Este documento presenta los procedimientos y resultados de un laboratorio de bioquímica sobre la identificación de aminoácidos, proteínas y caseína. Explica cómo realizar las pruebas de Biuret y Xantoproteica para identificar proteínas en muestras de clara de huevo y solución de glicina. También describe cómo aislar la caseína de la leche mediante precipitación con ácido acético y cómo determinar la presencia de fósforo y cloruros. Finalmente, presenta las conclusiones sobre la identific
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Este documento presenta los procedimientos y resultados de un laboratorio de bioquímica sobre la identificación de aminoácidos, proteínas y caseína. Explica cómo realizar las pruebas de Biuret y Xantoproteica para identificar proteínas en muestras de clara de huevo y solución de glicina. También describe cómo aislar la caseína de la leche mediante precipitación con ácido acético y cómo determinar la presencia de fósforo y cloruros. Finalmente, presenta las conclusiones sobre la identific
Este documento presenta los procedimientos y resultados de un laboratorio de bioquímica sobre la identificación de aminoácidos, proteínas y caseína. Explica cómo realizar las pruebas de Biuret y Xantoproteica para identificar proteínas en muestras de clara de huevo y solución de glicina. También describe cómo aislar la caseína de la leche mediante precipitación con ácido acético y cómo determinar la presencia de fósforo y cloruros. Finalmente, presenta las conclusiones sobre la identific
Este documento presenta los procedimientos y resultados de un laboratorio de bioquímica sobre la identificación de aminoácidos, proteínas y caseína. Explica cómo realizar las pruebas de Biuret y Xantoproteica para identificar proteínas en muestras de clara de huevo y solución de glicina. También describe cómo aislar la caseína de la leche mediante precipitación con ácido acético y cómo determinar la presencia de fósforo y cloruros. Finalmente, presenta las conclusiones sobre la identific
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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE SANTIAGO
UTESA ESCUELA DE MEDICINA
Estudiante Nayeli Carolina Peña Matricula 218-4472 Asignatura Laboratorio Bioquímica I Sección MED-197-014 Temas Identificación de aminoácidos y proteínas Obtención e identificación de la caseína Determinación del fósforo Profesora Carlita Zaez de Lantigua Introducción Las proteínas son moléculas muy grandes compuestas por aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, con función estructural (como el colágeno, que forma parte de la piel), reguladora de reacciones químicas (como la insulina), o de reserva energética (como la albúmina del huevo). La secuencia (orden) de los aminoácidos es la estructura primaria de la proteína. Esta cadena puede enrollarse o curvarse formando una estructura secundaria. A su vez esta cadena enrollada puede formar trenzas u ovillos dando la estructura terciaria. Esta estructura puede perderse por efecto de la temperatura, o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc. Este proceso se llama desnaturalización. Para identificar las proteínas utilizaremos la reacción de Biuret. Esta reacción se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH, de manera que la presentan las proteínas pero los aminoácidos. El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa, y el Cu, en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas. La caseína es un sólido blanco-amarillento, sin sabor ni olor, insoluble en agua. Se dispersa bien en un medio alcalino, como una solución acuosa de hidróxido de sodio: NaOH, formando caseinatos de sodio. La reacción de Biuret es un procedimiento utilizado para identificar la presencia de proteínas en una mezcla. La reacción debe su nombre al Biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina de NaOH o KOH. La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta (cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas), debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. El fósforo se encuentra en el organismo formando parte de compuestos orgánicos (proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, etc.) o como fosfatos inorgánicos, cumpliendo diversas funciones (transporte de energía, estructura de los tejidos, mantenimiento del pH de los líquidos corporales). Es constituyente esencial de los tejidos óseo y muscular y participa en la composición del tejido nervioso. Su concentración en circulación está regulada entre otros factores por los niveles de vitamina D y las glándulas endócrinas, observándose variaciones fisiológicas de acuerdo a la edad, ingesta, actividad física, embarazo. -REACCION XANTOPROTEICA
Reactivo: HNO3 concentrado.
