Protocolos Lme

PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL FACULTAD DE QUÍMICA
UNIDAD I. INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA
PRÁCTICA 1. Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología

Objetivos
Al finalizar la práctica el estudiante será capaz de:

• Aplicar las reglas básicas de higiene y seguridad para los laboratorios del área microbiológica.
• Analizar la importancia que tiene cada una de estas reglas, tanto en las actividades
académicas de aprendizaje, como en el ejercicio profesional.
Introducción
Un punto primordial al inicio del trabajo experimental es conocer y aplicar las reglas generales de
seguridad e higiene que deben cumplirse con la finalidad de salvaguardar la integridad y seguridad
del personal que ahí labora. En el caso del área microbiológica el objeto de estudio son seres vivos
que no podemos percibir a través de nuestros sentidos y muchos de ellos pueden ser agentes
causantes de enfermedades.
Material
Reglamento de Seguridad e Higiene para los Laboratorios de la Facultad de Química.

Reglamento de Seguridad e Higiene de los Laboratorios del Departamento de Biología.
Manual de Bioseguridad en Laboratorios de Ensayos Biomédicos y Clínicos (material
complementario).
Metodología
En grupos de trabajo, realizar la lectura y análisis del material asignado y exponerlo en un período
máximo de cinco minutos, para ello:
a. Discutir las normas generales de seguridad e higiene para cualquier laboratorio y
aquellas que se aplican especialmente en el área microbiológica. Hacer especial
hincapié en su importancia.
b. Ubicar las zonas de seguridad y controles maestros de suministro de servicios.
c. Establecer la utilidad de los desinfectantes, antisépticos y sanitizantes en el laboratorio
de Microbiología.
d. Simular los procedimientos a seguir en caso de accidentes, temblores, derrames y
sobre la disposición de desechos en el laboratorio.
e. Proponer otras guías de observación para verificar el cumplimiento de los reglamentos
vigentes en los laboratorios.
Para todas las sesiones de laboratorio llenar la siguiente guía de observación (cuadro 1) u otra
propuesta aprobada por los profesores.
Departamento de Biología
(1)
Cuadro 1. Guía de observación para evaluar el cumplimiento de los Reglamentos de Seguridad e

Higiene.
Fecha: NOMBRE Y NÚMERO DE EQUIPO
Mesa:
Nombre de quien evalúa:
PERSONAL
Bata limpia
Uso de cofia
Uso de cubrebocas
Uso de lentes de seguridad
Calzado cerrado
Cabello recogido
Sin joyería
Uñas cortas y sin esmalte
TRABAJO
Limpieza del área de trabajo
al iniciar sesión experimental
Orden de las áreas de
trabajo:
a. mesa
b. gaveta
Depósito adecuado de los
desechos
Esterilización de material
contaminado
Entrega oportuna del
material empleado en los
ejercicios anteriores
Respeta las instrucciones
dadas para el ejercicio
Limpieza del área de trabajo
al finalizar sesión
experimental
Observaciones
- Marcar 4 cuando no se cumpla la acción

- Marcar 5 cuando se cumpla la acción
- Marcar además con * cuando exista un comentario especial con respecto a la acción evaluada.
- Anotar el comentario en la parte de observaciones, en caso de ser insuficiente el espacio anotarlo al reverso
con la fecha de la evaluación.
(2)
Discusión de resultados
1. ¿Por qué debemos seguir el reglamento de seguridad e higiene dentro del laboratorio de
microbiología experimental?
2. ¿Crees que las medidas de seguridad e higiene que se aplican en el laboratorio de
microbiología experimental son las adecuadas para el trabajo práctico?
3. ¿Cuál crees que sea la importancia a nivel personal de cumplir con las reglas de seguridad e
higiene?
4. ¿Qué medidas de seguridad e higiene crees que no se cumplen en las instalaciones del
laboratorio de microbiología experimental? ¿Cómo podrías mejorarlas?
Literatura de consulta
Reglamento de Higiene y Seguridad de la Facultad de Química.2006.

http://www.fquim.unam.mx/sitio/
Reglamento para el Manejo, Tratamiento y Minimización de Residuos Generados en la Facultad
de Química de la UNAM. 2007. Anexo de la Gaceta de la Facultad de Química.
http://www.quimica.unam.mx
NOM-026 STPS-1998. Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por
fluidos conducidos en tuberías.
NOM-003 SEGOB-2002. Señales y avisos para protección civil. Colores, formas y símbolos a
utilizar.
NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las características, el procedimiento de identificación,
clasificación y los listados de los residuos peligrosos.
NOM-087-ECOL-SSA1- 2002. Protección ambiental- Salud ambiental- Residuos Peligrosos
Biológico Infecciosos- Clasificación y especificaciones de manejo.
INS. 2005. MAN-INS-001 Manual de Bioseguridad en Laboratorios de Ensayos Biomédicos y
Clínicos. http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/normatividad/norref/MAN-INS-
001%20Ed03%20BIOSEGURIDAD_%20IJL%2016_08_05.pdf
Collins C.H. y Lyne Patricia M. 1989. Métodos Microbiológicos. ACRIBIA. 524 pp
Gavilán Irma, Vélez Guadalupe y Santos Elvira. Manual de hojas de seguridad de agentes
infecciosos. FQ, UNAM, 2003.
(3)
UNIDAD II. TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA
PRÁCTICA 2.1 Uso y Cuidado del Microscopio de Campo Claro
Objetivos
Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de:

• Describir los cuidados básicos de un microscopio óptico de campo claro.
• Identificar cada una de las partes del microscopio y describir su funcionamiento.
• Enfocar adecuadamente el microscopio con todos sus aumentos.
Introducción
El microscopio es una de las herramientas más útiles en Microbiología. Su utilización permite la

observación de los microorganismos y con ella la obtención de datos esenciales para su
identificación, así como la descripción de características morfológicas, tintoriales, tamaño y
agrupación; por ello es muy importante saber utilizar éste instrumento y desde luego cuidarlo
adecuadamente.
Materiales
Muestras:
Agua de charco
Pulque
Alimento en estado de descomposición
Preparaciones de microorganismos
Material por equipo:

Microscopio
Aceite de inmersión
Pipetas Pasteur con bulbo
Preparaciones fijas
Pincel de cerdas suaves
Material que deben tener los alumnos:

Asas bacteriológicas
Portaobjetos excavados
Portaobjetos
Cubreobjetos
Paño limpio de algodón
Papel seda
Letras (a, b, f, g, r, t) muy pequeñas recortadas de periódico o revistas
Palillos
(4)
Metodología
2.1.1 Cuidado del microscopio e identificación de sus componentes.

1. Recibir el microscopio sujetándolo firmemente con ambas manos y depositarlo sobre la mesa
con suavidad.
2. Limpiar las partes mecánicas del microscopio con un paño (que no deje pelusa) limpio y seco.
3. Limpiar las lentes con un pincel libre de grasa.
4. Exhalar sobre la superficie de cada uno de las lentes oculares y limpiar con una hoja de papel
seda; exhalar sobre el papel seda antes de limpiar las lentes objetivos.
5. Identificar cada uno de los componentes del microscopio.
6. Siga las instrucciones del profesor para manipular correctamente
• El cable de conexión
• La lámpara
• El cabezal
• Pinzas de sujeción
• Tornillos de la platina y
• Tornillos macrométrico y micrométrico
• Revólver
• Control de intensidad de la luz
• Condensador
• Diafragma
• Lentes oculares
• Lentes de los objetivos
7. Observar los datos del microscopio e identificar:
• En el ocular, el coeficiente de aumento
• En el objetivo:
a) El coeficiente de aumento
b) la apertura numérica
c) la longitud mecánica del tubo
d) el espesor del portaobjeto a emplear
8. Calcular el total de amplificación que se puede obtener con los diferentes objetivos.
9. Calcular el aumento útil de los diferentes objetivos.
2.1.2 Enfoque de la preparación

1. Alinear el objetivo de menor aumento con el tubo del microscopio.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con el dispositivo móvil.
3. Observando lateralmente y mediante el tornillo macrométrico llevar la platina lo más cercano
posible al objetivo.
4. Observando a través de los oculares, ajustar el diafragma y el condensador para obtener la
iluminación adecuada
5. Observando por los oculares y mediante el tornillo macrométrico bajar lentamente la platina
hasta que aparezca la imagen del objeto.
6. Afinar el enfoque utilizando el tornillo micrométrico.
7. Para mejorar la nitidez de la imagen (dependiendo del modelo de microscopio):
a) Ajustar la intensidad de la luz, cerrando el diafragma de la lámpara o bajando
ligeramente el voltaje de la misma.
b) Regular el contraste de la imagen con ayuda del diafragma de iris del condensador.
(5)
8. Mediante los tornillos de la platina, centrar perfectamente el objeto de estudio. Recordar que con
mayor aumento el área de observación es menor, por lo que si el objeto de estudio no está
perfectamente centrado puede quedar fuera del campo de observación.
9. Girar el revólver y alinear el objetivo de 40x con el tubo del microscopio Recuerde que por la
propiedad parfocal del microscopio, al enfocar un objetivo, los demás quedan en foco.
10. Observar por el ocular y verificar que la imagen permanece enfocada y que sólo es necesario
mover el tornillo micrométrico o de precisión.
11. Girar el revólver a la posición media entre los objetivos de 40x y 100x, colocar una gota mínima
de aceite de inmersión sobre la preparación y continuar girando hasta alinear el objetivo de 100x.
12. Observar por el ocular y verificar que la imagen permanece enfocada y sólo es necesario mover
el tornillo micrométrico y en la mayoría de los casos aumentar la intensidad de la luz.
13. Al finalizar la observación de cada preparación y antes de retirarla, baje la platina, gire el revólver
hacía el objetivo de menor aumento.
14. Después de retirar la preparación, limpiar el aceite que queda en el objetivo con papel seda.
15. Iluminar el microscopio varias veces y enfocar tantas preparaciones como sea posible.
16. Observar primero las letras, después colorante seco y luego las preparaciones de
microorganismos proporcionadas por el profesor.
17. Al finalizar el trabajo, apague el equipo, limpie con papel seda las partes ópticas y con un paño
las mecánicas.
18. Colocar el cabezal en su posición original y asegurarlo.
19. Arregle el cable.
20. Entregue el equipo transportándolo adecuadamente (ver punto 1. de 2.1.1).
21. Antes de retirarse, asegurarse que las mesas de trabajo, las tarjas y el laboratorio en general
queden limpios.
Precauciones generales
• Nunca tocar las lentes con los dedos.

• No tocar la superficie del papel seda con la que se va a limpiar las lentes.
• Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de observación.
• Cuando el microscopio no este siendo utilizado debe permanecer apagado.
• El microscopio debe ser colocado en el centro de la mesa de trabajo, lejos de las orillas.
• En caso de derrames accidentales de muestras sobre el microscopio, limpiar las partes
afectadas con una solución sanitizante a base de sales cuaternarias de amonio, NUNCA CON
CLORO.
• El microscopio deberá ser protegido del polvo cubriéndolo con una funda o en un estuche.
Disposición de desechos
1. Después de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante 10 minutos en una
solución sanitizante de hipoclorito de sodio al 10% a partir de una solución comercial, después se
lavan con detergente líquido, se enjuagan y se sumergen en alcohol al 95% durante 24 horas.
2. En caso de que las preparaciones se rompan, envolverlas en papel, esterilizar en autoclave y
desecharlas en el contenedor exclusivo para material roto de vidrio.
3. Los portaobjetos rotos o dañados que se encuentren limpios se colocan directamente en el
mismo contenedor
4. Los desechos de colorantes se colocan en los contenedores dispuestos para este fin en cada
laboratorio. Posteriormente se someten a adsorción con carbón activado y el agua libre de
colorante es desechada
(6)
1. ¿Cuál es la importancia del uso del microscopio en el laboratorio de microbiología

experimental?
2. ¿Por qué crees que es importante cuidar adecuadamente el microscopio en tu laboratorio de
microbiología experimental?
3. ¿Qué otros cuidados crees que podamos adoptar en el laboratorio de microbiología
experimental para mejorar el cuidado del microscopio?
4. ¿Cuáles crees que sean los errores más comunes que cometen, los alumnos en clase, al
manipular el microscopio?
• Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock. Biología de los microorganismos. 10ª
Ed. Prentice Hall Iberia. España.
• Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García, A. Mejía
Chávez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A. Camacho Cruz y M del
C. Urzúa Hernández. 2006. Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª edición.
Facultad de Química, UNAM. México.
• Stanier,R. Y., J. L Ingraham, M. L Wheelis y P. R Painter, 1996. Microbiología. 2ª edición.
REVERTÉ, S. A. España
• Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L. 1995. Microbiology an Introduction. 5a.
ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 801 pp
(7)
PRÁCTICA 2.2 Preparaciones Microbiológicas (1ª sesión)

2.2.1 Preparaciones húmedas
2.2.2 Gota pendiente
2.2.3 Preparaciones fijas
2.2.4 Tinción simple
Objetivos

• Realizar diferentes preparaciones microbiológicas a partir de muestras naturales y cultivos
puros.
• Describir las características morfológicas y de locomoción de microorganismos que se
encuentran en muestras naturales.
• Realizar frotis fijos y tinciones simples.
• Identificar y describir las características morfológicas y de agrupación de bacterias y hongos
levaduriformes.
Introducción
El tamaño de los microorganismos impide detectarlos a simple vista, por lo que es esencial el uso del
microscopio. Para que un objeto pueda ser percibido a través del microscopio, este debe poseer
cierto grado de contraste con el medio circundante. Para aumentar el contraste de los
microorganismos y lograr una mejor observación de los mismos, se emplean diferentes técnicas de
tinción, las cuales se basan en la capacidad de los microorganismos para retener (o no) ciertos
colorantes lo que depende de la carga de la célula y del colorante.
Materiales
Muestras:
Agua de charco
Pulque
Alimento en estado de descomposición
Cultivos puros de las siguientes bacterias y un hongo:
Bacillus sp.
Micrococcus luteus
Serratia marcescens
Staphylococcus sp.
Streptococcus sp.
Saccharomyces cerevisiae

Microscopio
Pipetas Pasteur con bulbo
Preparaciones fijas
Frascos gotero con azul de metileno, safranina, cristal violeta
(8)

Mecheros
Asas
Portaobjetos excavados
Portaobjetos
Cubreobjetos
Charola para tinción
Puente de vidrio
Piseta
Pinzas de madera para ropa
Papel seda
Palillos
Vaselina sólida
Frasco con una solución de sanitizante para desechar preparaciones
Metodología
Lavar y desengrasar los portaobjetos y cubreobjetos. Para ello emplear jabón líquido y agua; enjuagar
varias veces con alcohol al 95%, ponerlos a secar al aire a temperatura ambiente y flamearlos de 2 a
3 veces.
2.2.1 Preparaciones húmedas

1. Con una pipeta Pasteur colocar una gota de la muestra (agua o de pulque) en el centro del
portaobjetos, cubrir la gota con un cubreobjetos.
2. Observar al microscopio con los objetivos de 10x y 40x. Nunca con el objetivo de inmersión.
3. Esquematizar la morfología y movimiento de los microorganismos observados.
2.2.2 Gota pendiente

1. Con un palillo colocar un poco de vaselina alrededor de la concavidad del portaobjetos
excavado.
2. Con una pipeta Pasteur tomar una gota de la muestra y colocarla en el centro del
cubreobjetos.
3. Invertir el portaobjetos excavado y colocar la excavación sobre el cubreobjetos que tiene la
muestra, procurando que ésta quede en el centro de la concavidad.
4. Oprimir suavemente la zona engrasada a fin de sellar y disminuir la evaporación.
5. Invertir la preparación y observar al microscopio con los objetivos de 10x y 40x.
6. Esquematizar la morfología y movimiento de los microorganismos observados.
2.2.3 Preparaciones fijas

2. Etiquetar los portaobjetos en uno de sus extremos.
3. Si la muestra del cultivo es sólida, colocar una pequeña gota de agua (con asa) en el centro
del portaobjetos.
4. Esterilizar el asa de siembra y en condiciones asépticas tomar una pequeña cantidad del
cultivo.
5. Mezclar suavemente el cultivo y el agua, con el asa, hasta obtener una suspensión
homogénea y extenderla en el centro del portaobjetos.
6. Esterilizar el asa.
7. Si la muestra se toma de un cultivo líquido, no es necesario poner la gota de agua, solo
extender directamente sobre el portaobjetos.
(9)
8. Dejar secar totalmente la preparación a temperatura ambiente.

9. Fijar el frote con calor, para ello cuando el frote está perfectamente seco pasar el portaobjetos
por la flama del mechero de cuatro a cinco veces y dejar enfriar.
2.2.4 Tinción simple

1. Cubrir el frote fijo con 3 gotas del colorante básico (azul de metileno, safranina o cristal violeta)
y dejar actuar durante 1 minuto.
2. Sobre una charola escurrir el colorante y lavar la preparación con el mínimo de agua, para ello
inclinar el portaobjetos y en la parte superior aplicar el agua con una piseta de manera que
resbale sobre el frote.
3. Colocar el portaobjetos inclinado sobre una toalla de papel absorbente y dejar secar a
temperatura ambiente.
4. Observar al microscopio con los objetivos de 10x, 40x y 100x.
5. Esquematizar sus observaciones y describir las características de los microorganismos
observados empleando los términos adecuados respecto a la morfología, agrupación y
estructuras; ejemplos: a) bacilos largos con extremos redondos, b) cocos agrupados en
cadenas denominadas estreptococos, c) célula móvil de forma ovoide con estructuras
internas.
• Procura preparar un frote delgado y sin extender demasiado sobre el portaobjetos.

• Cuando se fija la preparación al mechero, cuida que el portaobjetos no se caliente demasiado.
• Respeta los tiempos designados para cada colorante.
• Busca un buen campo microscópico (células separadas, bien teñidas, que se defina bien la
morfología y sin manchas de colorantes) para realizar descripciones confiables de tus
microorganismos.
• Para la observación de preparaciones húmedas baja la intensidad de luz y contrasta la imagen
con ayuda del diafragma iris del microscopio.
1. Después de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante 10 minutos en

una solución sanitizante de hipoclorito de sodio al 10% a partir de una solución comercial,
después se lavan con detergente líquido, se enjuagan y se sumergen en alcohol al 95%
durante 24 horas.
2. En caso de que las preparaciones se rompan, envolverlas en papel, esterilizarlas en autoclave
y desecharlas en el contenedor exclusivo para material roto de vidrio.
mismo contenedor.
4. Esterilizar en autoclave los cultivos bacterianos y muestras empleadas y desecharlas.
colorante es desechada.
1. ¿Qué diferencias encuentras en las observaciones al microscopio al realizar preparaciones

húmedas y fijas?
(10)
PRÁCTICA 2.2. Preparaciones Microbiológicas (2ª sesión)
2.2.5 Tinciones diferenciales

a. Tinción de Gram
b. Tinción de Ziehl Neelsen
Objetivos

• Identificar y describir las características microscópicas y tintoriales de las bacterias.
Introducción
La reacción a la tinción de Gram y de Ziehl-Neelsen se basa en la composición y estructura de la

pared celular, que determina que unas bacterias retengan el primer colorante, en tanto que otras lo
pierdan, lo que les permite reaccionar con el colorante de contraste.
Materiales
Cultivos puros de las siguientes bacterias:

Cepas de referencia:
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Escherichia coli ATCC 25922
Cepas de prueba (X):
Bacillus sp
Klebsiella o Serratia marcescens
Moraxella sp
Mycobacterium sp.
Streptococcus oralis

Microscopio
Colorantes para tinción de Gram
Frascos gotero con fucsina fenicada, azul de metileno de Löeffler, alcohol ácido

Mecheros
Asas
Portaobjetos
Cubreobjetos
Puente de vidrio para tinciones
Pinzas
Piseta
Papel seda
(11)
Metodología
varias veces con alcohol al 95%, ponerlos a secar y flamearlos 2 a 3 veces.
2.2.5 Tinciones diferenciales
Tinción de Gram
1. Etiquetar tres portaobjetos por uno de sus extremos con los nombres de: Staphylococcus
aureus, Escherichia coli y el tercero con la bacteria X.
2. Preparar los frotes bacterianos a partir de cultivos líquidos o sólidos.
3. Fijar con calor (mechero).
4. Agregar cristal violeta en cantidad suficiente para cubrir el frote (2 a 3 gotas) y dejar actuar 1
minuto.
5. Lavar con el mínimo de agua para eliminar el exceso de colorante.
6. Agregar lugol en cantidad suficiente para cubrir el frote (2 a 3 gotas) y dejar actuar 1 minuto.
7. Lavar con el mínimo de agua para eliminar el exceso de mordente.
8. Decolorar con alcohol acetona hasta que el efluente salga incoloro.
9. Lavar con agua para eliminar el exceso de disolvente.
10. Agregar safranina en cantidad suficiente hasta cubrir el frotis (2 ó 3 gotas) y dejar actuar 1
minuto.
11. Lavar con agua para eliminar el exceso del colorante de contraste.
12. Dejar secar la preparación a temperatura ambiente.
13. Observar al microscopio con los objetivos de 10x, 40x y 100x.
14. Esquematizar las observaciones realizadas con el objetivo de mayor aumento y describir las
características de los microorganismos observados e indicar si son Gram positivos o Gram
negativos (cuadro 2).
b) Tinción de Ziehl Neelsen

1. Etiquetar los portaobjetos por uno de sus extremos.
2. En el portaobjetos colocar 1 gota del cultivo de Mycobacterium sp. y 1 gota del cultivo de
Staphylococcus aureus.
3. Con el asa mezclar las dos suspensiones.
4. Secar al aire y fijar con calor (mechero).
5. Cubrir la preparación con un papel filtro y saturarla con fucsina básica fenicada, calentar la
preparación pasando la flama del mechero. Dejar actuar el colorante durante 10 minutos
cuidando que no se seque la preparación.
6. Dejar enfriar la preparación.
7. Con unas pinzas largas retirar el papel filtro y colocarlo en un frasco para su posterior desecho
8. Lavar con abundante agua (hasta que el efluente salga incoloro).
9. Decolorar con alcohol ácido el que se agrega gota a gota hasta que el efluente salga incoloro.
10. Lavar la preparación.
11. Cubrir la preparación con 2 a 3 gotas de azul de metileno de Löeffler y dejar actuar 2 minutos.
12. Lavar el exceso de colorante con el mínimo de agua.
13. Secar a temperatura ambiente.
14. Observar al microscopio con el objetivo de 100x.
15. Esquematizar sus observaciones y describir las características de los microorganismos e
indicar si son Bacterias Ácido Alcohol Resistentes (BAAR) o bacterias No Ácido Alcohol
Resistentes (cuadro 2)
(12)
Cuadro 2. Características microscópicas de bacterias, de acuerdo a la tinción de Gram y de Ziehl-

Neelsen.
Microorganismo Forma1 Agrupación2 Gram / Ácido Esquema
resistencia3
1
Forma: bacilo, coco, cocobacilo, espirilo, otro
2
Agrupación: pares, cadena, racimo, ninguno, otro
3
Gram: positivo, negativo, no determinado. BAAR: positivo, negativo, no determinado
• Primero prepara todos los frotes de tus muestras, apaga el mechero y posteriormente procede
a la tinción.
• No pierdas de vista el objetivo de cada tinción diferencial, cuándo se considera una bacteria
Gram positiva, cuándo una Gram negativa, en comparación de una BAAR positiva y de una
BAAR negativa.

durante 24 horas.
mismo contenedor.
1. Comparar los resultados obtenidos de la bacteria X con las cepas control

