Comité Editorial: González Andrade, M.; Hernández Alcántara, G.; Martínez González, J.J.

;
Ramírez Silva, L.H. y Vilchis Landeros, M.M.
© ISSN-0188-137X

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MENSAJE BIOQUÍMICO
Mens. Bioquím. 45 (2021) 35-47

Memoria del XLVIII Taller de Actualización Bioquímica, Facultad de Medicina; UNAM

Purificación de proteínas.
Protein purification.

Ramírez-Carreto, Santos1; Miranda-Zaragoza, Beatriz1,2 y Rodríguez-Almazán, Claudia*1,2.

1. Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnología, UNAM.

2. Departamento de Micro y Nanotecnologías, Instituto de Ciencias Aplicadas y Tecnología, UNAM

*Correspondencia. Instituto de Biotecnología, UNAM Av. Universidad # 2001 Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos, México.
CP. 62210 Tel. +52 (55) 56 22 86 02, claudiar@comunidad.unam.mx

Resumen Abstract
El desarrollo e innovación de técnicas que permitan The development and innovation of techniques that
un estudio cada vez más detallado de las proteínas, allow an increasingly detailed study of proteins
diverge en dos direcciones, hacia el conocimiento diverge in two directions, towards the basic
básico para conocer su papel en diferentes procesos knowledge to know their role in different cellular
celulares, y en otro sentido sus aplicaciones en las processes. In another sense, its application in the
áreas de la biomedicina, biotecnología y areas of biomedicine, bio- and nanotechnology.
nanotecnología. Las técnicas de purificación de Protein purification techniques play a fundamental
proteínas juegan un papel fundamental en estas role in these areas, the basis being the prior
investigaciones, tomando como base el knowledge of these biomolecules to determine the
conocimiento de las propiedades de estas purification protocol. A protocol to purify a protein
biomoléculas para determinar el protocolo de starts from choosing the biological sample, the
purificación. Un protocolo para purificar una method and its condition to lyse the cells to expose
proteína se inicia seleccionando la muestra biológica, the proteins, and inevitably together with all the
el método y la condición para lisar las células con la components of the cell, biomolecules, metabolites
finalidad de exponer a las proteínas, inevitablemente and fragments of cellular structures. From this
obteniendo una mezcla de estas junto con todos los moment on, it is imperative to keep the protein of
componentes de la célula, biomoléculas, metabolitos interest in optimal conditions to preserve its function
y fragmentos de estructuras celulares. A partir de este and structure. The methods for protein purification
momento, es imperante mantener a la proteína de can be listed based on protein properties: by
interés en condiciones óptimas que le permitan molecular weight (gel filtration chromatography), by
preservar su función y estructura. La gama de charge (ion-exchange chromatography) by
métodos para la purificación de proteínas la podemos hydrophobicity (precipitation by salts or solvents,
enlistar con base a estas propiedades; los métodos hydrophobic interaction chromatography or reverse-
más comunes están basados en: purificación por peso phase) by affinity to a ligand (chromatography
molecular (cromatografía de filtración en gel), por affinity). Polyacrylamide gel electrophoresis and
carga (cromatografía de intercambio iónico), por protein quantification methods go in each
hidrofobicidad (precipitación por sales o solventes, purification step to analyze the protein purity and
cromatografía de interacción hidrofóbica o fase yield. Finally, the conditions to preserve the pure
reversa), por afinidad a un ligando (cromatografía de protein must be defined, again, considering its
afinidad). La validación de cada técnica en un biochemical properties. The success of a protein
protocolo de purificación se basa en el uso de algunas purification consists of prior knowledge of the
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de las variantes de la electroforesis en gel de protein of interest, the foundation of technique,

poliacrilamida y cuantificación de proteínas. El éxito detailed analysis of each step, principally,
de una purificación de proteínas consiste en la persistence and patience.
paciencia, orden, y conocimiento previo de la
proteína de interés, del fundamento de cada técnica,
análisis detallado de cada paso, y sobre todo
persistencia.

Palabras claves: proteínas, cromatografía, Keywords: proteins, chromatography,

electroforesis, extracto. electrophoresis, extract.

