaño hacia la pared exterior como resultado de la segregación por rodado.
En general, los factores primarios que afectan a la segregación son el tamaño y la distribución del tamaño, la densidad y la
forma y la distribución de la forma de las partículas. De menor importancia resultan la rugosidad de la superficie, el coeficiente
de fricción de la superficie, el contenido de humedad y la forma y diseño del envase. Eltamaño de partícula es el factor indivi-
dual más importante y las diferencias sutiles en el tamaño de partícula pueden ocasionar una segregación medible. Si el atribu-
to relevante está asociado con el tamaño de partícula, entonces este atributo segregará junto con los tamaños diferentes de
partícula. Por ejemplo, si un fabricante elabora un granulado en el que las partículas de mayor tamaño contienen más fármaco
que las partículas más pequeñas, entonces el contenido de fármaco puede ser muy propenso a la segregación-es decir, el
contenido de fármaco presentará patrones de segregación similares a los asociados con la segregación por tamaño de partícu-
la.
La segregación puede incrementar notablemente el error de muestreo debido a que reduce la probabilidad de que ciertos
tipos de partículas se encuentren en la muestra. Además, cabe la posibilidad de que el lecho de polvo ya se hubiera segregado
al momento de recibir el material; asimismo, la manipulación deficiente de la muestra puede ocasionar segregación. Para evitar
la segregación adicional durante la manipulación de la muestra, el operador debería evitar situaciones que promuevan la se-
gregación, tales como las siguientes: verter donde el polvo forme una superficie inclinada, verter en el núcleo de una tolva, las
vibraciones, agitar y revolver (a menos que se haga para promover el mezclado). Asimismo, el uso de tolvas de flujo de masa
reduce la segregación.
Existen dos estrategias básicas que ayudan a promover el muestreo ideal: (1) usar un muestreador y (2) muestrear a partir de
una corriente de polvo en movimiento.
Un muestreador es una sonda larga en forma de arpón que se puede insertar en el lecho de polvo y que, una vez insertado,
puede recolectar muestras de los puntos adyacentes al arpón. Las partículas de casi cualquier punto del lecho de polvo pueden
ser incluidas en la muestra con el uso de un muestreador. El segundo método se basa en principios fundamentales de mues-
treo, principalmente en que (1) un polvo siempre debe muestrearse cuando esté en movimiento y (2) toda la corriente de
polvo debe muestrearse durante muchos periodos cortos en lugar de muestrear una parte de la corriente durante un periodo
prolongado.
Por ejemplo, si el envase a muestrear se vacía en una cinta transportadora, todo el material pasará por un solo punto en que
se pueda muestrear. De esta forma, sin importar qué tan segregado esté el sistema, la recolección del polvo en tiempos de
muestreo seleccionados al azar asegura que todas las partículas tengan una misma probabilidad de ser incluidas en la muestra.
El segundo principio fundamental toma en cuenta la segregación de material en la cinta transportadora: al recolectar toda la
corriente se obtiene una sección transversal de todas las partículas, sin importar cuánta segregación ocurra en la cinta trans-
portadora.
Se dispone de una gran cantidad de métodos para la obtención de una muestra de un sistema de polvo. Muchos de estos
métodos implican poner el lecho de polvo en movimiento o llevar a cabo el muestreo durante el proceso. Debido a la posibili-
dad de contaminación cruzada y a la presencia de materiales potencialmente tóxicos, la mayoría de estos métodos son poco
prácticos para el muestreo a granel requerido para cumplir con las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes (cGMP, por sus
siglas en inglés). Por consiguiente, la mayoría de los muestreos realizados en la industria farmacéutica son muestreos estáticos,
que se llevan a cabo ya sea mediante (1) muestreo con cuchara o muestreo por captura, o (2) muestreo estratificado, típica-
mente empleando un muestreador. La selección del método se establece por la distribución del atributo que se está mues-
treando en el envase, según se analiza a continuación.
RECOLECCIÓN
GENERALDE MUESTRAS:CONSIDERACIONES
Y HERRAMIENTAS
Tipos de Sistemasy ConsideracionesGenerales
SISTEMASHOMOGÉNEOS
Para los sistemas de polvo en los que el atributo relevante está distribuido uniformemente en todo el envase-de manera
que cualquier muestra sea una representación no sesgada de todo el envase, lote o población en análisis-el muestreo con
cuchara resulta adecuado. El muestreo con cuchara es un procedimiento sencillo en el que el operador, después de seleccionar
envases representativos para muestreo, abre un envase, retira con cuchara una cantidad suficiente de material de la parte su-
perior del lecho de polvo, y posteriormente, sella el envase. Si se sospecha que una delgada capa de material en la parte supe-
rior del lecho de polvo es diferente del material a granel, las muestras deben tomarse de un punto por debajo de esta capa
superior. Por ejemplo, en los casos de segregación por elutriación, es posible que una capa delgada de partículas finas se en-
cuentre en la parte superior del lecho de polvo, por lo que el operador debe profundizar en la cama de polvo para evitar la
obtención de muestras de esta capa. La cuchara debe ser lo suficientemente grande como para que no se pierda material du-
rante la manipulación, puesto que la pérdida de material puede resultar en un sesgo de la muestra. En otras palabras, se debe-
ría evitar el uso de una cuchara muy colmada de la que el material pudiera rodar por los costados. Las ventajas del muestreo
con cuchara son la conveniencia y el costo, y para materiales altamente potentes, se pueden usar cucharas desechables de
bajo costo para minimizar la contaminación cruzada.
SISTEMASHETEROGÉNEOS
Si el atributo relevante está distribuido espacialmente de manera heterogénea por toda la muestra, entonces el muestreo
con cuchara es propenso a errores potencialmente significativos. El muestreo con cuchara es un método no probabilístico de-
bido a que solamente se muestrea la fracción más accesible del envase. Obviamente, con una cuchara solo es posible alcanzar
el material en la capa superior. Por ejemplo, una muestra del borde exterior del tambor mostrado en la Figura3 puede estar
sesgada debido a que en este ejemplo, las partículas de mayor tamaño están distribuidas preferentemente hacia los bordes
superior y exterior del tambor. En consecuencia, las partículas más pequeñas tienen una menor probabilidad de aparecer en la
muestra. Como resultado, las partículas pequeñas no tendrán una representación aceptable en la muestra y cualquier análisis
de tamaño de partícula no reflejará la verdadera distribución del tamaño de partícula de la población original.
Para los sistemas heterogéneos, la muestra primaria inicial es la más difícil de obtener, por lo que es necesario el uso de un
muestreador, en ocasiones denominado sonda de granos o arpón de muestreo. La ventaja de un muestreador es que se puede
acceder a una mayor parte del lecho de polvo debido a que puede obtener muestras de diferentes puntos del lecho, lo cual
ayuda a reducir el sesgo del muestreo. Se encuentran disponibles muchos tipos de muestreadores, incluyendo: (1) la sonda de
tubo doble con compartimentos, (2) la sonda de tubo con un solo compartimento, (3) el muestreador de apertura terminal y
(4) el muestreador de n.úcleo. Cada uno de estos tipos tiene sus propios procedimientos operativos, según se describe a conti-
nuación.
La sonda de tubo doble con compartimentos separados es probablemente el tipo de muestreador más popular usado en la
industria farmacéutica. Este tipo consiste en dos tubos o cilindros concéntricos, en el cual el tubo interno se divide en compar-
timentos. Este diseño permite detectar diferencias en el atributo relevante a distintas profundidades del envase. Para recolectar
una muestra, el operador cierra los compartimentos e inserta el muestreador en el lecho de polvo con las aberturas de la zona
de recolección orientadas hacia arriba. El mango se gira para abrir las zonas de muestreo; después, el mango se mueve hacia
arriba y hacia abajo con dos movimientos cortos y rápidos para ayudar a llenar los compartimentos. Posteriormente, se cierra
el muestreador y se retira del lecho de polvo. El operador debe inspeccionar visualmente el polvo extraído antes de vaciar el
muestreador. El polvo de los compartimentos individuales se puede combinar en una superficie limpia o en un recipiente para
recolección. En algunas situaciones el material de cada compartimento se puede analizar por separado, sin mezclarlo.
En la sonda de tubo con un solo compartimento, el tubo interno no está dividido en compartimentos. La sonda se inserta
primero en el lecho de polvo con el compartimento abierto, luego se rota la manga externa a la posición de cerrado, y poste-
riormente, el muestreador se retira del lecho de polvo. El contenido de la sonda se vacía del extremo del mango sosteniendo la
sonda en posición vertical y permitiendo que la muestra se deslice hacia afuera del mango; éste es un método más convenien-
te que el utilizado con la sonda de tubo doble con compartimentos separados. Sin embargo, este tipo de muestreador dificulta
más llevar a cabo la inspección visual para examinar el material en busca de inconsistencias que dependen de la profundidad.
Una sonda muestreadora de apertura terminal, por lo regular usada para muestrear suspensiones espesas, tiene una sola zo-
na de entrada en la parte inferior del muestreador. Con frecuencia, la zona de muestreo terminal es de mayor tamaño que el
USP42 InformaciónGeneral/ (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel 7855
resto del muestreador. Esta característica resulta una desventaja debido a que cuanto más grande sea la sonda, más perturba el
lecho de polvo, lo que posiblemente resultará en la introducción de sesgo al muestreo.
Los muestreadores de núcleo tienen un cilindro exterior poco profundo con una pared exterior estrecha en el extremo abier-
to. Esta sonda se inserta en el lecho de polvo y la cohesión intrínseca de las partículas evita que fluyan hacia afuera al retirar la
sonda. Posteriormente, el contenido del cilindro se vacía en un recipiente limpio.
CONSIDERACIONES
GENERALES
Los resultados más confiables y reproducibles en las mediciones de tamaño de polvo se obtienen cuando el tamaño de partí-
cula es 2-1 O µm; de otro modo, el polvo es demasiado cohesivo y no fluye adecuadamente hacia el interior del muestreador.
Además, las partículas de tamaños mayores a aproximadamente un tercio del ancho del compartimento proporcionan resulta-
dos deficientes. Las muestras se deberían tomar de diversos sitios en todo el envase. La sonda debe ser lo suficientemente larga
para penetrar al menos tres cuartas partes de la profundidad del lecho de polvo, asegurando que se pueda capturar en la
muestra material procedente de todas las profundidades. La selección de los sitios debe establecerse por conocimiento (a me-
nudo subjetivo) del grado de heterogeneidad del lecho de polvo, la cual puede haberse originado por la manipulación o el
movimiento durante el transporte. Los planes de muestreo pueden requerir la inserción de la sonda en posiciones y ángulos
aleatorios o en posiciones y ángulos predeterminados. Por ejemplo, el plan puede requerir la inserción de la sonda en el centro
y en dos ubicaciones cerca de los bordes. Asimismo, muchos operadores recomiendan siempre insertar las sondas en un ángu-
lo de 10° de la vertical, lo cual incrementa la variedad de posiciones muestreadas.
Algunas de las desventajas del muestreador incluyen el arduo trabajo que requiere el procedimiento. La sonda se debe inser-
tar físicamente en el lecho de polvo, por lo regular en múltiples ocasiones; se debe vaciar el contenido de la sonda; y posterior-
mente, se debe limpiar la sonda a fondo. Para lechos de polvo sedimentados, la sonda de muestreo puede ser difícil de inser-
tar. Además, la sonda de muestreo puede introducir errores como resultado de lo siguiente: las partículas finas se pueden de-
positar entre los tubos interno y externo; las partículas se pueden fracturar; las partículas finas se pueden compactar y no fluir
bien hacia los compartimentos de muestreo; la segregación puede ocurrir durante el flujo hacia la zona de muestreo; y la inser-
ción de la sonda puede perturbar el lecho de polvo al arrastrar polvo de las capas superiores del lecho hacia abajo y a través
del lecho.
Muestreo Representativo del Lote
Los planes de muestreo estadísticos se basan en principios estadísticos y dependen de la heterogeneidad espacial y de la
variabilidad intrínseca de la población. Los planes de muestreo estadísticos son eficientes y permiten la recolección de un nú-
mero suficiente de muestras para proporcionar el grado de certeza deseado sin recolectar una cantidad muy alta o muy baja
de muestras para el método de prueba, escala, variación del producto, requisitos de riesgo y tolerancia para un nivel o especifi-
cación de calidad establecido del producto. El plan de muestreo -.[jij+ 1 comúnmente usado que se proporciona en la Tabla 7
no es un plan de muestreo estadístico y puede resultar en la recolección de un número de muestras demasiado bajo para po-
blaciones pequeñas o demasiado alto para poblaciones grandes. El uso de planes de muestreo estadístico es ventajoso debido
a que facilita la gestión de riesgos. No obstante, para los casos en los que el conocimiento previo de la población que se va a
muestrear es insuficiente, se puede considerar un plan de muestreo no estadístico, tal como el proporcionado en la Tabla 7.
La Figura4 presenta los pasos del esquema de selección del tamaño de muestra. La primera decisión radica en si debe usarse
un plan de muestreo estadístico o no estadístico. Cuando se está determinando un atributo variable como el tamaño de partí-
cula o el contenido de fármaco, se prefieren los planes estadísticos. Los métodos generales de muestreo se describen en el
capítulo de información general USPDatos Analíticos-Interpretación y Tratamiento(l 01 O). Los planes de muestreo estadístico
para aceptación del lote requieren de una base lógica con niveles de calidad conocidos para la determinación de las caracterís-
ticas del lote de producto. Conforme a lo indicado, la aplicación de planes de muestreo estadístico, incluyendo los planes de
muestreo para aceptación del lote, requiere de conocimiento específico y profundo del material que se está muestreando. Los
planes de muestreo estadístico de referencia establecen la base lógica para el muestreo como parte del esquema de muestreo.
Los fabricantes que usan un método de muestreo estadístico para aceptación del lote deberían referirse a una norma apropia-
da tal como la norma ANSI/ASQZl .9-2003 para materiales a granel o la norma ANSI/ASQZl .4-2003 para poblaciones de
unidades múltiples o discretas. Estas normas están disponibles en fuentes como la American Society far Quality (http:/ /
www.asq.org/) o el American National Standards lnstitute (http://www.ansi.org/).
7856 (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel / InformaciónGeneral USP42
••• Población que se va a muestrear
2 3 N
No estadístico: Estadistico:
Nivelesde Calidad No Definidos Niveles de Calidad Definidos
PoblaciónDefinida
y Atributos que ff
van a Muestrear
Unidades Múltiples
Nlvel2 ANSI/ASQ21.4-2003
Muestra
Insuficiente
Fin del Muestreo Fin del Muestreo
Figura 4. Esquema de selección del tamaño de la muestra.
Si se está desarrollando un plan de muestreo no estadístico cuyo nivel de calidad se desconoce, la Tabla 1 proporciona los
tamaños de muestra sugeridos para el número de envases que deben muestrearse en el lote.
El plan de muestreo Nivel 1 es pertinente para materiales cuando la heterogeneidad no afecta el análisis y el cliente busca
muestrear más de un envase, cuando el plan de muestreo puede ser proporcional a la raíz cuadrada del número de envases
recibidos y cuando el material proviene de una fuente conocida y confiable. En tales casos, la muestra se puede retirar de cual-
quier punto del envase. Para sistemas suficientemente homogéneos, resulta adecuado el muestreo con cuchara de la parte su-
perior del envase.
El plan de muestreo Nivel 2 implica un incremento del 50% en el tamaño de la muestra en comparación con el Nivel 1 y se
usa cuando es necesaria una mayor proporción del número de envases, por ejemplo, cuando se sospecha que la heterogenei-
dad de un material es importante y los niveles de calidad de muestreo para aceptación no están definidos o cuando el material
proviene de una fuente menos confiable. Dependiendo del grado de heterogeneidad del material, se puede usar un muestrea-
dor. Sin embargo, si el grado de heterogeneidad no afecta significativamente los resultados para el atributo que se está mues-
treando, aún puede ser adecuado un muestreo con cuchara a partir de la parte superior del tambor.
La Tabla 1 presenta el número de envases, n, que se va a muestrear para un lote segregado en N envases. Se debe tomar en
cuenta que el valor de n de la fórmula se redondea de 0,5 al número entero superior siguiente. Por ejemplo, si N = 6: para el
Nivel 1, n = --16+ 1 = 3,45 se redondea a n = 3; para el Nivel 2, n = 1,5 x --16
= 3,67, que se redondea a n = 4.
Tabla 1
n (Tamaño de la Muestra)
N (Número de Envases que Componen el Lote) Nlvel 1 Nlvel2
Ns3 Todos Todos
N,:4 -.fiii+1 1,5 X ,/iij
Estas decisiones iniciales, según se ilustra en la Figura4, por lo regular son difícilesy en ocasiones se deben tomar sin la infor-
mación suficiente. En ocasiones, cuando no se tiene la certeza sobre la aptitud de un método o nivel, una prueba rápida e
informal a pequeña escala del sistema puede ayudar a determinar la mejor manera de proceder. Asimismo, para algunos siste-
mas y atributos, los planes de muestreo de Nivel 1 y Nivel 2 pueden resultar en sobremuestreo. Por ejemplo, cuando se mues-
trea para fines de identificación a partir del mismo lote, los niveles sugeridos pueden resultar en la recolección de más mues-
tras que las estadísticamente requeridas; en tales casos, se pueden emplear los planes de muestreo estadísticos referidos en la
Figura4.
Recolección de la Muestra
Obtener una muestra representativa de un lote de polvo a granel es un procedimiento difícil que requiere de consideracio-
nes especiales; a continuación se analizan los procedimientos básicos para adquirir una muestra representativa. Se debe tomar
en cuenta que cada situación requiere de técnicas apropiadas para la población determinada que se va a muestrear. Los méto-
dos presentados en este capítulo son aplicables al muestreo de polvos estáticos almacenados en envases a granel de tamaño
mediano, tales como súper costales de 1 tonelada, tambores de 50 kg o bolsas de 50 libras. Estos métodos no son necesaria-
mente aplicables al muestreo de líquidos, envases de almacenamiento grandes tales como vagones de tren o silos o sistemas
durante el proceso tales como mezcladoras o cintas transportadoras móviles. Además, los procedimientos descritos en este ca-
pítulo son más aplicables a partículas con tamaños que van de aproximadamente -1 µm a aproximadamente -1 000 µm. Las
partículas con tamaños significativamente mayores o menores requieren de procedimientos especiales que no se tratan en este
capítulo.
RECOLECCIÓN
DE LA MUESTRAPRIMARIA
Las muestras para la aceptación del lote por lo general se transfieren o entregan en envases. Para recolectar una muestra
representativa primaria o bruta (ver la Figura 7), primero debe seleccionarse el envase o envases apropiados de la población de
N envases; después, se debe extraer una muestra representativa de cada uno de los envases seleccionados.
Selección del Envase
Para evitar sesgos y otros errores de muestreo, los envases que se van a muestrear deben seleccionarse de manera aleatoria.
Para llevar a cabo una selección aleatoria, primero se numeran todos los envases del lote y luego se emplea una tabla numérica
aleatoria (o números aleatorios generados por computadora) para seleccionar el o los envases de los cuales se extraerán las
muestras.
Para los sistemas en los que los envases se agrupan de tal manera que muchos de los envases individuales son prácticamente
inaccesibles (p. ej., bolsas de 50 lb apiladas y unidas con envoltorio plástico sobre una paleta), es posible que el plan de mues-
treo necesite tomar en cuenta el envase de mayor tamaño, además del envase más pequeño, como una unidad de muestreo, a
fin de asegurar una muestra representativa.
Retiro de la Muestra de un Envase
TIPOS DE ENVASES
Los tres tipos de envases más populares son la bolsa, el tambor y el súper costal. Debido a que las bolsas por lo general están
cerradas y no son resellables, se han diseñado muestreadores especiales, en ocasiones denominados caladores de bolsas, para
perforar las bolsas. Cuando el sistema que se va a muestrear es heterogéneo, las muestras deberían obtenerse del fondo, del
centro y de la parte superior de la bolsa; y dependiendo de la forma en que se apilan las bolsas en la paleta, también deberían
obtenerse muestras de las partes frontal y posterior de la bolsas. Cuando se toman muestras de bolsas, se debe prestar aten-
ción particular a las esquinas, debido a que pueden atrapar partículas finas de manera desproporcionada. Cuando no se cuenta
con un calador de bolsas, se puede usar un cuchillo para abrir la bolsa para el muestreo. Cuando se toman muestras de una
bolsa, es necesario asegurarse de que la superficie externa esté lo suficientemente limpia para no contaminar la muestra y evi-
tar la introducción de materia extraña en el material a granel. Una vez que se ha tomado la muestra, colocar un material com-
patible sobre el agujero de la bolsa y luego fijar este parche con una cinta adhesiva adecuada. Dependiendo de la heterogenei-
dad del tambor, se puede usar una cuchara o un muestreador. Los súper costales son costales de gran tamaño que por lo regu-
lar tienen una boca de llenado en la parte superior y una boca de descarga en el fondo. Para material adecuadamente homo-
géneo, el muestreo con cuchara es adecuado; no obstante, cuando existan dudas acerca de la heterogeneidad del material, se
debe usar un muestreador. El gran tamaño de los súper costales le otorga mayor importancia al uso de un muestreador para
un muestreo representativo que en el caso de un tambor o bolsa, a fin de disminuir el error de delimitación potencial.
Manipulación de la Muestra
Las muestras recolectadas se pueden analizar de manera individual o combinadas; posteriormente, se puede analizar un sub-
conjunto de la muestra bruta, según se ilustra en la Figura 7 y se describe a continuación. Las muestras acumuladas se deben
combinar sobre una superficie limpia y seca o en un recipiente o bolsa adecuados. Todos los recipientes con los que entre en
contacto la muestra deben ser inertes y no reaccionar química o físicamente con la muestra. Además, las muestras deben eti-
quetarse adecuadamente y es necesario mantener registros apropiados. Se debe conservar una porción en caso de que se re-
quiera un análisis futuro.
-,
REDUCCIÓNDELTAMAÑODE LA MUESTRAPRIMARIA
Conforme a lo mencionado anteriormente, la muestra primaria por lo general consiste en múltiples muestras tomadas de
varios envases y mezcladas entre sí. Para obtener una muestra para análisis o medición (Figura 1), la muestra bruta o primaria
debe reducirse a un tamaño apropiado para el método analítico. La reducción del tamaño de la muestra bruta o primaria es un
aspecto de un plan de muestreo que a menudo no se tiene en cuenta, pero que es un paso importante. Los factores que oca-
sionan la segregación en un envase también pueden provocar la segregación de la muestra primaria y cualquier sesgo en el
método de reducción del tamaño para la muestra primaria conducirá a resultados erróneos. La ventaja de las muestras secun-
darias es que la masa ha sido reducida a un punto en el que resulta más fácil obtener una muestra representativa debido a que
se puede acceder fácilmente a cada elemento en el lecho de polvo, lo cual facilita el cumplimiento con las mejores prácticas de
muestreo. En general, la medición de la muestra se lleva a cabo en condiciones húmedas o secas y son los requisitos del méto-
do analítico los que establecen las condiciones requeridas. Por ejemplo, el contador Coulter requiere que las muestras estén
uniformemente suspendidas en un electrolito, mientras que otros métodos, tales como el tamizado, por lo regular se realizan
con polvos secos.
Antes de dividir una muestra aglomerada, los aglomerados deberían separarse mediante una técnica adecuada como tami-
zado.
Métodos de Análisis en Seco

Existe una gran cantidad de dispositivos de laboratorio disponibles para la reducción de la muestra primaria a una muestra
analítica. Los tres métodos más importantes usados en la industria farmacéutica son: (1) el muestreo con cuchara, (2) la forma-
ción de cono y cuarteo, y (3) el "spinning riffler" o el separador rotatorio (método manual de fraccionamiento por pala); ver la
Figura5.
7= ~"--+---~
Figura 5. Dos procedimientos para dividir muestras. Parte superior; separador rotatorio, en el que un soporte cir1;ulargirn a
una velocidad constante y la muestra se carga a una velocidad constante en los recipientes mediante un vertedor vibratorio
que se alimenta con una tolva de flujo de masa. Parte inferior: formación de cono y cuarteo. (El cono a la izquierda se aplana y
se divide en cuatro; se pueden formar cuartos y luego subdividirlos.)
MUESTREOCON CUCHARA
El muestreo con cuchara se lleva a cabo según se describió anteriormente, pero por lo general con una cuchara o espátula
más pequeña. Se debe tener mucho cuidado al retirar material de la muestra primaria debido a que este material podría estar
altamente segregado como resultado de la manipulación. El muestreo con cuchara es adecuado para polvos homogéneos o
cohesivos. No obstante, si el polvo es propenso a la segregación, el muestreo con cuchara puede introducir errores significati-
vos. Además, el muestreo con cuchara presenta diversas desventajas importantes. En primer lugar, el método depende de la
decisión del operador sobre qué parte de la muestra primaria va a recoger con la cuchara y la cantidad de la muestra que
retira, que son aspectos que pueden introducir un sesgo debido al operador. Segundo, en el muestreo con cuchara, los opera-
dores tienden a retirar la muestra de la superficie libre, la cual es altamente propensa a la segregación y no es representativa de
todo el material a granel. Tercero, es necesario que los operadores eviten formar una pila en la cuchara o espátula que pueda
ocasionar segregación, debido a que el material podría caer por los bordes de la espátula o cuchara y sesgar en la muestra.
Resultaría ideal que el operador intentase mezclar la muestra primaria antes de usar la cuchara, pero esto también podría agra-
var los problemas de segregación por lo que se debe llevar a cabo con sumo cuidado.
FORMACIÓNDE CONO Y CUARTEO
la formación de cono y cuarteo se lleva a cabo vertiendo la muestra primaria formando un cono simétrico sobre una superfi-
cie plana. Posteriormente, el cono se aplana con una superficie plana tal como una espátula y se divide en cuatro cuartos idén-
ticos (Figura 5). Se toma un cuarto como muestra. Este procedimiento se puede repetir hasta obtener el tamaño de muestra
deseado (p. ej., se pueden subdividir muestras de cuartos en cuartos). la teoría de este método se basa en que al crear un
cono simétrico todos los procesos de segregación también ocurren simétricamente alrededor del cono, por lo que se usa la
simetría para mitigar el efecto de la segregación. En la práctica resulta muy difícil generar un cono de polvo simétrico y el
método se vuelve sumamente dependiente del operador y a menudo poco confiable. la diferencia en la manera en que los
operadores forman la pila y la subdividen puede llevar a la falta de precisión y errores significativos. Asimismo, cuando el méto-
do se lleva a cabo más de una vez, los errores se pueden propagar cada vez que se realiza la formación de cono y cuarteo.
Algunos expertos no recomiendan este método.
SEPARADOR
ROTATORIO
Un separador rotatorio (Figura 5) incluye una serie de recipientes montados en un soporte circular. El soporte circular gira a
una velocidad constante y la muestra se carga a una velocidad constante en los recipientes mediante un vertedor vibratorio
que se alimenta con una tolva de flujo de masa. Una vez que el material se ha dividido entre los diferentes receptáculos, se
puede retirar un receptáculo individual para su análisis o para una nueva división de la muestra. la velocidad angular de los
soportes circulares y la amplitud del alimentador vibratorio pueden ser controladas para acomodar polvos con diferentes pro-
piedades de flujo. La velocidad del soporte y la velocidad de alimentación deben ajustarse de manera que los recipientes se
llenen uniformemente y para evitar que se forme una pila en el alimentador vibratorio. Los separadores rotatorios están dispo-
nibles en diversos tamaños, lo que permite generar subdivisiones de polvos desde unos pocos miligramos hasta cientos de gra-
mos. las únicas desventajas del separador rotatorio son el tiempo requerido para procesar la muestra y la limpieza del equipo,
así como el capital requerido. A pesar de estas desventajas menores, el separador rotatorio es por ahora, el mejor método de
subdivisión de polvos de flujo libre.
Elfraccionamiento por pala es la versión manual del separador rotarorio. En este método, se toman las muestras con cuchara
a partir de la muestra original y se colocan en un número suficiente de alícuotas; posteriormente, se siguen tomando cuchara-
das subsiguientes de la muestra original y se colocan en una de las alícuotas en orden secuencial. Este proceso se repite hasta
agotar las muestras originales. Después, se toma al azar una de las alícuotas como la muestra reducida. Al igual que con todos
los métodos manuales, los errores derivados del operador y la variabilidad pueden representar errores significativos.
Métodos de Análisis Húmedos
los métodos de análisis húmedos requieren dispersar la muestra en un líquido adecuado para su análisis y después retirar
una alícuota usando una jeringa o pipeta. El muestreo secundario efectivo requiere preparar una suspensión homogénea esta-
ble (es decir, la muestra debe ser estable desde el momento de la formación de una suspensión hasta el momento en que se
completa el análisis). Algunos factores importantes del análisis húmedo son la solubilidad de la muestra en el vehículo de dis-
persión, la agregación de la muestra, el uso de agentes de suspensión y la desagregación de partículas primarias en el vehículo
de dispersión. Aún cuando la suspensión preparada sea uniforme, la muestra debe homogeneizarse, por lo regular agitando,
inmediatamente antes de retirar la muestra con una jeringa o pipeta. El diámetro de la jeringa o pipeta debe ser lo suficiente-
mente grande como para no excluir partículas y evitar obstrucciones. Los diámetros de las partículas de mayor tamaño no de-
ben exceder del 40% del diámetro de la punta de la jeringa o pipeta. Cuando por razones prácticas, la cantidad de material de
la muestra primaria es demasiado grande, el tamaño de la muestra se debería reducir antes de preparar una suspensión. Para
reducir el tamaño de la muestra se pueden usar los métodos descritos anteriormente en la sección Métodosde Análisisen Seco.
A manera de precaución, se debe recolectar y conservar suficiente muestra como para todas las pruebas un mínimo de cinco
veces.
APÉNDICES
Apéndice 1: Ejemplos de Submuestreo
Los siguientes ejemplos describen la importancia de la caracterización de las partículas del material durante la selección de
una masa de muestra adecuada. A continuación se presentan cuatro ejemplos. En el primer ejemplo se asume la similitud en
las características fundamentales o intrínsecas del material. En el segundo ejemplo se cambia la densidad del analito que se
está midiendo. En el tercer ejemplo se evalúa el efecto de cambiar el tamaño de partícula. En el cuarto ejemplo se evalúa la
capacidad de las características fundamentales de las partículas en una formulación necesaria para una unidad de dosificación
o masa de las partículas determinada.
EJEMPLO1. DETERMINACIÓN
DE LA MASADE LAMUESTRA
Si se asume que el tamaño del lote es 1 kg, el diámetro máximo de partícula es 1000 µm, y se espera que la concentración
del analito sea 1%, ¿qué masa de la muestra de partículas esféricas de 1000 µm de igual tamaño y forma con una densidad de
1 g/cm 3 se necesitaría para estimar la concentración promedio del analito con una desviación estándar relativa porcentual
(%RSD, por sus siglas en inglés) de 5%?
Si se reordena la ecuación 3, se puede estimar la masa de la muestra según se muestra en la ecuación 5:
1
mmuestra :;:::::--s~.-mf-'-,--- (5)
Cmáx1dmái m1ote
fforma9FG
La heterogeneidad máxima de composición (cmá,)se puede estimar tomando en cuenta la densidad del analito y de la ma-
triz(),.• y Am,respectivamente, y su promedio A) y la concentración del analito (aJ (ecuación 6):
(6)
Para concentraciones bajas de analito, la heterogeneidad máxima de composición se simplifica a la ecuación 7:
Para concentraciones altas de analito, la heterogeneidad máxima de composición se simplifica a la ecuación 8:
El factor de forma se aproxima mediante la ecuación 9:
f ~volumen/ 3 (9)
forma /d
Donde d es el diámetro de partícula nominal para una esfera y el factor de forma es [(4/3)n/8] o aproximadamente 0,5.
Elfactor granulométrico se puede aproximar mediante el diámetro mínimo típico observado en el percentil 5 de tamaño
dividido por el diámetro máximo típico observado en el percentil 95 de tamaño, según se observa en la ecuación 1O:
(1O)
Debido a que todas las partículas son del mismo tamaño, el factor granulométrico, 9Fc, es 1,0. Debido a que el analito se
presenta en un estado liberado de las partículas de la matriz, el factor de liberación es también 1,0. La masa de la muestra para
una RSDdel 5% (usando la ecuación 5) es, por ende:
mmuestra = 19,6 g
0,05 2 1
-------~+--
0,5 x 1 x 100 x 0, 13 1000
Una masa de la muestra de 19,6 g proporcionará un error de muestreo con RSDde aproximadamente 5%. Se debe tomar
en cuenta que en este ejemplo las características de las partículas se simplifican para demostrar que un lote con una masa de
1000 g contiene 2 x 10 6 partículas con una masa de 0,5 mg. La masa de la muestra de 19,6 g contiene aproximadamente 39
216 partículas, con una RSD del 5%, usando la distribución binomial donde p es la concentración del analito (a,) y n es el
número de partículas muestreadas, según se presenta en la ecuación 11.
RSDBinomial=,,J(1-p)/np =
,j(1-0,01)/39216x0,01 = 0,0498,.,0,05 (11)
('Jerla Tabla2 para un resumen de los cálculos.)
ra el Ejemplo 1, Partículas de Tamaños Formas Idénticas
m d(cm) a ,_ (g/cm 3) 1 m ()
0,1 0,01 1 1 19,6
USP42 InformaciónGeneral/ (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel 7861
Formas Idénticas (Continuación)

m () 1..(g/cm 3) 1 m ( )
RSDBinomial
p =a(L)=0,01
Masa por PartículaP, Partículasen 19,6 g n= 39216
d3f 1.. m /(P / ) (1 ual a 11)
0,005 39 216 0,05
Al determinar la masa de la muestra requerida, se asume que la muestra es representativa de la población. Además, al usar
una sola muestra representativa, se asume que la uniformidad de la masa de la muestra es constante con respecto a la pobla-
ción remanente. Se debe tomar en cuenta que los factores granulométricos y de liberación permiten el ajuste proporcional del
tamaño de la muestra, dependiendo de la naturaleza de las partículas. La inclusión de un factor de liberación en la ecuación
permite a las partículas contener una proporción del analito dentro de cada partícula o en una proporción de la misma partícu-
la. Elfactor granulométrico permite ajustar la masa de la muestra tomando en cuenta la relación de tamaño entre las partículas
más pequeñas y más grandes representadas en el lote.
Esta aproximación también se puede aplicar a suspensiones líquidas en las que cada partícula se considera discreta y la
muestra se puede caracterizar con respecto al tamaño, densidad, masa y volumen.
EJEMPLO2. METALPESADO
En este ejemplo se asume que el analito es el metal pesado plomo, con una densidad de 11,34 g/cm 3, con un límite de no
más de 5 ppm, donde las formas de las partículas son cúbicas (f10,ma = 1,0), las partículas son de aproximadamente 50 µm y se
toma una muestra de 5 g del material analizado (gFG= 0,55). Basándose en la ecuación 3, la %RSD es 17,7%. Usando la ecua-
ción 5, se puede encontrar que es necesaria una masa de la muestra de aproximadamente 60 g para lograr una RSD del 5%,
asumiendo que aLes igual al límite permitido y que no se puede suponer que el analito se liberará del material (1= 1,0). 0fer la
Tabla3 para un resumen de los cálculos.)
Tabla 3. Resumen de Cálculos ara el Ejemplo 2, Metal Pesado
m (g} d (cm) m (g)
1000 0,005 5 X 10-6 11,34 1,0 5B,71
Si se asumiera que la muestra es homogénea (1= O,1) con respecto a la presencia del analito en todas las partículas, enton-
ces sería necesaria una masa de muestra de 6,2 g. Asimismo, si la forma de las partículas fuera entre esférica y cúbica (f1o,ma
=
0,8), entonces sería necesaria una masa de muestra de 5 g para completar el análisis.
EJEMPLO3. SUBMUESTREO
El muestreo ideal, según se mencionó con anterioridad, es fundamental para entender el papel importante del submuestreo.
En muchas ocasiones, resulta deseable reducir el tamaño de la muestra de manera que resulte en una muestra representativa y
disminuya la necesidad de analizar una masa grande de muestra. En algunos casos, el tamaño de partícula y la heterogeneidad
de composición puede resultar en una masa de muestra difícil de manejar. Esto puede ocurrir con partículas de gran tamaño o
cuando se requiere de una muestra compuesta de muchos envases. Las muestras con partículas de mayor tamaño pueden ne-
cesitar ser reducidas físicamente.
Por ejemplo, usando el Ejemplo2 anterior, si el tamaño máximo de partícula fuera 1000 µm o 1 mm, entonces la ecuación 3
sugeriría una muestra de 997 g. Reduciendo el tamaño de partícula mediante molienda o submuestreo para conseguir una
%RSD de muestreo predeterminada puede requerir más de un submuestreo para lograr el tamaño de partícula deseado. Por
ejemplo, la muestra completa puede reducirse hasta 100 µm para disminuir la %RSD a aproximadamente 3%; luego, con el
muestreo ideal, se puede seleccionar una submuestra y reducirla completamente hasta 50 µm para lograr una RSDdel 5%.
Finalmente, sería posible tomar y analizar correctamente una submuestra de 5 g. Cuando ciertas partículas son de gran tama-
ño con una alta concentración del analito, entonces se deben seleccionar muestras para asegurar que al menos 1 partícula,
pero de preferencia al menos 5 a 6 partículas fueran seleccionadas con una probabilidad u oportunidad de selección del 95%.
EJEMPLO4. MASAMÍNIMADE UNIDADDE DOSIFICACIÓN
Sería deseable para el formulador conocer la masa mínima requerida para una forma farmacéutica a fin de asegurar, con una
confianza del 95%, una unidad de dosificación de polvo de fármaco activo al 1%. Elfármaco y el excipiente tienen una forma
= 0,5) y una densidad de 0,33 g/cm 3• Elfármaco activo se muele hasta 1 µm, pero el tamaño de los
redonda similar (f1orma
excipientes puede ser tan grande como 200 µm. El valor para gFcse toma de la ecuación 1O, usando el intervalo esperado del
excipiente que representa el 95% de la formulación, como 1O µm/200 µm o 9Fc= 0,05. La cantidad cmáxde la ecuación 7 se
toma como 0,33/0,01. Las partículas del fármaco están completamente liberadas del excipiente. El tamaño de la partida es de
100kg.
Tabla 4. Resumen de Cálculos ra el E'em lo 4, Masa Mínima de Unidad de Dosificación

m ( ) d (cm) g c . a 1,. (g/cm 3)
m (g)
5
10 0,02 0,5 0,05 33 0,01 0,33 1,0 0,00264
Se requiere una masa de muestra mínima de aproximadamente 3 mg para asegurar con una confianza del 95% (2 desvia-
ciones estándares relativas) que el contenido de fármaco promedio es O,9%-1, 1%. La forma farmacéutica propuesta tiene una
concentración activa de 100 µm/1 O mg de masa total por unidad. La masa de la forma farmacéutica por unidad es adecuada,
pero la formulación requiere que el proceso de mezclado, la producción de la unidad de dosificación, el dispositivo de mues-
treo a granel y la preparación de la muestra en el laboratorio o submuestreo a partir de muestras a granel resulten en una
probabilidad similar de selección de partículas del fármaco. Sólo si se cumplen dichas condiciones de mezclado, producción,
muestreo y análisis será posible demostrar con facilidad que se cumplen los criterios de aceptación de 1% (0,01 µg/mg) para
la unidad de dosificación y la determinación de la prueba. Los resultados aceptables de dicho análisis también indican que es
necesario controlar el tamaño de partícula, la forma y la densidad. Por ejemplo, un incremento en los tamaños de partículas
hasta 500 µm resulta en la necesidad de una masa de muestra y dosis de 42 mg. Si se asume una forma cúbica, contrario a lo
establecido para la forma redonda, la partícula incrementa la masa de la muestra hasta 5 mg, lo cual, para una masa fija de la
forma farmacéutica, puede resultar en menos espacio para la variación debida a otras características o en una confianza menor.
Si se cambiaran los criterios de aceptación a O,95%-1,05%, lo que requeriría una RSDde 1%, entonces la masa mínima de la
muestra se incrementaría hasta aproximadamente 70 mg. 0/er la Tabla4 para un resumen de los cálculos.)
Apéndice 2: Caracterización y Muestreo del Material

El conocimiento específico y profundo de la síntesis, composición y uso del material es crítico para desarrollar un plan de
muestreo de un material a granel. La caracterización del material es importante debido a que el material a granel puede adqui-
rir una gran cantidad de formas durante todo el flujo del proceso del material. Conforme a lo presentado en la Figura6, el tipo
de muestreo puede variar en cada paso del proceso y en última instancia afecta el uso del material en el medicamento. La
caracterización apropiada del material toma en cuenta el paso del proceso del material, el tipo de muestreo, el objetivo del
paso del proceso y finalmente, el medicamento.
Síntesis/ Muestreo
► Control del
Fabricación durante el
Proceso
~!~~~~?- ·- -
caracterización
del material Usodel '
Material
Almacenamiento; Repetición ·- ' ·•· ···~

_____ o,_1a_P_'"'_b~
__, ... __Fe~hado ___ ,
Figura 6. Flujo del proceso del material.
Por ejemplo, cuando el muestreo puede ser limitado o ideal para la característica relevante, el material puede mezclarse o
sintetizarse en un recipiente grande. Cuando la característica es importante pero las condiciones de muestreo no son ideales,
tal vez debido a la heterogeneidad de una mezcla de polvo, entonces el muestreo para dicha característica se puede llevar a
cabo de manera más apropiada en un área diferente, antes o después (más cerca o más lejos) en el proceso, para evaluar la
heterogeneidad del contenido y asegurar el muestreo ideal. Lo anterior se realiza a veces para reducir la dimensión del mues-
treo. La dimensión del muestreo se reduce cuando el espacio de tres dimensiones de un envase a granel se muestrea en un
flujo de 1 ó 2 dimensiones a través del tiempo. Reduciendo la dimensión espacial del muestreo puede proveer condiciones que
permitirán una medición más exacta de la heterogeneidad del material al tiempo que se limita el error de muestreo mediante
el muestreo ideal.
Los atributos de aceptación (ver la Tabla5) dependen de la caracterización y el proceso del material. Los atributos de acep-
tación pueden se aplicables durante toda la vida del material a granel. El número y el tamaño de las muestras requieren un
conocimiento de la variación del material.
Tabla 5. Ejemplos de Atributos de Aceptación
Atributos de Aceptación
Físicos Químicos Mlcroblológlcos Envasado
Tamaño de partícula Pureza Esterilidad Exactitudde la etiqueta
Viscosidad pH Pirógenos Integridad
Densidad Identidad Carga microbiana
Concentración
USP42 InformaciónGeneral/ (1099) Límite Número Desviaciones 7863
Apéndice 3: Fuentes Adicionales de Información
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(1099) LÍMITEEN ELNÚMERO DE GRANDESDESVIACIONESAL

EVALUAR LA UNIFORMIDADDE CONTENIDO EN MUESTRASDE GRAN
TAMAÑO
INTRODUCCIÓN
La incertidumbre que rodea la aplicación del criterio de cero tolerancia (ZTC, por sus siglas en inglés) a tamaños de muestra
mayores a 30 puede inhibir la recolección de datos de uniformidad en muestras de gran tamaño. Este capítulo proporciona un
proceso para limitar el número de resultados observados fuera del ZTC (c,), según se describe en Uniformidadde Unidadesde
Dosificación(905), cuando se recolectan más de 30 muestras. Se debe tener en cuenta que el criterio descrito en este capítulo
no pretende ser una prueba de liberación de partida, ni una sustitución o alternativa al capítulo (905). Como tampoco preten-
de extender la prueba más allá del segundo nivel especificado en el capítulo (905). Su uso es solamente para ayudar a determi-
nar si un conjunto grande de datos cumple con el elemento ZTC del capítulo (905). Debe decidirse por otros medios si el
conjunto grande de datos cumple con la serie completa de requisitos en el capítulo (905).
El ZTC del capítulo (905) establece que el contenido individual de ninguna unidad de dosificación puede ser menor de [1
- (0,01 )(L2)]M ni mayor de [1 + (0,01 )(l2)]M, donde L2 es 25,0% a menos que se especifique algo diferente en la monografía
pertinente, y M, el "valor de referencia", depende de la media de la muestra X (expresada como un porcentaje de la cantidad
declarada), según se indica a continuación:
7864 (1099) Límite Número Desviaciones / InformaciónGeneral USP42
M = 98,5% si X <98,5, M = 101,5% si X>101,5 y M =X en el resto de los casos, con un tamaño de muestra (N) de 30
PROCEDIMIENTO
Cuando se recolecta una muestra con el contenido de más de 30 unidades, se puede usar el siguiente procedimiento para
confirmar que los resultados en la muestra son congruentes con el ZTC del capítulo (905). Elcriterio es aplicable cuando el
contenido se determina tanto directamente, analizando un número de unidades, como indirectamente, pesando las unidades
en las situaciones en las que esto se permita en el capítulo (905). El procedimiento es el siguiente:
1. Expresarlos resultados individualesx 1, x2, •.., xNcomo un porcentaje de la cantidad declarada
2. Calcular la media (X)para el contenido de N unidades en la muestra
3. Calcular el valor de referencia M: M = 98,5% si X <98,5, M = 101,5% si X>101,5 y M =X en el resto de los casos
4. Determinar SN,el número de resultados de la muestra menores a [1 - (0,01 )(Ll)]M o mayores a [1 + (0,01 )(Ll)]M, donde
Ll = 25,0%, a menos que se especifique algo diferente en la monografía pertinente
5. La muestra cumple con el ZTC del capítulo (905) si SN$; c2, donde c2 depende del tamaño de la muestra según se indica
en la Tabla 1
Tabla 1. Límite en el Número de Resultados Observados Fuera del ZTCBasado en el Tamaño de Muestra
N e,
31-100 o
101-181 1
182-265 2
266-353 3
354-442 4
443-533 5
534-624 6
625-717 7
718-810 8
811-903 9
904-998 10
999-1092 11
1093-1187 12
1188-1283 13
1284-1379 14
1380-1475 15
1476-1571 16
1572-1667 17
1668-1764 18
1765-1861 19
Losvalores de c2 para otros tamaños de muestra, (N), se determinan de la siguiente manera
e, = máx {e:;~' (N)

; f' (!- ¡yv-;$; 0,75},
donde f= 1 - 0,75 1130 = 0,00954357. Elvalor c2 puede calcularse en una hoja de cálculo con una función binomial acumulada.
(1102) MÉTODOSDE PRUEBASINMUNOLÓGICAS-

CONSIDERACIONES
GENERALES
INTRODUCCIÓN
Este capítulo de información general proporciona descripciones de alto nivel sobre los principios de los métodos de pruebas
inmunológicas (MPI)que se pueden usar en las pruebas especificadasen las monografías, así como información y metodolo-
gías para el desarrollo analítico y la validación de los MPI.El alcance de este capítulo es proveer información general aplicable a
todos los MPI.Este capítulo ofrece una base para capítulos específicossobre diversos tipos de MPI,tales como los capítulos
USP42 InformaciónGeneral/ (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas 7865
Métodosde PruebasInmunológicas-Ensayopor lnmunoadsorciónLigadoa Enzimas(ELISA)(1103), Métodosde PruebasInmunoló-

gicas-Análisis por lnmunotransferencia(1104) (propuesto) y Métodosde PruebasInmunológicas-Resonanciade PlasmónSuperfi-
cial (1105). Este conjunto de capítulos de información general se relaciona con los capítulos de información general sobre valo-
raciones biológicas. El uso de MPI para monitoreo del proceso, diagnóstico y evaluación de respuesta clínica, evaluación de
farmacocinética/farmacodinámica/absorción, distribución, metabolismo y excreción (PK/PD/ADME,por sus siglas en inglés,
respectivamente), y demás caracterizaciones del producto (pruebas que no se usan para liberar el producto) quedan fuera del
alcance de este capítulo.
Elfundamento de todos los MPI usados para medir un atributo de calidad de un fármaco o medicamento biológico es la
interacción de unión no covalente altamente específica entre un antígeno y un anticuerpo. Por lo regular, el antígeno es un
analito de interés (p. ej., proteína, carbohidrato, virus o célula), mientras que el enlazante es por lo general un anticuerpo (p.
ej., un anticuerpo monoclonal o un antisuero policlonal). Los MPI se pueden aplicar a moléculas que son directamente antigé-
nicas (inmunogénicas) o que pueden transformarse indirectamente en antigénicas (haptenos). El mesurando en los MPI se re-
laciona directamente con un atributo de calidad del producto en análisis.
Los MPI tienen gran valor debido a que presentan una alta sensibilidad y especificidad para un analito en matrices comple-
jas. Asimismo, los MPI se usan generalmente para la evaluación cualitativa y cuantitativa de anticuerpos y antígenos, pero su
aplicación también se extiende a la medición de haptenos, complemento, complejos antígeno-anticuerpo y demás interaccio-
nes entre proteínas. Estas propiedades de los MPI permiten emplearlos para evaluar la identidad, potencia (contenido), pureza,
impurezas, estabilidad y demás atributos de calidad de fármacos y medicamentos biológicos.
Los MPI son útiles para una gran cantidad de aplicaciones debido a que pueden medir moléculas en un amplio intervalo de
tamaños y tipos de enlace. En general, los anticuerpos se mantienen estables durante varias modificaciones químicas que no
tienen una influencia adversa significativa sobre las interacciones con un antígeno. Las moléculas de anticuerpos tienden a to-
lerar cambios de pH acídicos y alcalinos moderados mejor que otras proteínas. Debido a tal característica, resulta posible una
variedad de MPI con altos grados de sensibilidad y especificidad. La capacidad de acelerar el contacto entre un antígeno y un
anticuerpo da lugar a formatos de MPI que proporcionan resultados rápidos o en tiempo real.
Por lo general, los MPI tienen una mayor precisión y un menor tiempo de respuesta que las valoraciones biológicas tradicio-
nales (es decir, las valoraciones en animales y las basadas en células). Aunque en algunas ocasiones, estas ventajas pueden res-
paldar el uso de un inmunoensayo en lugar de una valoración biológica, dichos cambios se deben plantear sistemáticamente y
con precaución. A menudo, probar la equivalencia o comparabilidad de resultados de valoraciones biológicas e inmunoensa-
yos representa un desafío, debido a que la interacción entre antígeno y anticuerpo podría no reflejar los atributos funcionales
observados en las valoraciones biológicas.
Una limitación importante de los MPI en comparación con los métodos fisicoquímicos (tales como cromatografía líquida o
de gases) es que estos últimos, por lo general, son más precisos y pueden identificar un conjunto de impurezas o sustancias
inesperadas simultáneamente. Otra limitación importante es que, por lo regular, los MPI operan en diluciones molares altas en
las que son sensibles a las alteraciones ocasionadas por factores ambientales en la matriz de la muestra (es decir, efectos de la
matriz). Los efectos de la matriz pueden depender del formato de MPI y aún no se comprenden del todo. Su especificidad,
una característica distintiva de los MPI, en ocasiones se ve comprometida por las similitudes en la estructura o secuencia entre
el analito y una impureza molecular estrechamente relacionada (reactividad cruzada).
La mayoría de los MPI reflejan la interacción física (unión) entre un antígeno y un anticuerpo y no las propiedades funciona-
les del analito. Por lo tanto, los analistas deben prestar atención a la selección y ejecución del formato de los MPI. Los MPI
basados en células que pueden proveer información funcional sobre el analito están fuera del alcance de este capítulo.
CARACTERÍSTICAS
GENERALES
DE LOSMPI
Los MPI se basan en el principio de interacciones específicas, no covalentes y reversibles entre antígeno y anticuerpo. En
general, la reacción antígeno-anticuerpo primaria es ocasionada por la complementariedad, lo que genera una especificidad
macromolecular. Esta interacción no covalente determina el grado de afinidad intrínseca. La afinidad intrínseca contribuye a la
afinidad funcional y/o relativa que depende de factores tales como la fase y valencia de reacción, lo cual, a su vez, determina el
grado de reversibilidad de una interacción. Comprender de manera adecuada los factores que afectan las interacciones antíge-
no-anticuerpo proporciona los fundamentos necesarios para el desarrollo de un formato de MPI adecuado (p. ej., fase líquida
o sólida, unión competitiva o no competitiva, etc.).
Una característica que define a los MPI es que emplean un antígeno (o hapteno) y un anticuerpo. Asimismo, los MPI pueden
contener moléculas acompañantes tales como complementos. Los componentes de los MPI se definen del siguiente modo:
• Antígenos-Comprenden un amplio rango de moléculas que son capaces de unirse al anticuerpo en una interacción es-
pecífica. Por lo general, las partes de un antígeno (los epítopes inmunogénicos) son capaces de provocar la respuesta del
anticuerpo.
• Haptenos-Pequeñasmoléculas que, por sí mismas, no son capaces de provocar una respuesta del anticuerpo, pero que
son capaces de provocar una respuesta inmune cuando se adjuntan a un portador más grande tal como una proteína. Los
anticuerpos producidos por un aducto hapteno-portador también pueden unirse al hapteno de la molécula pequeña en
una interacción específica.
• Complementos-Moléculas acompañantes que, en ciertas condiciones, ayudan a la funcionalidad de los complejos antí-
geno-anticuerpo, pero que no son necesarias para las interacciones antígeno-anticuerpo o hapteno-anticuerpo.
7866 (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas / InformaciónGeneral USP42
• Anticuerpos-Proteínas con regiones que imparten un alto grado de enlace específico a antígenos (y haptenos). Los ele-
mentos estructurales de un anticuerpo inmunoglobulina G (lgG) se muestran en la Figura 1.
Además de estos componentes, los MPI requieren de algunos medios para detectar o monitorear la reacción de unión entre
el antígeno y el anticuerpo.
Sitiosde unióndeantígenos
w Carbohídratos
- Enlaces
Disulfuro
Figura 1. Estructura de la lgG. La molécula de la lgG se caracteriza por una estructura de dominio distintiva de cadenas pesa-
das (H) y livianas (L), las cuales se dividen en regiones variables y constantes 01y C, respectivamente). Las cadenas livianas
consisten en dominios VLy Cu mientras que las cadenas pesadas consisten en un dominio variable 0/H)y tres dominios cons-
tantes (CH1, CH2y CH3).Todos los dominios se estabilizan mediante enlaces disulfuro, mientas que los dominios CH2contienen
carbohidratos. La región bisagra flexible entre los dominios CH1 y CH2permite el comportamiento independiente de dos sitios
de unión de antígeno formados por dominios variables.
TIPOS DE MPI
La medición de la unión antígeno-anticuerpo se puede llevar a cabo mediante una variedad de tipos y formatos de valora-
ción: fase sólida o líquida, manual o automática, marcada o sin marcar, competitiva o no competitiva, cualitativa o cuantitati-
va, homogénea o heterogénea, o combinaciones de algunas de las citadas. La característica distintiva de todas estas valoracio-
nes es la unión de un anticuerpo o antígeno con el analito (que también puede ser un antígeno o un anticuerpo), seguido por
la detección de un complejo antígeno-anticuerpo. Aunque se puede usar una gran cantidad de formatos para la reacción de
unión, en conjunto con diferentes métodos de detección, la cuantificación del analito en el artículo de prueba siempre se reali-
za comparando la medición con un estándar de referencia. Por ende, las investigaciones de calidad de producto están respal-
dadas por una variedad de tecnologías de MPI. Los diseños de valoración comúnmente usados incluyen: ensayo por inmu-
noadsorción ligado a enzimas (ELISA),transferencia Western, citometría de flujo, ensayo por inmunoadsorción ligado a enzi-
mas competitivo, resonancia de plasmón superficial (RPS), nefelometría cinética, radioinmunoensayo (RIA),inmunodifusión ra-
dial, precipitación y aglutinación. Dichos métodos se describen a continuación.
Ensayopor lnmunoadsorciónLigado a Enzimas
Un ELISAes un método inmunológico cuantitativo en fase sólida para medir un analito después de la unión con un inmu-
noadsorbente y su detección subsiguiente usando la hidrólisis enzimática de un sustrato revelador, ya sea de manera directa (el
analito tiene propiedades enzimáticas) o indirecta (p. ej., un anticuerpo unido a peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina enla-
zado posteriormente al analito inmunoadsorbido). Por lo regular, el analito se cuantifica mediante interpolación en una curva
estándar de un material de referencia. El capítulo de información general Métodosde PruebasInmunológicas-Ensayopor lnmu-
noadsorciónLigadoa Enzimas(ELISA)(1103) analiza el ELISAen mayor detalle, incluido el desarrollo de un ELISApara análisis
cuantitativo.
TransferenciaWestern
Una transferencia Western es un método semicuantitativo o cualitativo para la medición de un analito proteico que ha sido
resuelto mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y transferido posteriormente a una membrana sólida (p. ej., nitrocelu-
USP42 Información General/ (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas 7867
losa, nailon o difluoruro de polivinilideno). La detección se puede lograr de manera directa mediante reacción con un anticuer-
po primario marcado (anticuerpo específico contra el analito de interés), o de manera indirecta mediante reacción del anti-
cuerpo secundario marcado (anticuerpo contra el anticuerpo primario) contra el anticuerpo primario unido al antígeno inmo-
vilizado en la membrana. El marcado se puede realizar con un radioisótopo o una enzima que utilice el sustrato para producir
color, fluorescencia o luminiscencia. Este método es semicuantitativo, en especial cuando las proteínas están presentes en una
concentración baja y en mezclas muy complejas. Por lo regular se utiliza en las etapas tempranas de desarrollo del proceso (p.
ej., selección de anticuerpos, expresión de proteínas, purificación de proteínas, entre otros). La transferencia Western es un
método poderoso para analizar e identificar proteínas en mezclas complejas, en particular después de la separación usando
electroforesis en gel bidimensional, la cual separa proteínas basándose en el tamaño y la carga (pi).
Citometría de Flujo
La citometría de flujo es un método semicuantitativo basado en tecnología láser que permite la medición de sondas conju-
gadas con fluoróforo a medida que interactúan con sus ligandos respectivos en células o partículas. El capítulo general Citome-
tría de Flujo(1027) ofrece más detalles sobre esta técnica.
Resonanciade PlasmónSuperficial
La RPSes un método cuantitativo para medir un analito en una muestra en la que se puede medir en tiempo real la forma-
ción de un complejo antígeno-anticuerpo en la interfase de un líquido y de un sólido (p. ej., superficies o partículas de oro). La
medición que se toma es el cambio en tiempo real en la refracción de una luz polarizada y ocurre durante la formación del
complejo antígeno-anticuerpo, lo cual genera cambios en los mínimos de resonancia de plasmón (es decir, el sensorgrama).
La cantidad de analito se determina mediante comparación con la medición de una curva estándar de referencia determinada
en la misma valoración. El capítulo de información general Métodosde PruebasInmunológicas-Resonanciade PlasmónSuperfi-
cial (1105) ofrece más detalles sobre la RPS.
Nefelometría cinética
La nefelometría cinética es un método cuantitativo para medir un analito en una muestra en solución mediante de la medi-
ción de la dispersión de la luz introducida por pequeños agregados formados por complejos antígeno-anticuerpo. La cantidad
de analito se determina mediante comparación con la medición de una curva estándar de referencia determinada en la misma
valoración.
Radioinmunoensayo
El RIA,un MPI sensible desarrollado originalmente en 1950, es un método cuantitativo para medir un analito en una mues-
tra. El RIAgeneralmente emplea una reacción de unión competitiva antígeno-anticuerpo, aunque también se puede usar en
un formato de inmunoensayo tipo sándwich, incluyendo inmunoprecipitación. En los RIAcompetitivos, el analito compite para
unirse con un antígeno de referencia radiomarcado (p. ej., usando 125 1 ó 3 H) que es idéntico al analito; por lo tanto, el analito y
el antígeno compiten para unirse a una dilución fija y limitante de un anticuerpo específico (a menudo policlonal). El antígeno
radiomarcado se encuentra en exceso. El mismo antígeno sin marcar en la muestra de prueba compite para unirse al mismo
sitio en el anticuerpo, el cual se encuentra en una cantidad fija. La unión del antígeno sin marcar con el anticuerpo conlleva al
desplazamiento del antígeno marcado, lo que resulta en una reducción en la radioactividad de la fracción del complejo antíge-
no-anticuerpo. Para separar el complejo antígeno-anticuerpo del exceso de antígeno sin enlazar, el complejo generalmente se
precipita con un anticuerpo secundario (o proteína G) inmovilizado en una matriz sólida (p. ej., perlas de vidrio o resina) o con
un anticuerpo primario previamente inmovilizado. La cantidad de analito, por lo regular, se determina mediante interpolación
en una curva estándar de un material de referencia, en donde una cantidad fija de anticuerpo y de antígeno radiomarcado se
mezcla con una cantidad creciente de antígeno sin marcar. Por ende, incluso una pequeña cantidad de antígeno no marcado
resultará en una reducción cuantitativa relativa de la radioactividad total de la unión.
lnmunodifusiónRadial Simple
La inmunodifusión radial simple (IDRs)es un método cuantitativo para medir un analito en una muestra a través de la medi-
ción del diámetro del anillo de precipitina formado por el complejo antígeno-anticuerpo. El antígeno se aplica en un pocillo de
un gel infundido con un nivel constante de anticuerpo. Las soluciones con concentraciones más altas de antígeno difunden a
una mayor distancia antes de saturarse con el anticuerpo y precipitar. La cantidad de analito se determina mediante la compa-
ración con una curva estándar de referencia medida mediante la misma valoración.
7868 (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General USP42
Precipitación
El principio subyacente para este método es que la interacción de un anticuerpo multivalente y un antígeno conlleva a la
formación de un complejo. En algunos casos, se forma un precipitado visible. Otras técnicas de inmunoprecipitación implican
el uso de perlas de Proteína A o de Proteína G para capturar el complejo antígeno-anticuerpo y facilitar su separación de otros
antígenos en la solución. La precipitación no se usa comúnmente para propósitos de análisis cuantitativo debido al tiempo
requerido (días para completarla), la falta de sensibilidad y la necesidad de grandes cantidades de antígeno y anticuerpos.
Aglutinación
La aglutinación y la inhibición de la aglutinación, respectivamente, proporcionan mediciones cualitativas y cuantitativas de

ciertos antígenos y anticuerpos. La inhibición de la aglutinación es una modificación de la reacción de aglutinación que pro-
porciona una mayor sensibilidad para detectar pequeñas cantidades de proteínas, productos químicos, virus y otros analitos. El
principio de aglutinación es similar al de precipitación, con la excepción de que la interacción se lleva a cabo entre un anti-
cuerpo y un antígeno particulado y genera un cúmulo visible o aglutinación. El ejemplo de uso más común de esta aplicación
es la tipificación sanguínea (es decir, antígeno A, B u O).
SELECCIÓN
DELMPI
Al seleccionar un MPI, los analistas deben considerar su sensibilidad y especificidad, así como la complejidad de la muestra.
La Tabla1 proporciona al desarrollador de valoraciones una visión comparativa de las ventajas y desventajas de una variedad
de formatos de MPI. La selección del formato más adecuado debe estar regida por la aplicación prevista del MPI.
Tabla 1 MPI Usados en Laboratorios Blofarmacéutlcos
Método Ventajas Desventajas Usos Comunesen la Industria
ELISA • Alta Sensibilidad • Proceso de etapas múltiples alta- • Determinación de potencia
• A menudo con un amplio inter- mente dependiente de la ejecu- • Análisis de concentración de
valo dinámico ción adecuada de cada etapa proteínas específicas en mues-
• Alto rendimiento • Las etapas de lavado implican ma- tras complejas
• Bajo costo yor tiempo y a menudo de- • Identificación de proteínas
sechos de riesgo biológico • Evaluación de pureza
• Requiere el etiquetado de reactivos • Evaluación de inmunogenici-
dad
Transferencia • Provee información sobre el ta- • Por lo regular trabaja solo con epí- • Evaluación de pureza de pro-
Western maño y/o la carga del antígeno topes lineales teínas
• Permite la separación de diver- • Requiere una labor intensa • Evaluación de estabilidad de
sos antígenos (o productos de • Bajo rendimiento proteínas
degradación/agregación) que • Sujeto a interpretación • Pruebas de identidad de pro-
presentan el mismo epítope • La inmovilización puede alterar la teínas
• Puede tolerar mezclas comple- unión
jas • Limitado a proteínas
Citometría • Alto rendimiento • Uso limitado a células, partículas y • Determinación de potencia
de flujo • Altamente automatizada muestras enlazadas a perlas • Identidad celular en productos
• Sensible a los agregados y a la ma- de terapia celular
triz de muestra
RPS • Detección directa de unión • La inmovilización puede alterar la • Evaluación de inmunogenici-
• Puede medir la afinidad con unión dad
precisión, incluyendo las veloci- • La regeneración puede alterar la • Determinación de potencia
dades de acoplamiento y desa- unión • Análisis de concentración de
coplamiento • Bajo rendimiento proteínas específicas en mues-
tras complejas
Nefelometría • Fácilmente automatizable • Intervalo de detección pequeño • Valoración para componentes
cinética • Rápida • Alto fondo para muestras turbias individuales de vacunas para
verificar la estabilidad y la pu-
reza
RIA • La unión ocurre en una confor- • Requiere marcado radioactivo para • Identificación de proteínas (p.
mación nativa la detección ej., hormonas)
• Se pueden analizar muestras • La vida media más corta de algu- • Análisis de concentración de
con bajas concentraciones nos radioisótopos requiere la pre- proteínas específicas en mues-
• Anticuerpo de alta sensibilidad paración periódica del trazador tras complejas
usado en dilución limitante que • Desechos de riesgo biológico
conserva el reactivo
• Puede realizarse en placa para
un rendimiento mayor (p. ej.,
valoraciones de proximidad de
centelleo)
Tabla 1. MPI Usados en Laboratorios Blofannacéutlcos (Continuación)

Método Ventajas Desventajas Usos Comunes en la Industria
IDRs • Precisa • Semicuantitativa • Prueba de liberaciónde vacu-
• Configuraciónsimple • Bajaprecisión nas
• Bajasensibilidad
Precipitación • Bajocosto de equipos • Sujeta a interpretación • Identificaciónde vacunas
• Lenta
• Sensibilidaddeficiente (intervalo
de µg)
Aglutinación • Rápida • Sujeta a interpretación • Identificaciónde vacunas
• Bajocosto de equipos • lenta
• Bajaespecificidaddebido a sustan-
cias interferentes
CONSIDERACIONES
CLAVEPARAELDESARROLLO
DE MPI
El objetivo durante el desarrollo del método es producir una valoración exacta que sea factible desde el punto de vista prác-
tico y que cuente con un grado aceptable de precisión intra e intervaloración. Para una minimización general de las imprecisio-
nes, es necesario identificar y minimizar las fuentes de variabilidad.
Selección de Reactivos
Los inmunoensayos están sujetos a diversas fuentes de interferencia tales como reactividad cruzada, sustancias endógenas
interferentes, matrices de los amortiguadores, componentes de la muestra, epítopes enmascarados versus expuestos, cambios
en la conformación del antígeno de interés, entre otros factores. Por consiguiente, durante el desarrollo del método, los analis-
tas deben identificar las posibles fuentes de interferencia para desarrollar un método robusto y para facilitar la resolución de
futuros inconvenientes.
La reactividad cruzada representa un obstáculo importante durante el desarrollo del inmunoensayo. Ésta se presenta cuando
la especificidad de una reacción antígeno-anticuerpo se ve comprometida por la reactividad cruzada de moléculas estructural-
mente similares que se unen con el enlazante de reacción. Algunos ejemplos comunes son: isoformas de proteínas, entidades
de analito degradadas, moléculas de la misma clase, proteínas precursoras, metabolitos, entre otros. La reactividad cruzada se
puede minimizar mediante la rigurosa caracterización y selección del reactivo.
Los reactivos usados en las aplicaciones de MPI por lo general caen dentro de una de las dos categorías siguientes: reactivos
críticos y reactivos no críticos. Los reactivos críticos son específicos y únicos al MPI o a los reactivos particulares que no toleran
los más pequeños cambios en la composición o la estabilidad. Entre los ejemplos de reactivos críticos generalmente se incluyen
los anticuerpos específicos para la valoración y los estándares de referencia o de calibración del método. La equivalencia en el
formato de la valoración se debe establecer antes de reemplazar con un lote nuevo. Los reactivos no críticos son aquéllos cuya
composición puede variar en cierto grado sin afectar de manera adversa el desempeño del MPI. A menudo, se asume que los
reactivos no son críticos (p. ej., amortiguadores, calidad del agua, amortiguador de bloqueo o sustrato) pero posteriormente
se pueden identificar como componentes críticos si la tolerancia de la valoración incumple y es necesario iniciar una etapa de
resolución de problemas con los reactivos del MPI. Los reactivos específicos del MPI, incluyendo el proveedor y el número de
catálogo, deben definirse en la documentación de los procedimientos de prueba.
La selección de los anticuerpos es un paso crítico para el desarrollo de un inmunoensayo exitoso, debido a que con éste se
define la especificidad y sensibilidad de la valoración. Asimismo, los analistas deben asegurarse de que, durante la generación
de anticuerpos, los protocolos de inmunización respalden el uso final de los anticuerpos. Para algunas aplicaciones, se puede
generar un anticuerpo más específico mediante la selección de un inmunógeno pequeño y específico y la purificación de afini-
dad del anticuerpo, lo cual resulta en una cobertura del epítope altamente definida. En otras aplicaciones, puede resultar críti-
co asegurar una cobertura amplia de los diferentes epítopes disponibles en las moléculas de interés, mientras que una combi-
nación de anticuerpos policlonales (Acp)puede ser la mejor opción. Hoy en día, se prefieren los anticuerpos monoclonales
(Acm)para algunas aplicaciones de detección de analitos individuales debido a su alta especificidad, uniformidad entre lotes y
abastecimiento permanente. En comparación con los anticuerpos policlonales, los Acmtienen un costo inicial de producción
mayor, pero para estas aplicaciones, las ventajas por lo general tienen un mayor peso que los costos iniciales. Otras aplicacio-
nes pueden requerir de una selección más amplia de epítopes pasa asegurar que los cambios sutiles en las moléculas no eviten
el reconocimiento del antígeno completo, por lo que una combinación de anticuerpos monoclonales, o una combinación de
AcP' sería la opción preferida. Éstas últimas se usan ampliamente para la detección en una mezcla compleja de analitos (p. ej.,
proteínas de células huésped). De manera similar, los inmunoensayos pueden emplear dos epítopes distintos en un antígeno-
uno para captura y otro para detección-lo cual reduce en gran medida la reactividad cruzada. Otra metodología para minimi-
zar la reactividad cruzada consiste en purificar el antígeno antes del inmunoanálisis. Las variaciones en la temperatura y tiempo
de incubación pueden afectar la cinética de reacción de las interacciones del anticuerpo con antígenos similares aunque dife-
rentes. Por lo tanto, esta propiedad se debe optimizar para incrementar la especificidad de interacciones antígeno-anticuerpo.
7870 (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas/ Información General USP42
Desarrollo de lnmunoensayos
El desarrollo es una etapa importante para el establecimiento de un MPI adecuado. Durante el desarrollo de un MPI, los ana-
listas exploran diversas configuraciones de parámetros de valoración e interacciones entre parámetros para identificar las con-
diciones en las que la valoración producirá resultados confiables de manera uniforme usando una mínima cantidad de reacti-
vos, esfuerzo y tiempo. En la terminología de Calidad por Diseño, el término "espacio de operación posible" se refiere a la
colección de configuraciones de parámetros de valoración exploradas, mientras que "espacio de diseño" se refiere a las condi-
ciones en las que la valoración presenta un desempeño adecuado. Las propiedades de desempeño necesarias del PMI (preci-
sión, exactitud, especificidad, etc.) requerido dependen de los usos previstos. Durante el desarrollo del PMI, los analistas deben
considerar lo siguiente:
• La relación antígeno-anticuerpo;
• En inmunoensayos tipo sándwich, la relación entre anticuerpo de captura y anticuerpo de detección;
• La cinética de reacción antígeno-anticuerpo en la matriz de la muestra (por lo general, la unión antígeno-anticuerpo no
es lineal);
• La selección del estándar (longitud total del antígeno para el estándar o solo una pequeña porción del antígeno que con-
tiene el epítope de unión al anticuerpo, entre otras consideracones); y
• Los efectos de la matriz.
Se recomienda ampliamente el uso del diseño de experimentos (DOE, por sus siglas en inglés). Asimismo, diversos métodos
de DOE pueden ser adecuados en las distintas etapas del desarrollo. En las etapas tempranas del desarrollo, los diseños de se-
lección resultan particularmente útiles (generalmente, diseños factoriales geométricos fraccionados de dos niveles). Después de
la selección (con un modesto número de factores de estudio), por lo regular resultan apropiados los diseños factoriales com-
pletos o de superficie de respuesta. A medida que las actividades de desarrollo se trasladan hacia la calificación (idealmente, si
no por lo general, a medida que el enfoque se traslada hacia la robustez), los diseños de superficie de respuesta robusta a
menudo representan una buena opción. Durante la calificación o validación, puede resultar práctico para los analistas estudiar
de manera simultánea la robustez para las condiciones operativas de la valoración (usando un diseño factorial geométrico frac-
cionado pequeño) y los parámetros de validación tales como la precisión (mediante diseños anidados o cruzados para factores
aleatorios asociados con la repetibilidad, la precisión intermedia y la reproductibilidad).
Los experimentos que evalúan la linealidad dilucional y los componentes de especificidad, incluyendo los efectos de la ma-
triz, por lo regular implican la construcción de muestras adicionadas. Aunque la adición de cantidades conocidas a menudo se
lleva a cabo en una matriz de dilución, agregar cantidades conocidas a una colección de muestras reales o mezclar muestras
reales es un componente importante para demostrar la robustez de la linealidad dilucional y los componentes de especificidad
con los componentes de la muestra y de la matriz.
Consideraciones de Reactivos
El procedimiento para calificar fuentes y proveedores de reactivos (incluyendo auditorías), pedidos, recepción y eliminación
de reactivos e insumos comerciales debe detallarse mediante un procedimiento operativo estándar (POE). La preparación de
reactivos internos debe documentarse de tal manera que permita su reconstrucción. Los reactivos comerciales y los de prepa-
ración interna se deben etiquetar indicando la identidad, la concentración, el número de lote, la fecha de caducidad y las con-
diciones de almacenamiento. La estabilidad y la designación de fechas de caducidad para reactivos preparados internamente a
menudo se basan en la literatura disponible y en la experiencia científica, aunque puede ser necesario que los analistas las con-
firmen empíricamente. Se recomienda desarrollar un POE para la extensión de fechas de caducidad de reactivos críticos. Asi-
mismo, los analistas deben implementar un mecanismo para rastreo de reactivos y vinculación de números de lotes con núme-
ros de corridas analíticas. El desempeño inaceptable de reactivos se detecta mediante el rastreo de muestras de control de cali-
dad (CC). Los cambios en las muestras de CC deben dar lugar a una revisión de las corridas analíticas y de los cambios en los
números de lote de reactivos o una revisión del posible deterioro de reactivos críticos. Para evitar dichos cambios, los analistas
pueden efectuar una validación cruzada de los cambios en los lotes de reactivos críticos.
A menudo se pasa por alto el impacto que tienen los envases de recolección y almacenamiento sobre el desempeño analíti-
co. Al definir la estabilidad y la caducidad de reactivos producidos internamente, los analistas deben registrar información rela-
cionada con el proveedor, el número de catálogo y de lote del envase usado para almacenamiento. Es necesario volver a enfa-
tizar la importancia de un estándar de referencia adecuado y de su caracterización en los MPI para productos biológicos. Debi-
do a su complejidad inherente, la caracterización de los estándares de referencia y de calibración de productos biológicos ma-
cromoleculares a menudo es menos adecuada que la de los estándares de referencia para fármacos de moléculas pequeñas
convencionales. Si el estándar de calibración representa una mezcla de diferentes antígenos (p. ej., proteínas de células hués-
ped), éste debe ser representativo del perfil del antígeno en las muestras que se analizan. La uniformidad en los resultados del
MPI depende de la disponibilidad de un material estándar de referencia representativo adecuado.
VALIDACIÓN
La validación analítica implica la ejecución sistemática de un protocolo definido y de un análisis previamente especificado
que incluya criterios de aceptación previamente definidos. Una validación demuestra que un método analítico es adecuado
para uno o más de sus usos previstos [ver el capítulo Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos(1225), Validaciónde Va/oracio-
nes Biológicas(1033) e ICH Q2(Rl )]. La calificación puede implicar experimentos y procedimientos similares o idénticos a los
de la validación, aunque la calificación no requiere protocolos, análisis ni criterios de aceptación previamente especificados. En
algunas situaciones (p. ej., cuando se usa un kit comercial), el desarrollo de la valoración podría no ser necesario antes de la
calificación. El capítulo de información general (1225) analiza las características de desempeño de la valoración que se deben
examinar durante la validación para cuatro categorías primarias de usos previstos. Por ejemplo, los procedimientos analíticos
que cuantifican fármacos o ingredientes activos a granel importantes pueden no requerir de la validación de los límites de de-
tección y cuantificación, pero sí requerir la validación de exactitud, precisión, especificidad, linealidad e intervalo.
Aptitud del Sistema o Criterios de Aceptación de la Valoración
El propósito de la aptitud del sistema o de los criterios de aceptación de la valoración es asegurar que el sistema completo-
incluyendo instrumental, software, reactivos y analista-esté calificado para llevar a cabo la acción prevista para el propósito
previsto. Todos los procesos deben controlarse mediante POE bien definidos para asegurar la uniformidad, para reducir errores
y para promover la reproducibilidad de los procesos de laboratorio. Los archivos de capacitación para todo el personal deben
ser recientes e incluir alguna prueba de que los analistas están calificados para llevar a cabo el método y el MPI específico.
La calificación de instrumentos y software comienza con una definición de las calificaciones del diseño, la cual debe incluir
una evaluación de riesgos y un análisis de brechas que identifique cualquier amenaza potencial para la recolección, integridad
y captura permanente de datos del MPI. La calificación también incluye calificaciones de la instalación (CI) y calificaciones ope-
rativas (CO). Los paquetes comerciales adquiridos para la validación de instrumentos también pueden requerir de modificacio-
nes para cumplir con el uso previsto en cada instalación. El instrumental y el software deben monitorearse de manera continua
para asegurar su funcionalidad aceptable mediante la calificación del desempeño (CD) y las revisiones de las transcripciones de
prueba de validación de software. El mantenimiento de rutina de instrumentos se lleva a cabo de acuerdo con las recomenda-
ciones del fabricante; asimismo, puede ser necesario un mantenimiento adicional, dependiendo de las necesidades específicas
en el ambiente de trabajo. Es necesario archivar un historial completo de mantenimiento de rutina y no rutinario para cada
instrumento. Las actualizaciones de software se deben manejar con control de cambios y, por lo general, requieren de valida-
ción adicional. Es indispensable mantener el apego a las disposiciones del Título 21 del CFR 11.
Para asegurar la robustez, se debe establecer un proceso definido para implementar nuevos MPI en el laboratorio. Se debe
disponer de documentos de control, incluyendo planes de validación del método que contengan criterios de aceptación del
método e informes de validación a priori para el establecimiento de un nuevo MPI. Asimismo, para asegurar la reconstrucción
de resultados analíticos y para minimizar los errores de laboratorio, es necesario contar con documentos bien redactados sobre
el método analítico.
Los métodos de prueba analíticos deben incluir criterios de aceptación para aspectos críticos de la valoración, incluido el
desempeño de la curva de calibración, controles de calidad, concordancia entre determinaciones repetidas de muestras, proce-
dimientos para repetir análisis de muestras e identificación y tratamiento de valores aberrantes, cuando sea necesario. Además,
se debe implementar un POE para la investigación y resolución de eventos inesperados.
INFORMEDE DATOS
Unidades de Medición
Los MPI cuantitativos generan datos de la muestra de prueba con una concentración estimada basada en un ajuste de curva
de calibración con respecto a muestras de referencia (o estándar) usando un modelo matemático apropiado. Al determinar la
cantidad de analito en un proceso de fabricación, los analistas a menudo expresan la unidad de medición en términos de masa
de analito por volumen de solución (concentración) o masa de analito por masa de producto (p. ej., partes por millón). De-
pendiendo de la naturaleza del analito medido, el grado de estandarización de la medición, la región geográfica y el historial
del método, los analistas pueden expresar la concentración en términos de peso por volumen, mol por volumen o peso de
analito por peso de producto. En algunas circunstancias, la concentración se puede convertir a una unidad de medición de
actividad en la que se asume que la masa del analito es 100% activa. En ciertos casos, el análisis cualitativo usando un valor de
corte predeterminado puede constituir una alternativa aceptable a los métodos cuantitativos.
Análisis de Datos de lnmunoensayos
Los MPI emplean curvas de calibración preparadas con estándares de referencia con concentraciones conocidas (nominales)
y se incluyen en todos los métodos bioanalíticos. Esto ayuda a controlar la variación asociada con la repetibilidad, la precisión
intermedia y la reproducibilidad, al tiempo que permite estimar resultados para muestras de prueba desconocidas. Los análisis
estadísticos simples comunes asumen que los datos (posiblemente transformados) están distribuidos de manera normal, que
tienen una varianza constante, que son independientes, y que se ha usado un modelo apropiado. Para muchas valoraciones,
una o más de estas suposiciones podría resultar inadecuada. Los analistas deben evaluar dichas suposiciones usando un volu-
7872 (1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas / Información General USP42
men de datos sustancioso (por lo regular, decenas de valoraciones). Cuando tales suposiciones no son razonables, el análisis se
vuelve más complejo.
Las curvas de calibración por lo general se caracterizan mediante una relación no lineal entre la respuesta media y la concen-
tración de analito, y, generalmente, se grafican de manera logarítmica-lineal con la variable de respuesta (posiblemente trans-
formada y/o ponderada) graficada en el eje de las ordenadas en función de la concentración nominal del calibrador en el eje
de abscisas en escala logarítmica. La curva resultante que abarca el intervalo validado de la valoración es inherentemente ali-
nea! y a menudo presenta una forma de sigmoide con asíntotas horizontales a concentraciones de analito muy bajas y muy
altas. Los MPI competitivos tienen una pendiente negativa, mientas que los MPI no competitivos se caracterizan por una pen-
diente positiva. La concentración de analito en una muestra de prueba se estima mediante una regresión inversa contra la cur-
va de calibración. El resultado final a menudo se obtiene después de multuplicar la concentración estimada en la valoración
por un factor de dilución necesario para generar una respuesta dentro del intervalo de cuantificación del PMI.
Bajo la instrucción de un bioestadístico calificado, los analistas pueden implementar pruebas de valores aberrantes en docu-
mentos controlados que permitan la exclusión de resultados de muestra falsos. Se debe contar con un procedimiento bien
definido con respecto a la forma de identificar, repetir e informar valores aberrantes. Las pruebas para valores aberrantes y la
interpretación de resultados se describen en el capítulo general DatosAnalíticos-Interpretación y Tratamiento(101 O). Los resul-
tados de prueba que caigan fuera de sus especificaciones o criterios de aceptación previamente definidos se deben evaluar a
través de una investigación para resultados fuera de la especificación, a fin de identificar el origen del problema.
Análisisde Tendencias
Un sistema de calidad incluye el monitoreo del desempeño del MPI mediante la recopilación y la revisión de sus característi-
cas de desempeño. El análisis de tendencias puede detectar desviaciones en el desempeño de la valoración que podrían estar
relacionadas con eventos tales como cambios de lote de reactivo de la valoración, adición de nuevos analistas, desviaciones en
las condiciones ambientales, entre otros. Se recomienda contar con POE, protocolos de estudio, métodos de prueba analíticos
y diagramas de flujo para toma de decisiones a fin de proveer una definición estricta del manejo, uso, edición, rechazo, acepta-
bilidad e interpretación de datos de calibración y resultados de muestra de prueba para los MPI. Asimismo, resulta común con-
tar con varias revisiones de datos brutos, entre las que se incluyen revisiones realizadas por otros profesionales, de control de
calidad y de garantía de calidad. Los analistas deben ser capaces de distinguir dichas cuestiones analíticas de los cambios ver-
daderos en el analito medido, ocasionados por cambios o errores en el proceso de fabricación que hayan afectado al producto.
Dos de los resultados más importantes del monitoreo de tendencias adecuado son detectar problemas potenciales antes de
que ocurran e identificar áreas en las que se puedan aplicar medidas correctivas o preventivas. Los capítulos de información
general DatosAnalíticos-Interpretación y Tratamiento(101 O) y Validación de Va/oraciones Biológicas (1033), así como la literatu-
ra sobre estadística, ofrecen guías para varios métodos de análisis de tendencias. El monitoreo puede considerar diversas carac-
terísticas de desempeño de los MPI. El valor más común en el análisis de tendencias es la evaluación de muestras de control de
calidad (CC). Idealmente, se cuenta con una o más muestras de ce para análisis de tendencias a largo plazo en cantidad sufi-
ciente y con una estabilidad demostrada de modo que los aspectos de calidad se puedan evaluar en cada corrida y a través de
múltiples lotes de fabricación. A medida que la muestra de CC a largo plazo se agota o caduca, se debe completar una compa-
ración cruzada y establecer una nueva muestra de control de calidad de largo plazo. La revisión sistemática de datos de control
de calidad a través de valoraciones ayuda a resolver problemas con corridas fallidas del MPI, lo que genera confianza en la
evaluación de resultados aberrantes y permite controlar la reposición de reactivos a medida que se agotan, que pudieran no
desempeñarse exactamente igual que los anteriores.
Otras características de desempeño del MPI que se pueden monitorear incluyen las variables de respuesta de la curva de
calibración, los parámetros de ajuste de la curva, ruido de fondo de la valoración y la comparación de datos de control de
calidad en estudio con los datos de validación.
Rastreo
Las agencias reglamentarias tienen requisitos estrictos con respecto al mantenimiento de la identidad e integridad de mues-
tras y datos. Se debe implementar un proceso de calidad regido mediante POE para asegurar la identidad e integridad correc-
tas de las muestras de prueba y de retención. Idealmente, el sistema de código de barras debe usarse para rastrear la recolec-
ción, identidad, ubicación, cadena de custodia, número de ciclos de congelación/descongelación de la muestra, temperatura
de almacenamiento y duración del almacenamiento de la muestra. Esta información se debe capturar y debe ser susceptible de
auditoría desde el momento de la recolección (de la muestra) hasta su eliminación (o agotamiento). La capacidad para rastrear
la historia de la muestra permite la reconstrucción de los eventos que condujeron a la generación de los resultados. Esta infor-
mación es usada por las agencias reglamentarias para asegurar que se siguieron los procedimientos adecuados, y por los audi-
tores internos para asegurar que la manipulación de la muestra antes del análisis no comprometió los datos del estudio. Ade-
más, el rastreo de la muestra permite asegurar que la medición del analito se realizó dentro de los parámetros demostrados
para la estabilidad de dicho analito.
El resultado final generado a partir de un laboratorio bioanalítico es un número que representa una medición del analito en
una muestra de prueba. Los pasos necesarios para generar dichos datos y para preservar el resultado en un informe son nume-
rosos y suceptibles de error. Por lo tanto, se deben implementar sistemas de calidad para minimizar los errores en los datos.
USP 42 InformaciónGeneral/ (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas (ELISA)7873
Los errores pueden originarse a partir de factores tales como una ubicación o identificación incorrecta de la muestra, reducción
incorrecta de datos, cálculos mal realizados, errores de transcripción, omisiones, entre otros. Resulta ideal el uso de software y
de sistemas de administración de información de laboratorio validados siempre que sea posible para generar, transferir y archi-
var datos. Generalmente en los procesos automatizados se incluyen pruebas redundantes para revisar visualmente al menos el
10% de los procesos de transferencia de datos. En ausencia de transferencias electrónicas validadas, todos los datos deben ser
revisados por al menos un revisor. Al igual que con el rastreo de muestras, la generación, manipulación y almacenamiento de
datos deben ser reconstruibles. Asimismo, todos los datos deben tener una copia de seguridad en un formato estable. Se debe
contar con planes para actualizar los datos archivados de modo que, con el advenimiento de cambios en la tecnología, los
datos archivados aún puedan ser recuperables. Las agencias reglamentarias requieren que los datos brutos estén disponibles
durante cierto tiempo después de la culminación de un estudio o solicitud reglamentaria. Por último, los datos deben asegu-
rarse contra cualquier tipo de corrupción, alteración o acceso por parte de personal no autorizado.
(1103) MÉTODOSDE PRUEBAS

INMUNOLÓGICAS-ENSAYO POR
INMUNOADSORCIÓNLIGADOA ENZIMAS(ELISA)
INTRODUCCIÓN
Los Métodos de Pruebas Inmunológicas (MPI) utilizan la unión entre un antígeno (Ag) y un anticuerpo (Ac). 0/er el Apéndice
7 para una lista completa de acrónimos usados en este capítulo.) El ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)es
uno de los MPI más usados para los análisis de caracterización, liberación y estabilidad de productos biotecnológicos para ayu-
dar a asegurar la calidad de fármacos y medicamentos biológicos. El término ELISAse usa en este capítulo en un sentido más
amplio e incluye los enzimoinmunoensayos (EIA),así como métodos de detección alternativos, p.ej. quimioluminiscencia y
fluorescencia.
Este capítulo provee a los analistas información general sobre los principios, procedimientos, configuraciones experimenta-
les, desarrollo de valoraciones y validación para MPI en fase sólida, tales como el ELISA,y se puede usar para las otras variacio-
nes de enzimoinmunoensayos mencionadas anteriormente. Este capítulo también abarca estándares de referencia y controles
usados para inmunoensayos. La información se puede adaptar a los procedimientos específicos de una monografía. Este capí-
tulo no abarca inmunoensayos para la medición de respuesta inmune en animales o humanos (p. ej., valoraciones serológicas
o celulares), ensayos no inmunológicos (p. ej., interacciones entre receptor y ligando) ni metodologías relacionadas.
Este capítulo es parte de un grupo de capítulos de información general para métodos de pruebas inmunológicas [Métodos de
PruebasInmunológicas-ConsideracionesGenerales(11 02), Métodos de PruebasInmunológicas-Análisis por lnmunotransferencia
(1104) (propuesto) y Métodos de PruebasInmunológicas-Resonanciade PlasmónSuperficial(1105)]; asimismo, se relaciona con
los capítulos de información general para valoraciones biológicas [Diseñoy Desarrollode ValoracionesBiológicas(1032), Valida-
ción de ValoracionesBiológicas(1033) y Análisisde ValoracionesBiológicas(1034)].
Definición
El ELISAse puede definir como un método inmunológico cualitativo o cuantitativo en fase sólida para medir un analito des-
pués de su unión con una superficie inmunoadsorbente y su posterior detección mediante el uso de hidrólisis enzimática de un
sustrato revelador, ya sea de manera directa (como en el caso de un analito con propiedades enzimáticas o que se marca direc-
tamente con una enzima) o indirecta (mediante un anticuerpo ligado a enzima que se enlaza con el analito inmunoadsorbido).
Los resultados cualitativos proporcionan un resultado simple, positivo o negativo, para una muestra. Convertir resultados cuan-
titativos en cualitativos basándose en un valor de corte que separa a los resultados positivos de los negativos es una práctica
común. Debido a que las propiedades de desempeño de la valoración dependen en gran medida del valor de corte, el proce-
dimiento que se usa para determinar el corte debe basarse en evidencias y estar bien documentado. Las valoraciones cuantita-
tivas determinan la cantidad del analito basándose en la interpolación en una curva de calibración estándar con concentración
de analito conocida, que se lleva a cabo de manera simultánea en la misma valoración. Este estándar debe ser un material de
referencia o calibración apropiado, preferentemente homólogo, que sea representativo del analito de interés. La potencia de
los inmunoensayos ha quedado demostrada por la variedad de procedimientos que han ido evolucionando y que incluyen su-
perficies sólidas alternativas tales como perlas de diversos tipos, diversos plásticos en placas de diferentes configuraciones y
métodos de detección alternativos, p. ej., quimioluminiscencia y fluorescencia. Los ELISAtienen un amplio uso en la industria
biofarmacéutica para diversas aplicaciones, tales como identidad, pureza, potencia, detección o cuantificación de anticuerpos
o antígenos y otros procedimientos.
PrincipiosBásicos
Los pasos esenciales de un ELISAse pueden desglosar según se indica a continuación (ver la Figura 1):
7874 (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas (ELISA) / Información General USP42
Leyenda:
1 Reactivode Captura: C::::'.]

Proteínade Bloqueo:,
Fase Sólida 1. Unión del Reactivo
Analito: ~
de Captura
l AnalitoMarcado:
Detección Directa
/ oq
'L- "
ReactivoSecundario:
Detección Indirecta
~
l@&mJ
3. Unión del Analito
1 W:i:..rti
1
3a. Unión del Analito
'
4.Cuantificación de ◄
Señal y Análisis de
Datos
Lavado
1
•
d:&ti:J
3b. Unión Secundaria
Figura 1. Pasos esenciales para realizar un ELISA.

1
1. Unir el reactivo de captura (por lo general un anticuerpo o antígeno), que funciona como un inmunoadsorbente para
capturar el analito, a una superficie sólida;
2. Eliminar el exceso de reactivo de captura no unido, luego bloquear los sitios de unión sin ocupar, con una proteína de
bloqueo tal como albúmina, gelatina, caseína u otro material adecuado;
3a. Incubar el analito (en la muestra de prueba o estándar de referencia) con el reactivo de captura para unir el analito
sobre la superficie sólida, seguido del lavado de material no unido en la muestra de prueba y de la detección del analito.
La detección directa ocurre cuando el analito presenta actividad enzimática o se ha ligado a una molécula de detección
(p. ej., enzima); o
3b. Incubar el analito (en la muestra de prueba o estándar de referencia) con el reactivo de captura para unir el analito
sobre la superficie sólida, seguido del lavado de material no unido en la muestra de prueba y de la detección subsiguiente
del analito (Figura1, paso 3a). La detección indirecta ocurre cuando el analito se detecta mediante la adición de un reacti-
vo secundario marcado con enzimas (Figura1, paso 3b); y
4. Cuantificar el analito mediante la adición de un sustrato adecuado para el detector usado (p. ej., 3,3',5,5'-tetrametil-
bencidina (TMB)), seguido de la comparación de la muestra de prueba con el material de referencia.
DISEÑODE LA VALORACIÓN
En la Tabla1 y en las secciones siguientes de este capítulo se describen cinco categorías generales de ELISA.Los diseños de
valoración son flexibles y, dependiendo de las necesidades específicas, se pueden modificar a partir de estos procedimientos.
La selección de formatos depende principalmente de las cantidades y de la pureza de los reactivos y del equipo disponible. En
algunas ocasiones, el analito que se está caracterizando es, en efecto, un anticuerpo, como en el caso de un anticuerpo mono-
clonal que se está desarrollando como fármaco. En este caso, se usan anticuerpos antiidiotipo u otros anticuerpos específicos
para el anticuerpo que se usa para el desarrollo de las valoraciones.
1El ELISAestá confonnadopor cincopasosesenciales: unión del reactivode captura,bloqueo,unión del analito,unión del anticuerpode deteccióny análisis.
Despuésde cada uno de los pasos de unión del reactivode captura, bloqueo y unión del analito se debe llevara cabo un paso de lavado para eliminarreactivosno
unidos antes de agregarel siguiente reactivo.Antes del análisis,se debe agregarun sustratoadecuado, seguido de la medición del sustratomediante un equipo de
detección apropiado.Lacuantificaciónde elementos desconocidos se llevaa cabo mediante comparacióncon una curvaestándar.
USP 42 Información General/ (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas (ELISA) 7875
Tabla 1. Tipos Representativos de ELISA

Tipo de ELISA Reactivos Requeridos Atributos Desventa las
Deteccióndirecta • Analitode captura• • Rápidodebido a que se usa un • Puede modificarla conforma-
• Anticuerpoprimario marca- solo anticuerpo ción del analito
do específicopara antígeno • Usa menos reactivo • Sensiblea los componentes de
• Elanalito se inmoviliza la matriz y de los adyuvantes
• No se usa comúnmente
• Sensibilidaddeficiente
Detección indirecta • Analitode captura• • Versátildebido que se puede • Requieremayor tiempo debido
• Anticuerpo primarioespecí- usar una variedad de anticuer- a pasos adicionalesde incuba-
fico para el antígeno pos primarioscon el mismo de- ción y lavado
• Anticuerpode detección se- tector secundario
cundario marcado que se • Sensibilidadmejorada debido a
une al anticuerpo primario la amplificaciónde la señal
• Elanalito se inmoviliza
Competitivo • Elanalitoª se puede usar co- • Bueno para evaluar la reactivi- • Formato difícilpara la resolución
mo reactivo de captura o se dad cruzada antigénica de problemas
puede marcar con una eti- • Adecuado para proteínas más • Intervalodinámico limitado
queta de detección pequeñas con epítopes indivi-
• Anticuerpoespecíficopara duales
el analito que se puede usar • Requiereúnicamente un solo
para captura o marcado pa- anticuerpo
ra detección • Elanalito en solucióncompite
• Anticuerpossecundarios para unirse con el anticuerpo
marcados para unirse al an- primario
ticuerpo primariosi se usa
un formato indirecto
Tipo sándwich • Anticuerpode captura pri- • Sensibilidadmejorada • Requierecantidades relativa-
maria específicopara el • Bueno para valoracionescuanti- mente grandes de anticuerpo
analito tativas de moléculasmás gran- específicopuro o semipuro
• Soluciónmuestra que con- des con múltiplesepítopes • No adecuado para proteínas
tiene el analitoª • Analitomedido en solución más pequeñas que pudieran te-
• Un conjugado enzima-anti- ner únicamente un solo epítope
cuerpo primariodiferente o unos pocos epítopes muy pró-
específicopara el analito ximos entre sí
ª Estereactivopuede ser purificadoo parcialmentepurificado.Lostérminos"analito"y "antígeno"se usande maneraintercambiablepara describirlosELISA.
ELISADirecto
ANTICUERPOMARCADODIRECTAMENTE
En esta valoración una superficie sólida se recubre con el antígeno y se bloquean los sitios reactivos no unidos remanentes
(Figura 2A). Luego, se agrega una solución que contiene un anticuerpo específico marcado con un detector. Después de la
incubación, el anticuerpo no unido se lava y se procede a la adición de un sustrato apropiado para el detector usado.
7-
7876 (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas (ELISA)/ Información General USP42
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Directo Indirecto Competitivo
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Sándwich Puente
Figura 2. Representaciones esquemáticas de ELISAdirecto, indirecto, competitivo, tipo sándwich y tipo puente. 2 (Ac = anti-
cuerpo; Ag = antígeno (o analito); Preincub = preincubación)
ANTÍGENOMARCADODIRECTAMENTE
Esta valoración es similar a aquélla que usa un anticuerpo marcado directamente, excepto que la superficie sólida se recubre
con el anticuerpo y se usa un antígeno marcado como detector.
ELISAIndirecto
En esta valoración, una superficie sólida se recubre con un antígeno y, después del bloqueo, se agrega una solución que
contiene un anticuerpo específico (Figura28). Después de la incubación, el anticuerpo no unido se lava y se procede a la adi-
ción de un anticuerpo de detección antiinmunoglobulina (anti-lg). los detectores anti-lg están disponibles comercialmente pa-
ra clases y subclases específicas de lg de una variedad de especies, lo que hace de éste un formato de valoración útil para la
isotipificación de anticuerpos. Asimismo, el uso de un detector anti-lg marcado amplifica la señal en comparación con un ELISA
Directo,con lo que se incrementa la sensibilidad de la valoración.
ELISACompetitivos
ELISADIRECTOCOMPETITIVODE ANTICUERPO
Esta valoración se usa para detectar o cuantificar antígenos solubles (Figura2C). Requiere de un anticuerpo específico para el
antígeno que se ha conjugado con un detector apropiado, p. ej., peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, rutenio o fluoresceí-
na. Asimismo, requiere de un antígeno purificado o parcialmente purificado para recubrimiento. Se recubre una superficie sóli-
da con el antígeno, seguido de un paso de bloqueo. El anticuerpo conjugado se incuba con la solución de prueba que contie-
ne el antígeno soluble. Posteriormente, la mezcla se agrega al antígeno inmovilizado, se incuba y se lava el complejo antígeno-
anticuerpo no unido. Después, se agrega al sustrato y se mide la inhibición de la reacción (p. ej., calorimétrica, electroquimio-
luminiscencia, fluorescencia o quimioluminescencia) con respecto a la reacción cuando no se agrega un antígeno competidor.
la cantidad de inhibición es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra de prueba. Las valoraciones
competitivas también pueden medir moléculas pequeñas mediante el recubrimiento de la placa con un anticuerpo específico
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Eltipo de formato de ELISAdepende de la disponibilidad de reactivos, del uso previsto de la valoración y de las características fisicoquímicas del analito de
interés. Para un EUSATipo Puente,los anticuerpos de captura y de detección reconocen el mismo epítope y, por lo tanto, el antígeno diana debe tener al menos
dos epítopes disponibles para unión.
T
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para dicha molécula pequeña. La molécula pequeña es a menudo biotinilada con un conector largo que no interfiere con la
unión entre el anticuerpo de captura sobre la placa y la molécula pequeña. El antígeno (la molécula pequeña) en la muestra
compite posteriormente con la molécula pequeña marcada para unirse al anticuerpo de captura. Después del lavado, se agre-
ga un reactivo de detección (p. ej., estreptavidina marcada con HRP) para detectar el complejo de unión.
ELISADIRECTOCOMPETITIVODE ANTÍGENO
Esta valoraci6n es similar al ELISADirecto Competitivo de Anticuerpo, excepto que se usa para detectar anticuerpos solubles. El
antígeno se conjuga con el detector y la superficie sólida se recubre con el anticuerpo.
ELISAINDIRECTOCOMPETITIVODE ANTICUERPO
Esta valoración es similar al EL/SADirecto Competitivo de Anticuerpo, excepto que en lugar de marcar directamente el anticuer-
po, la prueba usa un reactivo anti-lg marcado para la detección.
ELISAINDIRECTOCOMPETITIVODE ANTÍGENO
Esta valoración es similar al EL/SADirecto Competitivo de Antígeno, excepto que en lugar de marcar directamente el antígeno,
la prueba usa un anticuerpo secundario marcado para la detección.
ELISATipo Sándwich
ELISATIPO SÁNDWICHDIRECTO
En esta valoración, se inmoviliza un anticuerpo sobre una superficie sólida, se bloquea y, posteriormente, se agrega una solu-
ción que contiene un antígeno específico (Figura 20). Después de una etapa de incubación, se lava el material no unido y se
agrega el anticuerpo de detección marcado. Este formato de valoración requiere de dos anticuerpos, cada uno de los cuales se
une a diferentes epítopes sobre la superficie de la molécula grande y compleja. Los dos anticuerpos son específicos para el
antígeno y el antígeno debe ser lo suficientemente grande y complejo para alojar la unión de dos anticuerpos.
ELISATIPO SÁNDWICHINDIRECTO
Como alternativa al marcado directo del anticuerpo detector, se puede usar un anticuerpo de detección anti-lg. Los forma-
tos de inmunoensayos tipo sándwich indirectos pueden considerarse únicamente si cada reactivo de unión proviene de una
especie diferente (p. ej., una valoración tipo sándwich que utiliza dos anticuerpos monoclonales de ratón para captura y detec-
ción no podría detectarse indirectamente debido a que la señal resultante se puede tornar independiente de la concentración
de antígeno).
ELISA TIPO PUENTE:
Esta categoría de ELISATipo Sándwich a menudo emplea un solo anticuerpo para captura y detección (Figura 2E). Si se usa un
anticuerpo monoclonal, es necesario que el antígeno diana tenga al menos dos epítopes idénticos que estén espaciados ade-
cuadamente para evitar el impedimento estérico, de modo que un epítope se una al anticuerpo de captura y el otro se una al
anticuerpo de detección. Como alternativa, se puede usar un anticuerpo policlonal, aunque esto requiere que el antígeno dia-
na sea lo suficientemente grande para alojar la unión de dos moléculas de anticuerpo. Con respecto a la especificidad y la
sensibilidad, las valoraciones tipo puente a menudo son adecuadas para moléculas grandes.
SELECCIÓN
DE LAVALORACIÓN
La decisión sobre el tipo de formato o procedimiento de ELISAque se va a utilizar a menudo depende de la selección y dis-
ponibilidad individual de reactivos, instrumentos y otros equipos. Por ejemplo, en ocasiones, un laboratorio puede modificar
por ingeniería repetidamente un epítope particular para generar múltiples proteínas de fusión. En dicho caso, el laboratorio
puede emplear ciertos reactivos calificados comunes (p.ej, un anticuerpo para una región de glutatión S-transferasa en múlti-
ples proteínas de fusión), lo cual facilita el desarrollo rápido de un inmunoensayo tipo sándwich. Los antígenos pequeños con
un número limitado de epítopes disponibles para unión de anticuerpos limitan las opciones de formato de ELISA.Si se encuen-
tra disponible únicamente un epítope de unión, entonces no es posible utilizar los métodos ELISAque emplean una unión tipo
sándwich con dos sitios ni otros formatos tipo puente debido a que estos necesitan al menos dos epítopes disponibles para la
unión de anticuerpos. Asimismo, las moléculas pequeñas por lo regular no se usan como reactivo de captura en una placa
debido a que el proceso puede interferir en la unión con el reactivo de detección. Entre los ejemplos de tales moléculas peque-
ñas se incluyen algunos péptidos, oligosacáridos, nucleótidos y antibacterianos. Los analistas generalmente adoptan un forma-
to de valoración competitiva para tales analitos pequeños.
Diversas valoraciones y formatos pueden demostrar diferentes propiedades y características, p. ej., especificidad, precisión,
exactitud, sensibilidad, intervalo dinámico, relación dosis-respuesta, rendimiento de la muestra, sensibilidad a interferencias y
simplicidad o eficiencia para la automatización. Asimismo, la facilidad de la validación puede variar entre los diversos protoco-
los y formatos de valoración. Los diseños de valoración con determinaciones repetidas en pocillos adyacentes pueden estar
sesgados si se presentan efectos por ubicación; por ende, en este caso, las determinaciones repetidas no deben estar en poci-
llos adyacentes. Los diseños de valoración que son convenientes para su realización en placas de 96 pocillos, los cuales requie-
ren de un menor uso de pipetas de un solo canal y un mayor uso de pipetas multicanal, son a menudo más fáciles de adaptar
a la automatización. Las valoraciones con curvas de dosis-respuesta pronunciadas tienen, por lo general, una mejor capacidad
de producir estimaciones de alta precisión; no obstante, algunas valoraciones con curvas de dosis-respuesta pronunciadas son
imprecisas en la CE50 y requieren de un intervalo de dosis más amplio.
,cambio en la redacdón:
PROCEDIMIENTOS
Fasesólida
Las fases sólidas están disponibles en una variedad de formas (p. ej., membrana, placa o perla) y composiciones químicas (p.
ej., nailon, nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno (PVDF),polivinilo, poliestireno o una superficie derivatizada químicamente).
La selección de la fase sólida determina el mecanismo de unión más probable, es decir, interacciones hidrófobas, hidrófilas o
covalentes. En comparación con las placas, las perlas generalmente ofrecen una mayor capacidad y se usan de manera más
común en ensayos clínicos, mientras que las placas se usan con mayor regularidad para analizar productos biotecnológicos.
Más adelante en este capítulo se proporciona información adicional sobre las placas.
RECUBRIMIENTO
DE LAFASESÓLIDA-INMOVILIZACIÓNDELREACTIVODE CAPTURA
Se recubre una fase sólida con los reactivos de captura agregando a la superficie una solución que contiene el reactivo de
captura. Los materiales de la fase sólida de uso más común para la inmovilización del reactivo de captura son las placas plásti-
cas de microtitulación de 96 pocillos. Para lecturas espectrofotométricas, se recomiendan las placas con pocillos de fondo pla-
no, mientras que las placas con pocillos de fondo redondo se recomiendan para la evaluación visual del desarrollo del color de
un colorante. El grado de recubrimiento se ve influenciado por la concentración del reactivo de captura, la temperatura duran-
te el recubrimiento, la duración de la adsorción del reactivo de captura, las propiedades de la superficie del material de fase
sólida y la naturaleza del amortiguador de la solución del reactivo de captura. Aunque se debe determinar la concentración de
recubrimiento óptima para cada reactivo de captura, las concentraciones de uso más común son de 1-1 O µg/•mL
• ERR(Ol-teb-ioia¡· El volumen de reactivo de captura que se agrega a cada pocillo por lo general se corresponde con el volumen
de muestra que se va a analizar, es decir, 50-1 00 µL. La duración del recubrimiento, la temperatura y los amortiguadores se
analizan por separado más adelante en este capítulo. Los analistas deben evitar la introducción de burbujas durante el proceso
de recubrimiento. Las proteínas que se unen al plástico pueden desnaturalizarse, lo cual altera la antigenicidad. En tales casos,
se puede usar un anticuerpo de captura o una proteína intermediaria tal como Proteína A o Proteína G. Además, se puede usar
estreptavidina cuando el reactivo está biotinilado. Es necesario optimizar el pH del amortiguador de recubrimiento basándose
en el punto isoeléctrico del reactivo de captura y en las propiedades de la superficie de la placa de valoración seleccionada.
PLACASDE MICROTITULACIÓN
La composición y fuente comercial de la placa de microtitulación pueden influenciar la unión del reactivo de captura duran-
te el recubrimiento. Se deben comparar varias placas de microtitulación de diversos proveedores usando un solo procedimien-
to de recubrimiento para seleccionar aquéllas que proporcionen una alta especificidad para el reactivo de captura de interés y
una baja unión inespecífica. Asimismo, puede ser necesario comparar diferentes grados de placas de un solo proveedor. Por lo
regular, se usan placas transparentes para ELISAcolorimétrico, mientras que las placas opacas se usan generalmente para ELISA
quimioluminiscente y fluorométrico. Los reactivos de captura acídicos pueden requerir una solución con un pH menor para
neutralizar las fuerzas de repulsión entre la proteína y la fase sólida. A menudo, los péptidos requieren de la optimización del
pH del amortiguador, basándose en la carga de estos, para condiciones óptimas de recubrimiento durante el desarrollo de la
valoración. El recubrimiento directo de la placa con polisacáridos, lipopolisacáridos o glicoproteínas puede ser complicado y
puede requerir de un anticuerpo de captura o de un amortiguador que contenga lisina o glutaraldehído. El recubrimiento con
un anticuerpo se puede mejorar recubriendo previamente la placa de microtitulación con Proteína A o Proteína G o una com-
binación de ambas, lo que permite la unión con la región Fe de modo que la porción Fab se pueda unir al analito de interés.
No obstante, se debe tener cuidado de asegurar que los anticuerpos secundarios subsiguientes no reaccionen con los pocillos
recubiertos con Proteína A o Proteína G. En este caso, por ejemplo, se puede usar inmunoglobulina Y (lgY) de pollo u otra
clase adecuada de anticuerpo. Se pueden usar formatos de placa de microtitulación diferentes a la variedad de 96 pocillos,
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tales como las placas de volumen reducido a la mitad de 96 pocillos o de 384 pocillos, para aumentar el rendimiento y/o con-
servación de reactivos.
TIEMPO DE RECUBRIMIENTO
El tiempo de recubrimiento depende de la cinética de unión, la estabilidad, la concentración del reactivo de captura y la
temperatura de incubación. Aunque diferentes combinaciones de tiempos y temperaturas de recubrimiento a menudo ofrecen
la misma eficiencia de recubrimiento, la estabilidad del reactivo de captura (que se debe determinar durante el desarrollo del
método) influye sobre la selección de condiciones. Los analistas deben evaluar el impacto de realizar variaciones en el tiempo
de recubrimiento para determinar la robustez del procedimiento de valoración.
TEMPERATURA
DE RECUBRIMIENTO
La temperatura y el tiempo de recubrimiento son parámetros de valoración estrechamente relacionados. La temperatura de

recubrimiento depende de la cinética de unión y de la estabilidad del antígeno. El uso de temperaturas más elevadas puede
aumentar la velocidad de adsorción y acortar el tiempo de recubrimiento, aunque también podrían afectar a los sitios de inte-
racción y reducir la afinidad antígeno-anticuerpo. Las combinaciones típicas de tiempo y temperatura son de 1 a 4 horas a
temperatura ambiente, de 15 minutos a 2 horas a 37° o durante toda la noche a 4°. Los analistas deben determinar los efectos
de las variaciones de temperatura a fin de evaluar la robustez del procedimiento de la valoración.
AMORTIGUADORES
Los amortiguadores usados para diluyentes, recubrimiento, bloqueo y lavado de placas pueden afectar el desempeño gene-
ral de la valoración. Los componentes de los amortiguadores pueden interactuar con la muestra de prueba e inhibir la unión.
Además, pueden disminuir la sensibilidad del antígeno o aumentar el fondo inespecífico.
Diluyente-Los amortiguadores [p. ej., solución salina amortiguada con fosfatos (PBS) o solución salina amortiguada con
imidazol] con polisorbato 20 (0,01 ºA>-0, 1%) se usan comúnmente para distintos pasos del ELISAcomo diluyente y amortigua-
dor de lavado.
Amortiguadores de Recubrimiento-Los amortiguadores de recubrimiento deben maximizar la uniformidad de la valora-
ción y promover la unión del reactivo de captura con la fase sólida. Los amortiguadores de recubrimiento comúnmente usados
incluyen soluciones de carbonato 50 mM, pH 9,6; de Tris-HCI20 mM, pH 8,5; y de PBS 1O mM, pH 7,2. La selección de amor-
tiguadores de recubrimiento depende de la naturaleza de los antígenos individuales y se debe determinar empíricamente.
Agentes de Bloqueo y Amortiguadores-Un agente de bloqueo es un compuesto (p. ej., proteína o detergente) que debe
saturar los sitios de unión inmunoadsorbentes remanentes después de la unión del reactivo de captura (anticuerpo o antíge-
no). Esto reduce la unión no específica del analito y otros componentes distintos al analito con la matriz inmunoadsorbente
y/o el reactivo adsorbido. La unión no específica ocurre cuando la proteína en la muestra de prueba se une al plástico de la
placa de microtitulación o al reactivo adsorbido en lugar de unirse específicamente al reactivo de captura de interés. La unión
no específica se puede reducir agregando reactivo de bloqueo a los pocillos y mediante la adición de otra proteína tal como
albúmina sérica bovina (BSA)al amortiguador de dilución. La selección del agente de bloqueo debe regirse por la naturaleza
del reactivo de captura, de la placa, del amortiguador de recubrimiento, del diluyente de la muestra de prueba y por factores
relacionados. Si alguno de estos parámetros cambia, puede ser necesario cambiar el agente de bloqueo. Los agentes de blo-
queo comúnmente usados incluyen BSA,leche descremada, gelatina, caseína, suero normal de caballo, suero fetal bovino y
polisorbato 20, entre otros. Se encuentran disponibles comercialmente diversos grados de BSA,pero el grado óptimo debe
determinarse empíricamente para cada valoración. Asimismo, se encuentra disponible una gran cantidad de reactivos de blo-
queo y diluyentes de valoración comerciales para los MPI.
Adición de Muestras y Reactivos
Las muestras y reactivos por lo general se pipetean y transfieren a los pocillos de la placa para ELISA.Se debe tener cuidado
de evitar la contaminación cruzada, espuma o burbujas. Además, se pueden usar equipos que faciliten los trabajos tales como
pipetas electrónicas, dispensadores automatizados de líquidos, lavadoras de placas y pipetas robóticas para mejorar la preci-
sión, reducir la variabilidad entre analistas y aumentar el rendimiento.
PIPETAS
Se encuentran disponibles pipetas monocanal, multicanal y robóticas con volúmenes regulables o fijos. Es necesario evaluar
el tipo y la exactitud de las pipetas para cada aplicación. Resulta indispensable llevar a cabo y documentar el mantenimiento
regular y la calibración profesional de las pipetas.
PUNTASPARAPIPETAS
Se encuentra disponible una variedad de puntas para pipetas, algunas de las cuales son específicas para ciertos tipos de pi-
petas. El tipo y la exactitud de la punta para pipeta, particularmente con respecto a la viscosidad y a la unión no específica de
los materiales, se deben evaluar para cada aplicación.
Lavado
Durante todo el procedimiento de ELISAse incluyen pasos de lavado para eliminar materiales no unidos tales como antígeno
de recubrimiento, muestra y reactivos de detección. El lavado es crítico para el desempeño de la valoración, puede ser una
fuente de falla de la valoración, y es importante evaluarlo durante el desarrollo del método. Se pueden usar múltiples metodo-
logías para el lavado. Los procedimientos manuales incluyen el uso de frascos exprimibles, sumersión de la placa de microtitu-
lación en amortiguador para lavado, y adición de amortiguador para lavado con una pipeta multicanal o lavadores manuales
multicanal (8 o 12 boquillas). Los analistas deben realizar el lavado con cuidado para evitar contaminación cruzada entre poci-
llos. Las lavadoras de microplacas automáticas por lo general proporcionan una mayor uniformidad de lavado. Asimismo, se
encuentran disponible lavadoras de pocillos en tira y multipocillos. La mayoría de las lavadoras automáticas se pueden progra-
mar para diferentes volúmenes y velocidades de dispensación, número de lavados, velocidad de aspirado de amortiguador y
cantidad de amortiguador residual remanente en el pocillo. Las lavadoras automáticas programadas o mantenidas incorrecta-
mente o cuya limpieza sea incompleta pueden ocasionar variaciones en la valoración y una elevada lectura de fondo.
Incubación
Los ELISAse incuban después de la adición de muestras y reactivos. El tiempo, las condiciones y la temperatura óptima de
cada paso de incubación se debe determinar durante el desarrollo del método. Los tiempos de incubación van desde minutos
hasta toda la noche. Las temperaturas de incubación comúnmente usadas son la temperatura ambiente, 4° y 37°. Las placas
para ELISApor lo regular se sellan o colocan en un recipiente secundario para evitar la evaporación o contaminación durante la
incubación. Asimismo, durante el desarrollo del método, se deben evaluar las condiciones atmosféricas tales como la incuba-
ción en seco o humidificada. Finalmente, puede ser necesario o apropiado agitar, rotar o someter a un movimiento oscilante
las placas para microtitulación, dependiendo de la cinética de unión.
Condicionesde Bloqueoy ReaccionesNo Específicas

Después de la inmovilización y eliminación de antígeno o anticuerpo no unido, los sitios de unión no ocupados se bloquean
para asegurar que el analito medido en el artículo de prueba o los reactivos subsiguientes (de detección) no se unan de mane-
ra inespecífica a la superficie sólida o al antígeno o anticuerpo recubierto. Si se produce unión inespecífica, cualquier señal in-
formada puede sesgar la medición y reducir la sensibilidad y el intervalo dinámico de la valoración. El bloqueo es crítico para
asegurar la sensibilidad y/o la especificidad de la valoración. Las fuentes de unión no específicas caen dentro de dos categorías
generales:
1. Lasinteraccionesiónicaso hidrófobasocurren cuando la unión se media a través de interacciones iónicas o hidrófobas no
específicas entre reactivos de valoración y la superficie sólida u otro reactivo de valoración.
2. Lasinteracciones inmunológicas ocurren cuando la unión se media a través de interacciones no previstas entre antígeno y
anticuerpo. Esto ocurre cuando las preparaciones de anticuerpos usadas en la valoración interactúan con otros reactivos
de valoración. Por ejemplo, si un ELISAse diseñó para analizar un analito derivado de suero usando anticuerpos murinos
de captura y de detección, los anticuerpos en el artículo de prueba con reactividad contra la lg murina (también conoci-
dos como anticuerpos heterófilos) se pueden detectar de manera inespecífica en la valoración.
La selección del agente de bloqueo (se pueden encontrar ejemplos en la sección anterior Agentesde Bloqueoy Amortiguado-
res) se determina empíricamente, y el balance entre la reducción en la unión no específica y el impacto sobre la sensibilidad de
la valoración se debe evaluar durante el desarrollo del método. Resulta necesario tomar en cuenta la reactividad cruzada con
otros reactivos de la valoración; por ejemplo, la biotina endógena de la leche y el suero, y anticuerpos contra proteínas virales
o bacterianas que pueden estar presentes en el suero. Por lo tanto, puede ser necesario realizar pruebas específicas para los
lotes de suero. El volumen de solución de bloqueo agregado al pocillo debe ser mayor que el volumen de reacción máximo
usado para los pasos posteriores, de tal manera que se bloquee el área potencial de la superficie que podría interferir con la
unión.
Además, la lg en los materiales de prueba se puede eliminar usando amortiguadores que inhiben la conformación de anti-
cuerpos o que agregan los anticuerpos heterófilos, mediante el bloqueo con suero no inmune, o eliminando las regiones Fe en
los reactivos de anticuerpos críticos, con lo cual se reducen o eliminan interacciones inmunológicas indeseadas que no se pue-
den tratar con los reactivos de bloqueo descritos anteriormente. Es posible incluir pocillos de control negativo para monitorear
reacciones no específicas. La naturaleza de los pocillos de control negativo depende de la valoración pero puede incluir pocillos
bloqueados sin antígeno de recubrimiento, pocillos en los que se elimina el anticuerpo primario o secundario, o pocillos en los
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que se usa amortiguador en lugar de muestra. Los pocillos de control pueden ser útiles como parte de un sistema de pruebas
de aptitud del sistema.
Pretratamiento de las Muestras
Aunque los métodos de ELISAse diseñan para medir un analito en mezclas complejas, la presencia de otros materiales puede
representar un problema si interfieren con la detección del analito. A fin de asegurar la especificidad de la valoración, el proce-
dimiento especifico de tratamiento de las muestras para eliminar sustancias interferentes inespecíficas (p. ej., agentes reducto-
res o precipitados) se puede determinar empíricamente durante el desarrollo del método para después incorporarlo en la valo-
ración validada. Cualquier paso de procesamiento de las muestras se debe evaluar teniendo en cuenta la posibilidad de que el
tratamiento altere las propiedades del artículo de prueba y/o induzca una mayor variabilidad que genere mediciones sesgadas.
Las muestras, estándares y controles se deben preparar y manipular en procesos que sean similares entre sí. Los analistas deben
verificar que los pretratamientos no hayan dañado la muestra a tal grado que ya no pueda medirse (p. ej., mediante experi-
mentos en los que la muestra haya recibido algún tipo de adición).
Anticuerpos de Detección
Dependiendo del formato del ELISA,se pueden usar como reactivos primarios o secundarios anticuerpos de detección mar-
cados con enzimas u otras marcas, a fin de permitir la detección del analito inmovilizado. En un ELISAdirecto o competitivo
(Figura 2A y Figura2(), después de que el analito se ha unido a la superficie inmunoadsorbente, se lava el analito en exceso y
se detecta el analito inmovilizado usando un anticuerpo de detección, el cual se considera el anticuerpo primario. En otros
formatos de ELISA(Figura 28, 2D, y 2E), se permite que la lg específica del analito (anticuerpo primario no conjugado) se una
al analito inmovilizado y se lava cualquier exceso de anticuerpo antes de la adición de un anticuerpo de detección, el cual se
denomina anticuerpo secundario.
Para facilitar la detección, en todos los formatos de ELISAque emplean anticuerpos conjugados con enzimas, se introduce
un sustrato específico para la enzima conjugada en el sistema de valoración. Se genera una reacción enzimática que convierte
un sustrato en un producto soluble el cual se puede medir usando longitudes de onda apropiadas y un lector adecuado.
La sensibilidad del ELISAdepende de la calidad de los reactivos y del sistema de detección, incluyendo la marca y el sustrato.
Si se dispone de múltiples anticuerpos conjugados, los analistas deben seleccionar uno apropiado para la valoración. Durante
esta evaluación, se debe determinar la dilución de cada conjugado que genere una sensibilidad y especificidad adecuadas me-
diante controles apropiados.
Las enzimas de marcado de uso más común para conjugar anticuerpos incluyen fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rábano
(HRP)y galactosidasa. Estas enzimas son altamente específicas, sensibles y estables para la catalización de reacciones cromogé-
nicas, luminiscentes o fluorescentes. El fosfato de para-nitrofenilo (pNPP) es un sustrato comúnmente usado para AP.Los sus-
tratos de uso común para HRP incluyen TMB, OPD (diclorhidrato de o-fenilendiamina) y ABTS[sal diamónica del ácido 2,2'-
azino-bis(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico)] (ver la Tabla2). Los sustratos para AP y HRPson cromogénicos y resultan en la for-
mación de un producto coloreado que se puede medir usando un espectrofotómetro. Asimismo, se encuentran disponibles
sustratos quimioluminiscentes y fluorescentes para AP y HRPque, en muchas ocasiones, están disponibles como kits comercia-
les. Elfosfato de 3-(4-metoxiespiro{l ,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo[3.3. l .13,7]decan}-4-il)fenilodisódico (CSPD) es un sus-
trato quimioluminiscente conocido para AP (ver la Tabla 2). Los sustratos fluorescentes bien conocidos para galactosidasa in-
cluyen MG (4-metilumbeliferil galactósido) y NG (nitrofenil galactósido). Si se usa un sustrato quimioluminiscente, entonces es
necesario un luminómetro para cuantificar el producto formado. Si en el ELISAse usa un sustrato fluorescente, es necesario
contar con un fluorómetro.
La Tabla 2 también provee un resumen de las ventajas y desventajas de diferentes tipos de sustratos para ELISA.Los sustratos
colorimétricos han prevalecido desde el origen de los ELISAy pueden generar valoraciones robustas que, por lo general, son
más asequibles que las valoraciones que usan sustratos quimioluminiscentes y fluorescentes. No obstante, los métodos de ELI-
SA quimioluminiscentes y fluorescentes pueden generar valoraciones más rápidas y sensibles con un intervalo dinámico más
amplio que las valoraciones que emplean una lectura colorimétrica. La selección final del tipo de lectura debe regirse por el
propósito de la valoración y los requisitos de la misma.
Tabla 2. Conjugados con Enzimas y Sustratos
Principio de la
Lectura Reacción Enzimática Enzima Sustrato Lector Ventajas Desventajas
Colorimétri- Produce un producto colo- AP, HRP pNP Espectrofotómetro • Robusto • Menos
ca reado que genera valores p • Económico sensible
de absorbancia directa- TMB • Disponibili-
mente proporcionales a la OPD dad del reac-
concentración de analito ABTS tivo
Tabla 2. Conluciados con Enzimas y Sustratos (Continuación)

Quimiolumi- Produce emisión de luz que AP CSP Luminómetro • Amplio inter- • Requiere pla-
niscente es directamente proporcio- D valo cas especiales
nal a la concentración de dinámico de • Costoso
analito valoración
• Concentra-
dones de re-
cubrimiento
más bajas
• Más sensible
• Generación
rápida de se-
ñal
Fluorescente Produce emisión de luz in- Galactosida- MG Fluorómetro • Rápida • Requiere pla-
ducida por excitación que sa NG • Sensible cas especiales
es directamente proporcio- • Costoso
nal a la concentración de • Interferencia
analito de excipien-
tes
PLAN DE DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE LA VALORACIÓN
Desarrollo de ReactivosCríticos
Las consideraciones claves para los reactivos críticos incluyen el origen, la pureza, la especificidad y la estabilidad. Para medi-
ciones de calidad, los MPI emplean estándares de referencia junto con reactivos críticos para captura y detección de analitos.
Resulta necesario evaluar cualquier cambio en los reactivos biológicos críticos (ver, por ejemplo, las guías contenidas en el capí-
tulo Diseñoy Desarrollode Valoraciones Biológicas(1032).)
FUENTES
La disponibilidad y calidad del material inicial se debe controlar de modo que la fabricación del reactivo (purificado) se pue-
da llevar a cabo de manera reproducible y uniforme, probablemente durante varias décadas. Debido a que los reactivos críti-
cos son moléculas biológicas, las fuentes pueden variar de síntesis químicas (p. ej., péptidos) a matrices biológicas complejas
(p. ej., anticuerpos preparados a partir de suero, anticuerpo monoclonal de ascitis/cultivo celular o productos de fermentación/
cultivo celular). Cuando resulte apropiado para el uso previsto de la valoración, se puede fabricar un solo lote de reactivo críti-
co para establecer un abastecimiento sustancioso y evitar la variabilidad entre lotes. En otros casos, puede resultar apropiado
incluir en la validación múltiples lotes o proveedores para demostrar que la valoración es lo suficientemente robusta para el uso
previsto.
PUREZA
En general, la pureza de los reactivos críticos se debe evaluar para asegurar la eliminación de impurezas y residuos del proce-
so de fabricación que pudieran influir sobre el desempeño y/o la estabilidad del reactivo.
ESPECIFICIDAD
La especificidad de un reactivo crítico se refiere a su capacidad para capturar o detectar solo el analito de interés. El reactivo
debe ser específico para el analito y debe presentar una baja unión inespecífica o ninguna unión cruzada con las moléculas
fuera de interés en materiales de prueba complejos.
ESTABILIDAD
La estabilidad de reactivos críticos debe determinarse empíricamente para asegurar el desempeño de la valoración con el
paso del tiempo (las cuestiones a tratar incluyen exactitud, precisión, reproducibilidad y desvíos de la valoración). Se debe de-
terminar la estabilidad a largo plazo (de meses a años) de los reactivos críticos en las condiciones de almacenamiento requeri-
das (p. ej., con temperatura y envases definidos) para poder asignarles una fecha de caducidad apropiada. Asimismo, también
se requiere la estabilidad a corto plazo (de minutos a días) (y la estabilidad durante el congelamiento/descongelamiento y a
temperatura ambiente para los reactivos críticos congelados) para asegurar la exactitud, precisión y reproducibilidad diarias de
la valoración.
USP 42 Información General/ (1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas (ELISA) 7883
Estudiosde Factibilidad/Piloto
A continuación, se describen las etapas del proceso mediante el cual se desarrolla, valida y emplea un método de ELISApara
análisis rutinarios de muestras:
• Generar o adquirir reactivos críticos para medir el analito. Determinar las condiciones de almacenamiento y de estabili-
dad.
• Comprender las metas de desempeño para el sistema de valoración.
• Desarrollar la valoración hasta obtener una curva de concentración-respuesta detectable.
• Llevar a cabo el desarrollo del método/análisis de robustez.
• Preparar el estándar de referencia/calibración y controlar y evaluar la estabilidad.
• Establecer procedimientos de valoración, controles y límites apropiados, criterios de aceptación de la valoración y de la
muestra, e instrumental.
• Determinar el desempeño del método y calificar la exactitud, especificidad, precisión y robustez del método, incluyendo
la calificación de todos los tipos de muestra aplicables que se van a analizar.
• Validar la valoración.
• Implementar el método (transferencia de tecnología) en el laboratorio de análisis, incluyendo la capacitación y calificación
de analistas.
• Monitorear el desempeño de la valoración.
Durante el desarrollo de la valoración, se deben evaluar los parámetros y reactivos críticos requeridos para la valoración, ade-
más de establecer niveles que generen un desempeño adecuado de la valoración. En muchos casos, se pueden evaluar diversos
parámetros, mientras que los experimentos bien diseñados pueden acelerar el desarrollo de la valoración, en particular para la
evaluación de la interacción potencial de diversos factores.
Muchos procedimientos de ELISAson específicos para productos, por lo que puede no haber estándares de referencia/cali-
bración externos disponibles. La preparación y estabilidad de estándares de referencia/calibración se deben considerar desde
las etapas tempranas del desarrollo de la valoración.
Validaciónde la Valoración
La validación de la valoración se lleva a cabo de conformidad con los lineamientos de las agencias reglamentarias apropiadas
(p. ej., ICH Q2) para demostrar que la prueba particular usada para un analito es apropiada para su uso previsto. Los capítulos
de información general sobre validación proporcionan información adicional, específicamente el capítulo Validación de Procedi-
mientosFarmacopeicos (1225), o el de Validación de Valoraciones
Biológicas (1033), cuando el ELISAse usa como valoración sus-
tituta de potencia. Ver el Apéndice2 para información adicional.
ANÁLISISDE DATOS
El análisis de datos del ELISApuede ser simple (p. ej., una calibración lineal con regresión inversa) o complejo (p. ej., una
curva de calibración no lineal con regresión inversa). El tipo y rigor del análisis de datos dependen en gran medida del sistema
de valoración y de los usos previstos de la misma. Por ejemplo, la reducción de datos puede estimar una concentración (p. ej.,
ng/mL) de una muestra desconocida usando una curva de calibración. Otras metodologías incluyen la estimación de la mitad
de la concentración inhibitoria máxima (Clm 50 ) o la mitad de la concentración efectiva (CE50 ), que son estimaciones de la can-
tidad de una muestra que genera la misma respuesta que la CE50 (o Clm 50 ) en una curva estándar y de la actividad relativa de
una muestra de prueba comparada con un estándar de referencia/calibración. Los capítulos de información general Diseñoy
Desarrollo de Valoraciones Biológicas
(1032) y Análisisde Va/oraciones Biológicas (1034) proporcionan guías más detalladas rela-
cionadas con métodos estadísticos para análisis de potencia.
En general, las curvas de valoración de ELISAse caracterizan por una relación no lineal entre la concentración del analito de
interés y la respuesta media calculada. Por lo regular, esta curva de respuesta se define mediante una relación de sigmoide de
la respuesta con la concentración. Las curvas estándar/de calibración se pueden ajustar mediante una amplia variedad de mo-
delos matemáticos, y los analistas deben seleccionar cuidadosamente un algoritmo de ajuste de curva adecuado. En otros ca-
sos, las valoraciones mediante ELISAse usan para propósitos cualitativos para determinar si una muestra es positiva o negativa
basándose en un umbral de sensibilidad.
AnálisisEstadísticoBásico
Los métodos estadísticos básicos no se detallan en este capítulo. El capítulo de información general DatosAnalíticos-Inter-
pretacióny Tratamiento(101 O) trata fundamentos importantes, que incluyen manejo de datos; cálculo de medias, desviaciones
estándar y errores estándar; detección y métodos para tratar variaciones no constantes o anormales; detección y administra-
ción de valores aberrantes; y procedimientos e interpretación de pruebas estadísticas e intervalos de confianza. Los conceptos
relacionados con la validación, objetivos, diseños, análisis y métodos prácticos de validación se describen en los capítulos de
información general DatosAnalíticos-Interpretación y Tratamiento(101 O), Validaciónde Procedimientos Farmacopeicos (1225) y
Validaciónde Va/oracionesBiológicas(1033). El capítulo de pruebas generales Diseñoy Análisisde Va/oracionesBiológicas(111)

contiene guías para la combinación de resultados de valoraciones independientes.
Análisis Estadísticos No Lineales
La calibración no lineal para inmunoensayos hace uso de una gran cantidad de fuentes para diseño y análisis estadístico.
Éstas incluyen métodos para evaluar y tratar la varianza no constante, diseños y métodos de análisis para experimentos con
estructuras complejas y validación. Los conceptos en los que se sustentan los diseños de calibración lineal, análisis y regresión
inversa se aplican a la calibración no lineal, y los estadísticos profesionales pueden ayudar a aplicar estos conceptos apropiada-
mente.
Informe de los Resultados

Se debe considerar que las estimaciones informadas de concentración tienen un intervalo de confianza asociado que se basa
en los resultados de la valoración. El valor o estimación de informe usado para describir una muestra se puede basar en un
resultado combinado de múltiples valoraciones.
APÉNDICES
Apéndice 1: Abreviaturas
Ac-Anticuerpo
Ag-Antígeno
ABTS-Sal diamónica del ácido 2,2'-azino-bis[3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico]
Anti-lg-antiinmunoglobulina
AP-Fosfatasa alcalina
BSA-Albúmina sérica bovina
CSPD-Fosfato de 3-(4-metoxiespiro{l ,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo[3.3. l. l 3-']decan}-4-il)fenilodisódico
EIA-Enzimoinmunoensayo
ELISA-Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas
HRP-Peroxidasa de rábano
lg-lnmunoglobulina
MPI-Métodos de pruebas inmunológicas
MG-4-Metilumbeliferil galactósido
NG-Nitrofenil galactósido
OPD-Diclorhidrato de o-fenilendiamina
PBS-Solución salina amortiguada con fosfatos
PVDF-Fluoruro de Polivinilideno
pNPP-para-Nitrofenil fosfato
TMB-3,3',5,5'-Tetrametilbencidina
Apéndice 2: Fuentes Adicionales de Información sobre Temas Específicos en Validación y Análisis

de Datos
Diseño y Análisis de Validación de Proce-

Datos Analítlcos-lnter- Valoraciones Blológl- dlmlentos Farmaco- Capítulos sobre Valoraciones
pretaclón y Tratamiento cas pelcos Biológicas
(1010) (111) (1225) (1032), (1033) y (1034)
Medias X
Desviacionesestán-
dar X
Erroresestándar X
Faltade normalidad X X
Varianza
no constante X X
Valoresaberrantes X X
Pruebas X
Intervalosde confian-
za X X
USP42 InformaciónGeneral/ (1104) Métodos de PruebasInmunológicaslnmunotransferencia7885
Dlselio y Análisis de Validación de Proce-

Datos Analítlcos-lnter- Valoraciones Blológl- dlmlentos Farmaco- Capítulos sobre Valoraciones
pretaclón y Tratamiento cas pelcos Biológicas
(1010) (111) (1225) (1032), (1033) y (1034)
Validación X X
Combinación de re-
sultados de
móltiples valorado-
nes X X

INMUNOLÓGICAS-ANÁLISISPOR
INMUNOTRANSFERENCIA
INTRODUCCIÓN
Definición y Alcance
Este capítulo forma parte de un grupo de capítulos de información general para métodos de pruebas inmunológicas (Méto-
dos de PruebasInmunológicas-ConsideracionesGenerales(1102), Métodos de PruebasInmunológicas-Ensayopor lnmunoadsor-
ción Ligado a Enzimas(ELISA)(1103) y Métodosde PruebasInmunológicas-Resonanciade PlasmónSuperficial(1105)), y provee a
los analistas información general sobre principios, desarrollo y validación de métodos, y evaluación de datos para análisis por
inmunotransferencia. El análisis por inmunotransferencia se define como cualquier método en el que se usa un anticuerpo para
la detección de uno o más analitos (p. ej., proteínas, polisacáridos) el cual ha sido transferido a la superficie de una membrana
de prueba. Los métodos por inmunotransferencia generalmente se clasifican dependiendo si el procedimiento de inmuno-
transferencia incluye una separación electroforética. La separación electroforética se basa en la diferencia de los pesos molecu-
lares y en las diferencias de carga de una población de moléculas. Ver los capítulos ElectroforesisCapilar (1053), ArtículosObteni-
dospor Biotecnología-lsoelectroenfoque(1054) y ArtículosObtenidospor Biotecnología-Electroforesisen Gel de Poliacrilamida
(1056) para una descripción detallada de los métodos de separación electroforética. Un ejemplo de análisis por inmunotransfe-
rencia que implica la separación electroforética es la transferencia Western (Western Blot), descrita por primera vez en la litera-
tura científica a finales de la década de 1970. Otro enfoque para el análisis por inmunotransferencia consiste en llevar a cabo la
detección de moléculas usando un anticuerpo sin separación electroforética previa. La transferencia en ranuras (slot blot) o en
puntos (dot blot) son ejemplos de este tipo de método sin separación electroforética.
El alcance de este capítulo incluye únicamente aquellos métodos en los que se usa un anticuerpo para la detección de una
molécula unida a una membrana. Por lo tanto, este capítulo no analiza procedimientos en los que se emplean medios de de-
tección no inmunológicos.
SELECCIÓN
DELENSAYO
Valoración Sin SeparaciónEletroforética(Transferenciaen Ranuras/en Puntos)
El método de transferencia en ranuras/en puntos es un método sin separación electroforética simplificado en el que una
mezcla que contiene los analitos para detección primero se aplica directamente en la membrana usando un manifold de vacío
cuya construcción incluye ranuras rectangulares separadas de manera uniforme. El método de transferencia en ranuras/en
puntos es más rápido y simple debido a que no hay separación electroforética de los múltiples analitos individuales que pudie-
ran estar presentes en la mezcla. Por estas razones, es fácil de adaptar a los análisis automatizados de múltiples muestras, para
los cuales se encuentra disponible comercialmente una variedad de sistemas, pero no ofrece información sobre el peso mole-
cular de los analitos y provee únicamente información limitada con respecto a la cantidad de analito presente en la muestra.
Aunque se puede configurar en un formato cuantitativo, el método a menudo se usa para producir un resultado cualitativo, p.
ej., confirmación de la identidad demostrando la presencia o ausencia de antígenos específicos mediante un sistema de detec-
ción que revela la presencia de inmunocomplejos. Después de que los analitos se enlazan a la membrana y se bloquean los
sitios no unidos, los analistas emplean un anticuerpo de detección para determinar la presencia o ausencia del analito o anali-
tos de interés. La forma uniforme de la transferencia en ranuras y su mayor área superficial para el enlace de analitos la vuelven
más adecuada que la transferencia en puntos para aplicaciones cuantitativas y análisis por densitometría.
7886 (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas lnmunotransferencia / Información General USP42
Valoración con Separación Electroforética
Los métodos de transferencia electroforética (comúnmente denominados Western blot) se usan ampliamente en el análisis
de mezclas de proteínas. El Western blot es una poderosa herramienta para determinar la identidad, la concentración relativa,
el peso molecular relativo y las modificaciones postranslacionales de proteínas específicas. En los Western blots, las proteínas de
la muestra se separan usando electroforesis en gel. La separación de proteínas puede basarse únicamente en el peso molecular
o en el punto isoeléctrico (pi) y el peso molecular. En el primer caso las proteínas migran en una dimensión (1 D) y en el segun-
do caso en dos dimensiones (2D) a través de un gel. Cuando las proteínas se separan de acuerdo a sus pesos moleculares, las
proteínas más pequeñas migran con mayor rapidez. Cuando los analistas emplean electroforesis bidimensional, las proteínas se
separan de acuerdo con el punto isoeléctrico en la primera dimensión y luego de acuerdo con sus pesos moleculares en la
segunda dimensión. Después de la separación, las proteínas se transfieren a una membrana, la cual se bloquea para evitar el
enlace no específico con los reactivos de valoración agregados subsiguientemente, y se detecta la proteína de interés usando
anticuerpos específicos.
La detección de un anticuerpo unido al analito de interés realizarse por diferentes métodos, los cuales incluyen la detección
calorimétrica, la detección fluorescente, la detección quimioluminiscente y la detección radioactiva. Una vez detectadas las
proteínas de interés, se puede llevar a cabo indirectamente la cuantificación de la inmunotransferencia mediante densitome-
tría.
ELECTROFORESIS
UNIDIMENSIONAL
En la electroforesis unidimensional, se separan proteínas individuales o grupos de proteínas por su peso molecular para su
análisis adicional mediante Western blot. Usando electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-
PAGE,por sus siglas en inglés), las proteínas migran respondiendo a las diferencias en la carga eléctrica a través de una red
tridimensional de fibras y poros. La red se forma a medida que la bisacrilamida bifuncional, u otro agente de entrecruzamien-
to, entrecruza cadenas adyacentes de poliacrilamida para formar un gel (ver también el capítulo general USP(1056)). La com-
binación del tamaño de poro del gel y las características de las proteínas determinan la migración de proteínas. Las proteínas
separadas se detectan posteriormente mediante análisis por Western blot usando anticuerpos específicos para las proteínas dia-
na. Mediante el análisis por Western blot, es posible comparar una muestra de prueba con un estándar, y se puede monitorear
la aparición de productos de degradación e impurezas específicamente relacionadas con las proteínas siempre que el anticuer-
po de detección mantenga su capacidad de reconocer las formas alteradas de la proteína. Aunque se puede lograr un alto
nivel de sensibilidad mediante este método, puede no ser posible conseguir la separación de proteínas con pesos moleculares
similares. Cuando los analistas deban analizar proteínas individuales con pesos moleculares similares, podría ser necesario em-
plear separaciones bidimensionales.
ELECTROFORESIS
BIDIMENSIONAL
En la electroforesis bidimensional, se separan proteínas individuales o grupos de proteínas en la primera dimensión mediante
isoelectroenfoque (IEF;carga) y en la segunda dimensión mediante electroforesis con dodecil sulfato de sodio (peso molecu-
lar). Separar las proteínas de esta manera permite obtener información no solo sobre el peso molecular, como en el caso de las
electroforesis unidimensionales, sino también sobre la carga de una proteína. Los geles bidimensionales son una opción útil
para resolver mezclas complejas y para evaluar la especificidad de anticuerpos de proteínas (p. ej., la evaluación de proteínas
de células huésped).
Membranas, Reactivos y Opciones de Detección
MEMBRANAS
Por lo general, se usan membranas de nitrocelulosa y fluoruro de polivinilidino (PVDF,por sus siglas en inglés) para los méto-
dos de inmunotransferencia. Por razones de costos, a menudo se prefieren las membranas de nitrocelulosa sobre las membra-
nas de PVDFpara transferencias en ranuras/en puntos (o transferencia por vacío), pero, debido a su mayor fuerza mecánica, se
deben considerar las membranas de PVDFcuando sea necesario despegar (stripping) los anticuerpos unidos a las bandas de las
proteínas y reanalizar (reprobing) la membrana con un nuevoanticuerpo.
REACTIVOS
DE BLOQUEO
Después de la transferencia o unión de la proteína a la membrana, los sitios de unión desocupados en las membranas deben
bloquearse para evitar el enlace no específico de los reactivos agregados subsiguientemente. La mayoría de las sondas de de-
tección son proteínas que también se pueden unir con la membrana. La falta de bloqueo adecuado de los sitios de la membra-
na puede generar uniones no específicas y un fondo elevado. Se encuentra disponible una variedad de reactivos de bloqueo,
entre los que se incluye gelatina, leche desgrasada y albúmina sérica bovina (BSA,por sus siglas en inglés). Los reactivos protei-
USP42 Información General/ (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas lnmunotransferencia 7887
cos no deben estar relacionados con los antígenos analizados en el estudio. Debido a que estos reactivos a menudo presentan
variabilidad entre lotes, puede resultar necesario calificarlos. Los reactivos deben evaluarse con el sistema de detección selec-
cionado y optimizarse usando dicho sistema de detección para lograr un fondo mínimo sin pérdida de señal. Si el reactivo de
bloqueo se deriva de una fuente biológica, no debe contener niveles de trazas de la proteína que se está midiendo, ya que esto
último puede incrementar el fondo.
MÉTODOSDE DETECCIÓN
La detección inmunológica de analitos en cualquier tipo de inmunotransferencia puede ser directa o indirecta. La selección
del formato depende de una combinación de factores tales como el nivel de sensibilidad requerido y la calidad de los antisue-
ros disponibles. Para la identificación o la detección de un producto, la sensibilidad por lo general no es crítica y comúnmente
se usa la detección directa mediante un anticuerpo conjugado, la cual a menudo simplifica y acorta el tiempo requerido para
ejecutar el método. Como alternativa, se puede usar la detección indirecta para mejorar la sensibilidad, generalmente median-
te el uso de un anticuerpo antiespecies conjugado. En algunas ocasiones, el analito que se está detectando es en realidad un
anticuerpo, como en el caso de un anticuerpo monoclonal que se está desarrollando como fármaco. En este caso, se pueden
usar anticuerpos específicos para el anticuerpo (p. ej., anticuerpos antiidiotipo).
Anticuerpo primario: El anticuerpo primario se selecciona basándose en su especificidad para el analito o proteína. Aun-
que los antisueros policlonales pueden ofrecer un amplio rango de detección contra un conjunto potencialmente grande de
epítopes, puede presentarse una reacción cruzada no deseada que resulte en una disminución de la especificidad. Si lo anterior
no puede resolverse mediante la optimización de la valoración, se puede usar un anticuerpo monoclonal o grupos de anticuer-
pos monoclonales seleccionados. Los anticuerpos monoclonales a menudo presentan ventajas para los estudios a largo plazo,
debido a que producen un suministro constante de anticuerpo contra un epítope específico. El uso de anticuerpos monoclona-
les limita directamente el número de epítopes implicados en la detección de la diana. Esto debe evaluarse para cada aplica-
ción. El anticuerpo primario se puede conjugar directamente o usarse en conjunto con un anticuerpo secundario en un sistema
apropiado de detección. Por lo general, se considera que la concentración óptima de anticuerpo es la dilución más grande de
anticuerpo que resulte en una señal positiva fuerte con fondo mínimo. Esto debe optimizarse en conjunto con el bloqueo y el
sistema de detección seleccionado. El anticuerpo primario debe calificarse antes de usarse en la valoración.
Anticuerpo secundario: El anticuerpo secundario por lo general se dirige contra la inmunoglobulina de la especie animal
usada para obtener el anticuerpo primario (que es específica para el analito, p. ej., lgG de cabra antiratón). Las enzimas tales
como peroxidasa de rábano (HRP,por sus siglas en inglés) o la fosfatasa alcalina (AP,por sus siglas en inglés) generalmente se
enlazan con el anticuerpo secundario, pero se pueden usar otros marcadores tales como fluoróforos o partículas de oro para la
detección. Si el anticuerpo secundario está biotinilado, se pueden usar complejos de biotina-avidina-peroxidasa de rábano o -
fosfatasa alcalina para la detección.
Enzima y sustrato de detección: Una vez que se ha formado un inmunocomplejo que contenga el anticuerpo conjugado
con una enzima, los analistas agregan un sustrato adecuado para la valoración. La degradación del sustrato por la acción de la
enzima resulta en una producción de un precipitado de color o un producto fluorescente o quimioluminiscente que se puede
registrar, medir y analizar en mayor detalle. Se encuentra disponible un amplio rango de opciones de detección para ajustarse
mejor a las aplicaciones individuales y a los usos previstos. Algunos de estos rangos se encuentran disponibles en los capítulos
(1103) y (1102), así como en la Tabla 1.
Tabla 1. Reactivos y Métodos de Detección
Principio de la
Lectura Reacción Enzimática Enzima Sustrato Detección Ventajas Desventajas
Produce un producto de co-
lor que genera valores de Fosfatasa al- pNPPb -Robusto
absorbancia directamente calina• TMBd -Económico - Lleva tiempo
proporcionales a la concen- Peroxidasa OPD• Espectro- - Disponibilidad de - Menos sensible que
Colorimétrica tración de analito de rábano< ABTst fotómetro reactivos otros métodos
• Fosfatasa alcalina.
b Fosfato para-nitrofenilico.
e Peroxidasa de rábano.
d 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina.
• Diclorhidrato de o-fenilendiamina.
1 Sal diamónica del ácido 2,2'-azino-bis[3-etil-benzotiazolina-6-sulfónico].
9 3-(4-Metoxiespiro{l ,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo[3.3.1.1 3, 7Jdecan}-4-il)fenilfosfato disódico.

h Dispositivo de acoplamiento de carga.
; 4-Metilumblliferil galactósido.
i Nitrofenil galactósido.
Tabla 1. Reactivos y Métodos de Detección (Continuación)

Principio de la
Lectura Reacción Enzimática Enzima Sustrato Detección Ventajas Desventalas
Luminómetro,
película foto-
gráfica (cá- -Amplio intervalo
mara con dinámico de valora-
Produce una emisión de luz Fosfatasa al- dispositivo ción
que es directamente pro- calina, pero- de acopla- - Muy sensible - La reproducibilidad
porcional a la concentra- xidasa de rá- miento de - Rápida genera- puede resultar un desa-
Quimioluminiscente ción de analito bano CSPD9 carqah) ción de señal fío
Produce una emisión de luz Galactosida-
inducida por excitación que sa, anticuer- Fluorómetro
es directamente proporcio- po marcado (cámara con
nal a la concentración de porfluores- MO CCD con fil- -Rápida - Interferencia por exci-
Fluorescente analito cencia NGi tros) -Sensible pientes
El antígeno se marca con un - Riesgo para la seguri-
isótopo radioactivo. La ra- - Fácil de cuantifi- dad por exposición
diación es proporcional a la - - Contador de car - Desechos radioacti-
Radioactiva concentración de analito. centelleo -Rápida vos
ª Fosfatasa alcalina.
b Fosfato para-nitrofenílico.
e Peroxidasade rábano.
d 3,31,5,5'-Tetrametilbencidina.
• Diclorhidrato de o-fenilendiamina.
1 Sal diamónica del ácido 2,2'-azino-bis[3-etil-benzotiazolina-6-sulfónico
].
9 3-(4-Metoxiespiro{l,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo[3.3.1.1"'Jdecan)-4-il)fenil fosfato disódico.
h Dispositivode acoplamiento de carga.
; 4-Metilumblliferilgalactósido.
i Nitrofenil galactósido.
DESARROLLO
DELMÉTODO
El desarrollo del método se puede realizar de acuerdo con la información basal recientemente dada. El alcance del desarrollo
del método, y eventualmente la validación del mismo, son determinados de acuerdo al propósito del método, el cual determi-
na el formato para la valoración y demás requisitos para la prueba, por lo que debe determinarse primero. Las siguientes sec-
ciones exploran los aspectos a considerar para el propósito del método.
Propósito Previsto del Método
ANÁLISISDE IDENTIDAD
En el caso de las pruebas de identidad, los analistas buscan detectar la presencia de una proteína; por ende, resulta esencial
y necesario demostrar la especificidad. Para este propósito, los analistas controlan también la cantidad de proteína en la mues-
tra. Por consiguiente, los límites de detección (LOD, por sus siglas en inglés), los límites de cuantificación (LOQ, por sus siglas
en inglés) y otras medidas de cantidad no constituyen atributos requeridos del método. Los ejemplos incluyen valoraciones de
identidad de materiales que demuestran el isotipo de una lgG y, en ocasiones, demuestran la especificidad de un anticuerpo
en una validación del método. Cuando no existe interferencia de la matriz o reacciones cruzadas potenciales con otros mate-
riales presentes en la muestra, entonces puede ser suficiente una transferencia en ranuras/en puntos. Cuando múltiples proteí-
nas en la muestra presentan inmunoreactividad y deben distinguirse entre sí, se debe usar un procedimiento de separación
antes de la transferencia y de la inmunotinción. La complejidad de las proteínas en la muestra y la utilidad de la información
adicional obtenida usando separación electroforética ayudan a determinar si una transferencia en ranuras/en puntos puede
cumplir con las necesidades de la prueba.
ANÁLISISDE LÍMITE
Es posible que en otras aplicaciones los analistas deseen demostrar la eliminación de una impureza hasta un nivel inferior al
que genera preocupación toxicológica. En muchos casos, se usa una prueba de límite cuando es posible definir la presencia de
una proteína por debajo de un nivel determinado con las expresiones sí o no. Esto simplifica el desarrollo y la validación del
método. El uso de equipo de densitometría (barrido o generación de imágenes) permite determinar la intensidad de las man-
chas o bandas con respecto a una curva estándar, lo que resulta en una estimación de la concentración. Se debe determinar
un límite de detección para establecer el umbral de límite apropiado para el método. Una transferencia en puntos puede ser
adecuada para cualquier circunstancia siempre que se pueda demostrar la especificidad del anticuerpo en la matriz de mues-
tra.
USP 42 Información General/ (1104} Métodos de Pruebas Inmunológicas lnmunotransferencia 7889
Otro propósito común para una inmunotransferencia es mostrar la presencia o ausencia de una proteína expresada a partir
de un cultivo. Ante esta situación, los analistas desean establecer la identidad de la proteína mediante inmunotransferencia, así
como verificar que la proteína tenga el peso molecular esperado. Esto provee una mayor garantía sobre la ausencia de interac-
ciones no específicas con otras proteínas en una matriz compleja que genera la señal en la transferencia.
ANÁLISISDE ESPECIFICIDAD
Otro propósito habitual de la inmunotransferencia es la caracterización de la especificidad de los reactivos para una prueba
de impurezas por ELISAo por columna de inmunoafinidad y constituye otra forma de una prueba de identidad en la que el
punto final deseado es la demostración de la especificidad de la unión entre el antígeno y el anticuerpo. El resultado de la
medición es una demostración de la unión con un grupo selecto de la población total de proteínas en la muestra o de la unión
con la población entera de proteínas en la muestra, conforme a lo requerido por las valoraciones de proteínas de células hués-
ped. Para demostrar la especificidad de un anticuerpo con respecto a una población de proteínas, los analistas generalmente
deben llevar a cabo separaciones electroforéticas o de otro tipo. La demostración mediante inmunotinción de que el anticuer-
po puede reconocer una proteína con el peso molecular o punto isoeléctrico correctos es una poderosa comprobación de la
especificidad hacia una proteína determinada y de la ausencia de unión con otras proteínas. Asimismo, contar dentro del mis-
mo experimento con las muestras apropiadas de control positivo que se sabe contienen la proteína, así como con las muestras
de control negativas que se sabe carecen de la proteína, constituye un argumento convincente para la especificidad del anti-
cuerpo cuando los analistas validan un método ELISApara determinar la presencia de impurezas en las muestras de proteínas.
Las separaciones electroforéticas pueden realizarse en una dimensión usando SDS-PAGE(para peso molecular) o isoelectroen-
foque (IEF;para punto isoeléctrico) para un número limitado de proteínas con pesos moleculares conocidos. Las separaciones
electroforéticas también se pueden realizar en dos dimensiones (p. ej., IEFseguida de SDS-PAGE)para mostrar la selectividad y
especificidad hacia una población más heterogénea de proteínas. Resulta común el uso de Western blot bidimensional para
demostrar la especificidad de un anticuerpo policlonal candidato dirigido contra una preparación de antígeno proteico de cé-
lulas huésped (HCP, por sus siglas en inglés) antes del desarrollo de un ELISAcuantitativo para dicho propósito.
Modo de Valoración e Introducción de la Muestra
Después de considerar los elementos críticos requeridos para cada propósito del método, el analista puede emplear esta in-
formación para seleccionar el modo de valoración más apropiado. Los puntos principales a considerar cuando se desarrolla un
método de inmunotransferencia se presentan en la Figura 1. Cuando resulte apropiado, la siembra de las muestras en una
membrana o su aplicación mediante vacío es la manera más fácil y conveniente de introducir una muestra en una membrana
para inmunotransferencia. No obstante, los niveles bajos de unión no específica de múltiples proteínas pueden crear interfe-
rencia no específica adicional en transferencias en ranuras o en puntos, lo que resulta en niveles de fondo que parecen ser el
analito deseado.
Decidirmodo de •Transferencia en ranuras/en puntos

valoración/ •Separación unidimensional
•Separaciónbidimensional
Introducciónde
~muestra
--- •Estándares
Controles/ •Controles negativos
Estándares •Controles de sensibilidad
de la valoración
~
--- •Nitrocelulosa
•PVDF
Selección de •Demostrar la unión del anticuerpo a la membrana con una tinción química
la membrana
~ - •Tiempo de transferencia (electroforesis en gel)
•Tiempo de vacío
Optimizarla •Volumende siembra
transferencia
~ - •Anticuerpo primario
•Anticuerpo secundario o de detección correspondiente con el anticuerpo primario
•Anticuerpo secundario o de detección con el sustrato/sistema de
Especificidad detección seleccionado
del anticuerpo •Seleccionar las sustancias conocidas que se van a agregar a la
matriz y a los controles
~ •Ausencia de anatito antígeno

•Bloquea uniones no específicas de los reactivos de anticuerpos y del
Selección del
sistema de detección secundario
reactivode
~ bloqueo
Valoraciónde
- •Anticuerpo primario
•Anticuerpo secundario
anticuerpos •Valoración simultánea con el diseño de la matriz
primariosy
:::::::....:_ecundarios
_
Incubacióndel •Tiempo de incubación del sustrato

•Tiempo de adquisición de datos
sustrato y •Análisis de datos
adquisición
de datos
Figura 1. Diagrama de Flujo del Desarrollo del Método.
Las separaciones electroforéticas, aunque llevan tiempo, pueden ser útiles para separar y distinguir con mayor detalle la
unión específica y no específica. Los analistas deben reemplazar la sensibilidad con la selectividad al trasladarse de un enfoque
unidimensional hacia uno bidimensional puesto que la separación adicional de especies inmunoreactivas de una sola banda en
múltiples manchas, como sucede con la heterogeneidad observada en las proteínas sialiladas o en las especies desamidadas.
Controles y Estándares de la Valoración

Los controles y estándares se seleccionan basándose en el propósito de la valoración y en la información requerida durante
el desarrollo. Se pueden usar proteínas marcadoras de peso molecular a fin de obtener una estimación exacta del peso molecu-
lar de las especies inmunoreactivas. El uso de controles positivos y negativos es útil para la resolución de problemas durante
todo el proceso del diseño experimental. Se pueden usar estándares o controles positivos y negativos para evaluar la aptitud
del sistema y para establecer el desempeño del método. Un control positivo puede confirmar la migración apropiada de pro-
teínas y puede confirmar que se ha completado la transferencia de la membrana. Un control negativo es útil para evaluar inte-
racciones no específicas. Se puede usar un control de sensibilidad del método cercano al límite de cuantificación para medir la
uniformidad del método cerca de dicho límite a fin de evaluar los cambios en el desempeño de la valoración.
USP42 InformaciónGeneral/ (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas lnmunotransferencia 7891
Selecciónde la Membrana
La selección de una membrana se realiza basándose en la aplicación y en la proteína que se esté valorando. Se debe contar
con membranas con diversos tamaños de poro y deben ser adecuadas para el peso molecular de la proteína de interés a fin de
ayudar en la transferencia apropiada de diferentes tamaños de proteínas. Cuando se sabe que un método de tinción química
funciona bien en una membrana específica con una proteína específica, entonces resulta ventajoso mostrar que la proteína se
une con la membrana y se tiñe antes de que los analistas lleven a cabo las etapas de inmunotinción para la valoración. Las
separaciones electroforéticas seguidas de la transferencia a una membrana se deben optimizar mediante tinción química, p.
ej., con colorantes fluorescentes o colorantes de plata sensibles y en cantidades de muestra potencialmente elevadas antes de
que los analistas trabajen con los niveles de muestra más bajos requeridos para la optimización de la transferencia. Los coloran-
tes tales como Coomassie o Coomassie coloidal podrían no ser lo suficientemente sensibles para detectar un nivel bajo de im-
purezas requerido para ciertas aplicaciones.
Optimización de la Transferencia
Los analistas deben optimizar los tiempos de la transferencia de las proteínas desde el gel a la membrana. Las proteínas de
mayor tamaño requieren más tiempo para su transferencia que las proteínas más pequeñas. Las proteínas pequeñas podrían
perderse si se usan tiempos largos de transferencia, ciertamente, pueden atravesar la membrana y perderse del otro lado de
ésta. La densidad del gel afecta la transferencia y cuando se usan geles de gradiente la transferencia puede no ser uniforme
desde la parte superior a la parte inferior del gel. Durante la optimización de la transferencia, muchos desarrolladores de méto-
dos emplean múltiples membranas para capturar proteínas que se transfieren a través de la primera membrana. La tinción quí-
mica del gel y de las membranas puede proveer información útil sobre la ubicación de las proteínas transferidas del gel a la
membrana, la optimización de la transferencia se realiza extendiendo o reduciendo el tiempo de transferencia.
Después de seleccionar el modo de la valoración, los analistas proceden a investigar la siembra del antígeno o la transferen-
cia desde un gel a la membrana apropiada usando diversos niveles pertinentes de concentración del analito. En un principio,
podrían requerirse niveles de analito por encima de la concentración requerida para un Western blot para determinar si es po-
sible realizar la transferencia y el reconocimiento por parte de los anticuerpos. Si el analito está presente en concentraciones
bajas, puede ser necesaria la adición de cantidades conocidas para mostrar su ubicación durante la optimización de la transfe-
rencia. Debido al potencial de variabilidad de la inmunotinción y la transferencia, se debe incorporar un control de sensibilidad
o diversos niveles de controles en el método basándose en la valoración del analito por encima del nivel de fondo. Esto se
puede ajustar a medida que progresa el desarrollo del método.
Especificidaddel Anticuerpo
Los analistas deben demostrar la especificidad del anticuerpo en las etapas tempranas del desarrollo del método de inmuno-
transferencia. Cuando sea posible, los analistas deben analizar muestras de la matriz sin el analito y deben demostrar la ausen-
cia de respuesta. Por el contrario, las muestras que contienen cantidades conocidas de analito agregadas a la matriz deben
mostrar una respuesta positiva, lo cual demuestra la especificidad de los anticuerpos.
Los analistas también deben demostrar la especificidad del anticuerpo secundario conjugado o marcado. Las inmunotransfe-
rencias de control con calles o siembras de anticuerpo primario y de muestras de la matriz que contengan el analito como un
control negativo pueden mostrar que el anticuerpo secundario se está uniendo con el anticuerpo primario y no con las proteí-
nas encontradas en la matriz. Existen anticuerpos contra especies conjugados con enzimas marcados con moléculas fluorescen-
tes fácilmente disponibles en el comercio y, por lo regular, han sido analizados o purificados por afinidad contra las especies
del anticuerpo que se está detectando, lo cual elimina parte del trabajo temprano requerido para lograr la especificidad desea-
da. El anticuerpo secundario o el sistema de detección se deben combinar con el equipo de detección y la sensibilidad deseada
de la valoración, p. ej., fluorescencia, sustratos para precipitación colorimétrica o quimioluminiscencia.
Selecciónde Reactivosde Bloqueo
Las membranas se pueden bloquear con agentes de bloqueo previamente descritos a medida que los analistas seleccionan el
reactivo de bloqueo más apropiado y la cantidad de tiempo requerido para minimizar el fondo mediante incubaciones subsi-
guientes del anticuerpo primario y secundario. Los analitos titulados en múltiples concentraciones en la membrana permiten a
los analistas evaluar la cantidad de señal con respecto a la cantidad de ruido (fondo) con diversos reactivos de bloqueo segui-
dos por inmunotinción con el anticuerpo primario, el anticuerpo secundario marcado y el sustrato, en caso necesario, para la
visualización. Esta valoración también sirve como el punto inicial para examinar el límite de detección y el límite de cuantifica-
ción para las pruebas de límite y las mediciones cuantitativas. El límite de detección para inmunotransferencias se determina
mediante el nivel de fondo no específico con respecto a la señal específica del analito. Como en el caso de cualquier otro mé-
todo analítico, si el fondo y la señal son iguales, no existe diferencia entre la señal y el ruido.
Valoración de Anticuerpos Primarios y Secundarios

Como en el caso de la selección de un reactivo de bloqueo se puede usar la valoración del nivel de anticuerpos primarios y
secundarios a partir de diluciones altas hasta diluciones bajas para seleccionar una concentración de anticuerpo que reduzca la
unión de fondo en las regiones blanco que rodean las siembras o bandas de proteínas, y puede optimizar la señal proveniente
del analito. Una matriz que varíe el nivel de la señal primaria contra la señal secundaria puede ser útil para optimizar el fondo,
mejorar la señal de analito y reducir los requisitos de consumo para reactivos de anticuerpos de alto costo.
La cromatografía de inmunoafinidad contra un antígeno altamente purificado se puede usar para reducir el nivel de interfe-
rencia no específico para todos los reactivos inmunológicos usados en la inmunotransferencia. El desarrollador del método de-
be tener cuidado de que no se pierdan la selectividad, la especificidad ni la afinidad del anticuerpo primario durante la purifica-
ción por afinidad debido a los anticuerpos de alta afinidad que permanecen en la columna de antígeno o debido a la destruc-
ción de enlaces de anticuerpos ocasionada por las condiciones de elución. Para el anticuerpo secundario, se encuentran dispo-
nibles comercialmente anticuerpos contra especies purificados por inmunoafinidad con una variedad de marcadores posibles
conjugados con el anticuerpo.
Incubación del Sustrato y Adquisición de Datos

Los analistas pueden optimizar el tiempo de desarrollo del sustrato por efecto de la enzima a fin de minimizar el fondo y
mejorar el límite de detección y el límite de cuantificación. Los tiempos de desarrollo del sustrato excesivos para sustratos que
precipitan pueden resultar en la intensificación del nivel de fondo con respecto a la señal específica proveniente del analito
deseado. Si la incubación con el sustrato se realiza con agitación se podrían formar patrones no deseados del producto a partir
de los sustratos precipitados. Un tiempo de incubación demasiado corto resulta en una señal menos específica; por el contra-
rio, demasiado tiempo puede resultar en un fondo alto y una resolución deficiente. La mayoría de los anticuerpos conjugados
con enzimas se caracterizan por un tiempo de desarrollo óptimo. Los marcadores fluorescentes y quimioluminiscentes tienen la
ventaja de la adquisición de los resultados mediante instrumentos de barrido que pueden almacenar datos electrónicamente y,
posiblemente, adquirir una imagen generada por la sumatoria de las señales. Los marcadores fluorescentes tienen las ventajas
adicionales de que la señal se mantiene estable con el tiempo, de que se pueden realizar numerosos experimentos durante el
desarrollo de la valoración con una sola transferencia y de que la optimización de la adquisición de la señal se puede realizar en
una sola transferencia.
PROCEDIMIENTOS
Transferencias en Ranuras/en Puntos
Mediante un aparato de transferencia en ranuras/en puntos apropiado, los analistas pueden hacer que los antígenos de inte-
rés se adhieran a una membrana adecuada (p. ej., nitrocelulosa) mediante filtración por gravedad o vacío, seguida de la adi-
ción e incubación de anticuerpos para antígenos específicos que se unen con epítopes de los antígenos. Los sitios de unión
que permanecen libres en la membrana se bloquean mediante la adición de antígeno no específico (p. ej., BSA),seguida por la
adición de anticuerpos para antígenos específicos con un sistema de detección [p. ej., la proteína A/G conjugada con peroxi-
dasa de rábano se une a los anticuerpos y estos complejos posteriormente se visualizan usando un sustrato de peroxidasa de 4-
cloro-naftol (4-CN)]. La identificación positiva se interpreta como el desarrollo de puntos o bandas en la membrana. Un resul-
tado negativo se produce cuando la membrana se mantiene de color blanco o presenta bandas apenas perceptibles que son
considerablemente más claras que las bandas positivas.
lnmunotransferencia Unidimensional
PREPARACIÓN
DE GELESSDS-PAGE
Los analistas deben seleccionar un gel SDS-PAGEcon un contenido de acrilamida-bisacrilamida adecuado para los pesos
moleculares de las proteínas de interés; es decir, cuanto menor sea el peso molecular de la proteína, mayor será el porcentaje
de mono o bisacrilamida, y por el contrario, cuanto más grande sea el peso molecular de la proteína, menor será el porcentaje
de mono o bisacrilamida.
Los geles con concentración uniforme tienen intervalos de separación como los presentados en la Tabla2, mientras que los
geles de gradientes tienen intervalos de separación como los presentados en la Tabla3. Los geles pueden comprarse listos para
usar o se pueden producir en el laboratorio de acuerdo con los procedimientos establecidos en el capítulo (1056).
Tabla 2. Intervalo Llneal de Separación (kDa) para Geles con Concentraclon Unlforme
Concentración de Acrllamlda Intervalo Llneal de Separación
(%) (kDa)
5 57-212
7,5 36-94
Tabla 2. Intervalo lineal de Separaclon (kDa) para Geles con Concentraclon Uniforme (Continuación)
Concentración de Acrllamlda Intervalo lineal de Separación
(%) (kDa)
10 20-80
12 12-60
15 10-43
I' (k Da) para Ge1es d e Gradl entes

Tabla 3. Intervalo L nea Id e Separacon
Acrllamlda Intervalo de Proteína
(%) (kDa)
5-15 20-250
5-20 10-200
10-20 10-150
8-20 8-150
MUESTRAS
Y ESTÁNDAR
Para preparar muestras, los analistas por lo general deben lisar células y tejidos para liberar las proteínas de interés. El princi-
pal aspecto a considerar durante la selección de una solución amortiguadora de lisis es si el anticuerpo seleccionado para la
detección de las proteínas de interés puede reconocer muestras desnaturalizadas. Cuando este no es el caso, los analistas em-
plean soluciones amortiguadoras sin detergente o con detergente relativamente suave como el detergente no iónico.
Las muestras deben tratarse (p. ej., reducirse, no reducirse o desnaturalizarse) de acuerdo con el capítulo general (1 056), y
cuando se use una muestra con un contenido desconocido de proteína, se debe cargar una serie de diluciones en el gel. Los
estándares (marcadores de peso molecular) deben tratarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
ELECTROFORESIS
Antes de aplicar las muestras a los pocillos del gel concentrador de acuerdo con el capítulo (1056), los analistas desnaturali-
zan las muestras (p. ej., calentar a 95º-l 00° durante 5 minutos). Se carga un volumen adecuado de muestra en el gel y se
aplica un voltaje de 8 V/cm hasta que el colorante se haya incorporado al gel de resolución. Después, se incrementa el voltaje
a 15 V/cm y se corre la separación hasta que el azul de bromofenol alcance el final del gel. Si se usa un gel disponible comer-
cialmente, se siguen las recomendaciones del fabricante. La Tabla4 presenta volúmenes comunes de carga de la muestra para
diversos geles.
Tabla 4 Volúmenes Comunes de Carga de la Muestra
Espesor del Gel Volumen Máximo de Carga de la Muestra
Pocillos (mm) (µL)
10 1,0 25
10 1,5 37
12 1,0 20
15 1,0 15
15 1,5 25
TRANSFERENCIA
Después de la electroforesis, las proteínas de interés pueden transferirse a una membrana de nitrocelulosa o PVDFcon un
tamaño de poro que sea apropiado para el peso molecular de las proteínas de interés. La nitrocelulosa y el PVDFposeen una
capacidad de unión proteica de aproximadamente 100-200 µg/cm 2 • ELPVDFes químicamente más resistente que la nitroce-
lulosa y es más fácil de manejar. Se pueden encontrar instrucciones detalladas para el proceso de transferencia en los sitios
Web de los fabricantes de aparatos de transferencia, las cuales varían dependiendo del sistema.
La transferencia se puede llevar a cabo en condiciones húmedas o semisecas. La transferencia semiseca por lo general es más
rápida, aunque la transferencia húmeda se recomienda especialmente para proteínas grandes de pesos moleculares de más de
100 kD. En ambas transferencias, la membrana se coloca junto al gel entre materiales absorbentes; luego, el sándwich se fija
con abrazaderas entre soportes sólidos para mantener el contacto ajustado entre el gel y la membrana.
Una solución amortiguadora estándar para transferencia es la misma que la solución amortiguadora usada para la migración
o corrida sin SDS, pero se le agrega metano! hasta una concentración final de 20%. Para proteínas con un tamaño mayor de
80 kD, el SDS debe incluirse a una concentración final de O,1%. La disminución de la cantidad de metano! en la solución amor-
tiguadora de transferencia también promueve la dilatación del gel, lo cual permite que las proteínas grandes se transfieran con
mayor facilidad. La Tabla5 contiene soluciones amortiguadoras comunes usadas para los métodos de Western blot.
7894 (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas lnmunotransferencia / InformaciónGeneral USP42
Tabla 5. Formulaciones Amortiguadoras Comunes para Western Blot

Solución Amortlquadora Contenido
1,89 g de Tris
5,0 g de SOS
50 mg de azul de bromofenol
25,0 ml de glicerol
100 ml de agua
Solución amortiguadora de muestra 2x Ajustar con HCI a un pH de 6,8.
(no reductora) para electroforesis unidimensional Aqregar agua hasta 125 ml.
A una solución amortiguadora de muestra no reductora:
Agregar 12,5 ml de 2-mercaptoetanol antes de ajustar el pH.
Solución amortiguadora de muestra 2x Alternativamente, usar 1,93 g de Tris y agregar una cantidad adecuada de OTT'
(reductora) para electroforesis unidimensional para obtener una concentración final de OTT 100 mM.
151,4 g de Tris
721,0 g de glicina
50,0 g de SOS
Solución amortiguadora de corrida 10x Agregar agua hasta 5000 ml.
para electroforesis unidimensional Ajustar a un pH de 8, 1--13,8.
151,4 g de Tris
721,0 g de glicina
Agregar agua hasta 5000 ml.
Solución amortiguadora de transferencia 10x Ajustar a un pH de 8, 1--13,8.
100 ml de madre 10x
500 ml de agua
200 ml de metano!
Solución amortiquadora de transferencia 1 x Agregar agua hasta 1 000 ml.
24,23 g de Tris base
80,06 g de NaCI
Mezclar en 800 ml de agua ultrapura.
Ajustar con HCI puro a un pH de 7,6.
TBS 10x Agregar agua hasta 1000 ml.
100 ml deTBS 10x
900 ml de agua
TBS-T 1 ml de polisorbato 20
510 g de urea
Solución madre de urea 8,5 M Agreqar agua hasta 1 000 ml.
47 ml de Solución madre de urea 8,5 M
385 mg de tributil fosfina (TBP)
2 g de CHAPSb
Solución amortiguadora de muestra para electroforesis bidi- 25 mg de azul de bromofenol
mensional 1% de amfolitos portadores preferidos
ª Ditiotreitol.
b 3-[(3-Colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato.
El metanol es necesario solo si los analistas emplean nitrocelulosa. Si los analistan usan PVDF,pueden eliminar el metanol de
la solución amortiguadora de transferencia y solo necesitan activar el PVDFantes de armar el sándwich del gel y la membrana.
En la transferencia semiseca, un sándwich de papel/gel/membrana/papel humedecido en solución amortiguadora de trans-
ferencia se coloca directamente entre el cátodo y el ánodo. Durante la transferencia húmeda, la membrana debe ser el compo-
nente más cercano al electrodo positivo, mientras que el gel deberá ser el más cercano al electrodo negativo. La composición
de la solución amortiguadora de transferencia no es necesariamente la misma que la de la solución amortiguadora de migra-
ción o transferencia. Los analistas deben consultar el protocolo del fabricante del aparato, además se debe notar que es común
agregar SOS y metanol. Las cantidades de SOS y metanol en la solución amortiguadora de transferencia, los pesos moleculares
de las proteínas y el porcentaje de poliacrelamida del gel pueden afectar la eficiencia de las transferencias semisecas y húme-
das.
BLOQUEO
El bloqueo de la membrana previene la unión no específica de los anticuerpos primarios y secundarios con la membrana. Por
lo regular, se usa una de las dos siguientes soluciones de bloqueo: leche desgrasada o BSA(fracción V de Cohn). La leche es
más barata pero no se recomienda para el estudio de fosfoproteínas. Para preparar una solución de leche o BSAal 5%, pesar
5 g de leche o BSA,y seguidamente disolver con solución salina amortiguada con Tris que contenga polisorbato 20 (TBS-T;ver
la Tabla5) para obtener un volumen de 100 ml. Mezclar bien y filtrar. Si se omite la filtración puede resultar en la aparición de
diminutos puntos oscuros contaminarán la transferencia durante el desarrollo. Incubar a 4 º durante 1 hora agitando suave-
mente. Enjuagar en TBS-Tdespués de la incubación.
ANTICUERPOPRIMARIOY SOLUCIÓNAMORTIGUADORA
DE INCUBACIÓN
Diluir el anticuerpo con solución amortiguadora de bloqueo a una dilución apropiada (1:100-1 :3000, dependiendo del títu-
lo del anticuerpo) y optimizar la dilución de acuerdo con los resultados. Demasiado anticuerpo puede generar bandas no espe-
cíficas.
TIEMPO DE INCUBACIÓN
El tiempo de incubación puede variar entre unas pocas horas y toda la noche, y depende de la afinidad de enlace del anti-
cuerpo con la proteína y de la abundancia de la proteína. Un anticuerpo más diluido con un tiempo de incubación prolongado
puede mejorar el enlace específico.
TEMPERATURA
DE INCUBACIÓN
La mejor práctica consiste en incubar a temperaturas frías. Cuando los analistas incuban en solución amortiguadora de blo-
queo durante toda la noche, deben incubar a 4º para prevenir la contaminación por crecimiento bacteriano y deben agitar
suavemente la solución de anticuerpo para permitir una cobertura homogénea y adecuada de la membrana.
ANTICUERPOSECUNDARIOY SOLUCIÓNAMORTIGUADORA
DE INCUBACIÓN
El anticuerpo secundario y la solución amortiguadora de incubación se tratan según se indica a continuación. Lavar la mem-
brana varias veces en TBS-Tmientras se agita para eliminar el anticuerpo primario residual. Diluir el anticuerpo secundario con
TBS-Ta la dilución sugerida. Demasiado anticuerpo secundario puede resultar en bandas no específicas. Incubar la membrana
a temperatura ambiente durante 1-2 horas agitando suavemente. La Tabla 1 presenta múltiples opciones para reactivos y mé-
todos de detección secundarios. La sección Análisisde Datos de lnmunotransferenciasiguiente provee más detalles al respecto.
Transferencia en Ranuras/en Puntos
El procedimiento es similar al procedimiento para inmunotransferencia unidimensional, pero difiere en que las muestras de
proteína no se separan electroforéticamente sino que se siembran directamente en la membrana de forma manual o usando
una unidad de transferencia (para formato en puntos o en ranuras).
PROCEDIMIENTOUSANDO LASIEMBRAMANUAL
Llevar a cabo la siembra manual según se indica a continuación. Colocar un papel de filtro seco sobre una pila de toallas de
papel secas. Colocar papel de filtro prehumedecido con solución amortiguadora de transferencia en la parte superior del papel
de filtro seco. Colocar una membrana prehumedecida en la parte superior del papel de filtro prehumedecido. Las muestras se
siembran en la membrana prehumedecida y se dejan absorber en la membrana. Una vez que la muestra ha sido absorbida,
colocar la membrana sobre un papel de filtro seco y limpio para secar.
PROCEDIMIENTOUSANDO UNA UNIDADDE TRANSFERENCIA

POR VACÍO
Por lo general, los analistas emplean una unidad de transferencia por vacío de la siguiente manera. Preparar una membrana
y colocarla en la unidad de transferencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aplicar vacío a la unidad de transfe-
rencia para eliminar el exceso de solución amortiguadora. Para mejorar la solubilidad, disolver la muestra en una solución
amortiguadora y, si no queda transparente, retirar los precipitados mediante centrifugación. Si la muestra es demasiado viscosa
para pipetearla, entonces diluirla más con solución amortiguadora. Con el vacío apagado, pipetear las muestras y transferirlas a
los pocillos, y aplicar vacío a la unidad de transferencia. Después de que todas las muestras se hayan filtrado a través de la
membrana, apagar el vacío, agregar solución amortiguadora a cada pocillo para lavar las paredes y aplicar vacío nuevamente.
Retirar la membrana y proceder con la inmunotransferencia.
lnmunotransferencia Bidimensional
PREPARACIÓN
DE LASMUESTRAS
Los compuestos usados para solubilizar las proteínas no deben incrementar la concentración iónica de la solución. Por ejem-
plo, una solución de solubilización de muestra común es la siguiente: Urea 8 M, ditiotreitol (DTT) 50 mM ó tributil fosfina
(TBP) 2 mM, 4% de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), 0,2% de anfolitos portadores y
0,0002% de azul de bromofenol. La adición de anfolitos portadores mejora la solubilidad de las proteínas conforme se acercan
a sus puntos isoeléctricos. El uso de anfolitos produce una conductividad uniforme aproximada a través del gradiente de pH
sin afectar su forma, lo que significa que debe optimizarse la concentración de anfolitos portadores.
SEPARACIÓNPOR CARGA
Diversos proveedores producen y venden tiras de gradientes de pH inmovilizados (IPG, por sus siglas en inglés) o se pueden
producir internamente de acuerdo con el capítulo (l 054). La selección de las tiras de gradientes de pH inmovilizados depende
del punto isoeléctrico de las proteínas de interés. El tamaño de las tiras de gradientes de pH inmovilizados debe corresponder
al tamaño del gel de la segunda dimensión. Se debe determinar la cantidad de proteína en cada muestra y las cantidades apli-
cadas a las tiras de gradientes de pH inmovilizados deben estar dentro del intervalo de 10-300 µg, dependiendo del tamaño
de las tiras de gradientes de pH inmovilizados. La muestra y el estándar deben sembrarse de acuerdo con las instrucciones del
fabricante o de acuerdo con el capítulo (1054). Después, los analistas proceden con el isoelectroenfoque aplicando los paráme-
tros eléctricos descritos en el capítulo (1054) o por el fabricante.
SEPARACIÓNPOR PESO MOLECULAR
Después de la separación por carga, los analistas deben equilibrar la tira en solución amortiguadora que contenga dodecil
sulfato de sodio antes de la separación en la segunda dimensión para determinar el peso molecular (según se indica previa-
mente en la sección lnmunotransferenciaUnidimensional).Los analistas deben colocar la tira directamente sobre la parte supe-
rior del gel, luego asegurar la tira recubriéndola con agarosa al 0,5%-1,0% preparada en solución amortiguadora de corrida
para SDS-PAGE.Para rastrear el frente de la corrida en la segunda dimensión, los analistas pueden agregar azul de bromofenol
a la agarosa.
ANÁLISISDE DATOSDE INMUNOTRANSFERENCIA

La presencia o ausencia de bandas a menudo se determina mediante comparación con un control (antígenos altamente ca-
racterizados conocidos o calificados para proveer una respuesta precisa o esperada) de un tipo similar al del antígeno que se
está procesando. Aunque los analistas a menudo llevan a cabo una comparación cualitativa, resulta posible cuantificar bandas
o puntos usando un sistema de detección (p. ej., después de incubar en una solución que contenga sustrato de peroxidasa 4-
CN; ver también la Tabla 1) y se comparan con las bandas de control que se corren en paralelo (p. ej., en el mismo gel).
Opciones de Detección
QUIMIOLUMINISCENCIA
MEJORADA
La quimioluminiscencia mejorada es un método popular para la detección en análisis de inmunotransferencia debido a que
es altamente sensible (detección al nivel de pg o menores) y se puede usar para cuantificar la concentración relativa de la pro-
teína de interés. El método depende de la incubación de la membrana con un sustrato que emana luminiscencia cuando se
degrada por la acción de la enzima conjugada con el anticuerpo secundario. La luz se detecta usando película fotográfica o
una cámara con dispositivo de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés). Posteriormente, la imagen se analiza
mediante densitometría para evaluar la intensidad relativa de la señal de las bandas de proteínas en términos de densidad Ópti-
ca. Usando un conjunto apropiado de estándares de peso molecular como marcadores, los analistas pueden estimar el peso
molecular de los analitos.
DETECCIÓNDE FLUORESCENCIA
La fluorescencia directa se puede usar para detectar proteínas transferidas a membranas. La fluorescencia directa es simple,
rápida, sensible y tiene un intervalo lineal mayor que la detección por quimioluminiscencia mejorada. La ventaja de la fluores-
cencia directa es la capacidad para detectar una gran cantidad de señales fluorescentes distintas. Este análisis evita la necesidad
de reanalizar la transferencia. En comparación con la quimioluminiscencia mejorada, los métodos de fluorescencia son más fá-
ciles de visualizar y cuantificar en sistemas de generación de imágenes con dispositivos de acoplamiento de carga o sistemas
de escaneo de imágenes con láser. Algunos sistemas de adquisición de datos permiten extender el tiempo de adquisición de
datos para optimizar los niveles de señal-ruido. Las transferencias marcadas por fluorescencia que se pueden reanalizar son úti-
les para este propósito.
La quimiofluorescencia mejorada (ECF,por sus siglas en inglés) es otro método común de fluorescencia. La quimiofluores-
cencia mejorada usa anticuerpos secundarios conjugados con HRPo AP.Las enzimas conjugadas con los anticuerpos catalizan
las reacciones que producen productos fluorescentes a partir de los sustratos no fluorescentes. Los analistas visualizan las seña-
les resultantes usando epiiluminación UVy capturan imágenes digitales. Una señal de quimiofluorescencia mejorada tiene un
intervalo lineal mayor que la quimioluminiscencia mejorada tradicional. Por ejemplo, la fluorescencia directa tiene un límite de
detección en el intervalo de pg, además de que tiene aproximadamente 2 logaritmos de intervalo dinámico lineal.
Los anticuerpos conjugados con puntos cuánticos son una alternativa para detectar proteínas en análisis de inmunotransfe-
rencia. Los puntos cuánticos son nanopartículas fluorescentes, las señales fluorescentes que emiten dependen de su tamaño y
éstas pueden ser fácilmente diferenciadas. Esto permite el uso simultáneo o secuencial de anticuerpos conjugados con puntos
cuánticos de diferente tamaño para determinar la presencia de varias proteínas, sin la necesidad de eliminar anticuerpos uni-
dos a las diferentes bandas de proteínas en las transferencias. De manera similar, el anticuerpo ligado con fluoróforo que emite
en el infrarrojo cercano (NIR, por sus siglas en inglés) es una herramienta de detección de analitos, en este caso, la luz produci-
da por la excitación del fluoróforo se mide en un estado estático. La luz medida en un estado estático permite una detección
más precisa y exacta que la luz medida en un estado dinámico (p. ej., quimioluminiscencia).
DETECCIÓNRADIOACTIVA
Las proteínas también pueden detectarse mediante la marcación de un antígeno con un isótopo radioactivo (p. ej., yodo).
Por otra parte, este método tiene la ventaja de que la radiactividad en una banda es fácil de cuantificar mediante el tiempo de
exposición a la película y densitometría, o escindiendo la banda directamente de la membrana realizando un conteo usando
un contador de centelleo. Por otra parte, la radiactividad también introduce la desventaja de la seguridad puesto que los ana-
listas deben manejar materiales radioactivos, mientras que los laboratorios deben contar con un programa para controlar y
monitorear el manejo de los desechos y la exposición del personal.
Cuantificación por lnmunotransferencia
CUANTIFICACIÓN
SIN SEPARACIÓNELECTROFORÉTICA
La cuantificación de una proteína específica se logra cuando el procedimiento de transferencia se optimiza adecuadamente y
genera un intervalo de respuesta lineal durante un marco de tiempo particular. La cuantificación por inmunotransferencia in-
cluye diversos elementos: concentraciones y pureza adecuadas de antígeno y anticuerpo, especificidad del anticuerpo, condi-
ciones del bloqueo, suficientes lavados y la duración e intensidad de las señales. Una vez que las exposiciones se capturan en
una película o de manera electrónica en condiciones optimizadas, los analistas emplean métodos densitométricos para cuanti-
ficar los resultados comparando con una proteína específica sobre la membrana y sobre el estándar. Los analistas pueden co-
rregir los resultados por el fondo mediante la inclusión de un control negativo.
La intensidad de las bandas depende de la cantidad de proteína. Se encuentran disponibles diversos paquetes informáticos
para el análisis de imágenes de bandas en una película. Alternativamente, los sistemas digitales de generación de imágenes
que contienen cámaras con dispositivos de acoplamiento de carga por lo regular incluyen software diseñado para realizar aná-
lisis de datos.
CUANTIFICACIÓN
ELECTROFORÉTICA
Las proteínas de diversos pesos moleculares se identifican mediante extrapolación de gráficas de las movilidades relativas de
proteínas preteñidas con pesos moleculares conocidos y se pueden comparar con el control positivo. Los controles positivos
tienden a determinar el intervalo del límite de los resultados de la densitometría en comparación con los resultados de las con-
centraciones nominales. Independientemente del método de detección, se deben cumplir los siguientes criterios para obtener
resultado válido de Western blot.
• Asegurar el desarrollo adecuado minimizando la sobreexposición de la membrana y visualizando los controles de tinción.
• Los marcadores de peso molecular previamente teñidos deben ser visibles y deben cubrir el intervalo previsto.
• Las bandas deben tener la ubicación e intensidad apropiadas para el estándar, el control y la proteína de interés.
• No deben haber artefactos de la transferencia o de la tinción que obstruyan la visualización e interpretación de las bandas.
VALIDACIÓNDELMÉTODO
Conforme a lo establecido en la Pauta Q2(Rl) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (en vigencia desde
noviembre de 2005) de la ICH y en el capítulo general de la USPValidaciónde ProcedimientosAnalíticos(1225), una validación
cualitativa tal como la transferencia en ranuras/en puntos requiere la validación de la especificidad. La especificidad es la capa-
cidad de detectar el analito en presencia de otros componentes. Para la validación, se debe demostrar que las etapas particula-
res del método de transferencia en ranuras/en puntos pueden detectar el antígeno cuando éste está presente y no informar
resultados falsos positivos cuando el antígeno está ausente. Además, demostrar la especificidad de los anticuerpos para antíge-
nos específicos es parte de la evaluación de especificidad.
El capítulo general de la USP(1225) provee pautas para la validación de procedimientos analíticos y los analistas deben con-
siderar este recurso al evaluar métodos de inmunotransferencia. Todos los métodos requieren una demostración de la especifi-
cidad del anticuerpo para el antígeno y la falta de reconocimiento de otras proteínas y reactivos en la matriz. Las pruebas de
identidad solo requieren especificidad. las pruebas de límite requieren especificidad y limites de detección. la incorporación
de un control de sensibilidad en cada prueba puede demostrar el cumplimiento con el límite de cuantificación en cada una de
7898 (1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas lnmunotransferencia / InformaciónGeneral USP42
las determinaciones para explicar potenciales cambios en la sensibilidad del método. Una prueba cuantitativa requiere todos
los parámetros de validación de la ICH, incluyendo la prueba de robustez.
La demostración de especificidad en la inmunotransferencia con separación electroforética debe incluir lo siguiente: geles
teñidos para demostrar la separación de las proteínas, transferencias teñidas para demostrar una transferencia adecuada de las
proteínas a la membrana, transferencias con muestras de control para demostrar la especificidad del conjugado por el anti-
cuerpo primario, así como transferencias que muestren la unión del anticuerpo al antígeno apropiado. La validación del méto-
do también puede identificar la necesidad de membranas de control para cada valoración, así como controles de sensibilidad
de las proteínas como mediciones de la aptitud del sistema.