2. Analizar las posibles causas de error en el procedimiento o los factores que contribuyeron a la
correcta tinción de las bacterias en estudio.
3. ¿Puede una bacteria Gram positiva teñirse como una Gram negativa? ¿Por qué?
(13)
PRÁCTICA 2.2. Preparaciones Microbiológicas (3ª sesión)

2.2.6 Tinciones selectivas
a) Tinción de endosporas bacterianas
b) Tinción de cápsula
Objetivos

• Localizar y describir endosporas y cápsulas bacterianas.
Introducción
Las tinciones selectivas son aquéllas que permiten observar un organelo celular determinado.
Algunas bacterias tienen la capacidad de producir endosporas y cápsulas. Los primeros son
organelos de resistencia que se caracterizan por presentar una capa externa formada por un
complejo de calcio, ácido dipicolínico y peptidoglicano. Debido a esta composición, es muy difícil que
los colorantes penetren, por lo que al aplicar una tinción simple, estas aparecen como cuerpos
incoloros (dentro o fuera de la célula). No obstante es posible teñirlas mediante la aplicación de
métodos drásticos. Respecto a la cápsula, esta es una cubierta extracelular constituida por agua y
polisacáridos que se acumulan alrededor de la célula. Estos componentes no se combinan con los
colorantes, por lo que para la observación de la misma se emplean tinciones negativas con las que se
oscurece el fondo y de esta manera se contrastan las cápsulas.
Materiales
Muestras:
Pulque

Bacillus subtilis
Bacillus megatherium
Bacillus cereus
Leuconostoc sp.,
Azotobacter sp.,
Bacillus sp,
Material por equipo

Microscopio
Vaso de precipitados de 250 ml
Charola de metal
Tripie o anillo
Papel filtro (cuadros 2x2cm)
Frascos goteros con verde de malaquita, safranina al 0.5% (no usar el de Gram), azul de metileno,
tinta china (1:1), cristal violeta al 1.0%, solución alcohólica de fucsina básica.
(14)

Mecheros
Asas
Gradilla
Portaobjetos
Cubreobjetos
Puente de vidrio para tinción
Pinzas de punta roma
Piseta
Papel seda
Metodología
varias veces con alcohol al 95%, ponerlos a secar y flamearlos 2 a 3 veces.
2.2.6 Tinciones selectivas

a) Tinción de endosporas
1. Etiquetar los portaobjetos por uno de sus extremos.
2. Preparar 2 frotes fijos a partir de cultivos de las diferentes especies de Bacillus.
3. Aplicar una tinción simple a uno de los frotes de cada bacteria (ver ejercicio 2.2.1).
4. Cubrir el segundo frote de cada microorganismo con papel filtro y saturarlo con verde de
malaquita.
5. Calentar la preparación sobre un vaso de precipitados con emisión de vapores de agua
durante 10 minutos, cuidando que el colorante no hierva y mantener la preparación húmeda.
6. Retirar el papel filtro con unas pinzas y colocarlo en un frasco para su posterior desecho.
7. Lavar con el mínimo de agua.
8. Agregar 3 gotas de una solución de safranina al 0.5% y dejarla reaccionar durante 30
segundos.
9. Lavar, dejar secar a temperatura ambiente y observar con el objetivo de 100x.
2.2.7 Tinciones negativas

b) Tinción de cápsula
1. En el extremo del portaobjetos, colocar una gota de agua y una de tinta china y mezclar.
2. Suspender una asada de Leuconostoc sp en la mezcla anterior.
3. Colocar el borde de otro portaobjetos sobre la gota y deslizar éste sobre el porta que contiene
la muestra formando una película delgada.
4. Dejar secar al aire (NO FIJAR).
5. Cubrir el frote con cristal violeta o fucsina fenicada, dejar actuar durante un minuto.
6. Lavar, dejar secar a temperatura ambiente y observar la preparación con el objetivo de
inmersión.
7. Repetir el procedimiento con los cultivos de Azotobacter sp, Bacillus sp o con la muestra de
pulque.
• Las preparaciones hechas para observar cápsula no deben fijarse con calor.
(15)
• Procura no saturar con verde de malaquita la preparación para observar endospora.

durante 24 horas.
mismo contenedor.
1. Distingue en tus preparaciones las endosporas de las esporas libres.

2. Distingue la diferencia de las endesporas de cada una de las especies del género Bacillus que
trabajaste en clase.
3. ¿Fue fácil reconocer las cápsulas bacterianas? ¿Por qué?
4. ¿Qué estrategia sugieres para reconocer y localizar más eficazmente las cápsulas
bacterianas?
5. Discute sobre la información que te proporciona cada una de las tinciones realizadas en
sesiones anteriores.
• Balows, A. 2005. Manual of Clinical Microbiolgy. 5ª edición. A. Society for Microbiology,

Washington, USA.
• Collins C.H. y Lyne Patricia M. 1989. Métodos Microbiológicos. ACRIBIA. 524 pp
• Díaz, R., G. Gamazo e I. López Goñi.1995. Manual Práctico de Microbiología. 1ª edición.
MASSON, S. A. España
• Leboffe, M. J., y B. E. Pierce. 2006. Microbiology Laboratory and application. 2a edición.
Morton Publishing Co., USA.
(16)
PRÁCTICA 2.3 Esterilización y Preparación de Medios de Cultivo

(1ª sesión)
Objetivos
Al finalizar este ejercicio el alumno será capaz de:

• Explicar el concepto de esterilización y su utilidad en microbiología.
• Preparar correctamente el material que se someterá a esterilización.
• Aplicar algunas metodologías para esterilizar material y medios de cultivo.
• Comprobar la efectividad del proceso de esterilización.
• Explicar el concepto de medio de cultivo en microbiología.
• Eliminar adecuadamente los desechos biológicos.
Introducción
Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas con material y
medios de cultivo estériles. En Microbiología la esterilización se define como “el proceso mediante el
cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de resistencia) de un objeto, medio o
superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de microorganismos en el material y medios de
cultivo a ser empleados. Existen diversos métodos de esterilización, entre ellos: calor (seco o
húmedo), filtración (para sustancias termolábiles y aire), radiaciones y aplicación de gas de oxido de
etileno (para jeringas y cajas de plástico).
Un medio de cultivo esta constituido por una mezcla de agua y sustancias orgánicas e inorgánicas,
los que en conjunto proporcionan los requerimientos nutricionales para el desarrollo de los
microorganismos. La composición de los medios de cultivo varía en función de: a) grupo microbiano
que se pretende estudiar, b) complejidad química, c) estado físico, y d) aplicación.
Materiales
Material por grupo:

Balanzas granatarias
Potenciómetro
Espátulas
Tiras de papel kraft de 2.5 cm de ancho (para envolver pipetas)
Tiras de papel kraft de 20 cm de ancho (para envolver cajas)
Indicador biológico de esterilización (ampolletas o tiras de papel filtro impregnada con esporas de
Geobacillus stearothermophylus)
Agua destilada
Caldo nutritivo o caldo tripticasa soya (medio de cultivo líquido deshidratado)
Gelosa nutritiva o tripticasa soya agar (medio de cultivo sólido deshidratado)
Agar-Agar
Solución de NaOH 1.0 N,
Solución de HCl al 10%

Tripie
Charola metálica para tripié
Matraz Erlenmeyer de 50 mL
(17)
Matraz Erlenmeyer de 250 o 300mL

Probeta de 100 o 250 mL
Varilla de vidrio
Gradilla
Pipeta de 10 mL
Pipetas de 1.0 mL
Pipetas Pasteur (esterilizar para la siguiente clase)
Tubos de ensayo de 16x150
Hisopos (palitos de madera con algodón)

Mecheros
Piseta
Papel kraft o de estraza
Maskin-tape
Clips
Plumones indelebles de punto grueso
Cestos o latas metálicas (frutas en conserva, 350 g)
Metodología
a) Preparación y esterilización de material de vidrio.

1. Lavar material con detergente líquido, enjuagar con abundante agua de la llave y al final con
agua destilada.
2. Secar el material de vidrio de preferencia en horno, si no es posible secar al aire.
3. En las pipetas de 1.0 mL colocar (con un clip) un filtro de algodón en la boquilla.
4. Envolver las cajas de Petri y pipetas con papel kraft de acuerdo a las indicaciones del
profesor.
5. Introducir los hisopos en un tubo de 22x175 y tapar con algodón.
6. En el papel de la envoltura identificar con nombre y marcar el volumen de las pipetas.
7. Introducir el material en un horno previamente calentado a 180ºC, esperar a que la
temperatura se estabilice nuevamente y a partir de este momento contar el tiempo de
esterilización (1 hora).
b) Preparación y esterilización de medios de cultivo.

1. Leer cuidadosamente el membrete del medio de cultivo deshidratado (caldo y agar).
2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 70 mL de caldo del medio de cultivo deshidratado
(ver figura 1).
3. Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operación debe ser rápida para
evitar que la humedad del ambiente no afecte el resto del contenido del frasco.
4. Disolver el medio en 50 mL de agua destilada en un matraz de 250 mL, y una vez disuelto
completar el volumen con 20 mL más.
5. Ajustar el pH entre 6.8 y 7.2.
6. Colocar 10 mL de caldo en 5 tubos de 16x150 c/u.
7. Colocar 20 mL del caldo en el matraz de 50 mL y calcular la cantidad necesaria de agar-agar
para obtener un medio semisólido (2 g agar/ 1 L medio).
8. Tapar el matraz y calentar hasta disolver totalmente, procurando agitar repetidamente.
9. Una vez fundido el medio de cultivo semisólido colocar 10 mL en 2 tubos de 16x150 c/u.
(18)
70 mL agua 90 mL de agua
de stila da destilada
Disolver X g de medio de cultivo D isolver X g de medio de cultivo

líquido deshidratado sólido deshidratado
Ajusta r pH (6.5 – 7.2)
Distribuir el caldo en:
Fundir el medio con

ca lentamie nto moderado
Distribuir 1 0 mL del medio en Distribuir 2 0 mL del medio
5 tubos de 16x150 en un matraz Erlenme yer D istribuir el medio en:
Medi o l íquid o Agregar y disolver 10 mL e n 2 tubo s

X g de agar-agar de 16x150
Distribuir 7 mL del me dio

e n 2 tubos de 16x150
7 mL en 4 tubos
de 16x150
Med io
sem isól ido
20 mL e n 2 tubo s
de 22x175
Med io sól ido
Figura 1. Práctica 2.3. Preparación de medios de cultivo.
(19)
10. Calcular la cantidad necesaria para preparar 90 mL de medio de cultivo sólido deshidratado y
seguir los pasos 3 y 4.
NOTA: Un medio de cultivo sólido (agar) se puede preparar a partir del medio de cultivo
líquido (caldo), agregando a éste la cantidad necesaria de agar-agar (15 a 20 g agar/ 1 L
medio) para el volumen de medio de deseado.
11. No medir pH. No es recomendable para medios que contienen agar-agar.
12. Tapar el matraz y calentar hasta disolución total, para ello agitar repetidamente y evitar que el
medio de cultivo hierva y se derrame.
13. Distribuir el medio de cultivo en el siguiente material:
• 20 mL en 2 tubos de 22x175
14. Tapar cada uno de los tubos con algodón, etiquetarlos y esterilizarlos en autoclave a 121oC y
15 lbs. de presión durante 20 minutos.
15. Actividad para un equipo por mesa. En uno de los tubos que contiene 10 mL de caldo, colocar
una tira de papel filtro impregnada con esporas de Geobacillus stearothermophylus (indicador
biológico de esterilidad).
16. Acomodar los tubos (incluyendo el que contiene el indicador biológico) de acuerdo a su estado
físico en tres latas o cestos metálicos (líquido, semisólido y sólido) y cubrir con papel kraft o de
estraza.
17. Esterilizar este material en autoclave a temperatura de 121°C, a 15 lbs. de presión durante 10
a 20 minutos (dependiendo de la cantidad de material).
18. Antes de abrir el autoclave, asegurarse que baje la temperatura y que la presión interior sea
igual a la del exterior.
• Al calentar los medios de cultivo con agar-agar es muy importante procurar agitar
repetidamente el medio para evitar que el agar-agar se pegue en el fondo del matraz y que se
queme. Asimismo evitar que hierva para evitar su derrame.
• Etiqueta debidamente tu material de vidrio (tubos d ensayo, matraces) antes de verter los
medios de cultivo en ellos. Procura no utilizar maskin-tape.
• Los cestos o las latas metálicas deben estar debidamente forradas con papel kraft o de
estraza.
• El material donde se preparó el medio de cultivo sólido (agar-agar) debe ser lavado con agua
y jabón inmediatamente después de su uso. Así evitarás que el agar-agar se pegue al vidrio.
• Antes de mandar a incubar el material con los medios de cultivo, verifica la manera cómo hay
que prepararlo para que sean recibidos (Reglamento del Área de Esterilización e Incubación).
1. Colocar el medio de cultivo sólido sobrante sobre un papel y envolverlo, colocar el paquete en
una bolsa de plástico y desecharlo en el contenedor rojo.
1. ¿Cuál es el punto crítico para preparar un medio de cultivo sólido?

2. Discute los cálculos para preparar los medios de cultivo en diferentes estados físicos.
(20)
PRÁCTICA 2.3 Control de Calidad de Esterilización,

Zona y Técnica Aséptica (2ª sesión)
Materiales

Cajas Petri con TSA
Tripie
Charola metálica

Mecheros
Asas
Gradilla
Cajas de Petri de plástico estériles desechables
Pinzas largas con punta roma
Material preparado la sesión anterior:
4 tubos de 16x150 con 7 mL del medio sólido
2 tubos de 22x175 con 20 mL de medio sólido
Por mesa 2 tubos de 16x150 con 10 mL de caldo nutritivo
Metodología
1. Fundir el medio sólido que se encuentra en 2 tubos de 22x175 con 20 mL y en 4 tubos de

16x150 con 7 mL (preparados en la sesión anterior).
2. Una vez fundido el medio, colocar los 4 tubos de 16x150 con 7 mL de medio en posición
inclinada y dejar solidificar. Los 2 tubos de 22x175 con 20 mL de medio mantenerlos en baño
María a 50ºC.
a) Comprobación de esterilidad.
Actividad para 1 equipo por mesa.
1. Separar el tubo en el que colocaron la tira de papel filtro impregnada con esporas de
Geobacillus stearothermophylus (indicador biológico de esterilidad) y etiquetar como “estéril”
2. Separar 1 tubo con caldo y en condiciones de asepsia colocar una tira de papel filtro
impregnada con esporas de Geobacillus stearothermophylus (indicador biológico de
esterilidad) y etiquetar como “control”.
3. Incubar los 4 tubos a 55ºC durante 48 horas.
b) Comprobación de zona aséptica.

1. Lavar y desinfectar la mesa, delimitar el área de trabajo y encender el mechero para crear una
zona aséptica.
2. Colocar las 3 cajas de Petri con TSA o gelosa nutritiva a 10 cm (Caja 1), 15 cm (Caja 2) y 20
cm (Caja 3) de distancia del mechero y dejarlas destapadas durante 30 minutos.
(21)
c) Comprobación de técnica aséptica.

1. En condiciones de asepsia vaciar el contenido de los tubos (22x175) en dos cajas de Petri de
plástico y dejar solidificar.
2. Marcar la caja por el reverso, dividiéndola en 2 secciones.
3. Esterilizar el asa al mechero, dejar enfriar y trazar una estría en el sector 1.
4. Incubar el material preparado en los incisos anteriores a 27°C durante 24 horas y registrar sus
resultados en el cuadro 3.
5. Guardar los medios preparados para la próxima sesión.
Cuadro 3. Resultados de la comprobación de esterilización, zona y técnica aséptica.

Comprobación de: Material Desarrollo microbiano
1 Bioindicador (estéril) *
1 Bioindicador (control) *
2 Tubos con caldo *
Esterilidad 2 Tubos con medio semisólido *
4 Tubos con gelosa inclinada *
2 Tubos con gelosa vertical *
Caja 1 *
Zona aséptica Caja 2 *
Caja 3 *
Técnica aséptica Sector 1 *
Sector 2 *
*Indicar: + = presencia de desarrollo microbiano, - = ausencia de desarrollo microbiano.
• Asegurarse de que el medio de cultivo este perfectamente fundido (sin grumos y de un color
claro) antes de ser vertido a las cjas Petri.
• Antes de esterilizar el material para su desecho, retirar etiquetas, maskin-tape y escritura con
plumón.
Disposición de desechos.
1. Separar el material en el que se haya registrado desarrollo microbiano y proceder a prepararlo

de la siguiente manera:
a) Cajas de Petri de plástico. Asegurarlas con maskin-tape y colocarlas en el contenedor
rojo ubicado en el laboratorio 1 A.
b) Recipientes de vidrio. Esterilizar en autoclave y posteriormente retirar el medio de
cultivo sólido, envolver en papel, colocar el paquete en una bolsa de plástico y
colocarla en el contenedor rojo ubicado en el laboratorio 1 A.
2. Depositar el papel de envoltura en el bote de basura correspondiente.
1. ¿Cuál es la importancia de verificar la eficacia de la esterilización de las autoclave del Área de

Esterilización e Incubación del laboratorio de microbiología experimental.
2. Según tus resultados, ¿cuál es la calidad de tu zona y técnica aséptica?, ¿A qué lo atribuyes?
¿Cómo mejorarías esta situación?
(22)

• Díaz, R., G. Gamazo e I. López Goñi.1995. Manual Práctico de Microbiología. 1ª edición.
MASSON, S. A. España
edición. Prentice Hall Iberia. España.
• Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L. 1995. Microbiology an
Introduction. 5a. ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 801 pp
• Zinsser. Microbiología. 1994. Ed. Panamericana. 1699 pp
(23)
UNIDAD III. ESTUDIO DE CULTIVOS BACTERIANOS PUROS

UNIDAD IV. ESTUDIO MICROSCÓPICO Y CULTIVO DE HONGOS
PRÁCTICA 3.1, 4.1 Técnicas de Siembra y de Cultivo de Bacterias y

Hongos (1ª Sesión)
Objetivos

• Aplicar las diferentes técnicas de siembra que se emplean para el estudio y aislamiento de
bacterias y hongos (levaduriformes y filamentosos).
• Relacionar la presentación del medio de cultivo con la técnica de siembra.
• Distinguir las condiciones de incubación para el cultivo de bacterias y hongos.
• Describir las características morfológicas macroscópicas y microscópicas de las bacterias y
hongos (levaduriformes y filamentosos).
• Comprobar la pureza de los cultivos mediante tinciones simples y/o diferenciales.
Introducción
La identificación de microorganismos se basa en la observación de las características microscópicas

y de desarrollo que presentan en medios líquidos, semisólidos y sólidos. En los últimos la formación
de colonias visibles con características particulares permite diferenciar a los microorganismos, así
como detectar contaminantes en los cultivos puros.
Materiales

Serratia marcescens
Pseudomonas aeruginosa
Bacillus sp.
Micrococcus luteus
Proteus vulgaris
Staphylococcus aureus
Streptomyces erythraeus
Streptomyces griseus
Cultivos puros de los siguientes hongos

Cepas de referencia :
Saccharomyces cerevisiae
Rhodotorula sp.
Penicillium sp.
Aspergillus niger
Rhizopus sp.
Alternaria sp.
Fusarium sp.
Geotrichum sp.
(24)

Microscopio
Tubos de ensaye de 16x150 con 7 mL de Solución Salina Isotónica (SSI)
Cajas de Petri con TSA
Cajas con YPDM
Cajas con Agar Sabouraud
Asa micológica
Pipetas graduadas de 1.0 mL estériles

Mecheros
Asas
Gradillas
Portaobjetos
Piseta
Papel seda
Cestos o latas metálicas (frutas en conserva, 350 g)
Material preparado la sesión anterior (PRÁCTICA 2.3 1ª Sesión):
2 tubos de 16x150 con 10 mL de caldo nutritivo
2 tubos de 16x150 con 10 mL de medio semisólido
4 tubos de 16x150 con 7 mL de medio sólido inclinado
2 tubos de 16x150 con 10 mL de medio sólido (fundir)
2 tubos de 22x175 con con medio sólido (fundir)
Metodología
a) Siembra de bacterias.
1. Sembrar 2 bacterias diferentes por cada equipo.
2. A partir del cultivo puro preparar un frote, teñir con Gram y observar con objetivo 100x.
3. Registrar sus observaciones.
4. Organizar el material de modo que cada alumno cuente con lo siguiente material:
3 cajas de Petri con TSA
*2 tubos de 16x150 con caldo nutritivo
*2 tubos de 16x150 con agar sólido inclinado
*1 tubo de 16x150 con medio semisólido
*1 tubo de 16x150con medio sólido (fundir)
* Material preparado la sesión anterior (PRÁCTICA 2.3 1ª Sesión).
5. Identificar las cajas de Petri y tubos de ensayo con plumón indeleble con los siguientes datos:
Clave de la materia y grupo

Nombre del alumno
Muestra
Fecha de siembra
(25)
6. A partir del cultivo puro transferir 0.2 mL a uno de los tubos de ensaye de 16x150 con 10 mL
de caldo nutritivo (Tubo 1).
NOTA: Cuando el cultivo se encuentre en estado sólido transferir 2 asadas.
7. A partir del Tubo 1 inocular el siguiente material (Figura 2):
*1 tubo de 16x150 con caldo nutritivo (2 asadas).
*2 tubos de 16x150 con agar sólido inclinado (uno con estría recta y otro con estría ondulada).
*1 tubo de 16x150 con agar semisólido mediante (picadura con asa recta o en aguja).
*1 tubo de 16x150 con medio sólido fundido (3 a 4 gotas con la pipeta Pasteur).
*2 cajas de Petri (una con estría simple y otra con cuadrante radial).
*1 caja de Petri (técnica de extendido o siembra masiva con hisopo).
8. Sellar las cajas con maskin-tape e invertirlas (tapa abajo, base arriba).
9. Colocar las cajas y los tubos en un recipiente (cesto o lata metálica) debidamente identificado
e incubar 24 horas a 37°C en condiciones aeróbicas.
Cepa
frotis
0.2 mL
10 mL caldo nutritivo (Tubo 1)
Pipeta
asada picadura asada hisopo
Pasteur
caldo gelosa gelosa gelosa

inclinada semisólida fundida
Figura 2. Práctica 3.1. Técnicas de inoculación de bacterias.
(26)
b) Siembra de actinomicetos o bacterias filamentosas.

1. Sembrar 2 bacterias diferentes por cada equipo.
2. Repetir los incisos 1 y 2.
3. Colocar con una pipeta Pasteur estéril en un extremo de la placa de YPDM dos gotas del cultivo.
de Streptomyces griseus o Streptomyces erythraeus
4. Esterilizar el asa y estriar el cultivo sobre el medio con la técnica de estría radial.
5. Sellar las cajas, invertirlas e incubar a temperatura ambiente durante 3 a 7 días.
c) Siembra de hongos levaduriformes.

1. Sembrar 2 levaduras diferentes por cada equipo.
2. Inocular con el asa 1 placa de Agar Sabouraud con el cultivo de Rhodotorula sp. o
Saccharomyces sp. mediante la técnica de estría radial.
3. Sellar las cajas, invertirlas e incubar a temperatura ambiente durante 2 a 5 días.
d) Siembra de hongos filamentosos.

