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Manual de Microbiología 2021

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Microbiología

UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO

UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO. QRO.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

QUIMICA ÁREA TECNOLOGÍA FARMACÉUTICAS

4° CUATRIMESTRE

_____ PARCIAL

NOMBRE PRACTICA: ________

INTEGRANTES DEL EQUIPO

GRUPO: _______

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: _______

M. en E.R. LUZ CARMEN CASTILLO MARTINEZ

M. en C. EDWIN JHONATAN GACHUZ VAZQUEZ

FECHA: ________________

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Microbiología
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CONTENIDO:

1. Reglamento del laboratorio del laboratorio de microbiología.

2. Requisitos que debe de cumplir el reporte.

3. Las partes del reporte:

4. Práctica No. 1: Preparación del material y usos y cuidados de la autoclave.

5. Practica No. 2: Preparación de medios de cultivo.

6. Práctica No. 3: Revisión de técnicas más más usadas en microbiología.

7. Práctica No. 4: Tinción de Gram.

8. Práctica No. 5: Reto microbiano.

9. Norma NOM-086-SSA1-1994

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Microbiología
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REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA


1.- Todos los alumnos deberán usar bata limpia y traerla abrochada debidamente.

2.- No se permitirá la entrada al laboratorio al alumno que llegue 5 minutos tarde después de la
hora de entrada.

3.- Absolutamente prohibido: fumar, beber agua, comer y en general llevar las cosas a la boca
dentro del laboratorio.

4.-No debe poner ropa o libros sobre la mesa de trabajo; todos los objetos personales deberán
ser guardados en los cajones de la misma mesa.

5.- No guardar material de laboratorio (cultivo microbiano) en las bolsas de las batas.

6.- El alumno deberá estar provisto del material personal asignado o de lo contrario no podrá
permanecer en el laboratorio.

7.- Debe evitarse entablar conversaciones, así como comunicarse a voces con los vecinos de otras
mesas.

8.- Todo material no contaminado, tal como: algodón, papeles, cerillos etc... Deberán ser
depositados en los botes de basura destinados para este uso. No se debe tirar basura en el suelo,
ni guardarla en los cajones, ni tirarla en los vertederos.

9.-Tendrá que desinfectar con solución HIPOCLORITO DE SODIO a 200 ppm (1ml de cloro en 500
de agua) la mesa de trabajo ANTES de empezar y al TERMINAR la práctica.

10.- En caso de romper o derramar el material contaminado, debe verterse Hipoclorito a 200
ppm dejándolo actual 10 min antes de limpiar. Así como otro tipo de accidente personar avisar
al instructor o al profesor.

11.-El asa y la porta-asa deberán ser esterilizadas a la flama antes y después de utilizarlos.
Calentar el asa vertical o diagonal (no horizontalmente). Si está cubierta de algún material,
séquese al lado de la flama antes de esterilizarla para evitar el chisporroteo del material y su
diseminación.

12.-Incubar el material el tiempo que se indique, en caso contrario, este será desechado.

13.- Al finalizar la práctica entregar el material empleado debidamente separado: material sucio
que contenga a esterilizar, quitarle las etiquetas, material sucio para lavar, colocar en otro sitio;
reactivos debidamente ordenados y cerrados, comprobar que las llaves del gas y del agua estén
cerradas antes de salir del laboratorio.

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CONTENIDO DEL REPORTE

1.- NOMBRE DE LA PRÁCTICA

2.- OBJETIVO (OS).

3.- INTRODUCCION (realizarla siempre)

4.- MATERIAL Y REACTIVOS

5.-DIAGRAMADE FLUJO DEL PROCEDIMIENTO

6.- RESULTADOS

7.- CUESTIONARIO

8.- CONCLUSIONES (PERSONALES)

9.- BIBLIOGRAFIA

10.- MEDIDAS DE SEGURIDAD Y RPBI

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Microbiología
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RUBRICA EN CADA PRÁCTICA

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Microbiología
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PRÁCTICA # 1
Preparación del material de laboratorio.

