¿Qué es Cromatografía?

La cromatografía es un procedimiento químico utilizado en todas las ramas de la ciencia, que

permite la separación, identificación, cuantificación, cualificación y determinación de los
componentes químicos individuales de sustancias en mezclas complejas, de acuerdo con la
purificación de compuestos de una manera muy precisa. Estos procedimientos, abarcan varias
técnicas separativas basadas en propiedades físicas de ciertos materiales que, en interacción con
otras sustancias o mezclas de éstas, permite descomponer la mezcla y analizar sus constituyentes,
mediante una fase móvil que consta, según el procedimiento, de un líquido o gas que corre a
través de una superficie y de la fase estacionaria y una fase estacionaria de materia sólida o líquida
que se queda en la misma posición.

Cromatografía

De esta manera, los componentes en una muestra a analizar se van distribuyendo en estas dos
fases, cuando la fase móvil atraviesa la fase estacionaria es lo que se denomina proceso de
elución. La separación de los distintos componentes de la muestra es resultado de repetidos
procesos de sorción – desorción de estos componentes, para finalmente lograr su separación y
visualizarlos en una gráfica que se conoce como cromatograma.

Los procedimientos más importantes en cromatografía son la cromatografía en papel,

cromatografía en capa fina, cromatografía en columna y la cromatografía de gases.

Esta técnica es muy efectiva por lo que es utilizada tanto en el área de la investigación como en el
campo industrial.
 Tipos de cromatografía

Existen diferentes criterios de clasificación de la cromatografía:

 Por la naturaleza de sus fases:

 Cromatografía líquido - líquido

 Cromatografía gas - líquido

 Cromatografía líquido -. sólido

 Cromatografía gas - sólido

 Atendiendo al proceso químico-físico que va a protagonizar el proceso de separación: siendo

este el

criterio más coherente de clasificación:

 Cromatografía de Adsorción (líquido - sólido o cromatografía de fases normales).

 Cromatografía de Reparto (o líquido - líquido), se basa en las características de solubilidad

relativa de los solutos entre la fase móvil y una fase estacionaria de un líquido no polar. La fase

líquida se impregna a un soporte inerte de sílice o, en el caso de cromatografía de fase

invertida, se une químicamente.

 Cromatografía de Intercambio iónico.

 Cromatografía de Exclusión.

 Con base en la naturaleza del soporte en el que se aloja la fase estacionaria:

 Cromatografía plana:

 Cromatografía en papel

 Cromatografía en capa fina (TLC)

 Cromatografía en columna:

 Cromatografía de gases (GC)

 Cromatografía líquida (LC)

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Todas las cromatografías denominadas en columna se caracterizan por tener una fase estacionaria
que se

encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de diámetro por la que se hace pasar
una fase móvil

líquida o gaseosa que estará en permanente movimiento. Según la afinidad de las moléculas por la
fase móvil

o la estacionaria, éstas se separaran.

Después de cada cromatografía se puede obtener información del cromatograma tanto cualitativa
(para

identificar los distintos compuestos de la mezcla) como cuantitativa (para poder obtener la
cantidad y

composición de las sustancias separadas).

Las fases estacionarias pueden ser de materiales muy distintos, existen derivados de dextranos
(sefadex),

derivados de agarosa, poliacrilamida, esferas de vidrio, sílice, etc.

Existen distintos tipos de cromatografía en columna:

Cromatografía de intercambio iónico: se basa en la afinidad de los iones en solución por los sitios
de

polaridad opuesta que se encuentran en la fase estacionaria.

Cromatografía de exclusión: Se basa en la habilidad de materiales de porosidad controlada para

separar los

componentes de una mezcla de acuerdo al tamaño y forma de las moléculas.

Cromatografía de afinidad: se fundamenta en la especificidad de algunas macromoléculas

biológicas. Éstas se

unen específicamente a la fase estacionaria y para separar dicha macromolécula, bastará con
variar el pH una

vez que la columna este limpia y sólo se encuentre de interés.

