DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES Y TOTALES EN TRES

MUESTRAS DE AGUA: RESIDUAL, POZO Y MINERAL

OVERALL FECAL AND TOTAL COLIFORMS IN THREE SAMPLES OF

WATER: WASTEWATER, AND MINERAL WELL

SULLCA ARAPA, EDER RAFAEL

Universidad Andina Nestor Caceres Velasquez – CAP. Ingenieria Sanitaria y Ambiental

RESUMEN: El grupo coliforme, es un conjunto de bacterias con ciertas características

biológicas - químicas especificas, las cuales están presentes mayormente en el sistema
digestivo de los animales como también en vegetales (semillas) y esparcidas por el suelo,
además, pueden utilizarse como indicadores de contaminación del agua. El análisis que se
realizo, determino la presencia y ausencia de coliformes fecales y totales en las tres
muestras diferentes de agua, como son: Agua residual, agua de pozo y agua mineral; a
partir de cultivar estos grupos de microorganismos en agares específicos con implementos
adecuados para su identificación. En la primera muestra mencionada, se obtuvo que el
total de muestras analizadas por dilución, presentan grupos coliforme, mas no se observo
lo mismo en las otras muestras de agua mineral y de pozo. La determinación de grupos
coliforme es una forma de identificar el grado de contaminación por excretas existente en
el agua.

PALABRAS CLAVE: Grupo coliforme, coliformes fecales, coliformes totales, agar, dilución,
inocularcion, incubación.

ABSTRACT: The coliform group is a set of bacteria with certain biological characteristics -
specific chemicals, which are present mainly in the digestive system of animals as well as
in plants (seeds) and scattered on the ground also can be used as indicators water
pollution. The analysis is performed, the presence and absence of fecal and total coliforms
in three different samples of water, such as: waste water, well water and mineral water
from these groups of microorganisms growing on specific agars tools suitable for
identification. In the first example above, we showed that the samples analyzed by
dilution, coliform groups, but there were not the same in the other samples of mineral
water and well water. The determination of coliform group is a way to identify the extent
of existing sewage pollution in water.
KEY WORDS: Group coliform, fecal coliforms, total coliforms, agar dilution, inocularcion,
incubation.

1.- INTRODUCCION:

El grupo coliforme, es un conjunto de bacterias con ciertas características biológicas -

químicas especificas, estas características, propias de cada organismo que integra este
grupo muestran que:

- Son organismos aerobios o anaerobios facultativos

- Son gran negativos
- Producen gas
- Fermentan la lactosa a 35ºC a 48h

Estas características son las relevantes de todos los miembros del grupo coliforme, la
bacteria principal de este grupo es la “Escherichia Coli”. De la cual deriva el nombre del
grupo en general. Estos microorganismos se encuentran de forma continua y general en el
sistema digestivo animal, específicamente en el intestino, por ende, es muy obvio
encontrarlos en zonas donde haya heces y en restos fecales de animales. A estos se les
llaman: “Coliformes fecales”, que al igual que los “coliformes totales”, forman parte del
grupo coliforme.

Coliformes fecales < coliformes totales = grupo coliforme

Estos microorganismos tienen una continua relación con el medio ambiente, puesto que,
en los lugares donde habita cualquier tipo de animal, existe coliformes, entonces estarán
expuestos a diferentes alteraciones producidas por estas bacterias, como: intoxicaciones y
enfermedades digestivas (mayormente).

Por otra parte, las bacterias coliformes que la lluvia arrastra, por el suelo, usualmente
quedan atrapadas por las rocas y a medida que el agua pasa por las rocas llega a los
sistemas de agua subterránea, sin embargo, los pozos que no están bien construidos, son
una puerta abierta para que estas bacterias contaminen el agua que se bebe.

El usar este tipo de análisis por coliformes resulta mucho mas sencillo y económico, a
comparación con el de buscar microorganismos específicos.

Para la detección de estos microorganismos, se utilizan medios de cultivos específicos, en

los cuales se les inocula una parte de la muestra a analizar, estos medios garantizan los
requerimientos nutricionales del grupo coliforme. Además, para analizar estos coliformes
se plantearon tres fases, la fase presuntiva, la fase confirmativa y la fase complementaria,
cada una de ella con una función especifica en la identificación y aislamiento de
microorganismos del grupo coliforme de las demás bacterias que están presentes en la
muestra.

2.- MATERIALES Y METODOS:

2.1.- Materiales y reactivos:

 Caldo lauril sulfato

 Caldo verde brillante bilis
 Caldo E.C.
 Envases de vidrio esterilizados
 Matraz Erlenmeyer
 Campanas de Durham
 Probetas
 Pipetas
 Tuvos de ensayo
 Agua destilada
 Mechero de alcohol
 Fiolas
 Papel Craft
 Gasa y algodón
 Detergente

2.2.- Métodos:

2.2.1.- Preparación de Materiales:

Se toman todos los materiales de vidrio, luego son lavados con agua y detergente
varias veces, posteriormente se enjuagan con agua de caño y luego con agua destilada,
esta ultima operación se debe de realizar múltiples veces para limpiar totalmente los
envases, si es posible esta limpieza puede hacerse también con agua bidestilada, esto para
obtener mejores resultados.

