Memorias V Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniería, Habana 2003, Junio 10 al 13 de 2003

ESTIMACION DEL CALOR METABOLICO GENERADO EN UN

FERMENTADOR DE 3000L POR LA LEVADURA PICHIA
PASTORIS -rec HBsAg

Denis Alvarez Betancourt, Miladys Limonta, Raúl E. Díaz Betancourt.

Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología.
P.O. Box 6162, C.P 10600, Habana, Cuba. e. mail: denis.alvarez@cigb.edu.cu

RESUMEN
En los procesos fermentativos uno de los parámetros a calcular el valor aproximado de este calor generado a partir
controlar la temperatura del proceso. En los equipos de de un balance estequiométrico de calor que utiliza los
fermentación estándares la recirculación de agentes valores de entalpía generados en la oxidación completa del
refrigerantes es el método más utilizado para la extracción sustrato unido al valor del entalpía de la oxidación
del calor que se genera en el proceso metabólico de completa de la biomasa generada afectada por el
crecimiento de microorganismos y de otras fuentes de rendimiento biomasa/sustrato, reportado por Bailey, J;
generación de calor aunque esta es la más importante. Es Ollis, D.F [2]. .
por ello que la determinación de la generación de este En nuestro proceso de producción industrial del
calor es un parámetro a ser determinado. En este trabajo HBsAg-rec a partir de la levadura Pichia pastoris se
se expone la determinación de este calor realizado en el obtienen altos valores de concentración celular lo que
proceso de Fermentación de la levadura Pichia pastoris derivó en dificultades para mantener la temperatura de
utilizada en la producción del ingrediente activo de la trabajo de 30 °C, en el Bioreactor. Como parte de una
vacuna antihepatitis B. investigación nos propusimos, utilizando la metodología
Este proceso de fermentación utiliza una etapa inicial reportada por Bailey, J; Ollis, D.F [2] determinar el calor
utilizando glicerol como fuente de carbono y metabólico que se genera en nuestro proceso de
posteriormente se realiza una inducción con el uso de Fermentación. Para ello se tomaron las cinéticas de
metanol para la producción del antígeno. crecimiento de procesos industriales así como los
A partir de este procedimiento fue posible estimar el valor consumos promedio de metanol.
de generación de calor del cultivo industrial en el tiempo
con un valor máximo de 37700 kcal/hora a las 100 horas de 2. METODOLOGIA
Fermentación y este valor permitió ajustar las
carácterísticas del sistema de bombeo del agente MATERIALES: Cepa Pichia Pastoris MP36 Muts, His +
refrigerante. modificada genéticamente para producir el HBsAg. (Clon
226)
Palabras claves: Fermentación, calor metabólico, Pichia Medio Salino: (NH 4)2SO4(22 g/L), K2HPO 4(18.2 g/L),
pastoris. MgSO 4x5H2O (7.50 g/L), CaCl 2 x 2H20(0.5 g/L), Extracto de
Levadura(5 g/L), H3PO4 (16.40 g/L), Vitaminas 400X, 2.50
ml/L, Sales basales1000X, 1ml/L, NH 3 (20 %) para ajuste
1. INTRODUCCION de pH y adiciones seriadas de vitaminas y sales basales.

Dentro de los llamados sistemas de segunda Fermentadores CHEMAP de 75 y 300 y 3000 L de

generación para la expresión de genes heterólogos capacidad total.
tenemos la Pichia pastoris. Esta levadura tiene como
característica fundamental que es capaz de utilizar el Bomba peristáltica WATSON-MARLOW 503U.
metanol como única fuente de carbono y energía. En 1987,
Cregg y col. [1] lograron expresar el HBsAg, Proceso Fermentativo.
desarrollándose entonces procedimientos de producción El proceso de fermentación del HBsAg, en la levadura
de este antígeno que se utiliza como materia prima activa Pichia pastoris se lleva a cabo en Fermentadores de 3000
de la vacuna anti-hepatitis B [3] . L con 1000 L de volumen de Medio, inoculado con 200 L
En general se conoce que los microorganismos de un cultivo de 8 horas previamente desarrollado en un
metilotróficos generan una gran cantidad de calor fermentador de 300 L con el mismo medio y glicerol al 3
metabólico creciendo en metanol. La generación de calor % como fuente de carbono.
metabólico no es más que el resultado dede una parte de la Se divide en tres etapas fundamentales. Crecimiento en
energía que se produce durante el proceso de crecimiento glicerol como fuente de carbono, Inducción del promotor
y biosín tesis de las células por lo que es razonable esperar AOXI mediante la adición de un flujo lento y continuo de
una relación directa entre el calor generado y la energía del metanol y Crecimiento y expresión del HBsAg por adición
sustrato utilizado [2]. regulada según un esquema preestablecido que mantiene
El valor de esta generación de calor metabólico se relaciones específicas entre el flujo de metanol y la
debe considerar al diseñar los sistemas tecnológicos para biomasa generada (gramos de MeOH a adicionar por
el enfriamiento de los bioreactores. Es posible hora/gramos de biomasa generada (base húmeda)) a
valores de 0.03, 0.025, 0.017, 0.015. Las condiciones de