1. Sembrar 2 hongos diferentes por cada equipo.
2. Esterilizar el asa micológica y dejar enfriar dentro de la zona aséptica.
3. Tomar una pequeña cantidad del cultivo del hongo seleccionado y sembrar en el centro de la
placa de Agar Sabouraud, para ello presionar ligeramente el asa sobre la placa.
4. Sellar las cajas e invertirlas.
5. Incubar a 28°C durante 7 días.
• Al etiquetar tu material, tener cuidado de que las anotaciones queden en la periferia de la tapa
de la caja Petri o a 2 cm de la boca del tubo de ensayo.
1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los laboratorios.

2. Después de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una solución sanitizante
durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y conservarlos en un frasco con alcohol al
95%.
3. En el caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel, esterilizar el
paquete en autoclave y después desecharlos en el contenedor de vidrio roto.
4. Los cultivos de referencia y los cultivados en clase deben ser esterilizados en autoclave antes de
ser desechados.
1. ¿Por qué las bacterias filamentosas se siembran de diferente forma que las bacterias no
filamentosas?
2. ¿Por qué los hongos levaduriformes se siembran de igual forma que las bacterias?
3. ¿Por qué los hongos filamentosos se siembran por picadura?
4. ¿Qué pasaría si sembraras un hongo filamentoso por agotamiento por estría recta?
(27)

a) Resultados del desarrollo de bacterias
Materiales

Microscopio

Mecheros
Asas
Gradillas
Portaobjetos
Piseta
Papel seda
Metodología
1. Describir las características de desarrollo en los tubos (medio líquido, semisólido y sólido) y
en las cajas de acuerdo con las guías de observación del Manual de Microbiología General.
2. A partir del cultivo líquido y de dos colonias aisladas preparar 3 frotes y teñir con Gram.
3. Registrar sus resultados en el cuadro 4.
1. Ver incisos 1 a 4 de la 1ª Sesión (PRÁCTICA 3.1).

2. Después de observar las características de desarrollo microbiano, esterilizar los cultivos en
autoclave.
3. Antes de esterilizar los tubos de ensayo retira las etiquetas (plumón, etiqueta o maskin-tape).
4. Vaciar el agar fundido en una bolsa de plástico y depositarla en el contenedor correspondiente.
5. Sujetar con maskin- tape las cajas de plástico con cultivos y depositarlas en el contendor rojo del
laboratorio 1 A.
6. Las cajas de Petri de vidrio se colocan de forma no invertida (tapa arriba y base abajo) en latas
metálicas para su posterior esterilización.
(28)
Cuadro 4. Características microscópicas y de crecimiento en medios líquidos, semisólidos y sólidos,

inoculados mediante diferentes técnicas.
Nombre científico de la bacteria:
Presentación del medio de Características de desarrollo Resultados

cultivo y técnica de siembra
Superficial (pelicular o anillado)
Caldo inoculado con asa Sedimento
Turbiedad
Picadura en medio semisólido Características de crecimiento
Movilidad (+ o -)
Superficial
Agar vertical inoculado con pipeta En todo el medio
En el fondo
Formación de burbujas
Forma del crecimiento: (filiforme, perlado o
arborescente)
Agar inclinado Color
Textura (acuosa, butirosa, cremosa,
membranosa, viscosa)
Consistencia (seca, húmeda)
Desarrollo a lo largo del estriado
Presencia de colonias aisladas
Características de las colonias:
Forma (puntiforme, circular, ameboide,
Placa cuadrante simple rizoide, fusiforme)
Color (blanquecino, blanco opaco, amarillo
etc)
Borde (entero, ondulado, lobulado,
crenado, filamentoso)
Elevación (plana, elevada, convexa,
rugosa, papilar, embonada)
Características de las colonias:

Placa estría radial Forma (puntiforme, circular, ameboide,
rizoide, fusiforme)
Color (blanquecino, blanco opaco, amarillo
etc)
Borde (entero, ondulado, lobulado,
crenado, filamentoso)
Elevación (plana, elevada, convexa,
rugosa, papilar, embonada)
Placa por extensión Desarrollo masivo o confluente
Color
Características microscópicas Forma
Agrupación
Gram
(29)

b, c, d) Resultados del desarrollo de bacterias filamentosas y hongos (levaduriformes y filamentosos).
Materiales

Microscopio
Asa micológica
Colorante para tinción de Gram
Frascos gotero con lactofenol azul de algodón, azul de metileno

Mecheros
Asas
Portaobjetos
Piseta
Papel seda
Diurex
Metodología
b) Bacterias filamentosas.
1. Revisar y registrar las características coloniales del desarrollo bacteriano en el cuadro 5.
2. Seleccionar una colonia aislada de cada una de las cepas en estudio, y a partir de ellas:
3. Realizar un frote y una tinción de Gram.
4. Comparar la morfología colonial y microscópica de las bacterias estudiadas registradas en la
1ª Sesión y en la Sesión actual.
c) Hongos levaduriformes.
1. Revisar y registrar las características coloniales del desarrollo microbiano en el cuadro 6.
2. Realizar un frote y una tinción simple de cada una de las cepas en estudio.
3. Comparar la morfología colonial y microscópica con las características de las bacterias.
La descripción de las colonias debe hacerse de acuerdo con las características indicadas en el
Manual de Microbiología General (2006).
d) Hongos filamentosos.
1. Revisar y registrar las características coloniales (cuadro 7).
2. Mediante la técnica de impronta con diurex, hacer una preparación en fresco y teñir, para ello:
• Cortar un pedazo de diurex de aproximadamente 1.5 cm;
(30)
• Colocar una gota de lactofenol azul de algodón en un portaobjetos limpio y

desengrasado;
• Esterilizar el asa micológica y dejar enfriar;
• Pegar el diurex en el extremo del asa y con el lado de goma hacia abajo presionar el
diurex sobre el cultivo de hongo cuidando de no frotar (Figura 3);
• Con ayuda del asa bacteriológica depositar el diurex (con la muestra hacia el
colorante) en el portaobjetos (Figura 4);
• Colocar un cubreobjetos (Figura 5) y observar al microscopio con los objetivos 10x y
40x
3. Registrar los resultados en el cuadro 7, para ello describir las características de los hongos
con ayuda de los esquemas del Manual de Microbiología General (2006).
Figura 3. Toma de muestra Figura 4. Colocación del diurex Figura 5. Muestra lista para
por impronta. en el portaobjetos. observar al microscopio.
• Evita que el diurex tenga rayas, dobleces o huellas dactilares antes de para realizar la
impronta.

2. Después de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una solución
sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un frasco
con alcohol al 95%.
4. Los cultivos muestra deben ser esterilizados en autoclave, antes de ser desechados.
5. Después de observar las características de desarrollo, esterilizar los cultivos en autoclave.
6. Vaciar el agar en una bolsa de plástico y depositarla en el contenedor correspondiente.
7. Sujetar con masking tape las cajas de plástico con cultivos y depositarlas en el contendor
rojo del laboratorio 1A.
(31)
Cuadro 5. Características coloniales y microscópicas del desarrollo de bacterias filamentosas.

Nombre científico de la bacteria:
Características Características de desarrollo Resultados

Forma
Color
Coloniales Elevación
Textura
Aspecto (seco, húmedo)
Forma
Microscópicas Otras estructuras
Gram
Cuadro 6. Características coloniales y microscópicas del desarrollo de un hongo levaduriforme.

Nombre científico de la levadura:

Color
Coloniales Aspecto superficial (liso, rugoso,
cerebriforme)
Consistencia (cremosa, seca)
Forma
Microscópicas Tamaño relativo con respecto a
las bacterias
Presencia y distribución de
blastosporas
Cuadro 7. Características coloniales y microscópicas del desarrollo de un hongo filamentoso.

Nombre científico del hongo filamentoso:

Desarrollo (escaso, medio,
abundante)
Color
Aspecto del micelio superficial
Coloniales (algodonoso laxo, lanoso,
aterciopelado)
Color del micelio profundo
Aspecto del micelio profundo
(homogéneo, con anillos
concéntricos, sectorial
Color
Tipo de hifas (cenocítica,
septada)
Microscópicas Tipo de cuerpo fructífero
(esporangióforo, conidióforo)
De las esporas:
Morfología (esférica, oval,
reniforme, fusiforme)
Color
Aspecto externo (lisas,
punteadas, estriadas, verrugosas)
(32)
1. Compara las características microscópicas y macroscópicas de cada uno de los grupos

microbianos.
2. ¿Encuentras alguna similitud entre ellos?
3. ¿Resulta fácil distinguir las estructuras microscópicas que conforman a un hongo
filamentoso?
4. Los tiempos de incubación que requieren los diferentes cultivos microbianos son iguales?
¿Por qué?
• Vullo, D., M. Wachsman, L. Alche. 2000. Microbiología en Práctica. Manual de laboratorio
para la enseñanza de Microbiología básica y aplicada. 1ª edición. Atlante S. R. L. Argentina
(33)
UNIDAD V. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
PRÁCTICA 5.1 Aislamiento de Microorganismos (1ª Sesión)

Objetivos

• Explicar el fundamento de diferentes medios de cultivo y condiciones de incubación para el
aislamiento de microorganismos con características específicas.
• Aplicar diferentes técnicas para el aislamiento de microorganismos.
• Comparar con cepas de referencia la eficiencia de las técnicas de siembra, medios de cultivo y
condiciones de incubación empleadas para el aislamiento de microorganismos.
• Obtener y comprobar la pureza de los cultivos aislados.
• Aplicar una técnica de conservación de corto o mediano plazo a los cultivos puros obtenidos.
Introducción
En todos los ambientes naturales habitan múltiples microorganismos de diversos tipos y actividad
fisiológica. Para efectuar el estudio de un organismo particular es necesario separarlo de la población
mixta en la que se encuentra. Para tal fin se emplean técnicas de aislamiento que conduzcan a la
obtención de un cultivo puro.
De manera general los métodos de aislamiento incluyen:
1. Separación física de los microorganismos mediante:
a) Diluciones seriadas y siembra por vertido en placa.
b) Siembra por agotamiento.
2. Utilización de medios de cultivo selectivos y diferenciales.
3. Aprovechamiento de características particulares de los microorganismos, tales como la
formación de esporas, el metabolismo anaerobio y/ o facultativo, la capacidad para utilizar
sustratos poco comunes, etc.
Para facilitar el proceso de aislamiento y obtener mejores resultados, frecuentemente se emplean
combinaciones de las técnicas anteriores.
Materiales

Bacillus sp.
Citrobacter freundii
Enterobacter sp.
Escherichia coli
Micrococcus luteus
Proteus vulgaris
Serratia marcescens
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus sp.
(34)
Muestras
Lodo o suelo o verdura fresca o fibra dietética o columna de Winogradsky
Material por grupo:

Baño María a 50ºC
Incubadora a 28 y 37°C
Tubo con solución de estreptomicina (3000 µg/ mL) estéril.

Balanza granataria
Espátula o cuchara de acero inoxidable
Tripie
Vaso de precipitados de 250 mL
Matraz Erlenmeyer (250 mL) con 90 mL de solución salina isotónica estéril (SSI) o solución
amortiguadora de fosfatos 0.1 M pH 7.2
Varilla de vidrio en “L”
Tubos de ensayo de 22x175 con 15 mL de los siguientes medios:
Medio general (gelosa nutritiva, TSA o BHI)
Eosina azul de metileno (EMB)
Manitol sal agar (MSA)
YPMD
Sabouraud Rosa de Bengala (SRB)
Tubos de ensayo de 16x150 con 9.0 mL de SSI estéril
Cajas de Petri con 15 mL de los siguientes medios: TSA o BHI, EMB, MSA, YPDM y TSA+MnSO4.

Mecheros
Asas
Gradilla
Cajas de Petri de plástico estériles desechables
Metodología
1. Rotular todo el material indicando dilución, o técnica de siembra, medio de cultivo (Figura 6).
a) Dilución de la muestra.
1. Pesar 10 g o medir 10 mL de la muestra y en condiciones asépticas vaciar en un matraz
Erlenmeyer con 90 mL de SSI estéril.
2. Homogeneizar y a partir de esta suspensión preparar 2 diluciones decimales mas (10-2 y 10-3),
para ello emplear dos tubos con 9 mL de SSI estéril c/u.
b) Siembra por vertido en placa en medios selectivos y diferenciales.

1. Fundir los medios contenidos en los tubos de ensayo de 22x175 y mantenerlos a 45ºC.
2. A partir de la última dilución y con una pipeta estéril transferir 0.1 mL a 5 cajas de Petri.
3. Colocar la pipeta después de su uso en un pipetero que contenga una solución sanitizante.
4. Agregar a cada caja, uno de los siguientes medios de cultivo: TSA, EMB, MSA, YPMD, SRB.
(35)
Dilución 10-1
(90 mL SSI) Muestra
1.0 mL 1.0 mL
9 mL SSI 9 mL SSI Agar Sabourad

+ rosa de
bengala +
estreptomicina
Dilución Dilución
Fundido
10-2 10-3
agotamiento
vertido en
placa
TSA
Calentar a
ebullición por Aerobiosis
Agar
10 min
MSA
TSA +
MnSO4
agotamiento Agar
EMB
Anaerobiosis
TSA + Agar
MnSO4 YPDM
Fgura 6. Práctica 5.1. Técnicas de aislamiento de microorganismos.
(36)
Nota: Agregar al medio fundido de SRB la estreptomicina estéril a una concentración de

3000 µg/ mL (0.15 mL/ 15 mL del medio para una concentración final 30 µg/ mL).
5. Mezclar suavemente el inóculo con el medio. Para ello colocar la caja sobre la mesa y girar 5
veces en el sentido de las manecillas del reloj, 5 veces en sentido inverso, 5 veces hacía
delante y atrás y 5 en sentido horizontal.
6. Dejar solidificar.
7. Asegurar cada una de las cajas con maskin-tape.
8. Incubar de acuerdo a las indicaciones del cuadro 8.
c) Siembra por agotamiento en medios selectivos y diferenciales.

1. A partir de la última dilución y con el asa bacteriológica sembrar por la técnica de cuadrante
radial cada una de las siguientes placas: TSA, EMB, MSA, YPMD.
2. Repite la siembra en los diferentes medios de cultivo utilizando cepas de referencia.
3. Asegurar cada una de las cajas con maskin-tape.
4. Incubar de acuerdo a las indicaciones del cuadro 8.
d) Aislamiento de bacilos esporulados.

1. Colocar el tubo con la segunda dilución en un baño de agua a ebullición y mantenerlo durante
10 minutos.
2. A partir del tubo anterior, con el asa bacteriológica sembrar por cuadrante radial 2 placas de
TSA con sulfato de manganeso.
3. Asegurar cada una de las cajas con maskin-tape e incubar en las condiciones que se indican
en el cuadro 8.
Cuadro 8. Condiciones de incubación para el desarrollo de microorganismos.

Medio de cultivo Temperatura (° C) Tiempo
TSA
EMB
MSA 37 24 h
TSA+MnSO4
YPMD
SRB 28 3 a 5 días
TSA+MnSO4
• Las estrías hechas para la siembra por agotamiento deben ser cerradas y trazadas
rápidamente.
• Etiqueta perfectamente tu material a sembrar.
1. Esterilizar el matraz y tubos en los que preparó las diluciones y posteriormente lavarlos.
2. Escurrir el exceso de sanitizante de las pipetas, envolverlas, esterilizarlas y lavarlas.
(37)
a) Aislamiento de la bacteria problema
Materiales

Microscopio
Reactivos para tinción de Gram

Mecheros
Portaobjetos
Piseta
Puente de vidrio
Material para profesores:

Placas con TSA, EMB, MSA, TSA+MnSO4.
Metodología
a) Comparación de la diversidad de las colonias desarrolladas en los diferentes medios de cultivo y

condiciones de incubación.
En las placas con TSA, EMB, MSA, SRB y TSA+MnSO4 proceda a:
1. Comparar la abundancia, separación y diversidad de las colonias desarrolladas en las cajas
sembradas por placa vertida y por agotamiento.
2. Seleccionar de cada medio de cultivo aquélla placa que presente mayor número de colonias
diferentes y separadas.
3. Registrar los resultados en el cuadro 9.
4. Seleccionar de cada placa 2 colonias diferentes.
5. Identificar con una clave las colonias seleccionadas y de cada una hacer una tinción de Gram
(tener cuidado de no arrastrar toda la colonia) y efectúe la observación microscópica.
7. Registra, en un cuadro, las características coloniales del desarrollo de las cepas de referencia
en los diferentes medios de cultivo.
b) Aislamiento primario.
1. Identifique las colonias en las que observó un solo tipo de morfología y Gram.
3. Con base en sus resultados y las instrucciones del profesor proceda a aislar:
• Una bacteria Gram negativa o
• un coco Gram positivo o
• un bacilo esporulado (realizar la confirmación de esporulación después de incubar un mínimo
de 5 días)
4. A partir de la colonia seleccionada inocular por agotamiento una placa que contenga el medio
de procedencia (1ª resiembra).
(38)
5. Incubar 24 horas a una temperatura que debe ser acorde con la procedencia de la colonia.
6. Guardar en refrigeración las cajas a partir de las cuales realizo el aislamiento.
Cuadro 9. Abundancia y diversidad (número y tipo) de colonias desarrolladas en placas

sembradas por diferentes técnicas de aislamiento.
Medios de cultivo / Técnica de Placa vertida Agotamiento
siembra
Número Número de Presencia de Número de
aproximado colonias colonias colonias
de colonias diferentes aisladas diferentes
TSA
EMB
MSA
YPDA
SRB ND ND
TSA+MnSO4 (28º C) ND ND
TSA+MnSO4 (37º C) ND ND
ND=no determinado
• Marca y rotula perfectamente las colonias seleccionadas para realizar el aislamiento primario.
• Guarda en refrigeración las placas de las cuales se seleccionó la colonia para el aislamiento
primario.

2. Después de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una solución sanitizante
durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un frasco con alcohol al
95%.
5. Sellar con maskin-tape las cajas de Petri no seleccionadas y colocarlas en el contenedor ubicado
en el laboratorio 1A.
1. ¿En qué medio de cultivo se presentó el mayor número y diversidad de colonias microbianas?
¿A qué lo atribuyes?
2. ¿La metodología a seguir para el aislamiento de bacterias esporuladas es efectiva? ¿Por
qué?
3. ¿Qué otra técnica conoces para aislar bacterias esporuladas?
(39)

a) Continuación del aislamiento de la bacteria problema (2ª resiembra)
b) Resultados. Crecimiento de actinomicetos y hongos.
Materiales

Microscopio
Asas micológicas
Tripie
Charola de metal
Frasco gotero con verde malaquita (5%), safranina (0.5%) y lactofenol azul de algodón
Placas de TSA
Incubadoras a 28 y 37°C

Mecheros
Portaobjetos
Cubreobjetos
Pinzas largas de punta roma
Piseta
Metodología
a) Continuación del aislamiento de la bacteria problema.
1. Seleccionar tres colonias que estén separadas e identificarlas con una clave en el reverso de
la caja.
2. A partir de cada colonia realizar un frotis y teñir con Gram para verficar la pureza
3. En el caso de las colonias aisladas a partir de TSA+MnSO4 hacer un frote y tinción de
esporas, para ello:
a) Cubrir la preparación con un papel filtro y saturarlo con verde de malaquita al 5 %,
calentar la preparación sobre un vaso de precipitado con emisión de vapores de agua.
Dejar actuar el colorante durante 10 minutos, procurando que no se seque la
preparación.
b) Retirar el papel filtro (con unas pinzas largas), lavar la preparación con agua abundante
(hasta que el efluente no salga verde)
c) Teñir con el colorante de contraste (safranina 0.5%) durante 2 minutos.
d) Lavar abundantemente con agua.
4. Registrar en el cuadro 10 las características de las colonias desarrolladas.
5. A partir de las observaciones, seleccionar una colonia que microscópicamente muestre un
solo tipo de morfología y Gram.
6. Resembrar la colonia por agotamiento en dos placas de TSA e incubar a 37°C durante 24
horas.
(40)
Cuadro 10. Características de colonias seleccionadas para el aislamiento y de las colonias obtenidas
en resiembras subsecuentes.
Medio de Clave de Características Características
cultivo la colonia macroscópicas* microscópicas
(incluir esquema)
Características
iniciales
1ª resiembra
2ª resiembra
3ª resiembra
* Describir las colonias de acuerdo con las características revisadas en la Práctica 3.1, 4.1 Técnicas de
Siembra.
b) Resultados del crecimiento de actinomicetos y hongos.

1. Observar y comparar las características macroscópicas de los microorganismos desarrollados
en YPMD y SRB.
2. Registrar la cantidad de colonias desarrolladas en los dos medios (cuadro 9) y las
características de las colonias (cuadro 11).
3. Seleccionar de cada medio 2 a 3 colonias que se encuentren separadas y sean diferentes.
4. Marcar las colonias con clave al reverso de la caja.
5. Hacer un frote y tinción de Gram a partir de las colonias seleccionadas en YPMD.
6. Observar al microscopio y registrar los resultados en el cuadro 11.
7. Hacer preparaciones húmedas con lactofenol azul de algodón a partir de las colonias
seleccionadas en SRB.
8. Observar al microscopio y registrar los resultados en el cuadro 11.
(41)
Cuadro 11. Resultados del crecimiento de actinomicetos y hongos.

Medio de Colonia Características Características
cultivo macroscópicas* microscópicas
(incluir esquema**)
1
YPMD
2
1
SRB
2
* Describir las colonias de acuerdo con las características revisadas en la Práctica 3.1, 4.1 Técnicas de
Siembra. **Dibuja el campo microscópico con las observaciones microscópicas a color.
• Algunas colonias de bacterias filamentosas son muy secas y duras, para realizar un frote de
éstas frota suavemente la colonia y resuspende en una pequeña gota de agua en el
portaobjetos.

con alcohol al 95%.
4. Sellar con maskin tape las cajas de Petri que contengan los cultivos de actinomicetos y
hongos y colocar en el contenedor ubicado en el laboratorio 1A
1. ¿La cantidad de colonias bacterianas es mayor o menor a la de colonias de hongos

filamentosos? ¿A qué lo atribuyes?
2. ¿Qué criterios seguiste para seleccionar la colonia para realizar el aislamiento primario?
3. ¿Cuáles han sido las dificultades a las que te has enfrentado para purificar tu cultivo
microbiano?
(42)
a) Continuación del aislamiento de la bacteria problema
Materiales

Microscopio
Tubos de ensayo de 13x100 con TSA inclinado

Mecheros
Asas
Portaobjetos
Charola para tición
Piseta
Material para profesores:

Placas con TSA
Metodología
a) Continuación del aislamiento de la bacteria problema.

1. Seleccionar tres colonias que estén separadas e identificarlas con una clave en el reverso de
la caja.
2. A partir de cada colonia realice un frotis y teñir con Gram para verficar la pureza.
3. Observar las características coloniales y microscópicas y registrar en el cuadro 10.
4. En el caso de observar cultivos mixtos repetir la resiembra en 2 placas de TSA, incubar y
repetir los incisos 1 a 3.
b) Conservación del cultivo puro.

1. Una vez confirmada la pureza de las colonias, proceda a resembrar en dos tubos de
ensaye de 13x100 con TSA inclinado (estría ondulada), debidamente etiquetados e
incubar a 35°C durante 24 horas.
2. Al término de la incubación sellar con papel ParafilmMR y guardar en refrigeración.
• Para asegurar la obtención de la pureza de tu cultivo, procura en cada resiembra la obtención

de colonias aisladas, realizar buenas tinciones y observaciones microscópicas, y respetar los
tiempos de incubación de acuerdo al tipo de microorganismo a aislar.
(43)

con alcohol al 95%.
3. En caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel, esterilizar el
1. Comparar la eficiencia de técnicas de separación empleadas.