Uso y cuidados con la autoclave

OBJETIVO:

El objetivo de esta práctica es conocer la preparación del material de laboratorio, así como
algunos métodos de esterilización y los cuidados de los materiales.

Utilizar adecuadamente la autoclave como medio de esterilización.

INTRODUCCIÓN:

La preparación del material del laboratorio se inicia desde el momento en que se colectan los
recipientes o utensilios conteniendo substancias de un estudio ya realizado, estos deberán
esterilizarse y lavarse, posteriormente se secan, se tapan y s envuelven adecuadamente para
ser esterilizados al horno o al autoclave.

Los materiales que con más frecuencia se utilizan en el trabajo rutinario son: cajas de Petri,
tubos de ensaye, matraces, pipetas, etc.,.

La esterilización implica la muerte de todos los microorganismos incluyendo esporas. Es un


proceso termodinámico, donde hay transferencia de calor pero no de masas, es un proceso o
un ciclo cerrado. Por lo tanto se le llama calor húmedo, el vapor mata más fácilmente a las
bacterias por desnaturalización de las proteínas.

Una convención de seguridad establece que la eficacia de la esterilización, es utilizar el vapor a


121ªC durante 15 a 20 minutos. El aire tiene influencia importante en la eficacia de la
esterilización, porque se presencia modifica la relación presión/temperatura, además la
existencia de bolsas de aire impedirá la penetración del vapor, debe de eliminarse todo el aire
que rodea y penetra en la carga antes de que pueda comenzar la esterilización por vapor.

MATERIAL:

 Cajas de Petri de vidrio.


 4 Tubos de ensaye.
 Matraces Erlenmeyer de diferente capacidad.
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 Pipetas volumétricas.
 Papel de estraza
 Gasa.
 Algodón.
 Autoclave
 Cinta testigo
 Perilla
 Colorante

PROCEDIMIENTO:

-Preparación del material:

Demostración del material de cristalería.

Demostración de la forma como se hace la limpieza y preparación y envoltura de cristalería


para utilizarla.

Utensilios para el manejo directo de los microorganismos, su conservación y su uso.

Los alumnos de cada Equipo harán tapones para tubos y matraces.

Envolver cajas de Petri y pipetas, marcándolas.

Esterilizar el material en la forma en que le indique el instructor.

Autoclave:

1.- Poner agua limpia hasta nivel del bulbo.

2.- Colocar el material a esterilizar, no más del 80% de su capacidad.

2.- Los frascos o matraces o tubos nunca deben apretarse.

4.- Cerrar en forma de cruz las mariposas y luego apretar.

5.- Conectar a la fuente de luz.

6.- Mover la perilla del termostato de DESC a MAX

7.- Abrir la válvula de escape.


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8.- Esperar que salga todo el aire de la cámara hasta que sea constante el vapor.

9.- Cerrar la válvula de escape.

10- Esperar que el manómetro marque 15 lb/cm 2

11- Cambiar la perilla del termostato a MED para mantener esta presión, durante 15 min.

12. – Concluido el tiempo la perilla se mueve a DESC. Y se espera a que la presión llegue a 0
para abrir la válvula de escape.

13.- Abrir la autoclave con guantes de seguridad y lentes.

14.- Sacar el agua, abriendo la llave del agua.

METODO:

El material de cristalería que se utiliza son cajas de petri, Tubos de Ensaye, Matraces
Erlenmeyer, Pipetas volumétricas y tapones, otros materiales utilizados son el algodón y las
gasas.

Tendrá que ser lavado con agua destilada antes de cualquier práctica en el laboratorio de
microbiología

CAJAS DE PETRI.

Para cubrir la caja de petri con papel, se coloca con la tapa hacia abajo y los dobleces se hacen
de manera que permita dejar un espacio para rotular al frente dela caja. Para el manejo de
la caja cuando aún no está cubierta por el papel se maneja con la mano izquierda
únicamente.

