FERMENTACIONES

INDUSTRIALES

GUÍA DEL ALUMNO

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 II. INDICE

CONTENIDO PÁGINA

I. DIRECTORIO Y RECONOCIMIENTOS

II. ÍNDICE 1

III. INTRODUCCIÓN DE LA ASIGNATURA 2

IV. DIAGNOSTICO DE CONOCIMIENTOS 3

V. UNIDADES TEMÁTICAS
Unidad 1. Fermentación, métodos de cultivo y cinética. 4
Unidad 2. Cultivos industriales. 8
Unidad 3. Fermentación alcohólica. 10
Unidad 4. Fermentación acética. 22
Unidad 5. Vinificación. 31
Unidad 6. Fermentación láctica. 44
Unidad 7. Producción de biomasa. 74
Unidad 8. Enzimas microbianas y producción de aminoácidos. 83

VII ANEXOS 94
Prácticas de laboratorio.
 INTRODUCCIÓN A LA ASIGNATURA

Los alimentos elaborados a base de fermentaciones han existido desde hace miles de años.
Por ejemplo, la mayoría de las dietas incluyen vinagre, fruto de la fermentación mixta del vino
mediante levaduras y, posteriormente, acetobacter (fermentos acéticos). El acetobacter aparece
espontáneamente cuando el vino está expuesto al aire, aunque la producción comercial
conlleva el uso de tanques de vinagre. La palabra "VINAGRE" proviene de vinagre (del francés,
vino agrio). Aunque no sólo se elabora a partir del vino, cualquier otra bebida alcohólica puede
emplearse como base, como por ejemplo la cerveza para producir vinagre de malta; y también
algunas frutas (frambuesas, manzanas)o verduras y almíbares.

También desde hace siglos en Oriente se produce la salsa de soja, el miso y el tempeh. En
la elaboración de la salsa de soja se utiliza el hongo Aspergillus oryzae y otros
microorganismos para fermentar una mezcla compuesta de soja y trigo. De ahí proviene su
fuerte aroma y su color marrón rojizo oscuro. El proceso está dividido en dos etapas y puede
durar entre 2 y 12 meses. Durante este tiempo, las proteínas y los azúcares se descomponen y
los productos de la mezcla inicial dan lugar a una gran variedad de componentes de diversos
sabores y aromas.

En la producción del tempeh también se usa un hongo, el Rhizopus oligosporus. El tempeh

es un alimento muy importante de la dieta de países como Indonesia, donde se utiliza como
fuente principal de proteínas y otros nutrientes esenciales. El miso, fruto de la fermentación de
la pasta de soja que se utiliza como base de sopas y salsas, se obtiene a partir de un cóctel de
microorganismos similar. Se pueden producir diferentes variedades, todo depende de la
cantidad de sal utilizada, los edulcorantes y el tiempo de fermentación.

La fermentación y, por consiguiente, los microorganismos también se utilizan para elaborar

aditivos. La propiedad del ácido glutámico (un aminoácido usado para obtener glutamato
monosódico) de potenciar el sabor fue descubierta en Japón a principios del siglo XX. Además
de dar sabor, los aminoácidos son nutrientes esenciales, ya que son componentes básicos de
las proteínas. Algunos alimentos, como los cereales, contienen proteínas con un contenido del
aminoácido lisina relativamente bajo. Puede añadirse lisina para mejorar la calidad nutricional
de las proteínas. Las fermentaciones en las que intervienen las bacterias Corynebacterium
glutamicum y Brevibacterium flavum producen tanto ácido glutámico como lisina.

Cabe mencionar también que el ácido cítrico se añade a refrescos, productos de confitería y
medicinas. En el pasado, se extraía de los cítricos; sin embargo, hoy en día, alrededor del 99%
de la producción mundial (más de 300.000 toneladas) proviene de la fermentación de un hongo,
el Aspergillus niger.

Los microorganismos también se utilizan para elaborar aditivos que dan consistencia a los
alimentos. Muchas gomas producidas por microorganismos se utilizan en la industria alimentaria
como espesantes, emulgentes y excipientes. Éstas pueden estabilizar la estructura del alimento
y hacerlo más agradable tanto a la vista como al paladar. Las gomas más comunes son la
xantina y la dextrina, producidas por cepas de las bacterias Xanthomonas y Leuconostoc
respectivamente.
III.- DIAGNÓSTICO DE CONOCIMIENTOS

NOMBRE:

A.- CONTESTA CORRECTAMENTE LO QUE A CONTINUACIÓN SE TE PIDE (2.1).

1. ¿Qué es una fermentación?
2. ¿Cuántos tipos de fermentación conoces?
3. ¿Qué es un método de cultivo?
4. ¿Qué tipos de microorganismos intervienen en una fermentación?
5. ¿De qué forma es benéfica para nosotros la fermentación?
6. ¿Cómo actúan las enzimas en una fermentación?
7. ¿Qué productos podemos obtener por medio de la fermentación?
IV.- UNIDADES TEMÁTICAS

UNIDAD 1.- FERMENTACIÓN, MÉTODOS DE CULTIVO Y CINÉTICA.

DEFINICIÓN DE FERMENTACIÓN:

o Proceso metabólico llevado acabo por microorganismos, bacterias y

levaduras bajo condiciones aeróbicas y anaerobias obteniendo energía y
teniendo características físico-químicas controladas.
o Es un proceso en el que se potencia deliberadamente el crecimiento de los
microorganismos que consumen una cantidad de sustrato y enriquecen, por
medio del cultivo los productos de su metabolismo.
o El proceso de fermentación es producido por acción de las enzimas cambios
químicos en las sustancias orgánica.

TIPOS DE FERMENTACIÓN:
o Fermentación acética
o Fermentación alcohólica
o Fermentación butírica
o Fermentación cítrica
o Fermentación láctica

Para llevar acabo la fermentación se requiere conocer el sustrato idóneo y

microorganismos idóneo y conocer las características físico-químicas del sustrato.

¿QUE ES UN MEDIO DE CULTIVO?

Un medio de cultivo es el sustrato que proporciona todos los requerimientos

necesarios para el crecimiento de los microorganismos.

CARACTERÍSTICAS IDONEAS QUE NECESITAN LOS MICROORGANISMOS PARA

LLEVAR A CABO UNA FERMENTACIÓN.

➢ Ser genéticamente estable en el medio de cultivo.

➢ Poseer células vegetativas, esporas algunas u otras unidades de reproducción.
➢ Tener un crecimiento rápido y vigoroso después de la inoculación (sembrar
microorganismos en el sustrato).
➢ Ser un cultivo puro.
➢ Reproducirse en un tiempo respectivamente corto.
➢ Que no produzcan sustancias tóxicas .
➢ Tiempo de conservación debe de ser considerado (que el microorganismo no se
muera rápido).
➢ El microorganismo debe ser industrialmente rentable .
➢ Que crezca o se desarrolle en condiciones relativamente sencilla.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS.

Los cultivos de microorganismos pueden prepararse de diferentes maneras, según

el proceso de producción se clasifican desde el punto de vista industrial dependiendo del
tipo de cambio que provocan en propiedades y transporte de las sustancias presentes en
el proceso.

FERMENTACIÓN POLIFÁSICO DISCONTINUO.

Estos métodos se utilizan para el cultivo de bacterias, levaduras y mohos, se

aplica sobre todo en la fermentación a gran escala recomendándose en la industria
farmacéutica y en la producción de alimentos.
Este tipo de fermentación industrial anaerobios facultativos se practica en donde
se requiere grandes cantidades de gérmenes vivos para su posterior concentración (por
ejemplo la obtención de biomasa, preparación continua de yogurt, crema, etc.).
Las diversas etapas de la fermentación polifásica discontinua pasa por las etapas
de preparación y cultivos de las cepas que por lo general se realiza en el laboratorio.
En cambio en las etapas de la fermentación, en los fermentadores se suele acondicionar
al proceso directo de producción.
De acuerdo al tamaño de los fermentadores y a la cantidad de inóculo necesario
se precisa un numero variable de etapas sucesivas de cultivo.

ETAPAS DE FERMENTACION INDUSTRIAL

Método polifásico de fermentación en superficie

Este tipo de fermentar es muy útil en la microbiología de los alimentos. En un

espacio de fermentación cerrada se colocan placas horizontales en una jaula que se
llenan de medio nutricio liquido que llega por un producto central de alimentación. La
siembra se realiza mediante inyección al primer medio nutricio con materia de inoculación
de cepa a utilizar.
Siembra en jeringa
Asa de
nicromio

Caja petri

Cepa conservada Cultivo Primer recultivo

liofilizada

Tanque
fermentador
a nivel industrial.

Segundo
recultivo

Etapa

Envasado
y envío

Dosificador

Solución

Termómetro Fermentador
 8
Representación esquemática de una instalación polifásica.
 MÉTODO MONOFÁSICO DE FERMENTACIÓN DE SUPERFICIE.

En este tipo de fermentación las necesidades del material son escasos. El principio
consiste en tomar con ayuda de asas o ganchos material de un cultivo madre, para
sembrarlo directamente en los medios nutricios sólidos.
Siembra en jeringa

Asa de
nicromio

Caja petri

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 UNIDAD 2.- CULTIVOS MICROBIANOS INDUSTRIALES

IMPORTANCIA DE LOS CULTIVOS DE MICROORGANISMOS.

Los microorganismos tienen importancia en la industria farmacéutica, alimenticia y la de

agricultura, esto con una visión a la disgregación de las materias primas, así como una compleja
y protección ambiental. El cultivo industrial necesario para la producción de determinados
productos es materia de la microbiología (tecnología microbiana) o microbiología industrial.

Factores con influencia sobre el crecimiento de los microorganismos.

Influencia de la temperatura sobre el curso de la fermentación: Las temperaturas muy

elevadas provocan la muerte de los microorganismos; y las temperaturas muy bajas inhiben el
desarrollo de estos. Las temperaturas de crecimiento se clasifican en: Mínimas, Óptimas y
Máximas.

➢ Temperatura mínima de crecimiento: es aquélla con la cual pueden evidenciarse toda

vía, en las bacterias proceso de desarrollo y división.
➢ Temperatura óptima de crecimiento: es aquella en la cual es mínimo el tiempo que
tardan los gérmenes en dividirse en la fase logarítmica.
➢ Temperatura máxima de crecimiento: se estima la mayor temperatura con la que
independientemente del tiempo de actuación, toda vía tiene lugar de crecimiento y
multiplicación.

Mínim Optimo Máximo

Logaritmo Logaritmo Logaritmo
No. de No. de No. de
M.O M.O MO.
Tiempo Tiempo Tiempo
Horas Horas Horas

Influencia de conservación de iones de hidrógeno sobre procesos de fermentación.

En todos los procesos fermentativos, constituyen la concentración de iones de hidrógeno

un parámetro esencial para el crecimiento de los microorganismos.

La clasificación de los valores de pH para el desarrollo de los microorganismos, pH

Mínimo, pH Óptimo y pH Máximo.

En la zona de pH óptima que depende de la especie del microorganismo, del medio,

etc. El tiempo que tardan los gérmenes en multiplicarse en la fase logarítmica es mínimo. Para
lograr una adecuada fermentación industrial, resulta imprescindible efectuar ensayos para
determinar el pH óptimo.

1
 UNIDAD 3.- FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

INTRODUCCIÓN.-

La producción de bebidas alcohólicas ha sido una actividad ligada a la mayoría de las

culturas durante miles de años.
Existen evidencias arqueológicas de más de 7000 años de antigüedad que en forma
empírica los humanos aprendimos a encausar las fermentaciones alcohólicas de diversos
sustratos.
Probablemente las primeras bebidas se hicieron a partir de sustratos azucarados como
los jugos de frutas, ya que éstos solamente requieren poner en contacto el jugo con la levadura
silvestre presente en la superficie de la propia fruta.
Desde épocas remotas diferentes civilizaciones aprendieron a fermentar diversos
sustratos a fin de producir sus bebidas alcohólicas autóctonas ,pero fue hasta el siglo XV
cuando empieza a popularizarse el arte de la destilación y de esta forma aparecen las bebidas
con mayor contenido alcohólico.
Las bebidas alcohólicas son compañeras constantes del hombre en su historia, pero
bien es cierto que su exceso es capaz de reducir nuestras sensibilidades y también es verdad
que tiene la virtud de animar el espíritu y de establecer atmósferas propicias para la
convivencia y conversación, esto cuando se consume con la justa medida y con la prudencia
que caracteriza a quienes saben disfrutar de las cosas de la vida.
Debido a a la gran importancia de estos productos la investigación científica y
tecnológica generan industrias las cuales son de mayor importancia económica en el mundo.

BEBIDAS ALCOHOLICAS.

Son soluciones acuosas que contienen además de agua alcohol sustancias orgánicas
que ejercen influencia sobre los aromas y el sabor según “ Francisco Rico Benitez.”

Son bebidas obtenidas a partir de cualquier jugo vegetal que no sea de uva y que
tienen propiedades organolépticas nuevas y atractivas para una prueba estadística significativa
de consumidores según Colin y Emilion.

De acuerdo a su contenido alcohólico las bebidas alcohólicas se clasifican en:

Fermentados..............................( 2-18% alcohol/volumen)

Destilados..................................( 30-60% alcohol/volumen)
Generosas..................................(15-20% alcohol/volumen)
Licores.......................................(15-90% alcohol/volumen)

Ejemplo de un proceso para una bebida alcohólica jugo vegetal 80 y 230 g/l de
azúcares fermentables pH:
 3.6 y 4.3 antes de sulfatarlo.
 Clarificación Microfiltración.
 Inóculo cultivo puro.
  Fermentación 20 y 28°C bajo una atmósfera de CO2.

¿ Como se obtiene el alcohol ?

glucosa levadura alcohol + CO2

DESTILACIÓN.

Es la separación de dos o más mezclas de sustancias con puntos de ebullición muy

diferentes de una mezcla a otra (agua, alcohol)

La temperatura de ebullición del alcohol es de 78 oC. A partir de la glucosa, fructosa o

sacarosa a través de las levaduras y temperaturas obtendremos alcohol (bebida fermentada)
(2-18%) porque contiene agua y el agua diluye la concentración de alcohol y por eso es menos
el porcentaje. Y así, aplicamos el proceso de destilación se separa el agua y obtendremos una
bebida destilada de (30-60%) que es alcohol más puro porque se separa agua.

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA.

Es un proceso bioquímico provocado por la acción de las levaduras y consiste en la

formación de los azúcares en etanol y bióxido de carbono que es un subproducto del proceso.

Es la formación de etanol producida por la fermentación anaerobia de la glucosa. La

fermentación alcohólica no solo la sufren los azúcares fermentables (glucosa o fructosa).

La sacarosa o azúcar de caña se desdobla en glucosa y fructosa por acción de la

enzima invertasa y pentasa producida por las levaduras. Además los productos alcohol
(anhídrido carbónico ), se forma también glicerina, ácido sucaníco, ácido subvolátiles,
butiliglicol, alcoholes superiores (esencia de fusel ), acetaldehído, ácido láctico y esteres.

La formación de los carbohidratos o azúcares a etanol mas bióxido de carbono se realiza

en condiciones anaerobiosis mediante la ruta de la glicólisis, que consiste en la escisición de la
glucosa para obtener energía (ATP). La transferencia de un fosforilo de ATP a la glucosa esta
catalizada por hexoquinasa, los siguientes intermediarios de esta vía metabólica la
dihidroxiacetona fosfato, gliceraldehido- 3-fosfato son azucares fosforilados, de hecho una de
las estrategias de la glicólisis es formar intermediarios de 3 carbonos capaces de intransferir
subgrupos fosfatos al ADP, y así obtener una síntesis neta de ATP. Desdoblamiento de la
sacarosa a fructosa y glucosa por medio de la enzima invertasa.

Es un proceso que genera ATP en el cual las sustancias orgánicas actúan como
ganadores y aceptores de electrones, la fermentación puede producirse en ausencia de O 2. Fue
descubierto por Pasteur, que la describió como la vía sansi’air (la vida sin aire).

Enzima : término propuesto en 1878 por Friedrich Wilhem Kuhne para designar a las
sustancias catalíticamente activas, a las que previamente se les había llamado fermento.
Derivado de las palabras griegas en (en) y zumos (levaduras).
 ETAPAS Y RECCIONES QUÍMICAS DE LA FERMENTACIÓN ALCOHOLICA.
GLICÓLISIS.

Derivado del griego glycos = azúcar (dulce), Lysis = disolución que quiere decir azúcar
en disolución.

La glucólisis es la secuencia de reacciones que convierte a la glucosa en piruvato con la

producción convidante de ATP.

La glicólisis es una de las diversas rutas catabólicas , conocidos generalmente como

fermentaciones anaerobias, mediante muchos organismos , obtienen energía química de varios
combustibles orgánicos en ausencia de oxígeno molecular.

Dado en que los organismos vivos sugieren inicialmente en una atmósfera que careció
de oxigeno.

La glicólisis es la secuencia de las reacciones que invierten la fructosa en piruvato con la

producción conocidamente en ATP . En los organismos aeróbicos la glicólisis sirve de
preámbulo al ciclo del ácido cítrico y a la cadena de transporte electrónica , las cuales
recolectan la mayor parte de la energía de la glucosa en condiciones aeróbicas , el piruvato
entra a la mitocondria en donde es completamente oxidasa hasta CO2 y H2 O. Si el
suministro es insuficiente como el músculo en contracción del piruvato se convierten en lactano.
En algunos organismos anaeróbicos como las levaduras del piruvato se convierten en etanol :
La formación del etanol y lactano a partir de glucosa son ejemplo de fermentación.
 RUTA GENERAL DE LA GLICÓLISIS

GLUCOSA
ATP
ADP
GLUCOSA 6 FOSFATO
ATP
ADP

FRUCTOSA 6 FOSFATO
FRUCTOSA 1, 6 FOSFATO

ESCISIÓN

GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO DIHIDROXICETONA FOSFATO

GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO

H2PO4 H2PO4

H2O 1, 3 BIFOSFOGLICERATO H2O

ADP
ATP
3 FOSFOGLICERATO

2 FOFOGLICERATO
H2O

FOSFOENOL PIRUVATO
ADP
ATP
PIRUVATO

ACETALDEHÍDO
ETANOL + H2O
 RUTA DE LA GLICÓLISIS

CH2OPO-23
H
CH2OH HH H H
H HEXOQUINASA H H
+ ATP OH OH
OH OH OH
OH OH OH

GLUCOSA GLUCOSA 6 FOSFATO

La hexoquinasa entonces es una enzima que transfiere un grupo fosforilo desde el ATP
a un grupo de azucares de 6 carbonos (hexosas) como la glucosa y la manosa. La hexoquinasa
al igual que otras quinasas requieren para su actividad Mg u otro ion bivalente como el Mn el
ion metálico bivalente forma un complejo con el ATP. La etapa siguiente de la glicólisis es la
isomerización de la glucosa 6 fosfato a fructuosa 6 fosfato, como se ve en la siguiente reacción:

CH2OPO-2 FOSFOGLUCOSA CH2OH

3
ISOMERASA OPO -2 3
HHH
+ ATP H OH
OH OH OH OH OH
OH
H H
GLUCOSA 6 FOSFATO FRUCTUOSA 6 FOSFATO

El siguiente paso es convertir la glucosa 6 fosfato a fructuosa 6 fosfato que lo

hace la encima fosfato isomerasa es un rompimiento entre el enlace del carbono 1 y 2
haciendo así una isomerización que es como un recorrido de partículas.

OPO-2
3 CH2OH OPO- CH2OPO-2
23
FOSFOFRUCTOQUINASA
H OH OH OH + ATP H OH OH OH

H H H H

FRUCTUOSA 6 FOSFATO FRUCTUOSA 1, 6 DIFOSFATO + ADP + H

 Lo que sucede en esta reacción es que la enzima fosfofructoquinasa hace que reaccione
el ATP para que este sede un grupo fosfato a la posición 1 convirtiéndose el ATP en ADP pero
también en esta reacción se va un H para que la transferencia del fosfato se ha exacta pasando
de fructuosa 6 fosfato a fructuosa 1,6 difosfato.
CH 2OPO3 H H
C=O ALDOLASA H-C-OH C=O
O H- C-H C=O H- C-OH

H-C-OH CH2OPO3 CH2OPO3

H- C-OH
CH2OPO3
FRUCTOSA 1, 6 FOSFATO DIHIDROXIACETONA GLICERALDEIDO 3 FOSFATO

La aldolaza parte a la mitad a la fructuosa 1,6 difosfato formando 2 moléculas que

son la dihidroxiacetona fosfato y el gliceraldehido 3 fosfato y también existe un reacomodo
de moléculas o partículas.

H TRIOFOSFATO H
H-C-OH ISOMERAZA C

C=O H -C-OH

CH2OPO3 CH2OPO3

DIHIDROXIACETONA GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO

En este caso la dihidroxiacetona fosfato se sede de la ruta y la tenemos que volver a

reintegrar a la ruta convirtiéndola en gliceraldehido 3 fosfato con ayuda de la triofosfato baja 2 H
a la posición 2 quitando la doble ligadura que existe en el O pero como en la posición uno
quedan solamente 3 enlaces para que se estabilice se le agrega una doble ligadura ya que el
carbono soporta 4 enlaces.

H O NAD++PI + FOSFATO DESHIDROGENASA O OPO-2 3

2
C C
H C OH H C OH

CH2OPO3
CH2OPO3
GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO 1,3 DIFOSFATO
 La isomerización de los azúcares fosforilados de 3 carbonos esta catalizada por la
triofosfato isomerasa.

Esta reacción es muy rápida y reversible. Así pues, se forma dos moléculas de
gliceraldehido 3 fosfato a partir de una molécula de fructosa 1, 6 difosfato por la acción secuencial
de la aldolasa y triofosfato isomerasa.

La reacción inicial de esta secuencia es la conversión de gliceraldehido 3 fosfato.

En 1,3 difosfato, reacción catalizada por el gliceraldehido 3 fosfato de deshidrogenasa.

O= C OPO-23
FOSFOGLICERATO
O =C O

H C OH + ATP QUINASA

C CH2OPO3
CH2OPO3

1, 3 DIFOSFOGLICERATO
3 FOSFOGLICERATO
FORMACIÓN DEL PIRUVATO Y PRODUCCIÓN DE UN SEGUNDO ATP

La posición del grupo fosforilo se desplaza en la conversión de 3 difosfoglicerato en 2

fosfoglicerato reacción canalizada por la fosfogliceromutasa.

2 C O FOSFOGLICERATO C-O
QUINASA
H C OH + ADP C - OPO-23

CH2OPO3 CH2OH

3 FOSFOGLICERATO 2 FOSFOGLICERATO

O H PIRUVATO O H
C
C QUINASA
C=O
C-OPO3
H C CH3
H

FOSFOENOL PIRUVICO PIRUVATO

H
O H PIRUVATO C
C CARBOXILASA
C=O
C=O
CH2 CH2

PIRUVATO ACETALDEHIDO

H
ALCOHOL H
C DESHIDROGENASA
H C OH
C=O
CH2 CH3

ACETALDEHIDO ETANOL +CO2

PRODUCTOS DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA.

La fermentación alcohólica no sólo la sufren los azúcares fermentables (glucosa y

fructosa). La sacarosa o azúcar de caña se desdobla en glucosa y fructosa; por la acción de la
enzima invertasa producida por las levaduras, además de los productos principales como
alcohol y bióxido de carbono, se forma glicerina, ácido succínico, ácidos volátiles, butilenglicol ,
alcoholes superiores(esencia fusen), acetaldehído, ácido láctico y esteres.

1.- ALCOHOL (ETANOL).

Es el producto más importante de la fermentación (etanol) espíritu de vino C2H5 (OH)3

cuya calidad (40-140g/l). Está sometido a grandes fluctuaciones según sea el contenido de
azúcar del jugo de frutas.
Es incoloro, muy fluido de agradable color que arde con llama azulada con formación de
agua y del anhídrido carbónico a 20°C tiene un peso especifico del 0.7894, hierve a 78.37°C y se
congela a –114°C. Se mezcla con el agua en todas las proporciones desprendiendo calor y
provocando una disminución de volumen próximo al 4%. Cuando se encuentra sin diluir el
alcohol tiene un penetrante olor a ardiente.

2.- GLICERINA

Es un alcohol trivalente C3H5(OH)3 en estado puro tiene aspecto liquido espeso

incoloro, de sabor dulce y no venenoso. Se mezcla con el agua y el alcohol en todas las
proporciones, reduciendo considerablemente, el punto de congelación del agua. La glicerina
pura tiene a 20°C un peso especifico de 1.2613, la glicerina se diluye en los productos de
fermentación valiosos del vino, ya que este presta cuerpo y consistencia.

3.- ALCOHOLES SUPERIORES

En 1910 fue emitido por f ehrlich que los alcoholes superiores, (alcohol propílico,
isopropilico, amílico, isoamilico e isobutilico), se originan de los aminoácidos correspondientes
(ácido amino butírico, valina leucina, isoleucina) mediante capacitación de agua y
desprendiendo dióxido de carbono y amoniaco. Efectivamente en experiencias modelo puede
comprobarse que agregando aminoácidos al medio que vaya a fermentar se estimula la
formación de alcoholes superiores por levaduras.

Azúcar ácido pirúvico

valina productos productor intermedio alcohol

isobutilico
intermedios
cetoivaleriato

2
 productos
intermedios

leucina celoisacaprato productos intermedios alcohol

isoamilico

Esquema simplificado de la formación de los alcoholes superiores (isobutil e isoamilico)

y de los aminoácidos valina y leucina por levaduras. Los alcoholes superiores solo se
encuentran en el vino en escasa cantidad ( 0.1 a 0.3 g/l ).
Ácido succínico ( COOH-CH2-CH2-COOH ) se origina también en la fermentación. Ya
Pasteur había determinado en el vino una cantidad de 0.6 gr. de sete producto para cada 100gr
de azúcar fermentado.

El ácido succínico cristaliza en placas o columnas monoclínicas, se disuelve en agua y

alcohol y tiene sabor limpiante ácido. La pequeña cantidad resulta de la fermentación (0.6 a 2
gr./l) compensa en parte la disminución de acidez que supone la merma de “Cartrato Potasio”.

4.- ÁCIDO ACÉTICO

Lo explicaremos con más detalle en la siguiente unidad temática.

5.- SUSTANCIAS AROMÁTICAS

El aroma de un vino obedece a varios cientos de componentes diferentes y está formado

por sustancias de distintas clases (aldehídos, cetonas, alcoholes, esteres, ácido terpenos).
Estas múltiples sustancias olorosas insípidas proporcionan en conjunto la intención total de dar
un vino.
En la constitución de los aromas y sabores peculiares de las uvas (bouquet) parece
participar un número relativamente pequeño de compuestos el bouquet del vino depende
fundamentalmente de números componentes generados en curso de la fermentación, conocidos
con el nombre de “esencia de fusel”.

Estos compuestos fundamentales del extracto de fusel no se originaron en la

fermentación en cantidades constantes. Diversas cepas de levaduras forman distintas
cantidades de estos compuestos.

Existen varios sabores: primarios, secundarios, tanto para olores como colores.

Sabores secundarios: son la mezcla de los sabores primarios (1, 2 o más).

Existen 4 sabores primarios: dulce, salado, agrio, amargo.

Sabor dulce: Los compuestos que lo presentan son: los azúcares que son los carbohidratos:
mono y disacárido. Los carbohidratos que son más complejos no presentan sabor (almidón,
celulosa, hemicelulosa).

Compuestos químicos que presentan sabor:

2
GLICOLIS, GLICEROL, SORVITOL LIGERAMENTE DULCE (SABOR)

CLOROFORMO SABOR DULCE

NITRATO DE ETILO SABOR DULCE

6.- ANHÍDRIDO CARBÓNICO.

Es el gas desprendido de la fermentación (gas carbónico) (CO 2) a partir del cual se

forma el ácido carbónico. Este último no se presenta libre si no únicamente en sus sales
(carbonatos ).

El anhídrido carbónico es un gas inodoro e incoloro que es 1.52 más pesado que el
aire y no hace combustión (no arde), el anhídrido carbónico no permite la respiración por lo
que ejerce acción asfixiante, de un 3 a 4 % del CO 2 en el aire y no hace combustión (no arde) .
El anhídrido carbónico no permite la respiración por lo que ejerce acción asfixiante. El CO 2 en el
aire dificulta ya la respiración y desarrolla acción sofocante por liberarse en la fermentación de
grandes cantidades de CO2 deben instalarse dispositivos de ventilación que aseguren su
eliminación, de aquí que la entrada de las bodegas durante la etapa de fermentación suponga
un evidente peligro de muerte.
.
En los vinos para embotellar es muy conveniente que exista un cierto contenido de
CO2 , el cual, hace al vino más espumoso.

Clasificación de bebidas alcohólicas de acuerdo con el sustrato del que proceden.

SUSTRATO NO DESTILADAS DESTILADAS FORTIFICADAS

Brandy,
Vino, chapage, Jere, oporto,
Uva
vinos espumosos vermut, madeira y
coñac,
moscatel
armañac, pisco y
Groppa
Sidra y sid
Manzana Calvados
espumo ra
sa
Pera Perry
Cereza Kirsch
Otros Vinos de frutas
Cereales, cebada cerveza Whisky
Burbon, whisky de
Maíz Tesguino maíz, whisky de
tennese
Vario (incluyend Vodka, ginebra y
s o akvait
pan.)
Arroz Sake
Sorgo Cerveza africana
Cachazo, pin
Ca melazas
charanda ga
ña,
aguardient ,
2
 e. R
jug
on
os o
,
Agaves Pulque Tequila, Mezcal.

Fue en la edad media cuando se descubrieron los principios físicos de la destilación, lo

que permitió a los alquimistas la época de destilar por primera vez, es decir, llevar a cabo una
separación de los componentes volátiles (alcohólicos) y las no volátiles (stractiles del vino).

El proceso de destilación del vino lo descubrió un sabio de Salerno (una de las más
antiguas universidades del mundo occidental) llamado Magíster Salernos.

En 1867 algunos escritores deducen que la destilación se usaba para la obtención de

nuevos medicamentos. Siglos después de su descubrimiento el aguardiente constituía, aún en
la mayoría de las culturas, un medicamento.

En el año de 1530 la ciudad de Núremberg puso a punto los primeros carros destinados
al transporte de los borrachos. En esta época apareció el término alcohol para denominar el
espíritu que contenía el vino.

Theophrastus, Bombastus Von Hohemhein paracel y médico, obtuvo el término de

alcohol copiando del árabe en este idioma, la palabra alcohol “alko hul” designa algo
esencialmente delicado y puro, “ la más útil de cada cosa “. El nuevo término acabó
sustituyéndolo a todos los utilizados hasta entonces de origen latino como “ agua vitae” que
quiere decir agua de vida o “ agua ordens “ por citar sólo algunos.

Durante el siglo XVI el aguardiente pasó definitivamente de ser una medicina a

convertirse en una bebida habitual.

La producción de aguardiente constituye uno de los hallazgos que mayor trascendencia

ha tenido comparación a la invención de la estructura, el dinero, la pólvora, la brújula, la
imprenta, y ha dado lugar a medicinas y también a exquisitas bebidas bajo el seductor nombre
de agua de vida.

UNIDAD 4.- FERMENTACIÓN ACÉTICA

INTRODUCCIÓN.-

El vinagre es el producto de la fermentación del vino o de alcohol, debido a la

reacción de Mycoderma aceti que oxida al etanol hasta ácido acético .

El ácido acético es un ácido que se encuentra en el vinagre, y que es el principal

responsable de su sabor y olor agrios. Su fórmula es CH 3-COOH y, de acuerdo con la
IUPAC se denomina sistemáticamente ácido etanoico.
H O
\ //
H-C-C

2
 / \
H OH

Es el segundo de los ácidos carboxílicos, después del ácido fórmico o

metanoico, que sólo tiene un carbono, y antes del ácido propanoico, que ya tiene una
cadena de tres carbonos.

En estado puro el ácido acético es un líquido incoloro, de olor y de sabor

penetrante a ácido, hierve a 118°C y posee una densidad de 1.0492 a 20 °C en la
fermentación se origina en cantidades muy pequeñas a partir del acetaldehído. El punto
de fusión es 16.6 °C y el punto de ebullición es 117.9 °C.

En disolución acuosa, el ácido acético puede perder el protón del grupo

carboxilo para dar su base conjugada, el acetato. Su pKa es de 4.8 a 25 ºC, lo cual
significa, que al pH moderadamente ácido de 4.8, aproximadamente la mitad de sus
moléculas se habrán desprendido del protón. Esto hace que sea un ácido débil y que, en
concentraciones adecuadas, pueda formar disoluciones tampón con su base conjugada.

HISTORIA.-

La historia del vinagre está íntimamente ligada a la historia del vino, como su
mismo nombre demuestra. El nombre castellano del vinagre proviene del latín “vinum
acre” o vino agrio y así ocurre en la mayoría de lenguas, con la excepción del italiano,
que toma el nombre de su principal componente, el ácido acético, y lo llaman “ACETO”.
No obstante, el vinagre ese regalo que Dios nos dio, se puede obtener de muchas
otras frutas, plantas y cereales.

Las primeras noticias, sobre un tipo de vinagre, que se obtenía de la palma,

provienen de Oriente y son del año 5.000 antes de Cristo (El salvador del mundo). Autores
griegos y romanos nos hablan también del vinagre, en este caso procedente del vino, que
no sólo utilizaban como condimento, sino como conservante de alimentos, muchas veces
mezclado con sal y miel.