2. Con base en sus observaciones microscópicas, la abundancia y la diversidad de las
colonias desarrolladas, discutir si se comprobó la función de los medios selectivos y
diferenciales.
3. Comparar las principales diferencias de crecimiento de bacterias no filamentosas,
bacterias filamentosas (actinomicetos) y hongos, y su relación con la técnica de siembra y
medio selectivo empleados para su aislamiento.
4. Analizar la diversidad microbiana en la muestra estudiada.
Literatura recomendada
(44)
UNIDAD VI. NUTRICIÓN MICROBIANA Y CARACTERIZACIÓN

FISIOLÓGICA DE BACTERIAS
PRÁCTICA 6.1 Nutrición Microbiana y Requerimientos de Oxígeno

(1ª Sesión)
Objetivos

• Establecer los requerimientos nutricionales y de oxígeno de una bacteria aislada y
compararlos con una bacteria de referencia.
Introducción
El grupo bacteriano es, desde el punto de vista estructural, el más simple (procariotes) de los
microorganismos; no obstante, fisiológicamente es el más complejo. Las bacterias obtienen su
energía a través de la luz solar (fotosintéticas), o por la oxidación de compuestos químicos
inorgánicos (quimiolitotrofas) u orgánicos (quimiorganótroficas); su fuente de carbono a partir del CO2
(autótrofas) o de compuestos orgánicos (heterótrofas). Así mismo, su fuente de nitrógeno la obtienen
a partir de aminoácidos o nitrógeno inorgánico en diferentes estados de oxidación incluyendo el
nitrógeno molecular. La capacidad de reducir el dinitrógeno atmosférico es exclusiva de algunos
microorganismos procariotes (fijadores de nitrógeno).
En general los requerimientos nutricionales y diversidad metabólica de cada grupo bacteriano están
íntimamente relacionados con el ambiente natural en que se desarrollan.
Materiales
Muestras
Columna de Winogradsky (zona aerobia, microaerofílica o anaerobia)

Cepa problema (cultivo puro aislado en la PRÁCTICA 5.1)
Cepas de referencia para nutrición:
Enterobacter sp.
Escherichia coli
Proteus sp.
Serratia marcescens
Bacillus sp.
Micrococcus luteus
Streptococcus sp.
Cepas de referencia para requerimientos de oxígeno:
Clostridium
Escherichia coli
Micrococcus luteus
(45)
Material por grupo

Baño María a 50ºC
Incubadora a 37°C

Pipeta automática (100 µL)
Tubos de ensaye de16x150 con los siguientes medios de cultivo:
2 con 9 mL de solución salina isotónica (SSI) estéril
2 con medio mineral sin carbono
2 con medio mineral con glucosa
2 con medio mineral con sacarosa
2 con medio mineral con celulosa
2 con el medio Ashbey’s libre de nitrógeno
2 con el medio Ashbey’s con amonio
2 con el medio Ashbey’s con nitratos
2 con el medio Ashbey’s con albúmina
2 con el medio Ashbey’s con peptona
2 con Gelosa o TSA
2 tubos con tioglicolato
Pipetas Pasteur (esterilizar para la siguiente clase)

Cultivo de 24 horas de la bacteria aislada (bacteria problema)
Mecheros
Asas
Gradillas
Puntas para micropipeta estériles (100 µL)
Pipetero
Metodología
a) Siembra de microorganismos en diferentes medios de cultivo variando las fuentes de carbono y

nitrógeno .
1. Rotular el material.
2. Con el cultivo de 24 horas de la cepa (problema o de referencia) o de la Columna de
Winogradsky, proceder a inocular un tubo con SSI estéril (pipeta Pasteur o asa bacteriológica)
hasta obtener una suspensión ligeramente turbia.
3. Organizar el material de modo que cada alumno cuente con una serie de tubos con los
siguientes medios de cultivo
1 con medio mineral sin carbono
1 con medio mineral con glucosa
1 con medio mineral con sacarosa
1 con medio mineral con celulosa
1 con el medio Ashbey’s libre de nitrógeno
1 con el medio Ashbey’s con amonio
1 con el medio Ashbey’s con nitratos
1 con el medio Ashbey’s con albúmina
1 con el medio Ashbey’s con peptona
4. Inocular la serie de tubos con los diferentes medios, mediante la adición de 2 gotas (100μ L)
de la suspensión bacteriana a cada uno de ellos (Figura 7).
(46)
5. Repetir el procedimiento con la 2ª serie, la que se inoculará con una de las bacterias de
referencia.
6. Incubar a 37° C y revisar a las 48 horas y a los 7 días.
ó
1 .0 m L S u s p e n s ió n
( 9 m L S S I)
zo n a a si g n a d a
Cepa
( pr o b le ma o C o lu m na d e
re fe r e n c ia W in o g r a d s ky 1 0 0 µ L ( 2 g o ta s )
l l l l
ra o ra ra ra ’s ’s ’s ’s ’s G e lo s a C a ld o
e n e a
s e sa e n
ó
y
e
o
n y
e
y
e s
y
e a y
e a
n
i o n
i n
i o
r n
i b b o
i b b in b n fun di d a ti og li co la to
b o id h
e
g h n h o
t h
m ra m c
lu
m a
c m lm s ró s o s a
rit
h
s m
ú s to
p
io c io g io a io a A it A m A A b
l A e
d in d + d s d + o
i n o
i a o
i n o
i a o
i p
e s e e + e d n d + d + d d +
M M M M e is e e e + e
M M M M M
1 0 0 µ L ( 2 g o ta s )
C e p a d e re f e re nc i a
e n c a ld o
Figura 7. Práctica 6.1. Nutrición microbiana y requerimientos de oxígeno.
b) Siembra para observar requerimientos de oxígeno.

b1) En medio sólido.
1. Fundir la gelosa.
2. Cuando el medio tenga una temperatura aproximada de 45ºC inocular un tubo con 2 gotas
(100μ L) de la suspensión de la bacteria problema.
3. Homogeneizar el inóculo con el medio y dejar solidificar.
4. Repetir el procedimiento con la bacteria de referencia.
5. Incubar a 37°C durante 48 horas.
Nota: En el caso de inocular la bacteria Clostridium sp. tener cuidado de no agitar el cultivo,
introducir suavemente la pipeta hasta el fondo del tubo, tomar el inóculo y transferirlo
rápidamente y hasta el fondo del segundo tubo.
(47)
b2) En un medio semifluido.

1. En los tubos con caldo tioglicolato, inocular en uno de ellos con 2 gotas (100μ L) de la cepa
problema y en otro con la cepa aislada.
2. Incubar a 37ºC durante 48 horas.
• Etiquetar correctamente el material antes de ser inoculado.

• Evita tocar los diferentes medios de cultivo (mineral y Ashbey’s) con la misma pipeta al ser
inoculados.
• Procurar tener el número de pipetas (1 mL) estériles necesarias para inocular los medios de
cultivo (puedes hacerlo con una sola, procurando cumplir las precauciones antes indicadas).
1. Esterilizar los tubos en los que se preparó la suspensión bacteriana, desechar en tarja y
después lavarlos con agua y jabón.
(48)

(2ª Sesión)
a) Resultados. Determinación de la nutrición microbiana.
Materiales
Material por grupo:

Frascos goteros con el reactivo de Nessler
Frascos goteros con la solución A del reactivo de Griess
Frascos goteros con la solución B del reactivo de Griess
Zinc en polvo

Mecheros
Asas
Gradillas
Portaobjetos
Pipetas Pasteur estériles
Pipetero
*Lavar y esterilizar las pipetas Pasteur para la siguiente clase
Metodología
a1) Determinación de la fuente de carbono.

1. Revisar el crecimiento microbiano después de 48 horas de incubación, en cada uno de los
tubos y registrar los resultados en el cuadro 12.
2. Realizar una tinción de Gram a los tubos con crecimiento microbiano para verificar la
presencia de microorganismos y la pureza del cultivo.
3. Incubar nuevamente a 37ºC durante 5 días más.
a2) Determinación de la fuente de nitrógeno.

1. Con una pipeta estéril transferir dos a tres gotas del medio Ashbey’s libre de nitrógeno a dos
portaobjetos (Colocar la pipeta en un pipetero con solución sanitizante).
a) En uno de los portaobjetos agregar una gota del reactivo de Nessler. El desarrollo de
un color naranja con o sin precipitado indica la presencia de amonio.
b) En el segundo portaobjetos agregar una gota de la solución A del reactivo a de Griess
y una gota de la solución B. La aparición de color rojo indica la presencia de nitritos en
el medio. Si el resultado para nitritos es negativo, agregar una pizca de polvo de zinc.
La aparición de color rojo indica la presencia de nitratos en el medio los cuales por
acción del zinc fueron reducidos a nitritos.
2. Revisar el crecimiento en cada uno de los tubos con el medio Ashbey’s más diferentes fuentes
de nitrógeno.
3. Realizar una tinción de Gram a los tubos con crecimiento para verificar la presencia del
microorganismo sembrado y descartar la presencia de contaminantes.
4. Registrar los resultados en el cuadro 13 e incubar durante otros 5 días.
(49)
b1) Requerimientos de oxígeno.

1. En los tubos con gelosa y caldo tioglicolato revisar el desarrollo de la cepa problema y las de
referencia e indicar si este se presenta en la superficie, a través de todo el medio o en el fondo
del tubo.
3. Comparar el desarrollo de la cepa problema con el de las cepas de referencia y clasificar al
microorganismo de acuerdo con sus requerimientos de oxígeno.
Cuadro 12. Crecimiento bacteriano en medios con diferentes fuentes de carbono.

Medio Cepa problema Nombre científico de cepa de referencia
Mineral ________________________________
48 h 7 días 48 h 7 días
Desarrollo Morfología Desarrollo* Morfología Desarrollo Morfología Desarrollo* Morfología
y Gram y Gram y Gram y Gram
Sin
carbono
con
glucosa
con
sacarosa
con
celulosa
*Indicar: +++ = desarrollo abundante, ++ = desarrollo medio, + = desarrollo escaso, - = sin desarrollo.
Cuadro 13. Crecimiento bacteriano en medio con diferentes fuentes de nitrógeno y detección de
nitrógeno en diferentes estados de óxido reducción.
Medio Cepa problema
de 48 horas 7 días
Ashby Desarrollo* NH4+ NO2 - NO3 - Morfología Desarrollo* NH4+ NO2 - NO3 - Morfología
y Gram y Gram
Sin N
+ NH4+
+ NO3 -
+
albúmina
+
Peptona
Nombre científico de la cepa de referencia:_______________________________________
48 horas 7 días
Desarrollo* NH4+ NO2 - NO3 - Morfología Desarrollo* NH4+ NO2 - NO3 - Morfología
y Gram y Gram
Sin N
+ NH4+
+ NO3 -
+
albúmina
+
Peptona
(50)
Cuadro 14. Resultados de requerimientos de oxígeno.

Bacteria Desarrollo Desarrollo Clasificación**
en gelosa nutritiva* en caldo tioglicolato*
Problema
Clostridium sp.
Escherichia coli
Micrococcus luteus
*Indicar: S = desarrollo en la superficie del medio, M = desarrollo a través de todo el medio, P = desarrollo en la
parte profunda del medio.
**Indicar: Aerobio estricto, Facultativo, Anaerobio estricto.
• Emplea los reactivos de Griess A y B y Nessler sólo en aquellos medios que presenten buen
desarrollo microbiano.

2. Después de usar los portaobjetos sumergirlos en una solución sanitizante durante 10
minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un frasco con alcohol al 95%.
3. Esterilizar el material de vidrio (cajas y tubos) en los que realizó sus lecturas y posteriormente
lavar.
4. Sellar con maskin-tape las cajas de Petri de plástico que contengan cultivos y colocar en el
contenedor ubicado en el laboratorio 1A.
(51)

(3ª Sesión)
a) Resultados. Determinación de la nutrición microbiana.
Materiales
Material por grupo:

Frascos goteros con el reactivo de Nessler
Frascos goteros con la solución A del reactivo de Griess
Frascos goteros con la solución B del reactivo de Griess
Zinc en polvo

Pipetas graduadas de 1.0 mL (esterilizar para la siguiente clase)
Tubo de ensayo de 13x100 con TSA inclinado

Mecheros
Asas
Gradillas
Portaobjetos
Metodología
a1) Determinación de la fuente de carbono.

1. Revisar el crecimiento en cada uno de los tubos con medio mineral y registrar los resultados
en el cuadro 12.
a2) Determinación de la fuente de nitrógeno.

1. Con una pipeta estéril transferir dos a tres gotas del medio Ashbey’s libre de nitrógeno a dos
portaobjetos:
a) En uno de los portaobjetos agregar una gota del reactivo de Nessler. El desarrollo de un color
naranja con o sin precipitado indica la presencia de amonio.
b) En el segundo portaobjetos agregar una gota de la solución A del reactivo a de Griess y una
gota de la solución B. La aparición de color rojo indica la presencia de nitritos en el medio. Si
el resultado para nitritos es negativo, agregar una pizca de polvo de zinc, la aparición de color
rojo indica la presencia de nitratos en el medio los cuales por acción del zinc fueron reducidos
a nitritos.
2. Revisar el crecimiento en cada uno de los tubos con el medio Ashbey’s más diferentes fuentes
de nitrógeno.
(52)
• Evita incubar por más de 10 días los medios de cultivo (mineral y Ashbey’s), ya que podrían
evaporarse.

2. Después de usar los portaobjetos sumergirlos en una solución sanitizante durante 10
minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un frasco con alcohol al 95 %.
3. Esterilizar el material de vidrio (cajas y tubos) en los que realizó sus lecturas y
posteriormente lavar.
1. ¿Lograste clasificar el tipo nutricional al que pertenecen tus microorganismos de prueba?

¿Por qué? ¿Qué elemento emplearon como fuente de energía?
2. De acuerdo al ciclo del N, ¿qué reacciones químicas se evaluaron en cada uno de los medios
Ashbey’s?
3. ¿Lograste identificar cada una de estas reacciones en los medios? ¿Por qué?
• Prescott Lansing M., Harley Jonh P. y Klemm Donald A. 2005. Microbiology. 6a. ed. McGraw
Hill. 992 pp
(53)
PRÁCTICA 6.2 Uso de Pruebas Bioquímicas y Técnicas Rápidas para la

Caracterización Fisiológica de Bacterias (1ª Sesión)
Objetivos

• Caracterizar mediante pruebas bioquímicas una bacteria aislada y compararlos con una
bacteria de referencia
Introducción
Para que una célula viva, crezca y se reproduzca, debe ser capaz de incorporar y transformar
(metabolismo) los compuestos químicos que necesita para obtener energía (catabolismo), así como
las moléculas que pasarán a formar parte de su material celular (anabolismo). Todas las reacciones
químicas que se llevan acabo son catalizadas por enzimas (catalizadores biológicos de naturaleza
proteica y actividad específica), las cuales se clasifican, de acuerdo al lugar del ambiente celular
donde actúan, en exoenzimas y endoenzimas.
Las pruebas bioquímicas se emplean para identificar de forma clara y precisa, la presencia o
ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas, o de una vía metabólica completa en uno o más
microorganismos. Una de las técnicas rápidas más usadas para la identificación de bacterias son las
galerías API de bioMerieuxMR, las cuales permiten identificar levaduras, bacterias entéricas, no
entéricas, especies de Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Campylobacter, y
otras más. En el laboratorio se emplean frecuentemente las galerías API 20E, que es un sistema
estandarizado que permite la identificación de bacterias de la familia Enterobateriaceae y otros
bacilos Gram negativos, no exigentes.
Materiales

Cepas de referencia para la caracterización fisiológica de bacterias:
Enterobacter sp.
Escherichia coli
Proteus sp.
Serratia marcescens
Bacillus sp.
Micrococcus luteus
Streptococcus sp.
Staphylococcus epidermidis
Material por grupo

Matraces Erlenmeyer (250 mL) con 100 mL de aceite mineral estéril
Incubadora a 37°C
(54)

Galerias API 20E (bioMérieuxMR) para la caracterización fisiológica rápida de enterobacterias.
Placas de Petri con los siguientes medios de cultivo:
1 con Gelosa nutritiva
1 con Agar sangre
1 con Agar almidón
1 con Agar DNA
1 con Agar leche descremada
Tubos de ensayo de 13x100 con los siguientes medios de cultivo:
2 con 10 mL de solución salina isotónica (SSI) estéril
2 con 3.5 mL de Agar Citrato de Simmons inclinado
2 con 3 mL de Caldo nitrato con campana de Durham
2 con 3 mL de Caldo rojo de fenol más sacarosa con campana de Durham
2 con 3 mL de Caldo rojo de fenol mas manitol con campana de Durham
2 con 2 mL de caldo urea
4 con Rojo de Metilo / Voges Proskawer (RM/VP)
2 con 3.5 mL de Agar Kliger inclinado
2 con 3.5 mL de Gelatina nutritiva
2 con 2 mL del SIM
2 con 2.5 mL de MIO y/o LIA
4 con 2 mL de Hugh & Leifson + glucosa

Cepa problema (cultivo puro aislado en la PRÁCTICA 5.1) con 24 horas de incubación previa
Mecheros
Asas
Gradillas
Piseta
Pipetas de 1.0 mL estériles
c) Siembra para caracterización fisiológica de bacterias.

1. Marcar las cajas por la parte inferior dividiéndolas en dos sectores.
2. Organizar los tubos de modo que cada alumno cuente con una serie de tubos con los medios
de cultivo antes indicados (ver Figura 8).
3. Etiquetar las cajas y los tubos con SSI estéril y los medios de cultivo y el nombre de la bacteria
a inocular (un integrante del equipo inoculará la bacteria problema y el otro una de las cepas
de referencia).
4. Con el cultivo de 24 horas de la bacteria problema (o cepa de referencia), proceder a inocular
un tubo con SSI estéril hasta obtener una Suspensión de bacterias ligeramente turbia.
5. A partir de la Suspensión anterior proceder a inocular los medios de cultivo en el orden que
se indica a continuación:
a) Por estría recta los tubos que contienen citrato de Simmons.
b) Mediante estría recta uno de los sectores de cada una de las 5 placas de Petri.
c) Mediante asada los tubos que contienen caldo nitrato, Rojo de fenol+sacarosa, Rojo de
fenol+manitol, caldo urea, y los dos con RM/VP.
d) Por estría recta y picadura el tubo que contiene Agar Kliger.
e) Por picadura los tubos que contienen los medios de gelatina nutritiva, SIM, MIO y los
dos con Hugh & Leifson; agregar a uno de estos últimos aceite mineral estéril.
(55)
6. Repetir el procedimiento con la segunda serie, la que se inoculará con una de las bacterias de
referencia.
7. Incubar a 37°C y revisar a las 24 horas. Si hay desarrollo abundante guardar los medios de
cultivo en refrigeración, y si el desarrollo es escaso incubar 24 horas más.
Cepa problema
o de ref erencia
S uspensión
(S SI)
P ic adura y
E stría recta A sada Picadura
est rí a recta
Citrato de Gelatina
Caldo nitratos Agar Kliger
Simmons nutritiva
Gelosa
nutr itiva Rojo de fenol +
sacar osa SIM
Agar
almidón
Rojo de fenol +
MIO / LIA
manitol
Agar leche
descremada
Agar Caldo Ur ea Hugh & Leifson

sangr e
A gregar ac ei te
mi neral est éri l
Agar
Rojo de Metilo /
DNA
Voges
Proskawer
Figura 8. Práctica 6.2. Pruebas bioquímicas para la caracterización fisiológica de bacterias.
(56)
d) Siembra de galerías API (20E) para caracterización fisiológica rápida de enterobacterias.

1. Etiquetar las galerías API en la lengüeta lateral pestaña de la cámara de incubación.
2. Llenar con agua destilada o desmineralizada, los alveolos del fondo de la cámara de
incubación.
3. Colocar la galería API dentro de la cámara de incubación.
4. A partir del tubo Suspensión, proceder a inocular las galerías de izquierda a derecha.
Introducir el inóculo en los pozos de la galería con ayuda de una pipeta Pasteur estéril (para
evitar la formación de burbujas en el fondo de los pozos, colocar la punta de la pipeta sobre la
pared de la cúpula, inclinando ligeramente la cámara de incubación hacia delante) (ver Figura
9). Tener cuidado de no mezclar el contenido de cada pozo una vez hidratado el medio de
cultivo.
5. Para las pruebas CIT, VP y GEL, llenar el pozo y la cúpula. Para las otras pruebas, llenar
únicamente los pozos (no las cúpulas). Para las pruebas ADH, LDC, ODC, H2S y URE crear
una atmósfera anaerobia llenando la cúpula con aceite mineral estéril.
6. Inocular dos galerías por equipo, una con el tubo de la Suspensión de la bacteria problema y
la otra con la cepa de referencia.
7. Cerrar la cámara de incubación e incubar a 37°C, durante 18 a 24 horas y realizar la lectura.
cúpula
pozo
Figura 9. Galerias API 20E (bioMérieuxMR) para la caracterización

fisiológica rápida de enterobacterias.
• Evitar tocar los medios de cultivo con la pipeta al ser inoculados.

• Respeta los tiempos de incubación para la prueba con galerías API.
1. Esterilizar los tubos empleados para la preparación de la suspensión bacteriana, desechar en

tarja y posteriormente lavar con agua y jabón.
2. Las galerías API se aseguran con maskin-tape y se desechan colocándolas en el contenedor
rojo del laboratorio 1A.
(57)
PRÁCTICA 6.2 Uso de Pruebas Bioquímicas y Técnicas Rápidas para la

Caracterización Fisiológica de Bacterias (2ª Sesión)
c, d) Lectura e interpretación de resultados. Caracterización fisiológica de bacterias.
Materiales
Material por mesa:

Hielo
Frascos gotero con:
Lugol
HCl 1.0 N
Reactivo de TPD (preparar con alcohol isoamílico)
Peróxido de hidrógeno al 3%
Rojo de metilo
Hidróxido de potasio al 40%
α-Naftol
Solución A del reactivo de Griess
Solución B del reactivo de Griess
Zinc en polvo
Reactivo de Erlich

Mecheros
Gradillas
Papel filtro (cuadros de 2x2cm)
Portaobjetos
Palillos de madera
Metodología
c) Caracterización fisiológica de bacterias.