PIPETAS.

Colocar el algodón, dentro del porta-pipetas, colocar tira indicadora.

GORRITOS.

Los gorritos se hacen a la medida del bote. El gorrito se hace con la finalidad de
proteger el bote que contiene los tubos y se deja un espacio para rotular el gorrito.

TAPONES.

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Los tapones se hacen de algodón o de gasa a la medida del tubo de ensaye, el matraz ó las pipetas
no les deben quedar ni muy apretadas ni muy flojas. El tapón se maneja con el dedo meñique de
la mano izquierda.

TECNICA DE DILUCIONES

1. Leer instrucciones sobre el uso y cuidados de la balanza.


2. Colocar el vidrio de reloj y pesar 1 g de colorante.
3. Colocar el reactivo en un matraz volumétrico de 100 mL y aforar con agua destilada.
4. Realizar diluciones:
a. Medir con una pipeta graduada 1 mL de la solución y con una probeta medir 50 mL y
agitar.
b. Medir con una pipeta graduada 5 mL de la solución y con una probeta medir 50 mL y
agitar
c. Medir con una pipeta graduada 10 mL de la solución y con una probeta medir 50 mL y
agitar
d. Medir con una pipeta graduada 20 mL de la solución y con una probeta medir 50 mL y
agitar
5. Colocar cada una de las soluciones utilizando la pipeta volumétrica de 10 mL en cada tubo de
ensaye y tapar.
CUESTIONARIO:

1. ¿Qué es la Esterilización?

2. ¿Qué tipo de esterilización utilizó para material de cristalería?

3. ¿Cuál es el fundamento de la esterilización por calor seco?

4. ¿Cuál es el fundamento de la Esterilización por calor húmedo?

5. ¿Cuál es la temperatura, presión y tiempo para la esterilización en autoclave?

CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFIA.

MSD

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PRÁCTICA # 2
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA MICROBIOLOGIA.

OBJETIVO:

El alumno aprenderá la preparación de los diferentes medios de cultivo

INTRODUCCIÓN

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su


crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de
los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un
medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura,
grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez
o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las
bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos
orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una
infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El Agar
es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. En
los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento
como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se
adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y
para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos.
El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los
microorganismos menos resistentes. Por su aspecto físico. Los medios de cultivo preparados
pueden ser clasificados por su aspecto en: Líquidos, Semisólidos, Sólidos. Y por su uso en:

I .- Medios de cultivos básicos

II:_ Medios de cultivos especiales como: mejorados, selectivos, diferenciales, de transporte.

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MATERIAL  Autoclave
 Cinta testigo
 Potenciómetro
 Tubos de ensaye con tapón
 Buffer pH 4, 7, 10
 2 Mecheros
 2 matraz Erlenmeyer (250ml) REACTIVOS
 1 probeta de 100ml
 Agua destilada
 Balanza granataria
 Caldo lactosado
 2 Tubos de ensayo medianos
 Solución de hipoclorito de sodio al
 1 Pipeta graduada de 10ml.
200 ppm
 2 Pipeta graduada de 1ml.
 Agar métodos estándar
 1 Probeta de 100ml.
 Solución salina al 0.9%
 1 Frasco de dilución
 Agua destilada
 1 Balanza granataría
 Agar Sal y manitol
 Campana Durham
 Agar MIO,
 Algodón
 Agar TSI
 Papel de estraza
 Agar Nutritivo
 Balanza granataria
 Agar Salmonella o TCBS
 Parrilla
 Caldo de infusión cerebro corazón
 Espátula
PROCEDIMIENTO

1) Leer cuidadosamente la etiqueta en la preparación del medio de cultivo.

2) Hacer una relación de gr. de acuerdo a los ml de medio

3) Colocar en el matraz EM y se la mitad de agua destilada, de acuerdo a los ml que sean cada
tipo de medio.