INMUNOLÓGICAS-RESONANCIADE
PLASMÓNSUPERFICIAL
Introducción
La detección óptica mediante resonancia de plasmón superficial (RPS)es un método que no depende del marcado previo de
las moléculas para estudiar interacciones biomoleculares. Los biosensores para RPSdisponibles comercialmente pueden reco-
lectar datos en tiempo real y vasta información proveniente de los enlaces entre las moléculas. Dichos datos se pueden usar
en una amplia variedad de aplicaciones, desde la investigación básica para el descubrimiento y desarrollo de un fármaco
hasta su fabricación y control de calidad (CC). La RPSpuede caracterizar eventos de enlace con muestras que varían desde
proteínas, ácidos nucleicos y pequeñas moléculas hasta mezclas complejas, vesículas lipídicas, virus, bacterias y células euca-
riotas. Los atributos de calidad y seguridad típicos tratados con el análisis de RPSincluyen:
• Especificidad de la interacción
• Afinidad de la interacción
• Parámetros cinéticos del enlace
• Parámetros termodinámicos
• Concentración biológicamente activa de un analito
Este capítulo ofrece una visión general sobre los aspectos físicos subyacentes a la RPSy sus configuraciones instrumentales co-
munes, así como la variedad de moléculas que se pueden estudiar y las consideraciones generales para el diseño experimen-
tal, conforme lo determine el objetivo de la valoración.
Historia
Los principios físicos de la RPSse explicaron por primera vez en los inicios del siglo XX, comenzando con una descripción
de la distribución poco uniforme de la luz en un espectro de red de difracción ocasionado por la excitación de las ondas
de plasmones superficiales. Una serie de experimentos fundamentales mostraron la excitación óptica de los plasmones su-
perficiales en condiciones de reflección interna total y promovieron estudios detallados de la aplicación de la RPS para
detección química y biológica. Desde entonces, se reconoce el potencial de la RPSpara caracterizar películas delgadas y
monitorear interacciones en interfases metálicas y además, la investigación y el desarrollo tecnológico significativos han
dado lugar a instrumentos que pueden evaluar cuantitativamente las interacciones de enlace de moléculas grandes y pe-
queñas.
Consideraciones
físicas
La RPSes un fenómeno óptico que se presenta cuando una delgada película conductora se coloca entre dos medios con
diferentes índices de refracción. En muchos instrumentos disponibles comercialmente, los dos medios son vidrio y la solu-
ción muestra, mientras que la película conductora es, de preferencia, una capa de oro aplicada al vidrio, aunque se han
empleado otros metales conductores como la plata. El componente de vidrio-metal comprende un soporte sólido que a
menudo se le conoce como sensor.
La luz aplicada al vidrio en condiciones de reflexión interna total produce un componente electromagnético denominado
ondaevanescente.La onda evanescente penetra el medio con menor índice de refracción (por lo general, la solución
muestra) sin perder energía neta. La amplitud de la onda evanescente se deteriora exponencialmente con la distancia des-
de la superficie, apenas la mitad de la longitud de onda de la luz incidente (p. ej., para una fuente de luz de 760 nm, la
onda evanescente penetra aproximadamente 300 nm).
Para una combinación específica de longitud de onda y ángulo de luz incidente, las ondas de la densidad de carga de elec-
trones, que reciben el nombre de plasmones,se excitan en la película de oro. A medida que la energía se absorbe a través
de la onda evanescente, se observa una reducción en la intensidad de la luz reflejada a un ángulo específico (el ángulo de
RPS).Los analistas pueden realizar un experimento de RPSfijando la longitud de onda y variando el ángulo de luz inci-
dente.
Un incremento en la masa en la superficie del sensor ocasionada por una interacción de enlace entre dos o más moléculas
ocasiona un cambio en el índice de refracción local (IR) que da origen a una respuesta de RPS,la cual se observa como
una desviación en el ángulo de RPS. Un analista puede generar un sensorgrama (Figura1) mediante el monitoreo de la
desviación en el ángulo de RPScomo una función de tiempo. El cambio en el índice de refracción es muy similar para
USP42 InformaciónGeneral/ (1105) Métodos de PruebasInmunológicasResonancia7899
diversas proteínas, por lo que la medición de RPSdepende principalmente del cambio de la masa en la superficie del sen-
sor y es relativamente independiente de la naturaleza de las moléculas que se están midiendo.
Equilibrio
Asociación Disociación
~
.,
U)
~---~----------------------
.,¡¡¡-Línea base
a:::
Regeneración
Tiempo
Figura 1. Sensorgrama representativo.
Instrumental
Los componentes principales de los instrumentos para RPSdisponibles comercialmente son (1) una fuente de luz, general-
mente un diodo emisor de luz de alta eficiencia, (2) un detector óptico, como un arreglo de diodos o una cámara con
dispositivo de acoplamiento de carga, (3) un soporte sólido que contenga la película conductora y algún medio para in-
movilizar moléculas en la película conductora, (4) un sistema de administración de muestra, a menudo con un dispositivo
para microfluidos capaz de administrar muestras usando inyecciones en serie o paralelas mediante una o varias agujas y
(5) una computadora con software apropiado para control de instrumental, recolección de datos y análisis.
Los sistemas de instrumentos basados en prisma y en red de difracción están disponibles comercialmente. La mayoría de
los sistemas basados en prismas siguen la configuración de Kretschmann (Figura 2). La luz se enfoca sobre la superficie del
sensor (lejos de las muestras) mediante un prisma con un índice de refracción igual al de la superficie. En esta configura-
ción, la luz incidente no penetra la solución muestra, lo que permite obtener mediciones de RPS para muestras heterogé-
neas, turbias u opacas. Para sistemas que emplean una red de difracción (Figura 3) la solución del analito se coloca sobre
una superficie de plástico en la que se ha depositado un metal. El plástico actúa como un prisma de reflexión interna total
atenuada en el que la luz reflejada de la red se refleja de nuevo una gran cantidad de veces hacia la superficie de la red.
En esta configuración, la luz pasa a través de la solución muestra de analito y, por consiguiente, las muestras turbias u
opacas no son adecuadas para su medición. La red de difracción permite el muestreo de un área superficial mayor y es
aplicable para las mediciones de matrices mediante RPS.
Medio de analito
Capa
metálica
=~==~=====;::=/
Luz Luz
polarizada reflejada
Figura 2. Configuración Kretschmann para RPS.
Capa
Medio de analito metálica
rn,léro~
Luz polarizada Luz reflejada
Figura 3. Configuración de red de difracción para RPS.
Los instrumentos son compatibles con una amplia variedad de muestras y amortiguadores biológicos, así como algunos
disolventes orgánicos.
7900 (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas Resonancia / Información General USP42
Interacciones Biomoleculares que se Pueden Estudiar Mediante Valoraciones con RPS

Es posible estudiar una diversidad de entidades biológicas usando RPS,entre las que se incluyen moléculas pequeñas (<100
Da), proteínas, ácido nucleicos, lípidos, bacterias, virus y células enteras. La mayor parte de las investigaciones de RPSpu-
blicadas implican interacciones entre proteínas, de las cuales las interacciones anticuerpo-antígeno representan un sub-
conjunto dominante. Las mejoras en la sensibilidad del instrumental y en los protocolos experimentales han ayudado a los
analistas a estudiar pequeñas moléculas, lípidos y ácido nucleicos. Las interacciones de proteínas con entidades más gran-
des tales como células enteras y algunas bacterias y virus están limitadas por el decaimiento exponencial de la onda eva-
nescente, según se describió con anterioridad. En la práctica, estas moléculas grandes se pueden estudiar de manera efec-
tiva, pero la información que se obtiene puede estar limitada a datos cualitativos o semicuantitativos (p. ej., clasificación
relativa).
Tipos de Valoraciones
Diversos tipos de valoraciones mediante RPSson de utilidad, incluyendo la especificidad del enlace, el análisis de concen-
tración, el análisis de cinética y afinidad y la termodinámica. Cada tipo de valoración genera información única que es útil
para generar perfiles de biomoléculas.
La RPStambién es adecuada para su uso en estudios cualitativos para confirmar la especificidad de las interacciones. El ana-
lista puede monitorear un número de eventos de enlace secuenciales debido a que cada evento individual produce un
aumento de masa en la superficie del sensor, y se monitorean todas las etapas del proceso de enlace. Los ejemplos inclu-
yen mapeo de epítopos, isotipificación de anticuerpos y mediciones de inmunogenicidad.
La mayoría de los métodos químicos y espectroscópicos usados para cuantificar proteínas (1) miden el contenido total pro-
teico, (2) no distinguen entre moléculas activas e inactivas y (3) no se pueden usar para determinar la concentración de
una proteína de interés en muestras no purificadas. Debido a que la RPSes un método no invasivo (la luz no penetra la
muestra), puede medir cantidades pequeñas de moléculas de analitos a partir de matrices complejas tales como produc-
tos alimenticios, suero o plasma y extractos celulares. Asimismo, son posibles los formatos directos o indirectos (inhibición
o competitivos) para medir la concentración. Los biosensores para RPSse ajustan de manera única para la medición de
constantes de velocidad de asociación y disociación cinética a partir de la medición en tiempo real de interacciones de
enlace. La afinidad se puede derivar de interacciones que hayan alcanzado el equilibrio o del cociente entre las constantes
de velocidad de disociación y asociación. El intervalo de trabajo típico para mediciones de afinidad es desde pM hasta
concentraciones µM altas. Las constantes de velocidad de asociación que se pueden medir por lo general varían de 1 0 3 a
107 M-1s-1, mientras que las constantes de velocidad de disociación van de 10-5 a 0,5 s-1 • Mediante el estudio de la depen-
dencia de las constantes de velocidad y afinidad con la temperatura, los analistas pueden determinar parámetros termodi-
námicos para una interacción de enlace. No solo es posible determinar los valores de equilibrio para cambios en la ental-
pía (.d/-1)y la entropía (.dS)relacionados con la formación de complejo, sino que se pueden evaluar también las cuestiones
energéticas de los estados de transición. Las secciones subsiguientes de este capítulo tratan detalles específicos para estos
diferentes tipos de valoraciones.
Valoración mediante RPS
La valoración mediante RPStípica implica cinco etapas:
1. Preparación de la muestra y del amortiguador
2. Preparación de la superficie
3. Enlace de analitos
4. Regeneración de la superficie
5. Análisis e interpretación de datos
La atención y el cuidado en el diseño experimental conlleva la obtención de datos y resultados de alta calidad. En las valo-
raciones mediante RPS, el transporte de masas es esencial para que las interacciones de enlace ocurran, cuando los experi-
mentos se lleven a cabo en los instrumentos que utilizan sistemas de celdas de flujo de capa delgada. Las moléculas de
analito se transfieren de la solución a granel a la superficie de enlace mediante transporte de masas. Cuando se presenta
una limitación en el enlace como resultado de una rápida cinética de enlace combinada con una alta densidad superficial
de la molécula que se asocia con el analito, la interacción de enlace se considera limitada por el transporte de masas. En
este caso, la cinética de enlace y la formación de complejo se ven influenciadas por la disponibilidad de moléculas de
analito. Las ventajas y desventajas del enlace limitado por el transporte de masas se analizan más adelante en los ejemplos
de aplicación.
Preparación de la Muestra y del Amortiguador
Las muestras crudas y purificadas se pueden analizar en una variedad de matrices, incluyendo suero, plasma, sobrenadan-
tes celulares y lisados. Puede ser necesario clarificar las muestras crudas que contienen partículas (p. ej., restos celulares o
precipitados) a fin de ayudar a minimizar uniones no deseadas. Se recomienda el uso de centrifugación breve (30-60 s)
en una centrífuga de mesa o de filtración usando filtros de bajo enlace proteico (0,22-1,0 µm). El intervalo de concen-
tración para la evaluación depende del objetivo del experimento (enlace sí/no, concentración o análisis de cinética/afini-
dad), así como de la afinidad de enlace de las moléculas que interactúan. En general, las concentraciones de muestra en
un orden de magnitud por debajo de la constante de disociación en equilibrio (K0 ), se pueden detectar mediante RPS,
aunque la determinación de una concentración exacta se puede ver influenciada por el tamaño del analito (moléculas
grandes vs. pequeñas), por la especificidad del enlace y por la actividad biológica general de las muestras.
USP42 InformaciónGeneral/ (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas Resonancia 7901
Se pueden emplear la mayoría de los amortiguadores biológicos, así como diversos disolventes orgánicos en los experi-
mentos de RPS. Con frecuencia, la adición de sales y detergentes a las soluciones amortiguadoras puede estabilizar las
biomoléculas. Se debe usar componentes para amortiguadores con un grado de alta calidad (p. ej., de grado para biolo-
gía molecular o mayor). Para simplificar los experimentos, los analistas deben agregar únicamente componentes que
sean absolutamente necesarios para la actividad o función biológica. Es necesario filtrar y desgasificar los amortiguadores
antes de su uso.
Preparación de la Superficie
La preparación de la superficie implica acoplar uno o más compañeros de enlace a un soporte sólido (superficie). Este
proceso recibe con frecuencia el nombre de inmobilizacióny la superficie resultante con la biomolécula acoplada es el
sensor para el experimento. La selección de compañeros de enlace, soporte sólido y método de inmobilización se ven
influenciados por (1) la naturaleza y demandas de la aplicación u objetivo experimental; (2) la disponibilidad de superfi-
cies con propiedades diferentes (p. ej., densidad de carga, hidrofobicidad o hidrofilicidad); (3) las características y apro-
visionamiento de la biomolécula que se usará para la inmovilización; y, lo más importante, que (4) se mantenga la activi-
dad biológica y que existan sitios de enlace disponibles para los compañeros que interactúan. Dependiendo del objetivo
experimental, también puede resultar deseable la adición homogénea o de orientación específica de biomoléculas. Las
dos categorías principales de los métodos de inmovilización son (1) inmovilización directa, en la que la molécula se aco-
pla de manera covalente a la superficie, y (2) inmovilización indirecta o de captura, que saca ventaja de etiquetas o gru-
pos nativos en la proteína o biomolécula (Tabla 1).
Tabla 1. Técnicas de Preparación de la Superficie
Química Método de lnmovlllzaclón Blomoléculas Comentarlos
Amina Directa Proteínasy péptidos Aminoterminal, residuosde Lis
Tiol-nativo Directa Proteínasy péptidos Residuode Cis nativo
Tiol-agreqado Directa Proteínasy péptidos Grupos carboxiloderivatizados
Aldehído Directa Glicoproteínas Cis-diol requerido
Péptidos, ácidos nucléicosy proteínas
Captura de biotina Indirecta biotinilados Captura irreversibley estable
Etiquetasde afinidad Indirecta Proteínasy péptidos His,Glutationa 5-transferasa(GST),etc.
Anticuerpos,moléculasmarcadas con Dependiente de
ProteínaA, Proteína G Indirecta lgG especies de lgG
Losanticuerpos mono o policlonalespue-
Biomoléculasespecíficasal anticuer- den ser adecuados-se recomienda el
ProteínaA, Proteína G Indirecta po de captura análisis
Adsorciónhidrófoba, captu- Lípidos,membranas, proteínas aso- Esposible el acoplamiento monocapa o
ra de membrana Indirecta ciadas con membranas bicapa
Inmovilización Directa: Para la inmovilización directa, se encuentran disponibles diversos métodos químicos para aco-
plar proteínas u otras biomoléculas a la superficie. Las propiedades de la superficie determinan la secuencia específica de
las etapas y la duración requerida para preparar la superficie. Muchas superficies disponibles comercialmente tienen una
capa biológicamente compatible (p. ej., un hidrogel) que contiene grupos funcionales tales como carboxilo, que se pue-
den usar para la inmovilización. Para asegurar la especificidad del enlace, la pureza de la biomolécula que se acopla a la
superficie debe ser del 95% o mayor y la concentración requerida debe ser de 1 a 1000 µg/ml. Los métodos químicos
de inmovilización directa con frecuencia resultan en superficies heterogéneas debido a la orientación aleatoria de biomo-
léculas en la superficie.
La inmovilización mediante grupos amino primarios libres tales como residuos de lisina en proteínas o el amino terminal
de proteínas o péptidos es, generalmente, uno de los métodos químicos de mayor aplicación para acoplar las proteínas
a una superficie mediante un enlace covalente. Los grupos carboxilo en la superficie se convierten en ésteres reactivos
usando una mezcla de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) o sulfo-NHS
(sNHS) La proteína o biomolécula se aplica en altas concentraciones (mg/mL) para maximizar la eficiencia del acopla-
miento de aminas. Por último, los ésteres libres se bloquean con etanolamina. El tiempo de contacto con la superficie,
la concentración proteica o la concentración de EDC/NHS se pueden variar para ajustarlos al nivel de inmovilización.
Cuando el acoplamiento de aminas interfiere con el sitio de enlace, la biomolécula se puede acoplar usando métodos
químicos de acoplamiento alternativos o una metodología de captura de alta afinidad. Por ejemplo, para biomoléculas
con grupos tiol libres (a menudo residuos de cisteína), se introduce un grupo de disulfuro tratando la superficie con
NHS y EDC para acoplar la 2-(2-piridinilditio)etanoamina (PDEA).Al agregar la biomolécula a la superficie se produce
un intercambio tiol-disulfuro y el exceso de grupos PDEAse desactiva con cisteína-HCI. Si la biomolécula carece de un
grupo tiol libre, se puede vincular un disulfuro reactivo (PDEA)a los grupos carboxilo. Los grupos piridildisulfuro se
pueden acoplar de manera subsiguiente a grupos tiol en la superficie que han sido derivatizados mediante inyección de
NHS y EDC, seguidos por cistamina, y luego la reducción con ditioeritritol (DTE) o ditiotreitol (DTT). El acoplamiento
de grupos maleimida a la superficie hace posible una forma alternativa de inmovilización mediante grupos tiol en la
que se forma un enlace tioéter estable. Las superficies que se preparan usando este método tienen la capacidad de so-
portar pH básico(> 9,5) y agentes reductores como fJ-mercaptoetanol y ditiotreitol. Se encuentran disponibles comer-
cialmente diversos reactivos heterobifuncionales para la introducción de grupos maleimido reactivos en la superficie,
incluyendo sulfo-MBS(éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida), sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil-4-(N-
maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), GMBS [éster de N-(y-maleimidobutiriloxi)sulfosuccinimida], EMCH [ácido
N-(c-maleimidocaproico)-hidrazida] o BMPH[ácido N-(/3-maleimidopropionico)-hidrazida]. Para biomoléculas que
contienen grupos aldehído nativos o cis-dioles,que se pueden convertir en aldehídos mediante oxidación moderada, el
acoplamiento a la superficie mediante un enlace de hidrazona es una opción. Los grupos hidrazida en la superficie del
sensor reaccionan con los grupos aldehído en la biomolécula para formar un enlace estable. La inmovilización median-
te grupos aldehído es más útil para glicoconjugados, glicoproteínas y polisacáridos.
Inmovilización Indirecta (Captura de Alta Afinidad): La metodología de inmovilización por captura indirecta o de al-
ta afinidad utiliza etiquetas comúnmente empleadas para la purificación de proteínas. Esta técnica explota la captura de
alta afinidad de la biomolécula mediante una molécula de captura que ha sido inmovilizada covalentemente usando una
de las técnicas descritas anteriormente. El requisito de pureza biomolecular es menos estricto para la inmovilización indi-
recta que para la directa debido a que la etapa de captura para la biomolécula también puede proveer purificación. La
inmovilización indirecta a menudo genera una superficie homogénea, debido a que todas las biomoléculas se orientan
de manera similar a través de la etiqueta. La afinidad entre la biomolécula y su agente de captura debe ser lo suficiente-
mente alta como para asegurar una mínima o nula disociación de la superficie durante el ciclo de análisis. Los anticuer-
pos monoclonales se usan con frecuencia como moléculas de captura. Por ejemplo, se pueden acoplar anticuerpos anti-
GST a la superficie del chip del sensor mediante métodos químicos con amina para capturar las moléculas marcadas con
GST. La Proteína A, la Proteína G y los anticuerpos anti-lgG son útiles para la captura de moléculas en conjunto con los
anticuerpos.
La interacción de alta afinidad entre estreptavidina o moléculas relacionadas y biotina (K0 "' 10-15 M) hace de esta un
sistema útil para la captura de moléculas biotiniladas (p. ej., proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, membranas y liposo-
mas). Con frecuencia, la proteína de enlace de biotina se acopla a la superficie usando grupos amino primarios. En vista
de la alta afinidad de la interacción, las moléculas biotiniladas se consideran permanentemente inmovilizadas y, a dife-
rencia de muchas otras metodologías de captura, estas moléculas no se pueden remover sin dañar la superficie. Las
proteínas recombinantes marcadas con histidina (His) se pueden capturar mediante procedimientos químicos con ní-
quel-NTA o con anticuerpos anti-His inmovilizados de manera covalente.
Los lípidos y las proteínas asociadas con membranas se pueden capturar en la superficie como monocapa o bicapa de
lípido. Los lípidos de micelas o liposomas se absorben en una superficie hidrófoba, creando una monocapa de lípido
con las colas del lípido hidrófobo orientadas en dirección del soporte sólido y las cabezas hidrófilas en dirección de la
muestra acuosa. Esta metodología proporciona un ambiente estable para proteínas asociadas con una superficie de
membrana o parcialmente insertadas en la membrana, aunque no es ideal para proteínas transmembranales debido a
que la superficie resultante presenta únicamente la mitad de la estructura de la membrana para interacciones de enla-
ce. Las estructuras intactas de la membrana (bicapas lípidas) con proteínas asociadas o incorporadas se pueden captu-
rar preparando liposomas con un componente antígeno específico o con lípidos biotinilados, lo que permite capturar
los liposomas con anticuerpos inmovilizados o estreptavidina, respectivamente.
Consideraciones adicionales: Una vez que la biomolécula ha sido acoplada al sensor usando una metodología de in-
movilización directa o indirecta, el analista debe evaluar la estabilidad de la línea base de la superficie recién creada. La
causa más probable de una reducción de la línea base (desplazamiento hacia abajo) es la presencia de biomoléculas no
acopladas, lo cual posiblemente se debe a una autoasociación o agregación. Cuando la línea base presenta un aumento
(desplazamiento hacia arriba), este cambio podría ser ocasionado por un replegamiento o reorientación. En cualquier
caso, la superficie recientemente creada debe acondicionarse antes de su uso mediante uno o más de los siguientes pro-
cedimientos: (1) inyecciones múltiples de un amortiguador biológicamente compatible; (2) lavado de la superficie con
un amortiguador a una velocidad de flujo rápida; (3) inyecciones múltiples de soluciones con alta concentración iónica
(p. ej., NaCI 1 M) o detergentes (p. ej., CHAPS20 mM o Polysorbato 20 al 0,05% (P20)); o (4) ciclos repetidos para
enlace del analito e inyecciones de regeneración. NOTA: las recomendaciones (3) y (4) deben usarse únicamente si se ha
evaluado previamente la actividad de la biomolécula ante la presencia de estos reactivos.
Los desplazamientos grandes de la línea base ocasionadas por una captura de baja afinidad se pueden superar usando
EDC/NHS como una etapa de entrecruzamiento, aunque esto puede comprometer la actividad de la biomolécula si los
sitios activos de ésta se ven implicados en los entrecruzamientos. El efecto del entrecruzamiento sobre la actividad de la
biomolécula se debe analizar empíricamente para cada sistema de biomolécula-analito. En general, el entrecruzamien-
to debe ser tan breve como sea posible: a menudo, 15 segundos resultan suficientes para conseguir una estabilidad
aceptable de la línea base sin comprometer la actividad de la biomolécula.
Cantidad a Inmovilizar: La cantidad de biomolécula que se va a inmovilizar depende del objetivo del experimento. Las
ecuaciones 1 y 2 son útiles para calcular la densidad superficial apropiada:
= (MWA/MWJ x R¡x sm [Ecuación 1]

Rmáx
R¡= Rmáx
x (1 /Sm) x (MWJMW,) [Ecuación 2]
Rmá, = respuesta de enlace teórica máxima (asumiendo que una superficie es 100% activa y 100% enlazada con
analito)
USP42 Información General/ (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas Resonancia 7903
RL = respuesta de la molécula inmovilizada

MWA = peso molecular del analito
MWt = peso molecular de la molécula inmovilizada
Sm = estequiometría del enlace molar
Para experimentos cinéticos, se prefiere una baja densidad de la molécula inmovilizada para evitar impedimento estéri-
co, agregación y/o enlace limitado por transporte de masas. La densidad baja se define como Rt que limita Rmáx a 5-50
unidades de respuesta. Para otras aplicaciones, p. ej., el análisis de concentración en el que se desea un enlace limitado
por transporte de masas, Rmáx puede ser 100-200 veces más grande que para los experimentos cinéticos, siempre y
cuando no se induzca el impedimento estérico o la agregación. Las recomendaciones específicas para la densidad de
inmovilización se incluyen en los ejemplos de aplicación de este capítulo.
Enlacede Analitos
No es necesario que las muestras en las que se evaluará el enlace usando RP5 tengan la misma pureza que las biomolécu-
las destinadas para inmovilización directa en la superficie. Debido a que la fuente de luz no penetra la muestra, es posi-
ble analizar muestras turbias u opacas mediante RPS. Siempre que resulte práctico, las muestras deben clarificarse de
acuerdo con las recomendaciones provistas en la sección Preparaciónde la Muestra y del Amortiguador, además de que se
deben minimizar los aditivos para amortiguadores, al incluir únicamente la cantidad requerida para la actividad biológi-
ca.
Las diferencias entre el índice de refracción de los amortiguadores a granel y de los amortiguadores de la muestra origi-
nan una respuesta. El uso de superficies y muestras de control ayuda a demostrar la especificidad del enlace para las
moléculas en la RPS. Para los métodos de inmovilización directa, las superficies de control adecuadas pueden ser (1) la
superficie del sensor sin ninguna modificación o biomolécula acoplada, (2) una superficie que haya sido químicamente
tratada de la misma manera que la superficie que contiene la biomolécula o (3) superficie que tenga acoplada una bio-
molécula relacionada no enlazante. Para superficies que se preparan usando inmovilización indirecta (captura), se debe
usar la molécula de captura como la superficie de control ante la ausencia del compañero de enlace marcado. La dife-
rencia de la respuesta entre las superficies activas y de control proporciona una indicación inicial de la especificidad del
enlace. Las respuestas dependientes de la concentración y la inhibición del enlace mediante la incubación de la muestra
con la biomolécula en la superficie pueden establecer aún más la especificidad del enlace.
Si se observa un enlace inespecífico o indeseado, los analistas deben determinar la fuente. Mediante cambios frecuentes
en el pH o en la concentración iónica de los amortiguadores usados en el experimento se puede reducir o eliminar el
enlace indeseado. La Tabla2 resume sugerencias adicionales para reducir enlaces inespecíficos.
Tabla 2. Acciones Sugeridas para Reducir Enlaces lnespecíflcos
Categoría Acción
Diseño Experimental 1. Optimizar los amortiguadores de corrida:
(a) incrementar la sal (de 150 a 500 mM)
(b) agregar detergente (0,001% a 0,05%)
(c) equiparar la composición de los amortiguadores de muestra y de corrida
2. Cambiar el método de inmovilización de ligandos
3. Evaluar la calidad de los ligandos
4. Aumentar o reducir la temperatura en la cámara de detección
Selección de Superficie 1. Cambiar la propiedades de la superficie del sensor:
(a) reducir las interacciones electrostáticas
(b) evaluar el caracter hidrófobo vs. hidrófilo de la superficie
(c) considerar un ligando alternativo para su uso como superficie de control
2. Preinmovilizar amino-PEG
3. Cambiar la molécula de bloqueo {p.ej, etilendiamina)
Adiciones a la Muestra 1. Agregar un reductor de enlace no específico a la muestra:
(a) incrementar la concentración iónica de los amortiguadores de corrida y de muestra (p.ej.
NaCI de 150 a 500 mM)
(b) agregar detergente a los amortiguadores de corrida y de muestra (p.ej. surfactante P20 del
0,001% al 0,05%)
(c) agregar carboximetil dextrano soluble (1-10 mg/ml, únicamente para superficies basadas
en dextrano)
2. Simplificar el amortiguador de muestra-incluir únicamente los componentes requeridos para
actividad biológica
3. Evaluar la calidad de los analitos
Las ecuaciones 1 y 2 también son útiles para evaluar la actividad de la superficie. Entre más grande sea la respuesta de
enlace, más activa será la superficie, a menos que la respuesta de enlace observada exceda el valor calculado Rmá,en
cuyo caso, la estequiometría de enlace molar es incorrecta, la molécula de analito presenta agregación o el analito se
enlaza de manera no específica a la superficie. Las respuestas de enlace que son bajas(< 10% de RmáJsugieren que la
concentración de analito seleccionada para el experimento es demasiado baja o que la actividad superficial de la molé-
cula inmovilizada es baja. En el primer caso, incrementar la concentración de analito debe aumentar la respuesta de en-
lace, mientras que en el segundo caso, puede ser útil emplear un método de inmovilización diferente.
7904 (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas Resonancia / InformaciónGeneral USP42
Regeneración de la Superficie
La regeneración de la superficie se refiere al proceso de remover el analito enlazado de la superficie a fin de reutilizar la
superficie para interacciones de enlace subsiguientes. En algunos casos, la disociación compleja es rápida y el analito en-
lazado simplemente se lava con solución amortiguadora, por lo que no se requiere de regeneración. Alternativamente, la
configuración del instrumento puede permitir la inyección de múltiples muestras de manera secuencial o en paralelo en
todas las superficies inmovilizadas simultáneamente, limitando así la necesidad de regeneración. Una regeneración ina-
decuada de la superficie puede afectar la reproducibilidad de una valoración y afectar de manera negativa la calidad glo-
bal de los datos resultantes. Para identificar las condiciones correctas, los analistas deben considerar la naturaleza de la
interacción específica y el objetivo del experimento. Por ejemplo, un ligero desplazamiento en la línea base no afectará
los resultados cuando se busca una simple respuesta polar (sí/no), pero para la determinación de la concentración o en
los estudios de cinética, optimizar la etapa de regeneración es un aspecto crítico.
La mayoría de las interacciones bioquímicas implican enlaces no covalentes, tales como enlaces de hidrógeno, electrostá-
ticos, de van der Waals e hidrófobos. Debido a que para la mayoría de las interacciones se desconocen la combinación
de las fuerzas físicas responsables de los enlaces y las condiciones de regeneración críticas para evitar cambios irreversi-
bles en la conformación, las condiciones finales se deben evaluar empíricamente.
La condición ideal para la regeneración es la disociación de todo el material enlazado sin afectar las propiedades biológi-
cas de la biomolécula inmovilizada. Una regeneración incompleta o condiciones demasiado estrictas pueden resultar en
una capacidad reducida de enlace del analito en los ciclos subsiguientes debido al bloqueo de los sitios de enlace por el
analito no disociado o por la desnaturalización parcial de la biomolécula. Los amortiguadores y soluciones para regene-
ración se pueden dividir en diferentes clases por el efecto que tienen sobre la interacción. Se puede usar cualquier com-
binación de amortiguadores.
Las clases principales de amortiguadores para regeneración son: ácidos, básicos, iónicos/caotrópicos, detergentes, hidró-
fobos/no polares y quelantes (ver la Tabla3 para obtener ejemplos de cada clase). Los analistas deben comenzar con
condiciones moderadas y trasladarse progresivamente hacia condiciones más severas. En muchos casos, especialmente
cuando se trabaja con anticuerpos, el cambio de pH es el método más efectivo para regenerar la superficie. El tiempo de
contacto con la superficie es importante para una regeneración eficiente. Cuando los analistas emplean el cambio de
pH, los tiempos de contacto deben ser cortos, de 30 segundos a 2 minutos. Cuando los analistas emplean una alta con-
centración iónica o caotropos, los tiempos de contactos más extensos, de 2-4 minutos, a menudo resultan efectivos.
Tabla 3. Elemplos de Soluciones para Regeneración
lónlcas/ Hidrófobas/
Ácidas Básicas Caotróplcas Detergentes No polares Quelantes
etilenglicol al 25%- EDTAo EGTA1O-
HCL 1-100 mM NaOH 1-100 mM NaCI 0,5-5 M SDSal 0,02%-0,5% 100% 20mM
glicina 10-100 mM, pH glicina 10-100 mM, pH octilenglicol 40 mM + imidazol l 0-200
1,3-3,0 9,0-10,0 MgCI, 1-4 M CHAPS20 mM DMSO al 5%-50% mM
ácido fosfórico 10-1 00 HCI de etanolamina 1
mM M, pH 9,0 o superior KSCN 1 M octilglucósido 40 mM acetonitrilo al 1%-10%
carbonato de sodio 100
mM + NaCI 1 M, pH 9- HCI de guanidina 2-
TFAal0,1% 11 6M
NaOH 20--100 mM que
contiene P20 surfactan-
te al 0,5% o SDSal
ácido fórmico 100 mM 0,05%
El propósito de optimizar las condiciones de regeneración es encontrar la solución de regeneración más moderada posible
para disociar completamente el complejo. Los analistas deben mantener un nivel constante de actividad sobre los ciclos
de enlace-regeneración, incluso si la línea base cambia un poco. Ciclos repetidos de enlace del analito seguidos por la
regeneración de la superficie proporcionarán información sobre el desempeño general de la superficie. Idealmente, se
debe evaluar el desempeño de la superficie para el mismo número de ciclos que se utilizarán durante el experimento de
RPS.
La superficie debe monitorearse para detectar señales de acumulación y la degradación del ligando inmovilizado (Figura
4). Esto se puede lograr monitoreando la línea base al inicio de cada ciclo de inyección y la señal de enlace (pendiente o
respuesta de enlace) de una muestra de control de calidad. Definir apropiadamente los criterios de aceptación para la
aptitud del sistema, tales como el desplazamiento de la línea base y el desempeño del control de calidad, ayuda a moni-
torear la integridad del ligando inmovilizado en la superficie.
USP42 Información General/ (1105} Métodos de Pruebas Inmunológicas Resonancia 7905
A. Nivel de la línea base B. Nivel de la respuesta
5"
5"
es es
.;""
~Q) Q)
:,
:, Q.
Q. "'
Q)
"'
Q)
o::
o::
o 2 3 4 5 6 o 2 3 4 5 6
Número de ciclo Número de ciclo
Figura 4. Evaluación del desempeño de la superficie (A) acumulación en la superficie y (B) degradación del ligando inmo-
vilizado.
Existen dos posibles explicaciones cuando la respuesta del enlace disminuye lentamente:
1. Si la línea base del sensograma de los datos brutos se mantiene constante, pero la respuesta del enlace continua
disminuyendo, las condiciones de regeneración ocasionan un cambio irreversible en la biomolécula que reduce la
capacidad de enlace de la superficie, lo cual a su vez reduce la cantidad de analito que se puede enlazar en la super-
ficie. Los analistas pueden reducir ligeramente la concentración de la solución de regeneración o cambiar a otra so-
lución de regeneración de igual concentración dentro de la misma clase.
2. Si la línea base aumenta, la acumulación de analito ocasiona una reducción de la capacidad de enlace en la superfi-
cie, lo que a su vez reduce la cantidad de analito que se puede enlazar en la superficie. Los analistas pueden aumen-
tar ligeramente la concentración de la solución de regeneración o cambiar a una solución de regeneración de igual
concentración dentro de la misma clase. Es posible que existan diferencias entre las soluciones de regeneración en
lo que respecta a su capacidad para solubilizar el analito.
Una vez que se ha determinado una solución de regeneración adecuada, ésta debe analizarse en una serie de ciclos de
enlace y regeneración. Debido a que la actividad de enlace de la superficie generalmente disminuye con el tiempo y/o el
uso, los analistas deben determinar empíricamente el umbral de respuesta de enlace y el número consecuente de ciclos
para uso de la superficie. A continuación se presentan ejemplos para determinar el umbral de enlace y el número de
ciclos (ver las Aplicaciones 1-3).
En algunos casos, la línea base disminuirá o aumentará y/o la capacidad de enlace disminuirá hasta cierto punto en las
primeras pocas inyecciones antes de que se estabilice. Esto se debe a la disociación de biomoléculas enlazadas electrostá-
ticamente de la superficie (dependiendo de las características de la superficie) o al enlace con una fracción de alta afini-
dad no regenerable de la superficie. Por esta razón, cada superficie recién inmovilizada debe ser acondicionada con ci-
clos repetidos de enlace y regeneración del analito antes de recolectar datos cuantitativos. Los métodos alternativos de
inmovilización, tales como un procedimiento químico diferente o captura indirecta, se deben evaluar cuando la biomo-
lécula inmovilizada es difícil de regenerar.
Análisis e Interpretación de Datos
El análisis y la interpretación de los datos son específicos para el objetivo del experimento. Existen diversos programas de
análisis de datos que ayudan a calcular las constantes de cinética y afinidad a partir de los datos de la RPS. La validez y
calidad de los resultados están directamente vinculados con el diseño experimental. El proceso de ajuste es puramente
matemático, independientemente de la significancia biológica de los valores obtenidos.
Algoritmo para el Análisis de Datos: El análisis global busca un solo conjunto de constantes de velocidad cinética para
todas las concentraciones usadas en el experimento. Mediante un algoritmo para el ajuste de los datos tal como el de
Marquardt-Levenberg, el software de análisis de datos inicia un proceso iterativo comenzando con una aproximación
inicial para encontrar el mejor conjunto de parámetros que produzca un acuerdo entre los datos experimentales (sensor-
grama) y el ajuste calculado para los datos. El proceso iterativo continúa hasta que se minimiza la diferencia entre las
curvas experimentales y calculadas (teóricas) conforme a la medición obtenida con la suma de los cuadrados residuales.
Preparación de los Datos para el Análisis: Antes de llevar a cabo el análisis cinético, los analistas deben inspeccionar
visualmente los datos experimentales para detectar anomalías o artefactos, tales como disturbios en la línea base o datos
fuera del intervalo (a menudo causados por burbujas de aire) que se presentan durante un periodo previamente definido
7906 (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas Resonancia / InformaciónGeneral USP42
(p. ej., 4-8 segundos). Se deben eliminar los valores aberrantes del conjunto de datos de acuerdo con los criterios pres-
tablecidos. Los datos no esenciales, tales como las inyecciones de captura o regeneración, se deben eliminar del sensor-
grama, y los datos de cada concentración de analito se deben ajustar usando el procedimiento de doble referencia des-
crito más adelante.
Antes del análisis, los datos brutos se deben procesar de la siguiente manera:
• Alinear el inicio de la inyección a cero segundos para todas las concentraciones y las inyecciones de amortiguador
para las superficies de referencia y activas.
• Alinear la línea base a cero respuesta para todos los sensorgramas.
• Restar el sensorgrama de la superficie de referencia del sensorgrama de la superficie activa para crear un conjunto
de datos corregido.
• Restar el sensorgrama del amortiguador corregido de los sensorgramas en las diferentes concentraciones para
crear un conjunto de datos doblemente referenciados.
El procedimiento de doble referencia elimina errores sistemáticos (p. ej., ruido de los instrumentos) y bajos niveles (me-
nos de 5% de la respuesta de enlace total) de enlace no específico. Este procedimiento no debe usarse para corregir los
eventos de enlace no específico importantes puesto que puede llevar a mediciones erróneas.
Cuando se analizan los datos para obtener información cinética, los analistas emplean las fases de asociación (inyección)
y de disociación (flujo de amortiguador) para todas las concentraciones en las series. Para los análisis de afinidad en
estado de equilibrio, la respuesta en equilibrio R,q(meseta de datos o sin cambio en respuesta vs. tiempo) se mide para
cada sensorgrama para crear una isoterma de enlace con R,qvs concentración. La isoterma se analiza usando las ecua-
ciones descritas a continuación.
Modelos Cinéticosy de Afinidad en Estadode Equilibrio: El modelo cinético de Langmuir asume una interacción 1:1
entre compañeros de enlace de modo que
A+B~AB
kd
Las constantes de velocidad de asociación y disociación se definen a continuación:
d[AB]=k x [A]x[B]
dt ª
= [B.,,- AB],la expresión de velocidad neta es

Combinando estas dos ecuaciones y definiendo [Bi;brel
d[AB]/dt= ka X [A¡;b,J[B,0 , -AB] - kd X [AB]
que se puede traducir en términos del experimento RPSde la manera siguiente:
dR/dt= ka X Cx (Rmáx-R)-kd X R
en donde R es la respuesta de enlace en algún punto a lo largo del sensorgrama y Ces la concentración conocida de
analito. Usando los análisis globales descritos anteriormente, k"' kdy Rmáx
se calculan a partir de los datos experimenta-
les usando las ecuaciones de velocidad presentadas a continuación:
Asociación: dR/dt = ka X e X (Rmáx - R)- kd X R
Disociación: dR/dt = -kd x R
Dado que la concentración del analito es cero durante la disociación, la ecuación de velocidad para disociación depende
únicamente de la respuesta, R, y de la constante de velocidad de disociación, kd.
La aplicación de la condición de equilibrio cuando la formación compleja (asociación) es igual al deterioro complejo (di-
sociación)
ka X [A] X [B] = kd X [AB]

genera la siguiente ecuación para la constante de disociación de equilibrio
K = [A]x[B] C(Rmáx-R.q)
D [AB] R,q
en donde R,qes la respuesta de enlace en el equilibrio que se mide en el experimento para una concentración dada de
analito y C, K0 y Rmá,se calculan usando un análisis global.
Los modelos de enlace cinético se pueden usar para describir interacciones que no son 1 :1, p. ej., interacciones bivalen-
tes que se presentan cuando se usa un anticuerpo como analito, hay heterogeneidad de los compañeros de unión,
cambio en la conformación o interacciones más complejas como enlace cooperativo. Los analistas de RPSdeben tener
cuidado de no usar modelos más complejos para evaluar datos a menos que se haya confirmado el diseño experimen-
tal.
Evaluación del Ajuste: La calidad y validez del ajuste a los datos cinéticos se puede evaluar mediante (1) inspección
visual de la concordancia entre las curvas experimentales y calculadas, (2) el tamaño y la forma de las gráficas de resi-
duos, (3) la importancia biológica de los resultados y (4) parámetros estadísticos tales como x2 (promedio de cuadrados
residuales) y error estándar (SE, por sus siglas en inglés), valor To factor U (singularidad). El mejor ajuste de parámetros
para los datos experimentales se debe superponer en la curva para cada concentración en el experimento. La gráfica de
residuos permite visualizar la diferencia entre los datos calculados y los experimentales. La forma de los residuos debe ser
aleatoria sin tendencia (ondulación o encorvamiento hacia arriba o hacia abajo). La altura de la gráfica de residuos debe
reflejar el ruido del instrumento. Además, se debe minimizar x2 para un buen ajuste con valores que dependan del ruido
del instrumento, número de datos puntuales y respuesta general de enlace. Se deben considerar los valores de los pará-
metros con respecto a su importancia biológica y experimental. Por ejemplo, ¿El valor calculado de k. es bajo cuando se
sabe que la interacción es rápida?, o ¿Es el valor calculado de Rmáxmayor que el valor que se calculó usando las Ecuacio-
nes 1 y 2? La significancia de los parámetros se evalúa basándose en el error estándar, en los valores Ty en el factor U.
Los parámetros que son significativos no se pueden cambiar sin afectar la calidad del ajuste. Todos los criterios deben
estar dentro de los límites aceptables.
Se puede usar un conjunto de criterios similar para evaluar el ajuste de los datos de afinidad en estado de equilibrio,
pero debido a que hay menos datos puntuales (6-12 en total, dependiendo del número de concentraciones usadas), es
menos factible predecir la calidad de ajuste de los parámetros estadísticos y de las gráficas de residuos. La inspección
visual de la concordancia entre las isotermas de enlace experimentales y calculadas y la relevancia de parámetro son
buenas herramientas que se usan para evaluar el ajuste. Asimismo, de acuerdo con la relación entre concentración, Ko,
y Rmáx,cuando la concentración es igual a la concentración K0 para la interacción, R es igual al 50% de Rmáx"Confirmar
que los datos analizados siguen esta relación representa otra forma de verificar la validez del resultado calculado. Cuan-
do resulte práctico calcular la concentración K0 usando metodologías cinéticas y de análisis en estado de equilibrio, los
valores de K0 deben concordar dentro del error experimental.
Corrección de la Falta de Ajuste: Cuando los datos no se ajustan o los valores de los parámetros no tienen sentido, a
menudo el problema se podrá resolver a través de una metodología sistemática que considere las fuentes potenciales
para desviaciones y que analice cada hipótesis. Los puntos a considerar incluyen la pureza del reactivo, la química de
inmovilización o la densidad superficial, los errores de concentración del analito, los enlaces no específicos, la pérdida de
actividad de ligandos o el enlace limitado por transporte de masas. Revisar los datos brutos (sin corregir) ayuda a deter-
minar la fuente de enlace no específico o los errores de concentración. La Tabla4 cita las fuentes potenciales de desvío
del enlace 1 :1 y las acciones recomendadas.
Tabla 4. Fuentes Comunes de Desvío de la Cinética de Enlace 1:1.
Fuente de Desvío Acción Recomendada
Línea base con un valor diferente de cero antes de la in-
yección • Normalizar la respuesta a cero y reanalizar
Tiempos de inicio y fin de inyección incorrectos o definí- • Ajustar el inicio/fin de la inyección
ción deficiente del inicio/fin de la inyección • Retirar los artefactos de sensorgrama (p. ej., inyección o espículas de burbujas de
aire)
Errores en la información de la concentración • Verificar los valores de concentración y reanalizar
Contribución demasiado alta del índice de refracción bruto • Usar una metodología de doble referencia antes del análisis
• Ajustar RI ; O
Enlace limitado por transporte de masas • Variar la velocidad de flujo (lenta a rápida) para una sola concentración y sobre-
poner los sensorgramas (deben ser idénticos para el mismo tiempo de asociación
y disociación)
• Incluir el término de transporte de masas, km, en el modelo de ajuste
• Reducir la densidad superficial
Enlace no específico • Cambiar el método químico de inmovilización
• Cambiar las propiedades de la superficie del sensor
• Aditivos para amortiguadores-agregar o minimizar
• Pureza del reactivo-purificar muestras de nuevo
Pérdida de actividad del compañero de enlace • Cambiar el método químico de inmovilización
• Cambiar la solución de regeneración
• Reanalizar los datos usando un ajuste de parámetros local en vez de un ajuste
global para Rmsx
Interacción de enlace multivalente • Inmovilizar el compañero de enlace multivalente
Las secciones subsiguientes de este capítulo ofrecerán recomendaciones para el análisis de datos.
Aplicación 1-Evaluación de lnmunogenicidad: La RPSha demostrado ser una técnica efectiva para evaluar la inmu-
nogenicidad de las proteínas con propiedades terapéuticas o proteínas de uso terapéutico. Una ventaja de esta platafor-
ma para detectar anticuerpos en muestras de suero (o plasma) es que permite una detección sin etiquetas basada en la
acumulación de masa en tiempo real, lo que permite potencialmente la detección de anticuerpos de poca afinidad de
todas las clases y subclases. Esta tecnología es útil para valoraciones de detección (inmunoensayos en primer nivel que se
usan para detectar la presencia de anticuerpos capaces de enlazarse a una proteína con propiedades terapéuticas) y para
los ensayos de caracterización. Los ensayos de caracterización son útiles para definir anticuerpos generados que se enla-
zan a la proteína y pueden incluir el análisis de concentración de anticuerpos, isotipos representados, afinidad de enlace
relativa y especificidad del enlace. Una limitación es que la RPSno es adecuada para determinar la capacidad neutrali-
zante de los anticuerpos, lo cual se determina mejor usando una valoración biológica basada en células. Al diseñar y vali-
dar valoraciones de RPSpara la evaluación de inmunogenicidad, los analistas deben considerar parámetros críticos, in-
cluyendo la inmovilización de proteína para asegurar la reactividad biológica, la estabilidad de la proteína inmovilizada y
las condiciones de regeneración de la superficie.
Inmovilizaciónde Proteínas: El primer paso en el desarrollo de las valoraciones para la evaluación de inmunogenici-
dad consiste en identificar el mecanismo óptimo para inmovilización de la proteína diana. Al considerar la densidad
diana para inmovilización, los analistas a menudo recomiendan usar una superficie de alta densidad. La ventaja de una
superficie de alta densidad es que maximiza la oportunidad de que los anticuerpos contra las proteínas terapéuticas
entren en contacto con un ligando inmovilizado. Asimismo, una superficie de alta densidad ofrece una sensibilidad de
valoración excelente. Un aspecto importante de estas valoraciones radica en que el método químico seleccionado para
la inmovilización debe ofrecer una orientación aleatoria en lugar de una orientación dirigida al sitio, de modo que to-
dos los epítopes potenciales en la proteína terapéutica estén disponibles para su enlace con anticuerpos. La efectividad
de la inmovilización se determina mediante la evaluación de la capacidad de los anticuerpos de control positivos para
enlazarse con la proteína inmovilizada. Al evaluar la efectividad de la inmovilización, los analistas deben analizar múlti-
ples anticuerpos con diferentes especificidades para epítopes. Cuando los paneles de anticuerpos que cubren un inter-
valo de afinidades y enlaces a diferentes epítopes en la proteína diana tienen la capacidad de enlazarse, esto da la con-
fianza de que los anticuerpos contenidos en las muestras clínicas también serán detectados. Si alguno de los anticuer-
pos de control positivo no demuestra una capacidad de enlace, esto sugiere que la inmovilización no es óptima y debe
modificarse. Aunque se ha demostrado que la RPSes eficiente para detectar anticuerpos de alta afinidad, los analistas
deben confirmar que el protocolo de inmovilización seleccionado sea efectivo para la detección de anticuerpos de alta
y baja afinidad.
Estabilizaciónde Proteínasal Momento de la Inmovilización: El anticuerpo de control positivo debe ser capaz de
enlazarse a la proteína inmovilizada para que el resultado de una valoración sea aceptable. Esta confirmación de enlace
da la confianza de que si en la muestra se presentan anticuerpos contra una proteína, éstos se enlazarán con la proteína
inmovilizada en la superficie del sensor. Puesto que la RPSse basa en la reutilización de la superficie de la proteína in-
movilizada para múltiples análisis, se requiere de un protocolo de regeneración para eliminar de la proteína inmoviliza-
da cualquier material enlazado de manera efectiva. Este procedimiento de regeneración se basa en la capacidad de eli-
minar el material enlazado sin dañar o eliminar la proteína inmovilizada. Se pueden usar diversos protocolos de regene-
ración y, casi siempre, la solución de regeneración es una solución ácida, por lo general un clorhidrato diluido. La pro-
teína inmovilizada debe mantenerse intacta y funcional después de etapas de regeneración repetidas.
Dado que la proteína inmovilizada se usará de manera rutinaria para múltiples análisis que implican ciclos repetidos de
muestras de suero, los analistas deben verificar la estabilidad de la proteína inmovilizada después de los ciclos de rege-
neración. La estabilidad de la proteína inmovilizada se puede monitorear de manera efectiva mediante el rastreo de
las unidades de respuesta después de la regeneración y también después de la adición de un anticuerpo de control
positivo. Si se presenta un cambio en la línea base o una reducción en la magnitud del enlace por parte del anticuer-
po de control positivo, entonces la proteína inmovilizada probablemente ya no sea adecuada para análisis adicionales.
La estabilidad posterior a la regeneración se debe establecer durante el desarrollo de la valoración y se debe confirmar
durante la validación de la valoración. A fin de monitorear el desempeño del sensor durante una valoración, los analis-
tas deben analizar periódicamente una muestra de control positivo durante una corrida de valoración. Si el desempe-
ño de las muestras de control positivo indica que la proteína inmovilizada ha sido comprometida, los analistas deben
reanalizar las muestras de prueba obtenidas después de haberse presentado la caída del desempeño de la valoración
por debajo de los límites aceptables. Los parámetros de aceptación para inmovilización pueden variar para cada com-
puesto y se deben establecer para cada valoración.
Disponibilidadde EpítopesDespuésde la Inmovilización: Una vez que se ha inmovilizado la proteína, se debe con-
firmar la disponibilidad de epítopes múltiples. Idealmente, dicha confirmación se lleva a cabo mediante un análisis para
determinar el enlace de anticuerpos de control positivo con diferente especificidad para epítopes. Un método para ana-
lizar la disponibilidad de epítopes consiste en usar un panel de anticuerpos monoclonales que puedan reconocer dife-
rentes regiones de la proteína. Si la proteína ha sido inmovilizada aleatoriamente, todos los anticuerpos de control posi-
tivo diferentes deben ser capaces de enlazarse. La razón para evaluar la disponibilidad de epítopes es prevenir resulta-
dos falsos negativos al evaluar muestras de suero. Si la inmovilización no es aleatoria, sería posible inmovilizar la proteí-
na de manera uniforme mediante un epítope específico, con lo que el epítope no estaría disponible para enlace por
parte de un anticuerpo. Otra posibilidad es que la modificación química de la proteína para facilitar la inmovilización
haya alterado la conformación de la proteína.
Regeneraciónde la Superficiey EstabilidadSubsiguientede la Proteína: Usando las pautas anteriores, los analistas
deben monitorear la superficie para buscar señales de acumulación y degradación del ligando inmovilizado y desconti-
nuar su uso cuando sea necesario. Por ejemplo, cuando la capacidad de enlace de un anticuerpo de control positivo
(diluido en suero de prueba) caiga por debajo del 80% de su capacidad inicial, no se deberá usar la superficie.
USP42 InformaciónGeneral/ (1105) Métodos de PruebasInmunológicas Resonancia7909
Determinación del Punto de Corte de la Valoración: Al realizar valoraciones para determinar si una muestra de suero
contiene anticuerpos contra una proteína, en ocasiones los analistas observan cierto nivel de enlace de fondo. Dicho
enlace de fondo puede variar dependiendo de la naturaleza de la proteína inmovilizada, así como de la población de
pacientes analizada. Para determinar si una muestra de prueba contiene anticuerpos, los analistas comparan el enlace
con muestras de control que no contienen anticuerpos contra la proteína. Posteriormente, se establece un punto de
corte y, cuando una muestra contiene anticuerpos, el enlace es mayor que dicho punto de corte. Los analistas determi-
nan el punto de corte de la valoración analizando una serie de muestras de suero que no contienen anticuerpos contra
la proteína inmovilizada y realizando posteriormente un análisis estadístico para determinar el nivel de enlace que se
corresponda con el de una muestra que no contenga anticuerpos. El punto de corte debe establecerse usando las mis-
mas condiciones que se emplearán para el análisis de la muestra. Aunque se emplean diferentes metodologías para de-
terminar un punto de corte, una común consiste en establecer la media a partir del enlace de 50-100 muestras de
suero obtenidas de voluntarios saludables y establecer el punto de corte al 95% (equivalente a la media más 1,645
veces la desviación estándar para una distribución normal). Los analistas deben eliminar los valores aberrantes estadísti-
cos de los cálculos, debido a que su inclusión puede ocasionar sesgo elevado y elevar el punto de corte. Dicho punto
de corte más alto resultará en la identificación de un número menor de muestras con anticuerpos contra la proteína
inmovilizada. El punto de corte estadísticamente evaluado es el valor de respuesta unitario que las muestras de suero
deben exceder para que se considere positiva la presencia de anticuerpos contra la proteína terapéutica. Una caracterís-
tica importante de la determinación del punto de corte es que éste puede variar para distintas poblaciones de pacien-
tes. Por ejemplo, pacientes con padecimientos inflamatorios pueden presentar un nivel más alto de reactividad no es-
pecífica en comparación con una población normal. Este nivel mayor de enlace no específico podría resultar en la iden-
tificación de muestras como positiva cuando en realidad no contienen ningún anticuerpo específico para la proteína.
Cuando se presenta dicha situación, se pueden usar muestras de suero predosificadas para establecer una nueva media
específica para la población de pacientes y un punto de corte para la valoración.
Desarrollo y Validación del Procedimiento Analítico: Una vez que se ha confirmado la estabilidad de la proteína in-
movilizada, que se ha definido un procedimiento de regeneración y que se ha establecido un punto de corte, se puede
proceder al desarrollo y validación del método de análisis de anticuerpos. Las condiciones usadas para analizar las
muestras deben ser idénticas a las usadas para establecer el punto de corte de la valoración. Un parámetro importante
a considerar es la dilución óptima de la muestra de suero. Al incrementar el factor de dilución, el enlace no específico
es reducido por las proteínas del suero, pero también se reduce la sensibilidad general. La mayoría de los procedimien-
tos de evaluación de anticuerpos usan suero al 5%-50%. A medida que se reduce el porcentaje de suero que se analiza,
también se reduce el porcentaje de la señal de enlace debida a la interacción no específica y, en consecuencia, se incre-
menta el porcentaje de la señal mediada por anticuerpos que se enlazan con la proteína inmovilizada. Aparte de la dilu-
ción, otros medios para reducir la interacción no específica incluyen la adición de surfactantes, el incremento de la con-
centración salina, la adición de BSAo HSAo la adición de material de sustento para la superficie del sensor tal como
carboximetil dextrano o alginato a la dilución y al amortiguador de corrida.
Otras variables importantes para la optimización incluyen la velocidad de flujo y el volumen de muestra. La combina-
ción de la velocidad de flujo y del volumen de muestra define el tiempo de contacto, que es el tiempo durante el cual
la muestra se encuentra en contacto con la proteína inmovilizada. Entré más tiempo una muestra esté en contacto
con la proteína inmovilizada, mayor será la probabilidad de enlace del anticuerpo. El siguiente aspecto importante a
considerar es la verificación de que el enlace inicial resulte de un anticuerpo y no de algún otro componente del sue-
ro. Lo anterior se puede lograr agregando un reactivo de inmunoglobulina antihumana y monitoreando el enlace sub-
siguiente. Si el enlace inicial observado se debe a un anticuerpo antiproteína, este reactivo se enlazará con dicho anti-
cuerpo (el anticuerpo antiproteína se mantiene enlazado a la proteína inmovilizada). Cuando la proteína inmovilizada
es un anticuerpo monoclonal terapéutico, se debe examinar y verificar que el reactivo confirmatorio no se enlace di-
rectamente con el anticuerpo monoclonal terapéutico inmovilizado. Una opción para este caso es la inmovilización
del fragmento Fab' en lugar del anticuerpo monoclonal terapéutico intacto. Se debe verificar la especificidad del reac-
tivo confirmatorio. Una vez que se han optimizado todos los parámetros, es posible validar la valoración. La validación
de parámetros incluye aquéllos asociados típicamente con ensayos de inmunogenicidad (precisión, especificidad, sen-
sibilidad y robustez) así como parámetros específicos de las valoraciones de RPS(inmovilización de la proteína, estabi-
lidad de la superficie inmovilizada y número de ciclos de regeneración).
Interferencia de los Componentes del Suero: Dependiendo de la proteína inmovilizada, es posible que los compo-
nentes del suero distintos a los anticuerpos específicamente dirigidos contra la proteína inmovilizada se enlacen con la
superficie inmovilizada. Asimismo, es posible que se presenten componentes del suero que bloquean la capacidad de
los anticuerpos para enlazarse con la proteína inmovilizada. Ambos componentes se pueden evaluar analizando el enla-
ce de las muestras de suero obtenidas de la población diana que se sabe carecen de anticuerpos contra la proteína
inmovilizada y, posteriormente, monitoreando para determinar si ocurre algún enlace. Si se identifica un enlace no es-
pecífico, se pueden tomar acciones para reducirlo o eliminarlo. Estas acciones pueden incluir el pretratamiento de
muestras para eliminar el reactivo no específico, la adición de surfactante o la alteración de la concentración salina en
los amortiguadores
de muestraparareducirel enlaceno específico.
Los analistas deben verificar que las muestras de suero no contengan agentes que sean capaces de inhibir el enlace del
anticuerpo con la proteína inmovilizada (éstos pueden incluir formas solubles de la proteína inmovilizada o receptores
~;,~"
~,~;
1
791 O (1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas Resonancia / InformaciónGeneral USP42
solubles que podrían enlazarse con la proteína inmovilizada y bloquear el enlace de los anticuerpos con la misma). Los
analistas pueden agregar el anticuerpo de control positivo a las muestras de suero dianas y evaluar el enlace. Si las
muestras de suero dianas presentan una inhibición del enlace en comparación con el enlace con muestras de suero
humano normal, se pueden tomar acciones para eliminar el agente inhibidor. Si no se identifica la interferencia del
suero diana, podrían generarse resultados falso positivos o falso negativos.
Implementación de EnsayosMultiplex: Cuando una proteína terapéutica es un producto de segunda generación que
ha sido modificado a partir de una proteína terapéutica original (p. ej., mediante pegilación o glicosilación aumenta-
da), la presencia de anticuerpos contra el producto original y de segunda generación deberá evaluarse simultáneamen-
te. Esto se puede lograr inmovilizando cada proteína en canales separados en el dispositivo para microfluidos y permi-
tiendo que las muestras de suero se enlacen en serie o en paralelo con ambas proteínas inmovilizadas. La justificación
para analizar el enlace con la proteína terapéutica original y la modificada es que los anticuerpos generados contra la
proteína modificada podrían tener también una especificidad de enlace con la proteína original. Como parte de la ca-
racterización de la respuesta inmune, los analistas deben entender la especificidad de los anticuerpos para los produc-
tos de primera y segunda generación. Cuando sea posible, también se puede analizar el enlace con un equivalente en-
dógeno mediante la inmovilización de la proteína endógena en una celda o canal de flujo distintos.
Caracterizaciónde AnticuerposAnti-ProteínasTerapéuticas: Una vez que los anticuerpos contra una proteína tera-
péutica han sido capturados enlazándolos con la proteína terapéutica inmovilizada, será posible caracterizar dichos an-
ticuerpos. Las características importantes de anticuerpos contra las proteínas terapéuticas que se pueden estudiar inclu-
yen la afinidad de enlace relativa, la cantidad de anticuerpos presentes en la muestra de suero, los isotipos de anticuer-
pos presentes en la muestra y la especificidad del enlace.
Mediante el monitoreo de la velocidad a la que disminuyen las unidades de respuesta después de concluida la adición
de la muestra al sensor, los analistas pueden determinar la afinidad relativa de los anticuerpos. Una velocidad elevada
de disociación es característica de un anticuerpo de baja afinidad, mientras que una velocidad de disociación baja su-
giere la presencia de anticuerpos de alta afinidad. Resulta útil comparar las velocidades de disociación tanto con el
anticuerpo de control positivo (generalmente una preparación de anticuerpos de alta afinidad) como con un panel de
anticuerpos monoclonales con afinidades de enlace conocidas.
La concentración activa relativa de los anticuerpos presentes en una muestra se puede estimar comparando la señal de
enlace con la señal producida a partir de una serie de diluciones del control positivo. Los analistas pueden generar una
curva estándar a partir del estándar y pueden comparar la concentración activa de anticuerpos en la muestra con di-
cha curva estándar. Debido a que el control positivo no remeda con exactitud la mezcla de anticuerpos contenida en
la muestra-de hecho, el control positivo a menudo se obtiene a partir de animales hiperinmunizados tales como co-
nejos-el valor de concentración obtenido es relativo al del estándar. Este valor únicamente se aproxima a la concen-
tración real de anticuerpos humanos. Debido a que se puede usar el mismo control positivo en todo el desarrollo quí-
mico, los analistas pueden comparar la cantidad de anticuerpos obtenidos a partir de sujetos diferentes usando esta
estrategia. Puesto que la señal del instrumento es proporcional a la masa que se enlaza al sensor, resulta valioso este
tipo de análisis. Los analistas deben considerar que los anticuerpos lgM tienen cinco veces la masa de los anticuerpos
lgG. Otra metodología para determinar la concentración de anticuerpos se describe en la sección de análisis de la
concentración de este capítulo (ver la Aplicación 2 a continuación).
El isotipo de anticuerpos capturados se puede determinar fácilmente monitoreando el enlace asociado con la adición
secuencial de reactivos para isotipificación. Por ejemplo, si los anticuerpos lgM están presentes y se han enlazado con
la proteína inmovilizada, la adición de un reactivo anti lgM humana producirá una señal adicional. Los reactivos para
isotipificación se pueden encontrar con especificidad para lgM, lgG, lgE, lgA, lgGl, lgG2, lgG3 e lgG4. Debido al im-
pedimento estérico, puede ser necesario que los analistas repitan los análisis de isotipificación en diferentes secuencias
para tener certeza de que la presencia de reactivos para isotipificación previamente enlazados no haya obstaculizado
los análisis subsiguientes. Por ejemplo, supóngase que una muestra contiene anticuerpos lgGl e lgG4 contra una pro-
teína y que ambas muestras se han enlazado con la proteína inmovilizada. Debido a que el reactivo de isotipifiación
anti-lgGl se ha enlazado con los anticuerpos lgGl, el reactivo de isotipificación enlazado a éstos puede evitar que el
reactivo anti lgG4 agregado subsiguientemente no reaccione con el lgG4, y la presencia del lgG4 permanecería sin
ser descubierta. Los analistas concluirán que únicamente están presentes los anticuerpos lgGl, pero si el orden de adi-
ción de los reactivos de isotipificación se revirtiera, se descubrirían los anticuerpos lgG4. Este ejemplo subraya la im-
portancia de interpretar con cuidado los resultados de la isotipificación. Esto representa un problema para análisis
subsiguientes únicamente si se observa un enlace derivado de un ciclo previo de adición de reactivo de isotipificación.
La especificidad de los reactivos de isotipificación se debe confirmar antes de su uso. Por ejemplo los analistas deben
verificar que un reactivo anti lgG humana se enlaza únicamente con lgG humana y no presenta una reacción cruzada
con la lgM humana.
La región de la proteína terapéutica reconocida por los anticuerpos en ocasiones puede determinarse mediante la in-
movilización de versiones de la proteína que hayan sido truncadas, que tengan mutaciones puntuales o que conten-
gan únicamente un fragmento de la proteína. Si los anticuerpos no son capaces de enlazarse con la versión modifica-
da de la proteína, esto podría sugerir que el epítope hacia el que se dirigió el anticuerpo se vió influenciado por el
cambio. Se debe tener en mente que las mutaciones y truncamientos puntuales no solo influencian a la secuencia
primaria de una proteína, sino que también pueden influir la estructura terciaria (p. ej., multiplicación, conformación)
de una proteína. Asimismo, un sujeto es propenso a generar una población de anticuerpos con diferentes especificida-
des para una variedad de epítopes. A pesar de esta cuestión, la estrategia descrita puede ser útil para identificar la
región en la proteína en la que los anticuerpos se están enlazando.
Aplicación2-Análisis de la Concentración: La RPSse puede usar para determinar la concentración de productos bio-
lógicos en sistemas amortiguadores definidos, p. ej., eluatos de columnas de purificación, amortiguadores de la formula-
ción y mezclas complejas tales como suero, caldos de fermentación, extractos celulares crudos y suspensiones celulares.
La concentración de un analito se mide por su enlace con el ligando específico u otras moléculas que pueden interactuar
con cualquier porción del analito. La concentración del analito se determina en una superficie en la que se inmoviliza el
ligando específico del analito o un reactivo de captura específico del analito. Se determina la velocidad de enlace o la
masa del analito enlazado y la concentración del analito se calcula usando una curva estándar obtenida a partir de una
serie de concentraciones de un material de referencia purificado y bien caracterizado o mediante un análisis exento de
calibración que se basa en la relación entre las propiedades de difusión del analito y la concentración absoluta del anali-
to.
Inmovilizacióndel Ligando: Para determinar la concentración, el ligando se inmoviliza de manera covalente o de ma-
nera no covalente en la superficie. Los analistas seleccionan un mecanismo de acoplamiento apropiado y el método
químico para asegurar la integridad funcional del ligando. A fin de proporcionar las condiciones que favorezcan una
independencia parcial o total de parámetros cinéticos, resulta deseable una densidad alta de la superficie del ligando.
Una superficie con alta densidad permite que el analito se enlace con el ligando en condiciones que limitan el transpor-
te de masa. La interacción entre el analito y el ligando se puede describir mediante el siguiente proceso de dos etapas:
A~ +B
Asuperfoie k AB
kd
en donde A es la concentración de analito en la muestra, Awpema, es la concentración del analito en la superficie del
sensor, kmes el coeficiente de transporte de masa, Bes el ligando inmovilizado, AB es el complejo analito-ligando y kª
y kdson las constantes de velocidad para la reacción de asociación entre A y By para la reacción de disociación del
complejo respectivamente. El coeficiente de transporte de masa kmdepende de la velocidad de flujo, de las dimensio-
nes de la celda de flujo y del coeficiente de difusión del analito. El analito primero debe transportarse de la muestra a
granel a la superficie del sensor para que reaccione con las moléculas del ligando inmovilizado. Si este transporte de
masa del analito es mucho más rápido que la etapa de asociación entre ligando y analito, el enlace general observado
será dirigido por la constante de la velocidad de asociación de A con By por la constante de la velocidad de disocia-
ción del complejo AB, un prerequisito para determinar con exactitud los parámetros cinéticos. Si el transporte de ma-
sa del analito es mucho más lento que la etapa de asociación, el enlace será limitado por el proceso de transporte de
masa y los parámetros cinéticos para la interacción específica entre A y B serán difíciles de obtener. No obstante, estas
condiciones son deseables para determinar la concentración activa de un analito. Una alta densidad del ligando en la
superficie del sensor y velocidades de flujo más lentas favorecen un transporte de masa limitado. Entre estos extre-
mos, el enlace general se determina mediante contribuciones del transporte de masa y de la cinética de interacción.
Puede no ser posible lograr condiciones limitadas de transporte de masa para análisis de concentración de interaccio-
nes con constantes de velocidad de asociación baja (p. ej., kª = 104 M- 1s-1).
El ligando y el material de referencia del analito deben tener una pureza suficiente y se debe poner especial atención a
la presencia de material agregado. Los agregados del analito pueden interferir con la regeneración de la superficie del
ligando debido a que pueden enlazarse con múltiples sitios de enlace.
El material de referencia debe ser comparable (p. ej., peso molecular y parámetros cinéticos) con las muestras de prue-
ba. En ciertas condiciones la concentración activa en las muestras desconocidas se puede determinar usando un pro-
cedimiento exento de calibración que se basa en la relación entre las propiedades de difusión del analito y la concen-
tración absoluta del mismo. Estas dos metodologías se describen más adelante por separado.
Determinaciónde la Concentracióncon una CurvaEstándarde Referencia: En las valoraciones típicas para deter-
minar la concentración, la concentración del analito se calcula a partir de una curva estándar que se obtiene con un
material de referencia que se inyecta usando concentraciones seleccionadas. Se pueden usar tres metodologías distintas
para medir la concentración con una curva de calibración estándar de referencia:
Valoraciónde EnlaceDirecto: Determina la cantidad de analito enlazado después de un tiempo de inyección de
muestra fijo y arbitrario. Se puede realizar un método de emparedado como extensión de la metodología de enlace
directo de una sola etapa para incrementar la sensibilidad de la valoración.
Determinaciónde la Velocidadde Enlace: Determina la velocidad de enlace inicial para una muestra en lugar de la
cantidad enlazada. En las condiciones de enlace limitado por transporte de masas, la velocidad de enlace es directa-
mente proporcional a la concentración de analito e independiente de la cinética de enlace. Esto permite medir la con-
centración de moléculas relacionadas que pudieran tener características de enlace distintas.
Ensayosde Inhibicióno Competencia: Se puede usar un ensayo de inhibición cuando el mecanismo de acción para
un analito depende de su enlace con un ligando soluble y, por tanto, se afecta la interacción ligando-receptor. En el
ensayo de inhibición, se acopla un receptor a la superficie del sensor mediante enlace covalente. La interacción entre
el analito y el ligando soluble se mide indirectamente mezclando una concentración fija de ligando con concentracio-
nes variadas del analito, e inyectando la mezcla ligando-analito en toda la superficie del receptor inmovilizado. Asi-
mismo, se pueden usar métodos competitivos en solución para moléculas y partículas grandes, tales como virus, y
para analitos pequeños que presentan respuestas directas bajas. En los sistemas paralelos, el ensayo se puede diseñar
para que las muestras estándar y la muestra desconocida se inyecten en paralelo. Este método puede ser útil para
ligandos que son difíciles de regenerar.
Los analistas pueden graficar la señal (cantidad enlazada o velocidad de enlace) de los estándares de referencia en fun-
ción de las concentraciones y luego generar una curva estándar empleando un modelo matemático apropiado, como
por ejemplo, un ajuste de curva lineal o de cuatro parámetros. Las muestras se pueden inyectar en una o más dilucio-
nes. Es posible emplear unas pocas diluciones cuando se ha demostrado una relación lineal entre la muestra y el es-
tándar de referencia. Las concentraciones de muestras desconocidas se obtienen mediante retrocálculos a partir de
una curva estándar o, si se analizan con las mismas concentraciones diana que las de la curva del estándar referencia,
mediante comparación de los parámetros para el ajuste de la curva.
Los parámetros que pueden influir sobre el desempeño y los resultados del ensayo incluyen, pero no se limitan a la
velocidad de flujo, la densidad del ligando en la superficie, la pureza de la muestra, la matriz de las muestras y la re-
producibilidad de la regeneración de la superficie. Estos parámetros deben evaluarse durante la calificación o valida-
ción del ensayo. La interferencia con el enlace del analito al ligando inmovilizado se puede minimizar mediante sales,
detergentes o material de sustento para la superficie del sensor. Una superficie de sensor comúnmente usada consta
de dextrano carboximetilado, por lo que la adición de dextrano al amortiguador de dilución muestra puede minimi-
zar las interacciones no específicas. También pueden usarse inyecciones en una superficie de control negativo para
restar matemáticamente los datos de enlace no específico de los datos obtenidos en la superficie positiva. Una valora-
ción RPScalificada o validada para la determinación de la concentración debe incluir muestras de Control de Calidad
que sirvan como medida para determinar la exactitud de la curva estándar que se ha preparado para analizar mues-
tras con una concentración de analito desconocida. Dichas muestras pueden prepararse convenientemente en parti-
das más grandes, calificarlas para su uso con un Certificado de Análisis para la concentración diana y almacenarlas en
pequeñas alícuotas en condiciones adecuadas de almacenamiento.
Después de cada inyección de analito, se regenera la superficie del ligando y se elimina todo el analito enlazado. Esta
regeneración debe ser lo suficientemente fuerte como para eliminar todo el analito enlazado, pero las condiciones
también deben dejar intacto el ligando inmovilizado para que las inyecciones puedan ser comparardas entre sí.
Determinación de la Concentración Sin Calibración: Las valoraciones de concentración exentas de calibración se ba-
san en la relación entre las propiedades de difusión del analito y la concentración absoluta del mismo. Los analistas
pueden derivar la concentración de analito midiendo la velocidad de enlace inicial, siempre que se conozcan propieda-
des específicas el analito y del ambiente analítico. Esta metodología es útil cuando no se dispone de un estándar de
referencia satisfactorio.
Para determinar la concentración de analito en una muestra, los analistas emplean la relación entre la velocidad de en-
lace inicial y la concentración de analito. En una superficie de sensor con un alto nivel de inmovilización, la velocidad
de enlace inicial (pendiente) se puede describir como una función del peso molecular, del coeficiente de transporte de
masa kmy de la concentración de analito. Antes de analizar una muestra, los analistas deben determinar el coeficiente
de transporte de masa. Éste depende del coeficiente de difusión (O), de la velocidad de flujo y de las dimensiones de
la celda de flujo, y se describe mediante la siguiente fórmula:
k
m
= o 98 X
'
3 ° 2
Xf
0,3xh 2 xwx/
en donde O es el coeficiente de difusión, fes la velocidad de flujo y h, w y / son la altura, ancho y longitud de la celda,
respectivamente. La velocidad de flujo y las dimensiones de la celda a menudo se conocen para un instrumento deter-
minado, mientras que el coeficiente de difusión se determina por el tamaño y la forma de la molécula usando herra-
mientas específicas del instrumento, referencias de la literatura o experimentos, p. ej., mediante ultracentrifugación
analítica o dispersión de luz.
En una configuración experimental típica, la evaluación requiere dos velocidades de flujo. Mediante el uso de medicio-
nes a dos velocidades de flujo distintas, los analistas pueden evaluar la influencia que tiene la velocidad de flujo sobre
la velocidad de enlace. La robustez de la valoración también se mejora ajustando los datos obtenidos a dos velocida-
des de flujo distintas, lo que en consecuencia proporciona dos valores distintos para km(debido a que kmdepende de
la velocidad de flujo), a un modelo con una variable global para concentración de analito (de tal manera que el mo-
delo se limita a encontrar un solo valor de concentración que mejor se ajuste a ambas curvas simultáneamente).
El análisis de concentración exento de calibración es adecuado únicamente para proteínas con MW ;>:5000 Da. Éste re-
quiere una rápida asociación analito-ligando (kª > 5 x 104 M-1s-1) y no puede manejar mezclas de analitos con propie-
dades de difusión distintas. El intervalo dinámico del método es aproximadamente 0,05-5 µg/ml.
Aplicación 3-Análisis Cinético y de Afinidad: Debido a su capacidad para detectar interacciones de enlace en tiempo
real, la RPS provee información valiosa sobre la cinética de la formación y disociación de complejos. Los instrumentos
para RPSse pueden usar para determinar las constantes de velocidad de asociación y disociación para una interacción de
enlace en particular, y dichos valores se pueden usar posteriormente para calcular la constante de equilibrio de disocia-
ción (K0 = kjkJ. Obtener K0 a partir de un cociente de kª y kd es útil cuando la interacción de enlace no alcanza el equili-
USP42 InformaciónGeneral/ (1105) Métodos de PruebasInmunológicas Resonancia7913
brio en un marco de tiempo adecuado para un experimento de enlace con RPS. Para interacciones de enlace que alcan-
zan el equilibrio (la velocidad de formación del complejo es igual a la velocidad de degradación del complejo) en minu-
tos (vs. horas), K0 se puede determinar directamente de una respuesta de enlace en estado de equilibrio. El tiempo re-
querido para alcanzar el equilibrio se ve influenciado por la velocidad de disociación, por lo que los complejos que que
presentan una rápida disociación (p. ej., kd= 10-2 s-1) alcanzarán el equilibrio más rápido que los de lenta disociación (p.
ej., kd= 10-5 s-1). Los programas de software capaces de simular la cinética de enlace 1:1 son útiles para predecir el tiem-
po requerido para alcanzar el equilibrio. El intervalo de trabajo típico para mediciones de afinidad con instrumentos de
RPSdisponibles comercialmente es de 10-12 M (pM) a 1Q--4M (µM).
Se requiere un diseño experimental adecuado para medir con exactitud k,,,kdy K0 . Son varias las preguntas que se de-
ben considerar al diseñar análisis cinéticos o experimentos de afinidad en estado de equilibrio, las cuales incluyen:
• ¿Qué compañero de enlace debe inmovilizarse?
• ¿Cómo inmovilizará el analista uno de los compañeros de enlace?
• ¿Qué tipo de superficie de referencia se debe usar?
• ¿Qué cantidad del compañero de enlace debe inmovilizarse?
• ¿Mantiene el compañero de enlace su actividad después de la inmovilización?
• ¿Es específico el enlace con el compañero de enlace inmovilizado?
• Si fuera necesario, ¿Qué condiciones de regeneración deben usarse?
Al seleccionar cuál compañero de enlace se va a inmovilizar para la mayoría de las interacciones proteína-proteína, los
analistas deben considerar diversos factores: (1) la pureza y disponibilidad de las proteínas, (2) la presencia de una eti-
queta o grupo funcional que ayude con la inmovilización, (3) el mantenimiento de la actividad biológica y (4) la valen-
cia del enlace (p. ej., enlace monovalente vs. multivalente).
Es necesaria una superficie de referencia para todos los experimentos de análisis cinéticos y de afinidad detallados. Si se
usa la inmovilización directa, se debe crear una superficie de referencia usando el mismo protocolo de inmovilización,
omitiendo la proteína durante el paso de acoplamiento. Alternativamente, se puede usar una forma mutante de la pro-
teína con un sitio de enlace modificado. La superficie de referencia para la captura de alta afinidad a menudo consiste
en la molécula de captura sin compañero de enlace o emplea una molécula no relacionada para una superficie de cap-
tura simulada. Para el caso específico de las interacciones anticuerpo-antígeno, un anticuerpo monoclonal no relacio-
nado generalmente funciona como el reactivo de captura en la superficie de referencia.
Después de decidir la metodología de inmovilización, los analistas deben decidir qué cantidad del compañero de enlace
se va a inmovilizar. Para análisis cinéticos, el aspecto primario a tomar en cuenta se centra en minimizar la densidad de
la superficie para evitar el enlace limitado por transporte de masa de la molécula del analito con el compañero de enla-
ce inmovilizado. Asimismo, los analistas deben considerar el nivel de inmovilización al realizar análisis de afinidad en
estado de equilibrio puesto que los niveles elevados de inmovilización pueden ocasionar impedimento estérico o indu-
cir efectos secundarios tales como enlace no específico o agregación.
Antes de llevar a cabo un experimento cinético o un análisis de afinidad en estado de equilibrio, los analistas deben eva-
luar la actividad de la superficie inyectando la molécula del analito con una sola concentración. La concentración debe
ser lo suficientemente alta como para que la respuesta de enlace en equilibrio provea una aproximación cercana de la
respuesta máxima experimental (Rmá,)-Esta condición a menudo se cumple cuando la concentración de la molécula
diana es al menos 1O veces mayor que la K0 de la interacción del enlace. Para una interacción proteína-proteína con un
valor K0 de 100 pM, esto significa que la molécula diana se debe inyectar con una concentración de al menos 1 nM.
Usando la ecuación para Rmáx(Ecuaciones1 y 2), los analistas pueden calcular la Rmáxteórica, basándose en la cantidad
de compañero de enlace inmovilizado o capturado. Si la Rmáxexperimental excede la Rmá,teórica, entonces la molécula
del analito es más grande de lo esperado o la estructura del analito existe en un orden más alto del esperado (p. ej.,
después de la agregación o como un multímer). Si la Rmáxexperimental es significativamente menor (<50%) que la Rmáx
teórica, esto sugiere que el procedimiento de inmovilización ha comprometido al sitio de enlace y que debe investigar-
se un procedimiento de inmovilización alternativo. Una ventaja de usar una captura de alta afinidad en lugar del aco-
plamiento directo es que la actividad de la superficie por lo general se mantiene cercana al 100%, siempre y cuando la
actividad específica del compañero de enlace inmovilizado sea del 100% antes de la captura.
Inyectar la molécula en toda la superficie de referencia también proporciona una evaluación rápida de la cantidad de
enlace no específico que existe en la superficie del sensor. El enlace no específico de naturaleza electrostática se puede
eliminar o reducir mediante la adición de sal (p. ej., NaCI 0,5-1,0 M) al amortiguador de dilución de muestra y al
amortiguador de corrida, o usando superficies de sensor con una baja densidad de carga. El enlace no específico que
surge por las interacciones hidrófobas se puede minimizar o eliminar agregando detergentes, tales como Polisorbato
20 al 0,05% o CHAPS1O mM, al amortiguador de dilución de muestra y al amortiguador de corrida. Antes de usar
aditivos en los amortiguadores, los analistas deben analizar si la actividad de enlace o la interacción de enlace específi-
cas podrían verse afectadas. El enlace no específico con una molécula de captura se puede resolver cambiando a una
molécula de captura distinta. Reducir la densidad de la superficie también puede eliminar el enlace no específico.
Muchas interacciones proteína-proteína se disocian lentamente (kd= 10-3 a 10-6 s-1), con vidas medias de los complejos
(t 112) de más de 2 horas. Una etapa de regeneración es importante para estos tipos de interacciones de enlace.
En algunas interacciones proteína-proteína, puede no ser posible regenerar la superficie debido a una interacción de en-
lace de alta afinidad entre las moléculas. Si esta situación se presenta, los analistas pueden considerar un experimento
cinético de valoración volumétrica o el uso de instrumentos que sean capaces de realizar las inyecciones de analitos de
forma paralela. En una valoración volumétrica cinética, se inyectan concentraciones crecientes de la molécula diana de
manera consecutiva en toda la superficie inmovilizada y los datos resultantes se analizan usando un modelo cinético de
valoración volumétrica. En instrumentos paralelos, la serie de concentraciones del analito se inyecta en un solo paso,
con lo que se elimina la necesidad de regeneración.
La regeneración de la superficie a menudo no se lleva a cabo en experimentos de afinidad en estado de equilibrio debi-
do a que las interacciones de enlace en este tipo de experimentos tiene valores kd en el intervalo de 10~2 a 0,5 segun-
dos-1 y, por lo tanto, tienen valores t 112 de <2 minutos. El analito enlazado se disocia de la superficie a medida que el
amortiguador fluye sobre la misma, por lo que no se requiere de regeneración.
Los analistas deben tener una concentración exacta de analito para los análisis cinéticos puesto que el cálculo de kª de-
pende de la concentración del analito. Por lo general, se emplea para este propósito una lectura de absorbancia a una
longitud de onda de 280 nm (A280 ), pero los analistas deben recordar que el valor A280 refleja la proteína bruta total y
en solución y no refleja la concentración real de proteína que es capaz de enlazarse (es decir, la concentración activa).
Se deben incluir por duplicado inyecciones de diluyente de muestra para experimentos cinéticos y de afinidad en estado
de equilibrio a fin de eliminar durante el proceso de evaluación de datos las respuestas no específicas debidas al instru-
mento o al diluyente de muestra.
El intervalo de concentración de analito recomendado es 1O veces por debajo y por encima de K0 para la interacción.
Manteniendo la densidad de la superficie baja (Rmáx = 5-50 RU)y extendiendo el tiempo de asociación, los analistas
deben ser capaces de recolectar datos con suficiente curvatura para definir con exactitud los valores de kª y kd. Cuando
la afinidad de la interacción es alta (K0 = baja nM a pM), pueden ser necesarias concentraciones más altas del analito
para construir un perfil cinético con curvatura suficiente para completar el análisis cinético. Incrementar la concentra-
ción del analito no debe usarse como sustituto para cambiar otros parámetros del diseño experimental (p. ej., densidad
de la superficie y tiempo de contacto). Aunque resulta deseable emplear concentraciones del analito que se aproximen
a Rm6., en pocas ocasiones las altas concentraciones podrán inducir la agregación del analito en solución o el enlace no
específico con la superficie.
Dentro de una serie de concentraciones del analito, se deben usar muestras repetidas para evaluar la actividad superfi-
cial. Asimismo, cada serie de concentraciones se debe analizar de 3-5 veces usando superficies distintas para establecer
intervalos de confianza para las constantes de cinética y afinidad resultantes.
La cantidad de datos que se recolectan durante un experimento cinético o de afinidad en estado de equilibrio afecta la
exactitud de los resultado. Para experimentos cinéticos que implican interacciones con valores kd bajos, los analistas de-
ben recolectar suficientes datos de disociación para poder obtener una respuesta de disociación mensurable (vs. ruido
del instrumento). Por ejemplo, una interacción de enlace entre un anticuerpo monoclonal terapéutico y su molécula
diana que tiene un valor kd de 10-5 segundos- 1 requerirá una recolección de por lo menos 4 horas de datos de disocia-
ción. En vez de recolectar dicha cantidad de datos de disociación para todas las concentraciones de analito, los analis-
tas pueden usar un tiempo largo de disociación para la concentración más alta de analito que se inyectará y pueden
emplear u tiempo de disociación corto (2-5 minutos) para todas las demás concentraciones de analito. Usando instru-
mentos de inyección paralela es posible recolectar los largos datos de disociación para todas las concentraciones. Para
evaluar los datos, los analistas deben recolectar datos de tiempos de disociación largos y cortos para las inyecciones de
diluyente de muestra. Para experimentos de afinidad en estado contante, el tiempo de inyección del analito debe ser lo
suficientemente largo como para permitir que ocurra una respuesta de enlace en estado de equilibrio con todas las
concentraciones de analito analizadas. No es necesario recolectar los datos de disociación para un experimento de afi-
nidad en estado de equilibrio, puesto que éstos no se usan en la evaluación de este tipo de experimento, pero se re-
quiere la disociación completa del analito antes de comenzar la siguiente inyección.
Uso de la RPS en un Ambiente Reglamentado
Cuando las valoraciones de RPSse emplean para análisis de liberación de lote y de estabilidad, la valoración debe existir dentro
de un entorno controlado de modo que se puedan tomar decisiones sobre el uso del producto dentro del ambiente clínico o
comercial. El instrumental para RPS,incluyendo el software, debe cumplir con los requisitos de la Parte 11 del Título 21 del
CFRy debe ser susceptible a la validación. Estos requisitos son importantes debido a que ayudan a asegurar la integridad
tanto de la adquisición como de la evaluación de los datos.
Además del uso de instrumental para RPSque cumpla con los requisitos reglamentarios, los analistas deben establecer criterios
de aptitud del sistema para una valoración por RPS.Incluir dichos criterios en una valoración por RPS asegura que los resulta-
dos obtenidos para la muestra de prueba se generen mediante una valoración cuyo desempeño se encuentre dentro de sus
parámetros operativos. El alcance de este capítulo no abarca la discusión sobre la evaluación de los parámetros de aptitud
del sistema, pero se recomienda al lector referirse a los capítulos generales de la USP, Diseñoy Análisisde ValoracionesBiológi-
cas(111) y Análisisde ValoracionesBiológicas(1034) para análisis más detallados. Algunos ejemplos de parámetros de aptitud
del sistema para una valoración por RPS pueden incluir:
• densidad de inmovilización del ligando
• parámetros a partir de un modelo de ajuste de curva (p. ej., un ajuste de curva logístico de cuatro parámetros)
- valores de EC50 para la curva estándar de referencia y una curva de Control de Calidad positiva
-Asíntotas efectivas (intervalo de respuesta) para una curva estándar de referencia y una curva de Control de Cali-
dad positiva
USP42 InformaciónGeneral/ (1106) Ensayosde lnmunogenicidad lnmunoensayos 7915
- R2 valores para una curva estándar de referencia y una curva de Control de Calidad positiva
- paralelismo entre una curva estándar de referencia y una curva de Control de Calidad positiva
• actividad biológica relativa para Control de Calidad positivo (cociente EC50 entre el estándar de referencia y el control
positivo)
• concentración calculada para Control de Calidad positivo (medición de Control de Calidad Positivo de un solo punto)
• respuesta de enlace para Control de Calidad negativo (analito o diluyente no específico)
Se deben usar múltiples lotes de ligando, analito, reactivos de acoplamiento y superficies para establecer criterios de aptitud
del sistema de valoración que reflejen condiciones normales de valoración. Se debe dar seguimiento a los resultados de valo-
ración para las muestras de estándar de referencia y de Control de Calidad. Se deben aplicar análisis regulares de tendencias
a los datos para comprobar que la valoración por RPS permanece controlada durante su ciclo de vida requerido. Si se obser-
van tendencias en los datos, se pueden tomar acciones correctivas de manera proactiva para prevenir futuras fallas.
Para las valoraciones por RPSque se usan en el análisis de liberación de lote, también es importante establecer criterios de
aceptación de la muestra. Estos criterios se usan para aceptar o rechazar los datos de muestra y pueden incluir:
• bioactividad relativa para la muestra de prueba
• coeficiente de variación (CV) para determinaciones repetidas de la muestra
• paralelismo entre la curva estándar de referencia y curva de Control de Calidad postiva
Otro punto a considerar para valoraciones por RPSen ambientes reglamentados es la identificación de reactivos críticos y no
críticos. Los reactivos no críticos por lo general incluyen amortiguadores de acoplamiento, de regeneración y de flujo conti-
nuo (corrida). Los reactivos críticos a menudo incluyen el ligando y el analito para ensayos de enlace directo, y el ligando,
analito y molécula competidora en ensayos de enlace por inhibición. Los reactivos críticos deben someterse de manera ruti-
naria a calificación/recalificación para asegurar que son adecuados para su uso en la valoración por RPS. El alcance de este
capítulo no comprende las mejores prácticas para la caracterización de reactivos oficiales, por lo que se recomienda al lector
referirse a los documentos reglamentarios vigentes correspondientes. Se recomienda a los analistas usar documentos regla-
mentarios vigentes, tales como las Pautas de la ICH Q2(Rl) Validation of Analytical Procedures y el Capítulo General de los
compendios USP-NFValidaciónde ProcedimientosFarmacopeicos (1225) para validar valoraciones por RPS en un laboratorio
reglamentado.
(1106) ENSAYOSDE INMUNOGENICIDAD-DISEÑO Y VALIDACIÓN

DE INMUNOENSAYOSPARADETECTAR ANTICUERPOS
ANTIFÁRMACOS
INTRODUCCIÓN
Y ALCANCE
La inducción de anticuerpos antifármacos (ADA,por sus siglas en inglés) puede ocurrir cuando los sistemas inmunes anima-
les o humanos reconocen un medicamento proteico como extraño. La administración de productos biofarmacéuticos puede
inducir la formación de anticuerpos antifármacos específicos del producto, además de que diversos tipos de respuestas de anti-
cuerpos antifármacos se pueden desarrollar tanto en estudios clínicos como no clínicos. [NOTA-El Apéndicecontiene una lista
de documentos reglamentarios, informes oficiales y otras referencias pertinentes.] Aunque el enfoque principal de este capítulo
es el diseño y la validación de inmunoensayos para anticuerpos antifármacos, también se incluye información sobre la estrate-
gia general del análisis del ensayo de inmunogenicidad basado en riesgos que incluye estudios preclínicos y clínicos.
Los resultados del ensayo de anticuerpos antifármacos son directamente influenciados por el diseño del ensayo, los reactivos,
la forma en que se realiza, las muestras que se corren (tiempo de recolección de muestras, etc.) y la forma en que se analizan
los datos. De hecho, resulta esencialmente imposible comparar los resultados de estudios que emplean ensayos diferentes de
anticuerpos antifármacos. Las pautas, tales como este capítulo de información general, que recomiendan las mejores prácticas
y consideraciones para el desarrollo de ensayos de anticuerpos antifármacos ayudan a asegurar que los ensayos produzcan re-
sultados significativos parala seguridad del paciente y la eficacia del producto.
La principal preocupación derivada de la inmunogenicidad no deseada o no prevista de productos biológicos yace en si los
anticuerpos producidos por los pacientes que reciben el producto podrían llevar a algún tipo de respuesta clínica (p. ej., efec-
tos sobre la seguridad o la eficacia del tratamiento). La utilidad e interpretación de los estudios toxicológicos preclínicos tam-
bién se puede ver influenciada por la presencia de anticuerpos antifármacos.
La farmacocinética o la actividad farmacológica del fármaco se puede ver alterada por anticuerpos antifármacos que mejoran
o reducen la eliminación del producto, alteran la biodisponibilidad o inhiben o exacerban la acción farmacológica del fármaco.
Cuando existe un equivalente endógeno de un fármaco, los anticuerpos antifármacos que inhiben la actividad del producto
también pueden ligarse y provocar reacciones cruzadas con la proteína endógena contraparte del producto, lo que podría
conducir a un síndrome de deficiencia. Ante ciertas circunstancias, los anticuerpos antifármacos pueden formar complejos in-
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munes capaces de inducir respuestas clínicas del tipo de la enfermedad del suero. Asimismo, las respuestas de los anticuerpos
antifármacos de isotipo lgE pueden generar anafilaxis.
El rol de las evaluaciones de inmunogenicidad va en crecimiento en el desarrollo de productos biofarmacéuticos como parte
de las Evaluaciones de Riesgos para la Calidad del Producto y en la evaluación de la criticidad de los atributos de calidad (con-
forme a lo descrito en las pautas QS y Q9 de la ICH). Asimismo, son de utilidad para demostrar la comparabilidad de procesos
y productos tras la aplicación de cambios en el proceso de fabricación. Frecuentemente, el proceso de fabricación de un pro-
ducto terapéutico biológico se irá perfeccionando durante el desarrollo clínico, mientras que los cambios generalmente ocu-
rren después de que el patrocinador obtiene la autorización para su comercialización. Aunque dichos cambios son menores,
podrían afectar la actividad biológica, la eficacia o la seguridad de un producto terapéutico biológico, en particular la inmuno-
genicidad es un factor clave a considerar. Los cambios en niveles y tipos de productos de degradación (oxidados, desamina-
dos, agregados, entre otros), isoformas de proteína e impurezas relacionadas con el proceso de producción tales como proteí-
nas de células huésped y ADN podrían afectar la inmunogenicidad y requerir una evaluación más a fondo.
FACTORES
QUEAFECTANELPOTENCIAL
INMUNOGÉNICO
DE UNA PROTEÍNATERAPÉUTICA
Son muchos los factores que pueden influenciar que la administración de un producto biológico induzca una respuesta in-
mune en el paciente, entre los que se incluyen la estructura misma del producto proteico, las variantes del producto, las for-
mulaciones del producto, el estado inmune y la composición genética del paciente, además de la ruta y régimen de dosifica-
ción usado en la clínica.
EstructuraProteica
La estructura primaria del producto (secuencia de aminoácidos) y sus variantes pueden determinar si existen epitopes inmu-
nogénicos que el sistema inmune del paciente reconozca como extraños, lo que conllevaría una respuesta inmune. No es sor-
prendente que las secuencias de aminoácidos que no se encuentran en las proteínas humanas y que, por ende, el sistema in-
mune humano podría reconocer como extrañas (p. ej., aquéllas derivadas de una línea celular no humana o elaboradas con
proteínas creadas por ingeniería genética, p. ej., proteínas de fusión), pueden inducir una respuesta inmune en humanos. Ade-
más, la modificación química de aminoácidos (p. ej., oxidación o desamidación) puede resultar en una secuencia que puede
inducir una respuesta inmune, aunque, al día de hoy, son pocos los datos que han confirmado dichos incidentes después de la
administración de proteínas terapéuticas. El corte de la proteína podría exponer secuencias de aminoácidos (neoepitopes) nor-
malmente no expuestos en la proteína nativa, provocando una respuesta inmune.
En general, la glicosilación no parece desempeñar un papel importante en la inducción de respuesta inmune a productos
biológicos, aunque la glicosilación no humana (p. ej., murina) o no mamífera (p. ej., productos derivados de plantas) puede
inducir respuesta inmune. Un ejemplo de lo anterior es un anticuerpo monoclonal humano que contenía un residuo terminal
de galactosa-a-1,3-galactosa debido a una modificación postranslacional introducida durante la producción del fármaco en
una línea celular murina. Este anticuerpo fue antigénico y ocasionó reacciones severas de hipersensibilidad en individuos pre-
viamente sensibilizados que portaban una lgE de reacción cruzada. No se presentó evidencia de que este glicano indujese
reacciones inmunes primarias en individuos sin tratar (es decir, que no fueron previamente sensibilizados). Dichos ejemplos son
poco comunes. En efecto, en la mayoría de los casos, los carbohidratos complejos pueden prevenir o reducir la antigenicidad
de las proteínas inmunogénicas, debido a que enmascaran los epitopes, impidiendo su unión a los anticuerpos.
Se ha demostrado que el agregado de proteínas induce inmunogenicidad en modelos animales. Los mecanismos de acción
propuestos incluyen la presentación de agregados proteícos de alto peso molecular, la repetición de subunidades (multímeros)
directamente en las células B, induciendo así una respuesta independiente de las células T o, alternativamente, mediante la
inducción de una respuesta dependiente de las células T a través de una presentación de antígeno mejorada. Se ha intentado
agregar moléculas de polietilenglicol (PEG) (PEGilación) a productos terapéuticos recombinantes para atenuar la inmunogeni-
cidad y la antigenicidad de proteínas recombinantes limitando la exposición de los epitopes. Aunque no existe evidencia clara
que establezca que la inmunogenicidad de las proteínas disminuya con la PEGilación, algunos datos clínicos sugieren que la
PEGilación puede limitar la unión de anticuerpos (es decir, antigenicidad) con el esqueleto de la proteína. El PEG mismo puede
ser inmunogénico y los anticuerpos anti-PEG deben monitorearse, especialmente en sujetos con hipersensibilidad conocida al
PEG. De hecho, se encuentra presente en la población general un nivel de fondo de anticuerpos anti-PEG, lo que lleva a la
necesidad de desarrollar un ensayo de anticuerpos anti-PEG al igual que un ensayo de anticuerpos antifármacos durante el de-
sarrollo clínico de los productos PEGilados.
Impurezas Relacionadascon el Proceso
Las impurezas relacionadas con el proceso de producción de fármacos tales como endotoxinas, ADN de la célula huésped, o
proteínas, pueden actuar como adyuvantes y pueden provocar una respuesta inmune al producir señales de peligro mediante
la activación de receptores celulares inmunes tales como los receptores del tipo Toll. Algunas fuentes postulan que los lixivia-
bles provenientes de los componenes de envasado primario también pueden actuar como estimuladores de respuesta inmune
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o afectar la estructura de alto orden del producto proteico e inducir una respuesta inmunogénica, aunque no se cuenta toda-
vía con datos que lo demuestren.
EstadoInmune del Paciente
La capacidad del sistema inmune del paciente para reconocer y responder a un producto proteico puede dictar el nivel de
respuesta inmune. Los pacientes que consumen fármacos inmunosupresores tales como glucocorticoides, ciclosporina o meto-
trexato, pueden presentar una probabilidad menor de respuesta inmune a un producto proteico, a pesar del potencial inmu-
nogénico de éste. Por el contrario, las enfermedades autoinmunes y la inflamación pueden conllevar la sobreactivación del sis-
tema inmune, por lo que el nivel de inmunogeniciad del producto puede ser mucho mayor de lo previsto. Asimismo, se debe
tomar también en cuenta la actividad farmacológica de la proteína terapéutica misma. Algunas proteínas terapéuticas dirigidas
contra antígenos de células B pueden agotar las células B periféricas. Por el contrario, otras proteínas terapéuticas pueden pre-
sentar actividades inmunomoduladoras, p. ej., alterar los patrones de tráfico de células T. Estas actividades pueden afectar la
capacidad de un paciente individual o de una población de pacientes para desarrollar una respuesta inmune a un producto
proteico.
Además, se debe considerar el estado inmune de un paciente cuando éste presenta anticuerpos antifármacos específicos
previamente existentes, anticuerpos antifármacos de reacción cruzada (por ejemplo, en el caso de productos de origen murino
o de plantas), o anticuerpos contra impurezas provenientes de las líneas celulares usadas en la producción, las cuales pueden
inducir una respuesta clínica no deseada.
AntecedentesGenéticosdel Paciente
Las moléculas que reconocen y presentan péptidos derivados de proteínas al sistema inmune adaptativo-el antígeno de
leucocitos humanos o las moléculas de antígeno mayor de histocompatibilidad (CMH)-presentan una diversidad genética
considerable entre individuos y entre poblaciones en diferentes partes del mundo. Dicha diversidad es una de las razones por
las que diferentes pacientes pueden presentar diferentes respuestas inmunes al mismo producto. Por consiguiente, si los estu-
dios clínicos incluyen solo una población con diversidad genética limitada, entonces el perfil de inmunogenicidad de un pro-
ducto de proteínas terapéuticas en dicha población puede no reflejar su perfil de inmunogenicidad en la población más gran-
de y más diversa a la que quedaría expuesto después de su aprobación.
Dosisy Vía de Administración
La forma en que se utiliza un producto de proteínas terapéuticas puede influenciar su potencial de inmunogenicidad. Las
diversas vías de administración parecen tener diferentes efectos en la inmunogenicidad, y la inyección subcutánea por lo gene-
ral se percibe como una vía de exposición más inmunogénica que la administración intravenosa. El régimen de dosificación
también puede influenciar la inmunogenicidad. Un producto de proteínas terapéuticas que por lo regular se administra una
vez como una sola dosis (p. ej., una proteína trombolítica) es menos propenso a inducir una respuesta inmune que una proteí-
na terapéutica que se usa en un régimen multidosis debido a que el sistema inmune por lo regular requiere de cebado seguido
de estimulación (prime-boost) para asegurar una respuesta robusta. Los pacientes pueden tener una sensibilización preexisten-
te incluso sin ninguna exposición conocida a un producto terapéutico proteíco y pueden presentar respuestas clínicas adversas
durante la primera exposición. No obstante, se ha demostrado que los productos con vidas medias largas o aquéllos que son
particularmente inmunogénicos (p. ej., aquéllos con múltiples epitopes - células T) inducen anticuerpos antifármacos después
de una sola inyección. Un régimen de dosificación crónico tiene una mayor probabilidad de inducir una respuesta inmune de-
bido a que el sistema inmune recibe múltiples exposiciones al producto y esto puede llevar a una respuesta más intensa de las
células T de memoria.
Otro régimen que ha ocasionado anticuerpos antifármacos con secuelas clínicas es uno mediante el cual se provee un pro-
ducto durante un periodo corto, se detiene la administración, y luego se introduce de nuevo solo después de transcurrido un
largo periodo de reposo. Esto tiene el efecto de cebar el sistema inmune y la reintroducción puede ocasionar eventos relacio-
nados con la respuesta inmune tales como respuestas alérgicas. El uso de dosificación crónica de manera regular, aunque pro-
vee el medicamento de manera repetida, parece evitar dicha hipersensibilidad mediante la inducción de algún tipo de toleran-
cia.
DETERMINACIÓN
DE LA INMUNOGENICIDAD
PRECLÍNICA
Y CLÍNICA
lnmunogenicidad Preclínica:Relevanciay Alcance
La inmunogenicidad de muchos productos terapéuticos biológicos es mayor en los estudios preclínicos y tiene un bajo valor
predictivo para humanos debido a que una respuesta inmune a proteínas humanas o humanizadas tiende a ser mayor en ani-
males que en los humanos dada la condición de desconocimiento de la proteína en los animales y la ausencia de una contra-
parte biológica endógena. Aunque la detección de anticuerpos antifármacos en animales puede no ser relevante desde el pun-
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to de vista clínico, los investigadores deben evaluar los anticuerpos antifármacos para la interpretación de los datos de toxici-
dad requeridos necesarios para las presentaciones reglamentarias (ver la pauta ICH S6Rl en el Apéndice).
Por lo general, las evaluaciones de anticuerpos antifármacos, los datos de farmacocinética y los datos de farmacodinámica
ayudan con la interpretación de los resultados y la validez de los estudios de toxicología en animales. En algunos casos, los
datos de inmunogenicidad preclínica también se pueden usar para comparar la inmunogenicidad relativa de los productos an-
tes y después de los cambios en la fabricación, aunque esto parece ser significativo solo con los cambios más importantes en la
inmunogenicidad relativa. Los estudios preclínicos, particularmente en especies animales más evoluvionadas, por lo general no
incluyen un análisis estadístico adecuado que permita generar conclusiones sobre inmunogenicidad relativa, aunque, cuando
se presenta el caso, se debe reconocer que las diferencias en la restricción de CMH y la tolerancia inmune natural de animales
frente a la de humanos no pueden permitir la traslación de dicha información sobre efectos en humanos. Asimismo, se debe
reconocer que la variedad de las especies usadas en estudios preclínicos es limitada en cuanto a la diversidad genética en com-
paración con la población humana.
Los anticuerpos antifármacos pueden alterar la exposición a un fármaco activo mediante el bloqueo de la unión del agente
terapéutico con la diana o acelerando la eliminación del agente terapéutico de la circulación, lo cual resulta en una exposición
reducida. Los anticuerpos antifármacos pueden incrementar la vida media de fármacos biológicos y con esto la exposición, si el
complejo fármaco-anticuerpo antifármaco sigue siendo biológicamente activo. Por lo general, las muestras deben recolectarse
para posibles análisis de anticuerpos antifármacos a partir de todos los estudios preclínicos de seguridad en los que los anima-
les se exponen al fármaco durante más de 7 días (ver las referencias en el Apéndicepara más información). Debido a que la
consideración clave para incluir análisis de inmunogenicidad en estudios no clínicos es demostrar la exposición al fármaco du-
rante el transcurso del estudio, esto también se puede lograr demostrando la modulación mediada por fármacos de un marca-
dor farmacodinámico. Además, la ausencia de un efecto en la concentración del suero o perfil farmacocinético del medica-
mento también puede demostrar de manera indirecta la ausencia de efectos detectables de un anticuerpo antifármaco ante la
exposición al fármaco. No obstante, en algunas situaciones el desarrollo de un anticuerpo antifármaco podría no afectar de
manera significativa la eliminación del fármaco, sino que, en vez de esto, el anticuerpo antifármaco puede afectar la unión del
fármaco con la diana y su actividad prevista (p. ej., anticuerpos anti-idiotipo). Por lo tanto, también se debe tomar en cuenta la
falta de un efecto sobre un marcador farmacodinámico y/o sobre la farmacocinética para asegurar que la actividad no se vea
afectada por el anticuerpo antifármaco.
Para la mayoría de los estudios no clínicos, se deben recolectar muestras en las distintas fases del estudio, almacenarlas y
analizarlas con respecto a cualquier cambio farmacológico o toxicológico observado. De hecho, la mayoría de los estudios to-
xicológicos no clínicos no evalúan la cinética del desarrollo de anticuerpos antifámacos, y, por lo general, las muestras para la
evaluación de anticuerpos antifármacos se toman al comienzo, al final del tratamiento y al final de los periodos de recupera-
ción.
Los análisis de muestras tomadas durante la fase de dosificación también se pueden realizar si se observan datos farmacoci-
néticos o hallazgos toxicológicos inusuales al final del estudio. En este caso, se debe tomar en cuenta que la interferencia del
fármaco puede complicar el análisis de las muestras tomadas durante la fase de dosificación. Por tanto, es importante tomar
muestras en tiempos de muestreo apropiados (p. ej., antes de la siguiente dosis) y contar con ensayos adecuados de alta tole-
rancia al fármaco. En algunos casos, cuando pudiera presentarse una diana soluble en la circulación, el conocimiento del nivel
de anticuerpos antifármacos (títulos o unidades de masa relativa) puede facilitar la interpretación de hallazgos toxicológicos.
Se debe usar un enfoque basado en riesgos para determinar si es necesaria la caracterización adicional (p. ej., demostrar la
actividad neutralizante) en los estudios preclínicos. Dicha decisión se puede ver afectada por factores tales como la presencia
de equivalentes endógenos, la utilidad de un marcador farmacodinámico o el ensayo farmacocinético. Si se consideran necesa-
rios datos a partir de un ensayo de anticuerpo neutralizante {AcN),entonces dicho ensayo puede ser un inmunoensayo de
inhibición de la unión a la diana o una valoración basada en células, independientemente del nivel de riesgo. La evaluación de
inmunogenicidad y la interpretación de los datos del estudio generalmente requieren de muestreos en serie y análisis de mues-
tras de suero para farmacocinética, farmacodinámica y anticuerpos antifármacos. Dichos muestreos repetidos y frecuentes po-
drían no ser factibles cuando los investigadores lleven a cabo estudios que utilizan roedores, particularmente ratones. En tales
casos, el estudio se puede diseñar para permitir análisis discretos de toxicidad, farmacocinética y farmacodinámica de anticuer-
pos antifármacos a partir de grupos de ratones tratados de manera similar con la recolección de muestras en tiempos de mues-
treo similares que permitan el análisis ilativo de los efectos observados en todos los grupos de tratamiento.
Estudios Clínicos: Relevancia y Alcance de las Evaluaciones de lnmunogenicidad
En los estudios clínicos, la detección y caracterización de anticuerpos antifármacos resulta importante para entender la segu-
ridad, exposición y perfil de eficacia del producto terapéutico. Por lo general, la estrategia de análisis de anticuerpos antifárma-
cos en estudios clínicos incluye un ensayo de detección (screening) para anticuerpos que se unen al fármaco y, posteriormen-
te, un ensayo confirmatorio, seguido de una caracterización adicional de AcN. Los datos de inmunogenicidad de estudios clíni-
cos por lo general se analizan en el contexto de su relevancia para la farmacocinética y la farmacodinámica del producto tera-
péutico y para los efectos adversos. Para terapias de reemplazo (p. ej., terapias de reemplazo de enzimas, factores de coagula-
ción sanguínea y eritropoyetina), se debe diseñar un extenso programa de monitoreo basado en la detección de anticuerpos
antifármacos combinado con múltiples parámetros de seguridad para monitorear el potencial de eventos adversos serios.
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Los investigadores deben considerar la cinética de la aparición de los anticuerpos antifármacos durante los estudios clínicos
debido a que esto puede afectar no solo la detección de anticuerpos antifármacos, sino también las secuelas clínicas potencia-
les. Algunos productos inducen anticuerpos rápidamente, pero otros productos bioterapéuticos pueden tomar años antes de
que se detecte una respuesta inmune o que ésta pueda relacionarse con alguna secuela clínica. Los investigadores también
deben considerar si una respuesta de anticuerpo es transitoria o persistente. Por lo tanto, es importante entender la cinética de
la presencia de los anticuerpos antifármacos. Este objetivo se puede lograr seleccionando cuidadosamente los tiempos de reco-
lección de muestras de anticuerpos antifármacos y procediendo con cuidado en el desarrollo del ensayo de anticuerpos antifár-
macos para estudios clínicos. Las muestras deben recolectarse durante cada fase del estudio (antes del tratamiento, durante el
tratamiento y durante cualquier fase de suspensión del tratamiento). La sensibilidad y la tolerancia a fármacos del ensayo de
anticuerpos antifármacos también debe ser apropiada para el uso previsto de la valoración. Por ejemplo, cuando los productos
tengan vidas medias largas (p. ej., anticuerpos monoclonales) los científicos deberán desarrollar ensayos de anticuerpos antifár-
macos que sean capaces de detectar anticuerpos antifármacos en presencia de producto en el nivel esperado en las muestras
de prueba de pacientes. Asimismo, durante el diseño de los planes de muestreo de anticuerpos antifármacos, los investigado-
res deben considerar la aptitud de la obtención de muestras después de un periodo de suspensión del medicamento.
El número de pacientes evaluados para anticuerpos antifármacos en ensayos clínicos y la duración y tiempo de la recolección
de muestras de anticuerpos antifármacos son factores críticos para entender la incidencia y el impacto clínico de los anticuer-
pos antifármacos. Existen otros factores que pueden frustrar los análisis de anticuerpos antifármacos, los cuales incluyen la na-
turaleza del producto terapéutico mismo, la presencia de anticuerpos de reacción cruzada preexistentes, factores reumatoi-
deos, anticuerpos heterófilos, dianas solubles o ligandos. Se deben tomar muestras para evaluar los niveles de estos factores
interferentes en el suero (y en otros marcadores farmacodinámicos, según corresponda) al mismo tiempo que las muestras de
anticuerpos antifármacos.
Además de determinar la presencia de anticuerpos de unión, los estudios de inmunogenicidad por lo general incluyen la
caracterización adicional de muestras positivas en valoraciones cuantitativas, así como de AcN para determinar el efecto poten-
cial de los niveles de anticuerpos antifármacos para neutralizar el efecto del fármaco o para mediar los eventos de seguridad.
Asimismo, comprender la cinética del desarrollo de anticuerpos antifármacos y de AcN mediante la detección de anticuerpos
antifármacos en muestras secuenciales tomadas durante todas las fases del estudio y la explicación de las clases y subclases de
inmunoglobulinas de los anticuerpos antifármacos puede ayudar a comprender mejor los factores relacionados con el paciente
y con el tratamiento así como los mecanismos a través de los cuales el producto terapéutico induce el desarrollo de anticuer-
pos antifármacos.
ENFOQUEBASADOEN RIESGOSPARAEVALUARLA INMUNOGENICIDAD

Y SUS
CONSECUENCIAS
Evaluación de Riesgos Potenciales de la lnmunogenicidad Específica del Producto
El concepto de riesgo se define en la pauta ICH Q9 como la combinación de la probabilidad de que ocurra un daño y la
severidaddel mismo. En relación con los productos farmacéuticos, la protección del paciente mediante la gestión de riesgos
para la seguridad debe considerarse de primordial importancia y, por ende, las evaluaciones de riesgos de respuestas inmunes
inducidas por los productos deben enfocarse más en la severidad potencial de las consecuencias clínicas derivadas de las res-
puestas de los anticuerpos antifármacos que en la probabilidad de que se presenten dichas respuestas. La mayor preocupación
se centra en un pequeño número de pacientes que presentan efectos secundarios severos o que ponen en riesgo sus vidas
debido a anticuerpos antifármacos, más que un número mayor de pacientes con anticuerpos antifármacos sin consecuencias
clínicas. La mitigación de riegos también debe incluirse en el proceso general de evaluación de riesgos (p. ej., la eliminación
del impacto clínico mediante la administración conjunta de otro medicamento).
Aunque las estrategias de análisis de anticuerpos antifármacos pueden basarse en la evaluación de riesgos de inmunogenici-
dad, esto puede no siempre resultar factible durante el desarrollo temprano del fármaco, cuando podría no contarse con ensa-
yos confiables.
Los eventos de seguridad inducidos por anticuerpos antifármacos pueden ir desde efectos secundarios moderados hasta
condiciones que atenten contra la vida. La potencial severidad de las consecuencias de una respuesta de anticuerpos antifár-
macos debe considerarse tan pronto como sea posible. La Tabla 1 resume algunos, no todos, los factores de riesgo que pue-
den influenciar la severidad de las consecuencias clínicas de una respuesta de anticuerpos antifármacos.
Tabla 1. Factores Que Pueden Influenciar la Severidad de las Secuelas Clínicas Relacionadas con los Anticuerpos Antlfármacos
Menor Riesgo1 Mediano Riesgo Mayor Riesgo
Presencia de un equivalente endógeno Equivalente no endógeno (p. ej., toxi- Equivalente redundante (p. ej., Equivalente no redundante [p. ej.,
idéntica (incluye familias de proteínas na botulínica) interferón u hormonas de ere- eritropoyetina o factor de creci-
que comparten dominios) cimiento) miento y de desarrollo de mega-
cariocitos (MGDF, por sus siglas
en inglés)]
1 Elriesgo es una consecuencia de la severidad y la frecuencia.
Tabla 1. Factores Q.ue Pueden Influenciar la Severidad de las Secuelas Clínicas Relacionadas con los Anticuerpos Antlfármacos
(Continuación)
Menor Riesqo1 Mediano Riesqo Mayor Riesqo
Presencia de una molécula o dominio Sin molécula o dominio endógeno es- Existe una molécula o dominio Existe una molécula o dominio en-
endógeno estructuralmente relacio- tructuralmente relacionados endógeno medianamente re- dógeno altamente relacionado
nados lacionado desde el punto de desde el punto de vista estructu-
vista estructural ral
Estado de la enfermedad del paciente Pone en riesgo la vida Moderado a severo Moderado
Consecuencias clínicas potenciales de Sin impacto clínicamente significativo Impacto manejable en la segu- Influencia clínica extensa sobre la
la inmunogenicidad en la seguridad o en la eficacia ridad o en la eficacia seguridad o pérdida (o reducción
dramática) de eficacia
1 El riesgo es una consecuencia de la severidad y la frecuencia.
Son varios los factores que pueden contribuir con la incidencia de una respuesta de anticuerpos antifármacos. La Tabla2
presenta solo algunos de estos factores. Durante una evaluación de riesgo de inmunogenicidad, se deben tomar en cuenta los
factores presentados en la Tabla2 en conjunto con los de la Tabla 1. Las consecuencias clínicas de la inmunogenicidad son
impredecibles, incluso con las evaluaciones de riesgos descritas anteriormente.
Una evaluación de riesgos de inmunogenicidad adquiere gran valor únicamente cuando se consideran cuidadosamente to-
dos los factores que influyen en la probabilidad y severidad de una respuesta inmune potencial. Las evaluaciones de riesgos
deben realizarse de tal modo que su funcionalidad sea cruzada, incluyendo el aporte de personal clínico, de las evaluaciones
de seguridad, de la farmacocinética, de los científicos bioanalíticos, además de los científicos que realizan el proceso. Las con-
sultas a las autoridades reglamentarias y los consejos de monitoreo de la seguridad clínica también pueden ser útiles y se de-
ben llevar a cabo repetidamente durante el proceso de desarrollo del producto a medida que se obtienen datos clínicos.
Las secuelas clínicas mediadas por anticuerpos antifármacos y la tasa de incidencia de anticuerpos antifármacos son entida-
des separadas, aunque existe una relación interna entre ambos factores debido a que el número de pacientes con eventos ad-
versos mediados por anticuerpos puede elevarse con una tasa de incidencia de anticuerpos antifármacos más alta.
Tabla 2. Factores Q.ue Pueden Influenciar la Incidencia de Antlcueroos Antlfármacos
Incidencia Incidencia Incidencia
Menor Media Mayor
Nivel circulante de un equivalente endó- Abundante Escaso Ninguno
geno
Estado inmune del paciente Suprimido Normal Activado
Exposición: régimen o frecuencia de dosi- Dosis única Crónica (mantenimiento) Dosificación
ficación episódica
Dosis múltiples
Vía de exposición 1ntravenosa u oral Subcutánea, intramuscular, lntradérmica o por inhalación
mucosa (no por inhalación)
Niveles más bajos (o ausencia) de im- Niveles más altos de impurezas
purezas del producto o relacionadas del producto o relacionadas
con el proceso (p. ej., agregados o con el proceso
desnaturalización, fragmentación) (p. ej., agregados o desnatura-
lización, fragmentación)
Se mantiene la integridad molecular Niveles intermedios de impure- Nivel más alto de epitopes anti-
Características de la sustancia activa zas del producto o relaciona- génicos (derivados de líneas
del Producto das con el proceso, y conteni- celulares murinas, contienen
do potencial de epitopes secuencias mutadas nuevas,
etc.)
Contenido bajo o nulo de epitopes Mecanismo de acción: activa-
potenciales de células T ción inmune
Mecanismo de acción: p. ej., inmuno-
supresor
Enfoque Basado en Riesgos para la Estrategia de Análisis de Anticuerpos Antifármacos
La estrategia de análisis de anticuerpos antifármacos debe basarse en una evaluación de riesgos de inmunogenicidad. Los
ensayos de inmunogenicidad y los esquemas de análisis apropiadamente diseñados, validados y ejecutados proveen datos que
hacen posible evaluar los riesgos y predecir los eventuales resultados para los pacientes. La frecuencia del muestreo, las evalua-
ciones de la actividad neutralizante y las mediciones cualitativas o semi cuantitativas pueden depender en su totalidad de los
riesgos percibidos.
En los estudios clínicos, la seguridad del paciente es una preocupación mayor, y el grado de caracterización de anticuerpos
antifármacos necesario depende del riesgo potencial de secuelas relacionadas con los anticuerpos antifármacos. Asimismo,
también se debe tomar en cuenta el tipo de fármaco. Por ejemplo, para una proteína de fusión de componentes múltiples que
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contiene al menos un componente con un riesgo potencialmente elevado de eventos adversos, se recomienda un método de
mapeo de dominios (es decir, reactividad de los anticuerpos antifármacos con componentes individuales).
Por lo general, se debe aplicar análisis y caracterizaciones de anticuerpos antifármacos más extensas cuando exista un alto
riesgo de efectos clínicos adversos. Las muestras deben analizarse y caracterizarse basándose en el tiempo y la incidencia de la
respuesta de los anticuerpos antifármacos, así como en la ocurrencia y severidad de los efectos clínicos secundarios. Normal-
mente, un riesgo mayor de incidencia de anticuerpos antifármacos no demanda una caracterización extensa de anticuerpos
antifármacos, y, por lo general, el riesgo de consecuencias clínicas dirige la estrategia bioanalítica. No obstante, algunas inves-
tigaciones pueden ser guiadas por la necesidad de entender la causa de una alta incidencia de anticuerpos antifármacos (p. ej.,
la reactividad de anticuerpos antifármacos con fármacos agregados contra no agregados).
La siguiente estrategia de análisis basada en riesgos y dividida en etapas puede perfeccionarse dependiendo del nivel de ries-
go del producto durante el diseño de los estudios clínicos para asegurar la obtención de la máxima cantidad de datos, inclui-
das las correlaciones con farmacocinética, farmadinámica, entre otros.
ETAPA1
Desarrollar métodos para anticuerpos antifármacos que sean adecuados para el propósito y que concuerden con las mejores
prácticas de la industria y las pautas reglamentarias. Incorporar el análisis de anticuerpos antifármacos para muestras obtenidas
antes (línea de base) y después del inicio del tratamiento con el medicamento en el diseño del estudio clínico, junto con un
análisis concurrente de farmacocinética, más cualquier marcador de farmacodinámica, seguridad o eficacia pertinente que faci-
lite la interpretación de los datos de anticuerpos antifármacos. El análisis de los resultados de las pruebas de anticuerpos anti-
fármacos debe transformarse en planes de análisis para el estudio.
ETAPA2
Realizar el análisis de detección de anticuerpos antifármacos a todas las muestras previas y posteriores a la dosificación. Dos
pruebas importantes que deben realizarse en todos los casos son el ensayo de detección de anticuerpos antifármacos y el ensa-
yo confirmatorio de inhibición del fármaco o del agotamiento de la inmunoglobulina. Informar como negativo cualquier resul-
tado de anticuerpos antifármacos que esté por debajo del punto de corte del ensayo y con niveles de fármaco por debajo de
los niveles de interferencia, así como aquéllos que resulten negativos en el ensayo confirmatorio. Se prefieren métodos de
prueba que sean capaces de ofrecer una detección sensible de anticuerpos antifármacos a pesar de niveles bajos de fármaco. Si
no se cuenta con dichos métodos, las muestras que contienen fármacos por encima de los niveles de interferencia deben infor-
marse como no concluyentes con una declaración de posible interferencia del fármaco. En dichos casos, los análisis de anti-
cuerpos antifármacos se pueden realizar más adelante, después de un periodo de eliminación del fármaco para obtener un
resultado concluyente (para más información, consultar la sección SensibilidadRelativade este capítulo). Para las muestras posi-
tivas confirmadas, se deben estimar los niveles de anticuerpos antifármacos, de preferencia mediante titulación, aunque pue-
den informarse en términos de unidades de masa relativa. Algunas plataformas tecnológicas basadas en masa pueden requerir
el uso de unidades de masa relativa.
ETAPA3
Se debe analizar la capacidad neutralizante y, potencialmente, otras características de las muestras consideradas positivas en
la Etapa2, dependiendo de la evaluación de riesgos. En situaciones de alto riesgo, se debe medir la actividad de AcN, por lo
general usando un ensayo basado en células. Dependiendo del mecanismo de acción del fármaco, en ocasiones es posible usar
un formato de ensayo de unión de ligandos de AcN siempre y cuando se demuestre adecuadamente la detección específica de
AcN. Los datos de farmacocinética/farmacodinámica/seguridad o de marcador biológico generados de manera simultánea de-
ben usarse para ayudar a interpretar la relevancia clínica de la actividad neutralizante de los anticuerpos. Además, la determi-
nación de los isotipos y la afinidad de los anticuerpos antifármacos puede ser útil para la evaluación general de la respuesta
inmune. Las reacciones alérgicas relacionadas con la administración de fármacos pueden requerir la medición de lgE específica
del fármaco, aunque la detección puede depender del esquema de muestreo y del diseño del método.
DISEt:1O
DE MÉTODOSDE PRUEBABASADOSEN INMUNOENSAYOS
Los métodos de inmunoensayo para la detección de anticuerpos antifármacos por lo general son complejos y requieren un
amplio entendimiento de múltiples desafíos técnicos. Los ensayos de detección que sirven como primera etapa clave en el es-
quema de análisis de inmunogenicidad se diseñan para contar con cierta tasa de falsos positivos (más que falsos negativos) a
fin de maximizar la sensibilidad para la detección de anticuerpos antifármacos. Además, usando un enfoque basado en riesgos,
resulta más apropiado contar con 5% de falsos positivos en lugar de falsos negativos durante esta fase inicial de detección. Por
lo regular, la confirmación de que las muestras de detección positivas contienen anticuerpos antifármacos específicos del fár-
maco se realiza mediante ensayos confirmatorios antes de determinar el nivel de anticuerpos antifármacos (títulos) o cualquier
caracterización adicional.
7922 (1106) Ensayosde lnmunogenicidad lnmunoensayos / Información General USP42
Ensayos de Detección
En su forma más simple, en los ensayos de detección de anticuerpos antifármacos se inmoviliza la proteína terapéutica en
una placa de microtitulación o en perlas para capturar anticuerpos antifármacos (fase sólida) o se incuba una proteína terapéu-
tica marcada a una concentración predeterminada con la muestra que contiene los anticuerpos antifármacos (ensayo en solu-
ción). El anticuerpo antifármaco policlonal unido se detecta posteriormente usando un reactivo secundario marcado o un fár-
maco marcado. Se puede incrementar la detección de anticuerpos con constantes de disociación rápidas en plataformas de
ensayos que usan etapas de lavado limitando el número de etapas de lavado o reduciendo las velocidades de dispensación de
fluido de lavado. Por lo general, los ensayos de detección están diseñados para detectar las clases de anticuerpos que pudieran
ser de mayor relevancia para la vía de administración del producto, p. ej., lgA para vías de administración mucosas. Aunque los
anticuerpos antifármacos más comunes producidos contra los productos terapéuticos de proteínas son los isotipos lgM e lgG,
otros isotipos de anticuerpos antifármacos que incluyen lgE y lgA pueden requerir de detección, basándose en la respuesta
clínica y en la vía de administración del producto. Asimismo, dependiendo de la rapidez con que se desarrollen las respuestas
de los anticuerpos antifármacos y de la vida media del producto terapéutico, puede resultar factible detectar el desarrollo de
anticuerpos antifármacos inicialmente del isotipo lgM que posteriormente maduran en un isotipo lgG luego de la administra-
ción repetida del producto.
Debido a que los ensayos de detección sirven como la primera etapa en el programa de análisis de inmunogenicidad, estos
ensayos están generalmente diseñados para ofrecer una velocidad de procesamiento moderada y a menudo están automatiza-
dos. Las diversas plataformas tecnológicas usadas para desarrollar los ensayos de detección de inmunogenicidad tienen fortale-
zas y debilidades inherentes, según se describe en la Tabla3. El desarrollo de una estrategia bioanalítica para usar cierta plata-
forma de tecnología para el desarrollo del ensayo debe tomar en cuenta la naturaleza del producto (p. ej., una proteína tera-
péutica o un anticuerpo monoclonal), las fuentes potenciales de interferencia en el ensayo (p. ej., la concentración terapéutica
prevista en las muestras de pacientes, la diana soluble basándose en medicaciones conjuntas y aspectos biológicos) y los facto-
res de interferencia específicos de la enfermedad o de reacción cruzada (p. ej., factor reumatoideo).
Asimismo, los analistas deben evaluar si el método no resulta en una subestimación de muestras de anticuerpos antifármacos
positivos debido a que los epitopes de unión de los anticuerpos antifármacos en el reactivo de captura estén bloqueados por
una etiqueta o recubriendo las placas o las perlas. Otro punto a considerar en el diseño y desarrollo de un ensayo de anticuer-
pos antifármacos es la adaptabilidad de la prueba tanto para matrices clínicas como no clínicas. Aunque la mayoría de los for-
matos de ensayo pueden transferirse fácilmente de uso no clínico a uso clínico, existen excepciones. Asimismo, el uso de ensa-
yos clínicos de anticuerpos antifármacos debe calificarse o validarse con muestras recolectadas de una población similar de pa-
cientes. Nuevamente, aunque la mayoría de los ensayos de detección de anticuerpos antifármacos pueden no presentar inter-
ferencias únicas de matriz entre una enfermedad y otra, puede haber excepciones. Los inmunoensayos usados para la detec-
ción de anticuerpos antifármacos por lo general son métodos semicuantitativos puesto que, generalmente, no se encuentran
disponibles calibradores policlonales de anticuerpos antifármacos estandarizados y específicos para especies (especialmente hu-
manos). Los controles positivos, generalmente desarrollados de manera interna como suero hiperinmune en animales o me-
diante fagos sirven como sustitutos para los anticuerpos antifármacos inducidos por fármacos en pacientes tratados.
Tal como se muestra en la Tabla3, algunos de los formatos de ensayo más comunes actualmente en uso para el desarrollo
de ensayos de detección incluyen ensayos por inmunoadsorción ligados a enzimas basados en placa o en perlas (ELISA;ver
también el capítulo general de la USP Métodosde PruebasInmunológicas-Ensayopor lnmunoadsorciónLigadoa Enzimas(ELISA)
(1103)) con lecturas colorimétricas, fluorométricas o luminiscentes, ensayos electroquimioluminiscentes en placa o en fase lí-
quida o ensayos ELISA,ensayos de resonancia de plasmón superficial (RPS;ver también el capítulo general de la USP Métodos
de PruebasInmunológicas-Resonanciade PlasmónSuperficial(1105)), o ensayos de interferometría en biocapa y ensayos de ra-
dioinmunoprecipitación (RIPA).Para diferenciar entre respuestas positivas y negativas, los puntos de corte de los ensayos se
determinan estadísticamente usando muestras recolectadas de la población diana. El punto de corte del ensayo también ayuda
a determinar la sensibilidad del ensayo. Un punto de corte incorrectamente establecido puede resultar en falsos negativos o en
demasiados falsos positivos que deben ser descartados como respuestas específicas del fármaco en el ensayo confirmatorio. El
desempeño del ensayo por lo general se optimiza durante el desarrollo mediante la evaluación de los siguientes parámetros:
sensibilidad (cantidad más baja de anticuerpos detectables en una muestra que se demuestra usando controles sustitutos); es-
pecificidad (posibilidad de detección de un positivo verdadero en lugar de una interacción no específica); precisión (reproduci-
bilidad de los resultados de múltiples análisis); interferencia (sustancias interferentes en la matriz de la muestra, incluido el fár-
maco administrado, lo que afecta la sensibilidad del ensayo); y estabilidad y robustez (probabilidad de desempeño óptimo del
ensayo con el tiempo). Después de optimizar estos parámetros, los analistas por lo general validan el método para el uso pre-
visto. Si el ensayo inicial no puede cumplir con los objetivos de desempeño (p. ej., debido a una sensibilidad deficiente o fon-
dos altos), entonces los analistas deben mejorar y validar el primer formato de ensayo nuevamente o desarrollar y validar más
de un formato de ensayo.
Tabla 3. Ventajas y Desventajas de Varios Tipos de Ensayos Usados para Evaluar Anticuerpos Antlfármacos
Tipo de ensayo Ventajas Desventajas
Alto rendimiento Potencial de ruido de fondo alto
Fácilmente disponible Podría no ser específico
Su utilidad depende de la capacidad de detectar
Fácil de automatizar
subtipos diferentes de lg
Menor tolerancia al fármaco para ELISAsen fase
ELISADirecto/Indirecto Económico
sólida
Los modos de lectura pueden incrementar la Los lavados en exceso pueden disminuir la detec-
sensibilidad (p. ej., electroquimioluminiscen- ción de anticuerpos antifármacos de baja afini-
cia) dad
Mayor tolerancia al fármaco para ELISAsen fase
líquida
Bajo fondo Difícilde confirmar la presencia de lgM
Alta especificidad Requiere marcado del producto
Fácilmente disponible Capacidad reducida para detectar anticuerpos de
Fácil de automatizar baja afinidad e lgG4 debido a la unión de un so-
lo brazo entre el ligando de unión y el detector
Formato tipo puente Económico
Elformato se puede usar entre especies y de-
tecta todos los isotipos
Se pueden usar diferentes plataformas de de-
tección (colorimétrica, electroquimiolumines-
cencia, etc.)
Flexibilidad para caracterizar la respuesta inmu- Tecnología costosa
Ensayos de Resonancia de Plasmón Superficial/ ne (concentración y afinidad relativa)
lnterferometría de Biocapa Mayor tolerancia al fármaco y puede detectar Proveedores limitados
anticuerpos de baja afinidad
Rendimiento moderado
Económico Desecho radioactivo
Requiere la recalificación frecuente de reactivos
Altamente sensible
radiomarcados debido a la vida media corta
Ensayos de Radioinmunoprecipitación Su utilidad depende de la capacidad de precipitar
todos los anticuerpos pertinentes presentes
Mejor para anticuerpos de alta afinidad
Puede ser menos útil para anticuerpos de baja afi-
nidad
EnsayosConfirmatorios
Las muestras que resultan positivas en el ensayo de detección a menudo se confirman en un segundo ensayo que incluye
agregar cierta cantidad en exceso del producto terapéutico. Esto tiene el propósito de demostrar que una señal positiva obser-
vada en el ensayo de detección de anticuerpos antifármacos es ocasionada por la presencia de anticuerpos específicos contra
el fármaco. Debido a que el punto de corte para el ensayo de detección se establece para obtener una detección de aproxima-
damente 5% de falsos positivos, el ensayo confirmatorio se usa para descartar las muestras falsas positivas de análisis adiciona-
les. Se encuentran disponibles múltiples opciones para llevar a cabo los ensayos confirmatorios. Por lo regular, se agrega un
fármaco soluble a la muestra, el cual debe competir con el fármaco inmovilizado unido en placa para poder unirse a los anti-
cuerpos antifármacos de la muestra. Una interacción específica con un fármaco soluble resulta en una reducción en la señal del
ensayo. Al igual que con el ensayo de detección, el punto de corte para el ensayo confirmatorio se establece estadísticamente.
La verificación de la presencia de un anticuerpo específico contra el fármaco también se puede llevar a cabo usando un méto-
do ortogonal en una plataforma de ensayo distinta que puede tener diferentes perfiles de unión no específica. Los analistas
deben tener cuidado al momento de adoptar este método para asegurar un ensayo con sensibilidad adecuada a fin de evitar
una reacción de falsos negativos. Finalmente, la especificidad de los anticuerpos antifármacos también se puede confirmar me-
diante el agotamiento de toda la inmunoglobulina de una muestra (p. ej., usando una columna de Proteína A o G) seguida de
la repetición del análisis de la muestra agotada. En el último método, la muestra agotada dará un resultado negativo en el
ensayo si un anticuerpo ocasionó la señal original. La validación de los ensayos confirmatorios ayuda a asegurar que los resulta-
dos del ensayo confirmatorio se interpreten adecuadamente.
Ensayosde Caracterización
Después de la detección y la confirmación, el nivel relativo de anticuerpos antifármacos en una muestra positiva se evalúa
mediante titulación. El método más común es diluir en serie la muestra e informar la inversa del factor de dilución más alto en
el que la muestra arroja un resultado positivo, o título de la muestra. Cuanto más alta sea la dilución de la muestra (y, por
tanto, el valor de título de anticuerpos antifármacos), más alta será la concentración de anticuerpos antifármacos circulantes en
dicha muestra. Este método se ha usado históricamente para informar datos serológicos obtenidos de estudios de vacunas.
Otro método de uso menos frecuente consiste en expresar la cantidad de anticuerpos antifármacos en la muestra en unidades
de masa con respecto a un estándar sustituto. Aunque este enfoque tiene la ventaja de relacionar la cantidad de anticuerpo en
la muestra con la sensibilidad del ensayo, los analistas deben reconocer que el calibrador podría no ser representativo de la
respuesta policlonal de anticuerpos antifármacos que se está midiendo.
Los métodos tradicionales para el análisis de linealidad dilucional no se aplican a los ensayos de anticuerpos antifármacos.
Sin embargo, cuando los analistas expresen datos de anticuerpos antifármacos en términos de valores de título, también debe-
rán demostrar que los controles positivos presentan una linealidad de dilución razonable (relativa).
Además de llevar a cabo la titulación, los analistas caracterizan de manera rutinaria muestras positivas de anticuerpos antifár-
macos en ensayos de neutralización para determinar el efecto in vitro de los anticuerpos antifármacos que podría reflejar la
actividad biológica o farmacológica in vivo del producto terapéutico. Asimismo, también se pueden analizar los isotipos de los
anticuerpos antifármacos. La identificación de isotipos en ocasiones se lleva a cabo de manera multiplexada. Mediante una pla-
taforma multiplex fluorescente, los analistas mezclan cada muestra con múltiples reactivos secundarios que son específicos pa-
ra los diferentes isotipos de inmunoglobulina y se marcan con etiquetas de fluorocromo únicas.
También se puede usar una plataforma de resonancia de plasmón superficial para este propósito (ver el capítulo Métodosde
PruebasInmunológicas-Resonanciade PlasmónSuperficial(1105)). El isotipo de un anticuerpo antifármaco se puede determinar
observando la unión de reactivos específicos del isotipo (tales como un Ac lgG1 antihumano) para el anticuerpo antifármaco
que ha sido capturado por el fármaco inmovilizado. Los analistas deben tener cuidado al identificar y validar los reactivos espe-
cíficos de un isotipo, debido a la inesperada reactividad cruzada que a menudo se observa. La isotipificación puede ayudar a
entender la maduración de la respuesta inmune. Por ejemplo, una respuesta de anticuerpos antifármacos que consta única-
mente de anticuerpos lgM es una respuesta inmune inmadura sin la participación de células T, y su progreso adicional no es
seguro. Por el contrario, una respuesta inmune que consta de anticuerpos lgG1 e lgG4 representa una respuesta más madura,
la cual ya ha involucrado más componentes del sistema inmune. La titulación de anticuerpos antifármacos y los ensayos de
caracterización se validan de manera rutinaria usando muchos de los mismos parámetros de los ensayos de detección y confir-
matorios para asegurar un desempeño constante del ensayo.
VALIDACIÓNDE INMUNOENSAYOS
La validación del método es un proceso para demostrar, mediante el uso de investigaciones específicas en el laboratorio, que
las características de desempeño de un método analítico son adecuadas para el uso previsto (ver también el capítulo general
de la USP Validaciónde Procedimientos Farmacopeicos (1225)). El nivel de validación del método depende de la etapa de desa-
rrollo del producto y de los riesgos asociados con el producto. Una validación parcial que incluya evaluaciones de la sensibili-
dad del método, de la especificidad y de los requisitos de precisión con menos énfasis en la robustez, la reproducibilidad y la
estabilidad, puede ser adecuada para las etapas tempranas de desarrollo clínico (estudios de Fase 1-Fase 2), mientras que los
estudios cruciales y posteriores a la comercialización requieren de métodos validados en su totalidad.
La validación de un ensayo antes de usar el método para el análisis biológico de la muestra recibe el nombre de validación
previaal estudio,y se pueden realizar enmiendas a este proceso entre cada estudio. Este proceso mapea las características de
desempeño del ensayo y debe demostrar que el método es adecuado para su uso previsto cuando se aplique de manera subsi-
guiente a las muestras del estudio. Por el contrario, la validaciónduranteel estudiose refiere al monitoreo del desempeño de la
valoración durante las aplicaciones de la fase de estudio del ensayo a fin de asegurar 9ue el ensayo sigue siendo válido y 9ue
los datos bioanalíticos resultantes son confiables.
El desempeño confiable del ensayo también depende de todos los elementos que abarca el análisis bioanalítico y la manipu-
lación de datos, tales como reactivos, analistas, equipo y programas informáticos para el ensayo. En esencia, el ensayo es un
sistema que comprende otros elementos distintos a las etapas del ensayo y a los reactivos por sí solos. Por lo tanto, la valida-
ción previa al estudio establece la aptitud del sistema (establecimiento de los criterios para muestras de control que se usan
para aceptar o rechazar corridas y límites de imprecisión para muestras individuales) y, posteriormente, la validación durante el
estudio continúa con la verificación. Los cambios críticos a los métodos a menudo requieren de validación adicional (parcial o
total), lo que en ocasiones conduce a la revisión de los criterios de aptitud del sistema.
DiluciónMínima Requerida
Durante el desarrollo del ensayo, la dilución mínima requerida se puede definir como el nivel de dilución de la muestra ne-
gativa de anticuerpos antifármacos que genera el cociente más alto entre señal y variabilidad (o factor Z').
La capacidad de diluir dichas muestras también se debe evaluar para asegurar que la dilución mínima requerida seleccionada
está adecuadamente alejada de cualquier efecto de prozona (efecto gancho) que pudiera haberse observado. Aunque son po-
co comunes, algunos efectos de prozona pueden requerir que el método de prueba incluya más de una dilución de una mues-
tra de prueba para minimizar los datos falsos negativos.
La dilución mínima requerida se debe evaluar durante la fase de desarrollo/diseño del ensayo, es decir, antes de que los ana-
listas inicien los experimentos de validación, de modo que los analistas no necesiten repetir la evaluación durante la validación.
La dilución mínima requerida se puede establecer usando 1O muestras negativas de anticuerpos antifármacos obtenidas de in-
USP42 InformaciónGeneral/ {1106) Ensayos de lnmunogenicidad lnmunoensayos 7925
dividuos sin tratar, cada una analizada en diluciones seriales dobles (p. ej., un intervalo de 1:5 a 1 :80). La dilución mínima
requerida en ocasiones se define como el nivel de dilución que genera el cociente más alto entre señal y fondo cuando, gene-
ralmente, el fondo es la matriz de dilución. Sin embargo, esta definición ignora la variabilidad en la señal. Por consiguiente, es
preferible definir el valor entre señal y fondo e incluir la variabilidad.
Una forma de hacerlo es usando un factor Z' que incluya tanto la intensidad de la lectura del ensayo como su variabilidad en
diluciones diferentes (ver el Apéndicepara más información). Elfactor Z' para cada nivel de dilución se obtiene a partir de la
fórmula [(media (S) - 3 SD (S)] - [media (EI)+ 3 SD (EI)]/[media(S) - media (EI)],donde 5 es la señal del ensayo de la muestra
diluida y Bes la señal de fondo. Por ende, la dilución mínima requerida es la dilución que genera un valor deseado para el
factor Z' y el cociente entre señal y fondo. Esta métrica se usa ampliamente para ensayos de detección de alto rendimiento
para asegurar una confianza adecuada en la capacidad para diferenciar entre muestras verdaderamente positivas y muestras
negativas. Una dilución mínima requerida inapropiadamente grande puede comprometer la sensibilidad de un ensayo.
Validación Previa al Estudio
La validación previa al estudio establece lo siguiente:

1 . Puntos de corte del ensayo
2. Criterios de aptitud del sistema
3. Sensibilidad relativa
4. Especificidad
5. Selectividad/interferencia
6. Precisión
7. Robustez
8. Reproducibilidad
9. Estabilidad
Puntos de Corte del Ensayo
Dada la naturaleza semicuantitativa de los métodos de detección de anticuerpos antifármacos, se vuelve necesario el uso de
un umbral de decisión o punto de corte para discriminar entre muestras positivas y negativas de anticuerpos antifármacos.
Puesto que el ensayo de detección y el ensayo confirmatorio de especificidad producen diferentes tipos de resultados, se re-
quieren puntos de corte separados. En algunos casos, también puede requerirse un punto de corte diferente para evaluar los
títulos de muestras positivas confirmadas del ensayo de titulación. A continuación se resumen algunos puntos clave del proce-
so de evaluación (más información se encuentra disponible en el Apéndice).
MUESTRASPARALA EVALUACIÓN
DELPUNTO DE CORTE
Se deben usar muestras de una población apropiada para el desarrollo de puntos de corte del ensayo. En algunos casos,
podría resultar poco práctico o factible obtener matrices de muestras de una población que tiene una enfermedad diana antes
de iniciar los experimentos de validación previos al estudio. Por consiguiente, comúnmente se usan muestras de sujetos salu-
dables sin tratar para establecer los puntos de corte iniciales. Se prefiere este enfoque para un estudio de Fase 1 convencional
con voluntarios normales. Cuando el programa clínico progresa más allá de la Fase 1 y las muestras obtenidas de la población
con la enfermedad diana se encuentran disponibles, resulta más apropiado reevaluar los datos de los puntos de corte para la
población diana. Si la distribución de las respuestas del ensayo con respecto a la media y a la variabilidad son comparables
entre la población diana y los voluntarios normales, entonces se puede usar el mismo punto de corte. De lo contrario, resultan
más apropiados los puntos de corte específicos para la enfermedad diana, además de que se pueden considerar puntos de
corte fijos o flotantes calculados a partir de datos obtenidos de muestras de la línea de base de un ensayo clínico.
PUNTOS DE CORTEDE DETECCIÓN
El punto de corte del ensayo de detección es una señal en el ensayo de detección que identifica una muestra que posible-
mente contiene anticuerpos antifármacos (denominada muestra positivade deteccióno potencialmentepositiva)contra una
muestra negativa de anticuerpos antifármacos. Se establece un punto de corte del ensayo de detección durante la validación
previa al estudio basándose en un riguroso análisis sistemático y estadístico de las respuestas del ensayo a partir de un panel de
muestras individuales que se consideran representativas de una población diana de pacientes sin tratar.
Para determinar los puntos de corte del método de detección para ensayos clínicos, los analistas deben usar muestras de al
menos 50 individuos que no hayan sido tratados con el fármaco para una evaluación robusta. Si se apunta a indicaciones adi-
cionales, los analistas deben analizar al menos 20 individuos que no hayan sido tratados con el fármaco por cada indicación. Si
la variabilidad es significativamente distinta de la indicación original, entonces puede ser necesario analizar a un número adi-
cional de individuos que no hayan sido tratados con el fármaco. De lo contrario, se puede aplicar el punto de corte original a
la indicación adicional. Para valoraciones no clínicas, debería ser suficiente un total de al menos 25 individuos que no hayan
sido tratados con el fármaco. Para asegurar que este punto de corte es robusto, al menos dos analistas deben realizar este ex-
perimento durante tres días usando al menos dos diseños diferentes de placa. Un diseño experimental equilibrado con los dise-
ños de placa ayudará a evitar confusiones potenciales entre analistas, muestras de sujetos, fechas de corridas, entre otros. Para
los ensayos clínicos de anticuerpos antifármacos, cuando se están analizando múltiples poblaciones en estado de enfermedad,
éstas deberán distribuirse de manera uniforme a través de las placas para asegurar que se encuentren apropiadamente equili-
bradas entre placas y corridas. Los valores aberrantes estadísticos de los resultados de las muestras deben examinarse y elimi-
narse, p. ej., usando gráficas de caja para valores aberrantes definidas en términos de rango de cuartiles e intercuartiles. Asimis-
mo, se pueden excluir también las muestras reactivas confirmadas (p. ej., mediante inmunoagotamiento ).
Se pueden calcular tres tipos de puntos de corte de detección para su aplicación durante la fase de estudio-fijos, flotantes y
dinámicos-y se debe seleccionar apropiadamente uno de éstos para el bioanálisis de la fase de estudio.
Punto de corte fijo-Un punto de corte fijo es aquél que se determina en una validación previa al estudio y se usa de ma-
nera subsiguiente en la fase durante el estudio. El punto de corte fijo se usa para análisis de muestras de prueba hasta que surja
la necesidad de revalidar o cambiar el punto de corte (p. ej., debido a un cambio crítico en el ensayo, transferencia del ensayo
a otro laboratorio, mejora en la versión de los instrumentos, etc.). Elvalor de punto de corte se puede fijar dentro de un estu-
dio dado, para una población diana o entre estudios y múltiples poblaciones diana. Para usar este enfoque, se deben demos-
trar estadísticamente medias y varianzas similares en todas las corridas durante la validación previa al estudio. Se puede deter-
minar un punto de corte fijo basándose en la media + 1,645 SD (desviación estándar), que representa el 95° percentilo de la
población en una distribución normal (y, por lo tanto, se espera identificar aproximadamente 5% de las muestras como falsos
positivos). La desviación estándar debe incluir diferentes fuentes de variación tales como la variabilidad intracorridas, entre co-
rridas, entre analistas y entre sujetos. Si los datos no están distribuidos de manera normal, se pueden usar transformaciones
apropiadas (por lo regular, transformaciones logarítmicas). Si la transformación no ayuda, generalmente se acepta determinar
el 95° percentilo no paramétrico. Sin embargo, se puede considerar adecuado en ensayos preclínicos usar un punto de corte
en el 99° o 99,9° percentilo, puesto que la inmunogenicidad de una proteína normalmente resulta en títulos altos de anticuer-
pos. Alternativamente, incluso si los datos de la validación sugieren medias y varianzas similares entre corridas, para tomar en
cuenta posibles desviaciones en todas las corridas del ensayo durante la fase de bioanálisis durante el estudio, resultaría más
seguro aplicar un punto de corte flotante.
Punto de corte flotante-Un punto de corte flotante es aquél que se calcula aplicando un factor de normalización aditivo
o multiplicativo, determinado a partir de los datos de la validación previa al estudio, al fondo biológico obtenido durante la
fase de estudio (ver el Apéndice G de Shanker et al., 2008, en el Apéndicepara información detallada). Elfondo biológico se
puede representar mediante el control negativo (combinación de la matriz de sujetos que son negativos para anticuerpos anti-
fármacos), el diluyente del ensayo o la muestra del sujeto previa a la dosis (punto de corte específico del sujeto). El método
para determinar el punto de corte flotante usa la estimación de variación de la validación previa al estudio que incluye diferen-
tes fuentes de variación tales como la variabilidad intracorridas, entre corridas, entre analistas y entre sujetos. Dicho punto de
corte se recomienda cuando las medias de las muestras no tratadas con el fármaco no son similares, pero sí lo son las varianzas
en todas las corridas. Cuando se usa un control negativo para la normalización, los analistas también deben asegurar que los
resultados del control negativo representan los resultados de la matriz de muestra que no ha sido tratada con el fármaco de la
población diana. Esto se logra demostrando que la señal del control negativo presenta una tendencia direccional con la señal
de las muestras individuales. Como alternativa, puede resultar más apropiado el uso del diluyente del ensayo para normaliza-
ción o el pretratamiento de los resultados de la muestra del sujeto ("línea de base"). Sin embargo, un cociente previo a la dosis
y posterior a la dosis puede ser una mejor solución.
Punto de corte dinámico-Un punto de corte dinámico es aquél que cambia entre las placas en una corrida, entre corridas
en un estudio o entre estudios, y no aplica las estimaciones de variación de la validación previa al estudio. Esta última caracte-
rística lo diferencia de un punto de corte flotante. Este enfoque es necesario únicamente cuando las medias y las varianzas
difieren significativamente entre corridas. Debido a que este enfoque implica analizar diversas muestras individuales que no
han sido tratadas con el fármaco para la evaluación de un punto de corte específico de la corrida, consume una gran parte de
las placas de cada corrida durante el estudio y, por tanto, no es factible desde el punto de vista práctico, en especial cuando
los analistas usan placas de 96 pocillos en lugar de placas de 384 pocillos. Las diferencias de variabilidad entre corridas del
ensayo en ocasiones pueden resolverse mediante la optimización adicional de algunos pasos clave en el protocolo del ensayo o
resolviendo algunas cuestiones analíticas. En algunos casos, las diferencias de variabilidad se pueden atribuir a analistas o ins-
trumentos diferentes, y el uso de un punto de corte flotante para un analista o instrumento específicos puede resolver dicha
cuestión. Si la optimización adicional no resuelve la situación o si las causas no son claras, otra alternativa práctica puede ser
combinar la variabilidad entre todas las corridas y usar esta varianza combinada para la evaluación del punto de corte flotante
durante la fase de estudio.
PUNTO DE CORTEDELMÉTODO DE CONFIRMACIÓNDE LAESPECIFICIDAD
Debido al enfoque conservador de incorporar una tasa de 5% de falsos positivos en el cálculo del punto de corte de detec-
ción, la eliminación de las muestras falsas positivas mediante la confirmación de la unión específica del fármaco es un compo-
nente importante de los análisis biológicos de anticuerpos antifármacos. También resulta importante comprender el nivel, si lo
hubiera, del fármaco mismo dentro de la muestra.
La cantidad de cambio en la señal del ensayo que diferencia la unión específica del fármaco de la unión no específica se
denomina punto de cortede especificidad. El punto de corte de especificidad debe determinarse mediante un enfoque objetivo
en el contexto de variabilidad del ensayo cerca del intervalo positivo bajo del ensayo. Para determinar el punto de corte de
especificidad, se deben evaluar muestras de al menos 25 individuos que no hayan sido tratadas con el fármaco (sin embargo,
comúnmente se usa un número mayor cuando se encuentran disponibles), con y sin preincubación del fármaco. Idealmente,
estas muestras deben ser las mismas que las analizadas durante la evaluación del punto de corte de detección, además de que
se deben analizar los equivalentes con y sin cantidades agregadas conocidas de las muestras individuales del sujeto en conjun-
to con las mismas placas.
Se debe calcular el cambio medio porcentual de la muestra sin cantidades agregadas conocidas (inhibición) y la desviación
estándar. La inhibición media más 3,09 SD (si se desea una tasa de falsos positivos de O,1%) representa el punto de corte de
especificidad. Al igual que en la determinación del punto de corte de detección, las muestras específicamente reactivas des-
pués de la preincubación con el fármaco (es decir, aquéllas que contienen anticuerpos preexistentes) y los valores estadísticos
aberrantes deben eliminarse para que el punto de corte de especificidad sea más conservador. El proceso analítico descrito
anteriormente para el punto de corte de detección se aplica también a la evaluación del punto de corte de especificidad.
En ocasiones, para esta evaluación de punto de corte se consideran enfoques alternativos, tales como el uso de muestras
positivasbajassimuladasen las que se agrega a las muestras individuales que no han sido tratadas con el fármaco una cantidad
conocida baja de un control positivo. Sin embargo, este método es subjetivo y no se recomienda debido a que depende de la
concentración del control positivo y a la afinidad/avidez única del control positivo que pudiera o no ser representativo de
muestras verdaderas de pacientes positivos verdaderos. Las fuentes adicionales de información relacionada con los méritos es-
tadísticos relativos de estos enfoques y métodos para verificar las suposiciones se encuentran listadas en el Apéndice.
PUNTO DE CORTEDELMÉTODO DE TITULACIÓN
El punto de corte del método de titulación es un valor del resultado de prueba por debajo del cual la dilución adicional en
serie de una muestra positiva de anticuerpos antifármacos produce resultados de ensayo negativos. Por lo regular, el punto de
corte del ensayo de detección se usa como el punto de corte de la titulación, pero puede ser necesaria la validación de un
punto de corte del método de titulación distinto cuando la señal del diluyente del ensayo o de la matriz ocasiona resultados
más altos que el punto de corte del ensayo de detección (debido a un efecto de bloqueo del suero) o si las muestras a una
dilución mayor que la dilución mínima requerida no generan constantemente resultados negativos, es decir, cuando el punto
de corte de detección cae en la meseta inferior de la curva de dilución del control positivo. En dichos casos, los mismos datos
generados durante un experimento de punto de corte de detección se pueden usar para definir el punto de corte de la titula-
ción usando un criterio de umbral con una tasa de O,1% de falsos positivos (es decir, Media+ 3,09 SD). Durante el bioanálisis,
se puede asignar a las muestras de pacientes positivas confirmadas que caen entre el punto de corte de detección y el punto
de corte de titulación un valor de título igual al de la dilución mínima requerida.
PUNTO DE CORTEDELMÉTODO DE REACTIVIDAD

