Universidad de Córdoba

Facultad en las Ciencias de la Salud

Bacteriología

Guías Laboratorio Bacteriología

GUIA 1 – GUIA 2 – GUIA 3

Danna Paternina Maussa

Cristina Niebles Vélez

Doc. Margarita Diaz

Montería
18/11/2021

GUIA N° 1
 “Coloraciones más frecuentes en bacteriología”
PRE-LABORATORIO
1. ¿Cuál es la utilidad de los colorantes en microbiología?
Los colorantes en microbiología permiten generar un contraste en la imagen del microscopio a la muestra con el
fin de identificar y diferenciar la estructura de los microorganismos que se encuentran en nuestro portaobjetos.

2. Investigar el fundamento de las coloraciones: Ziehl Neelsen, Tinta china, coloraciones para esporas, cuál
es su utilidad y el procedimiento para las mismas.
Ziehl Neelsen: Es una técnica de coloración para identificar microorganismos acido-alcohol resistentes (bacilos
acido-alcohol resistentes). Esta tinción se basa en las propiedades de la pared celular de estos microorganismos.
La pared esta formada por un tipo de ácidos graso llamados ácidos micólicos, caracterizados por presentar
cadenas muy largas. Cuando los ácidos grasos presentan estructuras muy largas, estos pueden retener el
colorante (fucsina) con mayor facilidad el cual tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la
pared celular.
Procedimiento:
 Frotis bacteriano de cepa mycobacterium y fijar la extensión con calor.
 Añadir primer colorante Carbol fucsina.
 Se pasa por el mechero varias veces (5 minutos) Sin permitir que hierba el colorante.
 Retirar el exceso de colorante con agua destilada
 Decolorar con alcohol acido. La muestra se va a observar rosada.
 Lavar con agua destilada
 Aplicar azul de metileno (1 minuto)
 Lavar con agua destilada para retirar el exceso de colorante
 Secar al aire
 Observar al microscopio

Tinta China: Descarta la presencia de cápsulas en algunos microorganismos principalmente en streptococcus

pneumoniae, klebsiella pneumoniae y cryptococcus neoformans. Está técnica recibe el nombre de tinción
negativa por qué actúa de forma contraria al resto de las técnicas de coloración. En está lo que queda sin teñir es
la estructura que se está buscando o que se desea ver; es decir, los microorganismos. Está tinción se basa en
teñir el fondo del frotis en un color oscuro. En este escenario Las estructuras capsuladas resaltan en un color
claro o incoloro.

Procedimiento:
 Se toma una porción pequeña de un cultivo joven y se disuelve en tinta China (sobre el portaobjetos)
 Se utiliza un cubreobjetos
 se monta al microscopio
 observar en 10x y luego en 40x

Coloración para esporas: Las esporas no se tiñen con las coloraciones convencionales debido a que poseen
una pared muy gruesa. La compleja composición de la espora impide la entrada de la mayoría de los colorantes.
La espora es una estructura deshidratada qué contiene un 15% de calcio y acido dipicolínico. Por ello, La
mayoría de las técnicas de coloración se basan en la aplicación de calor para que el colorante pueda penetrar la
gruesa estructura. Una vez la espora se tiñe ésta no puede eliminar el colorante.

Procedimiento
 cultivo puro de la cepa sospechosa
 someter a temperaturas extremas (24 horas) a 44°C en estufa
 si se someten demasiado tiempo se tendrán exosporas, pues todas las endosporas habrán salido del
bacilo.
 Colocar gotas de solución fisiológica estéril (portaobjetos) realizando el extendido fino del cultivo.
 Se deja secar, se fija al calor y se tiñe, ya sea con cualquiera de las técnicas disponibles.

3. ¿Que se reporta en una coloración de Gram?

En una coloración de Gram se reportan cocos Grampositivos y bacilos Gramnegativos para posteriormente
realizar otras pruebas de identificación y así poder realizar el seguimiento adecuado a las distintas clases
patologías con los microorganismos pertenecientes a estos estos dos grandes grupos.

4. ¿Qué es una tinción diferencial y que es una tinción simple?

Una tinción diferencial es aquella en la que se pretende identificar más de un tipo de bacteria usando
lógicamente mas de un colorante. En cambio, en una tinción simple solo se utiliza un colorante el cual va a
tener afinidad con la pared bacteriana. Solamente se usa para incrementar el contraste. Aquí todas las células
absorben el colorante y quedan teñidas del mismo color.

