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Recibido: 6 junio 2020 |Revisado: 4 de septiembre de 2020|Aceptado: 17 de septiembre de 2020

DOI: 10.1111/ijlh.13366

ARTÍCULO ORIGINAL

Utilidad de FLAER y CD157 en un ensayo de alta sensibilidad de un solo

tubo de cinco colores, para el diagnóstico de hemoglobinuria paroxística
nocturna (HPN): una experiencia de laboratorio de citometría de flujo
independiente

Neha Seth |Vidisha Mahajan |Shweta Kedia |Archana sutar |

Kunal Sehgal

Sehgal Path Lab, Bombay, India

Resumen
Correspondencia Fondo:El ensayo de citometría de flujo basado en FLAER se considera el estándar de oro para el
Kunal Sehgal, Sehgal Path Lab, 003 Yashodhan
building 2, JP Road, Four Bungalows, Andheri diagnóstico de la hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH). CD157 es un marcador recientemente
West, Mumbai-400053, India. informado para la proteína anclada a GPI que se encuentra tanto en los neutrófilos como en los

Correo electrónico: drkunalsehgal@gmail.com

monocitos. Este estudio destaca la solidez de la combinación de FLAER y CD157 para identificar clones

de PNH en un ensayo de alta sensibilidad. Aunque es raro, los datos que se muestran resaltan la

presencia de negatividad de CD157 en algunos casos, lo que vuelve a enfatizar la importancia de

FLAER para el diagnóstico de PNH.

Métodos:Se utilizó un único tubo de 5 colores (FLAER Alexa488/ CD157PE/ CD15PECy5/

CD64PE-Cy7 y CD45APCH7) para un ensayo de HPN de alta sensibilidad.
Resultados:De 364 casos, 59 (16,2%) casos tenían clon de PNH tanto en granulocitos como en

monocitos. Los tamaños de los clones de PNH oscilaron entre el 0,02 % y el 96,6 % en granulocitos y

entre el 0,07 % y el 96,3 % en monocitos según su fenotipo FLAER negativo y CD157 negativo. Veintidós

de los 59 casos de PNH (37,3 %) tenían un tamaño de clon de GB de <1 %. Además, hubo 10 casos que

mostraron ausencia de expresión de CD 157 tanto en granulocitos como en monocitos pero en la

tinción FLAER mostraron patrones de tinción normales. Tres de estos diez casos también mostraron un

clon de PNH basado en la ausencia de expresión de FLAER tanto en granulocitos como en monocitos.

Conclusión:FLAER y CD157 es una combinación robusta para el diagnóstico de PNH clínica y

subclínica. La ausencia de expresión de CD157 en glóbulos blancos normales, aunque rara, debe

tenerse en cuenta y vuelve a enfatizar la importancia de FLAER para el ensayo de PNH de alta

sensibilidad.

PALABRAS CLAVE

CD 157, FLAER, citometría de flujo, alta sensibilidad, PNH

1|ANTECEDENTES un ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI), a la que se unen muchas proteínas de

la membrana celular, conocidas colectivamente como proteínas ancladas a GPI

La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es una enfermedad adquirida de (GPI-AP).2Entre estos, los GPI-AP son las importantes proteínas reguladoras del

células madre hematopoyéticas con mutación somática del gen ligado al complemento CD55 y CD59. Su ausencia en los clones de PNH conduce a la lisis

cromosoma X (PIG-A).1Este gen es necesario para la síntesis de de glóbulos rojos mediada por el complemento, uno de los

Int J Lab Hematol.2020;00:1–7. wileyonlinelibrary.com/journal/ijlh © 2020 John Wiley & Sons Ltd. 1|
2 | SETHy otros.

rasgos característicos de la HPN.2La expansión de clones similares a PNH muestras recolectadas el mismo día, al ser un laboratorio de citometría de flujo

también se puede detectar en casos de anemia aplásica y síndromes independiente, también recibimos muestras enviadas. Todas las muestras fueron

mielodisplásicos.1,2 procesadas en un plazo máximo de 72 horas desde el momento de la recolección. Las

Hay disponibles múltiples pruebas de diagnóstico para la PNH en varias muestras coaguladas, las muestras hemolizadas y las muestras de sangre periférica

plataformas, incluidas las pruebas de tarjeta de gel y basadas en complemento, los sin EDTA no se aceptaron para los ensayos de PNH.