Cromatografía de adsorción: se basa principalmente en las diferencias en la afinidad relativa de los

compuestos por el sólido utilizado como fase estacionaria. Las separaciones obtenidas se
determinan casi

exclusivamente por interacciones polares, siendo la fase estacionaria más polar que la fase móvil.
Cromatografía de partición: la fase estacionaria es un líquido soportado en un sólido inerte. Otra
vez, la fase

móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido-líquido) o un gas (cromatografía de

partición

gas-líquido, GLC). La cromatografía en papel es un tipo de cromatografía de partición en la cual la

fase

estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel. La cromatografía de gases (GC) y
de alta

resolución (HPLC) son técnicas de partición ampliamente empleadas.

Cromatografía de fase reversa: el mecanismo de separación depende de interacciones

hidrofóbicas entre las

moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria.

La naturaleza

actual de las interacciones de unión hidrofóbica asume que la interacción de unión es el resultado
de un

efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales de unión de la fase móvil usadas en la
cromatografía de

fase reversa son acuosas lo cual indica un grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor
de las

moléculas de soluto y el ligando inmovilizado. A medida que el soluto se une al ligando hidrofóbico

inmovilizado disminuye el área hidrofóbica expuesta hacia el disolvente. Así, el grado de

organización de la

estructura de agua disminuye con un favorable aumento de entropía en el sistema

CROMATOGRAFÍA PLANA

La mayoría de los principios que se aplican para la cromatografía en columna se aplican también a
la

cromatografía en superficie plana.

Cromatografía en capa fina (TLC)

Para la cromatografía en capa fina (TLC), la fase estacionaria es una capa de partículas de unos
milímetros de

espesor, fijadas sobre un soporte sólido generalmente de aluminio, plástico o vidrio. Después de
aplicar el

analito cerca de la parte inferior de la placa seca, el disolvente empieza a producir la separación.
La ventaja principal de la TLC es que se analizan simultáneamente la muestra y el patrón, mientras
que en la

cromatografía en columna las muestras se analizan individualmente. Además, las muestras que
son difíciles de

separar, se pueden resolver utilizando dos disolventes diferentes por desarrollo de la placa en
direcciones

perpendiculares.

Otra ventaja es que, si los componentes no se pierden en los vapores que rodean la placa, todos
estarán en

algún lugar de la misma, mientras que en la cromatografía en columna algunos componentes no

eluyen y se

pierden. Y a esto se suma que la placa de TLC se usa una sola vez, por lo que se pueden utilizar
condiciones

severas de separación.

La mancha en una placa de TLC se caracteriza por la distancia que recorre con relación a la
distancia recorrida

por la fase móvil. El grado de retención en cromatografía plana de superficie se expresa como el
factor de

retardación, o índice de retención Rf: ܴ݂ =

‫݋ݐݑ݈݋ݏ݈݁݀݋ݐ݊݁݅ ݉ܽݖ݈ܽ݌ݏ݁݀݅ܿ݊ܽݐݏ݅ܦ‬

݁‫݊݁ݐݒ݈݋ݏ݈݀݅݁݀݋ݐ݊݁݅ ݉ܽݖ݈ܽ݌ݏ݁݀݅ܿ݊ܽݐݏ݅ܦ‬

El “frente” del disolvente es el límite alcanzado por la fase móvil, en éste se mide la distancia en
que se ha

desplazado éste. El valor de Rf depende de las mismas condiciones experimentales que el valor de
K de la

cromatografía en columna: la composición de la fase móvil, el tipo de fase estacionaria, la

temperatura y el

tipo de compuestos separados.

También se puede definir el coeficiente de distribución, K, en términos de la concentración del

soluto en la

fase móvil, Cm, y en la fase estacionaria, Cs:

=‫ܭ‬

‫ݏܥ‬
݉‫ܥ‬

La detección y localización de las manchas en la placa de TLC se hace observando los cambios en la

fluorescencia, o absorción en el U.V., de un indicador que se incorporó a la fase estacionaria. Toda

la placa

fluoresce bajo luz UV cuando no hay solutos presentes. Los lugares en los que reside el soluto
aparecen como

manchas oscuras. También podemos observar el color de los compuestos después de reaccionar
con reactivos

específicos para grupos o metales, rociados sobre la placa, como la fluorescamina para aminas.

