Interacción Rhizobium Leguminosas en Cultivo Bajo Invernadero

Universidad Nacional de Loja
Área Agropecuaria y de Recursos Naturales Renovables

Ingeniería Agronómica
Microbiología
Nombre:
Ciclo: Tercero
Fecha: 2016-08-15
Docente: Ing. Tulio Solano
Práctica #7
1. Tema: Interacción Rhizobium –leguminosas en cultivo bajo invernadero.
2. Objetivo:
 Evaluar la eficiencia de la inoculación de Rhizobium sp. en fréjol.
3. Introducción
El nitrógeno es muy abundante en la atmósfera, sin embargo, las plantas no pueden utilizarlo en
su forma elemental y tienen que obtenerlo del suelo principalmente en forma de nitratos o
amonio. La fijación biológica de nitrógeno es un proceso clave en la biosfera, por el cual
microorganismos portadores de la enzima nitrogenasa convierten el nitrógeno gaseoso en
nitrógeno combinado. El grupo de bacterias al que se conoce colectivamente como rizobios,
inducen en las raíces (o en el tallo) de las leguminosas la formación de estructuras
especializadas, los nódulos, dentro de los cuales el nitrógeno gaseoso es reducido a amonio. Se
estima que este proceso contribuye entre el 60-80 % de la fijación biológica de nitrógeno. La
simbiosis es inhibida si existe un exceso de nitrato o amonio en el suelo. En esta simbiosis en
los nódulos, la planta huésped obtiene nutrientes nitrogenados de la bacteria (rizobios) y ofrece
a ésta una fuente de carbono y un ambiente favorable para fijar nitrógeno. Esta simbiosis
contribuye con una parte considerable del nitrógeno combinado en la tierra y permite a las
plantas leguminosas crecer sin fertilizantes nitrogenados y sin empobrecer los suelos.
Las leguminosas muestran una amplia diversidad tanto morfológica como de hábitats y
ecología, encontramos desde formas herbáceas anuales hasta árboles tropicales. Muchas
leguminosas son noduladas por los rizobios. La fijación de nitrógeno en la simbiosis rizobio-
leguminosa es de considerable importancia en agricultura, porque causa un aumento
significativo del nitrógeno combinado en el suelo. Dado que la carencia de nitrógeno suele darse
en suelos desnudos y sin abonar, las leguminosas noduladas ofrecen una ventaja selectiva en
tales condiciones y pueden crecer bien en zonas donde no lo harían otras plantas. Es por ello que
leguminosas arbustivas y arbóreas se emplean como plantas pioneras en la reforestación de
zonas áridas y semiáridas. Por el interés que estas bacterias representan para la agricultura,
empleándose como inoculantes (bio-fertilizantes) para los cultivos se han realizado
investigaciones extensas sobre este sistema simbiótico, incluyendo estudios sobre la diversidad
y la taxonomía de los rizobios. Rhizobium fue la primera bacteria producida a gran escala y se
ha añadido como inoculante durante 105 años a diversos cultivos agrícolas, con éxito en muchos
casos.
Por otro lado, el uso indiscriminado de fertilizantes nitrogenados en agricultura ha ocasionado
graves problemas de contaminación. No todo el fertilizante que se aplica lo aprovecha la planta
sino que en una cuantía importante acaba en lagos y lagunas. La fijación biológica de nitrógeno
es la opción natural de fertilización química.
4. Marco Teórico
El proceso de simbiosis entre los rizobios (bacterias de los
géneros Rhizobium, Bradyrhizobium y Azorhizobium) y las plantas con la que se asocian
específicamente está controlado genéticamente. La capacidad de establecer simbiosis fijadoras
de nitrógeno se limita a las leguminosas (familia Leguminisae) y al género Parasponia de la
familia de las Ulmaceaeinfectada por el género Bradyrhizobium. Existe otra bacteria capaz de
formar nódulos fijadores de nitrógeno (Frankia, del grupo de los actinomicetos) en simbiosis
con ciertos árboles. La simbiosis entre los rizobios y las leguminosas no es debida a una
especialización de un nicho ecológico particular puesto que la distribución de las leguminosas
es muy amplia, sino que se trata de una relación debida a características genéticas particulares
de las leguminosas que no se presentan en otros grupos de plantas y que durante la evolución no
han aparecido más de una vez.
Los tres géneros de rizobios se han clasificado durante mucho tiempo junto con las bacterias del
género Agrobacterium en la familia Rhizobiaceae. Sin embargo, por análisis molecular se ha
comprobado que el grupo no es homogéneo:
 La distancia entre Rhizobium y Bradyrhizobium es grande.