Al principio el vinagre se consideraba como una alteración natural del vino. Hasta
el siglo VIII no se conoció la purificación del vinagre por destilación que fue dada a
conocer por Geber en, lo que se puede llamar, el primer tratado sobre la elaboración del
vinagre.

El vinagre se preparaba de una manera casera, permitiendo que el vino u otros

líquidos alcohólicos sufrieran, el contacto con el aire, una oxidación. Después se descubrió
que en este proceso intervenían unas bacterias, denominadas acéticas, que eran las
generadoras del proceso.

Hasta la Edad Media no aparecieron los primeros artesanos elaboradores de

vinagre.

En Francia, durante el reinado de Carlos VI, se agruparon convirtiéndose

2
en cofradía. Tenían unas severísimas normas para entrar en la orden y participar en los
secretos de la elaboración del vinagre. Según ellos “Era más difícil hacer un discreto
vinagre que un buen vino”. Aunque, en realidad, sus fórmulas secretas consistían en la
utilización de algunas sustancias de fuerte sabor, como la pimienta o el jengibre, que
daban al vinagre el sabor característico.

Como en tantas otras cosas fue necesario el grito de libertad de la Revolución

Francesa para que sé dejara libre la elaboración de vinagre en Francia. Si se ha hecho
referencia a Francia es porque en este país es donde se inició la producción industrial del
vinagre con el método Orleans.

Se utilizaban, barriles en serie de 200 a 400 litros de cabida y, partiendo de una

cantidad de vinagre al que se le añadía vino, por medio de una adecuada ventilación y
unas condiciones idóneas de temperatura, este vino se trasformaba en vinagre. Y fue
también en Francia, en el siglo XVIII, cuando Lavoisier empezó a dar una explicación
científica al proceso de elaboración del vinagre. Su teoría consistía en decir que el espíritu
del vino producía el vinagre al fijar el oxígeno del aire. Y lo que antes era un hecho que se
producía sin saber bien sus causas, se convirtió en algo explicable al conocerse los
agentes de la fermentación acética.

Fue Pasteur el que explicó con más detalle y exactitud el proceso, consistente en
la fermentación que una bacteria, el “Mycoderma aceti”, realiza en el alcohol vínico para
obtener el ácido acético. Pero, si para Pasteur la formación del vinagre se debía considerar
como un proceso fisiológico, ya que es una fermentación, para Liebig la transformación del
alcohol etílico en vinagre por acción de las bacterias, no es otra cosa que un proceso de
oxidación.

En medio de este proceso de teorías el vinagre se seguía produciendo. Todos los

países utilizaban las materias primas que tenían más a mano y elaboraban diferentes
tipos de vinagre.

Si en la cuenca mediterránea la base del vinagre era el vino, en Inglaterra del

norte, donde la cerveza era la bebida nacional, predominaba el vinagre de malta y en el sur
de Inglaterra, donde se cultivaban las manzanas, el vinagre era de sidra. En cada región, de
acuerdo con su clima y los cultivos propios, se encontró una materia prima para producir
vinagre.

MICROORGANISMOS PARTICIPANTES.

La especie de bacteria empleada es importante, cuanto más activa sea, más

rápida y completa será la fermentación. Se sabe que los vinos utilizados para la obtención
de vinagre no deben tener más de un 20% de agua y el alcohol en una concentración
comprendida entre el 5 - 11% del volumen en ningún caso por encima del 15%. De no ser
así, las bacterias acéticas mermarían su actividad prolongando el tiempo de fermentación.

Clasificación de las cepas:

2
 Las bacterias acéticas, para cumplir su cometido necesitan, además, cantidades
constantes de oxígeno y estar protegidas de la luz ultravioleta. Ésta, al tener acción
germicida, puede destruir la célula o retardar su desarrollo. La temperatura ideal del
proceso de fermentación acética está entre los 28 y los 30 ºC. A mayor temperatura la
enzima alcoholdeshidrogenasa se destruye.

Existen dos tipos de bacterias generadoras de ácido acético: El género

“Gluconobacter” y el género “Acetobacter”.

El genero “Gluconobacter” oxida los azúcares o alcoholes hasta cetonas y

ácidos, pero no pueden continuar degradándolo hasta CO2 y H2O se trata de bacterias
denominadas: sub – oxidantes. Se diferencia de acetobacter con sus flagelos situados
exclusivamente en posición aplical ( polares ) y por su capacidad para seguir degradando
al ácido acético y láctico, oxidan al etanol hasta ácido acético con una rapidez alta.
El genero “Acetobacter” representantes del otro grupo por lo contrario pueden
seguir degradando las cetonas y los ácidos hasta bióxido de carbono y agua y se les
conoce como bacterias: superoxidantes. Dentro del genero Acetobacter encontramos a
los súper oxidantes que se diferencias de tres especies con distintas subespecies.

La especie más importante desde el punto de vista industrial es acetobacter

aceti a ella pertenece como cepas de cultivo las de: ssp. Orlaense y ssp. Xylinum.

Ssp. Orlaense.
Son las bacterias del vinagre del vino y de la acidificación rápida que tiene las
tasas máximas de conversión de etanol a ácido acético. Es la más eficaz porque produce
un ácido muy concentrado.

Ssp. Xylinum
Se encuentra en las heces del vinagre (vinagre madre) conformando una capa
sólida correosa en los depósitos del vinagre tiene una eficacia limitada y resulta
indeseable porque forma colores y olores desagradables.
Las otras dos especies Acetobacter Pasterianus y Peroxidans, no tienen elaboración
de vinagre. La primera pertenece también a las bacterias perjudiciales vinagre de cerveza y
forma sustancia musilaginosas durante la obtención del mosto.

“Mycoderma aceti”
La bacteria llamada “Mycoderma aceti” realiza la fermentación acética del
alcohol, que contiene el vino, para transformarlo en ácido acético. Por esta razón, para la
producción de un buen vinagre se debe tratar con sumo cuidado esta bacteria. Además la
bacteria requiere unas condiciones especiales de trabajo. Su temperatura ideal para el
trabajo es de 25% a 30%, un exceso de temperatura causaría su muerte y con una
temperatura muy baja su ritmo de trabajo es muy lento, se retarda el proceso y por lo
tanto se incrementan los costos. Para su existencia y para su trabajo de oxidación necesita
también abundancia de oxígeno por lo que durante el proceso se deberá mantener una
buena oxigenación del vino.

MATERIAS PRIMAS.
2
 En la elaboración de vinagre es importantísima la selección de la materia prima.
Cuando el vino es de mejor calidad, mejor será el vinagre. La composición del vino
debe ser la adecuada para ser transformado en un excelente vinagre. El Control de
laboratorio en esta primera fase es indispensable.

Con el fin de que el vino que se va a utilizar esté totalmente limpio, por medio
del centrifugado, se procede a su limpieza y se almacena en grandes depósitos, de
donde se alimentaran los generadores del vinagre, su grado alcohólico debe ser como
mínimo de 11º y no debe tener ningún tipo de sabor y olor extraño.
La materia prima para obtener vinagre es el alcohol etílico, que sufre un proceso
aeróbico denominado “Oxidación”, debido a la presencia de bacterias del tipo
Acetobacter. Se trata de un género microbiano caracterizado por tener células de formas
elipsoidal y esférica, sueltas o unidas en cadenas, por lo general inmóviles, aunque
algunas son móviles por ayuda de flagelos. Según su función pueden clasificarse en dos
grupos: los que oxidan el ácido acético y lo transforman en dióxido de carbono y agua y
los que carecen de esta propiedad.
Teniendo en cuenta la materia prima de la cual ha sido fabricado, los vinagres se
pueden clasificar en:

1. Vinagres de jugo de fruta manzana, uva, pera, bayas, etc. Un ejemplo es el

vinagre de vino o de uva, se obtiene exclusivamente por fermentación de la uva y
del vino. Es el tipo de vinagre más usado en la gastronomía de distintos países de
Europa, en particular en Francia e Italia. Según el vino que se utilice se obtienen
vinagres distintos a los que se les da diferentes aplicaciones; el vinagre de vino
tinto realza el sabor de las carnes rojas; el de vino blanco resulta ideal para
elaborar ciertas salsas (mayonesa, holandesa). El vinagre de cerezas en España,
balsámico en Italia, vino tinto en Francia, etc. Muy apreciado por su ligero sabor
acaramelado es el vinagre de Jerez, y el vinagre de vino Rioja, que se caracteriza
por su tono teja brillante y un sabor muy definido. Excelente para el paladar es el
vinagre balsámico de Módena, un vinagre de origen italiano de consistencia
espesa y un bouquet muy apreciado. Se elabora con mosto fresco de uva que se
hierve para concentrar el contenido de azúcar y el sabor y se deja envejecer de 6
a 12 años. Otro ejemplo es el vinagre de manzana o de sidra es muy consumido
por su suave y delicado sabor. Se puede elaborar a partir de la pulpa de manzana
o su zumo, cuyo azúcar se convierte primero en alcohol y posteriormente en ácido
acético, o a partir de la sidra o mosto de manzana fermentado. A las ensaladas les
proporciona un toque a manzana y combina muy bien con pescados, carnes
blancas y salsas suaves.

2. Vinagres fabricados por hortalizas y amilasas, como son los vinagres de papatas,
cuyo almidón debe ser previamente hidrolizado a azucares. Como ejemplo esta el
vinagre de arroz es típico de países asiáticos como China o Japón donde se incluye
en la mayoría de platos populares de la gastronomía propia de estos países. Se
trata de un vinagre con sabor suave y algo dulce y con un color que oscila entre
el blanco, dorado pálido o rojizo, según se elabore solo con arroz o se combine
2
 con otros cereales como el trigo, el sorgo o el mijo.

3. Vinagres fabricados por cereales malteados, Vinagre de cebada, vinagre de

centeno, vinagre de trigo y vinagre de maíz. El vinagre blanco destilado es el más
usado en el hogar. Este vinagre, de un tono casi transparente, se destila antes de
que todo el alcohol se haya convertido en ácido acético. Este proceso aumenta
mucho el contenido en ácido acético, y a esto se debe el sabor fuerte y
pronunciado de estos vinagres. Se elaboran generalmente a partir de la caña de
azúcar, el maíz o la melaza, y son los más empleados en la elaboración de
encurtidos, salsas envasadas, etc.

4. Vinagres fabricados por productos azucarados.

5. Vinagres que se fabrican con espíritu de vino a alcohol, como el que se fabrica con
el líquido que queda después de preparar las levaduras de cerveza. Como el que
se fabrica con el alcohol desnaturalizado o diluido.

6. Sabores y aromas.- Cualquier vinagre se puede aromatizar o condimentar con

hierbas aromáticas (romero, tomillo, estragón, albahaca...), especias (ajo,
pimienta, chiles...), frutas (frambuesa, manzana, plátano, naranja, piña,
zarzamoras, limón...) u otros condimentos como azúcar o miel. El resultado es un
vinagre aromatizado que dan un toque especial a los alimentos o a los platos a los
que se añade.

7. Color.- El vinagre se encuentra con una gran variedad de tonos de colores, desde
un casi transparente vinagre blanco destilado a las diferentes tonalidades de rojo
de los vinagres de vino, amarillentos de los vinagres de sidra y color chocolate de
los vinagres de malta. El color del vinagre se deriva básicamente de los
ingredientes usados para su elaboración. Es también de esperar que el color varíe
entre los mismos tipos de vinagre, por ejemplo cambios naturales en la coloración
de las manzanas varían de cosecha en cosecha, y los tipos de manzanas
utilizados. Aunque también se puede utilizar color caramelo para darle un tono
café al vinagre.

PROCESO FERMENTATIVO.

La fabricación de vinagre a partir de materias primas que contienen azúcar

comprenden dos pasos:

1. La fermentación de azúcar a alcohol etílico.

2. La oxidación del alcohol a ácido acético.

El primer paso es un proceso anaerobio llevado acabo por levaduras

saccharomyce cereviseae var. Ellipsodeus. El segundo paso es la oxidación del
alcohol a ácido acético, es una reacción aerobia llevado acabo por bacterias acéticas
como son los del grupo acetobacter.

La enzima catalizadora (alcoholdeshidrogenasa) que posee Acetobacter es la

2
encargada de producir la oxidación del alcohol por retirada del hidrógeno.

Condiciones del proceso fermentativo.

No obstante, no solamente la presencia de Acetobacter hace posible la

producción de vinagre ya que existen múltiples factores que intervienen en la
fermentación acética como son la especie empleada y la pureza de la cepa, la
concentración acuosa y alcohólica del vino utilizado, la luz, el oxigeno, el agua, el pH, las
sales nutritivas y la temperatura.

Si se cumplen todas estas condiciones, las fermentaciones se desarrollarán de

manera perfecta. Las acetobacterias catalizan la oxidación de alcohol en ácido acético
según la siguiente fórmula:

C2H5OH + O2 ==> CH3COOH + H2O

Siguiendo un proceso que se repite continuamente.

En el ramo industrial se fabrica el ácido mediante oxidación de líquidos

alcohólicos diluidos por bacteria acéticas. También se efectúa mediante la siguiente
reacción:

2CH3 –CHO + H2O ----------------------- C2H5 OH + CH3 –C00H

ACETALDEHIDO AGUA ETANOL AC. ACETICO

En general el proceso de fermentación acética sigue la ruta de la glicólisis, la

cual se explica con más detalle en la unidad denominada “Fermentación alcohólica”.

IMPORTANCIA INDUSTRIAL DEL ÁCIDO ACÉTICO.

El vinagre puede ser usado en muchas formas. Existen mas de 300 aplicaciones
de cómo usarlo. A veces se piensa que sólo es utilizado en la cocina como acompañante
de las ensaladas mezclándolo con aceite y/o pimienta y sal. Sin embargo, el vinagre tiene
usos que van desde ser un ingrediente versátil de sus comidas como resaltador del sabor
o condimento, un ablandador de las carnes, un preservante natural de alimentos, un
agente medicinal y un elemento de gran utilidad en la limpieza del hogar y los equipos
utilizados en la industria de alimentos. En fin, el vinagre se utiliza en cualquier medio
donde se requiera de un acidulante natural. Algunas aplicaciones se muestran a
continuación:

Acidulante.- Al igual que los cítricos, el vinagre es un excelente ingrediente para

marinar ya que es un ablandador natural porque desdobla las fibras y proteínas de las
carnes. Por ejemplo, es ampliamente utilizado para ablandar el bistec de cinta (Flank
Steak). Solo una nota de precaución, debido a que el vinagre puede por si solo cocinar la
carne se recomienda mezclarlo con aceite vegetal o de oliva cuando se use para marinar.

2
 Resaltador del sabor.- Puede agregarse a la salsa que vaya a utilizar para
cocinar. Cuando se cocina su plato, el agua se evapora dejando el exquisito aroma y
sabor del vinagre. En el caso de los mariscos, es mejor agregar el toque de vinagre luego
de cocinados para mejorar así el sabor de los mismos.

Conservador natural.- La mayonesa, salsa picante, mostaza, el ketchup, salsa

de tomate y los encurtidos son preservados con vinagre. El vinagre es ampliamente
utilizado en la industria alimenticia por tener la propiedad de reducir el pH de los alimentos
para evitar el crecimiento de bacterias. Su sabor también ayuda a mejorar el de los
alimentos que se preservan. Evita el crecimiento de hongos, desinfecta los equipos que
se utilizan para procesar alimentos y neutraliza los malos olores característicos de ciertos
alimentos.

Higiene personal.- En los Estados Unidos un gran porcentaje de la producción

de vinagre destilado es utilizado por la industria farmacéutica para la elaboración de
duchas femeninas.

Limpieza de materiales.- La industria química lo usa por ejemplo como

ingrediente para elaborar limpiadores líquidos de vidrio.

UNIDAD 5.- VINIFICACIÓN

CARACTERÍSTICAS GENERALES, ETAPAS Y REACCIONES QUÍMICAS DEL

PROCESO DE VINIFICACIÓN.

INTRODUCCIÓN.

El vino es una bebida que se obtiene mediante fermentación alcohólica del sumo
de la uva fresca. Los <vinos> preparados a partir de otros frutos, como manzanas y
grosellas, no deben llamarse solamente vinos, sino que debe aludirse a los productos
vegetales de que proceden. El vino debe prepararse a partir de uva fresca. Resulta esencial
que el vino se obtenga mediante fermentación y que contenga alcohol.

Una actividad que ha estado ligada a la mayoría de las culturas durante miles de años ha
sido la producción de bebidas alcohólicas.
Evidencias arqueológicas que demuestran que desde hace mas de 7000 años de
antigüedad los humanos aprendimos a encausar las fermentaciones alcohólicas de
diversos sustratos en forma empírica. Quizá las primeras bebidas se hicieron con base a
sustratos azucarados como jugos de fruta, ya que éstos sólo requieren ponerse en
contacto el jugo con la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta.
Fue hasta el siglo XV cuando empezó a popularizarse el arte de la destilación y de esta
forma aparecen las bebidas con mayor contenido alcohólico.
Debido a la gran importancia de estos productos la investigación científica y tecnológica
generan industrias, las cuales son de mayor importancia económica en el mundo.

3
HISTORIA.

En todas las etapas marcadas en la historia y aún antes de la prehistoria el vino a

acompañado al hombre. Se extendió por los imperios y su elaboración cuidadosa cayo en
el olvido durante unos siglos. El vino cruzo el océano hasta América buscando otras
tierras. El vino y el hombre son compañeros de más de 4000 años de antigüedad. En este
tiempo esta bebida de los dioses a estado presente en mitos y ritos, en leyendas y en el
arte, como parte de la cultura de los pueblos.

La producción de bebidas alcohólicas ha sido una actividad ligada a la mayoría de

las culturas durante milenios. Existen evidencias arqueológicas de más de 7000 años de
antigüedad.

Se dice que los egipcios descubrieron las bebidas alcohólicas fermentadas en

forma accidental ya que un rey egipcio mandaba a sus sirvientes a recolectar uvas y ellos
depositaban el apreciado fruto en recipientes de cerámica. Las mozas daban al rey en la
boca este apreciado fruto y nos relata la historia que uno de los recipientes de cerámica
en donde se encontraban las uvas (almacenadas durante un largo tiempo) desprendían
un olor extraño y que además se observaba dentro del recipiente un líquido azulado. Al
darse cuenta sobre esto el rey, prohibió que el recipiente fuera tocado y que no se
consumieran esas uvas, ya que el decía que se trataba de un “veneno”.

En una ocasión, una de sus mozas que se encontraba más tiempo al lado del rey
fue desplazada por otra de sus mozas mas joven y bella. La moza al darse cuenta del
desplazamiento que la nueva y bella joven había logrado, toma la decisión de quitarse la
vida bebiendo de dicho veneno. Todos se quedaron sorprendidos esperando la muerte
de esta mujer decepcionada, pero grande fue la sorpresa al ver que ella no agonizaba y lo
único que observaron en ella fue una inmensa alegría y una actitud fuera de control. A
partir de ese momento todos los que conformaban el reino de Egipto, probaron de esa
misteriosa sustancia y descubrieron las grandes virtudes que esta poseía.

En forma empírica los humanos aprendimos a encauzar las fermentaciones

alcohólicas de diversos sustratos. (García Gariba y Col. Biotecnología Alimentaria, 1993).
Probablemente las primeras bebidas se hicieron a partir de sustratos azucarados como
los jugos de frutas, ya que éstos sólamente requieren poner en contacto al jugo con la
levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta (Wacher y Col., 1990).

Las bebidas alcohólicas son compañeras constantes del hombre en su historia,

pero bien es cierto que su exceso es capaz de reducir nuestras sensibilidades, también es
verdad que tienen la virtud de animar el espíritu y de establecer atmósferas propicias para
la convivencia y la conversación, esto cuando se consume en la justa medida y con la
prudencia que caracteriza a quienes saben disfrutar de las cosas buenas de la vida.

CARACTERÍSTICAS GENERALES.

Las uvas que se utilizan para fabricar vinos son de origen Europeo debido a que
contiene eninas. Las eninas son compuestos químicos colorantes que se encuentran en la

3
mayoría de las uvas, por lo tanto juega un papel primordial el la coloración del vino. ( las
semillas le dan la coloración al vino). Un ejemplo del porque no todas las uvas, del mundo
se pueden utilizar para hacer vinos son las que proceden de Chile. Las uvas de Chile no
tienen la misma composición química que las Europeas, debido a que estas uvas
contienen enidinas en lugar de eninas. Las enidinas es un compuesto químico que
transfiere un sabor amargo, esto se debe a los factores ambientales como son: el clima, la
temperatura, composición del suelo, la presión atmosférica y la altitud.

Del tipo de uva recibe el título el vino, por ejemplo:

TÍTULO TIPO DE UVA

Gabinete Uvas maduras.

Cosecha tardía Uva recolectada tardíamente y en estado de completa madurez.
Cosecha selecta Sólo se utilizan uvas completamente maduras eliminando grados
enfermos e inmaduros.
Cosecha especial Empleo únicamente de granos sobre maduros o con putridez
Generosa.
Uvas pasas Sólo se utilizan granos arrugados con putridez generosa o bien
granos sobre maduros y también arrugados.
Vino Helado Las uvas deben estar congeladas en el momento de la vendimia y
por lo general se efectúa una prendimia y una vendimia tardía.

Dependiendo de la zona vitivinícola que nos encontremos, es lo que determina

el tipo de vino que se pretende elaborar e irá condicionado por una serie de factores
sociales que predisponen los gustos del consumidor, por lo que demanda el mercado
diferentes formas de presentar el producto para poder llegar a más público de edades
distintas y gustos variados. Los tipos de vinos son extremadamente amplios. Pueden ser:

o -Aromáticos o de aroma discreto.

o -Secos, semisecos, dulces o licorosos.
o -Tranquilos o espumosos.
o -Frescos y afrutado.
o -Rancios y maderizados.

Existen una serie de características que determinan el tipo de vino del que se trata.
Veamos:

o -Envejecidos en madera o conservados jóvenes en envases herméticos.

o -Según las uvas: si están poco maduras, muy maduras o sobre maduras.
o -Según su estado sanitario y nivel de podredumbre.

En la actualidad conocemos la incidencia que sobre los compuestos volátiles de

un vino tienen los tratamientos que se realizan sobre la uva y el mosto. Dicho tratamiento
no sólo condiciona el resultado aromático final del vino elaborado sino que además,
repercuten en el desarrollo de la fermentación y en las posibles desviaciones o

3
ralentizaciones de la misma.

LEVADURAS UTILIZADAS.-

Otro factor importante son las levaduras, de composición muy sencilla, son células
redondas ovaladas y elípticas envueltas en una membrana muy fina elástica cuyo
diámetro es de 0.014 mm. El interior de dicha célula es incolora y a veces presenta un
aspecto granular, el protoplasma se encuentra situado junto a la pared celular y en su
interior aparece una o varías vacuolas que contienen el jugo celular.
Esta demostrado que las distintas levaduras difieren entre sí y que no todas las
especies de levaduras producen el mismo tipo de fermentación, presentando cada una de
ellas características propias, las levaduras más importantes para la fabricación de vino
son las comprendidas dentro del género saccharomyce y dentro de éstas encontraremos
a la Saccharomyce cereviseae var. Ellipsodeus.

Por otra parte la fermentación producida por levadura de uva origina valiosas
sustancias aromáticas que son las responsables del bouquet.

Las levaduras auténticas se encuentran en cualquier lugar de la naturaleza y

abundan en las regiones vitícolas. Persisten en formas de esporas en las capas
superiores de la tierra de los viñeros hasta que la lluvia y el viento y los insectos las
transportan a fines de verano y en otoño y después de ahí al mosto.

Las uvas que aún antes de haber madurado por completo han sido picadas y
estropeados por avispas y pájaros, constituyen auténticas incubadoras de gérmenes
fermentativos. Muchas de estas células de levadura crecen a través de la tierra y forman ahí
nuevas esporas que persistirán a lo largo del invierno.

La formación de alcohol y el desplazamiento de aire por medio del bióxido de

carbono que se está formando impide el desarrollo de los hongos formadores de micelios,
las levaduras superficiales y a la mayoría de las bacterias, triunfando así las levaduras
auténticas.

Las levaduras auténticas se producen por gemación, en condiciones favorables

formándose a un lado de las células de las levaduras, uno o varios brotes que al cabo de
pocas horas alcanzan la dimensión de la célula madre y se desprenden de ellas. Existen
diversos tipos de microorganismos de interés industrial, que varía de acuerdo al tipo de
fermentación que se quiera realizar, como son los siguientes:

Tipo de fermentación. Microorganismos que intervienen

Fermentación acética Acetobacterias

Fermentación alcohólica Saccharomyce cerevisae
Fermentación butílica Clostridium s.p.p.
Fermentación cítrica Aspergillus s.p.p
Fermentación láctica Lactobacillus s.p.p.

3
PIE DE CUBA.

El proceso de vinificación consiste desde la recolección de las uvas conocidos

como vendimia hasta el producto terminado (vino). La vendimia se conoce como la
recolección de las uvas. La vinificación es la serie de operaciones físicas enzimáticas que
transforman el jugo de las frutas en vino. La vinificación comienza con la trituración del
vino (hollaje) y continua con el despalillado (eliminación de escobajo). A continuación se
describen la etapas generales.

La Vendimia.- El período de recolección se prolonga, en el Penedés, de agosto a

octubre, según la época de madurez de las distintas variedades que se cosechan. La
vendimiadora mecánica se utiliza hoy en algunos viñedos para acelerar las labores de
recolección y transportar las uvas al lagar en el momento óptimo de madurez.
Las vendimias se acarrean en tolvas o en pequeñas cajas, evitando siempre la
oxidación de los mostos.
Estrujado, escurrido y prensado.- Cuando las vendimias llegan a la bodega se
procede al estrujado de la uva, liberando así el primer mosto.

El escurrido puede realizarse de dos formas:

1.- Estática: deslizando el mosto, por gravedad, entre los partes sólidas (hollejos,
pepitas, escobajos) de la vendimia.

2.- Dinámica: haciendo circular toda la masa de vendimia por un tornillo sin fin
que extrae el mosto.

La utilización de modernas prensas horizontales -movidas incluso por leve

presión neumática e hidroneumática- permiten exprimir delicadamente los mostos.

Clarificado.- Los mostos turbios deben ser clarificados para obtener vinos
limpios y de la máxima finura aromática. Las burbas o impurezas se eliminan por
decantación, dejando reposar los mostos en los depósitos. Pero las técnicas más
perfectas y modernas permiten la utilización de filtros y máquinas centrifugadoras que
eliminan los sólidos por medios estrictamente físicos y naturales, sin utilizar ningún
aditivo.

La fermentación de los Vinos Blancos.- Las levaduras depositadas en la piel

de la uva provocarán la fermentación alcohólica, o sea, la transformación del azúcar en
alcohol y anhídrido carbónico. Las levaduras seleccionadas pueden garantizar el
desarrollo más natural y completo de este proceso.

La fermentación aromática de los delicados mostos se realiza, generalmente, en

depósitos, eliminando así las lías sedimentadas en el proceso anterior.

La fermentación y maceración de los Vinos Rosados.- Las vendimias tintas

3
deben ser despalilladas y estrujadas para que los hollejos puedan macerarse en los
mostos, extrayendo así el color y los aromas.

Los vinos rosados permanecen sólo unas horas en contacto con sus hollejos,
hasta que se ha extraído la coloración deseada, luego, prosiguen su fermentación en los
depósitos de acero inoxidable sometidos a estricto control de temperatura.

La fermentación y maceración de los Vinos Tintos.- Las vendimias tintas,

despalilladas y estrujadas, fermentan en los depósitos de acero inoxidable, a temperatura
controlada. La perfecta maceración de los hollejos en el mosto permite la extracción del
color y de los aromas. Al terminar la fermentación alcohólica y la maceración, los tintos se
someten a la fermentación maloláctica que afina el paladar de los vinos mediante la
transformación del duro ácido málico en suave ácido láctico.

El vino de prensa se obtiene mediante el prensado de los hollejos y se añade

luego al "assemblage", en mayor o menor proporción, según las características de la
cosecha.
Se utilizan hoy delicadísimas técnicas para elaborar vinos tintos más finos y
genuinos: maceraciones carbónicas, utilización de depósitos autovaciantes, vinificación de
cada variedad por separado.

Crianza de los Vinos.- La mayor parte de los vinos blancos son vinos jóvenes,
embotellados en pleno esplendor frutal. Todos ellos exhiben en su etiqueta o en su
collarín la añada.

Se elaboran también algunos excelentes blancos de crianza, añejados en barrica

de roble aromático y nuevo.

Algunos tintos jóvenes y frutales reciben una ligera crianza en roble nuevo que no
se prolonga más del tiempo justo para redondear sus taninos y ceñir su cuerpo, sin
castigar su expresión varietal.

Los tintos añejos tradicionales y las nobles reservas permanecen un mínimo de

15 meses en barrica de roble y botella. Pero el carácter distintivo de la moderna enología
del Penedés estriba, precisamente, en la flexibilidad y veracidad de las normas. Teniendo
como único objetivo la garantía de calidad, muchos tintos del Penedés no se limitan hoy a
pregonar los records de su permanencia en madera; sino que declaran sus credenciales
fiables de crianza, beneficiándose del aporte aromático del roble nuevo y de las maderas
más selectas (Limousin, Ailier, Trongais, etc.); y prolongando luego su maduración en
barrica de roble de 3°o 4º año y en botella.
PROCESO DE INDUSTRIALIZACIÓN.

En la elaboración de vinos intervienen numerosas variables, no sólo en lo que se

refiere a la variedad, siendo muy importante realizar las técnicas adecuadas para la
obtención de un buen cultivo, sino también el estado sanitario de la uva. Por eso, es
conveniente realizar una serie de pasos que les avanzamos a continuación y que
trataremos a lo largo de esta unidad.

3
 1. -Control de la Maduración.
2. -Transporte de la vendimia.
3. -Recepción en bodega y toma de muestras.
4. -Extracción del Mosto.
5. -Maceraciones prefermentativas.
6. -Corrección del Mosto.
7. -Separación de Fangos.
8. -Comportamiento Fermentativo.
9. -Fermentación en Barrica.
10. -Acabado de la fermentación Alcohólica .

1.- Control de la maduración.- Se realiza un control de maduración en viña para

conocer el momento óptimo de maduración fénolica en la uva. Los análisis de grado Brix
que determinan el azúcar contenido en la uva ,(la concentración de los azúcares
superiores a 200mg/l pueden originar problemas para desdoblar los últimos gramos de
azúcar con el riesgo que repercute en la fermentación), y los análisis de taninos-
antocianos, que determinan el equilibrio y estabilidad posterior de los vinos, y cuando
estos parámetros son los adecuados para la recolección.

También se examina la evolución del pH y la acidez total. Los parámetros óptimos

son muy difíciles de conseguir al mismo tiempo, pero haciendo un seguimiento exhaustivo
podremos determinar con gran exactitud el momento adecuado de recolección en nuestro
viñedo. Sirve de gran ayuda el control de la materia nitrogenada. En un inicio de
fermentación alcohólica para la formación de las estructuras celulares las levaduras, que
son las responsables de la transformación del azúcar contenido en el mosto, el alcohol,
necesitamos al menos de 180 mg/l de nitrógeno fácilmente asimilable,(sales amoniacales
y aminoácidos, fundamentalmente la arginina).

La falta de dichos nutrientes puede originar ralentizaciones e incluso paradas en la

fermentación. Es recomendable, en estos casos, el uso de activadores amoniacales justo
al inicio de la fermentación.

2. - Transporte de la vendimia.-Para potenciar la calidad de los vinos, el

procesado de la vendimia debe realizarse lo más rápido posible, llegando los racimos casi
intactos para evitar maceraciones incontroladas e inicios de fermentaciones. Lo ideal son
cajas de 20 Kgs. Si el transporte se realiza en remolque, se recomienda no llenarlos
demasiado para que el peso de las uvas no sea capaz de aplastar las que se encuentran
debajo.

En la actualidad, domina un concepto ya implantado en todas las bodegas; se

prefiere tratar los mostos para no tener que tratar los vinos. Cada vez se van
acondicionando las bodegas para la recepción de la uva en un proceso rápido y aplicando
la tecnología adecuada a las necesidades de la uva en ese año, como por ejemplo, el
enfriar las uvas. Sin embargo, la técnica más adecuada es escoger el momento del día o
de la noche en que la temperatura es más baja, sobre todo, en la vendimia mecánica. Si
no es posible se puede recurrir a sistemas como gas inerte o productos estabilizantes con el

3
fin de que la uva llegue sin contaminación microbiana a la bodega para su posterior inicio
de fermentación en los depósitos.

3.- Recepción en bodega y toma de muestras.- Al llegar a la bodega se extraerá

una muestra representativa del conjunto de cajas o del remolque para cada entrada de
uvas. El enólogo o técnico responsable será quien determine, después de analizar la uva,
al depósito que va a ir destinado para su fermentación, ya que puede desviar
dependiendo del estado sanitario de la uva u otros criterios a distintos depósitos de
fermentación.

4. La extracción del mosto.- El sistema ideal de obtención del mosto sería

someter a la uva a presiones moderadas y pequeñas durante tiempos determinados y en
función de los rendimientos de la uva en ese año. Además, con el menor roce posible
entre las partes sólidas del racimo (hollejos, orujos, raspón,) con las superficies de presión.