CRUZADA
Cuando resulte aplicable, las muestras de anticuerpos antifármacos positivas que se confirmen como específicas del fármaco
se pueden caracterizar adicionalmente para determinar la reactividad cruzada con otros antígenos relacionados. Al igual que el
ensayo de confirmación de especificidad, un método de prueba de reactividad cruzada puede requerir una etapa de preincu-
bación con y sin el antígeno relacionado. La reactividad cruzada con el antígeno se confirma cuando la inhibición porcentual
de la señal en presencia del antígeno es mayor o igual al punto de corte del método de reactividad cruzada. Los métodos para
determinar el punto de corte del método de reactividad cruzada son similares a los del punto de corte del método de especifi-
cidad, aunque también puede resultar aceptable aplicar el punto de corte de confirmación de especificidad del fármaco.
Definiciónde la Aptitud del Sistema
CONTROLESDELENSAYO
Los controles para anticuerpos antifármacos positivos pueden incluir anticuerpos antiidiotipo policlonales o monoclonales. Es
necesario purificar y cuantificar la afinidad de los controles para permitir la validación del ensayo. Cada corrida (o placa) debe
incluir al menos un nivel bajo de control positivo (controlpositivobajo)y un control negativo, pero la inclusión de un control
de nivel más alto (controlpositivoalto) también puede ser útil en el monitoreo del desempeño del método. El seguimiento de
todos estos controles con el paso del tiempo puede asegurar que el método se esté desarrollando adecuadamente. Un control
positivo bajo ayuda a asegurar que el ensayo siga siendo igual de sensible durante el bioanálisis de la fase de estudio que du-
rante la validación previa al estudio.
Por una parte, el control positivo bajo debe producir una respuesta que pueda ser observada de manera reproducible por
encima del punto de corte, aunque, en ocasiones, puede resultar en una señal que esté por debajo del punto de corte (lo que
provocaría que el ensayo fallase o fuese invalidado). Por otra parte, seleccionar una concentración irracionalmente alta para un
control positivo bajo puede producir una señal de ensayo que esté significativamente por encima del punto de corte, lo cual es
7928 (1106) Ensayos de lnmunogenicidad lnmunoensayos / InformaciónGeneral USP42
inapropiado. Para darle objetividad a la selección de una concentración para el control positivo bajo, resulta útil pensar en tér-
minos de tasas de rechazo del ensayo, es decir, el porcentaje de ensayos (placas) que fallan debido a que el control positivo
bajo produce un resultado por debajo del punto de corte. A manera de ejemplo, y con el fin de entender si el control positivo
bajo es lo suficientemente bajo, una tasa de rechazo del 1% puede ser un objetivo razonable para un control positivo bajo.
Esto se calcula como media+ t0, 01,dl x SO, donde media y SO se determinan usando los datos del experimento de sensibilidad o
los datos de desarrollo del ensayo relacionados, y t 0, 01,d 1 es el valor crítico determinado a partir de la distribución t correspon-
diente a una tasa de falsos positivos del 1o/oy df son los grados de libertad que dependen del número de muestras y corridas
usadas en el cálculo. Esto teóricamente implica que aproximadamente 99% de los datos de los controles positivos bajos coinci-
dirán o estarán por encima del punto de corte.
Un control positivo alto opcional puede ser útil para métodos que son propensos a efectos de gancho, seguimiento del de-
sempeño del ensayo, calificaciones de reactivos y resolución de problemas, La concentración del control positivo alto se debe
seleccionar a partir del extremo superior del intervalo lineal de la curva de dilución, por lo general apenas por debajo de la
meseta superior de la curva.
CRITERIOSDE APTITUDDELSISTEMA
Los criterios de aptitud del sistema que usan controles del ensayo ayudan a asegurar que el procedimiento analítico siga
siendo válido para su uso. Se deben establecer intervalos de aceptación (criterios de aptitud del sistema) para controles de
calidad mediante la evaluación estadística de los datos experimentales adquiridos durante la validación del ensayo.
Cuando se considera necesario el enfoque de punto de corte flotante y se emplea para la evaluación del punto de corte de
la detección, los criterios o límites de aptitud del sistema se pueden definir para el cociente entre el control positivo bajo y el
control negativo y para el cociente entre el control positivo alto y el control positivo bajo, o un control negativo, en lugar de
definir límites por separado para cada control positivo. Asimismo, resulta de utilidad aplicar criterios de aceptación para la pre-
cisión dentro del ensayo (variabilidad de señales de determinaciones repetidas en un ensayo) para la fase durante el estudio.
Aunque deben rechazarse los datos de los ensayos que no cumplan con los criterios de aceptación en la fase de estudio, se
debe evitar el establecimiento de criterios para ensayos que pasen o fallen en los experimentos de validación previos al estudio
debido a que éstos pueden llevar a la potencial exclusión de algunos datos de validación, lo que puede resultar en una estima-
ción inexacta del error analítico. Se deben incluir todos los ensayos durante la validación previa al estudio y la única excepción
deberían ser aquéllos rechazados por una causa asignable (p. ej., error técnico).
Sensibilidad Relativa
No se puede esperar que alguno de los controles positivos de anticuerpos antifármacos sea representativo del espectro de
respuestas inmunes humorales observadas en individuos tratados con los compuestos en estudio. La sensibilidad de los ensa-
yos de anticuerpos antifármacos depende en gran medida de la naturaleza de los reactivos del control positivo, por lo que los
controles positivos de alta afinidad a menudo producen mejores valores de sensibilidad que los controles positivos de menor
afinidad en el mismo ensayo. Los analistas deben considerar esto al momento de seleccionar controles, así como al momento
de estimar la sensibilidad del ensayo. Además, debido a que el fármaco mismo puede interferir con la detección de anticuerpos
antifármacos, la sensibilidad de la detección de anticuerpos antifármacos se vuelve progresivamente más deficiente en presen-
cia de concentraciones crecientes del fármaco dentro de la muestra. A pesar de estas importantes consideraciones, la determi-
nación de la sensibilidad del ensayo tiene valor al momento en que los analistas seleccionan un método o plataforma óptima
de detección de anticuerpos antifármacos, un control positivo bajo para la validación, o cuando evalúan la aptitud de un ensa-
yo. La evaluación de la sensibilidad del ensayo en presencia de un fármaco interferente (tolerancia al fármaco) es crítica para
comprender la aptitud del método para detectar anticuerpos antifármacos en pacientes tratados con el fármaco. La sensibili-
dad del ensayo de anticuerpos antifármacos no debe definirse como un solo valor, sino como un conjunto de al menos dos
valores: (1) la concentración de anticuerpos antifármacos en el control positivo detectados dentro de una matriz sin diluir en
ausencia de cualquier fármaco y (2) la concentración de anticuerpos antifármacos en el control positivo detectados dentro de
una matriz sin diluir en presencia de niveles de fármaco esperados en los tiempos de muestreo cuando se toman las muestras
para los análisis de anticuerpos antifármacos. En general, los ensayos deben demostrar una sensibilidad de al menos 500
ng/mL para métodos aplicados a estudios clínicos (o 1000 ng/mL para estudios no clínicos) para demostrar su aptitud para el
propósito previsto-es decir, para la detección de anticuerpos antifármacos clínicamente significativos, aunque la sensibilidad
del ensayo debe justificarse para cada caso. No es de utilidad expresar la sensibilidad en términos de títulos de antisuero y, por
lo tanto, la sensibilidad debe evaluarse usando preparaciones de anticuerpos monoclonales o policlonales con afinidad purifica-
da. Los analistas pueden evaluar la sensibilidad mediante dos corridas de ensayo realizadas por dos operadores independientes
(cuando resulte factible) para un total de al menos tres corridas.
Para evaluar la sensibilidad en ausencia de un fármaco, los analistas deben preparar muestras simuladas con concentraciones
conocidas de anticuerpos antifármacos que se diluyen en serie (por lo general, diluciones en serie dobles o triples) en una ma-
triz combinada de individuos que no han sido tratados con el fármaco y evaluados de acuerdo con el método de detección
hasta que los resultados del ensayo de las diluciones en la matriz estén por debajo del punto de corte del ensayo de detección.
La concentración más baja de anticuerpos antifármacos que se halla constantemente (por ejemplo, usando un límite de con-
fianza superior del 95% basándose en el número de corridas u operadores) por encima del punto de corte del ensayo de de-
USP42 InformaciónGeneral/ (1106} Ensayosde lnmunogenicidad lnmunoensayos7929
tección se considera como la sensibilidad del ensayo. Alternativamente, se puede tratar de la concentración más baja de anti-
cuerpos antifármacos que se halla por encima del punto de corte del ensayo de detección en todas las corridas por todos los
operadores o en 19 de 20 corridas (ver el Apéndicepara más información).
Para evaluar la sensibilidad en presencia de un fármaco, se pueden considerar dos enfoques experimentales alternativos: (1)
titular el fármaco en una matriz sin diluir con concentraciones establecidas de un control positivo de anticuerpos antifármacos
(p. ej., 250, 500 ó 750 ng/mL). Informar la concentración más alta del fármaco en la que los anticuerpos antifármacos sigan
siendo detectables. (2) Como alternativa, debido a que las muestras de inmunogenicidad a menudo se toman a los tiempos de
muestreo de baja concentración de fármaco, se puede usar el conocimiento previo del intervalo de concentración previsto pa-
ra determinar la sensibilidad de la valoración en presencia de las concentraciones esperadas del fármaco.
Especificidad
La especificidad se refiere a la capacidad del método para detectar anticuerpos antifármacos que se unen específicamente a
la molécula del fármaco, sus dominios o componentes. La valoración se desarrolla y optimiza basándose en la capacidad de los
anticuerpos antifármacos del control positivo para unirse específicamente al fármaco. Durante la validación, los resultados del
ensayo de confirmación de especificidad sustentan la especificidad del ensayo.
Selectividade Interferencia
La selectividad de un ensayo de anticuerpos antifármacos es su capacidad para identificar un control positivo en matrices de
muestras biológicas que pueden contener sustancias interferentes potenciales y es una cuestión importante para los ensayos de
detección de anticuerpos antifármacos. Dichos efectos de la matriz por lo general surgen de interacciones de unión no especí-
fica entre un factor presente en la matriz y los anticuerpos antifármacos o de la unión específica de factores desconocidos.
Durante la validación, los analistas evalúan la selectividad del ensayo de anticuerpos antifármacos observando la recuperación
de analito (representada por una muestra de control positivo) a partir de matrices de muestras que contienen los interferentes
potenciales. Una consideración importante en ese punto es que la selectividad de un ensayo de anticuerpos antifármacos, se-
gún se evalúa usando el control positivo, puede no reflejar la selectividad del ensayo cuando se usa con muestras reales clínicas
o no clínicas.
La interferencia es la propiedad de un factor (regularmente el fármaco mismo y su diana, si es soluble) de afectar los resulta-
dos del ensayo de manera positiva o negativa. Se debe evaluar usando una muestra de prueba de anticuerpos antifármacos
positiva baja a la que se agrega una cantidad conocida a una matriz de muestra proveniente de pacientes que no han sido
tratados con el fármaco. Se debe evaluar cada uno de los factores interferentes potenciales en un intervalo fisiológicamente o
farmacológicamente pertinente de concentraciones. La concentración más alta del factor interferente que no altere la clasifica-
ción de la muestra de prueba (p. ej., una muestra de anticuerpos antifármacos que permanece positiva con respecto al punto
de corte del ensayo de detección) se define como la tolerancia del ensayo a dicho factor interferente. Para productos terapéuti-
cos que tienen una vida media terminal larga, el interferente principal en un ensayo de anticuerpos antifarmacos es el fármaco
mismo. Según se describió previamente, la tolerancia al fármaco de un ensayo se debe interpretar como la sensibilidad del
método en presencia del fármaco interferente.
Otros interferentes endógenos incluyen dianas de fármacos oligoméricas, o el receptor soluble de la diana puede interferir
con la detección de anticuerpos antifármacos. Asimismo, algunos pretatamientos de muestras que se llevan a cabo para redu-
cir la interferencia del fármaco pueden liberar la diana del fármaco de los complejos fármaco-diana, lo que conlleva a proble-
mas subsiguientes de interferencia. Por ende, los analistas deben evaluar cuidadosamente las etapas de pretratamiento tales
como disociación con ácido durante el desarrollo del ensayo para mitigar el riesgo de datos inexactos.
Precisión
La precisión es una medida de la variabilidad en una serie de mediciones para la misma corrida de material en un método.
Los criterios de aceptación para la precisión de los ensayos de anticuerpos antifármacos deben estar dentro del intervalo co-
múnmente esperado para inmunoensayos. Estos criterios también deben ser apropiados para la plataforma del ensayo y deben
ser adecuados para su propósito. Durante la validación del ensayo, se debe determinar la precisión en experimentos que se
corren al nivel de uso previsto durante la fase de estudio (p. ej., número de placas, muestras por placa, etc.).
Los criterios de aceptación para precisión deben estar dentro del intervalo comúnmente esperado para inmunoensayos. Es-
tos criterios también deben ser apropiados para la plataforma usada, tomando como guía los datos de desarrollo del ensayo y
la experiencia con la plataforma tecnológica y método del ensayo. El Apéndicecontiene información adicional sobre este tema.
DETECCIÓNY PRECISIÓNDELMÉTODO DE CONFIRMACIÓN
Para ensayos de detección de anticuerpos antifármacos con lecturas numéricas (contrarias a las lecturas categóricas sí/no), la
precisión del ensayo se puede determinar usando datos de al menos seis corridas de ensayo independientes de los controles
positivos de ensayo (controles positivos bajos y altos). Por lo regular, las estimaciones de la precisión intraensayo (variabilidad
7930 (1106) Ensayosde lnmunogenicidad lnmunoensayos / Información General USP42
entre determinaciones repetidas, también denominada repetibilidad intraensayo) y de la precisión entre ensayos (también de-
nominada repetibilidad entre ensayos o precisión general intermedia, total o general ) se informan como coeficiente de varia-
ción porcentual (o/oCV).
La precisión intraensayo (repetibilidad) es la variabilidad de los resultados del ensayo cuando se analiza el mismo material
múltiples veces dentro de la misma corrida. La precisión entre ensayos (también denominada precisión intermedia o total) es la
variabilidad de los resultados del ensayo cuando la misma muestra se analiza en corridas separadas, durante días separados y
por múltiples operadores (o solo un operador si el bioanálisis de la fase de estudio está diseñado para que lo lleve a cabo un
solo operador). Éstos se expresan como o/oCVde señales de anticuerpos antifármacos. Los datos de determinaciones repetidas
de controles negativos y positivos de cada una de todas las corridas analizadas durante la fase de validación previa al estudio se
combinan y analizan dentro del marco de ANOVAde efectos aleatorios, lo que resulta en estimaciones de o/oCVintraensayo y
o/oCVentre ensayos. Los analistas deben considerar los efectos de posición variando la posición de la muestra en las placas de
microtitulación puesto que dichos efectos (p. ej., efectos del borde) pueden influenciar la precisión del ensayo. Se debe usar el
mismo número de determinaciones repetidas de muestras de prueba y de control durante la validación tal como se usan en el
ensayo durante el uso de rutina.
De manera similar, las estimaciones de precisión intra y entre ensayos para el ensayo de confirmación se pueden derivar
usando los datos de inhibición porcentual de las muestras de control positivo bajo con cantidades agregadas conocidas contra
aquéllas sin cantidades agregadas a partir de múltiples corridas del ensayo (al menos seis) en la validación previa al estudio.
PRECISIÓNDELENSAYODE TITULACIÓN
Para determinar la precisión de un título, dos o más analistas deben valorar diluciones seriales dobles de cinco o más mues-
tras de control positivo alto simuladas en al menos seis corridas. Las muestras de control positivo alto simuladas se pueden
obtener mezclando cantidades conocidas de sueros individuales negativos obtenidos de la población diana con una muestra
positiva alta. Posteriormente, se determina el título mediante interpolación de cada una de las curvas de dilución y se calcula la
media y desviación estándar generales. Se puede determinar la precisión intra y entre valoraciones (o/oCV).
Un enfoque recomendado, aunque más riguroso, es usar estos datos para definir un cociente mínimo significativo (MSR, por
sus siglas en inglés): MSR = 1Q<•sqrt( 2l· 50 , donde SD es la desviación estándar general (intracorrida más la variación entre corri-
das) de los títulos en escala logarítmica en base 1O, y tes el umbral de la distribución t de Student con n - 1 grados de libertad
(n = número de corridas). El cociente mínimo significativo calculado refleja el cambio de veces más pequeño en los valores de
título que se puede considerar estadísticamente significativo (P< 0,05)-es decir, si el cociente mínimo significativo= 5, enton-
ces los títulos que difieran en más de cinco veces de dicho valor se pueden considerar significativos. Además de servir como un
indicador del nivel de variabilidad en los títulos del control positivo, esta evaluación del cociente mínimo significativo también
puede ser un criterio aproximado para comparar muestras con anticuerpos preexistentes confirmados en la línea de base con-
tra las muestras posteriores al tratamiento para evaluar la inmunogenicidad inducida por el tratamiento. El cociente mínimo
significativo se aplica únicamente si el título está interpolado y no se aplica a títulos de punto final.
Robustez
La robustez es una indicación de la confiabilidad de un ensayo. Se evalúa por la capacidad del ensayo de permanecer inafec-
tado por variaciones pequeñas pero deliberadas en el desempeño del método esperadas en cambios relevantes y reales en si-
tuaciones comunes en el laboratorio. La selección de variables de robustez para analizar durante la validación se debe basar en
el conocimiento del ensayo y sus riesgos asociados. Algunas variables comunes son los lotes de placa de microtitulación, tiem-
pos de incubación, temperatura y lotes de reactivo y concentraciones. Las muestras del estudio o las muestras de control posi-
tivo se pueden usar para analizar la robustez del ensayo. Se recomienda el uso de criterios de aceptación para controles de
aptitud del sistema durante la validación de la robustez (calculados a partir de los datos de desarrollo y optimización del ensa-
yo o de criterios de aceptación validados de control de la aptitud del sistema). El monitoreo continuo de un ensayo durante la
validación y en etapas posteriores con registros estrictos de parámetros de ensayo claves (p. ej., los tiempos de incubación,
volúmenes pipeteados de reactivos críticos, operadores, etc.) puede ayudar a identificar algunas de las interacciones de los fac-
tores de robustez cuando se han acumulado datos suficientes.
Reproducibilidad
La reproducibilidad de un ensayo de acuerdo con el capítulo general de la USP Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos

(1225) y de la pauta ICH Q2(Rl) Validationof Analytical Procedures:Textand Methodology (Validación de Procedimientos Analíti-
cos: Texto y Metodología) es la confiabilidad de un método cuando se realiza en dos o más laboratorios. En el contexto de la
transferencia de métodos y de demostraciones de la validez del método entre laboratorios, la reproducibilidad del ensayo es
igual que la validación cruzada.
La reproducibilidad se puede aplicar únicamente si un ensayo se lleva a cabo en dos o más laboratorios independientes du-
rante el bioanálisis de la fase de estudio. La reproducibilidad es una evaluación de la transferibilidad de un ensayo, es decir, la
validez de las muestras de análisis en dos o más laboratorios y la comparabilidad de los datos producidos por éstos. Las evalua-
USP42 InformaciónGeneral/ (1106) Ensayos de lnmunogenicidad lnmunoensayos 7931
ciones de reproducibilidad no consideran los cambios de rutina en un ensayo tales como la imprecisión entre equipos o entre
analistas. Dichos factores que contribuyen con la variabilidad (a menudo referidos como factores de precisión intermedia) son
parte de la variabilidad de la reproducibilidad.
Los criterios de aceptación de la fase del estudio para los controles de aptitud del sistema son establecidos por el laboratorio
generador (ver a continuación) durante el proceso original de validación del ensayo. El desempeño de estos controles se puede
comparar entre múltiples laboratorios. No obstante, cuando solamente un laboratorio realiza el ensayo de anticuerpos antifár-
macos, puede no ser necesario validar la reproducibilidad hasta que el método haya sido transferido a otro laboratorio.
Estabilidad
Resulta útil entender las condiciones de almacenamiento óptimas para muestras del ensayo, controles, materiales y reactivos,
y éstas deben investigarse como parte de la optimización del ensayo antes de la validación. Posteriormente, durante la valida-
ción del ensayo, los estudios de estabilidad deben evaluar el desempeño del ensayo siguiendo las condiciones de almacena-
miento previstas. Idealmente, las condiciones de análisis de estabilidad deben reproducir las condiciones de manipulación de la
muestra, materiales y reactivos esperadas, las temperaturas de almacenamiento y las diversas duraciones del tiempo de alma-
cenamiento.
ESTABILIDAD
DE MATERIALES
Y REACTIVOS
Los ensayos de anticuerpos antifármacos son indicadores de la estabilidad con respecto a los materiales y reactivos aplica-
bles, y, por tanto, generalmente no se requieren pruebas separadas de estabilidad del reactivo para la validación del ensayo.
Durante el bioanálisis de la fase de estudio, se presume que los materiales y reactivos del ensayo son estables si los controles de
aptitud del sistema cumplen con los criterios de aceptación validados. Sin embargo, los analistas deben validar con anticipa-
ción la estabilidad de las placas que han sido preparadas (p. ej., recubiertas con anticuerpo de captura o bloqueadas) y alma-
cenadas.
MANIPULACIÓN
Y ESTABILIDAD
DE LA MUESTRA
Las muestras de anticuerpos antifármacos por lo regular se recolectan en una matriz de suero o plasma. Para muestras alma-
cenadas a una temperatura igual o inferior a -20ºC, la estabilidad de los anticuerpos antifármacos se acepta de manera global,
por lo que esta condición de almacenamiento puede no requerir de validación. Generalmente se acepta que una muestra de
anticuerpos antifármacos en suero o plasma se mantendrá estable después de tres ciclos de congelación-descongelación y has-
ta dos años cuando se almacena a -70ºC.
Documentación de la Validación Previa al Estudio
Por lo regular, se crean tres tipos de documentos específicos del ensayo durante la validación previa al estudio: un plan o
protocolo de validación del ensayo, una descripción del método del ensayo y un informe de validación del ensayo.
Se recomienda contar con un plan o protocolo de validación del ensayo antes de que los analistas comiencen los experimen-
tos de la validación previa al estudio. Este documento debe etablecer el propósito previsto del método, una descripción deta-
llada del inmunoensayo y de los reactivos o materiales, un resumen de las características de desempeño que se van a validar y
criterios de aceptación a priori para precisión, robustez, estabilidad y, cuando corresponda, reproducibilidad. El plan de valida-
ción debe presentar algunos detalles experimentales y procedimientos de manejo de datos puesto que dichos detalles proveen
una guía clara a los analistas de la validación y aseguran un mejor control sobre los datos resultantes.
Frecuentemente, se establece una descripción del método después de la validación previa al estudio, pero antes del estudio.
Esto provee una descripción detallada de los reactivos, controles y equipo necesarios para correr el ensayo, junto con un proce-
dimiento operativo con etapas detalladas e información sobre los procesos para la reducción e interpretación de datos. El pun-
to en el que dicha descripción se vuelve un Procedimiento Operativo Estándar es específico para el sistema de calidad de cada
fabricante.
Una vez completada la validación, los fabricantes generalmente llevan a cabo una revisión técnica realizada por expertos de
los datos de validación, seguida por una auditoría de los datos de validación. Cuando el trabajo de validación ha sido comple-
tado, se genera un informe de la validación del ensayo, el cual documenta todos los datos de validación del estudio, junto con
información sobre los métodos y partidas de reactivos que se usaron. El informe auditado recibe la aprobación gerencial y pos-
teriormente se archiva.
Validación Durante el Estudio
La validación durante el estudio (monitoreo del mantenimiento de la aptitud del sistema) y la revalidación son componentes
críticos de cualquier método bioanalítico. Por ende, la validación de un método en realidad no termina sino hasta que el méto-
do haya sido retirado del uso analítico.
7932 (1106) Ensayosde lnmunogenicidad lnmunoensayos / InformaciónGeneral USP42
Para analizar el desempeño durante el estudio de los métodos bioanalíticos cuantitativos, por lo general se requieren crite-
rios de aceptación de precisión y exactitud. Puesto que la exactitud no es aplicable para los métodos de anticuerpos antifárma-
cos, el monitoreo del desempeño de las muestras de control de calidad reafirma la certeza para los analistas de que el sistema
de ensayo es adecuado para su uso previsto, es decir, que el ensayo sigue siendo válido y que su desempeño es el mismo que
durante la validación previa al estudio.
El uso de un control positivo bajo asegura que la valoración mantenga su sensibilidad. Por lo regular, durante el análisis de
las muestras del estudio, la precisión intraensayo (entre determinaciones repetidas) de los resultados de controles positivos, así
como las muestras de prueba (con una señal de ensayo igual o mayor que el punto de corte de detección), se controla usando
criterios de aceptación de la aptitud del sistema para asegurar la obtención constante de datos significativos. Sin embargo, los
resultados por debajo del punto de corte pueden no ser necesarios para cumplir con el criterio de límite de coeficiente del
variación.
GESTIÓNDELCICLODE VIDA
La gestión del desempeño de los ensayos de inmunogenicidad desde el desarrollo clínico inicial, pasando por el ciclo de vida
subsiguiente del producto, requiere comprender las fortalezas, debilidades y capacidades del formato del método, así como de
los reactivos críticos para el ensayo y de las características de desempeño del ensayo. Asimismo, un plan bien definido de pro-
ducción de reactivos críticos, de caracterización y calificación, de calificación de proveedores de reactivos críticos y de paráme-
tros de caracterización y calificación para reactivos producidos internamente (nivel agregado y eficiencia del etiquetado) ayu-
dará a gestionar los riesgos de mantenimiento del ensayo y de la transferencia del método a otros laboratorios.
Cuando se presentan cambios en los componentes o equipos críticos del método, o en la población que se está estudiando
con un ensayo de anticuerpos antifármacos particular, puede ser necesario llevar a cabo una revalidación del ensayo. La revali-
dación puede abarcar parte o la totalidad de las características de validación (es decir, puede ser una revalidación parcial o
completa del ensayo). El uso de lotes o partidas de reactivos críticos para el ensayo que sean diferentes de los usados en la
validación previa al estudio no requieren de revalidación del ensayo, pero se deben sustentar mediante datos de calificación
experimental apropiados para el nuevo reactivo a fin de asegurar el mantenimiento de la aptitud del sistema.
Otro aspecto crítico de la gestión del ciclo de vida es el desarrollo de una estrategia para relacionar datos clínicos entre un
formato de ensayo existente y uno mejorado. Dichos cambios por lo general ocurren durante el ciclo de vida de un producto
debido a los compromisos posteriores a la comercialización u otras necesidades. Para facilitar la comparación y la validación
cruzada del método existente con las versiones revisadas, los analistas deben conservar alícuotas suficientes de los lotes origi-
nales de los reactivos críticos para el ensayo. Además, archivar muestras con cantidades agregadas conocidas de analito, así
como muestras de pacientes ciegas, resulta útil para relacionar lotes de reactivos y métodos a fin de minimizar desviaciones en
el desempeño del ensayo. Los analistas deben desarrollar un plan por escrito que detalle el tipo de cambios en el ensayo exis-
tente o en los reactivos críticos que requerirán una calificación del ensayo contra una validación cruzada o validación comple-
ta. Un documento de gestión de calidad debe incluir detalles tales como el número de ensayos que se deben realizar, el núme-
ro de analistas que se van a usar, la capacitación requerida para los analistas, los criterios de aceptación para demostrar la equi-
valencia entre métodos existentes y revisados, el análisis de datos y el método de informe. Esta información demuestra la ro-
bustez y la uniformidad del ensayo después de los cambios. Los controles de calidad que aseguran la equivalencia del ensayo
incluyen %CV, límites de tolerancia, valores de pendiente EC50 , nivel de título y relación señal-ruido. Un enfoque comúnmente
usado para demostrar la equivalencia de dos métodos de inmunogenicidad es la demostración de una concordancia del ~90%
en resultados de muestras archivadas entre los métodos existentes y revisados.
Los analistas deben usar muestras archivadas con un intervalo de valores positivos, así como un número apropiado de nega-
tivos para verificar que un nuevo ensayo segrega muestras en categorías positivas y negativas de la misma manera que uno
existente.
Otra consideración importante para la gestión del ciclo de vida de los reactivos críticos del ensayo es el monitoreo de la
estabilidad a largo plazo de los reactivos en diferentes condiciones de almacenamiento. Un plan detallado de análisis de estabi-
lidad incluye temperaturas de almacenamiento (4ºC, -20ºC y -70ºC), volumen de alícuota, ciclos de congelación-descongela-
ción y características de desempeño aceptables para calificación del ensayo, y se deben documentar los resultados. En este
contexto, puede ser prudente archivar muestras de pacientes para demostrar la estabilidad a largo plazo de la respuesta de
anticuerpos antifármacos policlonales en muestras reales de pacientes.
APÉNDICES
Apéndice 1: Análisisde la lnmunogenicidadno Clínica
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Apéndice 2: Atributos de Calidad y Evaluaciones de Riesgo de lnmunogenicidad
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www.ema.europa.eu/docs/en_ GB/document_library /Scientific_guideline/201 2/06/WC500128688.pdf. Consultado el 30
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EMEA.Guideline on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. 2015. http://
www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/l 0/WC500194507.pdf. Consultado el 15
de octubre de 2015.
(1106.1) ENSAYOSDE INMUNOGENICIDAD-DISEÑO Y VALIDACIÓN

DE ENSAYOSPARADETECTAR ANTICUERPOSNEUTRALIZANTES
ANTIFÁRMACOS
INTRODUCCIÓN
Y ALCANCE
La administración de medicamentos biológicos de origen natural o recombinante puede provocar cierto grado de respuesta
inmune que conlleva al desarrollo de anticuerpos antifárrnacos en sujetos tratados. Los anticuerpos neutralizantes son un sub-
conjunto de anticuerpos antifármacos que afectan la actividad biológica del medicamento biológico. Para los propósitos de
este capítulo, los anticuerpos neutralizantes se definen por su capacidad de neutralizar la actividad biológica de un producto
terapéutico en un sistema in vitro. Este capítulo no trata anticuerpos que pueden tener un impacto sobre la eliminación del
fármaco de la circulación. [NOTA-El Apéndiceprovee dos referencias útiles sobre este tema.] Se requerirían estudios clínicos
adicionales para evaluar los cambios ocasionados por la actividad biológica sobre los resultados terapéuticos.
7934 (1106.1) Ensayosde lnmunogenicidad / InformaciónGeneral USP42
Los anticuerpos neutralizantes pueden alterar la actividad biológica de la molécula terapéutica uniéndose a uno o más epíto-
pes que están ubicados dentro de su sitio activo. Además, los anticuerpos neutralizantes pueden interferir con los sitios activos
por impedimento estérico (es decir, el anticuerpo se une a áreas de la proteína que están cerca del sitio activo) o por inducir
cambios alostéricos en la conformación del fármaco (es decir, el anticuerpo se une a un sitio del fármaco e induce un cambio
en la conformación que puede interferir con la actividad del fármaco). Por lo tanto, es importante monitorear la inmunogenici-
dad de los productos terapéuticos biológicos a lo largo del ciclo de desarrollo del medicamento usando métodos sensibles y
confiables que no solo determinen la presencia o ausencia de anticuerpos antifármacos, sino que también caractericen su ca-
pacidad neutralizante. El objetivo de este capítulo de información general es proveer recomendaciones útiles sobre las mejores
prácticas que se pueden usar para el diseño basado en riesgos y validación de ensayos de anticuerpos neutralizantes antifárma-
cos.
Conforme a lo descrito en el capítulo Ensayosde lnmunogenicidad-Diseño y Validaciónde lnmunoensayospara DetectarAnti-
cuerposAntifármacos(1106), por lo regular se usan inmunoensayos (o ensayos de unión de ligandos) para detectar la presencia
de anticuerpos antifármacos. Se pueden usar diversos formatos de ensayos para determinar si un anticuerpo antifármaco tam-
bién es un anticuerpo neutralizante. El primer formato de ensayo, definido aquí como ensayo funcional de anticuerpos neutra-
lizantes (que por ende implica una respuesta biológica real), es el de uso más común y puede tomar la forma de un ensayo
funcional basado en células o un ensayo funcional no basado en células (p. ej., un ensayo bioquímico para una enzima tera-
péutica). Otro grupo principal de formatos de ensayos se basa en la inhibición de unión del ligandos mediada por anticuerpos
neutralizantes entre los productos terapéuticos y sus dianas. Estos ensayos pueden adoptar la forma de ensayos de unión basa-
dos en células (p. ej., cuando existe una diana en la superficie celular) o ensayos de unión que no se basan en células (p. ej.,
cuando se usa un receptor soluble purificado o un fármaco diana).
La decisión de usar un ensayo basado en células o uno no basado en células depende de factores que incluyen el mecanismo
de acción del fármaco y la evaluación del riesgo de inmunogenicidad, así como la disponibilidad de ensayos de anticuerpos
neutralizantes pertinentes y sensibles (Figura 1). Otra consideración importante al seleccionar el formato del ensayo es el grado
de riesgo para la seguridad del paciente presentado por la formación de anticuerpos neutralizantes; por lo tanto, para produc-
tos terapéuticos en los que los anticuerpos presentan un riesgo alto para los pacientes, el formato del ensayo debe tener una
sensibilidad suficiente para detectar anticuerpos neutralizantes clínicamente relevantes. La urgencia con la que podrían necesi-
tarse los resultados puede influir sobre el tipo de ensayo seleccionado, en particular si el ensayo basado en células requiere un
tiempo largo de ejecución. Algunas consideraciones prácticas para tomar esta decisión se presentan en la sección EnfoqueBa-
sado en Riesgospara Evaluarlos AnticuerposNeutra/izantesy SusConsecuencias.
La detección de actividad neutralizante de fármacos en dichos ensayos in vitro facilita un mejor entendimiento de cualquier
efecto clínico observado como resultado de una actividad farmacológica alterada. Por lo tanto, se recomienda en gran medida
una investigación minuciosa de la presencia de anticuerpos neutralizantes y su caracterización con respecto a parámetros clíni-
cos del fármaco tales como farmacocinética, farmacodinámica , eficacia y seguridad. Los anticuerpos neutralizantes tienen que
ser producidos a una concentración biológicamente significativa de modo que pueda detectarse su efecto en un ensayo in vi-
tro, y dichos anticuerpos tendrán que unirse con afinidad suficiente para permanecer firmemente unidos al producto terapéuti-
co. Por el contrario, un anticuerpo con baja afinidad de unión que reconoce una región activa de una proteína terapéutica
podría no permanecer unido al producto terapéutico y, por ende, no mediaría fácilmente un efecto biológico. No obstante, no
puede descartarse la posibilidad de que los anticuerpos de baja afinidad tengan un efecto in vivo, por lo que los ensayos de
anticuerpos neutralizantes deben diseñarse para detectar anticuerpos con el más amplio rango de afinidades que sea práctica-
mente posible. (p. ej., limitar el número de pasos de lavado).
Aunque los principios descritos en este capítulo en general son aplicables a los ensayos de anticuerpos neutralizantes basa-
dos en células y no basados en células de uso más común, puede ser necesario modificar las estrategias del diseño y validación
del ensayo para ciertos productos (p.ej, enzimas), usos clínicos (p. ej., diferentes regímenes de dosificación o vías de adminis-
tración) o poblaciones de pacientes. [NOTA-El Apéndicecontiene una lista de guías reglamentarias e informes oficiales útiles.]
FACTORESQUE INFLUYENSOBREEL DESARROLLODE ANTICUERPOSNEUTRALIZANTES
Aunque no se tiene plena certeza acerca de la razón por la que los productos terapéuticos biológicos inducen anticuerpos
neutralizantes solo en algunos individuos, ni porqué algunos productos terapéuticos inducen más anticuerpos neutralizantes
que otros, la investigación ha mostrado que ciertos factores se encuentran regularmente relacionados con la generación de
dichos anticuerpos. La respuesta inicial de baja afinidad a una proteína terapéutica (principalmente compuesta por anticuerpos
lgM) raramente puede neutralizar de manera efectiva el efecto biológico de la proteína terapéutica. Sin embargo, la respuesta
de los anticuerpos a una proteína terapéutica puede madurar, generalmente por exposición repetida. A medida que madura la
respuesta inmune, más epítopes de la proteína terapéutica pueden ser reconocidos por los anticuerpos antifármacos, lo que
lleva a un aumento en la posibilidad de formación de anticuerpos neutralizantes, debido a que ahora los epítopes dentro de la
región activa de la proteína terapéutica son reconocidos.
Por último, aquellos factores que desencadenan el desarrollo de una respuesta inmune robusta requieren el desencadena-
miento de respuestas inmunes mediadas por células T. Algunos de estos factores incluyen la presencia de múltiples epítopes en
las células T (secuencia lineal de 7-9 aminoácidos reconocida en el entorno del complejo mayor de histocompatibilidad clase 11
o CMH 11);atributos específicos del producto, como la agregación, que fomentarían la captación en las células presentadoras
de antígenos; las diferencias en la secuencia genética entre la proteína terapéutica y sus equivalentes endógenos; el grado de
USP42 InformaciónGeneral/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 7935
tolerancia inmunológica; y la cantidad, vía y plan de administración de la proteína terapéutica. Existe también la probabilidad
de que proteínas residuales de la célula huésped actúen como adyuvantes. Las proteínas terapéuticas que tienen una secuencia
de aminoácidos muy cercana a la de las proteínas endógenas son menos propensas a desencadenar una respuesta inmune
robusta. Cuando la secuencia es idéntica y el equivalente endógeno está totalmente expuesto al sistema inmune, se puede
anticipar un alto nivel de tolerancia a la proteína terapéutica. Este podría no ser el caso en sujetos con trastornos autoinmunes,
debido a que la tolerancia a las proteínas propias ya está comprometida.
Los anticuerpos neutralizantes siempre se definen dentro del contexto del ensayo que los identifica. Por ende, es posible que
no todos los sujetos con anticuerpos neutralizantes puedan ser identificados en todos los programas. Asimismo, es importante
reconocer que si mejora la sensibilidad de un ensayo de anticuerpos neutralizantes, entonces puede incrementarse el número
detectado de sujetos con anticuerpos neutralizantes. Si aumenta la incidencia de sujetos con anticuerpos neutralizantes positi-
vos, es importante determinar si el cambio está relacionado con el desempeño del ensayo o con una alteración en los atributos
de calidad del producto de la proteína terapéutica. La especificidad del anticuerpo neutralizante también es importante. Para
ensayos con una especificidad relativamente deficiente, las muestras basales (pretratamiento) pueden presentar respuesta posi-
tiva; sin embargo, dicha respuesta puede no deberse a anticuerpos dirigidos específicamente contra el producto terapéutico
que se está estudiando.
DETERMINACIÓN
DE LA INMUNOGENICIDAD
PRECLÍNICA
Y CLÍNICA
EstudiosNo Clínicos:Relevanciay Alcance de la lnmunogenicidad Preclínica
Los estudios toxicológicos preclínicos por lo general se usan para sugerir la dosimetría y definir los márgenes de seguridad
mediante la evaluación de la toxicidad idiosincrática y la toxicidad específica en el órgano diana ocasionada por los productos
terapéuticos. El requisito primario para estos estudios es demostrar que los animales están expuestos durante todo el estudio al
producto terapéutico a los niveles de dosis determinados. Conforme se indica en la Guía S6 de la ICH, esto puede lograrse
analizando la concentración de fármaco circulante (datos farmacocinéticos) en combinación con datos sobre marcadores far-
macodinámicos, y/o usando evaluaciones de inmunogenicidad para facilitar la interpretación de la correlación entre exposición
y toxicidad. Según se trata en el capítulo (11 06), los sistemas de prueba en animales tienen limitaciones importantes en su
capacidad para fundamentar conclusiones específicas sobre la inmunogenicidad clínica potencial, en particular con respecto a
la restricción del CMH, a las respuestas de células B dependientes de células T, y a la posibilidad de neutralizar el efecto farma-
cológico del producto terapéutico. No obstante, la evaluación de inmunogenicidad en estudios no clínicos puede ser útil cuan-
do se presente una homología significativa entre el producto terapéutico y un equivalente endógeno en animales [p. ej., eritro-
poyetina (EPO) y trombopoyetina (TPO)]. Se ha descripto severa trombocitopenia en varias especies animales después de dosi-
ficar con moléculas de TPO autólogas, debido al desarrollo de anticuerpos neutralizantes anti-TPO circulantes. En estos estu-
dios, los anticuerpos neutralizantes afectaron directamente la actividad farmacológica de la proteína endógena y del producto
terapéutico administrado de manera exógena, lo que dificultó la interpretación de los hallazgos del estudio toxicológico.
Los anticuerpos neutralizantes por lo regular se detectan y caracterizan directamente mediante ensayos in vitro. Sin embar-
go, una disminución en la expresión o el nivel de actividad de un marcador farmacodinámico puede indicar la presencia de
anticuerpos neutralizantes. Si se desea confirmar que el efecto sobre el marcador farmacodinámico se debe a la presencia de
anticuerpos neutralizantes, esto puede lograrse mediante un ensayo de anticuerpos neutralizantes como sustituto para inferir
la presencia de anticuerpos neutralizantes. Es importante confirmar que el cambio en la reducción del marcador farmacodiná-
mico no se debe meramente a la eliminación del fármaco de la circulación, lo cual es un efecto que puede ser ocasionado por
anticuerpos antifármacos, más que por una neutralización "verdadera". Como parte de la evaluación de inmunogenicidad,
también puede ser útil caracterizar los epítopes inmunodominantes para proteínas de tan alto riesgo. La recolección de mues-
tras no clínicas y los aspectos relacionados a considerar se tratan en el capítulo (1106).
Aunque la incidencia medida y el título de anticuerpos neutralizantes pueden variar en las distintas especies animales, la in-
ducción de anticuerpos neutralizantes en múltiples especies puede sugerir una probabilidad mayor de desarrollo de anticuerpo
neutralizante en humanos cuando se presenta una homología significativa dentro del sitio biológicamente activo. Los estudios
de inmunogenicidad en animales transgénicos que expresan el gen que codifica la proteína de interés pueden ser útiles para
ayudar a predecir el potencial relativo de las diversas formas en que el medicamento puede inducir anticuerpos neutralizantes.
EstudiosClínicos:Relevanciay Alcance de las Evaluacionesde lnmunogenicidad
La evaluación de inmunogenicidad, incluido el desarrollo de anticuerpos neutralizantes, sigue siendo una parte importante
de la evaluación de seguridad en el desarrollo clínico de fármacos.
El alcance de la evaluación de inmunogenicidad para productos terapéuticos se basa en el tipo de producto terapéutico, la
indicación seleccionada, la farmacología, la vía de administración, la duración del tratamiento y la inmunocompetencia del pa-
ciente. La frecuencia de la recolección de muestras y el análisis deben basarse en el tiempo y la incidencia de la respuesta de
los anticuerpos, así como en la ocurrencia y severidad de las secuelas clínicas (ver el capítulo (1106) para mayor información).
Debido a que los anticuerpos neutralizantes pueden desencadenar una variedad de posibles efectos clínicos, se requieren mé-
todos analíticos específicos y sensibles para (1) investigar las características de los anticuerpos inducidos con el paso del tiempo
j--
7936 (1106.1) Ensayosde lnmunogenicidad / InformaciónGeneral USP42
(no neutralizantes y neutralizantes), (2) revelar la duración de la respuesta de los anticuerpos antifármacos (temporal contra
persistente) y (3) aclarar las implicaciones de la inmunogenicidad potencial para los resultados clínicos.
Se debe implementar un seguimiento adecuado para el paciente a fin de medir los anticuerpos antifármacos neutralizantes,
debido a que los anticuerpos neutralizantes persistentes por lo general se desarrollan tardíamente en el curso del tratamiento,
por lo que es importante caracterizar la naturaleza temporal de la respuesta del anticuerpo. Por ejemplo, un seguimiento cui-
dadoso puede revelar una respuesta temporal en la que aparecen anticuerpos, pero que desaparecen después de un periodo
de 2-3 meses. Además del muestreo programado y repetitivo de rutina, los pacientes deben ser evaluados clínicamente basán-
dose en los síntomas siempre que se sospeche el desarrollo de anticuerpos. Los ensayos clínicos previos a la aprobación po-
drían no detectar eventos inmunogénicos raros debido a un número insuficiente de pacientes para la evaluación estadística
adecuada y/o una duración inadecuada de la exposición al fármaco. Por lo tanto, puede ser necesario un programa de control
de la inmunogenicidad posterior a la aprobación para cualquier proteína terapéutica que presente riesgos de generar anticuer-
pos neutralizantes de importancia clínica.
ESTRATEGIA
BASADAEN RIESGOSPARAEVALUARLOSANTICUERPOS
NEUTRALIZANTES
Y
SUS CONSECUENCIAS
El capítulo (11 06) describe en detalle los principios de las estrategias basadas en riesgos para la detección y caracterización
de anticuerpos dirigidos contra medicamentos biológicos. Las dos preocupaciones principales relacionadas con los anticuerpos
neutralizantes son: (1) el producto terapéutico puede perder actividad farmacológica, lo que a su vez afectaría su eficacia; y (2)
los anticuerpos neutralizantes pueden presentar reacciones cruzadas con una proteína endógena no redundante. Asimismo, al
igual que con los anticuerpos antifármacos, los anticuerpos neutralizantes pueden contribuir a otros efectos adversos tales co-
mo la formación de complejos inmunes y la potencialidad del depósito de estos complejos en los tejidos y en el sistema vascu-
lar. La Tabla 7 del capítulo (1106) resume algunos factores de riesgo importantes que pueden influir en la severidad de las
consecuencias clínicas de una respuesta de anticuerpos antifármacos o anticuerpos neutralizantes. Los criterios básicos de eva-
luación de riesgos descritos en la Tabla 7 del capítulo (1106) proveen una orientación útil para este tipo de evaluación de ries-
go. Las diversas combinaciones de factores derivadas de las tres categorías de riesgo (riesgo bajo, medio, alto), así como las
propiedades reales del anticuerpo, pueden generar toda una gama de riesgos intermedios. Por ejemplo, los anticuerpos neu-
tralizantes dirigidos contra la hormona de crecimiento humano recombinante pueden neutralizar la hormona de crecimiento
humano endógena, que es un factor vital no redundante. No obstante, luego de décadas de terapia con diversas preparacio-
nes de hormonas de crecimiento humano recombinantes han demostrado que no se observa una atenuación del crecimiento,
incluso en presencia de anticuerpos neutralizantes con reactividad cruzada detectados con un ensayo in vitre. Por lo tanto, el
riesgo real asociado con la hormona de crecimiento humano recombinante puede considerarse intermedio entre las categorías
de riesgo alto y mediano, a pesar de la existencia del equivalente endógeno.
Los formatos potenciales de ensayo se seleccionan basándose en el mecanismo de acción del fármaco, caso por caso, con el
asesoramiento de las agencias reglamentarias, cuando así se requiera, mientras que la estrategia analítica (o evaluación de in-
munogenicidad) es conducida por el riesgo de inmunogenicidad para el producto terapéutico específico. La Figura 7 presenta
un diagrama de flujo con algunas opciones útiles para la selección del diseño de ensayo de anticuerpos neutralizantes.
USP42 InformaciónGeneral/ (1106.1) Ensayosde lnmunogenicidad 7937
Productos Biológicos Terapéuticos Caracterizados por Mecanismo de Acción
Agonista Conjugadode Anticuerpo Terapia con Antagonista

Anticuerpo-Fármaco Terapéutico con
(ADC) Enzimas
Función de ADCC
Ensayobasado Se prefiere
en células ensayo
basado en
células; se
Ensayo acepta CLBA
funcional
basado en
células'
Ensayos
basados en
células o
Ensayosde uniónbasados CLBAno
en célulasy/o CLBAno Ensayosbasados en
basados en célulaso CLBAno
basados en células' células' basados en células•
[Nota: ADCCes "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos"; CLBAes "ensayo competitivo de
unión de ligandos"; MAbes "anticuerpo monoclonal".]
' Para productos terapéuticos agonistas dirigidos a receptores celulares, se recomienda un ensayo funcional de
anticuerpos neutralizantes basado en células. Esto incluyeproductos terapéuticos con un equivalente endógeno
redundante o no redundante.
2
Para productos terapéuticos con función ADCC,un ensayo de ADCCbasado en células puede presentar
potencialmente dificultades técnicas. Además, los anticuerpos antifármacos específicos para la región Fe de anti-
cuerpos terapéuticos humanizados a menudo se unen a otras IgG no específicas en la matriz del suero y son
difíciles de detectar en ensayos de unión de anticuerpos antifármacos. En esta situación, una plataforma viable
para el ensayo de anticuerpos neutralizantes puede ser un ensayo de unión de ligando que emplee un diseño de
conexión o un método de ensayo basado en la interacción antígeno-fármaco.
3
Se deben considerar los ensayos no basados en células, con el asesoramiento de las agencias reglamentarias,
si la inhibición, inducida por los anticuerpos neutralizantes, del producto terapéutico enzimático lisosomal que
funciona a un pH bajo no es posible en la condiciones del ensayo basado en células.
4
Para productos terapéuticos que se unen a más de un receptor se recomienda un ensayo basado en células.
Figura 1. Ejemplos de selección de diseño de ensayo de anticuerpos neutralizantes.
Para agonistas terapéuticos que interactúan directamente con los receptores celulares, tales como factores y hormonas de
crecimiento, el desarrollo de ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células es apropiado para reflejar el mecanismo
de acción del fármaco. Esta categoría incluye productos terapéuticos con un equivalente endógeno no redundante que puede
generar secuelas clínicas con un alto nivel de riesgo para los pacientes. Para estos productos terapéuticos, se requieren ensayos
con la capacidad de determinar los niveles de anticuerpos neutralizantes con alta especificidad y sensibilidad; por lo general,
los resultados se expresan en títulos o equivalentes del fármaco neutralizado. Estas recomendaciones surgen de la preocupa-
ción de que los anticuerpos neutralizantes inducidos por las proteínas terapéuticas pueden presentar reacciones cruzadas con
homólogos endógenos vitales y neutralizarlos, y ocasionar síndromes de deficiencia de tipo autoinmune [p. ej., tal como el
observado con el factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos (MGDF,por sus siglas en inglés) y la EPO]. También se
recomienda la detección temprana y el análisis continuo de anticuerpos neutralizantes dirigido contra las moléculas de alto
riesgo debido a que los datos de anticuerpos neutralizantes pueden influir sobre las decisiones terapéuticas.
Para antagonistas terapéuticos (p. ej., anti-lgE o anti-factores de la coagulación), algunas agencias reglamentarias han acep-
tado ensayos competitivos de unión de ligandos no basados en células para la detección de anticuerpos neutralizantes que se
dirigen contra los productos terapéuticos con dianas humorales. Sin embargo, para antagonistas terapéuticos que interactúan
con un receptor y ca-receptor para ejercer un efecto farmacéutico sobre las células diana, por lo regular se recomiendan los
ensayos basados en células debido a que este tipo de mecanismo de acción puede no reflejarse con exactitud en un ensayo de
7938 (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad / InformaciónGeneral USP42
unión de ligando no basado en células, puesto que un anticuerpo antifármaco que no bloquea las interacciones fármaco-diana
puede interferir con las interacciones del co-receptor diana, ocasionando una neutralización funcional.
En lo que respecta a otros productos terapéuticos, tales como conjugados de anticuerpo-fármaco, anticuerpos terapéuticos
con funciones efectoras para la eficacia clínica y enzimas terapéuticas que funcionan en células diana, por lo general se reco-
miendan ensayos basados en células para reflejar el mecanismo de acción del fármaco. Sin embargo, para enzimas lisosomales
terapéuticas que funcionan óptimamente a un pH de 4-5, puede ser complicado generar cualquier control de anticuerpos
neutralizantes que puedan inhibir la enzima a un pH bajo con sensibilidad suficiente. Ante esta situación, el desarrollo de un
ensayo no basado en células (p. ej., inhibición de unión entre un fármaco enzimático y su receptor específico) requiere el ase-
soramiento de una agencia reglamentaria. Además, un ensayo de actividad enzimática no basado en células puede ser apro-
piado para enzimas terapéuticas, incluso para aquellos que ejercen sus actividades dentro de las células. No obstante, los resul-
tados de dicho ensayo solo serán concluyentes si las condiciones requeridas para la actividad intracelular de un fármaco enzi-
mático también permiten la unión efectiva de un anticuerpo neutralizante putativo con el fármaco.
Por lo general, se recomienda analizar los anticuerpos neutralizantes de manera más frecuente (p. ej., mensual o bimestral)
para situaciones de alto riesgo. Para los casos de pacientes que resulten positivos el muestreo se debe extender después de
terminado el estudio hasta que den negativo en dos pruebas consecutivas con al menos dos meses de diferencia, o un periodo
calculado en base de la vida media del anticuerpo antifármaco (p. ej., 3-5 vidas medias). Esto puede incluir el análisis posterior
a la comercialización. Para situaciones de riesgo medio y bajo, el análisis debe realizarse caso por caso, asesorándose con las
agencias reglamentarias.
Para evaluar por completo el riesgo potencial asociado con los anticuerpos neutralizantes, también es importante entender
la relación exposición-respuesta de un producto bioterapéutico dado, debido a que esta relación podría sugerir el grado en el
que los anticuerpos neutralizantes pueden afectar la actividad in vivo del fármaco. Por ejemplo, una alta dosis de fármaco sería
más difícil de neutralizar debido a que se requerirían más anticuerpos neutralizantes; por ende, existe un riesgo menor de pér-
dida de eficacia. Por el contrario, cuando una baja concentración de fármaco es suficiente para lograr el efecto terapéutico, los
niveles bajos de anticuerpos neutralizantes podrían neutralizar la actividad del fármaco, incrementando así el nivel de riesgo.
Pueden presentarse situaciones similares cuando la concentración de un equivalente endógeno del fármaco es baja; incluso los
niveles bajos de anticuerpo neutralizante podrían neutralizar su función fisiológica e incrementar así el riesgo relacionado con
el anticuerpo.
DISEÑODE MÉTODOSDE PRUEBAPARAANTICUERPOS

NEUTRALIZANTES
AspectosGenerales
La selección de un tipo de ensayo para anticuerpos neutralizantes se realiza según el mecanismo de acción del producto
terapéutico y la naturaleza de su diana. Un ejemplo es un anticuerpo monoclonal terapéutico que se une a un receptor en la
superficie de la célula, lo que a su vez afecta las interacciones con otros receptores de la superficie celular. Ante esta situación,
se debe usar un ensayo de anticuerpos neutralizantes basado en células debido a que es poco probable que dichas interaccio-
nes puedan replicarse en la superficie de una placa de microtitulación. La Figura1 presenta diversas selecciones de ensayos de
anticuerpos neutralizantes, categorizadas por su dependencia del mecanismo de acción del producto terapéutico. Los resulta-
dos del ensayo de anticuerpos neutralizantes por lo general son valores semi-cuantitativos por medio de un título, o cualitati-
vos, informando un resultado negativo o positivo. Algunas plataformas tecnológicas informan valores cuantitativos, tales como
el ensayo de resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) (ver el capítulo (1106) y el capítulo Métodos rJe
PruebasInmunológicas-Resonancia de PlasmónSuperficial(1105)) o, en casos especiales, informan la neutralización de cantida-
des específicas de fármaco. Se puede argumentar que cualquier valor numérico de capacidad neutralizante de la muestra es
semi-cuantitativo cuando se usa una preparación de anticuerpos como estándar de referencia, debido a que las afinidades y la
naturaleza de los anticuerpos dentro del estándar tienen una baja probabilidad de replicar exactamente lo que está contenido
en una muestra de prueba. Además, la comparación de valores de muestra entre diferentes laboratorios que usan diferentes
preparaciones estándar posiblemente producirá resultados diferentes para la misma muestra. Por lo tanto, aunque para una
muestra de anticuerpos neutralizantes un valor en unidades de masa es útil para realizar comparaciones relativas, se deben
tener en cuenta todas las advertencias relacionadas con dicho valor. Para los ensayos de anticuerpos neutralizantes se reco-
mienda obtener un título como respuesta primaria para los ensayos de anticuerpos neutralizantes, el cual se genera analizando
diluciones seriales de una muestra. La inversa de la dilución de la muestra de prueba que produce un resultado positivo, según
se define en el punto de corte del ensayo, representa el título del ensayo. Este título del ensayo debe multiplicarse por la dilu-
ción mínima requerida (MRD, por sus siglas en inglés; ver también (1106)) inicial, si no se ha considerado, para informar el
título de anticuerpos neutralizantes presente en la matriz de la muestra sin diluir.
Métodos Basadosen Célulaspara la Evaluaciónde AnticuerposNeutralizantes

Según se indicó anteriormente, los ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células pueden tener dos tipos genera-
les de lecturas: una basada en los eventos de unión, y la otra que requiere una serie de eventos intracelulares que llevan a una
respuesta funcional. La unión del fármaco a un receptor o ligando en la superficie de la célula puede resultar en la internaliza-
ción del receptor, fosforilación, o cambios en la concentración intracelular de monofosfato cíclico de adenosina (cAMP,por sus
siglas en inglés). Los ensayos funcionales determinan respuestas celulares más complejas, tales como la proliferación celular,
expresión del gen indicador o síntesis y secreción de proteínas.
Tal como se muestra en la Figura 1, cuando es apropiado un ensayo de anticuerpos neutralizantes basado en células, es im-
portante estudiar los parámetros de desempeño de los componentes críticos en el sistema del ensayo, en particular la línea
celular, el medicamento, el anticuerpo neutralizante usado como control positivo (CP) y la matriz de la especie de prueba. Los
ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células pueden ser desafiantes desde el punto de vista técnico debido a la
necesidad de optimizar la línea celular, las condiciones de cultivo y los componentes de la matriz de la muestra. La falta de
optimización puede comprometer la precisión, robustez y sensibilidad del ensayo. Inicialmente, se pueden evaluar las células
usadas para el ensayo de potencia biológica del fármaco para su uso en el ensayo de anticuerpos neutralizantes. La utilización
de la misma línea celular provee diversas ventajas, teniendo en cuenta que se ha optimizado su mantenimiento y las condicio-
nes de cultivo. A menudo, este sistema puede adaptarse para una matriz biológica. Como alternativa, se encuentran disponi-
bles fuentes comerciales de líneas celulares o se puede obtener por ingeniería genética una línea celular que responda al fárma-
co. Las líneas celulares transfectadas con receptores diana pueden ofrecer la ventaja de una densidad del receptor más contro-
lada, especificidad y generación de una señal mejorada. Las líneas celulares que expresan genes indicadores pueden proveer
puntos finales sensibles del ensayo.
La capacidad de respuesta de las células al fármaco debe ser caracterizada, en particular antes y después de la congelación,
al igual que durante el cultivo continuo (ver también el capítulo de información general Crioconservaciónde Células(1044)).
Los experimentos de dosis-respuesta del fármaco en la matriz biológica apropiada (p. ej., suero) pueden identificar problemas
tempranos de interferencia. Idealmente, se deben evaluar muestras de varias matrices. La especificidad debe estudiarse para
permitir el uso con suero obtenido de la especie de interés que desarrolló un anticuerpo neutralizante después de la exposición
al fármaco. Los anticuerpos del control positivo a menudo se aíslan a partir de antisueros de esta especie, pero debido a que
esto no siempre es posible durante el desarrollo del ensayo, se produce un reactivo con un anticuerpo de control sustituto para
usarlo durante el desarrollo y la validación del ensayo (ver la sección Desarrollode ControlesPositivosy Negativosen Ensayosde
AnticuerposNeutrafizantes).Los diseños de ensayo basados en células que se han usado con éxito en el desarrollo de medica-
mentos se presentan en la Tabla 1. El tipo de formato de ensayo seleccionado se ve influido por el mecanismo por el cual el
fármaco interactúa con las células. Estas interacciones pueden ser directas o indirectas. Una interacción directa es aquella en la
que el medicamento ejerce su efecto actuando directamente sobre las células, tales como citoquinas, péptidos o anticuerpos
monoclonales que actúan sobre factores determinantes de la superficie celular. Las interacciones indirectas son aquellas en las
que el medicamento bloquea la interacción de un ligando con su receptor de la superficie celular y que en consecuencia inter-
fiere con la actividad biológica del ligando. Los ejemplos de dichos fármacos incluyen anticuerpos monoclonales terapéuticos
sobre factores solubles y receptores solubles.
Tabla 1. Formatos de Ensayo de Anticuerpos Neutrallzantes Basados en Células de Uso Frecuente
Acción del
Ejemplos de Anticuerpo Neutral!-
Punto Final del Ensayo Plataforma de Ensayo zante Ventajas Desventalas
La interacción entre fárma- No se aplica a fármacos con
co, diana y anticuerpo un mecanismo de acción
Interfiere con la unión del neutralizante ocurre única- que implique vías de seña-
fármaco al sitio diana en la mente sobre la superficie lización intracelulares; la
Citometría de fluorescencia, célula o afecta la intemali- de las células, lo que pue- expresión inadecuada del
Interacciones en la superfi- unión a la superficie celular zación del medicamento de resultar en ensayos ro- receptor sobre la célula
cie celular en placa en la célula. bustos y simples. puede ser una limitación.
Afecta la fosforilación del re- Requiere de anticuerpos es-
Activación del receptor de ceptor/sustrato diana indu- pecfficos del sitio de tosto-
quinasas, ensayos por in- cida por el fármaco o afee- Utiliza eventos tempranos rilación; se requieren múlti-
munoadsorción ligados a ta la fosforilación inducida de la señalización celular, ples etapas en el ensayo si
Fosforilación de enzimas (ELISA),tinción in- por el ligando bloqueando lo que puede resultar en se usa ELISApara detectar
substratos intracelulares tracelular el fármaco. un ensayo más corto. la fosforilación.
El punto final del ensayo es
el resultado de múltiples
Afecta la proliferación celu- vías y etapas intracelulares,
lar que es inducida o inhi- El punto final del ensayo lo que puede resultar en
bida por el fármaco o afee- bien establecido para fár- un ensayo largo; propenso
ta la proliferación celular macos de tipo factor de a interferencia por factores
Incorporación de 3 H, Azul inducida por el ligando crecimiento refleja lo que séricos; el ensayo requiere
Proliferación celular Alamar bloqueando el fármaco. sucede en las células. demostrar especificidad.
Requiere invertir tiempo pa-
ra construir la línea celular
Afecta la expresión del gen del gen informante que
indicador por parte del puede responder de mane-
medicamento o afecta la ra robusta en presencia del
Luciferasa, p -galactosidasa, expresión del gen indica- suero de las especies de
cloranfenicol acetiltransfe- dor inducida por el ligando El ensayo puede ser rápido, prueba; requiere demostrar
Expresión del gen indicador rasa bloqueando el fármaco. sensible y robusto. especificidad.
7940 (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad / Información General USP42
Tabla 1. Formatos de Ensayo de Anticuerpos Neutrallzantes Basados en Células de Uso Frecuente (Continuación)
Acción del
Ejemplos de Anticuerpo Neutrall-
Punto Flnal del Ensayo Plataforma de Ensayo zante Ventajas Desventalas
El punto final del ensayo es
el resultado de múltiples
vías y etapas intracelulares,
lo que puede resultar en
un ensayo largo; el ensayo
Influye la expresión de pro- implica el cultivo celular
ELISA,enzimoinmunoensa- teínas por parte del fárma- seguido de un ensayo de
yo, radioinmunoensayo, co o influye la expresión de La proteína puede medirse unión de ligando para de-
ensayo electroquimiolumi- proteínas inducida por el li- en el sobrenadante celular tectar la proteína sintetiza-
Expresión o secreción niscente, ensayos de proxi- gando bloqueando el fár- o en el lisado celular usan- da, por lo que se requieren
de proteínas midad de centelleo maco. do un ELISA. dos ensayos.
Pueden estar implicadas
múltiples funciones efecto-
ras (citotoxicidad mediada
por células dependiente de
Citotoxicidad dependiente anticuerpos, citotoxicidad
del complemento (CDC), dependiente del comple-
citotoxicidad mediada por Influye sobre el destino de mento, fagocitosis, etc.), lo
células dependiente de anla célula diana mediado Requerido para anticuerpos que puede dificultar la se-
ticuerpos (ADCC, por sus por las funciones efectoras terapéuticos en los que los lección y el desarrollo del
siglas en inglés), unión del de los anticuerpos terapéu- dominios Fab y Fe están ensayo, así como la inter-
Funciones Efectoras receptor Fcy ticos. implicados en la función. prelación de los resultados.
Ensayos luminiscentes de Afecta la citotoxicidad/
viabilidad celular, ensayo apoptosis celular inducida Refleja directamente el me-
de marcación de extremos por fármaco o afecta la ci- canismo de acción de la
fragmentados de ADN por totoxicidad/apoptosis celu- muerte celular mediada
desoxinucleotidil transfera- lar inducida por ligandos por productos terapéuti- Requiere demostrar especifi-
Citotoxicidad/apoptosis sa terminal y dUTP bloqueando el fármaco. cos. cidad.
Se tiene en cuenta el punto final del ensayo, el cual puede reflejar respuestas celulares tempranas o tardías. Las respuestas
tempranas incluyen la unión inicial a la superficie celular, internalización, un evento temprano en la señalización celular o ex-
presión génica. Las respuestas tardías reflejan la participación de múltiples vías intracelulares que generan un resultado biológi-
co tal como proliferación, inducción de productos medibles, apoptosis o funciones efectoras tales como citotoxicidad mediada
por células dependiente de anticuerpos o citotoxicidad dependiente del complemento.
Se debe tener cuidado de optimizar las concentraciones de los componentes críticos del ensayo que influyen sobre su sensi-
bilidad para detectar anticuerpos neutralizantes. En el caso de un ensayo directo de anticuerpos neutralizantes, se debe evaluar
la respuesta de la dosis a diversas concentraciones del medicamento. La cantidad de medicamento usada en el ensayo debe
estar dentro de la porción lineal de la curva de dosis-respuesta que produce una respuesta reproducible (p. ej., a menudo una
respuesta máxima del ensayo de 30%-80%). La sensibilidad de un ensayo de anticuerpos neutralizantes indirecto depende de
la concentración de ligando y de la concentración de medicamento.
En todos los casos, se deben incorporar los controles apropiados. Por ejemplo, en un diseño de ensayo directo en el que el
fármaco actúa directamente sobre las células para inducir una respuesta biológica, los controles del ensayo deben incluir célu-
las solas, células con medicamento y células con medicamento y un control positivo de anticuerpos neutralizantes. Un formato
de ensayo indirecto debe incluir células solas, células con ligando, células con ligando y medicamento y células con ligando,
medicamento y un control positivo de anticuerpos neutralizantes. El ensayo puede configurarse como una dilución única para
proveer información cualitativa (positivo o negativo), como es generalmente el caso de estudios preclínicos, o puede usar dilu-
ciones múltiples para proveer un resultado semi cuantitativo, tal como el título. El diseño ensayos bien controlados facilita el
monitoreo del desempeño del ensayo con el paso del tiempo y la identificación de factores a considerar tales como las causas
del fracaso de un ensayo.
Métodos No Basados en Células para la Evaluación de Anticuerpos Neutralizantes
Las agencias reglamentarias han recomendado tradicionalmente los formatos de ensayos funcionales basados en células para
la evaluación de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, en comparación con los desafíos técnicos de los ensayos basados en
células descritos anteriormente, los inmunoensayos no basados en células son capaces de superar algunas de las limitaciones
técnicas inherentes a los ensayos biológicos basados en células y, por lo tanto, se han convertido en otra plataforma tecnológi-
ca útil para la evaluación de anticuerpos neutralizantes. Las plataformas de inmunoensayos no basados en células, en especial
los ensayos competitivos de unión de ligandos (CLBA,por sus siglas en inglés) cuando son pertinentes para el mecanismo de
acción del fármaco, pueden usarse para la evaluación de anticuerpos neutralizantes si se demuestra que detectan específica-
mente anticuerpos neutralizantes (Figura2A y Figura28).
En el caso de diversos productos terapéuticos biológicos (p. ej., anticuerpos monoclonales antagonistas contra un ligando
soluble), el fármaco ejerce su efecto farmacéutico uniéndose a su diana y bloqueando la interacción del ligando con su recep-
USP42 InformaciónGeneral/ (1106.1) Ensayosde lnmunogenicidad 7941
tor de la superficie celular; en consecuencia, el fármaco interfiere con la actividad biológica del ligando. En este caso, es apro-
piado un método de ensayo no basado en células para la evaluación de anticuerpos neutralizantes debido a que el método de
ensayo refleja el mecanismo de acción del fármaco mediante la medición de la unión del fármaco a su diana y la inhibición de
dicha actividad de unión por parte de los anticuerpos neutralizantes.
El diseño de ensayo para anticuerpos neutralizantes basado en ensayos competitivos de unión de ligandos se basa en la
competencia entre el ligando y los anticuerpos neutralizantes por un número limitado de sitios de unión a ligando presentes
en el producto terapéutico. A medida que se incrementa el nivel de anticuerpos neutralizantes, menos ligando se une al fárma-
co y la respuesta que se mide en el ensayo disminuye en comparación con una muestra de control que no tiene actividad
neutralizante. Por lo tanto, dentro del intervalo lineal del ensayo, la concentración de anticuerpos neutralizantes es proporcio-
nal al cambio porcentual en la respuesta del ensayo. En teoría, cualquier ensayo de unión de ligandos, tal como inmunoensa-
yos en fase sólida o líquida (p. ej., ensayos de radioligando, ELISA,quimioluminiscencia y electroquimioluminiscentes), ensayos
de radioinmunoprecipitación (RIPA,por sus siglas en inglés) y de resonancia de plasmón superficial, pueden adaptarse al dise-
ño de ensayos competitivos de unión de ligandos para la detección de anticuerpos neutralizantes en las muestras de prueba
(ver el Apéndicey el capítulo Métodosde PruebasInmunológicas-ConsideracionesGenerales(1102) y Métodosde PruebasInmu-
nológicas-Ensayo por lnmunoabsorciónLigado a Enzimas(ELISA)(1103), así como el capítulo(l 105) para mayor información).
Se encuentran disponibles dos formatos para ensayos competitivos de unión de ligandos no basados en células (ver la Figura
lA para formato directo y la Figura28 para formato indirecto).
A Ensayo Directo
Señal Ausencia de Señal
Figura 2A. Diseño Directo de Ensayo Competitivo de Unión de Ligandos: En este ejemplo de diseño de ensayo, se recubre en
una placa con el producto terapéutico que sirve como molécula de captura para unir el ligando marcado con una molécula de
detección (p. ej., una enzima, una marca fluorescente o una electroquimioluminiscente). La unión entre el producto terapéuti-
co y el ligando se inhibe ante la presencia de anticuerpo neutralizante en las muestras de prueba, lo que resulta en una señal
más baja. "T" representa el "producto terapéutico" y "L" representa el "ligando".
B Ensayo Indirecto
Ausencia de Señal ~ El Anticuerpo Anticuerpo

Neutrallzante se Neutralizante
~ ~
une al producto de la muestra
terapeutlco lo
marcado
_..,.
Receptor
f cual permite la~T