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trabajo son T= 30°C, pH 4.75, 2 VVM de aireación y 250 Fermentación en que se produce la máxima velocidad de
r.p.m. de agitación. crecimiento del cultivo. Después existe una reducción
asociada a la disminución de la adición de metanol como
Calculo del calor metabólico. Se calculó el calor estrategia para lograr la particulación adecuada intracelular
metabólico seccionando la fermentación en varias etapas y del HBsAg. La acumulación en el tiempo de biomasa en el
asumiendo la combustión completa de las fuentes de fermentador se incrementa paulatinamente hasta las 100
carbono. Según Bailey, J; Ollis, D.F [2] que plantea: horas en que se produce el máximo total de calor generado
observándose una reducción en las horas finales del
Y∆ = Ys/(∆Hs - Ys ∆Hc) proceso relacionado con la detención del crecimiento
celular.
donde: El máximo de flujo total de calor generado se produce
Ys: Rendimiento Biomasa-Substrato. para las 100 horas con un valor calculado de 37700
∆Hs(Variación de la entalpía por combustión completa del kcal/hora que coincide en tiempo con el momento donde
substrato) = #de moles x calor generado por la combustión no es controlable la temperatura del proceso industrial
completa donde además la cantidad de biomasa en el cultivo es
∆Hc : Variación de la entalpía debida a la combustión cercana a 100 kg (base seca).
completa de la biomasa. Este resultado máximo de calor es cercano a 0.40
= δHc x biomasa generada (gramos de d.w.) kcal/g.cél/h. del mismo orden que reporta Shay y col. [4].
Existe otro pico máximo a las 15 horas, momento en que el
δHc = 3 kcal/g cel. para levaduras creciendo en glicerol.
flujo de adición de sustrato y las condiciones de
δHc = 8.33 kcal/g cel. para levaduras creciendo en metanol. operación, permiten la mayor velocidad de crecimiento del
Además: microorganismo en metanol en el proceso. Posterior a este
Qc (Calor asociado a la combustión de la levadura) = tiempo
∆Hc x Ys
φ: (Flujo de calor genera do por la unidad de tiempo) 4. CONCLUSIONES
Ys/Y∆ = Qc-∆Hs
Φ = φ x tiempo Como conclusiones de este trabajo tenemos que fue
posible estimar el valor de generación de calor del cultivo
3. RESULTADOS industrial en el tiempo con un valor máximo de 37700
kcal/hora a las 100 horas de Fermentación. Este resultado
Los resultados de los cálculos a partir de la es del mismo orden del obtenido por Shay y col. [4] que
metodología reportada se muestran en la Tabla I. obtiene 0.58 kcal/g.cél/h para un cultivo de Pichia pastoris
de alta densidad, no obstante hay que considerar que en
Tabla I nuestro proceso se reducen las velocidades de
Resultados en la determinación del flujo de calor total crecimiento a partir de las 60 horas para coadyuvar a la
generado (F ) durante el proceso fermentativo de la particulación intracelular del antígeno no llegando a las
levadura Pichia pastoris. HBsAg-rec . concentraciones celulares reportadas por Shay y col [4].
Esta cantidad de calor no era posible extraerlo con los
t Biom. parámetros de operación del sistema de enfriamiento
V. Glic. V. MeOH M. sust.
(h) kg (d.w.) instalado en este tipo de Fermentador CHEMAP para un
8 30 L - 19,2 361,57 agua refrigerante de 20 °C. Este valor de calor se tomó
15 - 51 L 8,53 1224,2 como criterio para reducir la temperatura de diseño para el
53 - 155 L 29,25 3759,7 agua refrigerante desde 20 °C a 15 °C.
75 - 121 L 18,98 2925,0
90 - 81 L 12 1967,4 REFERENCIAS
100 - 96 L 13 2315,8
115 - 105 L 14 2535,5 [1] J.M., Cregg Tschopp J.F., Stillmann C.A., Siegel C.,
Arkog R., Craig M., Buckholtz W.S., Madden R.G.,
Kellaris K.R., Davis A., Smiley G.R., Cruze B.L.,
∆Hs
∆Hc Ys Qc F T orregross J., Velicel..Biotechnology 5:479-485, 1987
kcal/ g
kcal/g cel. kcal kcal/hora [2] J Bailey,.; D.F. Ollis, Biochemical Engineering
subst. Fundamentals. McGraw-Hill Book Company Second
132694 57600 0,577 3,32E+04 1,24E+04 Edition. 1981
209216 71054,9 0,218 1,55E+04 2,77E+04 [3] E Pentón, V. Muzio, M. González -Griego, Biotecnologia
642534 243652,5 0,243 5,92E+04 1,53E+04 Aplicada. Vol 11. 1:1 -10. 1994.
499887 158103,4 0,203 3,21E+04 2,13E+04 [4] L. K Shay., H. R. Hunt. J. of Industrial Microbiology 2:
336235 99960 0,191 1,91E+04 2,11E+04 79-85, 1987
395775 108290 0,175 1,90E+04 3,77E+04
433318 116620 0,173 2,01E+04 2,75E+04

Se pudo observar que existen dos máximos de flujo de

calor total. El primero es alrededor de las 15 horas de