ensayos basados en citometría de flujo y las pruebas de diagnóstico molecular para

la detección de mutaciones del gen PIG-A.3Actualmente, la citometría de flujo (FCM) es

la modalidad de diagnóstico estándar de oro para la detección de glóbulos rojos (RBC) 2.2|anticuerpos
deficientes en GPI-AP, así como leucocitos.4,5Utiliza anticuerpos monoclonales contra

GPI-AP, que están presentes en la superficie celular normal, pero son deficientes en El panel de cinco colores de anticuerpos que se utilizó fue en la siguiente

los clones de PNH. Debido a que la PNH se reconoció inicialmente como un tipo de combinación (fluoróforo, clon, volumen individual): FLAER (AF488, Cedarlane, 2µ

anemia hemolítica, el enfoque inicial en los glóbulos rojos (RBC) condujo al desarrollo L), CD157 (PE, SY11B5, 2,5µL), CD15 (PECy5, 80H5, 2µL), CD64 (PE-CY7, 10.1, 2.5µ

de varios ensayos basados en RBC. Las dos estructuras ligadas a GPI, CD55 (Factor de L) y CD45 (APCH7, 2D1, 2µL). Todos los anticuerpos fueron debidamente

aceleración de descomposición, DAF) y CD59 (Inhibidor de membrana de lisis reactiva, titulados. FLAER se obtuvo de Cedarlane, Ontario, Canadá. CD157PE,

MIRL) en glóbulos rojos, se han utilizado ampliamente para el ensayo de PNH basado CD64PECy7 y CD45APC-H7 se obtuvieron de BD Biosciences San Jose, CA, EE.

en RBC.5 UU. CD15 PECy5 se obtuvo de Beckman Coulter CA, EE. UU. Para el

La prueba de glóbulos rojos solo en un análisis de rutina no es adecuada para la procesamiento de rutina, se preparó un cóctel de anticuerpos para 10 pruebas

evaluación de pacientes con PNH, porque la hemólisis y la transfusión pueden para uso de rutina que incluía un volumen final total de anticuerpos de 110µL y

subestimar en gran medida el tamaño del clon de PNH. Además, los clones de RBC 90µL de fluido de vaina se agregó para lograr un volumen final de 200µL. Los

nunca se ven sin un clon de WBC.1No obstante, las pruebas de glóbulos rojos aún cócteles se almacenaron durante un período de un mes y se validaron mediante

pueden ser importantes, tanto porque las células de tipo II se detectan más fácilmente controles internos.

como porque la comparación de los tamaños relativos de los clones de glóbulos rojos

y glóbulos blancos puede proporcionar información clínica útil. Sutherland et al.4-6han

demostrado que la identificación de WBC de PNH con el ensayo FLAER representa una 2.3|Protocolo de preparación y tinción celular.
prueba de detección primaria mucho más eficiente y rentable para la mayoría de los

laboratorios de flujo clínico que realizan pruebas de PNH que los ensayos basados en Se tomó un hemograma completo (CBC) de una muestra de sangre periférica

RBC. Las guías de consenso ICCS/ESCCA PNH de 20184han sugerido usar dos con diferencial del analizador de CBC Sysmex Xn350 para comprobar el

marcadores vinculados a GPI que deben analizarse en más de un linaje, típicamente, recuento total de leucocitos (TLC) y el recuento absoluto de neutrófilos (ANC).

neutrófilos y monocitos. Si ANC fue más de 2500 células/µL, 100µSe usó L muestra para el

El diagnóstico de HPN mediante FLAER se recomendó como el ensayo procesamiento. Si ANC estaba entre 1500 y 2500 células/µL, 200µSe utilizó L

estándar de oro según las pautas internacionales de 2010.4FLAER (Pinewood muestra. Muestras con ANC de menos de 1500 células/µL, preferimos tomar

Scientific Services, Victoria, BC, Canadá) es una variante inactiva conjugada con 100µL muestra limpia y 100µL de capa leucocítica preparada a partir de la

fluorocromo de la proteína aerolisina formadora de canales derivada de misma muestra. Aislamos la capa leucocítica de la sangre total mediante una

bacterias, que se une específicamente a los anclajes GPI.7 centrifugación inicial (1200gramodurante 5 minutos)10sin gradiente de

