Screening Fitoquímico y Evaluación de La Actividad Antimicrobiana De: Catharanthus Roseus (L.) G. Don, Justicia Pectoralis Jacq. y Scoparia Dulcis L
Screening Fitoquímico y Evaluación de La Actividad Antimicrobiana De: Catharanthus Roseus (L.) G. Don, Justicia Pectoralis Jacq. y Scoparia Dulcis L
Screening Fitoquímico y Evaluación de La Actividad Antimicrobiana De: Catharanthus Roseus (L.) G. Don, Justicia Pectoralis Jacq. y Scoparia Dulcis L
Recibido: 03/abril/2017
Aprobado: 29/mayo/2017
ARTÍCULO ORIGINAL
Bioquímica Farmacéutica Licenciada en Ciencias Naturales y del Ambiente Biología y Química Especialista
en Fitoquímica y Biología Molecular Colegio Municipal Sebastián de Benalcázar. Docente Facultad de
Ciencias Químicas Universidad Central del Ecuador
e-mail: rafa_balseca@hotmail.com
Resumen
El
presente trabajo tiene como propósito; realizar el screening fitoquímico, mediante el método descrito por
CIULEI y determinar la acción antimicrobiana de: Scoparia dulcis L., Justicia pectoralis Jacq, y Catharanthus
roseus (L.) G. Don, mediante el método pro-puesto por Mitscher 1988. Este método se fundamenta en la
susceptibilidad bacteriana, medida in vitro. Consiste en utilizar el extracto de interés, frente a los
microorganismos de elección, en medio de agar y condiciones de completa asepsia. Catharanthus roseus (L.)
G. Don es la especie que mayor cantidad de alcaloides presenta, seguida de Justicia pectoralis Jacq. Y a con-
tinuación Scoparia dulcis L. esta última es la que mayor cantidad de Taninos y Glicósidos Cardiotónicos
presenta seguida de Catha-ranthus roseus (L.) G Don y Justicia pectoralis Jacq. que presentan similitud en el
contenido de Taninos y Glicósidos Cardiotónicos. En cuanto a los Esteroides, las 3 especies en estudio
68 presentan igual cantidad y únicamente Justicia pectoralis Jacq. contiene una ligera cantidad de Flavonoides. El
extracto crudo estandarizado de Scoparia dulcis L. presenta actividad antibiótica (acción bacteriostática),
sobre Pseudomona aeruginosa desde una concentración de 62.55 ug/ml siendo esta la concentración
mínima inhibitoria CMI. Así como también presenta actividad antifúngica con poder fungicida con
respecto a la levadura Candida albicans a una concentración de 31.25 ug/ml, siendo ésta la CMI.
Palabras Claves: scoparia dulcis l.; justicia pectoralis jacq.; catharanthus roseus (l.) g. don; screening
fitoquímico y acción anti-microbiana
Abstract: The present work purpose is to determinate the antimicrobial action or the Scoparia dulcis L., Justicia
pectoralis Jacq., and Ca-tharanthus roseus (L.) G. Don, through the method proposed by Mitscher 1988. This
method is based in the bacterial susceptibility measured in vitro. It consists on using the interest extract with
the microorganisms of election in agar environment and complete asepsis conditions. Catharanthus roseus (L.) G.
Don is the species that presents the greatest number of alkaloids, followed by Justicia pectoralis Jacq. and Sco-
paria dulcis L, which has the highest number of Tannins and Cardiotonic Glycosides and the next, is
Catharanthus roseus (L.) G. Don and Justicia pectoralis Jacq. Which present a similar content of Tannins and
Cardiotonic Glycosides? Regarding to the steroids the 3 studied species present a similar quantity and only Justicia
pectoralis Jacq. has light quantity of Flavonoids. The raw standardized extract of Scoparia dulcis L. shows
antibiotic action (bacteriostatic action), about Pseudomona aeruginosa from a concentration of 62.55 ug/ml,
this one is the minimum inhibitory concentration CMI. It also presents antibiotic activity with fungicide power in
the microorganism Candida albicans in a concentration of 31.25 ug/ml; this is the CMI.