-GRUPOS DETERMINADOS XANTOPROTEICA
Los anillos bencénicos que poseen grupos amino o grupos hidroxilos son fácilmente nitrados para dar compuestos nitro aromáticos de color amarillo, que reciben el nombre genérico de ácido xantoproteico (del griego xanto: amarillo). Esta prueba no es satisfactoria para exámenes de orina debido al color amarillo de la reacción.
-TECNICA AGREGADA
Agregue 1 ml de HNO3 a 2 ml de la solución problema, mezcle y observe la aparición de
cualquier precipitado denso y blanco, caliente con cuidado la mezcla y observa si la solución cambia a amarillo. Enfríen la mezcla en agua fría y agregue NaOH al 10%: observe si el color se torna anaranjado. Esto indica que la reacción es positiva.
-REACCION DE BIURET
Reactivo: es una solución de NaOH y de CuSO4 al 0.1%.
-REACTIVOS BIURET
Se observa un color violeta cuando se agrega este reactivo a sustancias cuyas moléculas contienen dos grupos carbamino (CO.NH) ligados directamente o a través de un solo átomo de nitrógeno o carbono. Sustancias similares con el grupo (S.NH) también responden a la prueba.
-PROCEDIMIENTO PARA LA IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS
Materiales: probeta, mecherom agitador, tubos de ensayos, beaker.
Reactivos: clara de huevo, HNO3, reactivo de Biuret, NaOH, solución de glicina 2%, HCl, ácido acético, nitrato de plata 0.1N, nitrato de potasio 0.1N.
En 2 tubos de ensayo coloque 2 ml de la solución de glicina y realice las pruebas
de Biuret y Xantoproteica. En 2 tubos de ensayo coloque 2 ml de la solución clara de huevo y realice las pruebas de Biuret y Xantoproteica. Anote y analice los resultados.
-ACCION PH DE LAS PROTEINAS
En 2 tubos de ensayo coloque 2 ml de la solución clara de huevo.
Al primer tubo añada 10 gotas de HCl concentrado y observe. Al segundo tubo añada 10 gotas de ácido acético y observe. Después, realice la prueba de Biuret a cada tubo. Analice los resultados. -ACCIONES DE LOS METALES PESADOS SOBRE LAS PROTEINAS
En 2 tubos de ensayo coloque 2 ml de la solución clara de huevo.
Al primer tubo añada 10 gotas de nitrato de plata y observe. Al segundo tubo añada 10 gotas de nitrato de potasio y observe. Luego, realice la prueba de Biuret a cada tubo. Analice los resultados.
-ACCION DE LA TEMPERATURA DE LA PROTEINAS
En 2 tubos de ensayo coloque 2 ml de la solución clara de huevo.
Lleve el tubo al mechero, caliente suavemente y observe. Realice la prueba de Biuret y anote los resultados.
-ACCION DE LA BASE FUERTE
En 2 tubos de ensayo coloque 2 ml de la solución clara de huevo.
Añada 1 ml de solución de NaOH al 10%. Realice la prueba de Biuret y anote los resultados.
-OBTENCION E IDENTIFICACION DE LA CASEINA
Se entiende por leche natural al producto integro, no alterado ni adulterado del ordeño higiénico, regular, completo e ininterrumpido de las hembras mamíferas, domesticas, sanas y bien alimentadas. En general, de forma genérica se entiende exclusivamente la leche como la de vaca.
La proteína principal de la leche es la caseína, representando el 82% de sus proteínas
totales. A diferencia de muchas otras proteínas, la caseína no precipita por acción del calor. Por contrario, precipita por la acción de una enzima proteasa presente en el estómago de los mamíferos llamada renina y forma un precipitado denominado paracaseína.
Si la precipitación se realiza por la acción de ácidos, se le llama caseína acida, produciendo
una masa coagulada, que arrastra grasa, agua y algunas sales.
Otras proteínas de la leche son la albúmina y globulina. Estas son solubles en agua, precipitando por la acción del calor. Las albúminas de la leche son: lactoalbumina y seroalbumina.
-MATERIALES Y REACTIVOS DE LA CASEINA
Materiales: vasos de pecipitados, embudo de filtración, probeta, agitador, gasas,
mechero, tubos de ensayos, Erlenmeyer.