Existen instrumentos para determinar directamente la fluorescencia y/o color de las manchas en
la placa. Los

instrumentos deben ser capaces de cuantificar la medida sobre el área total de la mancha.

Cromatografía en papel

En este caso, el soporte y fase estacionaria es papel. El papel que normalmente se utiliza es de
celulosa. La

celulosa es muy polar en el agua y se vuelve electronegativa. El papel tiene propiedades de

intercambio iónico

débiles, así como de adsorción.

La mayoría de las propiedades varían de papel a papel, lo que provoca variaciones en el Rf.
Actualmente

existen papeles modificados con resinas cambiadores de iones, alúmina, etc. El aparato que se usa
consta de

un soporte para el papel, un recipiente para el disolvente y una cámara hermética para desarrollar
el

cromatograma. La cámara hermética es necesaria para evitar la evaporación de los disolventes

volátiles

debido a la gran superficie del papel expuesta. Antes de sumergir el papel en el disolvente de
elución se aplica

la muestra en forma de punto diminuto con cualquier objeto que pueda transferir un pequeño
volumen.

El papel debe estar en equilibrio con los vapores del disolvente antes de empezar el desarrollo. La

cromatografía en papel se ha aplicado con buen éxito a problemas de química orgánica e

inorgánica y de
bioquímica.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

La separación en la cromatografía de intercambio iónico depende la adsorción reversible de

moléculas de

soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de carga opuesta. El mecanismo de separación se
basa en un

equilibrio de intercambio iónico. Muchos de los experimento de intercambio iónico se llevan a

cabo en cinco

etapas.

La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador iónico se encuentra en las

condiciones

apropiadas de pH y fuerza iónica, lo que permitirá la unión de las moléculas de soluto. En este
estado inicial,

los grupos que se intercambiarán están asociados con sus respectivos contra-iones (usualmente
aniones o

cationes simples, como cloruro o sodio).

En una segunda etapa se encuentra la aplicación de la muestra y su adsorción, en la cual las

moléculas del

soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento de carga de los contra-iones y se unen

reversiblemente al

gel. Las substancias que no se unen son eluídas de la cama del intercambiador usando el buffer
inicial.

En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorción de la muestra cambiando las condiciones de

elusión, al

desfavorecer la formación del enlace iónico de las moléculas de la muestra y la cama del
intercambiador. Esto

normalmente se logra aumentando la fuerza iónica del buffer de elusión o cambiando su pH.

En las cuarta y quinta etapas corresponden a la remoción de sustancia no eluídas bajo las
condiciones

experimentales previas y regresar al equilibrio de las condiciones iniciales para la siguiente

purificación.

La separación de diferentes sustancias se lleva a cabo porque éstas tienen diferentes grados
interacción con el
intercambiador iónico debido a diferencias en sus cargas, densidades de carga y distribuciones de
carga en su

superficie. Estas interacciones pueden ser controladas variando condiciones como la fuerza iónica
y el pH. Las

diferencias en propiedades de carga de compuestos biológicos son a menudo considerables, y

tomando en

cuenta que la cromatografía de intercambio iónico es capaz de separar especies con propiedades
poco

diferentes.

Se pueden llevar a cabo separaciones por intercambio iónico en una columna, mediante un
procedimiento en

lote o por adsorción en cama extendida.

La matriz. Un intercambiador iónico consiste de una matriz sólida insoluble a la cual se unen de
forma

covalente grupos cargados. Los grupos cargados se asocian a contra-iones móviles. Estos contra-
iones pueden

intercambiarse reversiblemente a otros iones de la misma carga sin alterar la matriz.

La matriz puede tener carga positiva o negativa y los contra-iones también. Los intercambiadores
cargados

positivamente tienen contra-iones cargados negativamente (aniones) disponibles para ser

intercambiados por

lo que son llamados intercambiadores aniónicos. Intercambiadores cargados negativamente

tienen contraiones cargados positivamente (cationes) y se les conoce como intercambiadores
catiónicos.

