TÉCNICAS DE CLONACIÓN DE EMBRIONES.

¿QUE ES?

La transferencia nuclear celular es una parte del proceso de clonación. Consiste en

introducir el material genético de la célula a clonar en ovocito de la misma especie
previamente enucleado sin su propio material genético. Se considera que el ovocito tiene
la capacidad de reprogramar el programa de expresión génica celular, reiniciándolo de
alguna manera, de forma que la célula nueva resultante será capaz de dar lugar a
cualquier otro tipo celular.

Con base en los conceptos de la clonación descritos anteriormente, se observa que

existen tres técnicas que han sido utilizadas en animales de granja o de laboratorio para
producir embriones genéticamente idénticos. Dos de ellas cabrían en el concepto de la
clonación en un sentido horizontal: la partición o división de embriones por microcirugía, y
la separación y cultivo de blastómeros aislados por métodos enzimáticos 0 mecánicos (9,
10). La tercera entra en el concepto de la clonación en un sentido vertical: la transferencia
nuclear a partir de células somáticas de adulto 0 embrionarias (3) 0 de blastómeros de
embriones (11, 12, 13) entre otras células (Cuadro 1).

1 Partición 0 división de embriones

 En la década de los 70 se pensaba que los embriones en fases tempranas de la
segmentación no sobrevivirían después de una microcirugía. Fue en los años
ochenta cuando se demostró que las mórulas y blastocistos de los animales
domésticos eran capaces de desarrollarse después de una partición y producir
nacimientos viables (14). Actualmente la partición de embriones permite la
producción de gemelos idénticos al dividir el embrión original por métodos
microquirúrgicos. Las evidencias experimentales indican que existe una relación
inversa entre el número de secciones que se le hagan al embrión y el porcentaje
de éxito. Las tasas de producción de gemelos monocigóticos van desde poco mas
de 30% en bovinos y ovinos (4, 15, 16) siendo hasta casi 70% en bovinos, con
porcentajes de gestación superiores a 60% (14) e incluso, en algunos casos,
equivalentes a 100% (17). El número de células que tenga el embrión no solo
limita el número de segmentos en que pueda dividirse, sino que también tiene
incidencia sobre otros aspectos.

Típicamente se utilizan embriones en etapa de mórula 0 blastocisto (18, 19). Esta

estrategia permite utilizar una de las secciones para otros fines experimentales
como la determinación del sexo del embrión, mientras que el resto se cultiva 0
congela para después transferirse a hembras receptoras previamente
sincronizadas para mantener la gestación (20, 21, 22). Los embriones en etapa de
blastocisto son seccionados de manera que se dividan en dos partes iguales tanto
la masa celular interna (MCI como el trofoectodermo. Es recomendable emplear
soluciones que deshidraten ligeramente al embrión (por ejemplo, sacarosa 200
mM), con lo que se reduce el daño al trofoectodermo durante su partición. Una vez
cortadas, las mórulas compactas y los blastocistos no necesariamente deben ser
introducidos a zonas pelúcidas, teniendo una sobrevivencia aceptable al ser
transferidas en hembras receptoras; aunque existen informes que indican tasas de
supervivencia de 15% en medios embriones (0 demi-embriones) sin zona pelúcida
y de 35% cuando se transfieren con zona pelúcida. En este último caso las tasas
de gestación van de 55% a 65% en bovinos (18). Willadsen y Godke (23)
obtuvieron tasas de gestación de 80% en bisecciones de embriones de ovino
indistintamente si tenían zona pelúcida 0 no. En el Cuadro 2 se muestran algunos
de los factores principales que afectan la s tasas de éxito con esta técnica.
2.

Separación y cultivo de blastómeros aislados

En algunas especies, como los equinos, se ha utilizado la separación de blastómeros de

embriones previos a su implantación para efectuar estudios de diagnóstico de
enfermedades genéticas. En ellos se ha determinado la viabilidad de los embriones
analizados después de su transferencia en hembras receptoras, encontrándose tasas de
gestación de 21% (24). En humanos la separación y cultivo de blastómeros aislados
también han sido utilizados en estudios de biopsias de embriones en diferentes etapas de
segmentación con la finalidad de dar alternativas a los estudios de diagnóstico prenatal,
evaluando a su vez el desarrollo embrionario in vitro con el propósito de que se
seleccionen los mejores embriones capaces de desarrollarse en blastocistos y congelarlos
mientras se evalúan sus blastómeros aislados (25, 26, 27).

La técnica de separación de los blastómeros implica la remoción de la zona pelúcida, ya

sea por métodos químicos, mecánicos 0 enzimáticos, para posteriormente obtener los
blastómeros mediante aspiración, extrusión 0 disminución de sus interacciones en
soluciones libres de Ca2+ y Mg2+ (12, 28, 29,30). Los blastómeros de rata aislados en la
etapa de dos células, son capaces de formar embriones completos (31).