Introducción protocolo para purificación, así como las condiciones

específicas en cada uno de ellos.
El auge de la aplicación de moléculas
polipeptídicas (péptidos y proteínas) en diferentes En este trabajo se describirán, de manera general,
áreas de la ciencia, ha marcado el rumbo de la las etapas a considerar para establecer un protocolo de
innovación de técnicas para la purificación de estas purificación de proteínas. La manera como se
biomoléculas. El conjunto de técnicas para purificar presentan las técnicas es con base a la secuencia que
moléculas polipeptídicas se ha convertido en un se sigue para una purificación convencional, llegando
campo de estudio amplio. Contar con una proteína a un punto en que cada protocolo puede divergir
pura permite, de manera directa y específica, la dependiendo de las características bioquímicas de la
caracterización de su función, estructura, estabilidad, biomolécula de interés, así como el objetivo de cada
la interacción con otras biomoléculas, con la finalidad investigación.
de comprender los procesos moleculares y celulares.
Asimismo, se explora la posibilidad de su aplicación Conocimiento de las características bioquímicas de
en la biotecnología, biomedicina, nanobiotecnología, las moléculas polipeptídicas
entre otras áreas.
Las proteínas son biomoléculas abundantes en los
Las biomoléculas polipeptídicas, péptidos y sistemas vivos, realizan una gran variedad de
proteínas, son cadenas formadas por aminoácidos, los funciones esenciales, por lo que se les considera como
cuales contienen dos grupos funcionales. En uno de protagonistas en gran número de procesos
los extremos se localiza un grupo amino (+NH2) y en bioquímicos para el mantenimiento y función de cada
el otro extremo un grupo carboxilo (-COOH), además organismo. La purificación de proteínas permite su
de una cadena lateral que determina la característica estudio de manera individual, lo que ha permitido
físico- química de cada uno de los aminoácidos conocer su función biológica, además de que brinda la
existentes en la naturaleza. La unión entre los oportunidad de su enfoque en aplicaciones
aminoácidos es mediante un enlace covalente llamado tecnológicas.
enlace peptídico, en el que interacciona el grupo
amino de un aminoácido con el grupo carboxilo de El primer paso en el estudio de una proteína se
otro aminoácido [1, 2]. basa en la investigación exhaustiva de las propiedades
bioquímica y físico- químicas, secuencia de
La cadena formada por aminoácidos requiere aminoácidos, carga, peso molecular, hidrofobicidad,
plegarse, es decir adquirir su conformación nativa, con función, incluso qué moléculas y parámetros físico-
la finalidad de generar una estructura y función químicos pueden modificar estas propiedades y el
determinada [2]. Las propiedades particulares de cada mecanismo por el cual llevan a cabo esta alteración de
polipéptido son determinantes en el manejo de las la molécula.
diversas técnicas para su caracterización bioquímica.
Las técnicas para purificar una proteína se La función de la proteína de interés es
determinan a partir de una o varias de estas determinante durante el proceso de purificación.
propiedades, como son la carga, el peso molecular, la Considerando que la muestra se dividirá en fracciones
hidrofobicidad, la especificidad por algún ligando, a lo largo de todo el proceso de purificación, la
principalmente [3]. Por lo que es fundamental conocer identificación de la proteína de interés será mediante
a profundidad, todas o la mayor parte de estas su función, o alguna característica que se pueda
propiedades para precisar los pasos a seguir en un monitorear de manera sencilla, rápida, reproducible y
económica. El ensayo que se determine para llevar a

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cabo esto, deberá estandarizarse antes de iniciar con la el amortiguador, los restos celulares se separan
obtención del extracto. mediante la centrifugación. La centrifugación consiste
en someter la muestra a una fuerza centrípeta a una
Partiendo de esta información se inicia con el velocidad determinada, con lo que se logrará que las
planteamiento de las técnicas para purificar a la partículas más pesadas se concentren al fondo del
proteína, e incluso determinar las condiciones en que contenedor de la mezcla. Finalmente, la muestra se
se trabajará cada técnica. Sin duda, esta información decanta para separar la parte soluble (donde se
es fundamental como primer paso en la purificación encuentra la proteína de interés) de los fragmentos
de proteínas, una decisión errónea por la falta de celulares (Figura 1). La Tabla 1 describe el
información de la proteína de interés puede ser fundamento de algunos métodos para la preparación
fatídico, debido a la posibilidad de perder la muestra de un extracto, así como el tipo de célula en el que se
biológica, tiempo y recursos materiales. pueden aplicar y algunos aspectos que deben
considerarse [4, 6–8].
Preparación de un extracto
Durante el proceso de purificación de una proteína
La purificación de una proteína parte de las se deben considerar dos aspectos importantes:
características del sistema biológico donde se sintetice
(produzca), sea una célula eucariota o procariota, así 1. Estandarizar un protocolo que abarque el menor
como la localización de la proteína dentro de la célula, tiempo posible, por lo que se deben considerar el
citoplasma, membrana celular, organelo, periplasma menor número de pasos que permitan obtener la
(espacio existente entre la pared y membrana mayor cantidad de proteína pura, y sobre todo que
plasmática de las bacterias Gram negativas) [4, 5]. mantenga su función y estabilidad.

La preparación de un extracto se inicia al 2. La muestra debe mantenerse siempre a cuatro

determinar el amortiguador o solución química con grados Celsius. Esto es con la finalidad de reducir
sales específicas y pH definido, los cuales se la actividad de las proteasas y procesos químicos
establecen a partir de las propiedades bioquímicas, que desencadenen la ruptura del enlace peptídico,
función de la proteína de interés, y la meta de la el cual puede ser resultado no sólo de la acción de
investigación. El siguiente paso es definir el método las proteasas.
para lisar (romper) a las células que contienen a la
proteína de interés. De manera general se consideran Cuantificación de proteínas
dos métodos para este paso, métodos mecánicos y
químicos [6, 7]. Una manera de evaluar el protocolo de
purificación es conociendo la cantidad de proteína
Entre los métodos mecánicos se enlistan la total de la muestra, desde que se clarifica el extracto
homogenización, sonicación, ciclos de congelado- hasta que se obtiene pura (rendimiento expresado en
descongelado y uso de presiones altas [7, 8]. En los porcentaje). Los métodos para cuantificar a la proteína
métodos químicos siempre se usará un compuesto se clasifican en colorimétricos y no colorimétricos.
químico para producir la lisis mediante un choque Ambos métodos se fundamentan en la ley de Beer y
osmótico, detergentes, disolventes orgánicos, entre Lambert, la cual se basa en la transmitancia y
otros. absorbancia de la incidencia de un haz de luz a través
de una muestra [9].
El rompimiento de las membranas celulares
permite la interacción de la proteína de interés con Los métodos no colorimétricos se basan en la
proteínas de la misma célula que tienen la capacidad detección de la proteína al incidir un haz de luz
de romper los enlaces peptídicos (enzimas proteasas). ultravioleta con una longitud de onda de 210 o 280 nm.
Por lo que es fundamental añadir en el amortiguador Esto se consigue mediante un equipo que se llama
inhibidores de proteasas, para mantener la integridad espectrofotómetro, observamos la detección mediante
de las proteínas [6, 8]. una gráfica (espectro). Con la longitud de onda de 210
nm se detecta el enlace peptídico, mientras que a una
Lo que se obtiene en este paso es una solución con longitud de onda de 280 nm se detecta el aminoácido
una mezcla de especies químicas (biomoléculas, triptófano presente en la mayor parte de las proteínas
metabolitos, etc.), fragmentos de membranas descritas hasta ahora. Este método se recomienda para
celulares, y en algunos casos de pared celular, como proteínas puras, ya que se considera el coeficiente de
es el caso de las plantas. El siguiente paso es clarificar extinción molar (es un parámetro específico para cada
el extracto, es decir, si nuestra proteína es soluble en proteína) para obtener la cantidad de proteína [10–13].