CD157 (ADP-ribosil ciclasa 2) es una enzima de superficie celular anclada a densidad. Este giro inicial concentra los glóbulos rojos en la parte inferior y el

GPI y se expresa brillantemente tanto en granulocitos como en monocitos. Se plasma en la parte superior, la capa leucocitaria forma la interfaz y contiene la

ha encontrado que tiene una sensibilidad equivalente en comparación con la de mayoría de los leucocitos y plaquetas de toda la sangre. La muestra para

los paneles de análisis de 4-6 colores que se usan habitualmente.8,9Una procesamiento se tomó en 12×Tubos Falcon de 75 mm.

combinación de FLAER y CD157 es una de las combinaciones recomendadas de En todos los casos se utilizó el protocolo Stain-Lyse-Wash. A los tubos

reactivos para identificar leucocitos con deficiencia de GPI.4 etiquetados, 20µSe añadió l de cóctel de anticuerpos a la muestra y se incubó en la

El objetivo de este estudio fue resaltar la solidez de la combinación de oscuridad durante 15 minutos, seguido de un paso de lisis de glóbulos rojos utilizando

FLAER y CD157 para identificar clones de PNH en un ensayo de alta sensibilidad 2 ml de solución FACS Lyse comercial (prediluida 1:10 para preparar una solución de

y compartir la experiencia de un laboratorio de citometría de flujo lisis de trabajo). Esto se mantuvo en incubación durante 10 minutos seguido de

independiente. centrifugación a 450gramodurante 5 minutos. El sobrenadante se decantó y el

sedimento celular se lavó con 2 ml de líquido envolvente. La suspensión final para la

adquisición se preparó con 0,5 mL de líquido envolvente.

2|MÉTODOS

2.1|Muestra 2.4|Adquisición y análisis

Se utilizaron muestras de sangre completa con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Las muestras se adquirieron en la plataforma de citómetro de flujo BD FACS CANTO II

Las muestras fueron procesadas dentro de las 24 horas siguientes a su recepción en el con el software BD FACS DIVA versión 8. La configuración del instrumento y el control

laboratorio. Si bien la mayoría de las muestras enviadas eran frescas de calidad diario se realizaron con cuentas CS&T (BD Biosciences).
SETHy otros. |3
Para cada caso, se adquirieron y analizaron un mínimo de 50 000 neutrófilos. Si El inmunofenotipo a veces puede informarse como un clon de PNH falso positivo en

hubo algún evento en el área positiva de PNH, se recolectaron 250 000 eventos un ensayo de alta sensibilidad y, por lo tanto, destaca la importancia de retroactivar

de neutrófilos reflejos para un ensayo de alta sensibilidad (0,01 %). El umbral de poblaciones pequeñas (Figura 1A, B) y volver a analizarlas en todos los gráficos de

20 eventos de neutrófilos que forman un grupo compacto y el umbral de 50 activación. Los eosinófilos se pueden identificar fácilmente mediante retrocompuertas,

eventos de neutrófilos que forman un grupo reproducible se definieron como como se muestra en la Figura 1 (E y B).

límite inferior de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ), Las muestras enviadas tienden a mostrar degeneración y desgranulación, por lo

respectivamente. que se alteran las propiedades de dispersión, así como la expresión del marcador CD,

como se muestra en la Figura 2. A menudo, el grupo normal de granulocitos y/o

monocitos comienza a mostrar un patrón de seguimiento, y estas células pueden

2.5|Consideraciones de tiempo y temperatura verse en la activación inversa. tener propiedades de dispersión alteradas así como una

menor expresión de CD45. Se debe tener cuidado de no informar sobre las células en

Se evaluó la estabilidad de la muestra del ensayo de PNH durante el proceso de degeneración como un clon menor falso positivo de células de PNH. En caso de duda,

validación original de este ensayo (datos no publicados), donde las muestras se se recomienda encarecidamente repetir el ensayo en una muestra nueva para

dividieron y almacenaron a temperatura ambiente y entre 2 y 8 grados. Las confirmarlo.