Para obtener el mosto se ha de trabajar en un equilibrio que nos permita conseguir

los aromas agradables, sin extraer los herbáceos (hexanol y aldehídos C6). Es decir,
disponer de sistemas que favorezcan únicamente los intercambios positivos entre zumo y
partes sólidas.

La mejor obtención del mosto se consigue combinando la rotura mecánica de la

pared celular con la degradación enzimática. Para respetar la calidad de la primera
fracción del "mosto flor" se han de vinificar por separado, ya que los mostos obtenidos de
las últimas fracciones del prensado originarán vinos más bastos, con más polifenoles,
mayores notas herbáceas, así como un contenido más bajo de acidez total. Esta
vinificación se hará por salificación parcial del tartárico con el potasio del escobajo y un
aumento en coloides (polisacáridos y proteínas).

El sistema mecánico para obtener el mosto flor se consigue a través de una

estrujadora de rodillos de caucho o de prensas neumáticas de membranas. Estas últimas
consiguen mejores resultados en la calidad del mosto.

5. Esquema del sistema de obtención del mosto .- Veamos los pasos a seguir
para la obtención del mosto.

A) Tolva de recepción: las hay en acero inoxidable, asimétricas, con diámetro y

paso de sinfín grande o con motovariador de velocidad. Es aconsejable poca longitud del
sinfín ya que a menor vueltas y longitud, menor rozamiento y por tanto mayor calidad.

B) Despalilladoras Horizontales: las hay en acero inoxidable con rotación del

tambor y eje en sentido contrario. Éstos con el menor número de aristas posible
(superficie redonda). Preparadas con motovariador de velocidad, con el fin de poder
regular el menor número de vueltas, en el cual el raspón sale limpio, lo que lleva consigo
una menor lesión al raspón, hollejos, etc. Tienen que estar preparadas para despalillar en
el porcentaje deseado.

C) Estrujado: el estrujado tiene como fin romper los hollejos y desprender la

pulpa. El estrujado debe ser el suficiente como para facilitar la separación del zumo, pero

3
no debe ser violento con el fin de no desgarrar y dilacerar las partes sólidas. Las
estrujadoras de rodillos de caucho son las más recomendadas. La ventaja del no
estrujado es la de producir un mosto que contiene pocos fangos ya que elimina toda
trituración de la vendimia y es menos sensible a la oxidación porque es menos rico en
polifenoloxidasas. Esta ventaja sólo se manifiesta cuando el prensado se hace
correctamente, es decir, lentamente y con presión progresiva.
D) Bomba de vendimia: se recomiendan dos tipos de bombas por el
comportamiento respecto al buen trato que dan a la pasta y son:

-Peristáticas: tienen bastante capacidad (dan altura o presión); la pasta no tiene

ningún rozamiento. Sin embargo, su mantenimiento es muy costoso.

-De leva excéntrica: menor altura manométrica, rozamiento tangencial, no eleva

líquidos, pero necesita poco mantenimiento y tiene un menor precio.
E) Escurridores o Patines: su misión es separar el zumo liberado por el estrujado
e interviene inmediatamente después de esta operación. Se distinguen dos escurridos:

-Estático: se efectúa por simple reposo de la vendimia estrujada.

-Mecánico: es el más rápido. Cuando se trabaja con grandes volúmenes de

vendimia este sistema permite obtener mostos sin excesivo fango y facilita el prensado
por la hidrólisis de las pectinas. Sin embargo, provoca un aumento de la oxidación de los
mostos, por los que es más conveniente utilizar el sistema estático. Los hay con cilindro
giratorio y con sinfín inclinado que conduce la vendimia estrujada por una especie de
canalón perforado. En estas instalaciones el escurridor se coloca bajo la estrujadora y se
alimenta directamente por gravedad.

F) Prensado: su misión es extraer el mosto por medio de la presión ejercida sobre

la vendimia una vez estrujada y escurrida. Con ello se consigue la desecación del hollejo.
Para este trabajo se pueden utilizar diferentes máquinas prensadoras:

- Prensas horizontales: trabajan por rotación y acercamiento de dos platos

móviles. Tiene unos programadores que modifican la velocidad del prensado y lo detienen
cuando alcanzan una determinada presión, procediendo automáticamente al
desmenuzado de los orujos.

- Prensas neumáticas: trabajan por medio de inflamiento de una bolsa axial

interior de caucho grueso. La bolsa oprime la vendimia contra la jaula cilíndrica de acero
inoxidable. El inflamiento se efectúa por medio de un compresor de aire. El prensado se
consigue por los presión que libera el pastel de los orujos y por la rotación de la jaula de
acero. Son las más utilizadas para la obtención de mostos de calidad.

- Prensas continuas: trabajan a través de un sinfín helicoidal o tornillo de

Arquímedes que empuja a los orujos formando un espeso tapón contra un obturador móvil
provisto de contrapesos. Las prensas continuas poseen un husillo de gran diámetro que
tiene rotación lenta y un sistema de regulación automática de presión. Disponen de
distintas salidas de mosto que aseguran el fraccionamiento según la calidad. Aunque la
extracción del mosto es muy rápida, es un prensado violento y hace una trituración

3
excesiva de los orujos. La mejor cadena de trabajo es siempre la más corta, aquella que
trasforma la uva en mosto en un tiempo mínimo, la que proporciona un mosto menos
turbio y menos sensible a la oxidación.

6. Maceraciones prefermentarias.- La maceración prefermentaria, también

conocida con el nombre más común de maceración pelicular, es un sistema utilizado en
algunas regiones vitivinícolas como práctica de elaboración de caldos en un sistema
tradicional. Pero, paralelamente a la extracción de aromas, el mosto se enriquece en
sustancias astringentes y desagradables, potencialmente peligrosas para la evolución del
vino, como polifenoles que aceleran el pardeamiento. Una práctica muy utilizada es la
maceración a baja temperatura durante un tiempo corto, en función de las características
varietales. Cuando se realiza una maceración pelicular podemos obtener unos resultados
muy satisfactorios que son:

- En mosto macerado aumenta la densidad y el grado Brix.-

- La acidez total se mantiene o eleva ligeramente, mientras que el pH aumenta
conforme lo hacen los tiempos de maceración. Los tiempos de maceración
breves ( 4 y 6 horas ) presentan un efecto poco significativo con respecto a los
no macerados, por lo que es conveniente alargar los tiempos de maceración de
9 a 12 horas para obtener un aumento de componentes aromáticos y tener mejor
estructura en boca.
- Cuando no hay posibilidad de bajar las temperaturas y se quiere realizar una
maceración pelicular se puede recurrir al empleo de preparados enzimáticos de calidad
que acortan los tiempos de maceración.

7. Corrección del mosto.- Una vez obtenido el mosto, haya o no maceración

prefermentativas, hemos de adicionar anhídrido sulfuroso lo antes posible. En cuanto el
mosto se separa, por escurrido o prensado, aumenta la acidez con la adición de ácido
tartárico hasta niveles de 5 - 5, 5 gr/l (expresado en ácido tartárico), lo que confiere al
mosto y después al vino una cierta estabilidad biológica. Esta operación es más
aconsejable realizarla tras el desfangado. El anhídrido sulfuroso ejerce una serie de
acciones importantes; como son:

- Antimicrobiana frente a levaduras y bacterias.

- Solubilizante de antocianos (en elaboración de vinos tintos).
- Acción antioxidante.
- Antioxidásica, inactivando enzimas polifenolixidásicas.

Antiguamente el sulfatado de la vendimia era determinado en función del estado

sanitario de las uvas, de la temperatura y del pH de los mostos. En la actualidad se tiende
a disminuir la dosis de SO2 en vendimia, ya que se controla la obtención de uvas sanas, y
una rigurosa higiene en todo el proceso y materiales utilizados.

Por el contrario, nunca se debe de sulfatar la vendimia ya estrujada puesto que es

una operación menos eficaz, ya que al anhídrido sulfuroso forma combinaciones estables
con los compuestos con grupos carbonílicos C=O que se generan durante la
fermentación: Etanal, ácido pirúvico, ácido 2-cetoglutárico, ácido glioxílico, ácido
oxalacético, con lo cual disminuye notablemente el SO2 libre que es el que ejerce la

3
función de protección en el mosto. Controlando la adicción de sulfuroso al mosto se podrá
utilizar una cantidad mucho menor en el vino para conseguir la mismo cantidad de
sulfuroso libre. La dosis necesaria de anhídrido sulfuroso puede variar de 6 a 12 g por Hl.
Estas consideraciones son para vinos de calidad obtenidos a partir de mosto flor, ya que
en vinos de prensa exigen por su distinta composición mayor cantidad de sulfuroso.

8. Separación de fangos.- Los fangos están constituidos por residuos terrosos,

fragmentos de raspones y hollejos, sustancias pépticas y mucilaginosas, en fin, proteínas
precipitadas por contactos establecidos con sustancias localizadas en puntos diferentes
de los granos de las uvas. La cantidad y naturaleza de los fangos depende de la uva, de
su estado de maduración y podredumbre, y de la técnica de obtención del mosto.

9. Comportamiento fermentativo.- Como se ha explicado anteriormente la

clarificación de los mostos blancos es imprescindible para la obtención de buenos vinos,
pero el desfangado puede originar una serie de riesgos que el enólogo puede solventar
con ayuda de coadyuvantes de fermentación específicos para cada proceso. Una vez
ajustada la dosis de activadores al mosto, realizamos una siembra de levaduras
seleccionadas, lo cual nos encontramos en las últimas operaciones prefermentativas.

En los "Estudios sobre el vino " PASTEUR escribió que "Las cualidades del vino
dependen en gran parte de la naturaleza específica de las levaduras que se desarrollan
durante la fermentación de los mostos". Así, podemos pensar que, al someter a un mismo
mosto a la acción de levaduras distintas se lograrán vinos de distinta naturaleza. La
garantía que tiene el enólogo al utilizar las levaduras secas seleccionadas es que le
permite un buen manejo, tienen dificultad para su contaminación y la inoculación de una alta
población viable.

Una vez trascurridos estos procesos, lo ponemos a fermentar en tanque o

depósitos de acero inoxidable que pueden variar en su capacidad de volumen, pero
siendo más aconsejable depósitos con capacidades más reducidas, es decir, 5000 l a
50.000 l. Estos depósitos tienen que estar preparados con camisas de frío a diferentes
alturas para que así el depósito esté uniformemente repartido en las frigorías .

También se pueden utilizar camisas interiores para depósitos que no hay

posibilidad de acondicionar exteriormente. La temperatura de fermentación será variable
en función de las distintas variedades, pero siempre es aconsejable una temperatura
entre 15-20 ºC. Si bajamos la temperatura de fermentación se repentizará varios días más
su terminación, pero siempre obtendremos mejores aromas a bajas temperaturas. Este
proceso durará aproximadamente unos 15 a 20 días hasta en final de la fermentación
alcohólica.

10. La fermentación en la barrica.- La función principal de la fermentación de

mostos en barrica es la obtención de vinos más estructurados y elegantes con matices de
madera que armonizan en boca su cata. Se realiza el llenado de las barricas con mosto
blanco sin terminar su llenado para evitar que se derrame en la fermentación más
tumultuosa.

En algunas regiones vitivinícolas el llenado de las barricas se realiza cuando el

4
mosto ha descendido su densidad entre 1000-1010, fermentado en una primera fase en
depósito para evitar que se produzcan derrames en las barricas. Por ello, una vez que ha
pasado esta fase se termina su fermentación en barrica y su posterior crianza sobre lías
finas.

Existen otras alternativas a las barricas, que ya se están utilizando en algunos

países con una reducida tradición vitivinícola, y se conoce con el nombre de Inserstave.
Este sistema utiliza en el interior del depósito de acero inoxidable unas tablas de madera
de roble francés o americano que tienen el mismo tratamiento que la madera utilizada
para la construcción de barricas, y que se colocan con una estructura de acero inoxidable
dentro del depósito, realizando las mismas condiciones que aporta la barrica con ayuda
de un aparato microoxigenador.

Con la utilización de este sistema podemos fermentar el mosto desde el inicio

hasta el final de la fermentación alcohólica, controlando la temperatura y su posterior
crianza sobre lías finas. En la región vitivinícola de La Borgoña tienen mucha tradición los
vinos blancos fermentados en barricas de roble francés.

11. Acabado de la fermentación alcohólica.- Si la marcha de la fermentación

alcohólica está bien definida por la toma de densidad, el densímetro no basta para decidir
sobre el final de la transformación de todo el azúcar contenido en el mosto en alcohol.
Para ello, hay que recurrir a análisis químicos y averiguar los azúcares reductores que
hay en el medio.

En algunas bodegas realizan la práctica de interrumpir la fermentación alcohólica

al final de su proceso para así, obtener vinos dulces o semidulces, es decir, con 15 ó 20
gramos de azúcares reductores en el medio. Una vez terminada la fermentación
alcohólica se procederá a una segunda fermentación, si es necesaria, llamada
fermentación maloláctica, que se realiza sobre todo en vinos con un contenido ácido
málico muy alto.

Esta fermentación se realiza para conseguir la transformación del ácido málico en

láctico. El resultado de estos vinos es muy bueno ya que los suaviza de esa acidez tan
marcada que tenían los vinos al término de la fermentación alcohólica. Si el vino no es
apto para la fermentación maloláctica se procederá a un trasiego inmediato con un aporte
de sulfuroso de 4 a 6 gr/ Hl, de tal manera que la dosis de anhídrido sulfuroso libre
después de la combinación sea del orden de 20 a 30 mg por litro.

Si el contacto con la lía en depósitos grandes es muy prolongado aparecerán los

olores a sulfhídrico (a huevo podrido).

Clarificación del vino.-

El gusto de los consumidores del vino se ha ido desplazando cada vez mas hacia
los vinos jóvenes y frescos. En la actualidad se prefieren vinos brillosos y claros,
completamente resistentes al aire.
El enturbiamiento del vino se puede eliminar por: clarificación, filtración y
centrifugación. Los tres procedimiento son eficaces proporcionando buenos resultados si

4
 se utilizan correctamente. El vino se puede clarificar con tierra de España o caolín. Estas
se utilizan para clarificar los vinos dulces y para el tratamiento del vino viscoso en dosis
de 100 a 4000 gr., por hectolitro ( 100-400 gr / Hl).
La tierra de España o Caolín es el silicato de aluminio hidratado y es un producto
que se obtiene de las ricas feldespatiferas.

A).- Bentonita.

Clarifica los enturbiamientos por precipitación de albúminas con materias de tipo

de Caolín, la bentonita es un complejo de silicato de aluminio, Mg, Ca, , de origen
volcánico. De acuerdo a la intensidad del enturbiamiento las necesidades del bentonita
son:
Enturbiamiento débil, igual de 50 a 100 gr./Hl .
Enturbiamiento medio de 100 – 200 gr / Hl
Enturbiamiento intenso de 200 – 400 gr de bentonita /Hl

B).- Carbón Activado.-

Es el carbón vegetal ( de madera) y carbón animal (de hueso). El carbón activo se
utiliza para decolorar los vinos y baja la concentración del sabor y color.
El vino de matiz amarillento obscuros se utiliza una cantidad de 10 a 15 gr/Hl para
decolorar vinos pardos se emplea de 15 a 30 gr/Hl .

Composición del zumo de uva.-

a) H2O 750-850 g/l

b) Contenido de azúcar 120g/l (glucosa, fructosa y sacarosa).
c) Ácidos:
-Ácido tartárico.
- ácido málico.
- Ácido cítrico.
d) sustancias minerales. Fosfato de potasio, calcio, magnesio, cloruros, sulfatos y
silicatos.
e) Sustancias nitrogenadas.
- Proteínas (albúminas y globulina) pentosas y aminoácidos.
f) Taninos y minerales colorantes.
- antocianonas, enina.
g) aceites, grasas y ceras
- Vitina.
h) fermentos.
-(enzima) oxidasas.
i) Sustancias responsables del color, sabor y aroma, aceites especiales.

ESPECIFICACIONES DEL VINO MINIMO MÁXIMO

Grado alcohólico GL real a 15 °C 9.0 14

Extracto seco reducido 15
Cenizas g/l 1.0
4
Acidez total (como ácido tartarico g/l) 4.5 10
(Como ácido acético ) 1.2
acidez fija (como ácido tartarico g/l) 4.0
metanol mg/100 ml de alcohol 100 % 300
bióxido de azufre total mg/l 300

Características fisicoquímicas de los vinos de acuerdo a las normas mexicanas

NOM.1991.

UNIDAD 6.- FERMENTACIÓN LÁCTICA

CARACTERÍSTICAS GENERALES, ETAPAS Y REACCIONES QUÍMICAS DE LA

FERMENTACIÓN LÁCTICA.

INTRODUCCIÓN.

Los lactobacillus, son bacterias que utilizan la fermentación láctica para obtener
energía; estos organismos transforman la lactosa de la leche en glucosa y posteriormente
en ácido láctico. Este proceso tiene importancia industrial ya que se utiliza en la
fabricación de yogurt.

El ácido láctico también lo podemos producir en nuestro cuerpo. Un ejemplo es la

acumulación de ácido láctico en tejidos humanos, lo podemos apreciar después de un
ejercicio intenso, el ácido láctico se acumula en las células musculares provocando dolor,
el cual va desapareciendo poco a poco, conforme el ácido láctico pasa a la circulación
sanguínea y llega al hígado donde se transforma nuevamente en ácido pirúvico.

El ácido láctico se produce en muchas bacterias (bacterias lácticas), también en

algunos protozoos y en el músculo esquelético humano. Es responsable de la producción
de productos lácteos acidificados ---> yoghurt, quesos, cuajada, crema ácida, etc. El ácido
láctico tiene excelentes propiedades conservantes de los alimentos.

Historia.-

El alcohol láctico fue descubierto por Schell en 1780. Después de haber

examinado muy detalladamente los resultados de anteriores investigadores y sus
deducciones, Luis Pasteur llegó a conclusiones completamente diferentes.

Sus últimos trabajos le permitieron establecer que existe una levadura láctica que está
siempre presente cuando hay transformación de azúcar en ácido láctico, especialmente
en una materia azoada, elemento indispensable para el desarrollo de una fermentación.

Pasteur observaba que en la fermentación láctica se podía ver a menudo, en la

parte superior, un depósito de cal y materia azoada, formado por unas manchas de
sustancia gris en suspensión que se distinguía perfectamente del resto. Pensaba que esa
materia gris desempeñaba un papel importante, lo que le llevó a separar la levadura de su

4
parte soluble, manteniéndola en el punto de ebullición con aproximadamente 1/5 de su
peso en agua.

Luego, disolvió nuevamente en esa solución unos cien gramos de azúcar por litro,
filtrándolo con mucho cuidado. La solución se mantenía en una estufa a una temperatura
de 30 a 35 grados. Hizo pasar una corriente de ácido carbónico por el frasco para eliminar
el aire y aproximadamente 24 horas después se produjo un cambio: el líquido se agitó y la
cal desapareció, formándose un depósito que aumentaba sin cesar.

Según los trabajos de Pasteur, es evidente que la levadura láctica proviene de la

atmósfera. Si se suprime todo contacto con el aire o se pone en ebullición el medio
sintético (creado por el científico y donde había azúcar, sal de amoniaco, fosfato y cal),
dejando entrar aire que atraviesa un conductor calentado al rojo vivo, no se desarrolla
ninguna levadura ni organismo vivo.

Para este experimento, Pasteur había creado un medio artificial que podía ser
reproducido en su totalidad, eliminando de ese modo numerosas causas de errores. Hoy
en día, la diferencia de medios -medios controlados-, todavía se utilizan de forma habitual
en todos los laboratorios de biología, química-biología y microbiología.

De 1857 a 1862, Luis Pasteur estudió las fermentaciones láctica y alcohólica

demostrando que:

1.-Toda fermentación es debida a la presencia de un microorganismo; a cada

fermentación le corresponde un fermento particular.

2.- De igual modo, constató que para estudiar una fermentación había que
preparar un medio de cultivo apropiado al fermento y estéril; sembrar ese medio con una
traza de fermento puro.

La fermentación láctica es utilizada por numerosos microorganismos, así como por

organismos superiores cuando el oxígeno está limitado (por ejemplo en el músculo,
durante una actividad intensa). Conduce a la formación del ácido láctico, interviniendo en
la producción de quesos, yogures, etc.

MICROORGANISMOS ÁCIDO LÁCTICOS.

Las bacterias lácticas son cocos y bacilos de longitud variable y de un grosor de 0,5-
0,8 micrómetros. Se trata de un grupo de bacteria fisiológicamente uniforme, de pared
Gram-positiva, que sólo utilizan sus substratos, predominantemente azúcares, de manera
fermentativa con formación de ácido láctico. Carecen de actividad respiratoria porque les
falta una enzima (citocromo catalasa) que contenga un grupo hemina, que les permita
poner en marcha «cadena respiratorias con el oxígeno como aceptor de electrones«

A pesar de su metabolismo anaerobio, son aerotolerantes, en los medios de cultivo

sólidos forman colonias en presencia aire

4
 Otra característica importante son sus complejas necesidades de nutrientes.
Ninguna bacteria láctica crece en un medio constituido exclusivamente por sales
minerales, azúcar y sales amónicas como única fuente de nitrógeno. La mayoría necesita
distintas vitaminas del grupo B (lactoflavina, tiamina, biotina, ácido nicotínico, ácido
pantoténico, ácido fólico) y varios aminoácidos.

Como su crecimiento disminuye linealmente en condiciones estándar en función

de la concentración del nutriente presente en concentraciones subóptimas, desde hace
tiempo se cultivan para realizar ensayos microbianos específicos y sensibles a la
presencia de pequeñas cantidades de vitaminas o aminoácidos en los alimentos. Por ello
se cultivan en medios complejos con abundante extracto de levadura, zumo de tomate o
lactosuero.

Debido a sus requerimientos nutricionales complejos y a su metabolismo

anaerobio se encuentran de manera espontánea principalmente en tres lugares:

En la leche y productos lácteos, en plantas intactas o trasplantadas y también en el

intestino y mucosas de los animales y del hombre, donde se encuentran como:
simbiontes, adventicias o patógenas.

Debido a que sintetizan intensamente ácido láctico y a su tolerancia a la acidez

(pH 4-5), en medios adecuados se imponen rápidamente a otros microorganismos con lo
que se consigue fácilmente su enriquecimiento.

Para conseguir un mejor crecimiento durante su cultivo conviene detener la

producción de ácido añadiendo carbonato calcio.

Hay un gran grupo de bacterias que incluyen las que fermentan los azúcares a
ácido láctico preferentemente, es decir, un 90 % o más.

Estas bacterias lácticas que en la fermentación originan un único producto se

engloban bajo el nombre de homofermentativas

Existe, además otro grupo fisiológico formado principalmente por especies de

Lactobacillus que como productos de la fermentación originan un 50 % de ácido láctico y
un 30 % de ácido acético o etanol y un 17 % de CO 2 estas especies productoras de gas
se denominan bacterias lácticas heterofermentativas.

Como consecuencia de sus características morfológicas ya no se incluyen todas

las bacterias lácticas en la familia Lactobacillaceae.

Los cocos constituyen su propia familia la de estreptococaceae, mientras que la

especie Sporolactobacillus inulinus que forma endospora termorresistentes, al igual que
las especies del género Bacillus se encuadra en la familia Bacillaceae

Las bacterias lácticas homofermentativas, es decir, las especies del género

Streptolactobacillus y una parte de las especies de los géneros lactobacilus y
Sporolactobacillus degradan la glucosa ácido pirúvico por la ruta de la fructosa bifosfato,

4
de manera análoga a las levaduras del vino y la cerveza.

RUTAS METABÓLICAS.

En la unidad denominada “Fermentación Alcohólica”, hemos detallado la ruta de la

glicólisis. El piruvato (o moléculas derivadas del piruvato) se encuentra disponible luego
del proceso de glicólisis.

Glucosa + 2ADP Ácido piruvico + NADH + H+ ácido láctico + NAD+

Como no poseen piruvato descarboxilasa, transfieren el hidrógeno formado por acción

de la fosfotriosa-deshidrogenasa a ácido pirúvico con ayuda de nicotinamida-adenin
dinucleótido (NAD) y lo transforman así en ácido láctico.

Rendimiento energético de la fermentación láctica.- Si comparamos el rendimiento

de la fermentación láctica con respecto a la alcohólica, observamos que la fermentación
láctica es mucho más eficiente a condiciones estándares. Debido a que se requiere mecho
menor energía para la formación de ácido láctico.

FERMENTACIÓN LÁCTICA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

C6H1206 + 2ADP + 2Pi C6H1206 + 2ADP + 2Pi

2C3H603 + 2ATP + 2H2O 2C2H50H + 2ATP + 2CO2

0'
DG = - 47 kcal/mol DG0' = - 56.3 kcal/mol

Rendimiento energético (cond. estándar): Rendimiento energético (cond. estándar):

(14.6/47)x100 = 31 % (14.6/56.3)x100 = 26%

4
 La enzima lactato-deshidrogenasa, que reduce el ácido pirúvico a ácido, tiene una
estereoespecificidad distinta según la especie bacteriana. Por ello algunas bacterias sólo
forman ácido láctico dextrorrotatorio [D-(-)] y otras, por el contrario, levorrotatorio[L-(+)]. Hay
bacterias que sintetizan además la enzima lactato-racemasa que lleva a cabo la
interconversión de las dos formas ópticamente activas.

En presencia de oxígeno, también en las bacterias homofermentativas una pequeña

parte del ácido pirúvico (menos del 10 %) se descarboxila con liberación de C02,
transformándose en ácido acético, etanol o acetoína dependiendo de la especie.

Como las especies heterofermentativas de Laciobacillus no sintetizan ni aldolasa ni

triosafosfatoisomerasa no pueden llevar a cabo la degradación preliminar de los
azúcaressiguiendo la ruta de la fructosa bisfosfato, como hacen las bacterias
hornofermentativas. Se realiza, por el contrario, por la ruta de las pentosas-fosfato
(PP), que es común a la mayoría de las bacterias. En ella, la glucosa se transforma en
pentosa, que se escinde a acetato y fosfogliceraldehído.

Esquema de la heterofermentación ácido láctica.

4
 La glucosa se transforma en glucosa-6-fosfato con la ayuda del ATP y se oxida a
ácido fosfoglucónico gracias a la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. La 6-fosfogluconato-
deshidrogesa hidroliza el C, del grupo carboxílico del ácido 6-fosfogliicónico, formándose
ribulosa-5-fosfato Y C02, el primer producto de la fermentación. Una epimerasa
transpone los ligandos -H y -OH del C 3 de la ribulosa, formándose xilulosa-5-fosfato. Este
azúcar será escindido a acetilfosfato y gliceraldehído-3-fosfato por la fosfopentosa-
cetolasa con ayuda del coenzima tiaminopirofosfato (TPP) por adición de un anión fosfato
(Pi). El enlace fosfato rico en energía del acetilfosfato se transfiere al adenosindifosfato
con formación de ATP. Se libera así ácido acético como segundo producto de la
fermentación, que, a su vez, puede ser reducido a etanol por distintas especies gracias a
una aldehído alcohol-deshidrogenasa con la ayuda del NADH 2- Como en las bacterias
homofermentativas, el gliceraldehído-3-fosfato se transforma por el contrario, siguiendo la
ruta de la fructosabisfosifato, en ácido pirúvico, por deshidrogenación y con formación de
2 moles de ATP vía 1,3-difosfoglicerato y fosfoenolpiruvato El ácido pirúvíco por acción de
una lactato deshidrogenasa y del NADH2 se reduce también a ácido láctico. De este
modo, algunas bacterias lácticas heterofermentativas pueden reducir a glicerina parte del
gliceraldehído formado durante la degradación del azúcar. Las cepas que fermentan la
fructosa reducen tambien así en parte la fructosa con formación de manita. por ello muchas
bacterias lácticas pueden formar 5 – 6 productos de fermentación: ácido láctico, etanol,
ácido acético, CO2, glicerina y manita.-.

Para obtener ácido láctico puro por un proceso microbiológico, que es mas
rentable que la síntesis química se emplean únicamente bacterias homofermentativas
porque al no producir metabolitos secundarios, permiten unos rendimientos mayores.

Leches y hortalizas fermentadas.

Diferentes tipo de productos elaboradas a base de leche fermentada.-

La acidificación de la nata es uno de los procesos más importantes para la

elaboración de mantequilla de nata ácida.

La crema se inócula por cultivos constituidos por una mezcla de :

❖ 45 % Streptococcus cremoris y S.lactis.

❖ 10% Leuconostoc cremoris.

Además de los productos de la fermentación del ácido láctico, cuando se utilizan

los dos últimos microorganismos en la acidificación de la nata de forma diacetilo, que
confiere el deseado aroma a mantequilla. Se origina vía ácido pirúvico, metabolito
intermediario de la fermentación.

O OH CO2 H2O

4
H3C – C H3C-C-CO–CH3 H3C-CO-CO-
CH3

HOOC CH3CHO COOH ½ O2 diacetilo

Ácido Ácido
Pirúvico a-acetil-láctico

4
 Con Leuconostic cremoris se degrada también el ácido cítrico de la leche, vía
ácido oxalacético, a ácido pirúvico y este a diacetilo:

Los iniciadores acidificantes.-

Se obtienen por acidificación natural de la leche sin Pasteurizar. La leche fresca

sin pasteurizar se inocula con leche acidificada espontáneamente. Después de repetir
varías veces este proceso, se habrá desarrollado por enriquecimiento específico en
bacterias lácticas un cultivo iniciador cuya composición es la ya citada.

Su crecimiento posterior en leche que haya sido pasteurizada durante 1 hora a 85

'C tiene lugar en unas 18 horas si la temperatura es de 21 °C ,hasta que la cantidad de
ácido formada sea equivalente a un hidróxido sódico 0,1 M.

Después de eliminar la capa de nata, esta leche se emplea para acidificar

cantidades mayores y finalmente se añade en una proporción que suponga el 3-4 % del
volumen total del tanque de crema una vez llenado con crema fresca.

Estos tanques de maduración de la crema son rectangulares y tienen doble pared

y fondo hemiesférico para recoger el líquido.

La acidificación de la crema tarda de 16 a 30 horas. Los tanques de maduración

se mantienen a 18-20 °C durante 3-4 horas hasta el espesamiento de la crema, es decir,
hasta la coagulación de las proteínas de la leche. Después se deja que prosiga la
acidificación a 12-14 °C, hasta que se consigue un pH de 5.0 aproximadamente.

Durante el proceso se agita la crema con frecuencia con el fin de proporcionar el

oxígeno necesario para la síntesis del diacetilo.

A temperaturas más altas, la formación de aroma es insuficiente y la grasa

demasiado fluida como para hacer mantequilla.

La crema madurada se pasa a la batidora donde se bate hasta que se forma la

mantequilla. Además de grasa, puesto que se trata de una «emulsión plástica», la
mantequilla contiene un 13-16 % de agua y también las sales, proteínas lácteas y
productos del metabolismo de las bacterias lácticas.

El residuo líquido que separa es la mazada. Contiene casi la totalidad de las

bacterias de los géneros Estreptococos y Leuconostoc.

El Yogur.

Obtenido originariamente en los Balcanes a partir de leche de oveja o de cabra, se

elabora hoy sobre todo a partir de leche de vaca. Esta leche se pasteuriza a 85 'C, se
enfría a 50 'C y se inocula con un cultivo mixto de Lactobacillus bulgaricus Streptococcus
thermophilus. Ambas especies bacterianas necesitan calor, se desarrollan óptimamente
a 40 'C y no crecen por debajo de 15 'C. La leche inoculada se pasa a los envases en los
que vaya a ser comercializada y se incuba a 40 'C durante 9-12 horas hasta su

5
coagulación y hasta que tenga un contenido de ácido láctico del 1.0 – 1.5 %. Después se
enfría inmediatamente y se conserva en sitio frío hasta el momento de su venta, para
impedir una acidificación excesiva. L. bulgaricus proporciona el aroma característico, S.
thermophilus el sabor fresco y ácido de este tipo de leche cuajada.

El Kefir.

Es una bebida de leche ácida de origen caucásico, que también se encuentra a la

venta frecuentemente, el kefir además de las bacterias lácticas contiene levaduras que
fermentan el azúcar, en una menor proporción, a alcohol Y C02.

Esta acidificación y fermentación alcohólica simultáneas tienen lugar a 20 'C y

duran unas 24 horas.

El kefir, ya fabricado contendrá 1,0-1,5 % de ácido, 0,25 % de alcohol y C02

disuelto. El inoculo lo constituyen los granos de kefir, que se emplean también para uso
doméstico. Están formados por proteínas lácteas coaguladas, sólidas, que contienen un
cultivo mixto de las siguientes bacterias y levaduras: Lactobacillus (caucasicus), L.
caseina, L. plantarum Leuconostoc cremoris y algunas levaduras fermentadoras de la
lactosa (Torulopsis spp., Saccharomyces fragilis).
Los granos de kefir pueden conservarse secos durante muchos años. Antes de
su utilización hay que reactivarlos por maceración. Al final de la fermentación se extraen
los granos, que habrán crecido como consecuencia de la coagulación de más proteínas, y
podrán volver a emplearse inmediatamente o más tarde, después de su desecación.

El Queso.

Se obtiene por degradación microbiana más o menos intensa de los componentes

de la leche .

Se coagula la Caseína por fermentación láctica y dependiendo de si la caseína

sufra o no una maduración microbiana se diferencian los quesos en:

➢ Madurados y Frescos.