Key words: scoparia dulcis l; justicia pectoralis jacq. and catharanthus roseus (l.) g. don; screening fitoquímico and antimicrobial
action
Introducción la tos y afecciones de las vías respiratorias.
Como antes, se pipetea 100 μL de esta disolución en una Preparación de los medios de cultivo “Trypticase Soy
caja Petri guardando condiciones de asepsia. El rema- Agar” (TSA) se disolvieron 40g de TSA en un litro de
nente de esta disolución (0.1 mL) se diluyó en un vial agua destilada, esta cantidad es suficiente para aproxi-
estéril con DMSO. Esto da origen a una segunda disolu- madamente 100 cajas.
ción que contiene 1000 μg/100 μL (1 mg/0.1 mL). Luego
se continúa con las diluciones hasta obtener concentra- Se hirvió el agua, se añadió el agar, se calentó la sus-
ciones de 500. 250, 125, 62.5, 31.25 μg/100 μL. pensión hasta que se logró disolución clara; luego, esta
disolución se transfirió a tubos con tapa (10mL/tubo)
Screening antibacteriano y a un erlenmeyer, y posteriormente se esterilizaron en
autoclave por 15 minutos a 121 oC.
Método de Mitscher (CYTED, 1995); procedemos a
colocar el extracto en μl. en la caja de Petri en la cá- “Trypticase Soy Broth” (TSB) Se disolvió 30g de TSB en
mara de flujo laminar, se deja evaporar el solvente, y un litro de agua destilada, se hirvió el agua; luego, se agre-
se añade el agar, “Trypticase Soy Agar” TSA, se agita gó al medio, y se calentó hasta obtener una disolución
y se deja solidificar. clara. Con una jeringa automática se transfirieron 10 mL.
de TSB a los erlenmeyers individuales de 25 mL. Estos se
Activación de cepas bacterianas; procedemos a pre- esterilizaron en autoclave a 121 oC por 15 minutos.
parar tubos con “Trypticase Soy Broth” TSB en el cual
inoculamos una asada de suspensión bacteriana. 71
Nota: Podrá emplearse el medio Agar Muller- Hinton,
A continuación, tomamos una asada de bacterias y a cambio de los medios anteriores.
procedemos a sembrarlas por rayado, en las cajas con
divisiones en número de 8, siguiendo la plantilla. Se utilizaron estos medios porque favorecen el creci-
miento de microorganismos fastidiosos (Exigentes en
Se incuban a 37oC por 24h. sus requerimientos) siendo estos aerobios y anaerobios.
Se enumeran las cepas bacterianas en el siguiente orden: Mantenimiento de microorganismos. Los microorga-
nismos fueron cepas de trabajo donados por el Labo-
1. Salmonella typhimuriun ATC No 14028 2. Escheri- ratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias
chia coli ATCC No11775
Químicas de la Universidad Central.
3. Proteus SPP`
4. Klebsiella SPP En los tubos de agar inclinados “Trypticase Soy Agar”
5. Staphylococcus aureus, ATCC No25923. (TSA) se inocula cada tres semanas los microorganis-
6. Pseudomona aeruginosa SPP mos. La siembra se efectuó por picadura y se incubó
por 24 horas para su crecimiento a 37oC, con identi-
Candida albicans SPP. ficación y la correspondiente rotulación.
Stock de sulfato de estreptomicina. Se preparó un Es importante siempre identificar cada uno y anotar
stock de soluciones de sulfato de estreptomicina como la fecha de siembra.
patrón de reacción positiva.
FIGEMPA: Investigación y Desarrollo, ISSN 1390-7042/ 2017 / Volumen 1 / Número 2 / Quito, Junio 2017 / Periodicidad semestral
Preparación de disolución salina Se preparó disolución salina Se tomó de las suspensiones de microorganismos di-
al 0.9 %. Se esterilizó en autoclave a 121 oC por 15 minutos. luidos con solución salina una asada y se sembró en
los platos Petri en forma radial, siguiendo una planti-
Preparación de las cajas. Después de que se esterilizó el lla marcada, para cada uno de ellos.