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Figura 1. Obtención de un extracto proteico. El primer paso (1) consiste en elegir la muestra biológica de partida, esta puede ser células
en suspensión (cultivo) o tejido total. Después (2) se requiere seleccionar la solución amortiguadora adecuada para realizar la ruptura del
tejido y la extracción de la proteína total en su forma soluble sin afectar las características estructurales y funcionales de la proteína de
interés. En este paso se recomienda trabajar a 4ºC, de forma rápida y en presencia de inhibidores de proteasas para proteger a las proteínas
de la degradación. Determinar el método que se empleará para lisar la membrana celular (3). Estos métodos pueden ser físicos como (A)
la homogenización manual o mecanizada, (B) la sonicación o ciclos de congelación y descongelación (C), o bien ser químicos como el uso
de detergentes como el Tritón X-100 (D) o la lisis por choque osmótico, por ejemplo, los eritrocitos al diluir su medio con agua y hacer
más hipotónica la solución en la que se encuentran hasta generar que se hinchen y revienten (E). Se puede emplear más de un paso de
extracción y la combinación de métodos químicos y físicos. El aclaramiento (4) consiste en separar fragmentos celulares de las proteínas
solubles mediante centrifugación. Finalmente se cuantifica la cantidad de proteína en el extracto usando un espectrofotómetro (5). El
extracto es la muestra (6) de la que se parte para aplicar una o varias técnicas de purificación de proteínas. Figura realizada en
BioRender.com

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Tabla 1. Métodos físicos y químicos para la obtención del extracto proteico.

Tipo de
Método Fundamento Comentarios
muestra
Métodos Físicos

En la sonicación se aplica energía sonora (ultrasonido)

Es ideal para obtener proteínas
mediante una sonda vibratoria sumergida en el líquido donde Células
citoplasmáticas. Es importante
se encuentra la suspensión celular. Este tipo de energía eucariontes y
Sonicación mantener la muestra en hielo para evitar
mecánica agita las partículas en el líquido generando la procariontes
que el calor generado durante el
ruptura de las membranas celulares y la liberación del en suspensión
procedimiento desnaturalice las
contenido celular al medio.
proteínas de interés.
La homogenización puede ser realizada empleando distintos
instrumentos como una licuadora o un politrón que emplean
Tejidos de El proceso es muy sensible y se debe
navajas, perlas de vidrio y un agitador, prensa francesa,
plantas, tener cuidado para evitar dañar los
Homogenización homogeneizador de vidrio tipo Potter-Elvehjem. En todos
hongos o componentes sub-celulares que se está
los casos se busca triturar el tejido y/o someterlo a presiones
animales tratando de aislar.
altas con la finalidad de romper las células mecánicamente.

Involucra el congelamiento de las células en un baño de hielo

seco/etanol o en un congelador siguiendo el
Ciclos de descongelamiento del material a temperatura ambiente o a Extractos Se requieren de múltiple ciclos para que
congelado y 37°C. La formación de los cristales de hielo generan la celulares la lisis se lleve a cabo de manera
descongelado ruptura de la membrana celular haciéndola más permeable y acuosos eficiente.
potenciando la liberación de su contenido.

Métodos Químicos

En este método las células son expuestas a una solución

Choque Es uno de los métodos más suaves para
hipotónica lo que genera que las células se hinchen y se Eritrocitos
osmótico generar la lisis celular junto con los
rompan. Se puede aplicar una agitación mecánica suave para
ciclos de congelado y descongelado.
favorecer la lisis.

Los detergentes rompen la barrera lipídica de las membranas Los detergentes no iónicos y bipolares,
Células
solubilizando las proteínas e interrumpiendo la interacción como los de la serie Tritón-X, son más
animales y
Detergentes lípido-lípido, lípido-proteína y proteína-proteína. Los suaves y menos desnaturalizantes, por
bacterianas en
detergentes, al igual que los lípidos, se asocian entre ellos y lo cual, son comúnmente empleados
suspensión
se unen a superficies hidrofóbicas. Se componen de una para estos fines.
cabeza polar hidrofílica y una cola no polar hidrofóbica.