La consistencia y sabor de los madurados están influenciados por :

❖ El contenido graso.
❖ Tipo de coagulación de la caseína.
❖ Aditivos.
❖ Tratamiento con bacterias y mohos y especie a la que pertenezcan.

Por combinación de estos factores pueden obtenerse numerosos tipos distintos de

queso. Ajustando el contenido graso de la leche de partida se obtendrán quesos que en
base a esto se clasifican en:

5
 QUESOS CONTENIDO EN GRASA

▪ Doble crema 60 %
▪ Crema 50 %
▪ Super graso 45%
▪ Graso 40 %
▪ Semigraso 20 %
▪ Poco graso 10 %
▪ Magros menos del 10 %.

Para la coagulación se emplea Quimosina o Renina que se obtiene del estomago

de los terneros como proenzima inactiva y se activa con ácido clorhídrico a pH 5.3.

Enzima inactiva HCl Enzima activada

Caseína láctea Paracaseínato cálcico

(Solución coloidal
paracaseinato insoluble)

Quesos Frescos.

En estos no hay maduración después de la coagulación de la caseína o la hay en

muy pequeña proporción (ver fig. 11).
Todos tiene un sabor suave, débilmente ácido por que todavía no hay degradación
microbiana de las proteínas y de los lípidos.

A. Queso blanco
B. Queso en capas y
C. Queso crema fresco.

A.- Queso blanco.- Se obtiene como cuajada ácida por precipitación a partir de
Leche ácida y cuajada enzimática ( fermento lab.) mayoritariamente.

B.- Queso en capas.- Contiene una capa intermedia algo más grasa.

C.- Queso Crema y doble crema.- A partir de leche entera a la que se le añade
crema.

Quesos madurados.- se obtienen por:

1) Fermentación ácido láctica de cuajada ácida

2) Precipitación con Fermento lab. De cuajada enzimática
.
Quesos de leche ácida.- Son quesos magros que se obtienen por degradación
microbiana progresiva de la cuajada ácida.

5
 Entre estos se encuentran los tipos:

✓ Haserkäse
✓ Karbkäse
✓ Stangekäise
✓ Quesos de hierbas
✓ Quesos con mohos.

Fuente C
(ác.láctico)

MADURACIÓN PARACASEÍNA Albumosa , a.a., aminas

peptonas,
ác.grasos y
compuestos volátiles

Degradación
Bacteriana

Bacterias lácticas: Lactobacillus casei, L.helveticus, Streptococcus lactis y

S:cremoris y participan a demás Micrococcus caseolyticus y Arthrobacter sp.

Los quesos de leche ácida, se condimentan, salan y conforman de acuerdo con el

tipo al que pertenezcan y se almacenan en un lugar húmedo durante la maduración.

Quesos con fermento lab.- Se realizan con leche acidificada débilmente y sin
cuajar, se le añaden de 1-2 % ( en volumen ) de cultivo de bacterias lácticas y fermento
Lab en forma de polvo o liquido.

La coagulación de la leche va ha ser mayor cuanto más elevada sea la

temperatura.
Quesos blandos Coagulan 18 – 22 °C.

Quesos duros Coagulan 31 – 33 °C.

Si la coagulación es lenta por la ausencia de calcio, se le puede CaCl2 a la leche.
Después de la cuajada el queso s e calienta varias horas hasta alcanzar los 54 –
55 °C. Para eliminar las levaduras y mohos de la leche .
En el suero quedan : Lactato, albúmina, lactosa y sales minerales.

Quesos blandos .

Después de la coagulación se les da forma prensándolos únicamente entre tablas

ajustables, en estos hay una degradación de la masa del interior y exterior hacia el centro,
determinando especialmente la maduración externas el carácter del queso (ver fig. 11).

5
 Los quesos blandos pueden ser:

1) Madurados con mohos.

2) Madurados sin hongos.
Dentro de los madurados con mohos se encuentran los madurados con:
Camembert y Brie que son madurados con Moho blanco, se inoculan con
Penicillium camemberti y Endomyces sp.

Roquefort, Bavaro azul que son madurados con moho azul , y se inoculan con
Penicillium roqueforti.

La maduración del queso fresco se realiza espolvoreándolo con migas de pan

invadido por el moho.

Quesos Duros.

Se prensan envueltos en paños a presiones hasta de 20 bar. hay una maduración

homogénea de toda la masa , dentro de los más importantes están:

Tilsit.- Es semiduro , flexible, 4-5 kg., con ojos repartidos y recubierto de una capa
pegajosa amarilla rojiza.

Edam .- Grande redondo amarillo dorado, graso, semiduro, ojos escasos

pequeños y redondos, corteza roja recubierta de parafina.

Emmental o suizos.- Son duros, grandes hasta de unos 100 cm. de diámetro y
unos 40 kg. de peso, grasos con grandes ojos y aroma característico.

Cheddar.- La cuajada debe de acidificarse antes de proseguir su elaboración.

Chester.- Son elaborados a partir de leche dulce y están recubiertos con cera.
Parmesano.- También se acidifica la leche, con textura granulosa y dura y ojos
pequeños y escasos.

La maduración se lleva a cabo en dos etapas , premaduración y maduración

principal (ver fig.).

PREMADURACIÓN

A).- Leche ácida.-

Lactosa residual Ácido láctico, ácido acético acetoína y diacetilo

Bacterias lácticas y
Estreptococos proteolisis.

5
B).- Fermentación enzimática.-

Lactosa y Lactato cálcico glucosa ácido + ácido + CO2

. propionico acético

Propionibacterium freudenreichii
P. ácidi- propionici
P. jensennii

El CO2 liberado forma los agujeros característicos de los quesos duros, los ojos.
Maduración principal.-
Además de la fermentación a ácido propionico termina la degradación de la
Caseína y el desarrollo del aroma.
Su degradación y transformación conducen ala formación de :

 Cetoacidos
 Oxiacidos
 Ac. Grasos sencillos
 Esteres de ácidos grasos

Existen otros muchos productos tradicionales de leche ácida originarios del medio
y lejano Oriente, a los que no podemos referirnos aquí con más detalle (por ejemplo dahi,
kumiss, leben, kurunga). Se obtienen a partir de la leche de distintos animales
domésticos y de inóculos de diversa composición.

5
Elaboración de queso de fermentación láctica (queso de untar).

Objetivo.- Que el alumno aprenda la elaboración de queso de fermentación láctica

(queso de untar).

Introducción.

Este tipo de queso está directamente relacionado con el queso más sencillo que
existe que es el que se elabora añadiendo un agente acidificante a la leche (ácido
clorhídrico, limón o vinagre) ya que la base es la misma pero en el caso del uso de las
bacterias ácido lácticas se tiene la gran ventaja de que es la lactosa (azúcar de la leche)
la que se metaboliza produciendo un sabor, una textura y una digestibilidad muy superior
que el producto obtenido por la simple acidificación.

La coagulación de las proteínas lácticas (conocidas como caseínas) por medio del
un descenso en la acidez de la leche origina la unión de las proteínas unas cono otras,
formando estructuras de mayor tamaño. Cada molécula de ácido actúa como un cemento
que se encargaría de unir las proteínas de la leche que actuarían como ladrillos siendo así
muy fáciles de separar de la parte acuosa de la leche (suero) constituyendo lo que se
denomina la cuajada. Como curiosidad conviene apuntar que este es un proceso químico
reversible, es decir que si se le añade a la leche coagulada por la acción de un ácido un
álcali (sustancia química con un pH alto como por ejemplo la lejía) la cuajada volvería a
ser líquida otra vez (cuidado ya no sería leche que se pudiera beber aunque su aspecto
sería igual que el de la leche fresca).

El queso que se obtiene tiene un sabor marcadamente ácido y es magnífico para

condimentar con finas hierbas, ajo y perejil, pimienta, nueces, etc. Su estructura es muy blanda
ya que la acción cementante del ácido es débil por ello no se pueden hacer quesos con una
determinada forma por medio de este tipo de fermentación.

Su consistencia va desde una pasta muy densa hasta una crema ligera que se puede
usar para hacer repostería como base de deliciosos bizcochos, etc.

Material y equipo necesario:

 1. 1 litro de leche.
2. Olla grande para el baño María si la temperatura es inferior a 22 ºC.
3. Recipiente para la coagulación puede ser de plástico, acero inoxidable o vidrio.
No se recomienda la porcelana, ni el aluminio, ni cualquier recipiente que pueda ser
alterado por la acción del ácido o no se pueda limpiar con facilidad.
4. Termómetro
5. Gasa
6. Fermento iniciador
7. Cazo de sopa o cucharón
8. Colador
9. Cuchillo de punta
10. Cuchara sopera
Proceso de elaboración:
Pasteurizar la leche si se trabaja con leche no comercial : calentar la leche hasta 70ºC
al baño María nunca directamente y mantener esta temperatura de 1 a 3 minutos.

Enfriar rápidamente introduciendo el recipiente de la leche en agua fría. Bajar la temperatura

hasta los 30 ºC . Si se trabaja con leche de cabra actuar siempre por debajo de 29 ºC después de
pasterizar.

Tomar la punta de un
Tomar 1 litro de leche cuchillo de fermento
Diluir el fermento en
pasteurizada y iniciador y depositarla en
una cucharada de
calentarla al baño María la cuchara sopera.
leche a 30 ºC.
hasta 30º.

La cuajada está lista para

desuerar cuando al introducir
el cuchillo y levantar la punta
hacia arriba se produzca una
grieta en la superficie. Esto
significará que la leche se ha
coagulado o “solidificado” y
Diluir la cucharada de
por lo tanto la cuajada está a
leche con el fermento Dejar reposar la mezcla
punto.
en el litro de leche sin molestar en un sitio
revolviendo suavemente. caldeado a temperatura
nunca inferior de 20º ni
superior a 35º durante
8a
24 horas dependiendo de
la temperatura
ambiente.
Es conveniente cubrir
con
 una tela o trapo para
evitar que se ensucie la
leche pero que se airee.

y forrar con ella el colador.

Humedecer con agua la

gasa de quesería
Sacar con cuidado la cuajada
y depositarla sobre la tela.
Si se desea recuperar el
suero para utilizarlo
posteriormente

poner debajo del colador

un recipiente limpio y
vaciarlo de vez en
cuando. El tiempo de desuerado es
Si fuera necesario tomar muy variable y depende de
la tela por sus extremos cómo de consistente
y levantarla ligeramente queramos dejar el queso y la
para destaponar la parte temperatura ambiente, como
de la gasa que está en orientación entre 4 y 8 horas.
contacto con la cuajada
y deje salir el suero.

Y se envasa en un recipiente hermético para meterlo en la

nevera donde se conservará hasta 10 días. Al enfriarse su
consistencia se endurece.

Cuando tenga el queso

la consistencia deseada
es el momento de
añadirle los condimentos
que queramos: sal,
pimienta, nueces
molidas, ajo, perejil,
orégano, finas
hierbas, azúcar, etc.
 Para obtener un queso más cremoso se puede añadir nata comercial a la leche antes de
empezar el proceso y se pueden variar los tiempos de fermentación y desuerado, así
como la cantidad de fermento; para obtener texturas y sabores diferentes. Es ideal como
ingrediente de repostería en vez de la nata o mezclado con los condimentos como
aperitivo.

Problemas más comunes y cómo resolverlos

Queso muy acuoso:
 Ha tenido poco tiempo de fermentación o se ha realizado en ambiente muy frío y
se ha desuerado antes de tener la cuajada la consistencia del corte limpio.
 Se ha desuerado poco tiempo o en ambiente muy frío.

Sabor excesivamente ácido:

 Se le ha añadido demasiado fermento iniciador y lo tanto hay que reducir la dosis.

 Conservar el fermento correctamente porque puede que haya perdido fuerza.

Hortalizas fermentadas.

Los encurtidos son aquellos productos vegetales hortícolas que, tras ser sometidos a
diversas transformaciones, tienen en común su aderezo con vinagre. Entre las especies
hortícolas cultivadas para encurtir destacan: pepinos, zanahorias, remolachas (hervirlas diez
minutos antes); repollo colorado, col crespo. Algunas combinaciones posibles: pepinos o
chauchas con borraja, eneldo y menta; repollo colorado con zanahorias, granos de mostaza,
kummel y coriandro; pimientos con zapallitos (probar que no sean amargos), cebollas, oregano
y ajo. Remolachas con manzanas, kren (rábano blanco picante), cáscaras de limón, granos de
mostaza y jengibre. Tallos de apio, manzana con kren o jengibre. Cada cultura ha desarrollado
diferentes variantes para encurtir hortalizas a partir de esta técnica.

La materia prima puede someterse a fermentación ácido-láctica o bien no fermentarse.

También pueden elaborarse numerosos tipos de encurtidos mediante adiciones de azúcares,
especias, esencias y aromas, pero siempre con presencia de vinagre, pues es la característica
fundamental del encurtido. Los encurtidos , independientemente de que se fermenten o no,
pueden pasteurizarse para mejorar su conservación.

El proceso de fabricación de encurtidos comprende dos fases:

o Fase de fermentación: tiene lugar la fermentación ácido-láctica de la materia prima

debido a la flora microbiana presente de forma natural en los frutos. Esta fase va
acompañada de una serie de operaciones previas preparatorias. Esta fase puede no
realizarse, pasando de las operaciones previas a la fase siguiente.
o Fase de elaboración: a partir de la materia prima fermentada y conservada en salmuera
o bien partiendo de productos en fresco son elaborados los distintos tipos de encurtidos.

El diagrama general que se sigue es el siguiente.-

6
 Materia prima.

La materia prima está constituida por los frutos inmaduros de las especies anteriormente
citadas. La textura de los frutos destinados a encurtir debe ser firme y éstos deberán estar
exentos de sabores extraños y amargos, así como de malos olores.

El tipo de recolección es un factor muy importante para determinar la distribución de

tamaños de los frutos recogidos. Mientras que la recolección manual produce mayor porcentaje
de frutos pequeños, muy apreciados comercialmente y de mayor precio, la recolección
mecanizada tiende a frutos de mayor tamaño, poco apreciados.

Selección.

Este apartado comprende diferentes operaciones, destinadas a incrementar la calidad

de la materia prima que se dispone a fermentar. Deberán ser eliminadas las hojas y las flores
que permanecen adheridos al fruto. Esta operación se realiza mecánicamente con una máquina
compuesta por una cinta transportadora de rodillos vulcanizados en caucho que giran por pares
en sentidos opuestos. Los rodillos atrapan las flores y restos de materia vegetal, mientras que
los frutos continúan avanzando por la cinta.

El objetivo de esta operación reside en la eliminación de las partes de la planta, que

contienen de forma natural poblaciones de hongos que son fuente de enzimas responsables del
reblandecimiento de estos frutos fermentados comercialmente. Se ha comprobado que aquellos
depósitos que contienen un porcentaje muy elevado de restos vegetales muestran una gran
actividad enzimática, y por lo general, el producto final fermentado es blando o de poca firmeza.

Calibrado.

Los frutos se clasifican según su diámetro. Esta característica es muy importante debido
a la fuerte demanda comercial de tamaños pequeños. No existe uniformidad internacional en la
clasificación teniendo cada país su propia norma.

El calibre va a ser un factor muy importante, que determinará la aparición de ciertas

6
alteraciones que deprecian el valor del encurtido en salmuera y del producto elaborado. Este es
el caso de la formación de huecos durante la fermentación, que está directamente relacionada
con el tamaño de los frutos. Se recomienda evitar fermentar en el mismo depósito frutos de
tamaños extremos, puesto que los pequeños fermentan con mayor rapidez que los grandes.

La clasificación se realiza mecánicamente mediante calibradoras que constan de varios

canales de calibrado, formados por cordones de caucho o nylon en forma divergente.
Regulando la divergencia de los cordones se consiguen los distintos calibres que se recogen en
tolvas.

Lavado.

Esta operación se realiza previa a la fermentación, cuyo objetivo es disminuir la suciedad

y los restos de tierra que los frutos llevan adheridos. Esta operación no se realiza en la
industria encurtidora, pues los fabricantes depositan los frutos en los depósitos de
fermentación tal y como los reciben del campo. Como la fermentación ácido- láctica es un
proceso microbiológico, la higiene en el manejo de la materia prima es fundamental. El
reblandecimiento de los frutos se debe a la presencia de enzimas pectinolíticas y celulolíticas.

El lavado constituye uno de los procesos más importantes en la fabricación de

encurtidos, pues la suciedad de los frutos y la presencia de hojas y frutos descompuestos,
dificulta el normal desarrollo de la fermentación natural.

El lavado se realiza simplemente con agua, la maquinaria empleada suele ser lavadoras
de tipo rotativo compuestas por cilindro de chapa perforada semisumergido en agua y cintas
transportadoras, también perforadas, con duchas a presión.

Fermentación.

Es la operación más importante en todo el proceso de fabricación. De forma general

esta operación consiste en colocar las especies hortícolas en solución salina (salmuera) y dejar
que la flora microbiana, realice la fermentación natural. La fermentación ácido-láctica se
consigue mediante la combinación de dos factores: la concentración de sal y el descenso del
pH de la salmuera debido a la producción de ácido láctico por las bacterias fermentativas.

La fermentación tiene lugar en depósitos de plástico con diferentes capacidades,

pudiendo oscilar éstas entre 120-14.000 litros, dependiendo del lugar de emplazamiento y de
las facilidades operativas. Estos depósitos se suelen instalar en naves industriales cubiertas,
aunque en algunas zonas cálidas los depósitos se colocan abiertos y al aire libre. Los depósitos
han de ser limpiados antes y después de su uso.

En la preparación de la salmuera se utilizará agua potable, que esté exenta de materia

orgánica en suspensión; las aguas duras no se emplearán. La sal empleada debe contener
menos del 1% de carbonatos o bicarbonatos de sodio, calcio y magnesio, debido a que estas
sales pueden neutralizar el ácido producido por las bacterias que realizan la fermentación.

Transcurridas 24 horas de la recolección; una vez llevadas a cabo las operaciones de

6
selección, calibrado y lavado, se introduce la materia prima en los bidones y se adiciona una
salmuera que contenga 10% de sal. En estas condiciones se mantiene durante la primera
semana. A continuación semanalmente, se añade sal en cantidad suficiente para elevar la
concentración de la salmuera en 1% de sal, hasta alcanzar 16% de Sal.

Se tendrán en cuenta que las natas sobrenadantes presentes en la superficie de la

salmuera, constituidas por levaduras oxidativas y mohos, se deben eliminar con periodicidad.
Esta práctica evita el el consumo por dichos microorganismos del ácido láctico producido en la
fermentación.
Durante la fermentación se producen numerosos cambios físicos, químicos y
microbiológicos, que se describen a continuación:

Cambios físicos.

En las primeras 48-72 horas el agua, los azúcares, proteínas, minerales y otras
sustancias contenidas en los frutos se difunden por ósmosis a la salmuera. En la salmuera
estas sustancias constituirán el alimento de las bacterias productoras de ácido láctico y otros
microorganismos. Como consecuencia, el producto pierde peso y se produce en él un
arrugamiento. Transcurrido este periodo, la sal comienza a penetrar en los tejidos y con ella se
produce la entrada de agua, con la que los frutos ganan peso y vuelven a su situación normal.
El cambio de textura de los productos durante la fermentación es el aspecto físico más
importante, ésta va a determinar las diferencias cualitativas entre los encurtidos procedentes de
producto fermentado y fresco.

Cambios químicos.

El principal cambio químico consiste en la transformación de los azúcares contenidos en

los frutos en ácido láctico debido a la acción microbiana. Aunque el principal producto de la
fermentación es el ácido láctico, también producen cantidades inferiores de ácido acético. Otros
compuestos que aparecen en menores proporciones son alcoholes y ésteres. En ocasiones,
durante la fermentación ácido-láctica se originan cantidades importantes de anhídrido carbónico
e hidrógeno.

Cambios microbiológicos.

Los microorganismos más importantes que intervienen en la fermentación son: bacterias

productoras de ácido láctico, bacterias productoras de gases y levaduras. Estos
microorganismos están presentes de forma natural en los frutos. Las bacterias productoras de
ácido láctico, aunque presentan variaciones estaciónales y de distribución, son siempre las
responsables de los mayores cambios en los frutos. Dentro de este grupo se encuentran
Leunostoc mesenteroides, que en los primeros momentos de la fermentación predomina sobre
el resto, esta bacteria se cultiva sobre medios hipersacarosados produciendo voluminosas
cápsulas (dextrano), esta producción se ha empleado en la producción de alimentos de textura
más o menos filante o espesa. También están presentes las siguientes especies:
Streptococcus faecalis (bacteria homofermentativa, pues su fermentación es de tipo
homoláctico, transformando la lactosa en ácido láctico), Pediococcus cerevisiae, un coco muy
productor de ácido, cuya actividad microbiológica se incrementa en proporción al tiempo
transcurrido, y Lactobacillus brevis, que puede contribuir a la formación de ácido láctico y a su
vez es productora de gas. Lactobacillus plantarum es la bacteria más importante a la hora de
6
producir ácido láctico.

Dentro del grupo de bacterias productoras de gases tenemos las especies coliformes del género
Aerobacter, que se caracterizan por la producción de anhídrido carbónico e hidrógeno. También
dentro de este grupo se encuentra Lactobacillus brevis, que es un bacilo productor de gas, pero
que en determinadas ocasiones ayuda a la formación de ácido láctico, se trata de una bacteria
heterofermentativa que no puede desarrollarse en anaerobiosis con glucosa, porque no es
capaz de reducir el acetil-fosfato a etanol.

Almacenamiento.

Los frutos fermentados pueden ser almacenados si no van a elaborarse

inmediatamente. Para ello la concentración de la salmuera se eleva al 20%. La acidez total de
la salmuera, expresada en ácido láctico, debe estar por encima del 1%, para lo cual si fuera
necesario se añadiría ácido láctico comercial. De esta forma se impide el desarrollo de
levaduras que podrían deteriorar el producto fermentado.

Fase de producción y envasado.

La planta de envasado recibe la materia prima, calibrada y fermentada, para llevar a
cabo su procesado. El procedimiento seguido durante esta fase se muestra en el siguiente
esquema:

6
 Recepción y control de la materia prima.

La materia prima es transportada en camiones hasta la planta de envasado, donde se

procede al pesado de todos y cada uno de los barriles de plástico que contienen los diferentes
productos. A continuación se procederá a la toma de muestras de los productos para determinar
si alcanzan o no la calidad requerida por la industria. También se determina el contenido en sal
de la salmuera, el pH y la acidez total.

Desalado.

Los frutos almacenados en salmuera no pueden consumirse directamente. Para poder

procesar el producto almacenado, éste debe ser previamente desalado, reduciendo su
contenido salino a un nivel aceptable por los consumidores. Se trata de un proceso inverso al de
salazón, que consiste en eliminar la sal con agua.

Mediante escurrido se elimina la salmuera inicial de los bidones. A continuación se

vuelven a llenar de agua y al cabo de unos minutos se escurren nuevamente, alcanzando así
los productos una concentración aproximada del 2% de sal. En cada lavado se consumen 25
litros de agua para 100 kg de producto.

Lavado.
Una vez desalado el producto, se realiza un último y ligero lavado del mismo con agua
corriente. Para esta operación se emplea una cinta transportadora, provista en su mitad inicial,
de un sistema de aspersores o duchas de baja presión. La segunda parte de la cinta, sin
aspersores, completa el escurrido, con objeto de eliminar el exceso de agua de la superficie
del producto.

Llenado de los envases.

Se empleará como único material de envasado el vidrio. Su elección se debe a las

siguientes ventajas:

 Son impermeables al agua, gases, olores, etc.

 Son inertes.
 Se pueden someter a tratamientos térmicos.
 Son transparentes.
 Realzan el contenido que contienen.

Previamente al llenado, el envase debe ser lavado, lo cual se lleva a cabo en una
lavadora de frascos dispuesta para tal fin. En primer lugar se vierte el envase y, a continuación,
se lanza un chorro de agua caliente, manteniéndose los frascos invertidos para evitar
contaminaciones y facilitar el escurrido antes del llenado.

Una vez preparada la materia prima para su envasado, es enviada por medio de una
banda transportadora a la llenadora-dosificadora, que realiza el llenado de los frascos de
manera precisa sin derramar el producto, ni contaminar la zona de cierre. Este hecho es de gran

6
importancia ya que la presencia de pequeñas partículas de producto entre el borde de la tapa y
el envase, puede producir problemas en el cierre y, como consecuencia, tener lugar posibles
alteraciones de oxidación o de reinfección por microorganismos, con la consiguiente
putrefacción.

Adición del líquido.

La adición del líquido de gobierno cumple entre otros los siguientes objetivos:

 Mejorar la transferencia de calor a las porciones sólidas del alimento.

 Desplazar el aire de los envases.
 Mejorar el sabor y la aceptabilidad del alimento, así como contribuir a su conservación.
 Actuar como medio de distribución para otros componentes (especias, aditivos, etc.).

El preparado consistirá en una disolución al 10% de vinagre puro de vino en agua. Su

añadido, a los envases con el producto, se realizará por medio de una dosificadora volumétrica
que se alimenta de un depósito en el cual se formula el líquido de gobierno. La máquina
permite variar de forma automática e independiente el volumen a dosificar. La temperatura del
líquido en el momento de su incorporación será de unos 85 ºC.
Cerrado.

Si los envases se cerraran a presión atmosférica, difícilmente resistirían la presión

interna producida durante el tratamiento térmico. Por tanto, es necesario expulsar el aire del
espacio de cabeza reservado y producir un vacío parcial. Esto se consigue con una temperatura
elevada del líquido de gobierno. De esta forma, también se reduce la cantidad de oxígeno
disponible que acarrearía la corrosión, la destrucción de vitaminas y la decoloración del
producto. Para esta operación se empleará una cerradora de tapas de rosca.

Tratamiento térmico.

El pH influye considerablemente en la temperatura y el tiempo de tratamiento,

condiciones que definen el procesado térmico, para obtener un producto aceptable. Los ácidos
ejercen un efecto inhibidor sobre los microorganismos. Por tanto, en productos muy ácidos con
pH < 3.7 no se multiplican las bacterias, solo los hongos y bastaría con un tratamiento térmico
consistente en un proceso de pasteurización.

El tratamiento térmico se llevará a cabo en un túnel de pasteurizado, con duchas de agua

caliente a la entrada y fría a la salida, para evitar roturas en los envases. Una vez concluido el
proceso de pasteurización, se enfrían los envases paulatinamente, evitando un cambio térmico
brusco que pueda aumentar la fatiga de los envases por sobrepresiones. La temperatura final
de enfriamiento será de unos 38 ºC, para que el calor residual ayude a secar los envases, con
lo que se evita la corrosión y se contribuye a evitar la recontaminación.

A continuación del túnel de pasteurizado y como una extensión del mismo, se instalará un túnel
de secado por chorros de aire. Su función será eliminar completamente las gotas de agua
existentes en los envases, elemento antiestético de cara a su posterior comercialización.

Etiquetado.
6
 El etiquetado se realizará una vez llevado a cabo el marcado de las tapas de los
envases. Para esta operación se empleará una etiquetadora lineal automática autoadhesiva,
dotada de dos cabezales para practicar, según las circunstancias, etiquetado simple o doble.

Embalaje.

A la salida de la etiquetadora una mesa de acumulación recoge los envases marcados y

etiquetados listos para su embalado y expedición. Como consecuencia de las diversas formas
de embalaje demandadas, así como los distintos destinos de producción se llevará a cabo el
embalado de dos maneras diferentes. Desde la mesa de acumulación
se instalarán dos líneas de embalado, una en cajas de cartón y otra en bandejas, también de
cartón, retractiladas.

Embalado en cajas de cartón.

En una mesa empaquetadora con plegadora de solapas inferiores, un operario forma la

parte inferior de la caja, para posteriormente proceder al llenado de la misma con los envases
de la mesa de acumulación. Finalizada esta operación, la caja es introducida manualmente en
la precintadora, ubicada a continuación, que lleva a cabo el precintado simultáneo por la parte
superior e inferior con un mecanismo de cerrado automático de solapas superiores.

Embalado en bandejas de cartón retractiladas.

Una vez formada la bandeja, se procede al llenado de la misma en una mesa de

embalaje, situada junto a la mesa de acumulación de los envases procedentes de la
etiquetadora. Seguidamente la bandeja es conducida por medio de un transportador de rodillos
a la retractiladora. A la entrada del túnel de retractilado, una empaquetadora realiza el estuche
del film plástico que envuelve la bandeja, que es empujada automáticamente al túnel para su
termoretracción.

Paletizado.

Se trata de la última operación de todo el proceso, a partir de la cual el producto está

preparado para su expedición. El paletizado se realizará de forma manual con las cajas o
bandejas procedentes de las respectivas líneas de embalado. Después de situar aquellas en el
palet, se practicará un enfardado como elemento de seguridad, que en el caso de ser
insuficiente se reforzará mediante flejes a ambos lados.

Almacenamiento.

Las dependencias para el almacenamiento de los encurtidos elaborados, por sus

especiales características, no precisan de un importante acondicionamiento. Para mantener los
elaborados durante el periodo de almacenamiento en condiciones adecuadas que garanticen
su calidad, se llevarán a cabo las siguientes recomendaciones:

o Evitar la exposición prolongada de los productos a la luz solar directa, principal causa de
la aparición de decoloraciones.

6
 o Mantener la temperatura ambiental por debajo de los 25 ºC, evitando así el efecto de
cocido y de ablandamiento del producto y, por tanto, la aceleración de la oxidación.

o Almacenar los palets colocando unos junto a otros, sin realizar ningún tipo de apilado
que pueda dar lugar a la rotura de envases, deformaciones en las tapas, etc.

o Realizar controles periódicos del tiempo y de la temperatura de almacenamiento, de la

evolución de la calidad, estado de los palets, etc.

La adopción de estas medidas es imprescindible para una buena conservación de los

encurtidos. Se trata de productos de duración media superior a dieciocho meses, que en
condiciones adecuadas pueden permanecer varios años en perfecto estado de consumo.

La producción procesada al cabo de una semana deberá permanecer en almacén hasta su

distribución, operación que se realizará, generalmente con periodicidad semanal.

Elaboración de repollo fermentado.

De las hortalizas fermentadas, el chucrut es la que más está en boca de todos. Si bien
se lo asocia con los alemanes (curiosamente junto a las salchichas de Viena, que deberían ser
austríacas) a tal punto que en muchas regiones se los apoda con este nombre, la técnica de
elaboración se remonta prácticamente al origen de la horticultura, o al menos, al origen de la
domesticación de los repollos.

Plino, quien describe los hábitos de vida del Imperio Romano, ya narra el procedimiento
mediante el cual se mantenía fresco el repollo en los largos viajes. Se utilizaban coles de las
costas de la península itálica que se comprimían con el agregado de sal en vasijas (limpias y
secas). También cita la costumbre romana de conservar olivas en salmuera. Este proceso, en
el que se agregaban especias, se denominaba "compositus". Bajo este nombre se difundió la
elaboración del chucrut en Europa central en el siglo 11. El tiempo trasladó el nombre de
compositus a compost y composta, dos términos relacionados con la huerta pero con
significados bien distintos.

Sin embargo, habían sido los chinos los primeros en hacer fermentar el repollo (como
también el arroz y la soja). La fermentación láctica (ahora redescubierta por la industria
alimenticia en las leches cultivadas y otros brebajes del rubro, con rimbombantes nombres
científicos y un apoyo publicitario espectacular), es de todos los procesos de fermentación en
6
los que intervienen ácidos orgánicos, el que más inhibe el desarrollo de microorganismos. Esta
propiedad, junto a su capacidad de facilitar el acceso a nutrientes de alto valor biológico en
épocas de escasez, justifican la importancia que ha tenido en la cultura alimentaria de casi todo
el mundo. Sigue siendo hoy día una técnica sencilla para producir y conservar alimentos
nutracéuticos que son la principal fuente de vitamina C, y encimas de muchos pueblos.

El proceso de conserva no es muy diferente al de los modernos silos húmedos (esos

chorizos grandotes de plástico blanco que se ven por doquier en el campo) en los que se
conserva, enriquece y predigiere el forraje almacenado para vacas u otros animales.

La versión "Fast food" de picar un poquito de repollo y agregarle limón o vinagre antes
de hervirlo, puede ser una rápida solución culinaria pero no puede ser considerada ni siquiera
un sustituto del proceso de fermentación natural.

Ilustración: Chucrutera Dr. Kuhl: pesa adaptada al recipiente, canaleta superiror que se
llena con agua hervida y en la que calza la tapa para un cierre hermético. Con esta técnica se
puede reducir el uso de sal a 3 g. por Kg. de hortaliza fresca.

La sal es un componente fundamental para el buen desarrollo de la conserva. El

contenido de proteínas de las hortalizas favorece su descomposición, sobre todo en contacto
con el aire. El agregado de sal inhibe este proceso, hasta que la fermentación genere el
suficiente ácido láctico que actúa luego como un conservante natural. Se sugiere el uso de sal
natural o marina (asegúrese que realmente lo sea, busque un proveedor confiable) ya que la sal
de mesa puede tener aditivos que enturbien el "Compositus", si bien no lo harán indigesto. Los
romanos no se medían la presión sanguínea y los alemanes del medioevo tal vez hayan vivido
con menos stress, por lo que utilizaban 10 gramos de sal por kg. de hortaliza. Así como
muchos horticultores abusan de los agroquímicos para asegurarse una buena cosecha, estos
conservadores querían estar seguros de su producción. Hoy día se usan unos 5 g. por Kg. de
hortaliza fresca, y si se tiene especial cuidado en la higiene y la "cancha" necesaria, se puede
llegar a 3 g. por Kg. para acelerar el inicio de la fermentación, sobre todo en clima frío, puede
agregarse un poco de suero de manteca, que se obtiene batiendo un pote de crema hasta que
se corte la misma y se separa en suero y manteca. También podría agregarse algo del jugo de
chucrut de una fermentación anterior.