union ligando-
receptor
T
Anticuerpo
Neutralizante
de la muestra
iii
' 0
El producto -+ ~ ~ ~
~~~
terapéutico une y
bloquea al receptormmm
Figura 2B. Formato indirecto de Ensayo Competitivo de Unión de Ligandos: En este ejemplo de diseño de ensayo, el ligando
recubre la placa y el producto terapéutico compite con el receptor marcado para unirse al ligando. Cuando está presente un
anticuerpo neutralizante en las muestras de prueba, éste se une al producto terapéutico y el producto terapéutico neutralizado
no es capaz de unirse al ligando; por lo tanto, la señal aumentará debido a que el receptor marcado ahora puede acceder y
unirse al ligando.
7942 (1106.1) Ensayosde lnmunogenicidad / Información General USP42
En el ensayo directo para anticuerpos neutralizantes basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos es un enfoque
simple, donde se mide la unión de un fármaco a su diana, (Figura2A y Tabla2), mientras que en el ensayo indirecto para
anticuerpos neutralizantes basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos se monitorea la inhibición mediada por el
fármaco de la unión ligando-receptor (Figura28 y Tabla2). Ambos formatos de ensayo utilizan el mecanismo de acción del
fármaco (inhibición de la unión fármaco-ligando o ligando-receptor) pero miden la actividad neutralizante usando diferentes
puntos finales del ensayo.
Tabla 2. Diseño de Ensayo para Anticuerpos Neutrallzantes Basado en Ensayo Competitivo de Unión de Llgandos y Componentes
'1 cos de 1 Ensayo
Cr1t
Diseño del Ensayo
para lnmunoensa-
Medición del yosen Componentes del
Diseño del Ensayo Ensayo Fase Sólida Ensayo Ventala Desventaja
Elfármaco como mo-
lécula de captura y el
ligando marcado co- Fármaco marcado o Si la unión previene la seña-
mo molécula de desin marcar,diana lización o el acoplamiento
lección (el formato conjugada, muestras de otro ligando a su recep-
Ensayo Competitivo reverso es más pro- de especies de prue- tor, en este ensayo solo se
de Unión de Ligan- Unión de un fármaco penso a la interferen- ba, controles positi- Diseño de ensayo sim- refleja el paso de unión
dos Directo a su liQando (diana) cia del fármaco) vos y negativos ple muy temprana.
Ligando sin marcar o
El ligando como mo- conjugado, receptor Refleja una conse- La complejidad de la purifi-
lécula de captura y el conjugado, fármaco cuencia de la activi- cación del receptor dificul-
Inhibición mediada receptor marcado sin conjugar,mues- dad de anticuerpos ta mantener un plegado
Ensayo Competitivo por el fármaco de la como molécula de tras de especies de neutralizantes que se apropiado de las proteínas
de Unión de Ligan- unión ligando-re- detección (el forma- prueba, controles produce en pasos y un desempeño uniforme
dos Indirecto ceptor to reverso es viable) positivos y neqativos subsiquientes. del ensayo.
Para el diseño de ensayo de anticuerpo neutralizante basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos directo aplica-
do a un inmunoensayo en fase sólida, el fármaco inmovilizado por lo regular sirve como molécula de captura, mientras que la
diana marcada sirve como molécula de detección, generando una señal después de que se une al fármaco. La actividad neu-
tralizante puede evaluarse como el nivel de inhibición de una unión fármaco-diana cuando se encuentran presentes anticuer-
pos neutralizantes en las muestras de prueba. La sensibilidad de estos ensayos directos se ve ampliamente determinada por la
concentración seleccionada del fármaco. Una concentración de fármaco baja por lo general lleva a un ensayo de anticuerpos
neutralizantes más sensible, pero un rango dinámico bajo de concentraciones puede limitar la detección de un rango amplio
de anticuerpos neutralizantes. Por lo tanto, es importante optimizar la concentración de fármaco durante el desarrollo del en-
sayo. Para optimizar aún más el ensayo, se puede tener en cuenta la implementación de un diseño de experimento para eva-
luar sistemáticamente las interacciones entre los parámetros clave de operación del ensayo e identificar las condiciones de en-
sayo más óptimas.
En ciertos casos, como cuando el ligando o el receptor es una molécula altamente cargada y tiende a unirse a las superficies
de manera no específica, el diseño del ensayo también puede invertirse usando el ligando o receptor proteico como molécula
de captura y el fármaco como molécula de detección. Sin embargo, debido al uso del ligando como agente de recubrimiento,
este diseño reverso puede ser mucho más propenso a interferencia del fármaco incluso si se logra una sensibilidad comparable
del ensayo. Por lo tanto, por lo regular se prefiere un ensayo para anticuerpos neutralizantes basado en un ensayo competitivo
de unión de ligandos directo que usa el fármaco como molécula de captura y el ligando conjugado como molécula de detec-
ción.
Un ensayo para anticuerpos neutralizantes basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos indirecto, el cual se basa
en la inhibición mediada por fármaco de la unión ligando-receptor, también se puede usar para la detección de anticuerpos
neutralizantes para antagonistas terapéuticos que neutralizan los ligandos solubles. Un formato de ensayo para anticuerpos
neutralizantes basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos indirecto aplicable usa el ligando como la molécula de
captura y la proteína receptora conjugada como molécula de detección en un inmunoensayo en fase sólida. Elformato reverso
también puede ser viable. El ligando inmovilizado se une al receptor conjugado, generando una señal. La unión ligando-re-
ceptor se inhibe ante la presencia del fármaco, pero ocurre cuando el fármaco es neutralizado por el anticuerpo neutralizante.
Por consiguiente, la actividad neutralizante en la muestra de prueba se estima mediante el nivel de restauración de la unión
ligando-receptor cuando la función del fármaco es bloqueada por el anticuerpo neutralizante.
La sensibilidad del ensayo para anticuerpos neutralizantes basado en un ensayo competitivo de unión de ligandos indirecto
depende en gran medida de las concentraciones de ligando y de fármaco. Una concentración menor de ligando resultará en
una concentración menor de fármaco seleccionada para el ensayo, lo que conlleva a una sensibilidad mayor del ensayo para
anticuerpos neutralizantes. Otros parámetros operativos también pueden evaluarse de manera efectiva a través del método de
diseño de experimento para determinar las condiciones óptimas del ensayo.
Cuando se incluye una proteína receptora oligomérica en el ensayo para anticuerpos neutralizantes no basado en células, se
deben tener en cuenta específicamente los desafíos presentados por este tipo de receptor, el cual puede ser menos propenso a
retener la conformación original necesaria para unirse al ligando cuando no se asocia con la membrana celular. Además, los
receptores celulares por lo regular tienen uno o más dominios transmembrana que necesitan ser truncados para facilitar la pu-
USP42 Información General/ (1106. l) Ensayos de lnmunogenicidad 7943
rificación del receptor. Por ende, surgen preocupaciones con respecto al plegado apropiado de la proteína truncada, que con-
tiene solamente los ectodominios , y a la retención de la estructura necesaria para la unión ligando-receptor. La complejidad
de la purificación del receptor requiere además que la variación entre lotes y la estabilidad de los productos proteicos se con-
trolen de manera efectiva para mantener el desempeño uniforme del ensayo.
Los controles positivos y negativos son críticos para el monitoreo del desempeño del ensayo para anticuerpos neutralizantes.
A diferencia de los ensayos para anticuerpos neutralizantes basados en células, el diseño de los controles de los ensayos com-
petitivos de unión de ligandos no basados en células es, por lo regular, más simple, sin necesidad de incluir controles de fon-
do. La selección de controles positivos y negativos se describe en detalle en la sección Desarrollode ControlesPositivosy Negati-
vos en Ensayosde AnticuerposNeutralizantes.
VALIDACIONDE ENSAYOSDE ANTICUERPOSNEUTRALIZANTES

Según se describió anteriormente, existen dos diseños principales de ensayos de anticuerpos neutralizantes: los ensayos fun-
cionales basados en células y los ensayos basados en unión. Las siguientes secciones describen los diversos componentes de la
validación que deben llevarse a cabo antes de iniciar el estudio. Los principios de cada aspecto de la validación se aplican a
ambos formatos de ensayo, a menos que se indique algo distinto.
Dilución Mínima Requerida
La determinación de la dilución apropiada de la matriz del ensayo es una parte importante de la optimización del ensayo de
anticuerpos neutralizantes debido a que esto afectará la dilución mínima de la muestra de prueba y, por lo tanto, la sensibili-
dad del ensayo. Los aspectos a considerar para definir la dilución mínima requerida usada para el inmunoensayo de detección
de anticuerpos antifármacos descritos en el capítulo (1106) también pueden ser aplicables a los ensayos de anticuerpos neutra-
lizantes. El efecto que tiene la matriz de la muestra sobre la capacidad del ensayo debe evaluarse en múltiples diluciones, de
preferencia usando mezclas diferentes de matrices de prueba. Se debe seleccionar la dilución de la matriz de muestra que ten-
ga un efecto mínimo sobre la respuesta del ensayo y evaluarla adicionalmente usando el control positivo de anticuerpos adicio-
nado a la matriz de la muestra. Un ensayo de anticuerpos neutralizantes debe ser capaz de detectar anticuerpos en presencia
de componentes de la matriz del ensayo cuya presencia puede esperarse. Estos pueden incluir complemento, factores de coa-
gulación, dianas solubles, lípidos, medicaciones concomitantes y el equivalente homólogo endógeno, así como el medicamen-
to administrado. Tal como se describe en el capítulo (1106), la dilución mínima requerida puede determinarse y definirse de
manera objetiva como el nivel de dilución que alcanza una relación señal-fondo óptima con una variabilidad aceptable.
Los factores tales como dianas solubles que se unen al medicamento o que actúan directamente sobre las células pueden
interferir en el ensayo, lo que conllevaría a resultados falsos positivos. Alternativamente, algunos factores pueden alterar la res-
puesta del ensayo de manera que se enmascare la presencia de anticuerpos neutralizantes en la muestra (p. ej., según se indi-
có para la presencia de niveles interferentes de productos bioterapéuticos o factores de crecimiento). La confirmación de la
especificidad del ensayo puede ayudar a determinar la presencia de dichas sustancias interferentes (ver la sección Especificidad
del Ensayo).La evaluación de los efectos de la matriz durante el desarrollo del ensayo se puede lograr usando matrices combi-
nadas. Idealmente, la matriz del ensayo debe definirse usando múltiples muestras individuales de matrices debido a la hetero-
geneidad de las diversas sustancias interferentes posibles. La matriz obtenida de pacientes afectados con la enfermedad (pero
que no han sido tratados) puede contener factores adicionales que interfieren en el ensayo y debe evaluarse siempre que sea
posible.
Si se encuentran disponibles sueros lipémicos, hemolizados, con coagulación incompleta y, de preferencia, sueros de pacien-
tes enfermos que no han sido tratados, estos deberían analizarse en el ensayo con y sin la adición del control positivo de anti-
cuerpos neutralizantes. Si los sueros a los que no se han agregado anticuerpos neutralizantes dan una respuesta en el ensayo
y/o los sueros interfieren en la detección del control, el procedimiento analítico debe establecer que las muestras comprometi-
das de esa manera podrían no proveer resultados confiables y podría ser necesario excluirlas del análisis.
Desarrollo de Controles Positivos y Negativos en Ensayos de Anticuerpos Neutralizantes
Los ensayos de anticuerpos neutralizantes, incluyendo los ensayos funcionales basados en células y los inmunoensayos no
basados en células, están diseñados para detectar inmunoglobulinas antifármacos heterogéneas y a menudo policlonales. De-
bido a la naturaleza diversa de las respuestas inmunes al fármaco, no es posible generar un estándar de referencia de anticuer-
pos neutralizantes verdadero. Por lo tanto, el desempeño del ensayo se monitorea usando controles positivos y negativos susti-
tutos. Por lo regular, un control negativo se genera mezclando matrices pertinentes negativas para anticuerpos antifármacos,
tal como una matriz recolectada a partir de sujetos sin exposición previa al fármaco. Se debe determinar si la mezcla usada
para producir un control negativo representa adecuadamente la población de estudio diana, por ejemplo, mediante compara-
ción de la respuesta del ensayo producida por el control negativo con la respuesta promedio producida por las muestras indivi-
duales de la matriz de la población diana (al menos 20 individuos). En algunos casos, puede ser complicado obtener un núme-
ro suficiente de muestras de matrices pertinentes de la población en estudio o asegurar que las muestras usadas en la valida-
ción del ensayo representan con exactitud las características de la matriz de las muestras de la población de estudio. Las mues-
1--
tras usadas como base de referencia del estudio deben evaluarse para detectar cualquier evidencia de reactividad con el com-
puesto previa a la dosis.
Los controles positivos del ensayo de anticuerpos neutralizantes por lo regular consisten en un suero animal hiperinmuniza-
do, un anticuerpo monoclonal o material que tenga una reactividad de anticuerpos antifármacos específica y generalmente
alta que neutralice la afinidad. La preparación de anticuerpos usada para generar el control positivo del ensayo de anticuerpos
neutralizantes debe ser capaz de neutralizar la actividad biológica del compuesto farmacéutico in vitro. Idealmente, el control
positivo puede prepararse agregando anticuerpos antifármacos (policlonales o monoclonales) purificados por inmunoafinidad
o una preparación purificada por proteína-A/G, a una matriz sin diluir apropiada. Como alternativa, únicamente para estudios
preclínicos, se puede usar suero animal hiperinmunizado agregado a una matriz sin diluir apropiada. Para anticuerpos mono-
clonales bioterapéuticos, el control positivo por lo general presenta reactividad de anticuerpo antiidiotípico. El control positivo
de anticuerpos se considera un reactivo crítico y deben documentarse y caracterizarse para su uso en el ensayo. La documenta-
ción y evaluaciones pertinentes que deben tenerse en cuenta incluyen el esquema de inmunización, el procedimiento y el ren-
dimiento de la purificación, la concentración de proteína, la afinidad relativa, la reactividad cruzada, el isotipo y el título de
anticuerpo neutralizante. Una caracterización minuciosa facilitará la uniformidad del reactivo con el paso del tiempo y minimi-
zará la variación entre lotes. Ver el (1106) para monitoreo de la estabilidad de los controles del ensayo.
Aunque los controles positivos se usan para desarrollar, validar y monitorear el desempeño de los ensayos de anticuerpos
neutralizantes, no se debe considerar que dichos controles representen las muestras de estudio. Se debe esperar una gran di-
versidad de respuestas inmunes a la molécula del fármaco, incluyendo la producción de anticuerpos que presentan con un
rango amplio de afinidad de unión y de características de especificidad. Por lo tanto, el desempeño de los controles positivos y
los controles negativos se usa principalmente para asegurar que el ensayo tenga el desempeño esperado (es decir, para confir-
mar la aptitud del sistema).
Puntos de Corte del Ensayo
El punto de corte de un ensayo de anticuerpos neutralizantes es la respuesta del ensayo usada para determinar si una mues-
tra es positiva para actividad neutralizante. A todas las muestras de sujetos que no han sido tratados con el fármaco y a las
muestras de control negativo usadas para la evaluación del punto de corte se les debe agregar una cantidad fija de fármaco
determinada antes de la validación; sin embargo, esto no se aplicaría al formato directo para ensayos de anticuerpos neutrali-
zantes no basados en células. La respuesta del ensayo puede expresarse como una señal del ensayo o como cociente entre la
señal del ensayo de una muestra de prueba y la derivada del control negativo. Las muestras positivas para anticuerpos neutrali-
zantes tendrían una respuesta por encima del punto de corte si el anticuerpo neutralizante incrementa la respuesta del ensayo
y por debajo del punto de corte si el anticuerpo neutralizante reduce la respuesta del ensayo. Como alternativa, la respuesta
del ensayo puede normalizarse y computarse como cambio porcentual a partir del control negativo.
Debido a que el capítulo (1106) incluye una descripción del proceso de evaluación de punto de corte, este capítulo única-
mente provee un resumen del proceso de evaluación, con énfasis y aclaraciones sobre algunos pasos clave para los ensayos de
anticuerpos neutralizantes (el Apéndiceprovee recursos adicionales de utilidad). Se pueden aplicar métodos estadísticos alter-
nativos en algunos pasos del proceso de evaluación de punto de corte (p. ej., evaluación de valores aberrantes) con la justifica-
ción apropiada.
Basándose en aspectos estadísticos y prácticos, se deben usar al menos 30 sueros de sujetos individuales a partir de la pobla-
ción con la enfermedad diana (si estuvieran disponibles) o de donantes sanos para la evaluación del punto de corte. Las mues-
tras a partir de estos sujetos deben ser analizadas en al menos tres corridas independientes (p. ej., días, analistas) por al menos
dos analistas usando una estructura de trabajo con un diseño equilibrado. Deben estar disponibles los informes de al menos
tres resultados para el control negativo por cada placa, donde el informe de un resultado d puede ser el promedio de los resul-
tados de muestras duplicadas si las muestras del estudio también se analizan por duplicado. Asimismo, estos tres resultados
deben provenir de diversos lugares de la placa, tales como la primera columna, la columna del medio y la última columna de
la placa.
Si el punto de corte se estima únicamente a partir de sueros de donantes sanos durante esta fase de validación, se deben
evaluar los datos obtenidos de la población con la enfermedad diana durante la fase de estudio para determinar estadística-
mente si las distribuciones de las respuestas del ensayo son similares a las de la población sana. Si las varianzas son significativa-
mente distintas, el punto de corte debe volver a evaluarse usando la población con la enfermedad diana. Si solo las medias son
significantemente distintas, se puede usar el mismo punto de corte después de volver a definir el control negativo basándose
en la población diana. Durante el proceso de selección de muestras también deben considerarse otras diferencias entre las po-
blaciones relevantes para el estudio clínico con respecto al género, a la edad y a otros factores.
Las distribuciones de datos originales y de datos transformados por logaritmo (u otras transformaciones), promediados entre
corridas del ensayo, se pueden evaluar en términos del coeficiente de asimetría y la gráfica de probabilidad normal. Los datos
de la escala (p. ej., original, logarítmica) que provee la distribución más simétrica o cercana a la normal deben usarse en todos
los análisis subsiguientes, tales como la evaluación de valores aberrantes, los cálculos del punto de corte y las comparaciones
de medias y varianzas entre corridas del ensayo. Los resultados aberrantes analíticos y biológicos deben identificarse usando
métodos estadísticos apropiados tales como residuales condicionales y estimaciones de la media de los sujetos a partir de un
modelo de efectos mixtos que incluya fuentes relevantes de variación en el experimento de punto de corte (p.ej, este modelo
puede incluir Sujetos incluidos dentro de Grupos de Sujetos, Número de Corrida incluida dentro de Analista e Identificación de
USP42 Información General/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 7945
la Placa como efectos aleatorios, así como Grupos de Sujetos, Analista, Orden de Análisis de las Placas y la interacción de Ana-
listas y Orden de Análisis de las Placas como efectos fijos).
Se deben identificar y eliminar los valores aberrantes analíticos antes de identificar los valores aberrantes biológicos, y se de-
be evaluar la distribución de la respuesta del ensayo después de eliminar los valores aberrantes analíticos y biológicos. Si la
distribución es adecuadamente normal (es decir, la prueba Shapiro-Wilk no es significativa), el método paramétrico [media
+2,33 xdesviación estándar (DE), si los anticuerpos neutralizantes incrementan la respuesta del ensayo, y la media -2,33 x DE,
si los anticuerpos neutralizantes reducen la respuesta del ensayo] se pueden usar para determinar el punto de corte a partir de
estos datos de validación. Este cálculo generará una tasa de falsos positivos sin tratar de 1% a partir de una distribución nor-
mal. El punto de corte puede definirse en términos de otras tasas de falsos positivos, tales como O,1%-5% para cada caso
específico, siempre que se justifique y se trate con las agencias reglamentarias. Si la distribución no es adecuadamente normal
(es decir, la prueba Shapiro-Wilk es significativa) pero es suficientemente simétrica (coeficiente de sesgo <1), y la divergencia
de la normalidad se debe principalmente a las colas sesgadas o a algunos valores extremos que podrían no haberse identifica-
do como valores aberrantes estadísticos, se pueden usar en la fórmula de cálculo de punto de corte alternativas robustas a la
media y a la desviación estándar, tales como la mediana y 1,4826 x desviación absoluta de la mediana, respectivamente. Si la
distribución es sumamente carente de simetría (coeficiente de sesgo >1), se recomienda el 99no percentil no paramétrico,
aunque esto debe ser el último recurso debido a que requiere un número mucho más grande de sujetos (> 100) para obtener
un estimado confiable.
Otro aspecto importante a considerar es que la estimación de desviación estándar usada en la estimación de punto de corte
debe incluir todas las fuentes distintas de variación que son relevantes para el contexto en el que se analizarán las muestras del
estudio durante la fase de estudio. Debido a que las muestras de estudio por lo regular son analizadas por múltiples analistas
en diversas placas y corridas del ensayo, la desviación estándar usada en la evaluación del punto de corte en dichos casos debe
incluir, como mínimo, la variabilidad entre analistas, entre placas/corrida, dentro de la placa/corrida y entre sujetos.
Para entender la naturaleza de la variabilidad en el ensayo y para determinar si se puede usar el mismo punto de corte eva-
luado durante la fase de validación para identificar muestras con actividad neutralizante durante la fase de estudio, se deben
comparar las medias y las varianzas de la distribución de la señal del ensayo a partir de aproximadamente seis corridas usando
un modelo de efectos mixtos y la prueba de Levene, respectivamente (ver el capítulo (1106)). Si éstas no son significativamen-
te diferentes, entonces se puede usar el mismo punto de corte (punto de corte fijo) durante la fase de estudio. Por otra parte,
el punto de corte evaluado según se indicó anteriormente usando estos datos de validación debe dividirse por (o restarse de)
el control negativo. A esto se le denomina un factor de normalización multiplicativo (o sumatorio). Este factor puede multipli-
carse (o sumarse) al control negativo usado durante cada corrida de la fase de análisis biológico para definir el punto de corte
específico para la corrida o para la placa. Dicho punto de corte recibe el nombre de punto de corte flotante. Si se encuentra
que dichos datos originales son aproximadamente simétricos o normales, entonces se puede usar el factor de corrección suma-
torio. Cuando es necesaria una transformación logarítmica para asegurar una simetría o normalidad aproximada de la distribu-
ción, o si se ha demostrado que la distribución de la relación entre los resultados de muestra originales (señal del ensayo) y el
control negativo tiene una simetría adecuada o es normal, entonces se puede usar un factor de corrección multiplicativo. En
dichos casos, todos los análisis para la evaluación de punto de corte también pueden realizarse en términos del cociente entre
la señal del ensayo obtenida de la muestra del sujeto individual y el control negativo de la placa correspondiente.
En la práctica, independientemente de si las medias y las varianzas son significativamente diferentes entre placas o corridas
del ensayo, se recomienda el uso de un punto de corte flotante debido a que puede acomodar desviaciones menores entre
corridas del ensayo durante la fase de análisis de las muestras durante el estudio.
Cuando se justifique un punto de corte fijo a partir de las evaluaciones anteriores y que por ende se implemente durante la
fase de estudio, se requerirá un mayor nivel de atención para monitorear y validar cambios en los reactivos y otras condiciones
del ensayo. Debido a que el punto de corte se ha fijado con respecto a dicho ensayo como existía al momento de realizar los
experimentos con los que se determinó el punto de corte, es esencial asegurar que los resultados de la señal del ensayo a partir
de los controles y las muestras de prueba sean uniformes y estables en caso de que se realice cualquier cambio al ensayo (p.
ej., nuevos reactivos, analistas o maquinaria).
Criterios de Aptitud del Sistema
Los ensayos de anticuerpos neutralizantes por lo regular tienen un diseño complejo con operaciones de etapas múltiples.
Estos ensayos usan reactivos complejos y equipos y también requieren una recolección extensa de datos. Por lo tanto, es im-
portante realizar evaluaciones de la aptitud del sistema para evaluar y verificar la validez y utilidad general del método.
Específicamente, se deben incluir los controles positivos y negativos del ensayo y los controles de fondo adicionales (p. ej.,
células individuales y/o células con medicamento) como parte de cada corrida analítica durante la validación del ensayo y du-
rante la fase de análisis de las muestras. La naturaleza exacta de los controles de fondo dependerá del tipo de ensayo de anti-
cuerpos neutralizantes desarrollado (ver la sección Diseñode Métodosde Pruebade AnticuerposNeutralizantes).Los datos obte-
nidos durante la validación del ensayo se usan para desarrollar los criterios de aceptación del ensayo.
Por lo general, el monitoreo del desempeño del control positivo bajo y alto se considera lo más crítico. La inclusión del con-
trol positivo bajo ayuda a monitorear la sensibilidad establecida del ensayo. Se debe evitar el uso exclusivo de un control positi-
vo medio debido a que el intervalo medio de la respuesta del ensayo en función de la concentración del control positivo pue-
de no verse afectado de manera significativa por los cambios en las condiciones del ensayo (p. ej., reactivos, cambios) de la
misma manera que el control positivo bajo y alto. Alternativamente, analizar un control positivo en una serie de diluciones
provee cobertura para múltiples niveles de control positivo, incluyendo el control positivo bajo. En algunas circunstancias, el
uso de un control negativo que incluya un anticuerpo no neutralizante puede ser útil para identificar fallas en la corrida y pre-
venir el informe de resultados falsos positivos. Los criterios de aceptación típicos para las muestras de control del ensayo inclu-
yen (a) precisión de la señal bruta del ensayo para control positivo y control negativo, (b) desempeño del control positivo bajo
o informe del título del control positivo, y (c) límite superior y/o inferior para la respuesta del ensayo generada mediante el
control negativo del ensayo. Se pueden aplicar otros criterios.
Cuando el diseño de punto de corte flotante se emplea para la evaluación del punto de corte del ensayo de anticuerpos
neutralizantes, los criterios o límites de aptitud del sistema se pueden definir para el cociente entre el control positivo bajo y el
control negativo y para el cociente entre el control positivo alto y el control positivo bajo, en lugar de definir límites por sepa-
rado para cada control positivo. Para la fase de estudio, también resulta útil aplicar criterios de aceptación para precisión in-
traensayo (variabilidad de respuesta que se replica en un ensayo). Conforme a lo tratado en el capítulo (1106), se debe evitar
el establecimiento de criterios de aprobación o fallo en los experimentos de validación previos al estudio y se deben incluir
todos los ensayos realizados durante la validación previa al estudio excepto aquellos rechazados por una causa atribuible. La
selección apropiada de la concentración de control positivo bajo y el intervalo aceptable de desempeño son importantes para
asegurar la capacidad de monitorear la sensibilidad sostenida del ensayo. Se espera que la tasa de falla para el control positivo
bajo sea 1o/obasándose en el desempeño del control positivo. De manera similar, se puede establecer una tasa de falla del
ensayo de 1o/obasándose en el desempeño del control negativo. Cuando sea aplicable, se podrán usar tasas de falla más altas
(p. ej., 5%). Para establecer una tasa de falla específica basándose en el desempeño del control negativo y del control positivo
bajo, se deben calcular límites de respuesta del ensayo apropiados basándose en el desempeño del control durante la valida-
ción del ensayo previa al estudio. Alternativamente, se pueden establecer límites para el valor del título de control positivo.
Estos deben definirse basándose en el desempeño del control positivo observado durante la fase de validación del ensayo pre-
via al estudio. Es importante que, dependiendo de los aspectos específicos del diseño del ensayo de anticuerpos neutralizantes,
se espera que la señal del ensayo aumente (Figura3A) o disminuya (Figura38) en respuesta al aumento de la concentración del
control positivo. Por ende, se debe establecer un límite de control negativo apropiado. Por ejemplo, en el primer caso, cuando
aumenta la señal del ensayo, se debe establecer un límite superior para el control negativo. En el segundo caso, tendrá más
importancia un límite inferior para el control negativo.
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Concentración de Control Positivo de Anticuerpos Neutralizantes
Figura 3A. Respuesta del ensayo de anticuerpos neutralizantes en función de la concentración del control positivo. La señal
del ensayo aumenta con concentraciones crecientes del control positivo.
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Concentración de Control Positivo de Anticuerpos Neutralizantes
Figura 3B. Respuesta del ensayo de anticuerpos neutralizantes en función de la concentración del control positivo. La señal
del ensayo disminuye con concentraciones crecientes del control positivo.
Los criterios iniciales de aceptación de control del ensayo pueden basarse en la información existente relacionada con el de-
sempeño del ensayo obtenida durante el desarrollo del ensayo y la fase de calificación. Como alternativa, se pueden aplicar
criterios estándar basados en un procedimiento operativo estándar específico existente para la validación del ensayo de anti-
cuerpos neutralizantes. Se deben tener en cuenta detalles técnicos importantes tales como la capacidad de lectura de señal de
los instrumentos al establecer las expectativas del desempeño del control del ensayo. Los criterios de aceptación reales para los
controles del ensayo solo pueden determinarse después de haber llevado a cabo una evaluación holística de toda la informa-
ción de la validación del ensayo.
Debido a la complejidad de los ensayos de anticuerpos neutralizantes, específicamente los protocolos de anticuerpos neutra-
lizantes basados en células, se debe hacer un esfuerzo por identificar los pasos y condiciones particulares que tengan el poten-
cial más alto de afectar el desempeño del ensayo. Por lo general, se debe monitorear el desempeño del control del ensayo
durante la fase de sustentación del estudio para asegurar la uniformidad de los datos informados. Se deben monitorear los
datos de desempeño del control del ensayo para detectar cualquier tendencia y variaciones a corto o largo plazo relacionadas
con el intervalo predefinido. Cuando se identifique una tendencia sospechosa en el desempeño del control o cuando la señal
falle cerca de un límite del intervalo aceptable, se deberá considerar realizar una investigación.
SensibilidadRelativa
La sensibilidad del ensayo de anticuerpos neutralizantes se define como la concentración más baja de un control positivo de
anticuerpos que el método puede detectar de manera confiable. El resultado obtenido por este parámetro de validación de-
pende en gran medida de las características del control positivo usado para realizar los experimentos, incluyendo su capacidad
neutralizante y su afinidad para unirse al fármaco. La sensibilidad relativa de los ensayos de anticuerpos neutralizantes también
es inversamente dependiente de la concentración de fármaco usada en el ensayo.
Para llevar a cabo el experimento, se agrega control positivo en la matrices combinadas pertinente para el ensayo. Estas
muestras adicionadas son analizadas en múltiples corridas, por lo regular, en al menos tres corridas independientes por parte
de dos operadores para un total de seis corridas. Se recomienda realizar más de una curva de anticuerpo por corrida y por
operador.
Por lo general, se realiza la interpolación lineal entre valores justo por encima y por debajo del punto de corte del ensayo
para calcular el parámetro de sensibilidad del ensayo. En algunos casos, se usa un método de ajuste mediante una función con
cuatro parámetros para el cual deben estar disponibles al menos seis valores generados por varias concentraciones de control
positivo para analizar de manera apropiada el conjunto de datos resultante. Uno de los valores debe caer por debajo del punto
de corte del ensayo. Cuando se usa interpolación lineal o un método de ajuste de cuatro parámetros, se calcula la concentra-
ción del control positivo que generaría una respuesta del ensayo igual al valor de punto de corte. Se promedian los valores
generados en múltiples pruebas durante múltiples días y el resultado se informa como la sensibilidad relativa del ensayo. Una
vez establecido, el valor de sensibilidad del ensayo puede usarse para guiar la selección de una concentración del control posi-
tivo bajo para usarla al monitorear el desempeño del ensayo durante la validación del mismo y al analizar las muestras de estu-
dio. Por lo general, la concentración del control positivo bajo se selecciona para que la tasa de fallo del ensayo debido al de-
sempeño del control positivo no sea mayor a 5%.
Debido a que la sensibilidad del ensayo depende en gran medida de las características del control positivo del ensayo, ésta
variará entre distintos anticuerpos neutralizantes. El valor de sensibilidad del ensayo determinado durante la validación del en-
sayo no puede usarse para predecir la concentración real de anticuerpos neutralizantes que podría detectarse en las muestras
de estudio. El parámetro de sensibilidad del ensayo de anticuerpos neutralizantes es útil para evaluar diversas plataformas ana-
líticas, durante el desarrollo y la optimización del ensayo, y para seleccionar las concentraciones de control positivo apropiadas
para la validación del ensayo y el análisis de aptitud del sistema. Las dianas típicas para la sensibilidad del ensayo de anticuer-
pos neutralizantes son a menudo 0,5-2 µg/mL; sin embargo, debido a que los ensayos de anticuerpos neutralizantes son com-
plejos, se usa un enfoque adecuado para el propósito de cada caso al momento de seleccionar la sensibilidad apropiada del
ensayo con el objetivo de detectar anticuerpos neutralizantes pertinentes desde el punto de vista clínico.
Especificidaddel Ensayo
La especificidad del ensayo se define como la capacidad de detectar sin ambigüedad el analito de interés. Por ejemplo, en el
caso de los ensayos basados en células, se debe realizar una evaluación inicial para investigar la capacidad de la línea celular
seleccionada para responder a los componentes biológicos que se espera estén presentes en la matriz del ensayo que pudieran
parecerse estructural o funcionalmente a la molécula del fármaco o a su diana molecular; el objetivo es asegurar la especifici-
dad del formato para anticuerpos neutralizantes. Dicha evaluación puede ayudar a determinar el diseño del ensayo, la platafor-
ma analítica, el tipo de línea celular que se va a usar en el ensayo, cualquier tratamiento previo de la muestra y demás condi-
ciones del ensayo. Se debe poner especial atención a las diferencias potenciales entre las muestras normales y muestras de
pacientes afectados por la enfermedad. La evaluación de la especificidad del ensayo puede incluir el análisis de anticuerpos
antifármacos irrelevantes (p. ej., anticuerpos contra otras moléculas similares) y debe incluir, cuando sea posible, anticuerpos
antifármacos de unión específica r que carezcan de actividad neutralizante. La comparación puede realizarse evaluando un per-
fil de dilución del anticuerpo o agregando el anticuerpo en exceso a una muestra de matrices negativas combinadas. En un
ensayo de anticuerpos neutralizantes específicos bien diseñado, se espera que los anticuerpos irrelevantes no arrojen un resul-
tado positivo. Otros componentes de la matriz (p. ej., formas solubles de receptores u otras moléculas capaces de unirse con el
fármaco) pueden presentar efectos inhibitorios en la actividad del fármaco. Es importante saber si se debe incluir un análisis
confirmatorio verdadero como parte del análisis rutinario de muestras. Dicho análisis confirmatorio debe demostrar que la inhi-
bición de la actividad del fármaco se debe específicamente a la acción de los anticuerpos neutralizantes y no a otros factores
hallados en la matriz del ensayo. El análisis confirmatorio de anticuerpos neutralizantes, también referido como ensayos de in-
terferencia de la matriz, por lo regular emplean un estrategia basada en el punto de corte. Si se va a tomar una decisión para
incluir un ensayo confirmatorio de anticuerpos neutralizantes de interferencia de la matriz durante el análisis de rutina de las
muestras, la validación debe seguir los principios generales descritos anteriormente para la determinación del punto de corte
del ensayo.
Selectividade Interferencia
La selectividad evalúa la capacidad de un ensayo de anticuerpos neutralizantes para detectar un control positivo de anticuer-
pos neutralizantes en una muestra de matriz que contiene factores de interferencia potenciales. Estos factores de la matriz pue-
den unirse a los anticuerpos neutralizantes mediante interacciones específicas o no específicas, interfiriendo con la detección
de anticuerpos neutralizantes. La interferencia general de la matriz puede investigarse evaluando la recuperación de la respues-
ta del ensayo de anticuerpos neutralizantes generada por el control positivo alto y el control positivo bajo preparados en 10-
20 muestras de matrices individuales pertinentes.
Uno de los principales agentes interferentes en un ensayo de anticuerpos neutralizantes es el fármaco mismo, cuando está
presente en las muestras de prueba de sujetos medicados. Elfármaco interfiere con la capacidad del ensayo para detectar anti-
cuerpos neutralizantes, lo que ocasiona resultados falsos negativos o falsos positivos, dependiendo del diseño del ensayo. La
magnitud de la interferencia del fármaco depende de múltiples factores, tales como la concentración del fármaco circulante, la
concentración y otras características (afinidad, avidez) del anticuerpo del control positivo, la vida media del fármaco y el diseño
del ensayo. Por lo tanto, no es posible establecer un "nivel de tolerancia al fármaco" universal para todos los ensayos de anti-
cuerpos neutralizantes. Sin embargo, la interferencia del fármaco en el ensayo de anticuerpos neutralizantes debe tratarse en el
diseño del ensayo y en las estrategias de análisis. Durante el desarrollo o la optimización del ensayo, la interferencia del fárma-
co puede evaluarse agregando concentraciones valoradas de fármaco en la matriz sin diluir que contiene concentraciones fijas
de un control positivo de anticuerpos neutralizantes, basándose en la sensibilidad del ensayo. El límite de tolerancia al fármaco
se informa como la concentración más alta de un fármaco a la que el anticuerpo neutralizante del control positivo sigue siendo
detectable, en cuyo caso debe definirse la detectabilidad (p. ej., una cierta relación señal-ruido, un nivel seleccionado por enci-
ma del basal). Para asegurar que el método de ensayo sea lo suficientemente sensible para detectar anticuerpos neutralizantes
ante la presencia de fármaco en circulación, el control positivo de anticuerpos neutralizantes debe titularse en una muestra de
matrices combinadas sin diluir (p. ej., a 250 ng/mL o 500 ng/mL para estudios clínicos o a 1000 ng/mL para estudios no clíni-
cos) a fin de evaluar el nivel de tolerancia al fármaco para el método del ensayo. Por ende, basándose en la sensibilidad del
ensayo de anticuerpos neutralizantes, el control positivo debe diluirse a dicho nivel cuando se intenta detectar el anticuerpo
USP42 Información General/ (1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 7949
neutralizante en presencia del fármaco en circulación. El nivel de tolerancia al fármaco puede variar considerablemente cuando
se agregan diferentes concentraciones del control positivo de anticuerpo neutralizante a la matriz del ensayo. Los anticuerpos
neutralizantes también pueden diferir en lo que respecta a la afinidad y/o avidez. Por lo tanto, el nivel de tolerancia al fármaco
evaluado usando un control positivo puede no predecir los niveles reales de interferencia del fármaco en las muestras de estu-
dio.
Debido a que los ensayos de anticuerpos neutralizantes tienden a ser sumamente susceptibles a la interferencia de fármacos,
por lo general no se recomienda analizar anticuerpos neutralizantes en muestras obtenidas de tiempos de muestreo en los que
se esperan niveles elevados de fármaco. Sin embargo, puede ser necesario analizar la actividad de anticuerpos neutralizantes
en muestras de estudio que contengan fármaco en circulación para investigar cuándo ocurre el inicio de la respuesta de los
anticuerpos neutralizantes y su impacto sobre la exposición del fármaco. En estas circunstancias, es necesario aplicar métodos
para superar la interferencia del fármaco y permitir la detección de anticuerpos neutralizantes en presencia de altos niveles de
fármaco en circulación. Las estrategias comúnmente usadas para mejorar el nivel de tolerancia al fármaco incluyen la disocia-
ción ácida y la eliminación del fármaco en exceso por medio de separación física o absorción en fase sólida. Un método alter-
nativo es un análisis basado en la cuantificación del fármaco en el que las muestras se analizan para determinar la actividad
biológica de fármaco en circulación o agregado de manera exógena. Cada método tiene sus propias advertencias. Por ejem-
plo, el pretratamiento ácido puede afectar la actividad de los anticuerpos neutralizantes. En los ensayos de anticuerpos neutra-
lizantes basados en células, el exceso de ácido contenido en las muestras puede afectar de manera negativa la respuesta celular
y disminuir la señal del ensayo, comprometiendo de esa manera la ventaja ofrecida por el uso del procedimiento de disocia-
ción ácida.
Además de la interferencia del fármaco, los ligandos solubles del fármaco también pueden interferir con los ensayos de anti-
cuerpos neutralizantes, generando potencialmente resultados falsos positivos. Asimismo, se puede introducir la interferencia de
la diana cuando la misma se libera de los complejos diana -fármaco durante la disociación ácida. Estos factores interferentes
pueden tratarse optimizando los métodos del pretratamiento de la muestra. Un método viable es el pretratamiento de las
muestras con esferas conjugadas con un anticuerpo antidiana. Después de eliminar las esferas, las muestras sin dianas se pue-
den usar en el ensayo de anticuerpos neutralizantes.
Precisión
La precisión-intraensayo y entre ensayos-es la expresión cuantitativa de variabilidad y provee una medida de la cantidad
de error aleatorio que ocurre durante la ejecución de un procedimiento analítico. Las estimaciones de precisión son indicado-
res útiles del desempeño del ensayo en la matriz especificada del ensayo.
ENSAYOSDE ANTICUERPOSNEUTRALIZANTES
CUALITATIVOS
De conformidad con el capítulo de información general Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos(1225) y la norma ICH

Q2(Rl ), la precisión intraensayo (repetibilidad) es el grado de acuerdo entre resultados generados por análisis consecutivos
(análisis repetidos) de los mismos controles o muestras del ensayo en las mismas condiciones operativas, por el mismo opera-
dor usando el mismo equipo en un laboratorio, dentro de un periodo corto. Se evalúan de cuatro a seis preparaciones inde-
pendientes de muestras de control positivo bajo, control positivo alto y/o control negativo en un lote individual de una mezcla
de sueros de donantes (normales o en estado de enfermedad) por duplicado o triplicado, en múltiples posiciones de la misma
placa de manera aleatoria, para determinar las fuentes relevantes que contribuyen a la variabilidad de la respuesta. La impreci-
sión de la respuesta del ensayo (densidad óptica, unidad de fluorescencia, unidad de luminiscencia o cambio porcentual en la
señal del ensayo después de la normalización o interpolación), se calcula e informa como coeficiente de variación porcentual
(%CV), que es igual a (desviación estándar/media) x 1OO.Los valores del coeficiente de variación porcentual del ensayo de la
respuesta media obtenida con los diversos controles del ensayo deben ser suficientes para la evaluación de la precisión intra-
ensayo. El coeficiente de variación porcentual puede variar dependiendo de la tecnología usada para la detección, la metodo-
logía del ensayo y la complejidad del procedimiento. Por lo tanto, el coeficiente de variación diana esperado o el coeficiente de
variación porcentual combinado para la precisión intra-ensayo debe definirse basándose en la capacidad del ensayo, así como
en el uso que se le pretende dar. No es posible generalizar la precisión aceptable debido a que depende del uso del ensayo y
tipo de fármaco, del riesgo para el paciente y otros factores, pero la necesidad de basarse en el resultado del ensayo debe
conducirse con límites aceptables.
La precisión entre ensayos (también denominada precisión total o intermedia) abarca la variación dentro del laboratorio en-
tre corridas de ensayo y, por lo tanto, representa la precisión general del ensayo. El experimento descrito anteriormente debe
llevarse a cabo durante múltiples días con al menos dos operadores, en especial si el análisis de muestras va a ser ejecutado por
más de un operador en la fase de estudio. La desviación estándar intra-placa combinada y la desviación estándar de la media
para cada muestra analizada en múltiples placas durante múltiples días puede usarse para calcular la precisión intermedia, su-
poniendo que la mayor parte de la variabilidad se puede atribuir a la variabilidad de la placa y a que el tamaño de la muestra
es el mismo en todas las placas. La precisión intermedia depende en gran medida de la metodología del ensayo y de la com-
plejidad del procedimiento. Por lo tanto la precisión intermedia diana debe definirse basándose en la capacidad del ensayo, así
como en el uso que se le pretende dar (aptitud para el propósito).
Mediante una estrategia alternativa, se puede evaluar la precisión entre-ensayos derivando la media, la desviación estándar y
el coeficiente de variación porcentual de los controles negativos y los controles positivos a partir de todos los experimentos
realizados durante el desarrollo del ensayo (siempre que los efectos de la ubicación de la placa sean inapreciables), con algunas
excepciones. Las corridas que se van a excluir son aquellas con errores atribuibles a un operador o un equipo o con variaciones
del método introducidas intencionalmente para el análisis de robustez.
ENSAYOSDE ANTICUERPOSNEUTRALIZANTES
SEMICUANTITATIVOS
Para evaluar la precisión de los títulos informados, los operadores por lo general usan el control positivo bajo y una o dos
concentraciones del control positivo alto. Los controles positivos altos (un mínimo de tres preparaciones independientes) de-
ben diluirse en serie, al medio o al tercio, usando una mezcla de matrices del ensayo sin diluir como diluyente y, posteriormen-
te, se deben analizar. El control positivo alto también puede diluirse en una dilución mínima requerida de una mezcla de matri-
ces, siempre que las muestra futuras se diluyan de la misma manera. Para medir la precisión intra-ensayos, por lo general se
recomienda que un operador en el mismo día analice tres curvas de titulación del control positivo bajo y alto. Para medir la
precisión entre ensayos, dos operadores en un mínimo de 2-3 días diferentes deben analizar cada uno tres curvas de titulación
del control positivo alto y bajo. Los títulos se determinan como un valor inverso de la dilución más alta del control positivo que
arroje un resultado positivo. Los títulos diana pueden determinarse y designarse para cada control positivo alto y bajo o se
pueden calcular como valores medios promediando los valores de los títulos obtenidos para los controles positivos bajos y altos
en la evaluación de la precisión. Posteriormente, las precisiones intra-ensayo y entre ensayos de los títulos se evalúan compa-
rando los títulos obtenidos para curvas preparadas de manera independiente con el título diana designado para el control posi-
tivo bajo y el control positivo alto, respectivamente. Según se describe en el capítulo (1106), un análisis recomendado, aunque
más riguroso, es usar estos datos para definir un cociente mínimo significativo. El cociente mínimo significativo calculado refle-
ja el número más pequeño diluciones que cambian el valor de un título que se puede considerar estadísticamente significativo
(P< 0,05); por ejemplo, si el cociente mínimo significativo= 5, entonces los títulos que difieran en más de cinco veces de di-
cho valor se pueden considerar significativos.
En general, el criterio de aceptación para la precisión del título es que el valor del título designado debe estar dentro de una
dilución del título diana en series de titulaciones independientes. Sin embargo, lo anterior dependerá de la capacidad del mé-
todo, del nivel de dilución (p. ej., este criterio puede ser adecuado para un diseño de ensayo de diluciones en serie al medio o
al tercio pero no para un diseño de dilución en serie al décimo) y el uso pretendido de los datos del título informado en el
ambiente clínico. Si se usa el análisis de título medio calculado, el título medio puede caer ocasionalmente entre las diluciones
debido a que se deriva de los valores observados a partir de múltiples análisis. En este escenario, se debe modificar la regla de
dilución ± 1, y los títulos observados para un control positivo definido se redondean a la dilución más próxima para obtener el
título diana.
Robustezy Reproducibilidad
La robustez y la reproducibilidad de los ensayos de inmunogenicidad se tratan en el capítulo (1106), que está armonizado
con el capítulo (1225) y la norma ICH Q2(Rl ).
El análisis de robustez debe realizarse como parte de la optimización del ensayo durante el desarrollo del mismo, cuando
resulte posible. Esto se debe a que es poco probable que durante la validación un analista específicamente intente hacer cam-
bios que podrían ocurrir de manera rutinaria (p. ej., cambiar lotes de materiales o modificar los tiempos de incubación dentro
de ciertos límites). Por lo tanto, es necesario conocer los parámetros del método que requieren un cumplimiento estricto (p.
ej., la concentración del anticuerpo de recubrimiento), con límites precisos para el parámetro delineado en el método, versus
los parámetros que requieran menos control y que puedan tener descripciones "aproximadas" en el método.
Los experimentos de robustez pueden realizarse de manera simple modificando una o dos variables a la vez o mediante aná-
lisis de diseño de experimentos, dependiendo de cuántos factores se van a analizar a la vez y el grado en el cual se examinarán
las interacciones entre parámetros. La amplitud del análisis de robustez depende del uso pretendido del ensayo (p. ej., un estu-
dio pequeño que busque cambios generales en un experimento toxicológico puede requerir menos análisis de robustez que
algunos otros estudios). Sin embargo, cualquier ensayo usado para estudios clínicos que implica el registro de un fármaco de-
be examinarse minuciosamente de forma rutinaria y durante un periodo prolongado para asegurar que su desempeño sea el
esperado. El efecto de borde de la placa (o uniformidad) debe examinarse durante el desarrollo del ensayo. Otros factores co-
munes cuyo impacto debe ser evaluado incluyen tiempos y temperaturas de incubación, concentraciones de reactivos y densi-
dades celulares.
Cuando sea necesario transferir un ensayo a un laboratorio distinto, los analistas deben evaluar la reproducibilidad del méto-
do en el nuevo laboratorio. Esto puede realizarse como parte de la calificación de transferencia del ensayo y/o la validación del
método en la nueva instalación. Es importante tener en cuenta que un ensayo diseñado y optimizado apropiadamente, en el
que se han conocido y controlado los parámetros críticos, debe ser lo suficientemente robusto para transferirlo sin ningún pro-
blema. Sin embargo, se pueden evaluar diversos indicadores útiles para asegurar que el ensayo tendrá un desempeño idéntico
en cada laboratorio. Las muestras compartidas pueden analizarse en ambos sitios, y se pueden evaluar las estimaciones de la
variabilidad del ensayo y del desempeño del control de calidad (ver también la sección Transferenciasa Otros Laboratoriosen
Gestióndel Ciclode Vida).
USP42 Información General/ (1106.1) Ensayosde lnmunogenicidad 7951
Estabilidad
Resultaútil conocer las condicionesde almacenamientoy manipulaciónóptimas para muestras, controles, materialesy reac-
tivos del ensayo (ver el capítulo (1106) para informaciónadicional).Por ejemplo, puede ser importante asesoraral personal
clínicosobre los procedimientosde preparación de alícuotas,el tiempo de congelación de las muestras, la temperatura de al-
macenamiento y las condicionesde transporte.
Un aspecto clavea considerarde los ensayos de anticuerpos neutralizantesbasados en célulases la estabilidadde la línea
celular misma. Laslíneascelulares,siendo entidades vivas,presentan una variabilidadinherente y el potencial para cambiar con
el paso del tiempo o reaccionaral ambiente de una manera que puede influirsobre su respuesta durante el ensayo. Por ejem-
plo, las variacionesen los nivelesde receptores en la superficiecelular pueden verse afectados por el número de duplicaciones
celulares,el tiempo de cultivo,la presencia de ciertos componentes de los medios (p. ej., suero) y/o la densidad celular.Por lo
tanto, durante el desarrollode un ensayo de anticuerpos neutralizantes,el desempeño de la línea celular debe caracterizarse
minuciosamente.Se deben establecer controles apropiados para parámetros tales como el número de pasajes, reactivosy cam-
bios de medios. Un ejemplo es que el uso de alícuotasde célulascongeladas del mismo número de pasajes para cada ensayo
puede, en ocasiones,reducir la variacióndebido a cambios en el cultivocontinuo.
Documentación de la Validación Previa al Estudio y Durante el Estudio
Elcapítulo (1106) describe la documentación recomendada para la validaciónprevia al estudio y durante el estudio.
MONITOREO
DELAVALIDACIÓN
DELENSAYO
DURANTE
ELESTUDIO
Lacapacidad del ensayo de anticuerpos neutralizantespara tener un desempeño confiablecon el paso del tiempo es impor-
tante para realizarcomparacioneshistóricasde la incidenciade los anticuerpos neutralizantespara un producto bioterapéutico
individuala medida que éste avanza en el ciclo de vida del desarrolloclínico.Asimismo,verificarque el ensayo validado conti-
núe teniendo el desempeño esperado es un proceso continuo y, una vez que se ha implementado el ensayo de anticuerpos
neutralizantes,se considera una buena práctica científicamonitorear su desempeño mediante el análisisde tendencias de los
resultadosobtenidos con controles del ensayo con el paso del tiempo. Se recomienda usar un enfoque estadístico(p. ej., las
reglas Westgard) para designar el umbral de falla del ensayo, así como una investigaciónbasada en el comportamiento del
control del ensayo (positivoo negativo). Esto puede ser más fácil de lograr en ensayos de alta precisiónque en ensayos con
tendencia a una mayor variabilidad.Independientemente, se recomienda tabular los valores de control del ensayo obtenidos a
partir de un mínimo de 1O corridas durante un periodo apropiado para establecer un umbral y una estrategia para identificar
ensayos que parezcan tener una tendencia hacia los límitesdel ensayo. Si el ensayo tiene un desempeño que esté fuera de las
expectativaspreestablecidas,se debe realizaruna investigaciónpara identificarla causa de la observación;asimismo,puede ser
necesario implementar pasos correctivosapropiados. Si se requieren pasos correctivos,puede ser necesarioverificarel desem-
peño del ensayo para demostrar que el desempeño ha vuelto a su niveloriginal.Asimismo,es importante identificarvariables
que podrían contribuir a desviacionesen el ensayo, tales como el uso de un nuevo banco de célulasde trabajo, cambios en los
lotes de reactivoscríticosy diversosoperadores del ensayo.
MANEJODELCICLODE VIDA
Cambio del Diseño de Ensayo de Anticuerpos Neutralizantes
Durante la fase de desarrollodel fármaco, puede ser necesario cambiar el diseño del ensayo de anticuerpos neutralizantes.
Por ejemplo, el diseño del ensayo puede cambiarsede un formato basado en célulasa uno no basado en células,o viceversa,
para obtener un ensayo con sensibilidado especificidadmejorada, u otras característicasdeseables. Cuando los eventos adver-
sos relacionadoscon anticuerpos neutralizantestiendan a ser serioso a amenazar la vida (p. ej., en el caso de medicamentos
de factor de crecimientoo citoquinas que tienen una función no redundante), se recomienda buscar el asesoramientode las
agencias reglamentariasal considerar un diseño de ensayo distinto para asegurar su aptitud para detectar anticuerpos neutrali-
zantes con relevanciaclínica.
Para todos los cambios de diseño de ensayo de anticuerpos neutralizantes,es importante evaluar la sensibilidady la especifi-
cidad del ensayo. Si el cambio se realizapara proveer un desempeño más sencillosin mejoras significativasen las características
del ensayo, se debe comparar la capacidad para detectar anticuerpos neutralizantesdel formato previoy del nuevo. Esta com-
paración debe realizarseusando muestras de suero de donante adicionadascon anticuerpos del control positivo,así como
muestras del estudio que hayan arrojado previamente resultados positivospara anticuerpos neutralizantes.Para éstas últimas,
se debe determinar previamentey cumplirseun grado de concordancia para los resultados de la muestra.
Transferencias a Otros Laboratorios
LABORATORIOS
NO CERTIFICADOS
POR EL PROGRAMADE ENMIENDASPARAEL MEJORAMIENTO
DE LABORATORIOS
CLÍNICOS
Si el laboratorio receptor no está certificado por el programa de Enmiendas para el Mejoramiento de Laboratorios Clínicos
(CLIA,por sus siglas en inglés), se debe evaluar la capacidad de dicho laboratorio para seguir las buenas prácticas de laborato-
rio antes de iniciar cualquier actividad de transferencia del ensayo. Los laboratorios certificados por el programa de enmiendas
para el mejoramiento de laboratorios clínicos son reglamentados por los Centers for Medicare and Medicaid Services (Centros
de Servicios de Medicare y Medicaid) del U.S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios
Humanos de los EE.UU.).Estos reglamentos se definen en el Título 24 del CFRParte 493 y se aplican a los laboratorios que
analizan muestras humanas con el propósito de diagnosticar, prevenir, monitorear o tratar enfermedades. La evaluación de ca-
pacidades para los laboratorios que no forman parte del programa de enmiendas para el mejoramiento de laboratorios clínicos
puede incluir la evaluación de la infraestructura existente para llevar a cabo ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en
células y no basados en células, la revisión de los registros de capacitación del personal, entre otras actividades. Un estudio
informal de viabilidad puede ser útil para evaluar el desempeño del ensayo en el laboratorio receptor. El laboratorio que trans-
fiere puede simplemente proveer el ensayo y los reactivos al laboratorio receptor, el cual puede realizar algunas corridas de
prueba y evaluar los controles del ensayo. Este ejercicio ayuda a evaluar tanto la claridad del método escrito y la capacidad del
laboratorio receptor para realizar el ensayo. Los resultados del estudio de viabilidad deben ser útiles al determinar el nivel de
capacitación forrnal que el laboratorio que transfiere deberá proveer al laboratorio receptor. De ser necesaria, la capacitación
formal deberá seguir un plan documentado de capacitación. Los controles del ensayo y las muestras de capacitación prepara-
das agregando anticuerpos neutralizantes del control positivo a las muestras de matrices pueden ser analizadas por ambos la-
boratorios, el que transfiere el ensayo y por el que recibe el ensayo siguiendo el mismo método detallado. El plan de capacita-
ción debe describir claramente los criterios de aceptación para determinar el éxito de una capacitación.
Las actividades formales de transferencia del ensayo pueden comenzar después de que el personal del laboratorio receptor
ha sido capacitado exitosamente y de que se ha calificado el equipo del laboratorio. Se debe escribir un protocolo de transfe-
rencia del ensayo el cual describa los experimentos que se realizarán durante la fase de transferencia del ensayo. Se deben defi-
nir claramente los criterios de aceptación para los experimentos. Algunos experimentos típicos que deben ser realizados por el
laboratorio receptor durante la transferencia del ensayo pueden incluir (a) corrida de curvas con los anticuerpos del control
positivo, (b) analizar las muestras de matrices a las que no se les han agregado o a las que sí se les han agregado anticuerpos
neutralizantes del control positivo ; y (c) análisis a diferentes lotes de reactivos críticos realizados por más de un analista. Para
los experimentos designados (b) y (c), puede ser útil para el laboratorio que transfiere y para el laboratorio que recibe el ensa-
yo realizar dichos experimentos usando las mismas muestras de capacitación. Posteriormente, se deben realizar análisis estadís-
ticos con los datos generados para evaluar el grado de concordancia entre ambos laboratorios. El protocolo debe detallar el
grado de concordancia requerido para una transferencia de ensayo exitosa. En ciertas situaciones, puede ser necesario derivar
un nuevo punto de corte del ensayo o un cambio en la sensibilidad del ensayo debido a un cambio en los reactivos o los anti-
cuerpos neutralizantes del control positivo. Todos los cambios en el método deben incorporarse en un método revisado, suple-
mentado mediante un informe de transferencia del ensayo que explique detalladamente todos los experimentos que sustentan
los cambios. Después de una transferencia del ensayo exitosa, el laboratorio receptor puede implementar el método para anali-
zar las muestras del estudio. Se deben implementar estrategias apropiadas de tendencia del ensayo para monitorear el desem-
peño del mismo y de esa forma asegurar que se mantiene dentro de las especificaciones recomendadas.
LABORATORIOS
CERTIFICADOS
POR EL PROGRAMADE ENMIENDASPARAELMEJORAMIENTO
DE LABORATORIOS
CLÍNICOS
En el caso de las transferencias de ensayos de anticuerpos neutralizantes a un laboratorio certificado por el programa de en-
miendas para el mejoramiento de laboratorios clínicos, es necesario seguir las guías pertinentes para calificación del personal
de laboratorio y para la revisión y aprobación de los documentos de capacitación del ensayo y de transferencia por parte de
personal que puede supervisar las pruebas requeridas por el programa de enmiendas. La estrategia para la transferencia de
ensayos de anticuerpos neutralizantes a laboratorios que cumplen con las buenas prácticas de laboratorio (no certificados por
el programa de enmiendas para el mejoramiento de laboratorios clínicos), descritos anteriormente, también se puede usar pa-
ra las transferencias a laboratorios certificados por el programa. Las evaluaciones anuales de competencia, el monitoreo de la
garantía de calidad y la revisión de los controles del ensayo, el inforrne de ensayos de pacientes individuales a los médicos
tratantes acerca de los resultados de prueba, y el análisis de competencia son necesarios en los laboratorios que cumplen con
los requisitos de certificación del programa. El análisis de competencia debe realizarse dos veces al año y puede incluir la pre-
paración de muestras de matrices combinadas que se analizan para establecer una línea base. Posteriorrnente, se proveen alí-
cuotas para el grupo de análisis usando un método ciego (al menos 5 muestras de análisis de competencia/evento de análisis
de competencia) y los resultados se comparan con la línea base. En general, 4 de 5 muestras deben pasar el análisis de compe-
tencia y cualquier resultado discrepante debe ser investigado.
USP42 Información General/ {1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad 7953
Validación Cruzada y Ensayos Puente
La validación cruzada puede ser necesaria si el mismo ensayo debe correrse o mantenerse de manera simultánea en múlti-
ples laboratorios. El primer paso es proveer capacitación al personal que corre el ensayo en el nuevo lugar, la cual a menudo es
provista por el laboratorio que transfiere el ensayo. Durante la validación cruzada, podrían aplicarse diversos componentes de
las actividades de transferencia del ensayo mencionados anteriormente. El desempeño del ensayo puede monitorearse usando
controles del ensayo y muestras de la matrices, adicionadas o no adicionadas en ambos lugares. Si el ensayo de anticuerpos
neutralizantes sufre alteraciones dentro de un estudio, se deben realizar experimentos de conexión. Esto se puede lograr co-
rriendo en el nuevo método muestras previamente analizadas con el método antiguo y evaluando la concordancia. Durante
cierto periodo, las muestras del estudio pueden correrse al mismo tiempo con el método antiguo y con el nuevo para asegu-
rarse de que el nuevo método sea aceptable.
Mejoras o Cambios en el Método
El laboratorio debe implementar un proceso para introducir cualquier cambio conocido en el ensayo que pudiera tener un
impacto sobre el desempeño del mismo. Se deben realizar experimentos apropiados de calificación antes de introducir el cam-
bio para asegurar que éste no interferirá con el desempeño histórico del ensayo. Si el cambio requiere un ajuste en los criterios
de aceptación del ensayo, podría requerirse documentación apropiada que demuestre el impacto del ajuste sobre el uso pre-
tendido del ensayo. Se debe consultar a un estadístico en caso necesario.
En el caso de los ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células, un cambio en el método puede implicar el uso
de una línea celular distinta o seleccionar un punto final del ensayo diferente con la misma línea celular para obtener caracte-
rísticas mejoradas del ensayo. En ocasiones, se realiza un cambio en la plataforma de lectura del ensayo de anticuerpos neutra-
lizantes (p. ej., valores de absorbancia generada por ELISAcontra valores de electroquimioluminiscencia). En los casos de mejo-
ras del método, se requerirá el desarrollo del ensayo y la validación del ensayo.
VALIDACIÓNCRUZADACON OTRASESPECIES
Durante el ciclo de desarrollo del fármaco, puede ser necesario cambiar la matriz del ensayo de una especie a otra (p. ej., de
monos cynomolgus o chimpancés a humanos) o entre poblaciones de pacientes. El cambio de matriz del ensayo puede reque-
rir una inversión de esfuerzos en el desarrollo del ensayo y en la validación del ensayo para asegurar que el ensayo tenga la
sensibilidad, la especificidad y demás características aceptables.
REEMPLAZODE REACTIVOS
La calificación de reactivos es necesaria cuando se debe reemplazar un reactivo crítico usando criterios de calificación previa-
mente establecidos. Idealmente, el lote de referencia y el nuevo lote deben compararse preparando controles del ensayo. Sin
embargo, en muchos casos puede no estar disponible un lote de referencia para llevar a cabo una comparación. Ante esta
situación, el nuevo reactivo deberá analizarse y solo se considerará aceptable si el ensayo presenta el comportamiento espera-
do.
Estandarización de Ensayos
Existe una creciente necesidad clínica y un valor aparente en la estandarización de ensayos (es decir, uso de estándares de
referencia, plataformas y método de referencia) para facilitar la armonización de la estrategia usada en la detección de anti-
cuerpos neutralizantes dirigidos contra fármacos en la misma clase de productos terapéuticos [p. ej., terapias con interferones,
anti-factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) anticuerpos monoclonales o agentes estimuladores de eritropoye-
sis]. Cuando participen varias compañías, se debe asumir una estrategia consensuada para estandarizar el método, lo cual re-
quiere acordar sobre un método y protocolo universales con reactivos comunes en todos los laboratorios relacionados. En el
caso de los ensayos de anticuerpos neutralizantes basados en células, es crítico establecer e implementar un banco de células
maestro común. Asimismo, se deben uniformar las unidades de informe para muestras positivas de anticuerpos neutralizantes,
por ejemplo, expresar los resultados como positivo o negativo en función de valores específicos con unidades y/o un protocolo
estándar y reactivos comunes para calcular la actividad de los anticuerpos neutralizantes. Para confirmar de manera exitosa la
implementación de dicha estandarización, todos los laboratorios participantes deben usar el método universal durante la es-
tandarización para analizar un conjunto de muestras de matrices con o sin agregado de anticuerpos neutralizantes del control
positivo en un experimento ciego. Además, se deben llevar a cabo análisis de muestras de estudio positivas y negativas.
APÉNDICE:FUENTESADICIONALESDE INFORMACIÓN
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2013.
(1111) EXAMENMICROBIOLÓGICODE PRODUCTOSNO

ESTÉRILES:CRITERIOSDE ACEPTACIÓNPARAPREPARACIONES
FARMACÉUTICAS Y SUSTANCIASDE USO FARMACÉUTICO
La presencia de ciertos microorganismos en preparaciones no estériles puede tener el potencial de reducir y hasta inactivar la
actividad terapéutica del producto y de afectar adversamente la salud del paciente. Los fabricantes deben asegurar por tanto
una baja biocarga de formas farmacéuticas terminadas mediante la implementación de las guías de Buenas Prácticas de Fabri-
cación vigentes durante la fabricación, el almacenamiento y la distribución de preparaciones farmacéuticas.
El examen microbiológico de productos no estériles se realiza de acuerdo a los métodos proporcionados en Pruebasde Re-
cuento Microbiano (61) y Pruebasde MicroorganismosEspecíficos (62). Los criterios de aceptación para productos farmacéuticos
no estériles basados en el recuento total de microorganismos aerobios (RTMA)y el recuento total combinado de hongos fila-
mentosos y levaduras (RTCHL)se presentan en las Tablas1 y 2. Los criterios de aceptación se basan en los resultados individua-
les o en el promedio de recuentos repetidos, si éstos se realizan (por ej. métodos de siembra directa en placa)
Cuando se indica un criterio de aceptación para la calidad microbiológica, interpretar de la siguiente manera:
- 10 1 ufc: recuento máximo aceptable = 20;
- 10 2 ufc: recuento máximo aceptable = 200;
- 10 3 ufc: recuento máximo aceptable= 2000; etc.
Tabla 1. Criterios de Ace1 taclón para la Calidad Mlcroblológlca de Formas Farmacéuticas No Estériles
Recuento
Total Combina-
Recuento Total do
de de Hongos
Mlcroorganls- FIiamentosos
mos Aerobios y Levaduras
(ufc/g o (ufc/g o
Vía de Administración ufc/ml) ufc/ml) Mlcroorganlsmo(s) Específlco(s)
Preparaciones no acuosas para uso oral 10 3 10 2 Ausencia de Escherichiacoli(1 g o 1 ml)
Preparaciones acuosas para uso oral 102 10 1 Ausencia de Escherichia
coli(1 Q o 1 ml)
Uso rectal 10 3 10 2 -
Uso oromucosal 10 2 10 1 Ausencia de Staphyfococcusaureus (1 g o 1 ml)
Ausencia de Pseudomonasaeruqinosa(1 g o 1 ml)
7956 (1111) Examen Microbiológico de Productos / Información General USP42
Tabla 1. Criterios de Aceptación para la Calidad Mlcroblológlca de Formas Farmacéuticas No Estériles (Continuación)
Recuento
Total Combina-
Recuento Total do
de de Hongos
Mlcroorganls- FIiamentosos
mos Aerobios y Levaduras
(ufc/g o (ufc/g o
Vía de Administración ufc/mL) ufc/mL) Mlcroorganlsmo(s) Específlco(s)
Uso gingival 10 2 10 1 Ausencia de Staphylococcus
aureus(1 q o 1 ml)
Ausencia de Pseudomonas
aerugínosa(1 g o 1 ml)
Uso cutáneo 102 10 1 Ausencia de Staphylococcus
aureus(1 g o 1 ml)
Uso nasal 102 10 1 Ausencia de Staphylococcus
aureus(1 g o 1 ml)
aeruginosa(1 q o 1 ml)
Uso auricular 10 2 10 1 Ausencia de Staphylococcus
aureus(1 g o 1 ml)
Uso vaginal 10 2 10 1 Ausencia de Pseudomonas
aerugínosa(1 q o 1 ml}
Ausencia de Staphylococcus
aureus(1 q o 1 ml}
Ausencia de Candídaalbicans(1 q o 1 ml)
Parches transdérmicos (límites para un par- 10 2 10 1 Ausencia de Staphylococcus
aureus(1 parche)
che incluyendo la capa adhesiva y el sopor- Ausencia de Pseudomonas
aeruginosa(1 parche)
te)
Uso por inhalación (los requisitos especiales 10 2 ,01 Ausencia de Staphy/ococcus
aureus(1 g o 1 ml)
aplican a las preparaciones líquidas para ne- Ausencia de Pseudomonas
aeruqinosa(1 q o 1 ml)
bulización)
Ausencia de bacterias Gramnegativas tolerantes a la bilis (1 g
o1 ml}
La Tabla 1 incluye una lista de microorganismos específicos para los que se establecen criterios de aceptación. Esta lista no es
necesariamente exhaustiva y, para algunas preparaciones, puede ser necesario realizar pruebas para detectar otros microorga-
nismos dependiendo de la naturaleza de los materiales iniciales y del proceso de fabricación.
Si se hubiera demostrado que ninguna de las pruebas descritas permitiría un recuento de microorganismos válido al nivel
prescrito, emplear un método validado con un límite de detección lo más cercano posible al criterio de aceptación indicado.
Tabla 2. Criterios de Aceptación ,ara la Calidad Mlcroblológlca de Sustancias No Estériles para Uso Farmacéutico
Recuento
Total Combinado
de Hongos
Recuento Total de FIiamentosos
Microorganismos Aerobios y Levaduras
(ufc/g o ufc/mL) (ufc/g o ufc/mL)
Sustancias para uso farmacéutico 10 3 10 2
Además de los microorganismos que se enumeran en la Tabla 1, se debe evaluar la relevancia de otros microorganismos
recuperados, en función de lo siguiente:
• El uso del producto: el riesgo varía de acuerdo con la vía de administración (ocular, nasal, respiratoria).
• La naturaleza del producto: ¿el producto sustenta el crecimiento? ¿posee la preservación antimicrobiana adecuada?
• El método de aplicación.
• A quiénes está destinado: los riesgos pueden variar si se destina a neonatos, infantes y pacientes debilitados.
• Uso de agentes inmunosupresores y corticosteroides.
• La presencia de enfermedades, heridas y órganos dañados.
De ser requerido, llevar a cabo una evaluación basada en el riesgo de los factores pertinentes con personal que posea el
entrenamiento especializado en microbiología e interpretación de datos microbiológicos. Para materias primas, la evaluación
considera el proceso al que se somete el producto, la tecnología actual para la realización de pruebas así como la disponibili-
dad de materiales de la calidad deseada.
USP42 InformaciónGeneral/ (1112) Determinación de Actividad de Agua 7957
(1112) DETERMINACIÓNDE ACTIVIDADDEAGUAEN PRODUCTOS

FARMACÉUTICOS NO ESTÉRILES
La determinación de actividad de agua en formas farmacéuticas no estériles auxilia en la toma de decisiones referentes a lo
siguiente:
(a) optimización de las formulaciones de productos para mejorar la eficacia antimicrobiana de los sistemas de conservación,
(b) reducción de la degradación de los ingredientes farmacéuticos activos susceptibles a la hidrólisis química dentro de las
formulaciones farmacéuticas,
(c) reducción de la susceptibilidad de las formulaciones (especialmente de líquidos, lociones, ungüentos y cremas) a la conta-
minación microbiana y
(d) provisión de una herramienta para fundamentar la reducción de la frecuencia de prueba en la determinación de límites
microbianos y análisis de los microorganismos objetables para la liberación del producto y de las pruebas de estabilidad
donde se emplean los métodos tratados en los capítulos generales Pruebasde RecuentoMicrobiano (61) y Pruebasde Micro-
organismosEspecíficos (62).
Una reducida actividad de agua (aw) ayudará en gran medida a prevenir la proliferación de microorganismos en los produc-
tos farmacéuticos; y la formulación, etapas de producción y análisis de formas farmacéuticas no estériles deberían considerar
este parámetro.
La reducción de actividad de agua ha sido usada tradicionalmente para controlar el deterioro microbiano de los alimentos.
Las frutas secas, los jarabes, y las carnes y vegetales encurtidos son ejemplos de alimentos donde se reduce el agua disponible.
La baja actividad de agua en estos materiales favorece su autoconservación. La baja actividad de agua también sirve para pre-
venir el crecimiento microbiano en productos farmacéuticos. Además de la actividad de agua reducida, otros atributos del pro-
ducto, tales como pH alto o bajo, ausencia de nutrientes, presencia de tensoactivos y el agregado de agentes antimicrobianos
también ayudan a prevenir el crecimiento microbiano. Se debe notar, sin embargo, que los microorganismos más resistentes,
entre otros las bacterias formadoras de esporas como Clostridiumspp., Bacil/usspp., Salmonel/aspp. y los hongos filamentosos
pueden persistir dentro del producto aunque no proliferen en un medicamento con baja actividad de agua.
Cuando se formula una forma farmacéutica acuosa, ya sea para la via oral o tópica, se deben evaluar las preformulaciones
con relación a la actividad de agua para que en lo posible el medicamento se autoconserve. Por ejemplo, pequeños cambios
en la concentración de cloruro de sodio, sacarosa, alcohol, propilenglicol o glicerina en una formulación pueden resultar en la
creación de un fármaco con una actividad de agua menor, lo que puede desfavorecer la proliferación de microorganismos en
el producto. Esto es particularmente valioso con un producto que se usa varias veces y que el mismo usuario puede contami-
nar. Se deben realizar estudios sobre el envasado para probar la estabilidad del producto y para determinar que el sistema de
envase-cierre protege el producto contra la incorporación de humedad, lo que aumentaría la actividad de agua durante el
almacenamiento.
La reducción de las pruebas de límites microbianos puede justificarse a través de la evaluación de riesgo. Esta reducción, si
fuera justificable, puede implicar la completa eliminación de las pruebas de límites microbianos, la implementación de un pro-
grama de pruebas sobre lotes salteados o la eliminación de pruebas de rutina.
Los líquidos no acuosos o las formas farmacéuticas sólidas secas no favorecen la germinación de esporas o el crecimiento
microbiano debido a su baja actividad de agua. La frecuencia del control microbiano puede determinarse mediante una revi-
sión de los datos históricos de las pruebas del producto y de la demostración de la eficacia en el control de contaminación
microbiana de las materias primas, el agua empleada como ingrediente, los procesos de fabricación, su formulación y el siste-
ma de envasado del producto. Los datos históricos de las pruebas incluirían el control microbiano durante el desarrollo del
producto, su posterior fabricación, la validación del proceso y las pruebas de rutina de una suficiente cantidad del producto ya
colocado en el mercado (p. ej., hasta 20 lotes) para asegurar que el producto tiene poca o ninguna posibilidad de contamina-
ción microbiana. Debido a que los requisitos de la actividad de agua para las bacterias Gram positivas, Gram negativas, espo-
ras bacterianas, levaduras y hongos filamentosos están bien descritos en la respectiva literatura, 1 se puede establecer un pro-
grama de pruebas de límites microbianos adecuado para productos con diferentes actividades de agua. Por ejemplo, las bacte-
rias Gram negativas, que comprenden microorganismos objetables específicos como Pseudomonasaeruginosa,Escherichiaco/iy
Sa/monellaspp., no proliferarán o sobrevivirán en productos conservados que tienen una actividad de agua por debajo de
0,91, mientras que las bacterias Gram positivas, tales como Staphylococcusaureus,no proliferarán por debajo de 0,86 y Asper-
gillus niger no proliferará por debajo de 0,77. Además, ni siquiera las levaduras más osmofílicas o los hongos más xerofílicos
proliferarían por debajo de 0,60 y no se los podría aislar en medios microbiológicos farmacopeicos. 1 Los requisitos de actividad
de agua medidos a 25º para el crecimiento de un rango de microorganismos representativos se exhiben en la Tabla 1.
1
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Health Association, Washington, DC, 1984 pp.124-134.
7958 (1112) Determinación de Actividad de Agua / Información General USP42
Tabla 1. Actividades de Agua {aw) Requeridas para Sustentar el Crecimiento de Microorganismos Representativos
Hongos FIiamentosos y Levadu-
Bacteria Actividad de Aqua {aw) ras Actividad de Agua {aw)
Pseudomonasaeruginosa 0,97 Rhyzopusniqricans 0,93
Bacilfuscereus 0,95 Mucor plumbeus 0,92
Clostridiumbotu/inum, Tipo A 0,95 Rhodotorulamucilaqinosa 0,92
Escherichiacoli 0,95 Saccharomyces
cerevisiae 0,90
Clostridiumperfrinqens 0,95 Paecilomvcesvariotti 0,84
Lactobacilfusviridescens 0,95 Penicilliumchrysoqenum 0,83
Salmonellaspp. 0,95 Asoeraillusfumigatus 0,82
Enterobacteraeroqenes 0,94 Penicil/iumglabrum 0,81
Bacillussubtilis 0,90 Aspergil/usflavus 0,78
Micrococcuslysodekticus 0,93 Aspergillusniger 0,77
Staphylococcusaureus 0,86 Zygosachharomyces
rouxii (levadura os- 0,62
mofílica)
Halobacteriumhalobium (bacteria ha- 0,75 Xeromycesbisporus(hongo xerofílico) 0,61
lofílica)
Los fármacos con actividades de agua muy por debajo de 0,75 (p. ej., tabletas de compresión directa, cápsulas rellenas de
líquido y de polvo, productos líquidos no acuosos, ungüentos y supositorios rectales) serían excelentes candidatos para la re-
ducción de las pruebas de límites microbianos para la liberación y para evaluar la estabilidad del producto. Esto es especial-
mente cierto cuando los productos farmacéuticos se hacen a partir de ingredientes de buena calidad microbiológica, el am-
biente de fabricación no favorece la contaminación microbiana, existen procesos que de por sí reducen el contenido microbia-
no, la formulación del fármaco tiene actividad antimicrobiana y los sitios de fabricación tienen un historial bien establecido de
pruebas con resultados de baja biocarga asociada con sus productos. La Tabla2 sugiere estrategias para pruebas de límites
microbianos para medicamentos de venta libre y productos farmacéuticos comunes basados en la actividad de agua. Otras
consideraciones, como las mencionadas previamente, serían pertinentes al establecer el programa de pruebas de límites micro-
bianos de medicamentos particulares debido a que las mediciones de la actividad de agua no pueden usarse como único crite-
rio para justificar la eliminación de las pruebas microbianas para la liberación de productos.
Se pueden esgrimir argumentos similares para las pruebas de límites microbianos de los ingredientes farmacéuticos. Se re-
queriría, sin embargo, que los fabricantes de medicamentos tengan un conocimiento integral acerca de los procesos de fabri-
cación, programas de calidad y registros de pruebas de los fabricantes de ingredientes farmacéuticos. Esto podría obtenerse
mediante un programa de auditoría de proveedores.
Tabla 2. Estrategia de Pruebas de Límite Microbiano para Medicamentos de Venta Ubre y Productos Farmacéuticos Representativos
Basada en la Actividad de Agua
Actividad de
Agua Contaminantes de
Productos {llw) Mayor Potencial Pruebas Recomendadas
lnhalante nasal 0,99 Bacteria Gram negativa RTMA,• RTCHL,ausencia de S. aureusy P.aerugino-
sa
Champú para el cabello 0,99 Bacteria G ram negativa RTMA,RTCHL,ausencia de S. aureusy P.
aeruqinosa
Antiácido 0,99 Bacteria G ram negativa RTMA,RTCHL ausencia de E.coli y
Sa/monellaspp.
Crema tópica 0,97 Bacteria Gram positiva RTMA,RTCHL,ausencia de S. aureusy P.aerugino-
sa
Líquido oral 0,90 Bacteria Gram positiva y hongos fi- RTMAyRTCHL
lamentosos
Suspensión oral 0,87 Honqos filamentosos RTMAyRTCHL
Ungüento tópico 0,55 Ninguno Pruebas reducidas
Bálsamo labial 0,36 Ninguno Pruebas reducidas
Supositorios vaqinales y rectales 0,30 Ninguno Pruebas reducidas
Tabletas comprimidas 0,36 Ninquno Pruebas reducidas
Cápsula rellena de líquido 0,30 Ninguno Pruebas reducidas
• RTMA= Recuento Total de Microorganismos Aerobios; RTCHL= Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos y Levaduras.
[NOTA-Las actividades del agua citadas en la Tabla2 son representativas para diferentes formas farmacéuticas y se recomienda a las empresas que
realicen pruebas de los productos individuales antes de desarrollar una estrategia de prueba.]
La actividad de agua, aw, es la razón entre la presión de vapor de H20 en el producto (P) y la presión de vapor de H2 0 pura
(Po) a la misma temperatura. Es numéricamente igual a 1/100 de la humedad relativa (HR) generada por el producto en un
USP42 InformaciónGeneral/ (1113) Caracterización, Identificación y Tipificación 7959
sistema cerrado. La HR puede calcularse por medición directa de la presión parcial de vapor o por el punto de rocío o medirse
indirectamente usando sensores cuyas características físicas o eléctricas se alteran por la HR a la que están expuestos.
La relación entre aw y la humedad relativa en equilibrio (EHR)se representa por las ecuaciones siguientes:
aw= P/Po y EHR(%)= ªw x 100
Se puede medir ªw mediante el método del espejo enfriado/punto de rocío. 2 Se emplea un espejo pulido y enfriado como
superficie de condensación. El sistema de enfriamiento se conecta electrónicamente a una celda fotoeléctrica en la cual se res
fleja luz desde el espejo de condensación. Se dirige una corriente de aire, en equilibrio con la muestra de la prueba, hacia el
espejo, el cual se enfría hasta que ocurra la condensación en el espejo. La temperatura en la que comienza esta condensación
es el punto de rocío a partir del cual se determina la EHR.Se debe tener en cuenta la preparación de la muestra ya que puede
afectar el nivel de actividad de agua del material en análisis. Instrumentos, disponibles comercialmente, que usan el método
del espejo enfriado/punto de rocío u otras tecnologías, deben ser evaluados en cuanto a su aptitud, validación y calibración
cuando se empleen para hacer determinaciones de actividad de agua. Estos instrumentos se calibran típicamente empleando
soluciones salinas saturadas a 25º, como figuran en la Tabla 3.
Tabla 3. Soluciones Salinas Saturadas Estándar para Calibrar Instrumentos que Determinan Actividad de Aqua
Soluciones Salinas Saturadas EHR(%) a,.,
Sulfato de potasio (K,SO4 ) 97,3 0,973

Cloruro de bario (BaCl7 ) 90,2 0,902
Cloruro sodio (NaCI) 75,3 0,753
Nitrato de magnesio [Mg(NO,),J 52,9 0,529
Cloruro de maqnesio (MqCI,) 32,8 0,328
(1113) CARACTERIZACIÓN,
IDENTIFICACIÓNY TIPIFICACIÓNDE
CEPASMICROBIANAS
INTRODUCCIÓN
Por lo general, la caracterización de microorganismos se lleva a cabo cuando éstos se detectan en fármacos, excipientes,
agua para uso farmacéutico, productos intermedios, productos farmacéuticos terminados y en el ambiente de fabricación, y
puede incluir la identificación y tipificación de cepas, según corresponda. [NOTA-Se proporciona un Glosariode Términosal
final de este capítulo.] La caracterización de rutina de microorganismos puede incluir la determinación de la morfología de la
colonia, morfología celular (bacilos, cocos, agrupaciones celulares, modos de esporulación, entre otros), reacción de Gram u
otras técnicas de tinción diferencial, así como diversas reacciones bioquímicas clave (p. ej., actividad de oxidasa, catalasa y coa-
gulasa) que pueden ser de diagnóstico. La caracterización microbiana a este nivel es suficiente para muchos de los propósitos
de evaluación de riesgos en operaciones de fabricación farmacéutica no estéril y en algunos ambientes de fabricación de pro-
ductos estériles.
En algunos casos, una identificación de los microorganismos más concluyente requiere una identificación a nivel de género y
especie. Más allá de lo antes mencionado, las metodologías disponibles pueden llevar a cabo una identificación a nivel de ce-
pa, que puede ser útil en una investigación para determinar la fuente del microorganismo. La identificación es especialmente
habitual cuando se recuperan organismos en tasas inusualmente altas o en cantidades que exceden los niveles recomendados
para las categorías específicas de los productos. La identificación microbiana además es útil en el procesamiento aséptico. Es
necesario realizarla cuando las pruebas de esterilidad arrojan resultados positivos y cuando se debe evaluar la contaminación
recuperada de simulaciones de procesamiento aséptico fallidas, es decir, del llenado de medios.
Los sistemas de identificación microbiológica se basan en diversas metodologías analíticas, por lo que las limitaciones pue-
den ser inherentes al método y/o derivarse de las limitaciones de las bases de datos. La identificación se logra cotejando las
características (genotípicas y/o fenotípicas) con un organismo estándar (de referencia) establecido, por ejemplo una cepa tipo.
Los microorganismos solo serán identificables cuando estén incluidos en la base de datos, por lo que los fabricantes deben
revisar la extensión de la base de datos del sistema de identificación que planean utilizar, así como la utilidad del mismo con
respecto a sus necesidades. Los usuarios deben considerar los sistemas de identificación microbiológica que mejor se ajusten a
sus necesidades. Teniendo en cuenta dichas limitaciones y el nivel de identificación requerido (género, especie, cepa), los usua-
rios deben seleccionar la tecnología apropiada para usar en las pruebas de identificación microbiológica de rutina.
El capítulo de pruebas generales de la USP ExamenMicrobiológicode ProductosNo Estériles:Pruebasde MicroorganismosEspe-
cíficos(62) cita específicamente la necesidad de la identificación microbiana. Asimismo, dicho capítulo requiere pruebas de
identificaci6n confirmatorias para organismos que proliferan en medios selectivos o de diagnóstico y presentan características
2 Método Oficial 978.18 de la AOAClntemational. En: Official Methodsof Analysisof AOAClnternational, 1?'h edition, AOAClntemational, Gaithersburg, Maryland.
7960 (111 3) Caracterización, Identificación y Tipificación / Información General USP42
morfológicas definidas. Por otra parte, el capítulo de pruebas generales de la USP Pruebasde Esterilidad(71) permite invalidar la
prueba cuando, después de la identificación de los microorganismos aislados de la prueba, el crecimiento de dichas especies se
puede atribuir inequívocamente a fallas relacionadas con el material y/o la técnica usada para llevar a cabo el procedimiento
de prueba de esterilidad. El capítulo de información general de la USP Control Microbiológicoy Monitoreode Ambientesde Proce-
samientoAséptico(1116) recomienda la identificación de los microorganismos aislados a una tasa que sea suficiente para res-
paldar el programa de monitoreo ambiental.
AISLAMIENTO
DE CULTIVOSPUROS
La primera etapa de la identificación consiste en aislar un cultivo puro para su análisis. Esto por lo general se logra mediante
la siembra sucesiva en estrías de la colonia de interés, empleando un patrón de cuadrante en medios sólidos microbiológicos
generales adecuados, con el propósito de obtener colonias discretas que, por lo general, producen cultivos puros. Esta técnica
también permite la expresión fenotípica y la proliferación de inóculo suficiente para los procedimientos de identificación subsi-
guientes. Los analistas deben reconocer que la fuente del aislamiento, la selección de los medios y las condiciones de creci-
miento (ver la Tabla 1) pueden afectar la expresión del fenotipo microbiano (es decir, tamaño y forma de la célula, esporula-
ción, composición celular, antigenicidad, actividad bioquímica y sensibilidad a los agentes antimicrobianos). Por lo tanto, los
medios preparatorios para identificación y el número de subcultivos pueden afectar los resultados de los métodos de identifica-
ción del fenotipo.
Tabla 1 . Caractenstlcas Fenot1p1cas
' 1 Usadas en 1a Taxonom,a' MIero bl ana
Categorías Características
Cultivo Morfologíade la colonia, color de la colonia, forma y tamaño, producción de pigmentos
Morfológicas Morfologíacelular,tamaño de la célula, forma de la célula, tipo de flagelos, material de reserva, reacción de Gram, es-
poras y tinción de ácido alcohol resistencia, modo de esporulación
Fisiológicas Toleranciaal oxíqeno, intervalo de pH, temperatura óptima e intervalo de temperatura, tolerancia a la salinidad
Bioquímicas Utilizaciónde carbono, oxidación o fermentación de carbohidratos, patrones enzimáticos
Inhibición Toleranciaa las sales biliares,susceptibilidada antibióticos,tolerancia a los colorantes
Serológicas Aglutinación,anticuerpo fluorescente
Quimiotaxonómicas Perfilde ácidos qrasos, toxinas microbianas,composición de la célula entera
Ecolóqicas Origen del organismo
Por el contrario, el genotipo microbiano generalmente se conserva de buena manera y no se ve afectado por las condiciones
del cultivo. Por lo tanto, una vez que se ha asegurado el aislamiento de una colonia monoclonal pura, el microorganismo pue-
de ser analizado sin preocupación alguna sobre los medios de crecimiento más recientes o aislamientos viables. La Tabla2 lista
las características genotípicas que se pueden determinar.
Tabla 2. Caractenstlcas Genotíplcas/Flloqenétlcas Que Se Pueden Usar en la Taxonom1a Micro bla na
Categorías Características
Genotípicas Relaciónde bases de ADN(contenido G + C), patrones de fraqmentos de restriccióny sondas de ADN
Filogenéticas HibridaciónADN-ADNy secuenciasde los ARNr16S y 23S
Lataxonomíabacteriana,segúnsedescribeen el Bergey's
Manualof Systematic
Bacteriology
[Manualde Bacterología
Sistemáti-
ca de Bergey](el Manual de Bergey)1 actualmente se logra mediante el análisis comparativo de material genético. Cuando el
ADN de un organismo desconocido se compara con el ADN de un organismo conocido, se puede determinar el grado de co-
rrelación. La identificación genotípica (Tabla 2) se logra mediante el uso de hibridación de ADN, comparaciones de los patro-
nes de fragmentos de restricción y/o sondas de ADN. Por ejemplo, una correlación superior al 70% con hibridación ADN-ADN
indica que los organismos son de la misma especie. El análisis filogenético (Tabla 2) por lo general se lleva a cabo mediante la
comparación de la secuencia de bases de una porción del gen del ARN ribosomal 16S para bacterias o el gen del ARN riboso-
mal 23S para hongos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar estos genes y, posteriormente, se
aísla la región amplificada y se obtiene su secuencia de bases usando un método electroforético o de terminación de cadena
didesoxi. Las comparaciones se pueden llevar a cabo empleando bases de datos validadas de patente o con aquéllas de acceso
público. [Precaución:Esposibleque las basesde datos de accesopúblico no esténvalidadas.]
DETECCIÓN
Y CARACTERIZACIÓN
PRIMARIA
Los microorganismos aislados en medios farmacopeicos a partir de muestras de ingredientes farmacéuticos, de agua para
uso farmacéutico, del ambiente de fabricación, de productos intermedios y de los productos terminados pueden estar bajo
estrés fisiológico. Los microorganismos pasarán de un estado metabólico adecuado para su supervivencia en condiciones am-
bientales adversas a condiciones de cultivo más favorables desde el punto de vista nutricional y que se encuentran a una tem-
1 Bergey'sManual of SystematicBacteriology,2da Edición,2003

USP42 InformaciónGeneral/ (1113) Caracterización, Identificación y Tipificación 7961
peratura de incubación óptima. Esta transición se puede controlar mediante el manejo cuidadoso de los aislamientos. Como
preparación para la identificación, se siembran colonias representativas individuales en estrías, a partir de los medios de aisla-
miento primario, en medios sólidos para colonias monoclonales, según se describió anteriormente. El primer paso consiste en
determinar la reacción de Gram, la morfología celular y, en algunos casos, las reacciones bioquímicas de diagnóstico de los
aislamientos de bacterias. Éste es un paso crítico para muchos esquemas de identificación fenotípica, puesto que si se asignan
características erróneas a un aislamiento, es posible que los análisis subsiguientes se lleven a cabo usando un kit de identifica-
ción microbiana erróneo, lo cual conduciría a resultados incorrectos. A continuación se describen diversas pruebas de detec-
ción preliminar de uso común.
Tinción de Gram
Los métodos de tinción de Gram se pueden realizar en cuatro pasos: cristal violeta (colorante primario), yodo (mordiente),
alcohol o solución de alcohol-acetona (decolorante) y safranina (colorante de contraste). En el método de tres pasos, se com-
binan los pasos de decoloración y contraste. En condiciones óptimas, los organismos Gram positivos retienen el colorante cris-
tal violeta y presentan un color violeta azulado. Los organismos Gram negativos pierden el colorante cristal violeta, por lo que
contienen únicamente el colorante de contraste, safranina, y se presentan de color rojo. Algunas bacterias pueden presentar
reacciones de Gram variables. Las dificultades más comunes de este método recaen en que la fijación con calor puede ocasio-
nar que las células Gram positivas se tiñan como Gram negativas, y que los cultivos más antiguos puedan presentar reacciones
de Gram variables. Un exceso de decolorante puede generar un resultado Gram negativo falso, mientras que una cantidad
insuficiente de decolorante puede generar un resultado Gram positivo falso. Una variación que presenta ventajas para algunos
casos consiste en fijar el frotis bacteriano con metanol en lugar de calor. En algunos casos, la fijación con alcohol puede arrojar
resultados de tinción de Gram más uniformes. Independientemente del método, se debe incluir un control Gram positivo y
Gram negativo que permita identificar errores de tinción. Debido a que la reacción de tinción de Gram se debe observar al
microscopio, es posible determinar simultáneamente la morfología celular.
Tinción de Esporas
La tinción de esporas se puede lograr usando colorante verde malquita para esporas bacterianas. Se debe incluir un control
positivo que permita la identificación de errores en la tinción de las esporas.
Detección Bioquímica
Las pruebas de detección bioquímica clave incluyen (1) la prueba de oxidasa para separar bacterias Gram negativas con for-
ma de bacilo en bacterias no fermentadoras (oxidasa positiva) y entéricas (oxidasa negativa), (2) la prueba de catalasa para
separar Staphylococci (catalasa positiva) de Streptococci(catalasa negativa) y (3) la prueba de coagulasa para separar Staphylo-
coccien coagulasa negativa (presuntamente no patogénica) y Staphylococci coagulasa positiva (más probablemente patogéni-
ca).
Este pequeño número de pruebas puede proveer información suficiente para la evaluación en curso en muchos tipos de in-
vestigaciones e inspecciones de rutina de la biocarga en el ambiente de fabricación. No obstante, cuando las circunstancias
exigen una evaluación más a fondo, la identificación hasta el nivel de género, especie o cepa puede generar información valio-
sa sobre la naturaleza y fuente de la biocarga ambiental. Asimismo, la identificación microbiana hasta el nivel de especie, e
incluso de cepa, puede ser crítica para la evaluación y mitigación de riesgos de contaminación microbiana.
IDENTIFICACIÓN
MICROBIANAPOR MÉTODOSFENOTÍPICOS
Los métodos fenotípicos emplean la expresión de productos génicos para distinguir entre microorganismos distintos. Por lo
general, éstos requieren un número relativamente grande de células en cultivo puro monoclonal. Los métodos de recuperación
y crecimiento para recuento e identificación microbianos se ven limitados por la duración de la incubación y por el hecho de
que muchos de los organismos presentes en el ambiente no son recuperados por los medios de crecimiento microbiológico
generales. Asimismo, es probable que los microorganismos estresados, recién aislados por subcultivo a partir de la recupera-
ción primaria no produzcan una expresión completa de las propiedades fenotípicas. Sin embargo, los métodos basados en la
utilización de carbono y reacciones bioquímicas, así como los perfiles de ácidos grasos mediante cromatografía de gas-líquido
y la composición de la célula entera por espectrometría de masas MALDI-TOF,siempre se basan en el desarrollo de inóculos
para un sistema de identificación específico. Estos sistemas dependen de los medios de cultivo y de las condiciones de incuba-
ción especificados para lograr una identificación uniforme. Los métodos fenotípicos de identificación microbiana se usan con
éxito en laboratorios de análisis microbiológico de alimentos, agua, clínicos y farmacéuticos. 2 Los métodos fenotípicos de iden-
tificación microbiana proveen información que permite a los microbiólogos tomar decisiones bien fundamentadas con respec-
to a los riesgos del producto y reconocer cambios en la microflora ambiental. La identificación fenotípica por sí misma es sufi-
2 O'Hara, C.M., M.P.Weinstein,y J.M. Miller.Manual and automated systemsfor detection and identificationof microorganisms.ASMManual of Clinica/Microbio-
logy, Bva Edición,2003.
7962 (111 3) Caracterización, Identificación y Tipificación / InformaciónGeneral USP42
ciente para muchas investigaciones de control de calidad y permitirá a los científicos llevar a cabo una investigación meticulosa
y recomendar acciones correctivas apropiadas, según se requiera.
IDENTIFICACIÓN
MICROBIANACON MÉTODOSGENOTÍPICOS
Los métodos genotípicos de identificación microbiana son, en teoría, más fidedignos, debido a que las secuencias de ácidos
nucleicos se conservan de muy buena manera en la mayoría de las especies microbianas. Los métodos genotípicos aplicables
incluyen hibridación ADN-ADN, PCR, secuenciación de ARNr 16S y ARNr 23S, tipificación por secuenciación multilocus (MLST,
por sus siglas en inglés), pirosecuenciación, sondas de ADN y ribotipificación analítica. Estos métodos pueden presentar desa-
fíos técnicos para los microbiólogos, además de requerir equipo e insumos analíticos más costosos. A menudo, estos análisis se
llevan a cabo en laboratorios contratados, laboratorios gubernamentales, universidades, institutos de investigación o laborato-
rios especializados pertenecientes a firmas industriales. Por lo tanto, el uso de métodos genotípicos de identificación se limita
generalmente a investigaciones microbiológicas críticas tales como investigaciones en falla de producto. Asimismo, si se lleva a
cabo una identificación a nivel de cepa en el transcurso de una investigación, los analistas deben asegurarse de que el método
sea apropiado.
La secuenciación de ADN de los primeros 500 pares de bases de la secuencia del gen de ARNr 16S es útil para la identifica-
ción a nivel de especies, pero puede no ser lo suficientemente potente para distinguir entre especies estrechamente relaciona-
das o cepas de la misma especie. Por el contrario, la hibridación Southern de digeridos de endonucleasas de restricción es una
técnica potente y puede resultar efectiva para demostrar diferencias entre dos cepas. Si los patrones de bandas parecen idénti-
cos, esto demuestra únicamente que la endonucleasa de restricción tiene sitios de ruptura similares en una determinada región
de los dos organismos. La demostración de que dos organismos son iguales debe incluir dos o más digeridos diferentes de
endonucleasas de restricción, cada uno de los cuales genera bandas en el área de interés. Todas las bandas de los dos organis-
mos deben ser idénticas.
A diferencia de la identificación microbiana, los métodos basados en ácidos nucleicos se pueden usar para detectar microor-
ganismos específicos. Los pasos relacionados con esta actividad son: recolección de las muestras, extracción de los ácidos nu-
cleicos, amplificación de los blancos, hibridación y detección. El problema de amplificar ADN a partir de células bacterianas no
viables se puede resolver utilizando transcripción reversa para convertir el ARNrque es transicional, y que por consiguiente se
relaciona con la viabilidad, en ADN para amplificación por PCR. Otras cuestiones incluyen: detección de variantes microbianas,
límites de detección, efectos de la matriz, verificación de cortes positivos, transferencia de instrumental y sistemas, exactitud
del diagnóstico y reproducibilidad.
VERIFICACIÓN
DE MÉTODOSDE IDENTIFICACIÓN
MICROBIANA
Las pruebas de identificación microbiana incluyen pruebas serológicas, de reactivos químicos, de organismos de referencia y
de instrumental. La verificación de un sistema de pruebas de identificación puede incluir cualquiera de los siguientes: (1) usar
un sistema existente para el análisis paralelo de aislamientos microbianos obtenidos del análisis de rutina (el número de aisla-
mientos analizados puede llegar a 50 y cualquier discrepancia en la identificación puede ser subsanada usando un método de
arbitraje); (2) analizar 12-15 cultivos madre representativos conocidos procedentes de diferentes especies comúnmente aisla-
das para un total de 50 pruebas; o (3) confirmar que 20-50 identificaciones de organismos, incluyendo 15-20 especies dife-
rentes, concuerdan con los resultados de un análisis realizado en un laboratorio de referencia de una muestra dividida. 3 En
cada caso, se deben incluir organismos de control de calidad apropiados para el proceso de verificación, según lo recomenda-
do por el proveedor y por la farmacopea.
La verificación de la identidad de las especies debe ser evaluada empleando sistemas de identificación, y además tomando
en cuenta el nivel de concordancia. Por lo general, se puede lograr una concordancia superior al 90% con muestras de micro-
organismos que sean apropiadas para el sistema de identificación. Los grupos de organismos que son difíciles de identificar (p.
ej., bacterias no fermentadoras, corinobacterias y Staphylococci coagulasa negativo) se pueden incluir, cuando corresponda, en
el proceso de verificación, pero pueden generar niveles de concordancia menores.
La jerarquía de los errores de identificación microbiana en orden descendente de impacto es (1 ) identificación errónea de
géneros, (2) identificación errónea de especies y (3) falta de identificación. La identificación errónea puede provocar la aplica-
ción de acciones correctivas y preventivas inadecuadas y el descarte del producto.
Cabe la posibilidad de que un sistema de identificación microbiana no pueda identificar algunos aislamientos por las siguien-
tes razones: el organismo no está incluido en la base de datos, los parámetros del sistema no son lo suficientemente amplios
como para identificar el organismo, el aislamiento no reacciona en el sistema o no existe una descripción taxonómica de las
especies. En tales casos, los aislamientos pueden enviarse al proveedor del sistema de identificación microbiana para estudio
adicional y, cuando corresponda, agregarlos a la base de datos. Alternativamente, se pueden llevar a cabo pruebas genotípicas
de identificación y agregar las especies a una base de datos interna. La identificación errónea es más difícil de determinar, pero
se debe corroborar que cualquier identificación microbiana sea razonable en lo que respecta a la morfología del microorganis-
mo, sus requisitos fisiológicos y la fuente de aislamiento. Los organismos identificados únicamente al nivel de género pueden
3 Cumitech 31. Verificationand Va/idationof Proceduresin the Clinica/MicrobiologyLaboratory.Elder,B.l.,

S.A. Hansen, J.A. Kellogg, F.J.Marsik,y R.J.Zabransky,ASM,
Febrero 1997.
USP42 Información General/ (1113) Caracterización, Identificación y Tipificación 7963
ser comunes para las numerosas especies no patógenas de Staphylococcus,Corynebacterium(y demás bacilos Gram positivos
pleomórficos pequeños) y Micrococcus.
Las pruebas de verificación más importantes son exactitud y reproducibilidad. Estas mediciones se pueden definir del si-
guiente modo:
% de Exactitud = (Número de resultados correctos/Número total de resultados) x 100
% de Reproducibilidad = (Número de resultados correctos que concuerdan entre sí/Número total de resultados) x 100
El usuario debe establecer criterios de aceptación adecuados de exactitud y reproducibilidad, tomando en cuenta las capaci-
dades del método.
Otras mediciones incluyen: sensibilidad, especificidad y valor predictivo positivo y negativo. Estas mediciones se ilustran me-
jor con el siguiente ejemplo. Un laboratorio clínico de microbiología comparó la frecuencia de aislamiento de una sonda de
hibridación de ADN contra un método de cultivo para la bacteria de transmisión sexual Neisseriagonorrhaeae.3 La frecuencia
de aislamiento a partir de muestras clínicas era históricamente de 10%. El laboratorio analizó 100 muestras divididas; los resul-
tados se presentan en la Tabla3.
Tabla 3. Comparaclon de la Distribución de los Resultados Neqatlvos v Positivos para os Metodos de Sonda de ADN y de Cultivo
Resultados del Cultivo
Resultados de la Sonda de ADN Positivo Negativo
Positivo 9 2
Negativo 1 88
Sensibilidad= [9/(9 + 1)] x 100 = 90%

Especificidad= [88/(88 + 2)] x 100 = 97,7%
Valor Predictivo Positivo= [9/(9 + 2)] x 100 = 81,8%
Valor Predictivo Negativo= [88/(88 + 1)] x 100 = 98,9%
Tener en cuenta que el valor predictivo positivo (VPP) no es intrínseco a la prueba; éste depende también de la preponde-
rancia del microorganismo en muestras clínicas. El VPP es directamente proporcional a la preponderancia de la enfermedad o
condición. En este ejemplo, si el grupo de individuos analizados hubiese incluido una proporción mayor de personas con la
infección, entonces el VPP probablemente habría sido mayor, mientras que el valor predictivo negativo (VPN) habría sido me-
nor. Si todas las personas del grupo hubieran presentado la infección, el VPP habría sido del 100% y el VPN del 0%. La deriva-
ción matemática de estas funciones se detalla en la Tabla4.
Tabla 4. Tabla de Contingencia de Dos FIiasy Dos Columnas con Respecto al Método de Cultivo de Referencia y al Método de PCR
Alternativo (De acuerdo a ISO5725- 1 y 5725-2 2004)*
PCR
Cultivo Positivo Negativo Suma
Positivo a b
Verdadero Positivo Falso Neqativo a+b
Negativo c d
Falso Positivo Verdadero Neqativo c+d
Suma a+c b+d
• ISO 5725-1 :l 994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results [Exactitud (veracidad y precisión) de los métodos y resultados de la
medición}-Part 1: General principies and definitions (Parte 1: Principios y Definiciones Generales) e ISO 5725-2:1994 Accuracy (trueness and precision) of mea-
surement methods and results [Exactitud (veracidad y precisión) de los métodos y resultados de la medición]-Part 2: Basic methods for the determination of
repeatability and reproducibility of standard measurement methods (Parte 2: Métodos básicos para la determinación de repetibilidad y reproducibilidad de mé-
todos de medición estándar).
lnclusividad (%) = [a/(a + b)] x 100

Exclusividad (%) = [d/(c + d)] x 100
Predictividad Positiva (%) = [a/(a + c)] x 100
Predictividad Negativa(%)= [d/(b + d)] x 100
Exactitud Analítica(%)= [(a+ d)/(a + b + c + d)] x 100
Índice Kappa= 2(ad - bc)/[(a + c) x (c + d) +(a+ b) x (b + d)]
ConsideracionesFilogenéticas
La segunda edición del Manual de Bergeyrepresentó un cambio mayor en términos de innovación con respecto a la primera
edición, e incluso con respecto a la octava y novena ediciones del Manual of DeterminativeBacteriology(Manual de Bacteriolo-
gía Determinativa). La organización del contenido en el Manual de Bergeysigue un marco filogenético, basado en el análisis de
la secuencia de nucleótidos de la subunidad pequeña del ARN ribosómico l 6S, en lugar de una estructura fenotípica.
Los árboles filogenéticos o dendrogramas presentan a los organismos con las relaciones genéticas más cercanas. La aplica-
ción de esta tecnología ha generado revisiones en la taxonomía, así como la redenominación de algunos microorganismos
bien conocidos; p. ej., al hongo A. niger ATCC 16404 se le renombró A. brasiliensis.En general, los organismos con una correla-
7964 (1113) Caracterización, Identificación y Tipificación / Información General USP42
ción menor o igual al 97% se consideran de géneros distintos, mientras que aquéllos con una correlación menor o igual al
99% se consideran especies diferentes, 4 aunque existen muchas excepciones a dicha generalización.
Las diferencias de genotipo y fenotipo son relativamente poco comunes; p. ej., el mismo genotipo o uno muy similar com-
partido por microorganismos con fenotipos diferentes, fenotipos similares pero genotipos diferentes y microorganismos cuyos
genotipos son muy distantes para ser de la misma especie o género. El concepto de taxonomía polifásica5 que hace referencia
al ensamble y uso de muchos niveles de información, p. ej., caracterización microbiana, datos fenotípicos y genotípicos, y ori-
gen de los microorganismos, se puede aplicar exitosamente a la identificación microbiana, lo cual evita tomar decisiones em-
pleando únicamente datos genotípicos que carecen de sentido cuando se consideran las caracterísitcas microbianas, el historial
de análisis y la fuente de aislamiento.
GLOSARIO
Caracterizaciónmicrobiana: Uso de la proliferación de colonias, morfología celular, tinción diferencial y características de
diagnóstico claves para caracterizar un aislamiento de laboratorio, a fin de determinar tendencias y para propósitos investigati-
vos sin identificación, p. ej., Staphylococci no patógenos.
Cepa: Aislamiento específico de una especie que se mantiene en un cultivo puro y está caracterizado. La cepa tipo es repre-
sentativa de la especie que proporciona una referencia para las especies basada en su historial de aislamiento, caracterización y
deposición en colecciones de cultivos reconocidos.
Clasificaciónmicrobiana: Agrupación de microorganismos en grupos taxonómicos basándose en sus similitudes y relacio-
nes.
Correlación: Se refiere al grado de relación o similitud de dos (o más) organismos en un Árbol Filogenético o Dendrograma.
Especie filogenética: Especie que consta de una gran cantidad de cepas, que incluyen el tipo de cepa que comparte por lo
menos 70% de la hibridación ADN-ADN del genoma total y menos de 5º .:Hm (diferencia en el punto de fusión del híbrido).
Identificaciónmicrobiana: Determinación del grupo amplio (p. ej., bacterias, levaduras u hongos filamentosos) o grupo re-
ducido (p. ej., géneros y/o especies) al que pertenece un aislamiento de laboratorio.
Mol %GC: Porcentaje molecular del contenido de guanina-citosina en el ADN cromosómico. [NOTA-%GC + %AT= 100%.]
Secuencia de ARNr: Las secuencias del ADN que codifican para el ARNr usado en la síntesis de proteínas se conservan de
muy buena manera entre microorganismos con un linaje común. Se usan para determinar la distancia filogenética entre orga-
nismos y son útiles para la taxonomía e identificación microbiana.
Taxonomía polifásica: Taxonomía que ensambla y asimila una gran cantidad de niveles de información de fuentes molecula-
res, fisiológicas, morfológicas, serológicas o ecológicas para clasificar un microorganismo.
Tipificaciónde la cepa: La tipificación de la cepa es una parte integral de las investigaciones epidemiológicas para la micro-
biología clínica y de salud pública. Los métodos que se pueden usar para demostrar que las especies microbianas pertenecen a
la misma cepa y posiblemente se derivan de una misma fuente incluyen electroforesis en gel de campo pulsado, identificación
por riboimpresión (riboprinting), reacción en cadena de la polimerasa con cebado aleatorio y mapeo de restricción ordenada
del genoma completo o mapeo óptico.
(1115) CONTROLDE BIOCARGADE FÁRMACOSY MEDICAMENTOS

NO ESTÉRILES
INTRODUCCIÓN
En términos de control de riesgos por contaminación microbiológica, existen dos grandes categorías de medicamentos: (a)
productos estériles, en los que la biocarga se elimina esencialmente usando metodologías validadas, y (b) productos no estéri-
les, en los que la biocarga del producto final se controla a niveles apropiados basándose en los atributos del producto, en la vía
de administración y en la población de pacientes esperada.
El contenido microbiano en productos no estériles se controla a un nivel que sea congruente con respecto a la seguridad del
paciente. El uso de controles excesivos que agreguen complejidad o costos adicionales sin un beneficio de seguridad propor-
cional no otorga ninguna ventaja en términos de valor agregado para el paciente o el fabricante. Por lo tanto, un enfoque
científico pragmático para gestionar la biocarga microbiana en productos no estériles necesita tomar en cuenta el riesgo para
el paciente y los objetivos del control de la contaminación a fin de lograr un nivel práctico y apropiado de gestión de riesgos.
Una consideración crítica para asegurar la calidad del producto es prevenir aquellas condiciones que puedan favorecer la
proliferación o el ingreso de microorganismos en las instalaciones o procesos de fabricación. El crecimiento microbiano en ex-
4
J.E.Clarridge111.The lmpact of 165 rRNAGeneSequencingAnalysisfor ldentificationof Bacteriaon ClinicalMicrobiology and lnfectiousDiseases,C/in.Microbio/.
Rev. 77 (2) 840-862, 2004.
5
Gillis,M., P.Vandamme,P.De Vos, J.Swingsy K. Kersters.PolyphasicTaxonomy.Bergey'sManual of SystematicBacterio/ogy,lda Edición,2003.
USP42 Información General/ (1115) Control de Biocarga 7965
cipientes, componentes y fármacos es un asunto de cuidado debido a que crea la posibilidad de que el contenido microbiano
viable alcance niveles inaceptables. Los niveles de biocarga dentro de los intervalos recomendados en ExamenMicrobiológicode
ProductosNo Estériles:Criteriosde Aceptaciónpara PreparacionesFarmacéuticasy Sustanciasde UsoFarmacéutico(1111) se consi-
deran seguros y no representan un riesgo de infección ni de toxinas microbianas. Los fabricantes deben tener una clara com-
prensión de las situaciones que pueden favorecer el crecimiento microbiano dentro de sus instalaciones y en sus materiales y
deben implementar medidas prácticas para contrarrestarlo.
Este capítulo describe un enfoque basado en riesgos para controlar la contaminación en la fabricación de productos no esté-
riles. La fabricación de productos no estériles y la gestión del contenido microbiológico son muy diferentes de las requeridas
para los productos estériles. Los productos estériles se administran por vía parenteral mediante inyección o se aplican por vía
tópica a tejidos sensibles cuando el riesgo de infección es comparativamente alto.
Por el contrario, los productos no estériles se administran en regiones del cuerpo humano que son ricas en flora microbiana
y que tienen barreras físicas o inmunológicas contra las infecciones. Entre los ejemplos se incluyen la cavidad oral, la piel, el
tracto naso-faríngeo, la vagina y el recto, los cuales albergan una alta y diversa población de microorganismos viables. Los ha-
llazgos recientes del proyecto de microbioma humano (7) enfatizan el enorme tamaño y diversidad de las poblaciones de bac-
terias relacionadas con los humanos. Un adulto sano presenta una población bacteriana que promedia aproximadamente 1014
bacterias, una cantidad que excede el número de células individuales propias por un factor de 1O. Todos los seres humanos
portan en sus cuerpos microorganismos que, en ciertas condiciones, pueden ocasionar infecciones en otros humanos. El hecho
de que estos microorganismos estén presentes en humanos significa que pueden estar presentes temporalmente en el ambien-
te no estéril de fabricación. Su carácter ubicuo y su infrecuente asociación con las infecciones confirman que los riesgos asocia-
dos con ellos son muy bajos. No obstante, los buenos controles higiénicos y la selección de sistemas de vestimenta adecuados
son aspectos importantes para productos destinados para pacientes que pudieran estar inmunocomprometidos.
La siguiente lista provee una jerarquía para las grandes categorías de productos farmacéuticos no estériles con respecto al
riesgo potencial de contaminación microbiológica (de elevada a baja) (2):
• inhaladores de dosis fija e inhaladores de polvo seco
• atomizadores nasales
• óticos
• supositorios vaginales
• tópicos
• supositorios rectales
• líquidos orales (acuosos)
• cápsulas rellenas con líquido
• tabletas orales y cápsulas rellenas con polvo
Cuando los formuladores evalúan la susceptibilidad de los productos farmacéuticos no estériles a los riesgos microbianos, los
aspectos a considerar incluyen saber si el ingrediente activo tiene una actividad antimicrobiana inherente, el contenido micro-
biológico de los excipientes, la inclusión de conservantes antimicrobianos en la formulación y la actividad del agua. Asimismo,
los fabricantes deben considerar si las etapas de procesamiento y los periodos de retención pueden generar cambios en la bio-
carga.
Se espera que los productos no estériles tengan algo de biocarga, la cual debe controlarse dentro de un intervalo apropiado
(ver el capítulo (1111 )). El riesgo de infección resultante de un medicamento no estéril es por lo general bajo, independiente-
mente de la vía de administración, siempre que se sigan las precauciones y los procedimientos apropiados. En este sentido, los
capítulos generales ExamenMicrobiológicode ProductosNo Estériles:Pruebasde RecuentoMicrobiano (61) y ExamenMicrobiológi-
co de ProductosNo Estériles:Pruebasde MicroorganismosEspecíficos (62) proveen métodos, mientras que el capítulo (1111) pro-
vee información para la evaluación de microorganismos aislados durante la fabricación de medicamentos no estériles. Resulta
imposible proveer una lista completa de microorganismos inaceptables para cada uno de los productos. El grado en que un
organismo puede ser inaceptable depende de los atributos del producto, la vía de administración y la población de pacientes.
Losfabricantes son responsables de determinar si los microorganismos recuperados de los medicamentos son inaceptables. En
general, los microorganismos inaceptables son aquéllos que se conocen como verdaderamente patógenos, tomando en cuen-
ta la vía de administración del producto. El capítulo (1111) provee en forma de lista por puntos las pautas sobre factores de
riesgo que se deben tomar en cuenta. Además, el riesgo puede surgir en situaciones en las que los microorganismos pueden
proliferar en números suficientes para generar un nivel inaceptable de riesgo para el paciente hasta un nivel por encima de los
intervalos recomendados en el capítulo (1111 ). Se debe evaluar el riesgo microbiológico para cada caso durante el desarrollo
de un producto nuevo y durante la validación del proceso de fabricación.
La proliferación de contaminación microbiana en una instalación de producción, en productos o en ingredientes de estos es
una condición inaceptable. La proliferación microbiana dentro de una instalación genera condiciones que favorecen la disemi-
nación de contaminantes, en números potencialmente peligrosos, en ingredientes, materiales de envasado primarios, e incluso
en el producto mismo. La proliferación de microorganismos en ingredientes o en la producción de productos intermedios de-
be prevenirse puesto que genera un riesgo debido a toxinas microbianas y puede resultar en daños a las propiedades químicas
y farmacológicas del medicamento.
7966 (1115) Control de Biocarga / Información General USP42
DOCUMENTOSGUÍAREGLAMENTARIOS
DE LOSEE.UU.
El Código de Reglamentos Federales de los EE.UU.(U.S. Code of Federal Regulations o CFR)incluye los requisitos de las Bue-
nas Prácticas de Fabricación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug Administration), los cuales se
citan en la Parte 211 (3). Estos reglamentos contienen requisitos generales para la fabricación de productos farmacéuticos. Las
secciones pertinentes del Título 21 del CFR211 incluyen: 211.42 Diseñoy construcción(Design and construction)-Esta sección
requiere que los edificios usados para la fabricación farmacéutica y sus actividades relacionadas tengan un tamaño, construc-
ción y ubicación adecuadas; 211.46 Ventilación,filtración, calefaccióny enfriamientodel aire (Ventilation, air filtration, air heating
and cooling)-Esta sección requiere el uso de equipo adecuado para controlar microorganismos, polvo, humedad y tempera-
tura y que se provean presiones diferenciales del aire cuando resulte apropiado para la fabricación de medicamentos; 211.56
Sanitízación-Esta sección requiere procedimientos escritos para el uso de rodenticidas, insecticidas, fungicidas, agentes de fu-
migación, de limpieza y de sanitización adecuados; los procedimientos escritos deben estar diseñados para prevenir la conta-
minación de equipos, componentes, envases de medicamentos, cierres, empaques y materiales de etiquetado; 211.82 Recep-
ción y almacenamientode envasesy cierrespara medicamentossin analizar (Receipt and storage of untested components, drug
product containers, and closures)-Esta sección requiere un procedimiento de aceptación, cuarentena, análisis y liberación pa-
ra componentes y envases; 211.11 OMuestreoy análisisde materialesy medicamentosdurante el proceso(Sampling and testing
of in-process materials and drug products)-Esta sección requiere controles de fabricación durante el proceso que incluyan la
determinación de biocarga. Consideraciones sobre organismos inaceptables: El Título21 del CFR211.84(d)(6}--requiere el aná-
lisis microbiológico de envases y componentes entrantes que tengan un potencial de contaminación microbiológica que sea
inaceptable para su uso pretendido; el Título 21 del CFR211.113(a}--requiere procedimientos escritos dirigidos al control de
microorganismos inaceptables en medicamentos que no requieren ser estériles; asimismo, el Título 21 del CFR211.165(b}--
requiere análisis de laboratorio apropiados, según sea necesario, de cada partida de medicamentos para los que la ausencia de
microorganismos inaceptables sea un requisito.
CONSIDERACIONES
SOBREELCONTROLMICROBIANODURANTEELDESARROLLO
DEL
PRODUCTO
Resulta útil un programa formal de evaluación de riesgos que identifique las modalidades de riesgos y que asigne puntos de
control críticos para la fabricación de productos no estériles. Los programas de Análisisde Riesgos y de Puntos de Control Críti-
cos (4) se usan ampliamente para evaluar y mitigar los riesgos microbianos en la fabricación de alimentos y también pueden
ser útiles para los fabricantes de medicamentos no estériles. A continuación se citan los puntos a tomar en cuenta por parte de
los microbiólogos farmacéuticos al momento de evaluar los riesgos potenciales relacionados con la fabricación de medicamen-
tos no estériles:
• síntesis, aislamiento y purificación final del fármaco
• atributos microbiológicos del fármaco
• atributos microbiológicos de excipientes y productos intermedios
• formulación y atributos fiisicoquímicos del medicamento
• propiedades antimicrobianas del material, p. ej., actividad del agua u otras
• proceso de fabricación
• sistema de administración
• envasado
• condiciones de almacenamiento para productos intermedios y la forma farmacéutica terminada
• vía de administración
• procedimiento para el tratamiento y régimen de dosificación esperados
• población a la que se administra el producto (p. ej., neonatos, pacientes inmunocomprometidos, etc.)
La consideración minuciosa de estos factores es de gran valor al definir los requisitos para las instalaciones de fabricación y
las mediciones de punto de control del proceso que limitan las condiciones que favorecen la proliferación y el ingreso de mi-
croorganismos.
CONSIDERACIONES
SOBREELCONTROLMICROBIANODURANTELA FABRICACIÓN
Aunque muchos factores (Figura 1) pueden resultar en la introducción de microorganismos, algunos presentan una mayor
probabilidad de contaminación microbiana. Estos factores de fabricación son, en orden descendente (5): (1) agua empleada
como ingrediente, (2) ingredientes farmacéuticos, (3) equipo de procesamiento, (4) personal de fabricación y (5) entorno de
fabricación.
USP42 InformaciónGeneral/ (1115) Control de Biocarga 7967
Influencias Microbianassobre Productos No Estériles

Agua para
Diseño y Mantenimiento . Procesamiento
de las Instalaciones Hérram·entas Influencias Efectos de las y Limpieza
~silios de Áreas Estacionzsdel Año
Flujo de Personal \ Adyacente!: Limpieza Y
Sanitización de
Diseño del
Equipo
Sistema d;--,......._\"'-
Acondicionam~nto ~ ,------------.
! ~las Instalaciones
Equipo de Contacto
No Relacionado
del Aire ---
(HVACJ --.... Materia1es d urante con el Producto
Condicionesde ___ ..,.. el Proceso ----- Validación

Almacenamiento
Prácticasy
1------------1 ----
Flujo de
Capacitación----• 1 Productos ----- Productos y
del Personal Materiales
Mantenimiento ~/
yl1mp1eza ~
del Equipo
Procesosde
t
Ingredientes
Farmacéuticos
Fabricación
Activos
y Llenado
Figura 1. Factores que contribuyen a la biocarga en productos no estériles.
Sistemas de Agua y su Uso
El agua usada en la fabricación de ingredientes activos, en la formulación, en la limpieza y en el mantenimiento de las insta-
laciones es el elemento de riesgo singular más importante que contribuye a la contaminación de productos no estériles. La
calidad o el tipo de agua usada para la formulación de productos no estériles y para el enjuague final del equipo limpio deben
seleccionarse basándose en los riesgos para el producto. Las aguas purificadas usadas en la fabricación farmacéutica son desio-
nizadas y, por ende, no contienen cloro para controlar el crecimiento microbiano. Las poblaciones importantes de bacterias
Gram negativas con forma de varilla y algunos hongos filamentosos pueden crecer en dicha agua purificada sin cloro, especial-
mente en tanques de almacenamiento a temperaturas ambiente o cercanas a ambiente. El agua estancada debe drenarse o
eliminarse físicamente a la mayor brevedad posible y de manera eficiente de los contenedores y equipos de producción, así
como de las superficies y pisos de trabajo. El agua potable dorada (agua que se usa en las ciudades) puede ser apropiada para
cierto tipo de actividades de limpieza, mantenimiento de las instalaciones y sanitización. La calidad del agua para aplicaciones
de procesamiento debe determinarse para cada caso. El capítulo Aguapara UsosFarmacéuticos (1231) provee pautas adiciona-
les para el diseño y la operación de sistemas de aguas.
Las aguas para procesamiento usadas en la fabricación de excipientes y, en algunos casos, ingredientes activos para produc-
tos no estériles representan un riesgo importante para la colonización y proliferación microbiana, particularmente en ingre-
dientes de origen natural que se han sometido a un procesamiento mínimo para reducir la biocarga o para controlar la prolife-
ración microbiana. El equipo de formulación y de fabricación puede ser una fuente de contaminación, y los riesgos se incre-
mentan cuando se utiliza agua e ingredientes que son susceptibles a la supervivencia o crecimiento de microorganismos. Por
lo tanto, la limpieza, el secado y, cuando resulte apropiado, la sanitización del equipo de fabricación pueden ser beneficiosos,
pero los residuos de desinfectantes deben limitarse en el ambiente operativo y se deben eliminar de las superficies que están
en contacto con el producto. Elaislamiento de organismos transmitidos a través del agua, en particular de los bacilos Gram
negativos, es un indicador probable de la eliminación inadecuada de agua estancada en equipos y superficies ambientales.
Ingredientes Farmacéuticos Activos, Materiales durante el Proceso y Excipientes
Los ingredientes y excipientes usados en los procesos de fabricación de productos no estériles son fuentes importantes de
contaminación microbiana. La evaluación de proveedores, las especificaciones, el análisis, la selección de empaques y envases,
el transporte, las condiciones de almacenamiento, las fechas de caducidad y la evaluación de la probable contaminación o ries-
go de la proliferación son todos críticos para la reducción de riesgos microbianos relacionados con estos materiales. Se consi-
deran especialmente críticos los materiales sin procesar de origen natural, aquéllos con alta actividad de agua (ver Determina-
ciónde Actividadde Agua en ProductosFarmacéuticos No Estériles(1112) para información adicional), los procesos sintéticos con
etapas de aislamiento acuoso o procesamiento abierto y los procesos biológicos con limitada purificación posterior o que care-
cen de etapas de eliminación microbiana definidas. Se deben establecer puntos de monitoreo de la biocarga durante el proce-
so en momentos inmediatamente anteriores o inmediatamente posteriores a un proceso de reducción potencial de la biocarga
(tal como una extracción con disolvente orgánico, calentamiento, un gran cambio en el pH) y/o inmediatamente antes del
7968 (1 1 1 5) Control de Biocarga / InformaciónGeneral USP42
llenado final según lo determinado en el análisis de riesgos realizado conforme a lo sugerido en la sección Consideraciones sobre
el Control Microbiano durante el Desarrollodel Producto.
Los fabricantes deben muestrear los materiales entrantes y deben asegurar condiciones adecuadas de control de la contami-
nación para las etapas de pesaje y adición de materiales al equipo de procesamiento. Todos los equipos de muestreo y pesaje
deben limpiarse, sanitizarse, almacenarse e identificarse apropiadamente. Las actividades y los controles relacionados que se
implementen para prevenir la colonización y la proliferación microbianas deben basarse en una estrategia documentada y
prospectiva de evaluación de riesgos y control de contaminación.
Los ingredientes farmacéuticos que presentan una calidad microbiana consistentemente adecuada constituyen un elemento
importante del programa de control microbiológico para productos no estériles. El aprovisionamiento de ingredientes con una
calidad microbiológica apropiada requiere la identificación de proveedores con capacidad demostrada para producir fármacos
o excipientes de calidad adecuada. Se pueden realizar periódicamente evaluaciones en forma de encuesta a los proveedores
para establecer que éstos cuentan con un programa de control microbiológico bien diseñado y mantenido para sus instalacio-
nes de fabricación y de envasado primario. Los materiales con baja actividad de agua, que tienen un pH alto o bajo, que no
son de origen natural, que son antimicrobianos por naturaleza o que contienen un conservante antimicrobiano, por lo general
se encuentran fuera de riesgo de proliferación microbiana. Las evaluaciones de riesgo deben considerar las características de
los ingredientes con respecto a la supervivencia microbiana, al soporte del crecimiento microbiano o al evidente antagonismo
a la supervivencia microbiana.
La introducción de humedad en los materiales almacenados incrementa de manera notoria el riesgo de contaminación mi-
crobiana. La condensación en la cámara gaseosa del tanque de almacenamiento o en los envases impermeables de almacena-
miento puede resultar en contaminación de los materiales con organismos u hongos que crecen debido al agua incluso cuan-
do se espera que el producto que se está almacenando elimine la posibilidad de colonización o proliferación microbiana.
El examen microbiano de ingredientes farmacéuticos (ver los capítulos (61 ), (62) y (1111 )) pueden proveer información im-
portante sobre la calidad microbiológica de los fármacos y excipientes.
Los envases primarios e intermedios (p. ej., recubrimiento interno de tambores, bolsas de plástico, entre otros) pueden ser
una fuente de contaminación microbiana, por lo que los fabricantes deben considerar su calidad inicial, condiciones de alma-
cenamiento, preparación y procedimientos de manejo.
CONTROLMICROBIANO
EN LA FABRICACIÓN
DE FÁRMACOS
Los enfoques para el control microbiano descritos en este capítulo se pueden aplicar con mínimas modificaciones a los fár-
macos fabricados mediante procesos biológicos o síntesis orgánica. Los procesos en síntesis orgánica a menudo usan extremos
de temperatura, presión, pH y otras condiciones que inhiben o destruyen microorganismos de manera activa. Cuando el pro-
ceso químico de fabricación de un fármaco es complejo, las etapas finales a menudo tienen el mayor efecto potencial sobre la
biocarga. Tal como en el caso de la fabricación de un medicamento, el agua usada en el proceso presenta el desafío más gran-
de para el control microbiano. Los tipos de agua usados en estos procesos varían. Por lo general, se usa agua potable en el
procesamiento y limpieza en etapas tempranas, mientras que el Agua Purificada y el Agua para Inyección se usan a menudo en
las etapas posteriores de procesamiento y limpieza. El uso de Agua para Inyección a menudo se restringe a las etapas finales de
fabricación de fármacos químicos o biológicos a granel que en última instancia se usarán en la formulación de productos esté-
riles. Estos procesos frecuentemente se realizan casi en su totalidad dentro de recipientes cerrados, lo cual minimiza las consi-
deraciones externas para las instalaciones. Ciertos equipos de proceso son adecuados para las operaciones de limpieza in situ
9ue emplean agentes 9ue no solo son limpiadores efectivos sino 9ue también, en algunos casos, inhiben el crecimiento y la
proliferación microbiana. Los materiales usados en la fabricación de fármacos incluyen sustancias naturales, compuestos orgá-
nicos de diversos tipos, sales inorgánicas, ácidos, bases y disolventes orgánicos, y el potencial de contaminación microbiana
derivada de estos materiales varía claramente. Las intervenciones del personal en estos procesos se ven limitadas por el carácter
del equipo y las consideraciones sobre seguridad del trabajador; por otra parte, en el procesamiento de productos biológicos y
en algunas etapas tardías de la síntesis orgánica, los entornos de fabricación pueden estar clasificados (p. ej., ISO 7 e ISO 8).
Limitar la participación de personal y el uso de ambientes controlados reducen las oportunidades de contaminación microbio-
lógica.
Diseño y Uso del Equipo
Cuando sea posible, las especificaciones para la selección del equipo que se usará en la fabricación de productos no estériles
deberá incluir un diseño sanitario. El equipo y los accesorios deben poder limpiarse de modo que los contaminantes y los pro-
ductos residuales se puedan eliminar de manera confiable. El equipo debe usar accesorios sanitarios y su diseño debe permitir
el fácil uso de agentes de limpieza y sanitización, y el drenado completo del agua que se usa para enjuagar. El agua residual en
tanques, sistemas de tuberías o en las superficies de equipos introduce el riesgo de colonización por organismos que se trans-
miten a través del agua. El equipo de fabricación que no se pueda limpiar in situ debe ser de fácil acceso para la limpieza
manual, y las partes que deban limpiarse fuera del sitio no solo deberán ser de fácil acceso sino también fáciles de retirar. Otro
aspecto adicional a tomar en cuenta es la compatibilidad del equipo con la variedad común de desinfectantes, incluyendo es-
poricidas, que se usan en los procedimientos de limpieza para sanitizar el equipo.
El material preferido para la construcción de equipos y utensilios que estarán en contacto con el producto es acero inoxida-
ble austenítico. Los fabricantes deben considerar el acabado de las superficies de los materiales que entran en contacto con el
producto, para los cuales una rugosidad promedio (RA, por sus siglas en inglés) de 15-20 µm es razonablemente aceptable.
Las superficies del equipo general y las superficies de la maquinaria no deben pulirse más allá de los valores de rugosidad pro-
medio antes mencionados. Los demás materiales de construcción deben ser no porosos, lisos y compatibles con los productos
y materiales de limpieza. Los sistemas de tuberías también deben seguir los principios de diseño higiénico y deben estar incli-
nados para facilitar el drenado, y el equipo debe contar con juntas de ajuste para evitar la acumulación de materiales y facilitar
la limpieza. Las Normas Sanitarias 3A (3A Sanitary Standards, verwww.3-A.org) proveen pautas que por lo general son útiles
para la disposición y diseño del proceso y para la selección de maquinaria. Se deben detallar los procedimientos de limpieza
del equipo y se debe asegurar que el equipo esté completamente seco después de la limpieza y que se almacene de manera tal
que se prevenga la proliferación de microorganismos. Los fabricantes deben implementar procedimientos para proteger el
equipo y los accesorios limpios antes de su siguiente uso. La validación del proceso de limpieza y sanitización debe incluir la
evaluación de contenido microbiano después de la sanitización y antes de su uso. El diseño adecuado de la protección del
almacenamiento debe mitigar la posibilidad de crecimiento microbiano antes de usar el equipo, de modo que no debería ser
necesario el monitoreo continuo del equipo y de los accesorios después de validar las condiciones adecuadas de almacena-
miento. El muestreo microbiano en superficies, inmediatamente después de la limpieza o inmediatamente antes de su uso,
debe realizarse con precaución; los residuos de medios y la humedad residual deben eliminarse cuidadosamente cuando se
realice el muestreo.
Los fabricantes deben evaluar si los productos que se fabrican usando una pieza del equipo de procesamiento puede, en
algunas circunstancias del procesamiento, promover el crecimiento de microorganismos. Esta evaluación es necesaria para es-
tablecer de manera apropiada los tiempos de espera y para definir las condiciones de uso del equipo después de la limpieza.
No es necesario el uso de agentes de sanitización en las superficies de contacto con el producto cuando los procedimientos de
limpieza que eliminan residuos químicos también eliminan microorganismos. Asimismo, existe un riesgo de contaminación del
producto con agentes de sanitización. Con un procedimiento de limpieza validado, la ausencia de residuos químicos y de agua
estancada visible puede garantizar la limpieza del equipo sin desinfección química de rutina y también puede obviar la necesi-
dad de monitoreo microbiológico del equipo.
Personal
Además de cuidar su higiene personal, los operadores deben estar capacitados y usar vestimentas adecuadas para la función
que desempeñan (Tabla1).
Tabla 1. Vestimenta en Áreas de Fabricación
Operadores en Áreas de Formulación y Envasado
Ropa Protectora Primario
Uniforme de planta o uniforme de planta con overol para productos y
ambientes de alto riesgo Sí
Cubrecabello/cubrebarba Sí
Gafas de seguridad Sí
Zapatos especiales o cubiertas para zapatos Sí
Guantes Sí (si se está en contacto directo con el producto)
Mascarillas Sí (si se está en contacto directo con el producto)
Ambiente de la Fabricación
Tal como se mencionó, los riesgos y controles ambientales para productos no estériles son diferentes de los de aquellos pro-
ductos estériles fabricados asépticamente. A diferencia del procesamiento aséptico, cuyos requisitos para las instalaciones son
generalmente uniformes en términos de especificación y desempeño, los ambientes de la fabricación de productos no estériles
a menudo involucran diversos productos y requisitos de control de la contaminación microbiana. En general, los productos
líquidos, en cremas o ungüentos requieren un mayor nivel de mitigación de riesgos de contaminación que las formas farma-
céuticas sólidas.
Los elementos comunes de diseño de control microbiano pueden incluir lo siguiente:
• Las paredes, los cielos rasos y los pisos se construyen con materiales no porosos que se pueden limpiar con facilidad y que
son resistentes a los agentes de limpieza y desinfectantes.
• Los drenajes en el suelo se permiten en áreas de fabricación de productos no estériles siempre que se puedan cerrar du-
rante el procesamiento o que cuenten con un interruptor de aire adecuado si se abren durante la limpieza del área y del
equipo.
• El acceso debe limitarse al personal necesario.
• Los flujos de materiales, equipos y personal deben evitar la contaminación.
• La ventilación y la filtración del aire deben ser adecuadas para mantener la limpieza, la presurización del espacio (cuando
sea necesario), la temperatura y la humedad relativa especificadas.
7970 (1115) Control de Biocarga / InformaciónGeneral USP42
• Se deben aplicar buenas prácticas de limpieza y de higiene general en todo momento.

• Asimismo, se debe conocer en todo momento el estado de la limpieza y del uso de todas las herramientas y accesorios
usados para la producción y de todo el equipo de procesamiento.
• Los sistemas de tuberías que están en contacto con el producto o de abastecimiento de agua, las válvulas y las juntas
deben limpiarse y sanitizarse de acuerdo con un programa definido, almacenarse secos y etiquetarse indicando su estado.
• Los fabricantes deben implementar un programa formal de limpieza y sanitización para las áreas operativas, corredores,
almacenamiento de equipo, almacenamiento temporal de materiales y otras áreas comunes.
No se requieren entornos clasificados para la fabricación de productos no estériles, p. ej., aquéllos especificados en la norma
ISO 14644-1 (6). La Guía Marco Nº 2 de la ISPE,Formas Farmacéuticas Orales Sólidas ( 7) provee las características mínimas de
diseño aceptables para instalaciones para la fabricación de productos no estériles.
EVALUACIÓN
MICROBIANADE AMBIENTESDE FABRICACIÓN
DE PRODUCTOSNO ESTÉRILES
Tal como se describió con anterioridad, el monitoreo microbiológico del ambiente de fabricación puede servir como un au-
xiliar de control y por lo general es una herramienta de evaluación cualitativa de un programa formal de control microbiológi-
co basado en riesgos adecuadamente implementado. Un programa de monitoreo apropiado para el riesgo de biocarga del
producto puede ayudar a confirmar la efectividad de controles microbiológicos y puede facilitar la detección temprana de pro-
blemas potenciales. Se pueden usar métodos y prácticas microbiológicas para instalaciones asépticas, pero las tasas de recupe-
ración de contaminación definidas en el capítulo Controly MonitoreoMicrobiológico de Entornosde ProcesamientoAséptico
(1116) no están destinadas para ambientes no estériles. Los ambientes clasificados de la misma clase no necesariamente cuen-
tan con capacidades de control microbiológico similares. Debido a que la mayoría de los organismos recuperados en el moni-
toreo del ambiente son de origen humano, los niveles de contaminación temporal recuperada dependen en gran parte del
nivel de actividad humana y de los requisitos de vestimenta. Los requisitos de vestimenta no son tan extensos para la fabrica-
ción de productos no estériles como para el procesamiento aséptico y, por ende, en los entornos no estériles, los fabricantes
pueden monitorear la biocarga con menor frecuencia y con expectativas de mayor recuperación de biocarga. Las evaluaciones
periódicas de la higiene de la planta de producción pueden ofrecer información útil sobre la efectividad de los controles de
limpieza y ambientales de las instalaciones.
Durante la fabricación de productos no estériles, el monitoreo microbiológico no necesita ser tan riguroso como el requerido
durante el procesamiento aséptico. De manera similar, durante la fabricación de productos no estériles, la mitigación de ries-
gos microbianos es diferente a la de los productos estériles. En productos no estériles, los fabricantes pueden esperar biocarga
microbiana intrínseca que, cuando se controla adecuadamente, no resulta en un riesgo para el usuario final. Los fabricantes
deben establecer niveles aceptables de microorganismos dentro de cada producto (3) y deben contar con una identificación
suficiente de microorganismos para lograr una comprensión adecuada de los patrones de biocarga y de la variabilidad estacio-
nal.
Muestreo Microbiano
Durante la fabricación de productos no estériles, los métodos de muestreo del aire usados para el monitoreo del ambiente
son activos o pasivos. Los dispositivos activos muestrean volúmenes de aire apropiados y depositan organismos viables en pla-
cas o tiras de medios sólidos. Los resultados por lo regular se expresan como unidades formadoras de colonias por unidad de
volumen, aunque se pueden usar métodos alternativos en lugar de la recuperación y del crecimiento en medios. El muestreo
pasivo en forma de acomodo de placas se puede usar en lugar de los muestreadores de aire activos.
Por lo regular no se requiere monitorear al personal en la fabricación de productos no estériles excepto cuando se emplean
materiales para vestimenta casi aséptica.
Los sitios de muestreo deben seleccionarse basándose en una evaluación de riesgos seguida por una medición de la higiene
general del ambiente. Las áreas muy transitadas donde los materiales son transferidos dentro y fuera de las mismas pueden ser
especialmente susceptibles a la contaminación microbiana pasajera. El monitoreo microbiológico no es necesario en áreas que
estén más allá del punto en el que el producto se coloca en los envases primarios.
Los métodos microbiológicos alternativos basados en cero crecimiento se pueden sustituir por los métodos basados en creci-
miento a discreción del usuario. Debido a que no existen métodos de muestreo del entorno estandarizados y debido a que el
monitoreo tiene como propósito la evaluación cualitativa de la higiene general de las instalaciones, no existe necesidad de es-
tudios comparativos entre métodos basados en crecimiento y basados en cero crecimiento. Un pequeño número de muestras
paralelas es suficiente para establecer un línea base comparativa para un ambiente.
La frecuencia del monitoreo debe reflejar el riesgo potencial relacionado con la forma farmacéutica (ver Introducción).Asimis-
mo, algunos productos pueden tener una actividad antimicrobiana innata debido a sus atributos tales como baja actividad de
agua o inclusión de un conservante antimicrobiano o un ingrediente activo que por sí mismo es un agente antimicrobiano, p.
ej., un antibiótico o agente antitumoral. Los productos que son resistentes a la colonización microbiana o que tienen caracte-
rísticas microbiocidas o microbioestáticas requieren de monitoreo limitado o no lo requieren.
En general, los ambientes para la fabricación de tabletas y cápsulas rellenas con polvos y líquidos no deberían requerir de
monitoreo o tan solo un monitoreo poco frecuente. Los programas de monitoreo deben basarse en riesgos y la frecuencia y el
número de los sitios de muestreo debe reflejar el nivel de riesgo. Las áreas de fabricación para formas farmacéuticas con un
riesgo más alto, tales como productos para inhalación, requieren un monitoreo más frecuente y, por lo general, se fabrican en
cuartos clasificados con una calidad de aire particular, por ejemplo, ISO 8.
Para la mayoría de los ambientes de fabricación de productos no estériles, debido a sus controles ambientales limitados y al
riesgo comparativamente bajo de los productos, podría no ser necesario establecer niveles de alerta y acción. El monitoreo del
entorno se considera una forma de evaluación informativa sobre las condiciones generales de higiene del entorno y no debe
usarse para tomar decisiones sobre la liberación de productos. No es necesario el monitoreo de ambientes no clasificados.
El capítulo de información general Caracterización Microbiana,Identificacióny Tipificaciónde Cepas(1113) contiene informa-
ción general sobre la caracterización microbiana. En la mayoría de las evaluaciones de higiene no estériles, resultan suficientes
la caracterización de los microorganismos, la morfología celular, la reacción Gram y los análisis de diagnóstico simples.
Medidas Activas para el Control Microbiano
Además de las consideraciones del diseño de instalaciones y procesos, y de la limpieza del equipo y los controles de almace-
namiento, existen casos en los que se requieren medios activos para abordar los riesgos de contaminación. El control microbio-
lógico de productos no estériles se puede mejorar mediante la adopción de procesos de control directo de contaminación tales
como los siguientes:
• descontaminación de superficies de contacto de productos, materiales y envases, por lo general mediante tratamiento
con calor (para las aplicaciones más críticas, se puede usar esterilización)
• tratamientos químicos o físicos de reducción de biocarga (p. ej., calor seco o húmedo) para materias primas e ingredien-
tes activos
• uso de sistemas cerrados, limpios o descontaminados para el manejo y transferencia de materiales
• uso de componentes y accesorios desechables
• materiales de vestimenta mejorados para el personal operativo
• uso de entornos clasificados en operaciones de alto riesgo
Estas medidas se pueden aplicar conforme se requieran para mejorar el control de la contaminación microbiana durante la
fabricación de productos no estériles.
GESTIÓNGENERAL
DE UN PROGRAMADE CONTROLMICROBIOLÓGICO
La gestión de un programa exitoso de control microbiológico incluye lo siguiente: identificación de proveedores adecuados
de ingredientes y excipientes farmacéuticos con buena calidad microbiológica; realizar una evaluación de riesgo microbiológi-
co del proceso de fabricación y sistema de envasado; y el establecimiento de un sistema de monitoreo y control apropiado.
Aunque la contaminación del entorno no es de ninguna manera la causa más significativa del retiro de productos no estéri-
les del mercado o de eventos de contaminación, el monitoreo del entorno puede ser un programa auxiliar al programa de
control microbiológico. El monitoreo microbiológico es una evaluación y no constituye por sí misma una actividad de control
de la contaminación. No existen estudios controlados con bases científicas que demuestren el vínculo, si lo hubiere, entre los
resultados del monitoreo de aire y superficies, y la seguridad microbiológica del producto final.
El programa de control de contaminación microbiológica debe desarrollarse para identificar y controlar los riesgos para el
producto, basándose en una evaluación formal de modalidades de riesgo. El análisis de riesgos debe resultar en la identifica-
ción de puntos de control críticos y debe facilitar la selección adecuada del equipo, la estructuración y diseño del proceso y los
requisitos de diseño de las instalaciones.
Los factores críticos para la prevención de contaminación microbiana durante la fabricación de productos no estériles son el
control de la calidad microbiológica de los ingredientes y del agua, junto con el desarrollo de procedimientos adecuados de
limpieza y sanitización. El monitoreo microbiológico no mitiga los riesgos, pero puede servir como herramienta de vigilancia.
Ningún programa de monitoreo puede proveer garantías sobre el control de la contaminación de manera tan efectiva como
las medidas preventivas estrictas y proactivas. El control uniforme de contaminación se puede lograr principalmente mediante
una evaluación general del proceso que abarque cada uno de los elementos de control descritos anteriormente mediante la
evaluación de riesgos. La evaluación de riesgos se puede unir a estudios de evaluación activos para asegurar que se cuente con
las medidas apropiadas para prevenir condiciones que conduzcan a la contaminación.
REFERENCIAS
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(1116) CONTROLMICROBIOLÓGICOY MONITOREO DE AMBIENTES

DE PROCESAMIENTOASÉPTICO
Los ambientes microbiológicamente controlados se usan para diversos propósitos dentro de la industria de los cuidados de
la salud. Este capítulo de información general proporciona información y recomendaciones para ambientes en los que el riesgo
de contaminación microbiana se controla mediante procesamiento aséptico. Los productos fabricados en tales ambientes in-
cluyen productos farmacéuticos estériles, fármacos estériles a granel, productos intermedios estériles, excipientes y, en ciertos
casos, dispositivos médicos. Los ambientes de procesamiento aséptico son mucho más críticos en lo que respecta a riesgos
para el paciente que los ambientes controlados que se usan para otras operaciones de fabricación-por ejemplo, preparación
de equipos y componentes, control de biocarga limitada en productos no estériles y procesamiento de productos con esterili-
zación terminal. En este capítulo, el tipo de procesamiento aséptico se diferencia por la presencia o ausencia de operadores
humanos. Un proceso aséptico avanzado es aquel en el que no se requiere ni se permite en todo momento la intervención
directa con envases de producto abiertos o superficies de contacto expuestas del producto por parte de operadores que utili-
zan vestimentas convencionales para cuartos limpios. [NOTA-En la parte final de este capítulo, se proporciona un Glosarioque
incluye una descripción de los términos usados.]
Los lineamientos provistos en este capítulo, así como los parámetros de monitoreo citados para evaluación microbiológica
deben aplicarse únicamente a cuartos limpios, sistemas de barrera con acceso restringido (RABS,por sus siglas en inglés) y
aisladores usados para procesamiento aséptico. Los ambientes clase ISO que se usan para otros propósitos no están sujetos a
cumplir con los niveles de control de contaminación requeridos para productos estériles producidos asépticamente. Los am-
bientes usados para aplicaciones no estériles requieren estrategias de control microbiano diferentes.
Una gran parte de los productos que se declaran estériles son fabricados mediante procesamiento aséptico, más que por
esterilización terminal. Debido a que el procesamiento aséptico se basa en excluir microorganismos del flujo de proceso y en
evitar que los microorganismos ingresen en los envases abiertos durante el procesamiento, la biocarga del producto, así como
la biocarga del ambiente de fabricación son factores importantes que rigen el riesgo de contaminación microbiana inacepta-
ble. Los términos asépticoy estérilno son sinónimos. Estérilse refiere a una ausencia total de microorganismos viables u orga-
nismos con potencial de reproducción. En el sentido microbiológico puro, un proceso asépticoes aquel que previene la conta-
minación mediante la exclusión de microorganismos. En la fabricación aséptica actual de productos para el cuidado de la sa-
lud, asépticodescribe el proceso de manipulación de materiales estériles en un ambiente controlado, diseñado para mantener
la contaminación microbiana a niveles que se ha demostrado representan un riesgo mínimo.
La contaminación microbiana a cierto nivel es inevitable en cualquier ambiente en que participen operadores humanos. Ni
siquiera los diseños y operaciones más cuidadosos de cuartos limpios son capaces de eliminar el desprendimiento de microor-
ganismos ante la presencia de operadores humanos. Por consiguiente, resulta técnicamente imposible y poco realista esperar
una contaminación nula (cero) en todas las instalaciones durante las operaciones de procesamiento aséptico. No existen me-
dios para demostrar la esterilidad de un ambiente de procesamiento aséptico ni de las superficies de contacto con el producto
dentro de dicho ambiente. El monitoreo de instalaciones deberá basarse en una evaluación de riesgos. Aunque los fabricantes
deben revisar con frecuencia los resultados del monitoreo ambiental para asegurar que la instalación opera en un estado de
control validado, dichos resultados de monitoreo no pueden probar ni refutar la esterilidad. Debido a las limitaciones del mo-
nitoreo, los fabricantes no pueden basarse únicamente en monitoreo, estadísticas, ni en simulaciones periódicas de procesa-
miento aséptico para asegurar un nivel de garantía de esterilidad.
Por lo general, el monitoreo ambiental es realizado por el personal, por lo que requiere la intervención de un operador. En
consecuencia, el monitoreo ambiental puede incrementar el riesgo de contaminación y también proporcionar resultados falsos
positivos. Por consiguiente, el monitoreo intensivo no ofrece garantías, particularmente en los ambientes ISO 5 que se usan en
las zonas más críticas del procesamiento aséptico.
Existen diversos métodos de muestreo para evaluar y controlar la situación microbiológica de los ambientes controlados para
procesamiento aséptico. En la actualidad, casi todos estos métodos se basan en el crecimiento y la recuperación de microorga-
nismos, muchos de los cuales pueden estar dañados debido al estrés ambiental, por lo que pueden ser difíciles de recuperar.
Los valores numéricos para monitoreo del aire, superficies y personal incluidos en este capítulo no pretenden representar lími-
tes o especificaciones, sino que se proporcionan estrictamente con fines informativos. Debido a la diversidad de equipos y mé-
todos de muestreo microbiológico, no es razonable, desde el punto de vista científico, sugerir que la consecución de dichos
USP42 Información General/ (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico 7973
valores garantiza un control microbiano o que las variaciones que superen los valores presentados en este capítulo indican una
pérdida de control. La evaluación de riesgos asociada con los ambientes de fabricación se debe llevar a cabo durante un perio-
do significativo y, en cada caso, la métrica de la tasa de recuperación de contaminación deberá establecerse basándose en una
revisión de los hallazgos reales dentro de la instalación. El objetivo de cada usuario debe basarse en el uso de las tasas de recu-
peración de contaminación para rastrear el desempeño actual y perfeccionar el programa de control microbiológico para pro-
mover mejoras. Una vez que se logran condiciones operativas óptimas dentro de una instalación, los niveles de las tasas de
recuperación de contaminación a menudo se vuelven relativamente estables dentro de un intervalo normal de variabilidad.
No existen métodos estándares para el muestreo del aire y la literatura disponible indica que los métodos de muestreo del
aire son muy variables. Resulta incorrecto asumir que volúmenes de muestra similares, tomados por métodos diferentes, pro-
ducirán tasas de recuperación similares. Son muchos los factores que pueden afectar la recuperación y la supervivencia de mi-
croorganismos; asimismo, es posible que los diferentes proveedores de muestreadores de aire hayan diseñado sus sistemas pa-
ra cumplir con requisitos distintos. Además, la variación entre muestras durante el muestreo microbiológico puede ser de con-
sideración. Los datos relacionados con la exactitud, precisión, sensibilidad y límites de detección de los métodos de monitoreo
usados en el procesamiento aséptico de productos para el cuidado de la salud son limitados.
Los métodos de muestreo de superficies tampoco han sido estandarizados. Los medios empleados varían y, para el caso de
los hisopos, cabe la posibilidad de que los métodos de hisopado húmedo y seco y de las placas de contacto produzcan resulta-
dos distintos. Se podría esperar que las placas de contacto de muestras repetidas produzcan resultados similares en condicio-
nes idénticas, pero se ha informado que las tasas de recuperación son menores de lo esperado y muy variables. En general, se
ha determinado que el monitoreo de superficies recupera <50%, incluso cuando se usa con niveles de inóculo relativamente
altos en cupones estandarizados. En los ambientes de producción reales donde los organismos son sometidos a varios grados
de estrés, las tasas de recuperación pueden ser menores.
TECNOLOGÍASASÉPTICASAVANZADAS
Las tecnologías asépticas avanzadas se pueden definir como aquellas que no dependen de la intervención directa de opera-
dores humanos durante el procesamiento. En la actualidad, las tecnologías tales como aisladores, unidades de soplado/llena-
do/sellado y RABScerrados (diseños que nunca se abren durante la instalación u operación) se pueden considerar tecnologías
asépticas avanzadas, siempre que se inhabilite la intervención directa de personal durante el procesamiento. En años recientes,
la tecnología de los aisladores ha sido ampliamente aceptada en la fabricación de productos para el cuidado de la salud. Los
aisladores y RABScerrados separan de manera efectiva al operador del ambiente de procesamiento aséptico crítico. Debido a
que estos sistemas reducen significativamente los riesgos de contaminación, sus niveles de control microbiológicos son mayo-
res que los de los cuartos limpios convencionales que cuentan con un nivel comparable de clasificación de partículas del aire,
por ejemplo, ISO 5.
CLASIFICACIÓNDE CUARTOSLIMPIOS PARAAMBIENTESDE PROCESAMIENTOASÉPTICO
La serie ISO 14644 abarca el diseño y la construcción de cuartos limpios y ambientes controlados. Esta norma define el de-
sempeño de un ambiente limpio con respecto a la concentración de partículas totales por unidad de volumen. La norma ISO
14644-1 estipula los recuentos totales de partículas permitidos para que el ambiente limpio cumpla con las clasificaciones defi-
nidas de calidad del aire. El lector debe referirse a dicha norma en relación con las características de diseño y la certificación de
ambientes limpios.
La contaminación por partículas no viables en inyectables concierne a los fabricantes farmacéuticos (ver Partículasen Inyecta-
bles(788)). A diferencia de la contaminación microbiana, en la que los datos experimentales sugieren que los humanos repre-
sentan la única fuente significativa, las partículas no viables pueden surgir tanto de humanos como del equipo de procesa-
miento. Los estudios indican que los humanos con vestimentas liberan partículas y contaminación microbiana a una tasa bas-
tante constante. No obstante, la relación entre contaminación microbiana (viable) y no viable no considera las partículas des-
prendidas por el equipo de procesamiento. Cuando el equipo es la fuente primaria de partículas, todas las partículas resultan-
tes son, en esencia, no viables.
La premisa que establece que al presentarse menos partículas totales en un cuarto limpio será menos probable la presencia
de microorganismos transportados por el aire solo se cumple si los operadores humanos son la única fuente de partículas. Es
imposible distinguir con claridad entre la contaminación de fondo total por partículas generadas en mayor medida por opera-
ciones mecánicas y las partículas totales generadas por el personal. En consecuencia, resulta común y adecuado para los pro-
gramas de monitoreo ambiental de cuartos limpios contar con un componente para partículas totales y con un componente
microbiológico. La Tabla 1 describe las clasificaciones de cuartos limpios comúnmente usadas en la industria farmacéutica. Por
lo regular, se emplean ambientes limpios ISO 14644-1 Clases 5-8 para el procesamiento aséptico.
7-
7974 (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico/ Información General USP42
Tabla 1. Claslflcaclón de Limpieza del Aire con respecto a Partículas Totalesª

Clase ISOb Partículas ;,,o,sµm/m 3
ISO 5 3520
ISO 6 35200
ISO 7 352000
IS08 3 520000
ª Tomada de la Norma Internacional ISO 14644 Parte 1, publicada por la lnternational Organization for Standardization (Organización Internacional para la
Normalización), mayo de 1999.
b Las cuatro clases ISO 14644-1 corresponden estrechamente a las antiguas clasificaciones de la Norma Federal de los EE.UU.209E. Las relaciones son: ISO 5/
Clase 100, ISO 6/Clase 1000, ISO 7/Clase 1O000 e ISO 8/Clase 100 000.
Los aisladores y RABScerrados presentan un panorama distinto, debido a que el personal queda excluido del ambiente de
procesamiento aséptico y las manipulaciones se llevan a cabo usando ensambles de guantes y mangas, así como medios trajes
fabricados con plástico grueso y flexible (como por ejemplo, cloruro de polivinilo o caucho sintético). El personal tiene menos
efectos sobre la calidad microbiana del ambiente dentro de un aislador que en ambientes de cuartos limpios. Algunos usuarios
han optado por operar los RABSde tal manera que permita la intervención humana abierta y directa. En un estado operativo
abierto, estos sistemas son más similares en operación a los cuartos limpios convencionales y, por consiguiente, no se pueden
considerar sistemas avanzados de procesamiento aséptico. En un RABSabierto, la capacidad de los operadores para afectar de
forma negativa el riesgo de contaminación microbiana es mayor que en los aisladores o RABScerrados.
Las especificaciones para cambios de aire por hora y las velocidades del aire no están comprendidas en la norma ISO 14644,
ni tampoco se incluían en la Norma Federal 209E. Por lo general, los cuartos ISO Clase 8/Clase 100 000 están diseñados para
proporcionar un mínimo de 20 cambios de aire por hora; los cuartos ISO Clase 7/Clase 1O000 están diseñados para proporcio-
nar más de 50 cambios de aire por hora; y los cuartos limpios ISO Clase 5/Clase 100 proporcionan más de 100 cambios de aire
por hora. Los criterios para el diseño de algunas instalaciones puede diferir. Es posible que, mediante la dilución y eliminación
de contaminantes, grandes volúmenes de aire puedan reducir la contaminación transmitida por el aire en la producción asépti-
ca. Las condiciones óptimas varían considerablemente, dependiendo de las características del proceso, particularmente de la
cantidad de contaminación derivada del personal. Estas especificaciones deben usarse únicamente como guía en el diseño y
operación de cuartos limpios, debido a que no se han establecido satisfactoriamente, desde el punto de vista experimental,
correlaciones precisas entre cambios de aire por hora, velocidad del aire y control microbiano.
Los fabricantes deben mantener un flujo de aire predominantemente unidireccional (vertical u horizontal) en un ambiente
de cuarto limpio Clase 5 con personal, especialmente cuando los productos y envases de productos y cierres se encuentran
expuestos. En lo que respecta a la evaluación del movimiento del aire dentro de un cuarto limpio, estudiar el flujo del aire
visualmente usando estudios con humo y otros medios adecuados es, probablemente, más útil que emplear medidas absolutas
de velocidad de flujo de aire y tasas de cambio. Los modelos de evaluación de riesgos son otra forma útil de reducir el riesgo
de contaminación y, por tanto, deberían considerarse.
La velocidad y las tasas de cambio del aire son mucho menos importantes en aisladores o RABScerrados que en los cuartos
limpios, debido a que el personal está separado de manera más cuidadosa del producto, de los envases del producto y de los
cierres. Se ha demostrado que las velocidades de aire significativamente menores que las usadas en los cuartos limpios de esca-
la humana son adecuadas para los sistemas aisladores y pueden ser apropiadas también para los RABS.En las zonas dentro de
los aisladores donde las partículas representan un riesgo para la calidad del producto, se puede mantener un flujo de aire uni-
direccional predominantemente vertical u horizontal. Se ha demostrado a través de la experiencia que un flujo de aire mezcla-
do o turbulento bien controlado resulta satisfactorio para una gran cantidad de procesos asépticos y para las pruebas de esteri-
lidad dentro de los aisladores r,Jer Pruebasde Esterilidad-Validación de SistemasAisladores(1208)).
IMPORTANCIADE UN PROGRAMADE EVALUACIÓNMICROBIOLÓGICAPARAAMBIENTES

CONTROLADOS
El monitoreo del recuento total de partículas en ambientes controlados, incluso mediante el uso continuo de instrumentos
electrónicos, no provee información acerca del contenido microbiológico del ambiente. La limitación básica de los contadores
de partículas es que miden partículas de 0,5 µm o mayores. Si bien los microorganismos transportados por el aire no son célu-
las individuales o que flotan libremente, con frecuencia se asocian a partículas de 1O a 20 µm. Los recuentos de partículas así
como los recuentos microbianos dentro de ambientes controlados varían según la localización del muestreo y las actividades
que se desarrollan durante el muestreo. El monitoreo de microorganismos no viables y partículas en el ambiente es una fun-
ción de control importante puesto que ambos son necesarios para satisfacer los requisitos farmacopeicos de los productos en
relación con Materiaextraña y Partículasy Esterilidaden MedicamentosInyectablesy en Implantes(1).
El monitoreo de partículas totales puede proveer medios más adecuados para evaluar la calidad general del ambiente en
aisladores y RABScerrados que en la mayoría de los cuartos limpios convencionales. La exclusión de alto nivel de contamina-
ción transmitida por humanos provista por un aislador da como resultado un aumento en la proporción de partículas no via-
bles. El recuento total de partículas en un aislador puede generar una indicación inmediata de cambios en el nivel de contami-
nación. Los programas de monitoreo microbiológico deben evaluar la efectividad de las prácticas de limpieza y sanitización
llevadas a cabo por y aplicadas al personal que pudiera tener algún impacto en la biocarga. Debido a que los aisladores por lo
regular se descontaminan usando un sistema automático de generación de vapor o gas, el monitoreo microbiológico es mu-
cho menos importante al momento de establecer la eficiencia de los mismos para eliminar la biocarga. Estos sistemas automá-
ticos de descontaminación se validan de manera directa, usando un desafío con un indicador biológico apropiado, y se contro-
lan mediante parámetros de exposición definidos durante su uso rutinario para asegurar una descontaminación uniforme.
El monitoreo microbiológico no puede ni necesita identificar ni cuantificar todos los contaminantes microbianos en estos
ambientes controlados. El monitoreo microbiológico de un cuarto limpio es técnicamente un ejercicio semicuantitativo, debi-
do a que es imposible realizar una evaluación verdaderamente cuantitativa del ambiente, dadas las limitaciones del equipo de
muestreo. La falta de precisión en los métodos de enumeración y los volúmenes de muestra restringidos que se pueden anali-
zar de manera efectiva sugieren que el monitoreo ambiental es incapaz de proporcionar información cuantitativa directa sobre
la garantía de la esterilidad. El analista debe recordar que ningún plan de muestreo microbiológico puede probar la ausencia
de contaminación microbiana, incluso si no se recupera contaminación viable. La ausencia de crecimiento en una muestra mi-
crobiológica significa únicamente que no se descubrió crecimiento, lo cual no implica que el ambiente esté exento de conta-
minación.
El monitoreo microbiano de rutina debe proveer información suficiente para demostrar que el ambiente de procesamiento
aséptico opera en un estado de control adecuado. Elvalor real de un programa de monitoreo microbiológico se basa en su
capacidad para confirmar en todo momento condiciones ambientales uniformes de alta calidad. Los programas de monitoreo
pueden detectar cambios en la tasa de recuperación de contaminación que pueden indicar cambios en el estado de control
dentro del ambiente.
El monitoreo microbiano ambiental y el análisis de datos por parte de personal calificado puede ayudar a asegurar la conser-
vación de un estado de control adecuado. El muestreo ambiental debe llevarse a cabo durante las operaciones normales para
recopilar datos significativos relacionados con el proceso. El muestreo microbiano debe realizarse cuando los materiales estén
en el área, se estén desarrollando las actividades de procesamiento y una dotación completa de personal esté trabajando den-
tro del ambiente de procesamiento aséptico.
El monitoreo microbiano de cuartos limpios de fabricación, RABSy aisladores debe incluir gases comprimidos, superficies,
aire del cuarto o recinto y cualquier otro material y equipo que pudiera representar un riesgo de contaminación. El análisis de
tendencias de contaminación en un ambiente aséptico ha sido durante mucho tiempo un componente del programa de con-
trol ambiental. En los ambientes de procesamiento aséptico y en particular en los ambientes ISO Clase 5, es poco frecuente
observar contaminación. En los recintos de aisladores, la contaminación es todavía menos común debido a la exclusión supe-
rior de contaminación transmitida por humanos. Debido a la criticidad de estos ambientes, incluso los cambios menores en las
tasas de incidentes de contaminación pueden resultar importantes, por lo que los fabricantes deben revisar de manera frecuen-
te y cuidadosa los datos de monitoreo. En los ambientes menos críticos, la contaminación microbiana puede ser más alta, pero
se deben tomar en cuenta, investigar y corregir los cambios en las tasas de recuperación. Las recuperaciones aisladas de micro-
organismos deben considerarse como un fenómeno normal en cuartos limpios convencionales, y estos incidentes por lo gene-
ral no requieren acciones correctivas específicas, debido a que se sabe con casi toda certeza que tales investigaciones no po-
drán ofrecer una causa científicamente verificable. Debido a que el muestreo por sí mismo requiere una intervención aséptica
en cuartos limpios convencionales, cualquier evento de contaminación no correlacionado puede ser un falso positivo.
Cuando las tasas de recuperación de contaminación superan una norma establecida, se debe llevar a cabo una investigación
de procesos y operaciones. Las investigaciones diferirán dependiendo del tipo y procesamiento del producto fabricado en el
cuarto limpio, RABSo aislador. La investigación debe incluir una revisión de la documentación de mantenimiento de la zona,
de la documentación de sanitización/descontaminación, de la incidencia de eventos no rutinarios, de los parámetros físicos u
operativos inherentes, tales como los cambios en la temperatura ambiental y humedad relativa, y la capacitación del personal
involucrado.
En RABScerrados y sistemas aisladores, la pérdida de integridad de los guantes o la introducción accidental de material que
no ha sido descontaminado se encuentran entre las causas más probables de contaminación microbiana detectable. Después
de la investigación, se deben tomar acciones para corregir o eliminar las causas más probables de contaminación. Debido a la
relativa poca frecuencia de eventos de contaminación en instalaciones modernas, la investigación a menudo presenta resulta-
dos no concluyentes. Las acciones correctivas pueden incluir el reforzamiento de la capacitación del personal para enfatizar el
uso adecuado de vestimentas, así como técnicas asépticas y control microbiano del ambiente aceptables. Es posible implemen-
tar algunos procesos de muestreo microbiológicos adicionales con mayor frecuencia, aunque esto podría no ser apropiado du-
rante el procesamiento aséptico debido a que el muestreo intrusivo o demasiado intensivo puede representar un mayor riesgo
de contaminación. Cuando el control adicional resulta conveniente, éste puede ser más apropiado durante los estudios de si-
mulación de proceso. Las medidas adicionales que se pueden considerar para controlar de mejor manera la contaminación
microbiana incluyen sanitización adicional, uso de distintos agentes de sanitización e identificación de contaminantes micro-
bianos y sus posibles fuentes.
En todos los ambientes asépticos, convencionales o avanzados, la investigación y la justificación para las acciones selecciona-
das como resultado de la investigación deben documentarse de manera cuidadosa e integral.
EVALUACIÓN FÍSICA DE LA EFECTIVIDAD DEL CONTROL DE CONTAMINACIÓN
Los ambientes limpios deben certificarse de acuerdo con lo descrito en la serie ISO 14644 para que cumplan con sus requisi-
tos de clasificación de diseño. El diseño, construcción y operación de cuartos limpios varían enormemente, por lo que es difícil
7976 (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico/ Información General USP42
generalizar los requisitos para parámetros tales como la integridad del filtro, velocidad del aire, patrones del aire, cambios de
aire y presión diferencial. En las aplicaciones particularmente críticas, tales como el procesamiento aséptico, puede ser apropia-
da una metodología estructurada para la evaluación física de riesgos.
Un método de este tipo ha sido desarrollado por Ljundqvist y Reinmüller. Este método, conocido como el método L-R,desa-
fía al sistema de ventilación de aire mediante la evaluación del flujo de aire y la capacidad de un ambiente para diluir y eliminar
partículas del aire. En el método L-R,un generador de humo permite a los analistas visualizar los movimientos de aire a través
de un cuarto limpio o un ambiente controlado, incluyendo vórtices o zonas turbulentas, mientras que el patrón de flujo de aire
puede ser ajustado detalladamente para minimizar estos efectos indeseables. Después de la optimización visual del flujo de
aire, se generan partículas cerca de la zona crítica y del campo estéril. Esta evaluación se realiza en condiciones simuladas de
producción, pero con los equipos y el personal en su lugar de trabajo. Este tipo de prueba también se puede usar para evaluar
la habilidad de los RABSy sistemas de aisladores para resistir los efectos de la contaminación, en particular alrededor de los
puertos de salida del producto en estos sistemas.
La evaluación visual del movimiento de aire dentro de los cuartos limpios es un proceso subjetivo. No es posible la elimina-
ción completa de turbulencias o vórtices en cuartos limpios en operación que contienen personal y equipo. La visualización del
aire representa simplemente un paso de todo el esfuerzo para optimizar las operaciones de cuartos limpios y no es una prueba
definitiva que indique el cumplimiento/incumplimiento, debido a que no es fácil definir condiciones aceptables o inaceptables.
Resulta esencial llevar a cabo pruebas adecuadas y optimizar las características físicas del cuarto limpio, RABSo aislador antes
de implementar el programa de monitoreo microbiológico. Asegurar que el cuarto limpio, RABSo aislador cumple con sus
especificaciones de ingeniería predeterminadas ofrece la certeza de que la capacidad de los sistemas de la instalación y de las
prácticas operativas para controlar la biocarga y las partículas no viables es apropiada para el uso previsto. Dichas pruebas de-
ben repetirse durante la certificación de rutina del cuarto limpio o de los sistemas de procesamiento aséptico avanzado y toda
vez que se cambie significativamente una operación, como el flujo de personal, operación del equipo, flujo de materiales, siste-
mas de manejo de aire o distribución de equipos.
CAPACITACIÓN
DE PERSONAL
El buen desempeño del personal ejerce un papel esencial sobre el control de contaminación, mientras que la capacitación y
supervisión adecuadas son aspectos centrales del control de contaminación. El procesamiento aséptico es la actividad más críti-
ca que se lleva a cabo en ambientes microbiológicamente controlados y los fabricantes deben poner especial atención a los
detalles en todos los aspectos de este esfuerzo. Una rigurosa disciplina y la estricta supervisión del personal son esenciales para
asegurar un nivel de calidad ambiental apropiado para el procesamiento aséptico.
La capacitación de todo el personal que trabaja en ambientes controlados es crítica. Esta capacitación es igualmente impor-
tante para el personal responsable del programa de monitoreo microbiano, debido a que la contaminación de la zona de tra-
bajo limpia podría ocurrir inadvertidamente durante el muestreo microbiano. En operaciones altamente automatizadas, el per-
sonal encargado del monitoreo pueden ser los empleados que tienen contacto más directo con zonas y superficies críticas den-
tro del área de procesamiento. El muestreo microbiológico tiene el potencial de contribuir con contaminación microbiana oca-
sionada por técnicas de muestreo inadecuadas o por la ubicación del personal dentro o cerca de la zona crítica. Se requiere un
programa formal de capacitación para minimizar este riesgo. Dicha capacitación debe ser documentada para todo el personal
que ingresa a los ambientes controlados. Deben minimizarse las intervenciones en todo momento, incluyendo aquellas reque-
ridas para actividades de monitoreo; sin embargo, cuando no es posible evitar las intervenciones, se pueden llevar a cabo em-
pleando técnicas asépticas c¡ue busc¡uen acercarse lo más posible a la la perfección.
La gerencia de la instalación debe asegurarse de que todo el personal que participa en operaciones en cuartos limpios y am-
bientes de procesamiento aséptico avanzado tengan buena instrucción sobre los principios microbiológicos relevantes. La ca-
pacitación debe incluir instrucción sobre los principios básicos de las técnicas asépticas y debe enfatizar la relación que guar-
dan los procesos de fabricación y manipulación con las posibles fuentes de contaminación de los productos. Las personas que
supervisan, auditan o inspeccionan el control microbiológico y las actividades de monitoreo deben tener un profundo conoci-
miento sobre principios básicos de microbiología, fisiología microbiana, desinfección y sanitización, selección y preparación de
medios, taxonomía y esterilización. El personal responsable de la supervisión y del análisis debe contar con capacitación acadé-
mica en microbiología médica o ambiental. Tanto el personal de muestreo como los individuos que trabajan en cuartos limpios
deben estar al tanto de sus responsabilidades para minimizar la liberación de contaminación microbiana. El personal implicado
en la identificación microbiana necesita una capacitación especializada sobre los métodos de laboratorio requeridos. Se debe
ofrecer capacitación adicional sobre la gestión de los datos recolectados. Resulta crítico conocer y comprender los procedi-
mientos operativos estándares, especialmente aquellos relacionados con las medidas correctivas que se toman cuando las con-
diciones ambientales así lo requieren. Comprender los principios del control de contaminación y las responsabilidades de cada
persona con respecto a las buenas prácticas de fabricación (BPF)debe ser parte integral del programa de capacitación, junto
con la capacitación para efectuar investigaciones y análisis de datos.
El personal representa la única fuente significativa de contaminación microbiana en los ambientes asépticos. Debido a que
los operadores dispersan contaminación y puesto que que el objetivo primordial del procesamiento aséptico es reducir los ries-
gos para el usuario final, únicamente se debe permitir la entrada a individuos saludables a los ambientes controlados. No se
debe permitir el acceso a ambientes de procesamiento aséptico a individuos enfermos, incluyendo ambientes que utilicen tec-
nologías asépticas avanzadas tales como aisladores, unidades de soplado/llenado/sellado o RABScerrados.
T
Se debe enfatizar en todo momento la importancia de una buena higiene personal y la atención cuidadosa al detalle en el
uso de vestimenta aséptica. Los requisitos de uso de vestimenta difieren dependiendo del uso del ambiente controlado y de los
aspectos específicos del sistema de vestimenta. Los ambientes de procesamiento aséptico requieren el uso de vestimenta este-
rilizada con las mejores propiedades de filtración disponibles. Es aconsejable cubrir la piel en la mayor medida posible, por lo
que se deben considerar cubre mangas o cinta para minimizar las fugas en las uniones críticas de guantes y mangas. La piel
expuesta nunca deber ser visible en cuartos limpios bajo ninguna circunstancia. Las consideraciones sobre personal y vestimen-
tas para RABSson esencialmente idénticas a los de los cuartos limpios convencionales.
Una vez que los empleados porten adecuadamente la vestimenta, deben tener cuidado de mantener la integridad de sus
guantes, máscaras y de otros materiales de la vestimenta en todo momento. Los operadores que trabajan con sistemas de ais-
ladores no están obligados a usar vestimentas esterilizadas para cuartos limpios; sin embargo, las técnicas asépticas inadecua-
das y la contaminación transmitida por los empleados representan los principales riesgos para las operaciones asépticas segu-
ras en aisladores, así como en RABSy en cuartos limpios convencionales. Los ensambles de guantes y mangas pueden generar
fugas que conllevan a la transferencia mecánica de microorganismos al producto. Un segundo guante, usado por debajo o por
encima del guante primario de aisladores/RABS,puede proporcionar un nivel adicional de seguridad contra fugas en el guante
o puede actuar como una medida higiénica. Asimismo, los operadores deben entender que la técnica aséptica es un requisito
absoluto para todas las manipulaciones realizadas con guantes dentro de RABSy aisladores.
El programa de monitoreo ambiental por sí mismo no es capaz de detectar todos los eventos que ocurren durante el proce-
samiento aséptico que pudieran comprometer la calidad microbiológica del ambiente. Por lo tanto, los estudios periódicos de
llenado de medios o de simulación de procesos, al igual que la supervisión integral continua, son necesarios para garantizar
que se mantengan eficazmente controles operativos y capacitación apropiados.
FACTORES
CRÍTICOSEN ELDISEÑOE IMP~EMENTACIÓNDE UN PROGRAMADE MONITOREO
MICROBIOLOGICO DEL AMBIENTE
Desde el surgimiento de los programas integrales de monitoreo ambiental, se han enfatizado sus aplicaciones para captar
tendencias o desviaciones adversas. En un ambiente de procesamiento aséptico moderno-ya sea un aislador, RABSo cuarto
limpio convencional-los casos de contaminación son cada vez más raros. No obstante, un programa de monitoreo debe ser
capaz de detectar un cambio del estado validado de control en una instalación, así como de ofrecer información para imple-
mentar medidas de corrección apropiadas. Los programas de monitoreo ambiental deben adaptarse a las instalaciones y con-
diciones específicas. Asimismo, resulta útil mantener una perspectiva amplia durante la interpretación de datos. Un solo resul-
tado no correlacionado de un día determinado puede no ser de importancia en el contexto de las limitaciones técnicas asocia-
das con métodos de muestreo aséptico.
Selección de Medios de Crecimiento
En la mayoría de los casos, resulta adecuado un medio de crecimiento microbiológico general, por ejemplo el medio de di-
gerido de caseína y soja (SCDM, por sus siglas en inglés), para el monitoreo ambiental, debido a que promueve el crecimiento
de una amplia variedad de bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Este medio se puede suplementar con aditivos para
reducir o minimizar los efectos de agentes sanitizantes o de antibióticos. Los fabricantes deben considerar la detección específi-
ca de hongos filamentosos y levaduras. Si fuera necesario, se pueden usar medios micológicos generales tales como agar de
Sabouraud, agar de Sabouraud modificado o agar inhibidor de hongos filamentosos. En general, no se lleva a cabo un monito-
reo estricto de anaerobios, debido a la poca posibilidad de supervivencia de estos organismos en el aire ambiental. No obstan-
te, se pueden observar organismos microaerófilos en el procesamiento aséptico. Cuando se presentan condiciones anóxicas o
si las investigaciones lo requieren (p. ej., la identificación de estos organismos en instalaciones de prueba de esterilidad o los
resultados de Pruebasde Esterilidad(71 )), puede ser necesario el monitoreo de organismos microaerófilos y de organismos que
crecen en condiciones de poco oxígeno. Se debe evaluar la capacidad de promoción de crecimiento de cualquier medio usado
en el monitoreo ambiental, incluyendo aquellos seleccionados para recuperar tipos específicos de organismos, según se indica
en (71 ).
Selección de Condiciones de Cultivo
Eltiempo y las temperaturas de incubación se establecen después de seleccionar los medios adecuados. Por lo regular, para
los medios generales de crecimiento microbiológico tales como SCDM, se han usado temperaturas de incubación en el inter-
valo de aproximadamente 20-35º con un tiempo de incubación de no menos de 72 horas. Se pueden considerar tiempos de
incubación mayores cuando se sabe que los contaminantes crecen con lentitud. Los intervalos de temperatura provistos ante-
riormente no son absolutos. Las bacterias mesófilas y los hongos filamentosos comunes en el ambiente de instalación típico
por lo general son capaces de crecer en un amplio intervalo de temperaturas. Para muchos organismos mesófilos, la recupera-
ción es posible en un intervalo de aproximadamente 20º. Ante la ausencia de pruebas confirmatorias, los microbiólogos pue-
den incubar una sola placa a una temperatura baja y a una más alta. El incubar primero a la temperatura más baja puede com-
prometer la recuperación de cocos Gram positivos que son importantes debido a que a menudo se les relaciona con humanos.
~i 1
T
7978 (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico / InformaciónGeneral USP42
Se deben validar los procesos de esterilización para preparar los medios de crecimiento. Cuando se usan medios selectivos
para el monitoreo, las condiciones de incubación deben reflejar los requisitos técnicos publicados. No se debe introducir con-
taminación a un cuarto limpio de fabricación como resultado del uso de medios o equipo de muestreo contaminados. El uso
de medios de muestreo preparados asépticamente representa una preocupación especial. Siempre que sea posible, se deben
esterilizar terminalmente los medios de muestreo y sus envolturas mediante calor húmedo, radiación u otros medios adecua-
dos. Cuando se deban usar medios preparados asépticamente, los analistas deberán llevar a cabo una preincubación e inspec-
ción visual de todos los medios de muestreo antes de introducirlos en el cuarto limpio. Se refiere al lector al capítulo general
ÓptimasPrácticasde LaboratorioMicrobiológico (111 7) para mayor información sobre operaciones y controles en laboratorios
microbiológicos.
ESTABLECIMIENTO
DE PLANESY SITIOSDE MUESTREO
Resulta necesario determinar ubicaciones específicas para el muestreo de aire y de superficies durante el inicio o la puesta en
servicio de un cuarto limpio u otro ambiente controlado. Entre las ubicaciones consideradas se deben incluir aquéllas en la
proximidad del producto, envases, cierres y superficies de contacto expuestos. Durante el procesamiento aséptico, al área en la
que los envases, cierres y producto están expuestos al ambiente a menudo se le denomina zona crítica-la zona crítica siempre
es un ambiente ISO 5. Para operaciones asépticas, toda la zona crítica debe tratarse como un campo estéril. Ningún objeto no
estéril, incluyendo manos enguantadas del personal del cuarto limpio o un guante para RABS/aislador,debe entrar en contacto
con un producto estéril, cierre de envase, estación de llenado o equipo de transporte antes o durante las operaciones de pro-
cesamiento aséptico. Los operadores y el personal de monitoreo ambiental nunca deben tocar partes estériles de transportado-
res, agujas de llenado, tolvas o cualquier otro equipo que esté dentro de la ruta de descarga del producto. Esto significa que es
mejor realizar el monitoreo de estas superficies al final de las operaciones de producción.
La frecuencia del muestreo depende del proceso de fabricación que se lleve a cabo dentro de un ambiente. Los ambientes
clasificados que se usan solo para proporcionar un nivel general de biocarga menor en las áreas de fabricación de productos
no estériles requieren monitoreo ambiental de menor frecuencia. Los ambientes clasificados en los que se llevan a cabo opera-
ciones cerradas de fabricación, entre las que se incluyen fermentación, procesamiento estéril de un ingrediente farmacéutico
activo y procesos químicos, requieren un número menor de sitios de monitoreo, así como monitoreo menos frecuente debido
a que el riesgo de contaminación microbiana del entorno es comparativamente bajo. El monitoreo microbiológico de ambien-
tes en donde los productos se llenan antes de la esterilización terminal a menudo es menos crítico que el monitoreo en las
áreas de procesamiento aséptico. La cantidad de monitoreo requerido en las operaciones de llenado para esterilización termi-
nal depende de la susceptibilidad de la supervivencia en el producto y del potencial de proliferación de contaminación micro-
biana. La identificación y el número estimado de microorganismos resistentes a la esterilización posterior pueden ser más críti-
cas que el monitoreo ambiental microbiológico de los ambientes de fabricación circundantes.
No es posible recomendar niveles de control microbianos para cada tipo de ambiente de fabricación. Por ejemplo, los nive-
les establecidos para un ambiente ISO Clase 7 pueden ser inapropiados para otro ambiente de la misma clase, dependiendo de
las actividades de producción que se lleven a cabo en cada ambiente. El usuario debe llevar a cabo un análisis de riesgos even-
tuales y desarrollar una justificación para las ubicaciones y frecuencias de muestreo para cada ambiente controlado. La clasifica-
ción de un cuarto limpio ayuda a establecer niveles de control, pero no implica que todos los cuartos con la misma clasifica-
ción deban tener los mismos niveles de control ni la misma frecuencia de monitoreo. El monitoreo debe reflejar los requisitos
de control microbiológico de las actividades de fabricación o procesamiento. Las técnicas formales de evaluación de riesgos
pueden conllevar a la formación de un programa de control de contaminación científicamente válido.
La Tabla2 sugiere frecuencias de muestreo en orden decreciente de frecuencia y según la criticidad o el riesgo para el pro-
ducto del área muestreada. Esta tabla distingue entre el procesamiento aséptico en el que el personal está sujeto al uso asépti-
co de vestimentas y aquel en el que resulta apropiado un menor uso de vestimentas. Los planes de muestreo para monitoreo
ambiental deben ser flexibles con respecto a las frecuencias del monitoreo; asimismo, las ubicaciones del plan de muestreo se
deben ajustar basándose en la tasa observada de contaminación y en los análisis de riesgos continuos. Los fabricantes, basán-
dose en observaciones a largo plazo, pueden incrementar o disminuir el muestreo en una ubicación dada o eliminar una ubica-
ción de muestreo. El muestreo en exceso puede ser perjudicial para el control de contaminación al igual que la falta de mues-
treo, por lo que considerar cuidadosamente los riesgos y las fuentes de contaminación puede ayudar a determinar la intensi-
dad del muestreo.
Tabla 2. Frecuencia de Muestreo Sugerida para Areas de Procesam ento Asept
- 1co•
Área/Ubicación del Muestreo 1 Frecuencia de Muestreo
Cuarto Limpio/RABS
Zona crítica(ISO5 o mejor)
Muestreo activo del aire 1 Cada turno operativo
Monitoreo de superficies 1 Al final de la operación
Áreaasépticaadyacentea la zona crítica
ª Todos los operadores están vestidos asépticamente en estos ambientes (con excepción de los ambientes de fondo en el caso de aisladores). Estas recomenda-
ciones no se aplicana las áreasde producciónparaproductosno estérileso a otros ambientesclasificadosen los que no se utilizanvestimentascompletamente
asépticas.
USP42 InformaciónGeneral/ (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico 7979
Tabla 2. Frecuenc1a de Muestreo Suge rlda para Á reas d e procesam ento A'sept 1co• Continuacion)
Área/Ubicación del Muestreo 1 Frecuencia de Muestreo
Todo el muestreo 1 Cada turno operativo
Otras áreasasépticasno adyacentes
Todo el muestreo 1 Una vez al día
Aisladores
Zona crítica(ISO5 o mejor)
Muestreo activo del aire 1 Una vez al día
Monitoreo de superficies 1 Al final de la campaña
Áreasno asépticasentornoal aislador
Todo el muestreo 1 Una vez al mes
ciones no se aplican a las áreas de producción para productos no estériles o a otros ambientes clasificados en los que no se utilizan vestimentas completamente
asépticas.
SELECCIÓNDE SITIOS DE MUESTREODENTRO QE CUARTOSLIMPIOS Y ÁREASDE

PROCESAMIENTOASEPTICO
La norma ISO 14644 sugiere una metodología de cuadrícula (grid approach)para la clasificación de partículas del aire totales
en cuartos limpios. Esta metodología es adecuada para certificar el desempeño de la calidad del aire en relación a partículas
totales en función del objetivo de su diseño. Asimismo, las cuadrículas pueden tener gran valor para el análisis de riesgos por
contaminación microbiana, aunque, en general, las cuadrículas que no presentan actividad por parte del personal propenden
a bajos niveles de contaminación. La contaminación microbiana está profundamente relacionada con el personal, por lo que el
monitoreo microbiológico de ambientes sin personal tiene un valor limitado.
Para seleccionar de la mejor manera los sitios de muestreo microbiológico se debe tomar en cuenta la actividad humana
durante operaciones de fabricación. La observación y el mapeo cuidadosos del cuarto limpio durante la fase de calificación
pueden proporcionar información útil relacionada con el movimiento y la ubicación del personal. Semejante observación pue-
de generar también información importante sobre las manipulaciones e intervenciones más frecuentes.
La ubicación y el movimiento del personal dentro del cuarto limpio se correlacionan con el riesgo de contaminación para el
ambiente y para los procesos que se llevan a cabo dentro de dicho ambiente. Los sitios de muestreo deben seleccionarse de tal
manera que evalúen el impacto del movimiento y el trabajo del personal dentro del área, en particular las intervenciones y
manipulaciones dentro de la zona crítica.
La vía más probable de contaminación es a través del aire, por lo que las muestras más críticas para evaluación de riesgos
son aquellas relacionadas con la contaminación transmitida por el aire cerca de materiales estériles expuestos. Otras áreas de
preocupación son los puntos de ingreso donde los equipos y materiales se mueven desde áreas con clasificaciones más bajas
hacia áreas con clasificaciones más altas. El esquema de monitoreo debe incluir las áreas dentro y alrededor de las puertas y
esclusas de aire. Se acostumbra también muestrear paredes y pisos; de hecho, el muestreo en estas ubicaciones puede proveer
información sobre la efectividad del programa de sanitización. El muestreo en estas ubicaciones puede llevarse a cabo relativa-
mente con poca frecuencia, debido a que es poco probable que la contaminación afecte al producto. Los operadores nunca
deben tocar los suelos ni paredes y, por consiguiente, no debería presentarse la transmisión mecánica de contaminación de
estas superficies a las áreas críticas donde se encuentra expuesto el producto.
Los fabricantes generalmente deben monitorear las superficies dentro de las zonas críticas, aunque dicho control debe reali-
zarse únicamente al final de las operaciones. Se deben evitar los residuos de medios o diluyentes de hisopos húmedos sobre las
superficies, debido a que pueden ocasionar la proliferación de microorganismos. Además, la limpieza de superficies para elimi-
nar diluyentes o medios requiere la intervención y movimientos del personal, lo que puede resultar en la liberación de conta-
minación microbiana dentro de la zona crítica y puede perturbar el flujo de aire.
PARÁMETROSDE CONTROL MICROBIOLÓGICOEN CUARTOSLIMPIOS, AISLADORESY RABS
Desde principios de la década de 1980, los fabricantes han establecido niveles de alerta y acción para monitoreo ambiental.
En años recientes, se ha reducido en buena medida la diferencia numérica entre los niveles de alerta y acción, especialmente
en ambientes ISO 5. El crecimiento y la recuperación en valoraciones microbiológicas presentan una variabilidad normal en el
intervalo de ±0,5 log 10 • Los estudios sobre muestreadores de aire microbiológicos activos indican que es posible una variabili-
dad tan alta como diez veces entre los dispositivos de muestreo comúnmente usados. Como resultado de esta variabilidad in-
herente y del error de muestreo indeterminado, las supuestas diferencias entre, por ejemplo, un nivel de alerta de 1 ufc y un
nivel de acción de 3 ufc no son analíticamente significativos. Desde el punto de vista científico, no es válido tratar las diferen-
cias que se encuentran dentro de los intervalos esperados, y por lo tanto normales, como numéricamente diferentes, pudiendo
resultar en actividades injustificadas. En términos prácticos, resulta posible que los valores numéricos que presentan variaciones
tan altas como cinco a diez veces no sean significativamente diferentes.
7980 (1116) Ambientes de Procesamiento Aséptico / Información General USP42
Debido a la exactitud y precisión limitadas de los ensayos de crecimiento y recuperación microbiana, los analistas pueden
considerar la frecuencia con la que se detecta contaminación en lugar de números absolutos de ufc detectadas en una sola
muestra. Asimismo, una ufc no es una enumeración directa de microorganismos presentes, sino una medición de la contami-
nación que pudiera haberse originado de un grupo de organismos.
Se deben determinar las tasas de recuperación de contaminación promedio para cada ambiente de cuarto limpio, mientras
que los cambios en las tasas de recuperación de contaminación en un sitio determinado o dentro de un cuarto determinado
pueden indicar la necesidad de acciones correctivas. Dentro de la zona crítica ISO 5, los métodos actuales deben permitir la
consecución de tasas de recuperación del aire y de superficies de 1% o menores. Las tasas de recuperación de contaminación
para RABScerrados y sistemas de aisladores deben ser significativamente menores y se puede esperar que sean <0, 1%, basán-
dose en los resultados de monitoreo publicados.
La contaminación observada en múltiples sitios en un ambiente dentro de un solo periodo de muestreo puede indicar un
aumento en los riesgos para el producto y se debe evaluar cuidadosamente. Asimismo, la aparición de contaminación casi de
manera simultánea en múltiples sitios puede ser generada por una técnica de muestreo deficiente, por lo que se requiere una
cuidadosa revisión antes de formular conclusiones sobre la potencial pérdida de control. Volver a muestrear un ambiente varios
días después de la contaminación ofrece poco valor, debido que las condiciones durante un muestreo pueden ser difíciles de
duplicar con exactitud durante otro muestreo.
Las muestras de superficies también se pueden tomar de vestimentas para cuartos limpios. Se debe enfatizar el muestreo de
personal durante la validación, el cual se lleva mejor a cabo una vez terminado el trabajo de producción a fin de evitar la con-
taminación adventicia de las vestimentas. En este caso, el promedio también debe ser <1 % para estos sitios de muestreo. Los
guantes en RABSy aisladores cerrados deben cumplir con la expectativa más rigurosa para tasas de recuperación de contami-
nación de <0, 1%.
Debido a la variabilidad inherente de los métodos de muestreo microbiano, las tasas de recuperación de contaminación re-
presentan una medición más útil de los resultados de tendencias que enfocarse en el número de colonias recuperadas de una
muestra determinada. La Tabla3 proporciona las tasas de recuperación recomendadas para ambientes de procesamiento asép-
tico. La tasa de incidencia corresponde a la tasa con que se encuentra contaminación microbiana en muestras del ambiente.
Por ejemplo, una tasa de incidencia de 1% significa que únicamente el 1% de las muestras tomadas presentan contaminación,
independientemente del número de colonias. En otras palabras, 99% de las muestras tomadas están completamente exentas
de contaminación. Las tasas de recuperación de contaminación que son más altas que las recomendadas en la Tabla3 pueden
ser aceptables en cuartos con clasificaciones similares que se usan para actividades de bajo riesgo. Las acciones se vuelven ne-
cesarias cuando la tasa de recuperación de contaminación presenta tendencias superiores a estas recomendaciones durante un
periodo significativo.
Tabl a 3. Tasas d e Recuperaclon de Contam naclon lnlc 1a 1es S,uge rld asen Am bl entes A'seJ t 1cosª
Placa de Sedimenta-
Muestra de clón (9 cm) 4 h de Ex- Placa de Contacto Guante o Vestimenta
Claslflcaclón del Cuarto Aire Activo (%) posición (%) o Hisopo(%) (%)
Aislador/ RABSCerrado {ISO 5 o mejor) <0,1 <0,1 <0,1 <0,1
ISO 5 <1 <1 <1 <1
ISO 6 <3 <3 <3 <3
ISO 7 <5 <5 <5 <5
ISO8 <10 <10 <10 <10
ciones no se aplican a las áreas de producción para productos no estériles o a otros ambientes clasificados en los que no se utilizan vestimentas completamente
asépticas.
La frecuencia de detección se debe basar en datos de monitoreo reales y se debe retabular mensualmente. Los niveles de
acción deben basarse en la capacidad empírica del proceso. Si las frecuencias de detección exceden las recomendaciones de la
Tabla3 o son mayores que la capacidad establecida del proceso, entonces deben tomarse acciones correctivas. Las acciones
correctivas pueden incluir, entre otras, las siguientes:
• Revisión del programa de sanitización, incluyendo la selección de agentes anti microbianos, métodos de aplicación y fre-
cuencias
• Mayor vigilancia en las prácticas del personal, lo cual podría incluir evaluaciones por escrito de métodos y técnicas asépti-
cas
• Revisión de métodos y técnicas de muestreo microbiológicos.
Cuando se observan niveles de recuperación más altos de lo común en lo referente a contaminación en guantes y vestimen-
tas, se puede instruir capacitación adicional sobre prácticas de uso de vestimentas.
VARIACIONESIMPORTANTES
Las variaciones superiores a aproximadamente 15 ufc recuperadas de una sola muestra ISO 5, derivadas del aire, de superfi-
cies o del personal, deben ocurrir con la menor frecuencia posible. La ocurrencia de semejantes variaciones en ISO 5 puede ser
indicativa de una pérdida importante de control cuando éstas se presentan dentro de la zona crítica ISO 5 con estrecha proxi-
midad al producto y a los componentes. Por consiguiente, cualquier variación en muestras ISO 5 > 15 ufc requiere una investi-
gación cuidadosa y minuciosa.
Una consideración clave para un número anormalmente alto de colonias recuperadas radica en si el incidente es aislado o si
se correlaciona con otras recuperaciones. Los microbiólogos deben revisar las tasas de recuperación para al menos dos sema-
nas previas al incidente de recuperación anormalmente alta, de modo que puedan estar al tanto de otras recuperaciones que
pudieran indicar un patrón inusual. Asimismo, los microbiólogos deben considerar cuidadosamente todas las recuperaciones,
incluyendo aquellas que se encuentran en el intervalo más común de 1-5 ufc. La identidad de los organismos recuperados es
un factor importante para llevar a cabo esta investigación.
En el caso de una sola variación aislada, existe la probailidad de que no se pueda establecer una causa definitiva, por lo que
solo podrán considerarse medidas correctivas generales. Resulta inapropiado sugerir una causa de raíz para la que no se cuenta
con evidencia científica sólida. Ademas, se debe ser consciente de la variabilidad del análisis microbiológico. Desde una pers-
pectiva realista, no existen razones científicas para tratar una recuperación de 25 ufc como estadísticamente diferente de una
recuperación de 15 ufc. Un valor de 15 ufc no debe considerarse significativo en términos de control de procesos, debido a
que, en realidad, no existe diferencia entre una recuperación de 14 ufc y una de 15 ufc. Los microbiólogos deben usar un
razonamiento científico práctico en sus metodologías para evaluar desviaciones.
CONSIDERACIONESADICIONALESSOBRELA INTERPRETACIÓNDE DATOS
En los ambientes de alta calidad requeridos para el procesamiento aséptico, la frecuencia de detección es a menudo baja.
Como se puede apreciar en las tasas recomendadas de la Tabla3, la mayoría de las muestras tomadas en un área de procesa-
miento aséptico producirán una recuperación de cero contaminación. En las áreas más críticas dentro de las operaciones de
procesamiento aséptico, se espera que menos del 1% de las muestras produzcan algún tipo de contaminación recuperable. En
las operaciones asépticas modernas más avanzadas que emplean tecnologías de separación, como por ejemplo aisladores o
RABScerrados, la tasa de recuperación se aproximará a cero en todo momento.
El microbiólogo responsable del control ambiental o de la garantía de esterilidad no debe interpretar lo anterior como un
acercamiento a la esterilidad por parte de la calidad ambiental. Se desconoce la sensibilidad de todo sistema de muestreo mi-
crobiano en términos absolutos. En el monitoreo ambiental, un resultado cero significa únicamente que el resultado está por
debajo del límite de detección del sistema analítico. Se debe evitar un falso sentido de seguridad derivado de la poca frecuen-
cia de recuperación de contaminación en el procesamiento aséptico.
La garantía de esterilidad se logra de mejor manera al enfocarse en la contaminación transmitida por humanos, así como en
las características de diseño de la instalación que mitiguen de mejor manera los riesgos de esta contaminación. La mejor mane-