Algunas células poseen, a parte de la membrana plasmática, Levaduras,

Para plantas pueden ser utilizada la
una pared celular rígida que confiere a las células forma, plantas y
Enzimáticos celulasa, para hongos quitinasas y en
protección y rigidez. Estas paredes pueden ser digeridas con bacterias en
bacterias lisozima.
enzimas específicas. suspensión

Referencias [3,6 y 7]

Los métodos colorimétricos se basan en el uso de se debe construir una gráfica conocida como “Curva
un colorante, el cual interacciona químicamente y de de calibración”, en la que se grafican concentraciones
manera específica e irreversible con algunos determinadas de albúmina sérica de bovino (BSA) y
aminoácidos presentes en las proteínas. La intensidad su respectiva absorbancia. A partir de un volumen
del color determina la cantidad de proteína, es decir, definido de la muestra problema se extrapolarán sus
si la mezcla de la muestra tiene un color claro denota valores de absorbancia para determinar su
una cantidad pequeña de proteínas, mientras que un concentración de proteína, otra alternativa es mediante
color intenso refiere la presencia de una alta la ecuación de la gráfica (recta). Los métodos
concentración de proteína en la muestra. colorimétricos se ensayan con un volumen
determinado de la muestra, de tal manera que no se
Los métodos colorimétricos más comunes son los expone el extracto al colorante. Los métodos
ensayos de Bradford, Lowry y ácido bicinconínico colorimétricos se recomiendan para muestras con una
(BCA) [10–12]. Cada método se convierte en un proteína pura y con muestras de varias proteínas.
análisis cuantitativo al medir la intensidad de color Al elegir el método para cuantificar la cantidad de
mediante la absorbancia de luz visible a una longitud proteína, se debe considerar la sensibilidad,
de onda determinada. Siempre en este tipo de técnicas reproducibilidad y costo del método. La

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compatibilidad de cada método con la muestra un gradiente de pH, cada proteína migra hacia la
depende de las condiciones (amortiguador, pH y región con carga eléctrica opuesta [15].
pureza) en las que se encuentra la proteína de interés,
composición de aminoácidos y otros componentes de La detección de proteínas en la matriz de
la muestra que puedan interferir con cada método. poliacrilamida se logra mediante colorantes que se
unen de manera específica a las proteínas, entre los
Electroforesis en gel que se encuentran son el azul de Coomassie G250, la
plata y reactivos fluorescentes como Deep PurpleTM
Para tener una idea de la complejidad del extracto, y SYPRO Ruby. Las proteínas se observan en el gel
es decir, conocer aproximadamente la cantidad de como líneas (bandas) de diferente intensidad,
proteínas que están presentes en la muestra, así como determinada por la cantidad de proteína total en cada
el tipo de proteínas con base en su peso molecular y banda, teniendo en cuenta que cuando la proteína aún
carga, las proteínas que conforman el extracto se no está pura, en cada banda podemos encontrar desde
pueden analizar mediante la técnica de electroforesis una hasta decenas de diferentes proteínas [10, 14, 15].
en gel. Esta técnica se basa en el movimiento de las
proteínas en respuesta a un campo eléctrico a través de Cuando se combina el análisis de la muestra
una matriz porosa (tamiz) o gel de poliacrilamida, considerando tanto el peso molecular como la carga,
dando como resultado la separación de las proteínas se aplica la electroforesis en dos dimensiones (2D), la
[14, 15]. La electroforesis en gel de poliacrilamida es cual consiste en la separación de las proteínas de una
una técnica de separación ampliamente empleada muestra mediante su peso molecular, y posteriormente
debido a que es fácil de realizar, es sencilla, con alto esas proteínas inmersas en el gel se incorporan en una
poder de resolución, y bajo costo. matriz de poliacrilamida con gradiente de pH,
Existen variantes de esta técnica, elegir una de entonces la misma muestra se analiza considerando
ellas dependerá de la característica bioquímica de la dos propiedades de las proteínas, peso molecular y
proteína con la que se basará su análisis. Esto es, si se carga [15, 16].
analiza la muestra por el peso molecular de las
proteínas o por carga, o ambas. El análisis de las La electroforesis en gel se puede acoplar a otra
proteínas con base en su peso molecular se realiza técnica conocida como Western blot, en la cual un gel
mediante electroforesis en condiciones de poliacrilamida que contiene proteínas se pone en
desnaturalizantes. contacto con una membrana (difluoruro de
polivinilideno o nitrocelulosa). Las proteínas del gel
En la electroforesis en condiciones se transfieren del gel a la membrana a través de un
desnaturalizantes, las proteínas se ponen en contacto campo eléctrico. A diferencia de los geles de
con un detergente catiónico que despliega estas poliacrilamida, para visualizar la presencia de
cadenas y les confiere carga negativa a todas las proteínas en la membrana, no se usan colorantes, sino
proteínas de la muestra, por lo que las proteínas anticuerpos [17, 18].
migrarán hacia la misma dirección, hacia el polo
positivo. El gel funciona como un tamiz, con poros Mediante electroforesis de gel, en específico en
microscópicos de tamaño definido, a través de los condiciones desnaturalizantes, se monitorea cada paso
cuales las proteínas de mayor tamaño permanecerán durante el proceso de purificación de proteínas, en el
en la parte superior del gel, mientras que las de menor paso final de purificación, si la proteína está pura, sólo
tamaño migrarán en la parte inferior de la matriz, y las se detectará una banda única. La cual se recomienda
de tamaño intermedio se distribuirán en la mayor parte analizar esa misma muestra mediante una
del gel. De esta manera, la separación de las proteínas electroforesis en gel que se base ahora en la carga de
dependerá de su tamaño. la proteína (isoelectroenfoque o gel nativo), para tener
la certeza de la pureza de la proteína.
En el caso de la electroforesis en condiciones
nativas, es decir, en ausencia de agentes químicos que Estandarización del protocolo de purificación
alteren la función y plegamiento de la proteína, se
mantendrá su conformación y función. La migración A partir de este paso, durante la estandarización
de las moléculas a través de la matriz se rige por la del protocolo de purificación de proteínas, se elegirá
carga natural de la proteína. una técnica a partir de una de las características
bioquímicas de la molécula de interés.
El isoelectroenfoque es otra técnica de
electroforesis en gel en la cual las proteínas se
distribuyen en un gel de poliacrilamida conteniendo