5. ¿Cómo realizaría usted el control de calidad de una coloración de Gram?

Para poder hacer un control de calidad adecuado del Gram se deben tener en cuenta unos aspectos muy
importantes.
Se deben seguir al pie de la letra las pruebas y los procedimientos a desarrollar en el laboratorio clínico. Hay
que hacer una verificación y validación del test. Tener muy en cuenta el manual de procedimientos.

6. ¿Qué enfermedades infecciosas se pueden diagnosticar a partir de una tinción?

Las enfermedades infecciosas que se reportan a partir de una tinción son:

 Meningitis
 Amigdalitis
 Otitis
 Faringitis
 Conjuntivitis
 Gastroenteritis
 Artritis
 Bronquitis

GUIA N° 2
 “Antibiograma”
PRE-LABORATORIO
1. Investigar las técnicas que existen para realizar antibiograma.

Las técnicas que existen para realizar antibiograma son las siguientes:

 Dilución en agar (Disco placa y test)

 Dilución (microdilución y macrodilucion)
 Técnicas automatizadas
 Dilución en caldo
 Difusión en agar (Kirby Bauer)

2. ¿Por qué se utiliza el lagar Mueller Hinton para realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana?

Es el más utilizado para realizar pruebas de susceptibilidad debido a la gran diversidad de bacterias que crecen
en él (Aerobias de rápido crecimiento o anaerobias facultativas)

3. ¿Cuál es la utilidad de la escala McFarland?

La escala macfarlán se utiliza cómo patrón de turbidez en la preparación de suspensiones de microorganismos.

El patrón 0.5 de McFarland tiene una aplicación especial en la preparación de inóculos bacterianos en pruebas
de susceptibilidad. Esta escala nos sirve como un indicador estándar Por ejemplo a la hora de hacer una siembra
bacteriana por el método Kirby Bauer.

POST-LABORATORIO
1. ¿Qué otras técnicas se emplean para evaluar la susceptibilidad antimicrobiana y en qué consisten?

Difusión en algar: Esta es una técnica cualitativa, Sus resultados puede interpretarse específicamente para
bacterias de crecimiento rápido Cómo son los Staphylococcus o los integrantes de la familia de las
enterobacterias.

Al momento de incubar la casa ya preparada con los sensidiscos a una temperatura de 35°C al aire del ambiente
y por un periodo no mayor de 18 horas excepto para los aislamientos de Staphylococcus y Enterococos (24
horas) principalmente para lograr una mayor detección de resistencia a oxaciclina y vancomicina.

En el caso que no se presente un halo de inhibición, se reporta el diámetro del sensidisco.

Dilución en agar: Se pretende hacer un gradiente de creciente de la concentración de un antibiótico dado y

probarlo con inóculo bacteriano estandarizado.

En esta técnica del ilusionen agar se preparan tubos con la concentración definida de antibióticos y se le agrega
a cada tubo una cantidad conocida de la del agar Mueller Hinton, Se tuvo se homogeniza y se chorrea en una
caja de Petri Vacía con lo que se logra una placa de agar con el antibiótico diluido a una concentración
determinada.

Macrotitulación en tubo: Derivada del anterior, pero no se utiliza para la cantidad de material que emplea Ya
que presenta el grave problema de dificultad para detectar antimicrobianos del medio de cultivo

Micro titulación: Se emplean placas plásticas, Estériles, Con tapa de 96 pozos y un fondo en U.

Cada placa permite realizar una concentración mínima inhibitoria de un antibiótico a 8 cepas diferentes o una
concentración mínima inhibitoria de una cepa contra 8 diferentes antibióticos

E test: Se utilizan Las tarjetas de plástico transparentes para la prueba de sensibilidad. Se trata De tarjetas de 30
pozos qué llenan con el inóculo batería no estandarizado, mediante una bomba de vacío y luego las tarjetas son
selladas herméticamente incubadas a 35 °C y cada 10 minutos el sistema hacer una lectura y se mide la
concentración del inoculó bacteriano. Cada tarjeta tiene un poso control positivo de crecimiento y este pozo es
donde se construye una curva normal de crecimiento bacteriano.

2. ¿Cuáles son las bases para la utilización clínica de los antibióticos?