La matriz puede estar hecha de compuestos inorgánicos, resinas sintéticas o polisacáridos. Las
características

de la matriz determinan sus propiedades cromatográficas tales como su eficiencia, capacidad y

recuperación,

así como su estabilidad química, fuerza mecánica y fluidez. La naturaleza de la matriz afectará su

comportamiento hacia sustancias biológicas y el mantenimiento de la actividad biológica

Grupos cargados. La presencia de grupos cargados es una propiedad fundamental de un

intercambiador

iónico, y el tipo de grupo determina el tipo y fuerza del intercambiador iónico; su número total y
disponibilidad determina la capacidad. Hay una variedad de grupos que pueden escogerse para
usarse en

intercambiadores iónicos; algunos de estos se muestran a continuación.

Se usan los grupos sulfónico y amino cuaternario para formar intercambiadores iónicos fuertes, los
otros

grupos formar intercambiadores iónicos débiles. Los términos fuertes y débiles se refieren a la
extensión de

variación de ionización con pH y no a la fuerza del enlace. Los intercambiadores iónicos fuertes
están

completamente ionizados en un amplio rango de pH mientras que con los intercambiadores

iónicos débiles, el

grado de disociación y la capacidad de intercambio varia más marcadamente con el pH.

CROMATOGRAFÍA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

Fundamentos y principios básicos

El proceso cromatográfico puede ser considerado como: un conjunto de fuerzas que compiten de
manera

selectiva por un compuesto (analito o soluto) para, por una parte, fijarlo al relleno de la columna o
fase

estacionaria, o llevarlo disuelto en los líquidos que fluyen a través de la columna o fase móvil. Los
distintos

tipos de fuerzas entre fase estacionaria y solutos definen los distintos tipos de cromatografía.

En la cromatografía de reparto se utilizan fases estacionarias polares (sílice, alúmina,

hidroxiapatito) y fases

móviles apolares (ciclohexano, isooctano, tetracloruro de carbono, etc.), aplicándose a la

separación de

solutos apolares. El origen de la retención es, por tanto, la interacción de los grupos polares de los
analitos con

los grupos polares de la superficie del relleno.

En la de partición la fase estacionaria es líquida, es necesario ligarla o embeberla sobre partículas

inertes

(generalmente de sílice) para que permanezca fija en la columna. Hoy en día los grupos
funcionales se fijan

mediante enlace químico a las partículas de relleno, lo que permite a la fase estacionaria resistir
las altas
presiones aplicadas en HPLC.

Hay dos posibilidades en la cromatografía de partición: cromatografía en fase normal (cuando la

fase

estacionaria es polar, por ejemplo si contiene grupos ciano, diol, amino o dimetilamino) y
cromatografía en

fase inversa (cuando la fase estacionaria es apolar, por ejemplo con grupos C8 ó C18). La
cromatografía de

partición en fase inversa es la más utilizada de todas las técnicas HPLC, pues las fases móviles
polares

permiten separar una amplia variedad de compuestos de interés bioquímico, farmacológico o

químico. En fase

inversa la retención esta basada en una atracción primaria entre la fase estacionaria y la región no
polar del

analito. El orden de elución es de hidrofílico a hidrofóbico, de polar a no polar. Para aumentar la

retención de

un compuesto, es necesario aumentar la polaridad de la fase móvil. La fase estacionaria más

común es C18.

Las fases móviles más comunes son; acetonitrilo, metanol, tetrahidrofurano, etc. con agua como
componente

de la fase móvil.

En cromatografía de intercambio iónico la fase móvil compite con la estacionaria por los solutos
mediante

fuerzas iónicas. La limitación es que el soluto sea iónico (un anión o un catión). Se trata de una
técnica muy útil

para separar iones inorgánicos, proteínas, etc. Mediante supresión iónica se separan compuestos
iónicos,

suprimiendo (o reduciendo) su estado iónico en solución a través del control del pH, de manera
que quedan

más retenidos en rellenos de fase reversa. Se trata, por tanto, de adaptar la cromatografía de
partición en fase

reversa a la separación de mezclas que contienen uno o varios compuestos ionizables. Funciona
bien para

ácidos débiles y bases débiles. Otro tipo es la cromatografía de pares iónicos que se forma al pasar
una fase
móvil polar que contiene un contraión de carga contraria a la de los solutos, se suele añadir a la
fase móvil un

catión o un anión hidrofóbico, que interacciona con el analito formando el par iónico.