muestras se analizaron los días 0, 1, 2 y 3. El análisis de WBC realizado en

muestras almacenadas a temperatura ambiente mostró signos de

degeneración después de 48 a 72 horas. Sin embargo, no hubo evidencia de 3|RESULTADOS

ninguna degeneración significativa para las muestras almacenadas a 2-8 grados

hasta una duración de 3 días. Se realizó un análisis retrospectivo de 364 pacientes durante un
período de 40 meses (agosto de 2015 a marzo de 2019). Las
citopenias periféricas y la hipoplasia de la médula ósea fueron las
2.6|Ensayos de dilución en serie indicaciones clínicas más comunes. La anemia fue el hallazgo más
común en estos casos, y también se observó con frecuencia
Una muestra fresca positiva para PNH con un tamaño de clon grande se diluyó trombocitopenia. Hubo 192 hombres y 172 mujeres (M: F = 1,12: 1)
en serie en una dilución de diez veces hasta 1:10 000, con sangre periférica en nuestro estudio, rango de edad de 1 a 85 años (mediana de 62
normal. A continuación, se tiñeron de forma rutinaria y se midió el tamaño del años). Diecisiete fueron casos pediátricos y 347 casos fueron adultos.
clon de PNH. Se anotaron las proporciones de granulocitos/monocitos de PNH y En nuestro estudio, se identificó el clon de HPN en 59 casos (16,2%)
se correlacionaron con la dilución como se muestra en la Tabla 1. de 364 casos. La variabilidad del tamaño del clon varía desde 0,02%
hasta 96,3% en el linaje de neutrófilos y desde 0,07% hasta un
máximo de 96,3% en monocitos. Veintidós (37,3 %) de los 59 casos
2.7|Plantilla de análisis que mostraban un clon de PNH tenían un tamaño de clon inferior al
1 %.11
La plantilla de análisis detallada se muestra en la Figura 1. Se utiliza una puerta primaria en

CD45 frente a SSC para seleccionar ampliamente granulocitos y monocitos. En CD15 frente a

SSC, los granulocitos brillantes de CD15 están estrechamente sincronizados y los monocitos En nuestro estudio, encontramos 10 casos (10/364 %-2,74 %) que

brillantes de CD64 están estrechamente sincronizados en el gráfico de CD64 frente a SSC. mostraban un fenotipo negativo para CD157 con ausencia de expresión de
También se ha mostrado la jerarquía de la población. En un análisis de HPN de alta CD157 en todos los granulocitos y monocitos excepto en un caso en el que solo

sensibilidad, es necesario asegurarse de que la pequeña cantidad de eventos de HPN un subconjunto ~1 % de granulocitos y monocitos mostró negatividad para

identificados formen un grupo compacto y se encuentren en la parte central de las células de CD157 (Figura 3, Caso 2—Parcelas [C] y [D]).

la serie de granulocitos y monocitos (Figura 1B) y no deben estar presentes en los bordes de Todos los pacientes eran de etnia india, pero no se disponía de antecedentes

los eventos cerrados. Eventos positivos para CD15 inespecíficos y eventos positivos para CD64 significativos de ingesta de medicamentos alternativos. Hepatitis B (5 casos) y análisis

que muestran FLAER negativo de ANA (2 casos) donde estuvo disponible fue negativo. Tres fuera

TABLA 1Ensayo de dilución en serie

HPN HPN
para granulocitos y monocitos
Granulocitos HPN granulocitos monocitos PNH monocitos
Dilución correr 1 correr 2 correr 1 correr 2

mezcla 1:1 con 59,4% 57,94% 84,1% 81,07%

PB normal

1:10 7,45% 8.454% 22.412% 24,8%

1:100 0.879% 1.143% 2.915% 4.006%

1:1000 0.104% 0.101% 0.354% 0.426%

1:10 000 0.014% 0.013% 0.050% 0.074%

4 | SETHy otros.

FIGURA 1Diagramas de puntos de la plantilla de PNH. El título de cada diagrama de puntos muestra la población que se muestra en el diagrama de puntos. A, la
población de Singlets se muestra en este diagrama de puntos, y la puerta de viabilidad FSC SSC se dibuja en esta población. B, Aquí se muestra la población viable
FSC SSC, y la puerta amplia CD45 frente a SSC se dibuja en esta población. Esta es la puerta principal utilizada para el análisis posterior. C y D, los granulocitos y los
monocitos se seleccionan aún más en las gráficas CD15 Vs SSC y CD64 Vs SSC, respectivamente. E, grupo de eosinófilos marcados por un color verde oscuro que
muestra una expresión de tenue a negativa de la expresión de CD157, (E) y (F) muestran una expresión normal de CD157 y FLAER en granulocitos (color rosa) y
monocitos (color verde), respectivamente. Parcelas (E) & (F) que muestra FLAER y una población negativa para CD157 indicativa de un clon de PNH que se ha
identificado en las series de granulocitos y monocitos como marcadas por el color azul y el color marrón, respectivamente. G, Jerarquía de población de la plantilla
de HPN [La figura en color se puede ver en wileyonlinelibrary.com]