Las bases para la utilización clínica de los antibióticos son las siguientes.

 Debe ser capaz de inhibir o destruir Muchos tipos de microorganismos patógenos.

 Inhibir a los microorganismos sin que estos de desarrollen resistencia los antibióticos.
 No deben producir efectos secundarios no deseables en el paciente tales cómo reacciones alérgicas, daño
del sistema nervioso, riñones o irritaciones del tracto gastrointestinal.
 No debe eliminar la microbiota normal del cuerpo.
 Sí el agente se administra oralmente, no debe inactivarse por los ácidos estomacales. Sí la
administración es parenteral, no debe inactivarse por la unión a proteínas de la sangre
 Debe ser altamente soluble en los fluidos corporales ya que debe estar en solución para ser activo.
 Alcanzar una concentración lo suficientemente alta en los tejidos o la sangre del paciente para poder
matar o inhibir a los microorganismos causantes de la infección.

3. ¿Cuáles son las estrategias para disminuir la aparición de las resistencias a los antimicrobianos?

Se debe mejorar la vigilancia las infecciones resistentes a los antimicrobianos, regular el uso adecuado de
medicamentos de calidad, informar al público sobre los peligros que conlleva un uso excesivo de los
medicamentos ya que está acción puede generar una mayor resistencia a los microorganismos.

4. Clasifique los antimicrobianos usados en la práctica de acuerdo a su estructura química y mecanismo de

acción en la estructura celular

De acuerdo a su estructura química

 Beta lactamicos
 Aminoglucósido
 Macrólido
  Lincosamidas
 Galactopeptidos
 Quinolonas
 Tetraciclinas

De acuerdo al mecanismo de acción

 Inhibidores de la formación de la pared bacteriana

 Inhibidores de la síntesis de proteínas
 Inhibidores de la duplicación del ADN
 Inhibidores de la membrana citoplasmática
 Inhibidores de las vías metabólicas

5. Los parámetros que son necesarios estandarizar para obtener resultados confiarles en un antibiograma
por método Kirby Bauer.
pH: 7,2 – 7,4
humedad
4 mm de espesor en placas de 100ml
Control de esterilidad 24h a 37°C
Discos refrigerados a 8°C
Antes de colocar los discos deben atemperarse y evitar su desecación

6. ¿Qué es una cepa ATCC?

Son microorganismos certificados para el control de calidad en Microbiología y es utilizado en la clínica

alimenticia, farmacéutica, cosmética y ambiental. Estas son un conjunto de especies bacterianas que comparten
al menos una característica. Son usadas En los laboratorios para controlar diversos procedimientos.

Los laboratorios para garantizar la trazabilidad de sus resultados, deben utilizar sepas de referencia de
microorganismos obtenidos directamente de una colección nacional o internacional

Las cepas ATCC se usan en los laboratorios para: garantizar la calidad de los resultados de ensayo, evaluar la
calidad de los medios de cultivo y validar los métodos microbiológicos utilizados.

7. ¿Qué es MIC y como se determina?

La concentración mínima inhibitoria es la concentración mas baja de un antimicrobiano capaz de inhibir el

crecimiento de un microorganismo después de su incubación.

Para determinar la concentración mínima inhibitoria de un antibiótico frente a una bacteria determinada hay que
preparar una serie de tubos con un medio de cultivo líquido, como el TSB, que tengan diluciones seriadas
al doble del antibiótico a ensayar.
GUIA N°3

“Identificación del Género Staphylococcus aureus en

Muestras Clínicas”
PRE-LABORATORIO

1) Investigar el fundamento del Agar salado manitol, la prueba de la coagulasa; catalasa y susceptibilidad a
la novobiocina y la coloración de Gram.

Agar salado manitol: el agar salado manitol es un medio de cultivo sólido, selectivo y diferencial. Creado para
el aislamiento de cocos grampositivos patógenos, en especial es microorganismo Staphylococcus aureus

El agar salado manitol es selectivo gracias a la concentración de sal que posee. La salinidad actúa como
sustancia inhibitoria y evita el crecimiento de bacterias gramnegativas. También es diferencial debido a la
presencia de carbohidrato manitol y al indicador de pH rojo fenol. A partir de este, las bacterias capaces de
fermentar el manitol producen ácidos, acidificando el medio, tornándose las colonias y el medio de color
amarillo.