La cromatografía de exclusión molecular separa los solutos en función de su tamaño molecular. El

principal

inconveniente es que se trata de un método de baja resolución. No obstante, es muy útil para la
separación de

proteínas y otras moléculas de alto peso molecular. Es importante que no haya interacción entre
la fase

estacionaria y la muestra.

Las reglas básicas en HPLC son cuatro:

1. Fase móvil y estacionaria han de ser de polaridad opuesta.

2. Todos los solutos han de ser solubles en la fase móvil (es decir, polaridad similar).

3. Todo soluto que entra en la columna ha de salir de ella (propagación).

4. Y, a ser posible, con los distintos solutos separados (migración diferencial).

La elución de los componentes de una muestra comprende el lavado de una parte de la muestra
disuelta en la

fase móvil a través de una columna de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. La
porción de

muestra se introduce por la parte superior de la columna (tiempo t0), los componentes se
distribuyen por sí

mismos entre las dos fases según la naturaleza química de éstos con respecto a las fases móvil y
estacionaria.

Adiciones posteriores del disolvente llevan a las moléculas de soluto hacia abajo en la columna,
hasta que

salen de ella en una tiempo determinado (tx).

La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fracción de tiempo que ha necesitado para
salir de la

columna, tiempo que es detectado por un detector. Esta velocidad será pequeña para solutos
fuertemente

retenidos por la fase estacionaria, y será grande para solutos que tengan mayor afinidad por la
fase móvil.
El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la señal se transforma en una gráfica en
función del

tiempo denominada cromatograma. El cromatograma discurre horizontalmente paralelo a la

escala de

tiempos (línea de base), zona que informa de las condiciones generales del sistema en ausencia de
solutos.

Luego se observa un brusco incremento sobre la línea base, seguido de un descenso más o menos
simétrico

que enlaza con la continuación de la misma (pico cromatográfico).

Idealmente el pico tiene apenas anchura: es estrecho, casi una línea vertical. Pero muchas veces
presenta una

anchura apreciable, tomando el aspecto habitual de una gaussiana. También se presenta una
primera banda

peculiar ascendente-descendente (frente del disolvente o frente de inyección), no siempre

observable, y que

suele hacerse coincidir con el tiempo muerto del sistema o tiempo necesario para que un fluido sin
retención

atraviese físicamente la columna, tubos, etc. del sistema.

Las moléculas de un mismo soluto, pese a hallarse sometido a las mismas fuerzas, no eluyen todas
al mismo

tiempo, sino obedeciendo a un modelo gaussiano.

Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto cualitativa (posición en el
eje) como

cuantitativamente (área bajo los picos) los componentes de la muestra.

La cromatografía cuantitativa se basa en una comparación de la altura o del área del pico de un
analito con el

de uno o más estándares. Ambos parámetros varían linealmente con la concentración. La

cromatografía

cualitativa se basa en la comparación de la posición de los picos (tiempos determinados de

retención) con

cromatogramas estándares.

La efectividad de la columna cromatográfica para la separación de solutos depende de las

velocidades
relativas a las cuales las especies son eluídas. La eficiencia máxima para la cromatografía líquida
ocurre a muy

bajas velocidades de flujo. Se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el

tamaño de la

partícula del empaque de la columna, se reduce la viscosidad de la fase móvil o se incrementa la

temperatura.

En una primera etapa, la cromatografía de líquidos se llevaba a cabo en columnas de vidrio con
diámetros de

1-5 cm y longitudes de 50-500 cm, cuyas partículas de la fase estacionaria no superaban las 150-
200 µm de

diámetro a fin de asegurar unos caudales razonables. Incluso así, los tiempos de separación eran
largos,

podían llevar varias horas.

La cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid Chromatography) es el

método más

sofisticado y moderno de la cromatografía líquida, que utiliza partículas de fase estacionaria para
el interior de

la columna con diámetros muy pequeños para aumentar la eficiencia, en torno a 3-10 µm. Así, se
ha

conseguido reducir el tamaño de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10 mm de diámetro en la

HPLC, y el

tiempo necesario para la separación.