1. Hemólisis. En las placas de agar sangre indique si la hemólisis fue parcial (α) o total (β).
2. Hidrólisis del almidón. En la placa de agar almidón agregue lugol alrededor de la estría de
desarrollo; la aparición de color azul revela la presencia de almidón, en tanto que una
coloración rojiza o parda indica la degradación del almidón y se considera la prueba positiva.
3. Hidrólisis de la caseína. En la placa de agar leche descremada observe si alrededor de las
colonias hay un halo transparente. La desaparición del color blanco de la leche indica que la
prueba es positiva.
4. Licuefacción de la gelatina. Colocar los tubos con gelatina nutritiva en hielo y observe si estos
permanecen líquidos o se solidifican. El primer caso indica la hidrólisis de la gelatina y se
considera la prueba positiva.
5. DNA-asa. En la placa de agar DNA adicione unas gotas de HCl (1.0 N) alrededor de la estría
de desarrollo. Observe el contraste de color que se presenta alrededor del desarrollo con el
resto de la placa. El ADN precipita con el HCl, por lo que la formación de un halo incoloro
alrededor de las colonias indica que la prueba es positiva.
6. Oxidasa. Realice lo siguiente:
a) Colocar en un portaobjetos un trozo de papel filtro.
(58)
b) En condiciones asépticas y con un palillo de madera tomar una muestra del crecimiento
obtenido en la placa de gelosa nutritiva y colocarla sobre el papel.
c) Colocar los palillos en un tubo vacío y taparlo.
d) Agregar unas gotas del reactivo de TPD hasta impregnar totalmente el papel filtro.
e) La aparición de un color morado sobre la muestra durante los primeros segundos se
considera como una prueba positiva.
7. Catalasa. Sobre el crecimiento obtenido en las placas de gelosa nutritiva o agar leche
descremada agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno (3%). La prueba positiva se
manifiesta por la formación de burbujas debido a la descomposición del H2O2
8. Utilización de diferentes fuentes de carbono. En los tubos con caldo rojo de fenol más
sacarosa o manitol, observe el vire del indicador de rojo a amarillo en donde además puede
haber formación de gas, lo anterior indica la utilización de los compuestos empleados.
9. Prueba de oxido/ fermentación y movilidad. En los tubos con Hugh & Leifson más glucosa.
a) Las bacterias que se desarrollan y producen ácido (vire del indicador de verde a amarillo)
en ambos tubos (sin y con aceite mineral) son fermentativas facultativas
b) Las bacterias que se desarrollan y producen ácido en el tubo sin aceite mineral son
oxidativas.
c) Las bacterias que no utilizan el carbohidrato no producen cambio en ninguno de los dos
tubos.
10. Utilización de carbohidratos y producción de ácido sulfhídrico. En Agar Kliger.
a) Pico y fondo alcalinos indican el desarrollo de bacterias incapaces de utilizar glucosa o la
lactosa.
b) Pico y fondo ácidos a las 18 a 24 h (reacción inicial) indican la fermentación de glucosa.
c) Pico alcalino / fondo ácido a las 48 h (reacción tardía). El pico retorna a pH alcalino por la
formación de aminas alcalinas procedentes de la descarboxilación oxidativa de proteínas
cerca de la superficie. También indica fermentación de la glucosa.
d) Pico y fondos ácidos a la 48 h de incubación indican fermentación de la lactosa.
e) Desarrollo de un precipitado negro. Prueba positiva para la producción de ácido sulfhidrico
(ver inciso 19).
11. Utilización de citrato. En agar Citrato de Simmons, la presencia de desarrollo bacteriano y el
vire del indicador a un color azul intenso indica una prueba positiva.
12. Hidrólisis de la urea. En caldo urea, el vire del indicador a rojo o rosa intenso indica una
prueba positiva.
13. Descarboxilación de aminoácidos. En el tubo con el medio MIO el vire del indicador a púrpura
indica la descarboxilación de la ornitina. En este medio se puede observar además la
movilidad de las bacterias, así como la producción de indol (ver incisos 17 y 18)
14. Fermentación ácido mixta. En uno de los tubos con caldo RM/VP incubados durante 72 h;
agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo. La aparición de un color rojo estable en la
superficie del cultivo indica una producción de ácidos suficientes para alcanzar un pH de 4.4
por lo que se considera la prueba positiva.
15. Producción de acetoína como subproducto de una fermentación ácido mixta. En el segundo
tubo con caldo RM/VP incubado durante 24 h añadir 0.6 mL de α-Naftol y 0.2 mL de hidróxido
de potasio (40%). La alteración en el orden de la adición de los reactivos puede originar
resultados falsos. Agitar suavemente el tubo y dejar reposar de 10 a 15 minutos. La aparición
de un color rojo indica una prueba positiva.
16. Reducción de nitratos. En el tubo con caldo nitrato y campana de Durham, observe si se
produjo el desplazamiento del medio de cultivo en la campana lo que indica la producción de
gas. Agregar 4 gotas de la solución A del reactivo de Griess y 4 gotas de la solución B del
reactivo de Griess. El desarrollo de un color rojo indica la presencia de nitritos y que la
bacteria produce la nitratorreductasa lo que corresponde a una prueba positiva. Dado que en
(59)
esta prueba solo se detecta la presencia de nitritos, la ausencia de color indica:

a) Que los nitratos no fueron reducidos (prueba negativa) o
b) Que los nitratos fueron reducidos a productos diferentes a los nitritos, tales como amoníaco
(reducción asimilatoria), óxido nítrico, óxido nitroso o nitrógeno molecular (desnitrificación o
reducción desasimilatoria).
Para establecer a cual de las opciones anteriores corresponde el resultado, añadir una pequeña
cantidad de zinc para reducir los nitratos presentes en el medio original a nitritos. El desarrollo de un
color rojo indica la presencia de nitratos residuales, confirmándose la prueba negativa. En tanto que
la ausencia de color indica una prueba positiva.
17. Prueba Movilidad: En los tubos con medio de SIM y MIO observe el crecimiento a lo largo de
la picadura. La movilidad de los microorganismos se manifiesta por su migración desde la
línea de siembra y su difusión en el medio lo que produce turbidez. Pueden mostrar estrías de
crecimiento velloso (+). Cuando el crecimiento bacteriano se acentúa a lo largo de la línea de
siembra y el medio que lo rodea permanece claro la prueba es negativa.
18. Prueba del Indol. Agregar unas gotas de Reactivo de Erlich o Kovac en la superficie de los
medios SIM y MIO. La aparición de un anillo color rosa indica la formación de compuestos
indólicos.
19. Prueba del ácido sulfhídrico. Observar la presencia de un precipitado negro en los tubos de los
medios SIM y Kliger que indica la formación del ácido sulfhídrico. Compare los resultados
obtenidos con la cepa problema y los obtenidos por el grupo con las diferentes cepas de
referencia, con base en lo anterior, proceda a establecer similitudes e identificar a cual
pertenece la cepa aislada.
20. Registrar en el cuadro 15 las características metabólicas reportadas para la bacteria con la
que encontró similitud.
21. Investigar las características metabólicas de la cepa de referencia con la que trabajo, con base
en esta información proceder a comparar lo reportado en la bibliografía con los resultados
obtenidos.
d) Siembra de galerías API (20E) para caracterización fisiológica rápida de enterobacterias.

1. Realizar la lectura de la galería API de acuerdo a lo indicado en la Tabla de Lectura (Cuadro
16).
2. Registrar los resultados en las papeletas API correspondientes en el siguiente orden: Anotar
primero todas las reacciones espontáneas y después revelar los ensayos que necesiten la
adición de reactivos (TDA, reactivo TDA, tomar lectura de inmediato; IND, reactivo de Erlich,
tomar lectura de inmediato; VP, reactivo α–Naftol + KOH 40%, tomar lectura después de 10
min). La prueba IND debe ser realizada en último lugar, pues esta reacción libera gases que
pueden alterar la interpretación de las otras pruebas.
Nota: Si el número de pruebas positivas antes de añadir los reactivos (incluyendo el
ensayo GLU) es inferior a 3, reincubar la galería 24 h más, sin volver a añadir los
reactivos.
3. Obtener el perfil numérico de cada bacteria en la papeleta de resultados. Las pruebas están
separados en grupos de tres y se indica para cada uno un valor de 1, 2 o 4. Como la galería
se conforma de 20 ensayos, sumando al interior de cada grupo los valores que corresponden
a reacciones positivas, se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. A la reacción de la oxidasa,
con constituye la prueba n°. 21 se le asigna el valor 4, cuando resulte positiva).
4. Identificar la identidad bacteriana mediante el Catálogo Analítico o con ayuda del Software.
5. Cuando el perfil de 7 cifras resulta insuficientemente discriminante, es necesario realizar los
ensayos complementarios (consultar con el profesor).
(60)
Cuadro 15. Caracterización fisiológica de dos bacterias en estudio.

BACTERIAS
Características Nombre científico de la cepa de Cepa problema Nombre de la
morfológicas y referencia______________________ bacteria con la que
pruebas metabólicas encontró similitud
Resultados Reportado en la Resultados Reportado en la
obtenidos bibliografía obtenidos bibliografía
Morfología
Agrupación
Gram
Estructuras especiales
Hemólisis
Amilasa
Caseinasa
Gelatinasa
DNA-asa
Oxidasa
Catalasa
Utilización de sacarosa
Utilización de manitol
O/F Glucosa
Kliger:
a) Fermentación de Glu
b) Fermentación de Lac
c) Producción de H2S
Citrato
Ureasa
Descarboxilación
a) Lisina
b) oitina
c) arginina
RM
VP
Reducción de NO3
Fenilalania-desaminasa
SIM
a) Producción de H2S
b) Indol
c) Movilidad
(61)
Cuadro 16. Tabla de Lectura para la lectura de resultados de la galería API 20E.
Prueba Componentes Reacciones/Enzimas Resultados
activos Negativo Positivo
ONPG 2-nitro-fenil-βD- β-galactosidasa (orto-nitrofenil- incoloro amarillo 1
galactopiranosida βD-galactopiranosidasa)
ADH L-arginina Arginina dihidrolasa amarillo rojo/anaranjado 2
LDC L-lisina Lisina decarboxilasa amarillo rojo/anaranjado 2
ODC L-ornitina Ornitina decarboxilasa amarillo rojo/anaranjado 2
CIT citrato trisódico Utilización del citrato verde pálido/amarillo azul-verde/azul 3
H2S tiosulfato sódico Producción de H2S incoloro/grisáceo depósito negro/fin
liserado
URE Urea Ureasa amarillo rojo/anaranjado 2
TDA L-triptófano Triptófano desaminasa amarillo marrón-rojizo
IND L-triptófano Producción de índoles incoloro rosa
verde páldo/amarillo
VP piruvato sódico Producción de acetoína incoloro/rosa pálido rosa/rojo
(Voges Proskawer)
GEL gelatina Gelatinasa no difusión difusión pigmento
(origen bovino) negro
GLU D-glucosa Fermentación/Oxidación azul/azul verdoso amarillo/amarillo
(glucosa) 4 grisáceo
MAN D-manitol Fermentación/Oxidación azul/azul verdoso amarillo/amarillo
(manitol) 4
INO Inositol Fermentación/Oxidación azul/azul verdoso amarillo/amarillo
(inositol) 4
SOR D-sorbitol Fermentación/Oxidación azul/azul verdoso amarillo/amarillo
(sorbitol) 4
RHA L-rhamnosa Fermentación/Oxidación azul/azul verdoso amarillo/amarillo
(rhamnosa) 4
SAC D-sacarosa Fermentación/Oxidación azul/azul verdoso amarillo/amarillo
(sacarosa) 4
MEL D-melibiosa Fermentación/Oxidación azul/azul verdoso amarillo/amarillo
(melibiosa) 4
AMY amigdalina Fermentación/Oxidación azul/azul verdoso amarillo/amarillo
(amygdalina) 4
ARA L-arabinosa Fermentación/Oxidación azul/azul verdoso amarillo/amarillo
(arabinosa) 4
OX Oxidasa Citocromo Oxidasa ver ficha técnica de la prueba de oxidasa
1 Un color amarillo muy ligero también implica resultado positivo.

2 La aparición de un color naranja tras 24-48 h de incubación corresponde a un resultado negativo.
3 Lectura en la cúpula (zona aeróbia).
4 La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, mientras que la oxidación empieza en la cúpula.
5 Una ligera coloración rosa, que aparece tras 10 min, debe ser leída como negativa.
• Emplea los reactivos reveladores en orden y en buen estado, algunos de ellos necesitan
prepararse en el momento.
(62)
1. Esterilizar los tubos que contienen los palillos y posteriormente desechar los palillos en el bote
de basura y lavar los tubos con agua y jabón.
2. Esterilizar el material de vidrio en los que realizó sus lecturas y posteriormente lavar.
4. Las galerías API asegurarlas con maskin-tape y colocarlas en el contenedor ubicado en el
laboratorio 1A.
1. ¿Qué variables pudieron causar errores al momento de revelar las pruebas bioquímicas?
2. ¿Cuáles crees que sean las variables que tú puedas controlar? ¿Por qué?
3. ¿Por qué empleaste la galería API 20E? ¿Cuál es su importancia?
4. ¿Qué ventajas y desventajas encuentras al emplear tanto las pruebas bioquímicas
tradicionales como las galerías API para determinar la fisiología bacteriana?
• Koneman, E. W., S. D. Allen, W. M. Jamda, P. C. Scneckenenherger y W. Winn. 1999.

Diágnóstico Microbiológico Texto y Atlas color. 5ª edición. Médica Panamericana, S. A.
Argentina
• Mac Faddin J. F. 2003. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia
clínica. 3ª edición Médica Panamericana, S. A. De C. V. México
Hill. 992 pp
• www.biomerieux.es
(63)
UNIDAD VII. TÉCNICAS PARA LA ENUMERACIÓN DE

MICROORGANISMOS. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA Y OTRAS
MUESTRAS.
Objetivos

• Explicar el fundamento de la técnicas más utilizadas en el recuento microbiano: microscópico,
turbidimétrico, dilución y siembra en placa o tubo; filtración y siembra en placa, reducción de
indicadores óxido-reducción.
• Establecer la cantidad de microorganismos en una muestra mediante la aplicación de las
técnicas más adecuadas.
• Relacionar los resultados obtenidos y explicar las causas que determinan la variación de
éstos.
Introducción
El crecimiento de los microorganismos presentes en sustratos que se encuentren en condiciones que

lo propicien, se traducirá primero en el aumento de los componentes celulares, y en seguida por el
aumento del tamaño y el incremento del número de células. Los estudios relacionados con el análisis
de muestras como agua, alimentos, leche y aire requieren de una enumeración cuantitativa de los
microorganismos presentes en estos compuestos, ya que la calidad microbiológica de estos
productos está en relación directa con la calidad sanitaria y la seguridad para el consumo de ellos.
Por lo heterogéneo de los microorganismos y de las muestras, existen muchos métodos para tales
fines que incluyen métodos microscópicos o directos, el uso de contadores electrónicos de células
como el contador Coulter, métodos químicos que permiten estimar la masa celular o constituyentes
celulares, lecturas turbidimétricas que se pueden relacionar con el aumento de la masa celular y el
método de cuenta en placa de unidades formadoras de colonias.
Las sesiones están diseñadas para realizar:

a) La determinación cuantitativa de bacterias en agua utilizando tres métodos que forman
parte del método oficial para determinar la calidad bacteriológica del agua: coliformes
totales por el método del Número Más Probable (NMP), cuenta en placa de mesófilos
aerobios y el método de filtración para determinar coliformes fecales. La cuantificación
de bacterias mediante los métodos: Cuenta directa al microscopio (Método de Breed) y
el Redox, ambos aplicados en el análisis de leche.
b) El método turbidimétrico para la construcción de una curva que relaciona la densidad
óptica y el log de UFC obtenido en cada muestra. El método turbidimétrico es aplicado
para ajustar inóculos a una determinada concentración o en el caso de vacunas.
(64)
PRÁCTICA 7.1 Método del Número Más Probable (NMP).

Cuantificación de Mesófilos Aerobios (1ª Sesión)
PRÁCTICA 7.2 Método de Filtración y Siembra en Placa.
Cuantificación de Coliformes Fecales (1ª Sesión)
Materiales

Equipo Millipore par filtración (matraz, filtro, envudo, pinzas de pato) estéril
Membrana Millipore estériles de 5 cm de diámetro y 0.45 µm de poro
Matraz Erlenmeyer con 100 mL de SSI estéril
Placa Petri de agar bilis rojo violeta (ABRV)
Vaso de precipitado de 250 mL
Pinzas Millipore
Manguera para vacío
Tubos de ensayo de 16x150:
12 tubos con 9 mL de caldo soya tripticaseína o caldo soya.
tripticaseína adicionado de lecitina (0.5%) y polisorbato (4.0%)
3 tubos con 9 mL de solución salina isotónica (SSI) estéril

Muestra de agua presumiblemente potable (cisterna, pileta,
Mecheros
Gradillas
Asas
Etanol (96°) para flamear pinzas
Metodología
7.1 Técnica del Número Más Probable (NMP).

1. Colocar en la gradilla los 12 tubos conteniendo el caldo soya tripticaseína o el caldo
adicionado de lecitina y polisorbato y rotularlos por triplicado: 10-1, 10-2, 10-3 y testigo (Figura
10).
2. Preparar la serie de diluciones de la muestra en solución salina isotónica estéril 10-1, 10-2, 10-3.
3. De la dilución 10-1 tomar 1 mL e inocular en condiciones asépticas el tubo con el medio
rotulado como tal. Repetir esta operación dos veces más.
4. De la dilución 10-2 hacer las inoculaciones en tres tubos con medio marcados con esta dilución
5. Repetir la misma operación en el caso de la dilución 10-3.
6. Los tres tubos restantes serán utilizados como testigos sin inocular.
7. Agitar cuidadosamente cada tubo para homogeneizar e incubar, dependiendo de la muestra,
entre 30 y 35°C durante 24-48 h.
(65)
1.0 mL 1.0 mL 1 .0 mL
9 ml SS I 9 ml S SI
9 ml SS I (10 -2 ) (10-3 )
(10 -1 )
1. 0 mL 1 .0 mL 1.0 mL
Muestra
9 ml caldo soya
triptica seína c/ u
Tes tigos (sin

in ocu lar)
Figura 10. Práctica 7.1. Método del Número Más Probable (NMP).
7.2 Técnica de filtración.

1. En condiciones de asepsia, montar el equipo Millipore y conectarlo al sistema de vacío.
2. Con las pinzas previamente flameadas con alcohol y enfriadas, colocar la membrana Millipore
en el soporte, montar nuevamente el equipo y fijarlo con la pinza adaptadora.
3. Agitar vigorosamente el frasco que contiene la muestra de agua y verter un volumen conocido
de ella en el embudo del equipo Millipore y filtrar al vacío; cuando haya pasado toda la
muestra, lavar el embudo con solución salina estéril. Cerrar el vacío antes de retirar la
membrana.
4. Retirar la membrana tomándola con la pinza y depositarla asépticamente sobre la placa de
bilis rojo violeta agar, asegurando el contacto de la membrana con el medio.
5. Incubar a 37° C durante 24-48 h.
• Procura emplear propipetas en buen estado. Es importante que las cantidades (volúmenes o
masa) empleadas en esta práctica sean lo más exactas posible.
• Si la muestra de agua, que se usará para la cuantificación de bacterias coliformes mediante la
técnica de filtración, está turbia (presencia de sólidos), será necesario diluirla o cambiar de
muestra.
1. Las pipetas se depositan en el pipetero (recipiente largo con una solución de sanitizante)
inmediatamente después de su uso, posteriormente se lavan con agua y jabón.
(66)
PRÁCTICA 7.1 Método del Número Más Probable (NMP).

Cuantificación de Mesófilos Aerobios (2ª Sesión)
PRÁCTICA 7.2 Método de Filtración y Siembra en Placa.
Cuantificación de Coliformes Fecales (2ª Sesión)
a) Resultados. Lectura e interpretación de resultados.
7.1 Técnica del Número Más Probable (NMP).

1. Observar y registrar el número de tubos de cada dilución que muestren turbidez resultante del
crecimiento microbiano (tubos positivos) (Cuadro 17).
2. Con los resultados obtenidos obtener el número característica.
3. Calcular el NMP de microorganismos por mililitro o gramo de muestra, utilizando la Tabla de
Mc Crady (Cuadro 18).
4. Si se observa turbidez en cualquiera de los tubos testigo se invalida la prueba y por lo tanto se
deberá repetir.
Cuadro 17. Registro de números positivos para el cálculo de microorganismos mediante el NMP.
Tubo Dilución 10-1 Dilución 10-2 Dilución 10-3
1 *
2
3
Número característica**
*Indicar el número de tubos positivos. **Consultar la Tabla de Mc Crady.
Cuadro 18. Tabla de Mc Crady para diluciones decimales y tres tubos inoculados/dilución.
Número NMP Número NMP Número NMP
característica característica característica
000 0.0 201 1.4 302 6.5
001 0.3 202 2.0 310 4.5
010 0.3 210 1.5 311 7.5
011 0.6 211 2.0 312 11.5
020 0.6 212 3.0 313 16.0
100 0.4 220 2.0 320 9.5
101 0.7 221 3.0 321 15.0
102 1.1 222 3.5 322 20.0
110 0.7 223 4.0 323 30.0
111 1.1 230 3.0 330 25.0
120 1.1 231 3.5 331 45.0
121 1.5 232 4.0 332 110.0
130 1.6 300 2.5 333 140.0
200 0.9 301 4.0
Tomado de AUTOR, AÑO. Manual de prácticas básicas para el estudio de la microbiología ambiental de agua y suelo.
(67)
7.2 Técnica de filtración.

1. Revisar las membranas sobre las placas y ubicar la presencia de colonias rojas.
2. Utilizar un cuentacolonias para contar las colonias con las características antes descritas y
calcular el número de UFC /100 mL de muestra.
3. Consultar la Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994, que señala los límites permitidos
de bacterias coliformes fecales y confirmar si el agua analizada reúne y cumple con lo
establecido.
1. Esterilizar los tubos en los que preparó las suspensiones bacterianas y posteriormente lavarlos.
2. Después de realizar las lecturas correspondientes, sellar las caja de Petri de plástico con la
membrana Millipore y colocarlas en el contenedor rojo ubicado en el laboratorio 1A.
1. ¿Cuáles son los puntos críticos para realizar las técnicas del NMP y Filtración?
2. ¿Cuáles fueron las dificultades a las que te enfrentaste al realizar la lectura de ambas
técnicas?
3. Discute sobre la información que te proporciona cada una de las técnicas.
• CCAYAC-M-004 (2006) “Estimación de la densidad microbiana por la técnica del número más
probable, detección de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli por el número
más probable”.
• Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. 8th ed.
• Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual” 9th ed. Arlington,
VA:AOAC.
• Norma Ofical Mexicana NOM-041-SSA1-1993. Bienes y servicios. Agua purificada
envasada.Especificaciones sanitarias.
• Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994. Salud ambiental, agua para uso y consumo
humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su
potabilización.
• Standard Methods for the examination of water and wastewater. 1998. American Public Health
Assiciation. 20th ed. Washington.
(68)
PRÁCTICA 7.3 Análisis microbiológico del agua
(69)
PRÁCTICA 7.3 Técnica de Cuenta Directa:

Método de Breed y Método Redox.
Materiales
Muestras
Leche pasteurizada
Leche no pasteurizada
Leche cruda o bronca (de establo)
Material por grupo

Cajas Koplin con Xilol
Cajas Koplin con Etanol (96°)
Material por mesa

Solución de resazurina (diazoresorcinol)
Solución de tiocianato de azul de metileno
Frasco gotero con azul de metileno

Microscopio
Objetivo micrométrico
Pipetas graduadas de 10 mL (esterilizar para la siguiente clase)
Pipetas graduadas de 5 mL (esterilizar para la siguiente clase)
Pipetas graduadas de 1.0 mL (esterilizar para la siguiente clase)
Tubos de ensayo de 16x150 estériles con tapón de rosca (esterilizar para la siguiente clase)

Mecheros
Gradillas
Portaobjetos
Tubos de ensayo de 16x150 con tapón de rosca estériles
Pipetas de 10 mL estériles
Pipetero
Metodología
7.3.1 Cuenta directa (método de Breed).