FIGURA 2Muestra enviada procesada después de 48 h. El título de cada diagrama de puntos muestra la población que se muestra en el diagrama de puntos. El diagrama de
puntos (A) muestra granulocitos (color rosa), (B) monocitos (color verde) que muestran una expresión normal de FLAER y CD157. El rastro de degeneración marcado por el color
azul en los granulocitos y el color rojo en los monocitos se ve en las parcelas (A) y (B), respectivamente. C, Se observa que la población de color azul y rojo muestra una expresión
de CD15 y CD64 relativamente más tenue en comparación con los granulocitos y los monocitos, respectivamente. Las poblaciones azul y roja muestran (D) una expresión de
CD45 relativamente más tenue, y también se observa que pierden (E) las propiedades de dispersión frontal y lateral indicativas de degeneración [La figura en color se puede ver
en wileyonlinelibrary.com]

de diez casos también mostró la presencia de PNH Clon como se identificó en base a la intentaron obtener muestras de nuestros pacientes para volver a analizar la

ausencia de expresión de FLAER tanto en granulocitos como en linajes de monocitos. negatividad de CD157 en un momento posterior, pero no tuvieron éxito. De nuestros

Los casos seleccionados se volvieron a comprobar con un cóctel fresco y se 10 casos, 3 casos se perdieron durante el seguimiento y 2 casos fallecieron debido a

compararon con los casos de control, pero mostraron resultados coherentes que complicaciones de la enfermedad primaria. Aunque otros cinco pacientes están vivos y

indicaban una posible expresión negativa de CD157 (clon SY11B5). Nosotros bien, todos son pacientes externos que habían visitado el
SETHy otros. |5

FIGURA 3Fenotipo negativo para CD157. Caso 1. [Gráficas (A) y (B)] Granulocitos positivos para FLAER negativos para CD157 (color rosa) y monocitos (color verde)
junto con un clon de PNH negativo para FLAER tanto en granulocitos (color azul) como en monocitos (color marrón), respectivamente. Caso 2. [Gráficas (C) y (D)]
muestran ausencia de expresión de CD157 solo en un subconjunto ~1 % de granulocitos (color rosa) y monocitos (color verde), mientras que la mayoría de
granulocitos y monocitos muestran una expresión normal de CD157 [Se puede ver la figura en color en wileyonlinelibrary.com]

ciudad durante su evaluación primaria solamente. Las muestras de seguimiento no estaban presencia del clon PNH.14Un estudio de Rahman et al.15y Kashyap R et al.dieciséis

disponibles para evaluación en ninguno de estos casos. ambos informaron una tasa de detección relativamente más alta de casos
positivos para HPN, de ~31,09 % y ~35,29 %, respectivamente. Zhang et al.17

y Morado M et al.18durante un período de 3 años se han notificado 43 casos

4|DISCUSIÓN positivos de PNH (~12 %) y 563 casos positivos de PNH (~14 %),

respectivamente. Rahman et al.15han resaltado el problema de la amplia

La PNH tiene una incidencia estimada de solo 1,3 casos nuevos por millón de variación en la tasa de detección de clones de PNH en función de la indicación

personas por año.1Aunque la PNH es rara, la detección de pacientes apropiados clínica utilizada para la prueba. Se encontraron clones positivos para PNH en

y el diagnóstico correcto son importantes, porque la PNH es una enfermedad 169/433 (39,03 %) casos de AA, 2/34 (5,88 %) casos de SMD, 22/84 (26,19 %)

crónica que persiste durante muchos años. El desarrollo y el ensayo clínico casos de hemolítico y 1/63 (1,59 %) casos de grupo de estudio de trombofilia.

exitoso de un anticuerpo monoclonal humanizado contra la proteína terminal Rahman et al.15en su estudio también informaron que el grupo de falla de la

del complemento C5 (Eculizumab) ha mejorado la calidad de vida de los médula ósea (BMF) [AA y MDS] con clon de PNH tenía un tamaño de clon

pacientes con PNH hemolítica al reducir los requisitos de hemólisis, trombosis y significativamente más bajo (mediana: 2,7 %) en comparación con el grupo de PNH

transfusiones. Esto ha hecho que la detección y el diagnóstico preciso de la PNH clásico (mediana: 77,2 %). De manera similar, en nuestro estudio, 22 (37,3 %) de 59

sean prioridades importantes para muchos laboratorios clínicos.12 casos mostraron clones menores de PNH con un tamaño de clon inferior al 1 %,

siendo la mayoría pacientes con anemia aplásica.