Material y equipo utilizado.

6
 Utilizamos un jarro, balde, vasija o barril, pudiendo ser de vidrio, cerámica o madera de
una capacidad mínima de cinco litros. Si va a utilizar plástico, asegúrese de que esté apto para
alimentos y en especial para ácidos, y que no esté contaminado con ningún tipo de residuos
tóxicos. Jamás utilice envases metálicos o que hayan contenido detergentes, agrotóxicos u otro
tipo de sustancias químicas de uso industrial, ni envases plásticos de baja calidad. La limpieza
es fundamental. Llenamos el recipiente el día anterior con agua para remojarlo. Luego lo
lavamos con jabón neutro y enjuagamos reiteradas veces con agua caliente. Finalmente lo
llenamos con agua y un veinte porciento de vinagre común, para desinfectarlo. Lavamos muy
bien un repasador o un paño de tela natural cruda (sin teñir), un plato de loza o madera y una
piedra que calcen en el envase y sirvan como pesa. Los colocamos en el recipiente para que
también entren en contacto con el agua con vinagre.

Recuerde que en toda preparación de alimentos, nuestro lugar de elaboración y los

utensilios estarán perfectamente limpios y secos, al igual que nuestras ropas y manos. El
cuchillo, bien afilado.

Procedimiento.

Para llenar un recipiente de 5 litros, necesitamos unos 3,5 kg. de repollo. Elegimos
piezas bien armadas y jugosas. Las lavamos bien con agua potable y le recortamos las partes
dañadas. Partimos el repollo en dos para extraer el corazón, que suele demasiado duro (si
llegara a estar sobremaduro o feo, descarte la planta). Con la cuchilla y sobre tabla cortamos el
repollo en tiritas finas. Se puede utilizar una multiprocesadora o la cuchilla de un rallador,
aunque los trozos no queden tan elegantes. A medida que vamos cortando, colocamos las
tiritas en una palangana y les agregamos unos 3 a 5 gr. de sal por Kg de repollo.
Condimentamos a gusto (tenga presente que la fermentación resalta el sabor de algunas
especias, úsese con moderación): laurel, trocitos de cebolla, rebanaditas de zanahoria, gajos de
manzana (sin semillas), semillas de eneldo y alcarabea (Kümmel). Es conveniente hervir las
cebollas diez minutos, antes de utilizarlas. Mezclamos bien todo y apisonamos con la ayuda de
un pisón de madera (bien limpio) del tipo que se utilizan en morteros, u otra herramienta similar.

Vaciamos el recipiente (el agua con vinagre se descarta) y colocamos una capa de unos
cinco centímetros del repollo picado y sazonado. Apretamos bien el repollo dentro del envase
con el pisón (o con el puño limpio), para que comience a soltar el jugo. Agregamos otra capa y
repetimos la operación, hasta llenar el envase unos diez centímetros debajo de su borde. Es
fundamental comprimir bien el repollo.

Estrujamos bien el paño o repasador y lo colocamos sobre la boca del recipiente. Luego
ponemos el plato en el centro y finalmente la piedra (un adoquín por ejemplo). Tapamos el
envase lo mejor posible, por ejemplo con una bolsa plástica apta para alimentos, para que no
entren impurezas y lo depositamos en un lugar limpio.

Fermentación:

Las levaduras y los bacilos que producen la fermentación láctica están presentes en el
ambiente. Si no, no se cortaría la leche. La velocidad del proceso de fermentación dependerá
de la temperatura ambiente. a 16 grados centígrados demorará unas seis semanas, a 18
grados, cinco, a 21, cuatro y a 24 grados, lo que se considera la temperatura ideal, unas tres
7
semanas. A mayor temperatura se corre el riesgo de que se descomponga antes de acumular
suficiente acidez que conserve el alimento. A temperatura muy baja, el proceso es demasiado
lento y puede producir el mismo resultado. En ambos extremos es conveniente agregar un
poco de suero de manteca, como ya se describió.

La temperatura ambiente de su lugar de depósito, además de la disponibilidad de

hortalizas, serán entonces los condicionantes para la elaboración de hortalizas ácidas. En el
Sur de la Argentina, esto se realizará en verano, en el Norte en invierno y en regiones
moderadas, al inicio de la primavera o otoño.

Unas seis horas después de rellenado el recipiente, el repollo debe haber liberado
suficiente jugo como para quedar cubierto de líquido al menos un centímetro. Si no hay líquido
suficiente, hervir agua con sal (15 g. de sal por litro de agua), dejarla enfriar y agregar hasta
llevar al nivel indicado. Agregar también un poco de suero de manteca, para favorecer la
fermentación.

Para evitar esto, la selección de repollos con alto contenido de humedad y el buen
machacado inicial son fundamentales.

Mientras las hortalizas fermentan, va ascendiendo espuma en el recipiente. Este

proceso dura entre una y dos semanas. Deberá quitar la espuma con una espumadera bien
limpia a diario. Cuando termina la fermentación (ya no se forma más espuma), se sacan todos
los pedacitos turbios con la espumadera, hasta que el repollo quede cubierto sólo por el jugo
transparente.

Almacenado:

Las hortalizas fermentadas deben almacenarse en un lugar fresco, sin calefacción ni

excesiva temperatura. Si no poseemos un lugar con estas condiciones, esperamos el tiempo de
elaboración necesario como se indicó más arriba y se prueba el preparado. Si ya tiene un
grado de acidez intenso, se procede a remover toda la capa superior (si ésta está turbia o
"babosa"). Se envasa el chucrut (u otras hortalizas) junto con el jugo en vasos de vidrio para
conserva, se cierran bien, se colocan en una cacerola con agua (que los tape completamente 5
cm.) y se cocinan durante 30 minutos a 85 grados centígrados. Luego se sacan y se dejan
enfriar y se guardan como cualquier otra conserva, en un lugar oscuro. Es conveniente envasar
en recipientes del tamaño de la porción que se empleará en una sola comida.

Si se conserva en el envase original, para utilizar una porción, ésta se saca con una
pinza de acero inoxidable u otra herramienta bien limpia. Ni bien se forma una baba (levaduras)
en el paño que recubre el encurtido, se debe quitar, lavar bien, lavar bien el plato y la piedra,
hervir el paño en agua con vinagre y volver a colocar todo en su lugar.

Notas.

Algunas hortalizas, en particular las chauchas, deben hervirse ya que poseen alcaloides
que se transforman en cianuros tóxicos y sólo se destruyen al hervirlos antes de su consumo.

7
 Recuerde siempre recubrir a las hortalizas con agua hervida con sal y suero de manteca,
si luego de unas horas de preparado, no liberaron suficiente jugo, para asegurarse la acidez
necesaria, sobre todo en hortalizas como los pimientos y las cebollas. El sabor de estos
alimentos deberá ser siempre ácido, lo cual es un indicador de su buen estado de
conservación. Si el líquido se tornara turbio y perdiera su acidez, el alimento puede
deteriorarse y no debe ser utilizado. En su conservación en el envase original, las
hortalizas nunca deben quedar fuera del jugo. En contacto con el aire del ambiente, pueden
contaminarse con hongos y levaduras que iniciarán un proceso de alcalinización, con el
consiguiente riesgo de intoxicación por salmonelas. Por este motivo, se descarta generalmente
la capa superior y se utiliza el plato con el paño y la pesa.

UNIDAD 7 B I O M A S A

INTRODUCCIÓN.

La vegetación empleada para energía puede llegar a ser uno de los combustibles más
importantes en el futuro. En los próximos veinte años podría suministrar un octavo del
presupuesto energético mundial. Una gran variedad de desechos agrícolas y madereros y de
cultivos energéticos, simbolizados por el campo de maíz, pueden transformarse para suministrar
una gama de combustibles para el transporte, o pueden ser quemados para generar
electricidad. Un ejemplo de esto es la conversión de las astillas de madera en un gas rico en
metano. Al igual que los combustibles fósiles, este gas puede quemarse en centrales eléctricas
eficientes que maximicen el contenido energético del combustible, generando electricidad al
mismo tiempo que utilizan el calor sobrante.

La utilización de la biomasa es tan antigua como el descubrimiento y el empleo del fuego para
calentarse y preparar alimentos, utilizando la leña. Aún hoy, la biomasa es la principal fuente
de energía para usos domésticos empleada por más de 2.500 millones de personas en el
Tercer Mundo.

La combustión de la biomasa es contaminante. En el caso de la incineración de basuras, tal y

como se viene haciendo con los residuos urbanos en la mayoría de las ciudades europeas y
norteamericanas, la combustión emite a la atmósfera contaminantes, algunos de ellos
cancerígenos, como las dioxinas. El reciclaje y la reutilización de los residuos permitirá mejorar
el medio ambiente, ahorrando importantes cantidades de energía y de materias primas, a la vez
que se trata de suprimir la generación de residuos tóxicos y de reducir los envases.

Biomasa es la abreviatura de masa biológica, cantidad de materia viva producida en un

área determinada de la superficie terrestre, o por organismos de un tipo específico. El término
es utilizado con mayor frecuencia en las discusiones relativas a la energía de biomasa, es decir,
al combustible energético que se obtiene directa o indirectamente de recursos biológicos. La
energía de biomasa que procede de la madera, residuos agrícolas y estiércol, continúa siendo
la fuente principal de energía de las zonas en desarrollo. En algunos casos también es el
recurso económico más importante, como en Brasil, donde la caña de azúcar se transforma en
etanol, y en la provincia de Sichuán, en China, donde se obtiene gas a partir de estiércol.
Existen varios proyectos de investigación que pretenden conseguir un desarrollo mayor de la
energía de biomasa, sin embargo, la rivalidad económica que plantea con el petróleo es

7
responsable de que dichos esfuerzos se hallen aún en una fase temprana de desarrollo.
Los combustibles derivados de la biomasa abarcan varias formas diferentes, entre ellas
los combustibles de alcohol (mencionados antes en este artículo), el estiércol y la leña. La leña
y el estiércol siguen siendo combustibles importantes en algunos países en vías de desarrollo, y
los elevados precios del petróleo han hecho que los países industrializados vuelvan a
interesarse por la leña. Por ejemplo, se calcula que casi la mitad de las viviendas de
Vermont (Estados Unidos) se calientan parcialmente con leña.

Los científicos están dedicando cada vez más atención a la explotación de plantas
energéticas, aunque existe cierta preocupación de que si se recurre a gran escala a la
agricultura para obtener energía podrían subir los precios de los alimentos.

En España actualmente el potencial energético de la biomasa asciende a 37 Mtep, pero

tal cifra incluye 19,6 Mtep de cultivos energéticos y 3,8 Mtep de residuos forestales y agrícolas.
La producción de biocombustibles y un uso energético excesivo de los residuos forestales y
agrícolas no es deseable, dadas sus repercusiones sobre la diversidad biológica, los suelos y el
ciclo hidrológico, sin olvidar que lo más importante es producir alimentos, y no biocombustibles
para los automóviles privados. El objetivo de alcanzar las 4,2Mtep en el 2.005 en la práctica
supone duplicar el consumo oficial de biomasa. La obtención de biogás en digestores a partir de
residuos ganaderos reducirá las emisiones de metano, y debe ser promocionada, con el fin de
reducir la contaminación, obtener fertilizantes y producir energía.

BIOMASA ( MASA CELULAR) .

Producción microbiana bruta obtenida por fermentación a partir de levaduras, bacterias,

mohos y algas. En algunos casos puede ingerirse directamente y en otras debe ser sometida a
una purificación mas o menos intensa. Este concepto ésta próximo al de proteínas unicelulares
“SIGLE CELL PROTEINS “.

Los microorganismos como alimento del hombre y de los animales.

En instalaciones biotecnológicas a gran escala y mediante numerosos procesos pueden

cultivarse grandes cantidades de microorganismos.

Sirven como alimento de alto valor proteico, por ejemplo, el cultivo de hongos
(principalmente champiñones), como complemento en la alimentación o como material de
partida para la obtención de grasas o de otras sustancias celulares útiles.

Los microorganismos se emplean también para la obtención de enzimas y saborizantes

para la industria alimentaría. Por ejemplo, se utilizan amilasas e invertasas en las industrias de
panadería y pastelería y ácido glutámico y nucleósidos como sustancias aromatizantes en la
industria conservera.

Utilidad en la alimentación animal y humana.

La principal demanda actual y sobre todo futura de proteína Microbiana «single cefl
protein», S.C.P., Proviene del sector de la industria de los piensos.

7
 Las fuentes principales de proteínas vegetales son las tortas de soja con un 45 % de
proteínas y las tortas de semillas oleaginosas de algodón y girasol con cerca del 41 % de
proteínas.

También se emplean como suplemento proteico harinas de pescado y de carne y leche

desnatada en polvo con contenidos de proteína del 66,50 y 3 5 % respectivamente.

Pero en la calidad nutritiva de los microorganismos no sólo son decisivos el contenido

de proteína y la composición de aminoácidos sino también la digestibilidad y la tolerancia.
Mientras que la digestibilidad depende, entre otros factores, del grosor y composición dé la
pared celular, en la tolerancia es especialmente importante el contenido de sustancias tóxicas o
nocivas para el metabolismo. Las posibilidades de utilizar las proteínas monocelulares se ven
reducidas en primer lugar por el contenido de ácidos nucleicos (ácidos ribo y
desoxirribonucleico), puesto que si éste es alto se produce un gran acúmulo de metabolitos
finales como bases púricas y pirimidínicas y ácido úrico.

Dado que ni los mamíferos ni el hombre son capaces de sintetizar por sí mismos ocho
aminoácidos a partir de los alimentos, se ven obligados a ingerir ciertas cantidades mínimas de
dichos «aminoácidos esenciales». En la siguiente Tabla se muestran algunos de los
aminoácidos más importantes.

Tabla.- Composición de los piensos concentrados microbianos , animales y vegetales y

necesidades humanas de aminoacidos esenciales.

Levadur Bacteria Harina Triturados Necesidade

as a sa de de soja s humanas
partir partir Pesca g.
de de do
parafin metanol
as

Proteína 66.2 78.1 66.2 45.0 70 -

bruta 90
Grasa bruta 9.0 4.9 8.1 1.0
Minerales 6.0 11.5 15.5 5.7

Aminoácido
s
esenciales
Leucina 4.2 4.9 5 3.4 7.2
.
0
Lisina 4.2 4.3 4.9 2.8 4.9
Valina 3.2 3.8 3.7 2.3 4.6
Fenilalanina
Y tirosina 4.7 4.8 5.2 3.8 4.2
Isoleucina 2.7 3.0 3.0 2.2 3.9
Treonina 2.9 3.3 3.0 1.9 3.3
Metionina
Y cistina 1.8 2.4 2.6 1.3 2.7
Triptófano 0.8 0.6 0.9 0.6 1.1

7
 Los microorganismos, por ser células de crecimiento rápido, tienen un mayor contenido
de ácidos nucleicos que las células animales y vegetales de los alimentos.
Para las necesidades humanas sólo se contempla la posibilidad de utilizar como alimento las
levaduras en forma de suspensión, pasta o polvo seco. Su alto contenido de vitaminas
(coenzimas) del complejo B las hace especialmente apropiadas para la terapéutica dietética de
convalecientes con una gran necesidad de vitaminas.

MATERIAS PRIMAS Y MÉTODOS DE PRODUCCIÓN.

Cultivo de biomasa bacteriana en metanol.

El metanol tiene ventajas decisivas como sustrato si se le compara con los

hidrocarburos gaseosos y líquidos. Es hidrosoluble y evita los problemas de reparto que se
presentan cuando existe una fase insoluble en agua y los de formación de mezclas gaseosas
explosivas. Además, su obtención a partir de muchas materias primas, sobre todo carbón, gas
natural y petróleo es fácil quimiotécnicamente y económicamente posible.

Es fácil de purificar, su degradación microbiana tiene un calor de reacción bajo y

necesita por ello una menor refrigeración que los hidrocarburos.
Los compuestos C, metanol y formaldehído son tóxicos para la mayoría de los organismos
con excepción de algunas levaduras como Candida spp. y bacterias como algunas especies del
género Methylomonas y algunas Pseudomonas spp.

Los organismos citados disponen de dos rutas especiales para incorporarlos compuestos C,
como metano, metanol, formaldehído y formiato a su metabolismo y utilizarlos como sustrato:
adicionarlos a la ribulosamonofosfato o a la glicina ( reacciones).

Para obtener proteínas a partir de metanol se seleccionó una cepa de Pseudomonas

methylotropha de crecimiento rápido y buena calidad proteica y se ensayó a gran escala.

Su ventaja sobre las levaduras radica en su mayor contenido de proteína (85 %), un tiempo de
generación menor, de dos horas, así como una concentración de producto de 30 g – L. de
peso celular seco.

El elevado aporte de oxígeno necesario se consiguió con un fermentador cíclico que funciona
por aire a presión distribuido homogéneamente.

El cultivo bacteriano, colocado en un tubo ascendente ancho que se estrecha hacia arriba, se
airea intensamente con aire estéril a presión distribuido homogéneamente que se introduce por
la parte inferior y que se mezcla con burbujas que ocupan un 50 % del volumen, con lo que el
cultivo se ve empujado hacia arriba. Un filtro para la espuma situado en la parte superior
facilita la separación del aire y del medio de cultivo. Al tiempo que se elimina el aire efluente, el
cultivo fluye por un tubo horizontal hacia un tubo descendente, donde es impelido nuevamente
por aire a presión y transportado hacia abajo. Por el extremo superior del tubo ascendente se
extrae el cultivo bacteriano que se haya desarrollado.

7
 Diagrama. Fermentador continuo con aire a presión para la obtención de biomasa.

LEVADURA: PANIFICACIÓN.

Cultivo de Levaduras.

Las levaduras pueden cultivarse biotecnológicamente en sustratos que contengan

hidratos de carbono de muy distinta procedencia, en alcoholes y en n-parafinas. Los sustratos
que contienen almidón y celulosa se degradan primero por hidrólisis química en mono y
disacáridos utilizables, mientras que otros sustratos como melazas, pulpas de cítricos y distintas
aguas residuales pueden emplearse sin hidrólisis previa.

Muchos sustratos, como los hidrolizados de madera, los residuos de lejías sulfíticas y
otros residuos vegetales tratados contienen, además de hexosas, pentosas, que no pueden
ser utilizadas por Saccharomyces pero si por Candida y Torula, Sobre todo las cepas de
Candida tienen múltiples aplicaciones porque pueden utilizar la mayoría de los sustratos.

El rendimiento celular por kg. de sustrato empleado depende del contenido energético y
de la concentración del sustrato, así como de su coeficiente de asimilación, es decir, la parte
de él asimilada como nutriente. Esta se ve influenciada a su vez por las condiciones del cultivo,
especialmente la temperatura, la intensidad de la aireación, la concentración de nutriente y él
pH y además por la presencia de sustancias inhibidoras del crecimiento.

Cuando la aireación de los fermentadores con sustratos azucarados no se lleva a cabo

con la suficiente intensidad, parte del azúcar fermenta a alcohol, es decir, no se oxida
totalmente. Pero como los rendimientos máximos sólo son posibles cuando la oxidación es
completa, hay que suprimir la fermentación con una aireación intensiva. Esta desviación del
metabolismo dependiendo de la disponibilidad de oxígeno de la fermentación hacia la
respiración ya había sido observada por Louis Pasteur y se conoce como «efecto Pasteur».
La mayoría de las veces se trabaja en proceso continuo. A 30 °C y pH 5.0 el consumo de
oxígeno asciende en un tiempo de generación de 5 horas a 2,2 kg. por kg. de levadura. Pero
7
hay que airear más intensamente porque sólo se utiliza un 30 % del oxígeno disponible para la
producción de biomasa.

Además, la adición de pequeñas cantidades de ozono de hasta un 1,5 % en volumen

estimula la respiración y el crecimiento de la levadura y es a la vez letal para posibles bacterias
y virus contaminantes. Las n-parafinas que van llegando al sistema se transforman totalmente
en C02, H20, calor y masa celular, de manera que no es necesario ningún tipo de purificación
especial del Cultivo efluente.. Las células se se- paran por centrifugación y se desecan.

Levadura en la panificación.

La levadura que hemos añadido a la masa debe mantenerse viva para hacer su función.
La energía necesaria para la actividad celular la obtiene a partir de los azúcares libres presentes
en la masa, preferiblemente glucosa. Se consumen primero los que ya aporta la harina y que
provienen del grano de trigo. Después, debe ponerse en marcha una compleja maquinaria
bioquímica: la amilolisis.

Teniendo en cuenta los niveles de temperatura a los que se realizan las distintas
operaciones de la panificación, podemos distinguir tres fases:

1. Amasado y fermentación.

2. Cocción.

3. Enfriamiento y almacenamiento.

Maltosa formada y fermentación de la masa

La maltosa es la fracción más importante de la fracción de bajo peso molecular,

producto de la amilolisis. Una vez transportada al interior de las células de levadura, puede
ser desdoblada en dos moléculas de glucosa, materia prima básica para la fermentación
alcohólica que produce el dióxido de carbono –o gas carbónico–, necesario para el desarrollo de
la masa. Su comportamiento químico es éste:

C12H22O11+H2O –––>2 C6H12O6

Maltosa Agua Glucosa

C6H12O6––>2 CH3 – CH2–OH + 2 CO2

Glucosa Etanol Dióxido de carbono

C12H22O11 + H2O –––> 2 C6H12O6

Maltosa Agua Glucosa

C6H12O6 ––> 2 CH3 –CH2 – OH + 2 CO2

Glucosa Etanol Dióxido de carbono
La producción de CO2 es, pues, proporcional a la velocidad de formación de maltosa por las
amilasas.

7
La cocción del pan se produce a una temperatura de unos 250º C y en presencia de vapor de
agua, siendo una etapa tan importante como la fermentación.

El aumento de temperatura de la masa se produce de manera gradual desde el exterior hacia el

interior de la pieza. Como en toda reacción química, el aumento de la temperatura supone una
aceleración de las diferentes reacciones que constituyen la amilolisis. La existencia de un
gradiente de temperatura entre la superficie y el corazón de la pieza añade un efecto de
progresividad de los fenómenos que ocurren con el incremento de la temperatura. Primero se
forma una fina película en la superficie, que se mantienen flexible gracias al vapor de agua
condensado sobre la misma. Por dilatación de los gases que contiene, aumenta mucho el
crecimiento de la masa . Además, las actividades vitales de la levadura sufren también el efecto
del aumento de temperatura, acelerándose la producción de carbónico y alcohol.

Cuando el interior de la pieza alcanza los 65º C, los gránulos de almidón sufren un violento
hinchamiento acompañado de una salida de amilosa, precisamente cuando la actividad de las
amilasas es máxima. Sin embargo, las enzimas, como cualquier proteína, son sensibles al calor.
Cuando se alcanzan los 70º C, la beta-amilasa y la amilasa fúngica añadida, quedan inactivadas.
La alfa-amilasa natural resiste hasta los 80º C.

El efecto final de la amilolisis en esta fase, está directamente ligado a la cinética térmica interior
de la pieza –la velocidad con que aumenta la temperatura en su interior–, y al tipo de alfa-amilasa
(natural o añadida; entre éstas, fúngica o bacteriana).

La alfa-amilasas fúngicas se inactivan antes de la gelificación total del almidón, con lo

que su efecto en la cocción es mucho menor que el de las naturales o las microbianas.

Los mejores resultados tecnológicos se obtienen cuando existe un equilibrio ente alfa y beta
amilasa.

APLICACIONES.

Cultivo de Bacterias.

Debido a las dificultades para separar las pequeñas células bacterianas del medio de
cultivo y por su alto contenido en ácidos nucleicos, hasta ahora se ha empleado poco la
biornasa bacteriana como suplemento proteico.

Un método de aprovechamiento de residuos vegetales que contengan celulosa para la

obtención de proteínas, consiste en degradar dichos residuo con un cultivo mixto de bacterias y
levaduras.

Obtención y aprovechamiento de grasas microbianas.

Muchas levaduras, mohos, bacterias y algas sintetizan y almacenan, en condiciones

adecuadas de cultivo, entre el 25 y el 70 % de su peso celular seco en forma de grasas. Las
necesidades nutricionales humanas se cubren actualmente de manera ex- clusiva con las grasas
animales y vegetales, más baratas. Además, las grasas y ácidos grasos técnicos, que se
obtienen de los vegetales por ejemplo para fabricación de detergentes estará también al alcance

7
de la síntesis biotecnológicas con microorganismos.

Además de las parafinas también son adecuados para la obtención de grasas los
sustratos azucarados principalmente.
De las levaduras son especialmente adecuadas las especies de Rhodotorula, Candida,
Lipomyces y Endomyces; de los mohos las especies de Mucor, Rhizopus, Penicillium, Aspergillus
y Fusarium Entre las bacterias son buenas formadoras de grasas algunas cepas de
Streptococcus, Enterobacter, Bacillus y Mycobacterium.

Además de la selección de las cepas adecuadas, son importantes sobre todo los
sustratos pobres en nitrógeno y fósforo para que haya un almacenamiento importante de grasas
en la célula microbiana. Por ello en muchas levaduras la mejor síntesis de grasas se consigue
cuando el medio de cultivo tiene un contenido de nitrógeno de un 50 –70 % por debajo del
contenido óptimo.

También en este caso los medios de cultivo tienen que ser ricos en azúcares pero
pobres en nitrógeno y fósforo. Se ha comprobado que resulta ventajoso que la relación C:N en
el medio de cultivo sea 66:1.

Las algas unicelulares fotosintéticas también pueden llevar a cabo una gran producción
de grasas sí se les suministra sólo una pequeña parte de sales nutritivas nitrogenadas (como
máxirno 1 % del medio de cultivo). Especialmente el alga verde Chlorella pyrenoídosa pueden
almacenar un máximo de 70-80 % de su peso seco como grasa respectivamente.

Cultivo del Champiñón.

Se empezaron a cultivar sobre todo Agaricus bisporus y A. bitorquis Ambos están

estrechamente emparentados con el champiñón silvestre, A. campestris. A modo de
experimento se cultivó también A. arvensis que forma un cuerpo fructífero de mayor tamaño.

A. bitoquis crece en todos los climas bajo el asfalto de las calles atravesándolo al formar
el cuerpo fructífero por lo que se denomina “ champiñón de calle “

Las especies de Agaricus crecen sobretodo en los suelos de prados y bosques

descomponiéndolos y aprovechando los componentes del humus. Para los cultivos sean
productivos necesitan compost o estiércol en descomposición ricos en nitrógeno.

Vitaminas.

Algunas vitaminas se obtienen por medio de la biomasa, la mayoría de estas vitaminas

son necesarias para la actuación de determinados enzimas, ya que funcionan como coenzimas
que intervienen en distintas rutas metabólicas y , por ello, una deficiencia en una vitamina
puede originar importantes defectos metabólicos, como puede verse en la tabla adjunta:

Enfermedades
VITAMINAS FUNCIONE
7
 carenciales
S
C (ácido Coenzima de algunas peptidasas. Interviene en la
Escorbuto
ascórbico) síntesis de colágeno
Coenzima de las descarboxilasas y de las enzima
B1 (tiamina) Beriberi
que transfieren grupos aldehídos
Dermatitis y
B2 Constituyente de los coenzimas FAD y FMN
lesiones en las
(riboflavina)
mucosas
B3 (ácido Fatiga y trastornos
Constituyente de la CoA
pantotinico) del sueqo
B5 (niacina) Constituyente de las coenzimas NAD y NADP Pelagra
Interviene en las reacciones de transferencia de
B6 Depresisn,
grupos aminos.
( piridoxina) anemia
B12
Coenzima en la transferencia de grupos metilo. Anemia
(cobalamina)
perniciosa
Coenzima de las enzimas que transfieren grupos
Biotina Fatiga,
carboxilo, en metabolismo de aminoácidos.
dermatitis...

8
 UNIDAD VIII. ENZIMAS MICROBIANAS Y PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS.

INTRODUCCIÓN.

Las enzimas, en griego in ferment, son biocatalizadores compuestos por una parte
proteica llamada apoenzima y una no proteica llamada coenzima. Las enzimas, también
denominadas fermentos, son sustancias capaces de acelerar las reacciones bioquímicas del
organismo. Están formadas por una proteína unida a una coenzima, sustancia de naturaleza no
orgánica que es, a veces, un oligoelemento, imprescindible para el funcionamiento de la
enzima, y que suele ser el centro activo de la misma.

Casi todas las reacciones químicas de las células son catalizadas por enzimas, con la
particularidad de que cada enzima sólo cataliza una reacción, por lo que existirían tantas
enzimas como reacciones, y no se consumen en el proceso. Los catalizadores no biológicos
son inespecíficos.

En una reacción catalizada por enzima (E), los reactivos se denomina sustratos (S), es
decir, la sustancia sobre la que actúa la enzima. El sustrato es modificado químicamente y se
convierte en uno o más productos (P). Como esta reacción es reversible se expresa de la
siguiente manera:

La enzima libre se encuentra en la misma forma química al comienzo y al final de la

reacción.

Especificidad.

Las moléculas del sustrato se unen a un sitio particular en la superficie de la enzima,

denominado sitio activo, donde, tiene lugar la catálisis. La estructura tridimensional de este
sitio activo, donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni siquiera sus isómeros) es lo
que determina la especificidad de las enzimas. El acoplamiento es tal que E. Fisher (1894)
enunció: "El sustrato se adapta al centro activo o catalítico de una enzima como una llave a una
cerradura".

Clases de enzima.

El nombre de las enzimas es el del sustrato + el sufijo: -asa. Los nombres de las enzimas
revelan la especificidad de su función:

Óxido-reductasas: catalizan reacciones de óxido-reducción, las que implican la ganancia

(o reducción) o pérdida de electrones (u oxidación). Las más importantes son las
deshidrogenasas y las oxidasas
Transferasas: transfieren grupos funcionales de una molécula a otra. Ej.: quinasas;
transfieren fosfatos del ATP a otra molécula.
Hidrolasas: rompen varios tipos de enlaces introduciendo radicales -H y -OH.
 Liasas: adicionan grupos funcionales a los dobles enlaces.
Isomerasas: convierten los sustratos isómeros unos en otros.
Ligasas o Sintasas: forman diversos tipos de enlaces aprovechando la energía de la
ruptura del ATP. Ej: polimerasas

Mecanismo de acción de una enzima.

Una enzima, por sí misma, no puede llevar a cabo una reacción, su función es modificar
la velocidad de la reacción, entendiéndose como tal la cantidad de producto formado por unidad
de tiempo. Tal variación se debe a la disminución de la energía de activación Ea; en una
reacción química, la Ea es la energía necesaria para convertir los reactivos en formas
moleculares inestables denominadas especies en estado de transición, que poseen mayor
energía libre que los reactivos y los productos.

Una enzima efectúa estas acciones mediante los siguientes pasos:

1. Orienta a los sustratos: parte de la energía de activación se utiliza para que los sustratos
roten y se enfrenten con los átomos correctos para formar los enlaces.
2. Agregan cargas a los sustratos: las cadenas laterales (R) de los aminoácidos de las
enzimas pueden participar directamente haciendo a los sustratos químicamente más
reactivos.
3. Inducen la deformación en el sustrato: cuando una sustancia se une al sitio activo, la
enzima puede causar que los enlaces se estiren, poniéndolo en un estado de transición
inestable.
4. Cambio de forma de la enzima al unirse al sustrato: el modelo de llave- cerradura de
Fisher fue actualizado cuando se descubrió que las enzimas son flexibles y sus sitios
activos pueden cambiar (expandirse) para acomodarse a sus sustratos. Este cambio de
forma causado por la unión al sustrato se denomina ajuste inducido.
5. En la Hexoquinasa puede observarse este ajuste inducido, con el sustrato (glucosa) y
sin él. El ajuste inducido alinea las cadenas laterales reactivas del sitio activo de la
enzima con los sustratos.

Acompañantes no proteicos de las enzimas.

Ya sea que consistan en una única cadena polipeptídica plegada o en varias unidades,
muchas enzimas requieren otras moléculas no proteicas para funcionar.

COFACTORES: son iones inorgánicos que se unen temporariamente a las enzimas

molécula papel en la reacción catalizada

Hierro Fe 2+ o Fe 3+ Oxidación / reducción
Cobre, Cu + o Cu 2+ Oxidación / reducción
Cinc, Zn2+ Ayuda a unir el NAD

COENZIMAS: moléculas pequeñas que tiene carbono, interaccionan débilmente durante

la catálisis. La mayor parte de las coenzimas son vitaminas, muchas de las cuales deben
 ser incorporadas con la dieta.

molécula papel en la reacción catalizada

Biotina transporta -COO-
Coenzima A transporta -CH2-CH3
NAD y FAD transportan electrones

GRUPOS PROSTETICOS: están permanentemente unidos a las enzimas

molécula papel en la reacción catalizada

une iones O2 y electrone contien e
Hemo
cofactor hierro s, e l
Flavina Une electrones
Retinal Cofactor en la absorción de la luz

Las coenzimas reaccionan con la enzima de igual modo que el sustrato, uniéndose al
sitio activo. Se mueven de una enzima a otra agregando o quitando grupos químicos del
sustrato.