 Existen bacterias muy relacionadas filogenéticamente (alta homología de ADN o de
ARN ribosomal) que no son capaces de establecer simbiosis ni de fijar nitrógeno.
Por otra parte, la denominación de las especies del grupo se ha realizado considerando la planta
con la que formaba simbiosis; sin embargo, se ha visto que el espectro de especies vegetales con
el que un rizobio puede establecer simbiosis varía mucho dependiendo del rizobio de que se
trate y que cambios simples en ciertos genes involucrados en la interacción entre el rizobio y la
planta pueden tener efectos drásticos en el perfil del espectro de interacción: la especificidad de
la simbiosis es mucho más compleja de lo que se había pensado.
La infección consta de dos etapas:
 La preinfección o atracción quimiotáctica de la bacteria por la planta seguida de la

inducción de cambios estructurales en los pelos radiculares. La atracción
quimiotáctica se debe a que la planta exuda compuestos tales como amoinoácidos y
ácidos dicarboxílicos que actúan como atrayentes nutritivos; también liberan
compuestos de tipo flavonoide que no son nutritivos. La quimiotaxis por sí no es
necesaria para la infección, sólo es necesaria para que las bacterias entren en contacto
con la planta. La bacteria entra en contacto con los pelos radiculares jóvenes de la
planta (se suelen infectar los que aparecen justo encima del meristemo apical; los pelos
maduros raramente son infectados): en primer lugar se establece una unión muy débil
entre la bacteria y el pelo radicular y, posteriormente, se agregan otras muchas bacterias
al sitio de unión y ésta se hace mucho más fuerte. Cuando la bacteria se aproxima o
entra en contacto con la raiz que va a infectar, secreta un compuesto lipopolisacarídico
denominado factor NOD que induce una serie de deformaciones en los pelos radiculares
que permitirán el progreso de la segunda etapa.
 La infección: la bacteria entra en el pelo y forma canales, recubiertos por nuevo
material de pared celular, que van ramificándose. Estos canales de infección van
entrando en la raiz al mismo tiempo que las células corticales de la raiz comienzan a
dividirse para formar el primordio de nódulo. El canal de infección se dirige entonces
hacia este primordio de nódulo en formación, los rizobios en ellos se dividen varias
veces y se transforman en bacteroides que quedan rodeados por una membrana
bacteriana denominada peribacteroidal.
5. Materiales y reactivos
Materiales
Cantida Unidad Descripción
d
1 Unidad Caja de petri
26 Unidad Semillas de Fréjol
26 Tarrinas Suelo Fértil
26 Tarrinas Humus
6. Equipos y herramientas
Equipos
Cantida Unidad Descripción
d
----- ml Agua destilada
1 Unidad Autoclave
26 Unidad Tarrinas
7. Procedimiento
 Colecta de nódulos de fréjol
 Tome muestras de raíces de fréjol, con nódulos nitrificantes en buen estado fitosanitario
y colóquelas en la funda plástica y etiquete.
 Lleve al laboratorio y mantenga en refrigeración.
 Elaboración de medio de cultivo
 Pese los siguientes componentes: 20 gramos de Glucosa, 10 gramos de Extracto de
levadura Yeast estract, 20 gramos de CaCO3, 20 gramos de Agar en 1000 cm3 de agua
destilada.
 Autoclavar por 15 minutos a 121o centígrados.
 Trasvasar el YMA a cajas de Petri.
 Aislamiento
 Lave y seque los nódulos de frejol
 En el flujo laminar colóquelos por 2 minutos en hipoclorito de sodio al 2%.
 Lave en abundante agua estéril por 4 veces.
 Macere lo nódulos en agua estéril.
 Tome una alicuta del macerado y simbre por estriado en la caja de Petri que contiene
YMA
 Siembra del fréjol
 Prepara un sustrato 1:1:1 y esterilícelo.
 Tome 44 semillas de fréjol inoculadas con Rhyzobium aislado, siembre y riegue.
 Tome 8 semillas de frejol y desinféctelas con antibiótico para eliminar Rhyzobium ,
siembre y rigue con agua destilada estéril.
 Inoculación
 Realice una suspensión del aislado de Rhyzobium , y confirme la concentración con los
estándares de turbidez de McFarland
 Para la primera inoculación sumerja las semillas por 30 minutos y siembre.
 Para la segunda y tercera inoculación ponga 5 ml de suspensión en cada planta.
 Variables agronómicas
 Al final del ensayo evalúe: Altura de planta cm, Biomasa foliar g, Número de Hojas,
Numero de foliolos, Número de flores, Número de vainas, Diámetro de tallo cm,
Perímetro de tallo cm, Biomasa Radical g, Peso de nódulos, Número de nódulos,
Promedio de 10 nódulos largo cm, Promedio de 10 nódulos ancho cm y Caracterización
microscopia de Rhyzobium.
8. Resultados y discusión.
Altura Promedio Promedio
Número Numer Número Númer Diámetr Perímetr Biomasa Númer
de Biomasa Peso de de 10 de 10
de o de de o de o de tallo o de tallo Radical o de
plant foliar g nódulos nódulos nódulos
Hojas foliolos flores vainas cm. cm g nódulos
a cm. largo cm ancho cm
30 6,5 11 18 5 0 0,2 0,8 3,9 0,43 38 1,8 1,5
Uso de esta bacteria como biofertilizante son:

Producen fitohormonas, como el ácido indolacètico y las
citoquininas, capaces de acelerar y potenciar el crecimiento de
las plantas.
 Al permanecer vivas durante años y reproducirse en el suelo,
no sólo no lo degradan sino que contribuyen a su
enriquecimiento en nitrógeno y a su regeneración de forma
ecológica y gradual, incluso en terrenos de alta concentración
salina.
 Crea una barrera protectora contra hongos y bacterias
patógenas en la raíz de la planta, por lo que ésta crece más sana
y fortalecida.
 Producen enzimas que solubilizan los fosfatos y los hacen más
accesibles a la planta, así como factores que facilitan la absorción de oligoelementos.
 Como consecuencia de todo lo anterior, es un mayor desarrollo de las raíces de las
plantas, con el consiguiente beneficio general para ésta, así como el peso de los frutos.
9. Conclusiones
 Las plantas regadas con agua esterilizada eran menos desarrolladas que la mayoría de
plantas con riego normal e inoculado.
 El tamaño de vainas, diámetro de tallo y presencia de flores es mayor en las plantas
infectadas que en las sin infección.
 Al permanecer en un medio común algunas de las plantas cuidadas con riego
esterilizado se infectaron con Rhizobium.
 Los nódulos al fijar nitrógeno y al realizar simbiosis con la leguminosa, permite un
mejor desarrollo de la planta.
10. Recomendaciones
- Tener constancia en el Riego.
- Recolectar tierra apta para el desarrollo de la planta.
- Desmontar la práctica con cuidado.
- Registrar de manera correcta y cuidadosa los datos.
11. Bibliografía consultada
 Brock, M. T., Madigan. 2009. Biología de los Microorganismos, Prentice Hall
Hispanoamericana.
 Guía Microbiología Agrícola, 2010, Centro de Impresiones de FAUBA.
 http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/53-rhizobium
%201.htm

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 La distancia entre Rhizobium y Bradyrhizobium es grande.

 La preinfección o atracción quimiotáctica de la bacteria por la planta seguida de la

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