El diagnóstico de PNH ha mejorado mucho con la llegada de los ensayos basados Cabe señalar que FLAER no está disponible en todos los países y/o es
en citometría de flujo. Los ensayos iniciales se dirigieron hacia los glóbulos rojos costoso de obtener en algunos otros. Para abordar este problema,
usando CD55/CD59. La presencia de glóbulos rojos normales recientemente Marinov et al.11había validado un ensayo de 6 colores de un solo tubo no
transfundidos reduce significativamente la capacidad de detectar glóbulos rojos de basado en FLAER, lo que sugiere que es posible una evaluación
PNH. Sin embargo, los análisis RBC de 2 colores (basados en CD235 y CD59) simultánea rentable de neutrófilos y monocitos de PNH sin FLAER.
recomendados actualmente y los análisis WBC basados en FLAER miden de manera Sutherland et al.6había desarrollado y validado un ensayo de leucocitos de
confiable los tamaños de los clones de PNH incluso a niveles muy bajos.4Solo hay un HPN de un solo tubo de 7 colores, compatible con las directrices,
puñado de laboratorios en India que realizan ensayos de PNH de alta sensibilidad multiplataforma (Navios y Canto II), y sus resultados confirmaron una
utilizando FLAER, que es el "estándar de oro" actual para la detección de clones de muy buena concordancia entre los tubos FLAER y los no basados en
PNH. FLAER. Sin embargo, no se recomienda el uso de enfoques no basados
Recibimos una mezcla de muestras con información clínica limitada y en FLAER en lugares donde FLAER está disponible y es asequible.
seguimiento limitado. De los 364 pacientes, se identificó el clon de HPN en las En el presente estudio encontramos 10 casos (2,74%) con falta de
series de granulocitos y monocitos en 59 pacientes (16,20 %) durante un señal de CD157 en granulocitos y monocitos. Zhang et al.17en su
período de 40 meses. El tamaño del clon de PNH varió de ~0,02 % a 96,6 % en estudio habían identificado un 5,75% de casos con ausencia de
granulocitos y de 0,07 % a 96,3 % en monocitos. En la bibliografía revisada, un CD157 que eran FLAER positivos. Blaha J y otros19en su estudio
estudio realizado por Sachdeva MU et al informó una tasa de detección general informaron que el clon de anticuerpo anti-CD157 comúnmente
de ~5,87 % y también mostró que la tasa de detección del clon PNH aumentó disponible SY11B5 no detecta una variante polimórfica común de
del 4,5 % (32/711) en la era anterior a FLAER a 9,2 % (27/293) con la introducción CD157 (p.Arg145Gln). La variante polimórfica de CD157 (p.Arg145Gln)
de FLAER.13En un estudio realizado por Illingworth et al, se examinaron un total solo fue detectable en experimentos de citometría de flujo utilizando
de 10 236 pacientes de alto riesgo durante un período de 9 años, de los cuales el clon de anticuerpo RF3. Habían explicado que dos casos de CD157-
633 (~6,2 %) pacientes revelaron negativo no HPN se debían a un polimorfismo en el CD157
6 | SETHy otros.

molécula. La instalación para el análisis genético y el clon CD157 alternativo ID ORCO