4) Pesar el medio de cultivo, vaciar en el matraz, agitar vigorosamente y después agregar la otra
parte del agua destilada, seguir mezclando.

5) Colocar el medio (si así lo indica la etiqueta) a la parrilla a calentar a ebullición; se quita de la
parrilla cuando comienza a hervir y se deja enfriar un poco, para medir pH.

6) Tapar etiquetar, pegar con cinta testigo.

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7) Introducir en el autoclave el material por 15Lb/ 15 min. Sacar de la autoclave y se hace el


vaciado respectivo si es necesario.

8) Se dejan enfriar y se colocan invertidas en bolsas de plástico, etiquetar correctamente


y se guardar en refrigeración.

9) Anotar en la bitácora de medios de cultivo.

RESULTADOS

Realizar un diagrama de flujo de la preparación de los medios de cultivos de cada una de las
técnicas usadas .Menciona cuales serían los puntos críticos en la preparación.

Describir cada uno de los componentes de los medios de cultivo.

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué norma mexicana nos indica el procedimiento para la realización de medios de cultivo?

2.- ¿Qué pasa si el medio de cultivo se excede en el calentamiento?

3.- ¿Cuántos tipos de medio de cultivo existen menciona un ejemplo de cada uno de ellos?

4.- ¿Cuál es la diferencia entre un medio líquido y un sólido?

5.- Defina que es un medio de cultivo

6.- ¿Qué sucede si el medio está muy frío y se desea vaciar?

7.- Diferencie entre los términos: Desarrollo y Crecimiento

8.- Usos y cuidados del potenciómetro.

9.- Investiga la técnica Gram

OBSERVACIONES

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA

MSD

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PRÁCTICA # 3
REVISIÓN DE TECNICAS MÁS USADAS EN MICROBIOLOGÍA (3 horas)

OBJETIVO:

Que el alumno recuerde o aprenda las técnicas que más frecuentemente serán utilizadas
en el presente curso.

MATERIAL REACTIVOS

 1 Matraz Erlenmeyer de 300ml.  Agar nutritivo


 2 Cajas petri  Algodón, papel manila, agua
 2 Tubos de ensayo medianos destilada
 1 Pipeta graduada de 10ml.  Solución de hipoclorito de sodio al
 1 Pipeta graduada de 1ml. 200 ppm
 1 Porta-asa con asa  Solución salina al 0.9% (3 a 5 tubos
 1 Agitador de vidrio con 9 mL y un frasco con 90 mL)
 Probeta de 100ml.  Muestra o alimento líquido
 Frasco de dilución  Inoculo fresco (18 a 24 horas)
 1 Licuadora
 1 Balanza Granataría

PROCEDIMIENTO

1. Realizar diluciones de muestras alimenticias en frascos y tubo con solución salina estéril
al 0.9% de un producto farmacéutico o alimento a realizar.

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2. Inoculación de líquido- liquido.

3. Aislamiento por acotamiento.

4. Vaciado de medio e inoculación en una caja Petri por la técnica de estría

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5. Inoculación del tubo de ensayo con agar inclinado (pico de flauta).

6. Observación y lectura de las placas y tubos después de ser inoculados a 36°C 24 horas.

RESULTADOS

Realizar una tabla donde expliques cada una de las colonias su morfología, borde y
características de elevación, el número.

Del alimento contar todas las colonias, y revisar la norma o la FEUM si está bien o no.

Del aislamiento, decir si, se logró o no la técnica

En la técnica de siembra liquido-liquido, describir el crecimiento del inoculo.

CUESTIONARIO

1) ¿Por qué es posible aislar microorganismos por las técnicas de dilución y siempre en placas?
Si usted tiene una población homogénea de 105 microorganismos/ml en la muestra original
¿Cuántas colonias espera encontrar en una placa sembrada con 1 ml de la dilución 10-3, después
de haber incubado el tiempo y las condiciones adecuadas?