Paralelo a ello se realiza la creación de tapones para tuvo hechos de algodón y

gasa para facilitar la inoculación u observación de los medios de cultivo.
 Luego de lavar y enjuagar los materiales, los tenemos listos para un análisis físico-
químico, o para una preparación de químicos, como ha de ser la preparación de los tres
tipos de caldos que nos servirán de medio de cultivo.

2.2.2.- Preparación de medios de cultivo:

- Preparación del caldo lauril sulfato:

Según las condiciones del fabricante de este caldo, la relación entre la porción de
caldo y agua es la siguiente:

35.6gr. ----------------------------------> 1000mL

Xgr. ------------------------------------> 600mL

35.6 x 600
 X= => X= 10.68gr.
1000

El volumen de 600mL, proviene de la cantidad de 60 tubos de ensayo a utilizar,

multiplicado por 10mL que es el volumen de cada tubo.

- Preparación del caldo verde brillante bilis:

Según las condiciones del fabricante de este caldo, la relación entre la proporción
de caldo y agua es la siguiente:

40gr. --------------------------------->1000mL
Xgr. ---------------------------------> 240mL

240 x 40
 X= => X= 9.6gr
1000

- Preparación del caldo E.C:

 Según las condiciones del fabricante de este caldo, la relación entre la proporción
del caldo y agua es la siguiente:

37gr. -------------------------------> 1000mL

Xgr. -------------------------------->110mL

37 x 110
 X= => X= 1.07
1000

Luego de esta preparación de los medio de cultivo en caldos, se procedió a distribuir parte
de estos a cada tubo de ensayo, cada uno con una campana de Durham que es el
accesorio indispensable para identificar la existencia de coliformes en nuestras muestras
de agua, así formamos nuestros medios de cultivo específicos, que luego de ellos serán
cubiertos con los tapones creados con algodón y gasa, entonces se les envolvió con papel
craft para su seguida esterilización.

2.2.3.- Esterilización de medios de cultivo:

Los medios de cultivo preparados anteriormente, poseen microorganismos propios del

ambiente, los cuales afectarían nuestro objetivo general, motivo por el cual, este paso nos
lleva a esterilizar estos medios de cultivo dentro de un autoclave. (la esterilización se a de
realizar antes del cultivo de bacterias).

Las condiciones de esterilización son las siguientes:

15 Lb/cm² por 15 a 20 minutos a una temperatura de 121 ºC.

En las características antes mencionadas, se elimina a toda bacteria presente en nuestros

medios de cultivo.

Luego de la esterilización en autoclave, se procederá a inocular nuestras muestras de agua

con diluciones de: 1/1, 1/10, 1/100, 1/1000

2.2.4.- Inoculación:

Este paso consiste en la introducción de parte de nuestra muestra de agua con

microorganismos a los medio de cultivo para que se desarrollen, para realizar la
inoculación primero se prepararon diferentes muestras así:

- Para nuestras tres muestras de agua:

 Tomamos 1 sorbo de 3mL en una jeringa, de la muestra de agua que tenemos en el
envase de vidrio y lo inoculamos en un tubo que contenga caldo lauril sulfato, se
repite este procedimiento dos veces mas hasta tener un grupo de tres tubos
inoculados, este grupo de tres tubos serán denominados disolución de 1/1.

Luego del envase de vidrio que contiene nuestra muestra problema, tomamos en
otra jeringa 10mL del agua y la pasamos a un matraz que contiene 90mL de agua
destilada, entonces este matraz tendrá una dilución de 1/10, de este matraz y con
la misma jeringa traspasamos 1mL de la solución a cada tubo de un conjunto de 3
tubos que contiene caldo lauril sulfato, entonces la inoculación de 1/10 ya había
terminado.

Posteriormente, del matraz de dilución 1/10, tomamos otros 10mL para pasarlo a
otro matraz que también contiene agua destilada en 90mL, entonces se había
formado una dilución de 1/100, y también de la misma forma anterior, sacamos
1mL de solución para cada tubo de una serie de 3 tubos, entonces la inoculación
de 1/100 había terminado.

Por ultimo del matraz de dilución de 1/100 se tomo 10mL de muestra combinada y
se paso dicha cantidad a un tercer matraz que al igual que los anteriores también
contenido de agua destilada en 90mL, entonces se formo la ultima dilución:
1/1000, de aquí también se tomaron 3mL de los cuales se pasaron de 1 en 1 a una
serie de tres tubos que formaron la dilución en tubos de 1/1000.

Luego de esta inoculación a cada tubo, se procedió a una incubación para que los
microorganismos desarrollen en condiciones optimas y adecuadas a su medio.

El mismo método es aplicado para todas las muestras de agua pero con diferentes
jeringas para no alterar los resultados que podamos obtener.