(RF3) no estuvo disponible para nuestra evaluación. Sutherland et al.20en su Neha Seth https://orcid.org/0000-0002-3299-4201
respuesta al estudio de Blaha J et al.19habían demostrado que los casos de Vidisha Mahajan https://orcid.org/0000-0003-3089-1580
CD157-negativos y no HPN son muy raros y notaron solo un total acumulado de Shweta Kedia https://orcid.org/0000-0002-2348-9238
18 casos de CD157-negativos con una frecuencia de entre 0,5% y 1%. En Archana sutar https://orcid.org/0000-0002-4595-1614
resumen, informaron que aproximadamente la mitad de todos los casos eran Kunal Sehgal https://orcid .org/0000-0002-4099-4578
de origen asiático. La mayoría de los casos, pero no todos, estaban tomando

medicamentos convencionales de varios tipos. Curiosamente, una minoría de REFERENCIAS

sus casos tenía antecedentes de positividad para el antígeno de superficie de la 1. Borowitz MJ, Craig FE, Diguiseppe JA, et al. Directrices para el diagnóstico y

hepatitis B (HepB) y otros tenían positividad para ANA. Hepatitis B (5 casos) y seguimiento de la hemoglobinuria paroxística nocturna y trastornos
relacionados por citometría de flujo.Citometría B. 2010;78:211-230.
análisis de ANA (2 casos) donde estuvo disponible fue negativo en nuestro
2. Parker CJ. Aspectos históricos de la hemoglobinuria paroxística nocturna
estudio. Similar a nuestro caso 2 (Parcelas C y D) que se muestra en la Figura 3, 'definiendo la enfermedad'.Br J Haematol. 2002; 117:3-22.
Sutherland et al.20también tuvo uno de sus casos en el que se observaron 3. Gupta R, Pandey P, Choudhary R, et al. Comparación prospectiva de
alrededor del 12 % de granulocitos CD157 negativos y monocitos CD157 cuatro técnicas para el diagnóstico de Hemoglobinuria Paroxística
Nocturna.Int J laboratorio Hematol. 2007;29:119-126.
negativos. Resumiendo, han afirmado correctamente que, si bien el
4. Sutherland DR, Illingworth A, Marinov I, et al. Pautas de consenso ICCS/ESCCA
polimorfismo CD157 explica algunos casos, puede que no sea una explicación
para detectar células con deficiencia de GPI en la hemoglobinuria paroxística
que cubra todas las diferentes situaciones negativas para CD157. Por lo tanto, nocturna (PNH) y trastornos relacionados, parte 2: selección de reactivos y