2) ¿Por qué la esterilización es eficiente en una autoclave que en un horno, a la misma


temperatura?

3) ¿Cuáles son las diferencias morfológicas y bioquímicas de los microorganismos Gram


positivos y Gram negativos?

4) Indique ¿Qué características deben observarse al estudiar la morfología colonial de las


bacterias y de los órganos?
5) De los medios MIO y LIA explique la ruta metabólica de cada uno de ellos.

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OBSERVACIONES

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA
MSD.

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PRACTICA No. 4

TINCIÓN DE GRAM (2 horas)

OBJETIVO:

Observar cómo actúa el colorante de Gram en los microorganismos ya que el más empleado en
bacteriología, ya que los microorganismos. Se clasifican de acuerdo a como actúen con este
colorante.

INTRODUCCION:

Es el más ampliamente usado en bacteriología y la mayoría de los microorganismos son


clasificados según su reacción a la tinción Gram.

Un MIO. Gram (+) debe presentar una pared celular sana. El mismo MiO. Si sufre daño a la pared
por una u otra causa, se vuelve Gram (-). Esto indica la importancia de la pared para la retención
o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:

El colorante básico entra al M.O. donde forma con el yodo una laca insoluble agua. El alcohol o
la cetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los MIO. Gram (+), tratados con
mordientes, y forman una barrera de la laca que no pueden atravesar.

En las células Gram (-), los lípidos de la pared celular (más abundante en las células Gram (+), se
disuelve por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal de violeta con
yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la pared
celular.

Las micobacterias son difíciles de teñir ya que tienen cubierta cérea y deben emplearse métodos
especiales. Así como son difíciles de teñir, estos M.O. una vez teñidos, son difíciles de colorear.
Este hecho es considerado para propósito de diagnóstico.

El GRAM, es la coloración más importante para bacterias. Fue ideada por Hans Christian Gram en
1884. Permite distinguir entre barias especies de bacterias que pueden presentar morfología
colonial similar.

Cuando las bacterias retienen la combinación Cristal violeta-lodo y se tiñen de violeta, son
bacterias Gram positivas; las bacterias que se tiñen de rojo por la Safranina son Gram Negativas.

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Las células bacterianas Gram Positivas se les adhiere el Cristal Violeta, porque hay disminución
de la permeabilidad de la pared Celular causada por el efecto deshidratante del Alcohol; mientras
que las Gram negativas, el complejo sale por el aumento de la permeabilidad causada por la
solubilidad de los lípidos de la Pared Celular al alcohol.

MATERIAL:

1.- Cultivos de Escherichia coli , Sacaromisses serevisae y hongos filamentosos

2.- Cristal Violeta (colorante primario):


Cristal Violeta (Violeta de genciana). 10 gr.
Etanol del 95º 100ml
Oxalato de amonio 4gr
Agua destilada
NOTA: Disolver el colorante en el alcohol y el oxalato en el agua. Mezclar las dos soluciones.

3.- Lugol (mordente):


Lodo 1gr.
Yoduro de Potasio. 2 gr.
Agua Destilada 400ml.

4.- Safranina (colorante secundário):


Safranina O. 1gr
Etanol 40 ml
Agua destilada. 400 ml

5.- Alcohol-Cetona (decolorante):


Relación 1:1
Portaobjetos

Asa.
Mechero.
Microscopio.
Cinta adhesiva
PROCEDIMIENTO:

Tinción Gram

1.- Preparar un frotis delgado de un cultivo de Escherichia Coli, secar a temperatura ambiente y
fijar al calor.

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2.- Cubrir el frotis con cristal violeta durante un minuto.

3.- Lavar.

4.- Cubrir con lugol durante un minuto.

5.- Lavar.

6.- Agregar alcohol-Cetona o alcohol de 95, hasta que no arrastre el colorante.

7.- Lavar abundantemente.

8.- Cubrir con safranina durante un minuto.