ENZIMAS MICROBIANAS.

El Hongo Pleurotus ostreatus.

El hongo Pleurotus ostreatus es un basidiomiceto que produce cuerpos fructíferos con

forma de concha. Se cultiva a nivel industrial para emplearlo como consumo humano, ya que es
un hongo comestible de excelente sabor rico en proteínas y vitaminas.

Para el cultivo industrial de Pleurotus ostreatus, se utilizan substratos ligno- celulósicos o

paja de cereales. El hongo P. ostreatus posee una maquinaria enzimática muy compleja que le
permite degradar los grandes polímeros (lignina y celulosa) que componen el substrato. Sin
embargo, la forma de nutrición de los hongos implica que la capacidad del hongo para producir
enzimas hidrolíticas específicas debido a la presencia de genes específicos, no es suficiente
para la eficiente degradación del substrato. Dado que los hongos filamentosos presentan una
pared celular rígida exterior a la membrana plasmática, las enzimas hidrolíticas además deben
ser secretadas al exterior de la célula, donde degradan los polímeros (lignina y celulosa) para
dar lugar a compuestos de bajo peso molecular que puedan ser absorbidos. La secreción de
enzimas por hongos filamentosos es un proceso muy relacionado con el crecimiento. Y al igual
que éste, la secreción está localizada exclusivamente en los ápices de las hifas.

Se han detectado importantes diferencias en la velocidad de crecimiento entre diferentes

monocariontes de P. ostreatus, pero se desconoce qué estructuras o procesos son
responsables de estas diferencias.

Xilanasas.

La producción de cultivos de hongos para la producción de celulasas y de hemicelulasas

(xilanasas) especialmente para su aplicación en la industria papelera y de la celulosa así como
también para la modificación y producción de lignocelulosa. Se obtiene a partir de cultivos de
hongo Trichoderma reesei modificados genéticamente que producen mas celulasa que el cultivo
original (15 mg celulasa / g micelio/ hora).

Amilasas.

De un correcto equilibrio en la acción de las alfa y beta amilasas en las harinas y en el

proceso de panificación depende el resultado de un pan con una miga bien esponjosa y una
corteja rojiza. En este artículo, su autor estudia la forma en que las amilasas actúan en el
proceso panario y su interrelación entre ellas. Esta interrelación pone en marcha una compleja
maquinaria bioquímica: la amilolisis, que actúa durante el amasado, fermentación y cocción de
los productos panarios.

Nosotros molemos el grano para aprovechar su harina, y parte de las amilasas quedan
en ella.

Se distinguen dos tipos de amilasas, que se denominan alfa (a) y beta (b), y cuya acción
combinada permite liberar unidades de maltosa, azúcar que se forma por la unión de dos
unidades de glucosa. Pero las moléculas de almidón, sistema de reserva de energía de
muchos vegetales, en su estado natural se encuentran empaquetadas en unas estructuras
denominadas gránulos, cuya forma y tamaño es característica de la especie (trigo, maíz,
patata...).

La accesibilidad de las amilasas al interior de los gránulos de almidón está limitada,

salvo que tengan fisuras por donde penetre el agua. En estos gránulos, muchos de los cuales
han sido dañados en la propia molienda, cuando han llegado a un cierto nivel de
hidratación, entran las amilasas y empiezan a actuar. Aunque la proporción de gránulos
dañados suele ser baja, el efecto combinado de humedad y temperatura produce cambios
drásticos en la estructura de los gránulos dañados, que favorecen la amilolisis.
Teniendo en cuenta los niveles de temperatura a los que se realizan las distintas operaciones
de la panificación, podemos distinguir tres fases:

1. Amasado y fermentación.
2. Cocción.
3. Enfriamiento y almacenamiento.

Durante el amasado y la preparación de las piezas, la temperatura se mantiene en torno

a 25º C, por lo que la actividad amilolítica es moderada y prácticamente constante. El almidón
no sufre mayor alteración física que la hidratación de los gránulos dañados, sobre los que se
produce la rápida acción de las amilasas. Sin embargo, los gránulos intactos, son totalmente
impermeables a la beta-amilasa, y sólo la alfa-amilasa provocará una hidrólisis lenta.

Podemos simplificar el balance de la amilolisis en esta fase: Almidón dañado + Agua +

Amilasas ––>Dextrinas + Maltosa + Glucosa
La maltosa es la fracción más importante de la fracción de bajo peso molecular, producto
de la amilolisis. Una vez transportada al interior de las células de levadura, puede ser
desdoblada en dos moléculas de glucosa, materia prima básica para la fermentación alcohólica
que produce el dióxido de carbono –o gas carbónico–, necesario para el desarrollo de la masa.
Su comportamiento químico es éste:

C12H22O11+H2O –––>2 C6H12O6

Maltosa Agua Glucosa

C6H12O6––>2 CH3 – CH2–OH + 2 CO2

Glucosa Etanol Dióxido de carbono

C12H22O11 + H2O –––> 2 C6H12O6

Maltosa Agua Glucosa

C6H12O6 ––> 2 CH3 –CH2 – OH + 2 CO2

Glucosa Etanol Dióxido de carbono

La producción de CO2 es, pues, proporcional a la velocidad de formación de maltosa por

las amilasas.

La producción de maltosa es responsabilidad de la beta-amilasa, bien directamente de

las cadenas de amilosa y amilopectina, o a partir de las dextrinas liberadas por las alfa-
amilasas. El nivel de beta-amilasa de las harinas es más que suficiente, por lo que su actividad
–la intensidad de la producción de maltosa– está, pues, parcialmente condicionada por el nivel
de alfa-amilasa existente en la masa.

Así, cuando el contenido en amilasa natural de la harina es bajo, se mejora la velocidad

de formación de maltosa al añadir amilasa fúngica al inicio del amasado, lo que es práctica
habitual ya que la contienen los mejorantes panarios.

Las dextrinas no transformadas en maltosa juegan un papel relevante en la retención de

agua y en la esponjosidad de la miga. Conforme se va degradando el almidón dañado, parte
del agua absorbida por estos gránulos pasa de nuevo a la masa, reduciéndose la consistencia
de la misma. Un exceso de dextrinas contribuye a hacer pegajosa la masa.
La actividad de las amilasas depende de la temperatura y de la acidez del medio.

La cocción del pan se produce a una temperatura de unos 250 ºC y en presencia de vapor
de agua, siendo una etapa tan importante como la fermentación.

El aumento de temperatura de la masa se produce de manera gradual desde el exterior

hacia el interior de la pieza. Como en toda reacción química, el aumento de la temperatura
supone una aceleración de las diferentes reacciones que constituyen la amilolisis. La existencia
de un gradiente de temperatura entre la superficie y el corazón de la pieza añade un efecto de
progresividad de los fenómenos que ocurren con el incremento de la temperatura. Primero se
forma una fina película en la superficie, que se mantienen flexible gracias al vapor de agua
condensado sobre la misma. Por dilatación de los gases que contiene, aumenta mucho el
crecimiento de la masa . Además, las actividades vitales de la levadura sufren también el efecto
del aumento de temperatura, acelerándose la producción de carbónico y alcohol.

Cuando el interior de la pieza alcanza los 65º C, los gránulos de almidón sufren un
violento hinchamiento acompañado de una salida de amilosa, precisamente cuando la actividad
de las amilasas es máxima. Sin embargo, las enzimas, como cualquier proteína, son sensibles
al calor. Cuando se alcanzan los 70º C, la beta-amilasa y la amilasa fúngica añadida, quedan
inactivadas. La alfa-amilasa natural resiste hasta los 80º C.

El efecto final de la amilolisis en esta fase, está directamente ligado a la cinética térmica
interior de la pieza –la velocidad con que aumenta la temperatura en su interior–, y al tipo de
alfa-amilasa (natural o añadida; entre éstas, fúngica o bacteriana). La alfa- amilasas fúngicas se
inactivan antes de la gelificación total del almidón, con lo que su efecto en la cocción es mucho
menor que el de las naturales o las microbianas.

Los mejores resultados tecnológicos se obtienen cuando existe un equilibrio ente alfa y
beta amilasa. Así, en una harina hiperdiastásica, la actividad de la beta-amilasa es insuficiente
para transformar todas las dextrinas presentes, quedando parte que produce pegajosidad de la
miga y corteza de color rojizas.

Proceso de producción de enzimas y aminoácidos. Introducción.

Muchos grupos de investigación en biotecnología alimentaría, han creado tecnologías
que permiten el desarrollo de nuevos iniciadores, aminoácidos, enzimas o herramientas de
diagnóstico con potencial aplicación en la industria agroalimentaria.

Una planta piloto de biotecnología se ha diseñado para generar, a escala piloto, la cantidad
suficiente de productos. Algunos de estos se detallan a continuación:

o Microorganismos (bacterias, levaduras y hongos) para iniciadores en la industria

agroalimentaria.
o Aditivos alimentarios específicos (enzimas, colorantes, aromas).
o Herramientas de diagnóstico molecular para la detección de contaminantes microbianos
o fraudes en alimentos.
o Microorganismos probióticos (de utilización en salud, nutrición del consumidor, etc.).
o Productos farmacéuticos microbianos.
o Insecticidas microbianos, productos fitosanitarios.
o Validación de procesos (biosensores).
o Manejo de los distintos microorganismos usados como iniciadores en la industria
alimentaría (bacterias lácticas, levaduras y hongos filamentosos).
o Producción por vía microbiana de aditivos.
o Diseño de métodos de purificación de proteínas a partir de caldos de fermentación.
o Adaptación de técnicas moleculares en alimentos.
o Crecimiento de microorganismos en fermentadores de hasta 50 litros.
o Optimización de procesos a partir de fermentadores de laboratorio.
o Manipulación de los caldos de cultivo tanto para la recuperación de células como para la
separación de componentes de alto valor añadido.

Descripción de una planta productora de enzimas.

Vista parcial de una planta piloto: fermentadores de 50 y 25 litros.

 Se distinguen cinco zonas con funciones bien diferenciadas:

1.- Almacén: Se efectúa la recepción de materias primas, previa cuarentena de aquellas que la
precisen.

2.- Laboratorio: Se realizan los controles de calidad de materia prima de acuerdo con la
normativa vigente y se preparan las muestras para su tratamiento posterior considerando
aspectos microbiológicos, de reproducibilidad de muestras y de seguridad para evitar las
contaminaciones.

3.- Zona de producción: En esta zona se realizan los procesos de fermentación y la preparación
de las muestras.

Fermentadores de 5 y 2 litros
4.- Sala de separación: En esta etapa se realiza la recuperación del producto de valor añadido
o de interés, biomasa, proteínas, aromas, etc.., mediante la utilización de técnicas de:

A. Separación por filtración tangencial

B. Liofilización y secado
C. Cromatografía líquida

5.- Sistema fermentador: El biorreactor dispone de sensores específicos que permiten la

medida y el control "in situ" de las variables de una forma precisa y reproducible.

6.- Cepario: Se permite almacenar los productos obtenidos para garantizar la futura producción
y la seguridad. Se realiza la conservación en ultra congelación a - 80 ºC, mediante liofilización.

7.- Controles de calidad: En todas y cada una de las fases del proceso, y al finalizar el mismo,
se realizan controles de calidad

Variables implicadas: Los microorganismos crecerán a una velocidad característica que

depende tanto de la composición del medio de cultivo como de la temperatura, pH, oxígeno
suministrado y condiciones de la mezcla. Por este motivo, durante el proceso de producción se
controlan mediante los oportunos sensores las siguientes variables:

o pH
o temperatura
o presión parcial de oxígeno
o producción de espumas
o nivel.
o

8
AMINOÁCIDOS.

Los aminoácidos son moléculas nitrogenadas simples con cadenas hidrocarbonadas de

bajo peso molecular.

Todos los aminoácidos, a excepción de la glicina, tienen dos formas estructurales o

estereoisómeros: L y D. En las proteínas animales todos los aminoácidos presentes pertenecen a
la serie L. Sin embargo, en ciertos casos el animal dispone de la capacidad enzimática precisa
para aprovechar la forma D, previa transformación a la forma L correspondiente. Así, por ejemplo,
para la metionina ambas formas son totalmente disponibles. Para el triptófano la equivalencia
está en torno al 90-100% en porcino pero sólo es del 55 al 85% en aves. Los isómeros D de
lisina y treonina no son biológicamente activos por lo que no tienen valor para el animal. Lisina,
metionina, treonina y triptófano son los aminoácidos actualmente disponibles a precios
competitivos para la fabricación de piensos.

Como hemos visto, la producción de enzimas y aminoácidos se efectúa a través de un

proceso de fermentadores perfectamente controlados, existen diverso tipos de aminoácidos y
enzimas que pueden ser sintetizados por este proceso, entre ellos destacan los siguientes:

La lisina.

La L-Lisina es un aminoácido esencial o constructor la proteínas, que no se puede

producir por el cuerpo y se debe obtener de otros alimentos. Ayuda a asegurar la absorción
adecuada del calcio y la formación del colágeno para el hueso, el cartílago y el tejido conectivo.
La lisina colabora en la producción de anticuerpos, hormonas y enzimas. La lisina fortalece el
sistema circulatorio y ayuda al sistema inmune a fabricar anticuerpos. También colabora en el
control el equilibrio ácido - alcalino del cuerpo, tiene influencia sobre las glándulas pineal y
mamarias así como en la vesícula biliar. Es necesaria para la asimilación de los aminoácidos.
Una deficiencia puede dar lugar a sensación de fatiga, falta de concentración , irritabilidad, los
ojos rojos, crecimiento retardado, pérdida del pelo, anemia y problemas reproductivos.

La lisina libre o pura es altamente higroscópica lo que limita su uso directo en la

fabricación de piensos. La forma comercial más frecuente es el monoclorhidrato de L- lisina, que
se obtiene mediante fermentación oxidativa utilizando una fuente de carbono (azúcar, almidón,
melazas, etc) y una fuente de nitrógeno (sales amónicas, amoníaco, hidrolizados proteicos, etc)
como sustrato de los microorganismos. También puede obtenerse mediante procesos químicos
enzimáticos a partir del a-amino-e-caprolactama. Los productos comerciales actuales tienen una
pureza mínima del 98% que se corresponde con un valor en lisina del 78% y un contenido en
cloro cercano al 19-20%. Recientemente, se ha iniciado la comercialización de la lisina líquida al
50% obtenida por un proceso similar al del clorhidrato. La diferencia más notable con respecto a
la L-lisina, aparte de la presentación y de la riqueza en el aminoácido, es que no aporta cloro. La
ventaja práctica más importante es la facilidad de manejo y de almacenamiento.

La metionina.

La metionina se comercializa actualmente en dos formas: DL-metionina y DL- metionina

8
hidroxianálogo (DL-2 hidroxi-4 metiltiobutanoico o HMB). La DL-metionina se obtiene por síntesis
química a partir del propileno, metiltiol, metano y amoníaco. El producto sólido comercial tiene
una riqueza superior al 99%, mientras que la presentación líquida (sal sódica), menos utilizada
por la industria, tiene una riqueza en metionina del 40%. Por su naturaleza química su contenido
en Na y S es alto (6,2 y 8,6%, respectivamente). El hidroxianálogo está disponible en forma
líquida, con un 88% de riqueza en el producto original, o en forma sólida, como sal con un 12%
de calcio. Se obtiene por síntesis química a partir del óxido de calcio y del ácido 2-hidroxi 3-
metiltiobutanoico.

La equivalencia en metionina del precursor ha sido objeto de profundas discusiones en

los últimos 20 años. Valores entre el 60 y el 100% han sido publicados en la literatura, con las
cifras más bajas obtenidas normalmente con dietas semisintéticas. En las presentes tablas
hemos adoptado el valor equivalente del 100% (880 g de metionina por cada Kg. de producto
comercial) que es el valor recomendado por los proveedores del producto comercial. Además,
es un producto ligeramente ácido, lo que potencia en cierta medida el control de hongos por
antifúngicos.

La L-treonina.

La L-treonina se obtiene preferentemente mediante un proceso fermentativo por

microorganismos. También puede obtenerse por aislamiento a partir de hidrolizados de proteína
para uso farmacéutico. El producto comercial en fabricación de piensos tiene una riqueza
mínima del 98% y un equivalente en proteína bruta en torno al 73-74%.

El triptófano.

El L-triptófano se obtiene mediante fermentación a partir de la glucosa u otras productos

carbonados como el indol. El producto comercial tiene un mínimo del 98% de riqueza y un
equivalente en proteína bruta del 85-86%. La síntesis química a partir del éster
acetaminomalónico y fenilhidracina produce DL-triptófano, de menor disponibilidad en
monogástricos y de escaso uso en la industria. Recientemente ha aparecido en el mercado una
combinación de triptófano y lisina sintética excipientada en solubles de fermentación. El
producto contiene 55,3% de lisina y 15% de triptófano totalmente disponibles y su equivalente
en proteína es del 95%.

El ácido glutámico.

El ácido glutámico juega un papel importante en la función neuronal ya que es el

principal neurotransmisor excitador del sistema nervioso central, participando en fenómenos tan
importantes como el aprendizaje, la memorización y la plasticidad neuronal durante el
desarrollo del cerebro.

La fermentación y, por consiguiente, los microorganismos también se utilizan para

elaborar aditivos. La propiedad del ácido glutámico (un aminoácido usado para obtener
glutamato monosódico) de potenciar el sabor fue descubierta en Japón a principios del siglo
XX. Además de dar sabor, los aminoácidos son nutrientes esenciales, ya que son
componentes básicos de las proteínas. Algunos alimentos, como los cereales, contienen

9
proteínas con un contenido del aminoácido lisina relativamente bajo. Puede añadirse lisina
para mejorar la calidad nutricional de las proteínas. Las fermentaciones en las que intervienen
las bacterias Corynebacterium glutamicum y Brevibacterium flavum producen tanto ácido
glutámico como lisina.

Sus funciones :

 Es capaz de controlar el exceso de amoníaco en el cerebro evitando así los daños que
éste pueda causar. Participa en los procesos de producción de energía para el cerebro.
 Junto con la vitamina B6 es precursor de un importante neurotransmisor, el ácido
gamma aminobutírico (GABA), con una importante acción sedante sobre el sistema
nervioso.
 Ayuda a la producción de ácido clorhídrico.
 Ayuda a controlar el alcoholismo.
 Ayuda a la cicatrización de úlceras.
 Alivia la fatiga, la depresión y la impotencia.
 Se usa en el tratamiento de la esquizofrenia y la demencia senil.
 Excelente en el tratamiento de las funciones normales de la próstata.
 Interviene específicamente en la utilización de la glucosa por las células del cerebro.
 Funciona como sistema de transporte de aminoácidos y de nitrógeno desde tejidos
periféricos hacia el hígado.
 Precursor en la biosíntesis de las bases purínicas y primidínicas.

9
 VI.- ANEXOS. PRACTICAS DE LABORATORIO

PRACTICA N°1

ELABORACIÓN DE VINO

OBJETIVO:

El alumno obtendrá una bebida tipo vino de frutas, a partir de un sustrato de frutas
inoculando con levaduras mediante un proceso de fermentación.

INTRODUCCIÓN

El vino es una bebida que se obtiene mediante fermentación alcohólica del sumo
de la uva fresca. Los <vinos> preparados a partir de otros frutos , como manzanas y
grosellas, no deben llamarse vinos sin más de más, sino que debe aludirse a los
productos vegetales de que proceden. El vino debe prepararse a partir de uva fresca.
Resulta esencial que el vino se obtenga mediante fermentación y que contenga alcohol.

Una actividad que ha estado ligada a la mayoría de las culturas durante miles de años ha
sido la producción de bebidas alcohólicas.
Evidencias arqueológicas que demuestran que desde hace mas de 7000 años de
antigüedad los humanos aprendimos a encausar las fermentaciones alcohólicas de
diversos sustratos en forma empírica. Quizá las primeras bebidas se hicieron en base a
sustratos azucarados como jugos de fruta, ya que estos solo requieren ponerse en
contacto el jugo con la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta.
Fue hasta el siglo XV cuando empezó a popularizarse el arte de la destilación y de esta
forma aparecen las bebidas con mayor contenido alcohólico.
Debido a la gran importancia de estos productos la investigación científica y tecnológica
generan industrias, las cuales son de mayor importancia económica en el mundo.

III. Bebidas Alcohólicas

“Son soluciones acuosas que contienen además de agua y alcohol sustancias orgánicas
que ejercen influencia sobre los aromas y el sabor “.
“Son bebidas obtenidas a partir de cualquier jugo vegetal que no sea de uva y que tienen
propiedades organolépticas nuevas y atractivas para una prueba estadística significativa de
consumidores”.

HISTORIA DEL VINO

Los hallazgos fósiles, que se remontaron hasta la Era Terciaria, y los

descubrimientos hechos en construcciones lacustres (palafitos), permiten sacar la
conclusión de que las formas primitivas de nuestra vid estaban difundidas por toda
Europa, Norteamérica y Japón. Plantas absolutamente semejantes a las vides actuales
aparecen sólo en los sedimentos superiores de la Era Terciaria, habiéndose hallado
hasta el presente únicamente en Grecia e Italia (Toscana y Piamonte). La obtención del
vino y las prácticas de viticultura tienen evidentemente su origen en los valles fluviales
ricos en vides silvestres de Asia Menor. Allí habitaban pueblo indogermánicos que deben
que deben considerarse antecesores inmediatos del cultivo de la vid y de las prácticas
viticultoras.

Los colonizadores griegos se encargaron de extender el cultivo de la vid a Italia y

sur de Francia (Marsella). Los griegos llamaron al sur de Italia “país del vino” (Oinotria).

III. COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL VINO.

La composición de un vino y sus características dependen de la clase de uva, de

la localización y suelo de la viña, del tiempo atmosférico reinante durante el desarrollo y
maduración, del grado de madurez de los racimos y del estado sanitario de los mismos.
También influyen sobre la composición y calidad de un vino el tratamiento del mosto,
tipo fermentación, levaduras actuantes y los cuidados prestados al vino durante su
maduración.

De acuerdo con su parentesco químico y desde el punto de vista analítico, las

sustancias que componen el vino se clasifican en los siguientes grupos: alcoholes,
ácidos, hidratos de carbono, tanino y pigmentos, compuestos nitrogenados y sales
minerales. A demás contienen el vino pequeñas cantidades de pectina, polisacáridos,
aldehídos, ésteres, terpenos y por lo común también algo de ácido carbónico y ácido
sulfuroso. Todas estas sustancias están disueltas en agua, que constituye el 85 – 90 %
del total del vino. Los compuestos no volátiles de los citados se reúnen en Química
Enológica bajo la denominación de extracto.

El valor de la calidad de un vino depende de manera muy particular de su

contenido de alcohol etílico (etanol), extracto, azúcar, ácidos y sustancias del buqué.

MATERIALES Y REACTIVOS.

4 matraces erlenmeyer redondos de fondo plano de 500 ml.

1 refrigerante
1 matraz erlenmeyer de 250 ml.
1 probeta de 100 ml.
1 tina para baño Maria
1 soporte universal
1 pinza de tres dedos
1 anillo metálico
1 tela de asbesto
1 mechero bunsen
1 parrilla de calentamiento
1 estufa para incubación
1 alcoholímetro
1 termómetro
1 bureta automática
1 pipeta de 10 ml.
1 potenciómetro
1 refractómetro 0-30
1 bureta de 50 ml
pinzas para bureta
1 embudo de filtración
1 cuchillo
1 campana de flujo laminar
3 matracez erlenmeyer de 125 ml.
1 Vaso de precipitado de 1000 ml
2 vasos de precipitado de 250 ml
1 baso de precipitado de 1000 ml
1 matraz volumétrico de 1000 ml
1 matraz volumétrico de 100 ml
3 matracez de 500 ml
1 licuadora
1 extractor de jugos
Centrifuga
Balanza analítica
Etiquetas
Gasas
Algodón
Papel estraza
Mangueras látex
Hielo
Fenolftaleina
NaOH 0.1 N
Solución Buffer PH 4, 7, 10.
Azul de metileno
Felhing A y B
Sacarosa
Na Cl

TÉCNICA:

a) Se selecciona la materia prima (fruta).

b) Se desinfecta la fruta.
c) Mondar y picar la fruta.
d) Licuar para obtener la pulpa (sin agregarle agua).
e) Determinar la humedad de la pulpa.
f) Cuando se tenga lista la pulpa, este se vacía 100 ml en un matraz volumétrico
( 1000 ml), se le agrega la cantidad de azúcar calculada y agua hasta aforar. Esto
se realiza en dos matraces.
 g) Homogenizarlo y determinar los °Brix, que debe dar un valor de 18°B.
h) Determinar azúcares reductores totales del jugo.
i) Determinar acidez del jugo.
j) Una vez que el jugo esté bien homogenizado y se haya obtenido los °B, verter 50
ml de jugo en cada matraz erlenmeyer de 500 ml. Esto se realiza en 4 matraces
de 500 ml.
k) Tapar los matraces con un tapón de algodón y con un caperucho de papel estraza.
l) Poner a hervirlos en la parrilla de calentamiento.
m) Dejarlos de enfriar
n) En 2 matraces se le agrega 0.5 g de levadura y en los otros 2 matraces se le
agrega 1.5 g de levadura.
o) Meter los matraces a la estufa que se encuentra a 28°C.
p) 2 matraces salen a las 25 hrs. que contiene 0.5g de levadura.
q) 2 “ “ 35 hrs. que contiene 1.5g de levadura.
r) 2 “ “ 45 hrs. que contiene 1.5g de levadura.
s) 2 “ “ a las 55 hrs. que contiene 2.5g de levadura.
t) Filtrar el jugo en algodón o con papel estraza.
u) Centrifugar.
v) Realizar determinación de pH, Acidez, concentración de alcohol y la prueba de
evaluación sensorial.

DETERMINACIÓN DE ACIDEZ:

➢ Verter 20 ml de vino en un vaso de precipitado.

➢ Agregarle carbón activado hasta que desaparezca el color del vino.
➢ Se pone a hervir.
➢ Se deja enfriar un poco y enseguida se filtra.
➢ Agregarle 3 gotas de fenolftaleína y después titular con hidróxido de sodio hasta
obtener un color rosa.
➢ Se realiza el mismo procedimiento para los siguientes matraces que contienen
vino de diferentes hrs. Y diferente cantidad de levadura.

CONCENTRACIÓN DE ALCOHOL:

❖ Colocar el refrigerante en el soporte universal.

❖ Verter 50 mL de vino y 50 ml de agua en un matraz erlenmeyer (500ml).
❖ Tapar el matraz con un tapón y colocar el termómetro dentro del matraz.
❖ Conectar con el refrigerante de modo que no se escape el vapor cuando este
empiece a hervir.
❖ A un extremo del refrigerante se coloca la parrilla para poner a hervir dicha
solución.
❖ Cuando empiece a hervir, en el otro extremo del refrigerante se coloca un vaso de
precipitado para recolectar 50 ml del destilado (alcohol).
❖ Se determina el alcohol con el alcoholímetro.
❖ Se realiza el mismo procedimiento para los demás matraces que contienen vino de
diferentes horas y diferente cantidad de levadura.
 PRACTICA 2

Cerveza Negra Clásica

OBJETIVO:

El alumno obtendrá una bebida denominada “Cerveza Negra Clásica” , a partir de

un sustrato de cebada inoculando con levaduras mediante un proceso de fermentación.
INTRODUCCIÓN
Vieja amiga del hombre, era ya conocida por egipcios y babilonios 4.000 años
a.C., el español Pizarro cuando conquista los Andes descubrió que los Incas la fabricaban
a partir del maíz fermentado (chicha). Bebida característica de los pueblos del norte
europeo, se elabora a partir del malteado de varios cereales como el maíz y la avena,
aunque generalmente se utiliza cebada.

Para su producción se debe partir del malteado de la cebada que se transforma en

malta, para ello se humedece la cebada y se la deja una semana para que germine, se
corta el proceso y se procede a secarla, si se quiere obtener cerveza negra se la debe
tostar. El paso siguiente es el molido de la malta, paso siguiente es el braceado que
consiste en mezclar la malta con agua caliente hasta obtener una pasta espesa. El
almidón de la malta se transforma en azúcares fermentados; se filtra el líquido pasándolo
a otro recipiente en donde se calentara hasta el punto de ebullición, antes de que hierba
se le incorpora un poco de lúpulo que le dará ese sabor amargo característico y exquisito.
Se la pasa a las cubas de fermentación en donde se baja la temperatura y se agrega una
selección de levaduras, elemento muy importante para obtener una buena cerveza, al
igual que el agua que debe ser de la mejor calidad y en lo posible de manantial natural y
con poca dureza y acidez, en sí, debe ser neutra y con excelentes características.

Para la fermentación existen dos técnicas, una es la que se realiza en frío, a 5°, y
dura una semana o dos, luego se la lleva a una fermentación secundaria o maduración a
una temperatura de 1 a 2 grados, durante 4 a 5 semanas.

La otra fermentación es en caliente, o de modo natural, a temperaturas más altas y el

periodo de maduración –fermentación secundaria- se realiza en pocos días.
Las cervezas comerciales se pasteurizan para estabilizarlas, sobre todo cuando
son destinadas a la exportación, cosa que no ocurre con las artesanales, que no pueden
perder su cadena de frío, ya que se trata de un producto perecedero, se la debe consumir
en corto tiempo. Otro detalle es que se debe conservar en recipientes de vidrio oscuro o
cerámica ya que se deteriora rápidamente con la luz.

Ingredientes:
2 kgs. Extracto de Malta líquido 1 oz. Bittering Lúpulo
1 oz. Lúpulo Final
1 cucharadita de té Irish moss
¾ taza Priming Sugar
 50 unidades y Tapas para botellas
1 cucharadita de Levadura Nottingham Ale
1 espumadera
1 fermentador (5 galones)
1 hidrómetro
1 termómetro
1 embotelladora
1 Airlock (trampa de aire)
1paq. De solución blanqueadora para esterilizar (One Step No-Rinse Cleaner) 1
tubo para embotellar
1 sifón
1 bottling bucket
1 grifo
1 colador
50 botellas de 250 cm

Equipo:
1 cacerola de 10 litros aprox.
1 batidor
1 cuchara larga

Procedimiento:

Cheque los ingredientes y equipamiento para asegurarse de tener todo antes de

comenzar.
Esterilice TODOS los instrumentos y el lugar de trabajo. Utilice barbijo y guantes
de goma para mantener las condiciones de asepsia.
Ponga 2 a 2 ½ galones de agua en una cacerola y lleve al fuego. Cuando ésta
hierva, sáquela e introduzca los dos paquetes de extracto de malta y bata vigorosamente.
Nota: el extracto de malta se mezclará más fácilmente si la deja reposar en agua caliente
por 10 minutos.
Agregue el bittering lúpulo directamente en la cacerola. Ponga al fuego
nuevamente hasta que alcance el hervor.
Deje esta mezcla (mosto) hierva por 45 minutos batiendo ocasionalmente.
Agregue al mosto el lúpulo final junto con el Irish moss y deje hervir por 15 minutos más.
Saque la cacerola del fuego; usando una espumadera remueva el lúpulo de la
superficie y deséchelo.
Introduzca la cacerola en una pileta de agua fría y recambie el agua hasta que el
mosto alcance una temperatura por debajo de los 100 ºF, preferentemente 80/85 ºF.
En el fermentador esterilizado ponga 2 galones de agua a 55/60 ºF y agregue el
mosto enfriado. Mezcle bien y agregue agua hasta alcanzar la marca de los cinco galones
y la temperatura sea de 70 ºF; revuelva. Usando el hidrómetro, mida la gravedad
específica, el porcentaje de azúcar y el de alcohol y vuelque la información obtenida en la
bitácora.
En una taza esterilizada, hidrate la levadura no más de 15 minutos en 4 a 6 onzas
de agua a una temperatura de 90 ºF. Luego, agréguelo al mosto.
Finalmente, introduzca en la boca del fermentador la trampa de aire esterilizada y
llene esta misma con agua hasta alcanzar la marca intermedia.
Sitúe el fermentador en un lugar con una temperatura ideal de 68 a 72 ºF y fuera
del alcance de la luz solar.
 En 12 a 72 horas verá burbujas en la trampa de aire. Eso indicará que el proceso
de fermentación ya ha comenzado y la levadura está comiendo el azúcar para producir
alcohol y dióxido de carbono. De 3 a 7 días después las burbujas comenzarán a
desaparecer. Utilice el hidrómetro para chequear la gravedad específica.
Si obtiene la misma lectura en los siguientes 3 días, la cerveza estará lista para
embotellar. La gravedad final es usualmente un 25 % mayor que la inicial. Por ejemplo:
Inicial 1,044 ; Final 1,011.
Use botellas retornables únicamente. No utilice botellas a rosca. Limpie y esterilice
las botellas con la solución blanqueadora y cúbralas con un plástico para evitar la
contaminación aérea.
Caliente 1 taza de agua en una cacerola y disuelva en ella ¾ taza de priming sugar.
Enfríe y vuelque el azúcar en el bottling bucket. Utilizando un sifón esterilizado, transfiera
la cerveza del primer fermentador al bottling bucket. ¡NO SALPIQUE!
Esterilice las tapas. Embotelle la cerveza dejando 1 cm. de espacio entre la tapa y el
líquido.
El priming sugar proveerá en la segunda fermentación la carbonatación. Almacene las
botellas a temperatura ambiente en un lugar oscuro por al menos 10 días. La cerveza
estará lista para consumir. Disfrútela!
 PRÁCTICA No. 3
CURVAS DE CRECIMIENTO MICROBIANO

OBJETIVO.
Utilizar algunos métodos para evaluar el crecimiento de los microorganismos.