la mayor parte de la literatura ha enfatizado claramente la inclusión obligatoria optimización del ensayo para pruebas de alta sensibilidad.Citometría B.
2018;94:23-48.
del reactivo GPI (FLAER) para evitar la interpretación errónea de los datos como
5. Sutherland DR, Keeney M, Illingworth A. Pautas prácticas para la
una "muestra que contiene clones de PNH" y se requiere la pérdida de al menos
detección y el control de alta sensibilidad de clones de
dos estructuras vinculadas a GPI por linaje. para identificar fenotipos de PNH de hemoglobinuria paroxística nocturna mediante citometría de flujo.
buena fe. Citometría B. 2012;82:195-208.
6. Sutherland DR, Ortiz F, Quest G, et al. Ensayos de WBC de HPN de 5, 6 y 7
colores de alta sensibilidad para las plataformas Canto II y Navios.
Citometría B. 2018;94:637-651.
5|CONCLUSIONES 7. Brodsky RA, Mukhina GL, Nelson KL, et al. Resistencia de las células de
hemoglobinuria paroxística nocturna a la toxina de unión a
La combinación de FLAER y CD157 fue exitosa para el diagnóstico de HPN glicosilfosfatidilinositol aerolisina.Sangre. 1999;93:1749-1756.
8. Sutherland DR, Acton E, Keeney M, et al. Uso de CD157 en un ensayo
con una tasa de detección del 16,18% en nuestro laboratorio. Veintidós
basado en FLAER para la detección de granulocitos y monocitos de PNH
(37,2 %) de los 59 casos que mostraban un clon de PNH tenían un tamaño de alta sensibilidad.Citometría B. 2014;86B:44-55.
de clon de <1 %, lo que destaca la importancia de los ensayos de alta 9. Marinov I, Kohutova M, Tkakova V, et al. Relevancia clínica de CD157
sensibilidad basados en FLAER para identificar clones subclínicos. Hubo para la evaluación simultánea rápida y rentable de granulocitos y
monocitos de PNH mediante citometría de flujo.Int J Lab Hematol.
diez casos con falta de señal de CD157 (clon SY11B5) en granulocitos y
2015;37:231-237.
monocitos. Estos casos raros de fenotipo negativo para CD157 resaltan la 10. Bain B, Bates I, Laffan M, Lewis S.Hematología práctica de Dacie y
necesidad de seguir las pautas internacionales que requieren el uso de Lewis. Filadelfia: Churchill Livingstone/Elsevier; 2012.
dos reactivos capaces de detectar fenotipos deficientes en GPI por linaje y 11. Marinov I, Illingworth AJ, Benko M, et al. Características de rendimiento de
un ensayo de hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH) no fluorescente
que no se puede declarar un fenotipo de PNH sin la pérdida de ambos.
basado en aerolisina para la evaluación simultánea de neutrófilos de PNH
y monocitos de PNH mediante citometría de flujo, siguiendo las pautas
publicadas de PNH.Citometría B. 2018;94:257-263.
CONFLICTO DE INTERESES 12. Brodsky RA, Young NS, Antonioli E, et al. Estudio multicéntrico fase 3
del inhibidor del complemento eculizumab para el tratamiento de
Ninguno de los autores tiene ningún conflicto de interés que declarar.
pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna.Sangre. 2008;
111: 1840-1847.
CONTRIBUCIONES DE AUTOR 13. Sachdeva MUS, Varma N, Chandra D, et al. La citometría de flujo
Kunal Sehgal diseñó el estudio, realizó el análisis de datos y escribió el multiparamétrica basada en FLAER para el cribado de la hemoglobinuria
paroxística nocturna mejora la tasa de detección en pacientes con anemia
artículo; Neha Seth hizo el análisis de datos, cotejó los datos y escribió el
aplásica.ann hematol. 2015;94:721-728.
documento; Vidisha Mahajan hizo el análisis de datos; Shweta Kedia,
14. Illingworth A, Marinov I, Sutherland DR, et al. Directrices de consenso ICCS/
Archana Sutar procesó las muestras y ayudó en el análisis y la recopilación ESCCA para detectar células deficientes en GPI en la hemoglobinuria
de datos. Todos los autores contribuyeron a la redacción del manuscrito y paroxística nocturna (PNH) y trastornos relacionados Parte 3
– Análisis de datos, elaboración de informes y estudios de casos.Citometría Parte B.
aprobaron la versión final del manuscrito.
2018;94B:49-66.
15. Rahman K, Gupta R, Yadav G, et al. Detección de hemoglobinuria paroxística
DECLARACIÓN DE DISPONIBILIDAD DE DATOS nocturna (PNH) basada en aerolisina fluorescente (FLAER): una
Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están experiencia de un solo centro de la India.En t. Hematol de laboratorio J.
disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. 2017;39:261-271.
SETHy otros. |7
16. Kashyap R, Awasthi NP, Gupta R. Análisis clínico y de citometría de de clones de PNH en glóbulos blancos, no detecta una variante
flujo de la hemoglobinuria paroxística nocturna en pacientes indios.J polimórfica común codificada por BST-1.Citometría B. 2019;96:16-18.
Appl Hemayol. 2019;9:85-90.
17. Zhang Y, Ding J, Gu H, et al. Diagnóstico de hemoglobinuria paroxística
nocturna con paneles de citometría de flujo que incluyen CD157: datos del
Cómo citar este artículo:Seth N, Mahajan V, Kedia S, Sutar A, Sehgal K.
mundo real.Citometría B. 2019;98:193-202.
Utilidad de FLAER y CD157 en un ensayo de alta sensibilidad de un solo
18. Morado M, Freire Sandes A, Colado E, et al. Detección diagnóstica de
hemoglobinuria paroxística nocturna: evaluación multicéntrica prospectiva de tubo de cinco colores, para el diagnóstico de paroxística
las indicaciones médicas actuales.Citometría B. 2017;92:361-370. Hemoglobinuria nocturna (PNH): una experiencia de
19. Blaha J, Schwarz K, Fischer C, et al. El clon de anticuerpo monoclonal anti-
laboratorio de citometría de flujo independiente.Int J Lab
CD157 SY11B5, utilizado para la detección de alta sensibilidad de clones
Hematol. 2020;00:1–7.https://doi.org/10.1111/ijlh.13366
de PNH en glóbulos blancos, no detecta una variante polimórfica común
codificada por BST-1.Citometría B. 2018;94B:652-659.
20. Sutherland DR, Musani R, Blaha J, et al. El anticuerpo monoclonal anti-
CD157 clon SY11B5, utilizado para la detección de alta sensibilidad