9.- Lavar

10.- Observar a inmersión y dibuje lo observado

11.- Haga otro frotis con Escherichia coli, y de Sacaromises Sereviseae. Y reporte el siguiente
cuadro:

BACTERIA FORMA, AGRUPACIÓN GRAM

12.-Realice esquemas de lo realizado Y observado:

Tinción con azul de lactofenol

1. Seleccionar las colonias para realizar las improntas.


2. Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente aproximadamente de 1 cm2 .
3. Pegar los segmentos de cinta en un asa micológica.
4. Poner una gota de azul de algodón en el portaobjetos.
5. Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior de hongo.
6. Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodón y poner otra gota de azul de algodón.
7. Poner un cubreobjetos sobre la preparación.
8. Observar en 40x.

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. Representación esquemática de la preparación de la impronta para la observación de hongos filamentosos

CUESTIONARIO:

1.- ¿Podría sustituir el colorante primario por algún otro colorante? ¿Por qué?

2.- ¿Cuál es la función del lugol en la Tinción Gram?

3.- ¿Cuál es la fórmula química semidesarrollada del cristal violeta?

4.- ¿Qué otro colorante se puede emplear en lugar de la Safranina?

5.- ¿Qué sucedería si agregara el colorante secundario más concentrado o por un tiempo más
prolongado?

6.-Que inconvenientes encontraría si agregase primero la safranina en esta técnica?

7.-Escriba la formula semidesarrollada de la safranina?

8.- ¿Qué es una colocación supervital?


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9.- ¿Bajo qué condiciones pueden dar error la tinción de Gram?

10.- ¿Cómo se preparan los colorantes?

11.- ¿Por qué Gram positivas y Gram Negativas?

CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFIA.

MSD.

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PRACTICA #5

Antibiograma: Método Bauer-Kirby (Reto microbioano)

OBJETIVO:

Sugiere uno.

MATERIAL

 Cajas petri
 Tubos de ensayo medianos
 Hisopos estériles
 Regla
 Incubadora 35 ªC
 Brotes
 15 círculos de papel filtro de 1 cm de diámetro.

REACTIVOS

 Cultivo joven en caja Petri


 Caldo infusión cerebro corazón (BHI).
 Agar Mueller Hinton
 Antibiogramas ó un antibiótico (ampolleta)

PROCEDIMIENTO

a.- Selección de bacterias

 Seleccionar una colonia bien aislada con morfología definida.

b.- Transferencia

 Se resiembra a un tubo de ensaye con 10 mL de BHI


 Se incuba a 35 ªC/24 horas.

c.- Resiembra
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 Humedecer un hisopo estéril en el tubo con BHI que contenga el inoculo, rodándolo
varias veces en el mismo tubo para quitar el exceso de líquido.

d.- Inoculación

 Con el hisopo inocular en la superficie de una placa de agar Mueller Hinton.


 Rodándolo en ángulo de 60 ªC , cubrir toda la superficie.
 Esperar de 3 a 5 min., pero no más de 15 min.
 Color el disco de antibiograma sobre la superficie en el centro de la placa ya inoculada.
 coloque discos de papel filtro impregnado con antibióticos (no más de 7 discos)

e.- Incubar.

 Inocular la placa de manera invertida a 35 ªC/16 a 18 horas.

f.- Leer

 Examinar la placa y medir los diámetros de las zonas de inhibición incluyendo el


diámetro del disco.
 Interpretar los tamaños de las zonas de inhibición de acuerdo a las tablas.

RESULTADOS:

Reportar a los microorganismos como NEGATIVO (sin crecimiento y con halo)

POSITIVO (con crecimiento)

CUESTIONARIOS:

1.- Que es la prueba de susceptibilidad:

2.- Que es un antibiótico?

3.- Normas que establecen el cuidado que deben tener lo medicamentos.

4.- Porque es importante probar si un medicamento desarrolla o no bacterias:

5.- Que es un vehículo en un medicamento?


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CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFIA

MSD

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