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Fraccionamiento del extracto por precipitación de un cilindro, y en la parte superior se coloca la

muestra. Las moléculas se desplazan a través de la fase
La solubilidad de una proteína depende de los estacionaria mediante el bombeo de la fase móvil
residuos de aminoácidos ionizados, regiones polares e (amortiguador) con un flujo a velocidad controlada.
hidrofóbicas que están en contacto con el solvente Para detectar las proteínas que salen de la columna, la
(agua), generando una capa de moléculas de agua fase móvil pasará por un detector UV (280 nm),
(capa de solvatación). Cuando la interacción de la generando una señal hacia un software, que finalmente
proteína con la capa de solvatación se interrumpe por se representará como una gráfica (cromatograma),
un aumento en la entropía del sistema, entonces la donde los picos o montañas representan la presencia
proteína se precipita, esto se logra con solventes, sales de proteínas, y los valles la usencia de éstas.
o cambios en el pH. Altas concentraciones de sales se
usan de manera común para precipitar proteínas, los En una muestra con un gran número de proteínas,
iones compiten con las proteínas por las moléculas de su cromatograma se representará con varios picos; si
agua en la capa de solvatación, hasta que la proteína el pico de la proteína de interés se mezcla con otros
pierde la interacción con la capa de solvatación. A este picos, entonces se deben considerar las diferentes
fenómeno se le llama en inglés “saltig out”, cuando la alternativas que tiene cada técnica para mejorar la
proteína es soluble en presencia de bajas resolución (cuando dos picos están bien definidos, dos
concentraciones de sales, se denota “salting in”[3, 19]. montañas y un valle) (Figura 2). Al final de cada
proceso de cromatografía, la fase estacionaria debe
La precipitación de proteínas con alta tener un proceso de mantenimiento (limpieza,
concentración de sal (Serie de Hofmeister) es una regeneración si es necesaria, almacenamiento).
alternativa recurrente en la purificación de proteínas
cuando se trata de extractos muy complejos (gran Por peso molecular
número de proteínas), o cuando se manejan volúmenes
grandes de la muestra, incluso se convierte en una Las técnicas de separación por peso molecular se
alternativa para clarificar extractos. Una gran ventaja comenzaron a utilizar en la década de los sesenta del
de precipitar proteínas con altas concentraciones de siglo XX, al tratar de separar compuestos de una
sales, en comparación con solventes o cambios del pH, planta. Investigadores de esa época descubrieron que
se mantiene la estructura y función de las proteínas. el dextrán, como fase estacionaria, tenía propiedades
para separar moléculas por tamaño (peso molecular),
Las proteínas precipitadas se recuperan por dando lugar a la cromatografía de exclusión molecular
centrifugación (precipitado y sobrenadante), se o filtración en gel [22].
solubilizan y dializan con un amortiguador
determinado. Las proteínas que no se precipitaron El principio de la cromatografía de exclusión
(sobrenadante) se recuperan adicionando una molecular consiste en que una mezcla de moléculas de
concentración mayor de sal. Para conseguir una diferentes tamaños se hace pasar a través de la fase
separación adecuada y reproducible la incorporación estacionaria, produciendo una separación con base al
del agente precipitante debe ser gradualmente. La tamaño de las moléculas, las de menor tamaño
temperatura, pH y la carga de las proteínas son penetran en el interior de las esferas (polímero o gel)
factores determinantes en la precipitación. En el caso que componen la fase estacionaria, deben pasar por
de la precipitación con sales, existen tablas o toda la columna para salir o eluir de la fase
servidores en internet que permiten determinar la estacionaria, recorriendo el volumen total de la
cantidad de sales que se requieren para precipitar columna (Vt). Mientras que las moléculas de mayor
proteínas [20, 21]. La validación de este método es por tamaño al de los poros del polímero, sólo rodean a éste
geles de acrilamida en condiciones desnaturalizantes, recorriendo únicamente el volumen vacío (Vo), siendo
así como la identificación de la proteína de interés (por las primeras en salir de la columna. Las moléculas de
función, peso molecular, inmunodetección, etc.) tamaño intermedio difunden con mayor o menor
facilidad en el interior del polímero en función de su
Cromatografía tamaño (volumen de elución, Ve), y salen de la
columna fraccionadamente en volúmenes
Es una técnica que se basa en la separación de comprendidos entre el Vt y el Vo (3, 25, 26) (Figura
moléculas a través de su distribución entre dos fases, 2B).
estacionaria y móvil. Las propiedades de cada
molécula determinarán su tiempo de permanencia (se Los factores que influyen en la resolución
retenga) en la fase estacionaria (tiempo de retención). mediante cromatografía de exclusión molecular son:
La fase estacionaria (polímero) es empaquetada dentro