En el ratón se han obtenido gemelos idénticos removiendo la zona pelúcida de embriones

de dos células y cultivándolos separadamente previo a su transferencia (16).
 En otras especies, el éxito del experimento se ha determinado como dependiente de
diversos factores. Así, por ejemplo, en porcinos y ovinos la baja eficiencia en la obtención
de fetos se debe a la baja sobrevivencia in vivo de embriones libres de zona pelúcida en
fases previas a la compactación (16). Esta tasa de nacimientos puede aumentarse si se
utilizan embriones encapsulados en gel de agarosa (15,32). De manera que algunas
estrategias para suplir a la zona pelúcida son el empleo de capsulas artificiales de
agarosa (33) 0 de alginato de sodio (34, 35), o matrices extracelulares como la
fibronectina y laminina (28, 36).

EI número de células que forman al embrión separado constituye otro factor importante
en la probabilidad de éxito. Willadsen (37) demostró que la tasa de gestación en ovinos y
bovinos se reducía conforme se hacían grupos de células de números menores. La mayor
tasa de gestación que obtuvo este autor fue del 66% al utilizar embriones de dos células 0
dos grupos de células provenientes de embriones de hasta ocho células. Cuando utilizó
embriones de cuatro células 0 pares de células de embriones de ocho células, la tasa de
gestación se redujo a 50%.

Cuando se utilizaron los blastómeros individuales provenientes de embriones de ocho

células, la tasa de gestación fue de sólo 5%. En todos los casos en los que se separaron
las células embrionarias, el número de células formando el blastocisto se reducía
linealmente con el número de "divisiones" a la que era sometido el embrión. Un dato
importante de este estudio es que cuando se utilizaron las células individuales de los
embriones de ocho células, el desarrollo de la MCI se veía fuertemente comprometido al
extremo de formarse sólo vesículas sin la presencia de este grupo de células.
Aparentemente, en los blastómeros aislados se promueve más fácilmente la apoptosis y
se afecta preferentemente alas células de la MCI. Este proceso contribuye a la incidencia
de abortosdebido a que la poca cantidad de células de la MCI reduce la viabilidad fetal
(38). En monos esta misma técnica ha sido aplicada a partir de embriones de ocho
células, en la que se separan los blastómeros mientras son mantenidos en medio libre de
2+ 2+ Ca y Mg ,y luego se reagrupan por pares que se introducen en zonas pelúcidas
para que puedan desarrollarse hasta la fase de compactación y así transferirlos a
hembras receptoras. El 8% de los embriones tratados brindaron crías vivas (38).

3. Transferencia nuclear
 Una técnica que incrementa el potencial de desarrollo de los blastómeros aislados de
embriones de ocho células 0 de etapas mas tardías de la segmentación es la
transferencia nuclear (37). Esta técnica permite la producción de individuos
genéticamente idénticos originados a partir de un solo donador de núcleos (1). Implica la
inserción por métodos químicos, físicos, biológicos 0 mecánicos del núcleo de una célula
donadora que puede ser tomada de varios tejidos a la cual se le llama carioplasto, con un
ovocito activado y carente de núcleo, 0 con un huevo fertilizado al que se le hayan
extraído los pronúcleos (4, 37, 39, 43). Contrariamente a lo que pudiera pensarse, el
desarrollo de esta metodología es más bien antiguo, si bien hasta hace poco ha
acaparado el interés no sólo de la comunidad científica, sino del público en general. En el
Cuadro 3 se muestra una cronología de los eventos más importantes en la obtención de
organismos clonados por transferencia nuclear.
Es importante destacar que tanto el citoplasma que recibirá al núcleo transferido como el
propio núcleo deben tener características fisiológicas específicas para que se realice con
éxito tanto la transferencia nuclear como el desarrollo posterior de la célula reconstituida
y, eventualmente, el desarrollo del nuevo organismo. La célula que contiene al núcleo que
será transferido (carioplasto) debe tener características particulares que permitan cierto
porcentaje de éxito antes de ser colocado en el espacio perivitelino adyacente a la
membrana del ovocito (citoplasto) y se fusione.

Experimentalmente el uso de citocalacina B para bloquear la polimerización de

microfilamentos, y de colchicina para la de los microtúbulos, permiten controlar los
movimientos del citoesqueleto en el carioplasto, provocar una elasticidad de la membrana
plasmática y favorecer así la enucleación mediante el uso de micropipetas, sin romper la
membrana plasmática (4, 11,29,40,41,42). Si se utiliza un embrión en segmentación como
carioplasto, también requerirá de la micromanipulación para obtener sus blastómeros.
Uno de estos últimos se transfiere dentro del ovocito en metafase II desprovisto
previamente de su núcleo, y se fusiona con él. Mediante este proceso, el ovocito se activa
y da inicio a su desarrollo como un nuevo embrión.