Cálculo del factor microscópico (FM):
1. Medir el diámetro del campo microscópico por medio del micrómetro objetivo, en mm.
2. Determinar el área del campo: elevar el radio al cuadrado y multiplicar por 3.1416. Dividir este
resultado entre 100 para obtener el área del campo en centímetros cuadrados.
3. Determinar el número de dichos campos en 1 cm2, dividiendo 1 cm2 entre el área del campo
obtenido antes.
4. Como se coloca 0.01 mL de leche en un área de 1 cm2, multiplicar el número de campos por
100 para conocer el número de campos microscópicos por mL de leche.
(70)
Preparación de la muestra:
1. En un portaobjetos desengrasado marcar un área de 1 cm2.
2. Agitar la muestra de leche de 25 a 30 veces.
3. Con una pipeta estéril tomar 0.01 mL de la leche (de preferencia utilizar leche descremada o
light) y transferirlo al portaobjetos previamente marcado, extendiendo la muestra en el área
marcada con el asa.
4. Dejar secar al aire.
5. Sumergir el frote en xilol durante 2 min.
6. Sacarlo del xilol y sumergirlo en etanol durante otros 2 min.
7. Sacar el frote del etanol y cubrirlo con solución de azul de metileno durante 2 min. Lavar con
agua. Dejar secar al aire.
8. Observar en el microscopio con objetivo de inmersión y contar el número de microorganismos
por campo, obteniendo el promedio de 5 campos.
9. Calcular el FM.
10. Calcular el número de bacterias por mL de leche.
7.3.2 Método Redox (reducción del azul de metileno).
Reducción del azul de metileno:

1. Agitar la muestra de leche pasteurizada y transferir 10 mL a un tubo de ensayo.
2. Agitar la muestra de leche cruda y transferir 10 mL a otro tubo de ensayo.
3. Agregar a cada tubo 1 mL de la solución de colorante, mezclar bien y colocarlos en un baño
de agua a 37°C (o en la incubadora).
4. Después de 10 minutos, asegurar los tapones e invertir lentamente los tubos tres veces para
distribuir la capa de crema.
5. Observar cada 30 minutos y continuar la incubación hasta que registre decoloración del
colorante.
6. Anotar los resultados obtenidos prácticamente, de acuerdo con la clasificación indicada en el
cuadro 19.
Cuadro 19. Clasificación de la calidad de leche y número de microorganismos, mediante la técnica de

reducción del azul de metileno.
Calidad Tiempo (°C) de incubación en el que se Número de microorganismos /
presenta la decoloración mL
Excelente No se decolora en 5.5 h < de 500 000
Buena Se decolora entre las 2 y 5.5 h 500,000 a 4 000 000
Mala Se decolora entre los 20 minutos y 2 h 4 a 20 millones
Muy mala Se decolora en 20 minutos > de 20 millones
• Registra los tiempos adecuadamente para observar el cambio de color en las muestras de
leche empleadas para cuantificar microorganismos mediante la técnica de Redox.
(71)

una solución sanitizante de hipoclorito de sodio al 10 % a partir de una solución comercial,
después se lavan con detergente líquido, se enjuagan y se sumergen en alcohol al 95 %
durante 24 horas.
3. Las muestras de leche con colorantes se colocan en los contenedores dispuestos para este fin
en cada laboratorio.
1. ¿Cuál fue la problemática a la que te enfrentaste para llevar a cabo los métodos de Breed y
Redox?
2. Discute acerca de la eficacia de los métodos empleados para conocer la calidad y cantidad de
microorganismos presentes en la leche.
• Atlas, R. M. Y R. Bartha. 2000. Microbial Ecology. Fundamentals and Applications. 4a edición.

Benjamin/Cummings Science Publishing
Assiciation. 20th ed. Washington.
(72)
PRÁCTICA 7.4 Método Turbidimétrico (1ª. Sesión)

PRÁCTICA 7.5 Método de Dilución y Siembra por Vertido en Placa
(1ª. Sesión)
Materiales
Material por equipo

Matraz nefelométrico conteniendo un cultivo de Escherichia coli de 24 h.
Celdas para espectrofotómetro
Matraz Erlenmeyer (500 mL) conteniendo 200 mL de solución salina isotónica (SSI) estéril.
Tubo de ensayo de 22x175 con 20 mL de caldo nutritivo estéril.
Tubos de ensayo de 16x150 con 12 mL de agar triptona glucosa extracto de levadura (TGEA)
estériles c/u, fundido y mantenidos en baño de agua a 50°C. También puede sustituirse por 2
matraces Erlenmeyer (250 mL) con 125 mL del medio indicado en c/u).

Cajas de Petri estériles de plástico
Pipetas graduadas de 10 mL estériles
Pipetas graduadas de 5 mL estériles
Tubos de ensayo de 16x150 vacíos con tapón de rosca estériles
Metodología
Organización de material
1. Colocar en la gradilla 23 tubos estériles y etiquetar de la siguiente manera:
3 tubos como A, B, C, D y T (blanco)
5 tubos como A-1, A-2, A-3, A-4 y A-5.
5 tubos como B-1, B-2, B-3, B-4 y B-5.
5 tubos como C-1, C-2, C-3, C-4 y C-5.
5 tubos como D-1, D-2, D-3, D-4 Y D-5.
2. Transferir, en condiciones asépticas, 5 mL de caldo nutritivo a cada uno de los tubos
marcados con A, B, C y D utilizando la pipeta de 5 mL.
3. Transferir, en condiciones asépticas, 9 mL de SSI estéril a cada uno de los tubos de la series
A, B, C y D, marcado -1 hasta -5, utilizando la pipeta de 10 mL,
4. El tubo marcado como T se empleará como blanco para la lectura de transmitancia (método
turbidimétrico). No será inculado.
a) Dilución y siembra por vertido en placa.

1. Agitar suavemente el matraz que contiene el cultivo de Escherichia coli y tomar asépticamente
5 mL y transferirlo al tubo de ensayo etiquetado como A, homogeneizar el inóculo con el
medio de cultivo.
2. Tomar asépticamente 5 mL de la suspensión A y transferirlo al tubo marcado como B,
homogeneizar el inóculo con el medio de cultivo.
3. Tomar asépticamente 5 mL de la suspensión B y transferirlo al tubo marcado como C,
(73)
4. Tomar asépticamente 5 mL de la suspensión C y transferirlo al tubo marcado como D,

5. Realizar diluciones decimales para cada uno de los tubos marcados como A, B, C y D (Figura
11):
a) En condiciones asépticas tomar 1.0 mL del tubo A y transferirlo al tubo marcado como A-1,
homogeneizar.
b) En condiciones asépticas tomar 1.0 mL del tubo A-1 y transferirlo al tubo marcado como A-
2, homogeneizar.
c) En condiciones asépticas tomar 1.0 mL del tubo A-2 y transferirlo al tubo marcado como A-
3, homogeneizar.
d) En condiciones asépticas tomar 1.0 mL del tubo A-3 y transferirlo al tubo marcado como A-
4, homogeneizar.
e) En condiciones asépticas tomar 1.0 mL del tubo A-4 y transferirlo al tubo marcado como A-
5, homogeneizar.
6. Repetir las respectivas diluciones con las series B, C y D.
7. En condiciones asépticas tomar 1.0 mL de la suspensión del tubo A-1 y transferirlo a una caja
de Petri que se marcará con la misma clave (por duplicado).
8. Repetir la operación con las diluciones restantes, teniendo cuidado de marcar con las claves
correspondientes.
9. Agregar a cada caja el medio de cultivo TGEA fundido (aprox. 20 mL).
10. Mezclar el inóculo con el medio, para ello colocar la caja sobre la mesa y girar 5 veces en el
sentido de las manecillas del reloj, 5 veces en sentido inverso, 5 veces hacía adelante atrás y
5 en sentido horizontal.
11. Dejar solidificar e invertir las cajas.
12. Incubar las cajas a 35°C durante 24 h.
13. Al término de la incubación, hacer el recuento de las UFC/mL.
b) Método turbidimétrico.
1. Agregar 1 gota de formaldehído a los tubos A, B, C, D y T una vez concluido el método de
dilución y siembra por vertido en placa.
2. Vaciar el contenido de cada uno de ellos a 5 celdas espectrofotométricas y proceder a tomar
la lectura del % de transmitancia.
3. Agitar suavemente el matraz que contiene el cultivo de Escherichia coli, insertar el tubo lateral
en el espectrofotómetro y tomar la lectura del % de transmitancia.
4. Construir una gráfica (y=No. Microorganismos, x=% transmitancia) con la Curva de McFarland.
5. Obtener la ecuación de la recta a partir de la curva e interpolar los datos obtenidos para los
tubos A, B, C y D en la curva de McFarland.
• Procura homogenizar perfectamente tus cultivos al realizar cada dilución, y antes de leer el %
transmitancia.
3. Esterilizar los tubos en los que preparó las suspensiones bacterianas y posteriormente lavarlos.
4. Después de realizar las lecturas correspondientes, sellar las cajas de Petri de plástico y
colocarlas en el contenedor rojo ubicado en el laboratorio 1A.
(74)
5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
5 mL de cal do
nu tri tivo c/u
Cultivo de
Escherichia
coli LEER
TRANSMITANCIA
A B C D T
( blanco)
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
9 mL de SSI
estéril c/u
A-1 A-2 A-3 A-4 A- 5
TGE A 1 mL c/u Re pet ir con las

fun dido series B, C, D
Figura 11. Práctica 7.5. Método de dilución y siembra por vertido en placa.
1. En la técnica de dilución y siembra por placa vertida ¿se observa el efecto de dilución?
Fundamenta tu respuesta.
2. ¿Se obtuvieron resultados similares con las dos técnicas? ¿Por qué?
3. ¿Cuál de las dos técnicas la consideras más confiable? ¿Por qué?
4. ¿Qué precauciones propondrías para mejorar las técnicas de dilución y siembra por placa
vertida y el método turbidimétrico?

• Madigan, M. T., J.M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock. Biología de los microorganismos.
10ª Edición en español. Prentice may Iberia, España.
Association. 20th edition. Washington.
• Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994.
(75)
UNIDAD VIII. CONDICIONES AMBIENTALES PARA EL DESARROLLO,

INHIBICIÓN Y DESTRUCCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
PRÁCTICA 8.1 Determinación del Efecto de pH, Temperatura y

Concentración de Solutos (1ª Sesión).
PRÁCTICA 8.2 Determinación del Efecto Letal y Mutagénico de las
Radiaciones UV (1ª Sesión).
PRÁCTICA 8.3 Efecto Biocida y Biostático de Diferentes Agentes
Químicos en el Desarrollo Microbiano (1ª Sesión).
Objetivos

• Explicar el efecto de factores físicos y químicos sobre el desarrollo de los microorganismos.
• Distinguir entre el efecto mutagénico y letal ocasionado por las radiaciones UV.
Introducción
En la naturaleza, así como en condiciones de laboratorio, la actividad de los microorganismos esta

regida por las variables ambientales tales como: pH, temperatura, presión osmótica, humedad,
radiaciones, tipo y concentración de sustancias químicas. Por lo que el conocimiento del efecto de
estas variables sobre el desarrollo de los microorganismos permite controlar el crecimiento de los
mismos, ya sea para favorecer o limitar su desarrollo o bien para eliminarlos de un área o producto
contaminado.
Materiales

Serratia marcescens
Micrococcus luteus
Pseudomona aeruginosa
Bacillus sp
Material por grupo:

Campana con lámpara de luz UV
Incubadoras a diferentes temperaturas (28, 37, 42, 55°C)
Refrigerador (4°C)
Soluciones estándar de cloramfenicol de 10, 30 y 50 μg/ mL estériles
Soluciones acuosas de cristal violeta al 0.1, 0.5 y 1.0 %
Soluciones acuosas de Verde de malaquita al 0.1, 0.5 y 1.0 %
Sensidiscos para Gram + y – (o pemprocilina y cloranfenicol)
(76)

Placas de Petri con TSA o gelosa nutritiva
Tubos de ensayo de 22x175 con 20 mL de BHI o TSA
Tubos de ensayo de 16x150:
2 con 5.0 mL de SSI estéril
10 con 7 mL de caldo nutritivo
8 con 7.0 mL de caldo nutritivo con diferentes pH (4.0, 5.0, 7.0 y 9.0, 2 de c/ u)
10 con 7.0 mL de caldo nutritivo con NaCl en las siguientes concentraciones 1, 4, 7,
10 y 15 % (2 de c/ u)
8 con 9.0 mL de caldo para antibióticos #3.
Tripie
Lámina metálica
Termómetro
Hisopos

Muestras de desinfectantes de uso común tales como: BenzalMR, IsodineMR, MerthiolateMR, Solución
de hipoclorito (5%), TriclosánMR (enjuague bucal), solución de vinagre, solución de manzanilla (gotas
oftálmicas), Maestro LimpioMR, PinolMR, Jabón líquido para las manos, Jabón líquido para trastes.
Mecheros
Gradillas
Asas
Cajas de Petri de plástico desechables estériles
Una caja de Petri de vidrio con 40 discos de papel filtro grueso de 7 mm de diámetro estériles
Pinzas largas de punta roma
Papel aluminio
Círculos de cartón grueso negro, dejando un cuadrante al descubierto
Vasitos desechables de 10 mL de capacidad
Metodología
Inocular un tubo de ensayo de 16x150 con 7 mL de SSI estéril con una asada del cultivo bacteriano
(cepa problema o de referencia con 24 h de incubación previa), éste será nuestra suspensión
bacteriana.
a) Efecto de temperatura, pH y concentración de solutos.

1. Colocar en el área de trabajo una gradilla con el siguiente material debidamente etiquetado:
5 tubos con caldo nutritivo,
4 con caldo nutritivo a diferentes pH (2, 5, 7 y 9)
5 con caldo nutritivo con diferentes concentraciones de NaCl (1, 4, 7, 10 y 15%)
2. A partir de la suspensión bacteriana inocular con 0.1 mL cada uno de los tubos de ensayo con
caldo nutritivo indicados en el punto 1 (Figura 12).
3. Incubar un tubo de ensayo con caldo nutritivo, de cada cepa, a diferentes temperaturas (4, 28,
37, 42, 55°C). Los tubos de ensayo con caldo nutritivo con diferentes pH’s y concentraciones
de NaCl, incubarlos a 37°C de 24-48 h.
(77)
Figura 12. Práctica 8.1. Efecto de los factores físicos ambientales en el desarrollo microbiano.
b) Efecto de letal y mutagénico de las radiaciones UV.

1. A partir de la suspensión bacteriana inocular con 0.1 mL cuatro placas Petri con TSA o gelosa
nutritiva. Dos placas con la cepa problema y dos con la cepa de referencia.
2. Extender el inóculo en toda la superficie de cada placa mediante un hisopo o una varilla de
vidrio en L previamente esterilizada y dejar que el inóculo se absorba en el medio.
3. Rotular en cuadrantes por la parte externa, y en la base, las placas inoculadas. Marcar un
cuadrante como control “C”, y los demás con el tiempo de exposición que se aplicará con luz
UV (30, 60 y 90 seg).
4. Colocar las placas bajo la lámpara de luz UV a una distancia aproximada de 20 cm de la
fuente de luz.
5. Retirar las tapas de las placas inoculadas y sustituirlas por los círculos negros de tal manera
que quede descubierto uno de los cuadrantes y radiar durante 30 segundos.
6. Apagar la lámpara y girar el círculo a modo de descubrir el 2° sector y radiar por 60 segundos.
7. Repetir el procedimiento para radiar el 3er sector durante 90 segundos. El cuadrante control
no se irradia.
8. Cubrir las placas con sus tapas correspondientes.
8. Envolver una de las placas con papel aluminio, y la otra exponerla a la luz solar durante 30
minutos y envolver con papel aluminio.
9. Invertir las cajas e incubar a 28°C de 24-48 horas.
(78)
c) Efecto biocida y biostático de diferentes agentes químicos en el desarrollo microbiano.
A partir de la suspensión bacteriana inocular con 0.1 mL ocho tubos de ensayo de 22x175 con gelosa
nutritiva, previamente fundida, homogenizar y verter inmediatamente en cajas Petri de plástico
desechables estériles (cuatro tubos para la cepa problema y cuatro para la cepa de referencia). Así
mismo inocular seis tubos con caldo para antibióticos #3 (tres tubos para la cepa problema y tres para
la cepa de referencia).
c1) Concentración de colorantes y otros agentes químicos (limpiadores, desinfectantes, antisépticos).

1. Dividir las cajas inoculadas en cuadrantes y rotular como control “C”, y con cada uno de los
agentes químicos, respectivamente.
2. En 8 vasitos desechables colocar unas gotas de la muestra de los agentes químicos a probar
(1 por vaso).
3. En condiciones asépticas (cerca del mechero y con la pinzas de punta roma flameadas),
impregnar los discos de papel filtro en la soluciones de colorantes (cristal violeta o verde de
malaquita a diferentes concentraciones) y en los diferentes agentes químicos. Procurar
escurrir los discos antes de ser colocados en las placas Petri con gelosa nutritiva inoculadas.
4. Colocar en la primera placa los discos impregnados con las soluciones de colorantes y el
control (no se coloca disco); en la segunda y tercera placa, los discos impregnados con los
diferentes agentes químicos c/u; y en la cuarta placa los antibióticos.
5. Incubar a 37°C durante 24 h.
c2) Antibióticos.
1. Colocar sensidiscos de diferentes antibióticos en cada uno de los cuadrantes de la cuarta
placa de gelosa nutritiva previamente inoculada.
2. Etiquetar los 4 tubos con caldo para antibióticos # 3 (previamente inoculados) con “C”, 1, 3 y 5
μg/ mL del antibiótico a evaluar.
3. Agregar 1 mL de cada solución estándar del antibiótico para tener la concentración deseada.
1. Se recomienda que las cepas de referencia a usar para evaluar el efecto de fotorreactivación
(irradiaciones con luz UV) sean Serratia marcescens o Micrococcus luteus.
2. Procura que la lámpara de luz UV quede a 20 cm de las placas a irradiar.
3. Al inocular los tubos de ensayo de 16x150 con caldo nutritivo (pH, %NaCl) evitar tocar el
medio de cultivo con la misma pipeta.
(79)
PRÁCTICA 8.1 Determinación del Efecto de pH, Temperatura y

Concentración de Solutos (2ª Sesión).
PRÁCTICA 8.2 Determinación del Efecto Letal y Mutagénico de las
Radiaciones UV (2ª Sesión).
PRÁCTICA 8.3 Efecto Biocida y Biostático de Diferentes Agentes
Químicos en el Crecimiento Microbiano (2ª Sesión).
Resultados. Lectura e interpretación de resultados.
a) Efecto de temperatura, pH y concentración de solutos.

1. Registrar la turbidez provocada por el desarrollo microbiano en cada uno de los tubos.
Cuadro 20. Efecto de los factores físicos ambientales en el desarrollo microbiano.

Factores Desarrollo microbiano*
físicos/Cepas Serratia Bacillus sp Micrococcus Pseudomonas Bacteria
marcescens luteus aeruginosa problema
Tiempo 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h
4
28
°C 37
42
55
2
pH 5
7
9
1
4
%NaCl 7
10
15
b) Efecto de letal y mutagénico de las radiaciones UV.

1. Registrar el desarrollo microbiano presente en cada cuadrante de cada placa, y anotar las
características coloniales y compararlas en cada caso.
(80)
Cuadro 21. Efecto letal y mutagénico de las radiaciones UV en el desarrollo microbiano.

Caja Tiempo de Nombre de la cepa problema: Nombre científico de la cepa de
exposición referencia:
(seg) Desarrollo* Características coloniales Desarrollo* Características coloniales
0
1 30
(c/sol) 60
90
0
2 30
(s/sol) 60
90
c) Efecto biocida y biostático de diferentes agentes químicos en el desarrollo microbiano.
Materiales

4 cajas de Petri con TSA o BHI

Mecheros
Gradillas
Asas
Metodología
1. Dividir dos cajas con TSA o BHI en cuadrantes.

2. Marcar en una de las cajas, los cuadrantes con “C”, 1, 3 y 5 μg/ mL
3. A partir del tubo “C” (inoculado la clase anterior), inocular por estría recta el sector
correspondiente.
4. Repetir el procedimiento con los tubos inoculados la clase anterior a los que agregó 1, 3 y 5 g/
mL del antibiótico sembrando en los cuadrantes correspondientes.
5. De las cajas en las que determinó el efecto de los agentes químicos por difusión en placa,
seleccionar 4 de ellos que hayan mostrado los mayores halos de inhibición.
6. Marcar los cuadrantes de la segunda caja con los agentes químicos correspondientes.
7. Tomar una asada del halo de inhibición y sembrar por estría recta el sector correspondiente.
8. Repetir el procedimiento con los otros tres agentes.
(81)
Cuadro 22. Efecto biocida y biostático de diferentes agentes químicos en el desarrollo microbiano.
Agentes químicos Desarrollo*
Nombre del (%) Serratia Bacillus Micrococcus Pseudomonas Bacteria
colorante marcescens sp luteus aeruginosa problema
0.1
0.5
1.0
Nombre del agente químico**
Nombre del antibiótico
Cloranfenicol μg/ mL
0
Tubo 1
3
5
0
Caja 1
3
5
Desinfectantes
2ª resiembra 1
en caja 2
3
4
**Desinfectante, antisépticos, limpiadores, etc.
1. Esterilizar los tubos en los que preparó las suspensiones bacterianas, desechar en tarja y
posteriormente lavarlos con agua y jabón.
2. Después de realizar las lecturas correspondientes, esterilizar los tubos y cajas de vidrio en
autoclave y lavarlos. En el caso de cajas de Petri de plástico proceder a sellarlas y colocarlas
en el contenedor rojo ubicado en el laboratorio 1A.
(82)
1. ¿Qué importancia tiene determinar qué factores físicos ambientales afectan el desarrollo de
los microorganismos?
2. Dentro del espectro electromagnético que región (nm) ocupa la luz UV?
3. Compara el efecto observado con cada uno de los agentes químicos empleados y discute
sobre los ingredientes activos de los mismos.
4. ¿Qué agente químico presentó un efecto biocida sobre la mayoría de los microorganismos
evaluados?
5. ¿Qué otras pruebas realizarías para determinar la eficacia de los agentes químicos que
evaluaste?