ra de mitigar riesgos se puede lograr reduciendo o eliminando las intervenciones humanas mediante el diseño de equipo ade-
cuado y proporcionando suficientes cambios de aire por hora para la población de personal pretendida de la instalación. Otros
factores para la mitigación de riesgos incluyen el movimiento efectivo del personal y de los materiales, así como el control ade-
cuado de la temperatura y la humedad. Entre los factores secundarios para la mitigación de riesgos se incluyen la limpieza y la
sanitización. Los modelos de análisis de riesgos que analizan los procesos de manera prospectiva para reducir el riesgo de con-
taminación microbiana transmitida por humanos mediante la minimización de las intervenciones del operador son herramien-
tas más poderosas para el aseguramiento de la esterilidad que el monitoreo. El monitoreo ambiental no puede probar ni refu-
tar en términos absolutos la esterilidad de un lote de producto. El monitoreo ambiental solo puede garantizar a los responsa-
bles de un proceso que un sistema de producción se encuentra en un estado de control validado y uniforme. Se debe tener
cuidado de no formular conclusiones inapropiadas a partir de los resultados del control.
MUESTREODE MICROORGANISMOSDELAIRE
Entre las herramientas más comúnmente usadas para el monitoreo de ambientes asépticos se encuentran los muestreadores
por impacto y centrífugos. A modo informativo, se detallan algunos muestreadores disponibles en el mercado. El usuario tiene
la responsabilidad de determinar la selección, conveniencia e idoneidad de cada muestreador.
Muestreador de Aire de Ranura-Agar(STA, por sussiglasen inglés)
La unidad está impulsada por una fuente acoplada de vacío controlable. La toma de aire se hace a través de una ranura
estandarizada debajo de la cual se coloca una placa de Petri que gira lentamente y que contiene agar nutritivo. Las partículas
en el aire que tienen una masa suficiente impactan la superficie del agar y permite el crecimiento de los organismos viables. A
menudo se usa una toma de aire remota para no alterar el flujo de aire unidireccional.
lmpactador de Tamiz
Este aparato consiste en un recipiente diseñado para alojar una placa de Petri con agar nutritivo. La cubierta de la unidad
está perforada con aberturas de un tamaño predeterminado. Una bomba de vacío toma un volumen conocido de aire a través
de la cubierta y las partículas del aire que contienen microorganismos impactan el medio de agar de la placa de Petri. Algunos
muestreadores disponen de una serie de tamices en cascada, con perforaciones de tamaño decreciente. Estas unidades permi-
ten determinar la distribución del intervalo de tamaños de partículas que contienen microorganismos viables, basándose en el
tamaño de las perforaciones que atraviesan las partículas para aterrizar en las placas de agar.
Muestreador Centrífugo
La unidad consiste en una hélice o turbina que aspira un volumen conocido de aire hacia el interior de la unidad y luego
impulsa el aire al exterior hacia una tira de agar nutritivo dispuesta tangencialmente sobre una base plástica flexible.
Atrio MicrobiológicoEsterilizable
La unidad es una variante del impactador de tamiz de una sola etapa. La cubierta de la unidad contiene orificios uniforme-
mente espaciados de un tamaño de aproximadamente 6,35 mm (0,25 pulgadas). La base de la unidad aloja una placa de Petri
que contiene agar nutritivo. Una bomba de vacío controla el movimiento de aire a través de la unidad y se encuentran dispo-
nibles un centro de control de unidades múltiples y una sonda de muestreo remoto.
Muestreador por Sistemade Aire en Superficie(Muestreador SAS,por sussiglasen inglés)
Esta unidad integrada está formada por una sección de ingreso que aloja una placa de contacto de agar. Inmediatamente
detrás de la placa de contacto hay un motor y una turbina que aspira aire a través de la cubierta perforada de la unidad hacia
la placa de contacto de agar y más allá del motor, donde se expulsa. También se encuentran disponibles unidades de montajes
múltiples.
Muestreador con Filtro de Gelatina
La unidad está formada por una bomba de vacío con una manguera de extensión que termina en un portafiltro que puede
ubicarse lejos, en el espacio crítico. Elfiltro está constituido por fibras de gelatina dispuestas al azar, capaces de retener los
microorganismos transportados por el aire. Después de un tiempo de exposición especificado, se retira asépticamente el filtro
y se lo disuelve en un diluyente adecuado; luego se realiza la siembra sobre un medio de agar adecuado para estimar su conte-
nido microbiano.
Placasde Sedimentación
Este método aún se utiliza ampliamente como una manera simple y económica de evaluar cualitativamente los ambientes
durante tiempos de exposición prolongados. Los datos publicados indican que las placas de sedimentación, al exponerlas du-
rante periodos de 4 a 5 horas, pueden proveer un límite de detección para una evaluación adecuada del ambiente aséptico.
Las placas de sedimentación pueden ser particularmente útiles en áreas críticas en las que el muestreo puede ser intrusivo y
representar un riesgo para la operación aséptica.
Uno de los principales inconvenientes de los muestreadores mecánicos de aire es el limitado tamaño de muestra de aire ana-
lizada. Cuando se espera que el nivel microbiano en el aire de un ambiente controlado contenga niveles extremadamente ba-
jos de contaminación por unidad de volumen, se debe analizar por lo menos 1 metro cúbico de aire a fin de maximizar la
sensibilidad. Típicamente, los dispositivos de ranura-agar tienen una capacidad de muestreo de 80 L/minuto (la capacidad de
los muestreadores SASes un poco mayor). El análisis de 1 metro cúbico requeriría un tiempo de exposición de 15 minutos.
Puede ser necesario usar tiempos de muestreo por encima de 15 minutos para obtener una muestra del ambiente representati-
va. Aunque se ha informado de muestreadores con altos volúmenes de muestreo, se debe considerar el potencial trastorno de
los patrones del flujo de aire en las zonas críticas o la generación de una turbulencia.
Es posible que los técnicos deseen utilizar sistemas de muestreo remotos para minimizar los riesgos potenciales que resultan
de la intervención por parte de muestreadores ambientales en las zonas críticas. Independientemente del tipo de muestreador
usado, los analistas deben determinar que la tubería extra requerida para una sonda remota no reduzca la sensibilidad del mé-
todo a tal grado que se vuelva poco probable o imposible la detección de niveles bajos de contaminación.
MUESTREODE SUPERFICIES
Otro componente del programa de control microbiano en ambientes controlados es el muestreo de las superficies de equi-
po, instalaciones y personal. La estandarización de los métodos y procedimientos para muestreo de superficies no ha sido tra-
tada de manera tan amplia en la industria farmacéutica como la estandarización de los procedimientos para muestreo del aire.
El muestreo de superficies puede llevarse a cabo mediante placas de contacto o por el método de hisopado.
Las placas de contacto llenas con agar nutritivo se usan al muestrear superficies regulares o planas y se incuban directamente
durante el tiempo y la temperatura apropiados para la recuperación de microoorganismos viables. Se puede usar agar especia-
T
lizado para la recuperación de organismos con requisitos de crecimiento específicos. Las estimaciones microbianas se informan
por placa de contacto.
El método de hisopado se puede usar como complemento de las placas de contacto para muestrear superficies irregulares,
en especial las superficies irregulares de los equipos. El área por donde se pasará el hisopo se define con una plantilla estéril de
tamaño adecuado. En general, se trata de un área de entre 24 y 30 cm 2 • Después de recolectar la muestra, el hisopo se coloca
en un diluyente adecuado o medio de transporte y se plaquea sobre el agar nutritivo adecuado. Las estimaciones microbianas
se informan por hisopado de un área de muestreo definida.
El monitoreo de superficies se usa como herramienta de evaluación ambiental en todos los tipos de ambientes clasificados.
En los ambientes ISO 5 para procesamiento aséptico, el monitoreo de superficies por lo general se lleva a cabo cerca de áreas y
superficies críticas. Las tolvas y rampas de alimentación que entran en contacto con superficies estériles en cierres y agujas de
llenado pueden ser analizadas para detectar contaminación microbiana. A menudo, en los cuartos limpios convencionales con
personal, estas superficies de contacto con productos se esterilizan con vapor y se ensamblan asépticamente. La capacidad de
los operadores para realizar manipulaciones asépticas se evalúa durante simulaciones del proceso o llenados de medios, aun-
que no es posible realizar de esta manera una validación verdadera de la técnica del operador. El monitoreo de superficies que
se realiza en superficies que entran en contacto directo con partes o productos estériles se debe llevar a cabo únicamente des-
pués de haber completado las operaciones de producción. El muestreo de superficies no es una prueba de esterilidad y no
debe considerarse un criterio para la liberación o rechazo de productos. Debido a que el personal debe tomar estas muestras
asépticamente, resulta difícil establecer con certeza si la contaminación recuperada está relacionada con el producto.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
Eltipo de medio, líquido o sólido, usado para el muestreo o plaqueo de microorganismos depende del procedimiento y
equipos usados. Se debe evaluar la aptitud de todos los medios utilizados según el propósito previsto. El medio de crecimiento
microbiológico sólido multipropósito más común es el agar con digerido de caseína y soja. Tal como se mencionó con anterio-
ridad, este medio se puede complementar con químicos que contrarresten el efecto de varios antimicrobianos.
IDENTIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS MICROBIANOS
Un programa de control ambiental exitoso incluye un nivel apropiado de identificación de la flora obtenida mediante el
muestreo. Conocer la flora normal de los ambientes controlados ayuda a determinar la flora microbiana habitual prevista para
la instalación que se está controlando, además de que permite evaluar la eficacia de los procedimientos, métodos y agentes de
limpieza y sanitización, así como los métodos de recuperación. La información reunida mediante un programa de identifica-
ción también puede resultar útil para investigar la fuente de contaminación, especialmente cuando se exceden las frecuencias
de detección recomendadas.
La identificación de aislamientos de las zonas críticas y las áreas inmediatamente adyacentes a ellas deben tener prioridad
sobre la identificación de microorganismos de zonas no críticas. Resulta necesario verificar los métodos de identificación y eva-
luar los kits listos para usar según su propósito previsto.
CONCLUSIÓN
El monitoreo ambiental es uno de los varios elementos clave requeridos para asegurar que un área de procesamiento asépti-
co se mantiene en un nivel de control adecuado. El monitoreo es un ejercicio cualitativo e, incluso en las aplicaciones más
críticas como el procesamiento aséptico, las conclusiones relacionadas con la aceptabilidad del lote no deben ser formuladas
basándose únicamente en los resultados del muestreo ambiental. Los ambientes esencialmente libres de operadores humanos
por lo general presentan tasas iniciales de contaminación bajas y mantienen bajos niveles de contaminación microbiana. Los
cuartos limpios de escala humana presentan un panorama muy distinto. Los estudios muestran de manera concluyente que los
operadores, incluso con el empleo cuidadoso y correcto de vestimentas, desprenden continuamente microorganismos en el
ambiente. Por consiguiente, no resulta razonable asumir que en todo momento se observarán muestras que no produzcan co-
lonias, incluso en la zona crítica o en superficies críticas. Las desviaciones periódicas son inevitables en los cuartos limpios de
escala humana, pero la tasa de recuperación de contaminación, particularmente en ambientes ISO 5 usados para el procesa-
miento aséptico, debe ser uniformemente baja.
Los operadores de los cuartos limpios, en especial aquellos dedicados al procesamiento aséptico, deben esforzarse por man-
tener una calidad ambiental adecuada y deben trabajar en función del mejoramiento continuo de las operaciones del personal
y del control ambiental. En general, un número bajo de personal implicado en el procesamiento y monitoreo asépticos, auna-
do a una reducción en las intervenciones, reduce el riesgo de contaminación microbiana.
GLOSARIO
Recuento de Partículas del Aire (también denominado RecuentoTotalde Partículas): El número total de partículas de un
tamaño determinado por unidad de volumen de aire.
7984 (111 6) Ambientes de Procesamiento Aséptico / Información General USP 42
Recuento de Partículas Viables del Aire: (también denominado Recuento Totalde MicroorganismosAerobios del Aire): El
número recuperado de unidades formadoras de colonias (ufc) por unidad de volumen de aire.
Cambios de Aire: La frecuencia por unidad de tiempo (minutos, horas, etc.) con la que se reemplaza el aire dentro de un
ambiente controlado. El aire puede ser parcialmente recirculado o reemplazarse por completo.
Muestreador de Aire: Dispositivos o equipos usados para muestrear una cantidad medida de aire en un tiempo especificado
para cuantificar el estado microbiológico o de partículas del aire en el ambiente controlado.
Aséptico: Técnicamente, se refiere a la ausencia de microorganismos; no obstante, en el procesamiento aséptico, se refiere a
métodos y operaciones que minimizan la contaminación microbiana en ambientes donde se llenan y/o ensamblan productos y
componentes esterilizados.
Procesamiento Aséptico: Operación en la que el producto se ensambla o transfiere a su envase primario en un ambiente
ISO 5 o mejor y en condiciones que minimicen el riesgo de contaminación microbiana. El objetivo final es producir productos
exentos tanto como sea posible de contaminación microbiana.
Sistema de Barreras: Barreras físicas instaladas dentro de un cuarto de procesamiento aséptico que proporcionan una sepa-
ración parcial entre el personal asépticamente ataviado y las áreas críticas sujetas a riesgos considerables de contaminación. El
acceso de personal a la zona crítica está altamente restringido. Se somete a una desinfección de alto nivel.
Biocarga: Número total e identidad de microorganismos predominantes detectados en o sobre un artículo.
Cuarto Limpio: Un cuarto donde se controla la concentración de partículas del aire para que cumpla con una Clase específi-
ca de limpieza del aire con respecto a partículas. Además, se monitorea la concentración de microorganismos en el ambiente;
cada Clase de limpieza definida tiene asignada además un nivel microbiano del aire, de superficies y de indumentaria del per-
sonal
Puesta en Servicio de un Ambiente Controlado: Certificación brindada por ingenieros y control de calidad que confirma
que el ambiente se ha construido según las especificaciones de la Clase de limpieza deseada y que, en las condiciones proba-
bles de funcionamiento normal (o peores condiciones), es capaz de lograr un proceso aséptico. La puesta en servicio incluye
ensayos de llenado de medios y resultados del programa de control ambiental.
Tasa de Recuperación de Contaminación: La tasa de recuperación de contaminación es la tasa con la que se mide cualquier
nivel de contaminación encontrado en las muestras del ambiente. Por ejemplo, una tasa de incidente de 1o/osignifica que úni-
camente el 1o/ode las muestras tomadas presentan contaminación, independientemente del número de colonias.
Ambiente Controlado: Toda zona de un sistema de procesamiento aséptico en la que se controlan niveles específicos de
partículas y microorganismos en el aire, adecuados para las actividades desarrolladas dentro de ese ambiente.
Acción Correctiva: Acciones descritas en los procedimientos operativos estándares y que hay que tomar cuando se superan
ciertas condiciones.
Zona Crítica: Por lo general, el área completa donde el producto, así como los envases y cierres están expuestos en el proce-
samiento aséptico.
Frecuencia de Detección: La frecuencia con la que se observa contaminación en un ambiente. Por lo general, se expresa
como porcentaje de muestras en las que se observó contaminación, por unidad de tiempo.
Aislamientos Ambientales: Microorganismos que se han aislado en el programa de control ambiental.
Programa de Monitoreo Ambiental: Programa documentado, implementado a través de procedimientos operativos están-
dares, que describe en detalle los métodos y criterios de aceptación usados para monitorear partículas y microorganismos en
ambientes controlados (aire, superficies, indumentaria del personal). El programa incluye sitios de muestreo, frecuencia de
muestreo e investigación y acciones correctivas.
Diagrama de la Distribución de Equipos: Representación gráfica de un sistema de procesamiento aséptico que muestra la
interrelación entre los equipos y el personal. Esta distribución se usa en el Análisisde Evaluaciónde Riesgospara determinar los
sitios y frecuencia de muestreo basándose en la posible contaminación microbiológica del sistema de producto/envase/cierre.
Los cambios deben ser evaluados por los gerentes responsables, dado que los cambios no autorizados en la distribución de los
equipos y de los puestos del personal podrían aumentar la probabilidad de contaminación del sistema de producto/envase/
cierre.
Aislador para Procesamiento Aséptico: Un aislador aséptico es un recinto sobrepresurizado con aire filtrado HEPAy que se
descontamina usando un sistema automático. Cuando se opera como sistema cerrado, utiliza únicamente interfases desconta-
minadas o puertos de transferencia rápida (RTP,por sus siglas en inglés) para la transferencia de materiales. Después de la des-
contaminación, se pueden operar de manera abierta con el ingreso y/o egreso de materiales a través de aberturas definidas
que han sido diseñadas y validadas para evitar la transferencia de contaminación. Se pueden usar para actividades de procesa-
miento aséptico o para asépsis y contención simultáneas.
Flujo de Materiales: Elflujo de material y personal que ingresa a los ambientes controlados debe seguir un camino especifi-
cado y documentado elegido para reducir o minimizar la probabilidad de contaminación microbiana de los sistemas de pro-
ducto/envase/cierre. Si no se cumple con el flujo indicado, podría aumentar la probabilidad de contaminación microbiana. Se
puede modificar el flujo de material y personal, pero los gerentes responsables tienen que evaluar las consecuencias de los
cambios desde un punto de vista microbiológico; dichos cambios se deben autorizar y documentar.
Llenado de Medios: Simulación microbiológica de un proceso aséptico mediante el uso de medios de crecimiento procesa-
dos de manera similar al procesamiento del producto y usando el mismo sistema de envase y cierre.
Promoción del Crecimiento en Medios: Procedimiento que hace referencia a la Pruebade Promociónde Crecimientode Or-
ganismosAerobios,Anaerobiosy Hongosen Pruebasde Esterilidad(71) para demostrar que los medios usados en el programa de
USP42 InformaciónGeneral/ (1116) Ambientes de ProcesamientoAséptico 7985
monitoreo ambiental microbiológico, o en ensayos de llenado de mediosson capaces de promover el crecimiento de microor-
ganismos indicadores y de aislamientos ambientales de muestras obtenidas en el programa de monitoreo o de sus cepas ATCC
correspondientes.
Áreas de Contacto con el Producto: Áreas y superficies en un ambiente controlado que están en contacto directo con pro-
ductos, envases o cierres y cuyo estado microbiológico puede resultar en una posible contaminación microbiana del sistema
de producto/envase/cierre.
Sistema de Barreras con Acceso Restringido (RABS, por sus siglas en inglés): Un recinto que se basa en una sobredescar-
ga de aire filtrado por HEPApara mantener la separación entre el personal asépticamente ataviado y el ambiente operativo. Se
somete a un alto nivel de desinfección antes de su uso en procesos asépticos. Emplea (cuando resulta necesario) interfases des-
contaminadas o puertos RTPpara transferencia de materiales. Permite el ingreso y/o egreso de materiales a través de aberturas
definidas que han sido diseñadas y validadas para evitar la transferencia de contaminación. Si se abre después de la desconta-
minación, su capacidad de desempeño resulta negativamente afectada.
Análisis de Evaluación de Riesgos: Análisis de la identificación de posibles contaminaciones en ambientes controlados que
establecen prioridades según su gravedad y frecuencia y que lleva al desarrollo de métodos y procedimientos para eliminar,
reducir, minimizar o atenuar la probabilidad de contaminación microbiana del sistema de producto/envase/cierre.
Plan de Muestreo: Plan documentado que describe los procedimientos y métodos para muestrear un ambiente controlado;
identifica los sitios de muestreo, la frecuencia de muestreo y el número de muestras, y describe el método de análisis y cómo
interpretar los resultados.
Sitios de Muestreo: Ubicación geográfica documentada, dentro de un ambiente controlado, donde se hace el muestreo pa-
ra evaluación microbiológica. En general, los sitios de muestreo se seleccionan según su potencial de entrar en contacto con el
producto/envase/cierre.
Procedimientos Operativos Estándares: Procedimientos escritos que describen operaciones, pruebas, muestreos, interpreta-
ción de resultados y acciones correctivas relacionadas con las operaciones que tienen lugar en un ambiente controlado y en
ambientes auxiliares. Las desviaciones de los procedimientos operativos estándares deben registrarse y estar aprobadas por los
gerentes responsables.
Campo Estéril o Aséptico: En el procesamiento aséptico o en otros ambientes controlados, es el espacio que está en el mis-
mo plano o encima de los envases abiertos, cierres o el producto en sí, donde es máxima la probabilidad de contaminación
microbiana.
Esterilidad: Según la definición más estricta de esterilidad, un artículo se considera estéril en ausencia absoluta de microorga-
nismos viables. Viable,para organismos, se define como la capacidad para reproducirse. La esterilidad absoluta no puede de-
mostrarse de manera práctica debido a que es técnicamente imposible demostrar una ausencia absoluta. Asimismo, la esterili-
dad absoluta no puede demostrarse de manera práctica sin analizar todos los artículos en una partida. La esterilidad se define
estadísticamente como una probabilidad de que la contaminación de un artículo sea aceptablemente remota.
Hisopos para Muestreo Microbiológico: Dispositivos usados para retirar microorganismos de superficies irregulares o regu-
lares para su posterior cultivo e identificación de población microbiana en la superficie. El hisopo, generalmente formado por
una varilla con un extremo absorbente, se humedece antes del muestreo y se frota a través de un área especificada de la super-
ficie de muestreo. Posteriormente, el hisopo se enjuaga en solución salina estéril para suspender los microorganismos y la solu-
ción se transfiere a un medio de crecimiento para el cultivo de la población microbiana.
Análisis de Tendencias: Datos provenientes de un programa rutinario de monitoreo ambiental microbiano que pueden rela-
cionarse con la hora, turno de trabajo, instalación, etc. Esta información se evalúa periódicamente para establecer el estado o
patrón de dicho programa, con el fin de determinar si se encuentra bajo control adecuado. Un análisis de tendencias se usa
para facilitar la toma de decisiones con respecto a la recalificación de un ambiente controlado o para programas de manteni-
miento y sanitización.
APÉNDICE
ReferenciasAdicionales
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(1117) ÓPTIMASPRÁCTICAS
DE LABORATORIO
MICROBIOLÓGICO
INTRODUCCIÓN
Las buenas prácticas en un laboratorio microbiológico consisten en actividades que dependen de varios principios: técnicas
asépticas, control de medios, control de cepas de prueba, operación y control de equipos, registro detallado y evaluación de
datos así como capacitación del personal de laboratorio. Debido al riesgo inherente de variabilidad de los datos microbiológi-
cos, la confiabilidad y la reproducibilidad dependen de la utilización de los métodos aceptados y del cumplimiento de las bue-
nas prácticas de laboratorio.
PREPARACIÓN
DE MEDIOSY CONTROLDE CALIDAD
Preparación de Medios
Los medios de cultivo constituyen la base de la mayoría de las pruebas microbiológicas. Por lo tanto, es de suma importan-
cia que se proteja la calidad de estos medios a fin de lograr resultados exitosos en el laboratorio microbiológico. La prepara-
ción de los medios, el almacenamiento apropiado y las pruebas de control de calidad pueden asegurar un suministro uniforme
de medios de alta calidad.
Es importante que se elijan correctamente los medios o componentes para generar medios en base al empleo de fuentes o
referencias aceptadas para su formulación. Los medios deshidratados y los medios previamente fabricados generalmente se
acompañan con la fórmula y las instrucciones de preparación provistas por el fabricante. Dado que los distintos tipos de me-
dios pueden tener diferentes requisitos de preparación (p. ej., calentamiento, aditivos y ajustes de pH) es importante seguir
estas instrucciones para asegurar la preparación de medios de calidad aceptable. Un certificado de análisis, donde figuran la
fecha de caducidad y las condiciones recomendadas para almacenamiento, acompaña a los medios prefabricados, como tam-
bién se incluyen organismos de control de calidad empleados para la promoción de crecimiento y pruebas de selectividad para
esos medios.
El agua es el diluyente universal que se emplea en medios microbiológicos. Lo que más se emplea en la preparación de me-
dios es Agua Purificada, aunque en ciertos casos pueda ser apropiado usar agua destilada o desionizada. No se debe usar agua
de menor calidad para la preparación de medios microbiológicos. Se debería registrar el volumen de agua usado.
La preparación uniforme de medios requiere que los medios deshidratados o los constituyentes se pesen con exactitud. Se
debería emplear una balanza calibrada de rango apropiado para pesar los ingredientes. (Ver Pesadaen una BalanzaAnalítica
(1251 )). Se deberían emplear recipientes de pesado y utensilios (tales como espátulas) limpios para evitar que sustancias extra-
ñas se incorporen a la formulación. Se debe llevar un registro del peso de los componentes.
Los medios deshidratados deberían disolverse bien en agua antes de su dispensación y esterilización. Si se necesita calenta-
miento para disolver los medios, se debe tener cuidado de no sobrecalentar puesto que todos los medios de cultivo, en mayor
o menor medida, son sensibles al calor. El equipo a emplearse en la preparación de los medios debería ser el adecuado para
poder controlar el calentamiento, la agitación constante y la mezcla de los medios. Una indicación general de sobrecalenta-
miento es el oscurecimiento de los medios (reacción tipo Maillard, una reacción no enzimática que produce la aparición de un
USP42 Información General/ (1117) Óptimas Prácticas de Laboratorio 7987
color amarronado). Al agregar los suplementos requeridos a los medios, se debe realizar una mezcla adecuada del medio des-
pués del agregado de los suplementos.
La preparación de medios en recipientes de vidrio que no estén completamente limpios puede ocasionar la introducción de
sustancias inhibitorias en los medios. Las sustancias inhibitorias pueden originarse si quedan residuos del detergente después
del lavado de los recipientes de vidrio o a partir de materiales usados previamente en los recipientes. Se recomienda que du-
rante el proceso de limpieza se remuevan todos los materiales de rezago y las sustancias extrañas y que se enjuague bien el
detergente con Agua Purificada. Ver Limpiezade Materialde Vidrio(1051) para obtener guías adicionales.
La esterilización de los medios debería realizarse dentro de los parámetros provistos por el fabricante o validados por el usua-
rio. Los medios preparados comercialmente deberían proveer documentación acerca del método de esterilización empleado.
La técnica de esterilización preferida es el autoclavado por calor húmedo, excepto para casos en los que se requiere ebullición
para evitar el deterioro de los componentes termolábiles de los medios. La esterilización por filtración puede ser también apro-
piada para algunas formulaciones.
Los efectos del método de esterilización y las condiciones en los medios deberían validarse mediante pruebas de esterilidad y
de promoción de crecimiento de los medios. Adicionalmente, si se esterilizan por calor húmedo, el ciclo de autoclave debería
validarse para asegurar la distribución adecuada de calor para cargas y volúmenes seleccionados. Usualmente los fabricantes
recomiendan que se use un ciclo de autoclave de 121 º durante 15 minutos empleando un autoclave validado. Estas condicio-
nes refieren al tiempo en el que el medio permanece a la temperatura indicada. Como el tamaño de recipiente y la configura-
ción de la carga del autoclave influirán en la velocidad del calentamiento, puede que se requieran ciclos más largos para cargas
de mayor tamaño. Sin embargo, el tiempo de esterilización dependerá del volumen de los medios y de la carga del autoclave.
Los ciclos de esterilización en los que el autoclave se calienta despacio puede ocasionar el sobrecalentamiento de los medios.
En consecuencia, se debe tener cuidado al validar un ciclo de esterilización, balanceando la necesidad de obtener un medio
estéril contra la tendencia de los medios a degradarse debido al excesivo calentamiento. Después de que se hayan enfriado, no
se recomienda almacenar medios en el autoclave tras completarse el ciclo líquido, ya que se pueden dañar los medios. El ca-
lentamiento o condiciones de esterilización inadecuados-para medios preparados en el laboratorio o comercialmente-pue-
den originar cambio de color, pérdida de transparencia, alteraciones en la consistencia del gel, variación de pH del intervalo
recomendado por el fabricante, así como una reducción en la actividad y/o selectividad de promoción de crecimiento.
Se debería confirmar el pH de cada lote del medio mediante la extracción aséptica de una muestra para la prueba después
de que se haya enfriado a temperatura ambiente (20º-25º). Si se trata de un medio refrigerado adquirido comercialmente, se
debe confirmar el pH una vez que haya alcanzado la temperatura ambiente. Para superficies de agar, se recomienda usar una
sonda plana para medir el pH y un dispositivo de inmersión para medir los líquidos. Ver pH (791) para obtener pautas sobre la
medición del pH y la calibración del instrumento. El pH de los medios debería estar en un intervalo de ±0,2 del valor indicado
por el fabricante, a menos que el método validado acepte un intervalo mayor.
Los medios preparados deberían comprobarse mediante una inspección adecuada de las placas y los tubos en los siguientes
casos:
• Recipientes y tapas rotos
• Llenado desigual de recipientes
• Deshidratación que genere grietas o hundimientos (hoyuelos) en la superficie de un medio sólido
• Hemólisis
• Oscurecimiento excesivo o cambio de color
• Formación de cristales debido a posible congelamiento
• Cantidad excesiva de burbujas
• Contaminación microbiana
• Estado de indicadores redox (si corresponde)
• Verificación y registro del número y fecha de caducidad del lote
• Esterilidad de los medios
• Limpieza de las placas (las tapas no deben adherirse a la placa)
Almacenamiento de Medios
Es prudente considerar cómo el fabricante o el proveedor transporta y almacena los medios antes de su distribución al usua-
rio final. Los fabricantes de medios deberían manejar los medios bajo condiciones de transporte y almacenamiento que mini-
micen la pérdida de humedad, controlen la temperatura, prevengan la contaminación microbiana y provean de protección
mecánica a los medios preparados.
Se deberían etiquetar adecuadamente los medios con los números de lote, fechas de preparación y de caducidad e identifi-
cación de los mismos. Los medios se deberían almacenar conforme a las instrucciones del fabricante. Los medios preparados
en el laboratorio deberían almacenarse bajo condiciones validadas. No almacenar un agar a temperaturas iguales o bajo Oº ya
que el congelamiento podría perjudicar la estructura del gel. Proteger los medios almacenados de su exposición a la luz y tem-
peraturas excesivas. Antes de un almacenamiento prolongado, se deberían colocar las placas de agar en envases sellados para
retardar la pérdida de humedad.
La fusión de los medios sólidos en su envase original debería realizarse una sola vez para evitar que la calidad de los medios
se deteriore por sobrecalentamiento o posible contaminación. Para volver a fundir se recomienda el uso de un baño de agua
7988 (111 7) Óptimas Prácticas de Laboratorio / InformaciónGeneral USP42
caliente o vapor fluente. Es común que se empleen hornos de microondas y placas de calentamiento, pero se debe tener cui-
dado de no dañar los medios por sobrecalentamiento y de la posibilidad que el personal de laboratorio se lesione por quema-
duras o rotura de cristales. El medio de agar líquido debería colocarse en un baño de agua controlado a una temperatura entre
45º y 50º durante no más de 8 horas. Se debe tener cuidado al verter medios contenidos en un envase sumergido en un baño
de agua para evitar que el agua del baño se mezcle con los medios estériles. Se recomendaría que antes de verter los medios
se seque el exterior del envase.
Para eliminar los medios de cultivo usados (como también los medios vencidos) se deberían seguir los procedimientos de
seguridad de riesgo biológico locales.
Pruebas de Control de Calidad
Mientras que los medios para crecimiento pueden prepararse en un laboratorio a partir de componentes individuales, mu-
chos laboratorios facilitan su tarea usando medios deshidratados o adquiriendo medios comercialmente preparados en placas
de plástico o envases de vidrio. Los fabricantes de medios tratan de estandarizar las materias primas de fuentes biológicas, aun-
que constantemente deben lidiar con las inevitables diferencias provenientes de fuentes naturales y, por ello, se debe tener en
cuenta la variabilidad lote a lote. Además, el desempeño de los medios preparados en un laboratorio o por un fabricante de-
penden, en gran medida, de las condiciones de preparación y almacenamiento. La preparación inadecuada de los medios pue-
de resultar en condiciones no satisfactorias para crecimiento o recuperación microbiana y dar resultados no confiables.
Por lo tanto, las pruebas de control de calidad deberían realizarse a todos los medios preparados, incluidos los medios aso-
ciados con hisopos o medio en tiras y demás formatos no tradicionales. Las pruebas que rutinariamente se realizan en medios
preparados internamente deberían incluir pH, promoción de crecimiento, inhibición y propiedades indicativas (según sea
apropiado), y controles periódicos de estabilidad para confirmar la fecha de caducidad.
Cuando los medios microbiológicos preparados internamente se preparan y esterilizan de forma adecuada empleando un
método validado, las pruebas de promoción de crecimiento pueden limitarse a cada lote de medios deshidratados, a menos
que se especifique algo diferente en el método farmacopeico pertinente. Si el procedimiento de la preparación de medios no
fue validado, cada lote de los medios debería someterse a pruebas de promoción de crecimiento. Se pueden seleccionar orga-
nismos de prueba a partir del capítulo de pruebas farmacopeicas apropiado. Asimismo, los microorganismos usados en la
prueba de promoción de crecimiento pueden basarse en la recomendación del fabricante de un medio en particular o puede
incluirse una muestra ambiental representativa (aunque estos últimos no deben considerarse como requisitos farmacopéicos).
Las fechas de caducidad de los medios deberían fundamentarse en pruebas de promoción de crecimiento para indicar que el
desempeño de los medios todavía cumple con los criterios de aceptación hasta su fecha de caducidad. La vida útil de un lote
de medios dependerá de la estabilidad de sus ingredientes y de la formulación bajo condiciones específicas, así como del tipo
de cierre y del envase.
Cuando un lote de medios no cumple con los requisitos de las pruebas de promoción de crecimiento, se debería iniciar una
investigación para identificar la causa. La investigación debería incluir un plan de acción correctivo para evitar que el problema
se repita. Cualquier partida de medio que no pase la prueba de promoción de crecimiento se considerará inadecuada para su
uso. [NOTA-Resultados fallidos de la prueba de promoción de crecimiento no pueden usarse para invalidar los resultados de
prueba positivos.]
Algunos reactivos se utilizan con fines de diagnóstico para coadyuvar en la identificación de organismos microbianos, p. ej.,
reactivos de tinción de Gram y pruebas de oxidasa. Estos podrían poseer atributos que pueden ser sometidos a controles de
calidad similares a los de los medios microbiológicos. Seleccionar los microorganismos estándares adecuados para realizar
pruebas de control de calidad, siguiendo las instrucciones del fabricante, y realizar las pruebas de control de calidad antes de
realizar una prueba de diagnóstico de una muestra desconocida. Todos los reactivos de diagnóstico pertinentes deberían so-
meterse a una confirmación de calidad de ingreso antes de su uso.
Se debe tener especial cuidado con los medios que se usan en pruebas de esterilidad (ver los requisitos en Pruebasde Esterili-
dad (71 )), así como en estudios de control ambiental. Los medios empleados en el control ambiental de áreas críticas deberían
preferentemente estar protegidos con una doble envoltura y sometidos a esterilización terminal. Si no se realiza la esterilización
terminal, los medios deberían someterse a una preincubación al 100% e inspección antes de emplearlos dentro de un área
crítica. [NOTA-La prueba de promoción de crecimiento para este medio se debe realizar después de la etapa de preincuba-
ción.] Esto evitará que la contaminación con materias extrañas llegue a los ambientes controlados y de ese modo prevendrá la
ocurrencia de resultados positivos falsos. Debería verificarse un nivel elevado del agar en las placas de contacto para superfi-
cies.
MANTENIMIENTO
DE CULTIVOSMICROBIOLÓGICOS
Los especímenes biológicos pueden ser los estándares más delicados para manipular ya que sus características y viabilidad
dependen del almacenamiento y manipulación adecuados. La estandarización de la manipulación y almacenamiento de los
cultivos por parte del laboratorio del usuario debería hacerse de tal modo que se minimice la posibilidad de contaminación o
alteración de las características de crecimiento. El tratamiento uniforme y cuidadoso de los cultivos madre es vital para lograr la
uniformidad de los resultados de las pruebas microbiológicas. Los cultivos que se empleen en pruebas farmacopeicas deberían
adquirirse de una colección nacional de cultivos o de un proveedor secundario calificado. Se los puede adquirir congelados,
tt
USP42 Información General/ (1117) Óptimas Prácticas de Laboratorio 7989
liofilizados, en tubos con medio inclinado o en formas listas para ser usadas. La confirmación de la pureza del cultivo y la iden-
tidad del mismo debería realizarse antes de su uso en pruebas de control de calidad. Los cultivos listos para usar deberían so-
meterse a pruebas de pureza e identidad de ingreso antes de su uso. La confirmación de identidad de cepas que se usan con
mucha frecuencia en los laboratorios debería idealmente realizarse al nivel de análisis de género y especie.
La preparación y resucitación de los cultivos deberían hacerse siguiendo las instrucciones del proveedor o mediante el em-
pleo de un método establecido y validado. Se recomienda la técnica de "Lote de Siembra" ("Seed-Lot") para el almacenamien-
to de los cultivos madre.
La muestra original de la colección nacional de cultivos o de un proveedor secundario calificado se resucita y se hace crecer
en un medio adecuado. Las alícuotas de este cultivo madre (la primera transferencia o pasaje) se suspenden en un medio crio-
protector, se transfieren a viales y se congelan a -30º o una temperatura más baja hasta su uso. Si se almacenan a -70º, o en
formas liofilizadas, las cepas pueden guardarse indefinidamente. Estos cultivos madre congelados luego se emplean para ino-
cular los cultivos de trabajo mensual o semanalmente. Una vez abiertos, no volver a congelar las suspensiones de células que
no se usaron después de hacer un cultivo en una suspensión de trabajo. Se debería descartar la porción no usada para minimi-
zar el riesgo de pérdida de viabilidad y la contaminación del cultivo madre.
Se debería hacer seguimiento del número de transferencias de los cultivos de control de trabajo para evitar el exceso de
subcultivos que incrementa el riesgo de la alteración fenotípica o mutación. El número de transferencias permisibles para prue-
bas farmacopéicas específicas se puede especificar en dicha prueba. Un pasaje se define como la transferencia de los organis-
mos desde un cultivo viable a un medio fresco con crecimiento de microorganismos. Toda forma de subcultivo se considera
una transferencia o pasaje.
EQUIPOSDE LABORATORIO
La mayor parte de los equipos (incubadoras, baños de agua y autoclaves) está sujeta a las prácticas estándares de calificación
de instalación, operación y desempeño. Además es común requerir una calibración periódica (generalmente cada año). Los
equipos nuevos, vitales para la operación del laboratorio, deberían calificarse para cumplir con lo estipulado por un protocolo
aprobado por la unidad de garantía de calidad (QAU, por sus siglas en inglés). Asimismo, se debería llevar a cabo la limpieza y
sanitización regular del equipo, por ejemplo incubadoras, refrigeradores y baños de agua, a fin de minimizar la posibilidad de
contaminación en el laboratorio. Los sellos de las puertas de las incubadoras y refrigeradores deben limpiarse y revisarse para
determinar si necesitan de reparaciones.
Los instrumentos (medidores de pH y espectrofotómetros) empleados en un laboratorio microbiológico deberían calibrarse
con regularidad y probarse para verificar en forma rutinaria su funcionamiento. La frecuencia de la calibración y la verificación
del desempeño variarán según el tipo de instrumento y la importancia de ese equipo en la generación de datos en el laborato-
rio.
Los equipos que son difíciles de sanitizar (p. ej., refrigeradores e incubadoras) se deberían destinar exclusivamente a opera-
ciones asépticas (tales como almacenamiento de los medios para análisis o incubación de muestras para pruebas de esterili-
dad) u operaciones de cultivos vivos para minimizar la posibilidad de contaminación involuntaria de las pruebas.
Los autoclaves son elementos centrales para la operación del laboratorio y deben contar con validación apropiada para de-
mostrar la esterilización adecuada de una variedad de operaciones. Los autoclaves deben estar disponibles (y validados) para
esterilizar los medios usados (si dicha esterilización se realizara en el laboratorio), así como los medios preparados en ese labo-
ratorio. La selección de uno o varios autoclaves no debe regirse por la necesidad de separar las operaciones en asépticas y no
asépticas (todo lo que se mantiene adecuadamente en el autoclave es estéril después del ciclo) sino considerando la disponibi-
lidad de recursos (ver a continuación).
DIAGRAMADELLABORATORIO
Y OPERACIONES
En el diagrama y diseño del laboratorio se deberían tener en cuenta los requisitos de buenas prácticas de microbiología y de
seguridad del laboratorio. Es esencial que se trate de minimizar en lo posible la contaminación cruzada de los cultivos micro-
biológicos y es también importante que las muestras microbiológicas se manipulen en un medio ambiente donde se evite la
contaminación.
En general, un laboratorio debería estar dividido en áreas limpias o asépticas y áreas de cultivos vivos. En lo posible, las áreas
donde se manejan e incuban muestras de productos estériles o ambientales deberían mantenerse completamente libres de cul-
tivos vivos. Si no se puede tener una separación completa entre las zonas de cultivos vivos y las zonas limpias, se deberían
emplear otras barreras o prácticas asépticas para reducir la posibilidad de contaminación accidental. Estas barreras incluyen
vestimentas de protección, procedimientos para sanitizar y desinfectar así como cabinas de seguridad biológica designadas so-
lo para operaciones limpias o asépticas. Se debería disponer de procedimientos para manejar derrames o percances con culti-
vos vivos y todo el personal técnico pertinente debería entrenarse en cuanto a la aplicación de estos métodos.
Algunas muestras demostrarán crecimiento microbiano y requerirán de análisis de laboratorio adicionales para identificar los
contaminantes. Cuando se detecta crecimiento, sin demora se debería trasladar la muestra de la sección limpia del laboratorio
a la sección de cultivos vivos. Los subcultivos, las tinciones, la identificación microbiana u otras operaciones investigativas de-
berían llevarse a cabo en la sección de cultivos vivos del laboratorio. En lo posible, no se deberían abrir muestras que canten-
7990 (1117) Óptimas Prácticas de Laboratorio / Información General USP42
gan colonias de crecimiento en las zonas limpias del laboratorio. La separación cuidadosa de materiales y muestras contamina-
das reducirá la posibilidad de obtener resultados positivos falsos.
El personal que trabaja con muestras no debería entrar o trabajar en la sección de manejo de cultivos vivos del laboratorio, a
menos que se observen precauciones específicas, tales como el uso de vestimentas y guantes de protección y desinfección mi-
nuciosa de manos al salir del área de trabajo. Lo ideal es que el personal asignado para llevar a cabo muestreos, especialmente
quienes están dedicados al procesamiento aséptico, no trabajen en áreas adyacentes donde se realizan las operaciones de labo-
ratorio para cultivos vivos.
Es importante considerar que la contaminación microbiana de muestras es siempre posible, en particular aquella que origina
falsos positivos, a menos que se tomen las debidas precauciones de asepsia. Las instalaciones deberían estar diseñadas de tal
manera que las muestras de excipientes y materias primas puedan hacerse bajo condiciones controladas, incluyéndose el uso
de vestimentas adecuadas y equipos esterilizados para muestreo. Puede ocurrir que no siempre se puedan llevar a cabo mues-
treos de sistemas, tales como los sistemas de agua, bajo condiciones de total asepsia. Sin embargo, se debería tener en cuenta
que cuando las muestras no se toman asépticamente inevitablemente su confiabilidad es dudosa.
Los métodos de muestreo ambiental deberían requerir una manipulación aséptica mínima durante la carga y descarga de los
instrumentos de muestreo. Cuando sea posible, el equipo de muestreo debería cargarse con el medio microbiológico de recu-
peración en el ambiente donde se realizará el muestreo.
Todas las pruebas de laboratorio que se usan para los procedimientos de prueba de mayor importancia, tales como las prue-
bas de esterilidad de las formas farmacéuticas finales, las de productos a granel, las de siembras de cultivo para producción
biológica o para cultivos de células que se emplean en producción biológica, deberían realizarse bajo condiciones controladas.
La tecnología de los aisladores también es adecuada para las pruebas microbiológicas estériles de mayor importancia. Los aisla-
dores han demostrado tener menores niveles de contaminación ambiental que los cuartos limpios con personal en ellos y, en
consecuencia, existe por lo general menor posibilidad de generar falsos positivos. Es crucial hacer la validación adecuada de
aisladores tanto para asegurar la integridad ambiental como para prevenir la posibilidad de generar falsos negativos como re-
sultado de la desinfección química de materiales que se ingresan o usan dentro de los aisladores (ver Pruebasde Esterilidad-
Validación de SistemasAisladores(1208>).
MANIPULACIÓNDE MUESTRAS
Los microorganismos viables en la mayoría de las muestras microbiológicas, particularmente muestras de agua, monitoreo
ambiental y biocarga, son sensibles a las condiciones de manipulación y almacenamiento. Los parámetros críticos en estas con-
dicoines incluyen la composición del producto (o muestra), composición del recipiente, tiempo de almacenamiento y tempe-
ratura de almacenamiento. Por lo tanto, es importante minimizar el tiempo entre el muestreo y el inicio de la prueba y contro-
lar, en la medida de lo posible, las condiciones de almacenamiento. Si la muestra va a ser transportada a un lugar distante para
su análisis, entonces se deberían calificar las condiciones de transporte (tiempo, temperatura, etc.) adecuadas para dicha prue-
ba y muestra. Se pueden encontrar pautas para el análisis de agua con relación a este tema en Aguapara UsosFarmacéuticos
(1231 ). Puede ser necesario evaluar el mezclado del producto y realizarlo antes del muestreo a fin de asegurar la dispersión de
los microorganismos y la representatividad de la alícuota de muestra.
Todas las muestras microbiológicas se deberían tomar usando técnicas asépticas, incluyendo aquellas tomadas de productos
no estériles. De ser posible, todas las muestras microbiológicas se deben tomar en condiciones absolutamente asépticas en
áreas de muestreo especializadas. Estas áreas deberían estar tan cerca como sea posible del lugar donde se van a usar para
minimizar la contaminación durante el traslado.
Las muestras entregadas al laboratorio microbiológico deberían estar acompañadas por documentación que detalle el origen
de la muestra, la fecha en que se tomó la muestra, la fecha de entrega de la muestra, la persona o departamento responsable
de la entrega y cualquier material potencialmente peligroso asociado con la muestra. El departamento de análisis debería acu-
sar recibo de la muestra y corroborar la identidad y número de muestras como parte de esta documentación.
TIEMPOSDE INCUBACIÓNDE MEDIOSMICROBIOLÓGICOS

Los tiempos de incubación para pruebas microbiológicas de menos de 3 días de duración se deberían expresar en horas: p.
ej., "Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 18 a 72 horas". Las pruebas con una duración mayor de 72 horas se
deberían expresar en días: p. ej., "Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante 3 a 5 días". Para tiempos de incubación
expresados en horas, incubar durante el tiempo mínimo especificado y ejercer buen criterio microbiológico cuando sea nece-
sario exceder el tiempo de incubación. Para tiempos de incubación expresados en días, las incubaciones iniciadas en la maña-
na o después del medio día deberían concluirse generalmente a la misma hora del día.
CAPACITACIÓN
DELPERSONAL
Cada persona involucrada en cualquiera de las fases de fabricación farmacéutica debería poseer la educación, la capacitación
y la experiencia necesarias para cumplir con su trabajo. Las exigencias de las pruebas microbiológicas requieren que los opera-
USP42 InformaciónGeneral/ (1117) Óptimas Prácticas de Laboratorio 7991
rios, supervisores y gerentes tengan una previa y sólida educación en microbiología o en otro campo científico vinculado a la
biología. Se les debería asignar responsabilidades acordes a su nivel de capacitación y experiencia.
Es necesario mantener un sistema coherente de procedimientos operativos estándares (POE) para el funcionamiento del la-
boratorio microbiológico. Estos procedimientos sirven para lograr dos finalidades en un programa de capacitación. En primer
lugar, estos POE describen la metodología que los microbiólogos seguirán para obtener resultados reproducibles y precisos y
que, a la vez, sirvan de base para la capacitación. En segundo lugar, registrando los procedimientos que domina un microbió-
logo en particular, el número o título del procedimiento sirve también para identificar el tipo de capacitación específica de su
trabajo, que haya recibido el microbiólogo.
Se deberían establecer programas de capacitación para cada miembro del laboratorio teniendo en consideración sus funcio-
nes laborales. El personal del laboratorio no debería realizar pruebas microbiológicas en forma independiente hasta estar capa-
citado para llevarlas a cabo. El historial de capacitación debe estar al día, documentando el entrenamiento del microbiólogo en
la revisión vigente de cada POE en particular.
Una evaluación periódica del desempeño del personal es una sabia inversión en la calidad de datos. Esta evaluación de de-
sempeño debería generar evidencia sobre la competencia en las actividades principales de los laboratorios microbiológicos, ta-
les como higiene, siembra en placas, técnicas asépticas, documentación y otras áreas vinculadas a la función del microbiólogo.
Los microbiólogos con responsabilidades gerenciales o de supervisión deberían tener una educación apropiada para tal car-
go y la capacitación, provista por su empleador, en habilidades de supervisión, medidas de seguridad laboral en el laboratorio,
planificación, presupuesto, investigación, redacción de informes técnicos, en los POE pertinentes y demás aspectos de impor-
tancia referentes a los procesos de la empresa cuando los mismos estuviesen vinculados a funciones directivas de un laborato-
rio.
La competencia se puede demostrar mediante trabajos específicos, experiencia pertinente y capacitación profesional conti-
nua. Conseguir una certificación a través de un organismo acreditado constituye también una acreditación deseable. Además,
se espera que los supervisores y gerentes de laboratorio cuenten con un nivel demostrado de competencia en microbiología
que sea al menos tan alto como el de las personas a quienes supervisan. La pericia en microbiología se puede lograr a través de
diversas rutas adicionales a los estudios académicos y a la acreditación. Se espera que cada compañia evalúe las acreditaciones
de aquellos responsables del diseño, implementación y operación del programa microbiológico. Las compañías pueden, por lo
tanto, asegurar que aquellos responsables del programa comprendan los principios básicos de microbiología, que puedan in-
terpretar las pautas y reglamentaciones con el soporte científico adecuado, y que tengan acceso a individuos con conocimien-
to teórico y práctico en microbiología que les provea de asistencia en áreas en las que no contaran con el conocimiento y
comprensión adecuados. Se debe tener en cuenta que la microbiología es una disciplina científica que trata con principios bio-
lógicos que son muy diferentes de aquellos relacionados con la química analítica e ingeniería. En muchas ocasiones es difícil
para los individuos sin capacitación microbiológica específica llevar a cabo la transición.
RECURSOSDELLABORATORIO
La gerencia del laboratorio es responsable de asegurar que el laboratorio cuente con los recursos suficientes para cumplir
con los requisitos de análisis existentes. Esto requiere habilidad en la administración presupuestaria y en determinar las medi-
das apropiadas de desempeño del laboratorio. Una medida del desempeño del laboratorio es el número de investigaciones
realizadas en las pruebas que se llevan a cabo en el laboratorio, pero esta medición por sí sola no es suficiente. Además del
registro de investigaciones, se debería conocer el periodo entre la entrega de la muestra y el inicio de la prueba, así como el
periodo entre la finalización de la prueba y la emisión del informe (o cierre de la prueba). Los retrasos importantes que de-
muestran estas mediciones también son indicativos de un personal de laboratorio con escasez de recursos.
La gerencia del laboratorio debería tener un presupuesto suficiente para cumplir con los requisitos de análisis. Las medicio-
nes particulares de los requisitos presupuestarios serán específicos para un laboratorio dado, pero las consideraciones presu-
puestarias que se relacionan directamente con la necesidad del laboratorio de contar con recursos suficientes se deben tratar
para asegurar resultados de prueba confiables.
DOCUMENTACIÓN
Se debería contar con suficiente documentación para demostrar que la prueba fue hecha en un laboratorio y que se emplea-
ron métodos adecuados. Esto incluye, pero no se limita, a la siguiente documentación:
• Capacitación de microbiólogos y verificación de competencia
• Validación, calibración y mantenimiento de equipos
• Desempeño de equipos durante la prueba (p. ej., registradores gráficos de 24 horas/7 días a la semana)
• Preparación de medios, controles de esterilidad, promoción de crecimiento y capacidad de selectividad
• Inventarios de los medios y pruebas de control
• Aspectos críticos de las pruebas realizadas según lo especifica un procedimiento
• Verificación de datos y cálculos
• Informes revisados por la unidad de garantía de calidad (QAU) o por un gerente responsable calificado
• Investigación de desviaciones de datos (cuando sea necesario)
7992 (111 7) Óptimas Prácticas de Laboratorio / Información General USP42
MANTENIMIENTO
DE LOSREGISTROS
DELLABORATORIO
Es crucial que se mantengan registros adecuados de datos y estudios para el óptimo funcionamiento del laboratorio micro-
biológico. El principio fundamental es que la prueba se lleve a cabo siguiendo la descripción del POE, que éste esté escrito de
manera que refleje cómo realmente se realiza la prueba y que el cuaderno del laboratorio suministre todos los detalles de ma-
yor importancia para reconstruir los detalles del análisis y para confirmar la integridad de los datos. Como mínimo, un informe
de laboratorio debería incluir lo siguiente:
• Fecha
• Material analizado
• Nombre del microbiólogo
• Número de procedimiento
• Registro de los resultados de la prueba
• Desviaciones (si se presentaran)
• Parámetros documentados (equipos usados, cultivos microbiológicos madre usados, lotes de los medios usados)
• Firma de la segunda revisión/Gerencia
Cada pieza crítica de equipo debería figurar en el informe y además todo debería estar bajo un plan de calibración, docu-
mentado en un POE y un libro de registro de mantenimiento. Según los casos, se debería contar con registros o formularios
que respalden los registros del cuaderno del laboratorio. Las temperaturas de los equipos (baños, incubadoras, autoclaves) de-
berían registrarse y ser rastreables.
En el informe se debería incluir en forma explícita el POE vigente y todas sus revisiones. Los cambios en los datos deberían
tacharse con una línea e incluir las iniciales. No se debería borrar ni usar correctores para cubrir los datos originales.
Los resultados de las pruebas deberían incluir el recuento original en placas para permitir que el revisor pueda reproducir los
cálculos usados para obtener los resultados finales. Los métodos para el análisis de datos deberían detallarse en los POE que se
citan. Si se incorporan tablas o gráficas en los cuadernos de laboratorio, estos deben asegurarse con cinta transparente y no
deben obstruir ningún dato de la página. La tabla o gráfica debe estar firmada por la persona que agrega el documento, con
la firma sobrepuesta en la página de la tabla y en el cuaderno. Los cuadernos del laboratorio deberían incluir número de pági-
na, un índice para referencia y un cronograma de uso intacto.
Se deberían archivar todos los registros de laboratorio y protegerlos contra pérdidas catastróficas. Se debe establecer un pro-
grama formal de retención y recuperación de registros.
INTERPRETACIÓN
DE LOSRESULTADOS
DE LASVALORACIONES
Los resultados de las valoraciones microbiológicas analíticas pueden ser de difícil interpretación debido a varias razones im-
portantes: (1) Los microorganismos se encuentran en todas partes y los contaminantes ambientales comunes, particularmente
los organismos asociados al ser humano, predominan en muchos tipos de análisis microbiológicos; (2) el analista corre el ries-
go de introducir organismos contaminantes durante la manipulación de la muestra o durante el procesamiento de la misma en
el laboratorio; (3) los microorganismos pueden no estar distribuidos en forma homogénea dentro de una muestra o ambiente;
y (4) las valoraciones microbiológicas están sujetas a una considerable variación respecto a sus resultados. Por lo tanto, diferen-
cias aparentes de un resultado esperado puede que no sean importantes.
Debido a estas características de los análisis microbiológicos, los estudios de laboratorio deberían llevarse a cabo con la ma-
yor precaución posible para evitar la contaminación exógena, como se discutió previamente en este capítulo. Igualmente im-
portante es que los resultados se interpreten a partir de una perspectiva microbiológica amplia que tenga en cuenta no solo la
naturaleza del contaminante putativo sino también la posibilidad de que ese organismo u organismos sobrevivan en el ingre-
diente farmacéutico, el excipiente o el ambiente en análisis. Además, las características de crecimiento del microorganismo de-
berían tenerse en cuenta (especialmente en lo que se relaciona al crecimiento de hongos filamentosos en medios líquidos).
Cuando se observan resultados que no se ajustan a una monografía farmacopeica o a otros criterios de aceptación conoci-
dos, es necesario llevar a cabo una investigación en la desviación de los datos microbianos (MDD, por sus siglas en inglés).
Existen generalmente dos razones diferentes para la observación de contaminación microbiana que no cumple con un requisi-
to u objetivo: existe un error de laboratorio o condiciones ambientales de laboratorio que generaron un resultado inválido o el
producto contiene un nivel de contaminación o tipos específicos de contaminantes fuera de los niveles o de los límites estable-
cidos. En cualquiera de los casos, la gerencia del laboratorio y, en la mayoría de los casos, la Unidad de Calidad deberían ser
notificadas de inmediato.
Se debería realizar una evaluación integral y completa de la situación del laboratorio en que se origina el resultado. Todas las
condiciones microbiológicas o los factores que pudieran generar la condición observada deberían tenerse en cuenta, incluyén-
dose la magnitud de la detección comparada con los límites o niveles establecidos. Asimismo, se puede requerir de un estima-
do de la variabilidad del ensayo para determinar si el hallazgo es significativo.
El ambiente de laboratorio, las condiciones de protección establecidas para el muestreo, los hallazgos históricos del material
en análisis y la naturaleza del material, especialmente en lo relacionado con la supervivencia de los microbios o la proliferación
de los mismos al producirse contacto con el material, se deberían considerar en la investigación. Adicionalmente, entrevistas a
los analistas de laboratorio pueden suministrar información respecto a cómo realmente se realizó la valoración, pudiendo ser
de gran valor para determinar la confiabilidad del resultado y proseguir con la acción adecuada. Si se identifica que las opera-
USP42 Información General/ (1118) Dispositivos de Monitoreo 7993
dones de laboratorio fueron la causa del resultado anómalo de la prueba, se debería establecer un plan de acción correctiva
para solucionar el problema o los problemas. Luego de aprobado e implementado el plan de acción correctivo, se debería ha-
cer un seguimiento cuidadoso de la situación y determinar si la acción correctiva es la adecuada.
Si se invalidan los resultados de la valoración con base al hallazgo de un error atribuible, esta acción se debe documentar.
Los laboratorios también deberían tener procedimientos aprobados para pruebas confirmatorias (repetición de la prueba) y, si
fuera necesario, para nuevos muestreos cuando las guías farmacopeicas o regulatorias específicas no reglamentan la forma de
realizar la investigación de una valoración.
(1118) DISPOSITIVOSDE MONITOREO-TIEMPO, TEMPERATURA

Y
HUMEDAD
INTRODUCCIÓN
Este capítulo contiene información general sobre la ciencia y tecnología del monitoreo de la temperatura y humedad con el
transcurso del tiempo. En él se describen las tecnologías existentes y sus características de funcionamiento y se proporcionan
recomendaciones para la calificación del funcionamiento. La vida útil de un medicamento depende de las condiciones de tem-
peratura y humedad durante el almacenamiento y transporte, así como de las propiedades químicas y físicas del medicamen-
to. Por esta razón, es importante poder monitorear dichas condiciones durante el transporte y almacenamiento de medica-
mentos sensibles a la temperatura y a la humedad. Este capítulo se enfoca estrictamente en los dispositivos de monitoreo de
temperatura y humedad tanto electrónicos como químicos de la cadena de distribución.
Las temperaturas de almacenamiento y distribución pueden ser diferentes cuando se justifique mediante estudios apropia-
dos de estabilidad y conforme se indica en el etiquetado. Los efectos de la humedad a menudo se observan durante los perio-
dos más largos de exposición, a diferencia de los efectos de la temperatura, debido a las barreras contra el ingreso de hume-
dad presentes en el envasado primario y secundario del medicamento.
Los dispositivos descritos en este capítulo son los de uso más común para monitorear el almacenamiento controlado y la
distribución establecida de medicamentos siguiendo las Buenas Prácticas de Distribución (BPD).1 Este capítulo no trata la medi-
ción de temperaturas extremas, las cuales se definen como temperaturas que están por encima de los niveles a los que se ex-
pondrían los medicamentos en la cadena de distribución. Los tipos de dispositivos descritos en este capítulo se usan actual-
mente a nivel mundial en la distribución de productos farmacéuticos, así como en otras industrias similares que requieren de
controles de temperatura durante la distribución (por ejemplo, las industrias de alimentos perecederos, componentes sanguí-
neos y dispositivos médicos). Algunos de estos dispositivos se pueden colocar en artículos individuales para el usuario final (por
ejemplo, en los viales de vacunas del programa de inmunización mundial de la Organización Mundial de la Salud (OMS)/
UNICEF).2 Se deben seguir prácticas adecuadas de reciclaje para todos los dispositivos conforme a lo requerido por las normas
locales.
DISPOSITIVOSDE MEDICIÓNDE TEMPERATURA
Termómetros de Alcohol o Mercurio
Estos dispositivos se basan en la variación del volumen de un líquido en función de la temperatura. Ambos tipos de termó-
metros pueden estar diseñados para indicar temperaturas máximas y mínimas (ver el capítulo Advertenciasy RequisitosGenera-
les, 6.80.30. Dispositivosde Mediciónde Temperaturapara más información). Históricamente, estos tipos de termómetros se
usan más en ambientes de laboratorio o farmacia que durante el monitoreo de la cadena de distribución. Los termómetros de
alcohol pueden tener una precisión de hasta 0,01 º, pero deben ser bastante grandes para poder medir temperaturas compren-
didas en intervalos de más de unos pocos grados.
Normalmente, los termómetros de mercurio se utilizan en un intervalo de temperaturas de Oº a 50°, con una precisión de
aproximadamente O,1º. Los termómetros de mercurio están sujetos a ciertas reglamentaciones locales, y muchos estados y de-
pendencias locales han legislado o desarrollado programas de recolección o intercambio de dispositivos que contienen mercu-
rio. La Agencia de Protección Ambiental de los EE.UU.(U.S. Environmental Protection Agency) también emite reglamentacio-
nes que requieren a la industria reducir la liberación de mercurio en el aire y en el agua, así como tratar y eliminar adecuada-
mente los desechos de mercurio para evitar riesgos potenciales para la salud. 3 La organización Salud Sin Daño y la OMS colide-
ran una Iniciativa Mundial Conjunta de Reemplazo de Productos para el Cuidado de la Salud (Health Care lnitiative Products
1
PDA Technical Report 52 (TR 52) Guidance for Good Distribution Practices (GDPs) For the Pharmaceutical Supply Chain.
2 World Health Organization (WHO)-UNICEF
Policy Statement on the lmplementation of Vaccine Vial Monitors: The Role of Vaccine Vial Monitors in lmproving
Access to lmmunization, http://whqlibdoc.who.int/hq/2007/WHO_IVB_07.04_eng.pdf.
3
http://www.epa.gov/espanol/mercurio/.
7994 (1118) Dispositivos de Monitoreo / Información General USP42
Partnership) para reducir la demanda de dispositivos que contienen mercurio en al menos 70% para el 2017 y para trasladar la
producción hacia alternativas sin mercurio exactas, económicas y más seguras. 4
Los termómetros de alcohol y mercurio son más frágiles que los otros dispositivos de medición de temperatura descritos en
este capítulo.
DispositivosInfrarrojos
Estos dispositivos se usan para medir el calor radiante infrarrojo (IR) del artículo cuya temperatura se desea medir. La lectura
IRvaría en función de la temperatura del objeto. La ventaja de este tipo de dispositivos es que el artículo puede estar a cierta
distancia del sensor IR. Los dispositivos IR pueden proveer lecturas de temperaturas inexactas que son más altas o más bajas a
las reales debido a las características superficiales de los empaques (p. ej., superficies negras en comparación con superficies
blancas), además del error potencial por parte del operador debido al uso incorrecto del lector IR (ángulo impropio).
Termómetros de Resistencia
El termómetro de resistencia (RTD, por sus siglas en inglés) se basa en el cambio en la resistencia eléctrica de un material en
función de la temperatura. Su precisión y exactitud dependen de la calidad de los componentes electrónicos utilizados para
medir la resistencia. Aunque los termómetros de resistencia se encuentran entre los sensores de temperatura más estables y
exactos, su exactitud puede variar con el tiempo y la temperatura del dispositivo debido a que sus componentes electrónicos
se ven afectados por el tiempo y el uso. Aunque todos los dispositivos de medición de la temperatura deben situarse en un
programa de calibración apropiado, según lo recomendado por el fabricante o lo determinado por el usuario del dispositivo,
esta calibración es de particular importancia para los termómetros de resistencia.
Dispositivosde EstadoSólido
Los dispositivos de estado sólido se basan en el efecto de la temperatura sobre un circuito integrado (ver Termistor)o sobre
un sistema micromecánico o microeléctrico. Estos dispositivos comúnmente se denominan registradores de datos y pueden
alcanzar una alta precisión y además, tienen la ventaja de producir un registro digital.
Termistores
Un termistor es un dispositivo basado en semiconductores, cuya resistencia varía en función de la temperatura. Los termisto-
res pueden detectar variaciones muy pequeñas de temperatura y son exactos en intervalos de temperatura muy amplios.
Termopares
Los termopares se basan en la variación de potencial en la unión de dos metales diferentes en función de la temperatura.
Pueden utilizarse una gran variedad de pares de metales diferentes, y cada par permite obtener un intervalo, exactitud y preci-
sión propios. La precisión y exactitud dependen de la calidad de los componentes electrónicos utilizados para medir el voltaje
entre ambos metales y del tipo de referencia térmica utilizada.
DispositivosTermomecánicos
Los dispositivos termomecánicos se basan en la variación de longitud de un material sólido en función de la temperatura. Un
ejemplo de estos dispositivos es un resorte mecánico, el cual se dilata o se contrae en función de la temperatura y, de esta
forma, abre y cierra un circuito eléctrico o mueve la pluma de un graficador. Los ejemplos típicos son los registradores gráficos
usados en cuartos fríos.
REGISTRADORES
ELECTRÓNICOS
DE HISTORIALDE TIEMPO-TEMPERATURA
Estos registradores usan una de las tecnologías electrónicas de medición de temperatura antes descritas y crean un historial
de la temperatura experimentada.
IndicadoresElectrónicosde Tiempo y Temperatura
Los indicadores electrónicos de tiempo y temperatura (ITT) pueden diseñarse para emitir una alarma por exceso de frío, por
exceso de calor o por desviaciones múltiples de temperatura, y pueden proveer una alarma visual mediante una luz de color o
una pantalla de cristal líquido. Por lo general, las alarmas son programables y pueden mostrar condiciones tales como fecha,
4
http://www.noharm.org/salud_sin_danio/.
USP42 InformaciónGeneral/ (1118) Dispositivos de Monitoreo 7995
tiempo, temperatura y duración de la alarma. Los certificados de calibración se emiten para unidades individuales o lotes. Los
dispositivos de usos múltiples deben contar con un programa de calibración, aunque se puede confiar en los certificados de
calibración de los fabricantes para los dispositivos de un solo uso.
RegistradoresElectrónicospara Datos de Temperatura
Los registradores electrónicos para datos de temperatura son registradores que monitorean la temperatura a intervalos pro-
gramables y transfieren el historial de temperatura a un sistema periférico, como por ejemplo una computadora personal. Asi-
mismo, los registradores de datos pueden registrar la humedad usando los sensores que se describen a continuación. Los regis-
tradores electrónicos monitorean y guardan los valores de temperatura representativos del historial de temperatura acumulado
durante un cierto periodo y, por consiguiente, tienen la ventaja de poder calcular la temperatura cinética media (MKT,por sus
siglas en inglés)5 basándose en las mediciones. Los registradores de datos equipados con dispositivos de transmisión (transmi-
sión por radio o cableado) pueden utilizarse para monitorear la temperatura y la humedad de un producto en tránsito, y pue-
den descargar los datos registrados cuando el registrador de datos ha llegado a su destino. Existe una creciente demanda por
parte de los ministerios de salud a nivel mundial para el uso de registradores de datos como parte de un sistema de calidad
estándar para buenas prácticas de distribución. Basándose en sus capacidades de comunicación, los registradores de datos
pueden clasificarse en distintas categorías.
Registradoresde Datos con Radiotransmisores
Además de los registradores de datos que requieren una conexión con cableado a una unidad de base o computadora, re-
cientemente las compañías han adaptado registradores inalámbricos (radiofrecuencia o con capacidad de radiofrecuencia) de
temperatura y humedad. Se ha demostrado a través de estudios variados sobre sangre, componentes sanguíneos, anticuerpos
monoclonales y vacunas, que el uso de identificación por radiofrecuencia (RFID)no tiene ningún efecto sobre los productos
biológicos.• Estos registradores contienen chips con capacidad de comunicación inalámbrica que constituyen las etiquetas
(tags) del sensor de identificación por radiofrecuencia. El chip de identificación por radiofrecuencia que está dentro de la eti-
queta puede ser activo, lo cual requiere energía de una batería para su operación, o pasivo, lo cual requiere un campo de
radiofrecuencia diferente de cero creado por la unidad interrogadora RFID(que comúnmente recibe el nombre de lector) en
las inmediaciones de la etiqueta. Las etiquetas del sensor con capacidad de identificación por radiofrecuencia (temperatura y/o
humedad) tienen la capacidad adicional de transmitir el historial de temperatura registrado de forma inalámbrica a una com-
putadora central o a una base de datos para el procesamiento remoto continuo. Existen múltiples estándares activos y pasivos
para controlar la comunicación entre la etiqueta y la unidad central, entre las que se incluyen: ISO-l 8000-6C,' ISO-18000-7, 8
ZigBee,9 IEEE802.11, 10 y muchos estándares particulares.
Al seleccionar entre tecnologías activas y pasivas, es necesario tener presente que las tecnologías activas por lo general pro-
veen un rango extenso de comunicación y capacidad de memoria a cambio de un costo más elevado. En la actualidad, los
rangos de lectura se extienden hasta 100 metros y el uso de repetidores permite abarcar mayores distancias. Sin importar si el
sistema de circuitos para comunicaciones es pasivo o activo, estos registradores de radiofrecuencia siguen siendo registradores
electrónicos de temperatura, lo que significa que el sistema de circuitos emplea energía externa provista por baterías u otras
fuentes.
Se ha desarrollado una etiqueta de identificación por radiofrecuencia inalámbrica completamente pasiva con una antena ca-
paz de funcionar como sensor. La etiqueta emplea estructuras de antena resonantes de etiquetas RFIDrecubiertas con películas
específicas para sensores. Las etiquetas pasivas inalámbricas de RFIDactúan como sensores análogos que, cuando son interro-
gados por un lector inalámbrico, muestran la temperatura instantánea. La película cambia las características de reflexión de la
antena basándose en la variable ambiental monitoreada (tal como temperatura y/o humedad), que es posteriormente decodi-
ficada por el lector. La película del sensor se puede diseñar para que trabaje con diferentes variables tales como temperatura,
humedad y diversos vapores de gas y químicos. Aunque no tienen la misma funcionalidad de memoria de los registradores
electrónicos, los sensores inalámbricos pasivos son económicos en comparación con los registradores de datos y se pueden
considerar para aplicaciones al nivel de los artículos.
5 The Use of Mean

Kinetic Temperature (MICT) in the Handling, Storage, and Distribution of Temperature Sensitive Molecules. R. H. Seevers, J. Hofer, P. Haber, D.
A. Ulrich, R. Bishara. Pharmaceutical Outsourcing, May/June, 30-37, 2009.
6
Effects of Radio Frequency ldentification-Related Radiation on In Vitro Biologics. l. Uysal, C. Hohberger, R. S. Rasmussen, D. A. Ulrich, J. P. Emond, A. Gutierrez.
PDA Joumal of Pharmaceutical Science and Technology, Vol. 66(4), July/Aug, 333-345, 2012.
7
ISO/IEC 18000-6:2010-lSO/IEC 18000-6:2010-lnformation technology-
Radio frequency identification for item management-Part 6: Parameters for air interface communications at 860 MHz to 960 MHz.
8
ISO/IEC 18000-7:2009-lnformation technology-Radio frequency identification for item management-Part 7: Parameters for active air interface communications
at433MHz.
9
IEEE802.15.4-Wireless Medium Access Control (MAC) and Physical Layer (PHY) Specifications for Low-Rate Wireless Personal Area Networks (LR-WPANs), 2003.
10
IEEE802.11-Wireless Local Area Networks (LANs), 2007.
7996 (1118) Dispositivos de Monitoreo / InformaciónGeneral USP42
INDICADORESQUÍMICOSDE TEMPERATURA
Los indicadores químicos de temperatura son relativamente económicos en comparación con los registradores electrónicos
de datos y se pueden considerar para aplicaciones al nivel de los artículos. Existen dos tipos básicos de indicadores químicos de
temperatura: 1) un indicador de umbral que responde a una temperatura específica y 2) un ITTque responde a una exposi-
ción de calor acumulativa.
Indicadores Químicos de Umbral de Temperatura
Estos indicadores, en ocasiones denominados indicadores de temperaturas críticas, se basan en un cambio físico o reacción
química que tiene lugar en función de la temperatura. Ejemplos de estos dispositivos son los cristales líquidos, las ceras, los
polímeros y las lacas que cambian de estado físico, y por lo tanto de aspecto, en función de la temperatura. Los indicadores
químicos de umbral de temperatura son reversibles o irreversibles y son aptos para altas o bajas temperaturas. Los indicadores
de umbral de temperatura no incluyen retrasos de tiempo especificados para presentar una respuesta y, generalmente, son
dispositivos de un solo uso. Estos indicadores proveen una señal solo cuando se les expone a temperaturas mayores (indicador
ascendente) o menores (indicador descendente) que un umbral predeterminado de temperatura.
Indicadores de Umbral de Temperatura Ascendente-Los indicadores de umbral de temperatura ascendente se pro-
veen como etiquetas o tarjetas autoadhesivas y generalmente están constituidas por un componente que se funde a la
temperatura crítica. La fusión del compuesto origina un cambio de color o la aparición de un color. Otros tipos de indica-
dores se proveen en forma de tintas, lacas, pellets o crayones. Los indicadores de umbral de temperatura ascendente es-
tán disponibles para temperaturas desde 0° hasta más de 200º y hasta 1Otemperaturas en una sola unidad. Algunos indi-
cadores de umbral de temperatura ascendente usados para monitorear temperaturas de congelación o refrigeración re-
quieren una etapa de activación (tales como retirar una pestaña o romper un sello de un depósito aplicando presión).
Indicadores de Umbral de Temperatura Descendente-Los indicadores de umbral de temperatura descendente gene-
ran una respuesta cuando se les expone a temperaturas inferiores a un umbral determinado. Estos indicadores no incluyen
un retraso de tiempo específico para generar una respuesta, y dicha respuesta generalmente es provocada por el tiempo
requerido para la solidificación del líquido a la temperatura del umbral. La solidificación de un líquido ocasiona un cambio
visual en el indicador. Los ejemplos incluyen: 1) la expansión del líquido hasta romper una ampolla y liberar un colorante,
2) la contracción del líquido hasta mezclar los componentes para generar un color o 3) la agregación de partículas coloi-
dales para cambiar el color.
Indicadores Químicos de Tiempo-Temperatura
Estos indicadores, en ocasiones referidos como integradores de tiempo-temperatura (ITT), incluyen sistemas que utilizan la
velocidad de reacción o un proceso de difusión para estimar una temperatura equivalente integrada a lo largo del tiempo. En
consecuencia, estos ITTproveen una medición del calor acumulado en lugar de una temperatura instantánea como un salto o
umbrales críticos (descritos anteriormente). Las reacciones por lo por lo general son irreversibles-una vez que ocurre un cam-
bio de color, desarrollo de color, o un proceso de difusión, la exposición a bajas temperaturas no llevará a que el indicador
recupere su estado original, pero las bajas temperaturas (refrigeración) enlentecen el cambio de color. La exactitud y precisión
de estos indicadores depende, en cierta medida, de la interpretación humana. Se han preparado algunas versiones de indica-
dores químicos usando un formato de código de barras y se pueden leer con lectores para códigos de barras. Otros desarrollos
incluyen leer un indicador químico con dispositivos de imagen tales como la cámara de un teléfono inteligente.
Los ITTno reflejan directamente el estado de los medicamentos a los que están adosados. En la práctica real, las característi-
cas de degradación de un fármaco particular que guían la selección de un ITTadecuado, 11 se conocen gracias a estudios de
estabilidad acelerados y en tiempo real que siguen pautas internacionalmente aceptadas tales como la PDATR 53. 12 No es
necesario que la energía de activación del ITTse corresponda exactamente con la energía de activación de la degradación del
medicamento que se está monitoreando, y es posible que la energía de activación del medicamento no se conozca con preci-
sión. Por lo tanto, la selección del ITTdebe realizarse buscando que éste provea una advertencia temprana que indique si el
fármaco se ha expuesto a calor excesivo antes de la fecha de caducidad.
Una característica importante de los ITTquímicos es la precisión con la que puede determinarse el punto final. Para los ITT
que cambian de color, se incluye una referencia de color que muestra la porción activa del ITTy el color del punto final, lo que
simplifica la interpretación del ITT.La exactitud puede variar ampliamente con el control y la calidad de los procesos de fabri-
cación. Algunos ITTse fabrican usando procedimientos que cumplen con las Reglamentaciones sobre Sistemas de Calidad para
Dispositivos Médicos. Según se analiza más adelante en Calibraciónde Dispositivosde Monitoreo de Temperaturay Humedad,no
es posible calibrar ningún dispositivo de un solo uso debido a que la prueba es, dada la naturaleza del ITT,necesariamente
destructiva. Esto es análogo a cualquier producto farmacéutico debido a que no es posible calibrar o validar cada dosis, pero se
deben usar procesos validados en el proceso de fabricación.
11 ASTM Fl 416-96 (2008) Standard Guide for Selection of Time Temperature lndicators.
12
PDA Technical Report 53 (TR 53) Guidance for lndustry: Stability Testing to Support Distribution of New Drug Products, https://store.pda.org.
USP42 Información General/ (1118) Dispositivos de Monitoreo 7997
Los ITTse dividen en dos tipos: aquéllos que indican el historial parcial y aquéllos que indican historial completo. Los ITTque
indican el historial parcial proveen una respuesta que depende del tiempo y de la temperatura cuando ésta última excede un
valor predeterminado. Un ITTque indica el historial parcial por lo regular consta de un compuesto teñido que se funde y luego
se difunde a lo largo de una tira o mecha porosa una vez que la temperatura excede el punto de fusión del compuesto. El
proceso de difusión del compuesto hacia la mecha depende de la temperatura y, por lo tanto, el ITTque indica el historial
parcial provee una respuesta de tiempo y temperatura por encima del punto de fusión del compuesto. La migración del com-
puesto hacia la mecha se detiene cuando el indicador se expone a una temperatura más baja, punto en el cual se solidifica el
compuesto. Estos ITTpor lo regular tienen una o más ventanas de observación para monitorear la longitud recorrida por el
compuesto teñido a lo largo de la mecha. Algunos indicadores se activan al retirar una película protectora que separa el com-
puesto teñido de la mecha, o rompiendo el depósito que contiene el compuesto teñido. Otros indicadores no requieren de
activación y se deben almacenar por debajo del punto de fusión del compuesto antes de usarlos. Estos ITTque indican el histo-
rial parcial pueden durar (vida de servicio) desde algunas horas hasta varios años. Los ITTque indican el historial completo
proveen una respuesta o temperatura continua; estos indicadores cambian de color o de apariencia física como resultado de la
exposición al paso del tiempo, y la velocidad del cambio se incrementa con la temperatura, por lo que son sensibles a la expo-
sición acumulativa al calor. Los ITTque indican el historial completo responden a la temperatura cinética media (ver el capítulo
(1079)) y generalmente son de un solo uso, irreversibles y desechables, debido a que una vez que el color ha cambiado, no
volverá a su color original.
Indicadores Químico-Físicos de Tiempo-Temperatura
Este tipo de ITTse basa en un proceso de difusión o una reacción química dependiente de la temperatura. Consta de un
dispositivo sensible a la presión en forma de cinta, compuesto por una cinta indicadora y una cinta activadora. En un ejemplo,
la cinta indicadora contiene un precursor colorante disperso en un portador polimérico. El activador se incorpora a un adhesi-
vo sobre la cinta activadora. La laminación de la cinta activadora sobre la cinta indicadora produce la activación. Cuando el
activador migra al indicador en función de la temperatura y el tiempo aparece un cambio de color o un mensaje legible. Otros
enfoques para desarrollar los cambios de color incluyen el uso de un indicador de pH o el grabado de aluminio por parte de la
cinta activadora.
Indicadores Químicos de Tiempo-Temperatura Basados en Polimerización
Este tipo de ITTutiliza un proceso de polimerización en estado sólido en el que tiene lugar un cambio en la intensidad del
color en función del tiempo y la temperatura. La evolución del color es ocasionada por la polimerización de un monómero
incoloro a un polímero altamente coloreado. Estos ITTpueden aplicarse mediante un proceso de impresión que permite su
integración directa en la etiqueta de un producto o etiqueta separada. Como este tipo de ITTno requiere activación, debe ser
despachado de fábrica en hielo seco o en condiciones de congelación y debe almacenarse a las temperaturas indicadas por las
instrucciones del fabricante, normalmente por debajo de -24º, antes de su uso. Los ITTquímicos basados en polimerización se
pueden diseñar para alcanzar el punto final en tan solo algunas semanas a la temperatura de refrigeración o con el paso de
muchos años a temperatura ambiente controlada.
Indicadores Químicos de Tiempo-Temperatura Basados en Enzimas
Este tipo de ITTutiliza una reacción generadora de color catalizada por enzimas que tiene lugar en función del tiempo y la
temperatura. El cambio de color es causado por una enzima que reacciona con un sustrato, acompañado por un cambio en el
pH. La enzima y el sustrato se encuentran en soluciones separadas en compartimentos adyacentes. Al romper la barrera entre
los dos compartimentos y mezclar las dos soluciones, el ITTse activa.
Indicadores Químicos de Tiempo-Temperatura Basados en Pigmentos Orgánicos
Este tipo de ITTusa un pigmento orgánico que se activa mediante la exposición a la luz ultravioleta para desarrollar un color
inicial azul oscuro. Posteriormente, se coloca un filtro sobre la etiqueta para protegerlo de la reactivación deliberada o acciden-
tal. El pigmento teñido se decolora con el paso del tiempo en función de la temperatura.
TECNOLOGÍAS
DE MEDICIÓNDE LA HUMEDADRELATIVA
La humedad relativa puede definirse como la relación entre la presión parcial de vapor de agua en el aire y la presión de
vapor de aire saturado a una temperatura dada. En otras palabras, la humedad relativa es la cantidad de vapor de agua presen-
te dividida por la cantidad teórica de vapor de agua que podría contener ese volumen de aire a una temperatura determinada.
Existen extensas tablas de datos sobre humedad relativa. Los dispositivos para medir la humedad relativa reciben el nombre de
higrómetros. Existen diversas tecnologías para medir la humedad relativa.
7998 (1 1 18) Dispositivos de Monitoreo / Información General USP42
Psicrómetro
Eltipo de higrómetro más simple se basa en la diferencia de temperatura observada entre dos termómetros idénticos, uno
común y el otro con una malla de tela húmeda sobre el bulbo. Los dos termómetros se hacen girar en el extremo de una
cadena y la evaporación de agua de la malla enfría el termómetro del bulbo húmedo debido al enfriamiento por evaporación.
Luego, se compara la diferencia de temperaturas entre el termómetro húmedo y el seco con una tabla, específica para ese
psicrómetro y basada en la temperatura del bulbo seco, y se determina así la humedad relativa.
Higrómetro de Cabello
Este tipo de dispositivo se basa en el hecho de que la longitud de un cabello sintético o humano aumenta en función de la
humedad relativa. Este cambio se utiliza para mover un indicador o afectar un medidor de tensión. Los higrómetros de cabello
pueden tener una exactitud de ±3%, pero no responden a cambios rápidos en la humedad y pierden exactitud a niveles muy
altos o muy bajos de humedad relativa.
Higrómetro Infrarrojo
Este tipo de higrometro determina la humedad relativa comparando la absorción de dos longitudes de onda diferentes de
radiación IR a través del aire. Una de las longitudes de onda es absorbida por el vapor de agua y la otra no. Este tipo de higró-
metro puede medir en forma exacta la humedad relativa en volúmenes de aire grandes o pequeños. Es sensible a las variacio-
nes rápidas de humedad y puede integrarse a un sistema de manejo de datos electrónico.
Higrómetro de Punto de Rocío
Este tipo de dispositivo utiliza un espejo enfriado para determinar el punto de rocío de una muestra de aire. El punto de
rocío es la temperatura a la que el vapor de agua presente en el aire comienza a condensarse, es decir, la temperatura en la
que la humedad relativa es 100%. La humedad relativa puede calcularse a partir de esta medición y de una medición exacta
de la temperatura ambiente. El higrómetro de punto de rocío es el estándar contra el cual se calibran la mayoría de los instru-
mentos disponibles comercialmente.
Higrómetro Capacitivo de Película Delgada
El principio de este tipo de higrómetro es que el dieléctrico de un polímero no conductor cambia en proporción directa a la
humedad relativa. Este cambio se mide como una variación en la capacitancia. Este tipo de higrómetro tiene una exactitud de
±3%.
Higrómetro Resistivo de Película Delgada
Este tipo de higrómetro es similar al higrómetro capacitivo de película delgada puesto que utiliza el efecto producido por el
cambio de humedad relativa en un circuito eléctrico. En el higrómetro resistivo de película delgada, el sensor es un polímero
orgánico cuya resistencia eléctrica cambia en proporción logarítmica a la humedad relativa. Este tipo de higrómetro tiene una
exactitud de ±5%.
CALIBRACIÓN
DE DISPOSITIVOSDE MONITOREODE TEMPERATURA
Y HUMEDAD
Los termómetros e higrómetros que se usan para proporcionar datos sobre la exposición de un producto a la temperatura y
humedad, deben ser adecuados para los usos previstos. Específicamente, deben estar correctamente calibrados. Un programa
de calibración asegura al usuario del dispositivo de monitoreo que el dispositivo ha sido probado con anterioridad por el fabri-
cante o por el usuario para evaluar la aptitud para el uso que se le pretende dar. Las calibraciones deben llevarse a cabo con la
frecuencia apropiada para sustentar un uso continuado. Los dispositivos de monitoreo utilizados en la fabricación, almacena-
miento y transporte de medicamentos deben ser calificados debidamente por sus usuarios para asegurar que fueron recibidos
y mantenidos en condiciones de buen funcionamiento. Resulta aceptable la calibración realizada por el fabricante del dispositi-
vo que se detalla en el certificado de calibración y la fecha de caducidad.
En el caso de dispositivos para el monitoreo de la temperatura y la humedad, la exactitud de las mediciones se refiere a la
proximidad del valor obtenido con un determinado dispositivo y al valor real del objeto o ambiente que se está midiendo. En
la práctica, esto se determina por comparación con un dispositivo calibrado contra un estándar que se obtiene del Instituto
Nacional de Normas y Tecnología (NIST,por sus siglas en inglés), o de una organización nacional de metrología comparable.
Todo dispositivo de monitoreo tarda un cierto tiempo en responder a una variación en la temperatura o humedad. La capa-
cidad de respuesta de la medición por lo general se define en las especificaciones de un dispositivo para su intervalo de opera-
ción. Los diferentes intervalos de registro de datos son apropiados para monitorear aplicaciones y se deben basar en la longi-
USP42 InformaciónGeneral/ (1119) Espectroscopíaen el IR Cercano 7999
tud de la cadena de distribución (por ejemplo, el transporte por vía marítima puede requerir intervalos de 30 minutos, mien-
tras que los intervalos de 15 minutos pueden ser adecuados para el transporte aéreo). Normalmente, la exactitud del tiempo
se expresa como un ± porcentaje de la duración total del período de registro. En el caso de aplicaciones farmacéuticas, una
exactitud de tiempo de ±0,5% es adecuada.
Los indicadores electrónicos y químicos de un solo uso deben seguir las Buenas Prácticas de Fabricación con controles de
prueba apropiados. Los indicadores electrónicos requieren calibración apropiada. El desempeño de indicadores de un solo uso
puede ser calificado por el usuario de la cadena de distribudón mediante el muestreo y análisis de múltiples lotes de produc-
ción. Para los ITTque calculan la temperatura cinética media, puede evaluarse el funcionamiento de una partida en forma esta-
dística, sometiendo una muestra del tamaño adecuado a condiciones de temperatura elevada durante un período establecido
de tiempo y observando los resultados. Los fabricantes deben adoptar criterios de aceptación apropiados. Resulta aceptable el
uso de la prueba de liberación realizada por el fabricante del indicador (basándose en el certificado de calibración o en el certi-
ficado de análisis y en la fecha de caducidad) en lugar de la calibración o de la calificación.
USO DE DATOSHISTÓRICOSDE TEMPERATURA

Aunque pueden utilizarse las tendencias geográficas y estacionales históricas como herramienta de planificación para selec-
cionar los tipos de dispositivos de monitoreo de la temperatura y humedad, las temperaturas ambiente externas no necesaria-
mente constituyen indicadores confiables de las temperaturas experimentadas por diferentes artículos en la cadena de distribu-
ción. Por ejemplo, estudios indicaron desviaciones importantes con respecto a la temperatura ambiente durante los días de
verano en el caso de buzones, camiones y depósitos. 13 Por lo tanto, resulta beneficioso usar el monitoreo de temperatura en
canales de distribución específicos cuando los fabricantes y transportistas desarrollan un perfil ambiental y puede ser un punto
valioso a tomar en cuenta en un enfoque basado en riesgos para mantener la calidad del producto. 14
La calidad de un medicamento (identidad, contenido y pureza) se puede ver notoriamente influenciada por variaciones en la
temperatura y la humedad durante el transcurso de su vida útil, por lo que los fabricantes deben monitorear apropiadamente
dichas condiciones ambientales. Los fabricantes farmacéuticos llevan a cabo análisis de estabilidad para evaluar cuidadosamen-
te los efectos de la temperatura y la humedad en sus productos. El envasado, la vida útil, las condiciones de almacenamiento y
transporte recomendadas para un producto se seleccionan basándose en los resultados de estos estudios de estabilidad. Los
efectos de la temperatura pueden presentarse con rapidez; por lo tanto, el monitoreo de la temperatura debe implementarse
en un enfoque basado en riesgos tomando en cuenta la estabilidad del producto, la vía de distribución, el modo de transporte
y los riesgos potenciales que pudieran comprometer la calidad del producto. Los efectos de la humedad relativa ocurren en un
lapso de tiempo mucho mayor; el monitoreo de la humedad puede omitirse cuando el medicamento cuenta con una protec-
ción suficiente provista por el envase primario, conforme se demuestre mediante estudios rigurosos de estabilidad. El monito-
reo de la humedad es recomendable cuando se definen restricciones ambientales especiales para el medicamento relacionadas
con la humedad.
(1119) ESPECTROSCOPÍA
EN ELINFRARROJO
CERCANO
INTRODUCCIÓN
La espectroscopía en el infrarrojo cercano (NIR, por sus siglas en inglés) es una rama de la espectroscopía vibracional que
tiene muchos principios en común con otras mediciones espectroscópicas. La región espectral del infrarrojo cercano incluye
dos subintervalos asociados a detectores usados en el desarrollo inicial del instrumental NIR. La longitud de onda corta (región
de Herschel o región de silicio) se extiende aproximadamente de 780 a 1100 nm (12 821-9000 cm- 1); y las longitudes de on-
da más largas entre 1100 y 2500 nm comprenden la región tradicional del NIR (sulfuro de plomo). Los espectros de las aplica-
ciones de la espectroscopía NIR se presentan tanto en unidades de longitud de onda como en número de onda. Como es el
caso de otras mediciones espectroscópicas, las interacciones entre la radiación NIR y la materia, suministran información que
puede servir para evaluar la composición química de las muestras en forma cualitativa y cuantitativa. Además se pueden carac-
terizar cualitativa y cuantitativamente las propiedades físicas de una muestra debido a su influencia sobre los espectros NIR.
Pueden realizarse mediciones directas sobre las muestras in situ además de las aplicaciones propias de los procedimientos es-
tándares de muestreo y análisis.
Las aplicaciones del análisis cualitativo incluyen la identificación de materias primas, muestras en proceso o productos termi-
nados. Estas aplicaciones a menudo implican la comparación de un espectro NIR de una muestra con el espectro de referencia
y la evaluación de las similitudes según los criterios de aceptación desarrollados y validados para una aplicación específica. Por
el contrario, las aplicaciones del análisis cuantitativo implican el desarrollo de una relación predictiva entre los atributos espec-
13 Okeke, C.C. Medwick, T., Bailey, L.C., y Grady L.T.Temperature and Humidity Conditions During Shipment in lnternational Commerce,
PF25(2) Mar.-Apr.
1999.
14 ISTA7E Standard, http://www.ista.org.
8000 (1119) Espectroscopía en el IR Cercano / Información General USP42
trales del NIRy las propiedades de la muestra. Estas aplicaciones, por lo general, usan modelos numéricos para predecir cuanti-
tativamente las propiedades químicas y/o físicas de la muestra en función de los atributos espectrales del NIR.
En la espectroscopía vibracional en la región del NIR predominan sobretonos y bandas combinadas que son mucho más
débiles que las vibraciones fundamentales del infrarrojo medio de las cuales se originan. Dado que las absortividades molares
en el intervalo del NIR son bajas, la radiación puede penetrar varios milímetros en el material, incluso en los sólidos. Muchos
materiales, como el vidrio, son relativamente transparentes en esta región. La tecnología de fibra óptica se implementa con
facilidad en el intervalo del infrarrojo cercano, lo que permite supervisar los procesos en entornos que de otra manera podrían
ser inaccesibles.
Las pruebas de calificación de los instrumentos y los criterios de aceptación suministrados en este capítulo podrían no ser
apropiados para todas las configuraciones instrumentales. En tales casos, se deben documentar y justificar científicamente las
verificaciones de aptitud y desempeño alternativos de los instrumentos. Además, los parámetros de validación discutidos en
este capítulo pueden no ser aptos para todas las aplicaciones de la espectroscopía NIR. Los parámetros de validación propios
de una aplicación NIR específica deben demostrar la aptitud de la aplicación NIR para su uso previsto.
Transmisióny Reflexión
Las mediciones más comunes realizadas en el intervalo espectral del NIR son las de espectroscopía de transmisión y refle-
xión. La radiación NIR incidente se absorbe o dispersa por la muestra y se mide como transmitancia o reflectancia, respectiva-
mente. La espectrometría de transflexión es un híbrido de transmisión y reflexión en donde se coloca un reflector detrás de la
muestra de forma que el paso óptico a través de la muestra y de regreso al detector se duplica en comparación con una medi-
ción de transmisión de una muestra del mismo espesor. La transflexión se usa para describir cualquier técnica de transmisión
de doble paso. La luz se puede reflejar desde un reflector difuso o especular (espejo) colocado detrás de la muestra. Se puede
adaptar esta configuración para que comparta la geometría del instrumento con ciertos sistemas de reflexión o de sondas de
fibra óptica en los que la fuente y el detector están del mismo lado de la muestra.
TRANSMITANCIA, T, es una medida de la disminución de la intensidad de radiación en función de la longitud de onda cuando
dicha radiación se pasa a través de una muestra. Se coloca la muestra en el haz óptico situado entre la fuente y el detector. Los
resultados de las mediciones de transmisión y transflexión, por lo general, se presentan directamente en términos de absorban-
cia, es decir, 10910(1/7).
REFLECTANCIA, R, es una medida del cociente entre la intensidad de la luz reflejada desde la muestra, /, y la reflejada desde un
fondo o superficie reflectiva de referencia, !,. La mayoría de las mediciones de reflexión en el NIR se realizan en muestras con
capacidad dispersiva como polvos y suspensiones espesas. En dichos materiales, la radiación NIR puede penetrar una distancia
considerable dentro de la muestra, donde puede ser absorbida cuando la longitud de onda de la radiación corresponde a una
transición entre el estado vibracional fundamental del analito, y un armónico de un modo vibracional determinado (un sobre-
tono) o la suma de dos o más modos diferentes (una banda de combinación).La radiación no absorbida se dispersa desde la
muestra de regreso al detector. Los espectros de reflexión en el infrarrojo cercano se obtienen calculando y graficando la curva
de log(l / R) en función de la longitud de onda. La forma logarítmica es la seudoabsorbancia del material y por lo general se
denomina absorbancia.
Factoresque Afectan los EspectrosNIR
La siguiente lista no es exhaustiva, pero incluye muchos de los factores principales que afectan los espectros NIR.
Temperatura de la Muestra-La temperatura de la muestra influye en los espectros obtenidos de soluciones acuosas y
otros líquidos con puentes de hidrógeno, y una diferencia de pocos grados puede ocasionar cambios espectrales significativos.
La temperatura puede afectar también los espectros obtenidos de líquidos menos polares, así como de sólidos que contienen
disolventes y/o agua.
Humedad y Disolvente-La humedad y el disolvente presentes en el material de muestra y en el sistema analítico pueden
cambiar el espectro de la muestra. Tanto la absorción por humedad como el disolvente y su influencia sobre los puentes de
hidrógeno de los ingredientes farmacéuticos activos y excipientes pueden cambiar el espectro NIR.
Espesorde la Muestra-El espesor de la muestra es una fuente conocida de variabilidad espectral y debe ser comprendida
y/o controlada. El espesor de la muestra en el modo de transmisión se controla, por lo general, usando un paso óptico de
longitud fija para la muestra. En modo de reflexión difusa, el espesor de la muestra se controla por lo general con el uso de
muestras con "espesor infinito" con respecto a la profundidad de penetración detectable de la luz NIR dentro de un material
sólido. Aquí "espesor infinito" implica que el espectro de reflexión no cambia si el espesor de la muestra aumenta.
Propiedades Ópticas de la Muestra-En los sólidos, deben tenerse en cuenta las propiedades dispersivas de la superficie y
del volumen de los estándares de calibración y de las muestras analíticas. La morfología de la superficie y el índice de refrac-
ción afectan las propiedades dispersivas de los materiales sólidos. En el caso de los materiales en polvo, el tamaño de las partí-
culas y la densidad aparente influyen sobre las propiedades dispersivas y el espectro NIR.
Polimorfismo-La variación en la estructura cristalina (polimorfismo) de los materiales con la misma composición química
puede influir sobre la respuesta espectral NIR. Los diferentes polimorfos y la forma amorfa del material sólido se pueden distin-
guir entre sí según sus propiedades espectrales NIR. De manera similar, los diferentes estados cristalinos de hidratación o solva-
tación de un mismo material pueden exhibir diferentes propiedades espectrales NIR.
USP42 InformaciónGeneral/ (1119) Espectroscopía en el IR Cercano 8001
Antigüedad de las Muestras-Las muestras pueden manifestar cambios en sus propiedades químicas, físicas u ópticas con
el paso del tiempo. Se debe tener cuidado de garantizar que tanto las muestras como los estándares usados en el análisis NIR
sean aptos para la aplicación prevista.
INSTRUMENTAL
Aparato
Todas las mediciones del NIR se basan en la exposición del material a radiación luminosa incidente NIR y en medir la atenua-
ción de la luz emergente (transmitida, dispersada o reflejada). Se cuenta con varios espectrofotómetros, basados en los dife-
rentes principios de funcionamiento, por ejemplo: filtros, redes de dispersión, filtro acústico-óptico sintonizable (AOTF,por sus
siglas en inglés), NIR por transformada de Fourier (FT-NIR,por sus siglas en inglés) y filtros de cristal líquido sintonizables
(LCTF,por sus siglas en inglés). Los materiales de detección comunes usados son silicio, sulfuro de plomo, arseniuro de indio y
galio y sulfato de triglicina deuterada. Ejemplos de interfases de muestra comunes para introducir la muestra en el tren óptico
del espectrómetro son las cubetas portamuestras convencionales, las sondas de fibra óptica, las celdas de inmersión para trans-
misión y los portamuestras giratorios o deslizantes.
La selección del instrumental específico y de los accesorios de muestreo se debe basar en la aplicación prevista y se debe
poner especial atención a la aptitud de la interfase de muestreo para el tipo de muestra que se va a analizar.
Espectros de Referencia en el Infrarrojo Cercano
Las referencias NIR que proporcionan mediciones conocidas y estables contra las que se pueden comparar otras mediciones
se utilizan para minimizar las variaciones instrumentales que podrían afectar la medición.
Transmitancia-La medición de la transmitancia requiere un espectro de referencia de fondo para determinar la absorción
de la muestra con respecto al fondo. Los materiales de referencia aptos para transmitancia dependen de la aplicación NIR es-
pecífica e incluyen aire, una celda vacía, un blanco de disolvente o una muestra de referencia.
Reflectancia-La medición de reflectancia requiere medir un espectro de reflexión como referencia para determinar la ate-
nuación de la luz reflejada con respecto al haz incidente no atenuado. El espectro de reflectancia se calcula como el cociente
entre los espectros de simple haz de la muestra con respecto al material de referencia. Los materiales de referencia aptos para
reflectancia dependen de la aplicación NIR específica e incluyen cerámica, polímeros perfluorados, oro y otros materiales apro-
piados.
Calificación de los Instrumentos NIR
Calificación-La calificación de un instrumento NIR se puede dividir en tres elementos: calificación de la instalación (IQ, por
sus siglas en inglés), calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en
inglés). Ver información adicional en el capítulo de información general Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).
Calificación de la Instalación-Los requisitos de calificación de la instalación ayudan a garantizar que el hardware y el softwa-
re se instalen para brindar un uso seguro y eficaz del instrumento en el sitio deseado.
Calificación Operativa-En la calificación operativa se caracteriza el desempeño del instrumento usando estándares para veri-
ficar que el sistema opere dentro de las especificaciones deseadas. El propósito de la calificación operativa es demostrar que el
desempeño del instrumento es adecuado. Dado que existen tantos enfoques diferentes para medir los espectros NIR, se reco-
mienda la calificación operativa usando estándares con propiedades espectrales conocidas. El uso de materiales estándares de
referencia externos rastreables no justifica la omisión de los procedimientos de control de calidad internos del instrumento.
Como en el caso de cualquier dispositivo espectroscópico, se deben calificar la incertidumbre de la longitud de onda, la lineali-
dad fotométrica y las características de ruido de los instrumentos NIR contra las especificaciones deseadas para la aplicación
prevista.
Calificación del Desempeño-La calificación del desempeño demuestra que la medición NIRfunciona siempre dentro de las
especificaciones deseadas definidas por el usuario para una aplicación específica y se denomina con frecuencia aptitud del siste-
ma. La calificación del desempeño para las mediciones NIR puede incluir la comparación de un espectro de una muestra o de
un estándar con espectros previamente registrados. Las comparaciones de espectros tomados a lo largo del tiempo de mues-
tras idénticas y estables o de materiales estándares de referencia pueden formar la base para evaluar la estabilidad a largo plazo
de un sistema de mediciones NIR. El objetivo es demostrar que no se produzca un desplazamiento anormal de la longitud de
onda o un cambio en la sensibilidad del detector durante el análisis en curso.
Caracterización de Desempeño del Instrumento-Los procedimientos específicos, los criterios de aceptación y los inter-
valos de tiempo para caracterizar el desempeño de un instrumento NIR dependen del instrumento y de la aplicación prevista.
Muchas aplicaciones NIR usan modelos previamente validados que relacionan la respuesta espectral NIR con una propiedad
física o química de interés. La demostración del desempeño estable del instrumento durante periodos extensos proporciona
cierta garantía de que se pueden tomar medidas confiables de los espectros de muestra usando modelos NIR previamente vali-
dados.
8002 (1119) Espectroscopía en el IR Cercano / InformaciónGeneral USP42
Incertidumbrede la Longitudde Onda-Los espectros NIR de la muestra y/o del estándar de referencia se pueden usar para
demostrar el desempeño adecuado de la dispersión de la longitud de onda del instrumento con respecto a las especificaciones
deseadas. El Estándar de Referencia USP para la Aptitud del Sistema en el Infrarrojo Cercano o el Material de Referencia Están-
dar (SRM) 2036 del National lnstitute of Standards and Technology (NIST) para la medición de reflectancia y el NIST SRM
2035 para la medición de transmitancia se pueden usar para la verificación de la longitud de onda. Los materiales aptos para
demostrar el desempeño de la dispersión de la longitud de onda incluyen poliestireno, mezclas de óxidos de tierras raras y
absorción por vapor de agua para instrumentos que usen un interferómetro para dispersión de la longitud de onda. Con la
debida justificación se pueden usar estándares alternativos. La incertidumbre de la longitud de onda se caracteriza por lo gene-
ral, a partir de un espectro único (obtenido con la misma resolución espectral que la utilizada para obtener el valor estándar),
usando un mínimo de tres picos que cubran un intervalo espectral apropiado del instrumento. Las tolerancias típicas para
cumplir con los valores estándares son ± 1,0 nm por debajo de 2000 nm y± 1,5 nm desde 2000 nm hasta 2500 nm. Se pueden
usar tolerancias alternativas para aplicaciones específicas cuando se justifique.
LinealidadFotométricay Estabilidadde Respuesta-Losespectros NIR de muestras y/o materiales estándares de referencia con
transmitancia o reflectancia relativas conocidas se pueden usar para demostrar una relación apta entre la atenuación de la luz
NIR (debido a la absorción) y la respuesta del instrumento. Para mediciones de reflectancia, a menudo se usan estándares de
reflectancia disponibles comercialmente, con propiedades de reflectancia conocidas. Los espectros obtenidos de los estándares
de reflexión están sujetos a variabilidad como resultado de la diferencia entre las condiciones experimentales bajo las cuales
fueron calibrados en fábrica y aquéllas en las que se les utiliza posteriormente. Por lo tanto, los valores de reflectancia provistos
con un set de estándares de calibración pueden no ser útiles al intentar establecer una calibración "absoluta" para un instru-
mento determinado. Siempre que (1) los estándares no cambien química ni físicamente, (2) se use también el mismo fondo de
referencia que el utilizado para obtener los valores estándares y (3) el instrumento mida cada estándar bajo idénticas condicio-
nes (incluso la colocación precisa de la muestra), la reproducibilidad de la escala fotométrica se establecerá sobre el intervalo
de estándares. Las mediciones subsiguientes en los sets de estándares idénticos brindan información sobre la estabilidad a lar-
go plazo. La linealidad fotométrica se caracteriza por lo general, usando un mínimo de cuatro estándares de referencia en el
intervalo de 10% a 90% de reflexión (o transmisión). Las aplicaciones NIR basadas en mediciones de absorbancia mayores que
1,0 pueden requerir estándares con propiedades de reflectividad entre 2% y 5% de reflexión (o transmisión) para caracterizar
el desempeño del instrumento a baja reflectancia. El propósito es demostrar una relación lineal entre la reflectancia de NIRy/o
la transmitancia y la respuesta del instrumento en el intervalo de barrido. Las tolerancias típicas para una relación lineal son
1,00 ± 0,05 para la pendiente y 0,00 ± 0,05 para la ordenada al origen de una gráfica de la respuesta fotométrica medida en
función de la respuesta fotométrica estándar. Pueden darse tolerancias alternativas para aplicaciones específicas cuando se jus-
tifique.
RuidoEspectroscópico--f.lsoftware de instrumentos NIR puede incluir procedimientos incorporados para determinar el ruido
del sistema de forma automática y para suministrar un informe estadístico del ruido o la relación señal/ruido (S/N) en el inter-
valo operativo del instrumento. Además, es conveniente complementar tales controles con mediciones que no dependan de
forma directa de los procedimientos suministrados por los fabricantes. Los procedimientos típicos incluyen la medición de los
espectros de los materiales de referencia rastreables con reflectancia alta y baja. Las tolerancias para estos procedimientos de-
ben demostrar la relación señal/ruido apta para la aplicación prevista.
RUIDO DEALTOFLUIO-EIruido del instrumento a alto flujo luminoso se evalúa midiendo la reflectancia o transmitancia del
estándar de referencia con respecto al mismo estándar de referencia (p. ej., estándar de reflexión al 99%) que funciona como
muestra y como referencia de fondo a la vez.
RUIDO DE BAJO FLUIO-Sepuede emplear el mismo procedimiento con un material de referencia de menor reflectividad (p. ej.,
estándar de reflectancia al 10%) para determinar el ruido del sistema a un flujo luminoso reducido. La fuente, los elementos
ópticos, el detector y los equipos electrónicos contribuyen sustancialmente al ruido en estas condiciones.
VALIDACIÓN
DELMÉTODO
Introducción
El objetivo de la validación de un método NIR, como en la validación de cualquier procedimiento analítico, es demostrar que
la medición es adecuada para el propósito previsto. Aunque la espectroscopía NIR difiere levemente de las técnicas analíticas
convencionales porque la validación se obtiene generalmente mediante la evaluación de parámetros quimiométricos, estos pa-
rámetros aún se pueden relacionar con las características fundamentales de validación requeridas para cualquier método analí-
tico.
El tratamiento previo de los datos es con frecuencia un paso vital en el análisis quimiométrico de los datos espectrales del
infrarrojo cercano. Eltratamiento previo de los datos se puede definir como la transformación matemática de los datos espec-
trales del infrarrojo cercano para mejorar las características espectrales y/o eliminar o reducir las fuentes de variación indesea-
bles antes de usar el espectro. La Calibraciónes el proceso mediante el cual se desarrolla una relación matemática entre la res-
puesta espectral NIRy las propiedades de las muestras. Existen muchos algoritmos quimiométricos adecuados para el trata-
miento previo de los datos y la calibración; la selección debe basarse en un criterio científico sólido y en la aptitud para la
aplicación prevista.
USP42 InformaciónGeneral/(1119) Espectroscopíaen el IR Cercano8003
Parámetrosde Validación
Las características de desempeño que demuestran la aptitud de los métodos NIR son similares a las requeridas para cualquier
procedimiento analítico. Un análisis de los principios generales aplicables se halla en Validación de Procedimientos Farmacopei-
cos (1225). Estos principios deben considerarse como típicos para los procedimientos NIR, pero las excepciones deberán tra-
tarse en forma individual, caso por caso. Para los métodos NIR cualitativos, ver el capítulo Validación de Procedimientos Farma-
copeicos (1225), Datos Requeridospara la Validación,CategoríaIV. Para los métodos NIR cuantitativos, ver el capítulo Validación
de Procedimientos Farmacopeicos (1225), Datos Requeridospara la Validación,CategoríaI y Categoría1/.Los criterios de acepta-
ción específicos para cada parámetro de validación deben ser coherentes con el uso previsto del método. Las muestras para la
validación deberán ser independientes del set de calibración.
Especificidad-El alcance de las pruebas de especificidad depende de la aplicación prevista. La demostración de la especifi-
cidad en los métodos NIR por lo general se logra mediante los siguientes enfoques:
Cualitativo-las pruebas de identificación son aplicaciones comunes de la espectroscopía NIR cualitativa. La identificación se
consigue comparando un espectro de muestra con un espectro de referencia o una biblioteca de referencia espectral. La espe-
cificidad del método de identificación por NIR se demuestra obteniendo una identificación positiva de las muestras junto con
resultados negativos de materiales que no deberían cumplir con los criterios para identificación positiva. Los materiales para
demostrar la especificidad deben basarse en un criterio científico sólido y pueden incluir materiales similares en apariencia vi-
sual, estructura química o nombre.
Cuantitativo-las aplicaciones cuantitativas de la espectroscopía NIR por lo general incluyen el establecimiento de una rela-
ción matemática entre la respuesta espectral NIRy una propiedad física o química de interés. La demostración de especificidad
con respecto a una propiedad física o química de interés se basa en interpretar tanto los atributos espectrales del NIR como los
parámetros quimiométricos en términos de la aplicación prevista y puede incluir lo siguiente:
• La correlación entre regiones espectrales en el modelo de calibración y una respuesta espectral NIR conocida, asociada
con la propiedad de interés.
• La verificación de la información espectroscópica relevante que se usa en el modelo matemático, mediante el examen de
las longitudes de onda utilizadas por análisis de regresión para la calibración (p. ej., en modelos de regresión lineal múlti-
ple [MLR,por sus siglas en inglés]) o los vectores de carga para cada factor (p. ej., en modelos de cuadrados mínimos
parciales [PLS,por sus siglas en inglés] o la regresión de componentes principales [PCR, por sus siglas en inglés])
• La variación en los espectros de las muestras de calibración, los cuales se pueden examinar e interpretar como observacio-
nes espectrales esperadas.
• La demostración de que las variaciones en la composición del material y la matriz de la muestra no tienen un efecto im-
portante sobre la cuantificación de la propiedad de interés en el intervalo especificado para el método.
Linealidad-Los métodos NIR cuantitativos generalmente intentan demostrar una relación lineal entre la respuesta espec-
tral NIRy la propiedad de interés. Aunque no se requiere demostrar una respuesta lineal para todas las aplicaciones NIR, el
modelo escogido, sea lineal o no, debe representar apropiadamente la relación.
La validación de la linealidad en los métodos NIR se puede conseguir examinando una gráfica de la respuesta espectral NIR
en función de valores reales o aceptados para la propiedad de interés. Se cuenta con muchos métodos estadísticos para la
evaluación de la bondad del ajuste de la relación lineal. Otros métodos estadísticos y gráficos aplicables pueden ser apropia-
dos.
El coeficiente de correlación, r, puede no ser una medida informativa de la linealidad. El cuadrado del coeficiente de correla-
ción (Pearson) es una medida de la fracción de la variación de los datos que está adecuadamente modelada por la ecuación. La
linealidad depende del error estándar de la ecuación de calibración (y por lo tanto, del método de referencia) y del intervalo
de los datos de calibración. Por tanto, aunque los valores muy cercanos a 1,00, tales como 0,99 o mayores, indican por lo
general una relación lineal, los valores más bajos no distinguen entre no linealidad y variabilidad alrededor de la línea.
Intervalo-El intervalo especificado de un método NIR depende de la aplicación específica. El intervalo por lo general se
establece confirmando que el método NIR proporciona una capacidad de medición apta (exactitud y precisión) cuando se
aplica a muestras dentro de los límites extremos de la medición NIR. Se deben usar controles para garantizar que no se acep-
ten los resultados fuera del intervalo validado. En ciertas circunstancias, puede no ser posible o deseable extender el intervalo
validado para incluir la variabilidad de la muestra por fuera del intervalo validado. La extensión del intervalo de un método NIR
requiere la demostración de la capacidad de medición apta dentro de los límites del intervalo expandido. Como ejemplos de
situaciones en las que solamente se puede disponer de un intervalo de muestras limitado, se encuentran las muestras de un
proceso controlado de fabricación y las muestras en proceso. El intervalo limitado de un método no excluye el uso del método
NIR.
Exactitud-La exactitud en los métodos NIRse demuestra por la proximidad con el valor que se ha aceptado como valor
verdadero convencional o un valor de referencia. La exactitud se puede determinar por comparación directa entre los resulta-
dos de la validación y los valores de referencia reales o aceptados. La proximidad apropiada entre los valores NIRy de referen-
cia se determina basándose en la capacidad de medición requerida para una aplicación específica. El propósito es demostrar
una relación lineal entre los resultados NIRy los valores reales. La exactitud se puede determinar por la proximidad entre el
error de predicción estándar (SEP,por sus siglas en inglés) y el error estándar del método de referencia para la validación. El
error del método de referencia puede conocerse basándose en los datos históricos, por medio de resultados de validación es-
8004 (1119) Espectroscopía en el IR Cercano / Información General USP42
pecíficos del método de referencia o por el cálculo del error estándar del laboratorio (SEL,por sus siglas en inglés). La proximi-
dad apropiada entre los valores SEPy SELse basa en la capacidad de medición requerida para una aplicación específica.
Precisión-La precisión de un método NIR expresa el grado de concordancia entre una serie de mediciones en las condicio-
nes prescritas. Se deben considerar dos niveles de precisión: repetibilidad y precisión intermedia. La precisión de un método
NIR se expresa por lo general, como la desviación estándar relativa de una serie de resultados del método NIR y debe ser apta
para la aplicación prevista. La demostración de la precisión en los métodos NIR se puede lograr mediante los siguientes enfo-
ques:
Repetibilidad-Larepetibilidad se puede demostrar por:
• Evaluación estadística de un número de mediciones repetidas de la muestra sin reposicionarla entre cada adquisición es-
pectral individual, o
• Evaluación estadística de resultados múltiples obtenidos por el método NIR, cada uno de los cuales proviene de un análisis
repetido de una muestra después de reposicionarla entre adquisiciones espectrales.
PrecisiónIntermedia-La precisión intermedia se puede demostrar por:
• Evaluación estadística de un número de mediciones NIR repetidas de las mismas muestras o similares en el estudio de
Repetibilidadefectuadas por diferentes analistas en días diferentes.
Robustez-Los parámetros de medición NIR seleccionados para demostrar la robustez variarán dependiendo de la aplica-
ción y de la interfase de la muestra con el instrumento NIR. Los parámetros de medición críticos asociados con la robustez a
menudo se identifican y caracterizan durante el desarrollo del método. Los parámetros de medición típicos incluyen:
• Efecto de las condiciones ambientales (p. ej., temperatura, humedad y vibración)
• Efecto de la temperatura de la muestra
• Manipulación de la muestra (p. ej., profundidad de la sonda, compresión del material, profundidad o espesor de la mues-
tra, presentación de la muestra)
• Influencia de los cambios del instrumento (p. ej., cambio de la lámpara, tiempo de calentamiento)
Evaluación Continua del Método
Los métodos NIRvalidados deben someterse a evaluación de desempeño continua, que puede incluir la supervisión de la
exactitud, precisión y otros parámetros apropiados del método. Si el desempeño es inaceptable, la acción correctiva se hace
necesaria. Eso implica llevar a cabo una investigación para identificar la causa del cambio en el desempeño del método y pue-
de indicar que el método NIR no es apto para el uso continuo. Mejorar el método NIR para que cumpla con los criterios de
aptitud de la medición puede requerir desarrollo adicional del método y documentación de los experimentos de validación
que demuestren que el método mejorado es apto para la aplicación prevista. El grado de revalidación requerido depende de la
causa del cambio en el desempeño del método y de la naturaleza de la acción correctiva requerida con el fin de establecer el
desempeño adecuado del método. Se deben implementar controles de cambio apropiados para documentar las actividades
continuas de mejoramiento del método.
La revalidación de un modelo cualitativo puede ser necesaria como resultado de:
• La adición de un material nuevo a la biblioteca de referencia espectral
• Cambios en las propiedades físicas del material
• Cambios en la fuente del suministro del material
• Identificación de atributos críticos de los materiales desconocidos previamente
La revalidación de un modelo cuantitativo puede ser necesaria como resultado de:
• Cambios en la composición de la muestra de prueba o del producto terminado
• Cambios en el proceso de fabricación
• Cambios en las fuentes o grados de las materias primas
• Cambios en el método analítico de referencia
• Cambios importantes en el hardware del instrumento
Resultados aberrantes-Los espectros de las muestras que producen una respuesta NIR que difiere del modelo de calibra-
ción cualitativo o cuantitativo pueden producir un resultado aberrante. Esto no necesariamente indica un resultado fuera de
especificación. Un resultado aberrante es dependiente del método NIR particular e indica que pueden requerirse más pruebas
de la muestra. Si las pruebas subsiguientes de la muestra por un método apropiado indican que la propiedad de interés está
dentro de las especificaciones, entonces la muestra cumple sus especificaciones. Los resultados aberrantes se pueden incluir en
un modelo de calibración actualizado después de la realización y documentación de estudios de validación apropiados.
Transferencia del Método
Los controles y mediciones para demostrar la aptitud del desempeño del método NIR después de la transferencia del méto-
do son similares a los requeridos para cualquier procedimiento analítico. Las excepciones a los principios generales para efec-
tuar la transferencia del método NIR se debe justificar en forma individual, caso por caso. La transferencia de un método NIR a
menudo se efectúa usando un modelo de calibración NIR sobre un segundo instrumento que sea similar al instrumento prima-
rio usado para desarrollar y validar el método. Cuando un modelo de calibración se transfiere a otro instrumento, deben apli-
carse los procedimientos y criterios necesarios para demostrar que el modelo de calibración cumple con los criterios de medi-
USP42 InformaciónGeneral/ (1119) Espectroscopía en el IR Cercano 8005
ción apropiados en el segundo instrumento. La selección de un procedimiento adecuado de transferencia del modelo de cali-
bración debe basarse en un criterio científico sólido.
GLOSARIO
ABSORBANCIA,A, está representada por la ecuación:

A =-log T=log (1/7)
donde Tes la transmitancia de la muestra. La absorbancia se expresa también con frecuencia como:
A= log (1 /R)
donde R es la reflectancia de la muestra.

ANCHO DE BANDA o RESOLUCIÓNDEL INSTRUMENTOes una medida de la capacidad del espectrómetro para separar la radiación
de longitudes de onda similares.
BIBLIOTECADE REFERENCIA ESPECTRAL es una colección de espectros de materiales conocidos para comparación con materiales
desconocidos. Eltérmino se usa comúnmente en relación con los métodos cualitativos de análisis espectral (p. ej., identifica-
ción de materiales).
CALIFICACIÓNDE LA INSTALACIÓNes el conjunto de actividades documentadas necesarias para establecer que un instrumento se
entrega como fue diseñado y especificado y está debidamente instalado en el entorno seleccionado, y que este entorno es
apto para el uso previsto del instrumento.
CALIFICACIÓNDEL DESEMPEÑOes el proceso por el cual se verifica el desempeño uniforme del instrumento mediante el uso de
uno o más materiales de referencia estables y bien caracterizados. La calificación de desempeño puede emplear estándares
iguales o diferentes para las diversas características de desempeño.
CALIFICACIÓNOPERATIVAes el proceso mediante el cual se demuestra y se documenta que un instrumento funciona de acuerdo
con las especificaciones y que puede realizar la tarea para la cual está previsto. Este proceso es necesario luego de cambios
sustanciales como la instalación del instrumento, cambio de ubicación o reparaciones importantes.
CUADRADOSMÍNIMOS PARCIALES (PLS, POR sus SIGLASEN INGLÉS)es un algoritmo de calibración para relacionar las respuestas del
instrumento con las propiedades de las muestras. La característica distintiva de este algoritmo es que los datos relacionados
con las propiedades de las muestras para calibración se usan en el cálculo de los factores para describir las respuestas del ins-
trumento.
ERRORDE CALIBRACIÓNESTÁNDAR(SEC, PORsus SIGLASEN INGLÉS)es una medida de la capacidad de un modelo para ajustarse a
los datos de referencia. El SECes la desviación estándar de los residuos obtenidos al comparar los valores conocidos para cada
una de las muestras de calibración con los valores que se calculan a partir de la calibración. El SEC no se debe usar como una
herramienta de evaluación de la exactitud esperada del método (veracidad y precisión de la predicción) del valor previsto de
muestras futuras. La exactitud del método debe verificarse por lo general calculando el error estándar de predicción (SEP),
usando un set de muestras de validación independientes. Un método aceptado consiste en marcar una parte del set de calibra-
ción como conjunto de validación. Este set no es totalmente independiente pero se puede usar como alternativa para la deter-
minación de la exactitud.
ERRORESTÁNDARDE PREDICCIÓN(SEP, PORsus SIGLASEN INGLÉS)es una medida de la exactitud del modelo de un método analíti-
co que se basa en la aplicación de un modelo de calibración determinado a la información espectral de un set de muestras
diferentes pero similares a las empleadas para calcular el modelo de calibración. El SEPes la desviación estándar de los residuos
obtenidos de la comparación de los valores del laboratorio de referencia con los obtenidos por medio del método en análisis,
para las muestras especificadas. El SEPofrece una medida de la exactitud esperada del modelo en la medición de muestras
futuras.
ERRORESTÁNDARDE VALIDACIÓN CRUZADA(SECV, PORsus SIGLASEN INGLÉS)es la desviación estándar calculada usando el método
de omisión de un dato. En este método se omite de la calibración una muestra de calibración y se obtiene la diferencia entre el
valor para esta muestra calculado a partir de su valor de referencia y el valor obtenido a partir de la calibración calculada con
todas las otras muestras del conjunto. El proceso se repite para todas las muestras en el conjunto y la SECVes la desviación
estándar de las diferencias calculadas para todas las muestras de calibración. Este proceso se puede efectuar también con un
grupo de muestras. En lugar de omitir una muestra, se omite un grupo de muestras. La SECVes una medida de la exactitud
del modelo que se puede esperar en mediciones futuras si no se cuenta con suficientes muestras para calcular la SEPa partir de
un conjunto de validación completamente independiente.
ERRORESTÁNDARDEL LABORATORIO(SEL, PORsus SIGLASEN INGLÉS)es un cálculo basado en las lecturas repetidas de una o más
muestras para estimar la precisión y/o exactitud del método del laboratorio de referencia, según cómo se hayan obtenido los
datos.
ESPECTRO DE FONDO se usa para generar un espectro de muestra con contribuciones mínimas de la respuesta del instrumento.
También se conoce como espectrode referenciao referenciade fondo. La relación entre el espectro de muestra y el espectro de
fondo produce un espectro de transmitancia o reflectancia dominado por la respuesta espectral NIR asociada con la muestra.
tn mediciones de reflexión, un material de referencia estándar altamente reflectivo y difuso sirve para la medición del espectro
de fondo. Para la medición de la transmisión, el espectro de fondo se puede medir sin que haya muestra presente en el espec-
trómetro, o usando una celda con un blanco de disolvente o una celda llena del material de referencia apropiado.
8006 (1119) Espectroscopía en el IR Cercano / InformaciónGeneral USP42
ESPECTRO DEREFERENCIA-Ver Espectrode Fondo.

LINEALIDAD FOTOMÉTRICA, también llamada verificaciónfotométrica, es el proceso de verificaciónde la respuesta de la escala
fotométrica de un instrumento.
MODELO DECALIBRACIÓN es una expresión matemática que relaciona la respuesta de un instrumento analítico con las propie-
dades de las muestras.
RAÍZMEDIA CUADRÁTICA DELRUIDO (RMS,PORsus SIGLAS ENINGLÉS) se calcula mediante la ecuación:
1 N( -i2
RMS= --¡;¡'f
A,-A
en donde A; es la absorbancia para cada punto de análisis;A es la absorbancia media del segmento espectral; y N es la canti-
dad de puntos por segmento.
REFLECTANCIA se describe mediante la ecuación:
en donde I es la intensidad de la radiación reflejada desde la superficie de la muestra; e 1,es la intensidad de la radiación refle-
jada desde un material de referencia de fondo y sus pérdidas incorporadas debido a la absorción, refracción y dispersión del
disolvente.
REFLECTANCIA DESUPERFICIE, también llamada reflexiónespecular,es la porción de la radiación que no interactúa con la muestra
sino que simplemente se refleja desde la capa superficialde la muestra (interfase muestra-aire).
REFLECTANCIA DIFUSA es la relación entre el espectro de luz irradiada que penetra en la superficie de la muestra, interactúa con
la muestra, vuelve a pasar por la superficie de la muestra y alcanza el detector, y el espectro de fondo. Éste es el componente
de la reflectancia total que permite obtener el espectro de absorción de la muestra.
REFLECTANCIA ESPECULAR (SUPERFICIAL)es la reflectancia de superficiefrontal de la muestra.
REFLECTANCIA TOTAL es la suma de reflectancia difusa y especular.
REGRESIÓN DECOMPONENTES PRINCIPALES
(PCR,PORsus SIGLAS ENINGLÉS) es un algoritmo de calibración para relacionar la res-
puesta de un instrumento analítico con las propiedades de las muestras. Este algoritmo, que expresa un set de variables inde-
pendientes como una combinación lineal de factores, es un método para relacionar estos factores con las propiedades de las
muestras para las cuales se han obtenido las variables independientes.
REGRESIÓN LINEAL MÚLTIPLE es un algoritmo de calibración para relacionar la respuesta de un instrumento analítico con las pro-
piedades de las muestras. La característica distintiva de este algoritmo es el uso de una cantidad limitada de variables indepen-
dientes. Se realizan cálculos de cuadrados mínimos lineales para establecer la relación entre estas variables independientes y las
propiedades de las muestras.
SEUDOABSORBANCIA A, está representada
, por la ecuación:
A =-log R = log (1/ R)
donde R es la reflectancia difusa de la muestra.
SONDAS DEFIBRA ÓPTICA contienen dos componentes: fibras ópticas, que pueden variar en longitud y en cantidad de fibras, y
un terminal que contiene elementos ópticos especialmente diseñados para examinar la matriz de la muestra.
TRANSFLEXIÓN es una técnica para medir la transmitancia, en la cual la radiación atraviesa la muestra dos veces. La segunda
vez se produce después de que la radiación se reflejadesde una superficie por detrás de la muestra.
TRANSMITANCIA se representa por la ecuación:
T = lila O T = 1QA
en donde I es la intensidad de la radiación transmitida a través de la muestra; la es la intensidad de la energía radiante inciden-
te sobre la muestra e incluye las pérdidas debidas a la absorción, refracción y dispersión del disolvente; y A es la absorbancia.
(1120) ESPECTROSCOPÍA
RAMAN
INTRODUCCIÓN
La espectroscopía Raman es una técnica espectroscópica vibracionaly, por tanto, está relacionada con la espectroscopía en
el infrarrojo (IR}y en el infrarrojo cercano (NIR,por sus siglas en inglés). Elefecto Raman en sí mismo surge como resultado de
un cambio en la polarizabilidadde enlaces moleculares durante un determinado modo vibracional y se mide como radiación
dispersada inelásticamente.
Un espectro Raman se genera mediante la excitación de la muestra de interés a un estado virtual con una fuente monocro-
mática, generalmente un láser. La luz dispersada elásticamente (sin cambio en la longitud de onda) se conoce como dispersión
de Rayleighy no presenta interés alguno en la espectrometría Raman, excepto para marcar la longitud de onda láser. Sin em-
USP42 InformaciónGeneral/ (1120) Espectroscopía Raman 8007
bargo, si la muestra se relaja a un nivel de energía vibracional que difiere del estado inicial, la radiación dispersada se desplaza
en energía. Este desplazamiento es proporcional a la diferencia de energía entre el estado vibracional inicial y el estado vibra-
cional final. A esta luz "dispersada inelásticamente" se la denomina dispersión Raman. Sólo aproximadamente uno de cada
106- 1osfotones que inciden sobre la muestra experimenta dispersión Raman. Por ello se emplean láseres en los espectróme-
tros Raman. Si el fotón Raman dispersado es de energía menor, se denomina dispersión de Stokes. Si es de energía mayor, se
denomina dispersión anti-Stokes. En la práctica, casi todas las mediciones Raman útiles desde el punto de vista analítico usan la
dispersión Raman de desplazamiento Stokes.
El espectro Raman es muy similar al espectro infrarrojo graficado linealmente en absorbancia. Las intensidades, o el número
de fotones Raman contados, se grafican en función de las energías de desplazamiento. El eje x generalmente se denomina
"Desplazamiento Raman/cm- 1" o "Número de onda/cm- 1". El desplazamiento Raman normalmente se expresa en número de
onda y representa la diferencia entre el número de onda absoluto del pico y el número de onda del láser. El espectro se inter-
preta del mismo modo que el espectro infrarrojo medio correspondiente. Las posiciones de los números de onda (desplazados
de Raman) para un modo vibracional dado son idénticos a los números de onda de las bandas correspondientes en un espec-
tro de absorción IR. Sin embargo, los picos más fuertes en un espectro Raman a menudo son débiles en un espectro IRy vice-
versa. Por este motivo, con frecuencia se dice que las dos técnicas espectroscópicas son complementarias.
La espectroscopía Raman es ventajosa porque a menudo se pueden realizar mediciones rápidas y exactas sin destruir la
muestra (sólida, semisólida, líquida o, con menor frecuencia, gas) y sin necesidad de preparar la muestra o con una prepara-
ción mínima. El espectro Raman contiene información sobre modos vibracionales fundamentales de la muestra que puede pro-
porcionar una comprensión tanto de la muestra como del proceso. La señal generalmente se encuentra dentro del intervalo
visible o del IR cercano, lo que permite un acoplamiento eficiente con la fibra óptica. Esto también significa que se puede obte-
ner una señal partiendo de cualquier medio que sea transparente a la luz del láser, como por ejemplo vidrios, plásticos o mues-
tras en medios acuosos. Además, dado que los espectros Raman se excitan por lo general con radiación visible o IR cercano,
pueden usarse elementos ópticos estándar de cuarzo o vidrio. Desde un punto de vista instrumental, los sistemas modernos
son fáciles de usar, proporcionan rápidos tiempos de análisis (desde segundos a varios minutos) y son confiables. Sin embargo,
debe tenerse presente el peligro de usar láseres de alta potencia, en especial cuando sus longitudes de onda están en el IR
cercano y, por lo tanto, no son visibles al ojo humano. Las sondas de fibra óptica se deben usar con precaución y respetando
las reglamentaciones gubernamentales apropiadas en lo que respecta a láseres y sus clases.
Además de la espectroscopía Raman "normal", existen varias técnicas Raman más especializadas. Éstas incluyen resonancia
Raman (RR), espectroscopía Raman de superficie amplificada (SERS,por sus siglas en inglés), actividad óptica Raman (ROA, por
sus siglas en inglés), espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS,por sus siglas en inglés), espectroscopía de ganancia
o de pérdida Raman y espectroscopía hiper-Raman. Estas técnicas no se usan ampliamente en los laboratorios farmacéuticos y
no se tratan en este capítulo de información general.
MEDICIONESRAMAN CUALITATIVAS
Y CUANTITATIVAS
Existen dos clases generales de mediciones que se realizan comúnmente con espectrometría Raman: cualitativa y cuantitati-
va.
Mediciones Raman Cualitativas
Las mediciones Raman cualitativas proporcionan información espectral sobre los grupos funcionales presentes en una mues-
tra. Debido a que el espectro Raman es específico para un compuesto dado, las mediciones Raman cualitativas se pueden usar
como una prueba de identificación farmacopeica, así como también para elucidación estructural.
Mediciones Raman Cuantitativas
Para instrumentos equipados con un detector que mide la potencia óptica (como un espectrómetro transformador de Fou-
rier [FT,por sus siglas en inglés]-Raman), las mediciones Raman cuantitativas utilizan la siguiente relación entre señal, Sw a un
determinado número de onda, v, y la concentración de un analito, C:
Sv= Ko"v(vL- Vp ) 4P0C
en donde K es una constante que depende del diámetro del rayo láser, los elementos ópticos de recolección, el volumen de la
muestra y la temperatura; uv es la sección transversal Raman del modo vibracional en particular; vL es el número de onda del
láser; vp es el número de onda del modo vibracional; y P0 es la potencia del láser. La sección transversal de Raman, a:.¡,es
característica de la naturaleza del modo vibracional en particular. Elvolumen de muestra está definido por el tamaño del foco
del rayo láser en la muestra, el elemento óptico usado para enfocar y las propiedades ópticas de la muestra misma. El tamaño
de las zonas de medida sobre la muestra puede variar desde menos de 1 µm para una microsonda, hasta 6 mm para un siste-
ma de muestreo de gran superficie. Para espectrómetros Raman que miden la cantidad de fotones por segundo (tales como
los espectrómetros con dispositivos de acoplamiento de carga [CCD, por sus siglas en inglés]-Raman), la ecuación correspon-
diente es:
8008 (1120) Espectroscopía Raman / Información General USP42
Sv = Ka-vvL(vL-Vp ) 3P0C
En las ecuaciones anteriores se observa que la señal del pico es directamente proporcional a la concentración. Esta relación es
la base para la mayoría de las aplicaciones Raman cuantitativas.
FACTORESQUEAFECTANLA CUANTIFICACIÓN
Factores Basados en la Muestra
Los factores más importantes, basados en la muestra, que afectan negativamente la espectrometría Raman cuantitativa son
la fluorescencia, el calentamiento de la muestra, la absorción de la matriz o de la misma muestra y el efecto de polarización. Si
la matriz de la muestra incluye compuestos fluorescentes, la señal medida por lo general contendrá una contribución de la
fluorescencia. La fluorescencia se observará solo si la longitud de onda de la excitación del láser se superpone a una banda de
absorción de un compuesto fluorescente. La fluorescencia se observa generalmente como un amplio fondo en pendiente sub-
yacente al espectro Raman. La fluorescencia puede ocasionar tanto un desplazamiento de la línea base como una reducción de
la relación señal-ruido. El intervalo de longitud de onda y la intensidad de la fluorescencia dependen de la composición quími-
ca del material fluorescente. Debido a que la fluorescencia es generalmente un proceso mucho más eficiente que la dispersión
Raman, incluso cantidades muy pequeñas de impurezas fluorescentes pueden dar como resultado una degradación significati-
va de la señal Raman. La fluorescencia se puede reducir utilizando fuentes de excitación de longitud de onda más larga, tales
como 785 nm o 1064 nm. Sin embargo, cabe recordar que la intensidad de la señal Raman es proporcional a (vL - vp )4, de
manera que la ventaja de usar un láser de excitación de longitud de onda larga para minimizar la fluorescencia es al menos
parcialmente compensada por una reducida intensidad de la señal Raman. La mejor relación señal-ruido se obtendrá equili-
brando el rechazo de la fluorescencia, la intensidad de la señal y la respuesta del detector.
La fluorescencia en los sólidos se puede mitigar en ocasiones exponiendo la muestra a la radiación láser durante un período
dado anterior a la medición. Este proceso se denomina fotoblanqueo (photobleaching) y funciona degradando las especies de
alta absorción. El fotoblanqueo es menos eficaz en líquidos, cuando la muestra es móvil o si la cantidad de material fluorescen-
te es más que trazas.
El calentamiento de las muestras con la fuente de láser puede causar una variedad de efectos, como por ejemplo cambios en
la forma física (fusión), conversión polimórfica o el quemado de la muestra. La probabilidad de que la muestra se caliente es
mayor cuando el tamaño de las zonas de medida en la muestra es más pequeño, es decir, cuando se usa una microsonda. Esto
es generalmente un problema para las especies coloreadas de alta absorción o para partículas muy pequeñas con una baja
transferencia de calor. Los efectos del calentamiento de la muestra generalmente se observan como cambios en el espectro
Raman con el transcurso del tiempo o mediante una inspección visual de la muestra. Además de disminuir el flujo láser, se
puede emplear una variedad de métodos para disminuir el calentamiento inducido por láser, como por ejemplo mover la
muestra o el láser durante la medición o mejorar la transferencia de calor a partir de la muestra mediante contacto térmico o
inmersión en un líquido.
También puede suceder que la matriz o la misma muestra absorba la señal Raman. Este problema prevalece más con siste-
mas FT-Ramande longitud de onda larga donde la señal Raman puede superponerse con la absorción de sobretonos del IR
cercano. Este efecto dependerá de los elementos ópticos en el sistema así como también de la presentación de la muestra. La
variabilidad de la dispersión en sólidos se asocia con este efecto como resultado de las diferencias en el tamaño de partículas y
la compactación. Sin embargo la magnitud de todos estos efectos generalmente es menos grave que en NIR debido a que en
la espectroscopía Raman la profundidad de penetración es limitada y a que se utiliza una región de longitudes de onda relati-
vamente más estrecha.
Finalmente, se debe reconocer que la radiación láser está polarizada y los espectros Raman de los materiales cristalinos y de
otras muestras orientadas pueden diferir significativamente, dependiendo de la forma en que se coloque la muestra. Si el es-
pectrómetro Raman es capaz de producir una radiación polarizada linealmente en la muestra, entonces se recomienda un des-
polarizador (polarization scrambler) para los análisis rutinarios de muestras.
Factores de Muestreo
La espectroscopía Raman es una técnica sin ruido de fondo, en donde la señal esperada en el detector en ausencia de la
muestra es cero. Esta situación puede contrastarse con espectrometría de absorción, donde la señal en el detector es máxima
en ausencia de la muestra. Las técnicas sin ruido de fondo son inherentemente sensibles debido a que pequeños cambios en la
concentración de la muestra conducen a cambios proporcionales en los niveles de la señal. El instrumento también será sensi-
ble a otras fuentes de luz que pueden causar variaciones de una muestra a otra en el nivel medido de la señal. Adicionalmente,
una señal fuerte de fondo, causada por fluorescencia conducirá a un incremento del nivel de ruido (photon noise shot). Por
tanto, puede ser muy difícil usar la señal Raman absoluta para la determinación directa de un analito. Otras fuentes potenciales
de variación son los cambios en la opacidad y la heterogeneidad de la muestra, los cambios de la potencia del láser sobre la
muestra y los cambios de la geometría de recolección óptica o la posición de la muestra. Estos efectos se pueden minimizar
realizando el muestreo de una forma reproducible y representativa. El diseño cuidadoso de la instrumentación puede reducir
estos efectos pero no los puede eliminar por completo.
USP42 Información General/ (1120) Espectroscopía Raman 8009
El uso de un estándar interno de referencia es el método más común y robusto para eliminar las variaciones debidas a las
fluctuaciones de intensidad absoluta. Existen varias opciones para este enfoque. Se puede agregar deliberadamente un están-
dar interno y se pueden emplear picos aislados de este estándar; o también puede usarse una banda debida a una subunidad
molecular, como un anillo aromático, cuya sección transversal Raman no cambia con la forma en que se prepara la muestra.
Para los espectros en solución, se puede emplear una banda de disolvente aislada ya que el disolvente permanecerá relativa-
mente sin cambios entre una muestra y otra. Además, en una formulación, se puede usar un pico de excipiente si está en un
exceso considerable en comparación con el analito. También se puede usar todo el espectro como referencia, asumiendo que
los cambios de orientación de la muestra y el láser afectarán a todo el espectro por igual.
Un segundo factor importante basado en el muestreo a tener en cuenta es la contaminación espectral. El efecto de disper-
sión Raman es débil y puede ser enmascarado por una cantidad de fuentes externas. las fuentes de contaminación comunes
incluyen artefactos de los portamuestras (recipiente o sustrato) y luz ambiental. Generalmente, estos problemas se pueden
identificar y resolver mediante una experimentación cuidadosa.
APARATO
Componentes
Todas las mediciones Raman modernas implican la irradiación de una muestra con láser, la recolección de la radiación dis-
persada, rechazando la dispersión Rayleigh de luz, diferenciando los fotones Raman por longitud de onda, y detectando el es-
pectro Raman resultante. En consecuencia, todos los instrumentos Raman comerciales comparten las siguientes características
comunes para realizar estas funciones:
1 . Fuente de excitación (láser)
2. Dispositivo de muestreo
3. Dispositivo para filtrar/rechazar la luz dispersada a la longitud de onda del láser
4. Unidad de procesamiento de longitud de onda
5. Detector y componentes electrónicos
FUENTEDE EXCITACIÓN(LÁSER)
la Tabla 1 identifica varios láseres comúnmente usados para aplicaciones farmacéuticas o espectrometría Raman. También se
han usado láseres UV para aplicaciones especializadas, pero éstos tienen muchas desventajas que limitan su utilidad para medi-
ciones analíticas generales. A medida que se describan más aplicaciones para los láseres UV,es probable que se vuelvan más
comunes para la espectrometría Raman.
Tabla 1. Láseres Usados en Apllcaclones Farmacéuticas
Intervalo de Longitud de
Potencia Tlplca Onda, nm (Reglón Stokes,
:\.del láser, nm (núme- 100 cm- 1 a 3000 cm- 1 des-
ro entero más cercano) Tipo en el Láser plazamlento) Comentarlos
LáseresNIR
1064 Estado sólido Hasta 3 W 1075-1563 Usados comúnmente en instrumentos de
(Nd:YAG) transformada de Fourier
830 Diodo Hasta 300 mW 827-980 Limitado por lo general a 2000 cm- 1; Des-
plazamiento Raman debido a respuesta
espectral CCD; menos común que otros
láseres
785 Diodo Hasta 500 mW 791-1027 LáseresRaman de dispersión más usado
LáseresVisibles
632,8 He-Ne Hasta 500 mW 637-781 RiesQode fluorescencia relativamente bajo
532 Duplicado Hasta 1 W 535-632,8 Alto riesgo de fluorescencia
(Nd:YAG)
514,5 Ar+ Hasta 1 W 517-608 Alto riesqo de fluorescencia
488--632,8 Ar+ Hasta 1 W 490-572 Alto riesqo de fluorescencia
DISPOSITIVODE MUESTREO
Existen varios dispositivos de muestreo posibles, incluyendo interfases ópticas directas, microscopios, sondas basadas en fibra
óptica (ya sean elementos ópticos de inmersión o sin contacto) y cámaras de muestras (incluyendo portamuestras especiales y
cambiadores de muestras automatizados). También se pueden diseñar elementos ópticos de muestreo para obtener un espec-
tro Raman dependiente de la polarización, que a menudo contiene información adicional. la selección del dispositivo de
muestreo a menudo depende de la muestra y del analito. Sin embargo, para optimizar el dispositivo de muestreo para una
801 O (1120) Espectroscopía Raman / Información General USP42
aplicación en particular, se deben evaluar consideraciones tales como el volumen de muestreo, la velocidad de la medición, la
seguridad del láser y la reproducibilidad en la presentación de la muestra.
DISPOSITIVODE FILTRACIÓN
La intensidad de luz dispersada a la longitud de onda del láser (Rayleigh) es varios órdenes de magnitud mayor que la señal
Raman y debe rechazarse antes del detector. Los filtros de banda escalonada se utilizan casi universalmente para este propósito
y proporcionan un rechazo y estabilidad excelentes con un tamaño pequeño. El uso tradicional de monocromadores de múlti-
ples etapas para este propósito, si bien aún es viable, ya casi no se usa. Además, se pueden necesitar varios filtros o barreras
físicas para proteger la muestra de fuentes de radiación externa (p. ej., luz ambiental, líneas de plasma láser) dependiendo de
la geometría de recolección del instrumento.
UNIDADDE PROCESAMIENTODE LONGITUDDE ONDA
La escala de longitud de onda se puede procesar con un monocromador de barrido, un policromador de red de dispersión
(en los espectrómetros CCD-Raman) o un interferómetro de doble haz (en espectrómetros-FT Raman). Un análisis de los bene-
ficios y desventajas específicos de cada uno de los diseños de dispersión comparados con el instrumento FT se encuentra fuera
del alcance de este capítulo. Cualquier instrumento debidamente calificado debería ser apto para las mediciones cualitativas.
Sin embargo, se debe tener cuidado al seleccionar un instrumento para realizar mediciones cuantitativas, ya que la linealidad
de respuesta y dispersión podría no ser uniforme en todo el intervalo espectral.
DETECTOR
El dispositivo de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés) a base de silicio es el detector más común para los
instrumentos de dispersión. El dispositivo detector enfriado permite mediciones a lo largo del intervalo espectral desde 4500
cm- 1 a 100 cm- 1 de desplazamiento Raman con bajo ruido, cuando se usan la mayoría de los láseres visibles, tales como el de
frecuencia duplicada de itrio-aluminio-granate dopado con neodimio (Nd:YAG)(532 nm) o el de helio-neón (632,8 nm).
Cuando se usa un láser de diodo de 785 nm, el intervalo de longitud de onda se reduce aproximadamente de 3100 cm- 1 a
100 cm- 1• El CCD más comúnmente usado tiene su máxima respuesta cuando se lo acopla al láser de gas He-Ne de 632,8 nm
o el láser de diodo de 785 nm generalmente usado. Los instrumentos de transformación de Fourier normalmente utilizan de-
tectores de un solo canal de germanio o de indio-galio arseniuro (lnGaAs) sensibles en el NIR para igualar la excitación a 1064
nm del láser de Nd:YAG.
Calibración
La calibración del instrumento Raman incluye tres componentes: longitud de onda primaria (eje x), longitud de onda del
láser e intensidad (eje y).
LONGITUDDE ONDA PRIMARIA(EJEX)
En el caso de instrumentos FT-Raman, la calibración del eje de longitud de onda primaria se mantiene, al menos en la prime-
ra aproximación, con un láser interno de He-Ne. La mayoría de los instrumentos dispersivos utilizan lámparas de emisión ató-
mica para la calibración del eje de longitud de onda primaria. En todos los instrumentos adecuados para mediciones analíticas
Raman, el proveedor ofrecerá un procedimiento de calibración del eje x que el usuario puede realizar. Para los instrumentos de
dispersión Raman, se prefiere una calibración basada en múltiples líneas de emisión atómica. La validez de este enfoque para la
calibración se puede verificar después de la calibración de la longitud de onda del láser usando un estándar de desplazamiento
Raman adecuado. Para los instrumentos de barrido dispersivo, puede ser que la calibración se deba realizar con mayor frecuen-
cia, y puede ser que se tenga que verificar la precisión tanto en el modo operativo de barrido como en el estático. 1
LONGITUDDE ONDA DELLÁSER
La variación de la longitud de onda del láser puede afectar tanto la precisión de la longitud de onda como la precisión foto-
métrica (señal) de un instrumento dado. Incluso los láseres actuales más estables pueden variar levemente la longitud de onda.
Por tanto, se debe confirmar la longitud de onda para asegurar que las posiciones de desplazamiento Raman sean exactas tan-
to para instrumentos FT-Raman como para los instrumentos Raman dispersivos. Para este propósito se pueden utilizar materia-
les estándar de referencia de desplazamiento Raman como los descritos en ASTM El 840-96 (2002) 1 u otros materiales verifica-
dos adecuadamente. [NOTA-Los valores estándar de desplazamiento Raman confiables para los reactivos líquidos y sólidos uti-
1
ASTM El 840-96(2002) Standard Guidefor RamanShift Standardsfor SpectrometerCalibrotion,ASTM lntemational, 100 Barr Harbar Drive, PO Box C700, West
Conshohocken, PA, USA 19428-2959.
lizados frecuentemente, necesarios para la calibración del número de onda de los espectrómetros Raman, se proporcionan en
la citada guía de normas ASTM. Se pueden utilizar estos valores además de las líneas de emisión de las lámparas de arco de
baja presión y alta precisión y exactitud que también están disponibles para usar en la calibración de los instrumentos Raman.]
Materiales de grado espectrométrico se pueden comprar a los proveedores apropiados para este uso. Ciertos instrumentos
pueden utilizar un estándar Raman interno separado del recorrido óptico principal. Los dispositivos de calibración externa re-
producen exactamente el recorrido óptico tomado por la radiación dispersada. [NOTA-Cuando se utilizan estándares quími-
cos, se debe tener cuidado de evitar la contaminación y confirmar la estabilidad del estándar.]
A menos que el instrumento sea de un tipo de calibración continua, la calibración del eje de longitud de onda primaria debe
realizarse, según los procedimientos del proveedor, justo antes de la medición de la longitud de onda del láser. Para la calibra-
ción externa, el estándar de desplazamiento Raman se debe colocar en la misma ubicación y se debe medir utilizando paráme-
tros de captación apropiados. Se deberá evaluar el centro del pico de una banda fuerte, bien resuelta en la región espectral de
interés. La posición se puede determinar manualmente o con un algoritmo válido de detección de picos adecuado. El software
que proporciona el proveedor podría medir la longitud de onda del láser y ajustarla apropiadamente para que este pico se
posicione correctamente. Si el proveedor no proporciona esta funcionalidad, la longitud de onda del láser se debe ajustar ma-
nualmente. Dependiendo del tipo de láser, su longitud de onda puede variar con la temperatura, la corriente y el voltaje. Las
tolerancias de longitud de onda pueden variar dependiendo de la aplicación específica.
INTENSIDADDE LASEÑAL(EJEY)
La calibración del eje fotométrico puede ser crítica para la cuantificación exitosa usando ciertos métodos analíticos (quimio-
metría) y para la transferencia de métodos entre instrumentos. Tanto los espectrómetros FT-Raman como los espectrómetros
Raman dispersivos deben pasar por procedimientos de calibración similares. La tolerancia de la precisión fotométrica aceptable
para una medición dada debe establecerse durante la etapa de desarrollo del método.
Para calibrar la respuesta fotométrica de un instrumento Raman, se debe utilizar una fuente de emisión de banda ancha.
Existen dos métodos aceptados. El Método A, utiliza una fuente de luz blanca de tungsteno. 2 La potencia de dichas fuentes es
rastreable al Instituto Nacional de Metrología (NMI, por sus siglas en inglés). En el Reino Unido, el Laboratorio Nacional de
Física suministra también bombillas de luz calibradas. Muchos otros proveedores suministran también estándares de calibra-
ción de irradiación rastreable al NIST.Este método se aplica a todas las longitudes de onda de excitación comunes de los láse-
res enumeradas en la Tabla 1. En el Método 8, se utilizan los materiales de referencia estándar (SRM, por sus siglas en inglés)
NIST.3 Varios estándares de fluorescencia de vidrio dopado están actualmente disponibles.
Método A-La fuente debe colocarse en la ubicación de la muestra con el láser apagado y medir la respuesta del detector
(usando parámetros apropiados para el instrumento). Se debe conocer la potencia de la fuente usada para la calibración. La
relación de la respuesta medida con respecto a la respuesta verdadera debe determinarse y se debe generar un archivo de
corrección. Esta corrección se debe aplicar a todos los espectros captados con el instrumento. La mayoría de los fabricantes
proporcionarán tanto fuentes apropiadas de calibración como software para este enfoque. Si el fabricante no proporciona un
procedimiento o un método, el usuario puede realizar la tarea utilizando una fuente obtenida del NISTy un software apropia-
do. Si se utiliza el método de un fabricante, se debe prestar atención al procedimiento de calibración y a la validez de la fuen-
te. El usuario debe obtener documentación apropiada del fabricante para asegurar un enfoque calificado.
Método B-EI estándar de fluorescencia debe colocarse en la ubicación de la muestra. Con el láser encendido, se debe ob-
tener un espectro del SRM (utilizando parámetros apropiados para el instrumento). El valor de la potencia de la fuente usada
para la calibración debe ser conocido. La relación de la respuesta medida con respecto a la respuesta verdadera debe determi-
narse y se debe generar un archivo de corrección. Esta corrección se debe aplicar a todos los espectros captados con el instru-
mento. La mayoría de los fabricantes proporcionarán tanto fuentes apropiadas de calibración como software para este enfo-
que. Si el fabricante no proporciona un procedimiento o un método, el usuario puede realizar la tarea utilizando una fuente
obtenida del NISTy un software apropiado. Si se utiliza el método de un fabricante, se debe prestar atención al procedimiento
de calibración y a la validez de la fuente. El usuario debe obtener documentación apropiada del fabricante para asegurar un
enfoque calificado. [NOTA-El Método 8 es adecuado actualmente para sistemas con excitación del láser de 785 nm (SRM
2241 ), 532 nm (SRM2242) y tanto para 514,5 nm como para 488 nm (SRM 2243). El NIST está desarrollando actualmente
otros materiales SRM que serán específicos para longitudes de onda de excitación de 1064 nm (SRM 2244) y 632,8 nm (se
espera que estén disponibles en 2006).]
CALIBRACIÓN
EXTERNA
Se recomienda la validación funcional detallada empleando estándares de referencia externos para demostrar la aptitud ins-
trumental de instrumentos de laboratorio, incluso para aquellos instrumentos que poseen sistemas internos de calibración. El
uso de estándares de referencia externos no evita la necesidad de procedimientos internos de control de calidad; por el contra-
2
Declaración de fuente de luz blanca de tungsteno rastreable al NIST:Mientras que la calibración del eje de frecuencia Raman (o desplaiamiento Raman, cm· 1)
utilizandomaterialespurosy una nonna ASTMexistente es muy aceptada, las técnicas parala calibracióndel eje de intensidadRamanno lo son. Lascalibraciones
de intensidad de los espectros Raman se pueden lograr con fuentes de luz blanca cert~icadas.
3
NISTSRM 2241: Ray KG, McCreery RL.Raman intensity correction standard for systems operating with 785-nm excitation. Appl. Spectrosc.1997,51, 108-116.
4
8012 (1120) Espectroscopía Raman / InformaciónGeneral USP42
rio, proporciona documentación independiente sobre la aptitud del instrumento para realizar el análisis o aplicación específi-
cos. Para los instrumentos instalados en sitios de procesamiento o en un reactor donde el posicionamiento de un estándar ex-
terno de forma rutinaria no es posible, incluidos aquellos instrumentos que poseen sistemas internos de calibración, se debe
realizar la verificación periódica del desempeño relativo del sistema de calibración interna y externa. El propósito de esta prue-
ba es comprobar los cambios en los componentes que no puedan incluirse en el método de calibración interna (lentes de pro-
ceso, sonda de fibra óptica, etc.), p. ej., la calibración fotométrica del sistema óptico.
CALIFICACIÓY
N VERIFICACIÓDE
N ESPECTRÓMETROS
RAMAN
La aptitud de un instrumento específico para un método dado se asegura mediante una evaluación exhaustiva de aptitud
tecnológica para la aplicación; una calificación operativa, rutinaria y periódica del instrumento; y la verificación de desempeño
más frecuente (ver Definiciónde Términosy Símbolos).El propósito de la evaluación de aptitud tecnológica es asegurar que la
tecnología propuesta es adecuada para la aplicación prevista. El propósito de la calificación del instrumento es asegurar que el
instrumento a usar sea adecuado para su aplicación prevista y, cuando se vuelva a calificar periódicamente, éste continúe fun-
cionando correctamente durante largos períodos de tiempo. Cuando el dispositivo se usa para un análisis cualitativo o cuanti-
tativo específico, se realizan verificaciones regulares del desempeño. Debido a que existen muchos enfoques distintos para me-
dir los espectros Raman, la calificación operativa del instrumento y la verificación del desempeño a menudo emplean estánda-
res externos que se pueden utilizar en cualquier instrumento. Como con cualquier dispositivo espectrométrico, un instrumento
Raman debe estar calificado tanto para la precisión del número de onda (eje x y desplazamiento de la fuente de excitación)
como para la precisión fotométrica (eje de señal).
En la verificación del desempeño, se puede emplear la calidad de ajuste a un barrido inicial o grupo de barridos (a menudo
llamada acumulación, en los instrumentos que no son de barrido) incluidos en la calificación instrumental. Se supone que, en
tal análisis, los espectros del estándar de referencia recogidos con un instrumento nuevo o recientemente reparado, que fun-
cione correctamente, representan los mejores espectros disponibles. La comparación de los espectros tomados a lo largo del
tiempo con estándares de referencia idénticos (ya sea el estándar original o nuevos estándares idénticos si la estabilidad de los
estándares de referencia es cuestionable) constituye la base para evaluar la estabilidad a largo plazo de un sistema de medición
Raman.
Frecuencia de Prueba
La calificación instrumental se realiza a intervalos especificados o después de una reparación o una reconfiguración óptica
significativa, tal como el reemplazo del láser, el detector o los filtros de banda escalonada o de borde. La recalificación total del
instrumento podría no ser necesaria cuando se cambian accesorios de muestreo como una microsonda, un compartimiento de
muestra o una sonda de fibra óptica fija. Las pruebas de verificación de desempeño pueden ser suficientes en estos casos; se
deberán seguir las pautas específicas para el instrumento proporcionadas por el proveedor sobre los requisitos de calificación.
Las pruebas incluyen la precisión de la longitud de onda (eje x y desplazamiento de la fuente de excitación) y la precisión foto-
métrica (eje de señal). Las pruebas de calificación del instrumento exigen que se cumpla con las tolerancias específicas depen-
dientes de la aplicación.
La verificación de desempeño se lleva a cabo en el instrumento configurado para las mediciones analíticas y se realiza más
frecuentemente que la calificación del instrumento. La verificación de desempeño incluye la medición de la incertidumbre de
la longitud de onda y la precisión de la escala de intensidad. Las pruebas de precisión de longitud de onda y de precisión de la
escala de intensidad pueden ser necesarias antes de la adquisición de datos en un día dado. El desempeño se verifica compa-
rando los espectros actuales con los recogidos durante la calificación anterior del instrumento.
Calificación Operativa del Instrumento
Es importante notar que las especificaciones de aceptación dadas en las secciones CalificaciónOperativadel Instrumentoy en
Calificaciónde Desempeñose aplican al uso general; las especificaciones para los instrumentos y las aplicaciones particulares
pueden variar según el método de análisis usado y la exactitud deseada en el resultado final. También se especifican los mate-
riales de referencia estándar de ASTM,entendiendo que bajo ciertas circunstancias (específicamente aplicaciones remotas en
línea) la calibración usando uno de estos materiales puede ser poco práctica y se pueden utilizar otros materiales verificados
adecuadamente. En este punto es importante destacar que se deben incluir parámetros específicos, como el ruido del espec-
trómetro, los límites de detección (LOD, por sus siglas en inglés), los límites de cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés) y
el ancho de banda espectral aceptable, para cualquier aplicación dada como parte del desarrollo del método analítico. Los va-
lores específicos para las pruebas, como el ruido del espectrómetro y el ancho de banda, dependerán del instrumento elegido
y del propósito de la prueba. Como resultado, las pruebas específicas del instrumento para estos parámetros no se incluyen en
este capítulo informativo.
DE LA LONGITUDDE ONDA (EJEX)

EXACTITUD
Es importante asegurar la exactitud del eje de la longitud de onda a través de la calibración, para mantener la integridad de
las posiciones de los picos Raman. La calibración de la longitud de onda de un espectrómetro Raman consta de dos partes:
calibración del eje de longitud de onda primaria y la calibración de la longitud de onda del láser. Después de calibrar tanto el
eje de longitud de onda primaria como la longitud de onda del láser, se puede determinar la incertidumbre de la longitud de
onda del instrumento. Esto se puede lograr usando un estándar de desplazamiento Raman como los estándares de desplaza-
miento ASTMu otro material verificado en forma adecuada. Se recomienda la elección de un estándar con bandas presentes a
lo largo de todo el intervalo espectral Raman para que la incertidumbre de la longitud de onda del instrumento se pueda eva-
luar en varias posiciones dentro del espectro. La tolerancia de la precisión de la longitud de onda necesaria para una medición
dada debe determinarse durante la etapa de desarrollo del método. [NOTA-Para los instrumentos de dispersión de barrido, es
posible que se necesite realizar la calibración con mayor frecuencia y puede ser que se tenga que verificar la precisión tanto en
el modo operativo de barrido como en el estático.]
PRECISIÓNFOTOMÉTRICA
La variación del láser con respecto a la cantidad total de fotones emitidos que ocurre durante dos mediciones puede causar
cambios en la precisión fotométrica del instrumento. Desafortunadamente, es muy difícil separar los cambios en la respuesta
fotométrica asociada a las variaciones en la cantidad total de fotones emitidos por la muestra y las perturbaciones inducidas
por el muestreo. Ésta es una de las razones por las que las mediciones Raman absolutas no se recomiendan y el motivo por el
cual se fijan especificaciones de precisión fotométrica relativamente amplias. La tolerancia de la precisión fotométrica necesaria
para una medición dada debe evaluarse durante la etapa de desarrollo del método.
CALIFICACIÓN
DE DESEMPEÑO
El objetivo de la calificación de desempeño es asegurar que el instrumento se desempeñe dentro de límites especificados
con respecto a la precisión de la longitud de onda, la precisión del eje fotométrico y la sensibilidad. En algunos casos, cuando
el instrumento haya sido ajustado para una medición específica (por ejemplo, cuando se lo instala en un reactor de proceso),
puede no ser posible ni deseable medir los estándares de referencia de calificación de la longitud de onda y fotométricos (se-
ñal) que se identificaron anteriormente. Siempre que la calificación operativa del instrumento haya mostrado que el equipo es
apto para ser usado, se puede utilizar un único estándar externo de verificación de desempeño para volver a verificar la función
de modo continuo (por ejemplo, una señal de un disolvente de proceso usada de manera rutinaria, para la precisión tanto de
la longitud de onda como fotométrica, después de la limpieza del reactor). El estándar de verificación de desempeño debe ser
lo más parecido posible en formato a las muestras en análisis y utilizar parámetros similares de adquisición espectral. Las medi-
ciones cuantitativas del espectro de un estándar de verificación de desempeño externo verifican la precisión tanto de la longi-
tud de onda (eje x y longitud de onda del láser) como fotométrica (señal). La comparación favorable de una serie de espectros
de verificación de desempeño demuestra el correcto funcionamiento continuo del instrumento.
PRECISIÓNDE LALONGITUDDE ONDA
La precisión de la longitud de onda debe medirse recolectando datos para un único espectro del estándar de desplazamien-
to Raman seleccionado para un período igual al usado en la prueba de uniformidad fotométrica. Cuando resulte apropiado, las
muestras en polvo se deben recompactar entre un conjunto de mediciones. Las posiciones de los picos a lo largo del intervalo
espectral de interés se utilizan para calcular la precisión. El desempeño se verifica comparando las posiciones actuales de los
picos con las recolectadas durante la calificación anterior del instrumento y no debe variar con una desviación estándar de más
de ±0,3 cm-', si bien esta especificación se puede ajustar según la exactitud necesaria en la medición.
PRECISIÓNFOTOMÉTRICA
La precisión fotométrica debe medirse recolectando datos para un único espectro de un material estándar de referencia veri-
ficado adecuadamente durante un tiempo especificado. Después de una corrección adecuada de la línea base, se deben calcu-
lar las áreas de una cierta cantidad de bandas, a lo largo del intervalo espectral de interés, usando un algoritmo apropiado. El
área de la banda más fuerte se ajusta a 1 y todas las otras se normalizan según esta banda. El desempeño se verifica haciendo
coincidir las áreas de banda actuales con las áreas respectivas recogidas durante la calificación anterior del instrumento. Las
áreas no deben variar en más de 10%, si bien esta especificación se puede ajustar según la exactitud requerida en la medición.
PRECISIÓNY EXACTITUDDE LAPOTENCIADE SALIDADELLÁSER
Esta prueba se aplica únicamente a los instrumentos Raman con medidores automáticos internos de potencia láser. Los ins-
trumentos sin medición de potencia láser deben utilizar un medidor de potencia láser calibrado de un proveedor reconocido.
8014 (1120) Espectroscopía Raman / InformaciónGeneral USP42
La potencia del láser debe ajustarse a una salida representativa, determinada por los requisitos de la medición analítica y por la
potencia del láser medida. La salida debe medirse y verificarse con respecto a la salida medida en la calificación del instrumen-
to. La energía (en milivatios o vatios) no debe variar más del 25% en comparación con el nivel calificado. Si la potencia varía
más de esta cantidad, se le debe realizar un servicio al instrumento (ya que esta variación puede indicar, entre otras cosas, una
gran desalineación del sistema o el principio de una falla del láser).
Para los instrumentos con un medidor automático interno de la potencia láser, la exactitud de los valores generados por el
medidor de potencia interno se debe comparar con un medidor de potencia láser externo calibrado a intervalos no mayores
de 12 meses. El valor calculado internamente se debe comparar con el generado por el medidor externo de potencia. El de-
sempeño se verifica comparando el valor actual con el generado durante la calificación anterior del instrumento. Elfabricante
puede proporcionar un software que facilite este análisis. Si el diseño del instrumento impide el uso de un medidor externo de
potencia, el proveedor debe proporcionar documentación para asegurar la calidad del instrumento y además un procedimien-
to recomendado para realizar el análisis mencionado anteriormente durante una visita de servicio programada.
VALIDACIÓNDE MÉTODOS
La validación de los métodos Raman seguirá los mismos protocolos descritos en Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos
(1225) en términos de exactitud, precisión, etc. Sin embargo, varios de estos criterios se ven afectados por variables específicas
para la espectrometría Raman. La fluorescencia es la principal variable que puede afectar la aptitud de un método. La presencia
de impurezas fluorescentes en las muestras puede ser bastante variable y tener poco efecto en la aceptabilidad de un material.
El método debe ser lo suficientemente flexible para aceptar los diferentes regímenes de muestreo que puedan ser necesarios
para minimizar los efectos de estas impurezas.
Se debe confirmar la linealidad del detector en todo el intervalo de niveles de señal posible. La fluorescencia podría provocar
elevaciones de la línea base y ruidos más allá de los utilizados en la validación, en cuyo caso se debe disminuir la fluorescencia,
o el método se debe modificar para aceptar los niveles de fluorescencia superiores. Esto también es cierto para la precisión, los
límites de detección (LOO) y los límites de cuantificación (LOQ) del método, debido a que un mayor ruido de la línea base
afectará negativamente a todos estos valores. Como la fluorescencia puede influir también en la cuantificación debido a los
desplazamientos en la línea base, se debe confirmar también la cuantificación aceptable a distintos niveles de fotoblanqueo,
cuando se use.
Se debe determinar el impacto del láser sobre la muestra. La inspección visual de la muestra y la inspección cualitativa del
espectro Raman para las mediciones con diferentes potencias de láser y tiempos de exposición confirmarán que la muestra no
se está alterando (excepto por fotoblanqueo). Las variables específicas a confirmar en el espectro son los desplazamientos en la
posición de los picos, los cambios en la altura y en el ancho de banda de los picos y los cambios inesperados en la intensidad
de fondo.
La precisión del método también debe abarcar la posición de la muestra. La presentación de la muestra es un factor crítico
tanto para sólidos como para líquidos y debe controlarse muy de cerca o debe tenerse en cuenta en el modelo de calibración.
La sensibilidad a la posición de la muestra puede a menudo minimizarse mediante la preparación apropiada de la muestra o la
geometría del portamuestras, pero variará de un instrumento a otro según la excitación y la configuración óptica de recolec-
ción.
DEFINICIÓNDE TÉRMINOSY SÍMBOLOS

ANCHO DE BANDA (o RESOLUCIÓN)DELINSTRUMENTO:es una medida de la capacidad del espectrómetro para separar radiaciones
de longitudes de onda similares.
CALIFICACIÓNDE DESEMPEÑO:es el proceso por el cual se verifica el desempeño uniforme del instrumento mediante el uso de
uno o más materiales de referencia estables y bien caracterizados. En la calificación se pueden emplear estándares iguales o
diferentes para las diversas características de desempeño.
CALIFICACIÓNOPERATIVA:es el proceso mediante el cual se demuestra y se documenta que el instrumento funciona de acuerdo
con las especificaciones, y que puede realizar la tarea para la cual está previsto. Este proceso es necesario luego de cambios
significativos como la instalación del instrumento, cambio de ubicación, reparaciones importantes, etc.
DESPLAZAMIENTO
DEL NÚMERODE ONDA RAMAN:4,
es el número de onda de la línea excitante menos el número de onda de la radiación dispersada. Unidad SI: m- 1• Unidad co-
mún: cm- 1 = 100 m- 1 •
/J!1íi
donde /3 es la sección transversal Raman diferencial, es positivo para la dispersión de Stokes y negativo para la dispersión anti-
Stokes.
USP42 InformaciónGeneral/ (1121) Nomenclatura 8015
DISPERSIÓN RAMAN (NORMAL): 4 es la dispersión inelástica de radiación que ocurre debido a cambios en la polarizabilidad, de los
enlaces pertinentes durante una vibración molecular. Los espectros Raman normales se excitan por radiación que no está en
resonancia con las transiciones electrónicas en la muestra.
ESPECTROS RAMAN:4 son gráficos de la energía radiante o de la cantidad de fotones dispersos por la muestra a través de la
interacción indirecta entre las vibraciones moleculares en la muestra y la radiación monocromática de frecuencia mucho mayor
que la de las vibraciones. La abscisa por lo general es la diferencia en el número de onda entre la radiación incidente y la dis-
persada.
MODELO DE CALIBRACIÓN: es una expresión matemática que relaciona la respuesta de un instrumento analítico con las propie-
dades de las muestras.
(1121) NOMENCLATURA
INTRODUCCIÓN
Las denominaciones USP(o NF) para artículos de monografías están reconocidas en la Ley Federal de Alimentos, Medica-
mentos y Cosméticos como las denominaciones de uso para etiquetar los artículos a los que se refieren.
El valor de denominar a cada fármaco mediante una única denominación común 1 es importante con respecto al logro de
simplicidad y uniformidad en la nomenclatura de fármacos. En apoyo al programa de Nombres Adoptados en los Estados Uni-
dos (U.S. Adopted Names) (ver Misión y Prefacioen los compendios USP-NF),copatrocinado por la Convención de la Farmaco-
pea de los Estados Unidos, el Consejo de Expertos de la USP considera la adopción del Nombre Adoptado en los Estados Uni-
dos, si existiera, como nombre oficial para cualquier compuesto que alcance reconocimiento farmacopeico.
Se proporciona una recopilación de los Nombres Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus siglas en ingles) publica-
da desde el inicio del programa USANen 1961, al igual que otros nombres de fármacos, tanto vigentes como retrospectivos,
en el USP Dictionary of USANand lnternational Drug Names (DiccionarioUSPde Nombresde FármacosUSANe Internacionales,
disponible solo en inglés). Esta publicación sirve como una guía de nombres útil para identificar y distinguir toda clase de
nombres de fármacos, ya sean nombres comunes, marcas comerciales, nombres químicos o designados por códigos (alfanu-
méricos).2
La denominación común de un fármaco sirve para numerosos y diversos propósitos. Su función principal es identificar la
sustancia a la que se refiere por medio de una denominación que pueda ser empleada por el público profesional y no profesio-
nal sin las limitaciones asociadas a las marcas registradas. La enseñanza en ciencias de la salud requiere una denominación co-
mún, especialmente en el caso de un fármaco que se puede obtener de distintas fuentes o que está incorporado en un pro-
ducto farmacéutico combinado; las denominaciones comunes facilitan la comunicación entre los profesionales de la salud; las
denominaciones comunes se deben utilizar como los nombres de los artículos reconocidos por los compendios oficiales de me-
dicamentos; una denominación común es esencial para el fabricante de productos farmacéuticos como un medio para prote-
ger la propiedad industrial del nombre de marca comercial del artículo correspondiente; y, finalmente, la ley federal obliga al
fabricante a incluir la denominación común establecida en la publicidad y el etiquetado.
Según los términos de las Enmiendas sobre Medicamentos (Drug Amendments) de 1962 a la Ley Federal de Alimentos, Me-
dicamentos y Cosméticos, que se transformaron en ley el 1O de octubre de 1962, la Secretaría de Salud y Asuntos Sociales
(Secretary of Health and Human Services) está autorizada a darle un nombre oficial a cualquier fármaco cuando se considere
"necesario o conveniente por motivos de utilidad y simplicidad". 3
El Comisionado de Alimentos y Medicamentos y la Secretaría de Salud y Asuntos Sociales publicaron en el Diario Oficial re-
glamentos en vigor a partir del 26 de noviembre de 1984, que establecen, en parte:
"Sec. 299.4 Nombres establecidos de fármacos."
"(e) La Administración de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug Administration) no designará de forma rutinaria
nombres oficiales de acuerdo con el artículo 508 de la ley. Como resultado, el nombre establecido de conformidad con el
artículo 502(e) de la ley será generalmente el nombre farmacopeico del fármaco, o, si no hay nombre farmacopeico, el
nombre común y habitual del fármaco. Las personas interesadas, en ausencia de una denominación oficial por parte de la
Administración de Alimentos y Medicamentos, pueden contar con el nombre farmacopeico vigente o el nombre USAN
adoptado que figure en el USANy el USPDictionary of Drug Namescomo el nombre establecido para cualquier fármaco.'' 4
Se debe tener en cuenta que las monografías sobre los productos biológicos, producidos de conformidad con licencias
otorgadas por la Secretaría del Departamento de Salud y Asuntos Sociales de Estados Unidos, representan un caso espe-
4
Chalmers, )., Griffiths, P., Eds. Handbookof VibrationalSpectroscopy;)ohn
Wiley & Sons, Lid: New York, 2002.
1
Con respectoa la nomenclaturade fármacos,el término "genérico"ha sido usadoampliamenteen lugar del término "común", que es másmás exactoy des-
criptivo.
2
ElUSPDictionaryot USANandlnternationalDrugNames(DiccionarioUSPde Nombresde ~ármacos
USANe Internacionales)
sepuedesolicitara: U.S.Pharmaco-
peia, Customer Service Department, 12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852.
3
F.D.&C. Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos), Sec. 508 [358].
4
53 Fed. Reg. (Diario Oficial) 5369 (1988) que enmienda el Título 21 del CFR (Código de Reglamentos Federales)§ 299.4.
8016 (1121) Nomenclatura / Información General USP42
cial. Si bien las gestiones para lograr la uniformidad continúan, puede haber alguna diferencia entre el nombre respectivo
estipulado por la ley federal y el nombre USP.Dichas diferencias son menos que las que había en revisiones anteriores de
la Farmacopea. El nombre USP,cuando es distinto del nombre otorgado por el Center for Biologics Evaluation and Re-
search de la FDA(Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos), no constituye necesariamente un sinóni-
mo a los fines del etiquetado; las condiciones para la concesión de la licencia de los productos biológicos en cuestión
exigen que cada uno de esos artículos sea denominado por el nombre que figura en la licencia de producto otorgada al
fabricante. Cuando un nombre USPdifiere del nombre establecido en los reglamentos federales, el primero ha sido adop-
tado en vista de su utilidad, simplicidad y cumplimiento con los principios que rigen la selección de títulos de monogra-
fías en general.
POLÍTICAPARA LA DENOMINACIÓNDE MONOGRAFÍASDE MEDICAMENTOS

Y
PREPARACIONES MAGISTRALES
QUECONTIENENSALESDE FÁRMACOS
Los títulos de las monografías de la USPpara productos farmacéuticos y preparaciones magistrales formulados con una sal
de un ácido o una base usan el nombre de la parte activa, según se define a continuación. El contenido del producto o prepa-
ración también se expresa en términos de la parte activa.
La porción activa es la molécula o ión, excluyendo aquellas partes de la molécula adjuntas que causan que el fármaco sea
una sal (incluyendo una sal con uniones de coordinación o puentes de hidrógeno), u otros derivados no covalentes de la molé-
cula (como complejos, quelatos o clatratos). La parte activa es responsable de las acciones fisiológicas o farmacológicas del
fármaco, sin importar si la molécula in vivo está eléctricamente cargada. Por ejemplo, la parte activa de la sal clorhidrato de
una base es la base libre y no la forma protonada de la base. La parte activa de una sal metálica de un ácido es el ácido libre.
La USP sigue esta Política para denominar los productos farmacéuticos y las preparaciones magistrales recientemente reco-
nocidos en el compendio USP.No se pretende revisar las monografías existentes para que se ajusten a esta Política, a menos
que el Consejo de Expertos de la USP determine que, por razones tales como seguridad, se justifique un cambio de nomencla-
tura.
Etiquetado
El etiquetado indica claramente la forma salina específica de la parte activa que está presente en el producto o preparación,
debido a que esta información puede ser útil para profesionales de la salud y pacientes. Se proveen en el etiquetado los nom-
bres y los contenidos tanto de la parte activa como de la forma salina específica (cuando corresponde).
Excepciones
Se puede considerar una excepción a esta Política, en aquellos casos raros en los que el uso de la forma salina específica de
la parte activa en el nombre suministra información vital desde una perspectiva clínica. En tales casos, cuando el título de la
monografía contiene la forma salina específica de la parte activa, el contenido del producto o preparación también se expresa
en términos de la forma salina específica.
FORMASGENERALES
DE NOMENCLATURA
Se encuentra disponible una lista de los productos farmacéuticos específicos con ejemplos amplios en el documento USP
Nomenclature Guidelines (Pautas de Nomenclatura de la USP) (www.usp.org). La USP ha desarrollado también diversas prácti-
cas generales para la nomenclatura de productos farmacéuticos:
• La [VÍADE ADMINISTRACIÓN]se omite en aquellas formas farmacéuticas para las que la vía de administración se so-
breentiende. Para esos casos, la forma general es simplemente [FÁRMACO],[FORMAFARMACÉUTICA].
- Por consiguiente, el término oral no se incluirá como la vía de administración para cápsulas, tabletas y tabletas de
disolución bucal que se administren por la vía oral.
- La vía de administración se omite para productos aplicados por vía tópica-cremas, ungüentos, lociones y pastas. No
obstante, si se prevé alguna otra vía de administración (p. ej., oftálmica), se incluirá en el título de la monografía.
• En algunos casos, el fármaco se presenta en una forma farmacéutica para la preparación de otra forma farmacéutica. En
tales casos, se nombra primero la forma farmacéutica provista en el envase y utiliza la preposición "para", seguida de la
forma farmacéutica final que es adecuada para administración. Elformato general es [FÁRMACO][FORMAFARMACÉUTI-
CA] para [FORMAFARMACÉUTICA] [VÍADE ADMINISTRACIÓN],p.ej. Aspirina, Tabletas Efervescentes para Solución Oral.
• El término "para" se incluye en los nombres de preparaciones sólidas que se deben disolver o suspender en un líquido
adecuado para obtener una forma farmacéutica adecuada para su administración, y la forma general es [FÁRMACO]para
[FORMAFARMACÉUTICA] [VÍADE ADMINISTRACIÓN],p. ej., Ampicilina para Suspensión Oral, Citarabina para Inyección.
• El término "Insertos Vaginales", en lugar de "Tabletas Vaginales", "Cápsulas Vaginales" o "Supositorios Vaginales" se usa
en el nombre de este tipo de preparación vaginal para reducir la posibilidad de uso indebido de estos productos.
• El término "Supositorios" se usa en los nombres de preparaciones sólidas destinadas a la administración rectal.
USP42 InformaciónGeneral/ (1121) Nomenclatura 801 7
• Las soluciones que se administran mediante inyección reciben oficialmente el nombre de Inyectables (ver el capítulo Medi-
camentosInyectablesy en Implantes(1)). La vía de administración se omite para fármacos que se inyectan, debido a que la
vía (p. ej., intravenosa, intramuscular, subcutánea, etc.) debe aparecer en las etiquetas y en el etiquetado. La USP define
siete tipos de inyectables:
1. [FÁRMACO]Inyección-Preparaciones líquidas que son fármacos o soluciones de los mismos.
2. [FÁRMACO]para Inyección-Sólidos secos que, al agregarles vehículos adecuados, producen soluciones que cum-
plen con todos los requisitos para Inyectables.
3. [FÁRMACO]Emulsión Inyectable-Preparaciones líquidas de fármacos disueltos o dispersos en un medio para emul-
sión adecuado.
4. [FÁRMACO]Suspensión Inyectable-Preparaciones líquidas de sólidos suspendidos en un medio líquido adecuado.
5. [FÁRMACO]para Suspensión Inyectable-Sólidos secos que, al agregarles vehículos adecuados, producen soluciones
que cumplen con todos los requisitos para Suspensiones Inyectables.
6. [FÁRMACO]Suspensión Inyectable de Liberación Prolongada-Preparaciones líquidas de sólidos suspendidos en un
medio líquido adecuado y formuladas de forma tal que permite la disponibilidad del ingrediente farmacéutico activo
durante un periodo prolongado.
7. [FÁRMACO]para Suspensión Inyectable de Liberación Prolongada-Sólidos secos que, al agregarles vehículos ade-
cuados, producen preparaciones que cumplen con todos los requisitos para Suspensiones Inyectables de Liberación
Prolongada.
Los inyectables destinados para ser administrados a través de un desvío en una línea intravenosa ("piggyback") que se for-
mulan en vehículos que no sean de Agua para Inyección deben denominarse de la siguiente manera: [FÁRMACO]en [VEHÍCU-
LO]. A continuación se presentan ejemplos de formatos de Vehículo que actualmente aparecen en títulos de monografías USP:
1. [FÁRMACO]en Inyección de Dextrosa
2. [FÁRMACO]en Inyección de Dextrosa y Cloruro de Sodio
3. [FÁRMACO]en Solución de Ringer Lactato y Dextrosa Inyectable
4. [FÁRMACO]en Inyección de Cloruro de Sodio
POLÍTICAPARA LA IMPLEMENTACIÓN
DE REVISIONES
DE NOMENCLATURA
Con el objeto de proveer un tiempo razonable para realizar los cambios en las etiquetas de los productos y para permitir que
los profesionales de la salud y los consumidores tengan suficiente tiempo para familiarizarse con la nueva terminología, es la
práctica de la USP establecer fechas oficiales para las revisiones en la nomenclatura (cambios en los nombres establecidos o en
los aspectos de la nomenclatura que se encuentran en las secciones de etiquetado de las monografías). La determinación del
periodo de implementación está a cargo del Comité de Expertos de la USP. Los periodos de implementación de la USP que se
describen a continuación, son automáticos, a menos que se trate de una excepción.
18 meses
Por lo general se aplica un periodo de implementación de 18 meses cuando solo uno o un pequeño número de productos
se ven afectados.
30 meses
Por lo general se aplica un periodo de implementación de 30 meses cuando se cambian los nombres o etiquetados de pro-
ductos de distintas fuentes o de líneas de varios productos de una compañía de preparaciones.
60 meses
Por lo general se aplica un periodo de implementación de 60 meses para cambios en nombres o etiquetados que afecten
excipientes, porque dichos cambios implican el reetiquetado de cantidades muy grandes de preparaciones con receta médica
y de preparaciones de venta libre.
Puede haber excepciones a estos periodos de implementación cuando se necesite un tiempo más corto para especificar los
cambios de nomenclatura y etiquetado en casos que la salud pública y la seguridad sean motivo de preocupación. Rara vez se
otorgan extensiones a los periodos de implementación y éstas deben contar con justificaciones adecuadas, además de la apro-
bación del Comité de Expertos de la USP.Cualquier pregunta o inquietud relacionada con los periodos de implementación se
debe dirigir al personal de enlace de la USP asignado al Comité de Expertos.
4
8018 (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos/ Información General USP42
(1125) TÉCNICASBASADASENÁCIDOSNUCLEICOS-
GENERALIDADES
ALCANCE
Los ensayos basados en ácidos nucleicos se usan en una gran variedad de ámbitos, de los cuales los más comunes son la
detección de agentes infecciosos (virus, bacterias, etc.) y materiales celulares, así como en la clasificación de enfermedades. En
los últimos tiempos, tales ensayos se han usado también para propósitos forenses y para la detección de oligocontaminantes
en materiales biológicos. Este último incluye aplicaciones para el desarrollo farmacéutico, como la depuración viral y el análisis
de agentes adventicios en lotes de siembra de vacunas y bancos de células para cultivo de tejidos. Este capítulo sirve de intro-
ducción a una serie de capítulos de información general que proporcionan técnicas de apoyo a procedimientos para la detec-
ción y el análisis de ácidos nucleicos (ver la Figura1). Los ensayos que usan estas técnicas pueden presentarse en un capítulo
general de la USP o en una especificación privada.
<1126> Técnicas Basadas

en ÁcidosNucleicos-
Extracción,
Deteccióny
Secuenciación

en Ácidos Nucleicos -
Amplificación
<1125> Técnicas Basadas <1128> Técnicas Basadas

1
en ÁcidosNucleicos- en Ácidos Nucleicos -
Generalidades
1 1 Micromatrices

Genotipificación

Enfoques para Detectar Trazas
de Ácidos Nucleicos
(Análisis de AON Residual)
Figura 1
El requisito principal para cualquier procedimiento analítico de ácidos nucleicos es la disponibilidad de ácidos nucleicos pu-
ros e intactos para análisis. La información en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Extracción,Deteccióny Secuenciación(1126)
discute los procedimientos disponibles para la extracción y manipulación de ácidos nucleicos. La hibridación es el mecanismo
central detrás de muchas técnicas de biología molecular y, además de la detección de ácidos nucleicos por mediciones de ab-
sorbancia y fluorescencia y mediciones de tamaño por electroforesis en gel, este capítulo cubre también la transferencia (blot-
ting) e identificación de especies de ácidos nucleicos por ensayos de hibridación, usando sondas marcadas (labeled probes).
Las sondas de hibridación son oligonucleótidos que tienen una secuencia complementaria al blanco de interés. Las sondas
contienen etiquetas (tags) radioactivas, fluorescentes, de biotina, de digoxigenina u otras etiquetas, que después de la unión
de la sonda al blanco permiten la visualización e identificación de este último. Las sondas son capaces de detectar secuencias
blanco que están presentes en concentraciones demasiado bajas para ser detectadas por mediciones de absorbancia o electro-
foresis en gel.
Estos procedimientos analíticos requieren una cantidad mínima de ácido nucleico, por lo general del orden de nanogramos
a microgramos. Sin embargo, en la gran mayoría de los casos, p.ej. en la detección de virus o especies de ARN celular poco
frecuentes, el ácido nucleico en análisis está presente en cantidades mínimas (del orden de picogramos a femtogramos) y se
debe efectuar un paso de amplificación antes de poder detectar e identificar el ácido nucleico. El paso de amplificación puede
USP42 Información General/ (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 8019
dirigirse, bien sea a la señal usada para la detección (amplificación de señal), como el ensayo de ADN ramificado (ensayo de
ADNb), o al blanco, como en las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (NAT,por sus siglas en inglés).
En 1983, se desarrolló un proceso revolucionario pero simple a la vez, conocido como reacción en cadena de la polimerasa
(PCR, por sus siglas en inglés), para amplificar el número de fragmentos específicos de ácido nucleico presentes en una mues-
tra y apenas unos pocos años después de su descubrimiento, la PCR se convirtió en el procedimiento más frecuentemente usa-
do para amplificar ácidos nucleicos, especialmente ADN. Desde que se comenzó a usar la PCR, el número de aplicaciones se ha
expandido rápidamente y la técnica, que incluye ahora ensayos cuantitativos y multiplex, se usa actualmente en casi todos los
campos de investigación y desarrollo en biología y medicina. Se han desarrollado numerosas variaciones de los procedimientos
del ensayo para analitos específicos. El capítulo de información general, TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Amplificación
(1127), describe los procedimientos de amplificación usados para los análisis de ADN y ARN, así como para los ensayos NAT
cualitativos y cuantitativos. Los procedimientos de amplificación de señal en los cuales se usan señales, por lo general fluores-
centes, para detectar ácidos nucleicos de interés no son muy comunes. El principal procedimiento para amplificación de la
señal, el ensayo de ADN ramificado (ensayo de ADNb), se usa predominantemente para la detección de ácidos nucleicos vira-
les.
Los aspectos de garantía de calidad de la metodología también están cubiertos, junto con un resumen de los requisitos re-
glamentarios actuales para los ensayos NAT.La necesidad de resultados mundialmente comparables, exactos y confiables en el
campo diagnóstico ha dirigido la búsqueda y el desarrollo de estándares nacionales e internacionales dentro de un ámbito re-
glamentario internacional altamente desarrollado, cada vez más sofisticado y sólido metrológicamente, dedicado a los más al-
tos estándares de la ciencia reglamentaria. Dado que las NATse han convertido en las técnicas de ácidos nucleicos más amplia-
mente usadas, la mayoría de las guías y normas están relacionados con tales tecnologías. El capítulo de información general,
TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Micromatrices(1128), se refiere a un campo todavía emergente con relevancia creciente
para el análisis de ADN. El tratamiento detallado de diversas micromatrices o microarreglos (microarrays), incluidos el análisis y
la validación de los datos, se excluyen del (1128) en este momento. El capítulo de información general, TécnicasBasadasen
ÁcidosNucleicos-Genotipificación(1129), se enfoca en las modificaciones específicas de las técnicas que son necesarias para
permitir la detección de diferencias en una sola base y las variaciones genéticas comunes, p. ej., los polimorfismos de un solo
nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés). El capítulo de información general final de la serie, TécnicasBasadasen ÁcidosNuclei-
cos-Enfoques para DetectarTrazasde ÁcidosNucleicos(Análisisde ADN Residual)(11 30), describe las pruebas de ADN residual
en el contexto de la fabricación farmacéutica. Las aplicaciones relevantes a los agentes virales adventicios se discuten en el ca-
pítulo de información general Métodosde PruebasVirológicas (1237).
De esta familia de capítulos sobre NATse excluyen dos usos principales del análisis de ácidos nucleicos: pruebas virales que
garantizan la seguridad de la sangre y hemoderivados y pruebas genéticas. La perspectiva tradicional de la USP consiste en
desarrollar normas públicas aplicables a un producto final en particular, sin definir expresamente los detalles de un producto
y/o de su producción. El objetivo de este capítulo consiste en especificar cuándo se pueden adaptar las metodologías tradicio-
nales o los estándares existentes. También se mencionan metodologías novedosas para amplificación y detección por NAT.A
medida que estas nuevas metodologías se desarrollen y sean correctamente validadas, se irán incluyendo en las revisiones su-
cesivas.
Debido al rápido desarrollo de ese campo, se aconseja a los científicos encargados de asuntos farmacopeicos y reglamenta-
rios que consulten la edición vigente de USPy sus Suplementoscon regularidad.
GLOSARIO
Absorbancia: [Símbolo: A]-Es el logaritmo, en base 1O, del recíproco de la transmitancia (T). [NOTA-Los términos descrip-
tivos empleados anteriormente incluyen densidad óptica y extinción.]
Ácido desoxirribonucleico (ADN): Material genético que pasa de la célula progenitora a las células hijas y propaga las carac-
terísticas de la especie a través de los genes que contiene y de las proteínas para las cuales codifica. El ADN contiene los cuatro
desoxirribonucleósidos siguientes: dA, dC, dT y dG.
Ácido nucleico: Polímeros lineales de nucleótidos, unidos por enlaces fosfodiéster 3', 5'. En el ADN, ácido desoxirribonuclei-
co, el azúcar es la desoxirribosa y las bases son adenina, guanina, timina y citosina. El ARN o ácido ribonucleico tiene ribosa
como azúcar y el uracilo reemplaza la timina.
Ácido ribonucleico (ARN): Un tipo de ácido nucleico compuesto por una secuencia específica de ribonucleótidos unidos. El
ARN contiene los cuatro ribonucleósidos siguientes: A, C, G y U.
Actividad correctora (proofreading): Consiste literalmente en leer con el propósito de detectar errores para su corrección
posterior. La ADN polimerasa tiene una actividad de exonucleasa 3'-5' que se usa durante la polimerización para retirar los
nucleótidos recién añadidos que están apareados incorrectamente.
Actividad exonucleasa 3'-5': Actividad enzimática para retirar un nucleótido mal apareado del extremo 3' de la cadena cre-
ciente. La reacción es una hidrólisis de un enlace fosfoéster. La presencia de una actividad exonucleasa 3'-5', o actividad co-
rrectora (proofreading), mejora la fidelidad de la polimerización.
Actividad exonucleasa 5'-3': Actividad enzimática para retirar un nucleótido mal apareado del extremo 5' de una cadena de
polinucleótidos. Esta actividad es en realidad la de una endonucleasa dependiente de cadena simple y es necesaria para retirar
los cebadores de ARN de los fragmentos de Okazaki, la cadena de ARN en el heterodúplex de ADN-ARN intermediario durante
la transcripción reversa, y durante la reparación del ADN.
8020 (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos / Información General USP42
ADN complementario (ADNc): ADN sintetizado a partir de un molde de ARN en una reacción enzimática catalizada por la
enzima transcriptasa reversa.
ADN polimerasa: Enzima que puede sintetizar nuevas cadenas de ADN complementario usando un molde de ADN y un ce-
bador. Varias de estas enzimas se consiguen comercialmente, entre ellas ADN Taqpolimerasa y ADN rTth polimerasa.
ADN rTth polimerasa: ADN polimerasa termoestable recombinante, aislada originalmente de la bacteria Thermusthermophi-
/us. La rTth tiene una actividad óptima entre 70° y 80º y no se degrada durante los pasos de desnaturalización de la PCR. Ade-
más de la actividad de ADN polimerasa, tiene una eficiente actividad de transcriptasa reversa en presencia de manganeso.
ADN Taq: ADN polimerasa termoestable que se aisló originalmente de la bacteria Thermusaquaticus.La Taqtiene actividad
óptima entre 70º y 80º y no se degrada durante los pasos de desnaturalización con calor elevado de la PCR.
Alelo: Una o más formas alternativas de un gen en una posición determinada (locus) de un cromosoma, debido a una dife-
rencia en la secuencia del ADN.
Amplicón: Segmento corto de ADN generado por el proceso de PCR, cuya secuencia está definida por cebadores directo e
inverso. A veces se denomina amplímero.
Amplificación: Replicación enzimática in vitre de un ácido nucleico blanco o diana.
Apareamiento (annealing): Hibridización o unión de ácidos nucleicos complementarios, por lo general a una temperatura
óptima.
Apareamiento incorrecto: Apareamiento de bases no convencional (distinto de C con G, A con To U). Un par de bases
apareadas incorrectamente tiene menos energía de enlace y disminuye la estabilidad de la molécula de ADN.
Cebador (primer): Las polimerasas de ácido nucleico unen un mononucleótido a una cadena de ácidos nucleicos denomina-
da cebador. Las ARN polimerasas son capaces de usar un solo nucleótido como cebador, mientras que las ADN polimerasas
siempre requieren un oligonucleótido.
Coeficiente de extinción: [Símbolo: s]-Cociente de la absorbancia (A) dividida por el producto de la concentración, expre-
sado en moles/L, de la sustancia y la longitud de paso de la absorción, en cm. [NOTA: Los términos empleados anteriormente
incluyen: índice de absorbancia molar, absortividad molar y coeficiente de absorción molar.]
Concatenación: Proceso en el cual el segmento de ADN compuesto por secuencias repetidas se une de punta a cabo (end-
to-end).
Desnaturalización: Proceso de separación del ADN de cadena doble en cadenas simples mediante la ruptura de los enlaces
de hidrógeno. Esto por lo general se consigue calentando la solución de ADN a temperaturas por encima de 90º o tratándola
con un álcali fuerte.
Desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP): Base que se agrega a un cebador durante la PCRy constituye la cadena recién
sintetizada. Ejemplos de dNTP son dATP,dUTP, dCTP, dGTP y dTTP.
Endonucleasa: Enzima que escinde los enlaces fosfodiéster en una cadena polinucleotídica.
Especificidad: Habilidad para evaluar inequívocamente el analito en presencia de componentes que podrían estar presentes,
como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz.
Exactitud: La exactitud de un procedimiento analítico es la proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos mediante
ese procedimiento y el valor verdadero.
Extensión: Elongación de la cadena de ADN que se está sintetizando, usando la cadena progenitora de ADN como molde
para la síntesis de la cadena hija. Este es un proceso natural que ocurre durante la replicación del ADN. La extensión ocurre
durante el proceso de PCR con las ADN polimerasas.
Extinción (quenching): Proceso de extinguir, retirar o disminuir una propiedad física como el calor o la luz. La extinción de
fluorescencia puede ser colisiona! o estática.
Fidelidad: Medida de la exactitud de la replicación del ácido nucleico. La enzima polimerasa usada es solo uno de los ele-
mentos que influyen en la fidelidad. Otros elementos incluyen las condiciones del amortiguador, los parámetros de termocicla-
do, la cantidad de ciclos, la eficiencia de la amplificación y la secuencia del ADN que se está copiando.
Fluorescencia: Emisión de uno o más fotones por una molécula o átomo activado por la absorción de un cuanto de radia-
ción electromagnética. Los rayos X, UV,la luz visible y las radiaciones IR pueden estimular la fluorescencia. Ver detalles sobre la
medición espectroscópica de fluorescencia en Espectroscopía de Fluorescencia(853).
Fluoróforo: Grupo funcional en una molécula, que la hace fluorescente al absorber energía de una longitud de onda especí-
fica y que reemite la energía a otra longitud de onda.
Fotoblanqueo (photobleaching): Destrucción irreversible de un fluoróforo en un estado excitado. Los diferentes fluoróforos
tienen tasas distintas de fotoblanqueo. Por ejemplo, la fluoresceína se fotoblanquea muy fácilmente. A menudo la tasa de des-
composición es proporcional a la intensidad de la iluminación. Una forma simple y práctica de evitar el fotoblanqueo consiste