INTRODUCCIÓN.
El crecimiento celular se define como un aumento ordenado de la cantidad de los
constituyentes y las estructuras celulares. Este crecimiento lleva a un incremento en el
tamaño y peso de las células lo que, en la mayoría de los microorganismos, conduce a la
división celular, dando por resultado el aumento en el numero de células (crecimiento
poblacional). Es importante no confundir este concepto con el de crecimiento individual
que implica solamente el aumento de tamaño, volumen y diferenciación dentro de un
mismo individuo. En general cuando se habla de crecimiento en bacterias se refiere a
crecimiento poblacional.
En la mayoría de las bacterias, el crecimiento se lleva a cabo por un proceso que se
conoce como fisión binaria, durante el cual todos los componentes estructurales de la
célula se duplican. El producto de la división celular genera el ciclo celular que en
bacterias puede ser muy sencillo como el de Escherichia coli (fig. 1).

En el crecimiento bacteriano se involucran aproximadamente 2000 reacciones

químicas como son:

- Reacciones de transformación de energía.

- Biosíntesis de moléculas pequeñas.

- Biosíntesis de cofactores y coenzimas.

- Reacciones de polimerización, como la síntesis de RNA, DNA y proteínas. El tiempo

requerido para que se lleve a cabo la fisión binaria se conoce como tiempo de
generación que es el intervalo necesario para que se formen dos células a partir de
una. Los tiempos de generación varían entre los diferentes microorganismos y
dependen del medio y condiciones de cultivo o hábitat en el que se encuentran
(tabla1).

10
 Las poblaciones microbianas muestran un patrón de crecimiento característico
donde el número de células se duplica por unidad de tiempo, al que se llama “Crecimiento
exponencial”. Experimentalmente esto se puede observar mejor si se hace una gráfica del
número de células a diferentes tiempos, obteniéndose una línea recta (fig. 2). Esta gráfica
se puede utilizar para calcular el tiempo de generación de una bacteria determinada (en el
ejemplo es de 2 horas).
 Los datos presentados en la figura anterior reflejan sólo una parte del ciclo de
crecimiento de una población bacteriana. La curva completa de crecimiento de cualquier
población bacteriana (fig. 2), la cual se puede dividir en las siguientes fases:

a) Fase Lag o de adaptación: la cual puede ser corta o larga dependiendo de

el medio del que proviene la cepa, las condiciones del medio y del estado de desarrollo de
la población microbiana. Así, por ejemplo, si tomamos un inóculo de un cultivo bacteriano
que esté creciendo activamente y lo ponemos en un recipiente con un medio de cultivo
igual y lo incubamos en las mismas condiciones ambientales, la fase lag puede ser muy
corta o no presentarse. Por el contrario, si tomamos un inóculo de un cultivo “viejo” al
ponerlo en otro matraz con el mismo medio, la fase lag se presenta, debido a que las
células necesitan de un determinado tiempo para inducir y volver a sintetizar los
constituyentes que se requieren para su crecimiento. En esta fase, aunque no se presente
un incremento en el tamaño y en la actividad celular, provocando con esto un aumento en
la síntesis de macromoléculas. En primer lugar aumenta el RNA y poco tiempo después la
síntesis del DNA y de proteínas. Esta diferencia en la síntesis de macromoléculas durante el
periodo inicial de cambio o fase lag se conoce como crecimiento desbalanceado.

b) Fase Exponencial: En esta etapa las células se duplican en número y en

masa cada vez que transcurre un cierto tiempo. La velocidad del crecimiento exponencial
depende de las características genéticas del microorganismo, de las condiciones y medio
de cultivo. En cualquier caso, la velocidad de crecimiento se mantiene constante durante
esta fase. Aquí se producen los llamados metabolitos primarios (por ejemplo,
aminoácidos). Mientras menor sea la pendiente de esta fase, mayor será el tiempo de
generación. Debido a que durante el crecimiento exponencial, todos los constituyentes
bioquímicos se están sintetizando más o menos a la misma velocidad se conoce como
crecimiento balanceado. Aunque la fase exponencial no se puede mantener por mucho
tiempo en un sistema o cultivo cerrado, si es posible mantenerla indefinidamente en un
sistema de cultivo continuo diseñado para proveer nutrientes frescos y eliminar
continuamente los desechos metabólicos del cultivo. Existen dos tipos principales de
cultivo continuo: el quimiostato y el turbidostato.

En el quimiostato, se va adicionando medio fresco al cultivo microbiano a la mismo

velocidad que se va eliminando parte del medio que contiene microorganismos. El medio
de cultivo de un quimiostato generalmente posee un nutriente esencial (como un
aminoácido) en cantidades limitadas y debido a esto, la velocidad del crecimiento está
determinada por la velocidad a la cual se está adicionando el medio fresco al cultivo
microbiano, La velocidad de este intercambio de nutrientes se expresa como la velocidad
de dilución, la cual relaciona la velocidad del flujo del medio fresco con el volumen total
del cultivo microbiano. Así, cuando la velocidad de dilución aumenta, el tiempo de
generación del microorganismo disminuye, es decir la velocidad de crecimiento se
incrementa; pero se tiene que controlar muy bien la velocidad de dilución ya que si esta
última es muy alta, los microorganismos pueden ser completamente eliminados del cultivo
donde están creciendo (cuando la velocidad de crecimiento).

El turbidostato posee una fotocelda que mide la absorbancia o la turbidez del

crecimiento microbiano dentro del reservorio; así, la velocidad de flujo del medio fresco
hacia el cultivo microbiano se regula automáticamente y de esta forma se mantiene una
determinada turbidez o densidad celular. El medio de cultivo de un turbidostato no posee
ningún nutriente limitante y mientras que el quimiostato es más efectivo a velocidades de
dilución bajas, el turbidostato trabaja mejor a velocidades de dilución altas.

c) Fase Estacionaria: Esta etapa se presenta en un sistema cerrado y es

debida principalmente a que un nutriente esencial del medio de cultivo se terminó o a que
un producto de desecho del microorganismo en crecimiento es inhibitorio para él mismo.
También se puede producir porque la población microbiana no puede seguir creciendo
debido a que en el medio ya no existe espacio físico para que esto ocurra. En esta fase el
número de microorganismos se mantiene más o menos constante en un estado al que se
conoce como crecimiento críptico. Al mismo tiempo, se producen cierto metabolitos
celulares llamados metabolitos secundarios como los antibióticos, pigmentos. En las
bacterias esporuladas, las esporas se producen precisamente en esta fase de desarrollo.
Cuando existen dos fuentes de carbono en concentración limitantes pueden desarrollarse
dos fases exponenciales y dos estacionarias dando forma a una curva de crecimiento
diaúxico (fig. 3)

d) Fase de Muerte: En esta fase la cuenta total de microorganismos puede

permanecer constante, medida por cuenta directa al microscopio o absorbancia, pero la
cuenta viable disminuye. En algunos casos, la muerte se acompaña de destrucción o lisis
celular con la subsecuente disminución en la turbidez del cultivo o en la cuenta
microscópica directa. Generalmente la muerte de una población microbiana ocurre en
forma logarítmica.

Existen muchas formas de aplicar los conocimientos adquiridos acerca de una

curva de crecimiento en las diferentes áreas de la Microbiología; así por ejemplo, el
microbiólogo industrial involucrado en la producción de alcohol intentará disminuir el
tiempo de la fase lag e incrementar el de la fase exponencial de su cultivo y de esta
manera obtener una producción máxima de alcohol en un tiempo mínimo. Por otro lado, el
microbiólogo clínico determinará la reacción de Gram de los cultivos que se encuentren
en la fase exponencial de crecimiento ya que se sabe que durante la fase estacionaria la
pared celular puede no sintetizarse en forma óptica dando variabilidad a esta técnica de
tinción. Al contrario, en la producción de levadura para alimento, el microbiólogo obtendrá
el cultivo de interés durante la fase estacionaria, ya que es en ésta donde la masa celular
llega a su máximo nivel.
 Es muy importante para un microbiólogo conocer y estudiar el crecimiento
microbiano durante la fase exponencial, ya que esto contribuye a la investigación básica en
fisiología y ecología microbianas y a la solución de varios problemas que se presentan en el
área de la microbiología industrial. Así, cuando un medio de cultivo se inócula con una sola
célula que se divide cada 20 minutos, la población total será de dos células después de
transcurridos los primeros 20 minutos, de cuatro células después de 40 minutos y así
sucesivamente. Debido a que la población se está duplicando cada vez que las células se
dividen, podemos expresar con base de 2 el crecimiento exponencial de la siguiente forma:

21 ----- 22 ----- 23 ----- 24 … 2n (1)

donde “n” representa el número de generaciones. De esta forma, empezando con una
célula, la población total o final “Nf” después de “n” generaciones será:

Nf=1 x 2n (2)
Si la población original o inicial no es una sino cientos o miles de células,
expresamos la población final como:

Nf = No x 2n (3)

Donde “No” representa el tamaño de la población original al tiempo cero. Para

determinar el valor de “n” se transforma la ecuación anterior a logaritmos con base 10,
obteniéndose:

Log Nf = log No + n log 2 (4)

Si de aquí despejamos “n” (5)

n = logNf-logNo
Log2
Para simplificar la ecuación, substituimos el valor del log de 2:
N = logNf-logNo
0.301 (6)

Así, conociendo la población inicial “No” y la población final “N f”, se puede calcular
el número de generaciones “n” que se han producido después de un tiempo de incubación
“t”.
Por otro lado, el tiempo de generación o duplicación “T” de una población
microbiana es igual a tiempo de incubación “t” dividido entre el número de generaciones
“n”:
T= t
n (7)
Despejando “n”, tenemos que:
N=t
T (8)
 Substituyendo la ecuación (8) en la (6):

t Log Nf- log No

T = Tx0.3010 (9)
En algunos casos se requiere conocer el comportamiento de una población
microbiana dentro de una curva de crecimiento que presenta una determinada fase lag,
en estos casos, la ecuación (9) se modifica y tenemos que:

t-L = log Nf – logNo

T T x 0.3010 (10)

Donde “L” es el tiempo de duración de la fase lag y “t”, “T”, “N f” y “No” tienen los
significados establecidos anteriormente.
Otra de las formas matemáticas de considerar el crecimiento exponencial es mediante el
uso del cálculo diferencial, el cual toma como base que dentro de una población
heterogénea (población donde existe una mezcla de células que se encuentran en un
estadio diferente del ciclo celular) una pequeña fracción de esta población está
dividiéndose en un tiempo dado y está contribuyendo con esto a un aumento infinitesimal
en el tamaño de la población. Por lo tanto, si consideramos una población inicial “No” a un
tiempo t=0, entonces después de un intervalo pequeño de tiempo “dt”, una pequeña
fracción de los organismos presentes en “No” completará su ciclo celular, dividiéndose y
aumentando el tamaño de la población en “dN”. Considerando que la magnitud de “dN”
depende del tamaño de “No” a un “dt” constante, la velocidad del cambio celular o más
comúnmente conocida como la velocidad de crecimiento de la población será
directamente proporcional al tamaño de la población inicial. Lo anterior lo podemos
expresar como:

dN No (11)
dt

substituyendo la proporcionalidad por una constante:

dN = No (12)
dt

donde  es una constante de proporcionalidad conocida como la velocidad específica de

crecimiento y cuyas unidades son:

t -1 o bien, h –1 o 1
h
dichas unidades se obtienen si despejamos “” de la ecuación (12):
g

 = dN 1 = l 1 = 1 = h -1
dt No h g h

“” tiene un significado biológico muy preciso, es la medida del número de individuos
nuevos producido por un número dado de individuos ya existentes en un tiempo fijo de
crecimiento.
Ahora bien, con este tipo de planteamiento matemático podemos calcular tanto la
velocidad específica de crecimiento como el tiempo de generación de un microorganismo
determinado. Por lo que si integramos la ecuación (12), obtenemos:

dN = No
dt

Nt = Noe t (13)
Si transformamos la ecuación anterior con logaritmos naturales:
In Nt = In No + t (14)

En este modelo, el tiempo en que se duplica la población será:

t= 1n2 (15)

Por lo tanto, con estas dos ecuaciones (14 y 15) podemos calcular las variables
que se mencionaron en párrafos anteriores.
El crecimiento poblacional puede obedecer a un modelo exponencial sólo bajo
circunstancias especiales (de laboratorio generalmente) y por periodos cortos, pues
ninguna especie exhibe en realidad un patrón de incremento indefinido debido a que
algún factor limita su crecimiento.
 En general, conforme aumenta la cantidad de células en un medio dado, la tasa de
incremento dN/dt disminuye gradualmente hasta que alcanza un valor de cero, en donde
la densidad de la población llega a un máximo; esta mediante una curva como la que se
muestra en la Fig. 4b, que en general puede ser descrita adecuadamente por la ecuación
logística de crecimiento de Verhulst-Pearl y que se expresa de la siguiente forma:

dN = N (K-N) = N(1 – N) (16)

k k

En esta ecuación, la letra “K” se conoce como la capacidad portadora del medio y
representa la densidad de población máxima que de manera estable puede soportar un
ambiente dado y en la que por definición
 = 0, y, dN = C
dt dN
La disminución en la tasa de crecimiento dt se logra mediante una
retroalimentación negativa de la densidad, haciendo que cada célula que se agregue a la
población produzca una reducción en la velocidad de crecimiento; dicho mecanismo
retroalimentador queda manifiesto mediante el término
1-N
K
En el caso del crecimiento exponencial la velocidad específica de crecimiento se
mantiene constante, pero en el modelo logístico ésta va disminuyendo a medida que “N”,
el número de individuos, tiende al valor de “K”, lo cual expresa se expresa de la siguiente
manera:

dN1 =  (1 – N ) (17)
dt N K
N
Conforme “N” aumenta, la razón K se aproxima cada vez más a la unidad y el
término entre paréntesis finalmente llega a hacerse igual a cero, indicando que cuando
N=K, la población se mantiene estable y el crecimiento efectivo es nulo.
Si efectuamos una modificación a la ecuación (17), obtenemos:

N =  (1 – N) =  -  (N) d (18)
Ndt K K

Esta expresión representa la ecuación de una recta con una ordenada al origen
igual a “”, una pendiente negativa igual a  y que corta al eje de las abscisas cuando N =
K (y cuando dN = 0 (ver Fig. 5).
 En el modelo logístico del crecimiento existen dos densidades en las que dN=0
dt ,

una que corresponde a los inicios del desarrollo cuando “N” es muy pequeña y
representa una población crítica por debajo de la cual la población no se desarrollará y la
otra corresponde a la densidad máxima en la que semantiene una población estable. Así
conforme “N” aumenta, también lo hará dN hasta que se alcanza un incremento máximo
cuando el tamaño de la dt población es igual a k , que es donde se presenta el punto de
inflexión de la curva de crecimiento (fig. 2).

A densidades mayores, cuando “N” tiende al valor de “K”, dN empieza a

dt
disminuir asintóticamente hasta que en N = K alcanza un valor de cero y en donde no hay
un crecimiento efectivo, sino de reposición de células, es decir, las células muertas se
substituyen por las que se están dividiendo, manteniéndose un número estable de
organismos. Si se construye una gráfica de dN con respecto al tiempo se obtiene una
curva en forma de campana como dt
la mostrada en la Fig. 2, la cual representa la gráfica típica de la expresión diferencial de
la ecuación Verhulst-Pearl; sin embargo , para el ajuste de datos experimentales se
emplea la forma integrada de la ecuación (16), que se expresa de la siguiente manera:
Nt = K (19)
(1+e a-f)
en donde Nt es el tamaño de la población al tiempo “t”, ; “K”, “” y “t” tienen los
significados ya mencionados y “a” es una constante surgida de la integración de (16), la
cual se define como:
a= Iv (K-No)
No
En la que “No” es la población inicial. La gráfica descrita por la ecuación (19) es una curva
sigmoidal como la mostrada en la Fig.6ª
 Para el cálculo de las constantes de la ecuación (19), trabajando con datos
experimentales, ésta se transforma para obtener:
1v (K-N) = a - t (20)
N
Que de acuerdo al modelo de crecimiento logístico representa la ecuación de una
recta que tiene una pendiente negativa (fig. 5). Para efectuar el cálculo de la pendiente  y
de la ordenada al origen “a” se tiene que utilizar la ecuación (20) y se requiere de una
estimación inicial de “K” que junto con las observaciones de “N” a los correspondientes
“ts” obtenidos en el desarrollo de la población nos permite, a su vez, efectuar una
regresión lineal de 1 n K-N
N
Contra “t” mediante el método de los mínimos cuadrados.
Para determinar el crecimiento bacteriano se pueden utilizar diferentes métodos,
ya sean directos o indirectos. Entre los tres principales métodos directos se encuentran:
A) La cuenta directa al microscopio: donde se utiliza la cámara de Petroff-
Hausser y se cuentan directamente las bacterias presente en una muestra dada,
posteriormente esta cuenta se multiplica por un factor para finalmente determinar el
número de bacterias/ml.
B) La cuenta viable: en la cual se realizan diluciones de la muestra original y
una alícuota de éstas se siembra en el medio de cultivo adecuado, expresándose el
resultado como el número de bacterias o unidades formadoras de colonias por mililitro
(UFC/ml) según sea el caso.
C) La medición de la turbidez: la cual puede efectuarse debido a que las
bacterias absorben y desvían cierta cantidad de luz, permitiendo de esta forma medir el
grado de turbidez del cultivo. Esto último se realiza con la ayuda de un fotocolorímetro con
un filtro rojo o azul o un espectrofotómetro y la lectura se expresa en unidades de
absorbancia. Para organismos unicelulares la absorbancia es proporcional al número de
células.
Dentro de los métodos indirectos, podemos mencionar:
11
 A) La medición de algún componente celular, como las proteínas o el ATP.
B) La medición del consumo de la fuente de carbono del medio de cultivo.
C) La medición en el cambio de algunas variables fisicoquímicas como el pH.

CRECIMIENTO DE HONGOS
Cuando una espora germina, emite un filamento o hifa que se alarga y ramifica
rápidamente a medida que va creciendo, formando así un conjunto de hifas llamado
micelio. El crecimiento de los hongos se lleva a cabo en los ápices de las hifas por lo que
se le conoce como crecimiento apical. Este crecimiento se puede ver al microscopio de
luz con un hongo de crecimiento “rápido” como Neurospora crassa el cual crece a una
velocidad de 40 m/min. a 25°C. También se ha visto un movimiento neto del citoplasma
hacia el ápice de la hifa, por lo tanto, para que el ápice de la hifa crezca tiene que utilizar
el material citoplásmico que viene de atrás.

Por otro lado, se sabe que el ápice hifal también está rodeado por la pared celular,
aunque ésta es más delgada y más “plástica” que la que se
Presenta en el resto de la hifa. Por lo tanto, en el crecimiento de la hifa deben
intervenir tanto una degradación como una síntesis de pared celular de una manera
balanceada.

11
 Hace tiempo se observaron en los ápices hifales ciertas vesículas que aparecían
cuando la hifa estaba creciendo y desaparecían cuando dejaba de crecer. Dichas
vesículas no se han caracterizado completamente pero presentan varios precursores para
la biosíntesis de pared celular y algunas enzimas murolíticas. En la Fig. 6 se observa una
representación hipotética de lo que sucede con las vesículas en la pared celular del ápice
hifal. No se sabe cual es el mecanismo del movimiento de estas vesículas hacia el ápice,
pero se ha sugerido que puede ser: a) por un gradiente electrogénico a través de la hifa,
b) por un flujo electroosmótico de agua hacia el ápice, o c) por un sistema de microtúbulos
o microfilamentos.
También se ha observado que cuando la espora germina existe una fase inicial de
“hinchazón” donde aumenta de tamaño debido a la entrada de agua y que, por lo tanto,
dicha espora tiene que sintetizar pared celular nueva de una manera más o menos
uniforme. Posteriormente la “hifa joven” llamada tubo germinativo emerge de la espora y
es en el ápice de esta estructura donde la síntesis de pared celular empieza a ocurrir. (fig.
7) En otras palabras, la germinación de la espora involucra una fase inicial donde la pared
celular se sintetiza de forma no polar u homogénea en la superficie de la espora seguida
de una síntesis polar en el ápice de tubo germinativo.

¿Cuál es el mecanismo de ramificación de las hifas una vez que la primera de

ellas ha germinado y ha formado el tubo germinativo?
1.- Se sabe que los hongos muestran un crecimiento con dominancia apical
aunque no se conoce el control de dicha dominancia. Las ramificaciones hifales van
apareciendo sólo un poco atrás de los ápices.
2.- Las ramificaciones divergen unas de otras, es decir, crecen hacia direcciones
opuestas, quizá respondiendo al gradiente de nutrientes del medio de cultivo o a la
presencia de inhibidores producidos por la hifa ya existente (fig. 8).
3.- La densidad de una colonia fúngica o el número de ramificaciones que forma
está directamente relacionada con la cantidad de nutrientes en el medio.
4.- Se han observado los diferentes estadios de desarrollo de las colonias fúngicas
jóvenes y se encontró que la unidad de crecimiento hifal “G” se puede expresar de la
forma siguiente:

G= Longitud total del micelio

Número de ápices hifales
 Después de fluctuaciones que se presentan al comienzo del crecimiento, el valor
de “G” se mantiene constante conforme la colonia se desarrolla, siendo dicho valor
característico para cada hongo, por ejemplo, para Geotrichum es de 160 m y para
Neurospora es de 120 m. Al mismo tiempo, se puede calcular la velocidad específica de
crecimiento “” se relaciona con la velocidad de crecimiento radial y el diámetro de la
colonia “W”, como sigue:
Velocidad de crecimiento radial = W
El crecimiento de los hongos filamentos se puede poner de manifiesto por
varios métodos, como son la determinación del crecimiento radial, del crecimiento
longitudinal, del peso seco y del peso húmedo.

REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPO.

Tubos de ensaye de 16 x 150 c0n 4.5 ml de agua destilada estéril

Cajas de Petri con gelosa nutritiva
Pipetas estériles de 1 y 10 ml
Tubos de Ryan con gelosa Sabouraud
Cajas de Petri con gelosa Sabouraud
Matraces nefelométricos con 25 ml de medio E +0.25% de glucosa
Tubos para fotocolorímetro Klett-Summerson
Probeta de 200 ml limpia
Matraces Erlenmeyer de 125 y 500 ml.
Cepas: Escherichia coli, Penicillium sp., Aspergillis sp., Rhizopus sp., Fusarium sp.

METODOLOGÍA.
I.- Cuenta de bacterias por el método nefelométrico.
1.- Inocular un matraz nefelométrico que contenga 25 ml de un cultivo de 12 horas
de E. Coli.
2.- Homogeneizar el inóculo en el medio y medir la turbidez del cultivo en
fotocolorímetro Klett-Summerson (tiempo cero). Incubar el matraz en un baño de 37°C. El
cero del fotocolorímetro se ajusta con medio E sin inocular.
3.- Realizar lecturas como en el punto 2 cada 0.5 horas durante 7 horas,
manteniendo el cultivo a 37°C.
II.- Cuenta viable del inóculo bacteriano original.
1.- Marcar del 1 al 10 dos series de 10 tubos que contienen 4.5 ml de agua
destilada estéril.
2.- Agregar al primer tubo 0.5 ml del cultivo joven (12h) de E. Coli.
3.- Efectuar diluciones decimales hasta 10-10.
4.- Colocar o.1 ml de las diluciones 10-6 a 10.10 en la superficie de 5 placas
de gelosa nutritiva marcadas previamente con la dilución correspondiente
(hacer lo anterior por duplicado).
5.- Extender con la varilla de vidrio previamente esterilizada.
6.- Incubar a 37°C durante 24-48 horas.

III.- Determinación de la relación de la turbidez como unidades Klett-

Summerson (U.K.) y la concentración bacteriana.
 Esta determinación no es necesario realizarla en condiciones de esterilidad, ni con
material estéril.

1.- Colocar 4.5 ml del cultivo original de E. Coli en un tubo para fotocoloríme-
tro Klett-Summerson y medir su turbidez.

2.- Realizar el siguiente esquema de diluciones al cultivo anterior, utilizando

medio E como diluyente. Determinar la turbidez en el fotocolorímetro a cada
una de las diluciones.

Diluir (ml) medio E (ml)

4.5 1.0 Medir U.K.
5.5 1.0 “
6.5 1.0 *
7.5 1.0 *
8.5 2.0 “
10.5 3.0 “
13.5 5.0 “
18.5 7.0 “
25.5 13 “
.0
38.5 25 “
.0
63.5 150.0 “
 IV.- Crecimiento longitudinal de hongos.
1.- Sembrar en un extremo del tubo de Ryan con gelosa Sabouraud
una porción del crecimiento de la cepa del hongo proporcionada.
Incubar a 28°C.
2.- Medir la longitud del crecimiento en mm a las 24, 48, 72 y 96 horas de
incubación.
V. Crecimiento radial de hongos.
1.- Sembrar por punto el centro de una caja de Petri con gelosa Sabouraud
con una porción del crecimiento de la cepa del hongo proporcionada.
Incubar a 28°C.
2.- Medir el diámetro en mm de la colonia a las 24, 48, 72 y 96
horas de incubación.
PRECAUCION:
Mover lo menos posible los tubos de Ryan y las cajas de Petri una vez
inoculadas para evitar la dispersión de las esporas.

INFORME.

1.- Tabular los resultados de la curva de crecimiento por el método

nefelómetrico, como se indica en la siguiente tabla.

Tiempo Unidades Klett

(horas)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7

2.- Escribir en la tabla siguiente, el número de colonias encontradas en

 cada una de las diluciones que efectuó del cultivo original de E.
Coli.

Dilución UFC/0.1 ml UFC/ml

3.- Con base en los datos de la tabla anterior, ¿cuál es el número de bacterias/ml del cultivo
original de E. Coli.
4.- De acuerdo con el punto III de la sección de Métodos, tabule las unidades Klett que
corresponden a cada una de las diluciones efectuadas y calcule la Concentración de
bacterias en cada dilución de la muestra original de E. Coli.

Dilución Unidades Klett Bacterias/ml

a) 1:1.22
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
k)

5.- Hacer una gráfica con los resultados de la tabla anterior. Interpolar
en la gráfica anterior cada uno de los valores de U.K. obtenidos en
el punto 1 de esta sección y tabularlos de la siguiente forma:

Tiempo Unidades
Bacterias/ml (horas) Klett-
Summerson
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
 6.5
7

7.- Hacer la gráfica en papel milimétrico o en computadora con los

resultados de la tabla anterior, colocando en el eje de las abscisas
el tiempo de incu- bación y en el de las ordenadas el número de
bacterias/ml.
8.- Efectuar con los datos obtenidos en esta práctica, una regresión
lineal por el método de los mínimos cuadrados.
9.- Con base en todos los datos obtenidos en esta práctica, diga usted
cuál fue la densidad máxima de población que se alcanzó (“K”) y
calcule cuál fue la velocidad específica de crecimiento (“”) para E.
Coli y cuál su tiempo de generación.
10.- Tabular los resultados del crecimiento lineal y radial de los hongos,
como se indica en la siguiente tabla.
Tiempo
(días) Radial Lineal
0
1
2
3
4
Cepa

11.- Hacer una gráfica con los resultados de la tabla anterior, colocando el
tiempo de incubación en el eje de las abscisas y el crecimiento en
centí- metros en el de las ordenadas.

CUESTIONARIO.
1.- De acuerdo con el modelo de crecimiento exponencial, resuelva el
siguiente problema: usted inoculó 106 células de E. Coli en 25 ml de
medio de cultivo adicionado de glucosa, incubó su matraz durante 4
horas. Sabiendo que el tiempo de generación es de 20 min. Calcule el
número de bacterias, toma
0.01 ml del matraz y lo inocula en medio de cultivo con manitol; incuba
durante 4 horas, obteniendo al cabo de este tiempo 2.4 X 10 7 bacterias/ml.
En este medio se presentó una fase lag de 20 min. Calcule usted el tiempo
de generación para este microorganismo en el medio con manitol.

2.- Si tenemos un cultivo que contiene 100 células de E. Coli, el cual

presenta un tiempo de generación de 30 min. a 35°C, dibuje la curva de
crecimiento de dicha bacteria cuando: a) las células se incuban a 35°C
durante 5 horas.
b) después de 5 horas, la temperatura se cambia a 20°C durante 2
horas.
c) después de 5 horas a 35°C la temperatura se cambia a 5°C durante 2
horas, al término de las cuales se regresa a 35°C durante 5 horas
más.
 REFERENCIAS.

Campbell, R.C. 1974. Statistics for biologists. 2nd Ed. Cambridge

University Press, London. P 385.

Deacon, J.W. 1984. Introduction to modern mycology. 2nd. Ed.

Blackwell Scientific Pub. Pp 42-56

Donachie, W:D: 1993. The cell cycle of Escherichia coli. Ann. Rev.
Microbiol. 47: 199-230

Hutchinson, G.E. 1978. An introduction to population ecology. Yale

University Pree. P 260 p.

Kolter, R., D. A. Siegele y A: Tormo. 1993. The stationary

phase of the bacterial life cycle. Ann. Rev. Microbiol. 47:855-
874.

Krebs, C.J. 1978. Ecology: the experimental analysis of distribution and Abundance. 2 nd.
Ed. Harper and Row, Pub. P 678.

Martínez Jerónimo, F:F: 1983. Crecimiento poblacional. En: Comparación De curvas de

crecimiento poblacional de Ankistrodesmus falcatus (Chlorellales, Chlorolleceae)
obtenidas al utilizar diferentes medios de cultivo. Aspectos ecológicos y de nutrición
mineral en el cultivos de algas microscópicas. Tesis profesional. Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas, IPN. México, D.F.

Poole, R.W. 1974. An introduction to quantitative ecology. Mc. Graw Hill Kogakusha, Ltd.
P. 532.
 PRÁCTICA No. 4

FERMENTACIÓN ACÉTICA EN UN REACTOR DE LECHO FIJO.

OBJETIVOS.
Producir vinagre de vino por un método industrial a escala de laboratorio como es
el caso del biorreactor con células inmovilizadas del tipo Frings determinando los
parámetros de proceso: cálculo de las mezclas vinagre-hidroalcohólicas para la
alimentación del biorreactor; cálculo de oxigeno necesario para la oxidación alcohólica;
cálculo de rendimientos de alcohol-vinagre; determinación del intervalo de temperatura
óptima de producción y obtención de vinagre al 4%, de tal manera que se amplíen los
criterios de aplicación de la Ingeniería Bioquímica.

INTRODUCCIÓN.
Aunque hace miles de años que se conoce el vinagre, no se determinó la
naturaleza microbiológica de su producción hasta hace poco m s de 160 años, cuando
Kútzing dio a conocer que la conversión del etanol en ácido acético era llevada a cabo
por microorganismos vivos. Quince años antes, Peerson había designado con el nombre
de Mycoderma a la película que se forma sobre los líquidos en los cuales tiene lugar una
fermentación acética. Pasteur (1868), confirmó la opinión de Kútzing y demostró la
naturaleza fisiológica de la fermentación acética, pero Pasteur creía que esta
fermentación era ocasionada por una sola especie de bacteria, Mycoderma aceti.
En 1878, Hansen demostró que eran más de una las especies de bacterias
capaces de producir la acidez de la cerveza, es decir, la oxidación del etanol a ácido
acético. Aisló y dio nombre a Bacterium aceti, y a Bacterium pasteurianum. Más tarde
aisló Bacterium kutzingianum, mientras que Brown describía una cuarta especie. Hacia el
año 1879. Hemberg estudió el grupo, lo reclasificó y describió varias especies más. La
nomenclatura y clasificación vigente es la adoptada en el Manual de Bergey.

Actividades bioquímicas tic Acetobacter.

Las actividades bioquímicas de Acetobacter consisten principalmente en procesos
catabólicos aerobios y anaerobios y en la síntesis de polisacáridos. Desde el punto de
vista industrial las m s importantes son las desasimilaciones aerobias que comprenden el
catabolismo oxidante de azúcares y alcoholes. De ellas la mejor conocida y más antigua
es la de producción de ácido acético o vinagre.
bacterias
CH3CH20H + 02 CH3COOH + H20
acéticas

El vinagre es el condimento hecho a partir de sustancias azucaradas o feculentas

por fermentación alcohólica seguida de fermentación acética cuyo producto final no debe
contener menos de 4 g de ácido acético por cada 100ml de solución a 20 grados
centígrados.
De acuerdo con lo anterior el proceso general quedaría descrito por:

levaduras
C6H 12O6 + O2 CH3CH2OH + CO2

12
 Bacterias acéticas
CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2o

Requisitos generales de la fabricación:

En la moderna fabricación de vinagre hay que considerar varios factores: la

selección de microorganismo, la naturaleza de la materia prima, las concentraciones del
etanol empleado y del vinagre añadido al principio para acidificarlo, la cantidad de oxígeno
suministrada, la naturaleza del medio de fermentación, la temperatura de fermentación, la
maduración y conservación, la clarificación, el embotellado y la pasteurización y
finalmente el carácter y composición de los depósitos, recipientes y materiales que se
ponen en contacto con el vinagre durante el proceso de fabricación.