(83)
UNIDAD IX. ASOCIACIONES MICROBIANAS
PRÁCTICA 9.1 Mutualismo, Comensalismo, Antagonismo y Sinergismo

(1ª Sesión)
Objetivos

• Describir las relaciones que presentan los microorganismos entre si y con algunos organismos
superiores
• Distinguir las relaciones benéficas, perjudiciales e indiferentes, que establecen los
microorganismos y la importancia que deriva de ellas.
Introducción
En el medio ambiente los microorganismos constituyen una población mixta representada por todos
los grupos microbianos, estos se encuentran interactuando entre ellos mismos y con los organismos
superiores, estableciendo relaciones con diferentes grados de complejidad y diversos efectos a las
que se les conoce como interacciones, asociaciones o simbiosis, y a los organismos involucrados se
les denomina simbiontes. Con relación al grado de complejidad se tiene que un microorganismo
puede estar alojado en otro organismo (endoasocaición); o bien estar dentro de otro organismo
(ectoasociación); en ambos casos la relación es muy estrecha ya que existe contacto físico entre los
organismos; en otras asociaciones, se observa que dos tipos de poblaciones microbianas se
encuentran en un hábitat común y existen entre ellas interacciones constantes sin que se presente el
contacto físico (paraasociación). Respecto al significado las asociaciones pueden ser benéficas,
perjudiciales o indiferentes y, su efecto repercutir sobre uno o los dos tipos de organismos
involucrados y en función del efecto se describen los siguientes tipos de simbiosis:
Mutualismo, asociación en donde los dos organismos involucrados son beneficiados.
Comensalismo, relación en donde un simbionte es beneficiado y el otro no resulta afectado.
Parasitismo, asociación en la que uno de los simbiontes resulta beneficiado (parásito) y el otro
dañado (hospedero).
Antagonismo o amensalismo, relación de dos especies en donde una inhibe el desarrollo de la otra
o bien le causa la muerte.
Sinergismo, relación en donde la actividad cooperativa de dos poblaciones es mayor a la suma de
las dos actividades realizadas por separado.
Competencia, interacción de organismos en un hábitat común en donde el sustrato u otro factor son
limitados, por lo que las dos poblaciones compiten por el sustrato o por el oxígeno para poder
sobrevivir.
Neutralismo o indiferentismo, dos poblaciones conviven en un hábitat común sin tener efecto una
sobre otra.
Depredación, interacción que involucra a un organismos (el depredador) que consume a otro (la
presa) y generalmente el primero es más grande que el segundo.
En todas las asociaciones, el efecto benéfico, perjudicial o indiferente es influenciado por las
condiciones ambientales y el estado fisiológico del macrosimbionte, lo que determina que una
relación benéfica se transforme en dañina. Es decir un mutualismo bajo ciertas condiciones puede
pasar a un comensalismo y en caso extremo a un parasitismo.
(84)
En esta práctica se desarrollarán ejercicios que permitan demostrar el efecto benéfico, perjudicial o
indiferente que deriva de la interacción de una población microbiana con otros microorganismos o
con organismos superiores.
Materiales

Bacillus subtilis (en agar nutritivo)
Clostridium sp (en caldo tioglicolato)
Micrococcus luteus (en caldo)
Escherichia coli (en caldo)
Staphylococcus aureus (en caldo)
Proteus vulgaris (en caldo)
Enterococcus faecalis (en caldo)
Muestras
Plantas de trébol con raíces noduladas
Material por grupo

Baño de agua caliente
Material por mesa

Frascos goteros con azul de metileno de Löeffler y fucsina fenicada

Microscopio
Bisturí
Matraz Erlenmeyer (125 mL) con 50 mL de solución salina isotónica estéril
Cajas de Petri con agar extracto de levadura manitol (ELMA)
Cajas de Petri con gelosa nutritiva
Tubos de ensayo de 22x175 con 20 mL de gelosa nutritiva
4 con caldo rojo de fenol + lactosa con campanas de Durham
6 con caldo rojo de fenol + sacarosa con campanas de Durham

Mecheros
Gradillas
Asas
Portaobjetos
Cajas de Petri de plástico desechables estériles
Tubo de ensayo de 13x100 estéril
Agitador de vidrio estéril
Etanol (96°) y Cloralex (5%)
Plastilina
Marcador indeleble
(85)
Metodología
a) Mutualismo. Observación de formas bacteroides en nódulos de leguminosas y aislamiento.

1. Lavar las raíces con agua corriente hasta eliminar las partículas de suelo.
2. Con el bisturí separar cuidadosamente los nódulos de las raíces y colocarlos en el tubo de
ensayo de 13x100.
3. Deshidratar los nódulos mediante la adición de un volumen pequeño de etanol, dejar actuar
durante 5 a 10 segundos, decantar, lavar con solución salina isotónica estéril durante 10
segundos y repetir el procedimiento de lavado.
4. Desinfectar los nódulos mediante la adición de un volumen pequeño de cloralex, dejar actuar
de 1 a 3 minutos.
5. Eliminar el desinfectante mediante lavado con solución salina isotónica estéril, repetir el lavado
un mínimo de seis veces, en el último lavado dejar un volumen pequeño de SSI.
6. En condiciones asépticas y con el agitador de vidrio macerar los nódulos hasta obtener una
suspensión.
7. A partir de la suspensión anterior preparar un frote, fijarlo y teñirlo con azul de metileno
Löeffler o fucsina fenicada (10 a 20 segundos).
8. Observar al microscopio y localizar formas bacteroides.
9. Tomar una asada de la suspensión con bacteroides y sembrar por estría y agotamiento dos
placas de Petri con agar extracto de levadura manitol (ELMA) e incubar a 28°C de 3 a 7 días.
b) Comensalismo.
1. Dividir las dos cajas que contienen gelosa nutritiva en dos secciones, trazando con un plumón
indeleble una raya en la parte externa del fondo de las cajas.
2. Tomar una asada del cultivo de Staphylococcus aureus y sembrar por estría recta una sección
de las dos cajas.
3. Tomar unas asada del cultivo de Clostridium sp. y sembrar por estría recta la segunda sección
de las dos cajas.
4. Invertir las cajas.
5. Sellar los bordes de una de ellas con plastilina.
7. Observar las cajas y registrar los resultados.
8. Continuar la incubación por 48 y 72 h en las mismas condiciones y registrar los resultados.
c) Antagonismo.
1. Fundir la gelosa nutritiva y enfriar, manteniendo los tubos a temperatura de 45 a 50°C.
2. Con una pipeta estéril y en condiciones de asepsia inocular uno de los tubos con 1.0 mL del
cultivo de Micrococcus luteus. Mezclar rápidamente, moviendo el tubo entre las palmas de las
manos.
3. Verter el contenido en una de las cajas de Petri, anotar el nombre del microorganismo y dejar
solidificar el medio.
4. Repetir el procedimiento, empleando el cultivo de Escherichia coli.
5. Tomar una asada del cultivo de Bacillus subtilis y sembrar tanto la caja inoculada con M.
luteus, como con E. coli, por medio de una estría recta.
6. Invertir las cajas e incubar a 37° C durante 48 h y observar.
(86)
d) Sinergismo.
1. Identificar los tubos que contienen lactosa con las claves L1, L2, L3 y L4 y los que contienen
sacarosa con S1, S2, S3, S4, S5, S6.
2. Con pipetas estériles inocular los tubos adicionando los volúmenes indicados en el cuadro 24
(emplear una pipeta para cada bacteria).
3. Incubar a 36°C durante 24, 48 y 72 h.
4. Observar y registrar los resultados a diferentes tiempos.
Cuadro 23. Registro del sinergismo presente en bacterias.

Bacteria Clave de los tubos
L1 L2 L3 L4 S1 S2 S3 S4 S5 S6
Proteus vulgaris 0.2 0.1 * *
Staphylococcus aureus 0.1 0.2 0.2 01.
Escherichia coli 0.1 0.2 0.1
Enterococcus faecalis 0.1 0.2
* Los tubos L4 y S6 se emplean como testigos.
• Asesórate con tu profesor(a) para reconocer los nódulos.

• Asegúrate que los nódulos queden bien lavados antes de macerarlos.
• Como en todas las prácticas: antes de iniciar, asegúrate de tener un diagrama de flujo
correctamente escrito de acuerdo al protocolo para calcular los tiempos de ejecución;
asimismo de tener todo el material debidamente etiquetado.
1. Los residuos de suelo y plantas serán colectados en un recipiente y desechados en una

jardinera.
2. Los residuos de las tinciones serán depositados en los recipientes destinados para tal fin.
3. Las pipetas se colocarán en solución desinfectante (pipetero) y posteriormente lavarlas con
agua y jabón.
(87)
PRÁCTICA 9.1 Mutualismo, Comensalismo, Antagonismo y Sinergismo

(2ª Sesión)
Resultados de asociaciones microbianas. Lectura e interpretación de resultados.
Materiales

Microscopio
Colorantes para la tinción de Gram

Mecheros
Gradillas
Asas
Portaobjetos
Marcador indeleble
Metodología
a) Mutualismo.
1. Observar el desarrollo de las placas, seleccionar colonias aisladas rosas y mucosas.
2. A partir de una de las colonias típicas seleccionadas, preparar un frote, aplicar la tinción de
Gram y observar al microscopio.
3. Comparar la morfología de las bacterias procedentes de la suspensión del macerado nodular,
con la morfología de las bacterias desarrolladas en las placas, esquematizar y registrar sus
dibujos.
b) Comensalismo.
1. Registrar el tiempo en el que apareció el desarrollo de cada uno de los microorganismos en
estudio.
2. Explicar las causas que determinan que una de las bacterias no se desarrolle en una de las
cajas.
3. Explicar las causas que determinan la diferencia de tiempo en que aparece el desarrollo de las
bacterias probadas.
c) Antagonismo.
1. Comparar el desarrollo de Bacillus subtilis en las cajas que previamente se inocularon con
Micrococcus luteus y Escherichia coli
2. Indicar las causas que determinan la presencia de un halo de inhibición y entre que
microorganismos se presentó este fenómeno.
d) Sinergismo.
1. Determinar en cuáles de los tubos se presentan cambios y registrar los datos
2. Explicar las causas que originan el fenómeno.
(88)
1. Después de realizar las lecturas correspondientes, esterilizar los tubos y cajas de vidrio en
autoclave y lavarlos.
2. En el caso de cajas de Petri de plástico proceder a sellarlas y colocarlas en el contenedor rojo
ubicado en el laboratorio 1A
1. Discute sobre las características microscópicas de las bacterias encontradas en los nódulos.
2. ¿Cómo reconociste las asociaciones microbianas que evaluaste en esta práctica?
3. ¿Qué asociación no fue posible reconocer? ¿Por qué?
4. ¿Qué metodología propondrías para poder observar competencia y depredación en el
laboratorio?

• Comité Nacional de la Fijación Biológica de Nitrógeno. 1984. Curso de Tecnología de
Rhizobium y Producción de Inoculantes. Manual de Prácticas. Facultad de Química, UNAM.,
Colegio de Postgraduados, Chapingo, fertilizantes Mexicanos, S. A., Universidad Autónoma
de Chapingo, CONACYT. México
Edición en español. Prentice Hall Iberia. España.
Hill. 992 pp
(89)
UNIDAD X. ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA EN UN

MICROAMBIENTE
Objetivos
Mediante el empleo de una columna de Winogradsky, el estudiante logrará:

• Aplicar e interpretar los conocimientos de las diferentes técnicas utilizadas para la
caracterización de microorganismos.
• Diferenciar los grupos microbianos presentes en un microambiente.
• Comparar los microorganismos que crecen a lo largo de la columna en diferentes tiempos.
• Relacionar la diversidad microbiana presente en un microambiente con algunas de sus
características fisiológicas.
• Explicar las causas que originan la sucesión de microorganismos observada.
Introducción
A diferencia de los estudios realizados por Luis Pasteur y Roberto Koch sobre cultivos puros, dos
famosos microbiólogos: Sergei N. Winogradsky (1856-1953) y Martinus Willem Beijerinck (1851-
1931), fueron los primeros en estudiar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos en un
mismo hábitat.
El estudio de las comunidades microbianas en condiciones de laboratorio puede realizarse fácilmente

en una columna de Winogradsky, la cual simula un microecosistema o microambiente que ilustra
cómo los microorganismos ocupan microespacios altamente específicos de acuerdo con sus
necesidades vitales, tales como: requerimientos de carbono, energía y oxígeno, así como la
interdependencia, de forma tal que la actividad metabólica de un microorganismo posibilita el
crecimiento de otros y viceversa. Estas columnas, que llevan el nombre del microbiólogo ruso que las
utilizó por primera vez, son sistemas completamente autoreciclables.
Las columnas de Winogradsky se preparan con muestras de suelo colectadas en ambientes

húmedos, las cuales son enriquecidas con compuestos orgánicos e inorgánicos y finalmente son
expuestas a una fuente de luz natural. En ellas se observa que después de 3 ó 4 semanas de
incubación aumenta la cantidad de los distintos tipos de microorganismos, mismos que de acuerdo
con sus características fisiológicas se establecen en las diferentes zonas a lo largo de la columna, lo
que se conoce como sucesión. De esta forma, el resultado es una columna estratificada (zonas de
diferente color) tanto en el suelo como en el agua, donde cada estrato se relaciona con un proceso
químico-biológico.
En la zona inferior de lodos se desarrollan organismos fermentadores que producen alcohol y ácidos
grasos como subproductos de su metabolismo. Estos productos de "desecho" constituyen el sustrato
para el desarrollo de bacterias reductoras de sulfato, las cuales como resultado de su metabolismo
liberan sulfuros que difunden a la zona superior oxigenada creando un gradiente en el que se
desarrollan bacterias fotosintéticas que utilizan el azufre.
Por encima de esta zona pueden desarrollarse las bacterias púrpura que no utilizan el azufre y que
obtienen su energía de reacciones luminosas, pero que emplean ácidos orgánicos como fuente de
carbono para su síntesis celular.
(90)
Finalmente, en la zona aerobia crecen las Cianobacterias y algas las cuales como producto de su
metabolismo liberan oxígeno. También pueden crecer bacterias que oxidan compuestos del azufre y
del nitrógeno hasta sulfatos y nitratos respectivamente. Todos estos grupos sintetizan su materia
orgánica a partir del CO2.
Actividades generales
1. Preparar una columna de Winogradsky.

2. Tomar muestras a distintos niveles de la columna para describir las variaciones en la
composición microbiana a diferentes tiempos.
3. Relacionar la sucesión microbiana que se establece en la columna con los requerimientos
de carbono, energía, oxígeno y metabolismo a lo largo del tiempo, durante 4 semanas.
4. Integrar los resultados obtenidos en los diferentes tiempos del muestreo.
(91)
PRÁCTICA 10.1 Instalación de la Columna de Winogradsky
Materiales
Muestras
Suelo o barro de un arroyo, lago, pantano o costa de mar o río (300 a 500 g de sedimento superficial).
Agua de estanque, río o asequía (1500 mL).
Material por grupo

4.0 g. de cada una de las siguientes sales minerales:
CaCO3 (o cáscara pulverizada de un huevo)
CaSO4
CaHPO4
Material por mesa

1 balanza granataria
Material que deben tener los alumnos (por cada cuatro equipos)
300 a 500g de muestra de suelo o barro de un arroyo, lago, pantano o costa de mar o río (sedimento
superficial o subsuperficial).
1 500 mL de agua de estanque, río o asequía.
1 recipiente alto de boca ancha, de paredes trasparentes, rectas y sin bordes. Se sugiere que sean
recipientes de plástico o de vidrio y que al menos sean tres veces más altos que ancho.
1 yema de huevo cocido
3 tornillos o clavos de hierro
Papel periódico finamente cortado
500 mL de medio mineral
3 m de cordón de nylon o hilo cáñamo
8 portaobjetos con muesca en uno de los extremos
1 varilla de vidrio de aprox. 20 cm
1 espátula
1 pliego de papel auto adherible transparente (20x20 cm)
Metodología
1. Colectar una cantidad de suelo, lodo o barro ricos en materia orgánica. Remover las piedras,
ramas o partículas grandes del material en estudio.
2. Adicionar al suelo 1 g de cada una de las sales, el papel finamente cortado y el huevo
desmenuzado. Mezclar hasta homogenizar completamente.
3. Colocar la mezcla en un recipiente adecuado hasta ocupar 1/3 del volumen total. Compactar
el suelo con la ayuda de una espátula a fin de eliminar las burbujas de aire (Figura 13)
4. Mezclar la muestra de agua con el medio mineral en proporción de 1:1.
5. Añadir la solución anterior a la muestra de suelo hasta llegar a una altura de
aproximadamente de 3 a 5 cm abajo del borde. Tener cuidado de no resuspender la muestra
compactada, para ello inclinar la botella y resbalar el agua lentamente por las paredes.
6. Agitar la solución con una varilla de vidrio para eliminar burbujas de aire.
7. Registrar el aspecto final de la columna (color del sedimento y del líquido).
(92)
8. Tomar 8 portaobjetos y hacerles unas muescas (Figura 12 2A). Sobre ellas amarrar un
extremo del hilo cáñamo de tal forma que se pueda jalar el portaobjetos con el otro extremo
(Figura 12 2B).
9. Colocar los 8 portaobjetos en una posición vertical a diferentes niveles, cuatro sobre el
sustrato inclinados contra la pared del recipiente dejando que el extremo de hilo suelto quede
suspendido fuera de la botella y cuatro en los primeros 10 cm de la superficie. (Figura 12 2C).
10. Colocar dos clavos (uno galvanizado y uno no galvanizado) al fondo, sobre el sustrato
amarrados de un hilo.
11. Marcar el nivel de agua y cubrir la boca de la botella con el plástico auto adherible. Hacer
algunas perforaciones para reducir la evaporación. Puede ser necesario reponer agua para
mantener el nivel original.
12. Incubar a temperatura ambiente (25 a 30°C) cerca de una ventana para que reciba la luz
solar.
2A. Portaobjetos 2B. Portaobjetos 2C. Forma en que deben

con muesca con hilo cáñamo colocarse los portabobjetos
dentro de la columna
Figura 12. Práctica 10.1. Secuencia de pasos para colocar los portaobjetos
con muesca en la columna de Winogradsky
agua
suelo
Figura 13. Práctica 10.1. Columna de Winogradsky instalada.
(93)
PRÁCTICA 10.2 Observaciones Microscópicas de la Diversidad

Microbiana en la Columna de Winigradsky (1ª Sesión)
Primera semana de incubación
Materiales
Material por mesa

Frascos goteros con los siguientes reactivos colorantes:
Azul de metileno (1:10000)
Verde de Janus (1:3000)
Verde de metilo (1:10000)
Rojo neutro (1:10000).
Solución de Ringers y de Noland’s
Alcohol-ácido acético (8:2)
Material por equipo

Pipetas graduadas de 5 ó 10 mL.
Pinzas largas de punta roma.
Microscopio.
Aceite de inmersión.
Colorantes para tinción de Gram.
Material para los alumnos por mesa

Mecheros
Portaobjetos con y sin muesca
Cubreobjetos
Asas
Propipetas
Piseta
Marcador indeleble
Metodología
1. Observar la columna y registrar, en el cuadro 25, los cambios físicos producidos con respecto
al aspecto inicial.
2. Remover dos portaobjetos (uno de la superficie y otro del fondo). Dado que los
microorganismos pueden colonizar ambos lados de los portaobjetos, es necesario limpiar una
de sus caras; observar los microorganismos sin teñir con los objetivos de 10x y 40x.
Posteriormente fijar con alcohol-ácido acético (8:2) durante 5 minutos a temperatura ambiente
y teñir con azul de metileno o safranina. Observar con el objetivo de inmersión, esquematizar
o fotografiar los microorganismos observados y registrar en el cuadro 26. Puede ser necesario
modificar las técnicas de fijación y coloración dependiendo del tiempo transcurrido. Recordar
que las bacterias son los primeros organismos en colonizar los portaobjetos, seguidos por las
algas, los protozoarios y algunos invertebrados.
3. Reemplazar los portaobjetos muestreados por unos nuevos.
(94)
4. Tomar muestras de los diferentes niveles de la columna, con una pipeta de vidrio, iniciando en
la superficie y terminando en la zona más profunda. Limpiar la superficie de la pipeta con un
algodón impregnado con una solución desinfectante y colocar la muestra en un tubo de
ensaye no estéril.
5. Hacer al menos 2 preparaciones de cada una de las muestras. Tener cuidado de enjuagar la
pipeta con agua corriente entre las distintas tomas de muestra. Al finalizar depositarla en el
pipetero.
6. Realizar de cada muestra una preparación húmeda y una fija y teñida.
a) Preparaciones húmedas: Colocar una gota de muestra en un portaobjetos y colocar un
cubreobjetos. Observar el tipo y la abundancia de los diferentes microorganismos, así
como su movilidad. Se recomienda este tipo de preparación sin teñir cuando las
muestras proceden de la zona aeróbica o superior, donde se encuentran con mayor
probabilidad algas, protozoarios y cianobacterias. En la segunda preparación colocar
la muestra, agregar una gota de algún colorante vital y colocar el cubreobjetos.
b) Preparaciones fijas y teñidas: Tomar una gota de muestra y realizar un frotis, teñir con
Gram o con tinción simple. Observar al microscopio.
7. Registrar y esquematizar en el cuadro 26 los distintos tipos de microorganismos observados.
• Evitar usar el objetivo de 100x en preparaciones donde la muestra esté muy gruesa (tierra,
grumos de tierra), ya que se podrían rayar las lentes.
• Las preparaciones húmedas deben ser trabajadas inmediatamente para evitar que se
deshidraten, de ocurrir esto se puede humedecer con un poco más de la misma muestra de
agua.
• Se recomienda que las observaciones físicas de la columna (apariencia) se realicen con luz
natural, y a la misma hora del día.
• Toma fotografías de la apariencia física de tu columna semanalmente.
(95)
PRÁCTICA 10.2 Observaciones Microscópicas de la Diversidad

Segunda semana de incubación y subsecuentes
Materiales
Material por mesa

Se ocuparán los mismos materiales indicados en la sesión anterior.
Material para los alumnos por mesa (esterilizar para la siguiente clase)
1 tubo de ensayo de 16x150 con 9 mL de solución salina isotónica (SSI).
Metodología
1. A partir de la tercera sesión y subsiguientes, repetir el procedimiento indicado en los incisos 1

a 3 indicados en la segunda sesión.
2. Registrar y esquematizar los cambios físicos de la columna, así como los distintos tipos de
microorganismos (emplear copias de los cuadros 25 y 26).
3. Comparar los esquemas e identificar los cambios físicos que tienen lugar en la columna a lo
largo del tiempo y describir la sucesión de los microorganismos.
4. En la cuarta semana se efectuará el estudio de nutrición y diversidad fisiológica (PRÁCTICAS
6.1 y 10.3) (Cuadro 27)
(96)
Cuadro 24. Observaciones físicas de la columna de Winogradsky durante 5 semanas de incubación.