en reducir la radiación incidente.
Genoma: Complemento genético completo o conjunto completo de instrucciones para reproducir un organismo y desem-
peñar su función biológica en la vida. El ADN de nuestras células conforma nuestro genoma. Cuando nuestras células se divi-
den, el genoma completo en ellas se duplica para su transmisión a cada una de las células hijas resultantes.
Genotipificación: Proceso de evaluación de las variaciones genéticas presentes en un individuo.
Genotipo: Constitución genética de un organismo según se revela en el análisis genético o molecular, es decir, el conjunto
completo de genes, tanto dominantes como recesivos, poseídos por una célula u organismo en particular.
Hibridación: Proceso de formación de una molécula de ácido nucleico de doble cadena, por ejemplo entre una secuencia de
nucleótidos (sonda) y un blanco (target).
USP42 InformaciónGeneral/ (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 8021
Horquilla (hairpin): Estructura dúplex antiparalela que se forma por apareamiento de secuencias repetidas invertidas dentro
de un ácido nucleico de cadena simple. La sección helicoidal se llama tallo y el segmento de bases no apareadas al final de la
estructura se llama bucle.
Ligación: Proceso de unión de dos o más fragmentos de ADN.
Límite de cuantificación: Mínima cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con precisión y exactitud
aceptables bajo las condiciones experimentales declaradas.
Límite de detección: Cantidad mínima de analito que puede detectarse en una muestra, aunque no necesariamente cuanti-
ficarse, bajo las condiciones experimentales declaradas.
Micromatriz o microarreglo (microarray): Sets de zonas de reacción química miniaturizadas que se usan para analizar frag-
mentos de ADN, anticuerpos o proteínas. Por lo general las sondas se inmovilizan sobre un chip y se hibridizan con un blanco
o diana.
Molde: Copia maestra usada para comenzar el proceso de replicación de ADN o ARN.
Oligonucleótido: Secuencia lineal que comprende hasta 25 nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster, generalmente usa-
dos como cebador en la síntesis de ADN.
PCRcon inicio en caliente (hot-start PCR): Técnica que se usa comúnmente para mejorar la sensibilidad y especificidad de
la amplificación por PCR. El inicio en caliente se efectúa reteniendo fuera de la mezcla de reacción uno de los componentes
clave, necesario para la amplificación, hasta que la reacción alcanza una temperatura por encima de la temperatura óptima de
apareamiento de los cebadores. El componente retenido de la mezcla de reacción puede ser un cebador, la ADN polimerasa,
MgCl2, o dNTP.
PCRen tiempo real: Procedimiento para la cuantificación y amplificación simultáneas del ADN. Es la generación de amplico-
nes monitoreados a medida que se están generando mediante el uso de un sistema indicador fluorescente y capturados por un
instrumental sofisticado. Puede denominarse con frecuencia PCRCuantitativa o PCR Cuantitativa en nempo Real, pero no RT-
PCR.
Polimerasa: Enzima que cataliza la síntesis de ácidos nucleicos en moldes de ácidos nucleicos preexistentes, ensamblando
ARNa partir de ribonucleótidos o ADN a partir de desoxirribonucleótidos.
Precisión: Grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento repeti-
damente a múltiples muestreos de una muestra homogénea.
Procesividad: Habilidad de una enzima para continuar repetitivamente su función catalítica sin disociarse de su sustrato.
Reacción en cadena de la polimerasa (pcr): Técnica de laboratorio que amplifica rápidamente una región específica de
ADN de doble cadena, predeterminada por el par de cebadores utilizados para la amplificación. Por lo general implica el uso
de una ADN polimerasa termoestable.
Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (rt-pcr): Variación de la técnica de PCR en la cual se pro-
duce ADNc a partir de ARN por transcripción reversa. El ADNc se amplifica después usando protocolos de PCR estándar.
Robustez: La robustez de un procedimiento analítico es una medida de su capacidad para no ser afectado por variaciones
pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros del procedimiento indicados en la documentación, y provee una indicación
de su aptitud durante condiciones normales de uso.
RT-PCRen tiempo real: Combinación de PCRen tiempo real y PCR con transcripción reversa.
Sonda: Secuencia específica de ADN o ARN que ha sido marcada con etiquetas (tags) radioactivas, fluorescentes o quimiolu-
miniscentes y se usa para detectar secuencias complementarias por técnicas de hibridación como transferencia (blotting) o hi-
bridación de colonias. Además, las sondas se pueden utilizar también para la cuantificación de amplicones según se describe
para los ensayos de PCR cuantitativa. Una descripción más detallada de dichas sondas se ofrece en el capítulo de información
general, TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Amplificación(1127).
Temperatura de fusión (desnaturalización) (Tm): Temperatura a la cual el 50% del ADN se vuelve de cadena simple.
Transcripción: Síntesis de ARN usando un molde de ADN.
Transcripción reversa (rt, por sus siglas en inglés): Proceso de obtención de ADNc usando un molde de ARN.
Transcriptasa reversa: Enzima que requiere un cebador de ADN y cataliza la síntesis de una cadena de ADN a partir de un
molde de ARN. Una enzima que puede usar ARN como molde para sintetizar ADN.
Transferencia de energía: Proceso en el cual un estado excitado de una entidad molecular (el donador) es desactivado a un
estado inferior por transferencia de energía a una segunda entidad molecular (el aceptor), que por lo tanto se eleva a un esta-
do de energía más alto.
APÉNDICES
Apéndice 1: Reglamentacionesy Estándares
Las técnicas basadas en ácidos nucleicos han transformado rápidamente casi todos los campos de investigación, desarrollo
farmacéutico y diagnóstico. La necesidad de resultados mundialmente comparables, exactos y confiables en el campo diagnós-
tico ha dirigido el desarrollo de estándares nacionales e internacionales, a la vez que ha promovido un ambiente reglamentario
altamente desarrollado. Dado que las NATse han convertido en las técnicas de ácidos nucleicos más ampliamente usadas, la
8022 (1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos / InformaciónGeneral USP42
mayoría de las guías y normas están relacionadas con dichas tecnologías. 1 Las reglamentaciones específicas para virus y los
estándares de referencia se tratarán en el Apéndice del Capítulo de Información General Métodosde PruebasVirológicas(1237).
La siguiente es una lista selectiva de documentos de orientación a nivel nacional. Para pautas específicas sobre la aplicación, se
remite al usuario de estos compendios a la agencia de reglamentación relevante donde encontrará la orientación más actuali-
zada.
• "Nucleic Acid Based In Vitro Diagnostic Devices for Detection of Microbial Pathogens" (2005); Centro para la Evaluación e
Investigación de Productos Biológicos (CBER,por sus siglas en inglés) de la FDA.
• "Guidance for lndustry: Content and Format of Chemistry, Manufacturing and Controls lnformation and Establishment
Description lnformation for a Biological In Vitro Diagnostic Product" (1999); Centro para la Evaluación e Investigación de
Productos Biológicos (CBER)de la FDA.
• "Guidance for lndustry: In the Manufacture and Clinical Evaluation of In Vitro Tests to Detect Nucleic Acid Sequences of
Human lmmunodeficiency Viruses Types 1 and 2" (1999); Centro para la Evaluación e Investigación de Productos Biológi-
cos (CBER)de la FDA.
• "Guidance for lndustry: Use of Nucleic Acid Tests on Pooled and Individual Samples from Donations of Whole Blood and
Blood Components (including Source Plasma and Source Leukocytes) to Adequately and Appropriately Reduce the Risk of
Transmission of HIV-1and HCV" (2004); Centro para la Evaluación e Investigación de Productos Biológicos (CBER)de la
FDA.
Apéndice 2: Abreviaturas
3SR replicación de secuencia autosostenida

AABB American Association of Blood Banks
ACD ácido-citrato-dextrosa
ADN ácido desoxirribonucleico
ADNasa desoxirribonucleasa
ADNb ensayo de ADN ramificado
ADNc ADN complementario
ADNcs ADN de cadena simple
ADNdc ADN de doble cadena
AMO aspirado de médula ósea
ARN ácido ribonucleico
ARNasa ribonucleasa
ARNm ARN mensajero
ASO oligonucléotidos alelo específicos (ASO, por sus siglas en inglés)
ceo dispositivo de acoplamiento de carga (CCD, por sus siqlas en inqlés)
CE-UF electroforesis capilar con detección mediante fluorescencia inducida por láser
CPR reacción cíclica con sonda (CPR, por sus siqlas en inqlés)
CsCI cloruro de cesio
Ct ciclo umbral
DEPC dietilpirocarbonato
DHPLC cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante
DMSO dimetilsulfóxido
dNTP desoxirribonucleótido trifosfato
DOP-PCR PCR con cebadores degenerados (DOP-PCR, por sus siqlas en inglés)
dTTP 2'-desoxitimidín 5'-trifosfato
dUTP 2'-desoxiuridín 5'-trifosfato
EDTA ácido etilendiaminotetraacético
ESI ionización por electrospray (ESI, por sus siglas en inglés)
FDA Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos; FDA, por sus siglas
en inglés)
FEN flap endonucleasa (FEN, por sus siglas en inglés)
FFPE fijado en formalina e incluído en parafina (FFPE,por sus siqlas en inglés)
FISH hibridación fluorescente in situ (FISH, por sus siqlas en inglés)
FRET fluorescencia por transferencia de energía resonante (FRET,por sus siqlas en inglés)
1
Los materiales de referencia para las técnicas basadas en ácidos nucleicos se consiguen en el National lnstitue of Standards and Technology (Instituto Nacional de
Normas y Tecnología; NIST,por sus siglas en inglés) http://ts.nist.gov/measurementservices/referencematerials/index.dm.
USP42 Información General/ (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción 8023
GLP buenas prácticas de laboratorio

ICH lnternational Conference on Harmonization(Conferencia Internacionalsobre Armonización;ICH,por sus siglas en in-
glés)
LAPS sensor potenciométrico fotosensible
LCR reacción en cadena de la ligasa (LCR,por sus siglas en inglés)
LEO diodo emisor de luz (LEO,por sus siglas en inglés)
LNA ácido nucleico bloqueado (LNA,por sus siglas en inglés)
MALDI ionización por deserción láser asistida por matrices (MALDI,por sus siglas en inglés)
MDA amplificaciónpor desplazamiento múltiple (MDA,por sus siglas en inglés)
MOPS ácido 3-[N-[morfolino]propanosulfónico
MS espectroscopía de masas
NASBA amplificaciónbasada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA,por sus siglas en inglés)
NAT tecnología de amplificaciónde ácidos nucleicos(NAT,por sus siglas en inglés)
NTP nucleótido trifosfato
OLA ensayo de ligaciónde oligonucleótidos(OLA,por sus siglas en inglés)
PAGE electroforesisen gel de poliacrilamida
PCR reacción en cadena de la polimerasa
PEP preamplificaciónpor extensión de cebadores (PEP,por sus siglasen inglés)
PPi pirofosfato
QA garantía de calidad
QC control de calidad
RCA amplificaciónpor círculo rodante (RCA,por sus siglas en inglés)
RFLP polimorfismode la longitud de los fragmentos de restricción(RFLP,por sus siglas en inglés)
RT transcriptasa reversa (RT,por sus siglas en inglés)
RT-PCR reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa
rTth Thermusthermophilusrecombinante
SDS dodecil sulfato de sodio
SNP polimorfismode un solo nucleótido (SNP,por sus siglas en inglés)
SSCP polimorfismoconformacionalde cadena simple (SSCP,por sus siglas en inglés)
STR repetición corta en tándem (STR,por sus siglasen inglés)
Taq Thermusoquaticus
Tm temperatura de fusión (desnaturalización)
TMA amplificaciónmediada por transcripción (TMA,por sus siglas en inglés)
TOF tiempo de vuelo (time-of-fliqht)
UNG uracil-N-glicosilasa
VHC virus de la hepatitis C
VIH virus de la inmunodeficienciahumana
WGA amplificacióndel genoma completo (WGA,por sus siglas en inglés)
(1126) TÉCNICASBASADASEN ÁCIDOS NUCLEICOS-EXTRACCIÓN,

DETECCIÓNY SECUENCIACIÓN
EXTRACCIÓNDE ÁCIDOS NUCLEICOS
Introducción
Los principios básicos de las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (NAT,por sus siglas en inglés) y las definiciones
de las diversas técnicas se tratan en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Generalidades(1125). El presente capítulo cubre los
pasos generales en la extracción y purificación de ácidos nucleicos de una gran variedad de muestras.
La disciplina en expansión de la biología molecular en la investigación y desarrollo farmacéutico y biomédico se caracteriza
por el rápido descubrimiento de nuevos marcadores para enfermedades y tecnologías para su detección. Los ácidos nucleicos
8024 (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción / Información General USP42
blanco o diana se aíslan de una gran variedad de muestras y la calidad y cantidad del blanco extraído se ven enormemente
afectadas por la recolección y manipulación de la muestra y la elección del procedimiento de extracción.
El análisis de organismos complejos con técnicas de biología molecular exige el aislamiento de ADN genómico puro de alto
peso molecular y de ARN intacto de longitud completa. La aplicación de estas técnicas permite entonces la detección, identifi-
cación y caracterización del organismo asociado o del agente adventicio. Las pruebas recientemente desarrolladas que em-
plean ADN humano purificado permiten hacer análisis genéticos para detectar la presencia, predisposición o estado del porta-
dor de enfermedades hereditarias como la fibrosis quística, la hemocromatosis hereditaria o la enfermedad de Tay-Sachs, para
nombrar unos pocos ejemplos, o el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés).
La ADNasa y la ARNasa son las principales fuentes de inestabilidad de ácidos nucleicos. Aunque ambas enzimas son ubicuas
y fácilmente liberadas durante la extracción de ácidos nucleicos, las ARNasas son bastante más estables y más difíciles de de-
sactivar que las ADNasas porque generalmente no requieren cofactores para funcionar. Para destruir el ARN bastan cantidades
mínimas de ARNasa, de manera que se debe poner especial atención para evitar introducir inadvertidamente estas enzimas en
la muestra durante o después del proceso de aislamiento. Si se recolecta ARN para la aplicación específica del análisis de expre-
sión génica, los investigadores deben tener en cuenta que el proceso mismo de recolección de la muestra puede alterar el per-
fil de expresión resultante.
Debido a la ubicuidad de las ARNasas, la medición de blancos o dianas de ARN intracelulares ha quedado rezagada con res-
pecto a la de blancos de ADN en la contribución al manejo de pacientes y la caracterización de blancos para fines farmacéuti-
cos. Sin embargo, el ARN representa el estado actual del organismo y es una herramienta importante para correlacionar un
fenotipo con su actividad genética asociada. La naturaleza inestable del ARN ha hecho difícil la estandarización de las pruebas
NATy es muy factible la producción de resultados falsos negativos en una muestra deficientemente manipulada, debido a la
degradación del blanco, más que a la ausencia de enfermedad o a regulación de la actividad de los genes. No obstante, los
sistemas de aislamiento y detección que se consiguen comercialmente proporcionan un alto grado de estandarización y robus-
tez que ha traído como consecuencia la implementación de ensayos basados en ARN en los últimos años. Las siguientes sec-
ciones discuten los pasos generales en la extracción y purificación de los ácidos nucleicos a partir de una gran variedad de
muestras, concentrándose en (1) recolección, manipulación y almacenamiento de muestras; (2) disrupción de muestras; (3)
subsiguiente extracción y purificación de ácidos nucleicos; y (4) almacenamiento de ácidos nucleicos purificados.
Fuentede la Muestra
La amplia diversidad de muestras posibles requiere diferentes procedimientos para su recolección. Por ejemplo, las muestras
de sangre se recolectan en un tubo que contiene el anticoagulante o aditivo apropiado. El ácido etilendiaminotetraacético (ED-
TA) y el ácido-citrato-dextrosa (ACD) son los anticoagulantes recomendados para las pruebas que requieren plasma o muestras
de aspirado de médula ósea (AMO). Cuando la extracción de los tejidos resulta apropiada, la cantidad de tejido óptima es por
lo general 1 a 2 g, dependiendo del tipo de tejido, porque la cantidad de ADN y ARN por peso de tejido varía enormemente
de un tejido a otro. Por lo general, se requieren más de 1O mg de tejido para obtener> 1O µg de ADN o ARN. Debido a las
cantidades y tipos tan variables de proteínas y otros contaminantes presentes en los diferentes tejidos, los protocolos de aisla-
miento de ácidos nucleicos son específicos de los tejidos. Varios fabricantes de kits para extracción de ácidos nucleicos ofrecen
una amplia gama de sistemas de aislamiento listos para usar. El tipo de tejido también influye en la estabilidad, tanto del ADN
como del ARN en las muestras, y los dos tipos de ácido nucleico difieren de manera importante con respecto a la preparación
de la muestra y el análisis en etapas posteriores. Estos temas se describen más adelante en este capítulo.
EtapasPreanalíticasy Recolecciónde la Muestra

Aunque la composición genética del organismo permanece prácticamente sin cambio con el tiempo, la población de ARNm
representa el estado actual de una célula bajo cualquier conjunto de condiciones dadas y por lo tanto, es sumamente dinámi-
ca. Para prevenir la degradación de ARNm y/o preservar el patrón de transcripción original del ARNm celular, se debe colocar
inmediatamente el tejido en hielo o congelarlo instantáneamente en nitrógeno líquido. Sin embargo, la congelación altera la
estructura celular y libera ARNasas. Por esa razón, para el aislamiento de ARN en general (ARNm, ARN ribosómico, ARN viral,
etc.) es esencial descongelarlo en una solución amortiguadora inactivante de la ARNasa. Un procedimiento más conveniente
emplea un agente estabilizante a temperatura ambiente. Se consiguen comercialmente varios reactivos para diferentes tipos de
material de muestra (p. ej., tejido o bacteria). Las sales de vanadio se usaban para inhibir la actividad de ARNasa, pero han sido
reemplazadas por el uso de agentes caotrópicos para la inhibición de ARNasa y la estabilización de ARN. La muestra se puede
recolectar fácilmente en dichos reactivos y almacenarse desde varios días a semanas antes del aislamiento del ARN.
Para el análisis confiable de la expresión génica, un prerrequisito ineludible es la estabilización inmediata del patrón de ex-
presión del ARNy del ARN mismo. Inmediatamente después que la muestra biológica es obtenida o extraída, ocurren cambios
en el patrón de expresión génica debido a la degradación específica y no específica del ARN, así como a la inducción de la
transcripción. Dichos cambios en el patrón de expresión génica se deben evitar en todos los análisis cuantitativos confiables de
la expresión génica, tales como el biochip y los análisis de matrices o arreglos (array analysis) y la reacción en cadena de la
polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR,por sus siglas en inglés) cuantitativa.
El uso de guantes mientras se manipulan reactivos y muestras de ARN es obligatorio para evitar la contaminación con ARNa-
sa proveniente del contacto con la superficie de la piel o del equipo de laboratorio. Con el fin de crear y mantener un ambien-
USP42 InformaciónGeneral/ (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción 8025
te sin ARNasa, el personal de laboratorio debe tratar el agua y las soluciones amortiguadoras con dietilpirocarbonato (DEPC), el
cual inactiva las ARNasas por modificación química covalente. Se debe tener cuidado porque el DEPC es irritante para los ojos,
piel y membranas mucosas y es también un posible carcinógeno. Como alternativa, se pueden usar soluciones y reactivos sin
ARNasa que se consiguen comercialmente. También se consiguen comercialmente las proteínas inhibidoras de la ARNasa para
uso en reacciones, pero con grados diferentes de eficacia con respecto a los diversos tipos de ARNasa. Sin embargo, cabe tener
en cuenta que el DEPC no puede usarse con soluciones amortiguadoras de Tris. Muchos científicos recomiendan el uso de reci-
pientes desechables al trabajar con ARN. El material de vidrio no desechable se debe limpiar con un detergente, enjuagar cui-
dadosamente y luego secar en horno a 240° durante 4 horas o más antes de usarlo (el autoclave solo no desactiva totalmente
muchas de las ARNasas). Como alternativa, el material de vidrio se puede tratar también con DEPC. El material de plástico no
desechable se debe enjuagar cuidadosamente con hidróxido de sodio O,1 M y EDTA1 mM, seguido por agua sin ARNasa.
Como alternativa, se puede enjuagar con cloroformo el material de plástico que sea resistente al cloroformo para inactivar las
ARNasas. El uso de puntas (tips) con filtros resistentes a los aerosoles también es importante para evitar la contaminación con
ARNasa. Estos temas no son críticos para el ADN y por lo general basta con seguir las pautas de Buenas Prácticas de Laborato-
rio (GLP,por sus siglas en inglés) para aislar exitosamente el ADN.
Como precaución general, el personal debe seguir todas las precauciones de seguridad aplicables cuando manipule tejidos o
líquidos corporales (humanos o de otro tipo). Algunas de estas precauciones (p. ej., el uso de guantes desechables) evitan tam-
bién la contaminación de la muestra. Las guías y normas aplicables para la recolección y procesamiento de materiales de ori-
gen humano han sido publicadas por la American Association of Blood Banks (AABB),la Conferencia Internacional sobre Armo-
nización (ICH) y la FDA.
Disrupción y Homogeneización de la Muestra

Antes de la extracción se disrumpe y homogeniza el material inicial. La disrupción es el rompimiento completo de las pare-
des celulares y membranas plasmáticas de los tejidos sólidos y de las células con el fin de liberar todo el ADN y el ARN conteni-
do en la muestra. Esto se logra por lo general usando una solución amortiguadora de lisis que también inactiva nucleasas en-
dógenas. Además de disrumpir tejidos, la homogeneización corta ADN y componentes celulares de alto peso molecular. Du-
rante el aislamiento del ARN, los científicos a menudo tienen que reducir la viscosidad de los lisados celulares (causada por la
presencia de moléculas de ADN de alto peso molecular) antes del aislamiento final, con el fin de hacer más fáciles y eficientes
los pasos siguientes de la extracción. La homogeneización incompleta puede interferir con los pasos subsiguientes de purifica-
ción de ARN (p. ej., unión ineficiente del ARN a membranas de sílice) y por lo tanto producir un rendimiento bajo. Un procedi-
miento típico para cortar ADN de alto peso molecular y homogeneizar la muestra consiste en pasar repetidamente el lisado a
través de una aguja de pequeño calibre. Sin embargo, este procedimiento requiere mucho tiempo y no es apto para procesar
un alto número de muestras. Los mejores procedimientos para conseguir la disrupción y homogeneización completas de las
células y tejidos incluyen la agitación rápida en presencia de perlas (beads) y solución amortiguadora de lisis (molienda con
perlas) u homogeneización con rotor-estator.
Durante el proceso de molienda con perlas, la disrupción y homogeneización simultáneas ocurren por la acción de ruptura y
trituración que imparten las perlas a medida que colisionan con las células. La eficiencia de la disrupción está influenciada por
el tamaño y composición de las perlas, la velocidad y configuración del agitador, la relación entre solución amortiguadora y
perlas, el tiempo de desintegración y la cantidad de material inicial. Estos parámetros se deben determinar empíricamente para
cada aplicación. Para disrupción con mortero y mano, las muestras deben congelarse en nitrógeno líquido y molerse hasta un
polvo fino bajo nitrógeno líquido. Al trabajar con nitrógeno líquido se deben poner en práctica las precauciones estándar de
seguridad y usar vestimenta de seguridad para proteger la piel y los ojos. Los homogeneizadores de rotor-estator son capaces
de disrumpir y homogeneizar tejidos animales y vegetales en 5 a 90 segundos, dependiendo de la muestra. El rotor gira a
velocidad muy alta, haciendo que la muestra se disrumpa por una combinación de turbulencia y ruptura mecánica. Otras al-
ternativas son las columnas homogeneizadoras para centrifugación (spin-column homogenizers) comerciales en combinación
con tecnología de membrana de sílice, que proporcionan una manera rápida y eficiente de homogeneizar lisados de células y
tejidos sin contaminación cruzada de las muestras.
Con el fin de conseguir la disrupción completa, los diferentes tipos de muestra requieren distintos procedimientos. Las célu-
las de cultivos de tejido que crecen como monocapa o en suspensión se disrumpen fácilmente por adición de una solución
amortiguadora de lisis que por lo general contiene una mezcla de un detergente aniónico, una proteasa y un agente caotrópi-
co en una solución salina amortiguada. En contraste, la disrupción de tejidos fibrosos, como músculo esquelético, corazón y
aorta, para el aislamiento de ácidos nucleicos puede ser dificultosa debido a la abundancia de proteínas contráctiles, tejido
conjuntivo y colágeno. Las muestras de tejido frescas o congeladas se deben cortar en pedazos pequeños para ayudar a la lisis.
Las muestras de sangre, incluyendo las tratadas para retirar eritrocitos pueden lisarse eficazmente con una solución amortigua-
dora de lisisy una proteinasa.
En general, los mismos procedimientos se pueden aplicar para la extracción de ADN y ARN. Para el aislamiento de ADN se
prefieren procedimientos más delicados, mientras que durante el aislamiento de ARN se pueden disrumpir células y tejidos
usando un molino mezclador porque no hay riesgo de cortar el ARN. Ciertas aplicaciones posteriores requieren ADN de alto
peso molecular; por lo tanto, se debe tener cuidado de no cortar las moléculas de ADN para no volverlo inapropiado para los
análisis posteriores.
8026 (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción/ Información General USP42
Extraccióny Purificación
Aunque hay varios procedimientos disponibles para la extracción de ácidos nucleicos, la aptitud de un procedimiento de-
pende del material inicial, del tipo y pureza del ácido nucleico aislado y posiblemente de la aplicación posterior. A continua-
ción se describen los principales procedimientos; el mercado ofrece varios kits comerciales para diferentes tipos de muestras y
aplicaciones.
EXTRACCIÓNDE FASE
La técnica original para extracción de ADN y ARN a partir de muestras lisadas es la extracción de fase, que incluye la extrac-
ción de ácido nucleico usando una mezcla de fenol y cloroformo. Dependiendo del pH y de la concentración salina, el ADN o
ARN se separan en la fase acuosa. A pH neutro o básico, el ADN permanece en la fase acuosa y el ARN en la fase orgánica o en
la interfase (con las proteínas). Sin embargo, a pH ácido, el ADN de la muestra se protona neutralizando la carga y esto ocasio-
na que se separe en la fase orgánica. El ARN que permanece cargado se separa en la fase acuosa. Las dos fases se separan por
centrifugación y la fase acuosa se vuelve a extraer con una mezcla de fenol y cloroformo, seguida por extracción con clorofor-
mo para retirar el fenol residual. El ácido nucleico se recupera de la fase acuosa por precipitación con alcohol. Para el ARN, este
procedimiento a menudo se combina con digestión con proteasas, precipitación con alcohol o cloruro de litio y/o gradientes
de densidad de cloruro de cesio (CsCI). Un problema potencial es la contaminación del ADN o ARN recuperado con disolven-
tes orgánicos que pueden interferir con las reacciones enzimáticas posteriores o las lecturas espectroscópicas.
CENTRIFUGACIÓN
EN GRADIENTEDE DENSIDADDE CLORURODE CESIO
Para el aislamiento de ADN genómico de alto peso molecular, la centrifugación en gradiente de densidad de CsCI es el pro-
cedimiento tradicional. Las células se lisan usando un detergente y el ADN se aísla del lisado por precipitación con alcohol. El
ADN se mezcla entonces con CsCI y bromuro de etidio y se centrifuga por varias horas a fuerza g alta (normalmente 100 000 x
g). La banda de ADN, que se puede visualizar bajo luz UV como resultado de la intercalación del bromuro de etidio con el
ADN se recolecta del tubo de centrífuga, se extrae con isopropanol para retirar el bromuro de etidio y luego se precipita con
etanol para recuperar el ADN. Este procedimiento permite el aislamiento de ADN de alta calidad pero requiere mucho tiempo
y también representa una preocupación en cuanto a seguridad debido a la gran cantidad de EtBr utilizado.
CROMATOGRAFÍA
DE INTERCAMBIO
ANIÓNICO
Un procedimiento alterno para la purificación de ADN genómico de alto peso molecular es la cromatografía de intercambio
aniónico basada en la interacción entre los grupos fosfato del ácido nucleico cargados negativamente, y las moléculas de su-
perficie cargadas positivamente, en la resina de intercambio aniónico. La unión ocurre bajo condiciones de baja salinidad y las
impurezas, como el ARN, las proteínas celulares y los metabolitos se lavan usando amortiguadores de salinidad media. El ADN
puro se eluye con un amortiguador de alta salinidad y se desaliniza y concentra por precipitación con alcohol. Este procedi-
miento produce ADN de una pureza y actividad biológica equivalente a dos rondas de purificación en gradientes de CsCI, pero
en mucho menos tiempo. El procedimiento evita también el uso de sustancias tóxicas y puede adaptarse para diferentes esca-
las de purificación. Con este procedimiento se puede aislar ADN de hasta 150 kilobases (kb) de longitud. Se consiguen varios
kits para el aislamiento de ADN basado en tecnología de intercambio aniónico y los procedimientos varían en los tiempos de
procesamiento y calidad y tamaño del ADN aislado.
TECNOLOGÍADE SÍLICE
El procedimiento actual de elección para la mayoría de las aplicaciones se basa en tecnología de sílice y se puede usar para el
aislamiento de ARN de longitud completa o ADN con un tamaño promedio de 20 a 50 kb. Sin embargo, el ADN de peso mo-
lecular mayor, que exceda de 100 kb, no se extrae eficientemente con esta tecnología. El procedimiento depende de la adsor-
ción selectiva de ácidos nucleicos a la sílice, en presencia de altas concentraciones de sales caotrópicas. Aunque ambos tipos de
ácido nucleico se adsorben a la sílice, el uso de soluciones amortiguadoras específicas en el procedimiento de lisis garantiza
que solo se adsorba el ácido nucleico deseado, mientras otros ácidos nucleicos, proteínas celulares y metabolitos permanecen
en solución. Los contaminantes se lavan y el ARN o ADN de alta calidad se eluye de la sílice usando una solución amortiguado-
ra de baja salinidad. La matriz de sílice se puede usar como partículas en suspensión, en forma de perlas magnéticas o como
una membrana. Esta técnica es de alta capacidad de procesamiento y comercialmente se consiguen varios kits y sistemas auto-
matizados. Sin embargo, estas soluciones amortiguadoras acuosas de lisis (en contraste con soluciones amortiguadoras de lisis
preparadas en un disolvente orgánico, como fenol) no son las más aptas para muestras difíciles de lisar (p. ej., tejidos adipo-
sos). Se consiguen kits diseñados para facilitar la lisis de tejidos adiposos y para inhibir las ARNasas. Los kits a base de sílice
ofrecen un procedimiento rápido y confiable para la purificación del ADN y del ARN y se usan comúnmente para la extracción
de ácidos nucleicos.
USP42 InformaciónGeneral/ (1126) Técnicas Basadasen Ácidos Nucleicos-Extracción8027
Aunque estos procedimientos generan ácidos nucleicos puros, en algunas aplicaciones en las cuales los oligocontaminantes
pueden interferir con ARN o ADN, puede ser necesario el pretratamiento con ADNasa o ARNasa. Como alternativa, se pueden
usar procedimientos que usen sondas de captura específicas. Las aplicaciones pertinentes que requieren tales ácidos nucleicos
ultrapuros se discuten en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Amplificación (1127).
AplicacionesEspecíficaspara Materiales de Difícil Extracción
EXTRACCIÓNA PARTIRDE BIOPSIASFIJADASCON FORMALINAE INCLUIDASEN PARAFINA
Los ácidos nucleicos en biopsias fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE,por sus siglas en inglés) están por lo gene-
ral muy fragmentados y químicamente modificados por el formaldehído. Aunque la modificación por formaldehído no se pue-
de detectar en ensayos estándar de control de calidad, como la electroforesis en gel, tal modificación interfiere con los análisis
enzimáticos. Con una digestión prolongada con proteasa se puede conseguir la suficiente extracción y desmodificación de
ADN, pero esto llevará a una extensa fragmentación y degradación del ARN. Algunos sistemas de aislamiento han sido optimi-
zados para invertir la modificación de formaldehído hasta donde sea posible sin posterior degradación del ARN. Sin embargo,
el ARN purificado de las muestras FFPEno se debe usar en las aplicaciones posteriores que requieren ARN de longitud comple-
ta. Algunas aplicaciones pueden requerir modificaciones para permitir el uso de ARN fragmentado (p. ej., diseño de amplico-
nes pequeños para RT-PCR).
EXTRACCIÓNA PARTIRDE BACTERIAS

Y PATÓGENOS
Aunque las bacterias gramnegativas son relativamente fáciles de lisar, las bacterias grampositivas o las levaduras necesitan
por lo general un pretratamiento enzimático para retirar la pared celular con el fin de lograr una lisis eficiente. Esta metodolo-
gía se puede aplicar solo al aislamiento de ADN porque el tratamiento enzimático influirá en el perfil de expresión del organis-
mo y por lo tanto el aislamiento de ARN requiere un procedimiento de lisis más rápido. Otro factor para tener en cuenta es
que los microorganismos normalmente se presentan dentro de una matriz anfitriona o ambiental (p. ej., tierra), lo cual dificulta
a menudo la detección por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), debido a los componentes
inhibidores. Esto significa que el procedimiento de aislamiento tiene que ser cuidadosamente adaptado y optimizado para el
organismo y tipo de muestra específicos. Se consiguen kits comerciales y la mayoría están basados en el uso de lisozima para la
remoción de las paredes celulares.
CONSIDERACIONESESPECIALES
PARACANTIDADESLIMITADASDE MUESTRA
Múltiples técnicas de pruebas genéticas, incluyendo el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), análisis de re-
petición corta en tándem, secuenciación o genotipificación usando matrices, PCR en tiempo real y otros procedimientos, de-
penden de la disponibilidad de ADN de alta calidad. Dado que el ADN genómico humano o las muestras de genotipos indivi-
duales con frecuencia son limitadas, un proceso para inmortalizar muestras de ácidos nucleicos podría superar esta limitación.
Los procedimientos aplicables a la genotipificación se discuten en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Genotipificación
(1129). La amplificación del genoma completo (:NGA, por sus siglas en inglés) se ha empleado recientemente para amplificar
ADN genómico limitado a partir de ADN ya purificado o directamente de muestras clínicas y casuísticas sin ninguna purifica-
ción del ADN. Existen dos tecnologías básicas para WGA, basadas en PCR o que dependen de amplificación isotérmica por
desplazamiento múltiple. Estas aplicaciones se describen en más detalle en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Amplificación
(1127).
Manipulaciónde la Muestra y Almacenamientoa Largo Plazo
El ADN es una macromolécula relativamente estable y una vez aislado puede mantenerse entre 2º y 8º al menos durante 1
año. Sin embargo, cuando el ADN está presente en cantidades muy pequeñas, como es el caso de una prueba de ADN resi-
dual, podría ser aconsejable almacenar el ADN a temperaturas menores o iguales a -20º. Por lo general, el ADN se almacena
en solución. Se puede usar agua destilada si el ADN se va a usar para PCR y/o digestión por endonucleasas a los pocos días
después de su aislamiento. Sin embargo, para el almacenamiento del ADN la solución amortiguadora preferida es Tris-EDTAa
pH entre 7,5 y 8,5, dado que en agua puede ocurrir la degradación del ADN debido a la limitada capacidad amortiguadora de
este medio. Los ácidos nucleicos purificados conservan características reconocibles durante el almacenamiento a largo plazo,
siempre y cuando las muestras se almacenen como soluciones congeladas. La solución de ADN se debe almacenar como una
solución madre primaria congelada a -80º. ElADN también se puede liofilizary almacenar seco sin necesidad de refrigeración.
En algunos casos, el ADN se puede almacenar por años sobre papeles de filtro especiales a los cuales se adhiere y que permiten
el almacenamiento en estado seco a temperatura ambiente.
La ubicuidad de las ARNasas requiere precauciones extras al manipular el ARN. El ARN aislado se debe mantener en hielo
mientras se pipetean las alícuotas. Se recomienda el uso de puntas (tips) con filtro que evitan el arrastre de la ARNasa de la
pipeta, y tubos estériles y desechables de polipropileno durante todo el procedimiento porque estos tubos por lo general no
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8028 (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción / Información General USP42
contienen ARNasa y no requieren ningún tratamiento para inactivar las ARNasas. ElARN purificado se puede almacenar a -20º
o -80° en agua. Bajo estas condiciones normalmente no se detecta degradación alguna. A diferencia del ADN, el ARN no se
beneficia de las soluciones amortiguadoras básicas durante el almacenamiento a largo plazo debido a su sensibilidad a las con-
diciones alcalinas. Por lo general, si se requieren muestras de ácido nucleico para pruebas múltiples, se deben congelar las
muestras de ARNy ADN en múltiples alícuotas a -80º para análisis subsiguientes, con el fin de evitar ciclos repetidos de conge-
lación-descongelación que pueden producir degradación y también para minimizar la posibilidad de contaminación, que po-
dría ser causa de inexactitud analítica.
EVALUACIÓNCUALITATIVA
Y CUANTITATIVA
DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Introducción
Esta sección describe los procedimientos que evalúan la pureza, integridad y cantidad de los ácidos nucleicos purificados,
incluidos los procedimientos espectroscópicos, la electroforesis de fragmentos de ácido nucleico y las técnicas basadas en son-
das. La detección y cuantificación por amplificación se discuten en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Amplificación (1127).
ESPECTROSCOPÍA
DE ABSORBANCIA
Los principios básicos se tratan en Espectroscopía Ultravioleta-Visible(857). La absorbancia de los ácidos nucleicos se determi-
na a 260 nm, pero este procedimiento no distingue entre ADN y ARN. La absorbancia se puede usar también para calcular la
contaminación proteica en los ácidos nucleicos. La absorción máxima de las proteínas se observa a 280 nm y la de los ácidos
nucleicos a 260 nm. Por lo tanto, el cálculo del cociente de absorbancias A260/A280 se usa como un cálculo aproximado de la
contaminación proteica en las preparaciones de ácidos nucleicos. Una relación de 1,8 a 2,0 se considera ideal. Como ejemplo,
el ADN de doble cadena tiene un coeficiente de extinción de 20 para 1 mg por mL de ADN a 260 nm y un coeficiente de 1O a
280 nm. En contraste, para 1 mg por mL de proteína, el coeficiente de extinción es del orden de 1 a 280 nm (dependiendo
del contenido de tirosina y triptofano) y 0,57 a 260 nm. Por lo tanto, puede existir una abundante contaminación proteica
para un cociente 260/280 de más de 1,8 debido a la baja sensibilidad de la absorbancia de las proteínas. Además, el cambio
de absorbancia del ADN con la longitud de onda (M/l!J..) es pronunciado a 280 nm y esto podría llevar a una determinación
incorrecta si el espectrofotómetro está descalibrado. El pico a 260 nm es amplio y por eso las lecturas son menos sensibles a los
problemas de calibración.
La información sobre contaminación por materiales no proteicos se puede obtener por un barrido del ADN de 220 nm a
320 nm. El ADN puro tiene un pico principalmente simétrico alrededor de 260 nm, cero absorbancia a 320 nm y un mínimo a
230 nm. La absorbancia se eleva de nuevo desde 230 nm a 220 nm. Las sustancias de interferencia pueden copurificarse con
el ADN y absorber en el intervalo UV más bajo (alrededor de 230 nm). Estas sustancias pueden interferir con el contenido de
ADN y llevar a sobrestimarlo, lo cual demuestra la utilidad de un barrido, o al menos de una medición de absorbancia, a 230
nm, además de hacerlo a 260 nm y 280 nm. La absorbancia por encima de 300 nm puede provenir de otros contaminantes y
partículas. Si no se retiran completamente los reactivos comunes usados en el aislamiento de ADN, en particular disolventes
como fenoles y alcoholes, pueden interferir con las mediciones de absorbancia del ADN. Los analistas deben estar conscientes
de las limitaciones de este tipo de medición. Por último, la absorbancia del ADN y el cociente de absorbancias 260/280 depen-
de de la fuerza iónica; puede existir una diferencia hasta de 30%. La absorbancia del ADN genómico es más alta y el cociente
de absorbancias 260/280 es más bajo en agua pura cuando se compara con el mismo ADN en una solución amortiguadora o
en solución salina.
Con el propósito de cuantificar los ácidos nucleicos, se usan los respectivos coeficientes de extinción para ADN y ARN. Una
absorbancia de 1 en una cubeta de 1 cm corresponde a 50 µg por mL de ADN de doble cadena [E (coeficiente de absorción
específico)= 0,02 (µg por mL)-1 cm- 1]. El coeficiente de absorción específico para el ARN a 260 nm es E= 0,025 (µg por mL)-1
cm- 1 (la absorbancia de 1,0 corresponde a 40 µg por mL), y para ADN de cadena simple E= 0,027 (la absorbancia de 1,0
corresponde a 37 µg por mL). Una solución de ADN se lee contra un blanco de la misma solución amortiguadora en la cual se
disuelve el ADN. Lo ideal es que las lecturas estén dentro del intervalo de O,1 a 1,0 de absorbancia para una linealidad adecua-
da. La absorbancia por encima de 1,0 se vuelve cada vez menos lineal a medida que crece la absorbancia. La exactitud de las
lecturas por debajo de O,1 (5 µg por mL de ADN) depende de la calidad y nivel de ruido del espectrofotómetro.
Protocolospara Cuantificaciónde ADN y ARN por Fluorescencia
Los derivados de colorantes de cianina se usan para la cuantificación de ácidos nucleicos porque actúan específicamente con
los ácidos nucleicos (ADN, ARNy oligonucleótidos) y fluorescen solo después de su unión. El mecanismo exacto de interacción
no siempre se comprende por completo pero puede involucrar la intercalación en el ADN de doble cadena y la unión superfi-
cial.
Las mediciones pueden efectuarse usando un fluorómetro o un lector de placa. La sensibilidad de la fluorescencia con estos
colorantes es mucho mayor que la de la absorbancia, por lo cual estos colorantes son de gran utilidad cuando la concentración
de ADN es baja (hasta un mínimo de 25 pg por mL). El colorante debe estar protegido de la luz para evitar el fotoblanqueo. La
linealidad se mantiene sobre tres a cuatro órdenes de magnitud. Con frecuencia se usan ADN de timo de ternero y fago Lamb-
da como calibradores para construir una curva estándar. Algunos de estos colorantes se han optimizado para unir ADN de do-
ble cadena o ARN de cadena simple y oligonucleótidos. Un colorante de unión a ADN también se unirá al ADN de cadena
simple y al ARN pero solo a baja fuerza iónica y la señal es aproximadamente de 10% o menos que la observada con ADN de
doble cadena para una masa de material equivalente. Por lo tanto, esta metodología se prefiere para mediciones de ADN
cuando no se ha intentado retirar el ARN de la preparación. Otro colorante fluorescente que está optimizado para mediciones
de ARN también se encuentra disponible. Usando dos concentraciones diferentes de este colorante, los analistas pueden detec-
tar ARN en cantidades tan bajas como 1 ng por mL y tan altas como 1 µg por ml. El colorante también emite fluorescencia
con el ADN pero no muestra una habilidad equivalente para minimizar la unión por el uso de condiciones particulares (p. ej.,
con ADN y el colorante de unión a la doble cadena). La cuantificación puede verse afectada por el ácido nucleico contaminan-
te (p. ej., ADN en una preparación de ARNy viceversa) El tratamiento con una ADNasa es necesario si hay ADN presente en la
preparación de ARN. Es poco probable que las proteínas interfieran con estos colorantes, pero algunos detergentes, así como
fenoles ocasionan una pérdida en la fluorescencia. Por lo tanto, se debe verificar el efecto de los reactivos para extracción de
ácidos nucleicos en los ensayos de fluorescencia subsiguientes.
Los colorantes del fluorocromo bisbenzimida (como 2'-[4-hidroxifenil]-5-[4-metil-1-piperazinil]-2,5'-bi-1 H-benzimidazol) re-
presentan otra opción para medir el ADN. Los investigadores han estudiado la unión de estos colorantes al surco menor del
ADN y han encontrado que las secuencias de adenina o timina en la secuencia de ADN proporcionan una dimensión del surco
menor que se une mejor a los colorantes. Por lo tanto, la señal fluorescente puede mostrar dependencia por la secuencia de
ADN y el calibrante de ADN debería tener una composición de nucleótido que sea similar a la del ADN que se va a medir. Estos
colorantes no son tan sensibles como los colorantes de cianina pero son más sensibles que las mediciones de absorbancia. Se
requieren concentraciones bajas de colorante y fuerza iónica alta con el fin de que los analistas distingan el ADN de doble
cadena del ARN. Se requieren condiciones de fuerza iónica baja con el fin de diferenciar el ADN de doble cadena del ADN de
cadena simple.
Detección por Tamaño
ELECTROFORESIS
EN GELDE AGAROSA
La electroforesis en gel de agarosa proporciona un procedimiento simple y exacto para separar los ácidos nucleicos por el
tamaño del fragmento. La técnica se puede adaptar para separar fragmentos de un gran intervalo de tamaños y se puede usar
en una forma preparatoria o analítica. Por ejemplo, la electroforesis en gel se puede usar para verificar que un producto de una
reacción de PCR sea del tamaño correcto. Los fragmentos de ADN se pueden recuperar de una porción de gel y proporcionan
un producto de PCR suficientemente puro para clonación o secuenciación. La integridad general de una preparación de ARN
puede determinarse también por electroforesis en gel. La estequiometría del tamaño del fragmento de ácido nucleico (en pa-
res de bases) y la carga negativa del fosfato proporcionan la base para la separación. Con excepción de los plásmidos, la elec-
troforesis está generalmente libre de efectos inducidos por la conformación del ADN. El plásmido de ADN superenrollado emi-
grará delante del plásmido lineal o de círculo abierto/mellado, lo cual es útil para determinar la conformación de una prepara-
ción de plásmidos. En contraste, los geles desnaturalizantes se usan para el ARN debido a la tendencia que tiene el ARN a for-
mar estructuras ínter e intramoleculares secundarias.
La electroforesis en gel de agarosa utiliza una configuración horizontal donde el gel se moldea en un soporte adecuado y se
coloca sobre un puente entre dos compartimientos para amortiguadores que están llenos de la solución amortiguadora elegi-
da. El gel se cubre también con una delgada capa (-1 mm) de solución amortiguadora. Aunque la principal resistencia eléctri-
ca está en el gel mismo, existe una carga suficiente en los ácidos nucleicos para mover los fragmentos hacia el ánodo a través
del gel. Los fragmentos se mueven en proporción con el tamaño, moviéndose más rápido los fragmentos más pequeños. Los
parámetros que más afectan la electroforesis son el tamaño de poro del gel, la concentración de la solución amortiguadora y el
gradiente de voltaje. La capacidad de separar los fragmentos elegidos es en gran medida una función del tamaño de poro del
gel, lo cual depende de la concentración de agarosa. Por lo general, la concentración de agarosa está en el intervalo de 0,5% a
1,0% para fragmentos de ADN de< 100 a 25 000 pares de bases y la concentración más alta se usa cuando es importante
distinguir los fragmentos más pequeños. La disminución de la concentración de agarosa en el gel lleva a la resolución de frag-
mentos más grandes pero también a una pérdida de resolución de los fragmentos pequeños. Para los fragmentos más grandes
se utiliza la electroforesis de campo pulsado (reverso).
Para conseguir una electroforesis uniforme, toda la agarosa debe estar completamente fundida. La agarosa de grado electro-
forético se disuelve en la misma solución amortiguadora que se usará para la electroforesis. Las soluciones amortiguadoras más
comúnmente usadas para las separaciones de ADN son TBE(tris-borato-EDTA)o TAE(tris-acetato-EDTA). La TBEtiene una ma-
yor capacidad amortiguadora que la TAE;pero esta última se debe usar si el ADN se va a recuperar del gel. Los geles desnatu-
ralizantes de ARN usan solución amortiguadora MOPS (40 mM de MOPS, 1 O mM de acetato de sodio y 1 mM de EDTA,pH
7,0). La fusión de la agarosa se logra de manera conveniente con ayuda de un horno de microondas. La agarosa entra fácil-
mente en ebullición, pero esto no siempre consigue la fusión completa de la agarosa, para lo cual se podría requerir llevar la
solución a ebullición varias veces, con períodos intermitentes de mezclado y reposo, hasta que la agarosa se funda completa-
mente. Las partículas de agarosa se transforman de blanco a transparente antes de la fusión. Cualquier agarosa parcialmente
fundida puede detectarse agitando el matraz mientras se sostiene contra la luz. La solución requiere más calentamiento si no
está uniforme. La agarosa se vierte en la cubeta para geles después de un enfriamiento parcial, pero antes de que gelifique.
También se pueden usar geles que se consiguen comercialmente listos para usar y aptos para una aplicación en particular. Para
geles desnaturalizantes de ARN, se agrega formaldehído a la agarosa fundida bajo una campana de extracción, hasta una con-
centración final de 2,2 M o 6,7%. Antes de que la agarosa se haya endurecido, el analista coloca un peine en el gel para crear
pocillos para las muestras y los estándares de tamaño. Una vez solidificado, el gel se coloca en la cubeta de electroforesis y la
solución amortiguadora se agrega hasta que llene ambos lados y haya una capa de solución amortiguadora sobre toda la su-
perficie del gel. Luego se agrega la solución amortiguadora de rastreo 1OX(40% de sacarosa con 0,25% de azul de bromofe-
nol o 0,25% de xileno cianol, o ambos) a cada muestra de ADN para aumentar la densidad de la muestra y proporcionar un
colorante de rastreo que se usa para evaluar cuándo termina la electroforesis. El aumento de la densidad permite transferir la
muestra al pocillo y mantenerla ahí hasta que migre dentro del gel durante la electroforesis.
Se deben usar una o más calles (lanes) para un estándar de tamaño de ADN que contenga fragmentos dentro del intervalo
pertinente a las muestras y la concentración de agarosa. Los estándares de tamaño en varios intervalos se consiguen fácilmen-
te. Es útil poner las muestras en los pocillos entre los estándares para determinar si el gradiente de electroforesis ha sido unifor-
me en todo el ancho del gel. Sin embargo, en el caso de preparaciones de ARN de células eucarióticas, los ARN ribosómicos
l 8S y 28S que se coextraen de las bandas prominentes (correspondientes a 1900 y 4700 nucleótidos) se pueden usar también
como estándares de tamaño. Además, el ARNr proporciona información sobre la integridad del ARN porque las bandas de
ARNrfaltantes o confusas indican problemas con la calidad de la preparación del ARN. Una vez que se han llenado los pocillos,
se coloca la tapa sobre la cubeta del gel y se conecta la cubeta al suministro eléctrico. El colorante indicador en la solución
amortiguadora de rastreo agregada a las muestras y al estándar de tamaño permite determinar fácilmente qué tan lejos ha
avanzado la electroforesis. El azul de bromofenol migrará con fragmentos de ADN de <500 pares de bases y el xileno cianol
migrará con fragmentos de 5000 pares de bases.
El suministro eléctrico funciona con frecuencia bajo condiciones de voltaje constante (1 a 1O V) por cm de la longitud del
gel. Elvoltaje elevado puede ocasionar corriente alta, lo cual produce calor nocivo y agotamiento de la solución amortiguado-
ra.
ELECTROFORESIS
DE CAMPO PULSADO
Esta variación de electroforesis en gel de agarosa se usa para separar un intervalo de fragmentos grandes de ADN y es muy
útil cuando se necesita una resolución de fragmentos de 50 000 a 200 000 pares de bases. La diferencia principal es la adición
de un dispositivo de campo alterno que controla el suministro eléctrico de voltaje constante. Los fragmentos grandes de ADN
cambian la conformación con el fin de moverse a través de los poros de agarosa; los fragmentos más grandes demoran más en
reajustarse cuando el campo se invierte y por lo tanto se mueven más lentamente que los fragmentos más pequeños. Esto
permite la resolución de fragmentos durante el período de horas en que funciona el procedimiento de campo pulsado. Una
relación comúnmente usada de dirección hacia delante y hacia atrás es 3:1 y, además, el procedimiento típicamente requiere
un aumento escalonado en la unidad de tiempo entre inversiones del campo. La electroforesis puede continuar por 1O a 16
horas para evitar la fluctuación en la temperatura del gel, la viscosidad y otras propiedades que podrían causar artefactos.
ELECTROFORESIS
EN GEL DE POLIACRILAMIDA
(PAGE, POR SUS SIGLASEN INGLÉS)
Elformato para efectuar la PAGEes muy diferente del de la electroforesis en gel de agarosa. El procedimiento general para
PAGEse describe en ArtículosObtenidospor Biotecnología-Electroforesis en Gelde Poliacrilamida(1056). Para resolución de pe-
queños fragmentos de ADN en el intervalo de 1O a 500 pares de bases, la electroforesis en gel de poliacrilamida no desnatura-
lizante es más apta que la electroforesis en gel de agarosa porque la separación de fragmentos de este tamaño requiere tama-
ño de poro mucho más pequeño que lo que se consigue en los geles de agarosa. El gel se prepara por polimerización de mo-
nómeros de acrilamida. El porcentaje de acrilamida determina el intervalo de tamaños de fragmentos que se pueden resolver
mejor. Por ejemplo, 20% de acrilamida es apto para el intervalo de 1O a 100 pares de bases y 5% de acrilamida es útil en el
intervalo de 100 a 500 pares de bases. También se pueden usar geles de poliacrilamida que se consiguen comercialmente lis-
tos para usar y son aptos para la discriminación de un tamaño particular. Los ácidos nucleicos separados se visualizan por tin-
ción por ejemplo con solución de nitrato de plata en vez de usar colorantes de bromuro de etidio o cianina. Sin embargo, la
tinción con nitrato de plata es laboriosa y requiere tiempo y no es apta para preparaciones que contengan una gran cantidad
de proteína, porque las proteínas se colorean también con el nitrato de plata.
ELECTROFORESIS
CAPILARY FLUORESCENCIA
INDUCIDAPOR LÁSER(CE-UF, POR SUS SIGLASEN INGLÉS)
La CEF se ha usado durante muchos años para separar fragmentos de ADN (para los principios generales de CE, ver Electrofo-
resisCapilar(1053)). El procedimiento se basa en un principio similar al de la electroforesis con gel de agarosa. La CE puede
utilizar los sistemas de amortiguación entrecruzada aplicados en la electroforesis en gel, pero la técnica puede usar también
soluciones que contienen polímeros (p. ej., polimetilcelulosas) que están diseñadas para crear poros que atrapen las proteínas.
Estas soluciones poliméricas se pueden agregar a los capilares entre las inyecciones, lo cual permite obtener un gel "fresco"
antes de cada corrida. Además, se pueden usar capilares para más inyecciones de lo que es posible para capilares polimeriza-
USP42 InformaciónGeneral/ (1126) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción 8031
dos llenos de gel. El poder de resolución de la separación depende del tamaño de los poros, que se basa en la composición del
gel. Se consiguen kits para separar fragmentos en los intervalos de tamaño deseados. Es posible separar tamaños de fragmen-
tos fuera de la ventana de resolución, pero dicha separación puede no ser confiable o reproducible cuando se excede la capa-
cidad del gel.
Los fragmentos se pueden detectar por una gran variedad de mecanismos. La detección usando absorbancia UV es posible,
pero el procedimiento de detección preferido y más común es la fluorescencia inducida por láser (UF, por sus siglas en inglés).
La fluorescencia ofrece ventajas sobre la detección UV en términos de selectividad y sensibilidad. Además, los límites de detec-
ción para fluorescencia son de dos a tres órdenes de magnitud superiores a los de UV.Aunque el ADN es intrínsecamente fluo-
rescente, la fluorescencia de fondo y la compleja espectroscopía láser requerida impiden el uso en forma rutinaria. La forma
más común de marcar el ADN se describe en la sección anterior sobre protocolos de fluorescencia para cuantificación de ARN
y ADN. Este sistema se emplea ampliamente debido a su simplicidad (los colorantes se agregan a la muestra o a la solución
amortiguadora de reacción) y eficacia. Las ventajas de la CE incluyen: velocidad de análisis, sensibilidad usando volúmenes mí-
nimos de muestra y posibilidad de automatización. Estas se consiguen principalmente por la miniaturización inherente del gel.
Los sistemas automatizados permiten el análisis robusto de la calidad, cantidad y tamaño de fragmentos tanto del ARN como
del ADN. Las aplicaciones de CE han sido especialmente importantes para evaluar la integridad del ARN debido a la inestabili-
dad y progresiva degradación del ARN causadas por las ARNasas ubicuas, mientras que las nuevas tecnologías que comparan
las relaciones entre 28S y 18S mejoran las capacidades de estos procedimientos.
HIBRIDACIÓN
DE FILTROSY MARCADO(LABELING)DE SONDAS IN VITRO
Introducción
Las técnicas de hibridación se usaron desde el comienzo en biología molecular para identificar ácidos nucleicos individuales
y para calcular el grado de similitud entre especies. La hibridación se usa ampliamente en los procedimientos descritos en este
y otros capítulos para visualizar e identificar secuencias de ácidos nucleicos (ver TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Amplifica-
ción (1127), TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Genotipificación(1129) y TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Enfoquespara
Detectar Trazasde ÁcidosNucleicos(Análisisde ADN Residual)(1130)). Con el advenimiento de la digestión de ADN con endo-
nucleasa de restricción y la separación electroforética por masa molecular, la hibridación usando sondas marcadas (labeled pro-
bes) proporcionó una manera de visualizar la organización de genes dentro de un genoma específico.
Las técnicas de hibridación descritas son transferencia en puntos (dot blotting) y por ranuras (slot blotting), transferencia
Northern, transferencia de Southern, hibridación in situ e hibridación fluorescente in situ (FISH,por sus siglas en inglés). Todas
estas técnicas dependen del uso de sondas de ácido nucleico. Las sondas son oligonucleótidos con secuencias específicas de
ADN o ARN que han sido marcadas con etiquetas radioactivas, fluorescentes, quimioluminiscentes, químicas o enzimas (molé-
culas indicadoras). Las sondas hibridizadas se unen a las secuencias complementarias en los ácidos nucleicos diana y se utilizan
para visualizar y caracterizar los blancos según se describe a continuación.
Transferencia en Puntos y por Ranuras (Dot and Slot Blotting)
La transferencia en puntos es la más simple y rápida de las técnicas de hibridación. Los ácidos nucleicos se aplican directa-
mente a una membrana de soporte, que puede ser de nitrocelulosa o nailon, sin separación previa de las especies de ácido
nucleico por electroforesis en gel de agarosa. Los ácidos nucleicos se aplican en el filtro con una micropipeta o un aparato
como el de transferencia por ranuras (slot blot) o el de transferencia en puntos (dot blot). Este consiste en un soporte de la
membrana con una membrana en sándwich entre las dos piezas del marco. La placa inferior del marco se conecta a un mani-
fold de vacío y la parte superior tiene ranuras a través de las cuales se cargan los ácidos nucleicos. Las muestras se cargan apli-
cando vacío y se pasan a través de la membrana por vacío, el ácido nucleico se une a la membrana y luego el filtro se seca con
aire. Los ácidos nucleicos se fijan al filtro, bien sea por calentamiento a 80º para membranas de nitrocelulosa o por exposición
a luz UVdurante un tiempo predeterminado para filtros de nailon. La hibridación con una sonda marcada proporciona confir-
mación de la identidad del ácido nucleico pero no suministra ninguna información sobre el número o tamaños de las especies.
Las especies de ácidos nucleicos de interés se pueden cuantificar por aplicación de concentraciones conocidas del ácido nuclei-
co purificado sobre el filtro y comparando la señal generada por las muestras desconocidas con las de las preparaciones están-
dar.
Transferencia de Southern (Southern Blotting)
La transferencia de Southern se refiere a la transferencia de ADN de un gel de agarosa o poliacrilamida a una membrana de
nitrocelulosa o nailon. Se pueden usar sondas pequeñas de ADN de cadena simple para visualizar e identificar las especies de
ADN de interés. El análisis por transferencia de Southern se basa en una metodología de transferencia e inmovilización desarro-
llada en 1975, junto con la separación electroforética de ADN fragmentado. Más específicamente, el procedimiento se usa por
lo general para identificar secuencias específicas de ácido nucleico en el contexto de una topografía genética definida, como
un mapa de endonucleasas de restricción. La posición de los genes dentro del genoma vírico se puede mapear con exactitud,
Lt
8032 (1126) Técnicas Basadasen Ácidos Nucleicos-Extracción/ Información General USP42
usando una gran variedad de endonucleasas de restricción en combinación con el análisis por transferencia de Southem. El
procedimiento requiere obtener suficiente cantidad de ADN para el análisis. El ADN fragmentado se separa de acuerdo con el
tamaño usando electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN de doble cadena se deben desnaturalizar antes de ser
transferidos e inmovilizados sobre una membrana por acción capilar. ElADN inmovilizado se entrecruza con el filtro, el cual
puede estar compuesto de nitrocelulosa o nailon, según se describe anteriormente. Sin embargo, el uso de membranas de
nailon cargadas positivamente elimina la necesidad de fijar el ADN a la membrana de nailon. Las membranas de nitrocelulosa
son más frágiles y pueden ser usadas hasta tres veces con sondas diferentes. Las membranas de nailon son más robustas y se
pueden sondear 1O a 12 veces, aunque pueden presentar más ruido de fondo, en particular cuando se usan con sondas cro-
mogénicas.
Transferencia Northern (Northern Blotting)
El análisis por transferencia Northem comprende una serie de etapas para la separación, transferencia e inmovilización del
ARN en una forma similar al tratamiento del ADN usando análisis por transferencia de Southem. Requiere la desnaturalización
del ARN para reducir la estructura secundaria con el fin de garantizar que el ARN se separe en la agarosa uniformemente, de
acuerdo con la longitud. La desnaturalización del ARN se consigue, bien sea antes de la electroforesis usando glioxal o dimetil
sulfóxido (DMSO) o durante la electroforesis, por medio de geles que contienen formaldehído. La transferencia se logra de
manera idéntica a la usada para la transferencia de Southem. Sin embargo, en el caso de transferencia Northem, no es necesa-
rio desnaturalizar el ARN antes de la transferencia, ya que la desnaturalización se consigue antes de la separación electroforéti-
ca de las especies de ARN. ElARN inmovilizado se entrecruza con la membrana de una manera similar al entrecruzamiento del
ADN.
Hibridación In Situ e Hibridación Fluorescente In Situ (FISH)
La hibridación de un ácido nucleico in situ clásicamente se refiere a la determinación de la ubicación de la secuencia del
ácido nucleico en su estado natural, en el tejido, en células individuales o en un cromosoma. Las sondas de hibridación in situ
están diseñadas para unirse a las secuencias complementarias de ácido nucleico, sean de ADN o ARN. El propósito de estos
procedimientos de hibridación consiste en descubrir dónde se expresa un gen en un tejido, en cuyo caso el blanco es el ARN,
o mapear una secuencia específica de ADN en su ubicación en un cromosoma, en cuyo caso el blanco es el ADN.
El mapeo cromosómico de secuencias de ADN se consigue pegando químicamente granos de plata a las secuencias de la
sonda y luego contando la densidad de los granos en un extendido de cromosomas en metafase. Aunque históricamente estos
procedimientos funcionaban bien, la sensibilidad no dejaba de ser una preocupación. La solución fue usar un indicador (repor-
ter) que fuera más sensible y seguro que otros indicadores, a saber, la fluorescencia usada en la técnica de hibridación fluores-
cente in situ (FISH).La FISHtiene el beneficio adicional de que los diferentes colores disponibles en fluorescencia permiten
observar múltiples eventos de hibridación simultáneamente, una característica que no estaba disponible con otros sistemas de
detección.
Detección de ADN y ARN en Ensayos de Hibridación Usando Sondas Marcadas
La visualización y localización de especies individuales de ácidos nucleicos de interés se consiguen por la hibridación específi-
ca de sondas de ADN y ARN que se marcan para facilitar la visualización. El filtro o muestra (células o tejidos fijados en el caso
de hibridación in situ y FISH)se incuba con la sonda marcada a una temperatura y concentración salina apropiadas que permi-
ta la hibridación con la rigurosidad deseada. Esto va seguido por lavado con soluciones amortiguadoras de concentraciones
variadas de detergente y sal y a diferentes temperaturas, con el fin de minimizar la señal de fondo debida a la hibridación no
específica. La marcación y los tipos de sondas se discuten a continuación.
Las sondas pueden ser de ARN generadas in vitro o sondas de ADN, bien sea de fragmentos de doble cadena, plásmidos u
oligonucleótidos de cadena simple conteniendo moléculas que facilitan la detección de fragmentos que contienen porciones
del gen de interés. Las sondas se pueden marcar con marcadores radioactivos como el 32P o el 35S, por incorporación de un
nucleótido marcado en la secuencia de la sonda o con un marcador radioactivo como biotina por incorporación de una base
modificada, como monofosfato de adenina unido a biotina. Las sondas radioactivas se visualizan con una película de rayos X
colocada sobre la membrana de transferencia. Las sondas marcadas con biotina se detectan con un conjugado de estreptavidi-
na-fosfatasa alcalina. Se produce una reacción enzimática con la fosfatasa alcalina y un sustrato que genera un producto inso-
luble coloreado en el sitio de la sonda. Las variantes de sondas no radioactivas utilizan otras modificaciones en el ADN y anti-
cuerpos unidos a la fosfatasa alcalina, así como sondas quimioluminiscentes que se detectan sobre una película.
Los ácidos nucleicos se pueden sintetizar y manipular por medios enzimáticos o químicos. Estos mismos sistemas se pueden
usar para modificar la estructura del ácido nucleico e introducir porciones extrañas para crear moléculas únicas que pueden
ofrecer una ventaja en la detección de ácidos nucleicos virales limitantes dentro de un marco de ácidos nucleicos anfitriones.
La síntesis química de ácidos nucleicos y su purificación se ha vuelto de rutina y comúnmente se consiguen síntesis y purifica-
ciones de alta calidad. Más aún, se pueden sintetizar segmentos más grandes y cuando se requieran segmentos todavía más
grandes, se pueden diseñar las subsecciones para concatenación y ligación.
lt
La síntesis de oligonucleótidos especiales de ADN se consigue fácilmente en el laboratorio usando reactivos y equipos dispo-
nibles comercialmente. Como alternativa, se puede hacer un pedido de sondas especiales a numerosos proveedores comercia-
les. Los procedimientos de purificación por exclusión de tamaño generalmente se usan para eliminar oligonucleótidos incom-
pletos. Los oligonucleótidos de ARN también se pueden sintetizar químicamente o generarse in vitro usando fragmentos com-
plementarios de ADN clonado bajo el control de diversas secuencias promotoras de la ARN polimerasa procariótica. El uso de
sondas de ADN es mucho más común, pero podrían haber algunas aplicaciones en las cuales la asociación creciente de híbri-
dos de ARN-ARNo ARN-ADNsea ventajosa.
Los principales procedimientos para marcar ADN son la marcación directa usando una reacción de kinasa para enganchar un
nucleótido marcado al final de cada cadena de ADN mediante la incorporación de nucleótidos marcados dentro de un ADN
mellado, utilizando la función de reparación del ADN del fragmento Klenow de la enzima ADN polimerasa I de Escherichia coli
(nick translation o traslación de mellas), y mediante PCR. Este último procedimiento genera una producción relativamente alta
de sondas marcadas internamente porque cada ronda de termociclado duplica la cantidad de la sonda marcada, mientras que
los procedimientos anteriores arrojaban una relación de menos de una molécula de sonda por molécula molde. El procedi-
miento de PCR se usa también para generar sondas únicas con una variedad de entidades localizadas en los terminales.
SECUENCIACIÓN
DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Introducción
El primer procedimiento de secuenciación de ADN, descrito en 1977, utilizó la escisión química para introducir específica-
mente rupturas de cadena en una secuencia de ADN (secuenciación de Maxam y Gilbert). El procedimiento demostró ser de
utilidad significativa en los primeros años de la biología molecular pero no se ha usado para efectuar secuenciación de alto
volumen y por lo tanto no se discute en detalle aquí. La mayoría de las secuenciaciones efectuadas en la actualidad se basan
en el procedimiento de secuenciación con didesoxinucleótidos, descrita también en 1977 (secuenciación de Sanger). Este pro-
cedimiento cambió fundamentalmente la secuenciación al explotar la especificidad enzimática de las polimerasas que introdu-
cen interrupciones de la cadena en bases específicas. Este es el procedimiento de secuenciación más ampliamente reconocido
y se considera un ensayo de rutina en laboratorios de biología molecular. Las innovaciones en instrumental, preparación y re-
colección de la muestra, gestión de datos, análisis de datos y ensamble de la secuencia han dependido de este procedimiento
de secuenciación como su generador de secuencias fundamental.
La secuenciación de alta capacidad de procesamiento (high-throughput sequencing) toma todos los elementos de los proce-
dimientos de secuenciación y los aplica a una colección masiva de datos de secuencias, típicamente para genomas más gran-
des, aunque tal secuenciación se puede usar también para proyectos más pequeños. La obtención de la información de la se-
cuencia final incluye todos los procesos asociados con la preparación de la muestra, la secuenciación, la reunión de los datos y
la terminación de los datos. La tecnología para conseguir estos objetivos individuales incluye al instrumental, materiales dese-
chables, protocolos y procedimientos.
Reacción de Secuenciación
El procedimiento de secuenciación con didesoxinucleótidos aprovecha la especificidad de la enzima de Klenow para introdu-
cir nucleósidos de terminación de cadena, llamados didesoxinucleótidos, de manera intermitente durante el proceso de exten-
sión de la polimerasa. La secuenciación de cada muestra requiere cuatro reacciones separadas (una por cada base). La mezcla
resultante de diversas longitudes de cadenas de nucleótidos se separa de acuerdo con las masas moleculares individuales. La
incorporación de nucleótidos marcados radioactivamente durante la reacción de secuenciación permite la detección de las ca-
denas de nucleótidos.
Las mejoras en biotecnología han llevado al descubrimiento de enzimas más robustas con alta fidelidad, estabilidad mejora-
da y otros atributos que han permitido lecturas más largas y fidelidad mejorada de la secuencia. Estos perfeccionamientos han
hecho posible la introducción de secuenciación cíclica, la cual se usa ahora comúnmente. El principio del procedimiento de
secuenciación cíclica es una combinación de secuenciación de Sanger y aspectos de la amplificación por PCR, en donde se
incorporan didesoxinucleótidos dentro del ADN amplificado. La secuenciación cíclica lleva a una concentración más alta de
fragmentos marcados, abarcando un intervalo mayor de tamaños que la secuenciación de Sanger, lo cual lleva a su vez a una
longitud de lectura mayor.
Procedimientos de Separación de los Fragmentos de Secuenciación de ADN
Las secciones anteriores de este capítulo se ocupan del tratamiento de moléculas intactas de ADN y ARN; las secciones si-
guientes tratan sobre los retos de la separación de fragmentos que resultan de las reacciones de secuenciación, especialmente
de la secuenciación en placa de gel y de la electroforesis capilar. Las secciones subsiguientes tratan sobre las tecnologías de
detección y la integridad de la secuencia.
Secuenciaciónen Placa de Gel
La electroforesis en gel de poliacrilamida, frecuentemente conocida como electroforesis en placa de gel, fue el primer meca-
nismo de separación empleado para separar los fragmentos de secuenciación del ADN. Tal como se ha descrito anteriormente,
la separación electroforética de fragmentos de ADN depende del tamaño de los fragmentos en la mezcla de la reacción. Sin
embargo, para la secuenciación en placa de gel se escogen los tamaños de poro de manera que sea posible la resolución de
bases individuales para muchos cientos de bases. Además de la poliacrilamida, frecuentemente se agrega al gel un desnaturali-
zante como la urea para garantizar la desnaturalización de los fragmentos. Hasta la implementación de sistemas de secuencia-
ción multicapilares, la capacidad de separación y de procesamiento de los mecanismos de separación en placa de gel a menu-
do se consideraban de vanguardia.
Secuenciaciónen ElectroforesisCapilar
Como se observó anteriormente, la electroforesis capilar ofrece ventajas significativas sobre las separaciones basadas en gel.
Sin embargo, al igual que en la secuenciación en placa de gel, se escogen los tamaños de poro de manera que sea posible la
resolución de bases individuales para muchos cientos de bases. Los sistemas multicapilares que utilizan de 8 a 384 capilares se
consiguen comercialmente. Estos son los principales sistemas utilizados para la secuenciación de ADN en gran escala y, en teo-
ría, rinden más de 1100 millones de pares de bases de secuencias de ADN al año.
Detección
RADIOACTIVIDAD
Las primeras estrategias de detección para las reacciones de secuenciación del ADN utilizaban isótopos radioactivos como
el 32 P o el 35 S, especialmente porque estos eran prácticos para las separaciones en gel. Entre las ventajas se pueden mencionar:
la detección es universal, son posibles límites bajos de detección, se eliminan los desplazamientos de movilidad y no se presen-
tan diferencias de fidelidad para las ADN polimerasas. Las desventajas incluyen los altos costos de eliminación y seguridad, la
incapacidad para multiplexar (lo cual en última instancia limita la capacidad de procesamiento) y la necesidad de exposición
durante 24 a 36 horas (es decir, no hay detección en tiempo real).
FLUORESCENCIA
Los colorantes para fluorescencia han reemplazado en gran medida a los isótopos radioactivos como medios de detección
durante la secuenciación del ADN, en especial porque no tienen las desventajas de las sondas radioactivas. Dado que los colo-
rantes se pueden discriminar por medio de sus máximos de emisión, la multiplexación (multiplexing) es posible, de manera
que cuatro reacciones de secuenciación por muestra pueden ser reemplazadas por una sola reacción, usando cuatro marcas
diferentes. De esa manera se puede usar una sola calle (lane) en vez de las cuatro calles separadas que se necesitaban con las
sondas radioactivas. Entre las ventajas adicionales se cuenta una alta capacidad de procesamiento y la recolección automatiza-
da de datos en tiempo real.
ESPECTROSCOPÍA
DE MASAS
La espectroscopía de masas (MS, por sus siglas en inglés) ha revolucionado el campo de la bioquímica y tiene un potencial
significativo en el área de la secuenciación de ácidos nucleicos. Las técnicas de ionización suave como la ionización por electro-
spray y la ionización por desorción láser asistida por matrices han expandido la aplicación potencial de MS a la secuenciación
del ADN. La MS ofrece algunas ventajas sobre otras metodologías de detección, incluso la velocidad de detección de fragmen-
tos (la adquisición de la señal está en el intervalo de microsegundos, comparado con horas para los enfoques convencionales)
y exactitud (p. ej., la masa molecular de cada fragmento se puede determinar con un alto grado de exactitud). El procedimien-
to de Sanger utiliza las diferencias de masa de los fragmentos generados como parte de la reacción de polimerización. La MS
es suficientemente precisa para resolver tamaños de fragmentos que difieran solo por un par de bases. Desafortunadamente, la
sensibilidad de la detección de la MS disminuye a medida que aumenta la longitud del fragmento y falta todavía cruzar la
barrera de los 100 pares de bases.
Más recientemente, han surgido otras tecnologías de secuenciación basadas en técnicas de secuenciación masiva en paralelo
que intentan lograr la secuenciación a bajo costo. Estas técnicas se basan, por ejemplo, en secuenciación en fase sólida o ha-
cen uso de pirosecuenciación altamente paralela y miniaturizada, como se describe en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-
Genotipificación(1129).
USP42 InformaciónGeneral/ (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación 8035
Integridad de la Secuencia
Un prerrequisito para la recolección automatizada de datos y la interpretación consiste en que los datos sean de buena cali-
dad, lo cual significa minimizar la intervención humana y permitir que el sistema haga las identificaciones de las bases siguien-
do las etapas de detección. Es un paso crítico para garantizar la identificación exacta de las bases secuenciando mínimamente,
varias veces, ambas cadenas de ADN. Además, se pueden emplear otras tácticas, como el uso de cebadores en diferentes posi-
ciones de la secuencia, lo cual puede mejorar la exactitud de la secuencia de consenso desarrollada. Los paquetes de software
especializado que se consiguen comercialmente pueden facilitar esta tarea. El desarrollo de tecnología más reciente ha produ-
cido plataformas de secuenciación alternas que se adaptan mejor a proyectos de secuenciación a gran escala. Estas técnicas
incluyen plataformas basadas en matrices o arreglos (arrays) en las cuales tiras cortas del blanco se secuencian en un chip que
suministra datos crudos a programas computacionales sofisticados que reconstruyen la secuencia. Se han desarrollado otros
enfoques para la secuenciación rápida de secuencias cortas de ácidos nucleicos como los oligonucleótidos de los productos de
PCRcortos. Estas tecnologías incluyen plataformas basadas en MS y pirosecuenciación; esta última se describe en TécnicasBa-
sadasen ÁcidosNucleicos-Genotipificación(1129).
(1127) TÉCNICASBASADASEN ÁCIDOS NUCLEICOS-

AMPLIFICACIÓN
INTRODUCCIÓN
de las diversas técnicas se tratan en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Generalidades (1125). Este capítulo cubre las principa-
les técnicas que llevan a la amplificación de secuencias blanco de ácidos nucleicos. El ensayo NAT más común es la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), descrita primero por Kary Mullís. Este procedimiento se refinó poste-
riormente para amplificar un fragmento de ADN a partir de ARN (PCR con transcripción reversa o RT-PCR).Inicialmente, la PCR
se usó en una manera cualitativa para amplificar y detectar moléculas de ADN porque su exquisita sensibilidad, a la par de su
alta especificidad, la convertían en una herramienta útil para la detección de blancos (dianas) de ácidos nucleicos. Desde que
se comenzó a usar la PCR, el número de aplicaciones se ha expandido rápidamente y la técnica, que incluye ahora ensayos
cuantitativos y multiplex, se usa actualmente en casi todos los campos de investigación y desarrollo en biología y medicina.
Además de los cambios y mejoras al diseño original del procedimiento de PCR, existen técnicas alternativas a la PCR que son
usadas en la amplificación de ácidos nucleicos diana para generar ARN en vez de amplicones de ADN. Las técnicas más co-
múnmente usadas son la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA,por sus siglas en inglés) y la amplifi-
cación mediada por transcripción (TMA, por sus siglas en inglés), las cuales se describen aquí en detalle. En contraste con la
PCR, que depende de la incubación de la muestra a tres temperaturas diferentes, la NASBAy la TMA se basan en condiciones
isotérmicas.
Además de la amplificación del ácido nucleico blanco, la etapa de amplificación se puede dirigir también a la señal usada
para la detección (amplificación de señal). La técnica empleada más comúnmente es el ensayo de ADN ramificado (ADNb), en
el cual se amplifica la señal, que por lo general es una sonda fluorescente que se une a la secuencia blanco. El ensayo de ADNb
se usa principalmente para la detección y cuantificación de ácido nucleico viral.
Este capítulo describe los principales componentes del ensayo que son necesarios para un procedimiento de PCR e incluye
una discusión de la optimización general de los ensayos de PCR. Se tratan los diversos formatos de ensayo, incluidas la PCR,
PCR anidada y RT-PCR,y a continuación se presenta una discusión de la detección de los amplicones resultantes. Aunque to-
dos estos ensayos son esencialmente procedimientos cualitativos, pueden modificarse para semicuantificación. Las diversas
modificaciones para semicuantificación también se describen en este capítulo. Para una cuantificación exacta y confiable, la
PCR en tiempo real ha reemplazado ahora los métodos listados más arriba; la PCR en tiempo real y la RT-PCRen tiempo real se
describen en la sección EnsayosNAT. La misma sección incluye una discusión sobre sondas y colorantes, que son uno de los
componentes esenciales de la PCR en tiempo real, así como de los métodos de cuantificación por medio de la generación de
curvas estándar. La siguiente técnica de PCRque se comenta es la PCR multiplex, que se usa para la detección simultánea de
blancos múltiples o para la normalización de los resultados de un ensayo. Además de la PCR, las principales pruebas NATalter-
nativas que se usan en forma rutinaria, especialmente en los ensayos de detección sistemática (screening) en sangre y en diag-
nóstico clínico, son la NASBAy la TMA. La última técnica descrita es la amplificación del genoma completo, en la cual las com-
plejidades de la amplificación requieren modificaciones de los procedimientos de la PCR. El capítulo concluye con una discu-
sión sobre la evolución del instrumental usado en los ensayos NATy las cuestiones de garantía de calidad y control de calidad
asociadas con NAT,dado que ésta es probablemente una de las técnicas biológicas más reguladas, especialmente cuando se
aplica a pruebas de detección sistemática en sangre.
8036 (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación / Información General USP42
COMPONENTESDELENSAYO
Enzimas
Los componentes esenciales de los ensayos NAT-polimerasas, soluciones amortiguadoras de reacción que incluyen desoxi-
nucleótidos, iones, cebadores (primers), sondas y colorantes fluorescentes-se pueden escoger de una vasta selección de kits
de reactivos NATcomercialmente disponibles y de distintos proveedores. Las polimerasas aptas para las aplicaciones de NATse
pueden agrupar, en principio, en ADN Taqpolimerasas o ADN polimerasas I obtenidas a partir de otras especies de Thermus,
que son polimerasas con características similares a las de la ADN Taqpolimerasa. Además, se consiguen las llamadas polimera-
sas correctoras (p. ej., de la especie Pyrococcus)que muestran actividad de exonucleasa 3'-5', capaces de retirar las bases erró-
neamente incorporadas a la cadena creciente de ADN bajo las condiciones de amplificación. La ADN Taqpolimerasa es la enzi-
ma estándar para NATy es la que se usa más a menudo en los ensayos NAT.También se usan modificaciones de la ADN Taq
polimerasa, tales como deleciones del dominio de exonucleasa 5'-3' (fragmento Klenow, fragmento Stoffel) o mutaciones pun-
tuales para la incorporación mejorada de didesoxinucleótidos (p. ej., para reacciones de secuenciación basadas en PCR). Las
polimerasas correctoras del ADN o las mezclas de ADN Taqpolimerasa con una polimerasa correctora se usan si la fidelidad del
producto NATes crítica (p. ej., para experimentos de clonación de ADN) o si se van a amplificar productos NATmás largos.
Para RT-PCRse necesita una transcriptasa reversa que convierta primero el ARN blanco en un ADN copia o complementario
(ADNc) que pueda amplificarse subsiguientemente. Para llevar a cabo la TMA, se requiere una transcriptasa reversa con activi-
dad de ARNasa H para convertir el ARN blanco en un molde de ADN de doble cadena, mientras que para la NASBAse agrega
ARNasa H exógena a la mezcla de la reacción. Dos tipos de enzimas se pueden usar para generar ADNc, dependiendo del
ambiente de reacción: una transcriptasa reversa aislada de fuentes retrovíricas o una ADN polimerasa que pueda funcionar a la
vez como transcriptasa reversa y como ADN polimerasa. Por último, la modificación química de la polimerasa, que produce
una enzima inactiva a temperaturas por debajo de 90°, se emplea ahora por lo general para evitar la unión incorrecta de ceba-
dores (mispriming) a los moldes a temperaturas subóptimas (ver sección Optimizacióndel Ensayo).
Amortiguadores de Reacción
Los amortiguadores de reacción varían de acuerdo con la composición iónica, pH y aditivos y en ocasiones se adaptan espe-
cíficamente para aplicaciones particulares como PCR multiplex, PCR en tiempo real, RT-PCR,TMA y NASBA.Un importante
componente de la mezcla de reacción son los iones Mg 2+ o, en el caso de polimerasas con funciones tanto de transcriptasa
reversa como de ADN polimerasa, como la de Thermusthermophilus(Tth), iones Mn2+. Pueden estar presentes otros aditivos
que mejoren la sensibilidad y especificidad del ensayo. La concentración de los cuatro desoxinucleótido trifosfatos (dNTPs) se
debe optimizar.
Cebadores
Los sets de cebadores (primers) son oligonucleótidos con secuencias diseñadas específicamente para cebar la amplificación
de una porción del ácido nucleico blanco de interés. Los oligonucleótidos sintéticos que se usan como cebadores tanto para la
PCR estándar como para la PCR en tiempo real o cuantitativa están diseñados para el reconocimiento específico y la unión a
una secuencia de ADN simple o de ARN. Dicha especificidad se consigue por medio del diseño que involucra tanto la longitud
como la secuencia de los cebadores. Las especificaciones de longitud y secuencia tienen criterios diferentes que se deben cum-
plir en forma simultánea con el fin de que los cebadores se desempeñen apropiadamente. La longitud de un cebador es una
cuestión estadística que está relacionada con la longitud mínima de una secuencia específica necesaria para garantizar que la
secuencia blanco deseada sea única, sin importar el tamaño o complejidad del genoma. Como ejemplo, en el caso del geno-
ma humano, con sus 3200 millones de bases de ADN, esa longitud es de 1 7 bases. Por esta razón, la mayoría de los cebadores
para PCR tienen entre 20 y 25 bases de longitud. La especificidad de un cebador se debe determinar por comparación con las
secuencias en todas las bases de datos conocidas. Las herramientas disponibles en la Web facilitan dichas comparaciones.
En términos de la secuencia del cebador, los puntos a considerar son la Tm (la temperatura a la cual el 50% de la molécula
de ácido nucleico de doble cadena se vuelve de cadena simple) y la estructura secundaria. Todo ADN tiene su propia Tm carac-
terística, determinada por la longitud, la composición de la secuencia y el ambiente de reacción. Los cebadores para PCR están
diseñados para unirse a una secuencia de ADN perfectamente complementaria, por medio del apareamiento de las bases gua-
nina con citosina (G-C) y adenina con timina (A-T). La Tmde los dos cebadores para PCR usados en una reacción debe ser lo
más cercana posible. En términos de la estructura secundaria, se debe minimizar la formación de estructuras por intra o inter-
complementariedad. La interacción entre los diferentes cebadores puede resultar en dímeros de cebadores que comprometan
la sensibilidad y especificidad del ensayo. Todas las cuestiones de diseño presentadas se tratan en los paquetes de software
para diseño de cebadores que están disponibles en la Internet.
USP42 Información General/ (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación 8037
Optimización del Ensayo
La optimización del ensayo NATes necesaria para una amplificación exitosa que sea sensible y específica. Los parámetros
que se deben optimizar incluyen las condiciones de termociclado, tanto las temperaturas como los tiempos de ciclado (que
dependen en gran medida de las secuencias del blanco, del cebador y de la sonda), las concentraciones del molde, las concen-
traciones de los reactivos NAT,la matriz de la muestra y la cantidad de ciclos de amplificación. En el caso de la PCR multiplex,
por lo general es necesario un compromiso entre los elementos de las condiciones de reacción, debido a las dificultades para
optimizar las condiciones de todos los sets de cebadores y sondas. Recientemente se han hecho cambios para mejorar la sensi-
bilidad y especificidad de los ensayos NAT.Uno de estos cambios es la PCR con inicio en caliente (hot-start PCR), en donde se
retiene temporalmente fuera de la mezcla de reacción uno de los componentes esenciales del ensayo NAT,por lo general la
ADN polimerasa. Cuando en la preparación de la reacción se contempla esta modificación, la etapa inicial de desnaturalización
del ácido nucleico evita la amplificación no específica debido a la unión incorrecta de cebadores a temperaturas subóptimas.
Los primeros procedimientos de inicio en caliente usaban barreras de cera que separaban eficazmente los componentes esen-
ciales en dos fases líquidas que se mezclaban solo cuando la cera se derretía. Sin embargo, este procedimiento ha sido reem-
plazado por dos tecnologías importantes de inicio en caliente que no requieren la separación física de los componentes me-
diante pasos adicionales de manipulación inconvenientes. En el primero de estos nuevos procedimientos, anticuerpos dirigidos
contra la ADN polimerasa forman un complejo con la enzima y pierden su avidez de unión a temperatura elevada al comienzo
de la reacción. El segundo procedimiento utiliza la modificación química de la polimerasa, lo cual produce una enzima inacti-
va. A temperaturas por encima de 90º, por lo general en la primera etapa de desnaturalización, el modificador se disocia de la
enzima y se restablece la actividad enzimática. La ventaja de un inicio en caliente mediado por anticuerpos es la liberación
inmediata de la actividad enzimática al comienzo de la reacción, por una etapa muy corta de incubación en caliente. Sin em-
bargo, si existe un gran exceso de moléculas de polimerasa activas, el inicio en caliente mediado por anticuerpos tiende a ser
menos riguroso cuando se compara con el de las enzimas químicamente activadas.
ENSAYOSNAT
Esta sección describe las técnicas básicas de PCR, PCR anidada y RT-PCR,así como las modificaciones del procedimiento que
permiten la semicuantificación.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
La técnica de PCR se basa en un proceso de tres etapas: la desnaturalización del ADN de doble cadena (ADNdc) en dos
cadenas simples (ADNcs), el apareamiento (annealing) de cebadores al ADNcs y la extensión enzimática de cebadores que son
complementarios a los moldes de ADNcs. Cada etapa se lleva a cabo por lo general a diferente temperatura. Repitiendo cícli-
camente las etapas de temperatura (usualmente 30 a 45 veces) se puede conseguir una amplificación de mil millones de veces
del ácido nucleico blanco, aunque el número óptimo de ciclos se debe determinar empíricamente. En algunos casos, especial-
mente cuando la sensibilidad es más importante que los resultados falsos positivos debido al exceso de ciclos, como en prue-
bas de detección sistemática en sangre, se puede obtener sensibilidad extra al incrementar el número de ciclos a 60 para ga-
rantizar la detección de concentraciones extremadamente bajas del blanco. En una reacción típica, el producto de PCR (ampli-
cón) se duplica en cada ciclo de amplificación (amplificación exponencial). El aumento en la amplificación en los primeros ci-
clos sigue una curva sigmoide. En los últimos ciclos, las concentraciones de las cadenas del molde y los amplicones favorecen
el reapareamiento de las cadenas del molde en lugar del apareamiento del cebador de PCR con el molde. En este punto, la
concentración del producto de PCR deja de duplicarse después de cada ciclo y la curva empieza a mostrar una meseta. El uso
de una enzima termoestable como la Taq-polimerasa es un prerrequisito porque los ciclos de temperatura a 95° (la temperatu-
ra típica de la etapa usada para desnaturalizar moldes de doble cadena) inactivaría una polimerasa termolábil.
PCR ANIDADA
Una variación previa del ensayo de PCRfue la PCR anidada, diseñada para aumentar la sensibilidad y especificidad del ensa-
yo. En este procedimiento, los amplicones de la reacción de PCR inicial se someten a una segunda ronda de amplificación,
usando un set de cebadores diferente. Este set de cebadores es específico de la secuencia de los amplicones pero está dentro
del primer set de cebadores (cebadores anidados). Las ventajas de la amplificación con dos sets de cebadores específicos del
blanco son la especificidad aumentada (se reduce cualquier amplificación no específica de la primera ronda de amplificación) y
la sensibilidad aumentada (debido a la amplificación inicial del blanco en la primera ronda de amplificación). Además, la am-
plificación de un producto del tamaño esperado se toma como una confirmación de la presencia del blanco. Sin embargo, uno
de los mayores inconvenientes de este procedimiento es la alta probabilidad de contaminación cruzada debido al incremento
de la manipulación de los amplicones generados en la primera ronda de amplificación. El uso de cebadores y sondas altamente
específicos y la optimización de las condiciones de reacción han llevado a la disminución de las aplicaciones de este procedi-
miento para pruebas de rutina, pero el procedimiento en ocasiones se usa para muestras que son difíciles de amplificar por la
PCRconvencional.
8038 (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación / InformaciónGeneral USP42
RT-PCR
Al amplificar blancos de ARN, los analistas preparan ADNc antes de la etapa de amplificación (RT-PCR).Se cuenta con proce-
dimientos de RT-PCRde uno o dos pasos. En RT-PCRde un solo paso, la transcripción reversa del ARN en ADNc y el subsi-
guiente paso de amplificación se llevan a cabo en una sola reacción sin procedimientos intermedios. Por lo tanto, la mezcla de
reacción para RT-PCRde un solo paso incluye cebadores de amplificación específicos del gen, que se usan tanto para la trans-
cripción reversa como para la amplificación. La ventaja de este procedimiento es la reducción general del tiempo de manipula-
ción, el aumento de la capacidad de procesamiento y el riesgo reducido de contaminación debido a que no es necesario vol-
ver a abrir el recipiente de la reacción. En contraste, en la RT-PCRde dos pasos, la transcripción reversa y la amplificación se
efectúan como dos etapas separadas. En general, para el paso de transcripción reversa se usan cebadores aleatorios o cebado-
res oligo-d(T) en vez de cebadores específicos del gen. Una alícuota de la reacción de síntesis del ADNc se transfiere entonces a
la reacción NAT para la subsiguiente amplificación. La ventaja de este procedimiento es la estandarización de la reacción de
transcripción reversa, que se puede usar como fuente única para el análisis de múltiples transcritos en el análisis de la expresión
del gen.
DETECCIÓNDE AMPLICONES
Después de la amplificación, los analistas pueden emplear una gran variedad de procedimientos para la detección del ampli-
cón, según se describe en detalle en el capítulo de información general, TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Extracción,De-
teccióny Secuenciación(1126). Estos incluyen electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio u otros colorantes, elec-
troforesis capilar y fluorescencia inducida por láser e hibridación, seguida por detección cromogénica, como la detección con
el complejo estreptavidina-peroxidasa de rábano, quimioluminiscencia o detección fluorescente usando sondas marcadas.
Cuantificación-Los ensayos originales de PCRy RT-PCReran cualitativos y detectaban amplicones al final de la reacción.
Dicha detección no es fácil de cuantificar porque en esta etapa la amplificación está en la fase de meseta al final del ensayo y la
cantidad de amplicones no necesariamente está relacionada en forma directa con la cantidad del molde inicial. Se han desarro-
llado varios enfoques para intentar resolver la deficiencia de la PCR para producir resultados cuantitativos confiables. Los inten-
tos iniciales de cuantificación se basaban en evaluar la cantidad del ADN amplificado durante el comienzo o la parte exponen-
cial del ensayo, pero este procedimiento estaba plagado de problemas porque las alícuotas se debían tomar de las mezclas de
reacción a intervalos regulares, lo cual aumentaba muchísimo el riesgo de contaminación cruzada. Uno de los primeros y más
directos enfoques para cuantificar los productos de PCR consistió en medir la cantidad de amplicones que se generaban duran-
te la fase exponencial de la reacción, comparándolos con un control externo diluido serialmente. Sin embargo, diversos aspec-
tos, incluyendo la variabilidad en la preparación de la muestra y las variaciones en las condiciones de la reacción, entorpecían
este procedimiento. Debido a la amplificación exponencial de los procedimientos NAT,incluso pequeños errores o discrepan-
cias pueden llevar a diferencias marcadas.
Comparado con los procedimientos de dilución, la PCR competitiva demostró ser un enfoque mucho más preciso para con-
seguir cálculos confiables de las moléculas blanco presentes originalmente. Este procedimiento se basa en la coamplificación
simultánea de una secuencia blanco específica, en presencia de concentraciones crecientes de una molécula blanco exógena
(control) que comparte los sitios de unión del cebador con la secuencia blanco, pero cuya secuencia está ligeramente modifi-
cada o acortada con el fin de facilitar la discriminación de los amplicones salvajes (wild-type). Además, se conoce la concentra-
ción del control. La estrecha homología de la secuencia y el tamaño similar del control y de los amplicones blanco están dise-
ñados para garantizar que el molde y el control interno se amplifiquen con eficiencia comparable. La concentración relativa de
las bandas de amplicones del molde y del control se deben analizar, por ejemplo, sobre geles de agarosa teñidos con bromuro
de etidio, lo cual da una cuantificación relativamente precisa del blanco salvaje. Un defecto de este enfoque es que el control
interno y el molde deben estar presentes en la reacción aproximadamente en la misma cantidad con el fin de producir resulta-
dos correctos. El desarrollo de la PCR cuantitativa en tiempo real ha eliminado la variabilidad asociada con la PCR cuantitativa,
permitiendo así la cuantificación rutinaria y confiable de los productos de PCR.
PCR EN TIEMPO REALY RT-PCREN TIEMPOREAL
Aunque la cuantificación de genes por PCR cuantitativa fue un procedimiento ampliamente usado, sus aplicaciones se ex-
pandieron con el advenimiento de la PCR en tiempo real y la RT-PCRen tiempo real. La PCR en tiempo real aporta las mismas
ventajas de la PCR cuantitativa estándar-sensibilidad, especificidad y amplio intervalo dinámico-pero el procedimiento en
tiempo real ofrece la ventaja adicional de no requerir de un procesamiento postamplificación porque combina amplificación y
detección en un solo paso. La PCR en tiempo real recolecta datos a lo largo del proceso de amplificación, midiendo una señal
de fluorescencia creada a medida que la amplificación progresa. Un gran número de estrategias de fluorescencia permiten la
correlación del producto generado por PCR con la intensidad de la fluorescencia. En principio, la intensidad de la fluorescencia
aumentará con cada ciclo efectuado. Una vez que la intensidad es mayor que la fluorescencia de fondo, se consigue el valor de
ciclo umbral (C,). Este valor, que representa el primer ciclo en el cual hay un aumento detectable en la fluorescencia por enci-
ma del nivel de fondo, se usa para medir cantidades de blanco relativas o absolutas. El valor C, es inversamente proporcional al
número de moléculas blanco en la muestra y por lo tanto proporciona un medio para cuantificar la cantidad de blanco en el
material inicial (es decir, cuanto mayor sea el número de moléculas blanco presentes, menor será el valor C,).
USP42 InformaciónGeneral/ (1127) TécnicasBasadasen Ácidos Nucleicos-Amplificación8039
Las condiciones de reacción para las aplicaciones de PCR en tiempo real deben contemplar la presencia de sondas y requie-
ren optimización. Las sondas más comúnmente usadas en la actualidad son sondas de hidrólisis, aunque las sondas de hibrida-
ción representan una alternativa. En la mayoría de los casos, las etapas de amplificación y detección se pueden combinar en
una reacción cíclica en dos pasos, pero estas condiciones tienen que optimizarse. En contraste, los colorantes de unión al ADN,
que también se pueden usar para la detección de amplicones, requieren la separación de los pasos de apareamiento y exten-
sión puesto que la unión con el colorante ocurre durante el paso de extensión que por lo general se hace a 72°.
Para la detección del producto de PCR en tiempo real se usa un colorante fluorescente que se intercala con el ADN. Este
colorante emite luz cuando se une al ADN de doble cadena y el subsiguiente aumento en fluorescencia puede ser detectado
por instrumentos de PCR en tiempo real. los colorantes que se unen al ADNdc no solo se unen al producto específico de PCR
sino a los artefactos, como los productos no específicos de PCRy los dímeros de cebadores. Los analistas han observado dife-
rencias sustanciales en la especificidad de los colorantes de unión al ADNdc que se usan con los kits de PCR en tiempo real. Por
esa razón, algunos analistas recomiendan verificar la presencia de un solo producto de PCR por electroforesis en gel para deter-
minar el tamaño correcto del mismo. También es aconsejable realizar un análisis de la curva de fusión (desnaturalización) para
garantizar la ausencia de artefactos que podrían contribuir a la señal fluorescente y por lo tanto llevar a interpretaciones erró-
neas de los datos cuantitativos. Como alternativa, se pueden emplear sondas marcadas, específicas de secuencia. Se cuenta
con una amplia variedad de cebadores y sondas marcadas con fluorescencia para su uso en PCR en tiempo real, las cuales se
describen en la próxima sección.
Sondas para PCR en Tiempo Real-La diferencia entre la PCR convencional y la PCR en tiempo real es la presencia de un
tercer oligonucleótido sintetizado químicamente, la sonda, que en el caso de las sondas más básicas de hibridación contiene
algún tipo de molécula indicadora, por lo general una molécula fluorescente o fluoróforo. A los ADN sintetizados químicamen-
te se les pueden agregar materiales distintos a ácidos nucleicos, que se incorporan luego en las sondas de oligonucleótidos
para PCR en tiempo real. Otras aplicaciones incluyen sondas de hibridación como las usadas para hibridación fluorescente in
situ (FISH,por sus siglas en inglés) y micromatrices y sondas diseñadas para capturar otros ácidos nucleicos. Al usar sondas
fluorescentes para PCR en tiempo real, se presenta el desafío impuesto por la sonda no unida o libre dado que ésta no se retira
antes de la detección, requiriéndose entonces un medio para distinguir entre la señal de la sonda unida y de la libre. Por el
contrario, los ensayos de FISHincluyen el lavado, después de la hibridación, para eliminar la sonda libre.
Todos los problemas asociados con el diseño del cebador para PCR convencional aplican a los cebadores para PCR en tiem-
po real, así como a la secuencia de la sonda. Como regla general, solo dos consideraciones adicionales aplican a la secuencia
de la sonda. Una de estas es la termodinámica y la otra concierne específicamente a las porciones indicadoras de la sonda.
Termodinámicamente, una buena molécula para sonda que se haya diseñado para unirse a la secuencia ubicada en algún pun-
to entre los dos cebadores de PCRtendrá una Tm que es aproximadamente 5º mayor que la de los dos cebadores. En la gran
mayoría de los casos, la longitud del amplicón estará entre 100 y 500 bases de ADN, aunque para la PCR en tiempo real un
amplicón más pequeño, entre 100 y 150 bases de longitud, producirá una reacción más eficiente. Por lo tanto, rara vez será
un problema encontrar una secuencia dentro del amplicón de PCR que cumpla con los criterios necesarios.
Los diseños actuales de las sondas permiten superar los problemas de la señal de fondo proveniente de la sonda no unida,
usando sondas de hibridación simples. En el diseño original, se marcan dos sondas que hibridizan secuencias adyacentes sobre
el ácido nucleico blanco. La porción indicadora es una molécula fluorescente unida al extremo 3' de la secuencia río arriba de
la sonda, en tanto una segunda molécula fluorescente se une al extremo 5' de la segunda sonda. La excitación del fluoróforo
en 5' con energía luminosa de la longitud de onda adecuada lleva a la absorción de dicha energía, seguida por emisión de
energía luminosa a una longitud de onda ligeramente más larga o menos energética (Ley de Stoke). Esta energía emitida exci-
ta luego el fluoróforo en 3', si éste está suficientemente cerca al emisor y es compatible con él, en el sentido de que la energía
emitida del fluoróforo en 5' pueda excitar el fluoróforo en 3'. Cuando esto ocurre, la longitud de onda de la luz fluorescente
observada será la de la molécula aceptora y no la de la dadora. Los espectros de absorción y emisión de fluorescencia se consi-
guen fácilmente para todos los fluoróforos comúnmente usados, y las únicas reglas que deben aplicarse consisten en que las
dos moléculas fluorescentes estén separadas por menos de 40 bases de ADN y que el espectro de emisión del dador se solape
con el espectro de absorción del aceptor. Por lo tanto, la hibridación de las dos sondas, también conocidas como sondas de
hibridación o sondas FRET(siglas en inglés para Fluorescencia por Transferencia de Energía Resonante), ocasiona la emisión de
una señal fluorescente por parte del aceptor, la cual se puede detectar. En ausencia de hibridación, las sondas están suficiente-
mente separadas en la solución, de manera que no puede ocurrir la transferencia de energía y el dador solo emite fluorescen-
cia de fondo.
Los problemas de compatibilidad de fluoróforos han sido resueltos por el uso creciente de una clase especial de molécula
llamada extintor (quencher). los extintores son moléculas fluorescentes que absorben energía fluorescente en una amplia ga-
ma de longitudes de onda. En vez de reemitir esa energía como luz, simplemente la disipan como calor. Por lo tanto, si una
molécula extintora se coloca en el extremo 3' de una sonda y un fluoróforo en el extremo 5', la sonda permanecerá oscura,
aunque esté presente la energía de excitación, siempre que la molécula permanezca intacta (sondas de hidrólisis). Estas sondas
utilizan la actividad de nucleasa 5' de la ADN polimerasa para hidrolizar una sonda unida a su amplicón blanco. La escisión
ocasiona la separación del indicador y el extintor y permite la fluorescencia del indicador. Esto reduce gran parte del trabajo de
optimización de las condiciones del ensayo (puesto que solo se usa una sonda) y el ruido de fondo generado con dos sondas.
Una variación de las sondas de hidrólisis incluye la colocación de las moléculas indicadora y extintora sobre un solo oligonu-
cleótido que está construido de tal forma que cuando no está unido, el extintor y el indicador estén cercanos, lo cual lleva a
una eficiente extinción del indicador. Cuando la sonda hibridiza a su secuencia complementaria en el amplicón, la sonda pasa
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por un cambio en la conformación que obliga al extintor y al indicador a separarse, permitiendo la fluorescencia del indicador.
Una variación de estos tipos de sonda consiste en un cebador y una sonda combinados, en los cuales, de nuevo, el extintor y
el indicador están cerca en la sonda nativa, por lo cual no hay señal. El cebado y subsiguiente elongación del cebador-sonda
producen la hibridación a la cadena de ADN recién sintetizada, ocasionando la separación espacial del extintor y el indicador y
la generación de una señal.
Marcación de la Sonda-Las estrategias modernas de modificación de oligonucleótidos sintéticos permiten la fabricación
de oligonucleótidos con materiales distintos de ácidos nucleicos. La incorporación de las modificaciones se efectúa de dos ma-
neras posibles: durante la síntesis o después de la síntesis. En el primer caso, las modificaciones se construyen de tal manera
que se comportan como las cuatro bases del ADN o ARN que se colocan rutinariamente en la secuencia. La modificación se
presenta entonces en el sitio deseado durante la síntesis como si fuera otra base en la serie. En el segundo caso, usualmente
empleado cuando se realiza más de una modificación, la síntesis incluye un ligador (linker), tal como un grupo amino, al cual
se conecta la modificación deseada. Este proceso con frecuencia se denomina etiquetado manual ("hand-tagging").
Quizás el ejemplo mejor conocido de etiquetado manual es la sonda convencional doblemente marcada que se usa en la
PCR en tiempo real. El extintor se coloca en el extremo 3' de la secuencia durante la síntesis y la molécula indicadora fluores-
cente se etiqueta manualmente a una modificación de grupo amino en el extremo 5' de la secuencia después de que la síntesis
ha terminado y ha pasado por el proceso de purificación. Se han diseñado algunas modificaciones, como las que utilizan bioti-
nas, para poder llevar a cabo múltiples modificaciones en una sola síntesis. De esa forma, es posible modificar una secuencia
de ADN o ARN sintéticos para que contengan una variedad de moléculas distintas de los ácidos nucleicos. Dichas modificacio-
nes tienen un costo asociado por cuanto las alteraciones a menudo se consiguen con una pérdida de masa debido a una me-
nor eficiencia inherente de las modificaciones para unirse a los oligonucleótidos, en comparación con las bases estándar de
ADN o ARN, o al requisito de que el producto de la síntesis sea purificado antes de la modificación, después de la modificación
o en ambos casos.
Los beneficios de la modificación de ADN o ARN sintéticos por lo general superan los costos. La sonda estándar para PCR en
tiempo real, doblemente marcada y con extintor, ha permitido la cuantificación precisa de la expresión génica. Los oligonu-
cleótidos de ADN marcados con fluorescencia son también componentes esenciales de las hibridaciones in situ y de las micro-
matrices (microarrays). Algunas modificaciones confieren un incremento en la estabilidad térmica cuando se hibridizan sondas
de ADN o ARN sintéticos a ADN o ARN complementarios, por comparación con los dúplex de ADN-ADN o ADN-ARN no mo-
dificados. Estos análogos incluyen ácidos nucleicos peptídicos, 2'-fluoro N3-P5'-fosforamidatos y ácidos l ',5'-anhidrohexitolnu-
cleicos. Aunque dichos análogos mejoran en diferentes grados las estabilidades térmicas, fallan en proporcionar un mejor reco-
nocimiento del blanco. Otro enfoque consiste en usar análogos de bases como el ácido nucleico bloqueado, el cual es un aná-
logo que contiene un puente 2'-0, 4'-C metileno. Este puente restringe la flexibilidad del anillo de la ribofuranosa y bloquea la
estructura en una formación bicíclica rígida, lo cual le confiere mejor desempeño y estabilidad a la hibridación.
La modificación de una sonda está determinada generalmente por el uso previsto de la misma. Por lo general, se usan indi-
cadores fluorescentes en PCR en tiempo real e hibridación in situ. La gama de indicadores fluorescentes disponibles cubre el
espectro de 517 nm a 778 nm. En el caso de las sondas de hibridación, se prefieren las modificaciones de las bases porque
éstas alteran principalmente las interacciones termodinámicas entre las bases, lo cual mejora la especificidad. Los grupos amino
de conexión, tanto los que tienen espaciadores C como los que no, se usan para conectar otras modificaciones a secuencias de
ADN y para conectar secuencias de ADN a superficies sólidas como los portaobjetos (slides) de vidrio. Un ejemplo es la unión
de moléculas de biotina a secuencias de ADN. La biotina forma un enlace fuerte con materiales recubiertos de estreptavidina,
tales como perlas magnéticas, permitiendo la captura de ácidos nucleicos específicos que podrían ser hibridizados a su vez a
otras moléculas.
Cuantificación-Los productos de PCR se pueden cuantificar usando una curva estándar graficada a partir de diluciones
seriadas repetidas de un reactivo o estándar de referencia para la secuencia de ácido nucleico de interés. Se conoce la concen-
tración del ácido nucleico en el reactivo de referencia. La cuantificación de PCR en tiempo real basada en una curva estándar
puede utilizar ADN de plásmidos u otras formas de ADN. Sin embargo, la eficiencia de la PCR debe ser la misma para los es-
tándares y para las muestras blanco. La PCR de blancos purificados puede ser en algunos casos más eficiente que la PCR con
mezclas complejas de ácidos nucleicos. Los valores de ciclo umbral (Ct) y las concentraciones de las diluciones del reactivo de
referencia se pueden usar para trazar una curva estándar a partir de la cual se pueda calcular la concentración de la muestra
desconocida. Cuando las condiciones de corrida del ensayo se han estandarizado bien y la curva estándar para un blanco parti-
cular está bien calibrada, en las subsiguientes corridas del ensayo será suficiente coamplificar solo dos diluciones de un reactivo
de referencia (habitualmente diluciones que contengan cantidades conocidas de ácido nucleico a alta y baja concentración).
Estas diluciones, o calibradores, se pueden usar entonces para cuantificar cualquier muestra desconocida por comparación de
los valores de e,.
PCRMultiplex-La PCR multiplex describe la amplificación simultánea de varias secuencias blanco de ácidos nucleicos en
una sola reacción del ensayo. Esta es una variación especialmente exigente de la PCR porque requiere el uso de un solo set de
condiciones de reacción para la amplificación de blancos múltiples con diferentes características de secuencia. Pueden surgir
complicaciones adicionales debido a la mayor probabilidad de productos de amplificación no específicos que resultan de múl-
tiples interacciones de los cebadores. Además, las diferentes eficiencias de amplificación de los blancos individuales pueden
llevar a que las reacciones más débiles sean superadas por reacciones más fuertes y más eficientes.
Las aplicaciones, tanto cualitativa como cuantitativa, de la PCR multiplex, han sido descritas en la literatura, al igual que los
ensayos de RT-PCRmultiplex. La PCR multiplex cuantitativa depende, bien sea de la generación de múltiples curvas estándar
para permitir la cuantificación de cada blanco en el ensayo o de la inclusión de secuencias del competidor interno que se pue-
dan usar como calibrantes.
La cinética de hibridación de los cebadores y de las sondas puede ser significativamente diferente, incluso cuando se diseñan
usando el mismo algoritmo. Esto deja al analista un campo muy limitado para optimizar las condiciones de reacción. Sin em-
bargo, la optimización puede incluir ajustes de la cantidad de la ADN polimerasa, del Mg 2+ para aumentar la eficiencia de la
hibridación o de la concentración del cebador. En la PCR en tiempo real, especialmente, la optimización de la concentración
del cebador es crítica para la coamplificación cuantitativa de los genes blanco, que están contenidos en la muestra en cantida-
des significativamente diferentes. El aumento de la eficiencia de la hibridación del sistema cebador-sonda se puede conseguir
suministrándole reactivos suficientes, como Mg 2+, así como agregando un reactivo de amontonamiento molecular ("molecular
crowding") que aumente la concentración efectiva de todos los componentes de la reacción en la mezcla. La PCR multiplex no
se usa solo para aplicaciones de genotipificación, sino también para PCR en tiempo real cuantitativa porque ofrece diversas
ventajas sobre las reacciones estándar de la PCR simple en tiempo real. Algunas de estas ventajas son: utilización de una canti-
dad minimizada de muestra, aumento de la precisión por medio del uso de un control interno (p. ej., un gen constitutivo o
"housekeeping gene") coamplificado con el gen blanco en la misma reacción, ausencia de pasos de pipeteo separados y mejor
relación costo-rendimiento.
La mayoría de los ensayos de PCR tienen un problema común, que es el de minimizar las diferencias en extracciones o am-
plificaciones entre las diferentes muestras. La PCR multiplex es útil en casos donde resulta crítico garantizar que la variabilidad
en la cuantificación de diferentes muestras no se debe a las diferencias en la extracción de ácidos nucleicos o en las mediciones
de amplificación (por lo general cuando se mide la producción de una especie de ARNm). Para minimizar estos retos se pue-
den emplear ciertas precauciones y técnicas que se discuten en la siguiente sección sobre normalización de los resultados del
ensayo.
Normalización de los Resultados del Ensayo-Para minimizar los efectos de las variables del ensayo, los analistas usan en
ocasiones un procedimiento de cuantificación relativa que normaliza la concentración del transcrito blanco frente a un control
que se puede emplear y comparar para todas las muestras incluidas en el estudio de expresión génica. Probablemente el pro-
cedimiento de cuantificación relativa más confiable y más frecuentemente usado se basa en la medición de genes constitutivos
(housekeeping genes) o de control para normalizar la expresión del gen blanco en un formato de PCR multiplex. Se prefiere
este procedimiento porque la cuantificación tanto del gen constitutivo como del gen blanco está influenciada por eficiencias
variables de la síntesis del ADNc o por la presencia de inhibidores enzimáticos contenidos en la muestra. Sin embargo, cabe
observar que la eficiencia de la conversión del ARN blanco a ADNc no es necesariamente coherente, ni siquiera dentro de una
reacción en un solo tubo, sino que depende del diseño del cebador, de la secuencia blanco, etc., los cuales pueden diferir
entre los genes blanco y constitutivo. La selección de genes apropiados de control puede causar problemas porque no necesa-
riamente se expresan de manera equivalente en todas las muestras desconocidas y pueden variar bajo condiciones experimen-
tales. La normalización de mediciones de un grupo de genes constitutivos con el fin de evitar el problema de variabilidad po-
dría resolver este inconveniente. Como alternativa, los analistas pueden establecer una evaluación cuidadosa de los genes
constitutivos que no alteren los grados de expresión génica bajo las condiciones experimentales.
Todas las técnicas NATdescritas hasta el momento son variaciones del ensayo de PCR, que es la técnica NATmás amplia-
mente usada. Sin embargo, los ensayos isotérmicos basados principalmente en la amplificación del ARN se usan para propósi-
tos rutinarios. Esto se conoce como ensayo de amplificación mediada por transcripción (TMA), el cual está muy relacionado
con el ensayo de amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA).Ambos ensayos se describen en más detalle
en la siguiente sección.
AMPLIFICACIÓNBASADAEN LASECUENCIADELÁCIDO NUCLEICOY AMPLIFICACIÓNMEDIADAPOR TRANSCRIPCIÓN
Tanto la NASBAcomo la TMA dependen de la amplificación isotérmica in vitro para la detección y amplificación de ácidos
nucleicos, también conocida como replicación de secuenciación autosostenida o 3SR. La principal diferencia entre los ensayos
radica en que la NASBAutiliza tres enzimas: transcriptasa reversa (RT), ARN polimerasa y ARNasa H, mientras que la TMA usa
solo dos enzimas: RTy ARN polimerasa. El procedimiento completo generalmente se efectúa de 41 º a 42º, usando dos ceba-
dores. Tanto la NASBAcomo la TMA son especialmente adecuadas para amplificar analitos de ARN, incluyendo ARNr,ARNm,
patógenos que tienen ARN como su material genético, así como ADN blancos.
Uno de los cebadores que tiene una secuencia promotora para la ARN polimerasa en el extremo 5' se une al ARN blanco y se
extiende por medio de la actividad de ADN polimerasa de la RT.El producto de esta reacción es un híbrido ARN-ADN. La
actividad de ARNasa H digiere entonces específicamente la cadena ARN del híbrido, dejando solo el ADNc al cual se puede
unir el segundo cebador. La RTsintetiza luego una cadena complementaria de ADN, dando lugar a una molécula ADNdc con
un promotor T7 en el extremo 5'. La ARN polimerasa T7 transcribe entonces múltiples copias del amplicón de ARN. Las copias
de ARN pueden pasar por el mismo ciclo para crear nuevas moléculas de ADN dúplex con un promotor T7 de las cuales se
transcriben muchas moléculas de ARN. Así, a diferencia de la PCR, el amplicón amplificado en este caso es de una especie de
ARN.
Algunas de las características de esta tecnología son: se pueden amplificar eficientemente solo secuencias blanco relativa-
mente cortas (cerca de 100 a 250 nucleótidos); emplea una sola temperatura, lo cual elimina la necesidad de un equipo espe-
cial de termociclado; la fidelidad de la técnica es comparable a la de otros procesos de amplificación; y los amplicones de ARN
se amplifican exponencialmente. La contaminación por arrastre se minimiza debido a la naturaleza lábil del amplicón de ARN
8042 (1127) Técnicas Basadasen Ácidos Nucleicos-Amplificación / Información General USP42
en el ambiente del laboratorio. Los procedimientos de contención incorporados al procedimiento del ensayo ayudan a minimi-
zar la contaminación aún más. La detección de amplicones se consigue por lo general mediante el uso de sondas marcadas y,
en la tecnología de TMA, un método común consiste en la detección de señales quimioluminiscentes de las sondas hibridiza-
das que permanecen intactas durante el subsiguiente paso de hidrólisis alcalina usado para destruir la sonda libre.
Las técnicas NATdescritas, tanto PCR como TMA, se optimizan para amplificar fragmentos pequeños y específicos de un
genoma. En casos donde es deseable la amplificación del genoma completo, como en los análisis de mutación o en las prue-
bas de identidad, las modificaciones de los procedimientos de la PCR son necesarias con el fin de garantizar la representación
de la secuencia adecuada de los loci genéticos, según se describe en la siguiente sección.
AMPLIFICACIÓN
DELGENOMACOMPLETO
Históricamente, la amplificación del genoma completo (:NGA, por sus siglas en inglés) se ha efectuado usando procedimien-
tos de PCR modificada. Estos procedimientos han dependido de la amplificación no específica del genoma, usando cebadores
que se unen bajo condiciones de baja rigurosidad al molde del ADN. Los enfoques basados en PCR difieren principalmente en
términos del tipo de cebador empleado en la reacción: en la preamplificación por extensión de cebadores (PEP,por sus siglas
en inglés) se usan cebadores aleatorios cortos de 15 bases en una reacción de ciclado inicial con baja rigurosidad para hacer
múltiples copias aleatorias de segmentos del genoma. Este producto se usa entonces como blanco para la reacción de PCR
específica. El mayor inconveniente de esta técnica son los sesgos de amplificación de los contextos favorables de secuencia que
llevan a la representación irregular del genoma. Otro inconveniente es la generación de fragmentos cada vez más cortos du-
rante cada ronda de amplificación. Otro procedimiento denominado PCR con cebadores de oligonucleotidos degenerados
(DOP-PCR,por sus siglas en inglés) usa cebadores etiquetados (tagged primers) y amplificación de baja rigurosidad para los
primeros ciclos de la amplificación, seguido por un aumento de la rigurosidad de apareamiento en los ciclos posteriores. Los
cebadores etiquetados se caracterizan por tener etiquetas (tags) de secuencia definidas en los extremos 3' y 5' y una secuencia
aleatoria en el centro del cebador. Bajo las últimas condiciones, más rigurosas, los fragmentos de ADN blanco generados du-
rante los primeros ciclos, que contienen las secuencias de la etiqueta de amplificación, se amplifican preferencialmente sin nin-
gún acortamiento posterior de la longitud del fragmento. La WGA basada en PCRemplea por lo general polimerasas tipo Taq
que presentan la desventaja de introducir variaciones dentro del ADN amplificado debido a la procesividad y fidelidad relativa-
mente bajas de las mismas, que se incrementan por el altísimo número de ciclos de amplificación usados en estos métodos.
Esto puede causar problemas en las aplicaciones posteriores, como el análisis de genotipificación. Estas limitaciones, así como
la relativamente mala representación de la secuencia de los loci genómicos, inherentes a la WGA basada en PCR pueden resol-
verse por una reacción isotérmica llamada amplificación por desplazamiento múltiple (MDA, por sus siglas en inglés).
La enzima que se usa para MDA comprende una polimerasa de alta procesividad con actividad correctora (proofreading) y
actividad de desplazamiento de cadena. La reacción isotérmica se efectúa a 30º, sin cambios en la temperatura de la reacción.
La reacción comienza con el apareamiento de múltiples cebadores aleatorios al ADN blanco y la elongación de los cebadores,
usando una ADN polimerasa del fago Phi29 del Bacillussubtilis.Dado que la polimerasa es capaz de desplazar las cadenas del
ADN en una dirección 5'-3', la reacción de la polimerasa no se detiene cuando las cadenas elongadas se encuentran con las
cadenas del ADN río abajo. La cadena de ADN desplazada sirve de nuevo como blanco para múltiples reacciones de elonga-
ción con cebadores de manera que el molde de ADN se amplifica exponencialmente de manera ramificada, produciendo ADN
de alto peso molecular con una buena representación de los loci genómicos. Comparado con la WGA basada en PCR, la tasa
de error es muy baja. En particular, la velocidad de mutación de las estructuras repetitivas de la secuencia es baja debido a la
actividad limitada de desplazamiento de la cadena de la polimerasa Phi29. Esto permite la 9enotipificación confiable del ADN
genómico (p. ej., análisis de SNP, análisis de mutación, pruebas de identidad o análisis de muestras casuísticas) en diferentes
plataformas, como la PCR en tiempo real o el análisis de matrices (arrays).
INSTRUMENTAL
El desarrollo de las numerosas y variadas técnicas NATdescritas en este capítulo se ha visto facilitado por la evolución del
instrumental que ha servido para automatizar estos procedimientos complejos. En esta sección se presenta una descripción ge-
neral de los principales cambios en el instrumental.
El control continuo de las etapas de temperatura necesarias para conseguir la amplificación exponencial para los ensayos de
PCR se lleva a cabo con termocicladores totalmente automatizados que constan de un bloque de calentamiento en el cual se
puede completar el ciclo de temperatura rápidamente. Los cambios de temperatura son inducidos por agua, o más reciente-
mente, con el efecto Peltier. Estos instrumentos pueden estar acoplados a un fluorómetro si se usan para análisis de PCR en
tiempo real. En ese caso, ciertos instrumentos se equipan con un dispositivo rotor que se calienta y enfría por aire en vez de
tener un bloque de metal que típicamente se usa como módulo de calentamiento. En el caso de la PCR de punto final (end-
point PCR), los productos de PCRse analizan por lo general de acuerdo con el tamaño en geles de agarosa o poliacrilamida o
por electroforesis capilar, usando cebadores marcados con fluoróforo. También se pueden analizar usando matrices o por otros
procedimientos de hibridación.
Dado que no se requieren etapas de separación de marcas o un procesamiento posterior a la PCR, los ensayos de PCR en
tiempo real son simples de realizar, lo cual los hace útiles para aplicaciones de alta capacidad de procesamiento. Los instru-
mentos de PCR en tiempo real combinan las propiedades de un termociclador y un fluorómetro que permiten la determina-
ción de los productos de PCR por medición de la fluorescencia. En cada ciclo de PCR, se toman una o varias lecturas de fluores-
cencia para monitorear la reacción de PCR en la generación de amplicones, por lo general en la etapa de extensión de la reac-
ción de PCR.
Los instrumentos para PCR en tiempo real varían con respecto a la capacidad de procesamiento de muestras simultáneas (32
a 384 recipientes de reacción), volumen de la muestra (5 µL a 100 µL), fuente de excitación y detector utilizado. Estas compo-
siciones definen el intervalo apropiado de los colorantes fluorescentes para PCR multiplex en tiempo real, así como el tamaño y
el principio de calentamiento/enfriamiento (ver arriba). La fuente de excitación de los termocicladores en tiempo real puede
ser un sistema basado en láser, lámparas halógenas o diodos emisores de luz (LED,por sus siglas en inglés). Para seleccionar la
longitud de onda de interés se usan filtros ópticos. En la mayoría de los instrumentos, la luz emitida es detectada por un dispo-
sitivo de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés) que consta de una matriz de celdas sensibles a la luz. La luz
proyectada hacia el CCD es convertida a una carga eléctrica, produciéndose una señal que es proporcional a la intensidad de
la luz.
La versatilidad del ensayo de PCR ha traído como consecuencia el uso extendido y diverso de esta técnica. Con el adveni-
miento de la PCR en tiempo real, ha sido posible diseñar instrumental de alta capacidad de procesamiento para pruebas auto-
matizadas. De manera similar, el ensayo de TMA también se ha automatizado. Dicha tecnología se usa en los laboratorios que
hacen pruebas sumamente reguladas y que requieren alta capacidad de procesamiento, como las pruebas de detección siste-
mática en sangre para el virus de la hepatitis C (VHC)o para el virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1), dado que las
pruebas automatizadas son ideales en un ambiente regulado en donde se requiere mínima intervención humana. El uso de
NATen un ambiente sumamente regulado ha traído como consecuencia el desarrollo de pautas para el manejo de los aspectos
de garantía de calidad (QA) y control de calidad (QC) en las pruebas, así como la validación de sistemas y ensayos según se
describe en la siguiente sección.
GARANTÍA DE CALIDAD Y CONTROL DE CALIDAD PARA NAT
Esta sección sirve como una guía general para el desarrollo de procedimientos específicos de QC y QA para el laboratorio y
el proceso NAT.No cubre aspectos como la eliminación de desechos, la manipulación de material radioactivo o el trabajo con
material peligroso. La NAT es una tecnología que ofrece extrema sensibilidad en su capacidad para generar millones de ampli-
cones a partir de algo tan pequeño como un solo molde de ácido nucleico y producir una señal detectable. Las ventajas de
esta tecnología pueden ser opacadas por la necesidad de establecer protocolos complejos para el ensayo y el requisito de se-
guir cuidadosamente protocolos muy rigurosos de QC/QA. La desviación de estos protocolos puede acarrear problemas im-
portantes, como los resultados falsos positivos debido a la contaminación de los moldes con los amplicones generados en co-
rridas previas del ensayo. De forma similar, el hecho de no controlar los inhibidores puede llevar a una amplificación subópti-
ma y posibles resultados falsos negativos. Considerando la multitud de factores que pueden influenciar enormemente el resul-
tado de un ensayo NAT,es preciso cubrir todos los aspectos relacionados con NAT por medio de procedimientos de QC/QA
que sean adecuados y rigurosos. Esto exige diseñar con cuidado la instalación, el flujo de trabajo y la selección de los equipos
apropiados para el propósito previsto. El registro de los datos, la conservación de los registros y la interpretación de los datos
son otros de los aspectos que deben estar cubiertos por QC/QA. Por ello, la QA para los ensayos NATincluye validación del
ensayo, establecimiento de especificaciones y criterios de aceptación y adherencia a las buenas prácticas de fabricación y de
laboratorio. Estos aspectos se describen también en esta sección. Además, se debe hacer referencia a otras guías publicadas
tales como Validation of Analytica/ Methods: Methodology (Q2B) de ICH y las NCCLSGuidelines.
QC/QA en el Laboratorio
Un laboratorio para NAT debe funcionar y estar diseñado de manera que se evite la contaminación de las reacciones con
productos de amplificaciones previas (arrastre) así como la contaminación cruzada entre muestras. Históricamente, la aplica-
ción de PCR requería la separación estricta de los diversos pasos del ensayo, con el fin de evitar la contaminación cruzada de la
PCR por amplicones. Esto era necesario porque los procedimientos previos para análisis de productos de PCR involucraban la
transferencia del producto, lo cual podía llevar a contaminación. Por lo tanto, en un sistema abierto, la mejor medida para
prevenir la contaminación consiste en la separación estricta de las zonas de trabajo para los pasos individuales del proceso.
Esto incluye áreas individuales para la preparación del molde, preparación de la mezcla maestra, distribución de la mezcla
maestra en los pocillos de reacción individual y la adición del molde, espacio para el termociclado de los ensayos de PCR y,
opcionalmente, un espacio de trabajo separado para análisis del producto de PCR. Estos requisitos no son necesarios en los
sistemas cerrados. Tanto para los sistemas abiertos como para los cerrados sigue siendo necesario tomar precauciones adicio-
nales. Estas medidas de seguridad incluyen iluminación UV de los espacios de trabajo durante la noche para inactivar el ADN
residual por entrecruzamiento (crosslinking). En caso de contaminación, las mesas y pipetas del laboratorio se deben desconta-
minar con una solución de blanqueador comercial al 10%, que por lo general contiene aproximadamente 5% de hipoclorito
de sodio, aplicado con las medidas de seguridad apropiadas, como el uso de guantes y gafas protectoras. Posteriormente, las
mesas y pipetas se deben enjuagar con agua destilada. Un flujo de trabajo unidireccional reducirá la oportunidad de que ocu-
rra contaminación. Además, no se deben intercambiar materiales, suministros ni equipos entre las áreas o cuartos de trabajo
designados.
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QC/QA de los Equipos
Otras buenas prácticas de laboratorio relacionadas con la prevención de contaminación por arrastre incluyen el uso de equi-
pos apropiados y limpios. Por lo general, se prefieren artículos consumibles desechables (tubos, puntas de pipeta (tips), etc.) al
equipo reutilizable. El uso de puntas de pipetas desechables que contengan filtros hidrófobos es otra medida muy eficaz para
minimizar la contaminación cruzada. Todas las muestras, cebadores, sondas, etc., deben rotularse con la información pertinen-
te, como identidad del contenido, fecha de uso o preparación, fecha de caducidad, concentración e información de almacena-
miento. Las batas destinadas al laboratorio o las batas desechables deben estar disponibles en cada cuarto (o sección) del labo-
ratorio de NAT.Durante todas las etapas del procesamiento se deben usar guantes apropiados para prevenir la contaminación
de la muestra. Los guantes se deben cambiar con frecuencia. Dado que la esterilización por calor no destruye completamente
el ADN, los productos de PCR pueden ocasionar contaminación detectable de las superficies de vidrio, por ejemplo. Es aconse-
jable seguir procedimientos de esterilización exclusivos para los diferentes materiales, como desechos y equipos de vidrio del
laboratorio.
Prevención de Contaminación de Arrastre con Uracil-N-Glicosilasa
La contaminación por arrastre del producto de PCR puede atenuarse con el uso del procedimiento de uracil-N-glicosilasa
(UNG) comercialmente disponible. El procedimiento implica la sustitución de 2'-desoxitimidina 5'-trifosfato (dTTP) por 2'-de-
soxiuridina 5'-trifosfato (dUTP) en la preparación de la PCRy el tratamiento de todas las mezclas de PCR con UNG antes de la
amplificación por PCR; esto puede incorporarse fácilmente como el primer paso de los programas de ciclado de la PCR. La
incorporación de dUTP dentro del amplicón hace que los productos de PCR sean bioquímicamente diferentes del molde de
ADN nativo. La enzima UNG corta los productos de PCR que contienen desoxiuridina por apertura del anillo desoxirribosa en
la posición Cl. Cuando el ADN que contiene desoxiuridina se calienta durante el primer ciclo térmico, la cadena de ADN del
amplicón se rompe en la posición de la desoxiuridina al pH alcalino de la mezcla de reacción de la PCRy por lo tanto hace que
el producto de PCR arrastrado no sea amplificable. De esa manera, cualquier amplicón generado previamente que contenga U
y que podría haber contaminado otra muestra, se volverá no amplificable. Como consecuencia, se pueden evitar los resultados
falsos positivos. Sin embargo, cabe anotar que la UNG tiene límites de concentración por encima de los cuales no elimina
completamente los productos de contaminación por arrastre de la PCR.
VALIDACIÓNDE LOS SISTEMASNAT
La validación del ensayo se consigue

(1) garantizando la calidad y la uniformidad de los componentes del ensayo, entre ellos los cebadores, las sondas y las enzi-
mas; (incluye control de la vida útil y de la contaminación) y
(2) estableciendo las características de desempeño del ensayo NATen términos de reproducibilidad, exactitud, tolerancia, ro-
bustez, especificidad, precisión y sensibilidad analítica y clínica.
La sensibilidad analítica de un ensayo se define como la concentración mínima de un reactivo de referencia o de un estándar
detectada por la prueba, mientras que la sensibilidad clínica de una prueba se determina por el análisis de las muestras clínicas
y la determinación del 95% de LOD. La sensibilidad clínica de una prueba no es necesariamente igual a la sensibilidad analíti-
ca. Cuanto más se asemeje el material de referencia o estándar a las muestras analizadas, más estrecha será la correlación.
Lo5principales pa5os de la validación del ensayo son
(1) la preparación de la muestra;
(2) la producción uniforme de reactivos críticos;
(3) el uso de controles, calibradores y estándares de cuantificación;
(4) la estabilidad de la muestra y de los reactivos;
(5) la funcionalidad de los instrumentos y del software;
(6) la capacitación del operador; y
(7) la vigilancia de la aptitud del laboratorio.
Después de la validación del ensayo, es necesario realizar QA para monitorear especificaciones y características funcionales
que hayan sido establecidas mediante el uso de reactivos bien caracterizados de potencia conocida.
Control de Calidad de los Reactivos
MOLDESDE ADN
Las muestras de prueba generalmente usadas son entre otras, sangre completa, plasma y suero. La preparación de la mues-
tra es el paso clave en el ensayo NATy tiene una gran influencia sobre el desempeño y variabilidad del ensayo. La recolección
de las muestras es el primer paso en la preparación de la muestra. El personal de QC/QA debe evaluar cuidadosamente los
efectos de los tubos de recolección y las temperaturas sobre la integridad del ADN durante el transporte de las muestras. Para
prevenir la contaminación cruzada durante la recolección de las muestras se deben usar técnicas asépticas, junto con sistemas
USP42 InformaciónGeneral/ (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación 8045
de muestreo cerrados, con el fin de evitar la contaminación de la muestra. El uso de técnicas, condiciones de temperatura y
anticoagulantes o preservantes apropiados para la manipulación de la muestra debe ayudar a reducir el riesgo de contamina-
ción. Ciertos anticoagulantes como heparina o EDTApueden interferir con el ensayo NAT.
EXTRACCIÓNDE LA MUESTRA
Se deben evaluar los efectos inhibidores de los amortiguadores, reactivos y detergentes o agentes caotrópicos usados para la
extracción de ácido nucleico sobre el ensayo NAT.Se deben incluir controles de extracción, entre ellos el uso de materiales con
cantidades conocidas agregadas (spiked materials), para monitorear la eficiencia y reproducibilidad del método de extracción.
La reproducibilidad del método de preparación de la muestra se debe determinar bajo las condiciones de procesamiento, in-
cluidas la manipulación, almacenamiento y condiciones de transporte de la muestra. El ADN por lo general es estable, pero el
personal debe tener cuidado de evitar el almacenamiento a temperaturas de refrigeración por períodos prolongados para evi-
tar la degradación de la muestra. Los ciclos de congelación-descongelación repetidos pueden ocasionar la fragmentación del
ADN. En caso de que el blanco sea ARN, debe notarse que el ARN es muy inestable y las muestras se deben congelar.
CEBADORES
Los cebadores y las sondas deben estar calificados en términos de pureza, identidad y potencia funcional. La pureza se pue-
de evaluar por medio de HPLCo espectroscopía de masas; la identidad se puede establecer por secuenciación; y la funcionali-
dad se puede determinar por medio del uso de reactivos de referencia. Sin embargo, en muchos casos es posible que no se
cuente con estos métodos para realizar las pruebas internamente. En esos casos, podría ser suficiente con comparar la varia-
ción en pureza y potencia funcional, de un lote a otro, usando métodos pertinentes disponibles en el laboratorio, junto con el
uso de reactivos de referencia.
ADN POLIMERASAS
La funcionalidad de las enzimas se debe determinar mediante el uso de materiales de referencia. Las preparaciones de enzi-
mas se deben examinar para detectar otras actividades enzimáticas; por ejemplo, se deben establecer las actividades y las espe-
cificaciones de exonucleasas y de polimerasa dependiente de ADN y ARN. Se debe hacer la comparación de un lote a otro, así
como la comparación con los certificados de análisis del fabricante. Las condiciones de almacenamiento recomendadas por el
fabricante se deben seguir estrictamente y usar los controles apropiados para monitorear la estabilidad de las enzimas.
Controles de Corrida
El uso de controles permite al operador garantizar que el ensayo se efectúa dentro de las especificaciones aceptadas. En las
pruebas de PCR se deben monitorear y verificar varios pasos en el proceso de la prueba, como se mencionara anteriormente.
Los controles múltiples o los controles que sirven para múltiples propósitos pueden ser necesarios para un ensayo de PCR. Los
controles deben reflejar la tecnología específica en desarrollo pero deben permitir el monitoreo de la ultracentrifugación, ex-
tracción, amplificación, hibridación, cuantificación, contaminación, etc. Los controles deben ser similares al tipo de muestra,
siempre que sea posible, aunque son aceptables los controles con cantidades conocidas agregadas (spiked controls).
Un control negativo es aquel que no contiene la secuencia blanco o el patógeno que se está examinando. Debe parecerse
tan estrechamente como sea posible a la matriz de muestra en análisis. Se deben examinar múltiples controles negativos, in-
cluyendo secuencias diferentes a las del blanco y controles sin ácidos nucleicos para supervisar falsos positivos que resulten de
la contaminación. Debido a la alta sensibilidad de los ensayos de amplificación, el personal de QC/QA recomienda ampliamen-
te que los patrocinadores incluyan medidas de control para la prevención de casos de contaminación.
Un control positivo es aquel que contiene la secuencia blanco de interés. Debe parecerse tan estrechamente como sea posi-
ble a la matriz de la muestra en análisis y debe contener una cantidad apropiada y definida de secuencias blanco (p. ej., kit de
control).
Se deben proporcionar las especificaciones, tanto para los controles positivos como para los negativos, así como los datos de
validación que respaldan el valor umbral de corte/reporte de valoración del ensayo o el límite de detección del ensayo. El labo-
ratorio debe definir la fuente de los controles y calibradores y contar con un plan para su renovación continua. Los controles
pueden ser infecciosos y no infecciosos. En este último caso, se debe proporcionar una validación de la inactivación viral.
Los controles de reactivos se conocen a menudo como blancos y pueden incluir muestras que no tienen la secuencia blanco,
enzimas, cebadores, etc. Estos controles proporcionan información adicional sobre los problemas encontrados en los ensayos
de PCR.
A cada muestra se le agrega un control interno para garantizar la validez general de los resultados de la prueba individual.
Los controles internos se usan para verificar la extracción, amplificación y detección de la muestra.
8046 (1127) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación / InformaciónGeneral USP42
Evaluación Externa de la Calidad y Pruebas de Aptitud

La evaluación de calidad del laboratorio se consigue por la participación en evaluaciones periódicas de competencia y pro-
gramas de aptitud del laboratorio. Estos últimos incluyen el análisis de reactivos de referencia y de paneles bien caracterizados
para medir la aptitud técnica de los operadores. Por lo tanto, se debe tener cuidado de evitar la contaminación cruzada, moni-
torear el flujo de trabajo y garantizar la cuidadosa manipulación de la muestra y de las preparaciones de la muestra. La evalua-
ción de la aptitud del operador debe incluir la participación en programas de competencia y medición de calidad. Todo opera-
dor en un laboratorio particular debe participar en dichos programas y demostrar resultados comparables.
Gestión de Datos
Se requiere la documentación acorde y completa de todas las actividades efectuadas y todos los datos generados. Dicha do-
cumentación no solo requiere el mantenimiento de registros de los datos generados durante el análisis de la muestra, sino
también información acerca de los reactivos y la calibración y mantenimiento de los equipos. Más aún, cualquier alteración en
el procedimiento del ensayo se debe introducir por medio de un proceso de control de cambios planeado y documentado de
tal manera que un tercero independiente lo pueda evaluar.

MICROMATRICES
INTRODUCCIÓN
Las micromatrices son conjuntos de puntos microscópicos de ADN (medidos en micrones) dispuestos de manera ordenada
(en columnas y filas) sobre una superficie plana de tal manera que cada punto de ADN se puede identificar de manera única
para facilitar el análisis exacto de los datos. Los puntos de ADN, denominados también elementos de la micromatriz, son molé-
culas específicas de ADN con secuencias conocidas o desconocidas de nucleótidos que pueden tener longitudes similares o
diferentes. Las muestras de estas moléculas de ADN se colocan en sitios fijos de la micromatriz.
A diferencia de las sondas convencionales, que son secuencias específicas de ADN o ARN marcadas con etiquetas (tags) ra-
dioactivas, fluorescentes o quimioluminiscentes (ver TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Generalidades(1125), Glosario),los
elementos de la micromatriz se denominan sondas cuando se conoce su secuencia, aunque no estén marcados. En este con-
texto, la diana se refiere a los ácidos nucleicos marcados que se encuentran en solución y se hibridizan con los elementos o
sondas de la micromatriz. El propósito de un experimento con micromatrices consiste en identificar la secuencia de estos áci-
dos nucleicos marcados y/o determinar sus contenidos. En la actualidad, las aplicaciones farmacopeicas son limitadas pero po-
drían incrementarse con un uso más difundido de las micromatrices en procesos de diagnóstico y aplicaciones para el descu-
brimiento, desarrollo, registro y control de fármacos. Cuando se utilizan para propósitos farmacopeicos, se podrían aplicar al
desarrollo de valoraciones estandarizadas y metodologías de validación con disponibilidad de materiales de referencia adecua-
dos.
Las micromatrices pueden ser de baja densidad cuando contienen desde cientos hasta miles de elementos, de alta densidad
cuando contienen desde decenas hasta cientos de miles de elementos y de muy alta densidad cuando contienen hasta millo-
nes de elementos. Se usan superficies planas para las micromatrices, pero además los elementos de la micromatriz se pueden
inmovilizar sobre partículas de soporte individuales, tales como perlas. En estos casos, los elementos de la micromatriz se iden-
tifican a través de las partículas mismas y no por ubicaciones específicas en una micromatriz. Algunas de las ventajas de usar
puntos microscópicos en la micromatriz incluyen alta densidad, cinética de hibridación rápida y bajos volúmenes de muestra.
En comparación con los ensayos convencionales basados en ácidos nucleicos, las micromatrices aceleran de gran manera la
adquisición de datos y, en ocasiones, incrementan el poder predictivo de los resultados. Lo anterior se logra mediante miniatu-
rización, combinación múltiple (multiplexing) y ejecución paralela de pruebas basadas en ácidos nucleicos que, tradicional-
mente se han realizado en tubos, placas o capilares conforme a lo descrito en el capítulo general (1125) (ver además Técnicas
Basadasen ÁcidosNucleicos-Extracción, Deteccióny Secuenciación(1126), TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Amplificación
(1127), TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Genotipificación(1129) y TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Enfoquespara De-
tectar Trazasde ÁcidosNucleicos(Análisisde ADN Residual)(1130)).
El principio del análisis con micromatrices se centra en la unión específica de las moléculas diana de ADN con las sondas o
elementos de la micromatriz. La disposición ordenada de las filas y columnas de los puntos permite una detección y análisis
altamente automatizados. Las micromatrices de ADN se fabrican, procesan, detectan y analizan de distintas formas y tienen un
gran número de aplicaciones. Con ayuda de computadoras, automatización del laboratorio y dispositivos de detección de alta
resolución, las micromatrices producen grandes cantidades de datos y representan la herramienta analítica preferida para de-
sentrañar la complejidad molecular del ADN o de sus expresiones como ARN mensajero.
USP42 InformaciónGeneral/ (1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Micromatrices 8047
Los principios básicos de las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (NAT)y las definiciones de las diversas técnicas
se tratan en el capítulo (1127). El presente capítulo abarca el campo general de las micromatrices; sin embargo, el análisis de-
tallado de las micromatrices para diversas aplicaciones específicas, incluyendo el análisis de datos y validación se excluyen por
el momento. Las siguientes secciones tratan las aplicaciones principales de las micromatrices, así como el procesamiento de las
muestras, marcación, secuencia de trabajo, detección y análisis de datos. Algunas de estas secciones, por ejemplo, preparación
de muestras y marcación, coinciden con los capítulos (1126) y (1127), por lo que se proporcionan las referencias cruzadas co-
rrespondientes. Por último, se analizan los aspectos reglamentarios de las micromatrices.
PRINCIPIOSGENERALES
DE LOS EXPERIMENTOS
CON MICROMATRICES
Tipos y Aplicaciones
Las micromatrices se usan ampliamente en tres tipos de análisis: expresión génica, hibridación genómica comparativa basa-
da en micromatrices (o hibridación de arreglo comparativo de genomas, aCGH, por sus siglas en inglés) y polimorfismo de un
solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés). En resumen, las micromatrices de expresión génica por lo general miden el ARN
mensajero de una célula; la aCGH analiza las variaciones en el número de copias (CNV, por sus siglas en inglés) del ADN, adi-
ciones cromosómicas y eliminaciones en el ADN genómico; y las micromatrices para SNP se emplean en la genotipificación
para analizar polimorfismos de un solo nucleótido (ver (1129)). Dentro de cada tipo de micromatriz, se encuentran disponibles
diversas plataformas, tanto manuales como con varios niveles de automatización. La Tabla 1 resume los tres tipos principales y
las aplicaciones más comunes, así como la diana de cada una de ellas, la sonda y las técnicas de ácidos nucleicos complemen-
tarias (ver (1126), (1127) y (1129)).
Tabla 1. Tipos y Ap 11
cae ones Prl nclpa es de las Mlcromat rlces
Tecnología
Tipos Aplicación Diana Sonda Complementaria
Expresión Génica Expresión Génica ARNm Oligonucleótido/ qRT/PCR, Transferencia de
ADNc Northern (Northern Blot-
ting)
aCGH aCGH ADN Oligonucleótido/ Análisis
CNV ADNc/Pac, citogenético
Yac, Bac de cromosomas
SNP Genotipificación de SNP ADN Oligonucleótidos Secuenciación
SNP Amplicones Oligonucleótido Secuenciación
SNP Oliqonucleótido Amplicón Secuenciación
MICROMATRICES
DE EXPRESIÓNGÉNICA
Las micromatrices de expresión génica se usan para medir el nivel relativo en el que se expresa un gen determinado. Asimis-
mo, son una herramienta potente para el descubrimiento de genes diana, caracterización molecular de tumores, diagnóstico,
clasificación, tratamiento y monitoreo de enfermedades. Ha sido posible identificar los subgrupos moleculares subyacentes que
están activos en algunas enfermedades mediante la observación de ciertos genes de expresión recurrentes presentes en los
tejidos enfermos. Las micromatrices de expresión génica también se usan para medir cambios en la expresión génica durante
un lapso de tiempo dado, p. ej., dentro de varias etapas de un ciclo celular o mediante la identificación de mutaciones génicas
que conllevan al crecimiento canceroso. Otra de las aplicaciones de las micromatrices de expresión génica es el desarrollo de
nuevos fármacos, p. ej., mediante la medición de la disminución de la expresión de un gen asociado con una enfermedad
particular para seguimiento de la efectividad de un nuevo fármaco. Cuando se miden los niveles de expresión de un conjunto
de genes, se emplea el término expresión génica característica (biomarcador o clasificador). Otros ejemplos de biomarcadores
o clasificadores incluyen los clasificadores de actividad del fármaco, que se usan para determinar el mecanismo de acción de
un fármaco, o los clasificadores de toxicidad, que se usan con fines diagnósticos y para desarrollar parámetros de dosificación
para un paciente.
MICROMATRICES
PARAACGH
A diferencia de las micromatrices de expresión génica, las micromatrices para aCGH se centran en segmentos de ADN y no
en genes individuales (similar al bandeo cromosómico y a la hibridación genómica comparativa tradicional). En una microma-
triz para aCGH, los elementos de la micromatriz, que son segmentos grandes de ADN genómico u oligonucleótidos especial-
mente diseñados, se usan para identificar cambios o un sitio cromosómico conocido. La principal ventaja de una aCGH es su
capacidad para detectar cambios en las copias del ADN en loci múltiples en un solo ensayo a una resolución mucho mayor
que la de la CGH convencional. Dependiendo de su diseño, las micromatrices para aCGH ofrecen distintas ventajas sobre los
análisis citogenéticos convencionales tales como cariotipificación e hibridación fluorescente in situ (FISH),debido a que tienen
el potencial de detectar la mayoría de las anormalidades cromosómicas microscópicas y submicroscópicas. En comparación
8048 (1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Micromatrices / InformaciónGeneral USP42
con la aCGH, las técnicas citogenéticas convencionales presentan un bajo rendimiento, requieren mucho trabajo y, a menudo,
personal especialmente capacitado para llevar a cabo las pruebas de forma uniforme. Las micromatrices para aCGH también
son útiles para la detección de cáncer, a través del seguimiento de los loci de oncogenes y de genes supresores de tumores.
MICROMATRICES
PARASNP
Las micromatrices para SNP identifican la presencia de polimorfismos de una secuencia conocida mediante el análisis del
patrón de hibridación con una serie de sondas que son específicamente complementarias para las secuencias mutantes o salva-
jes. Las micromatrices para SNP se pueden usar para identificar una enfermedad en un individuo cuando se conoce el SNP o el
conjunto de SNP asociados con la enfermedad en particular. Las micromatrices para SNP son una herramienta eficiente y eco-
nómica para el estudio simultáneo de múltiples variaciones genéticas en múltiples muestras.
Diseño de Micromatrices
Las siguientes secciones analizan el diseño de los tres tipos de micromatrices descritas anteriormente, así como la aptitud de
los materiales usados para las sondas de las micromatrices para cada uno de los tres tipos.
MICROMATRICES
DE EXPRESIÓNGÉNICA
Estas micromatrices representan el tipo de micromatriz más común usado en la actualidad. Los elementos de la micromatriz
constan de ADNc derivado de ARNm de genes conocidos pero con secuencia desconocida, o de oligonucleótidos para los que
se cuenta con información detallada sobre sus secuencias. Los oligonucleótidos son los elementos de la micromatriz preferidos
debido al bajo costo de síntesis y a la gran cantidad de información secuencial disponible hoy en día para genes y fragmentos
de genes específicos. Además, se pueden disponer en patrones específicos para permitir el análisis exacto de secuencias de
genes y de familias de genes relacionados en un solo ensayo de hibridación. Los siguientes principios generales se aplican al
diseño de oligonucleótidos para micromatrices de expresión génica:
(1) Los oligonucleótidos deben ser de 25-70 mers.
(2) Asimismo, se deben incluir oligonucleótidos control apropiados (es decir, oligonucleótidos que correspondan a secuencias
procedentes de un organismo diferente).
(3) Debe ser posible mapear todos los oligonucleótidos dentro de los 1000 nucleótidos del extremo 3' de los ADNc y deben
corresponder a la cadena codificante.
(4) Se deben evitar secuencias repetidas, alargamiento de poliA, G, C y T y extremos de Tms.
(5) Resulta necesario comparar los oligonucleótidos con secuencias existentes en bases de datos para evitar reactividad cruza-
da (se prefiere menos del 70% de identidad de la secuencia con secuencias no diana).
Además de los oligonucleótidos, también se usan como sondas los amplicones de la PCR y el ADN de doble cadena
(ADNdc). No obstante, los amplicones de la PCR requieren purificación para eliminar enzimas, sales, nucleótidos y demás con-
taminantes del proceso de amplificación que pudieran interferir con la unión de las sondas y que pudieran además inhibir la
hibridación. Asimismo, la preparación de sondas de ADNdc para ser colocadas sobre un soporte (spotting) es una labor intensa
y costosa, además de que las sondas de ADNdc pueden tener secuencias repetitivas que comprometen la especificidad de la
hibridación. Cuando no se cuenta con información sobre las secuencias, el ADNdc es la opción preferida, debido a que las
sondas de ADNdc desconocidas aún pueden usarse para el estudio de la expresión génica.
MICROMATRICES
PARAACGH
Estas micromatrices generalmente emplean cromosomas artificiales bacterianos (BAC,por sus siglas en inglés), de 100-200
mil pares de bases por segmento de ADN, como elementos de la micromatriz. Sin embargo, los aislamientos de ADN a gran
escala o las amplificaciones por PCR de tales clones de gran tamaño son laboriosos y requieren mucho tiempo. Es el caso de las
aplicaciones para determinar perfiles de expresión, donde las micromatrices para aCGH usan dianas de oligonucleótidos en
lugar de dianas de ADNdc. En la actualidad, se pueden comprar colecciones de oligonucleótidos o micromatrices prefabrica-
das, con lo que se ahorra considerable tiempo y esfuerzo.
MICROMATRICES
PARASNP
Las micromatrices para SNP pueden, dependiendo de su aplicación, utilizar como sondas tanto amplicones como oligonu-
cleótidos. En uno de los formatos más comunes para detectar mutaciones en una secuencia génica, la sonda contiene una
secuencia que difiere en un solo nucleótido de las demás en la matriz. Para la discriminación por un solo apareamiento inco-
rrecto, las sondas cortas de oligonucleótido (15-30 pares de bases) maximizan la desestabilización ocasionada por el aparea-
miento incorrecto y, por lo tanto, se usan para la detección de SNP.
USP42 Información GeneralJ (1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Micromatrices 8049
Fabricación de Micromatrices
Los elementos de la micromatriz se depositan sobre un soporte sólido; el vidrio es el soporte más usado. La fabricación de
micromatrices se puede dividir en dos categorías principales, síntesis directa de las sondas sobre la micromatriz (in situ) o sínte-
sis de las sondas antes de colocarlas sobre la micromatriz (ex situ). La síntesis in situ se usa por lo general para micromatrices
de mayor densidad, pero se limita a nucleótidos de aproximadamente 25-100 bases. A medida que se incrementa la longitud
del nucleótido, aumenta la probabilidad de productos truncados debido a la estabilidad limitada de la construcción de oligo-
nucleótidos in situ. Por el contrario, la fabricación de micromatrices ex situ puede transformar cualquier material prefabricado
en un formato de micromatriz, incluidos los oligonucleótidos, productos de la PCR (amplicones), ADN complementario
(ADNc) y BAC.
Las principales técnicas para la síntesis in situ son la fotolitografía, litografía sin máscara y la tecnología de "impresión a cho-
rro" (inkjet). Aunque las micromatrices por lo general se fabrican a escala comercial, para el caso de un pequeño número de
micromatrices de baja densidad, el usuario final puede fabricar las micromatrices usando un instrumento robótico de bajo ren-
dimiento (personal microarrayer). Sin embargo, únicamente la litografía sin máscara y la tecnología de "impresión a chorro"
están disponibles para ser usadas por los usuarios finales en la fabricación. Para sintetizar los oligonucleótidos sobre el sustrato,
se emplea la fotolitografía, que requiere un sustrato de vidrio que contiene una fotomáscara preparada químicamente, de mo-
do que determinados nucleótidos se unan a posiciones específicas. Las máscaras determinan previamente los nucleótidos que
se activarán cuando estén cubiertos con uno de los cuatro tipos de nucleótidos. El proceso se repite hasta sintetizar el número
de bases requerido. La fabricación de estas micromatrices emplea algoritmos generados por computadora y múltiples aplica-
ciones puntuales (spots) para abarcar el gen de interés. La litografía sin máscara emplea un dispositivo digital de microespejos
que utiliza un arreglo en estado sólido de espejos de aluminio en miniatura para crear máscaras virtuales que reemplazan a las
fotomáscaras físicas. Una computadora controla el patrón deseado de luz UV a través de espejos individuales. Los microespejos
controlados digitalmente, a su vez, controlan el patrón de luz UVproyectada sobre el vidrio en la cámara de reacción, la cual
está acoplada a un sintetizador de ADN. La luz UV rompe selectivamente un grupo protector lábil a la luz UVubicado precisa-
mente donde se acoplará el próximo nucleótido. Los patrones se coordinan con la síntesis química del ADN de manera parale-
la y combinatoria, de modo que puedan sintetizarse cientos de miles de oligonucleótidos únicos en una sola micromatriz. En la
tecnología de "impresión a chorro" los nucleótidos se construyen, base por base, en capas de impresión repetitivas usando la
típica reacción química de la fosforamidita. Las cabezas de "impresión a chorro", similares a las usadas en las impresoras de
chorro de tinta, se conectan con frascos que contienen los cuatro distintos nucleótidos de fosforamidita que se ensamblan co-
mo bloques de construcción en la síntesis de ácidos nucleicos in situ. Las ventajas de la "impresión a chorro" y la litografía sin
máscara son la flexibilidad de diseño y la capacidad para fabricar pequeñas partidas de micromatrices rápidamente.
Los dos tipos principales de técnicas de fabricación ex situ son la micropuntuación (impresión por contacto) y la impresión
piezoeléctrica (impresión sin contacto). La tecnología se destaca por imprimir múltiples sondas una gran cantidad de veces
sobre numerosas superficies con la carga de un pequeño volumen de sonda. El tamaño de la puntuación y el volumen de en-
trega se controlan por medio del tamaño de las terminaciones de las puntas, de las que se disponen muchos tamaños. Un
mecanismo de impresión piezoeléctrica emplea un pequeño cristal dieléctrico que está en contacto con un capilar de vidrio
que contiene la muestra líquida. La aplicación de voltaje produce la expulsión del líquido desde la punta, generándose gotas
con volúmenes que varían desde cientos de picolitros hasta varios microlitros.
Consideraciones Experimentales Generales
Todos los experimentos con micromatrices, independientemente del tipo y de la aplicación, se realizan en una secuencia de
etapas similares: amplificación, marcación, hibridación y lavado, seguidas por barrido, cuantificación e informe. El diseño expe-
rimental determina el tipo de micromatriz usada, el número de puntos requeridos y los conjuntos específicos de ácidos nuclei-
cos sobre la micromatriz. El diseño experimental también influye sobre la plataforma usada, por ejemplo, el número de pun-
tos, tipo de superficie, tipo de ácido nucleico, rendimiento, resolución y número de colores que se pueden detectar en un solo
ensayo. Las plataformas pueden ser abiertas (el soporte está disponible a través de varios proveedores) o cerradas (el soporte
está disponible a través de un solo proveedor). En general, los diseños experimentales que requieren micropuntuaciones de
alta densidad y los utilizados para ensayos cuantitativos son más difíciles de implementar y más caros que los ensayos cualitati-
vos.
Consideraciones de la Muestra para Micromatrices
Es necesario seleccionar cuidadosamente la extracción, aislamiento y preparación de la muestra para no alterar su capacidad
de hibridizarse sobre la micromatriz. En general, las dificultades para la preparación de la muestra para las micromatrices son
las mismas que para otras técnicas de laboratorio tales como PCR cuantitativa y secuenciación (descritas en los capítulos
(1126) y (1127)). Algunos de los tipos de muestras analizados con micromatrices están constituidos por ARN,ADNc, ADN ge-
nómico y productos de PCR. Para algunas aplicaciones de genotipificación, se emplean alelos específicos como elementos de
la micromatriz y como dianas.
Al igual que con cualquier técnica de ácidos nucleicos, la calidad del ácido nucleico es crítica para el experimento con micro-
matrices. El ácido nucleico debe ser puro, además de estar intacto y cuantificado con exactitud antes de su uso (1126). En
8050 (1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Micromatrices / Información General USP42
particular, la presencia de ADN contaminante en muestras de ARNtotal puede ocasionar problemas durante el análisis por mi-
cromatrices, debido a que algunos métodos de marcación marcan el ARN y el ADN con la misma eficiencia. El tratamiento
previo con ADNasa o ARNasa puede ser necesario para aquellas aplicaciones que pudieran resultar afectadas por trazas de ARN
o ADN contaminantes. Por ejemplo, el ADN contaminante marcado se podría hibridizar con sondas de la micromatriz, gene-
rando señales de hibridación elevadas no provenientes de transcriptos de ARN, provocando así una estimación inexacta de la
concentración de ARNdiana por cuantificar ambas especies de ácidos nucleicos a la misma longitud de onda.
Un aspecto de gran importancia a tener en cuenta para cualquier experimento con micromatrices es la disponibilidad de
cantidades suficientes de ácido nucleico en las muestras. Por ejemplo, una muestra obtenida mediante captura por microdisec-
ción láser, biopsias de tejidos con aguja u otras muestras clínicas pequeñas no producen suficiente ARN (para micromatrices de
expresión) ni ADN (para micromatrices para aCGH), por lo que se deben amplificar antes del análisis. Resulta crítico diseñar los
procedimientos de amplificación de ARNm de tal manera que la mezcla final de amplicones refleje con exactitud la distribu-
ción de las especies de ARNm en la muestra. La amplificación uniforme de ADN genómico para las micromatrices para aCGH
se puede lograr mediante el uso de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA, por sus siglas en inglés), procedimiento
que permite evitar la amplificación no uniforme de ADN genómico que se presenta en los métodos de amplificación basados
en PCR, que emplean PCR con cebador oligonucleótido degenerado (DOP-PCR). En el caso de las micromatrices para SNP en
las que las dianas de interés son alelos específicos, la amplificación no uniforme no representa un problema y las muestras se
pueden amplificar (y marcar) usando PCR, PCR multiplex y amplificación del genoma completo (ver (1127)).
Marcación de Micromatrices
Las dianas para micromatrices, son una población de ácidos nucleicos que se extraen de una muestra y que se marcan de
manera apropiada. Se pueden usar muchos métodos para la marcación de las dianas (ver (1127)), pero la marcación con fluo-
rescencia es el más usado debido a que ofrece una alta sensibilidad y un intervalo más amplio. Una ventaja adicional es la
capacidad de detectar dos o más señales en un solo experimento. El método de marcación depende del tipo de micromatriz.
En el capítulo (1127) se describe la marcación directa e indirecta como los dos métodos usados para la marcación fluorescente
de las dianas para micromatrices de expresión génica. En general la marcación indirecta, donde la etiqueta se agrega mediante
un conector (linker), requiere menos material de partida y es menos costosa. En la literatura se describe que este método pro-
duce resultados similares a los obtenidos a partir de muestras marcadas directamente. En las micromatrices para aCGH , el
ADN del paciente y el ADN de referencia (300-1000 ng) por lo general se marcan con colorantes fluorescentes rojos y verdes,
respectivamente, usando a menudo un protocolo de cebado aleatorio. La marcación con cebador aleatorio emplea una alta
concentración de enzima de Klenow, mediante lo cual el ADN genómico se digiere con enzimas de restricción y se hibridiza
con cebadores aleatorios. Los cebadores se extienden mediante la actividad de la 5'-3' polimerasa de Klenow, lo que resulta en
una actividad de desplazamiento de cadena con la incorporación directa de los nucleótidos marcados. Las micromatrices para
SNP que emplean oligonucleótidos como elementos de la micromatriz se marcan usando nucleótidos marcados con fluores-
cencia tanto en reacciones de PCR individuales como en las PCR multiplex, seguidas de una etapa de purificación para eliminar
los colorantes no incorporados. Cuando se usan amplicones como elementos de la micromatriz, las sondas de oligonucleótidos
marcados se sintetizan usando la reacción química de fosforamidita.
Hibridación y Lavado
La hibridación se debe llevar a cabo en condiciones que minimicen el apareamiento (annealing) de fragmentos no comple•
mentarios. Los pasos de lavado posteriores a la reacción de hibridación se optimizan para ofrecer la mejor especificidad, la rela-
ción señal-ruido más alta y la máxima reproducibilidad posibles (ver (1126)). Antes de la hibridación, es necesario desnaturali-
zar las sondas y dianas de doble cadena y bloquear los sitios no específicos. La composición química de la superficie de las
micromatrices está diseñada para capturar todos los ácidos nucleicos con una alta eficiencia, por lo que se deben bloquear o
inactivar los grupos de unión libres en la superficie para evitar la unión no específica de material marcado que pudiera compro-
meter la relación señal-ruido. Las superficies se bloquean y lavan con varias soluciones amortiguadoras acuosas que por lo ge-
neral incluyen sales, detergentes y agentes de bloqueo tales como proteínas hidrolizadas de bajo peso molecular. El propósito
de los lavados posteriores a la hibridación es eliminar de la superficie y de las sondas todas las etiquetas no acopladas y las
unidas en forma inespecífica. En general, los lavados manuales y automatizados se llevan a cabo en soluciones amortiguadoras
de solución salina de citrato de sodio/dodecil sulfato de sodio (SSC/SDS) de diversas concentraciones y a distintas temperatu-
ras elevadas, dependiendo de la intensidad requerida. Después de la etapa final de lavado, las micromatrices que usan dianas
fluorescentes se secan inmediatamente mediante centrifugación o en una corriente de nitrógeno. Es indispensable almacenar
las micromatrices hibridizadas en la oscuridad y barrerlas lo antes posible. Algunos colorantes fluorescentes usados en los análi-
sis por micromatrices se pueden degradar por el ozono ambiental; en estos casos, los niveles de ozono en el ambiente experi-
mental deben ser inferiores a 5 ppb (0,005 ppm). Se fabrican campanas especializadas exentas de ozono para proteger a los
colorantes de la micromatriz.
USP42 InformaciónGeneral/ (1128) TécnicasBasadasen Ácidos Nucleicos-Micromatrices8051
Detección en Micromatrices
Independientemente del tipo de micromatriz cada punto en una micromatriz representa una secuencia de sonda única a la
que se une una sola diana marcada, y esta unión específica permite la detección y cuantificación de la diana. Esto se realiza
mediante la detección de la luz emitida a una longitud de onda particular por los dúplex marcados fluorescentemente cuando
la micromatriz se expone a una luz de longitud de onda específica para excitación. La luz fluorescente emitida es convertida en
energía eléctrica por un detector. El detector puede ser un tubo fotomultiplicador o un dispositivo de acoplamiento de carga
con pasos ópticos especialmente diseñados para recolectar datos crudos de la micromatriz (barrido). Los filtros del detector y
los pasos ópticos se diseñan para detectar colorantes fluorescentes específicos a una resolución suficiente, al mismo tiempo
que eliminan la superposición entre los espectros (crosstalk) cuando se usan dos o más colorantes en una sola micromatriz. La
señal resultante es proporcional al número de fotones emitidos por la micromatriz. Estas señales se usan para crear una imagen
digitalizada que muestra la presencia y cuantificación de dianas específicas.
Las muestras se pueden barrer desde un único canal de longitud de onda o secuencialmente desde dos canales. Por ejem-
plo, para micromatrices con plataformas de un solo canal, la muestra se marca generalmente con un fluoróforo que emite una
señal en el canal rojo. Para un formato de micromatrices de doble canal, se puede marcar una segunda muestra con un colo-
rante que emita en el canal verde. La marcación doble se usa en algunos diseños experimentales, tales como micromatrices de
expresión, a fin de medir la sobre expresión de un gen asociado con una enfermedad. En dichos experimentos, los ADNc deri-
vados del ARNm de tejidos normales o enfermos se marcan de forma distinta, se mezclan y se analizan en la misma laminilla
en una reacción de hibridación competitiva. Las relaciones resultantes de los dos colores reflejan la relativa abundancia del ma-
terial marcado dentro de cada muestra. De manera similar, el cálculo de las relaciones de fluorescencia de cada diana en una
micromatriz para aCGH permite el mapeo de ganancias y pérdidas para un cromosoma de interés.
Procesamiento de Imágenes de Micromatrices
La mayoría de los escáners detectan y adquieren uno, dos o más colores (mediante uno, dos o más canales). El paso óptico
del sistema minimiza la superposición entre los espectros (crosstalk) y permite la adquisición de dos imágenes espectralmente
separadas. En muchas ocasiones, las imágenes se representan como una imagen roja y una verde. Cuando se emplean dos
colores, la relación entre las dos imágenes fluorescentes elimina artefactos ocasionados por irregularidades regionales y el ta-
maño desparejo de los puntos. Si se emplea solo un color, las señales fluorescentes de dos o más micromatrices se deben nor-
malizar para poder compararlas entre sí. Los diámetros de los puntos impresos sobre las micromatrices varían desde 1 O µm
hasta casi 1000 µm, y la resolución de los escáners varía desde 1 µm hasta 50 µm. En consecuencia, al barrer completamente
una micromatriz se pueden obtener cantidades variables de datos-píxeles dependiendo de la resolución del escáner.
ANÁLISISDE IMÁGENESDE MICROMATRICES

El análisis de las imágenes barridas generalmente implica tres pasos: localización de los puntos o grillado, segmentación de
la imagen y cuantificación de puntos.
Inicialmente se asignan coordenadas específicas a los puntos. El proceso de localización de puntos o grillado puede ser ma-
nual o totalmente automático, dependiendo del software de procesamiento de imágenes usado. Se tiene en cuenta el tamaño
individual y la forma de cada punto y se realizan ajustes para aquellas filas y columnas no uniformes producidas durante el
proceso de impresión.
El proceso de segmentación particiona la imagen completa dividiendo los píxeles entre píxeles resaltados y píxeles de fondo
basándose en la intensidad y las propiedades espaciales de cada píxel. Existen cuatro tipos principales de segmentación de
señales que se han empleado para las matrices de puntuación. El método más simple es la segmentación espacial que coloca
dos círculos (uno interno y otro externo), de tamaños fijos pero diferentes, sobre cada punto para distinguir la señal de la son-
da de la señal de fondo aledaña. Por una parte, debido a la irregularidad de los tamaños de los puntos en algunas micromatri-
ces el área real del círculo interno puede ser mayor que el diámetro del punto y, por lo tanto, contener píxeles correspondien-
tes al fondo. Por la otra parte, se pueden detectar artefactos y señales en el área entre el círculo interno y externo contribuyen-
do a la señal de fondo. El segundo método, la segmentación basada en la intensidad, distingue los píxeles-señales de los píxe-
les de fondo, de acuerdo con las intensidades de los puntos dentro de una región predeterminada. En este caso, se puede
clasificar un determinado porcentaje de píxeles dentro de las intensidades más altas, como píxeles-señales. Las ventajas de este
método son la simplicidad y la velocidad, pero el inconveniente es la incapacidad para distinguir entre artefactos y señales y su
tendencia a detectar señales bajas pertenecientes al fondo. El tercer método es un enfoque estadístico conocido como seg-
mentación Mann-Whitney que combina información de los análisis espaciales y los basados en la intensidad. En este método,
los píxeles de fondo localizados fuera del círculo interno se usan para determinar un nivel de umbral de intensidad para una
señal dentro del círculo interno. La limitación de este método recae en que su exactitud puede verse disminuida por una gran
cantidad de artefactos e irregularidades de los puntos. El cuarto método, el método de segmentación de medida limitada,
también combina información espacial con información de intensidad, y mide las distribuciones de las señales dentro y fuera
del círculo interno. El método elimina los extremos superior e inferior de cada distribución para excluir los artefactos y los píxe-
les-señales incorrectamente localizados en el fondo.
8052 (1128) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Micromatrices / Información General USP42
La hipótesis principal de la cuantificación de puntos consiste en que la intensidad total de fluorescencia de un punto es pro-
porcional al nivel de expresión del transcripto marcado. Esto depende en gran medida de una variedad de factores, que inclu-
yen la preparación de la diana, las condiciones de hibridación y la detección de la señal dentro del intervalo dinámico lineal. Si
la cantidad de sonda depositada durante el procedimiento de fabricación de la micromatriz varía de punto a punto y de matriz
a matriz, lo cual generaría puntos de diferentes tamaños, entonces la suma o la intensidad total de las señales puede ser varia-
ble e inexacta. Para corregir tal variación, la aplicación puntual de las sondas en las micromatrices se debe realizarr usando una
química de superficie homogénea que tenga capacidad de unión fija, lo que asegura que cada puntuacón contenga la misma
cantidad de sonda. Alternativamente, los puntos se pueden cuantificar tomando la media, la mediana, o la moda de las inten-
sidades de todos los píxeles-señales que se encuentran en la señal de medida. Los métodos más robustos que protegen contra
señales aberrantes son la media limitada (trimmed mean) (en el que un porcentaje determinado de señales más altas y más
bajas se descartan antes de calcular la media) y la mediana de las intensidades de las señales. Cuando se emplean dos fluorófo-
ros diferentes, se puede usar la relación de intensidad para realizar la corrección por cantidades de sonda variables y se puede
calcular a partir de la media, de la mediana y de la moda de las intensidades de cada canal.
ANÁLISISDE DATOSDE MICROMATRICES

Los formatos de micromatrices particularmente densos que contienen desde decenas de miles hasta millones de sondas por
chip o laminilla generan un gran volumen de datos brutos por micromatriz, lo cual requiere el uso de un software de análisis
de datos especializado. Los programas para micromatrices están diseñados para extraer datos primarios, normalizar los datos
para eliminar la influencia de variaciones experimentales y vincular las sondas a los genes y dianas derivados de secuencias
pertinentes. Los programas también están disponibles para aplicar métodos estadísticos, analizar, desplegar visualmente y ma-
nipular datos para extraer información biológica significativa. Las partes principales del análisis de datos son la normalización,
la corrección del fondo y el cálculo de la relación.
La normalización se emplea para ajustar sistemáticamente los datos sin procesar de la micromatriz en un esfuerzo por redu-
cir la variabilidad generada por las diferencias en la fabricación y procesamiento de las micromatrices y por las variables técni-
cas, de modo que se puedan detectar las verdaderas diferencias biológicas entre las muestras. La gran variedad de métodos de
normalización impide un análisis detallado del tema en este capítulo y, en la actualidad, no existen estándares para normaliza-
ción. Los algoritmos usados comúnmente se seleccionan basándose en el tipo de micromatriz, en el número de fluoróforos
usados y en las muestras que se están analizando. Algunos métodos están incorporados en el software del fabricante, pero
otros están disponibles a través de fuentes comerciales o proveedores de software de código abierto.
La corrección del ruido de fondo elimina los bajos niveles de ruido inherentes a los instrumentos de detección y a la química
de superficie usada en la fabricación. Algunos contaminantes introducidos durante el procesamiento de la micromatriz pueden
ocasionar altos niveles de ruido de fondo que deben corregirse antes de analizar los datos.
En las micromatrices de dos colores, la relación entre las intensidades de la señal de los elementos de la micromatriz de dos
muestras cohibridizadas se usa como medida relativa de la expresión génica. En sistemas de un solo canal, la relación se puede
calcular entre señales tomadas de dos muestras diferentes hibridizadas en micromatrices individuales, una de las cuales se to-
ma como muestra de referencia. Por consiguiente, los datos resultantes de las micromatrices no representan una cuantificación
absoluta, sino un nivel relativo de ARN o de ADN contra una muestra de referencia o un control .
Control de Calidad y Garantía de Calidad
Al igual que con cualquier ensayo de diagnóstico, el control de calidad y la garantía de calidad tienen una importancia críti-
ca. Las micromatrices deben demostrar robustez y reproducibilidad. Los pasos generales para el control y garantía de calidad
descritos en el capítulo (1127) para ácidos nucleicos y NATtambién se aplican a las micromatrices. A diferencia de otras prue-
bas de diagnóstico, en la actualidad no se cuenta con reactivos de referencia para el control de calidad de las micromatrices, y
las pautas reglamentarias se encuentran en desarrollo. La FDAha emitido una serie de guías preeliminares tituladas "In Vitro
Diagnostic Multivariate lndex Assays" (Análisisde Índice Multivariado de Diagnóstico In Vitro), las cuales tratan la definición y
el estado reglamentario de una clase de dispositivos de diagnóstico in vitro a los que se refiere como análisis de índice multiva-
riado de diagnóstico in vitro (IVDMIA,por sus siglas en inglés), y las micromatrices caen dentro de esta categoría. La guía trata
sobre la secuencia de etapas previas a la comercialización y los requisitos posteriores a la comercialización relacionados con los
IVDMIA.
Diversas fuentes no intencionales de variabilidad que son específicas de las micromatrices pueden afectar de gran manera las
intensidades de las señales y la derivación exacta de una señal verdadera que refleje con exactitud el transcripto marcado. Una
de las principales fuentes de variabilidad es la calidad de los puntos. Las mediciones de la calidad de los puntos en la etapa de
procesamiento permite la eliminación de puntos con calidad deficiente o cuestionable. Otras fuentes de variabilidad son los
artefactos, por ejemplo, desplazamientos regionales (elevaciones o caídas) en la señal general de la micromatriz que se pueden
observar dentro de un chip individual o en datos compuestos derivados de múltiples chips. Estos cambios se pueden diferen-
ciar de la variabilidad real debido a que no son aleatorios, y los patrones se pueden detectar visualizando las señales sobre el
área completa del chip. Cuando se usan colorantes con propiedades espectrales distintas para marcar dos muestras diferentes
en una reacción de hibridación competitiva usando una sola matriz, se pueden presentar diferencias debido a desviaciones in-
herentes a la marcación y no tanto por el nivel de expresión génica. Por ejemplo, el canal verde puede parecer uniformemente
USP42 InformaciónGeneral/ (1129) TécnicasBasadasen Ácidos Nucleicos-Genotipificación8053
más brillante que el canal rojo, a pesar de que no existan diferencias reales en la expresión. La hibridación con colorantes re-
versos puede asegurar la detección y eliminación de los efectos de las desviaciones debidas a los colorantes. De igual manera
que con cualquier ensayo cuantitativo para ARN, la integridad de la muestra afecta su medición y la calidad de la muestra es
un determinante importante para la exactitud. Por ejemplo, debido a que la marcación se dirige desde el extremo 3' al 5' pero
el ARN se degrada a partir del extremo 5', el ARN degradado conduce a altas relaciones 3'/5', lo que resulta en una marcación
no uniforme de todo el transcripto. Por último, se puede introducir variabilidad durante el procesamiento de las micromatri-
ces, un procedimiento relativamente complejo que implica múltiples pasos tales como marcación, hibridación, lavado y tinción
(variables técnicas). Dicha variabilidad puede enmascarar las verdaderas diferencias en las muestras analizadas.
Cuando se usan como prueba de diagnóstico, las micromatrices deben demostrar robustez, reproducibilidad, un alto grado
de correlación con el formato orginal y confiabilidad de la predicción pronóstica. En circunstancias ideales, las micromatrices
deben contener al menos 2-3 puntos repetidos por cada gen informante para asegurar la reproducibilidad intraensayo. Con
micromatrices de dos canales, se puede hibridizar una combinacón de muestras de referencia en el canal de fluorescencia
complementario para que los datos puedan expresarse como logaritmos de cocientes, con lo cual se reduce la necesidad de
una normalización extensiva. La reproducibilidad interensayo de los resultados de las pruebas y la estabilidad con el paso del
tiempo se pueden rastrear usando una variedad de muestras de referencia que, cuando se marcan e hibridizan, representan un
espectro de puntos finales predictivos (por ejemplo, riesgo alto, no conclusivo o bajo) y que deben caer dentro de un intervalo
predeterminado de resultados. Cualquier falla en estos controles debería resultar en el rechazo de los resultados de las mues-
tras en la misma corrida. Si el ensayo se realiza en un gran número de sitios, la reproducibilidad entre sitios es obligatoria y se
debe evaluar. Asimismo, se debe determinar la reproducibilidad del ensayo con respecto a la extracción del tejido, y se debe
especificar de manera clara la calidad de las muestras de tejido o ARN (por ejemplo, porcentaje de células tumorales dentro de
la muestra).
En conclusión, los experimentos con micromatrices deben diseñarse y llevarse a cabo cuidadosamente para minimizar la va-
riabilidad y producir datos que se relacionen de manera exacta con las muestras analizadas. Además, se deberían analizar y
verificar los marcadores biológicos de interés, usando una plataforma alternativa tal como qRT-PCR,la cual debería demostrar
que estos biomarcadores se pueden detectar de manera reproducible tanto en la misma muestra como en otras diferentes. El
desarrollo de estándares de referencia, en especial cuando se usan micromatrices como pruebas de diagnóstico, es el siguiente
paso para asegurar la calidad y la validación de los resultados obtenidos con micromatrices. Con el advenimiento de las micro-
matrices comerciales en reemplazo de las micromatrices personalizadas, se han solucionado ampliamente las cuestiones rela-
cionadas con la reproducibilidad, la estandarización y el control de calidad a través de los rigurosos controles de calidad usados
en la fabricación comercial.

GENOTIPIFICACIÓN
INTRODUCCIÓN
Este capítulo trata sobre las técnicas para detectar diferencias de una sola base en el ADN y otros tipos de secuencias poli-
mórficas del ADN que ocurren en los tres mil millones de bases que constituyen el genoma humano. La variación genética más
común es el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés), que es un simple cambio en una base de la
secuencia génica. Los SNP ocurren en promedio cada 1000 bases y constituyen una gran proporción de la variabilidad interin-
dividual. Los SNP pueden predisponer a los individuos a enfermedades o influir en su respuesta a un medicamento. Se han
identificado aproximadamente 1,8 millones de loci para SNP en humanos y probablemente se descubran más en los próximos
años. 1
Los enfoques comunes para detectar SNP y otros tipos de secuencias polimórficas del ADN se describen en las siguientes
secciones. Estos enfoques abarcan una gran variedad de técnicas, como las de tecnología de amplificación de ácidos nucleicos
(NAT,por sus siglas en inglés), NATen tiempo real y micromatrices (microarrays), cuyos principios se tratan en más detalle en
los capítulos relacionados. Este capítulo se concentra en las modificaciones específicas de las técnicas que son necesarias para
permitir la detección de diferencias de una sola base.
TECNOLOGÍAS
DE GENOTIPIFICACIÓN
DE SNP
Aunque la utilidad del estudio de SNP para mapeo de genes y estudios de asociación de enfermedades es evidente, no se ha
adoptado un único procedimiento estandarizado para la genotipificación de SNP. Se han desarrollado diversos métodos para
efectuar la genotipificación de SNP, que satisfacen una amplia gama de necesidades, incluyendo la capacidad de procesamien-
1 la
Database of Single Nucleotide Polymorphism (db SNP) Versión 128 se consigue en el National Center for Biotechnology lnformation (NCBI), http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/mdex.html.
8054 (1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación / Información General USP42
to, facilidad de diseño del ensayo, exactitud y confiabilidad. Los procedimientos disponibles también se pueden clasificar en
dos grupos: aquellos que se basan en la identificación de SNP conocidos y los que se pueden usar para detectar SNP descono-
cidos. Con el fin de identificar el procedimiento más apropiado para la genotipificación de SNP para una aplicación específica,
se deben determinar los requisitos de capacidad de procesamiento en términos del número de SNP a analizar por muestra
(nivel de multiplexación), y la capacidad de procesamiento en función de la cantidad de muestras a procesar, porque diversos
enfoques podrían funcionar mejor dependiendo de estos requisitos.
La mayoría de los procedimientos para la genotipificación de SNP dependen de la amplificación por reacción en cadena de
la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) de las regiones genómicas que abarcan los SNP, seguida por la reacción de genoti-
pificación. La PCR proporciona la sensibilidad y especificidad requeridas para distinguir entre genotipos heterocigóticos y ho-
mocigóticos en genomas grandes y complejos. La dificultad de diseñar y efectuar las reacciones de PCR multiplex limita la ca-
pacidad de procesamiento de muchos de los ensayos actuales para genotipificación de SNP. Las siguientes secciones destacan
varios de los enfoques principales que se usan actualmente para la genotipificación de SNP. En muchos casos, la tecnología
subyacente puede modificarse para que cumpla con los requisitos de la aplicación específica, en términos de la capacidad de
procesamiento de muestras y número de SNP detectados. En general, los procedimientos basados en PCR en tiempo real son
más adecuados para procesar un gran número de muestras y los procedimientos basados en matrices son más apropiados para
la detección simultánea de muchos SNP. También están surgiendo tecnologías más novedosas, basadas en formatos de matri-
ces multiplex (multiplexed arrays), que serán apropiadas para aplicaciones en las que se requiera procesar un gran número de
muestras y muchos SNP.
Secuenciación
La secuenciación es el procedimiento definitivo para analizar el ADN y su uso para la detección de SNP permite la identifica-
ción inequívoca de los cambios de bases (ver la secuenciación de ácido nucleico en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Ex-
tracción,Deteccióny Secuenciación(1126)). La tecnología estándar es costosa y el procedimiento toma tiempo, requiere mucha
mano de obra y tiene baja capacidad de procesamiento de muestras. La secuenciación es una herramienta confirmatoria útil y
tiene aplicación en situaciones donde otras tecnologías no son apropiadas, pero no es la solución más económica para la ma-
yoría de aplicaciones de genotipificación de SNP que requieren la identificación de solo una o unas pocas bases.
Análisis del Polimorfismo de la Longitud del Fragmento de Restricción
El primer procedimiento más ampliamente usado para la detección de polimorfismos aprovechaba las alteraciones en los
sitios de restricción enzimática ocasionados por los SNP, que llevan a la ganancia o pérdida de eventos de corte. El análisis del
polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP,por sus siglas en inglés) por PCR comprende la amplificación
con PCR de un fragmento de interés y la subsiguiente digestión con una enzima de restricción. Los fragmentos producidos se
analizan, generalmente con un procedimiento de fraccionamiento por tamaño, usualmente electroforesis en gel. Debido a su
simplicidad, el procedimiento se ha usado extensamente y aún se sigue usando, aunque conlleva ciertas limitaciones: solo el
subconjunto de polimorfismos que residen en un sitio de restricción de una endonucleasa se puede estudiar con el procedi-
miento convencional; la digestión incompleta debido a un procesamiento subóptimo puede producir patrones de digestión
engañosos; y el procedimiento es más complicado de automatizar que otros procedimientos usados para la genotipificación de
SNP.
Hibridación con Sonda
Muchos procedimientos de genotipificación de SNP se basan en hibridaciones del ADN, aprovechando el hecho de que una
sonda de ADN forma una unión más fuerte con una diana o blanco complementario con el que puede aparearse perfectamen-
te, que la unión con un blanco que contiene una base con la que no se aparea correctamente. La habilidad de la hibridación
con oligonucleótidos alelo-específicos (ASO, por sus siglas en inglés) para detectar un apareamiento incorrecto (mismatch) de
una sola base se demostró por primera vez a fines de los años 70 y se ha usado desde entonces para detectar la mutación de
drepanocitos en el gen de la beta-globina mediante una hibridación por transferencia de Southern. La invención de la PCR
facilitó el desarrollo posterior de ensayos basados en sondas para la genotipificación de SNP en genomas complejos.
La estabilidad térmica de un híbrido entre una sonda ASO y su secuencia blanco que contiene SNP no solo se determina por
la rigurosidad de las condiciones de la reacción sino también por la estructura secundaria de la secuencia blanco y de la se-
cuencia de nucleótidos que flanquean el SNP. Por lo tanto, resulta difícil predecir a priori las condiciones de la reacción o de la
secuencia de la sonda ASO que permitirá la discriminación óptima entre dos alelos, usando hibridación ASO. Estos parámetros
se deben establecer empíricamente y por separado para cada SNP. Por consiguiente, no existe un solo conjunto de condicio-
nes de reacción que sean óptimas para la genotipificación de todos los SNP, lo cual dificulta extremadamente el diseño de
ensayos multiplex basados en hibridación con sondas ASO.
Un enfoque para contrarrestar el problema del diseño del ensayo consiste en efectuar reacciones multiplex de hibridación
ASO sobre matrices que contengan sondas múltiples para cada SNP que se va a analizar. Esto implica el uso de conjuntos de
USP42 Información General/ (1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación 8055
sondas en las cuales el SNP ocurra en posiciones diferentes a lo largo de las sondas. Cuando se usan matrices de alta densidad
que pueden llevar hasta 10 6 sondas por cm 2 se hace posible incluir grandes cantidades de sondas ASO por SNP.
Otro enfoque consiste en usar análogos de bases como ácido nucleico bloqueado (LNA, por sus siglas en inglés), según se
describe en detalle en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Amplificación (1127). Para aplicaciones que involucran pocos SNP
pero muchas muestras, se han desarrollado métodos homogéneos de PCR en tiempo real. Estos incluyen el uso de sondas fluo-
rescentes, tales como sondas de hidrólisis, sondas tallo-bucle y sondas de hibridación que usan fluorescencia por transferencia
de ener~ía resonante (FRET,por sus siglas en inglés). El principio de estos ensayos se discute en más detalle en TécnicasBasa-
das en AcidosNucleicos-Amplificación (1127). La base de muchos ensayos para la detección de SNP consiste en la unión selec-
tiva de la sonda ASO y de su secuencia blanco perfectamente apareada, lo que lleva a la transferencia de energía y a la genera-
ción de una señal fluorescente. Las sondas diseñadas con estructuras secundarias específicas tienden a formar una estructura
tallo-bucle que desestabiliza los híbridos apareados incorrectamente, lo cual incrementa su poder para distinguir alelos, com-
parado con las sondas lineales ASO. Las sondas de hidrólisis modificadas con moléculas de unión al surco menor del ADN que
aumentan la afinidad del blanco muestran mayor poder de discriminación de alelos. El uso de dos sondas, cada una marcada
con un fluoróforo indicador diferente permite detectar ambos alelos SNP en un solo tubo. Al usar sondas marcadas con fluoró-
foros diferentes se puede conseguir multiplexación limitada. En los ensayos basados en sondas fluorescentes, el aumento de la
fluorescencia debido al producto acumulado de PCR por lo general se monitorea en tiempo real en placas de microtitulación
de 96 ó 384 pocillos. Como alternativa, se puede medir la fluorescencia generada por los dos alelos después de completada la
PCR. En este caso, los resultados se expresan como un cociente de señales que refleja la hibridación de los dos oligonucleóti-
dos a la secuencia blanco y de esa forma las diferencias en la eficiencia de la amplificación entre las muestras no afectan la
interpretación de los resultados de la genotipificación.
Un tercer método implica el calentamiento de los productos de amplificación después de haberse completado la PCR, con el
fin de separar la sonda del blanco. Cada dúplex tiene su propia Tmespecífica, definida como la temperatura a la cual el 50%
del ADN se vuelve de cadena simple. La Tmdepende de la estabilidad del dúplex de sonda-blanco. Los dúplex de sonda-blan-
co perfectamente apareados tienen mayor estabilidad y por lo tanto una Tmmayor que el mismo dúplex conteniendo una sola
base apareada incorrectamente. Al monitorear continuamente la fluorescencia durante la fase de calentamiento, los analistas
generan una "curva de fusión (desnaturalización)" que mide los cambios en fluorescencia cuando la sonda se desnaturaliza o
"funde" y se separa del amplicón. Este método se puede usar solo para sistemas que no dependen de la hidrólisis de la sonda
para generar una señal y por lo tanto no es apto para ensayos de hidrólisis de la sonda.
Dado que después de la PCR no se requieren pasos de procesamiento o separación de marcadores, los ensayos homogéneos
de PCR en tiempo real son simples de realizar, lo cual los hace útiles para aplicaciones en las que debe genotipificarse un alto
número de muestras. Las sondas óptimas se deben diseñar individualmente para cada SNP y por lo tanto los ensayos serán
más eficientes cuando se analice un número limitado de SNP. El costo de las sondas modificadas con moléculas fluorescentes y
de extinción también puede ser un factor limitante para la aplicación de los ensayos a alta capacidad de procesamiento.
Extensión del Cebador
En esta técnica se usa un oligonucleótido para cebar la síntesis de ADN con una enzima polimerasa, según se efectúa en una
PCR o en una reacción de secuenciación estándar. La técnica tiene variaciones. La PCR alelo-específica usa dos cebadores, cada
uno totalmente complementario a uno de los alelos del SNP, con la posición de SNP en el extremo 3' del cebador y un ceba-
dor inverso común de PCR para amplificar selectivamente los alelos SNP. Dado que solo los oligonucleótidos perfectamente
apareados cebarán la extensión de la polimerasa del ADN, el producto será detectado solo en la reacción que contiene el ceba-
dor perfectamente apareado.
La electroforesis en gel de agarosa se usa para detectar los productos amplificados, aunque también se han desarrollado mé-
todos homogéneos de PCR alelo-específica en tiempo real usando cebadores marcados con diferentes fluoróforos o un colo-
rante fluorescente, que se intercala con los productos de doble cadena de PCR, o efectuando la detección del amplicón con
sondas de hidrólisis y sondas horquilla (tallo-bucle). Cuando se usan colorantes intercalados o cebadores marcados para PCR
alelo-específica sin un paso de detección consecutiva específica del blanco o de separación por tamaño, se puede encontrar
que la especificidad del procedimiento está comprometida debido a la formación de dímeros de cebadores y a otros productos
espurios de la amplificación que no se distinguen del producto real de PCR. Una limitación de todas las variantes de la PCR
alelo-específica consiste en que las condiciones de la reacción o el diseño del cebador para la amplificación selectiva de los
alelos debe optimizarse empíricamente para cada SNP. Al igual que los ensayos de hidrólisis y sonda horquilla, los procedi-
mientos homogéneos de PCR alelo-específica son más apropiados para el análisis de un número limitado de SNP en un gran
número de muestras. También se han desarrollado métodos basados en matrices de mayor multiplexación de SNP.
En procedimientos basados en la extensión del cebador de un nucleótido único (a veces denominada minisecuenciación), la
discriminación de alelos se basa en la alta exactitud de la polimerasa del ADN para incorporar nucleótidos. Se usa un cebador y
su extremo 3' se coloca en la base que precede al SNP que se va a examinar. La polimerasa del ADN se utiliza entonces para
incorporar ddNTP marcados, cada uno con un colorante fluorescente diferente. Después de que los oligonucleótidos marcados
se separan de los ddNTP no incorporados, los resultados se pueden valorar sobre un lector de placas de fluorescencia. Además
de las etiquetas (tags) fluorescentes, los ddNTP se pueden marcar con biotina o haptenos y luego detectar indirectamente por
medio de anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina o peroxidasa, usando marcadores colorimétricos o quimioluminiscen-
tes en formatos ELISA.
8056 (1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación / InformaciónGeneral USP42
También se ha descrito que la multiplexación de este procedimiento resulta en una reducción de costos y un aumento de la
capacidad de procesamiento. En estos procedimientos multiplexados, se separan los diferentes loci genotipificados simultánea-
mente, bien sea por electroforesis en gel o por hibridación a matrices o arreglos de etiquetas (arrayed tags). También es posi-
ble la extensión del cebador directamente sobre un soporte sólido, como una micromatriz. La inmovilización de los cebadores
de cadena simple sobre el soporte sólido se puede hacer por medio de una reacción biotina-avidina-estreptavidina o en forma
covalente a través de grupos disulfuro en el extremo 5'.
La espectroscopía de masas con técnicas como la espectrometría de masas por tiempo de vuelo con ionización por desor-
ción láser asistida por matrices (MALDI-TOFMS, por sus siglas en inglés) se puede utilizar también para determinar la identi-
dad del ddNTP incorporado basándose en la masa del nucleótido. Una dificultad con la MALDI-TOFMS es que los productos
de extensión del cebador deben ser rigurosamente purificados antes de la medición para evitar el ruido del material biológico
presente en la muestra. Estos procedimientos asistidos por enzima han demostrado ser más robustos y proporcionar una discri-
minación más específica de los alelos que la hibridación ASO en condiciones de reacción similares. Estas características son
ventajosas para las aplicaciones en las que se requiere alto volumen de procesamiento, porque se minimiza el esfuerzo requeri-
do para el diseño y la optimización del ensayo.
Ligación
En el ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA,por sus siglas en inglés), los oligonucleótidos se diseñan de forma tal que
se encuentren en la posición del SNP que se va a examinar. La unión enzimática, con una ADN ligasa, ocurre solamente cuan-
do el apareamiento es perfecto. La prueba por lo general se efectúa diseñando dos oligonucleótidos específicos para cada ale-
lo, marcados en forma diferente en uno de los lados del SNP, con un oligonucleótido común en el otro. La detección de los
alelos se puede efectuar directamente en los pocillos de la microplaca por métodos colorimétricos. El uso de multiplex y de
separación en gel también se han descrito.
La OLA se ha usado en formatos de micromatriz con una de las sondas de ligación inmovilizada o con sondas tallo-bucle
únicas inmovilizadas. Como alternativa, la ligación se puede llevar a cabo en solución, seguida por la captura de los productos
de ligación sobre micromatrices o en micropartículas que llevan un conjunto genérico de oligonucleótidos que son comple-
mentarios a una secuencia de "etiquetas (tags)" sobre una de las sondas de ligación. En la práctica, se usan frecuentemente
ligasas termoestables para la genotipificación de SNP en combinación con PCR antes de las reacciones de detección de la liga-
sa alelo-específica. Dado que los mecanismos de reacción para PCRy ligación son diferentes, los reactivos de ambas reacciones
se pueden combinar. Esta característica se usa en un ensayo homogéneo de PCR en tiempo real con genotipificación mediada
por ligasa y detección por FRET.Comparado con los procedimientos de extensión del cebador asistidos por ADN polimerasa,
un inconveniente de la OLAes que la detección de cada SNP requiere tres oligonucleótidos, lo cual incrementa los costos de
estos ensayos.
Las sondas padlockson oligonucleótidos lineales cuyos extremos son complementarios al blanco y tienen una secuencia alea-
toria en el centro. Cuando se hibridizan perfectamente a su secuencia blanco, las sondas pad/ockpueden circularizarse por liga-
ción, mientras que un apareamiento incorrecto con la secuencia blanco evita la ligación. Los oligonucleótidos circularizados
pueden actuar como moldes para la amplificación por círculo rodante (RCA,por sus siglas en inglés) asistida por ADN polime-
rasa. La RCApuede usarse para amplificar las sondas padlockcircularizadas ligadas hasta un nivel requerido para detectar se-
cuencias de copia única. Se ha diseñado un ensayo homogéneo, isotérmico para genotipificación de SNP individuales en una
placa de microtitulación, el cual combina amplificación exponencial de las sondas pad/ockligadas, usando una reacción de am-
plificación por círculo rodante ramificada con detección por cebadores en forma de horquilla marcados por transferencia de
energía.
Desplazamiento
El ensayo invasor utiliza la propiedad de las flap endonucleasas (FEN, por sus siglas en inglés) para cortar las porciones re-
dundantes (flap) del extremo 5' de un fragmento de ADN río abajo (downstream) que se solapa sobre un fragmento de ADN
río arriba (upstream) (invasor). Se diseña un oligonucleótido invasor con su extremo 3' sobre el SNP que se va a examinar.
También se diseñan dos sondas de oligonucleótidos de señal que se solapan sobre el sitio polimórfico y cada una corresponde
a uno de los alelos. Después del desplazamiento de las sondas de señal por la sonda invasora, ocurre la escisión mediada por la
FENsolo para la sonda de señal alelo-específica perfectamente apareada. La generación del fragmento escindido se monitorea
usándolo en una segunda reacción como una sonda invasora para escindir una sonda FRET.Este ensayo no requiere amplifica-
ción por PCR del locus que se va a examinar y la cuantificación (scoring) se puede hacer con un simple lector de placa fluores-
cente.
Pirosecuenciación
En el procedimiento de pirosecuenciación, la extensión del cebador se monitorea por la detección luminométrica de pirofos-
fato (PPi) mediada por enzima, que se libera durante la incorporación del desoxinucleótido trifosfatos. El genotipo de un SNP
se deduce por la adición secuencial y degradación de los cuatro nucleótidos usando apirasa en un instrumento, dedicado a
USP42 InformaciónGeneral/ (1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación 8057
este ensayo, que funciona en un formato de placas de microtitulación de 96 ó 384 pocillos. Por medio de pirosecuenciación, el
aparato puede determinar secuencias de ADN de 30 a 50 bp que flanquean un SNP. Una limitación del procedimiento es que
la identificación secuencial de las bases no permite la genotipificación de varios SNP por reacción en genomas diploides. Una
ventaja del procedimiento es que permite detectar cualquier polimorfismo nuevo. Sin embargo, se necesitan equipos específi-
cos para la inyección de los nucleótidos.
Análisisde Polimorfismo de CadenaSimpley de Heterodúplex

Conformacional
El análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP,por sus siglas en inglés) y el análisis de heterodúplex
estuvieron entre los primeros procedimientos establecidos para la detección de SNP. El análisis SSCP convencional involucra la
desnaturalización de fragmentos amplificados por PCRy la subsiguiente formación de estructuras secundarias y terciarias espe-
cíficas de la secuencia de las cadenas individuales durante la electroforesis en gel no desnaturalizante. La movilidad electroforé-
tica depende entonces de la forma tridimensional de las moléculas de cadena simple. Una sola base de diferencia en los frag-
mentos de ADN de hasta 300 bps usualmente cambiará la conformación de manera que podrá ser detectada por PAGEno
desnaturalizante.
Los geles de poliacrilamida tradicionales y los fragmentos marcados con 32P están siendo frecuentemente reemplazados por
fragmentos marcados con fluorescencia y electroforesis capilar automatizada. La simplicidad del procedimiento, combinada
con automatización y corto tiempo de análisis, contribuye a una alta capacidad de procesamiento de muestras a un costo rela-
tivamente bajo. Si los productos de PCR desnaturalizados se dejan renaturalizar lentamente, forman los dúplex de ADN. Los
dúplex con la misma secuencia en ambas cadenas (homodúplex) o con un solo par de bases apareado incorrectamente en una
cadena (heterodúplex) tienen diferente movilidad electroforética en un gel nativo. En el caso de una sustitución de un único