Agar, se dejó enfriar aproximadamente a 55 oC. Asép-
ticamente, se añaden 10 mL de Agar a cada caja Petri Cuidando no topar una raya con otra, es decir un mi-
sobre el antibiótico o el extracto respectivamente. croorganismo con otro, para evitar contaminación.
Luego, se agitó suavemente la mezcla para homogeni- Una vez terminado el rayado, se incubaron las cajas
zar. Cuando el Agar se solidificó, las cajas se voltearon y por 48 horas a 37oC.
se mantuvieron a temperatura ambiente toda la noche.
Se preparó un plato Petri con “Trypticase Soy Agar”
Preparación de suspensiones con microorganismos. TSA puro, como control negativo del ensayo, en el
El medio ideal para el crecimiento de los microorga- que se verificó el crecimiento de todos los microor-
nismos es el de Trypticase Soy Broth (líquido), previa- ganismos.
mente esterilizado con vapor de agua.
Criterio de Evaluación Antimicrobiano. Existe activi-
Se prepararon sendos tubos de ensayo para cada mi- dad antimicrobiana de los extractos cuando no hay
croorganismo con 10 ml de TSB exactamente medido crecimiento visible en las líneas de siembra.
y se inoculó dos asadas tomadas de los tubos de TSA,
se incuba a 37o por 24 horas, luego de las cuales, los La actividad antibacteriana de los extractos de plantas
medios deben estar visiblemente turbios (crecimiento se verifica a los 4 días de crecimiento y en los que no
bacteriano positivo). hubo, 1 día más.
Con la finalidad de tener la misma isotonicidad de los mi- Para los resultados se deben considerar los controles
croorganismos en las cajas de los extractos, es importante positivos y negativos.
diluir con la solución salina estéril, antes de ser sembrados.
Concentración mínima inhibitoria. Como los extrac-
La solución se detalla así: tos muestran actividad antibacterial, se realizó la prue-
ba con concentraciones que varían en forma decrecien-
Staphylococcus aureus ATCC 25923 100ul susp. te, por Ej.: 500 ug/ml, 250ug/ml, 125ug/ml, 62.5 ug/
/10ml sol. Salina ml, 32.25 ug/ml; para definir la concentración mínima
inhibitoria (CMI), como la menor concentración en la
Escherichia coli ATCC 11775 100ul susp. /10ml sol. cual existe actividad antimicrobiana es decir la concen-
Salina tración a la cual no hay crecimiento bacteriano.
Salmonella typhimurium ATCC 14028 100ul susp. Concentración mínima bactericida (CMB) es la míni-
/10ml sol. Salina ma concentración a la cual son eliminadas el 99.9% de
Proteus vulgaris SPP 100ul susp./10ml sol. Salina bacterias del inóculo. (RUSSELLS, 2004)
72
Klebsiella SPP
Cepas Bacterianas utilizadas. Tenemos cepas de refe-
100ul susp./10ml sol. Salina rencia que vienen en polvo y son liofilizadas y cepas
de trabajo que son identificadas y preparadas previa-
Pseudomona aeruginosa PP 1ul susp. /10ml sol. Sa- mente. Para nuestro estudio utilizamos cepas de tra-
lina Candida albicans SPP 1ul susp. /10ml sol. Salina bajo donadas por el laboratorio de microbiología de
la Universidad Central, cuyo origen es el siguiente:
Rayado de los microorganismos. Antes de iniciar la Staphylococcus aureus ATCC No. 25923, Klebsiella
siembra de los microorganismos en las cajas Petri, se pneumoniae spp responsable de las enfermedades del
debe tomar en cuenta lo siguiente:
tracto respiratorio superior, Escherichia coli ATCC
Identificar claramente los tubos. Se debe tener las ca- No. 11765, Salmonella typhimurium ATCC NO.
jas completamente libres de humedad. 14028 responsables de las enfermedades del tracto
gastrointestinal, Proteus spp, por presentar resistencia
Las cajas que presenten contaminación deben ser des- a los agentes antimicrobianos, Pseudomona aerugi-
echadas. nosa spp patógena oportunista y la levadura Candida
albicans spp responsable de la candidiasis.