En algunas especies la sola transferencia del carioplasto inicia la activación del ovocito (4,
41, 43, 44). La primera etapa de esta metodología es la obtención del citoplasma
adecuado para que sirva de aceptor del núcleo. A los ovocitos en metafase II se les retira
el núcleo 0, en el caso de huevos fertilizados, se les extraen los pronúcleos en
microscopía de contraste de fases. Para confirmar q ue el material cromosómico haya
sido totalmente extraído, se aplican tinciones de ADN en el citoplasma del ovocito.

El colorante más utilizado para esta etapa es el Hoechst 33258 para visualizar la ausencia
de contenido nuclear en los ovocitos enucleados, bajo luz ultravioleta durante períodos de
menos de diez segundos, sin efectos negativos en el desarrollo de los embriones
reconstituidos (42, 45,46). Respecto alas características del carioplasto, entre mas
diferenciada esté la célula somática, menor será la probabilidad de éxito en la
transferencia nuclear. Para que una célula sea totipotencial requiere que su núcleo sea
capaz de desarrollarse en un nuevo embrión (47). Para ello los genes que dan lugar al
desarrollo de un organismo completo deben estar presentes aún cuando no todos sean
expresados (48).

Algunos de los genes que deben expresar las células totipotentes son el gen Tnap, los
factores de transcripción, los genes Oct 3/4, el proto-oncogen ckit, y la ADN
metiltransferasa 0 Mt (49). La experiencia con múltiples tipos celulares tanto embrionarios
como de tejidos diferenciados ha demostrado que el uso de núcleos de blastómeros
obtenidos de embriones de dos células es mas eficiente que los de ocho células;
asimismo, los núcleos de blastómeros 0 de las células de la MCI son más eficientes que
los de las células de la granulosa, por ende, las células embrionarias son más efectivas
que las células de individuos adultos (4).

A su vez, los núcleos de las células de la MCI son más efectivos que los de las células
del trofoectodermo (44). Cheong et al (29) encontraron que al utilizar núcleos de
blastómeros de embriones de dos, cuatro y ocho células que se hallaran en la fase
temprana del ciclo celular (fase G 1 de la segunda división), como donadores de núcleos
para ser transferidos, los de dos células daban 78% de blastocistos y 29% de ratones
nacidos vivos a partir de los embriones reconstituidos, mientras que los de cuatro células
daban 71% de blastocistos y 22% de ratones nacidos vivos, y los de ocho células daban
46% y 17% respectivamente.

En resumen, los núcleos obtenidos de embriones en las fases tempranas de la

segmentación tienen la ventaja sobre los provenientes de células diferenciadas en que los
primeros revierten con facilidad los cambios que sufren previo a su diferenciación;
mientras que los últimos deben revertir los cambios que ya han sufrido durante más de 30
ciclos de divisiones celulares. Es por ello que una transferencia nuclear eficiente, con un
desarrollo a término del huevo manipulado, dependerá de la reprogramación adecuada
del núcleo donador. Las macromoléculas del tipo del ARN mensajero y las proteínas
almacenadas en el ovocito sólo soportan el desarrollo embrionario durante un tiempo
relativamente corto.

Entre más corto sea este período, se requerirá menor tiempo para la reprogramación.
Conforme el embrión sufre cambios mayores y crece, sus células requerirán mayor tiempo
y será probable que esta reprogramación no se lleve a cabo adecuadamente. En algunas
especies, la activación de la transcripción del genoma reintroducido ocurre hasta el estado
previo al blastocisto, por 10 que depende de la transcripción del ARN materno. En
embriones productos de una fertilización normal, este proceso se lleva a cabo a diferentes
tiempos en diferentes especies: a partir del estado de dos células en ratones y caprinos;
de cuatro células en porcinos; y en el paso de ocho a dieciséis células en embriones de
ovinos y bovinos (11).

En la transferencia
nuclear, la compatibilidad entre el citoplasma recipiente y el núcleo donador, es poco
entendida aún y toma parte en la reprogramación del núcleo donado (47). Dentro de los
cambios que deben revertir los núcleos de las células de adulto durante la transferencia
nuclear está la metilación del ADN que es esencial para el desarrollo embrionario.