Semana Zona de la Observaciones*
columna
* Sedimentación, color uniforme o presencia de bandas, formación de burbujas, olor característico (por ejemplo
olor a huevo podrido), etc.
(97)
Cuadro 25. Observaciones microscópicas de las primeras tres semanas de incubación de la

columna de Winogradsky.
Requerimientos Zona de la Tipo de Morfología Tinción de Esquemas**
de Oxígeno Columna organismos Gram*
observados
Zona
aerobia
Zona
anaerobia
*Sólo bacterias.
**Se pueden poner únicamente los números de las imágenes y por separado colocar los esquemas de los organismos
observados.
(98)
Cuadro 26. Características microscópicas y fisiológicas de los microorganismos presentes en la

columna de Winograsky después de la cuarta semana de incubación (Complementar con
PRÁCTICAS 6.1 y 10.3).
Requerimientos Zona de Tipo de Género Morfología y Esquemas** Características

de Oxígeno la organismos representativo Tinción de fisiológicas***
Columna observados Gram*
Zona
aerobia
Zona
anaerobia
*Sólo bacterias.
**Se pueden poner únicamente los números de las imágenes y por separado colocar los esquemas de los organismos
observados.
***Por ejemplo presencia de organismos amilolíticos, fijadores de nitrógeno, solubilizadores o mineralizadores de fósforo,
etc.
• Se recomienda que las observaciones físicas de la columna (apariencia) se realicen con luz
natural, y a la misma hora del día.
• Toma fotografías de la apariencia física de tu columna semanalmente.
(99)
10.3 Caracterización Fisiológica de la Diversidad

Cuarta semana de incubación
Objetivos
Al finalizar este ejercicio el estudiante será capaz de:

• Determinar las características fisiológicas de algunos microorganismos presentes en la
columna de Winogradsky.
• Relacionar las características fisiológicas observadas con la zona de muestreo de la columna
y su tipo de nutrición.
Introducción
Las bacterias y arqueas son microorganismos que presentan una diversidad metabólica asombrosa,
la cual es mantenida por la dependencia que existe entre los microorganismos y su ambiente; es
decir, las actividades de unos microorganismos favorecen el crecimiento de otros, pero también
ocurre que los productos metabólicos de unos inhiben el desarrollo de otros.
En la primera situación, se encuentra el cometabolismo de los microorganismos pertenecientes a los

ciclos biogeoquímicos, en los cuales la mineralización o solubilización de un elemento, así como la
oxidación o reducción del mismo dependen además de las condiciones ambientales.
La solubilización se define como la transformación de un compuesto de una forma insoluble

generalmente inorgánica a otra soluble en agua y por lo tanto disponible para los organismos y la
mineralización se refiere a la transformación de un compuesto en su forma orgánico a una
inorgánica.
Como se mencionó anteriormente, estas transformaciones se llevan a cabo mediante reacciones de

óxido reducción de elementos como el nitrógeno, azufre, etc., es por ello que algunas de ellas se
realizan en condiciones aerobias o anaerobias.
Dependiendo de su maquinaria enzimática, los microorganismos pueden emplear un elemento en

alguna de las formas en que se encuentran en la naturaleza.
Por ejemplo, aproximadamente un 80% de las moléculas de la atmósfera de la tierra están hechas
de dos átomos de nitrógeno que están unidos entre sí, (N2), sin embargo en esta forma sólo es
accesible a un conjunto muy restringido de formas de vida, como las cianobacterias y las
azotobacteriáceas. Los organismos fotoautótrofos (plantas o algas) requieren por lo general nitrato
(NO3–) como forma de ingresar su nitrógeno; los heterótrofos (p. ej. los animales) necesitan el
nitrógeno ya reducido, en forma de radicales amino, que es como principalmente se presenta en la
materia viva.
En el caso del fósforo, la mayoría de este elemento se encuentra en las rocas y en el suelo. Además
muchos de los fosfatos de la corteza terrestre son insolubles en el agua lo que hace que su
disponibilidad no sea la más adecuada para los seres vivos. De esta forma, durante el ciclo del
(100)
fosforo se produce la mineralización del fósforo, la solubilización de las formas insolubles así como la
asimilación de los fosfatos inorgánicos.
Las condiciones que favorecen la mineralización del fósforo son: un sustrato carbonado degradable y
la presencia de nitrógeno. En lo que se refiere a la solubilización, el fósforo se encuentra en continuo
movimiento desde su forma soluble a depósito de fósforo. Este proceso es realizado únicamente por
bacterias autótrofas que son las mismas que intervienen en el paso de ion amonio a ácido nítrico.
Finalmente, la asimilación se refiere a la transformación del fósforo inorgánico a fósforo orgánico a
través de diferentes seres vivos (en el agua las algas llevan a cabo se absorción, en el suelo las
bacterias se encargan de su fijación).
En lo que respecta al azufre, este elemento es abundante a lo largo de la corteza terrestre. Se

encuentra disponible como sulfato soluble o en compuestos orgánicos. En la biosfera se produce la
reducción del azufre a H2S por obra de microorganismos. La reacción de oxidación de la forma
reducida a sulfato es usada por bacterias anaeróbicas para el metabolismo.
El azufre forma parte de incontables compuestos orgánicos; algunos de ellos llegan a formar parte de
proteínas. Las plantas y otros productores primarios lo obtienen principalmente en su forma de ion
sulfato (SO4 -2). Estos organismos lo incorporan a las moléculas de proteína, y de esta forma pasa a
los organismos del nivel trófico superior. Al morir los organismos, el azufre derivado de sus proteínas
entra en el ciclo del azufre y llega a transformarse para que las plantas puedan utilizarlos de nuevo
como ion sulfato.
En el caso de los metabolitos que inhiben el crecimiento de otros, esta interacción recibe el nombre
de antagonismo o antibiosis.
Antibiosis se define como la producción por parte de un microorganismo de sustancias tóxicas para
otros microorganismos, las cuales actúan en bajas concentraciones (menores a 10 ppm.). Esta
interacción ha sido ampliamente estudiada y su antecedente más importante data del descubrimiento
fortuito de la penicilina. Actualmente la mayor parte de los antibióticos utilizados son producidos por
bacterias u hongos del suelo.
Materiales
Cultivos puros de las siguientes bacterias

Cepas de referencia :
Bacillus sp
Escherichia coli
Micrococcus luteus
Streptomyces sp
Material por mesa (Cuadro 28)

2 tubos de ensayo de 16x150 vacíos estériles
2 pipetas de 10 mL estériles
4 pipetas Pasteur estériles
Material que deben tener los alumnos

Mecheros
Asas
Tubo de ensayo de 16x150 vacío estéril
(101)
Pipeta graduada de 10 mL estéril

Pipeta Pasteur estéril
Varilla de vidrio en “L” estéril
Marcador indeleble
Cuadro 27. Material y actividades a realizar para la caracterización fisiológica de bacterias presentes
en la columna de Winogradsky.
Material por mesa Actividad por equipo
• 2 placas de EMB Microorganismos degradadores de:

• 2 placas de Agar sal manitol - lactosa
• 3 tubos con BHI fundido - manitol
Producción de sustancias antimicrobianas
• 1 placa de Leche descremada Presencia de microorganismos:
• 1 placa de Agar-almidón - Proteolíticos
• 1 placa de Ramos Callao con lecitina - Amilolíticos
• 1 placa de ramos callao con f fósforo - Mineralizadores de P
precipitado - Solubilizadores de P
• 1 placa con Agar-Lipman Presencia de microorganismos:
• 2 tubos con medio para amonificantes - Fijadores de N
• 2 tubos con medio para desnitrificantes - Amonificantes
- Desnitrificantes
• 2 tubos con medio para oxidantes de Sº Presencia de microorganismos:
• 2 tubos con medio para reductores de SO4= - Oxidantes de Sº
- Reductores de SO4=
Metodología
1. Tomar una alícuota del líquido superficial de la columna, con una pipeta estéril y transferirla a
un tubo vacío estéril (Muestra 1)
2. Tomar una alícuota del sedimento de la columna, con otra pipeta estéril y transferirla al 2º tubo
vacío estéril (Muestra 2).
3. Efectuar la observación de preparaciones en fresco procedentes de las muestras 1 y 2.
4. Registrar las observaciones en el cuadro 2.
a) Presencia de microorganismos degradadores de lactosa y manitol.

1. Con una pipeta Pasteur tomar una gota de la Muestra 1 y colocarla en el centro de cada una
de las placas de EMB y MSA.
2. Extender con varilla de vidrio en “L” estéril.
3. Repetir el procedimiento con la Muestra 2. Flamear la varilla antes de ser usada nuevamente.
4. Dejar que se absorba el inóculo en las placas y después invertirlas.
5. Incubar a 28°C y revisar a las 24 y 48 h.
b) Producción de sustancias antimicrobianas.

1. Colocar 0.1 mL de la Muestra 1 en una caja de Petri y 0.1mL de la Muestra 2 en la segunda
caja.
2. Verter el agar BHI fundido en cada caja y dejar solidificar.
3. Trazar 1 estría recta en la superficie del medio con cada uno de los siguientes
microorganismos: Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Micrococcus luteus, Escherichia coli
(Figura 14).
(102)
4. Repetir el procedimiento con la otra placa.

5. Dejar que se absorban los cultivos en las placas y después invertirlas.
6. Incubar a 28° C y revisar a las 24 y 48 h.
Figura 14. Práctica 10.3. Producción de sustancias antimicrobianas.

Distribución de las estrías de siembra.
c) Presencia de microorganismos proteolíticos, amilolíticos, mineralizadores y solubilizadores de P.

1. Tomar una gota de la Muestra 1, con una pipeta Pasteur y colocarla en el centro de cada una
de las placas de agar leche descremada, agar almidón, Ramos Callao con lecitina y con
fósforo precipitado.
3. Repetir el procedimiento con la Muestra 2. Flamear la varilla antes de ser usada nuevamente.
4. Dejar que se absorba el inóculo en las placas y después invertirlas.
5. Incubar a 28°C y revisar a las 24 y 48 h (proteolíticos y amililíticos) y a los 3 y 5 días
(mineralizadores y solubilizadores de P).
d) Presencia de microorganismos fijadores de nitrógeno, amonificantes, desnitrificantes, reductores y

oxidadores del azufre.
1. Tomar una gota de la Muestra 1, con una pipeta Pasteur y colocarla en el centro de la placa
de agar Lipman.
3. Dejar que se absorba el inóculo y después invertirla.
4. Colocar una gota de la Muestra 1 en cada uno de los tubos que contienen el medio para
amonificantes, desnitrificantes, oxidantes del azufre y reductores de sulfatos.
5. En los tubos con medio para oxidantes, agregar en condiciones asépticas 50 mg de flor de
azufre.
6. En los tubos con medio para reductores, agregar asépticamente limadura de hierro.
7. Repetir el procedimiento con la Muestra 2.
8. Incubar a 28°C y revisar a los 3 y 7 días (fijadores de N y desnitrificantes) y de 3 a 4 semanas
(oxidantes del azufre y reductores de sulfatos).
(103)
10.3 Caracterización Fisiológica de la Diversidad

Quinta semana de incubación
Integración de resultados de diversidad morfológica, interacciones microbianas y actividad

metabólica de algunos microorganismos presentes en la columna de Winogradsky
Materiales
Material por grupo

Frasco gotero con BaCl2 al 5.0%
Material por equipo

Microscopio
Colorantes para tinción de Gram.
Material que deben tener los alumnos

Mecheros
Asas
Portaobjetos
Cubreobjetos
Piseta
Marcador indeleble
Metodología
a) Degradación de lactosa y manitol.

1. Observar el desarrollo en las placas con EMB y MSA. Comparar la abundancia y diversidad de
colonias.
2. Realizar una preparación fija y teñida con Gram de al menos tres tipos de colonias de cada
medio.
b) Determinación de actividad proteolítica, amilolítica, mineralizadora y solubilizadora de P.

1. Observar el halo de solubilización del sustrato en las placas con agar leche descremada,
Ramos Callao con fósforo precipitado y con lecitina. Comparar la abundancia y diversidad de
colonias.
2. Realizar una preparación fija y teñida con Gram de al menos tres tipos de colonias de cada
medio.
3. Agregar lugol a las placas con agar almidón. Observar la coloración que se presenta a lo largo
de las estrías.
(104)
c) Presencia de microorganismos fijadores de nitrógeno, amonificantes, desnitrificantes, reductores y

oxidadores del azufre.
1. Extraer y observar los clavos o tornillos de fierro introducidos inicialmente en la columna.
2. Observar el desarrollo microbiano en las placas de agar Lipman:
i. Comparar la abundancia y diversidad de colonias.
ii. Realizar una preparación fija y teñida con Gram de tres tipos de colonias.
3. Realizar una preparación fija y teñida con Gram de cada uno de los tubos con medio para
amonificantes, desnitrificantes, oxidantes y reductores del azufre.
4. Agregar 2 gotas del reactivo de Nessler a los tubos con medio para amonificantes
5. En los tubos con el medio para desnitrificantes:
i. Observar si hay formación de gas en campanas de Durham.
ii. Agregar 2 gotas de la solución A y 2 gotas de la solución B del reactivo de
Griess
iii. Observar la presencia o ausencia de coloración rosada indicadora de la
presencia de nitritos en el medio de cultivo.
6. Con un papel indicador determinar el pH en los tubos que contienen el medio para oxidantes
de azufre o bien agregar unas gotas de BaCl2 (5.0%) y observar la formación de un
precipitado blanco.
7. Observar la formación de un precipitado negro en los tubos que contienen el medio para
reductores de sulfatos.
d) Producción de sustancias antimicrobianas.

1. Observar la formación de halos de inhibición alrededor los microorganismos de prueba.

2. Sumergir los portaobjetos usados en una solución sanitizante durante 10 minutos, lavar con
detergente, enjuagarlos y colocarlos en un frasco con alcohol al 95 %.
3. Esterilizar el material de vidrio (cajas y tubos) en los que realizó sus lecturas y posteriormente
lavar.
4. Sellar con maskin tape las cajas de Petri de plástico que contengan cultivos y colocar en el
contenedor ubicado en el laboratorio A.
5. Desechar la columna de Winogradsky. Reunir en una cubeta el lodo y agua y posteriormente
colocar en una jardinera.
(105)
Cuadro 28. Diversidad metabólica observada en microorganismos presentes en la columna de

Winogradsky.
Tipo de microorganismos Zona aerobia Zona microaerofílica Zona anaerobia
Bacterias G+ *
Bacterias G –
Anaerobios
Proteolíticos
Amilolíticos
Mineralizadores de P
Solubilizadores de P
Fijadores de N de vida libre
Amonificantes
Desnitrificantes
Oxidantes del S
Reductores de SO4=
Cuadro 29. Antagonismo observado en microorganismos presentes en la columna de Winogradsky.

Escherichia coli Pseudomonas sp. Micrococcus Staphylococcus
luteus aureus
Zona aerobia
Zona microaerofílica
Zona anaerobia
Indicar presencia (+) o ausencia (-).
Discusión e integración de resultados
Comparar los resultados de los microorganismos observados a diferentes tiempos y niveles de la

columna. Discutir con respecto a:
• ¿Se observa el mismo tipo de microorganismos? ¿En qué zonas y a qué tiempo de
incubación se observa la mayor cantidad y diversidad de protozoos, algas, bacterias
grampositivas y gramnegativas?
• ¿Qué tipos de nutrición se identificaron?
• ¿Qué requerimientos de oxígeno presentaron los microorganismos desarrollados?
• ¿Se observó la producción de sustancias antimicrobianas (antagonismo) entre los
microorganismos de prueba y los provenientes de la columna?
• ¿Qué características fisiológicas se observaron en las diferentes zonas de la columna?
Con la información anterior, relacionar las características fisiológicas detectadas con los tipos de
nutrición y los requerimientos de oxígeno determinados con la zona de la columna de la cual procede
la muestra, el color desarrollado y el tiempo de incubación.
(106)
GUÍA PARA LA INTERPRETACIÓN DE LA DIVERSIDAD Y SUCESIÓN MICROBIANA EN UNA

COLUMNA DE WINOGRADSKY
Después de cuatro a seis semanas de la preparación de la columna, se establecen tres tipos de

ambientes: el anaerobio, el microaerofílico y el aerobio, en donde se desarrollan comunidades
bacterianas específicas (Figura 15), organizadas en tres diferentes zonas a lo largo de la columna:
Zona anaeróbica
Se localiza en el fondo de la columna en donde crecen dos tipos de organismos: los que fermentan la
materia orgánica y los que realizan la respiración anaerobia, ambos descomponen la materia
orgánica y dan lugar a la formación de ácidos orgánicos, alcoholes y H2.
La fermentación es un proceso en el que los compuestos orgánicos son degradados de forma

incompleta (por ejemplo, las levaduras fermentan los azúcares a alcohol). La respiración anaeróbica
es un proceso en el que los sustratos orgánicos son completamente degradados a CO2, usando una
sustancia distinta del oxígeno como aceptor terminal de electrones (por ejemplo, nitratos o iones
sulfato).
El nivel más bajo de esta zona se caracteriza por formar un ambiente con alta concentración de H2S,
aparecen varios grupos diferentes de bacterias: por ejemplo, dependiendo del tipo de barro utilizado,
encontramos bacterias del género Amoebacter, bacterias púrpura del azufre portadoras de vesículas
de gas, las cuales aparecen formando una banda de color rosado.
En esta misma zona, en condiciones estrictamente anaerobias al cabo de unas semanas, y utilizando
la carga de celulosa aportada por los restos de papel incorporados en el sedimento como fuente
primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del género Clostridium. Todas las especies de
este género son anaerobias estrictas porque, aunque sus esporas pueden sobrevivir en condiciones
aerobias, las células vegetativas mueren si están expuestas al oxígeno. Por eso no empiezan a
crecer hasta que éste desaparece del sedimento. Estas bacterias degradan la celulosa a glucosa y, a
continuación, fermenta la glucosa para obtener la energía que necesitan, produciendo una serie de
compuestos orgánicos simples (etanol, ácido acético, ácido succínico, etc.) como productos finales de
esa fermentación.
Un poco por encima, las bacterias reductoras del azufre (representadas por Desulfovibrio) se
visualizan como una profunda capa negra. Éstas pueden utilizar los subproductos de la fermentación
para su respiración anaerobia, usando sulfato, u otras formas parcialmente oxidadas de azufre como
el tiosulfato, generando grandes cantidades de H2S en el proceso. Este H2S reaccionará con
cualquier hierro presente en el sedimento, produciendo sulfuro ferroso, que da color negro. Es por
esto que los sedimentos acuáticos son frecuentemente negros.
Zona microaerófila
No todo el H2S es utilizado, ciertas cantidades se difunden hacia arriba a lo largo de la columna de
agua y son utilizados por otros organismos que crecen en las zonas superiores.
Este crecimiento se visualiza bajo la forma de dos bandas estrechas, brillantemente coloreadas,
inmediatamente por encima del sedimento: en una primera franja, las bacterias verdes del azufre
(como Chlorobium) procesan los sulfatos a azufre y aparecen en una franja verdosa. En otras zonas
(107)
cercanas, bacterias como Gallionella procesan el Hierro formando una capa negra que se forma
justamente por debajo de la anterior. Un poco más arriba, algo más alejadas por tanto de las altas
concentraciones de sulfhídrico se desarrolla una zona de bacterias púrpuras del azufre, como
Chromatium, caracterizada por su color rojo-púrpura. Estas bacterias del azufre, verdes y púrpuras,
obtienen energía de las reacciones luminosas y producen sus materiales celulares a partir de CO2. En
gran medida, de manera muy similar a como lo hacen las plantas aunque, sin embargo, hay una
diferencia esencial: no producen oxígeno durante la fotosíntesis porque no utilizan H2O como
elemento reductor sino H2S.
Un poco por encima de esta zona nos encontramos una banda de bacterias púrpuras no del azufre,
microorganismos anaerobios fotoorganótrofos que sólo pueden realizar la fotosíntesis en presencia
de una fuente de carbono orgánico, por ejemplo Rhodospirillum y Rhodopseudomonas, que adquiere
un color rojo-anaranjado. Su mayor o menor abundancia dependerá de la cantidad de sulfhídrico que
se haya producido y de la cantidad que, no haya sido utilizada por otros organismos, difunda hacia
arriba, ya que su presencia inhibe a estas bacterias.
Zona aerobia
La parte superior de la columna de agua puede contener abundantes poblaciones de bacterias de

diferentes tipos. Son organismos aerobios que se encuentran generalmente en los hábitats acuáticos
ricos en materia orgánica (estanques poco profundos, arroyos contaminados, etc.). Suelen ser
flagelados o ciliados (protozoarios), lo que les permite moverse y establecerse en nuevas áreas.
Puede desarrollarse también microorganismos fototróficos diferentes procedentes directamente del
agua o del barro utilizado originalmente en el montaje de la columna. La superficie del barro puede
presentar en esta zona un ligero color castaño. Esta es la parte de la columna más rica en oxígeno y
más pobre en azufre.
Sin embargo, también aquí llegarán por difusión, procedentes del barro de zonas inferiores, ciertas
cantidades de H2S que será oxidado a sulfato por bacterias que oxidan azufre (como Beggiatoa y
Thiobacillus). Estas bacterias obtienen energía oxidando el H2S a azufre elemental y sintetizan su
propia materia orgánica a partir de CO2. Por esto se les llama quimioautótrofas.
En las zonas superiores pueden crecer también cianobacterias fotosintéticas, lo que se visualizaría
cómo un tapete de césped de color verde. Estas bacterias se caracterizan por ser las únicas que
realizan una fotosíntesis similar a la de las plantas. De hecho, hay poderosas evidencias de que los
cloroplastos de las plantas proceden de cianobacterias ancestrales que se establecieron como
simbiontes dentro de células de algún eucariota primitivo. De forma paralela hay también evidencias
igualmente fuertes de que las mitocondrias de los eucariotas actuales se derivaron de bacterias
púrpuras ancestrales por un similar sistema de endosimbiosis.

Edición en español. Prentice Hall Iberia. España.
(108)
• Seeley, H. W. Jr., VanDemark, P. J., Lee, J. J. 1991. Microbes in action. A Laboratory Manual
of Microbiology. W. H. Freeman and Company New York. Fourth Edition.
• Sinauer Associates and Sumanas, Inc.2002. The Winogradsky Column: An Animated Tutorial.
http://serc.carleton.edu/resources/2577.html
• Vullo, D., Wachsman, M., Alche, L. 2000. Microbiología en Práctica. Manual de técnicas de
laboratorio para la enseñanza de Microbiología básica y aplicada. Primera edición Editorial
Atlante S.R.L., Buenos Aires.
Figura 15. Guía para la observación e interpretación de la columna de Winogradsky.
(109)

Protocolos Lme

Cargado por

Información del documentohacer clic para expandir la información del documento

Copyright:

Formatos disponibles

Protocolos Lme

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Protocolos Lme

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL FACULTAD DE QUÍMICA

UNIDAD I. INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA 1. Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología

Al finalizar la práctica el estudiante será capaz de:

Reglamento de Seguridad e Higiene para los Laboratorios de la Facultad de Química.

Cuadro 1. Guía de observación para evaluar el cumplimiento de los Reglamentos de Seguridad e

- Marcar 4 cuando no se cumpla la acción

 Reglamento de Higiene y Seguridad de la Facultad de Química.2006.

UNIDAD II. TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA 2.1 Uso y Cuidado del Microscopio de Campo Claro

Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de:

El microscopio es una de las herramientas más útiles en Microbiología. Su utilización permite la

Material por equipo:

Material que deben tener los alumnos:

2.1.1 Cuidado del microscopio e identificación de sus componentes.

2.1.2 Enfoque de la preparación

• Nunca tocar las lentes con los dedos.

1. ¿Cuál es la importancia del uso del microscopio en el laboratorio de microbiología

PRÁCTICA 2.2 Preparaciones Microbiológicas (1ª sesión)

Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de:

Material por equipo:

Material que deben tener los alumnos:

2.2.1 Preparaciones húmedas

2.2.2 Gota pendiente

2.2.3 Preparaciones fijas

8. Dejar secar totalmente la preparación a temperatura ambiente.

2.2.4 Tinción simple

• Procura preparar un frote delgado y sin extender demasiado sobre el portaobjetos.

1. Después de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante 10 minutos en

1. ¿Qué diferencias encuentras en las observaciones al microscopio al realizar preparaciones

PRÁCTICA 2.2. Preparaciones Microbiológicas (2ª sesión)

2.2.5 Tinciones diferenciales

Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de:

La reacción a la tinción de Gram y de Ziehl-Neelsen se basa en la composición y estructura de la

Cultivos puros de las siguientes bacterias:

Material por equipo:

Material que deben tener los alumnos:

2.2.5 Tinciones diferenciales

b) Tinción de Ziehl Neelsen

Cuadro 2. Características microscópicas de bacterias, de acuerdo a la tinción de Gram y de Ziehl-

1. Después de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante 10 minutos en

1. Comparar los resultados obtenidos de la bacteria X con las cepas control

PRÁCTICA 2.2. Preparaciones Microbiológicas (3ª sesión)

Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de:

Cultivos puros de las siguientes bacterias:

Material por equipo

Material que deben tener los alumnos:

2.2.6 Tinciones selectivas

2.2.7 Tinciones negativas

• Procura no saturar con verde de malaquita la preparación para observar endospora.

1. Después de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante 10 minutos en

1. Distingue en tus preparaciones las endosporas de las esporas libres.

• Balows, A. 2005. Manual of Clinical Microbiolgy. 5ª edición. A. Society for Microbiology,

PRÁCTICA 2.3 Esterilización y Preparación de Medios de Cultivo

Al finalizar este ejercicio el alumno será capaz de:

Material por grupo:

Material por equipo:

Matraz Erlenmeyer de 250 o 300mL

Reglamento de Higiene y Seguridad de la Facultad de Química.2006.