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a) Longitud de la columna. A mayor longitud de la calibración de la columna. En la cual se representa una

columna mejor separación. relación lineal del Kd (de diversas moléculas de
tamaño conocido) con el logaritmo del peso molecular
b) Flujo. La resolución de la separación disminuye al (Mr) de proteínas de tamaño conocido.
aumentar el flujo de la fase móvil.
La cromatografía de exclusión molecular tiene
c) Volumen de la muestra a separar. Las mejores varias aplicaciones: separación de grupos de
separaciones se obtienen con un volumen de moléculas por tamaño, cambio de amortiguador,
muestra entre 2 % y 5 % del volumen total de la eliminación de moléculas pequeñas de la muestra
columna. (como sales o marcas radioactivas), determinación del
peso molecular de una proteína.
d) Empaquetamiento de la columna. La resina debe
empaquetarse de manera homogénea a lo largo de Por carga
toda la columna para obtener picos bien definidos.
Esta característica va de la mano con la La cromatografía de intercambio iónico es la
composición del polímero de la columna. técnica que separa a las proteínas en función de su
carga (Figura 2C). La carga de la cada proteína varía
e) Viscosidad de la muestra. Debe ser muy similar a por su composición de aminoácidos cargad,
la viscosidad de la fase móvil. distribución y densidad de carga de la molécula, y el
f) Selección de la resina. La eficiencia de la ambiente químico en el que se encuentran. Los grupos
resina depende del tamaño de su partícula, ionizables de los residuos de aminoácidos modifican
una mejor resolución se obtiene con su carga de manera gradual como el pH del ambiente
partículas pequeñas, sin embargo, esto cambia, si esto lo observamos en una curva de
incrementa la presión de trabajo al usar un titulación, la proteína alcanzará un pH en el cual su
sistema automatizado. carga neta es igual a cero, a lo que se le conoce como
punto isoeléctrico (pI), lo que significa que la proteína
g) Interacciones inespecíficas de la muestra no interacciona con las cargas del medio y por lo tanto
con la columna. Las proteínas pueden se precipita. Si el pH del medio en el que se encuentra
interaccionar con la muestra mediante la proteína está por arriba de su pI, la proteína adquiere
interacciones iónicas o hidrofóbicas, lo que carga negativa; de manera contraria, si el pH del
puede alterar la elución de las proteínas. Esto medio es menor a su pI, la proteína adquiere carga
se evita aumentando la fuerza iónica de la positiva [1, 2].
fase móvil mediante pH o alguna sal.
La fase estacionaria en la cromatografía de
La distribución de la muestra en la fase intercambio iónico puede ser aniónica o catiónica, y
estacionaria (o partición) está relacionada con la se unirán moléculas de carga opuesta. La manera de
accesibilidad de los poros de la resina y el tamaño de separar y eluir a las proteínas de la fase estacionaria se
las proteínas. Estos dos parámetros se relacionan con basa en modificar la fuerza iónica de la fase móvil, por
el coeficiente de distribución (Kd), que se calcula a cambios graduales de pH o concentraciones de un
partir de la siguiente ecuación: intercambiador iónico (por lo general es una sal).

Kd = (Ve – V0)/Vi = (Ve – V0)/(Vt – V0) Los pasos para seguir una cromatografía de
intercambio iónico son:
donde Ve es el volumen de elución de la muestra
(volumen de la fase móvil que pasa a través de la - Equilibrar la columna con un amortiguador
columna, desde que se inyecta la muestra hasta el determinado, considerando el efecto del pH del
punto máximo del pico), V0 refiere al volumen muerto amortiguador en las cargas de la fase estacionaria
(volumen de la fase móvil que pasa a través de la y las proteínas de la fase móvil.
columna desde que se inyecta la muestra, hasta que
comienza a salir el primer pico), Vt es el volumen total - Aplicación de la muestra y lavado, en este paso
(volumen de toda la columna), Vi volumen interno del las moléculas que no se unen a la columna (es
poro (el correspondiente al volumen total que ocupa el decir, que tienen la misma carga que la columna)
interior de las esferas de la resina) [3, 4, 25, 26]. saldrán de la columna pasando algunos volúmenes
de la fase móvil.
Para elegir una resina se debe enfocar en su
capacidad de resolución con base a la curva de

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- Elución, las proteínas que se unieron a la como entrecruzador, al cual se une un grupo funcional
columna de manera diferencial se desplazarán- como dietilaminoetil (DEAE), carboximetil (CM),
mediante un gradiente de fuerza iónica, al sulfopropil (SP), amonio cuaternario (Q), entre otros.
aumentar la fuerza iónica, para eluir La longitud del grupo funcional se relaciona
completamente cualquier proteína unida y también directamente con la resolución de la técnica, a mayor
para regenerar las cargas [3, 4, 27]. longitud del grupo funcional mejor es la resolución
[27].
En esta técnica las proteínas son adsorbidas en
polímeros de poliestireno usando divinil benceno

Figura 2. Purificación de proteínas por cromatografía. A) Esquema general de cromatografía. En la parte superior e inferior se muestra
la composición de la muestra inicial y final, respectivamente, corroborada mediante una electroforesis de un gel desnaturalizante de
poliacrilamida. En color amarillo se encuentra la muestra (fase móvil) y en azul la fase estacionaria. B) Cromatografía de exclusión
molecular. C) Cromatografía de intercambio iónico. D) Cromatografía de afinidad. E) Cromatografía de interacción hidrofóbica. F)
Cromatografía de fase reversa. En la parte inferior de las distintas técnicas cromatográficas se encuentra un cromatograma, en el eje de las
abscisas se grafica el tiempo, volumen o número de fracción obtenida. En rojo se muestra el gradiente de elución empleado. Figura realizada
en BioRender.com