El genoma del ovocito está poc o metilado, mientras que en el embrión comienza a
incrementarse esta metilación. Esto ultimo afecta la expresión de los genes, la
inactivación del cromosoma X, la diferenciación celular, y el imprinting (50). Otros cambios
asociados son la activación de las histonas y modificaciones en otras proteínas nucleares.
Si estos cambios no se revierten, durante el crecimiento ocurrirían modificaciones
genéticas de los núcleos adultos, tales como la mutagénesis somática, los errores
mitóticos, las deleciones y trisomías (4). Con el propósito de revertir los cambios en las
células diferenciadas y así incrementar las tasas de éxito en la fusión y en el desarrollo de
embriones reconstituidos por medio de la transferencia nuclear, es importante la
sincronización de los. ciclos celulares de las células donadoras de núcleos y de los
ovocitos receptores (39, 47, 51). Merchant (6) le llama a este proceso sincronización
nucleocitoplásmica. Como es ampliamente conocido, durante la vida fetal y hasta la
pubertad, el ovocit o de los mamíferos se encuentra detenido en la etapa de diploteno de
la profase de la meiosis I y sus cromosomas se condensan poco antes de que ocurra la
ovulación por acción de las gonadotropinas. Este estímulo promueve que el ovocito
reasuma su programa de división formándose el ovocito secundario con su primer cuerpo
polar, eliminando así la mitad de su material genético. En los mamíferos adultos, el
crecimiento del ovocito es continuo y termina en la ovulación, cuando es depositado en el
oviducto en donde madura e inicia su segunda división meiótica (meiosis II), en la cual se
vuelve a detener, solo que esta vez 10 hace en la metafase II.

El ovocito arrestado en metafase II continuará su

división únicamente si es activado por el espermatozoide durante la fertilización, en cuyo
caso culminará su segunda división meiótica y formará el segundo cuerpo polar (6, 52,
53). Durante la maduración y la activación, el citoplasma del ovocito modifica sus
propiedades en la medida en que la célula es liberada del arresto en la metafase II y es
activada con la fertilización mediante una serie de descargas de calcio que promueven la
reacción cortical. Una vez ocurrida la fertilización, la transcripción del ARN materno
comienza a controlar el desarrollo en las primeras divisiones mitóticas hasta la activación
del genoma embrionario. Cuando se efectúa una transferencia nuclear, la transcripción
del genoma materno del ovocito dirige al núcleo donado mientras que éste es capaz de
asumir el control de las fases embrionarias tempranas por sí mismo (4). AI igual que en
las células que se dividen, el ciclo celular del ovocito se encuentra controlado mediante
dos factores proteínicos: el factor promotor de la mitosis 0 de la maduración (MPF)
formado por una ciclina y la cinasa dependiente de ciclina, y el factor citostático (CSF) que
es esencialmente el mismo MPF pero asociado a una proteína que inhibe la acción de la
cinasa. Cuando la proteína inhibidora de la ciclina se degrada, la célula es capaz de
sintetizar ADN, si el inhibidor no se degrada, la célula primeramente es incapaz de entrar
ala fase S del ciclo y, en consecuencia, puede condensar de manera prematura su
material genético. Cuando las concentraciones del MPF se elevan, se inducen algunas
alteraciones, tales como la desintegración 0 rompimiento de la envoltura nuclear (DEN), la
condensación prematura de los cromosomas (CPC) y la reorganización del citoesqueleto
(3, 39).

 Ventajas

Las ventajas que supone la transferencia de embriones en día 3 son:

– Aumenta la tasa de embarazo en bajas respondedoras.

– Menos cancelaciones de ciclos, menor costo económico y menor tiempo de

cultivo.

– Mejor pronóstico en pacientes con embriones que poseen un desarrollo lento y

un número bajo de cigotos.

Desventajas
– La principal desventaja de la transferencia de embriones en día 3, es que los
criterios morfológicos que regirán la selección es muy subjetiva y refleja con
menos exactitud la calidad génica , por lo tanto, es más difícil de seleccionar el
embrión más competente y de mejor calidad .

– La tasa de embarazo, de implantación, de parto y de recién nacidos vivos es

menor (Blake et al., 2005).
– Aumenta el número de embriones a transferir y por tanto, aumenta el riesgo de
embarazos múltiples.

– Las contracciones uterinas son más frecuentes en D+3 aumentando el riesgo de

un embarazo ectópico.
– La transferencia de embriones en D+3 tiene también la desventaja de que
embrión y endometrio interaccionan con mayor antelación de lo normal, pudiendo
verse afectada su capacidad de implantación.
– En este estadio también hay mayor riesgo de aneuploidías.
-Transferir un embrión antes de que se active su genoma, es transferir en la etapa
más crítica de su desarrollo, disminuyendo así la probabilidad de implantación.

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