Método de Maxam y Gilbert

MÉTODO DE MAXAM Y GILBERT
La secuenciación de ácidos nucleicos es el proceso que determina la posición de los

nucleótidos que componen una molécula de ADN o ARN. Depende de la complementariedad
entre bases nitrogenadas. Existen diferentes métodos de secuenciación de ácidos nucleicos,
entre ellos el método de degradación química, más conocido como el método de Maxam y
Gilbert. Fue propuesto en 1977 por Walter Gilbert, nacido en Estados Unidos, realizó un
doctorado de matemáticas en la universidad de Cambridge y posteriormente otro de
bioquímica en Harvard donde fue nombrado profesor de biología molecular. Fue galardonado
en 1980 junto a Sanger con el premio Nobel de Química por su contribución en la
secuenciación de ácidos nucleicos. Allan Maxam, también graduado en Harvard, fue el
compañero de laboratorio de Gilbert para el desarrollo de este método.
El método de degradación química se puede dividir en: corte del fragmento de ADN,
desnaturalización, marcaje, división en alícuotas, electroforesis y por último detección y
análisis.
Corte del fragmento de ADN

Se procede al corte de la muestra inicial de ADN en otras más pequeñas. Este proceso se lleva
a cabo con la ayuda de las endonucleasas o enzimas de restricción, que son enzimas con la
capacidad de reconocer una secuencia específica en una molécula de ADN y cortarla en un
punto en concreto que se denomina diana. Las enzimas actúan rompiendo los enlaces
fosfodiéster que unen los nucleótidos de la cadena de ADN. Existen numerosas enzimas de
restricción y cada una reconoce una secuencia de bases diferente, por lo que dependiendo el
tipo de enzima que empleemos, obtendremos un resultado diferente.
Desnaturalización
La desnaturalización se produce por la rotura de los enlaces por puentes de hidrógeno
establecidos entre las bases nitrogenadas de cada hebra, produciendo la separación de la
doble hélice. Existen diferentes agentes desnaturalizantes:
a) El calor: el calentamiento gradual del ADN produce una rotura de los enlaces por
puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas de cada hebra, por lo que la
estructura bicatenaria se rompe, dando lugar a moléculas de ADN bicatenario.
b) El pH: se emplea un pH básico, que altera las uniones entre las bases nitrogenadas de
la doble hélice, separándola. El uso de un pH ácido no es viable porque rompe los
enlaces covalentes de la molécula.
c) Compuestos químicos: son compuestos con grupos amino y carbonilo que compiten
por la formación de enlaces por puentes de hidrógeno con los grupos amino y
carbonilo de las bases. Algunos agentes químicos desnaturalizantes son la urea o la
formamida
Marcaje
Se marca el extremo 3’ o 5’ de la cadena monocatenaria de ADN con el isótopo radiactivo 32P.
Para ello se elimina el primer fosfato del extremo 3’ o 5’ de la cadena mediante una alcalina y
se fosforila de nuevo mediante un polinucleótido kinasa y ATP marcado con 32P.
División en cuatro alícuotas

La muestra de ADN ya marcada se fragmenta en cuatro reacciones químicas distintas:
1. Corte de purinas: se metilan las purinas (adenina y guanina) con dimetilsulfato y

después se le añade una solución alcalina que hace que la molécula de ADN se
fragmente en las purinas ya metiladas. Tras la electroforesis se obtienen una serie de
bandas oscuras, que corresponden a las guaninas y bandas claras, que corresponden a
las adeninas.
2. Corte de adeninas: esta reacción química es una variante de la primera. Las purinas
metiladas se tratan con un ácido diluido, que favorece el corte de las adeninas
metiladas. Después se trata con una solución alcalina y las guaninas metiladas
también se cortan. El resultado de esta reacción, al igual que en el corte de purinas,
también son una serie de bandas claras y oscuras que corresponden a las adeninas y a
las guaninas.
3. Corte de pirimidinas: se cortan las pirimidas (citosina y timina) mediante hidracina,
después se añade piperidina para completar la reacción.
4. Corte de citosinas: está reacción es una variante del corte de pirimidinas, se añade la
hidracina en presencia de NaCl 2M, que inhibe el corte de las timinas. Posteriormente
se añade la piperidina, y finalmente se cortan solamente las citosinas.
Electroforesis
Tras la elaboración de las cuatro reacciones por separado se realiza una electroforesis en gel
de poliacrilamida. Cada alícuota se introduce en un pocillo del gel siendo posible al final del
procedimiento separar cada una de las bandas por sus diferentes pesos moleculares. El gel de
poliacrilamida debe ser lo suficientemente largo como para separar las bandas por la
diferencia de prácticamente un sólo nucleótido. Por último, se realiza una autorradiografía al
gel de poliacrilamida para analizar los resultados del proceso.
Detección y análisis
Finalmente, tras hacer la autorradiografía del gel, se interpretan los resultados del proceso de
secuenciación. El gel se leerá de abajo a arriba. Si la banda coincide en dos reacciones significa
que se cortó el nucleótido que se tiene en común, mientras que si sólo se encuentra en una
corresponderá al nucleótido que no es compartido por ningún pocillo. Realizando este
procedimiento línea a línea obtendremos la secuencia de bases nitrogenadas de la muestra de
ADN.
Ventajas y desventajas
 La baja resolución obtenida debido a los geles de poliacrilamida. Para solucionarlo, se
utilizaron posteriormente geles más finos combinados con un voltaje más alto, que
daba como resultado bandas más delgadas y mejor separadas (método de Sanger).
 La necesidad de separar y analizar cada las hebras de ADN individualmente hace que el
proceso resulte laborioso.
 Aunque hoy en día esta prácticamente en desuso, sigue siendo el método más
adecuado para el análisis de muestras cortas de ADN porque permite la secuenciación
desde la primera base nitrogenada mientras que en el método de Sanger (más
utilizado actualmente) se secuencia a partir de la base 10-20.
Bibliografía
https://en.wikipedia.org/wiki/Walter_Gilbert
https://en.wikipedia.org/wiki/Maxam%E2%80%93Gilbert_sequencing
https://en.wikipedia.org/wiki/Allan_Maxam
https://prezi.com/kywbsbezy_l9/secuenciacion-de-acidos-nucleicos/
http://www.chlaep.org.uy/descargas/curso_tb_mico_bacterias/
metodos_de_secuenciacion_de_acidos_nucleicos.pdf
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/secuenciacion_acidos_nucleicos.pdf
https://www.youtube.com/watch?v=gP0uDYjA6jI

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MÉTODO DE MAXAM Y GILBERT

La secuenciación de ácidos nucleicos es el proceso que determina la posición de los

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