par de bases, el heterodúplex se puede separar fácilmente de un homodúplex.
En otras versiones de la técnica, se usa la cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante (DHPLC,por sus siglas en
inglés) para la separación de las cadenas heterodúplex y homodúplex. El análisis de mutación con DHPLCpuede automatizarse
casi totalmente con un muestreador automático en un extremo y un recolector de fracciones en el otro. El análisis es rápido
(cerca de 5 minutos por muestra) y la evaluación sencilla de los datos distingue entre picos simples y múltiples en los perfiles
de elución, permitiendo analizar ADN con una longitud de hasta 1,5 kb. Una desventaja puede ser el uso recomendado de
ADN polimerasa Pfu, que por ser una enzima de alta fidelidad permite picos más definidos pero puede ser menos exitosa para
amplificar algunas regiones.
Perfil de Repetición Corta en Tándem
Una repetición corta en tándem (STR,por sus siglas en inglés) es un tipo de polimorfismo de ADN que ocurre cuando un
patrón de dos o más nucleótidos se repite y las secuencias repetidas están adyacentes una de la otra. El patrón puede variar en
longitud de 2 a 1O bp (p. ej., CATGnen una región genómica) y por lo general está en la región intrónica no codificante o
regiones río arriba/río abajo. Al examinar varios loci de STRy contar cuántas repeticiones de una secuencia STRespecífica hay
en un locus determinado, se puede crear un perfil genético exclusivo de un individuo. Hasta el momento se han publicado
más de 1O000 secuencias STRen el genoma humano. Los análisis de STRse han convertido en el procedimiento de análisis
preferido para determinar los perfiles genéticos en casos forenses. El análisis de STRen el campo forense se volvió muy popular
desde mediados de los años 90. Los STRque se usan en análisis forenses son repeticiones de tetra o pentanucleótidos (4 ó 5
unidades de repetición) porque estas generan una alta proporción de datos sin error a la vez que son suficientemente robustas
para sobrevivir a la degradación en condiciones no idóneas. Las secuencias de repetición más cortas tienden a generar artefac-
tos como tartamudeo y amplificación preferencial; diversas enfermedades genéticas están asociadas con repeticiones de trinu-
cleótidos, incluyendo la enfermedad de Huntington. Las secuencias de repetición más largas son más susceptibles a la degra-
dación ambiental y no se amplifican por PCR tan bien como las secuencias más cortas.
El análisis se lleva a cabo por extracción de ADN nuclear de las células de una muestra forense de interés y la posterior ampli-
ficación por PCR de las regiones polimórficas específicas de la muestra extraída. Una vez que las secuencias han sido amplifica-
das, se resuelven por electroforesis en gel o por electroforesis capilar, lo cual permite a los analistas determinar el número de
las repeticiones de la secuencia STRen cuestión. Si el ADN se resuelve por electroforesis en gel, el ADN se puede visualizar por
tinción con plata o intercalando un colorante como bromuro de etidio o, como se hace en la mayoría de laboratorios forenses
modernos, por colorantes fluorescentes. Los instrumentos indicados para resolver fragmentos de STRpor electroforesis capilar
usan también colorantes fluorescentes. En Estados Unidos, se han seleccionado 13 loci centrales para STRcomo la base a partir
de la cual se puede generar un perfil genético individual. Estos perfiles se almacenan en bancos de datos de ADN locales, esta-
tales y nacionales como el Sistema de Índice Combinado de ADN (CODIS, por sus siglas en inglés).
Se cuenta con materiales de referencia forense. El Estándar del Perfil del ADN está compuesto por ADN humano bien carac-
terizado en dos formas: ADN genómico y ADN para ser extraído de células aplicadas en un papel de filtro.
8058 (1129) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Genotipificación / Información General USP42
CONSIDERACIONES
DE VALIDACIÓNDELENSAYO
La dificultad para reproducir y validar los ensayos existentes y emergentes de genotipificación por SNP, debido a factores
como la variación en el desempeño de los termocicladores de PCR, la eficiencia de diferentes enzimas, el personal y la presen-
cia de inhibidores de la PCR en la matriz de la muestra (discutidos en más detalle en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-
Amplificación(1127) para ensayos generales de NAT)pueden obstaculizar la implementación apropiada de las tecnologías.
Además, el uso de formatos de ensayo internos de cada laboratorio clínico a menudo dificulta las comparaciones entre labora-
torios. El diagnóstico incorrecto de una mutación genética puede tener consecuencias significativas, de manera que para di-
chos ensayos es esencial alcanzar una exactitud de 99,99% o más. Para poder determinar la exactitud de una tecnología, el
nuevo procedimiento se debe validar en múltiples muestras en las cuales se ha determinado previamente el genotipo con un
procedimiento estándar de referencia, como la secuenciación. Incluso con el procedimiento de análisis más exacto, la prepara-
ción y amplificación de la muestra y los procedimientos de detección se deben optimizar para eliminar cualquier posible ine-
xactitud.
Algunos errores de genotipificación se pueden minimizar por planeación cuidadosa de los procedimientos de laboratorio, la
inclusión de controles bien definidos y el aumento de automatización. Sin embargo, los errores debidos a los procesos usados
para genotipificación en ocasiones son difíciles de superar y es necesario tenerlos en cuenta. Los tipos de errores y la frecuencia
con la que ocurren difieren entre las diferentes estrategias. Todas las situaciones en las cuales ocurre la amplificación preferen-
cial de un alelo o sonda de hibridación no específica pueden llevar a identificaciones incorrectas en SNP. Los polimorfismos
adicionales no anticipados que están presentes en las secuencias del cebador y sonda pueden ocasionar sesgos en la amplifica-
ción, lo cual resalta la necesidad de un cuidadoso diseño y validación del ensayo usando técnicas alternativas. Las muestras
limitadas y degradadas también pueden ocasionar amplificación alélica preferencial debido a eventos de cebado casuales a ba-
jo número de copias.
Resulta preferible un resultado indeterminado, lo cual requeriría la repetición de la prueba, y no una identificación incorrecta
que proporcione resultados erróneos que se informen subsiguientemente. La realización de ensayos replicados puede también
ayudar a garantizar la exactitud. La interpretación de los datos también puede afectar la exactitud. Los resultados correspon-
dientes a las muestras salvaje, heterocigota y homocigota deben distinguirse claramente unos de otros y se les debe atribuir
una medida bien definida de incertidumbre. Los esquemas de pruebas de aptitud y los ensayos inter-laboratorio (ring-trials)
van más allá para garantizar que los ensayos individuales sean aptos para el propósito para el cual fueron previstos en las apli-
caciones específicas y que el personal que los efectúa sea competente. También es útil compartir la información técnica del
diseño del ensayo y la preparación de la muestra. La disponibilidad de paneles de referencia de muestras bien caracterizadas
ayuda al diseño y evaluación del ensayo y permite hacer comparaciones ínter-laboratorio.
(1130) TÉCNICASBASADAS EN ÁCIDOS NUCLEICOS-ENFOQUES

PARADETECTAR TRAZASDE ÁCIDOSNUCLEICOS(ANÁLISISDE ADN
RESIDUAL)
INTRODUCCIÓN
de las diversas técnicas se tratan en TécnicasBasadasen ÁcidosNucleicos-Generalidades(1125). Este capítulo cubre los proce-
dimientos analíticos usados para cuantificar el ADN residual en productos biofarmacéuticos.
La caracterización del proceso y las preocupaciones sobre los riesgos teóricos debidos a las impurezas relacionadas con el
proceso de fabricación resaltan la necesidad del análisis de ADN residual en productos biofarmacéuticos. La capacidad de un
proceso de fabricación para eliminar el ADN residual de un producto biofarmacéutico es un indicador de la calidad y uniformi-
dad del proceso y de que el proceso está bajo control. Además, las células usadas para elaborar un producto biofarmacéutico
pueden ser fuentes de una variedad de impurezas complejas, heterogéneas y potencialmente peligrosas, y entre éstas impure-
zas se cuenta el ADN de la célula huésped (host cell). Para líneas celulares continuas, el riesgo potencial del ADN residual surge
de sus actividades biológicas, principalmente infectividad y oncogenicidad. La infectividad puede deberse a la presencia de un
genoma viral infeccioso en el ADN celular del sustrato celular. La actividad de oncogenicidad del ADN residual puede surgir a
partir de su capacidad para inducir la transformación de una célula normal, lo que puede llevar a la tumorgenicidad. Aunque
las pruebas en animales han demostrado que el ADN extraño puede causar tumores o infecciones, hasta la fecha ningún infor-
me ha demostrado ese riesgo en seres humanos. Se pude considerar aceptable un contenido de ADN residual, de hasta 1O ng
de ADN residual por dosis parenteral, para el ADN que se origina de cultivos celulares de células de mamíferos, pero el conte-
nido de ADN residual aceptable puede variar dependiendo de la fuente de ADN residual y de la vía de administración del pro-
ducto. El ADN residual en los procesos biofarmacéuticos se puede evaluar de dos maneras: 1) validando la depuración (clea-
rance) durante la validación del proceso; y/o 2) monitoreando los niveles de ADN residual en el fármaco mediante pruebas de
USP42 Información General/ (1130) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Trazas 8059
rutina. Por lo general, el límite aceptado por las autoridades de salud es de 1O ng por dosis de ADN residual del huésped deri-
vado de cultivos de células de mamíferos. El grado de preocupación sobre el ADN residual puede vincularse a su fuente y a la
vía de administración, de manera que la especificación del ADN residual y el procedimiento para monitorear la depuración de
ADN para un producto determinado deben desarrollarse consultando a las agencias reglamentarias. Independientemente de si
se usan pruebas de rutina para determinar el contenido de ADN residual en un fármaco o si la depuración de ADN se demues-
tra por la validación del proceso, se requieren procedimientos analíticos para cuantificar el ADN residual. Las técnicas de ampli-
ficación de ADN, tales como la Reacción en Cadena de la Polimerasa cuantitativa (qPCR, por sus siglas en inglés), son a menu-
do las más usadas para analizar ADN residual debido a su sensibilidad superior y ventajas únicas (p. ej., alta especificidad). Se
espera que el procedimiento analítico utilizado para cuantificar el ADN residual en productos biofarmacéuticos tenga un límite
de detección muy por debajo del nivel de ADN permitido por las autoridades reglamentarias para productos biofarmacéuticos
(a menudo, 1O ng/dosis). Los ensayos basados en hibridación, proteína de unión a ADN y qPCR son típicamente las técnicas
de elección debido a que pueden cumplir con la expectativa de sensibilidad.
PRETRATAMIENTO
DE LA MUESTRA
El análisis de ADN residual requiere la cuantificación exacta de concentraciones de picogramos de ADN en mg (o cantidades
mayores) de producto, que pueden encontrarse en una variedad de matrices. En ciertas circunstancias, la muestra puede anali-
zarse sin diluir usando el procedimiento analítico elegido con una recuperación y precisión aceptables. Cuando el producto u
otros componentes de la muestra interfieren con la valoración de la muestra, la dilución de la muestra puede ser todo lo que
se necesita para superar la interferencia, siempre que el contenido de ADN especificado de la muestra diluida se mantenga
dentro del intervalo útil del procedimiento analítico. Cuando la dilución de la muestra no sea efectiva para reducir la interfe-
rencia de la valoración, puede ser necesario usar procedimientos de pretratamiento de la muestra más extensos, tales como
digestión proteolítica, disociación química o extracciones. Puede ser necesario usar una combinación de distintas etapas de
pretratamiento para eliminar la interferencia hasta un nivel aceptable. La manipulación extensa de la muestra puede llevar a
pérdidas de ADN o a la introducción de ADN del entorno, y debe ser un aspecto a considerar al usar una o más etapas de
pretratamiento de la muestra. La contaminación con ADN del entorno puede ser una preocupación solo cuando se usa un
procedimiento de determinación de ADN residual que no sea específico para la secuencia.
Las muestras que contienen proteínas pueden requerir solo digestión con proteinasa (p. ej., Proteinasa K, Pronasa) para per-
mitir que el método analítico recupere cuantitativamente el ADN residual. También es posible que el ADN esté unido a los
componentes de la muestra y que la disociación química (p. ej., tratamiento con detergentes) afecte la unión, permitiendo una
recuperación suficiente para la valoración del ADN residual. Los procedimientos de prueba de ADN residual a menudo em-
plean reactivos proteicos y utilizan un reactivo para disociación química. Estos materiales deben usarse a un nivel suficiente-
mente bajo o eliminarse a fin de no comprometer el análisis.
Puede ser necesario extraer el ADN de la muestra para eliminar las sustancias inhibitorias que ocasionan la recuperación re-
ducida de ADN. Los procedimientos de extracción por lo regular se basan en la precipitación del ADN de la muestra o de la
unión específica del ADN a una matriz (p. ej., perlas magnéticas). Históricamente, se han aplicado métodos de extracción ba-
sados en fenol y cloroformo, seguidos de precipitación con etanol, para la purificación de ADN en el área de investigación en
biología molecular. Aunque la técnica de extracción con fenol y cloroformo puede ser un pretratamiento útil para muestras de
ADN residual antes del análisis, se debe notar que la técnica de extracción con fenol y cloroformo podría no ser la mejor op-
ción para los niveles bajos de ADN típicamente hallados en las muestras de productos biofarmacéuticos. Debido a estos niveles
bajos, puede ser difícil la recuperación cuantitativa de ADN por precipitación con etanol. Por esta razón, puede ser necesaria la
utilización de una molécula coprecipitante (p. ej., glucógeno) para ayudar en la recuperación de ADN si se usa la técnica de
extracción con fenol y cloroformo. Se encuentran disponibles kits comerciales y se han usado de forma exitosa para el pretrata-
miento de muestras de ADN residual, debido a que producen una mejor recuperación del ADN residual en el ensayo. Por
ejemplo, algunos kits usan un caotropo (yoduro de sodio) y un detergente (N-lauroilsarcosinato de sodio) para romper la aso-
ciación del ADN con componentes de la muestra. El ADN se coprecipita entonces usando glucógeno como molécula copreci-
pitante, en presencia de isopropanol. La extracción de ADN de la muestra, basándose en la unión a una matriz sólida, puede
encontrarse en varios formatos. Uno de los formatos más populares emplea perlas magnéticas, en el cual las perlas se agregan
a una muestra con una solución de unión para capturar el ADN de la muestra en las perlas. Posteriormente, las perlas son
capturadas y retenidas en el tubo de muestra usando una gradilla magnética, mientras que el sobrenadante que contiene la
sustancia interferente es retirado y desechado. Las perlas se lavan repetidamente usando una gradilla magnética y una solución
de lavado. Finalmente, el ADN se eluye de las perlas para la valoración usando una solución amortiguadora de elución, retiran-
do las perlas de la preparación muestra usando la gradilla magnética.
La manipulación de la muestra implicada en el pretratamiento puede reducir la recuperación del ADN residual o introducir
ADN ambiental en la muestra. Se debe tener mucho cuidado durante las manipulaciones de las muestras para evitar pérdidas
de ADN o contaminación. Es una práctica común incorporar al ensayo de ADN residual muestras a las que se ha agregado una
cantidad conocida de ADN blanco (spiked samples). La muestra a la que se ha agregado una cantidad conocida de ADN blan-
co no debe confundirse con el control positivo interno (IPC, por sus siglas en inglés), el cual por lo regular no es un ADN blan-
co que se agrega después de la etapa de pretratamiento de la muestra para detectar la presencia de inhibidores de Reacción
en Cadena de la Polimerasa y para evaluar la amplificación de ADN durante el análisis. El control positivo interno también pue-
de introducirse antes de la extracción para mejorar el control de esta etapa. Para garantizar que el ensayo produzca resultados
8060 (1130) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Trazas/ Información General USP42
aceptables se aplica a menudo a los ensayos de ADN residual una recuperación de 50%-150% de la cantidad del ADN blanco
agregado. Cuando las características de la muestra (p. ej., efectos de la matriz, método de preparación de la muestra) hagan
que resulte impracticable conseguir un criterio de aceptación para la recuperación de 50%-150%, una práctica también acep-
table consiste en corregir la concentración de ADN observado usando el porcentaje de recuperación del ADN agregado.
ENSAYOSDE ADN RESIDUALBASADOS EN HIBRIDACIÓN

Los primeros ensayos de ADN residual se basaron en técnicas de hibridación del ADN, en las que una sonda de ADN creada
a partir del ADN de la célula huésped detecta y cuantifica la cantidad de ADN complementario presente en el producto en
análisis. El ADN de doble cadena de la célula huésped consta de dos cadenas complementarias de ADN que se mantienen
unidas por enlaces de hidrógeno. ElADN de doble cadena en la muestra de prueba se desnaturaliza a cadenas individuales y se
inmoviliza sobre una membrana, por lo general de nitrocelulosa o nailon. La muestra se analiza usando ADN de la célula hués-
ped que ha sido desnaturalizado y marcado. La sonda de ADN de la célula huésped no consiste de una secuencia específica
sino que se prepara por un procedimiento de marcado aleatorio durante el cual se introduce una marca radioactiva o fluores-
cente dentro del ADN de la célula huésped para producir la sonda. Cuando la sonda de ADN marcado y desnaturalizado se
pone en contacto con el ADN inmovilizado en la membrana, la sonda se une con las secuencias complementarias del ADN de
la célula huésped. Si la sonda es radioactiva, la membrana se coloca contra una película de autorradiografía durante un tiempo
suficiente, después se revela y se observa una mancha negra donde el ADN en análisis se encontraba inmovilizado. El nivel de
hibridación puede medirse usando un sistema de detección de imágenes por fosforescencia. Si la sonda tiene una marca fluo-
rescente, la intensidad de las manchas se determina usando un sistema de detección de imágenes por fluorescencia. La intensi-
dad de la mancha es proporcional a la cantidad de sonda que se hibridizó al ADN en análisis y por lo tanto es proporcional a la
cantidad de ADN residual en la muestra. La intensidad de la mancha se puede comparar visualmente con la intensidad de las
manchas que corresponden a una curva estándar produciendo resultados semicuantitativos (es decir, cuantificación visual) o la
intensidad se puede determinar usando un instrumento (p. ej., densitómetro) para crear un valor cuantitativo que se compara
con los valores obtenidos a partir de la curva estándar.
ENSAYOSDE ADN RESIDUALBASADOS EN PROTEÍNASDE UNIÓN A ADN

Se encuentra disponible comercialmente instrumental para la cuantificación de ADN residual en productos biofarmacéuticos.
El instrumental requiere reactivos que usen proteínas de unión a ADN y anticuerpos dirigidos contra ADN en un procedimiento
analítico de cuatro etapas.
1. En la primera etapa el ADN se desnaturaliza a ADN de cadena simple por calentamiento de la muestra. El ADN desnatura-
lizado se mezcla con un reactivo único que contiene proteína de unión a ADN conjugada con estreptavidina y un anti-
cuerpo monoclonal anti-ADN conjugado con ureasa. La proteína de unión a ADN y el anticuerpo monoclonal son especí-
ficos para el ADN de cadena simple pero no tienen especificidad de secuencia. Esta primera etapa, al realizarse en fase
líquida, facilita la formación de complejos de reacción que contienen ADN, estreptavidina y ureasa.
2. Durante la segunda etapa, la muestra se filtra a través de una membrana biotinilada que se une a la estreptavidina y cap-
tura los complejos sobre la membrana, la cual se lava para retirar cualquier reactivo que no esté unido a la misma.
3. Durante la tercera etapa, la membrana se inserta en un sensor del instrumento, donde la ureasa del complejo de ADN
reacciona con una solución de urea en el sensor, produciendo amoníaco y un cambio en el pH que se detecta usando un
sensor potenciométrico fotosensible (LAPS,por sus siglas en inglés). El cambio en el pH se correlaciona directamente con
la cantidad de ADN en la muestra.
4. En la cuarta etapa, los datos crudos del instrumento se analizan usando el software apropiado para determinar el conteni-
do de ADN residual en la muestra.
TÉCNICASDE REACCIÓNEN CADENADE LA POLIMERASA

La qPCR en tiempo real es un procedimiento que está bien adaptado para procesar rápidamente un gran número de mues-
tras y tiene aplicaciones en muchas áreas de la fabricación de productos biofarmacéuticos (p. ej., detección de número de co-
pias de ADN, detección de virus). La técnica puede cuantificar la cantidad de una secuencia blanco de ácido nucleico en el
ADN de una gran variedad de muestras. La sonda y los cebadores de ADN usados en el análisis son claves para el procedimien-
to. El método más común de qPCR para la detección de esta amplificación se denomina ensayo de nucleasa 5'. En este forma-
to, la sonda tiene un colorante indicador fluorescente en un extremo y un colorante extintor en el otro extremo. A la reacción
se le agrega también un par de cebadores de ADN. Durante la reacción de amplificación, una ADN polimerasa termoestable
inicia la síntesis del ADN donde el cebador de ADN se une a la muestra de ADN de cadena simple (molde) y se mueve a lo
largo de la muestra de ADN, sintetizando nuevo ADN complementario. Mientras se mueve a lo largo del molde de ADN, la
ADN polimerasa I corta cualquier ADN complementario en el camino. Si la ADN polimerasa I encuentra la sonda de ADN mar-
cada, la ADN polimerasa I cortará la sonda. El colorante indicador se libera dentro de la solución y, en ausencia del extintor, se
mide la fluorescencia resultante. La repetición del ciclo de reacción resulta en una amplificación de la señal de fluorescencia. El
número de ciclos requeridos para que la medición de fluorescencia exceda un valor umbral está correlacionado con la cantidad
T
USP42 Información General/ (1130) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Trazas 8061
inicial de ADN residual en la muestra. Al comparar la fluorescencia obtenida a partir de una muestra con una curva estándar,
los analistas pueden cuantificar el ADN residual en la muestra.
Estrategias de Detección Alternativas
Se han desarrollado diversas estrategias innovadoras de detección, las cuales se comercializan además de las descritas ante-
riormente. Algunas de las más comunes son las siguientes:
1. La intercalación de colorantes fluorescentes de cianina, la cual se produce después de la unión del colorante al ADN de
doble cadena. La cantidad de colorante incorporado es proporcional a la cantidad de amplicón blanco generado. Estos
colorantes son económicos y fáciles de usar. La desventaja de esta técnica es la falta de una sonda específica para conferir
especificidad de secuencia por encima de la lograda por los cebadores, y el colorante también se unirá de cierta forma al
ADN de una cadena y a las moléculas de ARN. En consecuencia, los dímeros de cebadores o productos no específicos
pueden afectar la cuantificación. Sin embargo, es posible verificar la especificidad del sistema corriendo una curva de fu-
sión al final de la corrida de PCR, basándose en el principio de que cada producto tiene una temperatura de disociación
diferente y dependiente del tamaño y contenido base.
2. Existen otras sondas sensibles que contienen una estructura de tallo-bucle con un fluoróforo y un extintor en sus extremos
5' y 3', respectivamente. Eltallo por lo general tiene seis bases de longitud, que consisten principalmente de citosinas y
guaninas, y mantiene la sonda en la configuración de horquilla. La secuencia de "tallo" mantiene el fluoróforo y el extin-
tor en la cercanía, pero solo en ausencia de una secuencia complementaria a la secuencia de "bucle". En presencia de una
secuencia complementaria, la sonda se despliega e hibridiza a la secuencia blanco, lo que lleva a la separación del fluoró-
foro y el extintor, y la sonda fluoresce. La cantidad de señal es proporcional a la cantidad de secuencia de amplicón blan-
co. El aumento en la fluorescencia que ocurre es reversible, debido a que no hay escisión de la sonda. También es posible
diseñar la estructura de tallo para agregar especificidad a este tipo de sonda. Sin embargo, estas sondas a menudo son
costosas y la señal puede ser débil debido a la posible separación física limitada entre el fluoróforo y el extintor.
3. Una variación del segundo ejemplo descripto usa una secuencia de ácido nucleico de cadena simple que contiene los ce-
badores de PCR específicos, la sonda específica con una cola de tallo-bucle que separa un fluoróforo y un extintor, y un
grupo de bloqueo. La cola de tallo-bucle se separa de la secuencia de cebador de PCR mediante un "bloqueador de PCR",
una modificación química que evita que la polimerasa copie la secuencia de tallo-bucle del cebador. Después de la exten-
sión del cebador durante la amplificación de la PCR, la secuencia de la sonda específica es capaz de unirse a su comple-
mento dentro de la misma cadena de ADN. Este evento de hibridación abre el bucle de la horquilla de modo que la fluo-
rescencia ya no se extingue, y se observa un incremento en la señal. El acoplamiento covalente de la sonda al amplicón
diana garantiza que cada sonda tenga una región de ADN diana cerca a la cual se pueda unirse. No se requiere la escisión
enzimática, ni tampoco una etapa separada de hibridación de la sonda, con lo que se reduce el tiempo requerido para la
generación de señal. Esto puede resultar en señales más fuertes y un ruido menor con ciclos más rápidos; sin embargo,
estas sondas pueden ser bastante costosas y complicadas en su diseño.
4. Las sondas fluorogénicas de unión al surco menor son sondas lineales cortas que tienen un dominio de unión al surco
menor con un extintor no fluorescente en el extremo 5' y un fluoróforo en el extremo 3'. El dominio de unión al surco
menor evita que la actividad de exonucleasa escinda la sonda. La extinción sucede cuando el plegamiento aleatorio de la
sonda en la forma libre acerca al extintor y al fluoróforo. La sonda se estira cuando se une a su diana y se reduce la extin-
ción, lo que genera un incremento en la señal fluorescente proporcional a la cantidad de amplicón acumulada. Estas son-
das también son costosas y pueden producir una relación señal-ruido baja.
Ensayo de ADN Residual Basado en PCR Cuantitativa Multiplex
Una evolución de la qPCR es la PCR cuantitativa multiplex, en la que se introducen diversos pares de cebadores y las sondas
correspondientes en el medio de reacción para detectar múltiples dianas de forma simultánea. Los beneficios incluyen un pro-
cesamiento mayor y un mejor control de resultados falsos-negativos, mientras que las desventajas provienen de las interferen-
cias a la amplificación y la detección, según se describe en TécnicasBasadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127). Una de
las aplicaciones de esta técnica es una qPCR dúplex, donde la introducción de un ADN exógeno, denominado control positivo
interno (ver la sección Pretratamiento de la Muestra anterior), mejora la confianza en la exactitud del análisis cuando se amplifi-
ca de forma apropiada. La qPCR multiplex no se usa tan comúnmente como qPCR de un una diana para valorar el ADN resi-
dual de la célula huésped en productos biofarmacéuticos.
PUNTOSA CONSIDERARPARA ELANÁLISISDE ADN RESIDUAL

Durante el desarrollo de un ensayo de ADN residual, se debe considerar cómo se usará el ensayo, la estructura del ADN
disponible (p. ej., longitud del fragmento) y asuntos reglamentarios. El costo del análisis puede ser significativo y debe tenerse
en cuenta al evaluar un formato para el ensayo. Además, se deben considerar los aspectos ambientales, de salud y seguridad.
Tradicionalmente, los ensayos de hibridación se efectuaban usando ADN marcado con fósforo (32 P) y autorradiografía. Dado
que el 32 P decae rápidamente, las sondas preparadas con 32 P tienen una vida útil limitada y las precauciones necesarias para
8062 (11 30) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Trazas / Información General USP42
manipular material radioactivo pueden ser engorrosas. Estos problemas con el marcado con 32 P pueden hacer que la marca-
ción de la sonda de hibridación con fluorescencia sea una opción preferible. Si el ensayo de hibridación se evalúa visualmente,
este proceso representará un ensayo semicuantitativo, pero si la intensidad de las manchas se determina usando un densitó-
metro u otro sistema de imágenes los resultados pueden ser cuantitativos. Los ensayos con proteína de unión a ADN y qPCR
arrojan resultados cuantitativos. Los ensayos cuantitativos se prefieren por lo general sobre los ensayos semicuantitativos (p.
ej., métodos basados en hibridación más antiguos) porque los resultados se consideran más exactos y precisos, lo cual permite
monitorear y controlar mejor el proceso. Debido a la interferencia de la matriz de la muestra, a menudo se requiere un paso de
pretratamiento de la muestra para obtener resultados exactos y reproducibles. Los pasos de pretratamiento pueden influir en
la recuperación de ADN, de modo que, por lo general, es necesario diseñar el ensayo incluyendo un control de recuperación
con una cantidad conocida de ADN agregado (spike-recovery control) y un criterio de aceptación para garantizar el desempe-
ño del ensayo.
Los controles internos se preparan usualmente en el laboratorio y se califican por espectroscopía ultravioleta, usando técni-
cas estándar empleadas en biología molecular para determinar el contenido y pureza del ADN. El ensayo de hibridación usa
ADN genómico y/o de vector, marcado aleatoriamente a lo largo del ADN, como sonda de hibridación. Por esta razón, el ensa-
yo de hibridación es específico para la fuente de ADN, pero no es específico para una secuencia en particular. Se puede sinteti-
zar una sonda, específica para una secuencia determinada, para usarla en el ensayo de hibridación si se requiere este grado de
especificidad. El ensayo de ADN residual con proteína de unión a ADN no es específico de la secuencia y por lo tanto no es
específico para el ADN de la célula huésped. Por esa razón, el personal de laboratorio debe evitar la contaminación de las
muestras para este ensayo con ADN ambiental antes de la desnaturalización del ADN; de lo contrario, los resultados de ADN
residual podrían presentar valores falsamente elevados. La sonda usada en los ensayos de qPCR tiene la ventaja de ser específi-
ca para una secuencia, pero esto crea algunos desafíos especiales para el desarrollo de un ensayo de ADN residual por qPCR.
La secuencia específica de la qPCR debe ser una secuencia estable dentro de una región adecuada del ADN. La recuperación
de la secuencia diana debe representar consistentemente la recuperación de todo el ADN residual. Un proceso de fabricación
de un producto biofarmacéutico puede implicar típicamente operaciones que corten el ADN en fragmentos más pequeños y
esto se debe tener en cuenta al seleccionar un ensayo. Existen procedimientos para determinar si los fragmentos de ADN en
una muestra son demasiado pequeños para permitir la recuperación del ADN residual con un ensayo determinado. Al trasla-
darse de una técnica de ensayo de ADN a otra, es crítico tener un entendimiento cabal del ADN analito. Algunos ensayos pue-
den detectar ADN de cadena simple y de doble cadena, mientras que algunos solo pueden detectar ADN de doble cadena (p.
ej., algunos ensayos de unión con colorantes fluorescentes). Existen ensayos que no son específicos para una secuencia, y
aquellos ensayos que son específicos para una secuencia pueden verse influenciados por el número de copia de la secuencias
dianas presentes en el ADN. Existen ensayos que requieren dos o más moléculas de anticuerpos para unirse al fragmento de
ADN (p. ej., ensayo de ADN residual basado en proteína de unión a ADN) y si los fragmentos de ADN son demasiado peque-
ños y están presentes en cantidad suficiente, pueden saturar los reactivos e inhibir el ensayo (efecto gancho).
Aunque las preocupaciones de seguridad relacionadas con las impurezas de ADN residual no son tan prominentes como an-
tes, las concentraciones de ADN residual en cualquier bioproceso siguen siendo un atributo de calidad clave y proveen una
caracterización valiosa del proceso de fabricación.
(11 32) MEDICIÓN DE PROTEÍNARESIDUALDE CÉLULASHUÉSPEDEN

PRODUCTOSBIOFARMACÉUTICOS
1. INTRODUCCIÓN
Y ALCANCE
Muchos productos medicinales se producen a través de tecnología recombinante mediante una célula huésped (p. ej., bac-
terias, levaduras o líneas celulares de mamíferos, insectos o plantas). Durante la fabricación de dichos productos, cierta canti-
dad de material de las células huésped que no forman parte del producto será inevitablemente introducida en la corriente del
proceso. Este proceso resulta en una mezcla del producto deseado y de impurezas derivadas de la célula huésped, incluyendo
proteínas de células huésped (HCP, por sus siglas en inglés) y otras impurezas relacionadas con el proceso que serán el objetivo
de la depuración mediante el bioprocesamiento.
Las proteínas residuales de células huésped tienen el potencial de afectar la calidad, seguridad y eficacia del producto; por lo
tanto, la cantidad de proteínas de células huésped debe ser baja. Los procesos de purificación del producto deben optimizarse
para eliminar de manera uniforme la mayor cantidad posible de proteínas de células huésped, con el propósito de producir un
producto tan puro como sea posible.
La preocupación principal con las proteínas de células huésped en productos biofarmacéuticos es su potencial de inducir
anticuerpos anti-HCP que podrían inducir un efecto clínico en los pacientes. Además, las proteínas de células huésped pueden
actuar como adyuvantes, lo que puede inducir anticuerpos antifármacos que pueden afectar la seguridad o la eficacia del me-
dicamento. El capítulo general USPEnsayosde Jnmunogenicidad-Diseño y Validaciónde lnmunoensayos para DetectarAnticuer-
posAntifármacos(1106), presenta una discusión más extensa de la inmunogenicidad y su efecto sobre los estudios preclínicos
USP42 Información General/ (1132) Proteína Residual de Células Huésped 8063
y clínicos. Las proteínas de células huésped también pueden tener un efecto directo sobre la calidad del producto mismo. Por
ejemplo, las proteínas proteolíticas de células huésped, incluso en cantidades diminutas, pueden escindir el producto proteico
deseado con el paso del tiempo, reduciendo o eliminando la potencia biológica o alterando la estabilidad.
Este capítulo se enfoca en los inmunoensayos de proteínas de células huésped para productos terapéuticos recombinantes.
Este capítulo no trata productos tales como vacunas o terapias genéticas, celulares o tisulares, aunque los principios generales
presentados podrían ser aplicables a la medición de proteínas de células huésped en dichos productos. El diseño y la validación
de inmunoensayos de proteínas de células huésped implica retos únicos y significativos debido a: 1) la amplia variedad de pro-
teínas de células huésped posibles en productos medicinales; 2) el uso general de reactivos de anticuerpos policlonales para
detectarlos; 3) la falta de estándares con una correspondencia exacta para cuantificación; 4) en algunos casos, un efecto consi-
derable de los efectos de dilución de la muestra; y 5) las limitaciones inherentes para medir especies individuales de proteínas
de células huésped.
El capítulo incluye estrategias de desarrollo de ensayos a través del ciclo de vida del desarrollo del producto y del proceso, y
describe enfoques para demostrar que el ensayo es apto para su uso (p. ej., ilustrar la depuración por operación unitaria de las
proteínas de células huésped, liberación de lote). Debido a la complejidad de los inmunoensayos de proteínas de células hués-
ped, se requiere el desarrollo y la caracterización cuidadosos de reactivos críticos, en particular del inmunógeno usado para
inducir los anticuerpos anti-HCP, los reactivos de anticuerpos y el estándar de proteínas de células huésped del ensayo. Debido
a que el análisis de proteínas de células huésped es una parte esencial del desarrollo del proceso y del control de calidad del
producto, el análisis de proteínas de células huésped también se trata en conjunto con los requisitos reglamentarios y otras
consideraciones para proveer pautas sobre la estrategia general de control para proteínas de células huésped. A continuación
se presenta una breve descripción del capítulo general:
1. Introduccióny Alcance
1.1 Consideraciones sobre Fabricación,Caracterizacióny Uniformidad
2. Terminología
3. Métodos de lnmunoensayode Proteínasde CélulasHuésped
3. 7 Ciclode Desarrollodel Ensayo
3.2 Desarrolloy Caracterizaciónde Reactivosde Proteínasde CélulasHuésped
3.3 Desarrollode Métodosde lnmunoensayoy Calificaciónde Aptitud para su Uso
4. Validaciónde Métodosde lnmunoensayode Proteínasde CélulasHuésped
4. 7 Exactitud
4.2 Sensibilidade Intervalo del Ensayo
4.3 Linealidadde la Muestra
4.4 Especificidad
5. Tecnologíasde Apoyopara la Detección,Identificacióny Mediciónde ProteínasResidualesde CélulasHuésped
5.1 Consideraciones para Métodos Electroforéticos
5.2 Consideraciones para Métodos de TransferenciaWestern(Western8/ot)
5 .3 Consideraciones para Métodos Cromatográficosy Proteómicos
5.4 ComentariosFinalessobre Tecnologíasde Apoyopara Proteínasde CélulasHuésped
6. Usode lnmunoensayosde Proteínasde CélulasHuéspedpara Desarrollo,Caracterizacióny Validacióndel Proceso
6.1 Ensayospara Proteínasde CélulasHuéspedIndividua/es
6.2. Estrategiade Control
7. Resumeny Conclusiones
8. Bibliografía
1.1 Consideraciones sobre Fabricación, Caracterización y Uniformidad

Se usan diferentes sistemas de expresión basados en células para fabricar productos medicinales, tales como bacterias (Esche-
richia coli, Pseudomonasfluorescens),levaduras (Saccharomyces cerevisae,Pichiapastoris), células de mamíferos (p. ej., ovario de
hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), línea celular NSO de mieloma de ratón, entre otros), células de insectos (células
de Spodopterafrugiperdainfectadas con baculovirus) y células vegetales (tabaco, Arabidopsis,arroz). El perfil particular de las
proteínas de células huésped es único y específico de cada tipo de células huésped, en condiciones de cultivo y procesos de
fabricación específicos. Las proteínas de células huésped puede variar en pi (-3-11) e hidrofobicidad, y presentan una amplio
intervalo de pesos moleculares (de -5 kDa a al menos -250 kDa), dependiendo de la célula huésped y del proceso de fabrica-
ción usado. El número de proteínas de células huésped en muestras del proceso previo a la purificación (upstream) puede ir
desde varios cientos hasta más de mil proteínas, dependiendo de la célula huésped y de las condiciones de cultivo. Aunque
históricamente se ha usado una gran cantidad de huéspedes celulares en la fabricación biofarrnacéutica, la mayor experiencia
se ha obtenido usando E. co/i y las células de mamíferos CHO, NSO, SP2/0, y la línea celular HEK293 de riñón embriónico
humano. La guía provista en este capítulo se basa principalmente en la experiencia con estos sistemas de expresión; sin embar-
go, los principios generales se aplican ampliamente a cualquier sistema de célula huésped.
En células de mamíferos, la proteína recombinante por lo general se secreta de las células al fluido del cultivo celular (CCF,
por sus siglas en inglés), junto con muchas de las proteínas de las células huésped. Sin embargo, se ha observado que el tráfico
de proteína intracelular puede no proceder de manera normal en los cultivos de producción. Por ejemplo, las proteínas que
8064 (1132) Proteína Residual de Células Huésped / Información General USP42
por lo regular se asocian con organelas intracelulares, tales como lisosomas, pueden encontrarse en el fluido del cultivo celular
de cultivos celulares altamente viables, debido a que los clones han sido seleccionados para la máxima exportación de proteí-
na. Además, a medida que mueren algunas de las células, sus proteínas intracelulares solubles son liberadas en el fluido del
cultivo celular. Algunas de las operaciones de cosecha también lisan las células; por lo tanto, el fluido del cultivo celular cose-
chado resultante por lo regular contiene proteínas de células huésped secretadas e intracelulares. Mientras esta mezcla de pro-
teínas se incuba en el fermentador, pueden ocurrir cambios adicionales en la población de proteínas de células huésped, por
ejemplo, como resultado de la actividad enzimática (p. ej., proteinasas o sialidasas).
Los ensayos de proteínas de células huésped proveen información importante sobre la composición del material que ingresa
en el proceso de recuperación a partir de la purificación (downstream) y la forma en que cada paso de purificación afecta la
depuración de proteínas de células huésped. En algunos casos, las proteínas de células huésped pueden incluso unirse, y co-
purificarse, con algunos productos. La caracterización del proceso y los estudios de validación son necesarios para mostrar qué
pasos del proceso eliminan las proteínas de células huésped y también para demostrar la robustez de estos pasos para eliminar
de manera uniforme las proteínas de células huésped. Como tal, los ensayos de proteínas de células huésped son una parte
esencial del desarrollo del proceso de purificación y ayudan a asegurar la uniformidad en la fabricación. Por último, pueden
requerirse ensayos de proteínas de células huésped reproducibles y confiables para medir las proteínas de células huésped resi-
duales remanentes en el fármaco usado para fabricar el medicamento que se administra al paciente. Los niveles de proteínas
de células huésped deben medirse en: 1) lotes preclínicos usados en la evaluación toxicológica, 2) todos los lotes durante el
desarrollo clínico y 3) muestras de validación del proceso a partir del proceso de fabricación final. Después de la aprobación,
puede requerirse el monitoreo de proteínas de células huésped como un elemento del sistema de control. Las secciones subsi-
guientes de este capítulo tratan en mayor detalle el uso de ensayos de proteínas de células huésped en la validación del proce-
so y en un sistema de control que cumpla con las buenas prácticas de fabricación (BPF).
2. TERMINOLOGÍA
Para ayudar a establecer la nomenclatura común en la literatura y con las autoridades reglamentarias, la Tabla1 lista térmi-
nos comunes con sus definiciones (indicando la forma en que se usan en este capítulo) además de los sinónimos usados histó-
ricamente. Se debe tener en cuenta que el término "plataforma" indica que dentro de una empresa se usa el mismo conjunto
de estándares y reactivos para analizar una variedad de productos fabricados a partir del mismo sistema de expresión (p. ej.,
células de CHO) cultivadas en condiciones similares en el proceso previo a la purificación (upstream). En el caso de las valora-
ciones en plataforma de proteínas de células huésped (plataforma HCP), los anticuerpos contra las proteínas de células hués-
ped se obtienen a partir de animales inmunizados con antígenos de proteínas de células huésped generados mediante un pro-
ceso común previo a la purificación (upstream) que es aplicable a una gran cantidad de productos, incluso si las purificaciones
realizadas a partir del proceso de purificación (downstream) son diferentes. Este enfoque permite aprovechar el conocimiento
de productos anteriores. Por consiguiente, la justificación de que un ensayo es adecuado para un nuevo producto, usando el
mismo sistema de expresión y condiciones de proceso previo a la purificación (upstream) comunes, es a menudo relativamen-
te simple.
El inmunógeno de las proteínas de células huésped usado para generar la plataforma de anticuerpos anti-HCP y a menudo
usado como estándar de calibración del ensayo está compuesto, por diseño, por un conjunto amplio de proteínas de las célu-
las huésped. Por el contrario, el calificativo "específicos del proceso" indica que el inmunógeno/estándar ha sido preparado a
partir de un conjunto de proteínas de células huésped único para un proceso determinado (un proceso de cultivo celular pre-
vio a la purificación (upstream) único o un proceso de purificación único a partir de la etapa de purificación (downstream)).
Los ensayos específicos del proceso tienen, por lo tanto, una utilidad limitada, y cada una debe calificarse cabalmente para
cada proceso. Los inmunógenos y estándares de calibración específicos del proceso son, intencionalmente, más estrechos y
específicos para un proceso determinado. Los ensayos "disponibles comercialmente" producidos por proveedores a menudo
se derivan de una combinación de cepas y procedimientos de recolección/purificación, y dichos ensayos están destinados para
una aplicación más amplia; sin embargo, estos ensayos disponibles comercialmente no están específicamente diseñados para
la línea celular patentada por un fabricante dado, y los usuarios no tienen control sobre la disponibilidad del reactivo ni la uni-
formidad entre lotes.
Tabla 1. Termlnología asociada con las proteínas de células huésped
Término Definición Sinónimos históricos
Disponible Disponible al público para venta comercial; por lo regular, se trata de una combinación Genérico
comercial- de aislados de proceso previo a la purificación (upstream) y anticuerpos correspondien-
mente tes fabricados por el proveedor y Que se vende como reactivos o kits.
Plataforma El mismo conjunto de un estándar de proteínas de célula huésped y anticuerpos es desa- Personalizado, desarrollado internamente,
rrollado con una cepa de células huésped patentada por la compañía y se usa amplia- de patente
mente dentro de un tipo (p.ej, CHO) en diversos productos cuando las condiciones del
proceso previo a la purificación (upstream) son similares.
ª En algunos casos, se realizan ambas purificaciones, por lo regular primero con proteína A o G y luego por afinidad con las proteínas de células huésped.
b Aunque las ppm se han usado históricamente, dicho término no se recomienda debido a que se usa para reflejar la masa por volumen unitario para otros tipos
de pruebas. Se reconoce que la unidad ng se usa convencionalmente como un valor derivado de la interpolación de una curva estándar de proteínas de célula
huésped (en unidades de ng/ml), en donde la señal refleja la unión de anticuerpos, a diferencia de la medición de concentración de proteínas terapéuticas, que
no estrictamente refleja la masa de proteínas de células huésped que pueden estar presentes.
USP42 InformaciónGeneral/ (1 132) ProteínaResidualde CélulasHuésped8065
Tabla 1 Terminología asociada con las proteínas de células huésped (Continuación)

Término Definición Sinónimos históricos
Específico Ensayodiseñado a partir de materialen donde el proceso de cultivo previo a la purifica- Personalizado,desarrolladointernamente,
del proceso ción (upstream) se desvíade manera significativade la plataforma. específicodel producto, de patente
previo a la Estopor lo general se presenta antes de cualquier purificacióny puede aplicarsea más
purificación de un producto si estos parámetros son similares.
(upstream)
Específico Ensayodiseñado a partir de materialesobtenidos de operaciones unitariasdel proceso a Personalizado,desarrolladointernamente,
del proceso partir de la purificación(downstream) que se usan para enriquecer la población de pro- específicodel producto, de patente
a partir de teínas de célula huésped.
la purifica- Estopuede aplicarsea más de un producto si estos parámetros son similares.Estose usa
ción raramente en la actualidad y no se recomienda excepto para algunos productos con
(downs- procesamiento a partir de la purificación(downstream) excepcional.
tream)
Ensayopara Ensayoque usa un estándar compuesto de una proteína de célula huésped conocida, in- Ensayode un analito individualo Personali-
una proteí- dividua!e identificaday sus anticuerpos específicos. zado, específicopara proteínas de células
na indivi- huésped
dual de cé-
lula hués-
ped
Cobertura Describela evaluacióndel nivelde reconocimientoque una población de anticuerpos po-
liclonaleshace sobre la población de proteínas de célulashuésped.
Laevaluaciónde cobertura puede realizarsesobre la población de proteínas de células
huésped usada como el antígeno de proteínas de células huésped o a partir del cultivo
de producción del producto.
Calificación Demostraciónde la aptitud de los métodos analíticos(incluyendolos reactivosusados en
estos métodos) para su aplicaciónprevistaa un proceso y muestras del proceso determi-
nados.
Purificación Purificaciónpor afinidad de anticuerpos con ProteínasA o G inmovilizadasª Cromatografíade afinidad
por afinidad
con proteí-
nas A o G
Purificación Purificaciónpor afinidadde anticuerpos usando proteínas de célula huésped inmoviliza- Cromatografíade afinidad, cromatografía
por afinidad das (antígeno)ª de inmunoafinidad
de proteí-
nas de célu-
las huésped
Célula nula Se refierea la cepa celularusada para la producción que no contiene los elementos gené- Célula parental, blanco o con transfección
ticos específicosdel producto; incluyecélulas parentales sin transfectary célulastrans- simulada
fectadas con el vector de expresión pero sin el qen del producto.
ng/mg Cantidad numérica (relación)de proteínas de célula huésped por producto, en la que ng ppmb
representa la masa de las proteínas de célula huésped y mg representa la masa del pro-
dueto.
Se calcula dividiendo la concentración de proteína de célula huésped (ng/ml) por la
concentración de proteína del producto (mq/ml).
ª En algunoscasos,se realizanambaspurificaciones,por lo regularprimerocon proteínaA o G y luegopor afinidadcon lasproteínasde célulashuésped.
b Aunquelasppm se han usadohistóricamente,dicho términono se recomiendadebido a que se usapara reflejarla masapor volumen unitariopara otrostipos
de pruebas.Se reconoceque la unidadng se usa convencionalmente como un valorderivadode la interpolaciónde una curvaestándarde proteínasde célula
huésped(en unidadesde ng/ml), en donde la señalreflejala uniónde anticuerpos,a diferenciade la mediciónde concentraciónde proteínasterapéuticas,que
no estrictamentereflejala masa de proteínasde célulashuéspedque pueden estar presentes.
3. MÉTODOSDE INMUNOENSAYO
DE PROTEÍNASDE CÉLULASHUÉSPED
Los métodos de inmunoensayo se basan en anticuerpos que reconocen, con la mayor amplitud posible, la población de pro-
teínas de células huésped que ingresan en el proceso de purificación (downstream); por lo tanto, el inmunoensayo tipo sánd-
wich, diseñado con anticuerpos policlonales, es eficaz para el monitoreo y cuantificación de proteínas de células huésped. Este
formato de ensayo ofrece una combinación de alta sensibilidad, especificidad, rendimiento, potencial de automatización, res-
puesta rápida, resultados cuantitativos y bajo costo por ensayo imposible de igualar por otra tecnología de ensayo actualmente
disponible. Otros formatos de inmunoensayo (p. ej., inmunoensayos competitivos) pueden o no ser adecuados debido a que
no cuentan con la especificidad o la sensibilidad lograda por el formato tipo sándwich. Aunque estos métodos resultan en un
valor individual de proteínas de célula huésped para un lote dado, el número puede proveer un mayor peso a las proteínas de
células huésped cuyos anticuerpos de alta afinidad están presentes en los reactivos-y un peso bajo o nulo a las proteínas de
células huésped que no son reconocidas, o que son reconocidas por anticuerpos de baja afinidad en el ensayo. Por estas razo-
nes, a menudo se requieren mediciones ortogonales de pureza del producto. La sección 5. Tecnologíasde Apoyopara la Detec-
ción, Identificacióny Medición de ProteínasResidualesde CélulasHuéspedprovee más detalles sobre estos métodos.
8066 (11 32) Proteína Residual de Células Huésped / Información General USP42
Los principios y el diseño básicos de los inmunoensayos se tratan en el capítulo Métodosde PruebasInmunológicas-Ensayo
por lnmunoadsorciónLigadoa Enzimas(EL/SA)(1103) de la USP.Elformato más comúnmente usado para el análisis de proteí-
nas de célula huésped es el inmunoensayo tipo sándwich con sistemas de detección tales como colorimétrico, electroquimiolu-
miniscente, quimioluminiscente, radioactivo, entre otros. Los inmunoensayos homogéneos, incluidos ensayos competitivos, en
los que todos los reactivos se combinan de una sola vez y la unión ocurre en un solo paso sin lavado, pueden ser problemáti-
cos debido al exceso de antígenos que puede generar problemas de insuficiencia de anticuerpos (tratado más adelante en este
capítulo); por lo tanto, estos formatos deben usarse con cuidado. Por lo general se prefiere el formato de inmunoensayo tipo
sándwich heterogéneo descrito en el capítulo (1103), debido a que el intervalo dinámico y la sensibilidad pueden verse reduci-
dos en el formato homogéneo. Los formatos, con sus ventajas y desventajas, se tratan con mayor profundidad en el capítulo
Métodosde PruebasInmunológicas-ConsideracionesGenerales(1102). El análisis de datos por lo general se realiza con un ajuste
no lineal de la curva sigmoidea generada por un amplio intervalo de concentraciones estándar, aunque algunos análisis pue-
den enfocarse en el extremo inferior de la curva para una mayor sensibilidad.
3.1 Ciclode Desarrollodel Ensayo

La Figura 1 ilustra los planes comunes de desarrollo de ensayos, dependiendo de los reactivos disponibles en diversas etapas.
Se requieren menos estudios puente cuando: 1) se encuentran disponibles reactivos de plataforma y 2) los procesos previos a
la purificación (upstream) son históricamente uniformes. La Figura 1A ilustra un escenario en el que no se encuentran disponi-
bles métodos de plataforma, y se usa un ensayo disponible comercialmente hasta la etapa de validación del proceso con califi-
cación apropiada del ensayo. Para la fase IIIy posteriores, se prefiere un método de plataforma o previo a la purificación (ups-
tream) específico del proceso. Se debe realizar un estudio puente para justificar el reemplazo de ensayos. Si el ensayo comer-
cial está destinado para la fase IIIy para la aprobación posterior, se debe tener cuidado de demostrar cabalmente que los reac-
tivos del ensayo son aplicables a las proteínas de células huésped del proceso. Una consideración adicional es que los reactivos
provienen de un proveedor externo sobre el cual el fabricante biofarmacéutico tiene menos control.
TransicíónparaCambiode Ensayo
A
Preclínico ~ ~I_F_a_se_l_l__,~1.
~ _ ~
FaselllNalidación
delProceso
Posterior a !a Aprobación
EnsayoComercial
EnsayoEspecificodel ProcesoPrevioa !a Purificación
Ensayode Plataforma
B TransiciónparaCambiode Ensayo
Preclínico Posteriora la Aprobación
Ensayode Plataforma
Figura 1A. Cuando no existe un ensayo de plataforma antes de iniciar el desarrollo del producto.
Figura 1B. Cuando existe un ensayo de plataforma antes de iniciar el desarrollo del producto.
La Figura 18 sugiere que puede usarse un ensayo de plataforma a través de todas las etapas del desarrollo del producto
cuando ya se encuentre disponible al momento de iniciar el desarrollo del producto. El ensayo de plataforma debe calificarse
para cada nuevo producto. Puede ser necesario cambiar a un ensayo (upstream) específico del proceso previo a la purificación
para la fase IIIo para la validación del proceso y etapas posteriores, si el proceso del cultivo celular sufre cambios importantes
con respecto al proceso de plataforma, y puede introducir poblaciones de proteínas de células huésped significativamente dis-
tintas. Se debe realizar un estudio puente para justificar el reemplazo de ensayos.
Se deben considerar las limitaciones de un ensayo de proteínas de células huésped específico para el proceso a partir de la
purificación (downstream), debido a que puede ser tentador pensar que los ensayos de proteínas de células huésped se mejo-
ran tomando las proteínas de células huésped de una expresión nula a lo largo de las primeras columnas e inmunizando ani-
males con una combinación de columna del proceso a partir de la purificación (downstream). Históricamente, la lógica era
que el inmunógeno y el estándar se enriquecerían con aquellas proteínas de células huésped con la probabilidad más alta de
ingresar al proceso de recuperación y estar presentes en el producto final. Esta estrategia se basaba en la suposición de que, en
vez de contar con miles de proteínas irrelevantes en el inmunógeno, solo aquellas con la mayor probabilidad de estar presen-
tes en el proceso estarán presentes en el inmunógeno; por ende, el ensayo resultante se enfocará en aquellas proteínas de
células huésped de mayor interés. Las preocupaciones potenciales que pueden surgir como resultado de este enfoque son:
1. Si se usan únicamente proteínas de células huésped derivadas de una combinación de células nulas a partir de la primera
columna, entonces los cambios posteriores durante el desarrollo del proceso (p. ej., cambios en las condiciones de corrida
de la columna) podrían invalidar el ensayo de proteínas de células huésped. Por ende, el desarrollo del proceso se vuelve
Lt
USP42 InformaciónGeneral/ (1132) Proteína Residual de Células Huésped 8067
muy restringido e implica el riesgo de requerir el desarrollo de múltiples ensayos de proteínas de células huésped por
cambios pequeños en el proceso (o la necesidad de manejar la incertidumbre).
2. Las ca-purificación de algunas proteínas de células huésped con un producto puede deberse a que éstas se unen directa o
indirectamente con la proteína del producto. Una corrida de célula nula de una columna sin la proteína del producto de-
jaría escapar dichas proteínas de células huésped.
3. La adsorción no específica a resinas cromatográficas es común y, a menudo, no es un fenómeno reproducible. En compa-
ración con el primer pasaje, los pasajes subsiguientes del material de corrida de célula nula por una columna probable-
mente producirán un conjunto distinto de proteínas de células huésped después del pasaje por una nueva resina de co-
lumna.
3.2 Desarrollo y Caracterización de Reactivos de Proteínas de Células Huésped
3.2.1 PREPARACIÓN
DE ANTÍGENO/ESTÁNDAR
Según se describió en la sección 1.1 Consideraciones sobre Fabricación,Caracterizacióny Uniformidad,el "antígeno" de proteí-
nas de células huésped total es una población compleja de proteínas; por lo tanto, al generar el reactivo de estándar/antígeno
de proteínas de células huésped, es importante asegurar que: 1) el estándar de calibración sea representativo de la línea celular
y del proceso de fabricación, 2) su concentración de proteínas se ha cuantificado con exactitud y 3) el inmunógeno se admi-
nistra de forma tal que genera anticuerpos policlonales que son reactivos a la mayor cantidad posible de proteínas de células
huésped. La composición del antígeno de proteínas de células huésped debe ser lo suficientemente integral para tolerar los
cambios normales en el proceso de fabricación durante el ciclo de vida de los productos.
Además de los usos citados anteriormente, el antígeno de proteínas de células huésped también puede ser necesario para
preparar la columna de afinidad para la purificación de antisueros. Si se usa la purificación por afinidad, la cantidad de antíge-
no de proteínas de células huésped requerida debe planearse con cuidado. La cantidad producida deber ser lo suficientemente
grande para proveer un inventario suficiente para muchos años (a menudo 10-20 años); idealmente, para el ciclo de vida
completo del producto. Sin embargo, el proceso de preparación del antígeno debe llevarse a cabo y documentarse de una
forma que facilite un potencial reabastecimiento.
Debido a que el ensayo de proteínas de células huésped se usa para analizar muestras de fármacos que contienen trazas de
impurezas de proteínas de células huésped, cualquier reactividad cruzada de los anticuerpos anti-HCP con el producto puede
comprometer el método de prueba y generar resultados sesgados. Por lo tanto, se debe evitar cualquier contaminación del
antígeno de proteínas de células huésped con el producto para evitar la generación de anticuerpos anti-producto.
3.2.1.1 Preparaciónde antígenos de proteínasde células huésped a partirde célulasde mamíferos: La mayoría de los
productos biofarmacéuticos producidos en la actualidad se expresan en células de mamíferos, p. ej., células de CHO. La Figura
2 describe un proceso típico para la preparación del antígeno de proteínas de células huésped de CHO.
Célulasnulas cultivadas en biorreactores
!
El líquido de cultivo celular en fase líquida se separade las
célulasy los desechoscelularesmediante centrifugación
/
Ultrafütración/diafiltración (UF/DF) de lavado de pellets de células,lisado(p.ej.,niediante cidos de
líquido de cultivo celular,seguida de conge!adón/descongelación o ultrasonido) y recolección de
concentracióne intercambio de sobrenadante tnediante centrifugación
solución amortiguadora
/
Análisispor separado del líquido de cultivo celular y del lisado celular (p.ej., deter-
minación de proteínatotal, SDS PAGEbidimensionaly TransferenciaWestern) y
selección posterior de antígeno de Proteínas de Células Huésped (líquido de
cultivo celular, lisado o una combinación de ambos)
Figura 2. Ejemplo de preparación de antígeno de proteínas de células huésped de mamífero.
El primer paso es establecer una célula nula que no exprese el gen del producto, ya sea usando células no transfectadas (es
decir, células parentales) con un origen común con aquellas usadas para fabricar el producto solo, o transfectarlas con el vector
usado para crear la línea celular de producción sin el gen codificante del producto (proceso históricamente descrito como una
transfección "simulada"). La ventaja principal para el segundo procedimiento es que se expresan marcadores selectivos (p. ej.,
dihidrofolato reductasa o glutamina sintetasa). Alternativamente, se pueden producir anticuerpos específicos de marcadores
selectivos de manera independiente. Otra ventaja es que las células nulas con transfección simulada expresan marcadores de
selección y pueden cultivarse en condiciones de cultivo celular que simulen de manera más cercana el proceso de fabricación.
El uso de combinaciones (pools) de líneas de células nulas transfectadas simuladas que no hayan sido clonadas permite la má-
xima diversidad genética potencial y, por lo tanto, provee el mayor potencial de generar una población amplia de proteínas de
células huésped. Sin embargo, estos cultivos, que se siembran con combinaciones de células (no clonadas), pueden mostrar
una mayor variabilidad entre corridas. Ambos enfoques [no transfectados (parental) y transfectados simulados] se usan común-
8068 (1132) Proteína Residual de Células Huésped / InformaciónGeneral USP42
mente y también están expuestos a los siguientes problemas: el proceso de cultivo celular optimizado para el don de produc-
ción puede no conllevar a una viabilidad y densidad celular similares de las células nulas. Además, en ausencia de las tensiones
experimentadas por las células que producen grandes cantidades de proteínas del producto, las líneas celulares nulas pueden
presentar un perfil de proteínas de células huésped distinto. Estos cambios en la viabilidad, el metabolismo celular y la densi-
dad celular pueden alterar el perfil de proteínas de células huésped del antígeno, volviéndolo menos representativo del proce-
so de fabricación. Más adelante se trata la selección de condiciones apropiadas para la preparación del antígeno de proteínas
de células huésped.
Una vez que se han establecido las células nulas, el antígeno de proteínas de células huésped se prepara en un biorreactor,
en un matraz de cultivo celular o en una bolsa de cultivo celular que refleje las condiciones del producto o del cultivo celular
del proceso. Se puede aplicar un proceso de cultivo celular de plataforma, lo cual representa un proceso de fabricación común
para diversos productos (p. ej., anticuerpos monoclonales derivados de CHO). Por lo regular, el antígeno de proteínas de célu-
las huésped resultante se procesa al mínimo para asegurar un espectro amplio de proteínas de células huésped, lo que vuelve
al antígeno adecuado para el monitoreo de las proteínas de células huésped de múltiples productos generados a partir del
proceso de plataforma. Un antígeno de plataforma HCP también puede producirse combinando diversas corridas de células
nulas en condiciones de cultivo celular ligeramente distintas (p. ej., permitiendo que el cultivo permanezca en el biorreactor
por periodos más largos para variar la viabilidad celular). Este enfoque se usa para obtener un espectro de proteínas de células
huésped más amplio, y los antisueros generados contra este inmunógeno pueden ser adecuados para la detección de proteí-
nas de células huésped en productos generados a partir de una variedad de procesos ligeramente distintos. Estos reactivos
también pueden incrementar la robustez del inmunoensayo de proteínas de células huésped con respecto a cambios en el pro-
ceso.
Alternativamente, el antígeno de proteínas de células huésped puede prepararse usando un enfoque (upstream) específico
del proceso previo a la purificación en el que el proceso de cultivo celular se diseña para replicar el proceso de producción para
un producto único o proceso específico. La ventaja de este enfoque puede ser la alta relevancia del antígeno de proteínas de
células huésped resultante para un proceso previo a la purificación (upstream) particular. Al igual que con los reactivos de pla-
taforma, debido a que no se incluyen pasos adicionales de purificación de procesamiento, el antígeno contiene una amplia
variedad de proteínas de células huésped, y el antígeno a menudo seguirá siendo adecuado para el monitoreo de proteínas de
células huésped después de los cambios en el proceso de producción a partir de la purificación (downstream). La desventaja
de este enfoque es que el uso de reactivos por lo regular se verá limitado a un solo (o unos pocos) producto(s) o proceso(s).
El antígeno de proteínas de células huésped puede producirse a partir de una corrida representativa a escala pequeña, a es-
cala piloto o a escala de producción. Existen ventajas y desventajas para cada enfoque. La escala piloto o de producción puede
replicar mejor el proceso real; no obstante, puede no reflejarse la variación normal entre corridas de cultivo celular si se aplica
únicamente una corrida a gran escala. Por el contrario, se pueden combinar diversas preparaciones a pequeña escala y se pue-
de reflejar de mejor manera la variabilidad entre corridas del proceso de cultivo celular. Independientemente de la escala, se
debe evitar de forma enfática la presencia del producto, debido a que su presencia en el inmunógeno de proteínas de células
huésped comprometerá la calidad de los antisueros del inmunoensayo resultantes.
Después de realizar la corrida de célula nula, el antígeno de proteínas de células huésped puede prepararse a partir del lisado
celular, del fluido del cultivo celular concentrado o como una mezcla de ambos, según se muestra en la Figura2. Si el antígeno
se prepara a partir del fluido del cultivo celular, las células pueden recolectarse en el momento cuando se lleve a cabo la reco-
lección de la línea de producción o algunos días después, a fin de permitir el lisado de algunas de las células y que liberen
proteínas de células huésped en el fluido del cultivo celular, con lo que se amplía el espectro de proteínas de células huésped.
Para preparar inmunógeno a partir de lisado celular, las células se recolectan mediante centrifugación y los pellets de células
se lavan y se lisan (p. ej., usando ciclos repetidos de congelación/descongelación, u homogenización a alta presión). Las condi-
ciones que por lo regular se seleccionan para replicar el proceso de producción (es decir, para preparar el inmunógeno a partir
del fluido del cultivo celular, las células y los desechos se eliminan mediante centrifugación y, posteriormente, el fluido de culti-
vo celular se trata mediante ultrafiltración/diafiltración). La solución amortiguadora se intercambia (p.ej. a PBS o HEPES)y el
fluido del cultivo celular se concentra. El corte para la filtración debe seleccionarse para minimizar la pérdida de proteínas de
células huésped, p, ej., 1OkDa o menor.
3.2.1.2 Preparación de antígenos de proteínas de células huésped a partir de células bacterianas: Muchos de los princi-
pios descritos anteriormente usados en la preparación de antígenos de proteínas de células huésped de mamíferos también
aplican a cultivos celulares de células procarióticas. Sin embargo, se deben considerar algunos desafíos únicos. En particular,
los procesos de fabricación para sistemas de expresión bacteriana son más variados, como aquéllos que generan depósitos de
proteínas concentradas conocidos como cuerpos de inclusión, los cuales pueden representar hasta 95% del total de proteínas
de células. Las impurezas de proteínas de células huésped también están presentes en los cuerpos de inclusión, incluidas pro-
teínas de membrana bacteriana, proteínas de subunidad ribosomal y proteínas citoplásmicas, tales como proteínas pequeñas
de choque térmico o chaperonas. La formación de cuerpos de inclusión en la cepa de producción hace más difícil generar una
preparación de proteínas de células huésped representativa a partir de un proceso de fermentación de células nulas. La célula
nula puede no tener el mismo perfil de proteínas de células huésped y no generará cuerpos de inclusión cuyas proteínas de
células huésped específicas puedan co-purificarse, tal como se describió con anterioridad. En otros casos, las proteínas de célu-
las huésped han sido creadas a partir de sistemas de secreción periplásmicos, si el proceso de producción puede replicarse en
la célula nula.
USP42 InformaciónGeneral/ (11 32) Proteína Residual de Células Huésped 8069
Debido a que no existe un enfoque obvio para superar estas limitaciones, en la práctica, el antígeno de proteínas de células
huésped bacterianas por lo general se genera a partir de lisados de células lavadas, usando fermentaciones de células nulas,
que se cultivan e inducen en condiciones que representan en la mayor medida posible el proceso de fabricación previo a la
purificación (upstream). Como en el caso de cualquier antígeno de proteínas de células huésped, es necesario demostrar que
el perfil de proteínas de células huésped es representativo del proceso de fabricación antes de usarlo en el desarrollo de la valo-
ración. Este enfoque genera el conjunto completo de proteínas de células huésped expresadas y, por lo tanto, es muy amplio.
Debido a que la mayoría de los animales han sido expuestos a antígenos bacterianos y pueden tener anticuerpos preexisten-
tes a muchas proteínas de células bacterianas, es importante caracterizar las respuestas del anticuerpo preexistente y, de ser
apropiado, considerar el uso específico de animales exentos de patógenos La presencia de niveles significativos de anticuerpos
anti-HCP preexistentes puede confundir el análisis de las respuestas de anticuerpos; por lo tanto, es importante analizar los
sueros preinmunes de los animales para detectar la presencia de anticuerpos preexistentes antes de la inmunización.
Las células bacterianas nulas transfectadas con el vector de expresión contienen genes chaperones que pueden expresarse a
niveles altos (p. ej., 5% del total de proteínas de células huésped). Dicha sobreexpresión de impurezas de proteínas de células
huésped particulares pueden requerir el desarrollo de ensayos de analito individual para estas impurezas particulares (ver 6.1
Ensayospara Proteínasde CélulasHuéspedIndividuales).
3.2.1.3 Caracterización del antígeno de proteínas de células huésped: Se recomiendan diversos análisis antes de la inmu-
nización: 1) contenido de proteína (ensayo de proteínas totales); 2) ausencia de producto (según se demuestra mediante
transferencia Western (Western blot), inmunoensayo y/o análisis por Espectrometría de Masas); y 3) caracterización mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE,por sus siglas en inglés) unidimensional o bidimensional. La concentración de
proteínas se mide para establecer la concentración estándar para uso futuro y para determinar la cantidad general del antígeno
preparado. Los métodos más comúnmente usados son el ensayo con ácido bicinconínico, el ensayo Bradford y el análisis de
aminoácidos, aunque los métodos colorimétricos requieren un estándar (p. ej., albúmina sérica bovina) que no está bien apa-
reado con el analito (proteína de célula huésped). La absorbancia a 280 nm (A280) también puede usarse, aunque es menos
específica para proteína (p. ej., también se medirán los ácidos nucleicos). Estas metodologías a menudo proveen resultados
similares, pero algunos métodos pueden verse afectados de manera más significativa que otros por la presencia de sustancias
interferentes. Se debe considerar el uso de dos métodos ortogonales para excluir una sobre o subestimación grosera de la con-
centración de proteína por un método particular. Para mayor información, ver el capítulo general ArtículosObtenidospor Biotec-
nología-Va/oración de ProteínasTotales(1057), el cual trata las ventajas y desventajas de diversos métodos de análisis de pro-
teínas. La concentración de proteínas de células huésped debe asignarse mediante un enfoque científicamente sólido que se
use de manera uniforme durante todo el ciclo de vida. La falta de producto puede evaluarse con geles, transferencias Western
de anticuerpos anti-producto u otros métodos adecuados. Por último, los geles unidimensionales o bidimensionales ayudan a
caracterizar el patrón de proteínas de células huésped, demuestran la presencia de un espectro amplio de proteínas, y demues-
tran la presencia de una correspondencia razonable con la producción. Sin embargo, esto puede ser desafiante debido a la
presencia de grandes cantidades del producto, lo que puede complicar la detección de proteínas de células huésped. Se pue-
den realizar comparaciones entre las poblaciones específicas de proteínas huésped producidas en cultivos nulos y en cultivos
de producción usando los métodos ortogonales tratados en 5. Tecnologíasde Apoyopara la Detección,Identificacióny Medición
de ProteínasResidualesde CélulasHuésped.
3.2.1.4 reactivos estándar de referencia para proteínas de células huésped: El material de proteínas de células huésped
congeladas es por lo regular estable durante un periodo muy largo, pero se debe monitorear la estabilidad de los reactivos
estándar de proteínas de células huésped con el paso del tiempo debido a que la vida del ensayo puede ser muy larga. La
estabilidad del estándar de proteínas de células huésped puede confirmarse monitoreando el desempeño del estándar de pro-
teínas de células huésped en el inmunoensayo de proteínas de células huésped, así como en métodos ortogonales.
Se pueden establecer controles apropiados dentro del intervalo del ensayo para monitorear el desempeño de este último. Se
pueden preparar controles a partir de diluciones independientes del estándar de proteínas de células huésped, muestras de
producto o combinaciones intermedias, o muestras de producto adicionadas. Sin embargo, existe el ligero riesgo de que las
muestras de control preparadas como dilución a partir del mismo material estándar de proteínas de células huésped puedan
degradarse a la misma velocidad que el estándar de proteínas de células huésped sin diluir, y que la degradación del estándar
no sea detectada. Para mitigar el riesgo, a menudo se evalúan los datos de diversos parámetros de curva estándar (p. ej., señal,
fondo, pendiente, coeficiente de determinación) para cada valoración y se usan para determinar la estabilidad del estándar de
proteínas de células huésped. El uso de material diferente al de referencia para preparar controles ayudará a asegurar que la
velocidad de degradación sea independiente, con lo que la degradación del estándar de proteínas de células huésped podrá
detectarse con facilidad.
Se pueden establecer y usar diagramas de control del ensayo para registrar parámetros de curvas de referencia, valores de
muestras de control e información específica del lote para los reactivos críticos, tales como anticuerpos contra proteínas de
células huésped marcados. Se deben establecer intervalos aceptables para los controles fundamentados en múltiples corridas
(por lo regular 20-30) y se pueden usar como parte de los criterios de aceptación de los ensayos de rutina. Además, los valores
para el coeficiente de variación % del estándar y de las determinaciones repetidas del control son a menudo una parte de los
criterios de aceptación del ensayo. Las diferencias con el paso del tiempo en el desempeño de la curva estándar de proteínas
de células huésped o de los niveles de control de proteínas de células huésped, o un incremento en la variabilidad del ensayo,
pueden indicar una falta de estabilidad del estándar de proteínas de células huésped.
3.2.2 PREPARACIÓN
Y CARACTERIZACIÓN
DE ANTICUERPOS
3.2.2.1 Preparación de anticuerpos contra proteínas de células huésped: Los anticuerpos anti-HCP preparados a menudo
se usan para muchas aplicaciones (transferencias Western, inmunoensayo) durante un periodo largo (p. ej., la vida anticipada
de un producto o plataforma). Por lo tanto, las necesidades de materiales no deben subestimarse. La cantidad de antisueros
recomendada dependerá de muchos factores incluyendo el uso previsto, la cantidad predicha que se purifica a partir de un
volumen dado de antisuero, la cantidad para recubrir placas de microtitulación y muchas otras consideraciones. La selección
de especies animales usadas para generar anticuerpos anti-HCP es guiada por el inmunógeno, por los requisitos del método
particular y las preferencias de cada investigador. A menudo se seleccionan conejos, ovejas y cabras para los programas de
inmunización. En algunos casos, se han usado múltiples especies animales, en los cuales, el uso de especies más filogenética-
mente distantes de los mamíferos (p. ej., pollos) ha ayudado a generar anticuerpos anti-HCP para proteínas de células huésped
de mamíferos conservadas. La selección de especies animales también puede ser guiada por el deseo de incrementar la canti-
dad de antisueros disponibles a partir de uno o varios animales (cabras u ovejas), o de usar una estrategia para obtener una
mayor diversidad de respuestas provista por el uso de una cantidad mayor de animales individuales de una única especie(p. ej.,
conejos). El número de animales seleccionado para generar las combinaciones de antisuero depende de las especies usadas y
de la duración del protocolo de inmunización. Si se usan animales más pequeños para generar el antisuero, por lo general se
requerirán más animales individuales (p. ej., 10-20 conejos). Por el contrario, si se usan animales más grandes (cabras u ove-
jas), los investigadores por lo regular inmunizarán 3-1 O animales por protocolo. Los protocolos de inmunización típicos pro-
veen aproximadamente 100-150 mL de antisuero por conejo o aproximadamente 500 mL de antisuero por cabra, y el total
generado de anticuerpo purificado de Proteína A o Proteína G es aproximadamente 1 gramo por conejo o 5 gramos por cabra.
Los animales deben analizarse para detectar anticuerpos contra fármacos preexistentes antes de la inmunización. Si se arrojan
resultados positivos, entonces estos animales deben excluirse de la inmunización.
Se mezcla una porción del antígeno de proteínas de células huésped preparado con un coadyuvante apropiado (más co-
múnmente, adyuvante de Freund o en combinación con adyuvante incompleto) y usado para la inmunización de animales.
Cada animal recibe una estimulación inicial de la inmunización, seguida de múltiples inmunizaciones de refuerzo (a menudo
de 4 a 8), para madurar la respuesta inmune y generar respuestas de anticuerpos de títulos altos de alta afinidad. El antisuero
se recolecta a partir de cada animal antes de la estimulación inicial de la inmunización (tiempo O) y en intervalos apropiados
(por lo general 10-14 días) después de las dosis de refuerzo. Por lo regular se recolectan de cuatro a seis sangrías de cada
animal. Sin embargo, la duración del protocolo de inmunización puede extenderse incrementando el número de inmunizacio-
nes de refuerzo, posibilitando la recolección de antisueros adicionales con títulos altos. Otras estrategias de inmunización tam-
bién pueden ser útiles (p. ej., inmunización en cascada o fraccionamiento por tamaño del inmunógeno de proteínas de células
huésped).
Los investigadores deben realizar análisis de títulos o de transferencia Western de las sangrías de prueba individuales antes
de combinar el antisuero para detectar y eliminar suero que 1) tenga título bajo, 2) muestre una respuesta inmune inmunodo-
minante a un grupo pequeño de proteínas de células huésped, o 3) tenga características de unión o reactividad antiproducto
no específicas. Esta evaluación debe realizarse también sobre las combinaciones de anticuerpos finales para demostrar la cober-
tura amplia de las proteínas de células huésped y la ausencia de unión al producto terapéutico. Además, algunos laboratorios
han encontrado la utilidad de evaluar agregados en anticuerpos usando cromatografía de exclusión por tamaño según se des-
cribe más adelante. Las condiciones de elución con ácido pueden ocasionar la agregación de algunos anticuerpos y los multí-
meros de este tipo, en particular cuando se marcan con biotina o peroxidasa de rábano, pueden generar un aumento de fon-
do del ensayo. Además, algunos laboratorios incluyen un paso final de cromatografía de exclusión por tamaño a escala de pro-
ceso para reducir los niveles de agregados a niveles bajos (p. ej., <5%).
A través de múltiples enfoques en el proceso de purificación de anticuerpos a partir de combinaciones de antisuero, se han
generado exitosamente anticuerpos adecuados para su uso en inmunoensayos de proteínas de células huésped. La purificación
de anticuerpos se realiza a menudo mediante cromatografía en columna por afinidad con Proteína A, Proteína G o proteínas
de células huésped. La aplicación de perlas magnéticas recubiertas puede también proveer beneficios en algunos casos. La se-
lección de Proteína A o Proteína G es guiada por el tipo de especie animal usado para generar el anticuerpo. Los fabricantes
proveen protocolos estándar para estas purificaciones de anticuerpos de rutina. Al purificar anticuerpos anti-HCP por afinidad,
se deben evitar materiales tales como resinas cromatográficas, que pudieran haber sido usadas previamente para otros produc-
tos, y se debe contar con ciclos de limpieza adicionales para minimizar el arrastre. Idealmente, los fabricantes deben usar una
resina que nunca haya sido expuesta a un medicamento. Antes del paso de purificación por afinidad, algunos laboratorios
también incluyen una precipitación inicial con sulfato de amonio al 50% del antisuero crudo para enriquecer y concentrar la
fracción de anticuerpo y extender de esa forma el desempeño y la duración de uso de las columnas de afinidad. El uso de
estrategias de purificación con Proteína A o Proteína G genera reactivos en los que los anticuerpos específicos anti-HCP consti-
tuyen una proporción pequeña del anticuerpo total. Por el contrario, las estrategias de purificación por afinidad para proteínas
de células huésped purifican selectivamente anticuerpos específicos anti-HCP a partir de antisuero o de preparaciones enrique-
cidas con anticuerpos. En este caso, los antígenos de proteínas de células huésped se acoplan a una resina activada y el anti-
suero se purifica mediante la columna siguiendo los protocolos establecidos o las instrucciones del fabricante de la resina. Los
anticuerpos purificados pueden ser purificados aún más usando cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar agrega-
dos, para posteriormente dializarlos, concentrarlos, dividirlos en alícuotas y almacenarlos congelados (por lo regular a -70º o
Lt
menos). Asimismo, el antisuero sin diluir debe almacenarse congelado (ver el capítulo (1106) para información adicional sobre
el almacenamiento de muestras de suero).
la purificación por afinidad de anticuerpos específicos usando proteínas de células huésped inmovilizadas en una columna
requiere una manipulación cuidadosa de la preparación de la columna y su uso para que sea reproducible confiablemente en
purificaciones futuras. Además, si se vuelve a usar, se deben evaluar y controlar procedimientos apropiados para almacena-
miento y regeneración de resina para evitar la degradación durante el almacenamiento. Cuando se realiza de forma adecuada,
se considera un proceso confiable y reproducible que ha generado anticuerpos anti-HCP e inmunoensayos de proteínas de cé-
lulas huésped uniformes. Después de cargar la columna con antisueros, es crítico un procedimiento de lavado optimizado. De-
bido a que la preparación es una mezcla de anticuerpos con afinidades distintas, el lavado exhaustivo puede eliminar anticuer-
pos de baja afinidad. De manera similar, cargar grandes cantidades de antisuero anti-HCP en la columna puede resultar en
anticuerpos de alta afinidad, desplazando anticuerpos de baja afinidad si reconocen los epítopes cercanos. En cualquier caso,
los anticuerpos de baja afinidad pueden ser eliminados. En teoría, los anticuerpos de alta afinidad también pueden ser difíciles
de eluir. Independientemente de las condiciones de carga y lavado seleccionadas al inicio para la purificación por afinidad es-
pecífica para antígenos, estas condiciones deben mantenerse en los lotes de producción futuros de los anticuerpos. la Tabla2
presenta una comparación entre estas dos estrategias de purificación. Ambos enfoques se usan comúnmente.
a a
"tbl2Es trateg 1as d e Purlfl cacon
I' de A nt 1cue11~os
Tipo de Purificación Ventajas Desventajas
Cromatografíaen Columna por Afinidadcon Pro- Robustay reproduciblepara separar rápidamen- Menor proporción de anticuerpos específicos
teínaAo G te la fracción de lgG de otras proteínas del sue- contra proteínas de células huésped y puede
ro tener una cantidad mayor de anticuerpos de
baja afinidad
Cromatografíaen Columna por Afinidadcon Pro- Enriqueceanticuerpos específicosanti-HCPde Se requieren mayores habilidadesy documenta-
teínas de CélulasHuésped alta afinidad;excluyeanticuerpos no especffi- ción para fabricary mantener resinas de mane-
cos y proteínas del suero ra uniforme.Algunosanticuerpos anti-HCPde
alta afinidad pueden no ser eluidos de forma
utilizabley podrían no ser recuperados
3.2.2.2 Caracterización de anticuerpos para proteínas de células huésped: los anticuerpos preparados para captura y de-
tección se evalúan independientemente y como parte del par de inmunoensayos tipo sándwich. La concentración del anticuer-
po sin modificar se determina más comúnmente mediante absorbancia a 280 nm, análisis de aminoácidos o ensayo bicinconí-
nico. Todos los enfoques son aceptables siempre que se apliquen de manera uniforme y (si es colorimétrico) que se estandarice
de manera similar. Es importante determinar la concentración de los anticuerpos de captura y detección en cada partida debi-
do a que se diluirán hasta una concentración dada en el método de inmunoensayo optimizado. los anticuerpos de detección y
captura se caracterizan por su desempeño en los métodos de inmunoensayo. La mejor relación de conjugación de marca y
anticuerpos se debe evaluar empíricamente, basándose principalmente en su mejor desempeño en el ensayo. Esta relación óp-
tima debe buscarse en el futuro cuando se fabriquen nuevos anticuerpos marcados. Finalmente, aunque los anticuerpos son
por lo general muy estables cuando se almacenan congelados (p. ej., -70º), los investigadores deben asegurar la integridad
del almacenamiento y determinar un periodo definido de uso. Esto se puede lograr monitoreando continuamente mediante
diagramas de tendencias o mediante experimentos de recalificación en intervalos de tiempo específicos.
la calidad del par de anticuerpos (captura y detector) a menudo se evalúa de dos maneras:
1. Demostrar que los pares de anticuerpos son específicos y sensibles en un formato de inmunoensayo para las proteínas de
células huésped presentes en una serie de muestras tomadas de las operaciones unitarias de un esquema de purificación
dado, incluido el fármaco. Este tema también se trata en más detalle en la sección 4. Validaciónde Métodos de lnmunoen-
sayo de Proteínasde CélulasHuésped.Conceptualmente, la capacidad de detectar y medir proteínas de células huésped
(inmunoreactividad) en una serie de muestras del proceso real obtenidas de un proceso determinado para un producto
en desarrollo se demuestra mediante datos que indiquen: 1) la depuración secuencial a medida que el producto se purifi-
ca, 2) la linealidad de la muestra a lo largo de una serie de diluciones y 3) la ausencia de reactividad cruzada con el pro-
ducto o la matriz. La reducción de proteínas de células huésped durante el proceso de purificación se determina mediante
los factores de depuración en donde el contenido de proteínas de células huésped (en ng/mg) en cada paso del proceso
se divide por la cantidad en el paso anterior. Por lo regular, las muestras de partida obtenidas del cultivo celular pueden
tener niveles de proteínas de células huésped que van desde algunos cientos de miles hasta algunos millones ng/mg y los
productos finales pueden tener niveles de proteínas de células huésped que van de <1 a 100 ng/mg (demostrando mu-
chos logaritmos de depuración). Dichas tendencias, al ser observadas, sugieren que el proceso y el ensayo funcionan de
manera efectiva, y que los anticuerpos usados en el inmunoensayo tienen atributos de calidad adecuados. El no observar
estas tendencias, no necesariamente refleja un problema con los anticuerpos, debido a que también es posible que el pro-
ceso de purificación no sea efectivo.
2. Demostrar el reconocimiento de una amplia variedad de proteínas de células huésped en el estándar de calibración (es
decir, que la cobertura de la población de proteínas de células huésped sea adecuada). La cobertura se evalúa al menos
para los anticuerpos de captura usando transferencias Western en gel bidimensionales o fraccionamiento por inmunoafini-
dad de la población total de proteínas de células huésped inmovilizando los anticuerpos anti-HCP en una columna. Ade-
más, se recomienda analizar la cobertura del anticuerpo de detección si se usan diferentes anticuerpos de recubrimiento y
de detección. los beneficios y limitaciones de usar geles bidimensionales o fraccionamiento por inmunoafinidad para de-
mostrar la cobertura se trata en mayor detalle más adelante. Independientemente del método usado, el grado de cober-
tura debe indicarse al calificar los reactivos inmunoquímicos.
Las evaluaciones de cobertura de las proteínas de células huésped ayudan a evaluar la capacidad de los anticuerpos para
reconocer una amplia variedad de proteínas de células huésped en el estándar de calibración y aquellas presentes en las mues-
tras del proceso y del fármaco. Existen dos métodos (los geles bidimensionales seguidos por análisis de transferencia Western y
purificación por inmunoafinidad seguida por análisis en gel bidimensional) muy comúnmente usados y los cuales tienen la li-
mitación de que tienden a subestimar la unión real del antígeno en los métodos de inmunoensayo, aunque pueden tener cier-
to valor al comparar dos preparaciones entre sí (o una plataforma con un reactivo comercial). Ambos procedimientos usan
electroforesis reductora en gel bidimensional para separar las proteínas de células huésped en el estándar de proteínas de célu-
las huésped o en las muestras tempranas del proceso (p. ej., recolección). Las comparaciones de cobertura numérica deben
usarse con precaución debido a la gran cantidad de variables del método y a la técnica requerida para reproducir resultados,
incluso con los mismos reactivos en el mismo laboratorio. Debido a esta variabilidad, la mejor forma de evaluar los resultados
es cualitativamente. Las comparaciones de partidas (o fuentes) de anticuerpos deben realizarse en paralelo en la mayor medida
posible para determinar si los lotes de anticuerpos son comparables o si uno es superior al otro. El enfoque SDS-PAGE/Westem
es básicamente una comparación del número de manchas presentes en la membrana inmunológicamente teñida en función
del número presente en un gel duplicado (o transferencia) teñido para proteína total (p. ej., mediante plata o colorante fluo-
rescente; ver también el capítulo Métodosde PruebaInmunológicos-Análisispor lnmunotransferencia(1104) de la USP).La tin-
ción diferencial de cada preparación de anticuerpos puede potenciar el análisis, debido a que puede usarse para analizar el
mismo gel bidimensional. El segundo enfoque de unión por inmunoafinidad/SDS-PAGE implica comparar el flujo y el eluato
con la carga del estándar de calibración de proteínas de células huésped (o de la muestra de proceso temprana) pasada por
una resina en la que los anticuerpos de captura se han inmovilizado de manera covalente. La resina se lava después de la carga
y antes de la elución para eliminar las proteínas de células huésped unidas de manera no específica. Para el propósito de la
comparación de muestra, puede ser útil la tecnología de electroforesis en gel por diferencia (DIGE,por sus siglas en inglés). La
Tabla3 lista las ventajas y desventajas de estos dos métodos de cobertura.
Ta bla 3. Comparaclon de Metodos de Cobertura
Ventajas Desventajas
la buena separación de proteínas de células huésped indi- Los antígenos de proteínas de células huésped son desna-
viduales permite el recuento de manchas individuales. turalizados, pueden no ser representativos de los que se
observa en ensayos inmunológicos (p. ej., ELISA).
Alta variabilidad -los valores de "cobertura porcentual"
numérica varían ampliamente con el mismo material ana-
lizado dentro de un solo laboratorio y entre diferentes la-
SDS-PAGEBidimensional/ boratorios.
Transferencia Western La eficiencia de la transferencia de un intervalo amplio de
proteínas de células huésped es difícil de optimizar, lo
que lleva a subestimaciones debidas a la sobre transferen-
cia a través de la membrana o falla en la transferencia
desde el gel, dependiendo del peso molecular.
Aparear las manchas correspondientes entre transferencias
y geles es difícil y no es estandarizable.
Las proteínas de células huésped se unen en solución a Puede representar de manera ineficiente a algunas proteí-
una resina de anticuerpo en condiciones nativas similares nas de células huésped si están unidas de manera muy
a las del inmunoensayo tipo sándwich. fuerte y no eluyen, lo que resulta en una subestimación
de la cobertura.
Unión por inmunoafinidad/
El análisis de manchas en geles no requiere de inmuno- La preparación de la resina anti-HCP debe realizarse cuida-
SDS-PAGEuni o bidimen-
transferencia y es más simple debido a que se evitan los dosamente y puede ser difícil de reproducir. los resulta-
sional
problemas de transferencia. dos pueden depender de las condiciones de la carga y de
elución de la resina.
No se detectarán las proteínas a baja concentración que
solo se observan en las transferencias Western.
Se puede encontrar más información sobre el uso apropiado de los métodos SDS-PAGE/transferenciaWestern y las formas
de minimizar las desventajas anteriores en la sección posterior 5.2 Consideraciones
para los Métodosde TransferenciaWestern.
La Figura3 presenta un ejemplo de uso adecuado de este enfoque.
kDa
160-
120-
100-
90-,>'
so-
70-
60-'''
so-•
40-
30-"'"
25-"''
20--
pH 3 pH 10 pH 3 pH 10
Figura 3. Panel izquierdo: Análisis IEFbidimensional/SDS-PAGEde estándar de calibración de proteínas de células huésped
de ovario de hámster chino teñido con un colorante fluorescente sensible. Panel izquierdo: Análisis de transferencia Western
del mismo gel mostrado en el panel izquierdo.
3.2.3 GENERACIÓNY CALIFICACIÓN

DE REACTIVOS
DE REEMPLAZO
Cuando se agota el abastecimiento de reactivos de proteínas de células huésped o si se presenta una disminución en su de-
sempeño, pueden ser necesarios nuevos reactivos. A menudo, los nuevos antígenos de proteínas de células huésped y los nue-
vos anticuerpos de proteínas de células huésped se generan al mismo tiempo. En teoría, el nuevo conjunto de reactivos debe
ser creado siguiendo el mismo protocolo usado para el conjunto previo de reactivos para hacer coincidir en la mayor medida
posible el desempeño de los ensayos nuevos y anteriores y producir datos uniformes para un programa dado. Sin embargo, en
la práctica no siempre es posible (ni recomendable) generar los reactivos del ensayo de forma exactamente igual a la forma en
que originalmente se prepararon. Por ejemplo, si el proceso de fabricación ha sido optimizado con el paso del tiempo y los
reactivos del ensayo de plataforma originales ya no son relevantes, se debe llevar a cabo una evaluación cuidadosa. Cuando se
requieren dichos cambios, la forma ideal de confirmar la calidad de los reactivos reemplazados es mediante caracterización de
anticuerpos (ver más adelante) y demostrando que pueden detectar una reducción logarítmica de proteínas de células hués-
ped mayor o similar, desde la recolección hasta el fármaco, usando las mismas muestras analizadas de manera directa con los
reactivos del ensayo originales.
Al reemplazar un antígeno de proteínas de células huésped en el que el proceso de producción vigente es esencialmente el
mismo que el proceso anterior, el nuevo antígeno de proteínas de células huésped debe prepararse de la manera más similar
posible al anterior. Es importante comparar en paralelo las concentraciones de proteína del antígeno de proteínas de células
huésped nuevo y anterior, usando el mismo método para asignar de manera correcta la concentración de proteína para el nue-
vo antígeno y para asegurar que las concentraciones de proteína son comparables en el estándar de calibración de proteínas
de células huésped nuevo y anterior. La caracterización mediante SDS-PAGEunidimensional o bidimensional debe realizarse
como una comparación en paralelo de los antígenos de proteínas de células huésped nuevo y anterior (ver arriba) para asegu-
rar que no hayan ocurrido cambios burdos en la composición de las proteínas.
Para el reemplazo de anticuerpos, de ser posible, se debe usar la misma especie animal. En los casos en los que se desee una
mejor respuesta de anticuerpos, se pueden evaluar los anticuerpos producidos mediante diferentes especies. La selección de
especies debe tomar en cuenta todos los puntos discutidos en este capítulo. Se debe incluir una comparación en paralelo de
los resultados de las muestras del proceso usando los anticuerpos nuevos y anteriores en un formato de inmunoensayo tipo
sándwich para demostrar la aptitud de los anticuerpos de reemplazo. Se recomienda la caracterización adicional por métodos
ortogonales (p. ej., cobertura usando SDS-PAGEunidimensional y bidimensional), según se describió anteriormente. La califica-
ción o validación del ensayo también debe considerarse después de cambiar los reactivos.
Entender por completo el efecto de reemplazar los reactivos críticos de proteínas de células huésped sobre los resultados del
ensayo requiere el análisis de las muestras del proceso en estudios puente usando múltiples muestras a partir de la recolección,
productos intermedios del proceso de todas las etapas de purificación apropiadas, y el fármaco final. Estos estudios pueden
requerir una intensa inversión de recursos, lo que enfatiza la importancia de fabricar cantidades suficientes de reactivos críticos
para proteínas de células huésped al inicio (y minimizar el reemplazo).
Lt
3.3 Desarrollo de Métodos de lnmunoensayo y Calificación de Aptitud para su Uso
Según lo indicado en 1. Introduccióny Alcance,los inmunoensayos de proteínas de células huésped tienen dos funciones im-
portantes en el desarrollo y control de procesos de fabricación de productos biofarmacéuticos. Los inmunoensayos de proteí-
nas de células huésped funcionan como una medición de la pureza del producto y, por lo tanto, se relacionan potencialmente
con la seguridad del paciente. También sirven como una medición de la uniformidad en la fabricación y, por ende, reflejan el
control del proceso. Para cumplir con estos requisitos, los ensayos de proteínas de células huésped a menudo se validan e in-
corporan en el sistema de control de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes, el cual incluye límites de rechazo específicos (en
el fármaco como un método de Certificado de Análisis (C de A) o como un control durante el proceso). Si el fármaco final es
una proteína conjugada, el análisis debe realizarse en el producto intermedio de la proteína (antes de la conjugación). Además,
los ensayos de proteínas de células huésped se usan para guiar el desarrollo del proceso y a menudo se usan para demostrar el
desempeño robusto del proceso en el contexto de las actividades formalizadas de validación del proceso.
Los inmunoensayos de proteínas de células huésped a menudo se presentan en formato de ELISAtipo sándwich, y se en-
cuentran disponibles múltiples opciones de marcado de anticuerpos (ver el capítulo (1103)). Dependiendo del marcado esco-
gido, se seleccionan conjugados y sustratos apropiados; en el capítulo (1103) se describen algunos ejemplos. La mayoría de las
proteínas pueden ser biotiniladas debido a su contenido de lisina y, debido a que la biotina es pequeña, es menos probable
que afecte la actividad de unión de las proteínas. Debido a que los anticuerpos son grandes y tienen muchos residuos de lisina,
la relación de conjugación entre biotina y anticuerpo puede ser mayor que la de las proteínas más pequeñas. Sin embargo, es
importante no sobremarcar ni submarcar el anticuerpo (p. ej., con biotina o peroxidasa de rábano), debido a que esto puede
llevar a una menor unión de antígenos o a una menor señal/sensibilidad, respectivamente. Controlar y definir la estequiome-
tría de marcado (p. ej., mol de biotina a mol de lgG) es útil para la fabricación uniforme de partidas futuras. Se debe analizar y
optimizar el desempeño de múltiples relaciones de marca y de anticuerpo en el inmunoensayo. Se debe eliminar el exceso de
reactivos no conjugados, ya sea por diálisis, purificación por afinidad o usando una columna de desalinización adecuada.
A menudo, el estándar primero se analiza para determinar si se puede generar una curva de dosis-respuesta y, de ser así, en
qué intervalo de concentración de analito. los resultados también pueden revelar un punto de partida para las concentracio-
nes iniciales de reactivos que pueden ser optimizadas de manera adicional. Si se ha preparado más de un par de anticuerpos,
entonces cada uno se analiza para encontrar el mejor desempeño (ver el capítulo (1103) de la USPpara más información). La
relaciones señal (estándar de calibración bajo) a ruido (fondo) generadas con cada candidato de anticuerpo se pueden usar
para seleccionar el mejor par. Por lo regular, los inmunoensayos de proteínas de células huésped no siempre poseen una curva
de dosis-respuesta completa con ambas asíntotas; por lo tanto, para el propósito de la detección de proteínas de células hués-
ped residuales, la valoración para liberación de fármaco debe enfocarse en el extremo inferior de la curva.
3.3.1 CALIFICACIÓN
DE UN PROCESODE FABRICACIÓN
NUEVOMEDIANTEVALORACIÓNEN PLATAFORMA
HCP
Tal como se indicó anteriormente, si se equipara el procedimiento de aislamiento/proceso previo a la purificación (ups-
tream), entonces un nuevo producto producido en dicho sistema puede beneficiarse del uso de un ensayo de plataforma que
puede disminuir el tiempo y el esfuerzo de calificación. Sin embargo, en casos en los que existen variaciones que ocurren al
optimizar los cultivos de producción y el espacio del diseño del cultivo celular no está completamente definido, es importante
entender si dichas variaciones son lo suficientemente significativas para considerar que el ensayo de plataforma es inadecuado.
En estos casos, el ensayo de plataforma debe calificarse por medios experimentales para demostrar que es adecuado para me-
dir proteínas de células huésped a partir del nuevo proceso. Se debe evaluar la exactitud, la precisión, la sensibilidad, la lineali-
dad, el intervalo y la especificidad del ensayo (ver 4. Validaciónde Métodosde lnmunoensayo de Proteínasde CélulasHuésped).
Además, el intervalo de proteínas de células huésped en el estándar de la plataforma HCP debe ser comparado con los presen-
tes en el nuevo proceso. Los anticuerpos también deben caracterizarse usando muestras a partir del nuevo proceso o producto
usando los enfoques tratados anteriormente.
los siguientes enfoques y conceptos pueden ser útiles al determinar si un ensayo de plataforma es adecuado para un pro-
ducto fabricado con un nuevo proceso:
1. Realizar una corrida de célula nula representativa a pequeña escala en condiciones usadas en el nuevo proceso de cultivo
y determinar la concentración de proteína del fluido del cultivo celular de la corrida de célula nula. Valorar el fluido del
cultivo celular de la corrida de célula nula a la misma concentración nominal que el estándar de proteínas de células hués-
ped del ensayo usando el inmunoensayo de proteínas de células huésped tipo sándwich y comparar la curva de dilución
del fluido del cultivo celular de la corrida de célula nula con el estándar usado en el ensayo. Si la curva estándar y la nueva
curva del fluido del cultivo celular de la corrida de célula nula son similares (p. ej., en su forma y amplitud, y las concen-
traciones de proteínas de células huésped calculadas están dentro de un factor de dos), entonces se considera que el nue-
vo proceso no es diferente al de plataforma, y por lo regular no se requiere un ensayo de proteínas de células huésped
específico del proceso.
2. Con el fluido del cultivo celular obtenido de la corrida de célula nula anterior del nuevo proceso, realizar comparaciones
con el estándar de calibración de proteínas de células huésped usando electroforesis en gel bidimensional. Esto comparará
la diversidad de proteínas producidas mediante los dos procesos. Sin embargo, se debe ser consciente de que pueden
aparecer nuevas "manchas" en los geles bidimensionales que pueden no reflejar las diferencias inmunoquímicas en el en-
sayo, por ejemplo, las modificaciones post-traduccionales o la proteólisis limitada. Como tal, la aparición de unas pocas
manchas nuevas o del aumento o disminución de intensidad de manchas en la corrida de célula nula específica del proce-
so no es una base para invalidar la aplicación del ensayo de plataforma. Se recomienda una evaluación cualitativa (p. ej.,
contra una transferencia Western).
3. También es valiosa la comparación de niveles de proteínas de células huésped al momento de la recolección en las corri-
das reales de producción (muestras de fluido del cultivo celular) con el mismo producto producido en el proceso original
y en el "nuevo" proceso. En general, los resultados del inmunoensayo dentro de un factor de dos a menudo se consideran
similares, con lo que se confirman los reactivos de la plataforma HCP.
4. Las proteínas de células huésped en el fluido del cultivo celular de los cultivos de producción también pueden estimarse
basándose en las mediciones de proteínas totales. La proteína total en el fluido del cultivo celular es la suma del producto
(que se mide usando un ensayo de titulación específico del producto) y de las proteínas de células huésped. Las muestras
de cosechas del cultivo celular de corrida de fabricación pueden dializarse, siempre y cuando presenten una concentra-
ción suficiente para que las pérdidas de membrana sean inapreciables, para remover los péptidos pequeños y los aminoá-
cidos, y posteriormente, se determinan las proteínas totales (p. ej., mediante análisis de aminoácidos). Restar la concentra-
ción del producto de las proteínas totales provee una estimación de la proteína que no corresponde al producto, es decir,
la proteína de células huésped, en mg/ml. Este valor puede compararse con la concentración de proteínas de células
huésped a partir del inmunoensayo. Los valores comparables (p. ej., dentro de 2x) indican la confirmación de la platafor-
ma de proteínas de células huésped para el nuevo proceso.
3.3.2 NECESIDADDE NUEVOSREACTIVOS

DESPUÉSDE CAMBIOSEN ELPROCESO
Los cambios grandes, tales como cambios sustanciales y no ambiguos en las condiciones del cultivo celular (p. ej., trasladar-
se de un proceso que contenga suero a un proceso de producción exento de suero), por lo regular requiere la producción de
nuevos reactivos y el desarrollo y la validación de un nuevo ensayo de proteínas de células huésped. En este ejemplo, los reacti-
vos de proteínas de células huésped generados usando el anterior proceso reconocen un número de proteínas de suero pero
podrían no reconocer muchas nuevas proteínas de células huésped en el proceso exento de suero. Debido al cambio en el
proceso y al cambio en la valoración, se observarán diferentes niveles de proteínas de células huésped cuando se midan las
proteínas de células huésped en las mismas muestras en el ensayo nuevo y en el anterior (es decir, las muestras del proceso
que contiene suero puede tener un alto nivel de proteínas de células huésped medido en el ensayo anterior y un bajo nivel de
proteínas de células huésped medido por el nuevo ensayo, mientras que las muestras del proceso exento de suero puede pre-
sentar resultados de proteínas de células huésped mucho más bajas en el ensayo anterior, pero mayores con el nuevo ensayo).
Si el ensayo fue desarrollado como un ensayo específico del proceso a partir de la purificación (downstream), los cambios en
las etapas de purificación también pueden requerir reemplazar el ensayo con uno que sea relevante para el nuevo proceso a
partir de la purificación (downstream). Este es el principal problema con estos ensayos tan especializados y la razón por la que
regularmente se prefieren los ensayos basados en plataforma, debido a que a menudo no requieren un nuevo ensayo cuando
se presentan cambios en los pasos del proceso a partir de la purificación (downstream).
3.3.3. ESTABILIDAD
DE LA MUESTRA
Es importante demostrar que los procedimientos de manipulación de muestras no afecten los resultados del ensayo. Esto es
particularmente cierto al comparar los resultados de diversas combinaciones de procesos intermedios. En ocasiones, las proteí-
nas de células huésped pueden precipitarse durante la congelación o cuando el pH de la muestra se ajusta de ácido a neutro.
Además, el almacenamiento a 2º-8º o múltiples ciclos de congelación-descongelación pueden resultar en una pérdida de reac-
tividad. Puede ser necesario agregar componentes estabilizadores específicos (p. ej., cationes divalentes) a las muestras para
asegurar la estabilidad.
4. VALIDACIÓN
DE MÉTODOSDE INMUNOENSAYO
Los inmunoensayos de proteínas de células huésped para evaluación de la pureza del producto por lo regular forman parte
del sistema de control de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes, ya sea como una prueba durante el proceso o en el Certifi-
cado de Análisis,y debe validarse apropiadamente. El enfoque de validación depende en parte de los tipos de muestras que se
analizarán con el método. Al usar una prueba de impurezas cuantitativa para el fármaco final, se requieren todos los paráme-
tros de validación para dicha prueba, mientras que la validación para las muestras durante el proceso por lo regular se enfoca
en la linealidad, la interferencia y la precisión de la dilución. Independientemente de si el ensayo es un ensayo realizado duran-
te el proceso o un ensayo de liberación (fármaco), los límites de acción son valiosos como parte de una estrategia de control
general. Se recomienda a los lectores referirse a las guías ICH Q2(Rl) y al capítulo Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos
(1225) con respecto a las expectativas generales para la validación del ensayo, en particular para los requisitos de validación
del ensayo de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes, y al capítulo (1103) para inmunoensayos tipo sándwich. Aunque el
enfoque principal de esta sección es la validación del ensayo de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes, muchos de los mis-
mos principios se aplican a los ensayos usados para demostrar que los pasos de purificación del proceso son adecuados para el
uso previsto.
8076 (1132) Proteína Residual de Células Huésped/ Información General USP42
Esta sección se enfocará en aquellos aspectos de los inmunoensayos de proteínas de células huésped que son únicos o que
requieren atención y documentación especial. Los inmunoensayos de proteínas de células huésped difieren de los inmunoensa-
yos más convencionales en que son ensayos multianalitos. Existen potencialmente miles de proteínas en el inmunógeno y en el
estándar, y se produce un conjunto de anticuerpos correspondientemente diverso, aunque solo el fluido del cultivo celular del
proceso previo a la purificación (upstream) contendrá una diversidad de proteínas que se aproximan al estándar de calibración
de proteínas de células huésped. Las combinaciones intermedias y los productos finales por lo regular contienen un número
progresivamente menor de proteínas de las células huésped que están presentes en el estándar. Según se trató anteriormente,
este es el aspecto relacionado con la exactitud que se ve comprometido por los inmunoensayos de proteínas de células hués-
ped, y la razón por la que las relaciones de unidades de masa (ng de proteínas de células huésped por mg de fármaco) no son
una relación de "masa" literal. Sin embargo, a continuación se presentan enfoques comunes de la industria que tratan estas
limitaciones en la mayor medida posible.
El siguiente resumen de validación es para el fármaco final o para un penúltimo paso del proceso, cualquiera que se seleccio-
ne para el Certificado de Análisisdel método. Se debe tomar en cuenta que para el análisis durante el proceso, el enfoque se
centra en la exactitud del método (recuperación de cantidades agregadas conocidas), la linealidad de la dilución y la precisión.
En el caso de la exactitud, algunas muestras tendrán un número mayor de sustancias interferentes potenciales (otras impurezas
o aditivos del proceso) que pueden requerir de ser confirmadas como no interferentes (p. ej., ADN residual, proteína A lixivia-
da, inactivadores de virus, agentes caotrópicos y amortiguadores de pH bajo).
4.1 Exactitud
Para evaluar la exactitud del ensayo de proteínas de células huésped en el fármaco, como mínimo se debe agregar el están-
dar del ensayo analítico a muestras apropiadas y se debe demostrar la recuperación de cantidades agregadas conocidas en el
intervalo del ensayo. La interferencia de la matriz puede provenir de los componentes de la solución amortiguadora y del pro-
ducto, y la dilución mínima requerida para la recuperación aceptable de cantidades agregadas conocidas (por lo regular entre
70% y 130%) debe determinarse para cada tipo de muestra. Por lo regular, los experimentos de recuperación de cantidades
agregadas conocidas se realizan con cantidades agregadas conocidas usando al menos tres y potencialmente hasta cinco nive-
les diferentes. Debido a que las muestras se valoran en múltiples diluciones, el investigador puede agregar cantidades conoci-
das y luego diluir la muestra, o diluir la muestra y luego agregar cantidades conocidas a las muestras diluidas. Las cantidades
agregadas conocidas cerca del límite de cuantificación ayudan a evaluar la exactitud y repetibilidad del ensayo cerca del límite
de cuantificación, que es el punto en el que a menudo la medición es más variable. Una recuperación de cantidades agregadas
conocidas del 50%-200% puede ser aceptable para una cantidad agregada conocida en o cerca del límite de cuantificación.
Aunque estos representan los requisitos mínimos para la validación del ensayo, no se debe interpretar que demuestran la
exactitud de ninguna proteína de célula huésped específica que puede ca-purificarse con el producto. Para lograr lo anterior,
se requiere la comparación con un estándar de dicha especie de proteína de célula huésped particular; sin embargo, esto pue-
de no ser posible debido a que dicha proteína de célula huésped raramente se conoce. Se proveen consejos para distinguir
estas situaciones en la sección de linealidad siguiente, así como en 5. Tecnologíasde Apoyo para la Detección,Identificacióny
Mediciónde ProteínasResidualesde CélulasHuésped.
4.2 Sensibilidad e Intervalo del Ensayo
Los inmunoensayos tipo sándwich para proteínas de células huésped a menudo logran una sensibilidad de curva estándar de
un solo dígito bajo en ng/ml. En el caso de las concentraciones de proteína en las muestras donde la dilución de prueba es de
1O mg/mL, esto implica que es posible una sensibilidad de aproximadamente 1 ng de proteínas de célula huésped por mg de
producto. Sin embargo, esta sensibilidad puede ser difícil de lograr con concentraciones bajas de proteína. Es importante resal-
tar que la relación de proteínas de células huésped informada (ng de proteínas de células huésped residuales con respecto a
mg de producto) no es en realidad la relación de masas implicada por la unidad ng/mg, sino los "equivalentes inmunológicos"
por mg de producto.
El primer aspecto para determinar el límite de cuantificación por lo regular se determina de manera experimental para cada
producto en una matriz de amortiguador de muestra dada en estudios de recuperación de cantidades agregadas conocidas. La
dilución mínima recomendada (MRD, por sus siglas en inglés) para el fármaco debe establecerse agregando cantidades cono-
cidas del estándar de proteínas de células huésped a una serie de diluciones muestra. Por ejemplo, una cantidad conocida de
proteína de célula huésped de 1O ng/mL agregada a cada serie de diluciones que contengan proteína sin diluir (p. ej., 1O
mg/mL) y fármaco diluido en series. Aquellas diluciones en las que la recuperación de cantidades agregadas conocidas es
70%-130% (50%-150% también se usa comúnmente para niveles cercanos al límite de cuantificación) se consideran acepta-
bles. Por lo regular, se analiza adicionalmente una dilución mínima recomendada de fármaco para asegurar que la recupera-
ción de cantidades agregadas conocidas se logre constantemente.
Para la segunda parte de la determinación del límite de cuantificación, el fármaco se analiza a la dilución mínima recomen-
dada (si las muestras de fármaco tienen altos niveles de proteína de célula huésped detectable, se puede usar una solución
amortiguadora de formulación). El límite de cuantificación por lo general se determina mediante el análisis de concentraciones
de cantidades agregadas conocidas de proteína de célula huésped y estableciendo el nivel mínimo al que se puede determinar
la proteína de célula huésped con exactitud y precisión aceptable. Este estudio por lo regular se realiza al menos tres veces, de
preferencia por varios analistas o en días diferentes. Por ejemplo, una cantidad agregada conocida de 3 ng/mL de proteína de
célula huésped en una concentración de proteína del producto de 5 mg/mL tiene un límite de cuantificación de 0,6 ng/mg o
3 ng/mL si se logra una recuperación de cantidades agregadas conocidas en, p. ej., al menos cuatro de seis pruebas o si se
cumple el criterio de recuperación media de cantidades agregadas conocidas.
Por lo regular, los ensayos se configuran para medir el intervalo de unos pocos ng/mL hasta >100 000 ng/ml. Este intervalo
permite al analista analizar una variedad de muestras a diferentes diluciones (ver la sección 4.3 Linealidadde la Muestra) y per-
mite un ensayo práctico que puede acomodar las combinaciones durante el proceso con niveles de proteínas de células hués-
ped que difieren en gran medida. Por ejemplo, las muestras del proceso previo a la purificación (upstream) pueden contener
>100 000 ng/mL de proteínas de células huésped y requiere grandes diluciones para obtener resultados en el intervalo de la
curva estándar.
Para la fabricación comercial de fármaco de rutina donde se conoce la concentración de proteína del producto y se entien-
den bien las impurezas del proceso, se puede usar un análisis a una sola dilución para la liberación. Los resultados se informan
como la relación entre proteína de célula huésped medida (ng/mL) y la concentración de producto (mg/mL) resultante en
unidades de ng/mg. Cuando el fármaco tiene niveles indetectables, los resultados se informan como "menor que" el límite de
cuantificación del ensayo (ng/mL) dividido por la concentración del producto (mg/mL; p. ej., <0,6 ng/mg en el ejemplo ante-
rior). Sin embargo, antes de establecer esta concentración esperada para el análisis, la linealidad de la dilución de las muestras
debe entenderse cabalmente y se debe establecer un proceso robusto de fabricación. En caso de que el nivel o las especies de
proteínas de células huésped varíen entre corridas, puede ser necesario analizar cada muestra a múltiples diluciones (ver más
adelante).
4.3 Linealidad de la Muestra
La falta de linealidad del ensayo de proteínas de células huésped para algunas muestras no es extraña y se debe evaluar en el
caso de múltiples partidas de un tipo de muestra dado (p. ej., a partir de diversos lotes clínicos del fármaco o partidas de vali-
dación del proceso) para asegurar la uniformidad y el informe apropiado de los resultados. Debido a que una proteína de célu-
la huésped individual (o unas pocas proteínas de células huésped individuales) pueden co-purificarse con el producto, es posi-
ble que se presente un exceso de proteínas de células huésped particulares respecto de los anticuerpos disponibles en el inmu-
noensayo de proteínas de células huésped. Esto es posible en ensayos de analitos múltiples en los que solo se encuentra dispo-
nible un área de superficie limitada en las placas de microtitulación o perlas del ensayo, y debido a que se requieren miles de
anticuerpos anti-HCP diferentes, los anticuerpos para cualquier proteína individual de célula huésped serán necesariamente li-
mitados. Además, tampoco se controla la cantidad relativa de anticuerpo para cada proteína de célula huésped independiente,
por lo que la capacidad de unión para cada proteína de célula huésped independiente difiere. Para muestras que presentan
este comportamiento, los analistas deben diluir la muestra en el intervalo del ensayo, es decir, a un punto en el que ya no se
observe el comportamiento no lineal debido a que la proteína de célula huésped se ha diluido a una concentración en la que
ya no excede la cantidad de anticuerpo disponible. En algunos casos, la sensibilidad del ensayo se convierte en una limitante y
no es posible alcanzar una dilución en la que el resultado del ensayo sea independiente de la dilución de muestra. En algunos
casos, el valor de la relación de proteínas de células huésped más alta (corregida para la dilución muestra) dentro del intervalo
validado del ensayo debe informarse. A continuación se presenta un ejemplo detallado de cómo manejar las diluciones no li-
neales que surgen como resultado de la insuficiencia de anticuerpo.
La Tabla 4 y la Figura4 presentan datos para tres muestras diferentes analizadas en un ELISAque tiene un intervalo de 1-100
ng/ml. En este ejemplo, todas las muestras se diluyeron inicialmente hasta 1O mg/mL (la dilución mínima recomendada, en la
que la recuperación de cantidades agregadas conocidas ha sido previamente confirmada) y luego se diluyeron en serie usando
una serie de diluciones al medio hasta por debajo del límite de cuantificación del ensayo de 1 ng/ml. Mientras que la Muestra
7 (diamantes) se diluye linealmente en el intervalo completo analizado, los resultados de proteínas de células huésped de la
Muestra 2 (cuadrados) y de la Muestra 3 (triángulos) se estabilizan a concentraciones más altas de la muestra. La saturación de
los anticuerpos refleja el exceso de antígeno y la determinación del valor de proteínas de células huésped se lleva a cabo dilu-
yendo la muestra en el intervalo de dilución lineal; se estima visualmente como <2 mg/mL para los cuadrados y <1 mg/mL
para los triángulos. [NOTA-Si se requieren diluciones de muestra grandes para alcanzar el intervalo del ensayo de proteínas de
células huésped, se puede considerar realizar diluciones intermedias para limitar los errores relacionados con la dilución.]
Tabla 4.ª Datos Brutos para el Gráfico de la Figuro 4'

Producto Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
Concen- Cociente Concen- Cociente Concen- Cociente
traclón de de proteí- traclón de de proteí- traclón de de proteí-
proteínas nas de cé- Valor de proteínas nas de cé- Valor de proteínas nas de cé- Valor de
Concen- de células lulas relación de células lulas relación de células lulas relación
traclón huésped huésped máximo huésped huésped máximo huésped huésped máximo
(mq/ml) (nq/ml) (nq/mq) % (nq/ml) (nq/mq) % (nq/ml) (nq/mq) %
10,00 (sin 3,2 (sin di-
diluir) 49 (sin diluir) 4,90 83% 20 (sin diluir) 2,00 <20 luir) 0,32 22%
5,00 28,5 5,70 96% 16,5 3,30 54% 2,5 0,50 35%
2,50 12 4,80 81% 10 4,00 66% 1,5 0,60 42%
1,25 7,4 5,92 100% 7,4 5,92 97% 1,1 0,88 61%
0,625 3,1 4,96 84% 3,3 5,28 87% 0,9 1,44 100%
NO DISPO-
0,3125 1,6 5,12 86% 1,9 6,08 100% <1 <6 NIBLE
NO DISPO- NO DISPO- NO DISPO-
<1 <6 <1 <6 <1 <6
0,15625 NIBLE NIBLE NIBLE
Valor de rela-
ción de
proteínas
de células
huésped in-
formado
con la guía Guía 1 = 5,2 (n = 6); Guía 1 = 5,8 (n = 3); Guía 1 = 1,2 (n = 2);
yn Guía 2 = 5,2 (n = 6) Guía 2 = 5,3 (n = 4) Guía2=1,4(n=l)
ª Datos numéricos para tres muestras (también graficadas en la Figura4) que presentan grados diversos de saturación de la respuesta a concentraciones más
altas de producto (e impureza de proteínas de células huésped) analizado. Dos guías sobre cómo interpretar estos datos (las guías 1 y 2) ilustran la forma en que
el "intervalo lineal" del ensayo se limita para la mayoña de los puntos de datos de dilución mostrados en la Tabla4 y la Figura4. Nota-Las muestras siempre se
diluyen hasta que la concentración de proteínas de células huésped esté por debajo del límite de cuantificación del ensayo (en este ejemplo, el límite de cuantifi-
cación es 1 ng/mL). Guía 1: Se promedian todos los valores que se encuentran dentro del 20% del valor máximo. Guía 2: Los valores se promedian siempre que
el coeficientede variacióndel valor sea<20%, eliminandoprimerolasmuestrasmenosdiluidas.Tambiénse puede usaruna terceraguía que informael valor
más alto medido por encima del límite de cuantificación pero la aptitud de este enfoque debe demostrarse de manera adecuada por la validación del método.
Pº
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_g
·~
~ 0,1
8 Concentración del Producto(mg/ml)
Figura 4. Dilución en serie al medio de las tres muestras listadas en la Tabla4. Los resultados de la concentración de proteí-
nas de células huésped se grafican en función de la concentración de producto en las muestras, lo que sirve como una medi-
ción de la dilución muestra.
Debido a que las mediciones cerca del límite de cuantificación pueden tener una mayor variabilidad y una menor reproduci-
bilidad que las mediciones más alejadas del límite del ensayo, por lo regular (si fuera posible) se promedian los valores dentro
del intervalo de respuesta de concentración lineal de proteínas de células huésped de la muestra. Se debe especificar el proce-
dimiento para el cual se pueden promediar los puntos de datos antes de realizar el ensayo y por lo regular se documenta como
parte del procedimiento de prueba. En el ejemplo mostrado en la Tabla4, se ilustran dos guías diferentes. La Guía 1 promedia
todos los valores dentro de 20%-25% del valor máximo de relación de proteínas de células huésped. La Guía2 promedia valo-
res solo si el coeficiente de variación para los valores promedio resultantes es <20%-25%. Aunque sus conjuntos de datos no
son idénticos, ambas reglas se justifican, basándose en el argumento de que las variaciones del 20%-25% están dentro de la
variación observada en las determinaciones repetidas del ensayo y reflejan la reproducibilidad subyacente de los métodos del
inmunoensayo. En este ejemplo, ambos métodos proveen resultados muy similares. Por el contrario, la tercera guía potencial,
que informa el valor más alto medido por encima del límite de cuantificación, generaría resultados que son al menos 10% más
altos. Además, la validez de la tercera guía dependería en gran medida de la calidad del desarrollo del método.
Los inmunoensayos tipo sándwich homogéneos (incubaciones en un solo paso sin lavados entre adiciones de reactivos) son
más propensos al exceso de antígeno y a problemas resultantes de falta de linealidad de la dilución y pueden exhibir "efectos
USP42 InformaciónGeneral/ (1132) Proteína Residualde CélulasHuésped 8079
de gancho de alta dosis" en los que las muestras con grandes cantidades de antígeno proveen lecturas inexactamente bajas,
debido a que el exceso de antígeno previene la formación del sándwich completo. El uso adecuado de este formato debe con-
firmarse experimentalmente para cada tipo de muestra y puede ser aceptable si las muestras están diluidas para ensayar el
límite de cuantificación del ensayo y se confirma la ausencia de efectos de gancho.
Históricamente, algunas compañías han usado datos de recuperación de cantidades agregadas conocidas producidos en la
validación de exactitud para demostrar la linealidad. Aunque esto demuestra la dilución lineal del estándar, no demuestra la
dilución lineal de las proteínas de células huésped en las muestras. Por las razones de exceso de antígeno tratadas anteriormen-
te, la dilución lineal del estándar es una condición necesaria aunque insuficiente para demostrar la linealidad del ensayo para
diversos tipos de muestras.
Finalmente, aunque por lo general se cree que la insuficiencia del anticuerpo es la causa principal de una falta de linealidad
de dilución, otras causas potenciales son: 1) reactividad de los anticuerpos con proteína del producto, 2) la presencia de anti-
cuerpos no específicos (anticuerpos "problemáticos"), 3) reactividad de los anticuerpos a las proteínas que no son de células
huésped presentes en las muestras (tales como peptonas o albúmina sérica bovina), 4) agregación de proteínas de célula hués-
ped, 5) perfil de dilución del estándar de proteínas de célula huésped que no es representativo de las proteínas de célula hués-
ped del proceso o del producto final y 6) interferencia de la matriz de muestra. La reactividad cruzada y la interferencia de la
matriz se tratan más adelante.
4.4 Especificidad
La evaluación de la interferencia potencial de la matriz en las muestras se trata en la sección 4.1 Exactitudy se usa principal-
mente para establecer la ausencia de interferencia de la formulación (en el fármaco) y otras impurezas que por lo regular están
presentes (para muestras del proceso previo a la purificación (upstream). Otro problema de especificidad que se debe evaluar
es la reactividad cruzada potencial de los anticuerpos anti-HCP dentro del producto mismo. Aunque esto es posible, rara vez se
observan anticuerpos para proteínas de células huésped que presentan reactividad cruzada con los epítopes del producto.
En aquellos casos en los que se observa reactividad cruzada, un mayor número de señales positivas falsas del ensayo consti-
tuyen riesgos que se deben manejar. Si se sospecha reactividad cruzada, se debe establecer científicamente y de manera cuida-
dosa. En la vasta mayoría de los casos, las señales en los inmunoensayos de proteínas de células huésped son reales, lo que
indica la presencia de impurezas de proteínas de células huésped. En particular, aquellos casos en los que las proteínas de célu-
las huésped están asociadas con el producto de manera no covalente y se co-purifican, puede parecer reactividad cruzada. Sin
embargo, debido a la tremenda variedad de anticuerpos en una combinación (pool) de anticuerpos policlonales anti-HCP, al
medir las proteínas residuales de célula huésped en presencia de niveles excesivos de producto, algunos anticuerpos pueden
aún unirse al producto, generando una señal positiva falsa. En este caso, puede ser necesario modificar el ensayo o el reactivo
anti-HCP. Si se usa una valoración en plataforma HCP para analizar múltiples partidas (para el mismo programa) y se observan
distintos niveles de proteínas de célula huésped entre partidas, esto es una fuerte evidencia de que la señal de proteínas de
célula huésped positiva es real y que no se debe a reactividad cruzada.
A menudo se observa evidencia de reactividad cruzada en un producto que se ha purificado en una secuencia de pasos y
cuando los niveles de proteínas de células huésped no son reducidos por los procesos de purificación típicos. La relación pro-
teínas de célula huésped/producto (ng/mg) debe usarse de modo que se puedan comparar los cambios en la relación de pro-
teínas de célula huésped/producto durante la purificación. Primeramente, las transferencias Western del fármaco por lo regular
se sondean con anticuerpos anti-HCP para determinar si las proteínas de células huésped están asociadas de manera no cova-
lente con el producto. Si se detectan bandas que no están relacionadas con el producto, esto sugiere que no está ocurriendo
reactividad cruzada y puede requerirse un desarrollo mayor del proceso si se buscan niveles más bajos de proteínas de células
huésped.
Alternativamente, si el anticuerpo anti-HCP está reconociendo una banda asociada con el producto, esto sugiere reactividad
cruzada. Sin embargo, se debe proceder con precaución debido a que el producto está desnaturalizado (por la SDS-PAGE)y la
unión puede darse con epítopes que no son accesibles en la fase soluble nativa (es decir, en el inmunoensayo). En este caso,
una transferencia Western positiva puede tratarse de un artefacto (por el contrario, una transferencia Western negativa tam-
bién puede no detectar la reactividad cruzada, aunque esto es menos probable). Independientemente de esto, si se sospecha
reactividad cruzada, se puede confirmar y corregir mediante: 1) la adición de un producto de alta pureza (o estructuras relacio-
nadas, tales como lgG humana derivada de una fuente distinta, para un anticuerpo monoclonal) para bloquear los anticuerpos
que presentan reactividad cruzada en el ensayo, o 2) el agotamiento del anticuerpo anti-HCP en los reactivos usando una co-
lumna de afinidad del producto fabricada a partir de producto altamente purificado. En cualquier caso, es importante asegu-
rarse de que el antígeno usado para bloquear o agotar el suero está libre de proteínas de células huésped residuales. Esta infor-
mación está disponible a partir de las transferencias Western sondeadas con anticuerpos anti-HCP. Si se presentan bandas de
proteínas de células huésped, esto indica que puede ser necesario un producto de mayor pureza y se puede preparar con puri-
ficaciones ortogonales a escala de laboratorio. En ocasiones, la HPLCen fase reversa puede ser efectiva al preparar este mate-
rial, aunque esto no es útil durante la producción del producto debido a sus propiedades desnaturalizantes.
8080 (11 32) Proteína Residual de Células Huésped / Información General USP42
5. TECNOLOGÍASDE APOYO PARA LA DETECCIÓtl,IDENTIFl~ACIÓNY MEDICIÓNDE

PROTEINASRESIDUALESDE CELULASHUESPED
Los fabricantes biofarmacéuticos requieren un sistema de control integrado que ofrezca garantía de la pureza general del
producto y de la uniformidad en la fabricación. Por lo regular, la pureza de un producto se demuestra usando una combina-
ción de métodos, y este es en gran medida el caso de las proteínas de células huésped. Además del formato de inmunoensayo
tipo sándwich más común, otros tipos de ensayos proveen información complementaria valiosa. Las Tablas5, 6 y 7 proveen
información general sobre los métodos comúnmente usados para la detección, cuantificación y caracterización de proteínas de
células huésped. La Tabla5 trata métodos electroforéticos; la Tabla6 trata métodos de transferencia Western; y la Tabla7 trata
métodos cromatográficos y proteómicos. La electroforesis en gel y las inmunotransferencias se tratan también en la sección
3.2.2.2 Caracterización
de anticuerpospara proteínasde célulashuésped.
Los métodos de ensayo ortogonales usados para proveer garantías adicionales sobre la pureza y la ausencia de proteínas de
células huésped pueden usarse en cualquiera de las tres maneras siguientes "detección", "identificación" o "cuantificación". En
el caso de la detección, los ensayos ortogonales responden al interrogante de "si existe alguna proteína distinta a una forma
del producto que podría haber sido pasada por alto por el inmunoensayo." Si este es el caso, a medida que se acumula cono-
cimiento con respecto a la identidad de las proteínas de células huésped, se vuelve posible realizar una evaluación de riesgo
específica para proteínas y, en caso necesario, generar un estándar y una prueba independiente para dicha impureza particular
de proteínas de célula huésped. El método ortogonal puede entonces usarse en un modo "cuantitativo" comparando la mues-
tra de producto con el estándar de proteínas de célula huésped apropiado para la proteína de célula huésped conocida. Por
ejemplo, se puede desarrollar un método de HPLC-MS/MScuantitativo basándose en los péptidos de monitoreo que ionizan
bien a partir de digeridos de la proteína estándar analítica y de la muestra.
5.1 Consideraciones para Métodos Electroforéticos
Tres métodos electroforéticos que son útiles en los análisis de impurezas son SOS-PAGEunidimensional y bidimensional y la
SOS-electroforesis capilar que emplea tamizado sin gel (CE-SOS).En todos estos métodos, se carga muestra en exceso para
asegurar la detección de trazas de impurezas de proteínas. La desventaja es que el exceso de producto oculta impurezas que
podrían migrar a una zona cerca del producto y ocasionar interferencia. Sin embargo, los geles unidimensionales o CE-SOS
pueden ya formar parte del sistema de control de Buenas Prácticas de Fabricación para el monitoreo de fragmentos relaciona-
dos con el producto; por lo tanto, extender estos métodos para el monitoreo de proteínas de células huésped no implica análi-
sis adicional. Los geles bidimensionales se han usado para investigar la pureza del producto final y para identificar manchas
menores en los geles asociadas con las variantes de producto o impurezas de proteínas de células huésped. La presencia de
una nueva banda en el gel, o un nuevo pico en el electroferograma CE-SOS,puede representar una nueva sustancia/impureza
relacionada con el producto o puede reflejar la presencia de una impureza de proteínas de células huésped ("relacionada con
el proceso"). En cualquier caso, se justifica una investigación. Si no forma parte del sistema de control de rutina, un gel unidi-
mensional continúa siendo un excelente método para la caracterización extendida de lotes importantes, tales como lotes de
registro y para investigaciones de fabricación. Los geles y el CE-SOSson útiles para confirmar la ausencia de niveles altos de
proteínas de células huésped (si estuvieran presentes y si hubiesen sido pasados por alto en el inmunoensayo). Los geles por lo
regular se tiñen con un colorante de alta sensibilidad, tal como un fluoróforo o plata. Idealmente, la tinción debe ser compati-
ble con la digestión proteolítica en el gel y el análisis subsiguiente mediante espectrometría de masas para identificar la proteí-
na.
Las proteínas difieren en su intensidad de tinción con plata o colorantes fluorescentes; por lo tanto, solo son posibles estima-
ciones semicuantitativas de la cantidad de proteína en una banda o mancha (p. ej., las formas glicosiladas pueden no teñirse
con tanta intensidad). Sin embargo, debido a que estos métodos no se basan en anticuerpos anti-HCP, proveen una importan-
te medición ortogonal de la pureza.
Algunas proteínas pueden aparecer en geles como bandas o manchas múltiples que resultan de modificaciones post-traduc-
cionales o corte proteolítico. En la medida en que se distribuye un producto génico individual a múltiples ubicaciones en el
gel, esto reduce más la sensibilidad de los geles para detectar impurezas.
Como se analiza en la Tabla7 siguiente respecto a los métodos proteómicos, a menudo es posible extirpar/recortar bandas o
manchas de los geles. Estos fragmentos de gel extirpados pueden posteriorrnente incubarse con proteasas para promover la
digestión in situ de la proteína en péptidos. Estos péptidos pueden fraccionarse y secuenciarse posteriormente usando LC-
MS/MS y compararse con bases de datos para identificar el origen de los péptidos como relacionados con el producto o con
proteínas de células huésped.
Tabla 5. Métodos Electroforétlcos Analítlcos y de Caracterización para el Anállsls de Proteínas de Células Huésped
Senslbllldad
Aproximada para Pro-
teínas de Células Hués-
ped y Capacidad para
Método Uso Ventajas Desventajas Cuantificar
Gel unidimensional reduci- Detección de un gran nú- Separación de alta resolu- Un exceso grande de proteí- 100 ng/mg.
do o no reducido, teñido mero de muestras para ción; provee información na de producto puede Semicuantitativa a menos
con plata o colorante fluo- propósitos de uniformidad aproximada sobre el peso ocultar bandas de proteí- que se use con un estándar
rescente de alta sensibili- y presencia de bandas de molecular (MW); relativa- nas de células huésped. Di- analítico para una proteína
dad. proteínas que no corres- mente simple de correr. ferentes proteínas presen- de célula huésped conocí-
panden al producto. Se Los análisis paralelos de tan diferencias en las inten- da.
puede usar como parte del muestras proveen campa- sidades de tinción por lo
sistema de control de Bue- raciones poderosas para la que solo es semicuantitati-
nas Prácticas de Fabrica- uniformidad en la fabrica- va. Capacidad limitada de
ción. ción. las calles del gel para carga
de proteína total.
Gel bidimensional de forma- Detección de un número Separación de alta resolu- Un exceso grande de proteí- 100 ng/mg de carga de
to grande (por e.j., 20 x pequeño de muestras para ción de trazas de impure- na de producto puede proteína total).
25 cm), teñido con plata o propósitos de uniformidad zas de proteínas de células ocultar manchas de proteí- Semicuantitativa a menos
colorante fluorescente de y presencia de manchas de huésped a partir del pro- nas de células huésped. Di- que se use con un estándar
alta sensibilidad. proteínas desconocidas. dueto. Provee el peso mo- ferentes proteínas presen- analítico para una proteína
No adecuado para uso ru- lecular aproximado y la in- tan diferencias en las inten- de célula huésped conocí-
tinario en la liberación de formación de pi de las sidades de tinción por lo da.
lote, pero se puede usar manchas de proteínas. que solo es semícuantitati-
para la caracterización de va. Resultados altamente
lotes específicos o estánda- dependientes de la técnica
res de proteínas de células que requieren personal ca-
huésped. pacitado y equipo sofistica-
do.
CE-SDScon detector de Detección de un número Método rápido de alta reso- La sensibilidad puede no ser 1000 ng/mg (0,1% de car-
fluorescencia inducida por grande de muestras para lución para separar proteí- tan grande como con un ga de proteína total).
láser (UF, por sus siglas en propósitos de uniformidad nas marcadas con fluores- gel unidimensional con Semicuantitativa a menos
inglés). Las muestras mar- y presencia de picos de cencia. una tinción altamente sen- que se use con un estándar
cadas con fluorescencia se proteínas desconocidas. Se sible. Las etiquetas fluores- analítico para una proteína
separan como muestras re- puede usar como parte del centes no son específicas de célula huésped conocí-
ducidas o no reducidas. sistema de control de Bue- para proteínas de células da.
nas Prácticas de Fabrica- huésped, por lo que no
ción. existe distinción entre las
proteínas de células hués-
ped y los péptidos relacio-
nados con el producto. Di-
fícil de extender a otras
mediciones, tales como
transferencias Western, o
para identificar picos de
proteínas.
5.2 Consideraciones para Métodos de Transferencia Western (Western Blot)
La técnica de transferencia Western (Western Blot) es complementaria al inmunoensayo tipo sándwich para demostrar la pu-
reza del producto y para caracterizar los reactivos inmunoquímicos usados en el inmunoensayo (ver 3.2.2.2 Caracterizaciónde
Anticuerpospara Proteínasde CélulasHuésped).Cuando se usan anticuerpos anti-HCP como sonda, puede ser útil para: 1) de-
tectar las proteínas de células huésped que están asociadas de manera no covalente con el producto y (potencialmente) pasa-
dos por alto en el inmunoensayo, o 2) monitorear una proteína de célula huésped individual. En otros casos, una proteína que
reacciona bien en el inmunoensayo puede no ser detectada en la transferencia Western debido a la pérdida de un epítope
conformacional después de la desnaturalización. Las inmunotransferencias requieren solo un anticuerpo para una proteína da-
da, mientras que los inmunoensayos tipo sándwich requieren dos. Eltrabajo previo ha mostrado que los anticuerpos de alta
afinidad que reaccionan con una proteína de célula huésped dada pueden ser más sensibles que la tinción de geles con plata o
fluorescente.
Las transferencias Western unidimensionales de producto final proveen un método ortogonal simple y confiable para demos-
trar la pureza del producto. Aunque se puede usar la misma preparación del anticuerpo en el inmunoensayo y en la transferen-
cia Western, por las razones citadas anteriormente, la transferencia puede proveer información adicional sobre las trazas de
proteínas (y no detectar otras), lo que le da su naturaleza ortogonal. La Tabla 6 presenta las ventajas y desventajas de los méto-
dos de transferencia western unidimensionales y bidimensionales para estos propósitos.
A continuación se presenta una lista de las principales consideraciones para la optimización de los métodos SDS-PAGE/
Western:
• Formato y tamaño del gel bidimensional: Los formatos de mayor tamaño (18 cm de longitud o mayores) resuelven proteí-
nas mejor y se presentan en una variedad de modos de aplicación de isoelectroenfoque (IEF)y dimensiones de peso mole-
cular (p. ej., gradientes). La tinción de proteína total de varios formatos puede ser estudiada para optimizar la separación
en ambas dimensiones y encontrar así el equilibrio que separa la mayoría (o el número máximo) de proteínas de células
huésped.
• Se debe optimizar la carga en los geles bidimensionales para equilibrar la sensibilidad requerida (carga mayor) en función
de la resolución deseada (carga menor). Es necesario equilibrar la carga de proteína, el contenido iónico de la muestra y la
velocidad de separación para evitar el sobrecalentamiento y para optimizar la resolución. Las tinciones o sustratos que se
van a usar influirán en esta decisión. Por lo regular, se carga más para la inmunotransferencia (p. ej., 200 µg) que para el
gel o transferencia teñidos con proteína total (p. ej., 50 µg para tinciones en plata). La diferencia en la carga puede afec-
tar en cierto grado la separación; por lo tanto, encontrar el balance adecuado requerirá de experimentación.
• El desarrollo de la señal para la proteína total (gel o transferencia) y la transferencia Western requiere de experimentación
importante (p. ej., tipos de colorantes, tiempos de exposición, condiciones del amortiguador) para su optimización. Por
ejemplo, debido a que es importante detectar tantas bandas como sea posible, en ocasiones la señal se amplifica tanto
que las especies más abundantes obstruyen a las otras, o el fondo aumenta y se pierde el contraste. Un asunto relaciona-
do es la estandarización y calibración del densitómetro o del generador de imágenes, el cual se debe ajustar de manera
precisa para lograr la uniformidad en condiciones determinadas experimentalmente. La optimización de reactivos y del
instrumento pueden requerir de tiempo significativo para establecer de manera reproducible las condiciones optimizadas
en las que la señal se maximiza y el fondo se minimiza (ver también (1104)).
• Los reactivos de transferencia y de bloqueo requieren de experimentación para identificar las mejores condiciones (tales
como amortiguadores, potencia/tiempo del instrumento, temperatura y bloqueantes).
Tabla 6. Métodos de Transferencia Western Analítlcos y de Caracterización para el Anállsls de Proteinas de Células Huésped
Senslbllldad
Aproximada y Capad-
dad para Cuantificar
Proteínas de Células
Método Uso Ventajas Desventajas Huésped
Gel unidimensional,transfe- Detecciónde un número Separaciónde alta resolu- Requiereuna fuente de anti- No cuantitativo para proteí-
rencia Western grande de muestras para ción; provee información cuerpos anti-HCPde alta nas de células huésped a
propósitos de uniformidad aproximada sobre el peso calidad. Un gran exceso de menos que se use un es-
y presenciade bandas de molecular(MW);relativa- producto en el gel puede tándar de proteína especí-
proteínas desconocidas mente simple de correr. llevara la tinción no espe- fico. Lasensibilidaddepen-
que reaccionan con anti- Losanálisisparalelosde cfficade las bandas de pro- de completamente de la
cuerpos anti-HCP.Se pue- muestras proveen compa- duetos. Ladesnaturaliza- calidad del anticuerpo.
de usar como parte del sis- raciones poderosas de lo- ción inducida por SDSde
tema de control de Buenas tes. las proteínas conllevaa la
Prácticasde Fabricación. pérdida de epítopes con-
formacionales.
TransferenciaWestern en Detecciónde un número Separaciónde alta resolu- Requiereuna fuente de anti- No cuantitativo para proteí-
gel bidimensionalde for- pequeño de muestras para ción de trazas de impure- cuerpos anti-HCPde alta nas de células huésped a
mato grande (p. ej., 20 x propósitos de uniformidad zas de proteínas de células calidad. Un exceso grande menos que se use un es-
25 cm) con quimioluminis- y presenciade manchas de huésped a partir del pro- de proteína de producto tándar de proteína especí-
cencia o detección de alta proteínas desconocidas dueto. Provee el peso mo- puede ocultar manchas de fico.
sensibilidadsimilar. que reaccionan con anti- lecularaproximado y la in- proteínas de células hués- Lasensibilidaddepende to-
cuerpos de proteínas de formación de pi de las ped. Ladesnaturalización talmente de la calidad del
células huésped. No ade- manchas de proteínas. en SDSde proteínas con- anticuerpo, pero es posible
cuado para uso rutinario, llevaa la pérdida de epíto- un valor de 100 ng/mg.
pero se puede usar para la pes conformacionales.Pro-
caracterizaciónde lotes es- duce resultadosaltamente
pecfficosde producto o la dependientes de la técnica
caracterizaciónde reacti- que requieren personal ca-
vos de anticuerpos. pacitado y equipo sofistica-
do.
5.3 Consideraciones para Métodos Cromatográficos y Proteómicos

Las técnicas de espectrometría de masas para la detección, identificación y cuantificación de proteínas de células huésped
individuales están evolucionando rápidamente y aprovecha una gran parte de la tecnología desarrollada para proteómicos.
Además, a medida que ponen a disposición nuevas bases de datos genómicos (p. ej., el genoma CHO), los enfoques espectro-
métricos de masa se vuelven más útiles. Estos métodos (ver también Aplicaciones de Espectrometría de Masas(1736) para infor-
mación adicional) a menudo combinan la preparación de la muestra tal como reducción, alquilación y digestión proteolítica,
seguida por separación (p. ej., cromatografía de fase reversa RP-HPLCde) antes de la introducción en un espectrómetro de
masas que fragmenta todas las proteínas, proveyendo así una secuencia de aminoácidos para cada péptido. La información de
la secuencia resultante se compara con la secuencia del producto para identificar fragmentos relacionados con el producto y
con una base de datos relacionada con el huésped (p. ej., E. coli, CHO) para identificar proteínas de células huésped.
USP42 InformaciónGeneral/ (11 32) Proteína Residual de Células Huésped 8083
Un desafío para el análisis por Espectrometría de Masas proviene del abrumador número de péptidos relacionados con el
producto relativos a los péptidos de impurezas. Un enfoque para tratar este problema de ionización competitiva de los pépti-
dos (también denominada supresión iónica de los péptidos de la proteína de célula huésped por parte de los péptidos del pro-
ducto), consiste en aplicar el análisis LC-MS/MSsobre preparaciones de proteínas de células huésped parcialmente resueltas
(p. ej., fracciones de HPLC).Esta purificación reduce la contribución del producto a los iones totales en el espectrómetro de
masas. Se encuentran en desarrollo otros enfoques. Las mejoras tecnológicas recientes tales como 1) resinas para cromatogra-
fía capaces de resolver de manera efectiva usando fases móviles aptas para MS, 2) interfaces mejoradas para sistemas de sepa-
ración por LC de extremo frontal y/o IEF,y 3) espectrómetros de masas con mayor resolución de masas, exactitud y velocida-
des más altas de barrido, ahora posibilitan la identificación y cuantificación de proteínas de células huésped específicas en fár-
macos con un alto grado de confianza. Los principales cambios en términos de sensibilidad y cuantificación de conjuntos sufi-
cientemente grandes de proteínas de células huésped heterogéneas, el costo y los problemas relacionados con el control de
calidad aún deben resolverse antes de que esta tecnología pueda reemplazar a los inmunoensayos para el control de proteínas
de células huésped en fármacos.
Como un método de caracterización ortogonal al inmunoensayo de proteínas de células huésped, los datos de LC-MS/MS
pueden usarse de dos maneras. Primero, si el método basado en Espectrometría de Masas no encuentra proteínas de células
huésped en muestras que también estuvieron por debajo del límite de cuantificación en el inmunoensayo, entonces estas téc-
nicas ortogonales pueden aumentar la confianza de que el ELISAde proteínas de células huésped no fallará en detectar una
proteína de célula huésped que se ha co-purificado. El límite de detección para muchos métodos de LC-MS/MSse encuentra
actualmente en el intervalo de aproximadamente 1O a 100 ng de proteína de célula huésped por mg de producto. Por lo tan-
to, es lo suficientemente sensible para descartar una proteína de célula huésped individual que esté presente a un nivel alto y
es más sensible que los geles. Segundo, si se identifica una impureza a un nivel alto o a otro que represente una preocupación
para la seguridad, entonces se puede evaluar si es necesario mejorar el proceso de purificación para eliminarla, o si el sistema
de control vigente es adecuado, y si se requiere desarrollar una valoración específica. La ausencia de señal no es evidencia de la
ausencia de proteínas de células huésped, pero una vez que se ha identificado una proteína de célula huésped, se puede mejo-
rar la sensibilidad de la LC-MS/MS.La LC-MS/MSes complementaria a otras tecnologías de proteínas de células huésped y su
valor como método ortogonal sigue aumentando. La discusión detallada de todos los enfoques proteómicos al análisis de pro-
teínas de células huésped está fuera del alcance de este capítulo, debido en parte a que el campo está evolucionando de ma-
nera tan rápida que cualquier revisión perdería su vigencia rápidamente.
Las proteínas de células huésped intactas también pueden ser separadas usando HPLCcon detección UV.Por ejemplo, el
perfil ha sido usado para comparar distintos lotes de corridas celulares nulas. Los lectores deben referirse al capítulo Cromato-
grafía(621) para los fundamentos científicos de los métodos cromatográficos de HPLC.Debido a que las proteínas de células
huésped difieren en abundancia y a que la cromatografía puede no proveer una resolución única de todas las proteínas, una
proteína de célula huésped individual debe constituir aproximadamente 1o/o(o menos con buena resolución) de la población
total de proteínas para una posible detección (incluso así, una proteína de célula huésped determinada puede verse obstruida
por el producto, dependiendo de su tiempo de retención). Sin embargo, la investigación de picos desconocidos como una
práctica general y las comparaciones de los perfiles cromatográficos de proteínas de células huésped de corridas de células
nulas pueden ser útiles para determinar la similitud de las proteínas de células huésped producidas en distintas condiciones de
cultivo.
Al igual que con los métodos electroforéticos tratados en este capítulo, la separación en fase reversa de muestras de produc-
tos separados proteolíticamente con detección UVpuede ya estar incluida en un sistema de control de Buenas Prácticas de
Fabricación como parte del análisis del producto. La presencia de picos nuevos o inesperados en el cromatograma UVpuede
indicar la presencia de una impureza de proteína de célula huésped, aunque este método no es excesivamente sensible (-1 o/o
de impureza si no se ve obstruido por otros picos). Sin embargo, debido a que no se requiere un nuevo análisis o preparación
de muestra, se debe considerar esta oportunidad de usar un método ortogonal para determinar la pureza.
Tabla 7. Métodos Cromatográflcos y Proteómlcos Analíticos y de Caracterización para el Anállsls de Proteínas de Células Huésped
Senslbllldad
Aproximada y Capad-
Método Uso Ventajas Desventajas dad para Cuantificar
Espectrometría de Masas Identificación de proteínas Permite la identificación y el Método de bajo rendimien- 100 ng/mg y semicuantita-
- individuales de células monitoreo de proteínas in- to que requiere de signifi- tivo si se usa en el modo
HPLC/ionización por elec- huésped. Se puede aplicar dividuales de células hués- cativa preparación de la de descrubrimiento para
trospray (ESl)-MS/MSo a la caracterización de un ped. Se puede combinar muestra, personal capad- proteínas de células hués-
clEF/ESI-MS/MSo MALDI- lote de producto purifica- con geles para identificar tado e instrumentos sofisti- ped desconocidas. 1O
TOF de digeridos de pro- do o a estándares de pro- las proteínas individuales cados. ng/mg (o posiblemente
teína teínas de células huésped observadas en geles. mejor) y cuantitativa si se
de corrida de células nulas. usa con un estándar analí-
tico para una proteína de
células huésped conocida.
8084 (11 32) Proteína Residual de Células Huésped / InformaciónGeneral USP42
Tabla 7. Métodos Cromatográflcos y Proteómlcos Analítlcos y de Caracterización para el Análisis de Proteínas de Células Huésped
(Continuación)
Sensibilidad
Aproximada y Capad-
Método Uso Ventajas Desventajas dad para Cuantificar
RP-HPLC/UV o RP- Adecuado para comparar Alta resolución,separa pro- Difícilde encontrar una 10 000 ng/mg (1%).
UHPLC/UV. Puede aplicarse estándares de corrida de teínas de célulashuésped combinación de fase esta- Semicuantitativaa menos
a proteínas intactas o dige- células nulas si las proteí- basándose en la hidrofobi- cionariay fase móvil para que se use con un estándar
ridos proteolíticos nas están bien separadas. cidad y el tamaño; es posi- resolvery eluirtodas las analítico para una proteína
Lasproteínas más grandes ble la comparación directa proteínas de células hués- de célula huésped conocí-
pueden requerir proteólisis de cepa nula y cepa del ped. Lacoelución puede da.
limitadao reducción para producto mediante super- dificultarla cuantificación
mejorar la resolución. posiciones. de proteínas específicas.La
alta concentración de picos
de productos puede inter-
ferir con la detección de
trazas de proteínas de célu-
las huésped.
5.4 ComentariosFinalessobreTecnologíasde Apoyo para Proteínasde CélulasHuésped
Con el paso del tiempo, se han intentado diversas técnicas analíticas híbridas. Un ejemplo es el fraccionamiento de estánda-
res de proteínas de células huésped mediante intercambio iónico, seguido de cromatografía en fase reversa y luego un inmu-
noensayo o análisis por Espectrometría de Masas (MS bidimensional) en las proteínas de las fracciones finales. Alternativamen-
te, se ha evaluado la "sustracción de producto" para eliminar el grueso de la proteína total a partir de las muestras de produc-
to antes de la electroforesis en gel del análisis LC-MS/MS. Estos métodos híbridos para la determinación de cobertura requie-
ren mucho trabajo y pueden introducir artefactos o sesgo de sí mismos (p. ej., los anticuerpos para productos por lo regular no
eliminan la multitud de formas heterogéneas). Por ende, no se han aplicado de manera tan amplia, aunque en algunos casos
puntuales pueden proveer información sobre la naturaleza de las impurezas del producto.
La electroforesis, la transferencia Western y el inmunoensayo se mantienen como los métodos de uso más amplio para la
caracterización de reactivos de proteínas de células huésped y para demostrar la depuración de proteínas de células huésped
por parte de los procesos de purificación, debido a que son robustos, sensibles y pueden abarcar un amplio rango de impure-
zas de proteínas. El inmunoensayo y (cada vez más) la espectrometría de masas son altamente complementarias y son los mé-
todos más poderosos para monitorear niveles de proteínas de células huésped residuales en muestras y para confirmar su au-
sencia en el fármaco final.
6. USO DE INMUNOENSAYOS
DE PRQTEÍNASDE CÉLJJLAS
HUÉSPEDPARA DESARROLLO,
CARACTERIZACION
Y VALIDACIONDELPROCESO
Según se describió anteriormente, aunque el análisis de proteínas de células huésped tiene limitaciones como ensayo cuanti-
tativo, si el inmunoensayo puede detectar de manera rápida y robusta la mayoría de las proteínas de células huésped, entonces
es extremadamente valioso durante el desarrollo, la caracterización y la validación del proceso. La depuración de proteínas de
células huésped en cada etapa intermedia del proceso en una variedad de condiciones representa datos valiosos. Su aplicación
al proceso de validación requiere la demostración de que el ensayo es científicamente sólido y adecuado para el propósito pre-
visto y que está apropiadamente documentado. Según se indicó anteriormente, las combinaciones del proceso pueden diferir
ampliamente en lo que respecta a los componentes del amortiguador, a la concentración del producto y a la composición de
las proteínas de células huésped. Como mínimo, es necesaria la recuperación aceptable de cantidades agregadas conocidas del
estándar de las proteínas de células huésped en las muestras de combinaciones del proceso para calificar las diluciones de
prueba de las diversas combinaciones en el ensayo. Además, analizar cada tipo de muestra en diluciones múltiples es útil du-
rante el desarrollo para verificar que: 1) los resultados están dentro del intervalo del ensayo y 2) se considera la falta de lineali-
dad en la dilución de la muestra. En los casos en los que se demuestra que el proceso depura proteínas de células huésped de
manera robusta, la validación del proceso también puede usarse para justificar el no contar con una prueba de proteínas de
células huésped de rutina como parte del sistema de control de Buenas Prácticas de Fabricación vigentes.
La Figura5 ilustra los datos recolectados durante el desarrollo y la validación del proceso y muestra la dependencia en la
dilución de una variedad de combinaciones del proceso (la Combinación1 es posterior al primer paso de purificación de fluido
del cultivo celular, la Combinación2 es la siguiente, y así sucesivamente) a través del mismo. La Figura5 muestra la relación de
proteínas de células huésped (en ng/mg) en el eje ygraficado contra la dilución del producto en el pocillo de prueba en el eje
x. Cada muestra se diluye en serie a través de tres o cuatro diluciones al medio. La dilución inicial se determina por la necesi-
dad de diluir muestras con altos niveles de proteína de célula huésped en el intervalo de la valoración y la necesidad de anali-
zar solo diluciones en las que ya se haya demostrado una recuperación de cantidad conocida agregada aceptable. En la Figura
5, el fluido del cultivo celular tiene un poco más de 1 millón de ng de proteína de célula huésped por mg de producto, lo que
significa que un poco menos de la mitad de la proteína total en el fluido del cultivo celular es producto. La primera combina-
ción de columna reduce el nivel de proteína de célula huésped a apenas por encima de 1O 000 ng/mg. La segunda columna
Lt
tiene una depuración de proteína de célula huésped mínima; la tercera columna reduce el intervalo de proteína de célula hués-
ped a 1000 ng/mg. La columna final en el proceso reduce el nivel de proteína de célula huésped en 2 logaritmos adicionales,
lo que resulta en una proporción final de proteínas de células huésped de 1O ng/mg. Todas las combinaciones intermedias
presentan valores de proporción de proteínas de células huésped que son independientes de la dilución de la muestra.
10000000 ~---------------~
íi, 1 000 000 1--L-iq~u~d-º~ _d'~';,"_lt~~'°-c,_r,r_"
_________ __,
~
S: 100 ooor-------------------l
$ Combinación 1
l 10 000 f-------~•~•~• -------i
~-~C,.=ºm=:=m:=ció="~'
i 1 000 f----------_._,....,~-------l
3 Comb'inación3
~ 100 f--------------------l
~ Combinación Final
10f----------------''-+--.-J
1 Dilución
Figura 5. Ejemplo de depuración de proteínas de células huésped mediante cada etapa de purificación. Dentro de un con-
junto de muestra, el primer valor es la mayor dilución en su serie de diluciones.
La Figura6 presenta un conjunto de datos para un proceso de recuperación diferente. Al igual que en la Figura5, se grafican
los datos de la relación de proteínas de células huésped para una serie de diluciones al medio de cada muestra de combinación
del proceso. Para el líquido de cultivo celular y las combinaciones de las columnas 1 y 2, la proporción de proteínas de células
huésped (ng/mg) es independiente de la dilución de la muestra (la linealidad de la dilución se logra al igual que en la Figura
5). Sin embargo, después de procesar la tercera columna, se vuelve aparente en el ensayo una dependencia distintiva de la
dilución. Esta dilución no lineal está probablemente asociada con el exceso de antígeno con respecto al anticuerpo disponible
para el conjunto particular de proteínas de células huésped en la muestra (es decir, un número individual o limitado de espe-
cies de proteínas de células huésped co-purifican con el producto). Con la purificación del producto, se debe colocar más pro-
ducto en el pocillo del ensayo para que las proteínas de células huésped sean detectables en el inmunoensayo. La concentra-
ción de producto en el ensayo puede aumentarse con cada etapa de purificación y, por ende, existe un aumento similar en la
concentración de la impureza de proteínas de células huésped que co-purifica. Al llegar a la columna 3, la cantidad de impure-
zas probablemente excede la capacidad de los anticuerpos disponibles. Este fenómeno se repite en la combinación final, lo
que no implica una depuración de proteínas de células huésped sino únicamente el intercambio de amortiguadores mediante
UF/DF.Elvalor de informe para estas combinaciones es el que se obtiene diluyendo la muestra hasta cerca del límite de cuanti-
ficación del ensayo (la muestra más diluida de la serie) usando un método descrito en la Tabla4, que en este caso es aproxima-
damente 300 ng/mg. La subsección 4.3 Linealidadde la Muestrade la sección 4. Validaciónde Métodosde lnmunoensayode
Proteínasde CélulasHuéspedprovee información adicional sobre la falta de linealidad del ensayo.
10 000000 ~--------------~
Líquido de Cultivo Celular
1000000·····
o,
i 100 000 f-------------------1
i
.;:
~
..,
1O 000 1-------
..... .
Combinación l
............... ...
~ 1 000 Combinación 2 -----l
~ x x Combinación 3
~ 100 f-------------•-'•'--,cx~----l
_.,,a
1
X
6
Combinación Fina! ~
10 .__ ______________ __,
Dilución
Figura 6. Ejemplo de depuración de proteínas de células huésped con un proceso de purificación. Dentro de un conjunto de
muestra, el primer valor es la mayor dilución en su serie de diluciones.
6.1 Ensayospara Proteínas de CélulasHuésped Individuales
En algunos casos, un proceso de fabricación puede resultar en la producción de niveles relativamente elevados de una pro-
teína de célula huésped individual que pueden generar sesgo en los resultados informados. Tal como se discutió anteriormen-
te, en este caso la concentración de los anticuerpos presentes en el ensayo de proteínas totales de células huésped puede no
ser suficiente para capturar en su totalidad dicha proteína de célula huésped particular presente. En tales casos, cuando se pre-
sente una proteína de célula huésped individual conocida, puede ser necesario otro ensayo para dicha proteína de célula hués-
ped individual. Por ejemplo, en el caso de los cultivos de producción de E. coli, pueden producirse a niveles muy altos de cha-
peronas de coexpresión u otras enzimas de procesamiento que ayudan a plegar o con la formación de disulfuro. Además, estas
chaperonas pueden estar presentes en el inmunógeno usado para desarrollar los reactivos del ensayo de proteínas de células
huésped, en una conformación que sea distinta a la que la proteína presenta en las muestras. Por ende, los anticuerpos produ-
cidos para chaperonas no unidas pueden no reconocer, o reconocer de manera deficiente, las proteínas de células huésped
unidas al producto. En este caso, puede ser necesario desarrollar ensayos independientes usando anticuerpos apropiados. La
existencia de altos niveles de una proteína de célula huésped individual no es exclusiva a los cultivos celulares bacterianos y
puede presentarse con cualquier sistema de expresión celular. Otro ejemplo es cuando una proteína se agrega intencionalmen-
te como parte del procesamiento, entonces se trata como una proteína de célula huésped individual, y un ensayo específico
proveerá mejores datos (que el inmunoensayo de proteínas de células huésped total).
6.2 Estrategia de Control
6.2.1 OBJETIVOS,LÍMITESDE ALERTA

Y LÍMITESDE RECHAZO
En las reglamentaciones de los Estados Unidos y de la Unión Europea, así como en otros mercados en general, las proteínas
de células huésped se describen como impurezas relacionadas con el proceso, y las guías indican que su presencia debe ser
minimizada mediante el uso de procesos de fabricación apropiados bien controlados. El Título 21 del CFR 610.13 de los EE.UU.
requiere que los productos biológicos estén " ... exentos de material extraño, excepto cuando sea inevitable ... ". La guía ICH
Q6B indica que los fabricantes de productos biológicos deben evaluar las impurezas que pudieran estar presentes y desarrollar
criterios de aceptación para las impurezas basándose en su experiencia preclínica y clínica. Sin embargo, la guía reglamentaria
también reconoce los desafíos inherentes relacionados con el uso de datos específicos del ensayo y de reactivos específicos
para el producto y el proceso. Las Guía indica que "La pureza absoluta de productos biotecnológicos y biológicos es difícil de
determinar y los resultados son dependientes del método" (ICH Q6B), y que "De la misma manera, la estandarización de los
métodos analíticos sería problemática debido a que los reactivos usados están relacionados con el producto y con el sistema de
producción" [Agencia Europea para la Evaluación de Productos Medicinales (EMEA,por sus siglas en inglés) 1997].
Aunque la guía de la FDAdescribe la necesidad de analizar la presencia de proteínas de células huésped, también permite,
mediante validación, la eliminación del requisito de la prueba de liberación, una vez que se haya demostrado la uniformidad
de la depuración. Existe la expectativa de que, siempre que sea posible, las impurezas introducidas por los procesos de fabrica-
ción y que permanecen en los productos deben estar por debajo de los niveles detectables basados en un método analítico
altamente sensible. Sin embargo, un estudio de depuración apropiadamente realizado como parte del proceso de validación
puede ser un sustituto aceptable del análisis de lotes (Certificado de Análisis) (FDA1997), incluso cuando se encuentren pre-
sentes niveles bajos de proteínas de células huésped en el fármaco. Además, "Si las impurezas son cualitativa y cuantitativa-
mente las mismas (es decir, las cantidades y/o concentraciones relativas) en el fármaco, no es necesario el análisis del medica-
mento" (ICH Q6B). Este es el caso para las proteínas de células huésped, cuya concentración en el medicamento puede inferir-
se a partir del fármaco, debido a que el proceso de fabricación no introduce, o depura, proteínas de células huésped al mo-
mento de convertir el fármaco en el medicamento. Por ende, en estos casos, por lo general no se requiere el análisis de proteí-
nas de células huésped del medicamento.
El objetivo global es desarrollar procesos que minimicen las cantidades de proteínas de células huésped residuales en fárma-
cos. Al usar inmunoensayos de proteínas de células huésped como parte de un sistema de control de fabricación, es necesario
establecer límites para resultados aceptables. La "diana" para proteínas de célula huésped en un producto final provee al gru-
po de desarrollo de la purificación un objetivo para el proceso, el cual se puede alcanzar o no. Los procesos de anticuerpos con
pasos de cromatografía de afinidad altamente selectiva (p. ej., que usan Proteína A) en ocasiones son capaces de conseguir
una sensibilidad de 1 ng de proteína de célula huésped por mg de proteína. Los niveles de proteínas de células huésped espe-
rados determinan el criterio del diseño que se usará posteriormente para desarrollar el proceso.
Los lotes para toxicología preclínica son los primeros lotes para los que se deben determinar valores oficiales de proteínas de
células huésped, debido a que en este punto en el desarrollo del producto, el investigador se encuentra construyendo el con-
junto de datos que se usará para sustentar la seguridad de los estudios clínicos subsiguientes. A medida que la molécula avanza
en el desarrollo clínico, los estudios precedentes se usan para sustentar la seguridad (y los riesgos) proyectada asociada con los
estudios subsiguientes. Idealmente, los cambios en el nivel de proteínas de células huésped y, por ende, la exposición clínica,
debe reducirse a medida que el producto se mueve a través del desarrollo clínico.
Como parte de una estrategia de control general, los "límites de rechazo" son aquellos niveles que, de ser excedidos, resul-
tarán en un producto no apto para uso. Durante el desarrollo del producto, aumenta el conocimiento sobre el proceso y el
producto; por lo tanto, se espera que los límites de rechazo se ajusten a medida que se avanza del material para toxicología al
material de fase 1/11,al de la fase IIIy finalmente al material comercial. El perfil de cada medicamento candidato y su programa
clínico es único; por consiguiente, ningún límite numérico individual es aplicable a todos los casos.
Los límites de rechazo están principalmente relacionados con la seguridad del paciente. Por lo regular, no se cuenta con da-
tos específicos que documenten niveles "inseguros" de proteínas de células huésped. En su lugar, se deben determinar niveles
aceptables para los productos de etapas tempranas mediante una evaluación de riesgos (incluyendo datos no clínicos, biblio-
grafía disponible, experiencia previa con productos fabricados usando la misma línea celular o una similar, entre otros). Para
productos comerciales, los niveles aceptables también se basan en la experiencia recabada durante los ensayos clínicos. Debido
a que los perfiles de impurezas de proteínas de células huésped pueden verse influenciados por el proceso de purificación, las
USP 42 Información General/ (1132) Proteína Residual de Células Huésped 8087
partidas de registro usadas en los ensayos clínicos de pivote deben ser representativos del proceso que se va a comercializar.
Los límites de rechazo para el producto comercial deben establecerse para excluir valores de proteínas de células huésped que
estén fuera del rango de experiencia clínica que sirvió como base para tomar la decisión de riesgo/beneficio para el biofárma-
co.
Los límites de alerta, límites de tendencias o límites de acción (compañías distintas emplean distintos términos) reflejan las
consideraciones de la uniformidad en la fabricación. En un proceso comercial, debe existir un historial de fabricación suficiente
para poder definir los resultados que estén fuera de la tendencia. Sin embargo, en las etapas tempranas del desarrollo del pro-
ducto, cuando se cuenta con un historial corto o nulo de fabricación, se pueden usar los límites de acción para establecer lími-
tes superiores sobre las proteínas de células huésped esperadas, basándose en la experiencia con productos similares para los
que existe un historial, o comparando con el valor esperado. Exceder dichos límites debe desencadenar una investigación para
determinar si el lote es liberable. Las mediciones ortogonales de pureza del producto son valiosas en dichas investigaciones.
Con el surgimiento de mediciones ortogonales de pureza, se debe evaluar cualquier señal atípica no relacionada con el pro-
ducto. Se deben realizar esfuerzos para revisar el proceso de purificación para eliminar cualquier proteína de célula huésped no
deseada a niveles más altos que los niveles deseados (basándose en, por ejemplo, datos clínicos y no clínicos, bibliografía dis-
ponible, etc.), o se debe proveer una justificación específica de su aceptabilidad. Esto se logra como parte de un análisis de
riesgo que tome en cuenta la exposición clínica similar a la descrita anteriormente para inmunoensayos.
En los casos en los que los ensayos de proteínas de células presentan mejorías o cambios debidos a eventos inesperados,
puede ser necesario modificar los límites de rechazo y, en algunos casos, incluso aumentarlos (si el nuevo ensayo tiene una
cobertura más amplia). Sin embargo, es esencial que las muestras se analicen en estudios puente para asegurar que no se pa-
sará por alto ningún cambio en la calidad durante la nueva valoración mejorada. En algunos casos, los ensayos mejorados pro-
veen valores más altos, por lo que se requerirán estudios puente (contrastando el ensayo original con el ensayo mejorado) para
justificar el nuevo límite de especificación.
6.2.2 CONSIDERACIONES
DE SEGURIDADDURANTEELESTABLECIMIENTO
DE LÍMITES
Los límites de especificación de proteínas de células huésped en unidades de ng/mg por lo regular se establecen usando las
capacidades del proceso y también basándose en la experiencia clínica (es decir, los niveles usados en ensayos en los que se
conocen los resultados clínicos). Aunque existen diversas preocupaciones teóricas de seguridad con respecto a las impurezas
de proteínas de células huésped, la inmunogenicidad de la impureza es un aspecto primario a considerar. Una respuesta inmu-
ne puede incluir la formación de anticuerpos dirigidos contra la proteína de célula huésped o dirigida contra la proteína tera-
péutica, donde se cree que la proteína de célula huésped ha actuado como un adyuvante. Se refiere a los lectores al capítulo
(11 06) para una discusión más profunda de factores que influyen sobre la inmunogenicidad. Cuando los pacientes reciben
más de una proteína bioterapéutica con sus impurezas asociadas, la inmunogenicidad se vuelve una preocupación aún mayor
Aunque los productos de alta dosis pueden tener una masa mayor de proteínas de células huésped residuales por dosis y esto
debe considerarse durante las evaluaciones de riesgos, el efecto potencial no es necesariamente predecible a partir de un resul-
tado clínico. En algunos casos, niveles muy bajos de algunas proteínas de células huésped han demostrado tener efectos clíni-
cos, mientras que niveles mayores de otras proteínas de células huésped no han presentado efecto alguno.
Se pueden establecer diversos límites, dependiendo de si el producto tiene una o un número muy limitado de proteínas de
células huésped que co-purifican o si presenta multiplicidad de proteínas de células huésped, cada una presente como una
pequeña fracción del nivel de proteínas de células huésped total en el producto. Esto puede llevar a un ensayo y especificación
independientes para proteínas de células huésped individuales que no pueden depurarse del proceso y que se espera estén
presentes en el fármaco y que pudieran presentar bioactividad.
El origen de la célula huésped también puede ser un aspecto a tener en cuenta. Es posible que las proteínas de células hués-
ped de líneas celulares humanas (p. ej., células HEK293) puedan presentar un riesgo menor de inmunogenicidad que las pro-
teínas de células huésped de especies relacionadas más distantes debido a la homología de las secuencias. Sin embargo, si es-
tas proteínas son por lo regular intracelulares, entonces aún podrían ser inmunógenas y podrían ser observadas como "extra-
ñas" por el sistema inmune del paciente. Si se desarrollan dichos anticuerpos, estos podrían presentar una reacción cruzada
con proteínas humanas endógenas y neutralizar o volver inefectivos uno o más sistemas biológicos necesarios. En consecuen-
cia, se pueden presentar argumentos sobre ambos lados; por ende, por lo general se cree que los riesgos basados en la línea
celular de producción (microbiana contra mamífera) son los mismos y que prácticamente no pueden ser informativos a priori.
Además de considerar la inmunogenicidad, la proteína de célula huésped puede ser bioactiva y presentar un riesgo. Por
ejemplo, un homólogo de hámster de una proteína terapéutica expresada en células CHO puede ser lo suficientemente similar
al producto para presentar co-purificación. Alternativamente, un producto de anticuerpo de citoquina antihumana expresado
en células CHO puede unirse a la citoquina de hámster homóloga, y el complejo podría co-purificar con el producto del anti-
cuerpo. En ambos casos, las proteínas de hámster homólogo pueden estar biológicamente activas al administrarlas a los pa-
cientes.
7. RESUMENY CONCLUSIONES
Los productos biofarmacéuticos deben estar libres de proteínas de células huésped residuales en la medida de lo posible. La
norma de la industria para medir proteínas de células huésped es un inmunoensayo tipo sándwich que usa anticuerpos policlo-
8088 (11 32) Proteína Residual de Células Huésped / InformaciónGeneral USP42
nales dirigidos contra el espectro más amplio posible de potenciales impurezas de proteínas. Debido a la diversidad y a que la
proporción de proteínas de células huésped en el estándar de calibración nunca se equipara exactamente con las proteínas de
células huésped de ninguna muestra, y debido al amplio intervalo de anticuerpos en los reactivos inmunoquímicos, diferentes
ensayos de proteínas de células huésped cuantificarán proteínas individuales de células huésped a un grado distinto. Por ende,
la lectura del valor numérico individual del inmunoensayo de proteínas de células huésped "se pondera inmunológicamente".
Las proteínas altamente inmunogénicas sobrecuantificarán con respecto a la población promedio, mientras que las proteínas
con inmunogenicidad débil presentarán una subcuantiificación. Algunas proteínas pueden no inducir una respuesta inmune en
las especies animales usadas para generar anticuerpos, y el inmunoensayo de proteínas de células huésped no detectara a di-
chas proteínas. Debido a esta posibilidad, también deben incluirse en el sistema de control métodos ortogonales para juzgar la
pureza del producto. La mejor estrategia es usar el inmunoensayo de proteínas de células huésped en conjunto con otras he-
rramientas analíticas.
Finalmente, se debe tener cuidado al extrapolar valores de proteínas de células huésped seguros entre productos. Ningún
límite de especificación individual será suficiente para abarcar todo. Las diferencias en las propiedades biológicas de proteínas
particulares de células huésped que co-purifican con el producto, la vía de administración, la población de pacientes y la dosis
de producto/proteína de célula huésped contribuyen en conjunto como posibles factores que influyen en los riesgos para el
paciente. Durante la historia de los productos bioterapéuticos recombinantes, se han presentado ejemplos en los que las pro-
teínas individuales que co-purifican han sido inmunógenas, han actuado como adyuvantes e incrementan la respuesta inmune
del paciente a la proteína terapéutica, o han presentado actividad biológica propia. A pesar de su existencia, dichos ejemplos
son raros y, en general, existe un registro de seguridad excelente para los productos biológicos. No obstante, las limitaciones y
complejidades de los ensayos de proteínas de células huésped, el cuidadoso y laborioso desarrollo y aplicación de dichos ensa-
yos han ayudado a asegurar la seguridad del paciente para millones de dosis. El análisis de proteínas de células huésped conti-
núa siendo un problema complejo que requiere de tiempo, recursos y consideración cuidadosa por parte de los fabricantes de
biofarmacéuticos con el propósito de asegurar que los productos cumplan constantemente con la norma de alcanzar un nivel
de impurezas de proteínas de células huésped tan bajo como sea razonablemente posible.
8. BIBLIOGRAFÍA
EMEA.1997. CPMP position statement on DNA and host cell proteins (HCP) impurities, routine testing versus validation
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Public_Web_Site/lCH_Products/Guidelines/Quality/Q2_Rl /Step4/Q2_Rl _Guideline.pdf. Consultado el 26-02-2014.
(1136) ENVASADO
Y REENVASADO-ENVASES
UNITARIOS
ALCANCE
Este capítulo proporciona pautas para el envasado y reenvasado en envases unitarios, así como para el uso y aplicación del
envasado en unidades de uso. Aunque este capítulo está destinado principalmente para su uso por parte de fabricantes de
medicamentos, reenvasadores y farmacéuticos, la información en el capítulo puede ser útil también para proveedores de em-
balajes y componentes de los envases. Para definiciones sobre los tipos específicos de los envases, ver el capítulo Requisitosde
Envasadoy Almacenamiento(659).
ENVASEUNITARIO
Los envases unitarios en los que se envasa un medicamento de venta bajo receta médica para su dispensación directa al
paciente deben cumplir con el requisito de ser seguros para niños. Por otra parte, los envases unitarios destinados para su uso
en instituciones u hospitales no están obligados a cumplir con dicho requisito. Los envases unitarios que son seguros para ni-
ños incluyen blísteres reforzados, tales como blísteres con ranuras rasgables, coberturas desprendibles o presionables y blísteres
sobre tarjetas o sellados, como los de pestaña desprendible y envases deslizables.
USP42 Información General/ (1136) Envasado y Reenvasado 8089
MATERIALES
DE ENVASES
Los materiales usados para la fabricación de envases unitarios incluyen vidrio y plástico. El vidrio usado como un componen-
te de los envases primarios debe cumplir con los requisitos del capítulo Envases-Vidrio(660). Por su parte, los materiales de
plástico usados como componente de los envases primarios deben cumplir con los requisitos del capítulo Sistemasde Envases
Plásticosy sus Materialesde Construcción (661 ), MaterialesPlásticos
de Construcción (661.1 ), Sistemasde EnvasesPlásticos
para
UsoFarmacéutico (661.2). La prueba de permeabilidad a la humedad se puede llevar a cabo conforme a lo descrito en el capí-
tulo de pruebas generales Envases-Pruebasde Desempeño(671 ).
TIPOSDE CIERRESPARA ENVASES

Las formas farmacéuticas sólidas, semisólidas y líquidas se pueden envasar en envases recerrables o en envases no recerra-
bles. Ambos tipos de envases deben cumplir con las normas del Título 16 del CFR 1 700.15. La Poison Prevention Packaging
Act {Leyde Envases para Prevenir Envenenamiento o PPPA)de 1970 requiere para ciertos casos el uso de envases especiales-
seguros para niños y adecuados para la tercera edad. Los envases seguros para niños protegen a los niños de lesiones o padeci-
mientos serios derivados de la ingestión o manipulación de productos peligrosos incluidos los medicamentos.
Debido a que los medicamentos envasados en envases de unidad de uso están destinados para su dispensación al consumi-
dor sin que tengan que ser reenvasados por el farmacéutico, el fabricante o el reenvasador es responsable del envasado espe-
cial de sustancias reglamentadas por la PPPAen envases de unidad de uso {Título 16 del CFR 1701.1 ).
Envases Recerrables
Los envases recerrables son envases con cierres adecuados que pueden evidenciar su alteración intencional y ser seguros pa-
ra niños. Los envases recerrables pueden emplearse para envases de vidrio o plástico.
Envases No Recerrables
Los envases no recerrables son envases con cierres que no pueden volver a cerrarse, tales como blísteres, sachets, tiras y
otros envases unitarios. Los envases no recerrables pueden incluir envases tales como tiras laminadas y blísteres laminados mul-
ticapa combinando materiales de PVCy Aclar® que se pueden moldear en frío o en caliente. Los envases no recerrables pue-
den ser seguros para niños según el uso previsto y el lugar de uso. Los destinados para uso en el hogar están sujetos a las
disposiciones de la PPPA,según se define en el Título 16 del CFR 1700.14. No obstante, debido al diseño de algunos envases
de dosis única, no todos cumplen con la PPPA.
ENVASESDE UNIDADDE USO

Los envases de unidad de uso provistos por el fabricante ofrecen algunas ventajas interesantes, que se enumeran a continua-
ción. (1) La forma farmacéutica se puede dispensar al paciente en el envase original del fabricante, práctica que implica que el
fabricante ha comprobado la aptitud del envase mediante sus estudios de estabilidad. (2) Se elimina la necesidad de contar y
reenvasar las unidades de dosificación en la farmacia, reduciendo de este modo la posibilidad de errores humanos. (3) Elfar-
macéutico puede fijar la etiqueta al envase de unidad de uso para el paciente y puede emplear la fecha de caducidad del fabri-
cante como fecha límite de uso. (4) Se puede determinar en cada caso cuántas unidades de dosificación contiene un envase
de unidad de uso. (5) Mejora el cumplimiento del tratamiento por parte del paciente. (6) El envase de unidad de uso protege
contra la falsificación puesto que mejora la rastreabilidad del producto mediante códigos de barras y números del National
Drug Code (Código Nacional de Fármacos o NDC).
Los envases de unidad de uso provistos por los reenvasadores ofrecen las mismas ventajas interesantes que los del fabricante.
Sin embargo, los reenvasadores de envases de unidad de uso deben cumplir con todos los requisitos especificados en el capí-
tulo BuenasPrácticas de Reenvasado(1178). Existen varios motivos por los que los reenvasadores realizan el envasado en unida-
des de uso, por ejemplo, (1) a pedido de las instituciones, (2) para un mejor control del inventario, (3) para reducir los tiempos
de dispensación y (4) debido a variaciones de algunos tratamientos.
El envase de un sistema de unidad de uso puede ser un envase de unidades múltiples o un envase unitario. Los sistemas de
unidad de uso pueden contener productos farmacéuticos en formas farmacéuticas líquidas, semisólidas o sólidas (ver también
FDAGuidanceforlndustry,ContainerClosureSystemsfor PackagingHumanDrugsand Biologics [Guía para la Industria, Sistemas
de Cierres de Envases para Medicamentos y Productos Biológicos de Uso Humano]).
Etiquetado de Envases de Unidad de Uso
El etiquetado de los envases de unidad de uso incluye fechas de caducidad, números de lote del fabricante, designación del
NDC y códigos de barras conforme a lo estipulado en Etiquetado (7) y BuenasPrácticas de Reenvasado(11 78). Algunas ventajas
de los códigos de barras en las etiquetas incluyen una reducción en los errores de medicación, mejoran el control de inventario
8090 (11 36) Envasado y Reenvasado / Información General USP42
y facilitan la identificación del medicamento. El etiquetado comprende la información que el fabricante coloca en el envase
(ver las Advertenciasy RequisitosGenerales).Se considera aceptable tanto un etiquetado completo como el de los envases de
unidades múltiples, como un etiquetado abreviado que se usa cuando el envase es demasiado pequeño para incluir todo el
texto. También se puede incluir el texto de etiquetado completo sobre el envase protector secundario si no estuviera presente
en el envase primario.
Envasesde Unidad de Uso-Reenvasado y Reprocesamiento

Los envases de unidad de uso se reprocesan y reenvasan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un envase de uni-
dad de uso en forma de blíster no puede ser reprocesado por el farmacéutico una vez que el medicamento ha sido extraído
del envase de dosis única (ver Etiquetado(7), Fechade Caducidady FechaLímite de Uso).El retiro del blíster se refiere al proceso
de extraer el medicamento del envase tipo blíster. Sin embargo, tanto el fabricante como el reenvasador contratado pueden
reenvasar y reprocesar los envases de unidad de uso siguiendo las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes y estrictos controles
de calidad.
Información de los Fabricantes
Los fabricantes deben ofrecer información apropiada acerca de la estabilidad, de modo que pueda ser empleada para definir
las declaraciones adecuadas de etiquetado, almacenamiento y transporte útiles para los pacientes y médicos. Los fabricantes
pueden ofrecer otras garantías basándose en la información del producto en el envasado y distribución. Cuando el producto
no deba ser reenvasado, los fabricantes pueden especificar esa condición en el etiquetado. Los fabricantes también incluyen
etiquetados e información necesarios para el manejo óptimo del medicamento por parte de médicos y pacientes. El etiquetado
y la información deben incluir un código de barras a fin de prevenir errores de medicación y facilitar el rastreo del producto.
Responsabilidad del Dispensador-Etiquetado
El etiquetado que aparece en los envases de unidad de uso también incluye una etiqueta que agrega el farmacéutico al dis-
pensarlos. Antes de dispensar el envase de unidad de uso, el dispensador debe agregar una o varias etiquetas que suministren
la información siguiente:
1. el nombre del paciente;
2. el nombre del producto y el contenido, las instrucciones de uso conforme a la prescripción del médico o el profesional de
la salud, y el nombre de la persona que prescribe; y
3. toda instrucción de almacenamiento, la fecha límite de uso y toda información que las leyes federales y estatales conside-
ren necesaria.
En la farmacia, es aconsejable que el farmacéutico emplee códigos de barra, junto con recetas computarizadas, para confir-
mar que se está dispensando el medicamento correcto al paciente correcto. Los códigos de barra ayudan a minimizar los erro-
res y permiten rastrear los medicamentos y registrar al responsable de su dispensación.
Control de Calidad del Sistema de Envase
El sistema de envase deberá cumplir las consideraciones generales respecto a la aptitud del sistema, protección, seguridad y
características de desempeño descritas en la FDAGuidancefar /ndustry, ContainerClosureSystemsfar PackagingHuman Drugs
and Biologics(Guía de la FDApara la Industria sobre Sistemas de Cierre de Envases para el Envasado de Medicamentos y Pro-
ductos Biológicos de Uso Humano) y en los capítulos de pruebas generales Sistemasde EnvasesPlásticosy susMaterialesde
Construcción(661), MaterialesPlásticosde Construcción(661.1), Sistemasde EnvasesPlásticospara UsoFarmacéutico(661.2) y
Envases-Pruebasde Desempeño(671 ).
REENVASADO
DE MEDICAMENTOS
SÓLIDOSORALESSIMPLESEN ENVASESDE DOSISÚNICA
El reenvasado de productos farmacéuticos sólidos orales, tales como tabletas y cápsulas, en configuraciones de dosis única es
una práctica habitual tanto para la farmacia que distribuye medicamentos conforme a una receta médica como para el labora-
torio farmacéutico que los reenvasa. La siguiente sección contiene las normas mínimas que servirán de guía para la práctica del
reenvasado.
El reenvasado de preparaciones en configuraciones de dosis única es un aspecto importante del cuidado farmacéutico y de
la optimización del cumplimiento por parte del paciente. A efectos de este capítulo, existen dos tipos de reenvasado: el prime-
ro se refiere a las farmacias que dispensan medicamentos recetados y el segundo se aplica a las empresas farmacéuticas comer-
ciales que se dedican a reenvasarlos.
t- lt
USP42 Información General/ (11 36) Envasadoy Reenvasado8091
Materiales
Los blísteres ofrecen una amplia gama de diseños tanto en lo que respecta a la funcionalidad como al aspecto. Se emplean
diversos materiales para fabricar blísteres que tengan un desempeño óptimo. El envase tipo blíster está formado por dos com-
ponentes: el blíster, formado por la cavidad en donde se ubica el producto, y la lámina de sellado, que es el material que se
sella al blíster, como se muestra a continuación.
~ Láminade
------- Sellado
~Blíster
Representación Esquemática de un Envase npo Blíster
Debido a la diversidad de películas para blíster disponibles, la elección de la película se hará en función del grado de protec-
ción necesario. La elección de la lámina de sellado depende de cómo se vaya a usar el blíster, pero en general dicha lámina
está hecha de papel aluminio. El material usado para formar la cavidad habitualmente es plástico, que puede ser diseñado para
proteger la forma farmacéutica contra la humedad. Actualmente se dispone de una gran variedad de grados de protección
contra la humedad. A efectos de este capítulo general, se las denomina propiedades de barrera contra la humedad nominal,
media, alta y extrema.
CLORURODE POLIVINILO
El material más utilizado para la fabricación de blísteres es el cloruro de polivinilo (PVC). Este material, que brinda una barre-
ra nominal o cero contra la humedad, se utiliza cuando el producto no requiere una protección eficaz contra la humedad. El
PVC se encuentra disponible en varios calibres y puede ser opaco o pigmentado para impedir la entrada de luz de longitudes
de onda específicas.
La profundidad y el tamaño de la cavidad que se va a formar determinan el espesor del PVC utilizado. Debido a que el plásti-
co se adelgaza durante el proceso de formación del blíster, se debe tener cuidado para garantizar que el blíster terminado brin-
de suficiente protección contra la luz (si se requiere) y que sea suficientemente fuerte para proteger de manera adecuada la
forma farmacéutica. Los calibres habituales del PVCusados en la industria farmacéutica van de 7,5 a 15 mil (0,0075 a 0,015
pulgadas).
PELÍCULAS
DE BARRERA
Muchas preparaciones farmacológicas son extremadamente sensibles a la humedad y por ende requieren películas de barre-
ra que brinden una protección alta. Se pueden emplear varios materiales para proporcionar protección contra la humedad. Las
películas de barrera más usadas en la industria farmacéutica se describen a continuación.
Laminacionesde PVC/PCTFE: La película de policlorotrifluoroetileno (PCTFE)1 es una película termoplástica de fluoropolí-
mero de policlorotrifluoroetileno. La película de PCTFEse lamina al PVC mediante una capa adhesiva colocada entre el PVCy
la película de PCTFE(estructura doble),
Adhesivo-iiiiii= :~~e
Estructura Doble
o con una capa de polietileno (PE) colocada entre la capa de adhesivo del PVCy la del PCTFE(estructura triple).
Estructura Triple
Con el uso de diversos calibres de película de PCTFE,se pueden obtener barreras contra la humedad de media a extrema.
Laminacionesde PVC/PVdC: El PVC/PVdCes una película en la que el PVCestá recubierto por una emulsión de cloruro
de polivinilideno (PVdC), según se muestra en la estructura doble ilustrada a continuación.
1
Se pueden obtener películas de PCTFEen Allied Signal (como Aclar®) y en otras fuentes.
8092 (1136) Envasado y Reenvasado / Información General USP42
Estructura Doble
La capa de PVdC se especifica en g/m y se puede fabricar para brindar barreras de protección de media a alta. Los pesos de
2
recubrimiento más usados en la industria farmacéutica son 40, 60 y 90 g/m 2, y la película se ofrece con una capa intermedia
de polietileno (PE) o sin ella, según se muestra en la estructura triple siguiente. El polietileno se trabaja con pesos de recubri-
miento superiores, tales como 60 y 90 g/m 2, para mejorar las características de termoformado de la cavidad del blíster.
Adhesivo
Adhesivo
Estructura Triple
Polipropileno: Debido a su morfología, el polipropileno (PP) constituye una buena barrera contra la humedad, porque su
estructura esferulítica crea un camino arduo para que las moléculas de agua lo atraviesen. Aunque no se use habitualmente en
los Estados Unidos como película para blíster, el PP constituye una alternativa económica para los materiales de barrera media
y se emplea en Europa como alternativa al PVC.
Lámina Moldeada en Frío: Este material se usa para productos extremadamente higroscópicos o sensibles a la luz. Es una
barrera contra la humedad extrema que consta de tres capas: PVC, papel aluminio y nailon.
Nailon
Aluminio
Adhesivo--
Lámina Moldeada en Frío
LÁMINADE SELLADO
La lámina de sellado se sella al blíster moldeado tal como se describió anteriormente. Se pueden obtener distintos diseños de
láminas de sellado y la elección de uno en particular dependerá del modo en que se vaya a utilizar el empaque. Los diseños
estándar-desprendible, desprendible seguro para niños y a presión-se describen a continuación. El componente principal de
la lámina de sellado es habitualmente aluminio y su calibre varía de 18-25 µm (0,0078-0,001 pulgadas). El lado del laminado
de papel aluminio que está en contacto con el producto proporciona la capa termosellada que forma el sellado del material del
blíster. El recubrimiento de termosellado debe ser capaz de lograr un sellado adecuado con la película del blíster que se va a
sellar. Los materiales empleados para formar la capa de termosellado cumplen con lo establecido en el Título 21 del CFR 175 y
177.
Desprendible: La lámina desprendible, que se usa por lo general en un ámbito institucional, consta de varias capas, como
se muestra a continuación y puede desprenderse del blíster. [NOTA-Para obtener una lámina desprendible segura para niños,
se agregará una capa de poliéster con los adhesivos pertinentes.] La lámina de sellado desprendible, usada junto con el monta-
je del blíster,hacenecesarioun procesode tres pasosparaabrir el blíster.
Papel
Adhesivo~
laminado Aluminio
Sellopor
calor
Construcción de una Lámina Desprendible
Primero, se debe separar la cavidad del blíster del resto de la tira del blíster. A continuación, las capas de papel y de poliéster
se retiran de un área que no está sellada. Por último, el producto se empuja a través del papel aluminio remanente. Es impor-
tante destacar que el uso de este tipo de estructura laminada ayuda a que el envase sea más seguro para los niños. No obstan-
te, si es necesario un envase seguro para niños, el diseño debe probarse de acuerdo con lo establecido por el protocolo descri-
to en el Título 16 del CFR 1700, la Ley de Envasado para la Prevención de Envenenamiento.
Papel
Poliéster
Aluminio
Sello por
calor
Lámina Segura para Niños
t
A presión: Existen dos tipos habituales de láminas que se abren a presión: una con una capa externa de papel separada
del aluminio por una capa de adhesivo y otra sin papel. La capa externa de papel tiene un fin estético y permite la impresión
en el reverso del blíster.
Lámina perforable por presión (con papel)
Sello por calor

Lámina perforable por presión (sin papel)
OTROS TIPOS DE ENVASES
Otros tipos de envases usados para dosis únicas de formas farmacéuticas sólidas son tiras, bolsas y envases tipo sachet.
Poliéster (48 ga)

Adhesivo
Aluminio (0,0035)
Adhesivo
Polietileno lineal de
baja densidad (150 g)
Estructura de material para sobres laminados
PROCESO
Los envases para dosis únicas se pueden fabricar y sellar de diversas maneras. Quienes reenvasan grandes cantidades de me-
dicamentos pueden usar termoformadoras que cumplen estas funciones en la línea de producción, mientras que quienes reen-
vasan menores cantidades podrían comprar el material preformado para los blísteres. Este apartado comienza con una pers-
pectiva general del proceso de termoformado de un blíster, el proceso fundamental que también se aplica a otros envases de
dosis única como las bolsas. Esta perspectiva general no pretende ser exhaustiva sino destacar las operaciones principales junto
con sus parámetros críticos.
Termoformado de un Blíster de Dosis Única
El proceso completo de termoformado consta de cuatro estaciones básicas donde se efectúan las siguientes operaciones:
moldeado, llenado, sellado y terminado. Moldear el blíster mediante termoformado requiere el uso de calor y de aire. El mate-
rial de la lámina de sellado se sella al material de la cavidad del blíster por un tiempo definido (el recorrido de la máquina),
punto en el que la placa de calentamiento se cierra sobre los dos materiales.
ESTACIÓNDE MOLDEADO
Antes de ingresar en la estación de moldeado, el material del blíster pasa a través de una unidad de calentamiento donde se
calienta de manera uniforme por etapas para garantizar el moldeado correspondiente. Debido a que los diferentes plásticos
tienen distintos puntos de ablandamiento, se debe prestar especial atención para determinar la temperatura correcta de la es-
tación de calentamiento, que suele tener múltiples zonas de temperatura. La temperatura, determinada por el material del blís-
ter y la velocidad a la que atraviesa la estación de calentamiento, es un parámetro crítico en lo que respecta al desempeño
óptimo. En la estación de moldeado, el material del blíster se calienta hasta el punto en el que el plástico se ablanda lo sufi-
ciente para permitir que se forme la cavidad El material del blíster procede de un rollo montado sobre un rodillo (al que se
denomina bobina) y la máquina tira de él. Hay una mesa de empalme junto al rodillo de bobinado que deja espacio para un
segundo rollo de material de blíster para empalmar y reanudar el proceso de envasado. Se puede instalar un dispositivo de
bobinado para ayudar a mover el material del blíster desde el rodillo ajustado a un índice específico.
Una vez que el material está debidamente calentado, por lo general se emplea aire comprimido para formar la cavidad del
blíster. Una matriz superior y una inferior se cierran sobre el material mientras se introduce aire y se moldea un blíster que
8094 (1136) Envasadoy Reenvasado/ Información General USP42
corresponde al tamaño de la cavidad. Es posible que se necesite un molde macho auxiliar según el material y el tamaño de la
cavidad. El molde macho auxiliar asegura una reducción uniforme del grosor del material del blíster que permite optimizar las
características de protección del material formado. Una vez moldeado el material según la configuración de blíster deseada, se
lleva a la estación de llenado.
ESTACIÓNDE LLENADO
En esta estación, se introduce el producto en la cavidad del blíster. Las cavidades se pueden llenar mediante un dispositivo
de llenado automatizado o a mano. El parámetro crítico en esta estación es el llenado correcto de los blísteres moldeados.
ESTACIÓNDE SELLADO
En esta estación, se sella la lámina de sellado a la cavidad llena del blíster, usando calor y presión durante un tiempo de
permanencia definido. Los parámetros críticos que se deben considerar en esta estación son la temperatura, la presión y el
tiempo de permanencia.
El material de la lámina de sellado se monta sobre un rodillo por encima de la cavidad del blíster y puede estar preimpreso o
se puede imprimir en la línea de producción. En este punto se pueden imprimir el número de lote y la fecha de caducidad. Las
láminas de sellado preimpresas deben tener un sistema de registro de la impresión para controlar la posición de lo que se im-
prime respecto de la cavidad del blíster. Los parámetros críticos en esta parte de la estación están relacionados con que el eti-
quetado sea legible y correcto.
ESTACIÓNDE TERMINADO
La estación de terminado comprende todos los otros pasos del proceso de envasado, incluido el grabado, la perforación y el
corte. El grabado implica la colocación del número de lote y la fecha de caducidad en el envase. Se usan tipos de acero para
grabar esta información en los bordes del blíster. Uno de los parámetros críticos en esta estación es la integridad del envase. Es
importante que los procesos de grabado, perforación y corte no afecten el blíster, la tapa o el sellado. Otro parámetro crítico
en el proceso tiene que ver con la calidad del grabado, el cual tiene que ser legible, correcto, e incluir toda la información
necesaria.
Bolsas (Pouches) para Dosis Única
El proceso de elaboración de bolsas también consiste en una operación de moldeado, llenado y sellado, pero no proporcio-
na una cavidad moldeada y definida como el proceso de termoformado. Si bien la maquinaria usada para formar bolsas de
dosis única puede funcionar de forma distinta a la que se describió para termoformar un blíster, las operaciones principales
(moldeado, llenado y sellado) y los parámetros críticos observados en esas estaciones son bastante similares. [NOTA-Ver los
parámetros críticos antes mencionados y definidos en la sección sobre termoformado.]
El proceso de elaboración de tiras consiste en dosificar un medicamento en una bolsa moldeada de tres caras. Una vez llena-
da con el medicamento, la máquina sella la bolsa y forma una tira de bolsas de dosis única selladas. El flujo básico del proceso
comienza cuando el medicamento se sitúa encima del material de la bolsa. Se usa un rollo de material de la tira para formar la
bolsa. Esto se logra moviendo el material sobre un dispositivo que hace que el material se doble en dos lados iguales. Los lados
y el fondo se sellan antes de la dosificación. La tira se puede cortar más tarde, durante el procesamiento en la máquina, o
puede rodar de forma continua y se corta manualmente. La temperatura y el tiempo de permanencia son los factores críticos
de esta máquina.
Envases de Dosis Única Preformados
Los envases preformados se sellan ya sea por calor o por adhesión. Los selladores por calor pueden ser unidades manuales
que requieren que se aplique presión manual o unidades automatizadas que proporcionan una presión de sellado más contro-
lada.
El sellado por calor se puede lograr con el uso de aparatos manuales pequeños. Este equipo generalmente opera a una pre-
sión establecida. Los parámetros críticos de estos dispositivos son el control de la presión y la temperatura porque una varia-
ción no deseada en estos parámetros puede producir sellados deficientes.
Parámetros Críticos
A fin de asegurar que el envase terminado se comporte como se espera, se debe determinar la calificación de los parámetros
críticos. Normalmente, la validación de una línea de envasado consiste en la calificación de la instalación, operación y desem-
peño del sistema de envasado.
USP42 Información General/ (11 36) Envasado y Reenvasado 8095
CALIFICACIÓN
DE LAINSTALACIÓN
Antes de su uso, las máquinas deben estar instaladas y se debe comprobar que estén en condiciones de funcionamiento
adecuadas.
CALIFICACIÓN
OPERATIVA
La calificación operacional se debe realizar para establecer que las máquinas funcionan dentro de los límites especificados
por el fabricante. Se deben vigilar y verificar periódicamente los servicios externos necesarios para el funcionamiento del equi-
po, tales como electricidad, aire, etc.
CALIFICACIÓN
DELDESEMPEÑO
La calificación del desempeño debe hacerse para garantizar que las máquinas funcionan correctamente con los materiales
requeridos para producir un envase que responda como se espera. Los parámetros críticos incluyen temperatura y presión de
moldeado, temperatura y presión de sellado y tiempo de permanencia en la estación de sellado. Para la puesta en marcha de
las máquinas, los intervalos calificados deben estar fácilmente disponibles en una fuente de referencia. Será necesaria una nue-
va evaluación si se efectúan cambios en las máquinas, los materiales o el proceso.
InspeccionesDurante el Proceso
Deben realizarse controles estrictos en lo que respecta al envasado y etiquetado. Se debe evaluar el desempeño del envase
final en cada una de las estaciones descritas anteriormente. Específicamente, se debe inspeccionar visualmente el envase for-
mado para garantizar que esté debidamente moldeado. La evaluación de la estación de llenado debe incluir una verificación
para asegurar que la dosis única se llene debidamente (es decir, que el producto correcto esté presente). Se debe evaluar la
estación de llenado para garantizar que se ha logrado el sellado correcto y que el envase sellado cumple las especificaciones
sobre impermeabilidad a la humedad. Se debe realizar un examen visual del envase para garantizar que los pasos finales del
proceso de envasado son aceptables.
Los reenvasadores y dispensadores deben aplicar un plan de inspección estándar para verificar que el envase es adecuado.
Se debe realizar una inspección visual para verificar que se ha colocado el producto correcto en el envase adecuado con el
etiquetado correspondiente. Se debe evaluar la integridad del sellado, usando una prueba de vacío/ prueba de helio, prueba
de rasgado y otros métodos de prueba adecuados para establecer si se mantiene la integridad del sellado.
DESEMPEÑO