METODOLOGÍA.
Aunque hace miles de años que se conoce el vinagre, no se determinó la
naturaleza microbiológica de su producción hasta hace poco m s de 160 años, cuando
Kútzing dio a conocer que la conversión del etanol en ácido acético era llevada a cabo
por microorganismos vivos. Quince años antes, Peerson había designado con el nombre
de Mycoderma a la película que se forma sobre los líquidos en los cuales tiene lugar una
fermentación acética. Pasteur (1868), confirmó la opinión de Kútzing y demostró la
naturaleza fisiológica de la fermentación acética, pero Pasteur creía que esta
fermentación era ocasionada por una sola especie de bacteria, Mycoderma aceti.
En 1878, Hansen demostró que eran más de una las especies de bacterias
capaces de producir la acidez de la cerveza, es decir, la oxidación del etanol a ácido
acético. Aisló y dio nombre a Bacterium aceti, y a Bacterium pasteurianum. Más tarde
aisló Bacterium kutzingianum, mientras que Brown describía una cuarta especie. Hacia el
año 1879. Hemberg estudió el grupo, lo reclasificó y describió varias especies más. La
nomenclatura y clasificación vigente es la adoptada en el Manual de Bergey.
Actividades bioquímicas tic Acetobacter.
Las actividades bioquímicas de Acetobacter consisten principalmente en procesos
catabólicos aerobios y anaerobios y en la síntesis de polisacáridos. Desde el punto de
vista industrial las m s importantes son las desasimilaciones aerobias que comprenden el
catabolismo oxidante de azúcares y alcoholes. De ellas la mejor conocida y más antigua
es la de producción de ácido acético o vinagre.
bacterias
CH3CH20H + 02 CH3COOH + H20
acéticas
El vinagre es el condimento hecho a partir de sustancias azucaradas o feculentas
por fermentación alcohólica seguida de fermentación acética cuyo producto final no debe
contener menos de 4 g de ácido acético por cada 100ml de solución a 20 grados
centígrados.
De acuerdo con lo anterior el proceso general quedaría descrito por:

levaduras
C6H 12O6 + O2 CH3CH2OH + CO2

Bacterias acéticas

12
 CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2o

Requisitos generales de la fabricación:

En la moderna fabricación de vinagre hay que considerar varios factores: la

selección de microorganismo, la naturaleza de la materia prima, las concentraciones del
etanol empleado y del vinagre añadido al principio para acidificarlo, la cantidad de oxígeno
suministrada, la naturaleza del medio de fermentación, la temperatura de fermentación, la
maduración y conservación, la clarificación, el embotellado y la pasteurización y
finalmente el carácter y composición de los depósitos, recipientes y materiales que se
ponen en contacto con el vinagre durante el proceso de fabricación.

RESULTADOS.
 Presentar en un cuadro los cálculos para. el ajuste de la concentración de
la mezcla vino-vinagre y la aireación necesaria.
 Presentar cuadro y gráfica de la velocidad media de reacción.
 Si la velocidad de reacción es de primer orden, usando los valores
experimentales, determinar:
a) - la constante k de la reacción
b) - el tiempo óptimo de cosecha

 Proponga y establezca las condiciones de operación de un biorreactor tipo

Frings capaz de producir 500 1 de vinagre de vino cada 24 horas.

REFERENCIAS.
Amerine, M.A.1974. Análisis de vinos y mostos. Ed. Acribia, Barcelona
Pirt, S.J. 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Blackwell Scientific
Publications, London.

Prescott, S.C. & Dunn, C.B. 1962.Microbiología Industrial. 3a Edición. Editorial

Aguilar. Madrid

Antonio Madrid, V. 1991. Vinos e industria vinícola. Tecnología del vino y bebidas
derivadas. Mundi-Prensa Libros S.A.. Madrid España 1991.
Vinagre envasado para consumo público. Norma Oficial Mexicana DGN-F-122-
1968. Secretaria de Comercio y Fomento Industrial

Nomura, Y., lwahara, M. & Hong, M. 1994. Production of acetic acid by

Clostridium thermoaceticum in electrodialysis culture using a fermenter equipped with an
alectrodialyser. World lournal of Microbiology and Biotechnology. 10 (4):427-432

Han, K, henry c. Lim, H.C. & Hon& J. 1992. Acetic acid formation in Escherichia
col- fermentation. Biotechnology and Bioengineering. 39:663-671

Hekmat, D. & Vortmeyer, D. 1992. Measurement, control, and modeling of

submerged acetic acid fermentation. Journal of Fermentation and Bioengineering. 73:26-
30

12
 PRÁCTICA No. 5
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS DE HONGOS

OBJETIVOS.
Realizar la extracción y purificación parcial de la invertasa de levaduras.

INTRODUCCION.
Los caldos de fermentación son mezclas complejas, compuestas de células,
productos solubles extracelulares, productos intracelulares y medio de cultivo sin
convertir. Particularmente un bioproceso incluye los procesos de producción de un
metabolito específico y su posterior recuperación.
La selección del proceso de recuperación del producto se basa en los siguientes
criterios:
❖ La localización del producto (intracelular o extracelular).
❖ La concentración del producto en el caldo de fermentación.
❖ Las propiedades físicas y químicas del producto (tamaño, carga,
solubilidad, etc.).
❖ El uso tentativo de] producto.
❖ Las impurezas del caldo de fermentación.
❖ El precio del producto en el mercado.

La secuencia de operaciones a través de las cuales se somete el caldo de

fermentación para obtener el producto deseado con una alta pureza son generalmente las
siguientes:
Remoción de partículas insolubles. Las operaciones más comúnmente usadas en
esta etapa son filtración, centrifugación, sedimentación y decantación.

Aislamiento primario. La extracción con disolventes, la adsorción, precipitación y

ultrafiltración son las operaciones m s usadas. Durante este aislamiento primario, la
concentración del producto deseado aumenta considerablemente.

Purificación. Con esta operación se remueven las impurezas del producto

concentrado, se utilizan entre otras operaciones la precipitación fraccionada, diferentes
tipos de cromatografía o la adsorción.

Obtención del producto final. En esta última etapa se obtiene el producto con el
nivel de pureza requerido. Los procesos que se incluyen aqu¡, son un secado al vacío,
cristalización y liofilización.

En la presente práctica se realizar la extracción y parcial purificación de la

invertasa de levaduras La enzima invertasa y en especial la invertasa de levadura ha
tenido un papel primordial en el desarrollo de la enzimología. Gran parte de los
conocimientos en cinética enzimática se deben a esta enzima.

La invertasa es una enzima con especificidad de fructofuranosidasa que participa

en la reacción de hidrólisis de los oligosacáridos con enlaces del tipo -
21,fructofuranosos. Se obtiene comercialmente a partir de la levadura de Saccharomyces
cerevisiae que es un subproducto de la industria cervecero. Sin embargo después de un
estudio cinético realizado, se encontró que en la levadura Candida utilis Y-900 bajo ciertas
condiciones se presenta una mayor actividad específica (U/g de células). Actualmente en
México no se produce invertasa y la que se utiliza en la industria es importada de Europa
y los Estados Unidos.

A pesar de que es una enzima extracelular, la mayor parte de ella está retenida en
la pared celular, por lo que es necesario la desorganización de esta estructura para su
liberación.
Se ha informado que compuestos con grupos sulfhidrilos son capaces de inducir la
liberación de enzimas que se encuentran de alguna forma unidas a la pared celular de
levaduras. La adición de cisteína a altas densidades celulares de la levadura reduce el
tiempo de liberación de la enzima.
Una vez que se tiene el extracto enzimático, se seleccionan las técnicas para la
purificación de la invertasa. En este caso el mejor m‚todo fue la precipitación con etanol,
estableciendo las condiciones para precipitar selectivamente a la invertasa, dejando en
solución al resto.
El etanol ha sido empleado por varias décadas como un agente precipitante de
proteínas. La obtención de proteínas puras de una mezcla compleja se facilita por la
influencia de factores como el pH, la fuerza iónica, la temperatura y la concentración de
proteína sobre la acción precipitante del etanol.
Además de interaccionar con otras variables, el etanol por s¡ mismo causa
precipitación de proteínas ya que disminuye significativamente la constante dieléctrica de
las soluciones acuosas.
Finalmente se utiliza la centrifugación para recuperar el precipitado.

METODOLOGÍA.
Se utilizará la biomasa generada en la práctica de Producción de proteínas
unicelular mediante la técnica de cultivo extendido como materia prima para la obtención
de la invertasa, o bien, se emplear S. cerevisiae de origen comercial.

ACTIVIDADES POR SESIÓN.

SESIÓN 1. EXTRACCIÓN DE LA ENZIMA UTILIZANDO CISTEINA.

Se utilizará una concentración celular de aproximadamente 200 g/-,

resuspendiendo el paquete celular en una solución reguladora de fosfatos 0.1 M pH 7.2.
Se adicionará cisteína hasta una concentración de 0.25% (p/v) y se incubará a
temperatura ambiente por 24 horas. Después de este tiempo la suspensión se colocará
en el refrigerador hasta la siguiente sesión.

Una hora después de haberse iniciado la autolisis, se tomará una muestra a la

que se le determinará la actividad enzimática y la concentración de proteína. Se
comparará con una muestra tomada al inicio de la incubación para asegurarse de que
está llevándose a cabo el proceso de autolisis.

SESIÓN 2. RECUPERACIÓN PARCIAL Y PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA.

 Recuperación de la enzima. Separar los residuos celulares por centrifugación de la
suspensión celular a 3500 rpm por 10 minutos Tomar una muestra del sobrenadante para
su posterior análisis de actividad y concentración de proteína.

Purificación parcial de la enzima. Al sobrenadante obtenido se le adicionan 4°C

volúmenes de etanol muy lentamente y con agitación en un baño de hielo. Se deja
reposar por una hora a 40C para permitir la precipitación de la enzima. Después de este
tiempo se recuperar el precipitado por centrifugación a 3500 rpm por 10 minutos. El
precipitado se resuspende en un volumen exacto de regulador de TRIS-HCI 50 mM y pH
de 7.2. A este precipitado se le determinará la actividad de invertasa empleando el
método de glucosa-oxidasa-peroxidasa y la concentración de proteína por el método de
Lowry.

METÓDOS ANALÍTICOS.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE INVERTASA POR EL MÉTODO DE LA
GLUCOSA-OXIDASA-PEROXIDASA.
Reactivos:
A. Solución enzimática: a un litro de regulador de fosfatos 0.1 M pH 7.0 se le
adicionan 5 mg de peroxidasa (SIGMA) y 1 ml de la enzima glucosa oxidasa (SIGMA).
B. Solución de o-dianisidina: 300 mg de o-dianisidina en 50 mi de agua destilada.
C. Mezcla enzimática: 20 mi de reactivo A m s 1 mi de reactivo B (preparada al
momento de usarse).
D. Solución de sacarosa 0.5 M.
E. Solución de HCI 6 N.
F. Regulador de acetatos 0.1 M PH 4.5.

Procedimiento:
En un tubo de ensayo se colocan 100 microlitros del reactivo F y 50 microlitros del
reactivo D. La mezcla se incuba 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se
adicionan 2 mi del reactivo C y se deja a temperatura ambiente durante 8 minutos.
Transcurrido este tiempo se detiene la reacción adicionando 2 mi del reactivo E. El color
desarrollado se mide a 540 nm en un espectrofotómetro.

Para ajustar el espectrofotómetro se prepara un testigo de reactivos siguiendo el

mismo procedimiento usando agua destilada en lugar de muestra. También se utiliza un
control de glucosa 2 mM.

Una unidad de invertasa (U) se define como un micromol de glucosa liberada por
un minuto en las condiciones de ensayo.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE LOWRY.

Reactivos:
A. Solución de tartrato de sodio y potasio al 1% en sulfato cúprico al 0.5%.
B. Solución de carbonato de sodio al 2% en hidróxido de sodio 0.1 N.
C. Se mezclan 50 mi de B con 1 mi de A (preparado al momento de usarse)
D. Reactivo Folin-Ciocalteu diluido 1:2 con agua destilada.
 Procedimiento:
En un tubo de ensayo se adicionan 500 microlitros de muestra diluida y 5 ml del
reactivo C, se dejan incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, pasado este
tiempo se agregan 0.5 ni] del reactivo D, la mezcla se agita y se esperan 30 minutos para
que se lleve a cabo la reacción, transcurrido este tiempo, el color desarrollado se mide en
un espectrofotómetro a 500 nm. De la misma manera se prepara un blanco de reactivos,
sustituyendo la muestra por agua destilada, y un control utilizando una solución de
albúmina de bovino de 0.5 mg/ml tratado en forma similar.

RESULTADOS.
1. Elaborar un cuadro comparativo de la actividad enzimática en el
sobrenadante y el paquete celular antes y después de la extracción.
2. Determinar el % de liberación de la enzima durante la extracción.
3. Determinar la eficiencia de recuperación de la enzima durante la
purificación.
4. Determinar el grado de purificación relativo de la invertasa.
5. Discusión y conclusiones.

REFERENCIAS.
Ahuatzi C. D. Extracción y purificación de la invertasa de Cándida utilis Y-900.
Tesis Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. IPN. México.

Castro B.F. & Romero, F.F. 1984. Cinética de acumulación de invertasa de

levaduras cultivadas en distintos sistemas fermentativos. Tesis Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas. IPN. México.

De la Vega, G. M., & Paneque, A. 1990. Purification and properties of an

extracellular invertase from Acetobacter chroococuni. Enzynic & Microbial Technol.13:267-
271.

Casc¢n, S & Lampen, 0. J. 1968. Purification of the internal invertase of yeast. J.

Biol Chem. 243:1567-1572.

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-fructofuranoside (an exo-inulase) form Kluyveroniyces fragilis at high density.
Enzyme Microb. Technol. 7:239-242.
Lowry, 0. H. Rosebrough, N. J. Farr, A.L. & Randall R. J. 1951. Protein
measurement with the Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.
 PRÁCTICA No. 6
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

OBJETIVOS.
Esta práctica tiene como objetivo que el participante conozca la importancia
económica y social que tiene la producción de alcohol, permitiendo la integración de
conocimientos de microbiología industrial, ingeniería bioquímica, operaciones unitarias,
as¡ como diversos métodos analíticos, para su elaboración a escala de laboratorio,
partiendo desde el acondicionamiento de la materia prima hasta la recuperación de]
producto, basados en una investigación previa de los métodos actuales de producción de
alcohol a nivel industrial.

INTRODUCCIÓN.
Una de las fermentaciones industriales de mayor importancia económica y, quizás,
la más antigua producida por el hombre, es la fermentación alcohólica, que es la base
para la producción del aguardiente, por destilación de un mosto fermentado.
El mosto fermentado se obtiene a partir de la acción de un microorganismo
usualmente una levadura, sobre una solución azucarada.
La fuente más común para la producción de alcohol, es la caña de azúcar,
utilizando principalmente en la industria las melazas. Otras son los frutos, los granos,
tubérculos, y agaves. El uso de una u otra dependerá del producto que se desea y de un
estudio económico.
A continuación se presenta una tabla que relaciona el tipo de bebida alcohólica
según la materia prima que se utilice.

MATERIA PRIMA BEBIDAS NATATURALES BEBIDAS DERIVADAS

I.Frutas
Uvas.
a) Vinos generosos. Licores (bebidas naturales
b) coñac. con ingredientes y
c) Brandy. endulzadas).

Manzana. a)Sidra.
Durazno, zarzamora, b)Licores
Naranja, etc.
II. Caña de azúcar
Piloncillo.
a) Aguardiente. Licores
b) Ron. Vodka, Ginebra.
c) Alcohol
Melazas.. a) Aguardiente. Licores
b) Ron. Vodka Ginebra
c)Alcohol Alcohol industrial

III. Granos
Maíz glucosa a) Whisky. Vodka.
b) Alcohol Ginebra.
 Cebada, maltosa, a) Cerveza.
Y glucosa. b) Whisky.

Arroz. a) Sake.
b) Whisky

IV.Tubérculos
Remolacha. a) Aguardiente.
b) alcohol.

Papa .a) Aguardiente.

b) Whisky.

V.Agaves
Agave atrovirens. a) Pulque.
Agave azul. a) Tequila
Agave esperrima Jacobi a) Mezcal
Agave. a) sotol
.
REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPO.
1. Materias primas: Fuente de carbono (de acuerdo a la disponibilidad en el
laboratorio, melazas, piloncillo, ó almidón y malta), sulfato de amonio dibásico, fosfato de
amonio, sulfato de magnesio, ácido sulfúrico 1:1, levadura de panificación seca o fresca,
y agua.
2. Mosto: Preparar el mosto a partir de melazas, o piloncillo, continuar en el
inciso 3. Si la materia prima es almidón y malta, continuar en el punto 7.
3. Determinar el contenido de azúcares reductores y los grados Brix a las
melazas (piloncillo).
4. Con el resultado anterior, y utilizando el diagrama de Pearson, estimar la
cantidad de melazas que se requieren para 15 litros de mosto con una
concentración de 18 % de azúcares reductores.
5. Enriquecer el mosto con:
NH4)2SO4 0.300 g/l.
NH4)2HP04 0.240 g/l.
MgSO4 0.024 g/l.
6. Ajustar el pH entre 4.0 y 4.5 con ácido sulfúrico diluido 1:1
7. Almidón, en este caso se requiere como paso preliminar la transformación
del almidón en azúcares fermentables por la levadura, este proceso se realiza utilizando
enzimas procedentes de otras fuentes, que hidrolizan al almidón en maltosa y glucosa. El
grano de trigo se somete a una molienda regular, para aumentar el rea de contacto del
almidón con las enzimas, pesar y colocar la molienda en un recipiente y agregar dos
veces su peso de agua, y calentar para gelatinizar el almidón. La temperatura de
gelatinización varía con el tipo de almidón y tamaño de los granos, por ejemplo el almidón
de trigo gelatiniza a temperatura de 60 a 85°C, el de papa entre 55 y 60°C y el almidón de
arroz entre 80 y 85°C. el tiempo de gelatinización es de 15 a 20 minutos. Ya gelatinizado,
se ajusta la temperatura a 70°C y se le adiciona de un 20 a 30% de malta referido al peso
de la molienda del grano de almidón, se mantiene a 70'C para que las enzimas que se
encuentran en la malta actúen hidrolizando el almidón, el tiempo de hidrolizado se
determina con una prueba sencilla de tinción de almidón con una solución de yodo al 1%,
cuando la prueba es negativa, habrá terminado el proceso de gelatinización (el yodo ya
no da color, ya que los almidones han sido hidrolizados).
8. Se procede como en los puntos 3, 4. y 6, y luego pasar al inciso 9
9. Fermentación: Para iniciar la fermentación primero se tiene que inocular
adicionando 2 g de levadura fresca de panificación por litro de mosto, o 1 g de levadura
de panificación seca por litro de mosto. Se recomienda activar la levadura 30 min. antes en
1.5 litros del mismo mosto con burbujeo de aire estéril. Una vez realizado esto, se tapa el
recipiente en que ha de efectuarse la fermentación, del cual se tomar n muestras cada 6
horas para el control del proceso, iniciando con una muestra al tiempo cero.

CONTROL DEL PROCESO.

A.R. Bx pH CONC. Gl. TEMP.

(g/1) (20*C) CELULAR (150C) (*C)
materias
primas x x
mosto x x x x
fermentación x x x x x x

Azúcares: Tomar 5 ml de muestra en un matraz volumétrico de 100 mi,

agregar 20 ml de agua y 1 mi de ácido clorhídrico concentrado. Poner a ebullición 5
minutos, enseguida agregar 20 ml de agua y 1.5 ml de hidróxido de amonio concentrado y
llevar a 100 mi con agua destilada. Con esta solución titular el reactivo de Fehling (5 ml
de solución "A" más 5 mi de solución "B" más una gota de azul de metileno al 1%). Para
cuantificar el azúcar presente es necesario conocer el factor de la solución de Fehling y
las diluciones que se hayan hecho.

Concentración celular. En un tubo de ensayo colocar 5 ml de muestra y agregar

agua destilada para lavar (el volumen de agua es de acuerdo al tamaño del tubo),
centrifugar 10 minutos a 3500 rpm. Desechar el sobrenadante y resuspender en agua
destilada y repetir la centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete
celular en un matraz volumétrico de 100 ml, con agua destilada hasta el aforo, leer la
absorbancia. a 595 nm e interpolar la lectura de densidad óptica en la gráfica tipo. El
resultado multiplicarlo por 20 que es la dilución.

Grado alcohólico real: En un matraz balón de 500 ml, colocar 100 ml de muestra
(15 o 20°C), mas 60 ml de agua destilada. Destilar lentamente recibiendo el destilado en
un matraz volumétrico de 100 m], éste se sumerge en un recipiente con hielo. Recoger el
destilado hasta 2 ml antes del aforo, completar con agua destilada, homogeneizar y medir
el grado alcohólico con un densímetro Ga -Lussac, y la temperatura (corregir por
temperatura y referir la lectura Gay-Lussac a 15 °C)

METODOLOGÍA.
La práctica se efectuará en cuatro sesiones, de acuerdo a. la programación que le
ser entregada por el coordinador del laboratorio, más tiempo extraclase.
En la primera sesión los participantes del equipo, presentarán en una sesión de
Seminario los siguientes puntos que habrá investigado con anticipación a la fecha de la
práctica programada.
 Ruta metabólica a través de la cual se verifica la fermentación alcohólica y
organismos que la llevan a cabo.

 Antecedentes históricos sobre la producción de alcohol en el país.

Importancia económica e impacto social.
 Uso del alcohol
 Fuentes de carbono susceptibles de ser usados como materia prima en la
producción de alcohol y su acondicionamiento.
 Producción industrial de alcohol por vía fermentativa, a) materias primas, b)
condiciones del proceso, c) cinética de la fermentación d) productos y subproductos,e)
recuperación del producto.

Las siguientes tres sesiones se realizarán de acuerdo al plan de trabajo que el

equipo participante y el profesor diseñen.

Para acreditar la práctica se consideran los siguientes puntos.

 Entrega de una memoria del seminario.
 El trabajo de laboratorio en equipo.
 Entrega de un informe de la práctica.

RESULTADOS.
El informe de la práctica incluir los siguientes puntos:
 Presentación e introducción.
 Cinética de producción de etanol, consumo del sustrato y crecimiento
microbiano.
 Comparar los rendimientos, teórico y experimental de producción de etanol.
 Calcular el rendimiento de la primera destilación.
 Discusión y conclusiones.
 Bibliografía.

REFERENCIAS.
Amerine, M.A. 1974. Análisis de vinos y mostos. Ed. Acribia Barcelona
Palacios L. H. 1956. Fabricación del alcohol. Salvat editores, S.A.

Lehninger. 1981. Bioquímica, 4a edición, Omega, Barcelona

Pirt, S.J. 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Blackweil Scientific
Publications, London

Prescott, S.C. & Dunn C.G. 1962. Microbiología Industrial, 3a. edición Aguilar,
Madrid
 PRÁCTICA No. 7
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA UNICELULAR MEDIANTE LA TÉCNICA DEL
CULTIVO EXTENDIDO

OBJETIVOS.
Realizar un proceso fermentativo de producción de proteína unicelular
programando la alimentación de sustrato a partir de la simulación del proceso basada en
los modelos, las constantes cinéticas y estequiométricas que rigen el crecimiento del
microorganismo.

INTRODUCCIÓN.
Los cultivos por lote co - suministro de sustrato han recibido a lo largo de su
historia diversas denominaciones; proceso "Zulauf - término introducido por investigadores
daneses y alemanes a principios de este siglo -, proceso "batch fed", "Semibatch" y "fed-
batch" en los países de habla inglesa. Este último término es actualmente el de uso más
generalizado y fue introducido por Yoshida en 1973.

Existen otras denominaciones para casos particulares como son los de: "cultivo
extendido" y el de "fed-batch exponencial" que se aplican para describir un cultivo
alimentado en donde la concentración de sustrato limitante del crecimiento es mantenida
constante por manipulación de la velocidad de suministro de nutrientes. Ocasionalmente,
estos cultivos son referidos como “fermentaciones de volumen variable”..

La técnica del cultivo extendido (CE) se ha venido utilizando desde hace por lo
menos medio siglo. Su uso fue completamente empírico hasta bien entrada la década de
los setenta en que coinciden; el desarrollo de modelos matemáticos para este tipo de
cultivos con el auge de la aplicación de los microprocesadores en la tecnología de
fermentaciones, coincidiendo además con el desarrollo de nuevos sensores y
servomecanismos para el seguimiento y control de procesos.

Para que un cultivo alimentado sea realmente productivo y en ‚l se obtengan

valores elevados de conversión de nutrientes a productos, se requiere de una exacta
predicción de los eventos que ocurrir n en el cultivo, tales como variación en los
indicadores cuantitativos de: crecimiento, producción de metabolitos y consumo de
nutrientes y de oxígeno, del microorganismo; así como de un estricto control de las
variables ambientales que afectan al proceso fermentativo. Una inadecuada predicción
de eventos puede resultar en alteraciones ambientales que modifiquen de forma
imprevista la fisiología del microorganismo, provocando una desviación en la fermentación
hacia la producción de metabolitos indeseables, abatiéndose la productividad, el
rendimiento o ambos.

Dependiendo del objetivo de una fermentación, la estrategia de alimentación de

nutrientes a un cultivo puede ser de dos tipos: velocidad de suministro constante o
variable. En este último caso, la velocidad de suministro se incremento paulatinamente con
el fin de sostener un nivel constante del sustrato limitante en el cultivo. La variación en
este suministro puede programarse previamente para satisfacer la demanda creciente del
cultivo por nutrientes o bien, puede introducirse un sistema de control capaz de estimar y
satisfacer dicha demanda. Tal sistema tendría una serie de sensores que suministrarían

13
información a una unidad de procesamiento de datos, la cual enviaría a servomecanismos
periféricos específicos (válvulas, bombas, motovariadores, etc.) para modificar velocidades
de suministro de nutrientes o de oxígeno, cuando esto fuera necesario.

BASES TEÓRICAS DEL CULTIVO EXTENDIDO.

a) Ecuaciones de balaiwe.

Consideremos un reactor con un volumen inicial [Vo] de medio de cultivo con una
concentración de sustrato limitante [s] y una densidad de población celular [x] que se
incremento con una velocidad específica de crecimiento []. A un tiempo dado se
comienza a suministrar al cultivo un flujo [F] de medio fresco que contiene al sustrato
limitante del crecimiento a una concentración [Sr]. No habiendo salida del mosto del
reactor durante el proceso, el volumen de medio en el fermentador variará continuamente,
a menos que la alimentación se haga con sustrato puro (sólido o líquido), en cuyo caso el
volumen se mantendrá constante.

Se consideran las siguientes restricciones para el sistema:

1. La suspensión celular es homogénea.
2. Aún cuando la población consiste de un número de partículas discretas, su
concentración es o suficientemente alta y el tamaño de partícula lo suficientemente
pequeño para considerar como una variable continua a la densidad de población [x]. Por
otra parte, el volumen ocupado por las partículas representa sólo una fracción del
volumen total del sistema y se considera despreciable.
3. Tan pronto como los nutrientes entran al cultivo son instantáneamente
dispersados en él.
4. Toda la población celular permanece viable.
5. La velocidad específica de crecimiento [] es una función de la
concentración de un solo sustrato limitante [s] y se asume la funcionalidad de Monod.
=máxs/(Ks+s)
6. Si el sustrato que limita al crecimiento es la fuente de energía, la cantidad
de biomasa producida por unidad de sustrato limitante utilizado no ser constante. Este
rendimiento celular [Y] ser una función de la velocidad específica de crecimiento y est
dado por la ecuación:
Yxs = Yg/( + mYg) (2)
Donde:

13
 Yg= Rendimiento celular m ximo para crecimiento.

m = Coeficiente de mantenimiento celular.

Si el sustrato que limita al crecimiento no es la fuente de energía, el valor de [Yxs]
se asume constante.
7. Durante el proceso no existe inhibición del crecimiento por los metabolitos
producidos por el mismo microorganismo.
Con base en las anteriores consideraciones, las ecuaciones de balance en el
reactor serán las siguientes:
Balance de biomasa:
Acumulación global Entrada - Salida + Crecimiento global
[d(Vx)/dt]ac = 0 - 0 + [d(Vx)/dt]crec =  (Vx)
Haciendo (Vx = X):
V(dx/dt)ac + x(dV/dt) = dX/dt = X (3)
Pero (dV/dt = F); despejando de la ecuación anterior a (dx/dt) ac y haciendo
(F/V=D), se obtiene la velocidad de acumulación volumétrica de biomasa:
(dx/dt)ac = x( - D) (4)
Siendo [D] la velocidad de dilución del cultivo.
Balance de sustrato:
Acumulación global = Entrada - Salida - Consumo global.

[d(Vs)/dt]ac = F(Sr) - 0 - qs(Vx) = F(Sr) - (/Yxs)(Vx) (5)

Siendo (qs = /Yxs), donde [qs] es la velocidad específica de consumo de sustrato.
s(dV/dt) + V(ds/dt) = F(Sr) - (/Yxs)(Vx)
Por lo tanto la velocidad volumétrica de acumulación de sustrato estar dada por:
(ds/dt)ac = D(Sr - s) - x/Yxs (6)

Cuando interesa describir la acumulación de algún producto en el reactor, se

hace a partir de la ecuación de balance para producto.
Las ecuaciones de balance anteriores pueden considerarse como las
fundamentales para el cultivo alimentado.
b) Comportamiento de un cultivo extendido.
Partiendo de la base de que el suministro de nutrientes se mantendrá igual a la
demanda del cultivo; se tendrá un valor constante de la concentración de sustrato
limitante [s], y por lo tanto una velocidad específica de crecimiento [m] constante. En
estas condiciones tendremos que en la ecuación de balance (6), el valor de la
acumulación volumétrica de sustrato ser cero.
Por tanto:
(F/V)(Sr - s) = (x/Yxs)
De donde:
F = [(xV)/Y(Sr - S)] (7)
 Sustituyendo el valor (xV = X) en la ecuación de balance (3) e integrando entre los
límites (to = 0 -> t):
X = Xo e(t) = xV (8)
Sustituyendo esta expresión en la ecuación (7), tendremos:
F = [Xo/Yxs(Sr - s)] e(t) (9)
Con base en las consideraciones iniciales planteadas (s= cte,  = cte.) tendremos
que de acuerdo a la ecuación (2); el valor d‚ [Y] ser también constante. Por lo tanto
tendremos que el flujo variar exponencialmente de acuerdo a la ecuación:
F = a e(t) (10)
Donde:
a = [.Xo/Yxs(Sr - S)] = Constante.
La variación en volumen se obtiene sustituyendo el valor de [F] en la
diferencial:
dV/dt = F = a e(t)
Integrando entre los límites (to = 0 -> t), obtendremos:
V=Vo + [Xo/ Yxs(Sr - s)] [e(t) – 1] (11)
Por sustitución de las ecuaciones (2) y (11) en la ecuación (8), obtendremos la
trayectoria de la concentración celular en un cultivo alimentado exponencialmente:
x = [(XoVo) e(t)]/(Vo +[xoVo ( + mYg)/(Yg)(Sr - s)][e(t) – 1]} (1,2)
Para poder alimentar exponencialmente a un cultivo, manteniendo un nivel
constante del sustrato limitante, se requiere de un control muy preciso de la velocidad de
operación de Ia bomba de suministro de nutrientes.

Para efectuar tal control puede recurriese al uso de equipo relativamente

sofisticado; bombas acopladas a un trazador automático de curvas, con el objeto de
alimentar nutrientes de acuerdo a un perfil gráfico predeterminado o bien, alimentar bajo
el control de una computadora.
Cuando no se dispone de tal equipo, es posible hacer una aproximación al
suministro exponencial mediante la adición (manual o autom tica) de volúmenes discretos
de medio de suministro a intervalos de tiempo programados, para mantener los niveles de
sustrato limitante dentro de un intervalo de valores preestablecidos.

METODOLOGÍA.

1. Se realizará un cultivo por lote en donde se estimarán los siguientes valores:

[máx] y [Yxsl. Estos, junto con otros valores obtenidos anteriormente (m, Y g y Ks), para
Candida utilis Y-900 en cultivo continuo a 35'C, ser n utilizados para establecer el
programa de alimentación del cultivo.
2. El suministro de medio fresco ser exponencial y se iniciará cuando la
concentración de sustrato llegue a un valor mínimo preestablecido. La alimentación
programada a partir de la simulación del comportamiento del cultivo, se hará por medio
de una bomba peristáltica de velocidad variable para mantener un valor de [s] constante.
3. Durante el cultivo por lote y el cultivo extendido se tomar n muestras, a las que
se les determinará inmediatamente la concentración celular y la concentración de
glucosa. La concentración celular se estimar por turbiedad y por peso seco, y la glucosa
por ensayo enzimático con glucosa oxidasa.
 RESULTADOS.

 Calcular [máx], y los valores de rendimiento y productividad celular media de

Candida utilis Y-900 en el cultivo por lote.

 Para el cultivo extendido, construir curvas comparativas (teóricas y

experimentales) de:
x = f(t)
X = f(t)
 = f(t)
s = f(t)

 Estimar los valores de productividad media y los de rendimiento celular

medio en el cultivo extendido (teóricos y experimentales).
 Discusión de resultados y conclusiones.

REFERENCIAS.
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plátano mediante un proceso fermentativo de volumen variable con alimentación
programada. Tesis profesional. ENCB.

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