Por afinidad amortiguador (cambiando fuerza iónica, polaridad o

pH, con una molécula que compita con el ligando de
La capacidad de las proteínas de interaccionar de la columna) [3, 23, 28].
manera reversible, estable y específica con otras
moléculas que funcionan como ligando (anticuerpos, Para obtener aumentar la resolución en la
proteínas, carbohidratos, metales, entre otras), cromatografía por afinidad es importante considerar
determina el fundamento de la cromatografía por que la composición de la columna consista de un
afinidad (Figura 2D). En esta técnica una proteína del polímero (dextrán, celulosa, poliacrilamida, silica, o
extracto se une a un ligando inmovilizado en la mezcla de ellas) de gran área para favorecer la
columna. Al pasar algunos volúmenes de la fase móvil interacción con el ligando, que sea hidrofílica o neutra,
(lavado), las moléculas que no se unieron a la columna para evitar la interacción no específica entre las
se disociarán y recuperará al modificar el proteínas y la fase estacionaria, con grupos

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funcionales que favorezcan la unión química del la cromatografía. Las condiciones para el proceso de
ligando, que sea físicamente estable [3, 23]. cromatografía no deben alterar la inmovilización del
ligando ni sus propiedades de interacción con la
En cuanto al ligando, este debe ser compatible con proteína. Es fundamental almacenar la resina para
los reactivos que se apliquen para su unión con la fase cromatografía de afinidad a 4°C, con la finalidad de
estacionaria, al menos con un grupo funcional (amino, mantener estable la inmovilización del ligando [3, 4,
carboxilo, aldehído, tiol, hidroxilo). Lo recomendable 23].
es usar ligandos largos para aumentar la resolución de
Tabla 2. Generalidades y consideraciones de las técnicas cromatográficas.

Componentes Propiedades Exclusión molecular Afinidad Intercambio iónico Interacción hidrofóbica Fase reversa

Característica Peso molecular de las Interacción específica

Carga superficial Hidrofobicidad Hidrofobicidad
fisicoquímica proteínas con un ligando
Interacción inespecífica
Fase móvil Interacción con Reversibles,
controlada adicionando Electrostática Hidrofóbica Hidrofóbica
matriz electrostáticas
sales
Solución clarificada, filtrada, desgasificada, 4 °C en las condiciones de pH y fuerza iónica de acuerdo con la proteína de interés. Uso de
Consideraciones
inhibidores de proteasas durante la ruptura celular.
Dextranos, agarosa,
Dextranos, agarosa, Silica, metacrilato, Apolar: silanol, éter,
Matriz celulosa, silica, Agarosa, poliestireno, silica
sephadex, sephacryl agarosa octadecil
poliacrilamida
Sulfopropil, metil
Fase N-alquilo o
Estable y compatible sulfonato,
estacionaria Ligando/Grupo No es necesario Butilo, octilo, fenilo, eter hidrocarbonos
con la proteína dietilaminoetil,
aromáticos,
dietilaminopropil
Consideraciones Mantener la resina siempre hidratada y con un empaquetamiento homogéneo. Almacén en etanol 20 %, 4 ° C

Volumen de la muestra Unión específica. Baja fuerza iónica, no

Condiciones iniciales Alta fuerza iónica, volumen de
limitado (< 10 % del Volumen de la muestra hay volumen Fase móvil es polar
de la muestra muestra no limitante
volumen total) no limitante limitante de muestra

Muestra con alta

Muestra al final, alta
concentración de
Condiciones finales Elución específica, fuerza iónica, o Baja fuerza iónica, muestra
Muestra diluida solventes no polares u
de la muestra muestra concentrada cambio de pH, concentrada
orgánicos, concentrada y
muestra concentrada
baja fuerza iónica

Desprendimiento en
relación a fuerza
Proceso Flujo depende de la fase Ligando competitivo, Solventes no polares,
iónica de menor a
Elución móvil y del movimiento pH, fuerza iónica, Disminución de salinidad orgánicos, acetonitrilo o
mayor, concentración
browniano polaridad metanol
de sal, flujo,
temperatura , pH,

Tamaño y uniformidad Alta resolución, Alta resolución,

de partículas, altura y capacidad desde 5 y capacidad y Buena resolución, capacidad y
Resolución empaque de la columna, hasta 250 mg por mL de velocidad, en general velocidad, en general en Alta resolución
velocidad de flujo y resina, en general en procesos de más procesos de más de un paso
concentración de muestra procesos de un solo paso de un paso

Consideraciones Flujo de acuerdo con las especificaciones de la resina, en general 1 mL min-1.

No se trata de resinas
No se trata de resinas Riesgo de
particularmente
particularmente específicas. Se desnaturalización de la
No existen ligandos para específicas. Se debe
Desventajas Dilución de la muestra requieren parches hidrofóbicos muestra. Utilizada
todas las proteínas considerar la diálisis
superficiales capaces de principalmente para
para remover el
interaccionar con la resina. péptidos
exceso de sales

Referencias [3,4,23,24]

Por hidrofobicidad las proteínas no están en contacto con el solvente (ver

precipitación de proteínas). Mientras que en la fase
En la superficie de las proteínas se pueden detectar reversa el ambiente hidrofóbico lo favorece la fase
regiones que repelen moléculas de agua (regiones móvil, es decir, el solvente.
hidrofóbicas). Esta propiedad de las proteínas se
aprovecha en las cromatografías de interacción La resolución de dichas cromatografías se rige,
hidrofóbica y en fase reversa (Figura 2E y 2F). En la primeramente, por la composición de grupos
cromatografía de interacción hidrofóbica, las funcionales unidos al polímero de la columna [29, 30].
proteínas se unen a la fase estacionaria en un ambiente La cromatografía de interacción hidrofóbica utiliza
que favorezca el efecto “salting out”, es decir, donde grupos tales como: fenilo, octilo y butilo; para las