El objetivo principal de los envases de dosis única usados para envasar medicamentos es garantizar que, hasta la fecha de
caducidad, haya una protección adecuada frente al entorno mientras la forma farmacéutica se distribuye y almacena. Asimis-
mo, es fundamental que los materiales usados no interactúen con la forma farmacéutica.
Cuando se determina qué tipo de envase se debe usar en el reenvasado, se deben considerar las sensibilidades de las formas
farmacéuticas (si las hubiera) en relación con los entornos de almacenamiento y distribución (por ejemplo, temperatura, luz y
humedad).
Los materiales usados para fabricar el envase de dosis única así como el proceso de moldeado y sellado en conjunto definen
las propiedades del envase terminado. Según se analizó en Materiales,hay una gran variedad de estructuras de películas dispo-
nibles comercialmente que proporcionan envases de dosis única con diversos grados de protección contra la humedad y la luz.
Los proveedores de estos materiales suelen proporcionar datos cuantitativos, obtenidos a partir de métodos de prueba bien
establecidos, para destacar las propiedades de protección del material con que están hechos. Estos datos se basan en las hojas
planas de la película, no en el envase moldeado.
Resulta crítico comprender que, una vez moldeada la película, las propiedades de protección cambian debido a que el espe-
sor general de la película disminuye cuando se forma la cavidad del blíster. Habitualmente, el cambio implica una disminución,
en especial en el caso de las propiedades de barrera. No obstante, el grado de cambio variará según el tipo de estructura de la
película usada y también, en gran medida, según el proceso de moldeado del envase utilizado (ver Proceso).Además, un sella-
do que sea menos que óptimo en el envase moldeado disminuirá las propiedades de protección del envase. La temperatura, el
tiempo o la presión insuficientes durante la operación de termosellado pueden permitir el paso de humedad o de oxígeno a
través de la zona sellada con el transcurso del tiempo, lo que puede afectar a la forma farmacéutica. Además, puede presentar-
2
Una prueba de vacíoconsisteen colocarmuestrasde la operaciónde envasadoen un frascollenode agua. Se colocauna tapa sobrelasmuestraspara sumergir-
laspor completo en el agua. Se colocauna tapa al envasepara crearun selloeficazy produciraproximadamente25 cm de vacío. Se colocala bomba de vacíoy
las muestras se someten a la prueba durante aproximadamente 1 minuto, se retiran del agua, se secan y se abren para determinar si se ha mojado el intenor de la
cavidad del blíster o de la bolsa de dosis única. Este proceso debe ajustarse hasta que esté bajo control y se pueden efectuar pruebas adicionales para asegurar que
la integridad del sellado se mantiene en niveles aceptables. La presencia de humedad indica que el sellado es defectuoso y por lo tanto existe el riesgo potencial de
que el medicamentose degrade al ser expuesto a las condicionesambientales.Losenvasesdefectuososdeben retirarsede la circulación.
se el mismo problema si la zona sellada no tiene suficiente superficie. Para garantizar un buen sellado, se recomienda dejar una
distancia mínima de 3 mm desde el borde de la cavidad del blíster hasta el borde o la perforación más cercanos. Por lo tanto,
es más importante evaluar el desempeño del envase moldeado y sellado que el desempeño de la hoja plana.
La humedad constituye un factor crítico en la integridad de la preparación. El capítulo Envases-Pruebasde Desempeño(671)
describe el modo de determinar y clasificar la velocidad de permeación de la humedad. Si la etiqueta del fabricante incluye
"Proteger de la Humedad", el reenvasador utilizará una película que brinde una mayor barrera.
Si un medicamento requiere protección contra la luz, el reenvasador debe cumplir los requisitos para la transmisión de la luz
establecidos en Envases-Pruebasde Desempeño(671 ). Nuevamente, esta prueba debe efectuarse al envase moldeado porque
las propiedades de protección de la película contra la luz se ven alteradas una vez que la película pierde grosor durante el
proceso de moldeado. Se recomienda que estas pruebas, junto con cualquier guía proporcionada por el fabricante, se conside-
ren apropiadas para cualquier sistema de envase-cierre usado en el reenvasado de un medicamento.
FECHALÍMITEDE USO
Si no se cuenta con datos de estabilidad del producto farmacéutico en el envase reenvasado, la fecha límite de uso será un
año o el tiempo que reste hasta la fecha de caducidad, sea cual sea el primero. Si se dispone de datos de estabilidad actuales
del medicamento en el envase reenvasado, el tiempo establecido por el estudio de estabilidad se puede usar para fijar la fecha
límite de uso pero no puede exceder la fecha de caducidad determinada por el fabricante.
El dispensador debe mantener el lugar donde se envasan y almacenan las formas farmacéuticas a una temperatura tal que la
temperatura cinética media no sea mayor de 25º. El material plástico usado en el envasado de las formas farmacéuticas debe
brindar mayor protección que el cloruro de polivinilo, el cual no proporciona una protección adecuada contra la permeación
de humedad. Se deben guardar registros de la temperatura del lugar donde se almacenan las formas farmacéuticas y de los
materiales plásticos usados en el envasado.
REQUISITOS
MÍNIMOS
Los apartados anteriores sirven de introducción general al reenvasado al proporcionar conocimientos básicos sobre la selec-
ción de materiales, el proceso de moldeado-llenado-sellado y la importancia del desempeño de un envase sellado. En este
apartado, se describen con mayor detalle ciertos requisitos mínimos del reenvasado que deben cumplirse.
Personal
Toda persona con responsabilidad en el reenvasado de un medicamento debe tener la formación, capacitación y experien-
cia, o una combinación de las mismas, para efectuar las tareas asignadas de manera que se mantengan la seguridad, la identi-
dad, el contenido, la calidad, la pureza, la potencia y la presentación de la forma farmacéutica. La capacitación debe estar do-
cumentada.
El personal involucrado en el reenvasado de un medicamento usará ropa limpia y adecuada para las tareas o procesos que
efectúe
Instalaciones
Las instalaciones para el reenvasado pueden requerir áreas de baja humedad relativa y las condiciones de temperatura deben
cumplir con los requisitos de temperatura ambiente controlada especificados en Requisitosde Envasadoy Almacenamiento
(659).
Equipo
Los equipos utilizados en el reenvasado de un medicamento tendrán un diseño apropiado y estarán ubicados en un lugar
adecuado para facilitar las operaciones para las que están destinados. Su diseño debe permitir la limpieza para evitar la conta-
minación cruzada y facilitar el mantenimiento. Los equipos deben estar fabricados de tal manera que las superficies que estén
en contacto con los componentes o medicamentos no sean reactivas, aditivas o absorbentes. Deberá evitarse el contacto de
cualquier sustancia necesaria para el funcionamiento del equipo, tales como lubricantes o refrigerantes, con los componentes
o los medicamentos.
Los equipos y los utensilios deben limpiarse, mantenerse y desinfectarse a intervalos adecuados para evitar el funcionamien-
to defectuoso o la contaminación. Se debe efectuar un mantenimiento preventivo a intervalos apropiados de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante. Se deben calibrar los instrumentos usados para controlar los parámetros críticos siguiendo un
esquema definido.
Proceso
Se deben tomar medidas para determinar los parámetros críticos del proceso (por ejemplo, temperatura de sellado, tiempo
de permanencia) al operar las máquinas. Se deben documentar los puntos determinados para estos parámetros y establecer
procedimientos para garantizar que éstos se cumplan cada vez que se operen las máquinas.
Etiquetado
Los requisitos para el etiquetado difieren dependiendo de si se trata de un reenvasador comercial o de un farmacéutico. Por
ejemplo, el reenvasador comercial debe cumplir con lo establecido en el Títilo 21 del CFR201.1, pero esto no se aplica al far-
macéutico o dispensador. Si no se dispone de datos de estabilidad, el dispensador reenvasará solo una cantidad suficiente para
un tiempo limitado e incluirá en la etiqueta el nombre del producto y su contenido, el número de lote, el fabricante y la fecha
límite de uso correspondiente. Cuando se reenvasan cantidades con anticipación a las necesidades inmediatas, cada medica-
mento debe llevar una etiqueta identificadora y el dispensador debe guardar registros de reenvasado adecuados en los que
conste el nombre del fabricante, el número de lote, la fecha de caducidad, la fecha de reenvasado y el nombre de las personas
responsables del reenvasado y del control. El reenvasador o dispensador llevará controles documentados para evitar errores en
el etiquetado.
Materiales
El reenvasador o dispensador colocará la fecha límite de uso correspondiente en la etiqueta y en el envase sobre los materia-
les adecuados. Los materiales que utilice el reenvasador no podrán ser reactivos, aditivos o absorbentes y deben cumplir con
los requisitos descritos en el Título 21 del CFR175 y 177.
Almacenamiento
El dispensador rotará y controlará las existencias de cerca para asegurarse de que los medicamentos se expendan en el mis-
mo orden en que se envasan. El reenvasador o dispensador almacenará los medicamentos en las condiciones ambientales re-
queridas (por ejemplo, temperatura ambiente controlada con una temperatura cinética media que no supere los 25º).
Medicamento
El reenvasador o dispensador examinará los medicamentos en busca de signos de inestabilidad tales como cambio en el co-
lor o en el olor y aplicará su criterio profesional para determinar si un envase es aceptable.
Reclamos
El reenvasador o dispensador guardará registros escritos que describan los reclamos orales y escritos respecto de un medica-
mento y se asegurará de que dichos reclamos se investiguen y resuelvan como corresponde.
Artículos Devueltos
Deben establecerse políticas y procedimientos relativos a los artículos devueltos para asegurar su manejo adecuado.
Reprocesamiento
No se deben volver a procesar envases de dosis única reenvasados (es decir, retirar el medicamento de un envase de dosis
única y colocarlo en otro envase de dosis única). No obstante, el reprocesamiento de un empaque secundario (por ejemplo,
retirar el blíster de una caja de cartón y colocarlo en otra caja de cartón) está permitido siempre que se mantenga la fecha
límite de uso original y se garantice la integridad del blíster.
Consideraciones especiales
Si un medicamento presenta sensibilidad al oxígeno o sensibilidad extrema a la humedad o a la luz (por ejemplo, si está
envasado con lámina moldeada en frío) no debe reenvasarse. Si un medicamento debe estar refrigerado, no se reenvasará a
menos que se disponga de las condiciones ambientales apropiadas y de los materiales adecuados. Ciertos medicamentos (tales
como agentes oncológicos, hormonas o derivados de la penicilina) requieren una manipulación especial porque se consideran
muy potentes o tóxicos y porque la transferencia de una porción de estos productos a otros productos podría tener un efecto
pernicioso.
8098 (11 36) Envasado y Reenvasado / Información General USP42
REENVASADODE FORMASFARMACÉUTICAS SÓLIDASY LÍQUIDASNO ESTÉRILES

EN ENVASES
UNITARIOSY ENVASESDE DOSIS ÚNICA
Las siguientes guías están dirigidas a aquéllos relacionados con la dispensación farmacéutica y no se aplica a la dispensación
comercial. Lasformas farmacéuticas oficiales deben presentar en su etiqueta una fecha de caducidad designada para la formu-
lación particular y el envase del artículo. Dicha fecha limita el tiempo durante el cual el producto puede ser dispensado o usa-
do. Debido a que la fecha de caducidad indicada en el sistema de envase-cierre original del fabricante se determina específica-
mente para el medicamento en dicho sistema particular y no debe aplicarse a un producto que ha sido reenvasado en un en-
vase distinto, los medicamentos reenvasados que se dispensen de conformidad con una receta médica quedarán exentos del
uso de la fecha de caducidad indicada en el envase original del fabricante. No obstante, bajo ninguna circunstancia, la fecha
de caducidad del medicamento reenvasado puede exceder la fecha de caducidad del fabricante original. Por lo tanto, el dis-
pensador debe tomar otras precauciones para conservar el contenido, la calidad y la pureza de aquellos medicamentos que
sean reenvasados para su distribución o venta final a pacientes.
Las siguientes guías y requisitos se aplican a los casos en que se reenvasen formas farmacéuticas oficiales en envases unitarios
o de dosis única o en envases mnemotécnicos para su dispensación conforme a una receta médica.
Etiquetado
El dispensador tiene la responsabilidad de colocar una fecha de caducidad adecuada en la etiqueta, tomando en cuenta la
naturaleza del medicamento reenvasado, la información relativa al envasado o fechas de caducidad que aparezca en el etique-
tado del producto del fabricante, las características de los envases y las condiciones de almacenamiento a las que debe some-
terse el artículo. Lasformas farmacéuticas reenvasadas deben mostrar en sus etiquetas las fechas de caducidad determinadas
conforme a la información del etiquetado del producto (ver Etiquetado(7), Fechade Caducidady FechaLímitede Uso).Todo
envase unitario o de dosis única incluirá una etiqueta individual, a menos que el dispositivo que contiene la dosis única de la
forma farmacéutica no permita el retiro o la separación del envase intacto unitario o de dosis única del mismo.
Almacenamiento
Almacenar el artículo reenvasado en un ambiente con humedad controlada y a la temperatura especificada en la monografía
individual o en el etiquetado del producto. Para instrucciones adicionales, consultar el capítulo Requisitosde Envasadoy Almace-
namiento(659).
Los refrigeradores y congeladores no se deben considerar ambientes con humedad controlada. Los medicamentos que se
van a almacenar en refrigeradores o congeladores deberán protegerse durante su almacenamiento en dichos ambientes, para
lo cual podría ser necesario un envase exterior; se recomienda consultar la monografía del medicamento con respecto al alma-
cenamiento.
Reprocesamiento
No se deben volver a procesar envases de dosis única reenvasados (es decir, retirar la unidad de dosificación de un envase de
dosis única y colocarlo en otro envase de dosis única). No obstante, el reprocesamiento de un empaque secundario (por ejem-
plo, retirar el blíster de una caja de cartón y colocarlo en otra caja de cartón) está permitido siempre que se mantenga la fecha
de caducidad original.
PAQUETESDE MEDICACIÓNPERSONALIZADOSPARA PACIENTES
En vez de dispensar dos o más medicamentos prescritos en envases separados, los farmacéuticos pueden proveer a los pa-
cientes un paquete de medicación personalizado, previa autorización del paciente, del médico del paciente o de quien extien-
de la prescripción (paquete de medicación personalizado para el paciente). 3
Un paquete de medicación personalizado para el paciente, es decir, un paquete preparado por un farmacéutico para un pa-
ciente específico, consta de una serie de envases y contiene dos o más formas farmacéuticas sólidas orales prescritas. El diseño
del paquete de medicación personalizado para el paciente, o el etiquetado de cada uno de los envases, debe indicar el día y la
hora o periodo en el que debe administrarse su contenido.
El dispensador tiene la responsabilidad de instruir al paciente o a la persona encargada de su cuidado sobre el uso del pa-
quete de medicación personalizado para el paciente.
3 Se debe tomar en cuenta que no existen excepciones especiales para los paquetes de medicación personalizados para pacientes con respecto a los requisitos de
la Ley de Envasado para la Prevención de Envenenamiento. Por tanto, cuando los paquetes de medicación personalizados para pacientes no cumplan con las nor-
mas de seguridad para niños, deberán colocarse en un envase externo que cumpla con dichas normas, o deberá obtenerse la autorización del comprador o del
médicopara dispensaren un envaseque no cumplacon lasnormasde seguridadpara niños.
USP42 Información General/ (11 36) Envasado y Reenvasado 8099
Etiqueta
El paquete de medicación personalizado para el paciente debe incluir una etiqueta en la que se declare lo siguiente:
1. El nombre del paciente.
2. Un número de serie exclusivo para el paquete de medicación personalizado para el paciente y un número de serie de
identificación distinto para cada una de las órdenes de prescripción de cada uno de los medicamentos contenidos en di-
cho paquete.
3. El nombre, contenido, descripción física o identificación y la cantidad total de cada medicamento en el paquete.
4. Las instrucciones de uso y las declaraciones precautorias, si las hubiera, contenidas en la orden de prescripción para cada
medicamento ahí contenido.
5. Todas las instrucciones o declaraciones precautorias requeridas por los compendios oficiales.
6. El nombre del profesional que recetó cada medicamento.
7. La fecha de preparación del paquete de medicación personalizado para el paciente y la fecha límite de uso o periodo de-
signado a dicho paquete (dicha fecha límite de uso o periodo no debe ser más extenso que la fecha límite de uso más
corta recomendada para cualquier forma farmacéutica incluida en el paquete ni superior a 60 días a partir de la fecha de
preparación del paquete, y no deberá exceder la fecha de caducidad más corta indicada en los envases a granel del fabri-
cante original para las formas farmacéuticas ahí incluidas); como alternativa, la etiqueta del empaque deberá indicar la
fecha de las prescripciones o la fecha de preparación del paquete, siempre que éste se acompañe de un registro que indi-
que la fecha de inicio y la fecha límite de uso.
8. El nombre, dirección y número telefónico del dispensador (así como el número de registro del dispensador cuando sea
necesario).
9. Cualquier otra información, declaraciones o advertencias requeridas para cualquiera de los medicamentos contenidos en
el paquete.
Si el paquete de medicación personalizado para el paciente permite el retiro o separación de los envases intactos de éste,
cada envase individual deberá incluir una etiqueta que identifique cada uno de los medicamentos en el paquete.
Etiquetado
El paquete de medicación personalizado para el paciente deberá acompañarse de un inserto o prospecto del empaque para
-
el paciente para los casos en que alguno de los medicamentos ahí contenidos deba dispensarse junto con dicho inserto como
etiquetado adjunto. Alternativamente, dicha información requerida se puede incorporar en un solo inserto de información
educativa general provisto por el farmacéutico para todo el paquete de medicación personalizado para el paciente.
Envasado
Cuando no existan requisitos de envasado más estrictos para alguno de los medicamentos contenidos en el paquete de me-
dicación personalizado para el paciente, cada envase del paquete deberá cumplir con los requisitos de permeabilidad a la hu-
medad para envases de dosis única o unitarios de la Clase B (ver Envases-Pruebasde Desempeño(671)). Todos los envases
deberán ser no reutilizables o designarse de tal modo que evidencien su apertura.
Guías
Al preparar un paquete de medicación personalizado para el paciente, el dispensador tiene la responsabilidad de tomar en
cuenta todos los requisitos o guías farmacopeicas aplicables así como la compatibilidad física y química de las formas farma-
céuticas colocadas dentro de cada envase, además de cualquier incompatibilidad terapéutica que pudiera ocurrir con la admi-
nistración simultánea de los medicamentos. Con respecto a lo anterior, se recomienda a los farmacéuticos informar a las ofici-
nas centrales de la USP sobre cualquier incompatibilidad observada o informada. Una vez que el medicamento ha sido coloca-
do en el paquete de medicación personalizado para el paciente con otra forma farmacéutica sólida oral, no podrá ser devuelta
al inventario, redistribuirse o revenderse si no se hubiera utilizado.
Registros
Además de los requisitos de llenado de prescripciones individuales, se debe mantener y archivar un registro de cada paquete
de medicación personalizado para el paciente, el cual debe contener, como mínimo:
1. El nombre y la dirección del paciente.
2. El número de serie de la orden de la receta correspondiente para cada uno de los medicamentos contenidos en dicho
paquete.
3. El nombre del fabricante o encargado de asignar la etiqueta y el número de partida para cada uno de los medicamentos
contenidos en dicho paquete.
4. Información suficiente que identifique o describa el diseño, características o especificaciones del paquete de medicación
personalizado para el paciente para permitir la preparación posterior de un paquete de medicación personalizado idéntico
para el paciente.
5. La fecha de preparación del paquete de medicación personalizado para el paciente y la fecha límite de uso designada.
6. Todas las instrucciones especiales de etiquetado.
7. El nombre o las iniciales del farmacéutico que preparó el paquete de medicación personalizado para el paciente.
GLOSARIO
Dispensador: Un dispensador es un profesional autorizado o registrado quien es legalmente responsable de suministrar
un medicamento al paciente, con una etiqueta específica para el paciente, conforme a una orden o receta médica. Además, los
dispensadores podrán preparar cantidades limitadas anticipando una prescripción u orden médica. Los dispensadores depen-
den de la comisión de farmacias de cada estado en particular.
Empaque: El término "empaque" es sinónimo del término "empaque". Ver Requisitosde Envasadoy Almacenamiento
(659).
Farmacia: Una farmacia es un establecimiento legalmente responsable de suministrar un medicamento a un paciente, con
una etiqueta específica para el paciente, conforme a una prescripción u orden médica. Los términos "dispensador" y "farma-
cia" se usan de manera intercambiable.
Reenvasado: El reenvasado es el acto de retirar un medicamento de su envase primario original y colocarlo en otro envase
primario, generalmente más pequeño.
Reenvasador: Un reenvasador es un establecimiento que reenvasa medicamentos y los envía a otro lugar en donde se
prevé que serán necesarios. Los laboratorios que reenvasan medicamentos lo hacen para su distribución (por ejemplo, para
revenderlas a distribuidores, hospitales u otras farmacias), función que no contempla la práctica habitual de una farmacia. La
distribución no es específica para un paciente ya que no hay recetas médicas. A diferencia de los dispensadores, los laborato-
rios que se ocupan de reenvasar medicamentos deben estar registrados ante la FDAy cumplir con la normativa sobre Buenas
Prácticas de Fabricación Vigentes establecidas en el Título del 21 CFR21 O y 211.
(1151) FORMASFARMACÉUTICAS
CONSIDERACIONES
GENERALES
Este capítulo proporciona descripciones generales y definiciones para productos farmacéuticos o formas farmacéuticas co-
múnmente usados para administrar el fármaco (ingrediente farmacéutico activo; IFA).Asimismo, se analizan los principios ge-
nerales relacionados con la fabricación o preparación magistral de estas formas farmacéuticas. Se proporciona un glosario co-
mo recurso para nomenclatura.
Una forma farmacéutica es una combinación de uno o más fármacos y/o excipientes para facilitar la dosificación, administra-
ción y liberación del medicamento en el paciente. El diseño, materiales, fabricación y análisis de todas las formas farmacéuticas
se centra en la calidad del producto farmacéutico. 1 Un protocolo de análisis no solo debe considerar las propiedades físicas,
químicas y biológicas de la forma farmacéutica, según corresponda, sino también la vía de administración y el régimen de do-
sificación deseado. Las interrelaciones entre las formas farmacéuticas y las vías de administración se han resumido en la taxono-
mía farmacopeica para formas farmacéuticas (ver la Figura 7).2 La organización de este capítulo de información general se cen-
tra en los atributos físicos de cada forma farmacéutica particular (Nivel Dos), por lo general, sin referencia específica a la vía de
administración. Los términos de formas farmacéuticas acompañados por asteriscos (*) son términos no preferidos y no deben
1 En los EstadosUnidosde América,un fármaco con un nombre reconocido en la USP-NF debe cumplir con las normas de identidad farmacopeicaso se considera
adulterado, rotulado incorrectamente (misbranded), o ambos. Para evitar que se consideren adulterados, losfármacos deben cumplir con las normas farmacopei-
cas de contenido, calidad y pureza, a menos que se declaren en el etiquetado todos los aspectos en los que el medicamento difiere.Verla FederalFood, Drug, and
CosmeticAct (LeyFederalde Alimentos,Medicamentosy Cosméticoso FDCA),Secciones§S0l(b) y §502(e)(3)(b),y las reglamentacionesde la Food and Drug
Administration(Administraciónde Alimentosy Medicamentos de los EE.UU.o FDA)en el Título21 del CFR§299.5. Asimismo,para evitar que se consideren rotu-
ladosincorrectamente,losfármacosreconocidosen USP-NFtambiéndeben envasarse y etiquetarsede conformidadcon lasnormasfarmacopeicas,ver la FOCA,
Sección502(9). En este capítulo, el término "Calidad" abarca todos los requisitosfarmacopeicosdescritosanteriormente. Esta metodología también es consecuen-
te con la participaciónde los EE.UU.y de la FDAen la lntemational Conference on Harmonization(ConferenciaInternacionalpara la Armonizacióno ICH).La
pauta Q6Ade la ICHsobre especificaciones,indica que "las especificacionesse seleccionanpara confirmarla calidad del fármaco y del producto farmacéutico... " y
define "calidad" como "Laaptitud de un fármaco o producto farmacéutico para su uso previsto. Estetérmino incluyeatributos tales como identidad, contenido y
pureza."
2 MarshallK, FosterTS, Cartin HS,WilliamsRL.Development of a compendia! taxonomy and glossaryfor pharmaceutical dosage forms. Pharm Forum.2003;29(5):
1742-1752.
USP42 InformaciónGeneral/ (1151) FormasFarmacéuticas8101
usarse en los títulos de medicamentos nuevos. La información específica sobre la vía de administración se proporciona para los
casos que así lo requieren.
NIVELUNO
VÍADf ADMINISTRACIÓN
INYECCIÓN/
PORIMPLANTEGASTROINTESTINAL TÓPICA/DERMICAMUCOSA INHALACIÓN
NIVELD05
FORMAFARMACl':UTICA
AEROSOi.ES
CAPSULAS
CREMAS
EMULS!ONES
PELÍCULAS
ESPUMASGASES GELES
GRANULOS GOMAS IMPLANTES !NYECCIONES INSERTOSIRRIGACIONES UQU!D05 LOCIONES
TABLETASDEOlSOLUCIONSUCAL
UNGÜENTOS PASTAS PfüCTS PlLDORAS EMPLASTOS*
POLVOSJABONES/CHAMPÜS
SOLUCIONESESPRÁIS
TIRAS SUPOSrTORlOS
SUSPENSIONES SISTEMAS TABLETAS C!NTASADHESIVAS""
NIVELTRES
PATRóNDELIBERACIÓN
INMED!ATA PROLONGADA RETARDADA
Figura 1. Taxonomía farmacopeica para formas farmacéuticas.
Las pruebas para garantizar el cumplimiento con las normas de la USPpara el desempeño de las formas farmacéuticas caen
dentro de una de las siguientes áreas.
Uniformidad de Dosis
(Yer también Uniformidadde Unidadesde Dosificación(905).) La uniformidad de la dosificación para un paciente o consumi-
dor requiere el control exacto de las variaciones en el contenido de fármaco de cada unidad de dosificación en toda la partida
del medicamento fabricado a escala industrial o del lote de producto farmacéutico preparado magistralmente. La uniformidad
de unidades de dosificación a menudo se demuestra empleando uno de los dos procedimientos siguientes: uniformidad de
contenido o variación de peso. El procedimiento para uniformidad de contenido requiere la valoración apropiada del conteni-
do de fármaco en unidades individuales, mientras que el de variación de peso emplea el peso de las unidades individuales para
estimar su contenido. La variación de peso puede ser utilizada cuando se presume que la distribución subyacente del fármaco
en la mezcla es uniforme y está bien controlada, como en el caso de las soluciones. En tales casos, el contenido de fármaco
puede estimarse adecuadamente mediante el peso neto. La uniformidad de contenido no se basa en la suposición de la unifor-
midad de la mezcla y se puede aplicar en todos los casos. El éxito en el desarrollo y la fabricación de formas farmacéuticas
requiere de una evaluación cuidadosa del tamaño de partícula o de las gotitas del fármaco, de las técnicas de incorporación y
de las propiedades del excipiente.
Estabilidad
La estabilidad del producto farmacéutico implica la evaluación de la estabilidad química, de la estabilidad física y del desem-
peño con el paso del tiempo. La estabilidad química del fármaco en la matriz de la forma farmacéutica debe respaldar la asig-
nación de la fecha de caducidad para las formas farmacéuticas preparadas comercialmente y de una fecha límite de uso para
una forma farmacéutica preparada magistralmente. Los procedimientos de prueba para potencia deben ser indicadores de la
estabilidad (ver Validaciónde ProcedimientosFarmacopeicos (1225)). Se deben cuantificar los productos de degradación. Para el
caso de sistemas dispersos o emulsificados, se debe tomar en cuenta el potencial de sedimentación o separación de los com-
ponentes de la formulación. Cualquier cambio físico en la forma farmacéutica debe ser fácil de revertir (p.ej., agitando) antes
de dosificar o administrar. Para tabletas, cápsulas, suspensiones orales e implantes, los procedimientos de prueba de liberación
in vitro, tales como disolución y desintegración, ofrecen una medición de la uniformidad continua del desempeño con el paso
del tiempo (ver Disolución(711 ), Desintegración(701) y Liberaciónde Fármacos(724)).
Biodisponibilidad
(Yer también EvaluaciónIn Vivoe In Vitro de FormasFarmacéuticas(1088) y • Evaluacióndel Desempeñoe lntercambiabi/idadde

MedicamentosSólidosOrales-• (AFoi-may- 2019JBiodisponibilidad, Bioequivalenciay Disolución(1090).) La biodisponibilidad se ve
afectada por diversos factores tales como el método de fabricación o de preparación magistral, el tamaño de partícula, la for-
ma cristalina (polimorfismo) del fármaco, las propiedades de los excipientes usados para formular la forma farmacéutica y los
cambios físicos conforme el producto farmacéutico envejece. Garantizar la uniformidad de la biodisponibilidad con el paso del
tiempo (bioequivalencia) requiere una atención extrema en todos los aspectos de producción (o preparación magistral) y del
análisis de la forma farmacéutica. Con la justificación adecuada, se pueden usar pruebas de liberación in vitro (p.ej., desinte-
gración y disolución) como reemplazo para demostrar la disponibilidad uniforme del fármaco a partir de la dosis formulada.
Perfil de Liberaciónde Fármacos
Se reconocen dos categorías principales de liberación de fármacos: liberación inmediata y liberación modificada.
8102 (1151) Formas Farmacéuticas / Información General USP42
Se presenta una "liberación inmediata" cuando no se ha modificado intencionalmente el perfil de liberación del fármaco.
Por ejemplo, las cápsulas y las tabletas se consideran de liberación inmediata, incluso si se ha usado un agente desintegrante o
un lubricante.
Se usa el término "liberación modificada" cuando la velocidad y/o el tiempo de liberación del fármaco se han modificado en
comparación con lo que se debería observar o anticipar para un producto de liberación inmediata. Se reconocen dos perfiles
de liberación modificada: liberación retardada y liberación prolongada. No se usa el término "liberación modificada" en títulos
de artículos oficiales.
Se usa el término "liberación retardada" cuando intencionalmente se formula una forma farmacéutica para lograr retardar la
liberación del fármaco durante cierto periodo después de la administración inicial. Para productos de uso oral, también se usan
las expresiones "con recubrimiento entérico" o "gastrorresistente" cuando se previene la liberación del fármaco en el entorno
gástrico, pero se promueve en el medio intestinal. Sin embargo, se usa el término "liberación retardada" en títulos de artículos
oficiales.
Se usa el término "liberación prolongada" cuando intencionalmente se formula una forma farmacéutica para lograr prolon-
gar la liberación del fármaco, en comparación con lo que se observa o anticipa para una forma farmacéutica de liberación in-
mediata. Las expresiones como "liberación extendida", "acción repetida", "liberación controlada", "acción prolongada" y "li-
beración sostenida" también se usan para describir estas formas farmacéuticas. Sin embargo, se usa el término "liberación pro-
longada" en títulos de artículos oficiales.
Se deben consultar las Nomenc/atureGuidelines(Guíasde Nomenclatura)' para obtener información sobre las convenciones
de nomenclatura para productos que contienen un solo fármaco o para productos que contienen una combinación de más de
un fármaco que presente una combinación de perfiles de liberación, como liberación inmediata y liberación prolongada, libe-
ración inmediata y liberación retardada, o liberación prolongada y liberación retardada.
Fabricación
Aunque las instrucciones detalladas sobre fabricación de cualquiera de estas formas farmacéuticas están más allá del alcance
de este capítulo de información general, se han incluido principios generales de fabricación. 4 Se puede encontrar información
pertinente a las preparaciones magistrales extemporáneas de formas farmacéuticas en PreparaciónMagistral-PreparacionesNo
Estériles(795) y en PreparaciónMagistral-PreparacionesEstériles(797).
Vía de Administración
Las vías de administración primarias de formas farmacéuticas se pueden definir como parenteral (ver MedicamentosInyecta-
bles yen Implantes(1)), gastrointestinal (ver MedicamentosOrales-Pruebas de Calidaddel Producto(2)), tópica/dérmica (ver
MedicamentosTópicosy Transdérmicos-Pruebasde Calidaddel Producto(3)), por mucosa y por inhalación (ver Medicamentos
Nasalesy para Inhalación-Información Generaly Pruebasde Calidaddel Producto(5)), y cada una de ellas cuenta con sus pro-
pias subcategorías necesarias. Por lo general, muchas de las pruebas usadas para asegurar la calidad se aplican a todas las vías
de administración; sin embargo, algunas pruebas son específicas para ciertas vías. Por ejemplo, los productos destinados a in-
yecciones se deben evaluar usando Pruebasde Esterilidad(71 ), Pruebade EndotoxinasBacterianas(85) o Pruebade Pirógenos
(151 ), y el proceso de fabricación (y la técnica de esterilización) empleado para parenterales (por inyección) debe asegurar el
cumplimiento de dichas pruebas. Algunas formas farmacéuticas pueden requerir pruebas para la determinación de partículas,
dependiendo de la vía de administración (p.ej., por inyección, ver Partículasen Inyectables(788) o mucosa, ver Partículasen
SolucionesOftálmicas(789)). Asimismo, para las formas farmacéuticas destinadas a la administración por inhalación, se debe
monitorear el tamaño de partícula y el patrón de rocío (para inhaladores de dosis fija o inhaladores de polvo seco) y el tamaño
de las gotitas (para atomizadores nasales). Se puede encontrar información adicional relacionada con las vías de administración
y las pruebas sugeridas en la Guíade los CapítulosGenerales,Diagrama de Capítulos,Diagramas4-8, 1Oy 13.
Un proceso de fabricación y régimen de pruebas adecuados ayudan a asegurar que una forma farmacéutica pueda cumplir
con los atributos de calidad apropiados para la vía de administración prevista.
Envasadoy Almacenamiento
Se determina un envasado adecuado para cada producto. Para obtener más información sobre el cumplimiento de los requi-
sitos de envasado listados en el etiquetado individual, consultar Requisitosde Envasadoy Almacenamiento(659), Envases-Prue-
bas de Desempeño(671 ), BuenasPrácticasde Envasado(1177) y BuenasPrácticasde Reenvasado (1178). El etiquetado del pro-
ducto debe especificar requisitos de almacenamiento que describan las condiciones ambientales, limitaciones y restricciones.
Por ejemplo, la exposición a temperaturas excesivas, humedad y luz puede afectar la capacidad del sistema de envase para
proteger el producto.
3 Nomenc/atureGuidelines,http://www.usp.org/health-quality-safety/compendial-nomenclature.
4
Lostérminos"fabricación"y "preparación"se usanintercambiablementeen estecapítulogeneral.
USP42 InformaciónGeneral/ (1151 >Formas Farmacéuticas 8103
Declaracionesen el Etiquetado
Algunas formas farmacéuticas o artículos presentan declaraciones obligatorias en el etiquetado, las cuales se listan en el Code
of FederalRegulations(Código de Reglamentos Federales o CFR) (p.ej., Título 21 del CFR§201.320 y Título 21 del CFR
§369.21). Se debe consultar el texto del Título 21 del CFR para determinar las recomendaciones vigentes.
PRUEBASGENERALESDE CALIDAD DE PRODUCTOS
La guía Q6A de la ICH (disponible en www.ich.org) recomienda especificaciones (lista de pruebas, referencias a procedi-
mientos analíticos y criterios de aceptación) para asegurar que los productos farmacéuticos sean seguros y efectivos al momen-
to de la liberación y durante su vida útil. Las pruebas que se aplican universalmente para asegurar la seguridad, eficacia, conte-
nido, calidad y pureza incluyen: descripción, identificación, valoración e impurezas.
Descripción
La sección Definición(ver Advertenciasy RequisitosGenerales,4.1 OMonografías)en las monografías USPdescribe el medica-

mento y especifica el intervalo de contenido valorado aceptable de los fármacos presentes en la forma farmacéutica. Para cier-
tos productos, la Definición incluye información adicional relevante, tal como la presencia o ausencia de otros componentes,
excipientes, o adyuvantes, declaraciones de advertencia sobre toxicidad y estabilidad, etc. Aunque las propuestas reglamenta-
rias incluyen información sobre apariencia para facilitar la identificación (p.ej., descripción cualitativa del tamaño, la forma, el
color, etc.) normalmente, no es una parte requerida de las monografías de la USP.Esta información es específica del medica-
mento.
Identificación
Las pruebas de identificación se discuten en las Advertenciasy RequisitosGenerales,5.40 Identificación.Las pruebas de identifi-
cación deben establecer la identidad de los fármacos presentes en el producto farmacéutico y deben distinguir entre compues-
tos con estructuras estrechamente relacionadas que pudieran estar presentes. Las pruebas de identificación deben ser específi-
cas para los fármacos. Por ejemplo, el espectro de absorción en el infrarrojo se usa a menudo (ver Espectroscopía en el Infrarrojo
Medio (854) y Pruebasde IdentificaciónEspectrofotométrica (197)). Si no es posible obtener un espectro infrarrojo adecuado, se
pueden usar otros métodos analíticos. Los métodos de espectrofotometría en el Infrarrojo Cercano (NIR, por sus siglas en in-
glés) o Raman también podrían ser aceptables como método único de identificación de la formulación del producto farmacéu-
tico (ver Espectroscopíaen el Infrarrojo Cercano(1119) y Espectroscopía Raman(1120)). La identificación mediante un tiempo de
retención cromatográfico a partir de un solo procedimiento no se considera específica. Puede resultar aceptable el uso de
tiempos de retención procedentes de dos procedimientos cromatográficos para los que la separación se basa en diferentes
principios o una combinación de pruebas en un solo procedimiento (ver Cromatografía(621) y Pruebade Identificaciónpor Cro-
matografía en CapaDelgada(201 )).
Valoración
Se debe usar una prueba específica e indicadora de la estabilidad para determinar la concentración (contenido de fármaco)
en el producto farmacéutico. Algunos ejemplos de estos procedimientos son los capítulos Antibióticos-Valoraciones Microbioló-
gicas (81 ), (621) o Valoraciónde Esteroides(351 ). Para los casos en los que se justifica el uso de una valoración no específica
(p.ej., Vo/umetría(541 )), se deben usar otros procedimientos analíticos de suplementarios para lograr la especificidad. Cuando
exista evidencia de interferencia de los excipientes en una valoración no específica, se debe usar un procedimiento con especi-
ficidad comprobada.
Impurezas
El fármaco y los excipientes usados en la fabricación del producto farmacéutico pueden presentar impurezas del proceso,
subproductos sintéticos y demás impurezas orgánicas e inorgánicas. Dichas impurezas se evalúan mediante las pruebas conte-
nidas en las monografías del fármaco y de los excipientes. Resulta necesario monitorear las impurezas resultantes de la degra-
dación del fármaco o del proceso de fabricación del producto farmacéutico. El capítulo DisolventesResiduales(467) se aplica a
todos los productos, siempre que sea pertinente.
En ocasiones, resulta adecuado analizar las impurezas de metales pesados.
Además de las pruebas universales citadas anteriormente, se pueden considerar las siguientes pruebas para cada caso especí-
fico.
Propiedades Fisicoquímicas
Los ejemplos incluyen pH (791 ), Viscosidad-Métodos Capilares(911) o Viscosidad-Métodos Rotatorios(912) y PesoEspecífico

(841).
Tamaño de Partícula
En el caso de algunas formas farmacéuticas, el tamaño de partícula puede tener un efecto significativo sobre las velocidades
de disolución, la biodisponibilidad, el resultado terapéutico y la estabilidad. Se pueden usar procedimientos tales como los des-
critos en MedicamentosNasalesy para Inhalación: Pruebasde Calidad de Desempeñode Aerosoles,Atomizadoresy Polvos(601) y
en Estimaciónde la Distribucióndel Tamañode Partículapor TamizadoAnalítico (786).
Uniformidad de Unidades de Dosificación
Ver la discusión sobre Uniformidadde Dosisen la sección de ConsideracionesGenerales.
Contenido de Agua
Cuando resulta apropiado, se incluye una prueba de determinación de agua (ver Determinaciónde Agua (921 )).
Límites Microbiológicos
El tipo de prueba(s) microbiológica(s) y los criterios de aceptación se basan en la naturaleza del medicamento no estéril, el
método de fabricación y la vía de administración (ver Pruebasde RecuentoMicrobiano (61 ), Pruebasde MicroorganismosEspecífi-
cos(62) y ExamenMicrobiológicode ProductosNo Estériles:Criteriosde Aceptaciónpara PreparacionesFarmacéuticasy Sustancias
de UsoFarmacéutico(1111 )).
Contenido de Conservante Antimicrobiano
Se deben establecer criterios de aceptación para el contenido de conservantes en productos multidosis, los cuales se basan
en los niveles de conservantes antimicrobianos necesarios para mantener la calidad microbiológica del producto en todas las
etapas durante su uso y vida útil propuestos (ver Pruebasde EficaciaAntimicrobiana(51 )).
Contenido de Antioxidantes
Si el producto farmacéutico contiene antioxidantes, se deben realizar pruebas para determinar su contenido a fin de mante-
ner la calidad del producto en todas las etapas durante su uso y vida útil propuestos.
Esterilidad
Dependiendo de la vía de administración, (p.ej., preparaciones oftálmicas, implantes, preparaciones acuosas para inhalación
oral e inyecciones) la esterilidad del producto se demuestra cuando resulte apropiado (ver el capítulo (71 )).
Disolución
Las formas farmacéuticas tales como tabletas, cápsulas, suspensiones, gránulos para suspensiones, implantes, sistemas de ad-
ministración transdérmica y gomas de mascar medicadas normalmente incluyen una prueba para medir la liberación de los
fármacos a partir del producto farmacéutico. Las mediciones a un solo tiempo a menudo se usan para formas farmacéuticas de
liberación inmediata. Para formas farmacéuticas de liberación modificada, se establecen condiciones de prueba y procedimien-
tos de muestreo apropiados, según sea necesario, (ver los capítulos (711) y (724)). En algunos casos, las pruebas de disolución
se pueden reemplazar con una prueba de desintegración (ver el capítulo (701 )).
Fuerza de Ruptura y Friabilidad

Estos parámetros se evalúan como controles durante el proceso. Los criterios de aceptación dependen del envasado, cadena
de aprovisionamiento y uso previsto (ver Friabilidadde las Tabletas(1216) y Fuerzade Ruptura de las Tabletas(1217)).
USP42 InformaciónGeneral/ (1151) FormasFarmacéuticas8105
Sustancias Lixiviables
Cuando existe evidencia de que las sustancias lixiviables de los sistemas de envase-cierre (p.ej., los tapones de goma, el re-
cubrimiento interno de la tapa o los frascos de plástico) tienen un impacto sobre la seguridad o eficacia del producto farma-
céutico, se incluye una prueba para evaluar la presencia de dichas sustancias.
Otras Pruebas
Dependiendo del tipo y composición de la forma farmacéutica, pueden ser necesarias otras pruebas, por ejemplo, contenido
de alcohol, redispersabilidad, distribución del tamaño de partícula, propiedades reológicas, tiempo de reconstitución, endoto-
xinas/pirógenos, partículas, pruebas de funcionalidad de sistemas de administración, uniformidad de dosis liberada, viscosidad
y osmolaridad.
FORMASFARMACÉUTICAS
Aerosoles
Los aerosoles son formas farmacéuticas envasadas a presión que contienen agentes terapéuticos y un propelente que se libe-
ran al activar un sistema de válvula apropiado. Al momento de activar el sistema de válvula, el fármaco es liberado como una
nube de partículas finas o gotitas. Al activar la válvula de dosis fija se libera únicamente una dosis de la preparación. En el caso
de productos tópicos, y dependiendo de la naturaleza del fármaco y de las condiciones que se estén tratando, la activación de
la válvula puede resultar en una liberación fija de una cantidad controlada de formulación o la liberación continua mientras la
válvula esté siendo presionada.
La forma farmacéutica aerosol se refiere únicamente a aquellos productos envasados a presión que liberan una nube de finas
partículas o gotitas al activarlos (ver el Glosario).Los demás productos que producen dispersiones de gotitas o partículas finas
se tratan en las secciones subsiguientes (p.ej., Polvosy Espráis).
COMPONENTESTÍPICOS
Los componentes típicos de los aerosoles son: la formulación que contiene uno o más fármacos y el propelente, el envase, la
válvula y el disparador. Cada componente desempeña un papel para la determinación de las diversas características de la nube
emitida, por ejemplo, la distribución del tamaño de partícula o de las gotitas, uniformidad de administración del agente tera-
péutico, la velocidad de liberación y la velocidad y geometría de la nube. La válvula dosificadora y el disparador actúan en
tándem para generar la nube de gotitas o partículas. La válvula dosificadora administra un volumen exacto de la formulación
líquida presurizada desde el envase. El disparador dirige el volumen medido a un pequeño orificio que se abre a la atmósfera.
Al momento de la activación, la formulación es empujada a través del orificio, formando un rocío fino de partículas que se
dirige hacia el sitio de administración.
Las preparaciones en aerosol pueden consistir en una formulación de dos fases (gas y líquido) o de tres fases (gas, líquido y
sólido o líquido). La formulación de dos fases consta de fármacos disueltos en propelente licuado. Se pueden agregar codisol-
ventes, tales como alcohol, para mejorar la solubilidad de los fármacos. Los sistemas de aerosoles para inhalación y nasales de
tres fases constan de fármacos suspendidos en propelentes, codisolventes y, posiblemente, otros excipientes adecuados. La
suspensión o emulsión del fármaco finamente dividido a menudo se dispersa en el líquido propelente con ayuda de agentes
tensoactivos biocompatibles adecuados u otros excipientes.
Los propelentes para formulaciones en aerosol a menudo tienen hidrofluorocarburos o hidrocarburos de bajo peso molecu-
lar que están en forma líquida cuando se introducen en el envase, presentan una presión de vapor adecuada a temperatura
ambiente y son biocompatibles y no irritantes. Los gases comprimidos no ofrecen una presión constante con el uso y, a menu-
do, no se utilizan como propelentes.
Los envases metálicos pueden tolerar la presión de vapor producida por el propelente. Se puede agregar un exceso de for-
mulación al envase para asegurar la administración exacta del número total de dosis declaradas. El envase y el cierre deben ser
capaces de tolerar las presiones anticipadas en condiciones de uso normales y cuando el sistema se exponga a temperaturas
elevadas.
TIPOS DE FORMASFARMACÉUTICAS
EN AEROSOL
Los aerosoles se pueden administrar mediante diversas vías. El envase, el disparador y la válvula dosificadora, así como la
formulación, están diseñadas para el sitio de administración específico.
Los aerosoles para inhalación, comúnmente conocidos como inhaladores de dosis fija (MDI, por sus siglas en inglés), están
destinados para producir partículas finas o gotitas para inhalación a través de la boca y para depositarse en el árbol pulmonar.
El diseño del sistema de administración tiene como propósito liberar una masa medida y de calidad apropiada de la sustancia
activa con cada disparo.
Los aerosoles nasales, comúnmente conocidos como MDI nasales, producen partículas finas o gotitas para administración a
través del vestíbulo nasal y para depositarse en la cavidad nasal. Cada disparo de la válvula libera una masa medida de fármaco
con las características de calidad apropiadas.
Los aerosoles linguales están destinados a producir partículas finas o gotitas para depositarse en la superficie de la lengua. El
diseño del sistema de administración permite liberar una dosis con cada disparo.
Los aerosoles tópicos producen partículas finas o gotitas para su aplicación sobre la piel.
ETIQUETADOPARAUSO APROPIADO
Referirse al Título 21 del CFR §201.320 y al Título 21 del CFR§369.21.
Cápsulas
Las cápsulas son formas farmacéuticas sólidas en las que el fármaco y/o los excipientes están contenidos dentro de un recep-
táculo o cubierta soluble o recubren la cubierta de la cápsula. Las cubiertas pueden estar compuestas por dos piezas (un cuer-
po y una tapa) o por una sola pieza. A menudo, se hace referencia a las cápsulas de dos piezas con el nombre de cápsulas de
cubierta dura, mientras que las cápsulas de una sola pieza reciben el nombre de cápsulas de cubierta blanda. Aunque impreci-
sa, esta distinción entre cápsulas de dos y de una pieza refleja los diferentes niveles de plastificantes en las dos composiciones,
así como el hecho de que las cápsulas de una pieza generalmente son más flexibles que las cápsulas de dos piezas.
Las cubiertas de las cápsulas por lo general se fabrican con gelatina. Sin embargo, también se pueden fabricar con polímeros
de celulosa u otro material adecuado. La mayoría de las cápsulas están diseñadas para administración oral. Cuando no se ha
modificado intencionalmente la velocidad de liberación del fármaco, las cápsulas reciben el nombre de cápsulas de liberación
inmediata.
CÁPSULASDE DOS PIEZASO DE CUBIERTADURA
Las cápsulas de dos piezas consisten en dos piezas telescópicas, -un cuerpo y una tapa, en un intervalo de tamaños estanda-
rizados.
CÁPSULASDE UNA PIEZAO DE CUBIERTABLANDA
Las cápsulas de una pieza generalmente se usan para administrar un fármaco en forma de solución o suspensión. Las formu-
laciones líquidas colocadas en las cápsulas de una pieza pueden ofrecer ventajas en comparación con las cápsulas con conteni-
do seco y las tabletas en lo que respecta a lograr la uniformidad de contenido de fármacos potentes o la disolución aceptable
de fármacos con poca solubilidad en agua. Debido a que el contacto entre la pared de la cubierta y su contenido líquido es
más íntimo que en las cápsulas con contenido seco, la probabilidad de que ocurran interacciones no deseadas es más alta (in-
cluyendo el entrecruzamiento con la gelatina y la formación de película).
CÁPSULASDE LIBERACIÓNMODIFICADA
La liberación de fármacos a partir de las cápsulas se puede modificar de varias maneras. Existen dos categorías para formula-
ciones de cápsulas de liberación modificada reconocidas por la USP:
Cápsulas de liberación retardada: En ocasiones, las cápsulas se formulan para incluir gránulos con recubrimiento entérico
que protege los fármacos ácido-lábiles del entorno gástrico o para evitar eventos adversos, tales como irritación. Las cápsulas
con múltiples partículas con recubrimiento entérico pueden reducir la variabilidad en la biodisponibilidad asociada con los
tiempos de vaciado gástrico para partículas más grandes (p.ej., tabletas) y para minimizar la probabilidad de falla terapéutica
cuando se presentan defectos en el recubrimiento durante la fabricación. Como alternativa, se puede aplicar un recubrimiento
a la cubierta de la cápsula para conseguir la liberación retardada del contenido.
Cápsulas de liberación prolongada: Las cápsulas de liberación prolongada se formulan de tal manera que el fármaco conte-
nido esté disponible durante un periodo prolongado después de la ingestión. Los requisitos de disolución (ver el capítulo
(711 )) por lo general se especifican en la monografía individual.
Los métodos para modificar la liberación del fármaco a partir de las cápsulas incluyen recubrir las cubiertas de las cápsulas
llenas o el contenido de las cápsulas en el caso de las cápsulas con contenido seco.
PREPARACIÓN
Cápsulas de dos piezas: Las cápsulas de gelatina de dos piezas, por lo general, se fabrican a partir de mezclas de gelatinas
con una fuerza de gel relativamente alta, a fin de optimizar la claridad y dureza de la cubierta, o a partir de hipromelosa. Así-
USP42 Información General/ (1151) Formas Farmacéuticas 8107
mismo, pueden contener colorantes tales como colorantes D&C y FD&C5 o diversos pigmentos, agentes opacificantes como
dióxido de titanio, agentes dispersantes, plastificantes y conservantes. Las cubiertas de las cápsulas de gelatina normalmente
contienen entre 12% y 16% de agua.
Las cubiertas se fabrican en un conjunto de operaciones y posteriormente se llenan en un proceso de fabricación distinto.
Las cubiertas de las cápsulas de dos piezas se fabrican mediante un proceso que consiste en la inmersión de punzones moldea-
dos en soluciones de gelatina o hipromelosa y posteriores etapas de secado, cortado y ensamblado.
Las formulaciones en polvo para cápsulas de gelatina de dos piezas por lo general están compuestas por el fármaco y al
menos un excipiente. Tanto la formulación como el método de llenado pueden afectar la liberación del fármaco. En la opera-
ción de llenado, el cuerpo y la tapa de la cubierta son separadas antes del llenado. Después de la operación de llenado, la
maquinaria reensambla el cuerpo con la tapa y asegura el cierre satisfactorio de la cápsula aplicando una fuerza adecuada so-
bre las dos piezas. Las cápsulas ensambladas se pueden sellar después del llenado usando una banda sobre la unión del cuerpo
y la tapa o empleando una junta de sujeción diseñada entre la tapa y el cuerpo. En la práctica de la preparación magistral de
prescripciones, las cápsulas de dos piezas se pueden llenar a mano. Esto permite al prescriptor seleccionar un solo fármaco o
una combinación de fármacos al nivel de dosis exacto que se considera mejor para cada paciente.
Cápsulas de una pieza: Las cápsulas de una sola pieza se fabrican, llenan y sellan en un solo proceso usando la misma má-
quina, y se encuentran disponibles en una amplia variedad de tamaños, formas y colores. El tipo de cápsula de una pieza más
común es el que se produce usando un proceso de matrices rotativas, el cual produce una cápsula con costura. Las cubiertas
de gelatina blanda son un poco más gruesas que las de las cápsulas de dos piezas y pueden plastificarse mediante el agregado
de polioles, tales como glicerina, sorbitol u otro material adecuado. La relación entre plastificante y gelatina se puede modificar
para cambiar la flexibilidad de la cubierta, dependiendo de la naturaleza del material de llenado, el uso a que la cápsula está
destinado o las condiciones ambientales.
En la mayoría de los casos, las cápsulas de una pieza se llenan con líquidos. Por lo general, los fármacos se disuelven o sus-
penden en un vehículo líquido. Tradicionalmente, se empleaban vehículos oleosos, por ejemplo, aceite vegetal. Sin embargo,
en la actualidad resultan más comunes los vehículos líquidos no acuosos miscibles en agua, como los polietilenglicoles de bajo
peso molecular. Es posible seleccionar las propiedades fisicoquímicas del vehículo a fin de asegurar la estabilidad del fármaco y
para influenciar el perfil de liberación a partir de la cubierta de la cápsula.
Cremas
(Yer Emulsiones.)
Emulsiones
Una emulsión es un sistema coloidal disperso que consiste en dos fases líquidas inmiscibles, generalmente estabilizadas con
uno o más agentes adecuados.
Normalmente, las emulsiones farmacéuticas se preparan a partir de líquidos acuosos y orgánicos (aceites) inmiscibles. En una
emulsión pueden existir sistemas multifases complejos. Que la fase acuosa o la orgánica sea la fase dispersa depende de los
volúmenes de las dos fases, el emulsionante elegido y el método de preparación. Cuando una fase oleosa está dispersa en una
fase acuosa, la emulsión se denomina emulsión de aceite en agua (0/W, por sus siglas en inglés) y la fase acuosa se denomina
fase continua. Cuando la fase acuosa está dispersa en la fase oleosa, la emulsión se denomina emulsión de agua en aceite
(:N/0, por sus siglas en inglés). Normalmente, el tamaño de las gotas de las fases dispersas de las emulsiones varía de O,1 a
100 µm. Las emulsiones son opacas, mientras que las microemulsiones son normalmente transparentes o translúcidas. Las mi-
croemulsiones tienen fases dispersas con gotas de menos de O,1 µm.
Las emulsiones pueden presentar tres tipos de inestabilidad: floculación, cremado y coalescencia. La floculación describe el
proceso mediante el cual la fase dispersa sale de la suspensión en forma de escamas. La coalescencia es otra forma de inestabi-
lidad-pequeñas gotitas contenidas en los medios se combinan continuamente para formar gotitas de mayor tamaño progre-
sivamente. Las emulsiones también pueden experimentar un cremado, cuando una de las fases emigra a la parte superior (o
inferior, dependiendo de las densidades relativas de las dos fases) de la emulsión. Para evitar la floculación, el cremado y la
coalescencia de las emulsiones, los fabricantes suelen agregar agentes tensoactivos, agentes modificadores del pH o agentes
emulsionantes para aumentar la estabilidad de las emulsiones de modo que la emulsión no cambie significativamente con el
paso del tiempo.
5 En 1960 el Congreso de los EE.UU. promulgó Enmiendas para AditivosColorantes

(Color AdditiveAmendments), en las que requiere a la FDAla regulación de
colorantes, pigmentos y demás agentes colorantes en alimentos, medicamentos y cosméticos de manera independiente a los aditivos alimenticios.Por ley, los aditi-
vos colorantes se consideran inseguros a menos que se usen de conformidad con las reglamentaciones de la FDA.La ley ofrece un marco de trabajo para la inclu-
sión y certificaciónde aditivos colorantes. Ver la FDCA§721; ver las reglamentaciones de la FDAen el lítulo 21 del CFRParte 70. Loscolorantes también deben
incluirseen las reglamentaciones de la FDApertinentes para usos específicos;la lista de aditivos colorantes para medicamentos que están exentos del requisito de
certificaciónestá publicada en el Título 21 del CFRParte 73, Subparte B. Asimismo,la FDAlleva a cabo un programa de certificaciónpara partidas de aditivos
colorantes que requieren certificaciónantes de su venta; ver el Título 21 del CFRParte 74 (Subparte B referente a medicamentos). Lasreglamentaciones relaciona-
das con los procedimientos de certificación,las especificacionesgenerales y el listado de colorantes con certificaciónprovisionalse encuentran en el lítulo 21 del
CFRParte 80. La FDAmantiene un sitio web para aditivos colorantes con enlaces a diversos recursos legales y reglamentarios en: http://www.fda.gov; buscar por
título de documento.
Las emulsiones se usan ampliamente como formas farmacéuticas. Las emulsiones orales se preparan para mejorar el sabor, la
solubilidad, la estabilidad o la biodisponibilidad. Las emulsiones para administración tópica se denominan cremas, lociones y a
veces ungüentos. Las emulsiones parenterales se usan para anestésicos, nutrición parenteral y para administración de medica-
mentos con poca solubilidad en agua.
CREMAS
Las cremas son formas farmacéuticas en emulsión semisólida. A menudo, contienen más de 20% de agua y sustancias voláti-
les y/o por lo general contienen menos de 50% de hidrocarburos, ceras o polioles como vehículos para el fármaco. Las cremas,
por lo general, están destinadas a la aplicación externa sobre la piel o las membranas mucosas. Las cremas tienen una consis-
tencia relativamente suave y untable, y se pueden formular como una emulsión de agua en aceite (p.ej., Crema Fríao Crema
Grasatal como se cita en la FarmacopeaEuropea)o como una emulsión de aceite en agua (p.ej., la Cremade Va/eratode Beta-
metasona). Las cremas, por lo general, se describen como no lavables o lavables, lo que refleja el hecho de que una emulsión
con una fase externa acuosa continua es más fácil de eliminar que una con fase externa no acuosa (emulsión de agua en acei-
te).
LOCIONES
Las lociones son formas farmacéuticas líquidas emulsificadas destinadas a la aplicación externa sobre la piel. Algunas suspen-
siones tópicas, tales como la loción de calamina, han sido denominadas históricamente como lociones; sin embargo, dicha
nomenclatura no es la preferida en la actualidad. Las lociones comparten una gran cantidad de características con las cremas.
Elfactor de distinción se basa en que las lociones son más fluidas que semisólidas y, por lo tanto, se pueden verter. Debido a su
carácter fluido, las lociones son más fáciles de aplicar en superficies extensas de la piel que las preparaciones semisólidas. Las
lociones pueden contener agentes antimicrobianos como conservantes.
EMULSIONESINYECTABLES
Las emulsiones inyectables son formas farmacéuticas líquidas estériles de fármacos disueltos o dispersos en un medio de
emulsión adecuado. Las emulsiones inyectables se usan para la administración parenteral de medicamentos con poca solubili-
dad en agua.
UNGÜENTOS
Los ungüentos a veces son formas farmacéuticas en emulsiones semisólidas (ver FormasFarmacéuticas,Ungüentos).
PREPARACIÓN
El capítulo (795) proporciona información general sobre la preparación de emulsiones.

Cremas: Las cremas se pueden formular a partir de una variedad de aceites minerales y vegetales, y de alcoholes grasos, áci-
dos grasos y ésteres grasos. Los agentes emulsificantes incluyen agentes tensoactivos no iónicos, detergentes y jabones. Los
jabones, por lo general, se forman in situ durante la preparación de las cremas, a partir de un ácido graso en fase oleosa que se
hidroliza con una base disuelta en la fase acuosa.
La preparación a menudo implica la separación de los componentes de la fórmula en dos porciones: lipídica y acuosa. La
porción lipídica contiene todos los componentes insolubles en agua, mientras que la porción acuosa contiene los componentes
solubles en agua. Ambas fases se calientan a una temperatura por encima del punto de fusión del componente con el punto
de fusión más alto. Posteriormente, las fases se mezclan y se sigue mezclando hasta que la mezcla alcance la temperatura am-
biente o hasta que solidifique. Por lo general, el mezclado continúa durante el proceso de enfriamiento para promover la uni-
formidad. Tradicionalmente, la fase acuosa se agrega a la fase lipídica, aunque se han obtenido resultados comparables usando
el procedimiento inverso. Se puede emplear homogeneización de alta velocidad para reducir el tamaño de partícula o de las
gotitas y para mejorar la estabilidad física de la forma farmacéutica resultante.
Los fármacos se pueden agregar a la fase en la que son solubles al inicio del proceso de fabricación o se pueden agregar
después de preparar la crema mediante un proceso de dispersión adecuado tal como levigación o molienda con un molino de
rodillo. Las cremas, por lo general, requieren la adición de conservantes, a menos que se trate de una formulación magistral
preparada inmediatamente antes de su uso y estén destinadas para su consumo en un periodo relativamente corto.
Lociones: Las lociones, por lo general, se preparan disolviendo o dispersando el fármaco en la fase más apropiada (aceite o
agua), agregando el emulsionante o agente de suspensión apropiado y mezclando las fases oleosa y acuosa para formar una
emulsión fluida uniforme.
Emulsionesinyectables: El capítulo (1) proporciona una guía sobre preparaciones estériles. Las emulsiones destinadas a su
administración parenteral pueden formularse usando los mismos principios que las cremas y las lociones. La formulación debe
diseñarse para que su administración sea fácil. El tamaño de partícula de la fase dispersa puede variar dependiendo de la vía de
administración. Por ejemplo, las emulsiones destinadas a su administración intravenosa deben cumplir con Distribucióndel Ta-
maño de Glóbulosen EmulsionesInyectablesde Lípidos(729). El procedimiento que asegure la esterilidad se debe validar por
llenado con medios. Por lo general, no se usan conservantes en emulsiones inyectables.
Ungüentos: 0Jer FormasFarmacéuticas,Ungüentos.)
Películas
Las películas son láminas finas que se colocan en la cavidad oral. Contienen una o más capas. Las capas pueden o no conte-
ner el fármaco. Normalmente, estas láminas finas se forman mediante fundición o extrusión que resulta en la dispersión de los
componentes por toda la película. Las películas se clasifican según su lugar de aplicación. Las "películas orales" se pueden for-
mular para que liberen la medicación en la boca, como los productos de higiene oral, o en el tracto gastrointestinal donde se
absorbe. Las "películas bucales" y las "películas sublinguales" están formuladas para facilitar la absorción a través de la mem-
brana proximal de las mucosas evitando el primer paso del metabolismo o su degradación en el tracto gastrointestinal y pro-
porcionando un rápido comienzo de la acción.
Las películas se pueden formular con polímeros comestibles, tales como pululano o con polímeros solubles en agua, tales
como celulosa modificada, gomas comestibles y copolímeros. La velocidad de disolución de la película se controla para facilitar
la incorporación de la medicación a la saliva o su absorción por la mucosa proximal. Estas películas deben ser capaces de man-
tener su integridad durante la fabricación y el envasado, y durante la manipulación por parte del paciente. Debido a su rápida
disolución, el gusto y la sensación en la boca son consideraciones importantes.
Espumas
Las espumas son preparaciones que contienen burbujas de gases distribuidas en un líquido. El líquido contiene el fármaco y
excipientes adecuados. Las espumas medicadas pueden envasarse en envases presurizados o en otros dispositivos dispensado-
res especiales. Las espumas medicadas que se administran desde envases no presurizados requieren el uso de fuerza mecánica
para generar la espuma. Las espumas están destinadas a su aplicación sobre la piel o sobre las membranas mucosas. La espu-
ma medicada se forma en el momento de su aplicación. Se usan agentes tensoactivos para asegurar la distribución del gas en
el líquido y para estabilizar la espuma. Las espumas medicadas tienen una consistencia semisólida y pueden formularse para
que se colapsen rápidamente formando un líquido o para que se mantengan como espuma y así asegurar el contacto prolon-
gado.
Las espumas medicadas destinadas al tratamiento de la piel severamente lesionada o de heridas abiertas deben ser estériles.
PREPARACIÓN
Una espuma puede contener uno o varios fármacos, agentes tensoactivos y líquidos acuosos o no acuosos, y se produce con
o sin la ayuda de propelentes. Cuando no se usa ningún propelente, se requiere trabajo mecánico para generar la espuma. Si
el propelente se encuentra en la fase interna (discontinua), se descarga una espuma estable. Si el propelente se encuentra en la
fase externa (continua), se descarga una espuma que se colapsa rápidamente. Las espumas que se colapsan rápidamente for-
muladas con alcohol generan una sensación refrescante después de aplicarlas sobre la piel y pueden tener propiedades antimi-
crobianas.
Gases
Los gases medicinales son productos que se administran directamente en forma de gas. Un gas medicinal tiene una acción
farmacológica directa o actúa como diluyente para otro gas medicinal. Los gases usados como excipientes para la administra-
ción de productos en aerosol, como un adyuvante en el envase, o los producidos por otras formas farmacéuticas, no se inclu-
yen en esta definición.
COMPONENTES
Los gases medicinales pueden ser componentes individuales o mezclas definidas de componentes. Las mezclas también se
pueden preparar extemporáneamente en el momento de su uso.
ADMINISTRACIÓN
Los gases medicinales se pueden administrar al paciente usando diversos métodos: cánulas nasales, mascarillas faciales, car-
pas atmosféricas para gases y tubos endotraqueales para la vía pulmonar; cámaras hiperbáricas para las vías de administración
pulmonar y dérmica; tubos de chorro que se dirigen al tejido dental para promover el secado en la preparación de obturacio-
nes y coronas; tubos para dilatar los intestinos para facilitar la generación de imágenes médicas durante la colonoscopia; tubos
para dilatar la pelvis mediante insuflación transuterina durante la preparación para ligadura de trompas de Falopio; y tubos
811O (1151) Formas Farmacéuticas / Información General USP42
para dilatar los dispositivos de angioplastia. La dosis de gas medicinal, por lo general, se mide mediante el caudal en condicio-
nes de presión y temperatura ambientales. La administración de un gas sumamente comprimido, por lo general, requiere un
regulador para disminuir la presión, un controlador de flujo de volumen variable y un sistema de tubos adecuado para dirigir el
gas hacia el paciente. Para administración pulmonar, el flujo de gas se dirigirá hacia la nariz o la boca mediante un dispositivo
adecuado o hacia el interior de la tráquea a través de un respirador mecánico. Cuando los gases medicinales se administran de
forma crónica, resulta común humidificarlos. Se debe tener cuidado de evitar la contaminación microbiana.
CONSIDERACIONES
ESPECIALES
Las conexiones del envase y del sistema deben ser adecuadas para el gas medicinal. No se deben usar adaptadores para
conectar los envases a los tubos o equipo del sistema de administración para uso del paciente. Se pueden almacenar grandes
cantidades de gases, tales como oxígeno o nitrógeno, en estado líquido en un envase criogénico y convertirlos en gas, según
se requiera, mediante evaporación. Las agencias gubernamentales (p.ej., el U.S. Department of Commerce [Departamento de
Comercio de los EE.UU.]) promulgan reglas adicionales con respecto a la fabricación y uso de envases criogénicos.
Los envases, tubos y mascarillas de administración usados para gases que contienen oxígeno deben estar libres de todo
compuesto susceptible a la oxidación o que pudiera irritar el tracto respiratorio.
Una fracción significativa de la dosis de un gas medicinal podría ser liberada en las inmediaciones del paciente debido a una
absorción incompleta. Puede ser necesaria ventilación adecuada para proteger a los trabajadores sanitarios y demás individuos
de la exposición al gas (p.ej., óxido nitroso).
Geles
Un gel es un sólido o un semisólido. Los geles se pueden clasificar en dos grupos: geles químicos y físicos. En general, los
geles químicos son geles entrecruzados covalentemente, mientras que los geles físicos consisten en pequeñas moléculas o ca-
denas moleculares que están físicamente entrecruzadas formando redes, o soluciones, o dispersiones coloidales que se tornan
más firmes mediante el uso de un agente gelificante. Típicamente, los geles mantienen su forma por sí mismos. Algunos geles
pueden presentar diversos comportamientos cuando se someten a fuerzas mecánicas. Los geles pueden ser tixotrópicos, los
cuales forman semisólidos durante el reposo y se vuelven menos viscosos al agitarlos. Al igual que las emulsiones, los geles se
pueden caracterizar por tener una fase continua y una fase dispersa. Existe una variedad de rutas de administración para geles,
tal como tópica, por mucosa u oral. En medicina veterinaria, los geles también pueden administrarse mediante infusión intra-
mamaria.
Los geles pueden constar de una red de pequeñas partículas discretas (p. ej., Ge/ de Hidróxidode Aluminio, Magma de Bento-
nita o Hemicelulosade Psyllium).Ya que estos geles pueden ser tixotrópicos, los cuales forman semisólidos durante el reposo y
se vuelven menos viscosos al agitarlos, se deben etiquetar indicando que deben agitarse antes de su uso para garantizar la
homogeneidad.
Los geles pueden consistir en macromoléculas orgánicas distribuidas uniformemente en todo el líquido, de manera tal que
no exista ningún límite evidente entre las macromoléculas dispersas y la fase continua líquida. Estos geles se pueden fabricar a
partir de macromoléculas naturales o sintéticas (p. ej., carbómero, hipromelosa o almidón), o de gomas naturales (p. ej., traga-
canto). Aunque estos geles frecuentemente son acuosos, se pueden emplear alcoholes y aceites como fase continua.
Los geles masticables se usan para administrar fármacos o suplementos dietéticos por vía oral. Los geles masticables consis-
ten en todos o algunos, de los siguientes componentes: agentes gelificantes, azúcares, agua, edulcorantes y agentes saborizan-
tes. Los edulcorantes y los saborizantes tienen como objetivo mejorar la aceptación por parte del paciente y enmascarar el sa-
bor del suplemento dietético o del fármaco que se administra o declara. Los geles masticables mantienen su forma moldeada,
son elásticos y ceden a la masticación. Están destinados a masticarse antes de deglutirse. Los geles masticables también se co-
nocen como "gomitas" en la industria confitera y de los suplementos dietéticos, pero este término no se usa en títulos de artí-
culos oficiales.
PREPARACIÓN
Los geles se pueden formar dispersando el agente gelificante en la fase continua (p. ej., calentando almidón), entrecruzando
el agente gelificante de la fase dispersa, mediante la modificación del pH (como en el caso del Copolímerode Carbómero)o
mediante la reducción de la fase continua usando calentamiento o vacío (como en el caso de los geles que se forman con
sacarosa).
Se debe tener cuidado de asegurar la uniformidad de los fármacos dispersándolos mediante mezcla o molienda vigorosa, o
agitando si la preparación es menos viscosa.
Los geles masticables se formulan con uno o más agentes gelificantes (como la gelatina o el almidón), azúcares (como la
sacarosa o el jarabe de maíz), agentes saborizantes, edulcorantes, colorantes, y agua. Los ingredientes se mezclan y calientan
para formar una solución viscosa que se vierte en moldes (p. ej., moldes de almidón de maíz). Una vez que se enfríen, las
unidades individuales se separan de los moldes.
Gránulos
Los gránulos son formas farmacéuticas sólidas compuestas por aglomeraciones de partículas más pequeñas. Estas composi-
ciones de componentes múltiples se preparan para administración oral y se usan para facilitar regímenes de dosificación flexi-
bles como gránulos o como suspensiones, para encarar desafíos de estabilidad, para permitir el enmascaramiento de sabores o
para facilitar la flexibilidad de la administración (por ejemplo, en pacientes pediátricos, pacientes geriátricos o animales). Las
formas farmacéuticas granulares se pueden formular para administración oral directa y pueden facilitar la preparación magis-
tral de múltiples fármacos permitiendo al farmacéutico encargado de la preparación magistral mezclar varias composiciones
granulares en la farmacia comercial u hospitalaria. Con mayor frecuencia, los gránulos se reconstituyen en forma de suspensión
mediante la adición de agua o un diluyente líquido suministrado, inmediatamente antes de su administración al paciente. Los
gránulos efervescentes están formulados para liberar gas (dióxido de carbono) con la adición de agua. Entre los ejemplos co-
munes de gránulos efervescentes se encuentran las preparaciones antiácidas y de suplementos de potasio. Las clases comunes
de medicamentos terapéuticos formulados como gránulos incluyen antibióticos, algunos laxantes (por ejemplo, productos de
extracto de senna), electrolitos y diversos remedios para la tos y el resfriado que contienen múltiples fármacos.
PREPARACIÓN
Los gránulos son a menudo los precursores usados en la compresión de tabletas o en el llenado de cápsulas. Aunque esta
aplicación representa un producto farmacéutico intermedio y no una forma farmacéutica final, son muchos los productos co-
merciales que se basan en gránulos. En la fabricación típica de gránulos, el fármaco se mezcla con excipientes (coadyuvantes
de procesamiento) y se humecta con una solución de unión, disolvente o mezcla de disolventes farmacéuticos adecuados para
promover la aglomeración. Esta composición se seca y, posteriormente, se ajusta su tamaño para proporcionar las propiedades
deseadas del material.
Con frecuencia, los gránulos se usan debido a que el fármaco es inestable en ambientes acuosos y no se puede exponer al
agua durante periodos suficientes para cubrir la fabricación, el almacenamiento y la distribución en una suspensión. La prepa-
ración de una forma farmacéutica líquida a partir de gránulos inmediatamente antes de su dispensación permite una estabili-
dad aceptable durante el periodo de uso. Los gránulos fabricados para este propósito se envasan en cantidades suficientes du-
rante un periodo limitado-por lo general el transcurso de una terapia que a menudo no excede de 2 semanas. Además del
fármaco, se pueden agregar otros ingredientes para asegurar una estabilidad aceptable (p.ej., amortiguadores, antioxidantes o
agentes quelantes) o para colorear, edulcorar y saborizar; y, en el caso de las suspensiones, para proporcionar una viscosidad
aceptable a fin de asegurar una suspensión adecuada de las partículas que permita la dosificación uniforme.
Los gránulos efervescentes por lo general se formulan a partir de bicarbonato de sodio o potasio y un ácido, por ejemplo,
ácido cítrico o tartárico. Para prevenir la generación inoportuna de dióxido de carbono, los fabricantes deben tomar precaucio-
nes especiales para limitar el agua residual en el producto derivada de la fabricación, así como en la selección de envases que
protejan los productos de la humedad. La fabricación de gránulos efervescentes puede requerir instalaciones especializadas,
diseñadas para mantener una humedad muy baja (aproximadamente 10% de humedad relativa). Las mezclas de polvo efer-
vescente se producen intencionadamente en forma de gránulos relativamente gruesos para reducir la velocidad de disolución
y para proveer una efervescencia más controlada.
La reconstitución de los gránulos debe asegurar la humectación completa de todos los ingredientes, además del tiempo y la
agitación suficientes para permitir que se disuelvan los componentes solubles. Se deben seguir cuidadosamente las instruccio-
nes específicas de reconstitución provistas por el fabricante.
Las suspensiones reconstituidas deben mezclarse o agitarse minuciosamente antes de su uso, para resuspender las partículas
dispersas, lo cual es especialmente importante para las suspensiones cuyas dosis se obtienen de envases multidosis. Para sus-
pensiones particularmente viscosas propensas a atrapar aire, las instrucciones pueden recomendar al usuario la manera en que
se debe agitar la preparación para resuspender las partículas sedimentadas y minimizar la posibilidad de atrapar aire.
Para gránulos reconstituidos para formar suspensiones para administración oral, la suspensión aceptable de la fase particula-
da depende del tamaño de partícula de la fase dispersa y de la viscosidad del vehículo. La temperatura puede influenciar la
viscosidad, lo cual a su vez afecta las propiedades de la suspensión y la facilidad para extraer la dosis del frasco. Asimismo, los
ciclos de temperatura pueden ocasionar cambios en el tamaño de partícula de la fase dispersa a través de la maduración de
Ostwald. Por consiguiente, se deben proveer instrucciones claras en relación con la temperatura de almacenamiento adecuada
para el producto.
Gomas
La goma medicada es una forma farmacéutica flexible diseñada para masticarse en lugar de deglutirse (tragarse). Las gomas
medicadas liberan los fármacos en la saliva. Las gomas medicadas pueden liberar agentes terapéuticos para acción local en la
boca o para absorción sistémica por las vías bucal o gastrointestinal (p.ej., nicotina o aspirina). La mayoría de las gomas se
fabrican usando el proceso de fusión convencional de la industria confitera o, alternativamente, se pueden compactar directa-
mente a partir de polvo para goma. Las gomas medicadas se formulan a partir de bases sintéticas insolubles para goma, tales
como poliisopreno, poliisobutileno, copolímero de isobutilenisopreno, caucho de estireno-butadieno, acetato de polivinilo, po-
lietileno, gomas de éster o politerpenos. Se agregan plastificantes y ablandadores, tales como propilenglicol, glicerina, ácido
oleico o aceites vegetales procesados, para mantener la flexibilidad de la goma base y para facilitar la incorporación de los
fármacos, edulcorantes y agentes saborizantes. Los azúcares y los edulcorantes artificiales se incorporan para mejorar el sabor;
asimismo, se pueden usar colorantes para mejorar la apariencia. Algunas gomas medicadas se recubren con estearato de mag-
nesio para reducir la adhesividad y mejorar el manejo durante el envasado. Se pueden agregar conservantes.
PREPARACIÓN
Goma fundida: La goma base se funde a una temperatura de aproximadamente 115º hasta que adquiere la viscosidad de
jarabe espeso y, en ese momento, se filtra a través de un tamiz de malla fina. La goma base fundida se transfiere a tanques de
mezclado donde se le agregan y mezclan los edulcorantes, plastificantes y normalmente el fármaco. La adición de colorantes,
saborizantes y conservantes se lleva a cabo mientras la goma fundida se enfría. Posteriormente, se le da forma a la mezcla fría
mediante extrusión o pasándola por un mecanismo de rodillos y corte. Las unidades de dosificación con la forma y potencia
deseadas se envasan individualmente. Se pueden agregar recubrimientos adicionales, tales como recubrimientos en polvo para
reducir la adhesividad o recubrimientos de película o azúcar, para mejorar el sabor o facilitar el envasado a granel.
Goma compactada directamente: La goma base se provee en forma de polvo granular que fluye libremente. Posteriormen-
te, la goma base en polvo se mezcla en seco con edulcorantes, saborizantes, el fármaco y lubricantes. Después, la mezcla se
procesa a través de una prensa para tabletas convencional y se producen las tabletas con la forma deseada. Las tabletas de
goma medicada resultantes se pueden recubrir con azúcar o excipientes libres de azúcar. Estas tabletas se pueden envasar en
blísteres o frascos, según se requiera.
CONSIDERACIONES
ESPECIALES
Las gomas medicadas por lo general se dispensan en envases de dosis única. Las instrucciones para el paciente también pue-
den incluir una advertencia de que debe evitarse el calor excesivo.
Implantes
Los implantes son formas farmacéuticas de larga acción que proveen una liberación continua del fármaco, a menudo duran-
te periodos que van de meses a años. Los implantes se administran por vía parenteral. Asimismo, para la administración sisté-
mica se pueden colocar por vía subcutánea o, para administración local, se pueden colocar en una región específica del cuerpo
(p.ej., en los senos nasales, en una arteria, en el ojo, en el cerebro, etc.).
Se encuentran disponibles diversos tipos de implantes. Los implantes en pellet son pequeñas masas sólidas y estériles com-
puestas por un fármaco con o sin excipientes, que por lo general se administran con un inyector especial adecuado (p.ej., un
trocar) o a través de una incisión quirúrgica. La liberación del fármaco de los pellets regularmente se controla mediante cinéti-
cas de difusión y disolución. El tamaño de los pellets y la velocidad de erosión afectarán la velocidad de liberación, que por lo
general sigue una cinética de primer orden. Resulta posible la liberación del fármaco a partir de los pellets durante periodos de
6 meses o más.
Las micropartículas reabsorbibles son un tipo de implante que provee una liberación prolongada del fármaco durante perio-
dos que van de unas cuantas semanas hasta meses. Para su liberación sistémica, se pueden administrar por vía subcutánea o
intramuscular, o se pueden depositar en una ubicación deseada del cuerpo para su liberación en un sitio específico. El diáme-
tro de las micropartículas readsorbibles inyectables (o microesferas) por lo general va desde 20 hasta 100 µm. Están compues-
tas por un fármaco disperso dentro de un excipiente polimérico biocompatible y bioreadsorbible (matriz). Los polímeros de
poli(lactido-co-glicólido) se han utilizado con frecuencia. Estos excipientes por lo general se reabsorben mediante la hidrólisis
de enlaces éster. Las micropartículas se administran suspendiéndolas en un vehículo acuoso, y posteriormente se inyectan
usando una jeringa y aguja convencionales. La liberación del fármaco de las micropartículas comienza después de que el fluido
fisiológico ingresa en la matriz de polímero, disolviendo una parte del fármaco que, posteriormente, se libera mediante un pro-
ceso de difusión controlada. La liberación del fármaco también puede ocurrir a medida que la matriz se desgasta.
Los implantes poliméricos pueden formarse como una masa de una sola forma, por ejemplo, un cilindro. La matriz del polí-
mero debe ser biocompatible (ver Biocompatibilidad de losMaterialesUsadosen Envasesde Medicamentos, DispositivosMédicose
Implantes(1031 )), aunque puede ser biodegradable o no biodegradable. Los implantes poliméricos con forma definida se ad-
ministran usando un inyector especial adecuado. Por lo general, la cinética de liberación no será de orden cero, aunque dicha
cinética puede ser posible. La liberación del fármaco se puede controlar mediante la difusión del fármaco a partir de la masa de
la matriz del polímero o mediante las propiedades de un recubrimiento de membrana polimérico que limite la velocidad. Los
implantes poliméricos se usan para liberar moléculas pequeñas potentes como esteroides (p.ej., estradiol para ganado) y molé-
culas grandes como péptidos [p.ej., hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH,por sus siglas en inglés)]. Algunos
ejemplos de los periodos de liberación de fármacos pueden ser 2 o 3 meses para implantes biodegradables y hasta 3 años para
implantes no biodegradables. Una ventaja de los implantes biodegradables es que no es necesaria su extracción después de
que han liberado todo el contenido del fármaco. Los implantes poliméricos no biodegradables pueden extraerse antes o des-
pués de completar la liberación del fármaco, o se pueden dejar in situ. Un implante puede tener una pestaña con un orificio
para facilitar su sutura en el lugar requerido, (p.ej., para un implante intravítreo para administración ocular local). Estos implan-
tes pueden proveer una liberación terapéutica durante periodos de hasta 2,5 años.
Los estents liberadores de fármaco combinan el efecto mecánico del estent para mantener la arteria desbloqueada con el
efecto farmacológico prolongado del fármaco incorporado (a fin de reducir la reestenosis, inhibir la formación de coágulos o
combatir infecciones). Por ejemplo, un estent metálico puede recubrirse con un fármaco que contiene un polímero no biode-
gradable o biodegradable. El recubrimiento resultante es una matriz polimérica que controla la liberación prolongada del fár-
maco.
En medicina veterinaria, los fármacos en pellet pueden implantarse subcutáneamente en la oreja del animal (ganado).
PREPARACIÓN
Los implantes en pellet se fabrican mediante compresión o moldeado del fármaco. Los implantes poliméricos cilíndricos por
lo general se fabrican mediante extrusión fundida de una mezcla de fármaco y polímero, con lo que se obtiene una varilla que
se corta en trozos menores. Los implantes poliméricos también se pueden fabricar mediante moldeado por inyección. En la
actualidad, algunos implantes aún se ensamblan a partir de tubos metálicos y componentes plásticos moldeados por inyec-
ción.
La esterilidad se puede lograr mediante esterilización terminal o a través de procedimientos de fabricación aséptica.
Inyecciones
0fer Emulsiones,Polvos,Solucionesy Suspensiones.)

Las inyecciones no se tratan como una forma farmacéutica en este capítulo. El capítulo (1) proporciona información sobre la
calidad y otros aspectos de los productos inyectables. Se puede encontrar información sobre terminología de formas farmacéu-
ticas específicas en el Glosario.Para la nomenclatura apropiada sobre inyecciones, ver Nomenclatura(1121 ).
Exceso de volumen en inyectables: Los envases de los inyectables se deben llenar con un volumen ligeramente mayor que
el "volumen" declarado en la etiqueta o el volumen a extraer. Los excesos de volumen recomendados en la Tabla 1 son, por lo
general, suficientes para permitir la extracción y administración del volumen declarado en la etiqueta.
Tabla 1
Exceso de Volumen Recomendado
Para Líquidos Para Líquidos
Volumen Declarado Móviles Viscosos
(ml) (ml) (ml)
0,5 0,10 0,12
1,0 0,10 0,15
2,0 0,15 0,25
5,0 0,30 0,50
10,0 0,50 0,70
20,0 0,60 0,90
30,0 0,80 1,20
50,0 o más 2% 3%
Insertos
Los insertos son formas farmacéuticas sólidas que se insertan en una cavidad natural del cuerpo (no quirúrgica) distinta a la
boca o al recto (ver Supositorios).Los insertos liberan el fármaco para su acción sistémica o local. Los insertos vaginales, por lo
general, tienen forma globular u oval y cada uno pesa aproximadamente 5 g. Los insertos destinados para disolución en secre-
ciones vaginales a menudo se fabrican con vehículos solubles o miscibles en agua tales como polietilenglicol o gelatina gliceri-
nizada.
PREPARACIÓN
Para consideraciones generales, ver el capítulo (795). La preparación de los insertos puede variar de manera considerable.
Los insertos se pueden moldear (usando tecnología similar a la empleada para preparar las tabletas de disolución bucal, suposi-
torios o plásticos), compactar a partir de polvos (como al preparar tabletas) o formular como aplicaciones especiales de cápsu-
las (se han utilizado cápsulas de gelatina blanda y cápsulas de gelatina dura para preparaciones magistrales extemporáneas).
Los insertos pueden estar formulados para que fundan a la temperatura corporal o para que se desintegren al momento de la
inserción. Se debe tomar en cuenta para el diseño de la forma farmacéutica el volumen de fluido disponible en el sitio de inser-
ción y minimizar la posibilidad de irritación local. La mayoría de los insertos están formulados para asegurar su retención en el
sitio de administración.
Irrigaciones
0/er Soluciones.)
Líquidos
Como forma farmacéutica, un líquido consiste en un químico puro en su estado líquido. Entre los ejemplos se incluyen el
aceite mineral, isoflurano y éter. Este término de forma farmacéutica no se aplica a las soluciones.
Lociones
0/er Emulsiones.)
Tabletas de DisoluciónBucal
Las tabletas de disolución bucal son formas farmacéuticas orales sólidas diseñadas para disolverse o desintegrarse lentamente
en la boca. Contienen uno o más fármacos que se liberan lentamente de la base, normalmente saborizada y edulcorada. Con
frecuencia, están destinadas a proporcionar una acción local en la cavidad bucal o en la garganta, aunque también se incluyen
aquéllas destinadas para su absorción sistémica después de la disolución. Las categorías terapéuticas comunes de fármacos ad-
ministrados como tabletas de disolución bucal son antisépticos, analgésicos, descongestionantes, antitusivos y antibióticos. Las
tabletas de disolución bucal moldeadas se denominan caramelos para la tos o pastillas, pero este término no se usa en títulos
de artículos oficiales. Las tabletas de disolución bucal preparadas por compresión o mediante estampado o cortado a partir de
un lecho uniforme de pasta en ocasiones reciben el nombre de trociscos (término que no se usa en títulos de artículos oficia-
les). Las tabletas de disolución bucal comprimidas o estampadas a menudo se producen con forma circular.
Las tabletas de disolución bucal se pueden fabricar usando azúcares tales como sacarosa y dextrosa o pueden ofrecer los
beneficios de una formulación exenta de azúcar, la cual generalmente se basa en sorbitol o manito!. En ocasiones se incluyen
polietilenglicoles e hipromelosa para disminuir la velocidad de disolución.
PREPARACIÓN
Los excipientes usados en la fabricación de tabletas de disolución bucal moldeadas incluyen gelatina, sacarosa fundida, sor-
bitol u otra base de carbohidratos.
Las tabletas de disolución bucal moldeadas que emplean una base de sacarosa o sorbitol que contienen fármacos tales como
fenol, dextrometorfano, fentanilo, clorhidrato de diclonina y mentol se preparan cocinando el azúcar (sacarosa, jarabe de maíz
y sorbitol) y el agua a aproximadamente 150º hasta reducir el contenido de agua a menos de 2%. La solución de azúcar fundi-
da se transfiere a una banda o mesa de enfriamiento y, posteriormente, se agregan y mezclan minuciosamente los medica-
mentos, saborizantes y colorantes mientras se enfría. Después, a las unidades de dosificación individuales se les confiere la for-
ma deseada transfiriendo la masa fundida a moldes. Estas tabletas de disolución bucal se enfrían rápidamente en los moldes
para atrapar la base en su estado vítreo. Una vez formadas, las tabletas de disolución bucal son retiradas de los moldes y enva-
sadas. Se debe tener cuidado de evitar la humedad excesiva durante el almacenamiento para prevenir la cristalización de la
base de azúcar.
Las tabletas de disolución bucal comprimidas se fabrican usando excipientes que pueden incluir diluyentes sólidos, agluti-
nantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes y lubricantes. A menudo se incluyen azúcares tales como sacarosa, sorbitol
y manito! debido a que pueden actuar como diluyentes sólidos o aglutinantes, además de que funcionan como agentes edul-
corantes. Asimismo, pueden estar presentes colorantes y lacas (colorantes adsorbidos en hidróxido de aluminio insoluble)
FD&:Cy D&:Caprobados.
La fabricación de tabletas de disolución bucal comprimidas es, en esencia, igual a la empleada para la fabricación convencio-
nal de tabletas, excepto que puede ser necesaria una prensa para tabletas capaz de fabricar tabletas más grandes y ejercer una
fuerza mayor para producir tabletas más duras (ver Tabletas).
La pasta usada para producir tabletas de disolución bucal que se fabrican mediante estampado o cortado contiene un agen-
te humectante, sacarosa y agentes edulcorantes y saborizantes. La pasta homogénea se esparce en forma de lecho con un es-
pesor uniforme del cual se cortan o estampan las tabletas de disolución bucal para posteriormente dejarlas secar. Algunas ta-
bletas de disolución bucal se preparan forzando polvos humedecidos a baja presión en cavidades de moldes y expulsándolos
en bandejas adecuadas para secado a temperaturas moderadas.
Ungüentos
Los ungüentos son preparaciones semisólidas generalmente destinadas a la aplicación externa sobre la piel o las membranas
mucosas. Los fármacos administrados en ungüentos están destinados a la acción local o la absorción sistémica. A menudo con-
tienen menos de 20% de agua y sustancia volátiles, y más de 50% de hidrocarburos, ceras o polioles como vehículos. Las ba-
ses para ungüentos reconocidas para su uso como vehículos caen dentro de cuatro clases generales: bases hidrocarbonadas,
bases de absorción, bases lavables con agua y bases hidrosolubles.
BASESHIDROCARBONADAS
También conocidas como bases oleosas para ungüentos, las bases hidrocarbonadas solo permiten la incorporación de canti-
dades mínimas de un componente acuoso. Los ungüentos preparados a partir de bases hidrocarbonadas actúan como apósi-
tos oclusivos y mantienen al fármaco en contacto prolongado con la piel. Son difíciles de eliminar y sus características físicas no
cambian con el paso del tiempo.
BASESDE ABSORCIÓN
Permiten la incorporación de soluciones acuosas e incluyen únicamente componentes anhidros (p.ej., VaselinaHidrofílica)o
emulsiones de tipo agua en aceite (p.ej., Lanolina). Las bases de absorción también sirven como emolientes.
BASESLAVABLES
CON AGUA
Las emulsiones de tipo aceite en agua (p.ej., UngüentoHidrofílico)en ocasiones se denominan cremas (ver Emulsiones).Pue-
den lavarse fácilmente de la piel o de la ropa con agua, lo que las vuelve viables para fines cosméticos. Otra ventaja de las
bases lavables con agua es que se pueden diluir con agua, además de que favorecen la absorción de secreciones serosas en las
afecciones dermatológicas.
BASESHIDROSOLUBLES
También conocidas como bases no grasas para ungüentos, están totalmente formuladas a partir de componentes solubles
en agua. El Ungüentode Polietilenglicoles la única preparación oficial de este grupo. Estas bases ofrecen muchas de las ventajas
de las bases lavables con agua. Además, no contienen sustancias insolubles en agua tales como vaselina, lanolina anhidra o
ceras. Estas bases se categorizan correctamente como geles (ver Geles).
La selección de una base de ungüento depende de la acción deseada, de las características del fármaco incorporado y de la
biodisponibilidad de este último para casos en los que se desea una acción sistémica. Para lograr la estabilidad del producto,
puede ser necesario usar una base poco idónea en lo que respecta al cumplimiento con otros atributos de calidad. Por ejem-
plo, los fármacos que se hidrolizan rápidamente son más estables en bases hidrocarbonadas que en las bases que contienen
agua.
PREPARACIÓN
Los ungüentos por lo general se fabrican mediante la incorporación directa en una base para ungüentos previamente prepa-
rada o mediante fusión (calentando durante la preparación del ungüento). A menudo se agrega un agente levigante para faci-
litar la incorporación del medicamento en la base para ungüento mediante el procedimiento de incorporación directa. En el
método de fusión, los ingredientes se calientan. Por lo general, se requiere de homogeneización. La velocidad de enfriamiento
es un detalle importante de la fabricación, debido a que el enfriamiento rápido puede generar una estructura más rígida en el
producto preparado por el método de fusión.
Pastas
Las pastas son preparaciones semisólidas de consistencia firme que contienen un alto porcentaje (20%-50%) de sólidos fina-
mente dispersos. Las pastas están destinadas a la aplicación sobre la piel, la cavidad oral o las membranas mucosas. Por lo
general, las pastas no fluyen a la temperatura corporal y, por consiguiente, pueden servir como recubrimientos oclusivos y pro-
tectores. Como consecuencia, las pastas se usan para ofrecer una acción protectora más a menudo que los ungüentos.
Las pastas grasas que tienen una alta proporción de sólidos hidrófilos son menos oleosas y más absorbentes que los ungüen-
tos. Éstas se usan para absorber secreciones serosas y a menudo se prefieren para lesiones agudas con tendencia a formar cos-
tras, vesículas o exudados.
Las pastas dentales se aplican a los dientes. Otras pastas administradas oralmente pueden estar destinadas a la adhesión a la
membrana mucosa para conseguir un efecto local.
En medicina veterinaria, generalmente, las pastas se administran oralmente y están destinadas a la administración sistémica
de los fármacos. La pasta se estruja dentro de la boca del animal, generalmente en la parte posterior de la lengua, o se unta
dentro de la boca.
8116 (1151) Formas Farmacéuticas/ Información General USP42
Pellets
Los pellets son formas farmacéuticas compuestas por pequeñas partículas sólidas de forma uniforme, que en ocasiones reci-
ben el nombre de perlas, aunque "perlas" no es el término preferido como forma farmacéutica. Por lo general, los pellets tie-
nen forma casi esférica, aunque no es obligatorio. Los pellets pueden administrarse por la vía oral (gastrointestinal) o mediante
inyección (ver también Implantes).Las formulaciones de pellets pueden ofrecer varias ventajas, incluyendo la separación física
de materiales con incompatibilidad física o química, la liberación prolongada del fármaco o la liberación retardada para prote-
ger un fármaco ácido-lábil de la degradación en el estómago, o para proteger los tejidos estomacales de la irritación. Las for-
mulaciones de pellets de liberación prolongada pueden estar diseñadas con el fármaco disperso en una matriz o se puede re-
cubrir el pellet con un recubrimiento de polímero adecuado que modifique las características de liberación del fármaco. Como
alternativa, el diseño del pellet puede combinar los dos enfoques anteriores. En el caso de las formulaciones de liberación retar-
dada, se prefiere el polímero de recubrimiento para resistir la disolución en las condiciones del pH bajo del entorno gástrico,
pero para disolverse en el pH mayor del entorno intestinal. Las preparaciones de pellets que se administran por inyección o por
la vía quirúrgica (ver Implantes)a menudo se usan para proveer una terapia continua durante periodos de meses o años.
Los pellets se pueden diseñar como entidades individuales o múltiples. Por lo general, los pellets implantados incluirán el
contenido deseado de fármaco en una o varias unidades. Los pellets orales generalmente se encuentran dentro de cápsulas de
gelatina dura para su administración. Aunque no existen requisitos absolutos relacionados con el tamaño, el intervalo de tama-
ño útil de los pellets depende de las limitaciones prácticas del volumen de las cápsulas comúnmente usadas y de la necesidad
de incluir una cantidad suficiente de pellets en cada dosis para asegurar una dosificación uniforme del fármaco. Por consi-
guiente, muchos pellets usados para administración oral caen dentro de un intervalo de tamaño de 71 O µm a 2,5 mm. En
ocasiones, las formulaciones de pellets se usan para minimizar la variabilidad relacionada con la retención gástrica de formas
farmacéuticas de mayor tamaño.
Las formulaciones de pellets de liberación retardada y algunas formulaciones de liberación prolongada se preparan mediante
la aplicación de un recubrimiento a las partículas formuladas. El recubrimiento se debe aplicar como una película continua so-
bre toda la superficie de cada partícula. Puesto que es difícil evitar que el recubrimiento de una pequeña población de las par-
tículas quede imperfecto, el diseño de los pellets orales requiere la administración de un gran número en una sola dosis, a fin
de minimizar los efectos adversos de los pellets con recubrimiento imperfecto durante la administración del fármaco.
PREPARACIÓN
Las características de desempeño deseadas determinan la selección del método de fabricación. En general, los pellets se fa-
brican mediante procesos de extrusión húmeda seguida de procesos de esferonización, de recubrimiento húmedo o seco, o de
compresión. Ú fabricación de pellets mediante recubrimiento húmedo por lo general implica la aplicación de recubrimientos
sucesivos en esférulas (nonpareil seeds). Con frecuencia, este proceso de fabricación se lleva a cabo en equipos de procesa-
miento de lecho fluido. Los procesos de recubrimiento de polvo seco o de aplicación de capas a menudo se realizan en equi-
pos especializados de granulación por rotor. El grado de crecimiento de las partículas que se puede conseguir en los procesos
de recubrimiento húmedo, por lo general es más limitado que el crecimiento obtenible mediante técnicas de aplicación de
capas de polvo seco, aunque cualquiera de los métodos permite al formulador desarrollar y aplicar múltiples capas de recubri-
miento para lograr el perfil de liberación deseado. La fabricación de pellets mediante compresión está limitada en gran medida
a la producción de material para implantación subcutánea. Este método de fabricación provee el control necesario para asegu-
rar la uniformidad de la dosis y, en general, se adapta mejor a los rec¡uisitos de procesamiento aséptico,
Alternativamente, para la fabricación de pellets se pueden usar las técnicas de microencapsulamiento. Las técnicas de recu-
brimiento por coacervación por lo general producen partículas recubiertas de tamaños mucho menores que aquéllas fabrica-
das usando otras técnicas.
Píldoras
Las píldoras son pequeños cuerpos sólidos y esféricos, que contienen fármacos, y que están destinados a la administración
oral. La píldora ha sido ampliamente reemplazada por las tabletas comprimidas y por las cápsulas. A diferencia de las tabletas,
las píldoras, generalmente se preparan mediante una técnica de amasado por vía húmeda, producción de magdaleones y mol-
deo. Este término se usa infrecuente e incorrectamente como un término general para describir formas farmacéuticas orales
sólidas, como tabletas y cápsulas.
PREPARACIÓN
La selección de excipientes se lleva a cabo basándose en su capacidad para producir una masa firme y con textura plástica.
El fármaco se tritura con excipientes en polvo mediante diluciones en serie hasta obtener una mezcla uniforme. Posteriormen-
te, se agregan excipientes líquidos a los materiales secos para unir y proveer elasticidad a la masa. La masa se forma mediante
amasado. Las propiedades de firmeza y plasticidad son indispensables para permitir que la masa pueda ser trabajada y que ésta
conserve la forma producida. Se forman magdaleones a partir de porciones de la masa. El magdaleón se corta en pedacitos
USP 42 InformaciónGeneral/ (1151) Formas Farmacéuticas 8117
que corresponden al tamaño deseado de las píldoras y se ruedan para adoptar la forma final. Las máquinas para fabricar píldo-
ras pueden automatizar la preparación de la masa, la producción de los magdaleones, el corte y el rodado.
Emplastos
Un emplasto es una sustancia semisólida para aplicación externa que generalmente se proporciona en un material de sopor-
te. Los emplastos se aplican durante periodos prolongados para proveer protección, soporte u oclusión (maceración). Éste es
un término no preferido y no debe usarse para títulos de medicamentos nuevos. Los emplastos consisten en una capa adhesiva
que puede contener sustancias activas y que se esparce uniformemente sobre un soporte apropiado el cual, por lo general,
está fabricado de una base de caucho o resina sintética. Los emplastos no medicados están diseñados para proveer protección
o soporte mecánico en el sitio de aplicación. Los emplastos están disponibles en una variedad de tamaños o se cortan en tama-
ños determinados para ofrecer un contacto prolongado efectivo en el sitio de aplicación. Asimismo, se adhieren firmemente a
la piel, pero pueden ser retirados sin ocasionar lesiones.
Polvos
Los polvos se definen como un único sólido o una mezcla de sólidos en estado finamente dividido. Los polvos usados como
formas farmacéuticas pueden contener uno o más fármacos y se pueden usar tal cual o mezclarse con un vehículo adecuado
para su administración. Los polvos pueden estar destinados para uso interno o externo. Por lo general, los polvos para uso
externo se espolvorean sobre la piel, o se aplican a vendajes o a la ropa. Los polvos para uso interno se pueden aplicar a mem-
branas mucosas accesibles con aplicadores adecuados o pueden arrastrarse en corrientes de aire para aplicación en la nariz o
los pulmones.
El desempeño de los polvos como forma farmacéutica se puede ver afectado por las características físicas del polvo. La selec-
ción de características pertinentes y apropiadas del polvo depende de la forma farmacéutica y de su vía de administración. Por
ejemplo, el tamaño de partícula puede influir sobre la velocidad de disolución de las partículas, afectando así la biodisponibili-
dad y/o la efectividad en el lugar de acción. Los polvos para aplicación externa deben tener un tamaño de partícula de 150 µm
o menor (por lo general en el intervalo de 50 a 1 00 µm para prevenir una sensación arenosa en la piel que pudiera irritar aún
más la piel lesionada). El tamaño de partícula de los polvos que se administran en el pulmón o la nariz condiciona dónde se
deposita el polvo. El tamaño de partícula puede influir en el mezclado, la segregación y la agregación de las partículas, que a
su vez puede afectar la administración y la uniformidad de la forma farmacéutica. Para más información ver Finurade Polvos
(811) y (5).
En medicina veterinaria, un polvo que necesita ser reconstituido antes de su administración se denomina concentrado (p.ej.,
medicamentos que se administran agregándolos al agua potable). El uso del término "concentrado" ya no es el preferido.
POLVOSPARAINHALACIÓNY POLVOSNASALES
Los polvos para inhalación y los polvos nasales consisten en un sólido dividido fina y apropiadamente y de un sistema de
administración de envase-cierre adecuado. Para más información, ver los capítulos (5) y (601 ).
PREPARACIÓN
Los polvos se pueden producir mediante la combinación de múltiples componentes para formar una mezcla uniforme. Esta
preparación puede implicar además la reducción del tamaño de partícula, un proceso referido como pulverización. Se puede
reducir el tamaño de partícula de los polvos usando molienda, secado por rocío, fluido supercrítico, homogeneización a alta
presión, tecnologías de precipitación y técnicas de fabricación de micropartículas. A medida que se reduce el tamaño de partí-
cula, se incrementa el número de partículas y el área superficial, lo que puede aumentar la velocidad de disolución y la biodis-
ponibilidad y/o la velocidad y la intensidad de la acción local del fármaco.
El mezclado de polvos puede conseguirse mediante diferentes técnicas. Los procesos industriales pueden emplear el tamiza-
do o la rotación de polvos en un recipiente giratorio. Uno de los mezcladores por rotación más comunes es el mezclador en V,
que está disponible en una variedad de tamaños adecuados para la preparación magistral a pequeña y gran escala y para la
producción industrial. Dependiendo del tamaño de partícula del fármaco, se puede usar una mezcla aleatoria de polvos. Las
técnicas de mezclado para polvos incluyen aquéllas usadas en la farmacia magistral, tales como la técnica con espátula o de
trituración (ver el capítulo (795)).
Elflujo del polvo se puede ver afectado por el tamaño y la forma de la partícula. Las partículas de mayor tamaño por lo
general fluyen de manera más libre que las partículas finas. Elflujo del polvo es un atributo importante que puede afectar el
envasado o la dispensación de un polvo.
Jabones y Champús
Los jabones y champús son preparaciones sólidas o líquidas destinadas para aplicación tópica sobre la piel o el cuero cabellu-
do, seguida de enjuagado con agua. Los jabones y champús son emulsiones, suspensiones, o composiciones tensoactivas que
forman fácilmente emulsiones, micelas o espumas con la adición de agua seguida de frotamiento. La incorporación de fárma-
cos en jabones y champús combina las capacidades limpiadoras y desengrasantes del vehículo y facilita la aplicación tópica del
fármaco sobre las áreas afectadas, e incluso áreas grandes del cuerpo. Las propiedades tensoactivas del vehículo facilitan el
contacto del fármaco con la piel o el cuero cabelludo. Las formulaciones de jabón y champú medicado con frecuencia contie-
nen agentes antimicrobianos adecuados para proteger de la contaminación por bacterias, hongos filamentosos y levaduras.
PREPARACIÓN
La preparación de jabones y champús medicados sigue técnicas frecuentemente usadas para la preparación de sistemas
emulsificados. Para asegurar la uniformidad, los fármacos deben agregarse al vehículo antes de la solidificación (en el caso de
los jabones) seguido por el mezclado minucioso. Si la medicación está presente como suspensión, se debe controlar el tamaño
de partícula para promover la distribución uniforme del fármaco y para, posiblemente, optimizar el desempeño. Debido a que
la fabricación de jabones con frecuencia implica el procesamiento de ingredientes a una temperatura elevada, se debe tener
cuidado de evitar la degradación excesiva del fármaco durante el procesamiento.
Soluciones
Una solución es una preparación que contiene una o más sustancias químicas disueltas en un disolvente adecuado o mezcla
de disolventes mutuamente miscibles. Dado que las moléculas de un fármaco en solución se dispersan uniformemente, el uso
de soluciones como formas farmacéuticas, por lo general, garantiza la administración de dosis uniformes y la exactitud cuando
la solución se diluye o mezcla por otros medios.
Las sustancias en solución son más susceptibles a la inestabilidad química que cuando se encuentran en estado sólido y, por
lo general, son más pesadas y más voluminosas por dosis que las formas farmacéuticas sólidas. Estos factores incrementan el
costo de envasado y envío con respecto al de las formas farmacéuticas sólidas. Las soluciones se pueden administrar mediante
inyección, inhalación y por la vía mucosa, tópica/dérmica y gastrointestinal. Las soluciones que se administran mediante inyec-
ción reciben oficialmente el nombre de inyección (ver (1 )).
Algunas soluciones están diseñadas para formar una masa in situ. Estas soluciones incluyen polímeros, fármacos y disolventes
del polímero. El disolvente del polímero puede ser agua o un disolvente orgánico. Después de administrar la solución a un
paciente mediante administración subcutánea o intramuscular, forma un gel o una matriz polimérica sólida que atrapa el fár-
maco y extiende la liberación del fármaco durante días o meses.
Las soluciones destinadas a la administración oral por lo general contienen saborizantes y colorantes que dan un mayor
atractivo al medicamento y lo vuelven más apetecible para el paciente o usuario. Asimismo, cuando sea necesario, pueden
contener estabilizantes para mantener la estabilidad química y física, además de conservantes para evitar el crecimiento micro-
biano.
A veces, para facilitar la aplicación, las soluciones se colocan en hisopos, paños o esponjas.
En medicina veterinaria, una solución que necesita ser diluida antes de su administración se ha denominado concentrado
(p.ej., medicamentos que se administran agregándolos al agua potable). El uso del término "concentrado" ya no es el preferi-
do.
Espráis
Las preparaciones en atomizador pueden administrar la formulación en cantidades exactamente medidas o en cantidades no
medidas.
Un espray es una forma farmacéutica que contiene un fármaco en estado líquido como una solución o suspensión que está
destinada a administrarse en forma de rocío de gotitas. Los espráis se diferencian de los aerosoles en que los atomizadores no
están presurizados. La mayoría de las atomizaciones se generan apretando manualmente un envase flexible o activando una
bomba que genera el rocío al descargar el contenido a través de la boquilla.
Dependiendo del diseño de la formulación y del sistema de válvula, las gotitas generadas pueden estar destinadas a la inha-
lación inmediata por la boca y depositarse en el árbol pulmonar, o a la inhalación por la nariz y depositarse en la cavidad nasal.
El mecanismo para generación de las gotitas y el uso previsto de la preparación distingue entre varios tipos de espráis. Un
atomizador puede estar compuesto de una bomba, envase, disparador, válvula, boquilla, además de la formulación que con-
tiene los fármacos, disolventes y excipientes. El diseño de cada componente tiene una función en el desempeño apropiado del
producto farmacéutico y para determinar las características críticas de la distribución del tamaño de las gotitas. Las distribucio-
nes de tamaño de las gotitas y de las partículas, uniformidad de dosis liberada, geometría de la nube y velocidad de las gotitas
son parámetros críticos que afectan a la eficiencia de la administración del fármaco. Cuando la preparación se suministra como
un envase multidosis, puede ser necesario agregar un conservante antimicrobiano adecuado. Las formulaciones de los espráis
USP42 InformaciónGeneral/ (1151) Formas Farmacéuticas 8119
destinadas para conseguir un efecto local o sistémico, por lo general, tienen una base acuosa y pueden contener excipientes
para controlar el pH y la viscosidad. Además, dependiendo de la vía de administración, la formulación puede ser isotónica.
Para más información, ver los capítulos (5) y (601 ).
ETIQUETADO
Y USO
Referirse a la Guíapara la Industria del Centrode Evaluacióne Investigaciónde Medicamentos(CDER,por sus siglasen inglés):
Nasal Sprayand lnhalation Solutíon,Suspension,and SprayDrug Products-Chemistry, Manufacturing, and ControlsDocumenta-
tion (Medicamentosen Atomizador Nasal, Concentradopara Soluciónlnhalable, SuspensiónInhalable y Atomizadorpara Inhala-
ción-Documentación Química,de Fabricacióny de Control).
Tiras
Una tira es una forma farmacéutica o dispositivo en forma de material sólido, alargado, estrecho, delgado y absorbente, co-
mo el papel de filtro. Normalmente es estéril y puede estar impregnada con un compuesto o estar indicada para permitir me-
diciones con propósitos diagnósticos, como la medición de producción de lágrimas. Eltérmino "tira" no debe usarse cuando
otro término, como "película" sea más apropiado.
Supositorios
Los supositorios son formas farmacéuticas adaptadas para su aplicación en el recto. Se funden, ablandan o disuelven a la
temperatura corporal. Un supositorio puede tener un efecto protector o paliativo local o puede liberar un fármaco para conse-
guir una acción sistémica o local.
Las bases para supositorios por lo general incluyen manteca de cacao, gelatina glicerinada, aceites vegetales hidrogenados,
mezclas de polietilenglicoles de diversos pesos moleculares y ésteres de ácidos grasos del polietilenglicol. Las bases para suposi-
torios pueden tener una influencia notoria sobre la liberación de los fármacos. Aunque la manteca de cacao se funde rápida-
mente a temperatura corporal, es inmiscible con los líquidos corporales, lo que inhibe la difusión de fármacos liposolubles en
las zonas afectadas. El polietilenglicol es una base adecuada para algunos antisépticos. En los casos en que se desea una acción
sistémica, incorporar la forma ionizada del fármaco, en lugar de la forma no ionizada, puede ayudar a maximizar la biodisponi-
bilidad. Aunque los fármacos no ionizados se liberan con más facilidad desde bases miscibles en agua, como la gelatina gliceri-
nada y el polietilenglicol, las bases mismas tienden a disolverse muy lentamente, lo que reduce la velocidad de liberación del
fármaco. La manteca de cacao y sus sustitutos (p.ej., GrasaSólida)tienen un mejor desempeño que otras bases para aliviar la
irritación en preparaciones destinadas para el tratamiento de hemorroides internas. Los supositorios para adultos se estrechan
en uno o ambos extremos y pesan aproximadamente 2 g cada uno.
PREPARACIÓN
Los supositorios que tienen como base manteca de cacao se pueden preparar incorporando el fármaco finamente dividido a
la base oleosa sólida, a temperatura ambiente, y luego moldeando adecuadamente la masa resultante; o bien, fundiendo la
base para trabajarla en caliente y permitiendo que la suspensión resultante se enfríe en moldes especiales. Puede agregarse
una cantidad apropiada de agentes endurecedores para contrarrestar la tendencia de algunos fármacos (p.ej., el hidrato de
cloral y el fenal) a ablandar la base. El supositorio terminado funde a la temperatura corporal.
Diversos aceites vegetales, tales como el aceite de coco o el aceite de semilla de palma, modificados por esterificación, hi-
drogenación o fraccionamiento, se usan como sustitutos de la manteca de cacao para obtener productos de composición y
temperatura de fusión variables (p.ej., Aceite VegetalHidrogenadoy GrasaSólida).Estos productos pueden presentar un diseño
que reduzca la rancidez, al mismo tiempo que incorpora las características deseadas, tales como intervalos estrechos entre
temperaturas de fusión y solidificación e intervalos de fusión para ajustarse a la formulación y condiciones climáticas.
Los fármacos pueden incorporarse a las bases de gelatina glicerinada mediante el agregado de las cantidades indicadas a un
vehículo que consiste en 70 partes de glicerina, 20 partes de gelatina y 1O partes de agua.
Diversas combinaciones de polietilenglicoles con temperaturas de fusión superiores a la temperatura corporal se emplean
como bases para supositorios. Debido a que la liberación a partir de estas bases depende de la disolución en lugar de la fusión,
presentan muchos menos problemas en la preparación y almacenamiento que los vehículos que actúan por fusión. Sin embar-
go, las altas concentraciones de polietilenglicoles de mayor peso molecular pueden extender el tiempo de disolución, generan-
do problemas de retención.
Resulta posible emplear diversos agentes tensoactivos no iónicos, que guardan estrechas relaciones químicas con los polieti-
lenglicoles, como vehículos para supositorios. Algunos ejemplos incluyen ésteres de ácidos grasos de sorbitán de polioxietileno
y estearatos de polioxietileno. Estos agentes tensoactivos se emplean solos o en combinación con otros vehículos para suposi-
torios para obtener un amplio rango de temperaturas de fusión y consistencias adecuadas. Una ventaja notoria de tales vehícu-
los es su capacidad de dispersión en agua. Sin embargo, se debe tener cuidado con el empleo de agentes tensoactivos, dado
que pueden aumentar la velocidad de absorción del fármaco o interactuar con éste, conduciendo a una disminución en la ac-
ción terapéutica.
La preparación magistral de supositorios usando una base para supositorios, por lo general requiere fundir la base para supo-
sitorios y disolver o dispersar el fármaco en la base fundida (ver el capítulo (795)). En la preparación magistral de supositorios,
el profesional de la preparación magistral prepara una cantidad en exceso de formulación total, a fin de dispensar con exacti-
tud la cantidad prescrita. Durante la preparación magistral de supositorios, se deben evitar ingredientes cáusticos o irritantes,
además de seleccionar una base que permita al fármaco generar el efecto esperado; asimismo, a fin de minimizar la abrasión
en las membranas del recto, se deben reducir los ingredientes sólidos al menor tamaño de partícula posible.
Suspensiones
Una suspensión es una preparación bifásica que consta de partículas sólidas dispersas en una fase líquida. Las suspensiones
se pueden formular para vías específicas de administración tales como oral, inhalación, tópica, oftálmica, ótica e inyectable.
Algunas suspensiones están preparadas y listas para usar, mientras que otras se presentan como mezclas de sólidos para re-
constitución con un vehículo apropiado justo antes de su uso.
Las suspensiones inhalables (ver el capítulo (5)), suspensiones oftálmicas, suspensiones inyectables y algunas suspensiones
óticas se preparan de manera estéril. Por lo general, las suspensiones no se inyectan por vía intravenosa, epidural o intratecal, a
menos que el etiquetado del producto especifique claramente tales vías de administración.
Algunos medicamentos liposomales se denominan suspensiones porque pueden sedimentar y requerir una resuspensión an-
tes de su administración (ver (1 )).
Algunas suspensiones están diseñadas para formar una masa in situ. Estas suspensiones incluyen polímeros, fármacos y disol-
ventes del polímero. El disolvente del polímero puede ser agua o un disolvente orgánico. Después de administrar la suspensión
a un paciente mediante administración subcutánea o intramuscular, forma un gel o una matriz polimérica sólida que atrapa el
fármaco y extiende la liberación del fármaco durante días o meses.
Históricamente, el término "leche" se usaba para describir suspensiones en vehículos acuosos destinadas a la administración
oral (p.ej., Lechede Magnesia).El término "magma" a menudo se emplea para describir suspensiones de sólidos inorgánicos,
como las arcillas en agua, que presentan una fuerte tendencia a la hidratación y agregación del sólido, originando una consis-
tencia similar a la de los geles y un comportamiento reológico tixotrópico (p.ej., Magma de Bentonita).Antiguamente, el térmi-
no "loción" se refería tanto a suspensiones tópicas como a emulsiones tópicas. Hoy en día, el término se refiere solo a emulsio-
nes tópicas (ver Emulsiones).
La limitada solubilidad acuosa de los fármacos es la justificación más común para el desarrollo de una suspensión. Otras ven-
tajas potenciales de una suspensión oral incluyen el enmascaramiento de sabores y un mejor cumplimiento del paciente debi-
do a la mayor conveniencia de la forma farmacéutica. En comparación con las soluciones, las suspensiones pueden presentar
una mejor estabilidad química. Una suspensión idealmente debe contener partículas pequeñas uniformes que se suspenden de
inmediato y se redispersan fácilmente después de la sedimentación. A menos que el sólido dispersado sea coloidal, las partícu-
las en una suspensión sedimentarán hacia el fondo del envase al dejarlo en reposo. Tal sedimentación puede conducir a la
aglutinación y la solidificación del sedimento y dificultar la redispersión de la suspensión al agitar. Para evitar estos problemas,
los fabricantes por lo general agregan ingredientes para aumentar la viscosidad y el estado de gel de la suspensión o la flocula-
ción, incluyendo arcillas, agentes tensoactivos, polioles, polímeros o azúcares. Con frecuencia, se emplean vehículos tixotrópi-
cos para contrarrestar las tendencias de sedimentación de las partículas, aunque dichos vehículos no deben interferir con el
vertido o la redispersión. Asimismo, se puede modificar la densidad de la fase dispersa y de la fase continua para tener mayor
control sobre la velocidad de sedimentación. En el caso de las suspensiones tópicas, resulta deseable el secado rápido después
de la aplicación.
La temperatura puede influenciar la viscosidad (y por ende las propiedades de la suspensión y la facilidad para retirar la dosis
del frasco), mientras que los ciclos de temperatura pueden ocasionar cambios en el tamaño de partícula de la fase dispersa
debido a la maduración de Ostwald. Cuando los fabricantes realizan estudios de estabilidad para establecer la vida útil y las
condiciones de almacenamiento, deben someter las condiciones a ciclos (congelación/descongelación) para investigar los efec-
tos de la temperatura.
A menos que los estudios confirmen que la formulación no respaldará el crecimiento microbiano, las suspensiones envasadas
para proporcionar múltiples dosis deben contener agentes antimicrobianos adecuados que protejan de la contaminación bac-
teriana, por levaduras y hongos filamentosos (ver el capítulo (51 )) o se deben tomar otras medidas apropiadas para evitar la
contaminación microbiana.
Las suspensiones para reconstitución son polvo seco o mezclas granulares que requieren la adición de agua, o de un diluyen-
te formulado provisto, antes de la administración. Este enfoque de formulación se usa con frecuencia cuando la estabilidad
química o física del fármaco o de la suspensión no permite una vida útil suficiente para una suspensión previamente formula-
da. A menudo, estas suspensiones se refrigeran después de la reconstitución para aumentar su vida útil. Para este tipo de sus-
pensiones, la mezcla de polvos es uniforme y el polvo se dispersa fácilmente al momento de la reconstitución.
Las suspensiones inyectables por lo general están destinadas a rutas de administración subcutánea o intramuscular y deben
tener un tamaño de partícula controlado, que por lo general es de 5 µm o menor. La justificación para el desarrollo de suspen-
siones inyectables puede incluir poca solubilidad del fármaco, estabilidad química mejorada, duración prolongada de la acción
y prevención del metabolismo de primer paso. Se debe tener cuidado al seleccionar la técnica de esterilización, puesto que
ésta puede afectar la estabilidad del producto o alterar las propiedades físicas del material.
En medicina veterinaria, una solución que necesita ser diluida antes de su administración se denominaba un concentrado
(p.ej., medicamentos que se administran agregándolos al agua potable). El uso del término "concentrado" ya no es el preferi-
do.
PREPARACIÓN
Las suspensiones se preparan agregando agentes de suspensión u otros excipientes y agua purificada o aceite a los fármacos
sólidos, y mezclando hasta lograr la uniformidad. Al preparar una suspensión, se deben considerar las características de la fase
dispersa y del medio de dispersión. Durante el desarrollo, los fabricantes deben definir una distribución del tamaño de partícu-
la apropiada para el material suspendido para alcanzar la efectividad deseada y minimizar la probabilidad de cambios en el
tamaño de partícula durante el almacenamiento.
En algunos casos, la fase dispersa tiene cierta afinidad por el vehículo y se humedece fácilmente con la adición del mismo.
Para algunos materiales, resulta difícil desplazar el aire de la superficie del sólido y las partículas sólidas pueden formar grumos
o flotar en la parte superior del vehículo. En este último caso, para ciertos tipos de suspensión se puede emplear un agente
humectante para facilitar el desplazamiento del aire de la superficie del polvo. Se pueden usar agentes tensoactivos, alcohol,
glicerina y demás líquidos hidrófilos como agentes humectantes para los casos en que se utilizará un vehículo acuoso como
fase de dispersión. Estos agentes funcionan desplazando el aire presente en las grietas de las partículas y dispersándolas. En la
preparación de suspensiones a gran escala, se puede facilitar la humectación de la fase dispersa mediante el uso de equipo de
mezcla de alta energía, como molinos coloidales u otros dispositivos de mezcla de rotor-estator.
Después de que se ha humedecido el polvo, se agrega el medio de dispersión (que contiene los componentes solubles de la
formulación tales como colorantes, saborizantes y conservantes) en porciones al polvo y la mezcla se mezcla minuciosamente
antes de las adiciones subsiguientes de vehículo. Se emplea una porción del vehículo para lavar el equipo de mezcla a fin de
eliminar todo el material suspendido; esta porción también se usa para llevar la suspensión a volumen final y para asegurar que
la suspensión tenga la concentración deseada de materia sólida. El producto final se puede pasar a través de un molino coloi-
dal u otro mezclador o dispositivo de mezcla para asegurar la uniformidad.
Las suspensiones se resuspenden antes de dispensar la dosis. Dada la viscosidad de muchos vehículos de suspensión, se pue-
de presentar atrapamiento de aire durante la dosificación. El proceso de formulación permite evaluar esta posibilidad. Realizar
ajustes a la viscosidad del vehículo o incorporar bajos niveles de agentes antiespumantes son enfoques comunes para minimi-
zar atrapamiento de aire. Como alternativa, se pueden proporcionar instrucciones específicas para resuspender la formulación
a fin de minimizar la incorporación de aire y para asegurar la dosis exacta.
Sistemas
Los sistemas son preparaciones de fármacos en dispositivos transportadores, a menudo contienen un revestimiento adhesivo
y se aplican tópicamente o se insertan en cavidades del cuerpo. Elfármaco está diseñado para que se libere de forma controla-
da durante un periodo especificado o se libere en función de su concentración en la formulación. A menos que el etiquetado
indique algo diferente, el dispositivo transportador se retira después de usar. El término "sistema" no debe usarse cuando el
término de otra forma farmacéutica sea más apropiado (p.ej., insertos e implantes).
La notación del contenido se define en términos de la cantidad de fármaco liberada del sistema durante un periodo específi-
co o como la concentración de fármaco dentro de la formulación (p.ej., el porcentaje de fármaco). Son posibles varias vías de
administración, por lo que cuando una localización específica sea esencial para el uso apropiado, la vía siempre deberá estar
indicada en el nombre farmacopeico (p.ej., "intrauterina", "ocular'' o "periodontal" como la vía de administración). Por ejem-
plo, los sistemas que se aplican al ojo se llaman sistemas oculares. Por ejemplo, cuando la absorción sistémica del fármaco se
realiza a través de la dermis, sin especificar la región del cuerpo a la que se aplica el sistema, la vía se llama "transdérmica".
El término "parche" se ha usado en ocasiones, pero no es el término preferido de uso en la nomenclatura de monografías de
medicamentos cuando se refiere a un sistema.
Los sistemas intrauterinos están destinados para su colocación en el útero. La liberación del fármaco puede durar hasta 5
años.
Los sistemas oculares están destinados para su colocación en el fórnix conjuntivo inferior, desde donde se difunde el fármaco
a través de la membrana a una velocidad constante.
Los sistemas periodontales están destinados a ser colocados en la cavidad entre el diente y la encía. En algunos casos, los
sistemas periodontales se pueden formar in situ en la cavidad periodontal y liberar los fármacos durante varias semanas.
Los sistemas transdérmicos se colocan sobre piel intacta para administrar el fármaco a la circulación sistémica. Están diseña-
dos para una liberación prolongada (hasta 7 días). Se pueden encontrar pruebas de calidad específicas para sistemas transdér-
micos en el capítulo (3).
8122 (1151) Formas Farmacéuticas / InformaciónGeneral USP42
Tabletas
Las tabletas son formas farmacéuticas sólidas en las que el fármaco se mezcla generalmente con excipientes y se comprime
para formar la dosis final. Las tabletas representan la forma farmacéutica de más amplio uso en los EE. UU. Las prensas para
tabletas emplean punzones y matrices de acero para preparar tabletas compactadas mediante la aplicación de altas presiones a
las mezclas de polvos o granulados. Las tabletas pueden elaborarse en una amplia variedad de tamaños, formas e inscripciones
en la superficie. Las tabletas oblongas o con forma de cápsula son comúnmente llamadas "capletas" en Estados Unidos, aun-
que es un término que no se usa en títulos de artículos oficiales. Se pueden usar prensas para tabletas especializadas para pro-
ducir tabletas con múltiples capas o tabletas con núcleo especialmente formuladas que se colocan en el interior de la forma
farmacéutica final. Estas presentaciones de tabletas especializadas pueden retardar o prolongar la liberación de los fármacos o
separar físicamente fármacos incompatibles. Las tabletas se pueden recubrir mediante una variedad de técnicas para enmasca-
rar sabores, proteger fármacos sensibles a la luz, prolongar o retardar la liberación, o para brindar una apariencia única (colo-
res). Cuando no se ha modificado intencionalmente la velocidad de liberación del fármaco, las tabletas reciben el nombre de
tabletas de liberación inmediata.
TABLETAS
BUCALES
Están destinadas a insertarse en la cavidad bucal, donde los fármacos se absorben directamente a través de la mucosa oral.
Son pocos los fármacos que se absorben fácilmente de esta manera (los ejemplos incluyen nitroglicerina y algunas hormonas
esteroideas).
TABLETAS
MASTICABLES
Se formulan y fabrican para producir un residuo de sabor agradable en la boca y para facilitar su ingestión. Las tabletas mas-
ticables duras se preparan por compresión, por lo general utilizando manito!, sorbitol o sacarosa como aglutinantes y diluyen-
tes sólidos, y contienen colorantes y saborizantes para mejorar su aspecto y sabor. Las tabletas masticables blandas general-
mente se fabrican mediante un proceso de moldeado o extrusión, a menudo con más de 10% de agua para ayudar a mante-
ner un producto flexible y blando. En medicina veterinaria, las tabletas masticables duras a menudo tienen agentes que mejo-
1
ran el sabor, tales como levadura de cerveza o saborizantes basados en carne/pescado.
Las tabletas para uso humano cuyo título incluye la denominación "masticable" se deben masticar o triturar antes de deglu-
tir a fin de asegurar la liberación confiable de los fármacos o para facilitar su deglución. Si las tabletas están diseñadas para que
puedan ser masticadas (pero el mascado no es necesario para liberar el fármaco o facilitar la deglución), el título no debe in-
cluir la referencia "masticable". En ese caso, el producto aún puede describirse como "masticable" en la declaración auxiliar en
el etiquetado.
Las tabletas para uso veterinario destinadas a ser masticadas incluirán la denominación "Masticables" en el título. No obstan-
te, se entiende que, en lo que respecta a productos veterinarios, no es posible asegurar que sean masticadas antes de su inges-
tión. Las tabletas masticables se pueden partir en pedazos y darlas a los animales que normalmente tragan la tableta entera.
TABLETAS
EFERVESCENTES
Se preparan mediante compresión y contienen, además de los fármacos, mezclas de ácidos (p.ej., ácido cítrico o ácido tartá-
rico) y carbonatos y/o bicarbonato de sodio. Al contacto con el agua, estas formulaciones liberan dióxido de carbono, produ-
ciendo la característica acción de efervescencia.
TABLETAS
HIPODÉRMICAS
Tabletas moldeadas preparadas a partir de ingredientes que se disuelven fácil y completamente en agua; anteriormente se
utilizaban en las preparaciones para inyecciones hipodérmicas. Estas tabletas se pueden administrar por vía oral o sublingual
cuando se requiere una disponibilidad rápida del fármaco.
TABLETAS
DE LIBERACIÓN
MODIFICADA
Existen dos categorías de formulaciones de tabletas de liberación modificada reconocidas por la USP.
Tabletas de liberación retardada: Las tabletas en ocasiones se formulan con recubrimientos resistentes a ácidos o entéricos
(también llamados "gastrorresistentes") para proteger a los fármacos ácido-lábiles del entorno gástrico o para prevenir eventos
adversos como la irritación.
Tabletas de liberación prolongada: Las tabletas de liberación prolongada se formulan de tal manera que el fármaco esté
disponible durante un periodo prolongado después de la ingestión. Los requisitos de disolución (ver el capítulo (711)) por lo
general se especifican en las monografías individuales.
TABLETAS
DE DESINTEGRACIÓN
ORAL
Las tabletas de desintegración oral están destinadas a desintegrarse rápidamente dentro de la boca para generar una disper-
sión antes de que el paciente degluta la suspensión espesa resultante, donde el fármaco está destinado a la administración y/o
absorción gastrointestinal. Algunas de estas formas farmacéuticas han sido formuladas para facilitar la desintegración rápida y
se fabrican por medios convencionales o mediante procesos de liofilización o moldeado. Se pueden obtener mayores detalles
en la Guidancefor lndustry: Oral/yDisintegratingTablets[Guía para la Industria: Tabletas de Desintegración Oral] del CDER.
TABLETAS
SUBLINGUALES
Las tabletas sublinguales están destinadas a colocarse debajo de la lengua, donde los fármacos se absorben directamente a
través de la mucosa oral. Al igual que con las tabletas bucales, son pocos los fármacos que se absorben íntegramente de esta
manera y una gran parte del fármaco se deglute y está disponible para absorción gastrointestinal.
TABLETAS
PARASOLUCIÓNORAL
Las tabletas para solución oral están destinadas a solubilizarse en un diluyente líquido antes de su administración. En algunos
casos, las tabletas para solución oral también se pueden masticar o deglutir.
TABLETAS
PARASUSPENSIÓNORAL
Las tabletas para suspensión oral están destinadas a dispersarse en un líquido antes de su administración como una suspen-
sión. La forma farmacéutica es una tableta para suspensión oral cuando el fármaco o los excipientes no se disuelven al disper-
sarse en un líquido. En algunos casos, las tabletas para suspensión oral también se pueden masticar o deglutir.
TRITURADODE TABLETAS
Tabletas pequeñas, normalmente cilíndricas, moldeadas o comprimidas que se empleaban, tradicionalmente, como tabletas
de dispensación para administrar una cantidad convenientemente medida de un fármaco potente en preparaciones magistra-
les, pero que raramente se usan en la actualidad.
PREPARACIÓN
La mayoría de las tabletas compactadas (comprimidas) están compuestas por el fármaco y una variedad de excipientes. Es-
tos excipientes pueden incluir diluyentes sólidos (diluyentes), aglutinantes, agentes desintegrantes, lubricantes y deslizantes.
Asimismo, pueden estar presentes colorantes o lacas FD&C y D&C, saborizantes y agentes edulcorantes aprobados.
Los diluyentes sólidos se agregan cuando la cantidad de fármaco es demasiado pequeña o cuando las propiedades del fár-
maco no permiten una compresión satisfactoria en ausencia de otros ingredientes. Los aglutinantes confieren adhesividad a la
mezcla de polvo, además de promover la formación de tabletas y mantener la uniformidad del fármaco en la mezcla para ta-
bletas. Los agentes desintegrantes facilitan la reducción de la tableta en pequeñas partículas al contacto con el agua o fluidos
biológicos. Los lubricantes reducen la fricción durante los ciclos de compactación y eyección. Los deslizantes mejoran la fluidez
de los polvos, sus propiedades de manipulación y el control de peso de las tabletas. A menudo, también se agregan colorantes
a las formulaciones de tabletas por razones estéticas o a efectos de la identificación del producto.
Las tabletas se preparan a partir de formulaciones procesadas mediante uno de los tres métodos generales: granulación hú-
meda, granulación seca (compactación con rodillos o aglomeración) y compresión directa.
Granulación húmeda: Implica la mezcla de polvos con un líquido de granulación para formar una masa granular húmeda
que se seca y se ajusta en tamaño antes de la compresión. Resulta particularmente útil para lograr mezclas uniformes de fárma-
cos de dosis baja y para facilitar la humectación y disolución de fármacos hidrófobos con poca solubilidad.
Granulaciones en seco: Se pueden producir pasando los polvos entre rodillos a una presión elevada (compactación con ro-
dillos). Como alternativa, la granulación en seco también se puede llevar a cabo mediante el proceso de aglomeración, que
consiste en la compactación de los polvos a presiones elevadas en prensas para tabletas. En cualquier caso, el tamaño de los
compactados se ajusta antes de la compresión. La granulación en seco mejora el flujo y las propiedades de manipulación de la
formulación en polvo sin necesidad de humectar durante el procesamiento.
Compresión directa: El procesamiento de tabletas implica la mezcla en seco de los fármacos y excipientes seguida de com-
presión. Al tratarse de la técnica de fabricación más simple, la compresión directa solo es aceptable cuando el fármaco y los
excipientes presentan propiedades de flujo y compresión aceptables sin necesidad de etapas de procesamiento previas.
Las tabletas pueden recubrirse para proteger los ingredientes de la acción del aire, la humedad o la luz; para enmascarar
sabores y olores desagradables; para mejorar la apariencia de la tableta; y para reducir la erosión generadora de polvo. Asimis-
mo, el recubrimiento se puede usar para proteger el fármaco de valores de pH ácidos relacionados con los fluidos gástricos o
para controlar la velocidad de liberación del fármaco en el tracto gastrointestinal.
El recubrimiento más común que se usa en la actualidad es un recubrimiento de película fina compuesto por un polímero
que se deriva de celulosa. Un método alternativo menos común es el recubrimiento de azúcar. Las tabletas recubiertas con
azúcar tienen recubrimientos considerablemente más gruesos que consisten principalmente en sacarosa con una variedad de
diluyentes inorgánicos. Se encuentra disponible una variedad de polímeros de recubrimiento en película que permiten el desa-
rrollo de perfiles de liberación especializados. Estas formulaciones se usan para proteger los fármacos acido-lábiles del entorno
ácido estomacal y para prolongar la liberación del fármaco a fin de reducir la frecuencia de dosificación (ver el capítulo (711) o
el (701 )).
Cintas Adhesivas
Una cinta adhesiva es una forma farmacéutica adecuada para administrar fármacos sobre la piel, que consiste en un fármaco
impregnado en un material sintético tejido o extrudido, durable y flexible, recubierto con un agente adhesivo. Por lo general,
el fármaco impregnado se presenta en estado seco. La capa de adhesivo está diseñada para mantener la cinta de manera segu-
ra en su lugar sin ayuda de vendajes adicionales. A diferencia de los sistemas transdérmicos, las cintas adhesivas no están dise-
ñadas para controlar la velocidad de liberación del fármaco. El término "cinta adhesiva" es un término no preferido y no debe
usarse para títulos de artículos oficiales nuevos.
El contenido de fármaco en las cintas adhesivas se expresa como cantidad por área superficial con respecto a la superficie de
la cinta adhesiva expuesta sobre la piel. El uso de un revestimiento oclusivo con la cinta adhesiva mejora la velocidad y el gra-
do de liberación del fármaco en capas más profundas de la piel, lo que puede resultar en una mayor absorción sistémica del
fármaco.
GLOSARIO
Este glosario provee definiciones de términos usados en medicina y sirve como fuente de títulos oficiales para los artículos
oficiales, excepto cuando la definición indique específicamente que el término no debe usarse en el título del medicamento.
Los ejemplos de nomenclatura general para las categorías más frecuentes de formas farmacéuticas se presentan en el capítulo
(1121 ). La compilación se realizó sin las limitaciones que imponen las convenciones vigentes sobre nomenclatura preferida pa-
ra lograr una referencia exhaustiva. Para identificar y/o distinguir con claridad entre términos preferidos y no preferidos, las
entradas indican cuando se trata de un término no preferido y generalmente refieren al usuario al término vigente preferido.
Se usan términos descriptivos o atributos para identificar una presentación especializada o característica de una forma farma-
céutica. Por ejemplo, el término descriptivo "masticable" se puede usar con la forma farmacéutica "tabletas" para identificar
un tipo específico de tableta que debe masticarse antes de deglutirse. Cuando un término se describe en este glosario como
un atributo de una forma farmacéutica, generalmente tiene el propósito de distinguir dicho término de aquellos usados en los
títulos de las formas farmacéuticas oficiales.
Aerosol: Forma farmacéutica que consta de una preparación líquida o sólida envasada a presión y destinada a la adminis-
tración en forma de niebla fina o humo. El término descriptivo "aerosol" también hace referencia a la niebla fina de gotitas o
humo de partículas sólidas emitidas por el producto.
Agua aromática (ver Solución): Solución acuosa, transparente y saturada de aceites volátiles, u otras sustancias aromáticas
o volátiles. Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Auditivo (ver Ótico): Para administración en, o por, el oído. Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Perla (ver Pe//ets): Forma farmacéutica sólida con forma de esfera pequeña. En la mayoría de los productos, una unidad de
dosificación consta de múltiples pertas. Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Bolo (término no preferido; ver Tableta): Tableta grande destinada a la administración en animales grandes. En ocasiones,
el término "bolo" se usa para describir un método de administración.
Bucal: Administración dirigida hacia la mucosa interna de las mejillas.
Capleta (ver Tableta): Tableta con forma de cápsula. Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Cápsula: Forma farmacéutica sólida en la que el fármaco, con o sin otros ingredientes, se introduce como relleno en una
cápsula de cubierta dura o blanda, o recubre la cubierta de la cápsula. La mayoría de las cubiertas de las cápsulas están com-
puestas principalmente de gelatina.
Masticable: Atributo de una forma farmacéutica sólida que está destinada a ser masticada o triturada antes de deglutirse.
Gel Masticable: Formas farmacéuticas orales moldeadas o modeladas mediante otro método, que mantienen su forma,
son elásticas y ceden a la masticación. Los geles masticables también se conocen como "gamitas" pero este término no se usa
en títulos de artículos oficiales.
Recubrimiento: Atributo (recubierto/a) de una forma farmacéutica sólida que implica recubrir externamente con un sóli-
do. El depósito externo se denomina recubrimiento o película. El término se usa como un atributo cuando se aplica a una for-
ma farmacéutica sólida oral. Los recubrimientos se aplican con fines funcionales estéticos, como el enmascaramiento del sabor,
la estabilidad, la modificación de las características de liberación, la identificación del producto y su apariencia.
Colodión (término no preferido; ver Solución): Preparación en solución compuesta por piroxilina disuelta en una mezcla
de disolventes de alcohol y éter, y que se aplica externamente.
Dispersióncoloidal: Atributo de una preparación o formulación en la que las partículas con dimensiones coloidales (es
decir, generalmente entre 1 nm y 1 µm) se distribuyen uniformemente en todo el líquido.
Concentrado (término no preferido para medicamentos de uso humano o veterinario): En la actualidad se usa para fár-
macos que no están destinados a la administración directa a humanos o animales. Su uso en la nomenclatura de medicamen-
tos se ha descontinuado (ver el capítulo (1121) y Nomenc/atureGuidelines(Guíasde Nomenclatura)').
Liberación convencional (ver Liberacióninmediata): Término descriptivo de una forma farmacéutica para la que no se ha
pretendido modificar intencionalmente la velocidad de liberación del fármaco. En el caso de cápsulas y tabletas, la inclusión o
la exclusión de un agente desintegrante no se interpretan como una modificación. Este término no se usa en títulos de artícu-
los oficiales.
Caramelos o pastillas para la tos (ver Tabletasde disoluciónbucal): Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Crema: Emulsión semisólida que a menudo contiene más de 20% de agua y sustancias volátiles, y/o menos de 50% de
hidrocarburos, ceras o polioles como vehículos para el fármaco. Las cremas, por lo general, están destinadas a la aplicación
externa sobre la piel o las membranas mucosas.
Liberación retardada: Tipo de forma farmacéutica de liberación modificada. Término descriptivo de una forma farmacéu-
tica formulada intencionalmente para retardar la liberación del fármaco durante cierto periodo después de la administración
inicial. Para productos de uso oral, también se usan las expresiones "con recubrimiento entérico" o "gastrorresistente" cuando
se previene la liberación del fármaco en el medio gástrico, pero se promueve en el medio intestinal. Sin embargo, se usa el
término "liberación retardada" en títulos de artículos oficiales.
Dental: Término descriptivo de una preparación que se aplica en los dientes para ejercer acción localizada.
Dérmico/a: Vía de administración tópica en la que el fármaco está destinado a alcanzar la dermis o a aplicarse sobre esta.
Inmersión (término no preferido; ver Baño)
Tabletas dispersables (ver Tabletas,Tabletaspara suspensiónoral o Tabletaspara soluciónoral): Este término no se usa en
títulos de artículos oficiales.
Tabletas desintegrables (ver Tabletas,Tabletaspara suspensiónoral o Tabletaspara soluciónoral; ver también Tabletasde
desintegraciónoral): Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Forma farmacéutica: Combinación de fármacos y/o excipientes en cantidades y formas físicas diseñadas para permitir
una administración exacta y eficiente del fármaco al paciente humano o animal. Este término no se usa en títulos de artículos
oficiales.
Inhalador de polvo seco: Dispositivo usado para administrar un polvo para inhalación en estado finamente dividido y
adecuado para inhalación oral por parte del paciente. Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Efervescente: Atributo de una forma farmacéutica oral, con frecuencia tabletas o gránulos que contienen ingredientes
que, al entrar en contacto con el agua, liberan rápidamente dióxido de carbono. La forma farmacéutica se disuelve o dispersa
en agua para iniciar la efervescencia antes de la ingestión.
Elíxir (término no preferido; ver Solución): Preparación que, por lo general, se trata de una solución hidroalcohólica edul-
corada, transparente y saborizada destinada al uso oral. Este término no debe usarse para medicamentos nuevos de la USP-NF,
pero es de uso frecuente en la farmacia magistral.
Emoliente: Atributo de una crema o un ungüento que indica una acción humectante sobre la piel después de la aplica-
ción de sustancias blandas, grasas u oleosas. Este término no debe usarse en títulos de artículos oficiales.
Emulsión: Forma farmacéutica que consta de un sistema de dos fases compuesto de por lo menos dos líquidos inmisci-
bles, uno de los cuales se dispersa como gotitas (fase interna o dispersa) dentro del otro líquido (fase externa o continua),
generalmente estabilizado con uno o más agentes emulsionantes. Emulsión no se usa como término para forma farmacéutica
cuando se puede aplicar un término más específico (p. ej., Crema,Locióno Ungüento).
Recubrimiento entérico (término no preferido; ver Liberaciónretardada): Término descriptivo para una forma farmacéuti-
ca sólida sobre la que se ha aplicado un recubrimiento polimérico para prevenir la liberación del fármaco en el medio gástrico.
Excipiente: Ingrediente de una forma farmacéutica distinto al fármaco. Este término no se usa en títulos de artículos ofi-
ciales. El término "excipiente" es sinónimo de ingrediente inactivo.
Liberación prolongada: Término descriptivo de una forma farmacéutica que se formula intencionalmente para prolongar
la liberación del fármaco, en comparación con lo observado en una forma farmacéutica de liberación inmediata. Las expresio-
nes como "liberación extendida", "acción repetida", "liberación controlada", "acción prolongada" y "liberación sostenida"
también se usan para describir estas formas farmacéuticas. Sin embargo, se usa el término "liberación prolongada" en títulos
de artículos oficiales.
Película: Término usado para describir una lámina fina de material, generalmente compuesto por un polímero. Las pelícu-
las se emplean en diversas vías de administración, incluso como medio de administración oral de un material en una forma de
disolución rápida.
Espuma: Forma farmacéutica que contiene burbujas de gas dispersas en un líquido. Las espumas medicadas tienen una
consistencia semisólida y se pueden formular para que se colapsen rápidamente formando un líquido o para que se manten-
gan como espuma y así asegurar el contacto prolongado.
Gas: Uno de los estados de la materia sin forma ni volumen definidos y que ocupa la totalidad del envase en el que se
encuentra confinado.
Gastrorresistente ( ver Liberaciónretardada): Término descriptivo para una forma farmacéutica sólida sobre la que se ha
aplicado un recubrimiento polimérico para prevenir la liberación en el entorno gástrico. Este término no se usa en títulos de
artículos oficiales.
Gel: Forma farmacéutica que se presenta como una dispersión semisólida de partículas pequeñas o una solución de molé-
culas grandes compenetradas por una solución que contiene un agente gelificante que proporciona dureza.
Gelcap: Una cápsula recubierta en ocasiones se denomina gelcap. El término gelcap no se usa en títulos de artículos ofi-
ciales.
Geltab/Filmtab: Una tableta recubierta en ocasiones se denomina geltab o filmtab. Los términos geltab o filmtab no se
usan en títulos de artículos oficiales.
Gránulos: Forma farmacéutica compuesta por agregados secos de partículas de polvo que puede contener uno o más fár-
macos, con o sin otros ingredientes. Pueden ingerirse en su forma original, dispersarse en alimentos o disolverse en agua. Con
frecuencia, los gránulos se compactan para formar tabletas o para llenar cápsulas, con o sin ingredientes adicionales. Más fre-
cuentemente, los gránulos se dispersan para formar o reconstituir suspensiones.
Goma: Forma farmacéutica cuya base consiste en un material flexible que, al mascar, libera el fármaco en la cavidad oral.
Gomitas (ver Gel Masticable): Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Cápsulade cubierta dura (término no preferido; ver Cápsulas): Tipo de cápsula con una cubierta de dos piezas que se
llena con uno o más fármacos, con o sin otros ingredientes. La mayoría de las cápsulas de cubierta dura están compuestas
principalmente de gelatina y se fabrican antes de la operación de llenado.
Liberacióninmediata: Término descriptivo para una forma farmacéutica en la que no se ha pretendido modificar inten-
cionalmente la velocidad de liberación del fármaco. Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Baño: Vía de administración veterinaria mediante la sumersión parcial o completa en un ambiente específico, como líqui-
do o aire.
Implante: Forma farmacéutica que consiste en un material sólido o semisólido, el cual contiene el fármaco, que se inserta
en el cuerpo. El proceso de inserción es invasivo y el material está destinado a residir en el sitio durante un periodo concordan-
te con el diseño para la cinética o perfil de liberación del fármaco.
Inhalación (por inhalación): Vía de administración para aerosoles caracterizada por la dispersión del fármaco en las vías
respiratorias durante la inspiración.
Inyectable (por inyección): Vía de administración de un líquido o un semisólido depositado en una cavidad, fluido o teji-
do corporal mediante una aguja.
Inyección: Preparaciones líquidas que pueden contener fármacos y/o excipientes o sus soluciones. El término "para inyec-
ción" es indicativo de sólidos secos que, cuando se les agrega un vehículo adecuado, producen soluciones que cumplen con
los requisitos para inyecciones en todos los aspectos.
Emulsióninyectable: Preparaciones líquidas de fármacos disueltos o dispersos en un medio de emulsión adecuado.
Suspensióninyectable: Preparaciones líquidas de sólidos suspendidos en un medio líquido. El término "para suspensión
inyectable" es indicativo de sólidos secos que, cuando se les agrega un vehículo adecuado, producen preparaciones que cum-
plen con los requisitos para suspensiones inyectables en todos los aspectos.
Suspensióninyectablede liberación prolongada: Preparaciones líquidas de sólidos suspendidos en un vehículo adecua-
do y formuladas para permitir que el fármaco esté disponible durante un periodo prolongado. El término "para suspensión
inyectable de liberación prolongada" es indicativo de sólidos secos que, cuando se les agrega un vehículo adecuado, producen
una preparación que cumple con los requisitos para suspensiones inyectables de liberación prolongada en todos los aspectos.
Inserto: Forma farmacéutica sólida que se inserta en una cavidad natural del cuerpo (no quirúrgica) excepto la boca o el
recto. Se debe tomar en cuenta que un supositorio está destinado a aplicación en el recto y no se clasifica como un inserto (ver
Supositorio).
Intraocular: Vía de administración para liberar una preparación estéril dentro del ojo.
Irrigación: Solución o líquido estéril para bañar o lavar heridas abiertas o cavidades del cuerpo.
Jalea(término no preferido; ver Ge/): Dispersión semisólida de pequeñas partículas o una solución de moléculas orgánicas
grandes compenetradas por una solución que contiene un agente gelificante que promueve firmeza.
Liposomas: Atributo para preparaciones de lípidos anfifílicos de hidrosolubilidad baja (ver (1 )).
Líquido: Forma farmacéutica que consiste en un químico puro en su estado líquido. Este término de forma farmacéutica
no debe aplicarse a las soluciones. Este término no se usa en títulos de artículos oficiales. Cuando la palabra "líquido" se usa
como término descriptivo, esta hace referencia a un material que es vertible y que se ajusta a su envase a temperatura ambien-
te.
Loción: Forma farmacéutica líquida en emulsión que se aplica a la superficie externa del cuerpo. Históricamente, este tér-
mino se aplicaba a suspensiones tópicas y emulsiones tópicas. La definición actual de loción se limita a emulsión.
Tabletasde disoluciónbucal: Forma farmacéutica sólida destinada para una lenta desintegración o disolución en la boca.
Liberaciónmodificada: Término descriptivo para una forma farmacéutica con un patrón de liberación de fármaco que se
ha modificado intencionalmente con respecto al observado en la forma farmacéutica de liberación inmediata del mismo fár-
maco. Los dos tipos de liberación modificada son liberación prolongada y liberación retardada. El término "liberación modifi-
cada" no se usa en títulos de artículos oficiales.
Tabletasmoldeadas: Tableta que se forma humedeciendo los ingredientes, presionándolos en un molde y, posteriormen-
te, retirando del molde y secando la masa sólida resultante. Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Enjuaguebucal (ver Enjuague): Término aplicado a una preparación en solución que se usa para enjuagar la cavidad bu-
cal. Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Nasal: Vía de administración (mucosa) caracterizada por su administración en o por la nariz para lograr un efecto local o
sistémico.
Ocular (término no preferido; ver Intraocular): Vía de administración que indica la aplicación del fármaco dentro del ojo.
Ungüento: Forma farmacéutica semisólida, que a menudo contiene menos de 20% de agua y sustancias volátiles, y más
de 50% de hidrocarburos, ceras o polioles como vehículos. Esta forma farmacéutica por lo general está destinada a la aplica-
ción externa sobre la piel o las membranas mucosas.
Oftálmico(a): Vía de administración caracterizada por la aplicación de una preparación estéril a las partes externas del
ojo.
Oral: Vía de administración caracterizada por su aplicación en la boca o administración en el tracto gastrointestinal a tra-
vés de la boca.
Desintegración oral: Término descriptivo para una forma farmacéutica sólida oral que se desintegra rápidamente en la
boca antes de la deglución. Elfármaco está destinado para administración y/o absorción gastrointestinal. Ver también CDER
Guidancefor lndustry, Oral/y Disintegrating Tablets(Guía para la Industria, Tabletas de Desintegración Oral).
De dispersión oral (ver Desintegraciónora{): Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Orofaríngeo(a): Vía de administración caracterizada por el depósito de una preparación en la cavidad oral y/o en la re-
gión faríngea para ejercer un efecto local o sistémico.
Ótico: Vía de administración caracterizada por el depósito de una preparación en o por el oído. En ocasiones también se
denomina Auditivo (Auditivo es un término no preferido).
Parenteral: Vía de administración general caracterizada por una inyección a través de la piel u otro tejido externo aislante,
o por una implantación dentro del cuerpo. Las vías parenterales específicas incluyen las vías intravenosas, intraventricular, in-
traarterial, intraarticular, subcutánea, intramuscular, intratecal, intracistemal e intraocular (ver (1 )).
Pasta: Forma farmacéutica semisólida con una consistencia firme que contiene un alto porcentaje de sólidos (20%--50%)
finamente dispersos. Esta forma farmacéutica está destinada a la aplicación sobre la piel, la cavidad oral o las membranas mu-
cosas.
Pastilla (ver Tabletasde disoluciónbucal): Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Parche (término no preferido; ver Sistema): Se usa con frecuencia de manera incorrecta para describir un Sistema.
Pellet: Forma farmacéutica sólida y pequeña con forma a menudo esférica y uniforme destinada a la administración direc-
ta como un pellet. Los pellets esféricos en ocasiones reciben el nombre de Perlas.Los pellets destinados a la implantación (im-
plantes) deben ser estériles. El uso del término "pellet" para formas farmacéuticas implantables ya no es el término preferido
(ver Implantes).
Periodontal: Término descriptivo de una preparación que se aplica alrededor de un diente para ejercer una acción locali-
zada.
Píldora: Forma farmacéutica sólida y esférica que generalmente se prepara mediante una técnica de amasado por vía hú-
meda, producción de magdaleones y moldeado. Este término a veces se usa de manera incorrecta como término general para
describir formas farmacéuticas sólidas orales, como tabletas o cápsulas.
Emplasto (término no preferido): Forma farmacéutica que contiene una composición semisólida provista sobre un mate-
rial de soporte para aplicación externa. Los emplastos se aplican durante periodos prolongados para proveer protección, so-
porte u oclusión (maceración).
Polvo: Forma farmacéutica compuesta por un sólido o una mezcla de sólidos, reducidos a un estado finamente dividido, y
destinada al uso externo o interno.
Polvo para inhalación: Polvo que contiene un fármaco para inhalación oral. El polvo se usa con un dispositivo que lo
transforma en aerosol y libera una cantidad medida con exactitud.
Premezcla (término no preferido; ver MedicamentosVeterinariosUsadosen Alimentospara Animales(1152), Alcance,Artículos
MedicadosTipo A y Alimentos MedicadosTipo B)
Liberación extendida (ver Liberaciónprolongada): Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Rectal: Vía de administración caracterizada por depositarse en el recto para lograr un efecto local o sistémico.
Enjuague (ver Solución): Preparación líquida que se usa para limpiar mediante enjuague. El enjuague se usa para hacer
buches en la boca y luego expectorarlo. El término no preferido "enjuague bucal" se ha usado a veces en lugar de "enjuague".
Semisólido(a): Atributo de un material cuyo flujo presenta un comportamiento plástico. Un material semisólido no se
puede verter, no se ajusta fácilmente a su envase a temperatura ambiente y no fluye a una tensión de corte baja. Este término
no se usa en títulos de artículos oficiales.
Champú: Forma farmacéutica en solución, emulsión o suspensión usada para limpiar el cabello y el cuero cabelludo. Pue-
de contener un fármaco destinado a la aplicación tópica sobre el cuero cabelludo.
Jabón: Sales alcalinas de un ácido graso o mezcla de ácidos grasos usadas para limpiar la piel. Los jabones que se usan
como formas farmacéuticas pueden contener un fármaco destinado para aplicación tópica sobre la piel. Los jabones también
se han usado como linimentos y enemas.
Cápsula de gelatina blanda (término no preferido; ver Cápsulas): Tipo específico de cápsula caracterizado por una alta
cantidad de plastificantes para producir un material con paredes más gruesas y flexibles que las cápsulas de gelatina dura. Una
distinción adicional de las cápsulas de gelatina blanda es que se presentan como formas farmacéuticas selladas de una sola
pieza. Resulta frecuente su uso para administrar composiciones líquidas.
Tabletas solubles (ver Tabletasy Tabletaspara solución ora{): Este término no se usa en títulos de artículos oficiales.
8128 (1151) Formas Farmacéuticas/ Información General USP42
Solución: Forma farmacéutica líquida, transparente y homogénea que contiene una o más sustancias químicas disueltas
en un disolvente o una mezcla de disolventes mutuamente miscibles.
Alcoholado (término no preferido; ver Solución): Forma farmacéutica líquida compuesta de una solución alcohólica o hi-
droalcohólica de sustancias volátiles.
Aplicaciónpuntual (aplicación en línea): Método de administración de medicamentos líquidos veterinarios basado en la
administración sobre la piel del animal, por lo regular entre los omoplatos (aplicación puntual) o de manera descendente sobre
la espalda (aplicación en línea).
Espray: Un espray es una forma farmacéutica que contiene fármacos en estado líquido, como una solución o como una
suspensión, y que está destinado a su administración como rocío. Los espráis se diferencian de los aerosoles en que los atomi-
zadores no están presurizados. La mayoría de las atomizaciones se generan apretando manualmente un envase flexible o acti-
vando una bomba que genera el rocío al descargar el contenido a través de la boquilla.
Como atributo, la atomización describe la generación de gotitas de un líquido o una solución para facilitar su aplicación en
el área prevista.
Estent, liberadorde fármaco (Estents): Forma especializada de implante usada para administración local prolongada del
fármaco en las inmediaciones del estent.
Tira(solo se usa para productos de diagnóstico, de otra forma es no preferido; ver Película): Forma farmacéutica o disposi-
tivo de material sólido, alargado, estrecho, delgado y absorbente, como el papel de filtro.
Sublingual: Vía de administración caracterizada por la colocación debajo de la lengua y por la liberación del fármaco para
su absorción en dicha región.
Supositorio: Forma farmacéutica sólida en la que se dispersan uno o más fármacos en una base adecuada y se moldean o
se les da una forma adecuada por otros medios para su inserción en el recto para proporcionar un efecto local o sistémico.
Suspensión: Forma farmacéutica líquida que consta de partículas sólidas dispersadas en una fase líquida.
Jarabe(término no preferido; ver Solución): Solución que contiene concentraciones altas de sacarosa u otros azúcares. Este
término se emplea frecuentemente en la farmacia magistral.
Sistema: Preparación de fármacos en dispositivos transportadores que se aplican tópicamente o se insertan en una cavi-
dad del cuerpo. Elfármaco está diseñado para que se libere de forma controlada durante un periodo especificado o se libere
en función de su concentración en la formulación. A menos que el etiquetado indique algo diferente, el dispositivo transporta-
dor se retira después de usar.
Tableta: Forma farmacéutica sólida preparada a partir de polvos o gránulos mediante compactación.
Tabletaspara solución oral: Tabletas que están destinadas a dispersarse en un líquido antes de su administración. Cuan-
do se dispersan en el líquido, se produce una solución.
Tabletaspara suspensión oral: Tabletas que están destinadas a dispersarse en un líquido antes de su administración.
Cuando se dispersan en el líquido, se produce una suspensión.
Cintaadhesiva (término no preferido): Forma farmacéutica o dispositivo compuesto de tejido o material sintético sobre el
cual se coloca un fármaco, por lo general con un adhesivo en uno o ambos lados para facilitar la aplicación tópica. No se con-
trola la velocidad de liberación del fármaco.
Tintura(término no preferido; ver Solución): Solución alcohólica o hidroalcohólica preparada a partir de materiales vege-
tales o sustancias químicas.
Tópico/a: Vía de administración caracterizada por la aplicación sobre la superficie externa del cuerpo.
Transdérmica(o): Vía de administración a través de la capa dérmica de la piel hasta la circulación sistémica.
Trociscos(ver Tabletasde disoluciónbucal): Forma farmacéutica sólida destinada a una desintegración o disolución lenta
en la boca y que, por lo general, se prepara mediante una técnica de compactación similar a la usada para las tabletas. Este
término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Uretral: Vía de administración caracterizada por depositarse dentro de la uretra.
Vaginal: Vía de administración caracterizada por depositarse dentro de la vagina.
Vehículo: Término de uso frecuente en la farmacia magistral que se refiere a un componente para uso interno o externo,
el cual se usa como portador o diluyente donde se disuelven o suspenden líquidos, semisólidos o sólidos. Entre los ejemplos se
incluye agua, jarabes, elixires, líquidos oleosos, portadores sólidos y semisólidos, y productos registrados (ver Excipientes).Este
término no se usa en títulos de artículos oficiales.
Veterinario: Término descriptivo para formas farmacéuticas destinadas al uso en animales no humanos.
USP42 InformaciónGeneral/ (1152) Medicamentos Veterinarios 8129
(1152) MEDICAMENTOSVETERINARIOS
USADOSEN ALIMENTOS
PARAANIMALES
PROPÓSITO
Este capítulo provee descripciones generales y definiciones de medicamentos y productos farmacéuticos veterinarios admi-
nistrados en alimentos para animales. Asimismo, trata los principios generales relacionados con la fabricación, envasado y eti-
quetado de dichos medicamentos y productos farmacéuticos.
ALCANCE
Este capítulo de información general trata sobre los artículos y alimentos medicados que se usan para administrar medica-
mentos veterinarios a los animales por medio de alimentos. Los medicamentos aprobados para la fabricación posterior de ali-
mentos medicados para animales no son formas farmacéuticas. Las formas farmacéuticas que se administran con alimentos no
son alimentos ni artículos medicados. Las formas farmacéuticas se listan en el capítulo general de la USPFormasFarmacéuticas
(1151).
Los medicamentos veterinarios aprobados para la fabricación posterior de alimentos medicados para animales pueden estar
en forma seca o líquida. En ocasiones se hace referencia a estos como premezclas. El término "premezcla" ya no se usa para
medicamentos veterinarios usados en alimentos para animales, aunque aún se usa en algunas monografías antiguas de medi-
camentos. Los medicamentos veterinarios en alimentos se regulan como artículos medicados Tipo A y alimentos medicados
Tipo B yTipo C.
Artículos Medicados Tipo A
Los artículos medicados Tipo A [Título 21 del CFR558.3(b)(2)] son formas concentradas de medicamentos veterinarios desti-
nados únicamente a la fabricación posterior de otros artículos medicados Tipo A o alimentos medicados Tipo By Tipo C apro-
bados. Esto significa que los artículos medicados Tipo A no pueden suministrarse como alimento directamente a los animales.
Estos artículos consisten en uno o más medicamentos veterinarios con o sin un portador (p. ej., carbonato de calcio, cáscara
de arroz, maíz, gluten) y con o sin otros ingredientes inactivos. Se pueden preparar en forma seca o líquida. Se venden a las
fábricas de alimentos o productores de ganado y están destinados a ser diluidos adicionalmente mezclándolos con los alimen-
tos antes de ser consumidos por los animales.
Alimentos Medicados Tipo B
Los alimentos medicados Tipo B [Título 21 del CFR558.3(b)(3)] son alimentos medicados intermedios para animales. Se fa-
brican a partir de artículos medicados Tipo A u otros alimentos medicados Tipo B mediante dilución con ingredientes alimen-
tarios no medicados. Los alimentos medicados Tipo B contienen una cantidad importante de nutrientes, no menos del 25%
del peso total del alimento, además de los medicamentos veterinarios. Se pueden preparar en forma seca o líquida. De manera
similar a los artículos medicados Tipo A, los alimentos medicados Tipo B están destinados únicamente para ser diluidos adicio-
nalmente mezclándolos con los alimentos, y no están aprobados como alimento para animales.
Alimentos Medicados Tipo C
Los alimentos medicados Tipo C [Título 21 del CFR558.3(b)(4)] están destinados a suministrarse como alimento directa-
mente a los animales. Se fabrican a partir de artículos medicados Tipo A, alimentos medicados Tipo B u otros alimentos medi-
cados Tipo C diluidos con ingredientes alimentarios no medicados. Los alimentos medicados Tipo C se pueden preparar en
forma seca o líquida. Los alimentos medicados Tipo C se pueden suministrar a los animales como alimento completo, como
aderezo en la parte superior de las raciones diarias normales u ofrecerse como de "libre elección" (free-choice) (21 CFR
510.455). Los alimentos medicados Tipo C aprobados para ofrecerse como de libre elección no están destinados a ser consu-
midos por completo en una sola ración ni a constituir la dieta completa de los animales.
PREPARACIÓN
Los artículos medicados Tipo A en forma seca por lo regular se producen mezclando los fármacos con portadores y otros
excipientes para promover el mezclado uniforme durante su adición posterior al alimento para animales. Los fármacos pueden
mezclarse primero con un excipiente (p. ej.,almidón o aluminosilicato de sodio) que tenga un tamaño de partícula similar y
que pueda ayudar a distribuir los fármacos uniformemente en la mezcla final. Esta premezcla se combina posteriormente con
excipientes a granel (p. ej., carbonato de calcio o cáscara de soja). El producto puede granularse y/o se le puede agregar aceite
81 30 (1152) Medicamentos Veterinarios / Información General USP42
(p. ej., aceite mineral, aceite de soja) para facilitar la distribución uniforme, para prevenir la segregación de partículas durante
el transporte y/o para minimizar la formación de partículas de fármacos dispersados en el aire durante la producción de otro
artículo medicado npo A o alimentos medicados npo B o Tipo C.
Los artículos medicados Tipo A en forma líquida se producen mezclando los fármacos con un disolvente adecuado (p. ej.,
agua o propilenglicol). Los fármacos por lo regular se disuelven hasta producir una solución, aunque también se pueden for-
mar productos en suspensión.
Los alimentos medicados Tipo B o npo C por lo general son fabricados en molinos de alimentos o en granjas de productores
de ganado. Para fabricar los alimentos medicados Tipo B o Tipo C en forma seca, los artículos medicados npo A se agregan a
los alimentos durante el proceso de mezclado. Los artículos medicados Tipo A en forma líquida pueden rociarse a velocidades
establecidas, mientras que los artículos medicados Tipo A en forma seca se agregan usando métodos que facilitan la distribu-
ción uniforme en los alimentos. Los alimentos medicados Tipo By Tipo C en forma seca se pueden procesar adicionalmente
por medio de calor, vapor y extrusión para formar pellets. Los pellets pueden enrollarse o romperse para crear pequeños trozos
crujientes. Los alimentos medicados Tipo B y C también se pueden preparar en forma líquida. Los alimentos líquidos por lo
regular son una base de melazas que contienen un medicamento veterinario disuelto o suspendido en la matriz de líquido.
Puede ser necesario recircular o agitar el alimento líquido rutinariamente para mantener una distribución uniforme de los me-
dicamentos.
Un alimento medicado Tipo B también puede prepararse diluyendo otro alimento medicado Tipo B. Un alimento medicado
Tipo C también puede prepararse diluyendo un alimento medicado Tipo B u otro alimento medicado Tipo C.
ETIQUETADOY ENVASADO
El etiquetado para artículos medicados Tipo A y alimentos medicados Tipo By Tipo C provee toda la información necesaria
para su uso seguro y efectivo. La etiqueta para el artículo medicado Tipo A incluye instrucciones de mezclado para la fabrica-
ción de alimentos medicados a partir del artículo medicado Tipo A e instrucciones para el suministro como alimento de los
alimentos medicados Tipo C. La etiqueta para el alimento medicado Tipo B provee instrucciones de mezclado para la fabrica-
ción de alimentos medicados para animales. Las etiquetas para los artículos medicados Tipo A y los alimentos medicados Tipo
B indican que no se deben usar para alimentar a los animales directamente. La etiqueta para alimentos medicados Tipo C in-
cluye instrucciones para suministro como alimento.
Los artículos medicados Tipo A se envasan en bolsas (p. ej., papel con recubrimiento interno de polietileno) para productos
secos o en envases apropiados (p. ej., de plástico) para líquidos. Los tamaños típicos son bolsas de 50 lb o envases de varios
galones. Los alimentos medicados Tipo B y Tipo C en forma seca pueden envasarse en bolsas para almacenamiento y adminis-
tración, o pueden transportarse a granel para su almacenamiento o uso inmediato. Los alimentos medicados Tipo C de libre
elección pueden envasarse en bolsas (p. ej., minerales sueltos), envolverse en película (p. ej., bloques comprimidos) o envasar-
se en tubos (p. ej., bloques moldeados). Los alimentos medicados Tipo B y Tipo C en forma líquida se almacenan y transportan
en tanques a granel.
NOMENCLATURA
El nombre establecido del medicamento (genérico) consta del fármaco (parte activa) y un tipo apropiado del artículo o ali-
mento medicado. Se dispone de las siguientes opciones de nomenclatura para indicar los tipos de artículos o alimentos medi-
cados como parte del nombre establecido del producto:
[Fármaco] artículo medicado Tipo A
[Fármaco] artículo medicado Tipo A en forma líquida
[Fármaco] alimento medicado Tipo B
[Fármaco] alimento medicado Tipo Ben forma líquida
[Fármaco] alimento medicado Tipo C
[Fármaco] alimento medicado Tipo C en forma líquida
[Fármaco] alimento medicado Tipo C de libre elección
[Fármaco] alimento medicado Tipo C de libre elección en forma líquida
[Fármaco] alimento medicado Tipo C como aderezo superior (top-dress)
7-
USP42 InformaciónGeneral/ (1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica 8131
(1160) CÁLCULOSEN LAPRÁCTICA

FARMACÉUTICA
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN
2. • ._usP42
CANTIDADESDEINGREDIENTES ACTIVOS
3. DOSIFICACIÓN •POR PESOY PORSUPERFICIE CORPORAL,.usP42
4. UNIDADESDEPOTENCIA•BIOLÓGICA,.usP4i
5. SUMASDEVOLÚMENES Y PESOS
6. DENSIDADY PESOESPECÍFICO
l. MIL/EQUIVALENTESY MIL/MOLES
8. EXPRESIONES DECONCENTRACIÓN • .usP42
9. ALCOHOL.. y ETANOL,.USP42
1O.MÉTODOSDEALIGACIÓNALTERNAY ALGEBRAICO •PARACOMBINARMÚLTIPLES
CONCENTRACIONES
DELMISMOIN-
GREDIENTE FARMACÉUTICO ACTIVO•usP42
11. •DILUCIONES,.usP<l
DEALÍCUOTAS
12. •DESPLAZAMIENTO DE,.usP4i
VOLUMENDEPOLVO•EN LÍQUIDOS,.usP42
13. VELOCIDADES DEINFUSIÓNO FLUJOINTRAVENOSO
14. •OSMOLARIDADY TONICIDADDE,.usP42 SOLUCIONES
15. • •USP42
pH Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS •de pH.usP4i
16. TEMPERATURAS
17. ENDOTOXINAS
18. •CINÉTICA,.usp
42DEESTABILIDADY•PREDICCIÓNDELA,.usp 42FECHADECADUCIDAD
• 19. TEMPERATURA CINÉTICAMEDIA,.USP42
APÉNDICE1: LOGARITMOS •COMUNESY NATURALES,.usP42• .usp42
1. INTRODUCCIÓN
El propósito de este capítulo general es proporcionar información general que ayude a los farmacéuticos y al personal de
apoyo en la realización de los cálculos necesarios para la preparación magistral y dispensación de medicamentos. Este capítulo
general no incluye toda la información necesaria para realizar cálculos farmacéuticos. Para obtener información adicional sobre
cálculos farmacéuticos, consulte un libro de texto sobre el tema. Para obtener información adicional sobre preparación magis-
tral farmacéutica y estabilidad de medicamentos, consulte PreparaciónMagistral-Preparaciones No Estériles(795), Preparación
Magistral-Preparaciones Estériles(797), Requisitosde Envasadoy Almacenamiento(659), Garantía de Calidad en la Preparación
Magistral (1163) y Consideracionessobre Estabilidaden la Prácticade Dispensación(1191 ).
Se pueden lograr cálculos farmacéuticos correctos usando conversiones apropiadas de un sistema de medición a otro y colo-
cando comas decimales de manera apropiada (o puntos, en los países en los que se acostumbre a usar dicho signo en lugar de
comas decimales), mediante el entendimiento de conceptos aritméticos, y poniendo especial atención a los detalles de los cál-
culos. Antes de proceder con cualquier cálculo, los farmacéuticos deben hacer lo siguiente: (a) leer con cuidado toda la fórmu-
la o receta médica; (b) determinar los materiales requeridos; y, posteriormente, (c) seleccionar los métodos de preparación y
los cálculos apropiados.
Se deben seleccionar métodos lógicos que requieran la menor cantidad de pasos a fin de asegurar que los cálculos se lleven
a cabo de manera exacta y correcta. Un farmacéutico debe realizar una doble verificación de cada cálculo o solicitar a otra
persona que lo haga, p. ej., un técnico, cuando no esté disponible otro farmacéutico, antes de proceder con la preparación
magistral. Un método apropiado para la doble verificación es la estimación, la cual consiste en redondear de manera conve-
niente (p. ej., 0,01 2 a 0,01; 0,44 a 0,5; 18, 3 a 20 y 476 a 500) para aproximar la magnitud de las respuestas.
2. ,..usp42 CANTIDADESDE INGREDIENTES

ACTIVOS
Elfarmacéutico debe ser capaz de calcular la cantidad o la concentración de fármacos en cada unidad o porción de dosis de
una preparación magistral al momento de su preparación y, nuevamente, al momento de su dispensación. Los farmacéuticos
deben realizar los cálculos y las mediciones para obtener, en teoría, 1 00% de la cantidad de cada ingrediente en las formula-
ciones preparadas magistralmente. Los cálculos deben tener en cuenta el ingrediente activo, o la parte activa, así como el con-
tenido de agua de los fármacos, que incluye el agua en las fórmulas químicas de los hidratos. Los fármacos y las sustancias
agregadas oficiales deben cumplir con los requisitos del capítulo general Pérdidapor Secado(731 ), por lo tanto se deben incluir
8132 (1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica/ Información General USP42
las correcciones correspondientes en los cálculos de las cantidades y concentraciones de los ingredientes. Elfarmacéutico de-
bería tener en cuenta el efecto que tiene la humedad ambiental sobre la ganancia o pérdida de agua de fármacos y sustancias
agregadas en envases que estén sujetos a la apertura intermitente durante el almacenamiento prolongado. Cada envase debe-
ría abrirse durante el tiempo mínimo necesario e, inmediatamente después de su uso, cerrarse herméticamente.
Se debe conocer la naturaleza del fármaco que se va a pesar y a usar en la preparación magistral de una receta médica. Si la
sustancia es un hidrato, puede ser necesario calcular su peso equivalente anhidro. Por otra parte, cuando el fármaco se presen-
ta con humedad adsorbida, ya sea especificada en un Certificado de Análisis o determinada en la farmacia inmediatamente
antes de usar el fármaco en la preparación (ver (731 )), dicha información deberá usarse al calcular la cantidad de fármaco que
se va a pesar para determinar la cantidad exacta de fármaco anhidro requerido.
Existen casos en los que la cantidad requerida de una dosis se especifica en términos de un catión (p. ej., Li•), de un anión
(p. ej., F-) o de una molécula (p. ej., teofilina en aminofilina). En dichos casos, el fármaco pesado es una sal o un complejo, una
porción del cual representa la parte farmacológicamente activa. Por consiguiente, la cantidad exacta de dichos fármacos pesa-
dos debe calcularse con respecto a la cantidad requerida de la parte farmacológica.
Se puede usar la siguiente fórmula para calcular el peso teórico de un ingrediente en una preparación magistral:
W= AB/CD
W = cantidad pesada real
A= peso prescrito o determinado por el farmacéutico de la parte activa o funcional del fármaco o de la sustancia agrega-
da
B = peso molecular (MW, por sus siglas en inglés) del ingrediente, incluida el agua de hidratación para los ingredientes
hidratados
C = peso molecular de la parte activa o funcional de un fármaco o de una sustancia agregada que provee el peso molecu-
lar del ingrediente pesado
D = fracción de peso seco cuando se conoce el contenido de humedad adsorbida como porcentaje en peso a partir del
procedimiento de pérdida por secado (ver (731)) o del Certificado de Análisis. El Certificado de Análisis debe ser específico
para el lote.
2.1 IngredientesActivos
2.1.1 CÁLCULODE FÁRMACOSDOSIFICADOSCOMO SALESE HIDRATOS
Ejemplos-Fármacos dosificados como sales e hidratos

1. Fármacos dosificados en forma de sal e hidrato
Triturar cantidades de sulfato de morfina y lactosa para obtener 1O g que contengan 30 mg de sulfato de morfina por cada
200 mg de la mezcla de morfina y lactosa. [NOTA-La morfina se dosifica como sulfato de morfina, que es el pentahidrato.]
W = peso de sulfato de morfina (g)
A= peso de sulfato de morfina pentahidrato en la receta médica, 1,5 g
B= peso molecular de sulfato de morfina pentahidrato, 759 g/mol
C = peso molecular de sulfato de morfina pentahidrato, 759 g/mol
D= 1,0
Resolver la ecuación:
W = (1,5 g x 759 g/mol)/(759 g/mol x 1) = 1,5 g de sulfato de morfina pentahidrato
2. Parte activa del fármaco y corrección por humedad
Pesar con exactitud una cantidad de aminofilina para obtener 250 mg de teofilina anhidra. [NOTA-En este ejemplo, la ami-
nofilina dihidrato en polvo pesada contiene 0,4% p/p de humedad adsorbida según se indica en el Certificado de Análisis reci-
bido por la farmacia.]
W= AB/CD
W = peso de aminofilina dihidrato (mg)
A= peso de teofilina anhidra, 250 mg
B = peso molecular de aminofilina dihidrato, 456 g/mol
C = peso molecular de teofilina anhidra, 360 g/mol
D = 0,996
[NOTA-Un mol de aminofilina contiene 2 moles de teofilina. La teofilina tiene un peso molecular de 180.]
W = (250 mg x 456 g/mol)/(360 g/mol x 0,996) = 318 mg de aminofilina dihidrato
USP42 Información General/ (1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica 8133
2.2 Hidratos, Salesy Ésteres
A menudo, por cuestiones de estabilidad u otras razones como sabor o solubilidad, la forma base de un fármaco se adminis-
tra en otra forma, tal como una sal o un éster. Esta forma alterada del fármaco por lo regular tiene un peso molecular diferente
y, en ocasiones, puede ser útil para determinar la cantidad de la forma base del fármaco en la forma alterada.
2.2.1 CÁLCULODE HIDRATOS,SALESY ÉSTERES
Ejemplos-Hidratos, Sales y Ésteres

l. Hidratos
Si se va a preparar una receta médica de 100 g de gel de clorhidrato de lidocaína al 2%, se podrían usar 2 g de clorhidrato
de lidocaína anhidra, o se podría calcular la cantidad equivalente de clorhidrato de lidocaína monohidrato según se indica a
continuación:
W = peso de clorhidrato de lidocaína monohidrato (g)
A = peso de clorhidrato de lidocaína anhidra en la receta médica, 2 g
B = peso molecular de clorhidrato de lidocaína monohidrato, 288,81 g/mol
C = peso molecular de clorhidrato de lidocaína anhidra, 270,80 g/mol
D= 1,0
W = (2 g x 288,81 g/mol)/(270,80 g/mol x 1) = 2,133 g de clorhidrato de lidocaína monohidrato
2. Sales
Una receta médica requiere 1O mL de un gel tópico de fentanilo a una concentración de 50 mcg de fentanilo/0, 1 mL, pre-
parado a partir de citrato de fentanilo. La cantidad de citrato de fentanilo requerida para la preparación se podría calcular se-
gún se indica a continuación:
Cantidad de fentanilo requerida para la preparación:
(50 mcg de fentanilo/0, 1 mL) x 1O mL = 5000 mcg de fentanilo
W = peso de citrato de fentanilo en la receta médica (mcg)
A = peso de fentanilo en la receta médica, 5000 mcg
B = peso molecular de citrato de fentanilo, 528,59 g/mol
C = peso molecular de fentanilo, 336,47 g/mol
D= 1,0
W = (5000 mcg x 528,59 g/mol)/(336,47 g/mol x 1) = 7855 mcg de citrato de fentanilo
3. Ésteres
La cantidad de cefuroxima axetilo contenida en una sola tableta de cefuroxima de 250 mg se puede calcular según se indica
a continuación:
W = peso de cefuroxima axetilo en la tableta (mg)
A = peso de cefuroxima en la receta médica, 250 mg
B = peso molecular de cefuroxima axetilo, 510,47 mg/mmol
C = peso molecular de cefuroxima, 424,39 mg/mmol
D= 1,0
W= (250 mg x 510,47 g/mol)/(424,39 g/mol x 1) = 300 mg de cefuroxima axetilo
,cambioen la redacdón:
3. DOSIFICACIÓN ..POR PESO Y POR SUPERFICIECORPORAL..usP42
3.1 Dosificaciónpor Peso
Las dosis a menudo se expresan como mg de fármaco por kg de peso corporal por intervalo de dosificación.
3.1.1 CÁLCULODE LA DOSIFICACIÓNPOR PESO
Ejemplo-Dosificación por peso

81 34 (1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica / Información General USP42
Un médico ordena azitromicina para suspensión oral a una dosis de 15 mg/kg/día, dividida cada 12 horas, para un niño que
pesa 36 lb. Calcular el volumen de suspensión oral, en mL, que debería administrarse para cada dosis de una suspensión de
200 mg/5 mL según se indica a continuación:
1. Calcular el peso del niño en kg:
36 lb x kg/2,2 lb = 16,4 kg
2. Multiplicar el peso, en kg, por la dosificación:
16,4 kg x 15 mg/kg/día= 246 mg/día

3. Dividir la dosis total diaria por el número de dosis/día:
246 mg/2 dosis= 123 mg/dosis

4. Calcular el volumen de cada dosis usando relación y proporción:
(123 mg/dosis)/(200 mg/5 mL) = 3, 1 mL/dosis
Algunos cálculos también pueden completarse usando el análisis dimensional de unidades. El análisis dimensional de unida-
des debería comenzar en el lado izquierdo de la ecuación con un factor que contenga las unidades del número de la respues-
ta. Se deben cancelar todas las unidades distintas a las del resultado. Si se va a usar un análisis dimensional de unidades, la
ecuación precedente sería la siguiente:
.b ( .. ) kg 15 mg 5 ml x ----día 3,1 ml
361 rasnmox ---
1 x ---x ----
2,2libras kg-día 200mg 2dosis dosis
3.2 Dosificación por Superficie Corporal (Humanos)
Algunos medicamentos, incluidos agentes quimioterapéuticos, requieren dosificación por superficie corporal (BSA,por sus
siglas en inglés). La dosis se expresa como cantidad de fármaco por metro cuadrado (m 2). La superficie corporal se puede cal-
cular usando las fórmulas siguientes:
BSA (m 2 ) = .J[altura (pulgadas) x peso (libras)]/ 3131
BSA (m 2
) = .J[altura (cm) x peso (kg)] / 3600
3.2.1 CÁLCULOPOR SUPERFICIE

CORPORAL(HUMANOS)
Ejemplo-Dosificación por superficie corporal (humanos)

Un médico prescribe rituximab a una dosis de 375 mg/m 2 cada semana durante 6 semanas para un paciente que mide 6
pies 2 pulgadas de altura y pesa 183 lb. Calcular el volumen, en mL, de inyección de rituximab de 1O mg/mL requerido para
preparar cada dosis de infusión IV según se indica a continuación:
1. Calcular la superficie corporal del paciente:
m2 = .j[74pulgadas 2,08 m2
x183libras]/3131=
2. Multiplicar la superficie corporal por la dosificación:
2,08 m 2 x 375 mg/m 2 = 780 mg/dosis
3. Calcular el volumen de cada dosis usando relación y proporción:
(780 mg/dosis)/(1 O mg/mL) = 78 mL/dosis
El cálculo anterior también puede completarse usando un análisis dimensional de unidades según se indica a continuación:
2,08 m2 (paciente)x 375 mg x ~ = 78 ml

m2 -dosis 10 mg dosis
3.3 Dosificación por Superficie Corporal (Animales)
La superficie corporal para gatos y perros se puede calcular usando las fórmulas siguientes. Para otros animales, consultar
referencias apropiadas sobre medicina veterinaria.
Superficie corporal para gatos:
Superficie corporal (m 2 ) = {1O x [peso corporal (g)]º,667 }/l O 000

Superficie corporal para perros:
USP42 Información General/ (1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica 8135
Superficie corporal (m 2 ) = {l O,1 x [peso corporal (g)J0,667 }/l O 000
3.3.1 CÁLCULODE DOSIFICACIÓNPOR SUPERFICIE

CORPORAL(ANIMALES)
Ejemplo-Dosificación por superficie corporal (animales)

Un médico veterinario prescribe una terapia con ciclofosfamida oral a una dosis de 50 mg/m 2 para un gato que pesa 5,8 kg.
Calcular la dosis de ciclofosfamida según se indica a continuación:
1 . Calcular la superficie corporal del gato:
Superficie corporal (m 2) = [1O x (5800 g) 0,667 ]/1 O000 = 0,324 m2
2. Multiplicar la superficie corporal por la dosificación:
0,324 m2 x 50 mg/m 2 = 16,2 mg
4. UNIDADESDE POTENCIA,.BIOLÓGICA,.usm
Dado que algunas sustancias no se pueden caracterizar por completo por medios químicos y físicos, podría ser necesario
expresar las cantidades de actividad en unidades de potencia biológica [ver las Advertenciasy RequisitosGenerales5.50.1 O, Uni-
dadesde Potencia(Biológica)de la USP].
4.1 Cálculo mediante el Uso de las Unidades de Potencia
EJEMPLOS-USO DE LASUNIDADESDE POTENCIA
1. Conversión de unidades de potencia a miligramos

Se administra una dosis de penicilina G benzatínica de 1,2 millones de unidades por vía intramuscular debido a una infec-
ción estreptocócica. Si un producto específico contiene 1180 unidades/mg, calcular la cantidad, en mg, de penicilina G benza-
tínica en la dosis según se indica a continuación:
(1 200 000 unidades)/(1180 unidades/mg) = 1017 mg de penicilina G benzatínica
2. Conversión de unidades de potencia a miligramos
Una receta médica indica 60 g de un ungüento que contenga 150 000 unidades de nistatina por cada gramo. Calcular la
cantidad de nistatina con una potencia de 4400 unidades/mg que debe pesarse para la receta médica según se indica a conti-
nuación:
60 g x (150 000 unidades de nistatina/g) = 9 000 000 unidades
9 000 000 unidades/(4400 unidades/mg) = 2045 mg de nistatina
5. SUMAS DE VOLÚMENESY PESOS
Los pesos son aditivos en la mayoría de las mezclas de líquidos, semisólidos y sólidos. Los volúmenes en las mezclas de solu-
ciones miscibles y líquidos puros pueden o no ser aditivos, dependiendo principalmente de efectos debidos a las proporciones
de volumen y a la formación de puentes de hidrógeno intermoleculares. Por ejemplo, las mezclas que contienen volúmenes
iguales o casi iguales de agua y etanol (y otros alcoholes monohidroxílicos miscibles) serán exotérmicas y generarán una con-
tracción de volumen de <5%, p. ej., 50 mL de agua+ 50 mL de etanol generan 97-98 mL a 20°-25º. La contracción de volu-
men es inapreciable entre el agua y alcoholes polihidroxílicos o polihídricos, p. ej., glicerina y propilenglicol. Los volúmenes
son aditivos con un error generalmente inapreciable en mezclas acuosas que contienen <10% de alcoholes monohidroxílicos,
es decir, se presenta una contracción de volumen de <0,5%.
6. DENSIDADY PESO ESPECÍFICO

La densidad se define como el cociente entre la masa de una sustancia en aire a una temperatura específica (por lo regular,
25º) y la unidad de volumen de dicha sustancia a la misma temperatura. La densidad puede calcularse con la siguiente ecua-
ción:
Densidad = (masa de sustancia/volumen de sustancia) a una temperatura y presión particulares
El peso específico es la relación sin unidades de la densidad de una sustancia con la densidad del agua a 4°, o [(g de sustan-
cia/mL)/1,00 g/mL]. Como alternativa, el peso específico se puede calcular a una temperatura determinada en algunas unida-
des comunes de densidad a partir de la densidad de la sustancia dividida por la densidad del agua.
8136 (1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica / InformaciónGeneral USP42
El peso específico puede calcularse con la siguiente ecuación:

Peso específico = (peso de la sustancia)/(peso de un volumen igual de agua)
6.1 Cálculode Densidady Peso Específico
EJEMPLOS-DENSIDADY PESO ESPECÍFICO
1 . Cálculo de densidad
2,3 g de polvo de carbón activado ocupan un volumen aparente de 5,2 mL a 20º y 1 atm. La densidad del polvo de carbón
activado puede calcularse según se indica a continuación:
Densidad= 2,3 g/5,2 mL = 0,44 g/mL
2. Cálculo del peso específico
125 g de glicerina ocupan un volumen de 99 mL a 25º. [NOTA-La densidad del agua a 25º es 0,997 g/mL.] El peso específi-
co de glicerina se puede calcular según se indica a continuación:
Peso específico= (125 g/99 mL)/(0,997 g/mL) = 1,266
3. Cálculo de ácido concentrado
El ácido clorhídrico es una solución de aproximadamente 37% p/p de ácido clorhídrico en agua. Calcular la cantidad, en g,
de ácido clorhídrico contenido en 75 mL de ácido clorhídrico según se indica a continuación. [NOTA-El peso específico del
ácido clorhídrico es 1, 18.]
37% p/p X 1,18 = 43,7% p/V
(43,7 g/100 ml) x 75 mL = 32,8 g de ácido clorhídrico
7. MILIEQUIVALENTES
Y MILIMOLES
[NOTA-Esta sección trata sobre miliequivalentes (mEq) y milimoles (mmol) aplicables a electrólitos para los cálculos de dosi-
ficación. Ver también 8. Expresionesde Concentración.]
La cantidad de electrólitos administrada a pacientes por lo general se expresa en mEq. Las unidades de peso como los mg o
g no se usan con frecuencia para los electrólitos porque las propiedades eléctricas de los iones se expresan mejor en mEq. Un
equivalente (Eq) es el peso de una sustancia que aporta 1 unidad de carga. El peso equivalente es el peso, en g, de un átomo o
radical dividido por la valencia del átomo o radical. Un mEq es 1/1 00Qmo de un Eq. El peso equivalente de un compuesto se
puede determinar dividiendo su fórmula o peso molecular en g por la valencia de su valencia iónica más grande.
Un mol equivale al peso atómico o molecular de una sustancia expresado en gramos. Un milimol equivale a 1/1 0QQmo de un
mol.
7.1 Cálculode Miliequivalentesy Milimoles
E)EMPLOS-MILIEQUIVALENTES
Y MILIMOLES
1. Calcular el peso en mEq de calcio. [NOTA-El calcio tiene un peso molecular de 40,08 y su valencia es de 2•.]
Peso Eq = 40,08 g/2 = 20,04 g
peso mEq = 20,04 g/1000 = 0,02004 g = 20,04 mg
2. Calcular la cantidad, en mEq, de potasio en una Tableta de Penicilina V Potásica de 250 mg. [NOTA-La penicilina V potá-
sica tiene un peso molecular de 388,48 g, hay un átomo de potasio en la molécula y la valencia de potasio es 1•.]
Peso Eq = 388,48 g/1 = 388,48 g
peso mEq = 388,48 g/1000 = 0,38848 g = 388,48 mg
(250 mg/tableta)/(388,48 mg/mEq) = 0,644 mEq de potasio/tableta
3. Calcular el número de mEq de magnesio y sulfato en una dosis de 2 ml de Inyección de Sulfato de Magnesio al 50%.
[NOTA-El sulfato de magnesio (MgS0 4 • 7Hp) tiene un peso molecular de 246,47, y la valencia iónica más alta es magnesio
2• y sulfato 2-.]
(SOg/100 mL) x (2 mL/dosis) = 1 g/dosis
peso Eq = 246,47 g/2 = 123,24 g/Eq
USP 42 Información General/ (1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica 81 37
(1 g/dosis)/(123,24 g/Eq) = 0,008114 Eq = 8,114 mEq de magnesio y sulfato por cada dosis
Este problema también puede resolverse usando un análisis dimensional de unidades según se indica a continuación:
50g 2ml 2Eq 1000mEq 8,114 mEq

x---x----x----~
100 ml dosis 246,47 g Eq dosis
4. Un vial de inyección de cloruro de sodio contiene 3 mEq/mL de cloruro de sodio. Calcular la concentración, en % p/v, de
la inyección. [NOTA-El cloruro de sodio tiene un peso molecular de 58,44.]
3 mEq 58,44 g Eq O,1753 g
---x---x-----
ml 1 Eq 1000 mEq ml
(O,1753 g/mL) x 100 mL = 17,53 g en 100 mL = 17,53% p/v
5. Calcular el peso de potasio en mmol. [NOTA-El potasio tiene un peso molecular de 39, 1.]
El peso de 1 mol es 39, 1 g y el peso en mmol es:
39,1 g/1000=0,0391 g ó 39,1 mg
6. Calcular el contenido, en mmol, de penicilina V potásica en una Tableta de Penicilina V Potásica de 250 mg. [NOTA-La
penicilina V potásica tiene un peso molecular de 388,48.]
El peso de 1 mol es 388,48 g y el peso de 1 mmol es:
388,48 g/1000 = 0,38848 g ó 388,48 mg
250 mg mmol 0,644 mmol de Penicilina V potásica

----X------
tableta 388,48 mg tableta
8. EXPRESIONES
DE CONCENTRACIÓN
Las expresiones de concentración de esta sección hacen referencia a mezclas homogéneas de los siguientes estados de la
materia a una temperatura de 20°-30° y a una presión de 1 atm (29,92 en Hg, 760 mm Hg, 101,3 kPa, 1013,3 mb): gas en
gas, gas en líquido, líquido en líquido, líquido en semisólido, sólido en líquido, sólido en semisólido y sólido en sólido. Las
expresiones para las concentraciones usadas en la práctica farmacéutica y en la investigación farmacéutica incluyen, entre
otras, aquellas citadas en la Tabla1. La concentración métrica de fármaco y las concentraciones clínicas comunes incluyen, por
ejemplo, mcg/mL, mg/dL, g o mg por cada L, y ng/µL (ver las Advertenciasy RequisitosGenerales8.240, Pesosy Medidas).
Tabla 1
Título Abreviatura Definición
Relaciones de masa en volu- Cociente entre la masa de un ingrediente dispersado o disuelto y la cantidad en volumen
men Ninguno es estándar de mezclas que contienen dicho inqrediente
Cociente entre el número de mEq de un electrolito o sal y la unidad de volumen de solu-
mEqª por volumen mEq/unidad de volumen ciones que contienen dicho electrolito o sal
Molalidad M molb de un soluto/kc¡ de un disolvente que contiene dicho solutoc
Molaridad M mol de un soluto/L de un disolvente que contiene dicho solutod
Normalidad• N Equivalentes (Eqf) de un soluto/L de un disolvente que contiene dicho soluto9
Partes de un gas, líquido o sólido en 1 parte por millón de otro gas, líquido o sólido que
Partes por millón Ppm contiene el primer qas, líquido o sólido
% Volumen en volumen %v/v ml de líquido en 100 ml de un disolvente que contiene dicho líquido
% Peso en volumen % p/v g de un soluto en 100 ml de un disolvente que contiene dicho soluto
% Peso en peso % p/p g de un soluto en 100 g de una mezcla que contiene dicho soluto
1:R 1 parte de un inqrediente en Rhpartes de una mezcla que contiene dicho inqrediente
1 en R 1 parte de un ingrediente en Rhpartes de una mezcla que contiene dicho ingrediente
Relación de contenido X:Y Xh partes de un ingrediente en )'11partes de otro inqrediente en una mezcla
ª 1 mEq = Eq/1000.
b La abreviaturade mol es mol.
e 1 mol de soluto en 1 kg de disolvente es una solución 1 molal (1 m).
d 1 mol de soluto en 1 L de solución de dicho soluto es una solución 1 molar (1 M).
• Normalidad= (Molaridad x valencia iónica más grande de un compuesto), p. ej., (18 M H2 S0 4 x 2) = 36 N H2 S0 4 , donde 2 se deriva de la valencia 2- de 50 4 .
' Eq de un compuesto= (1 mol x valencia iónica más grande de un compuesto), p. ej., 1 mol de citrato de litio= 3 Eq de citrato de litio; 1 mol de Ca(glucona-
to)i = 2 Eq de Ca(gluconato)i; y 1 mol de KCI= 1 Eq de KCI.
9 1 Eq de soluto en 1 L de solución de dicho soluto es una solución 1 normal (1 N).
h R, X e Y son números enteros.
8138 (1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica/ Información General USP 42
8.1 Cálculo de Normalidad
EJEMPLO-NORMALIDAD
Calcular la cantidad de polvo de bicarbonato de sodio requerida para preparar 50 mL de una solución de bicarbonato de
sodio 0,07 N (NaHCO3). [NOTA-El bicarbonato de sodio tiene un peso molecular de 84,01 .] En una reacción ácida o básica,
debido a que NaHCO3 se puede comportar como un ácido cediendo un protón, o como una base aceptando un protón, hay
un Eq de NaHCO3 contenido en cada mol de NaHCO3•
o 050 L
' L 1 Eq
•º
x O,O?Eq x 1 mol x 84 1 g = 0,294 g de bicarbonato de sodio
1 mol
8.2 Cálculo de Concentraciones Porcentuales
Las concentraciones porcentuales de las soluciones y otras mezclas homogéneas por lo general se expresan en una de las
tres formas comunes en las que las cantidades del numerador y del denominador están en las unidades de medición g y ml.
1. Porcentaje en volumen (% v/v) = (volumen de soluto líquido/volumen de solución o suspensión) x 100 o o/ov/v = mL de
soluto líquido en 100 mL de solución o suspensión
2. Porcentaje en peso (% p/p) = (peso de soluto/peso de la mezcla) x 100 o o/op/p = g de ingrediente en 100 g de mezcla
3. Porcentaje de peso en volumen (% p/v) = (peso de soluto/volumen de solución o suspensión) x 100 o o/op/v = g de solu-
to en 100 ml de solución o suspensión
Es posible usar las tres ecuaciones anteriores para calcular cualquiera de los tres valores (es decir, pesos, volúmenes o porcen-
tajes) en una ecuación determinada, si se conocen los otros dos valores (ver también Advertenciasy RequisitosGenerales8.140,
ConcentracionesPorcentuales).
EJEMPLOS-CONCENTRACIONESPORCENTUALES
1. Porcentaje en peso
Una receta médica indica lo siguiente (ver la Tabla2):
Tabla2
Óxido de cinc 7,5 g
Calamina 7,5 q
Almidón 15 g
Vaselinablanca 30 g
Calcular la concentración porcentual de cada uno de los cuatro componentes usando la ecuación de porcentaje en peso
anterior según se indica a continuación:
1. El peso total de ungüento= 7,5 g + 7,5 g + 15 g + 30 g = 60,0 g
2. El porcentaje en peso de óxido de cinc= (7,5 g de óxido de cinc/60 g de ungüento) x 100% = 12,5%
3. El porcentaje en peso de calamina= (7,5 9 de calamina/60 9 de ungüento) x 100% = 12,5%
4. El porcentaje en peso de almidón = (15 g de almidón/60 g de ungüento) x 100% = 25%
5. El porcentaje en peso de vaselina blanca = (30 g de vaselina blanca/60 g de ungüento) x 100% = 50%
2. Porcentaje en volumen
Una receta médica indica lo siguiente:
Receta médica: Aceite de Eucalipto al 3% v/v en Aceite Mineral.
Dispensar 30 ml.
Calcular las cantidades de ingredientes en esta receta médica usando la ecuación de porcentaje en volumen según se indi-
ca a continuación:
1. La cantidad de aceite de eucalipto.
3% v/v = (volumen de aceite en ml/30,0 ml) x 100%
volumen en aceite= 0,9 ml de aceite de eucalipto
2. La cantidad de aceite mineral.
30 mL - 0,9 mL = 29, 1 mL de aceite mineral
USP42 InformaciónGeneral/ (1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica8139
8.3 Conversiones de las Expresiones de Concentración
8.3.1 CONVERSIONESPARASOLUCIONESDE SÓLIDO EN LÍQUIDO
A continuación, se presentan los cálculos usados para convertir el porcentaje de peso en volumen, % p/v, a otras concentra-
ciones y viceversa, usando las mismas densidades y fórmula o pesos moleculares, para soluciones de cloruro de calcio, sulfato
de magnesio y cloruro de potasio en agua.
8.3.1.1 Cálculode conversionesde sólido en líquido
Ejemplos-Conversionesde sólidoen líquido
1. Convertir cloruro de calcio al 10% p/v (CaCl2 • 2H,O) a molalidad (m). [NOTA-El cloruro de calcio tiene un peso molecu-
lar de 147,01 g; una solución al 10% p/v tiene una densidad de 1,087 g/ml.]
10% p/v = 1Og de calcio/100 mL de solución
Usando la densidad de la solución:
100 mL de solución x 1,087 g/ml = 108,7 g de solución
108,7 g de solución - 1O g de cloruro de calcio= 98,7 g de agua= 0,0987 kg de agua
10g de cloruro de calcio/(147,01 g de cloruro de calcio/mol de cloruro de calcio)= 0,068 mol de cloruro de calcio
0,068 mol de cloruro de calcio/0,0987 kg de agua= 0,689 m
2. Convertir sulfato de magnesio al 50% p/v (MgSO4 • 7H2 O) a molaridad (M). [NOTA-El sulfato de magnesio tiene un peso
molecular de 246,47 g.]
50 g mol 1000 ml
X X 2,029M
100 ml 246,47 1L
3. Convertir cloruro de calcio al 10% p/v (CaCl2 • 2H2 O) a normalidad (N).
10 g 1 mol x 2 Eq x 1000 ml = 1, N
X 36
100 ml 147,01g 1 mol 1L
*2 Eq/mol derivado de la valencia 2• de calcio
4. Convertir cloruro de calcio al 10% p/v (CaCl2 • 2H2 O) a mEq/mL.
J.QJLx 1mol x 2 Eq x 1000 mEq = 1 36 mEq/mL

100ml 147,019 1mol 1Eq '
5. Convertir cloruro de calcio al O,1% p/v (CaCl2 • 2H2O) a ppm.
(O,1 g/100 mL) x (1 x 106 ppm) = 1000 ppm
6. Convertir cloruro de potasio al 33% p/v (KCI)a una relación de contenido 1 :R.
(1 / R) = (33 g/100 mL)
R = 3,03
1:R = 1:3
8.3.2 CONVERSIONESPARASOLUCIONESDE LÍQUIDOEN LÍQUIDO
A continuación, se presentan los cálculos usados para convertir el porcentaje de peso en peso, % p/p, y volumen en volu-
men, % v/v, a otras concentraciones y viceversa, usando las mismas densidades y fórmulas o pesos moleculares, para glicerina
y alcohol isopropílico en agua. Además de mezclas de líquido en semisólido, sólido en semisólido y sólido en sólido, el % p/p
se usa para líquidos viscosos, tales como alquitrán de hulla, glicerina y ácidos concentrados.
8.3.2.1 Conversiónde solucionesde líquido en líquido
Ejemplos-Conversionesde líquidoen líquido
1. Convertir glicerina al 50% p/p a% p/v. [NOTA-La glicerina al 50% p/p tiene una densidad de 1, 13 g/ml.]
(50 g/100 g) x (1, 1 3 g/ml) = 0,565 g/ml
56,5 g/100 mL = 56,5% p/v
8140 (1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica/ Información General USP42
2. Convertir alcohol isopropílico al 70% v/v a% p/p. [NOTA-El alcohol isopropílico tiene una densidad de 0,79 g/mL y el
alcohol isopropílico al 70% v/v tiene una densidad de 0,85 g/ml.]
70 mL de alcohol isopropílico x (0,79 g/mL) = 55,3 g de alcohol isopropílico
100 mL de solución x (0,85 g/mL) = 85 g de solución

(55, 3 g de alcohol isopropílico/85 g de solución) x 100 = 65,06% p/p
3. Convertir alcohol isopropílico al 70% v/v a% p/v. Los siguientes valores se derivan del ejemplo 2.
55,3 g de alcohol isopropílico/100 mL de solución= 55,3% p/v
4. Convertir glicerina al 50% p/p a molalidad (m). [NOTA-La glicerina tiene un peso molecular de 92, l.]
50 g de glicerina/(92, 1 g/mol) = 0,543 mol de glicerina
100 g de solución - 50 g de glicerina= 50 g de agua= 0,05 kg de agua
(0,543

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2019

USP 42 FARMACOPEADE LOS ESTADOSUNIDOS DE

Volumen 5 Autorizados por la Convención de la Farmacopea de

Oficial desde el 1º de mayo de 2019

La designación "USP NF 2019" en la cubierta de esta publicación es solo para

THE UNITED STATESPHARMACOPEIAL CONVENTION

Fecha de Publicación Fecha de Entrega de Fecha de Publlcaclón

Copyright © 2018 The United States Pharmacopeial Convention

VOLUMEN 1 Lista Detallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxxvii

Integrantes del Ciclo de Revisión Guía para los Capítulos Generales . . . . 15

Funcionarios ........................... xiii LJSP

Consejo de Expertos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii

Miembros y Delegados de la Índice

Reconocimiento para los Donantes

Acta Constitutiva .................. xxxi Advertencias

Estatutos ............................. xxxii

Políticas de la USP...................... xxxii

Artículos Incorporados a USP42 mediante

Artículos Incluidos en USP41 Ausentes

Salud Global Reactivos, Indicadores y

Índice Capítulos Generales

Pruebasy ValoracionesBiológicas . . . . . . . . . 6490

Pruebasy ValoracionesQuímicas. . . . . . . . . . 6602 Guía para los Capítulos Generales . . 7281

Aplicablesa las Normas,Pruebas,

1. Título y Revisión .................... 7269 6.70. Reactivos........................... 7275

1O. Conservación, Envasado, Almacena- 10.1O. Envasadoy Almacenamiento............ 7279

Partes de Disolvente Reque- Además de las pruebas prescritas en la monografía indivi-

Ejemplos de Redondeo de Valores Numéricos

sión menor de 20 mm de mercurio (2,67 kPas),a menos Elsímbolo µg se usa en

Unidades Símbolo Comentarlos Unidades Símbolo Comentarlos

10. CONSERVACIÓN,ENVASADO,ALMACENAMIENTOY 10.20. Etiquetado

Guía para los Capítulos

PRUEBASY VALORACIONESGENERALES (90) Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y

Pruebas Microbiológicas Pruebas y Valoraciones Químicas

Pruebas de Límite (580) Valoración de Vitamina C ............... 6844

(795) Preparación Magistral-Preparaciones No (1050.1) Diseño, Evaluacióny Caracterización

(1106.1) Ensayosde lnmunogenicidad-Diseño y (121O) Métodos Estadísticospara la Validación

(1644) Teoríay Prácticade Medicionesde

PRUEBASDE DESEMPEÑOPARA MEDICAMENTOS

Cremas, Gelesy Ungüentos

Figura 1. La celda de flujo diseñada para supositorios (dimensiones en mm).

Tabletas Sublinguales y Tabletas Bucales

(1005) EMISIÓN ACÚSTICA

Calificación y Verificación de Instrumentos de Emisión Acústica

Amplitud: La magnitud o potencia de una forma de onda variable.

(101 O) DATOSANALÍTICOS-INTERPRETACIÓNY TRATAMIENTO

Mantenimiento Adecuado de Registros

Consideraciones Relativas al Muestreo

Uso de Estándaresde Referencia

Verificacióndel Desempeñodel Sistema

PRINCIPIOSDE MEDICIÓNY VARIACIÓN

1 Lasmedicionesmúltiples(o, por equivalencia,los erroresexperimentalesasociadoscon las medicionesmúltiples)son independientesentre sí cuando se puede

%ASO= 100% · ✓e-~- 1·

%ASO= 100% • (e'-1)

Determinacióndel Tamañode la Muestra

Apéndice 1: Gráficasde Control

-------------- ------------- UCL = 106,5

- - - - --- - - -- - - - - --- - - -- - - - -- - LCL = 97, 5

Apéndice2: Estudiode Precisión