El asa de inoculación debe ser flameada antes y des-
pués de usarla.
Resultados
Nunca se debe topar con el asa caliente la superficie
del medio, ya que puede ser la causa de la formación Screening o tamizaje fitoquímico cualitativo
de aerosoles contaminantes o se puede inhibir los mi-
croorganismos del inóculo. El análisis o screening fitoquímico se efectuó en el la-
boratorio del Centro Científico de Río Palenque; en los
extractos de las tres especies vegetales: Scoparia dul-
cis L. Justicia pectoralis Jacq. y Catharanthus roseus
(L.) G. Don. Se encontró en todas ellas: Alcaloides y Tabla 3. Justicia pectoralis Jacq.
esteroides en mayor proporción, taninos y glicósidos
FECHA: May-02
cardiotónicos en menor proporción y únicamente en
la especie botánica justicia pectoralis Jacq, además de Muestra N° 12
los citados, una ligera presencia de flavonoides. Código agronómico 3J142N1
Código laboratorio 12JE1AFC
Resultados de la Actividad Antimicrobiana. Especie J
COMPUESTO
Tabla 5
“Entre los principales productos químicos incluyen dad antimicrobiana a diferentes concentraciones
también scopadiol, scopaldulciol, scopadulin, el áci- de extractos contra los microorganismos utiliza-
do scopadulcic A y B y ácido scoparico A y C que son dos Gram (+) y (-). Por lo que se acepta la hipóte-
diterpenos, ácido - 12 - betulínico y glutinol que son sis alternativa 1Ha. “Las tres especies vegetales en
triterpenos, sitosterol que es un esteroide, flavonas estudio tienen diferente actividad bacteriana sobre
como vitexin y linarin. (MASUMA, S. y LAZUMA, gérmenes Gram (+) y (-)”.
N. 2011) Con el fin de determinar las propiedades ter-
apéuticas del vegetal han sido realizadas varias inves- c) Scoparia dulcis L. es la especie de mayor sen-
tigaciones coincidiendo con los datos expuestos por sibilidad antimicrobiana, siendo activa contra
Das (2001), Masuma (2011) que la teatina contiene Pseudomona aeruginosa a una concentración de
terpenos, alcaloides, cumarinas, saponinas, taninos, 62,5ppm; siendo esta la concentración mínima in-
terpenos, compuestos fenólicos, flavonoides.” ( LLA- hibitoria (CMI).
MUCA, 2014).
d) También presenta actividad antimicótica con poder
Catharanthus roseus (L.) G. Don fungicida contra la levadura Candida albicans en
todas las concentraciones. Por lo que se afirma que
Etnobotánica y etnomédica Scoparia dulcis L. presenta acción bacteriostática
sobre Pseudomona aeruginosa, con poder fungici-
Raíces purgantes, vermífugas (vermicida destructor da sobre la levadura Candida albicans.
de gusanos intestinales; SIN: antihelmíntico), depu-
rativas (dícese de lo que se supone capas de purificar e) Justicia pectoralis Jacq. No presentó actividad bi-
los humores. Agente, sustancia o medicamento que ológica a las concentraciones de estudio frente a
tienen esta acción. Se incluyen los purgantes, diuréti- los microorganismos seleccionados.
cos, diaforéticos, etc.), hemostáticas (que cohíbe el
flujo de sangre o hemorragia. Agente mecánico, físico f) Catharanthus roseus (L.) G. Don igual que la an-
o químico que posee esta acción; SIN: hemostático), terior especie vegetal no presenta acción biológica
odontológicas (que se utiliza para el dolor de dientes), a las concentraciones de estudio y contra las cepas
hipoglucemiante (que disminuye la cantidad de glu- seleccionadas.
cosa contenida en la sangre).