Reactivos: leche de vaca, éter, etanol, nitrato de plata, reactivo de Biuret, molibdato de amonio, ácido nítrico, ácido acético glacial. -PROCEDIMIENTO PARA AISLAR LA CASEINA
Caliente 100 ml de leche hasta 40º C.
Añada 1 ml de ácido acético hasta que precipite toda la proteína. Debe evitarse un exceso de ácido porque puede hidrolizarse para lactosa. Agitar hasta que se forme una gran masa amorfa. Filtre con gasa presionando hasta sacar el máximo de agua. Guarde el filtrado para determinar la presencia de cloruro y fósforo. Suspenda el precipitado en 50 ml de etanol y agite. Filtre con gasa y guarde el filtrado. Repita el proceso anterior añadiendo 50 ml de etanol-éter. 1:1 y filtre. Lave el residuo con 50 ml de éter y deje evaporarlo sobre un vidrio de reloj. Centrifugue el filtrado acuoso y el alcohólico. Tome 2 ml de filtrado acuoso y del alcohólico por separado en 2 tubos de ensayo y acidifique con ácido nítrico. Añada 2 ml de molibdato de amonio. Observe el color (determinación de fósforo). Tome 2 ml de filtración acuoso y alcohólico en 2 tubos de ensayo. Añada a cada uno nitrato de plata al 1% gota a gota. Observa y anote (determinación de cloruro). En 2 tubos de ensayo añada 0.5 mg de caseína obtenida y realice las pruebas de Biuret y Xantoproteica.
-DETERMINACION DEL FOSFORO
El fosfato inorgánico reacciona en medio ácido con el molibdato para dar fosfomolibdato, que es reducido por el ácido ascórbico a azul de molibdeno, desarrollándose el color en medio arsenito/citrato. El arsenito/citrato se combina con el exceso de molibdato impidiendo su reacción posterior con el fosfato liberado de los ésteres lábiles. El color obtenido se mide entre 620 y 650 nm. -MUESTRA DEL FOSFORO
Suero, plasma u orina
El suero o plasma debe ser separado de los glóbulos rojos dentro de las 2 horas de extraído y la determinación efectuada inmediatamente; de lo contrario se deberá refrigerar la muestra para evitar el aumento de fósforo inorgánico producido por hidrólisis enzimática de los ésteres orgánicos lábiles. La orina es estable 7 días refrigerada (2-10º C). -REACTIVO DEL FOSFORO
Solución de molibdato de sodio 230 mmol/l en ácido clorhídrico 1 mol/l.
Ácido ascórbico (≥ 5,6 mmol) desecado. Solución de arsenito de sodio 120 mmol/l en citrato de sodio 50 mmol/l con agentes tensioactivos. Solución estabilizada de fosfatos que equivale a 4 mg/dl de fósforo inorgánico. Agua destilada. Conclusiones Identificamos los aminoácidos: glicina y serina; también de proteínas como la albumina (solución de clara de huevo). Realizamos las reacciones de los aminoácidos y proteínas. La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización. La presencia de precipitado en la solución de caseína, al añadir ácido acético 1N, es la evidencia en la práctica, de haber encontrado el punto isoeléctrico. El precipitado formado, se puede volver a disolver adicionando poco a poco, NaOH 1N. La reacción de la caseína con el reactivo de Biuret observamos una coloración violeta lo que quiere decir que nos dio positivo ya que se da la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2 y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos de la proteína. El fósforo inorgánico (Pi) reacciona en medio ácido con el molibdato para dar un complejo fosfomolíbdico que se mide espectrofotométricamente a 340 nm. Para lograr una mejor performance en los resultados, se recomienda procesar un Blanco de Muestra con cada determinación, reemplazando el Reactivo por solución fisiológica. Este procedimiento es indispensable en el caso de muestras turbias, ictéricas, lipémicas o hemolizadas. Los niveles elevados de fósforo sérico son encontrados en el hipoparatiroidismo, mientras que el hiperparatiroidismo conduce a la situación contraria. También puede encontrarse hiperfosfatemia por hipervitaminosis D y diversos trastornos renales, mientras que la hipofosfatemia se relaciona con deficiencias de vitamina D y defectos en la reabsorción de fósforo a nivel renal.