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columnas de fase reversa el soporte es a base de silica manera exponencial y siempre en concordancia con el
que varía en el número de carbonos (de 8 a 18). En desarrollo de nuevas tecnologías y métodos. La
ambas técnicas, entre mayor es el tamaño del grupo diversidad de técnicas para la purificación de
funcional, mejor es la retención de las proteínas y por proteínas ha generado un efecto excepcional en la
tanto la resolución de la cromatografía. Las proteínas ciencia. El estudio de proteínas como moléculas
se adsorben a la fase estacionaria en un ambiente aisladas, libres de un ambiente celular, contribuye en
hidrofóbico, con alta concentración de sal (hasta 2 M). el entendimiento de procesos celulares, metabolismo
e incluso la biología de múltiples enfermedades, en el
Una ventaja de la interacción hidrofóbica es diseño de nuevas moléculas con aplicación en la
mantener a las proteínas en su conformación y nativas, biomedicina y diversas industrias.
en la fase reversa las proteínas se desnaturalizan. Sin
embargo, la resolución de la fase reversa es mayor, en La amplia gama de materiales para la purificación
particular para péptidos, los cuales no presentan de proteínas, como lo son las matrices usadas en la
regiones hidrofóbicas de tamaño considerable para cromatografía, permite solucionar de manera rápida y
unirse a una columna de interacción hidrofóbica. La eficiente problemas para purificar proteínas. Para
elución de las proteínas o péptidos, en ambas técnicas, lograr esto, es fundamental considerar en todo
es la reducción del ambiente hidrofóbico de manera momento, las propiedades bioquímicas de la proteína
gradual [3, 4, 31]. de interés y los fundamentos teóricos de cada técnica,
para poder realizar los ajustes necesarios de acuerdo a
Los pasos de ambas cromatografías consisten en: los objetivos de cada investigación; sin olvidar que
equilibrar la columna, adicionar la muestra, lavar con durante el proceso de purificación de una proteína,
el amortiguador con el que se equilibró la columna, debemos contar con un método adecuado para
eluir las proteínas reduciendo de manera gradual el identificarla, mantener en lo posible su estabilidad y
ambiente hidrofóbico y regenerar la columna. función, estandarizar un protocolo eficiente de
purificación, en el cual se incluya el menor número de
Conclusión pasos para reducir el tiempo. Finalmente, hay que
recordar que el éxito para obtener una proteína pura se
En las últimas tres décadas, el impacto de la obtendrá con persistencia, constancia y paciencia.
generación del conocimiento científico ha sido de

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and Purification: Methods and Protocols, Methods in Enzymol. 541, 51–65.

forma constante como docente en cursos de posgrado

y en divulgación de la ciencia.

Tiene a su cargo de dos líneas de investigación:

1) Toxinología de anémonas. Las anémonas

tienen la capacidad de producir veneno mediante
estructuras celulares llamadas nematocistos. Debido
a la complejidad que se tiene para la obtención del
veneno de anémona, las ciencias ómicas han abierto
grandes perspectivas para este campo. Esta línea de
investigación es conducida en dos vertientes, el
DRA. CLAUDIA RODRÍGUEZ estudio ómico del veneno de la anémona Anthopleura
ALMAZÁN dowii y la identificación de toxinas formadoras de
poro (TFP) por métodos de bioquímica clásica. Las
ID ORCID: 0000-0002-8586-2317 TFPs forman monómeros en solución que se pueden
unir a la membrana plasmática, cambiando su
Bióloga de la Facultad de Ciencias, UNAM; conformación a un estado oligomérico al
obtuvo su Maestría en Ciencias por el Instituto de interaccionar con lípidos como la esfingomielina y
Ciencias del Mar y Limnología, al realizar colesterol, presentando una selectividad con el
investigación relacionada con toxinas formadoras de primero. Dos aplicaciones principales le han sido
poro de anémona. Obtuvo su Doctorado en Ciencias otorgadas a las toxinas formadoras de poro de
Biomédicas, en el Instituto de Fisiología Celular, anémona: el diseño de inmunotoxinas como posibles
UNAM; en el área de físico- química y herramientas en la terapia de cáncer, y el diseño de
termodinámica del plegamiento y estabilidad de biosensores basados en nanoporos.
enzimas. Realizó una estancia posdoctoral en el
Instituto de Biotecnología, UNAM, mecanismos de 2) Ingeniería de enzimas de bacterias
acción de toxinas formadoras de poro de bacterias. extremófilas. El cuidado del ambiente dio pauta para
implementar estrategias que deben ser consideradas
Desde el año 2010 es Investigadora Asociado del en los procesos químicos y que tuvieran el menor
Instituto de Biotecnología, UNAM. Actualmente en impacto posible en el ambiente, a lo que se le nombró
comisión en el Instituto de Ciencias Aplicadas y química verde. Uno de los objetivos de la química
Tecnología, UNAM. Ha sido mentora de alumnos de verde es el uso de catalizadores, que pueden ser
licenciatura, maestría y doctorado. Tiene múltiples sensibles a condiciones extremas de temperatura y
publicaciones en revistas indizadas. Ha participado de pH, entornos en los cuales gran parte de los procesos
industriales se desarrollan. En este sentido, las lacasas

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han surgido como enzimas de gran interés en la contaminación ambiental, industria alimentaria,
industria, debido a que no solamente son una biosensores, industria textil y farmacéutica. En esta
excelente alternativa en la química verde al llevar a línea estudiamos a las lacasas bacterianas y mediante
cabo reacciones acopladas, también engloban Ingeniería de proteínas mejoramos sus características
aplicaciones en un gran número de procesos catalíticas para su aplicación en el diseño de
industriales, como industria del papel, control de la biosensores.

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