Recomendaciones
En investigaciones realizadas del extracto crudo de
Justicia pectoralis Jacq. En Colombia, en el departa- a) Los resultados del tamizaje fitoquímico constituyen
mento del Tolima, tiene acción antimicrobiana con únicamente una orientación y deben interpretarse
respecto a Estafilococos aureus. No coincidiendo con en conjunto con los resultados del screening far-
nuestra investigación pudiendo deberse a la variedad macológico, por lo que se sugiere realizar dicho
del terreno y de las condiciones ambientales en el cual screening de las tres plantas, para poder determi-
fue cultivado. nar las fracciones químicas o metabolitos secunda-
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rios biológicamente activos y ser sometidas a prue-
La planta dio positiva a la prueba de esteroides, bas más específicas.
taninos, glicósidos cardiotónicos y alcaloides con
mayor intensidad, coincidiendo con los reportes de b) Se recomienda continuar con los estudios in vivo
Charles Beer (1958) y Svodoba (1961) tiene en sus para tratar la candidiasis por medio del extracto
componentes a la Vincristina y Vinblastina, analitos estandarizado de Scoparia dulcis L. y el posteri-
fitoquímicos de uso en la quimioterapia, los cuales or diseño del fitofármaco para el uso etnomédico
pertenecen a la familia de los alcaloides. como bacteriostático contra Pseudomona aerugi-
nosa y fungicida ante la levadura Candida albicans.
Conclusiones Desarrollar estudios del mecanismo de acción en
cuanto al agente causal de esta patología.
a) En relación al tamizaje fitoquímico, una vez real-
izada la investigación se verificó que las tres espe- c) Se debería investigar la familia o grupo de antibióti-
cies vegetales de estudio, tienen una similitud en cos al cual pertenece el antimicrobiano respectiva-
cuanto a su contenido químico: alcaloides, taninos, mente, encontrados en Scoparia dulcis L. y carac-
glicósidos cardiotónicos, esteroides; en mayor o terizar su fórmula, pudiendo este ser el responsable
menor proporción. Excepto Justicia pectoralis Jacq, del uso etnomédico que se le da en la zona como
que es la única que presenta flavonoides. Por lo que antiinflamatorio y posible antitumoral.
se acepta la hipótesis nula, Ho. “Las tres plantas de
estudio tienen igual composición química”. d) Al presentar las tres plantas alcaloides, en mayor
o menor proporción, se sugiere, extraer específica-
b) En el estudio de la actividad antimicrobiana de las mente las fracciones alcaloidales de las tres plantas
plantas, se comprobó que tienen diferente activi- y someterlas a la evaluación de la actividad antimi-
crobiana, concomitante realizar el estudio como: Granda-Acosta. (1984). Catharantus roseus L. G.
Antiinflamatorios y antitumorales (anticáncer). Don cultivos tropicales apuntes sobre el cultivo de
plantas p491-498.
Agradecimiento
Gross, et al. (1985). Introducción al estudio de los
Al Dios Altísimo por darme la maravillosa oportuni- productos naturales. Buenos Aires, AR. Edit. Eva V.
dad de realizar este proyecto. Chesneau. 69, 79, 100, 111, 113,129p.
A la gloriosa Universidad Central del Ecuador y su Koneman, E. et al. (2004). Diagnóstico
Facultad de Ciencias Químicas, donde se realizó la
evaluación antimicrobiana; a la Fundación Wong y su Microbiológico 5ed. Buenos Aires, AR. Edit.
estación Científica de Río Palenque, donde se realizó Médica Panamericana 781, 795,796p
la domesticación de las plantas en estudio y el screen-
La explotación del petróleo en la cuenca amazónica
ing fitoquímico..
del Ecuador produce una emergencia sanitaria 14-
A la Fundación Wong y al IECE que financiaron este may-08 disponible http://publications.paho.org/
proyecto. spanish/index.cfm
Goodman, G. (1996). Las bases farmacológicas de la Narváez, I. (2004). Derecho ambiental y sociología
terapéutica. 11ed México, MX. Mc Graw Hill ambiental 1ed. Quito, EC. Edit. Librería Jurídica
Interamericana p1351. Cevallos.
FIGEMPA: Investigación y Desarrollo, ISSN 1390-7042/ 2017 / Volumen 1 / Número 2 / Quito, Junio 2017 / Periodicidad semestral