2.2.5.- Incubación:

El proceso de incubación consta de dos etapas:

- La primera etapa es de 24h a 35ºC, en esta etapa se han de haber formado los
primeros indicadores de grupos de coliformes, en caso no verse resultados
entonces se pasa ala segunda etapa.
 - Esta segunda etapa consta de seguir incubando los medios hasta pos 48h a 35ºC,
como tiempo máximo por que de no haber resultados, entonces la muestra no
presenta coliformes fecales ni totales dentro de su medio.

- A partir de los resultados obtenidos luego de este experimento se podrá

determinar el número de coliformes por medio del NMP.

2.2.6.- Lectura:

- Esta etapa solo consta de analizar los tubos con nuestro cultivo y aceptar o descartar
los posibles medios que tengas grupos de coliforme, es decir analizamos los resultados:
gas positivo y gas negativo; de estos solo tomaremos los resultados: “gas positivos”, por
que se sabe que los coliformes totales tienden a producir gas.

2.2.7.- Prueba confirmativa:

- Todos los pasos anteriores pertenecen a la prueba presuntiva, es decir, solo

determinación de coliformes totales, la siguiente prueba muestra la presencia
positiva o negativa de coliformes fecales dentro de la muestra analizada.

- Los coliformes Fecales tiende a fermentar la lactosa, y también producir gas,

entonces debido a la ausencia de algún caldo que presente lactosa en su
composición, solo se analizo la producción de gas de las bacterias a partir del caldo
verde brillante bilis, pues este medio aun inhibe y elimina la presencia de bacterias
del tipo gram positivas que también puedan emanar gases pero que no tiene nada
que ver con el grupo coliforme.

- Este procedimiento se llevo a cabo, tomando 10 micras del caldo lauril sulfato que
contenía microorganismos fecales no puros, estas 10 micras fueron tomadas
gracias a un asa de Colli, luego de la segunda inoculación, también se llevo a
incubadora las muestras con caldo verde brillante, entonces la incubación es solo
de 24h. a las mismas características antes mencionadas.
3.- RESULTADOS:

Los resultados que obtuvimos, dependieron del trabajo en el primero caldo, es decir:

- En el caldo de lauril sulfato, todos nuestros tubos presentaron presencia de

produccion de gas, debido a que las campanas de Durham presentes en el interior
de nuestro tuvo, ascendieron por el gas que los mircroorganismos preoducieron,
entonces de nuestros 4 grupos de 3 tuvos de ensayo a diferente dilucion,
solamente seria necesaria el analisis de 3 de estos grupos, entonces, los resultados
obtenidos los plasmamos asi:

 En el conteo de tuvos con rpesencia de gas, se obutvo el siguiente orden:

3 – 3 – 3.

 Este orden a de ser analizado en la tabla de determinacion del NMP.

Según este material, el NMP es de 2 400.

Resolviendo y reemplazando el dato obteniedo en nuestra formula de

NMP/100mL.

10
2400x = 24000 NMP/100mL.
1

El resultado obtenido nos muestra la cantidad de coliformes presentes en

el agua a rango de 100 mL de muestra problema.

 Una vez separados estos tuvos con produccion de gas (15), se procede a
analizar la produccion de gas en el segundo caldo, que es aun mucho mas
selectivo que el anterior, hablamos del caldo: Verde Brillante Bilis; en este
caso, la produccion de gas si se llevo a cabo, pudiendo asi confirmar la
presencia de coliformes fecales y totales dentro de la muestra de agua
residual, en cambio, en las otras 2 muestras no hubo produccion de gas en
ninguno de los dos caldos, solo se denoto una pequeña turvidez en la
muestra de agua de pozo, esta podria ser producida por otros
microorganismos, exepto los coliformes, por ende estas muestras restantes
las separamos de nuestro tema especifico.
4.- DISCUSIÓN:

- Cabe mencionar, que los resultados obtenidos eran los esperdos por todos,
claro esta en cuanto al agua residual, pero seria necesario un anilisis mas
minucioso en lo que respecta al analisis del agua de pozo, por que, podemos
intuir la presencia de coliformes dentro de estas aguas, pero tendrian que
hacerse en diluciones mucho mas pequeñas 1/10000, 1/100000, etc.

- Por ultimo la presencia de un medio de cultivo que contengas lactosa es

indispensable, puesto que, solo este azucar, es un asegurados de al repsencia
de coliformes fecales, ya que estos microorganismos tienen la capacidad
defermentar este azucar de leche, el haber usao el cado VBB es un
seleccionador no eficiente, por que tambien hay otros organismos gram
negativos en cualtquier tipo de ambiente, estos pudieron tambien ser los
productores de una cantidad del gas de las campanas de Durham.

5.- BIBLIOGRAFIA:

- Manual de los porductos BBL y laboratorios productores.6ta edition. Editado por

Power D.;A.y McCuen P. J.. Cockeysville. Maryland. 1988.

- Introducción a la microbiología del agua. Distribución de microorganismos en

ambientes acuáticos. Laboratorio de Microbiología. Instituto de Investigación y
Análisis alimentarios. Universidad de Santiago de Compostela. 1.995

- Métodos microbiológicos rápidos para análisis de aguas y alimentos. Editado por

Borrego, J. J. . Secretariado de Publicaciones e Intercambio Científico.Universidad
de Málaga 1.992