2) En el hombre, ¿cuáles son las zonas en donde es frecuente encontrar a Staphylococcus aureus es capaz
de crecer?

En el hombre, Staphylococcus aureus crece frecuentemente en:

 La piel

 Cabello

 Fosas nasales

 Garganta

3) ¿Qué diferencias hay entre la coagulasa libre y la coagulasa de unión?

la coagulasa libre es una enzima extracelular producida cuando se cultiva el microorganismo en caldo. En
cambio, la coagulasa de unión permanece ligada a la pared, además que esta se relaciona con el portaobjetos y
no con el caldo.

4) ¿Qué otras pruebas de identificación se pueden utilizar para la identificación Staphylococcus spp y cuál
es su fundamento?
Hay otras pruebas para la identificación de Staphylococcus las cuales son:

Presencia de la desoxirribonucleasa: se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que es

capaz de clivar los enlaces fosfodiéster internos de la molécula de DNA. Se utiliza un medio solido
como verde de metilo el cual se combina con DNA altamente polimerizado. Cuando la combinación no
ocurre, por acción de la enzima DNAsa, se produce una decoloración del medio.

Prueba de ELISA: se basa en el reconocimiento inmunológico de algunos antígenos o factores

presentes en el agente patógeno.

Identificación de medios de cultivos: basado en la detección fluoregenica de la coagulasa mediante la

incorporación en el medio de cultivo de substratos cromogénicos para la fosfatasa alcalina y la
β galactosidadsaen cuanto a la identificación de S. aureus

5) ¿Cuál es el efecto biológico de las enzimas coagulasa y catalasa en la patogenia de las infecciones?

Por una parte, la enzima coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama
estafilotrombina y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina, lo que hace que se
coagule la sangre.

Por otra parte, la enzima catalasa que es una enzima antioxidante va a desdoblar o a convertir el peróxido de
hidrogeno (toxico para muchos microorganismos) en agua y oxigeno que aprovechará como nutrientes para su
desarrollo.

POST LABORATORIO

1. Indique algunos de los medios de cultivo y sus características en los cuales los Staphylococcus sean
capaces de crecer.

Agar Salado Manitol: es un medio selectivo de Staphylococcus aureus, el agar sal manitol contiene una
concentración de cloruro sodio de 7.5% el cuál es el agente activo del medio e inhibe a los organismos
bacterianos diferentes de los estafilococos

Los estafilococos coagulasa (+) (Staphylococcus aureus) producen colonias de color amarillo y halos de color
amarillo, mientras que los estafilococos negativos a la coagulasa producen colonias de color rojo y no provocan
cambios en el color del indicador rojo fenol

Agar Baird-Parker: Es un medio excelente para el recuento de Staphylococcus aureus, incluso, aunque se
trate de células que sufrieron daño. Además, es el medio moderadamente selectivo más corrientemente usado su
composición consta de piruvato sódico el cual ayuda a recuperar las bacterias lesionadas; su habilidad selectiva
se debe a la presencia de telurito, cloruro de litio y glicina
En el medio la característica positiva de la presencia de Staphylococcus aureus es la presencia de un aspecto
negro, debido a la reducción del telurito, con un halo transparente que revela la actividad lipolítica sobre la
yema de huevo sin embargo, las colonias deben confirmarse mediante un examen de frotis teñido con
coloración de Gram.

Agar estafilococos N° 110: Es un medio selectivo para aislar estafilococos patógenos a partir de muestras
clínicas y no clínicas, basado en fermentación de manitol junto a la formación de pigmento y la actividad
gelatinasa.

Este medio también se utiliza para el aislamiento de estafilococos que infectan alimentos y producen una
intoxicación alimentaria. Los estafilococos coagulasa (+) patógenos crecen en altas concentraciones de NaCl y
forman colonias amarillas y doradas.

2. En qué consiste la actividad hemolítica de los estafilococos sobre los glóbulos rojos.

S. aureus produce una hemólisis que es causada por sustancias que lisan los glóbulos rojos o hemolisinas. Estas
son en realidad potentes toxinas citolíticas que actúan sobre las membranas de muchas células (incluyendo
eritrocitos) en caso del s. aureus este crea una Hemólisis beta lo cual indica que la hemólisis es total y el halo
que rodea a las colonias es totalmente transparente.

3. Enuncie tres pruebas que permitan la identificación plena de S. aureus.

 Ensayo de la termonucleasa (desoxiribonucleasa termoestable estafilocócica)

 Ensayo de aglutinación en látex

 Identificación mediante medios de cultivos

 Ensayos inmunoenzimáticos

4. ¿Por qué no es recomendable utilizar plasma citratado en la prueba de la coagulasa?

Puede variar el tiempo de coagulación del plasma sanguíneo ya que la cantidad de citrato presente afecta la
concentración de calcio utilizada en estas pruebas.

5. ¿Qué enfermedades supurativas y no supurativas produce el Staphylococcus aureus? Y quienes

descubrieron y documentaron el primer caso de shock tóxico estafilocócico.

Enfermedades supurativas por Staphylococcus aureus

  Neumonía: infección de inflama los sacos de aire de uno o ambos pulmones, los que pueden llenarse
de fluido. La neumonía puede provocar que los sacos de aire se llenen de fluido o pus.

 Endocarditis: inflamación del revestimiento interno de las cavidades y válvulas cardiacas (endocardio)
que pueden poner en peligro la vida de la persona

 Osteomielitis: inflamación del hueso ocasionada por una infección, generalmente en las piernas, los
brazos y la columna vertebral

 Artritis: inflamación de una o más articulaciones que provoca dolor y rigidez, y puede empeorar con la
edad.

 Gastroenteritis: infección intestinal acompañada de calambres, vomito, diarreas, fiebre y nauseas.

 Celulitis: infección cutánea

 Forúnculo: protuberancia dolorosa y llena de pus debajo de la piel ocasionada por folículos pilosos
infectados, y además inflamados.

 Impétigo: infección cutánea que ocasiona llagas rojas en el rostro

 Meningitis: inflamación de las meninges, membranas que rodean el cerebro.

Enfermedades no supurativas por Staphylococcus aureus

 Síndrome del shock toxico: es una enfermedad que grabe que se presenta con fiebre, shock y
problemas con varios órganos del cuerpo

 Síndrome de la piel escaldada: causada por cepas de Staphylococcus. Estas bacterias producen una
toxina que ocasiona daño a la piel. Dicho daño crea ampollas como si la piel estuviera escaldada las
cuales pueden ocurrir en zonas de la piel lejos del sitio inicial.
  Intoxicación alimentaria: es una enfermedad por la ingesta de alimentos contaminados con
bacterias, virus, parasito, en este caso por Staphylococcus aureus más específicamente por sus
enterotoxinas.

7) ¿Qué sucedería si se prolongara el tiempo de lectura de la coagulasa, explique por qué?

Si se prolongara el tiempo de lectura de la coagulasa estaríamos ante un falso negativo, ya que algunas sepas de
S. aureus van a producir altas concentraciones de fibrinolisina lo que provocará una dilución del coagulo
formado de una manera rápida evitando que hagamos una correcta lectura de la situación.

8) Qué enfermedades produce con frecuencia S. aureus.?

Las enfermedades más frecuentes que produce el Staphylococcus aureus son las siguientes.

 Endocarditis: cuando las personas se inyectan drogas, se infecta el catéter en los vasos sanguíneos o se
les ha instalado una válvula cardiaca artificial.

 Osteomielitis: si Staphylococcus aureus se propaga al hueso desde una infección del torrente
sanguíneo o desde una infección de tejidos blandos adyacentes, como puede ocurrir con las personas que
sufren ulceras por presión profunda o ulceras en los pies debido a la diabetes.

 Infección pulmonar (neumonía): cuando se ha sufrido una gripe (especialmente) o una septicemia,
cuando se toman corticoesteroles u otros fármacos inhibidores del sistema inmunitario
(inmunosupresores), o cuando los afectados han sido hospitalizados al necesitar intubación traqueal y
ventilación mecánica.

Bibliografía
https://medlineplus.gov/

https://es.slideshare.net/

https://es.scribd.com/doc/58723553/Control-de-calidad-de-las-tecnicas-de-Gram

https://www.scielo.sa.cr/

http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/apua-cuba/a3-agentes_antimicrobianos_y_microorganismos.pdf

https://www.who.int/mediacentre/commentaries/stop-antibiotic-resistance/es/

http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/BacteCEFA34.pdf

https://mdmcientifica.com/cepasatcc/